KR20170027831A

KR20170027831A - 세포 은행의 해동 회수를 개선하는 ph 조정

Info

Publication number: KR20170027831A
Application number: KR1020177003220A
Authority: KR
Inventors: 엔젤라 마이어; 스티븐 제이. 마이어; 필립 더피; 마르시아 코인; 카라 칼훈
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 2014-07-09
Filing date: 2015-07-09
Publication date: 2017-03-10
Also published as: KR102355306B1; BR112017000142B1; CA2953154A1; PL3166401T3; BR112017000142A2; US20170112122A1; EP3166401B1; JP2017521075A; EP3166401A1; RU2017104107A3; RU2714759C2; CN106686977A; US20200315162A1; NZ765734A; US20220151221A1; US10602739B2; JP2020072668A; SG11201700097WA; JP6826975B2; NZ727705A

Abstract

세포 은행의 해동 회수의 개선 또는 저장을 위하여 포유동물 세포를 냉각하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 6.7 내지 8.5의 pH를 갖는 동결 배지 내에서 포유동물 세포를 동결하는 단계를 포함한다.

Description

세포 은행의 해동 회수를 개선하는 PH 조정{PH ADJUSTMENT TO IMPROVE THAW RECOVERY OF CELL BANKS}

관련 출원에 대한 상호-참조

본원은 2014년 7월 9일로 출원된 미국 가출원 시리즈 번호 62/022,392의 우선권 이점을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 편입되어 있다.

발명의 분야

본 발명은 동결 세포용 동결 배지의 보관 및 동결을 위한, 세포 (예컨대 포유동물 세포)의 동결 방법에 관한 것이다.

세포 은행은 뱃치/관류 세포 배양 공정에서 세포를 우선 축적하고, 이후 보관을 위하여 세포를 수거함으로써 생산된다. 이러한 공정은 하기의 3 단계를 포함한다: 세포 축적, 수거 및 세포 농축, 및 세포 보관. 수거 공정 단계는 최종 세포 배양 유체를 농축하기 위하여, 또는 원심분리를 사용하여 세포 배양 유체로부터 세포를 추출하기 위하여 작용한다. 차후의 풀링(pooling) 및 충전 공정은 장기간 보관을 위하여 세포 은행 앰플을 제조하기 위하여 작용한다.

이러한 전통적인 방법은 선택된 세포주에 대한, 해동-후 불일치되거나 또는 불량한 생존률을 유발할 수 있다. 세포 보관 공정에 대하여 필수적으로 요구되는 것은 동결된 세포의 해동 후의 높은 세포 생존률이다. 따라서, 세포 보관에 대한 동결 세포의 개선된 방법이 바람직하다. 보관 후 해동될 경우, 보다 큰 세포 생존력을 가능하도록 하는, 동결 세포에 대한 세포 배양 배지가 이점으로 작용할 것이다.

본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 이들의 전문이 본원에 참조로 편입된다.

발명의 요약

일 구현예에서, 동결 배지 내에서의 보관을 위한 진핵생물 세포 (예컨대, 포유동물 세포, 곤충세포 등)을 동결하는 단계를 포함하는, 세포 은행의 해동 회수를 개선하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 상기 동결 배지는 완충액 및 동결방지제를 포함하고, 상기 동결 배지는 동결 전에 약 6.7 내지 약 8.5의 pH를 갖거나, 또는 동결 전에 약 6.7 내지 약 8.5의 pH까지 조정된다,

일 구현예에서, 동결 배지 내에서 세포를 동결하는 단계를 포함하는, 저장을 위하여 진핵생물 세포 (예컨대, 포유동물 세포, 곤충세포 등)을 동결하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 상기 동결 배지는 완충액 및 동결방지제를 포함하고, 상기 동결 배지는 동결 전에 약 6.7 내지 약 8.5의 pH를 갖거나, 또는 동결 전에 약 6.7 내지 약 8.5의 pH로 조정된다.

상기 또는 본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, 동결 배지는 하기의 pH를 갖는다: 동결 전에, 약 6.7 내지 약 8.3, 약 6.8 내지 약 8.3, 약 6.9 내지 약 8.3, 약 7.0 내지 약 8.3, 약 7.1 내지 약 8.3, 약 7.2 내지 약 8.3, 약 7.3 내지 약 8.3, 약 7.4 내지 약 8.3, 약 7.5 내지 약 8.3, 약 7.2 내지 약 8.0, 약 7.2 내지 약 7.8, 또는 약 7.5.

상기 또는 본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, 동결 배지의 pH는 하기 pH로 조정된다: 약 6.7 내지 약 8.5, 약 6.7 내지 약 8.3, 약 6.8 내지 약 8.3, 약 6.9 내지 약 8.3, 약 7.0 내지 약 8.3, 약 7.1 내지 약 8.3, 약 7.2 내지 약 8.3, 약 7.3 내지 약 8.3, 약 7.4 내지 약 8.3, 약 7.5 내지 약 8.3, 약 7.2 내지 약 8.0, 약 7.2 내지 약 7.8, 또는 약 7.5. 상기 또는 본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충 세포)는, pH 조정 전에 및/또는 후에 동결 배지와 조합된다. 일부 구현예에서, 조정된 pH는 표적 pH 또는 측정된 pH이다. 일부 구현예에서, 표적 pH는 약 6.7 내지 약 8.5이거나, 본원에 기술된 pH 범위 중 임의의 pH이다. 일부 구현예에서, 측정된 pH는 약 6.7 내지 약 8.5이거나, 본원에 기술된 pH 범위 중 임의의 pH이다. 상기 또는 본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, 상기 방법은, 동결 배지의 pH 조정 전에 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충 세포)를 함유하는 동결 배지의 초기 pH를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 또는 본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, 상기 방법은 동결 배지의 조정된 pH를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 또는 본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, 동결 배지의 측정된 pH가 표적 pH 미만일 경우, 상기 방법은, 동결 배지의 조정된 pH가 약 6.7 내지 약 8.5이거나, 본원에 기술된 pH 범위 중 임의의 pH이 될 때까지 조정 단계 및 측정 단계를 반복하는 단계를 포함한다.

상기 또는 본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, pH는 염기를 첨가함에 의하여 조정된다. 일부 구현예에서, 염기는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 탄산나트륨, 중탄산나트륨, HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산) 나트륨 염, 수산화나트륨, 및 수산화칼륨. 일부 구현예에서, 동결 배지의 pH는, 식 V_base = C_base*V_p (pH_t - pH_i)에 따라 동결 배지에 염기를 첨가함으로써 조정되고, 여기서 C_base 는 염기-특정 계수이고, V_base 는 동결 배지에 첨가되는 염기의 용적이고, V_p 는 동결 배지의 용적이고, pH_t 는 표적 pH이며, 그리고 pH_i 는 초기 pH이다. 일부 구현예에서, 동결 배지의 pH는, 식 V_Na2CO3 = 0.0085V_p (pH_t - pH_i)에 따라 동결 배지에 탄산나트륨을 첨가함으로써 조정되고, 여기서 V_Na2CO3 는 동결 배지에 첨가되는 1M 탄산나트륨의 용적이고, V_p 는 동결 배지의 용적이고, pH_t 는 표적 pH이며, 그리고 pH_i 는 초기 pH이다. 일부 구현예에서, 표적 pH는 약 6.7 내지 약 8.5, 약 7.2 내지 약 8.3, 또는 본원에 기술된 임의의 pH 범위 중의 임의의 pH 중의 pH이다. 일부 구현예에서, 표적 pH는 7.5이다.

상기 또는 본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충 세포)는, 세포가 동결 배지와 조합되기 전에, 약 6.2 내지 약 6.6의 pH를 갖는 배지 내에 있다.

상기 또는 본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, 동결방지제는 DMSO (디메틸 설폭시드), 글리세롤, 프로판디올, 에틸렌 글리콜, 거대분자, 당, 또는 이의 조합이다. 일부 구현예에서, 동결 전 동결 배지 내의 DMSO 또는 글리세롤의 농도는 약 5 용적% 내지 약 12.5 용적%이다. 일부 구현예에서, 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충 세포) 동결 전 동결 배지 내의 DMSO 또는 글리세롤의 농도는 약 5 용적% 내지 약 10 용적%이다.

상기 또는 본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충 세포)를 함유하는 동결 배지는, 동결 전 약 8% 내지 약 28%의 충전 세포 용적 (PCV)의 세포 밀도를 갖는다.

상기 또는 본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, 상기 방법은, 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충 세포)가 동결 배지와 조합되기 전에, 세포 수거 및 농축 동안 세포 배양 유체를 냉각하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 유체는 약 20℃ 이하의 온도로 냉각된다. 일부 구현예에서, 세포 배양 유체는 약 10℃ 이하의 온도로 냉각된다.

또 다른 구현예에서, 저장 또는 세포 은행의 해동 회수를 개선하기 위하여, 진핵생물 세포 (예컨대, 포유동물 세포, 곤충세포 등)을 동결하는 방법이 본원에 제공되며, 이는 하기 단계를 포함한다: (a) 세포를 함유하는 동결 배지의 pH를 약 6.7 내지 약 8.5의 pH로 조정하는 단계 (상기 동결 배지는 완충액 및 동결방지제를 포함함); 및 (b) 상기 세포를 동결하는 단계.

일부 구현예에서, pH는 하기의 pH로 조정된다: 약 6.7 내지 약 8.3, 약 6.8 내지 약 8.3, 약 6.9 내지 약 8.3, 약 7.0 내지 약 8.3, 약 7.1 내지 약 8.3, 약 7.2 내지 약 8.3, 약 7.3 내지 약 8.3, 약 7.4 내지 약 8.3, 약 7.5 내지 약 8.3, 약 7.2 내지 약 8.0, 약 7.2 내지 약 7.8, 또는 약 7.5. 일부 구현예에서, 조정된 pH는 표적 pH 또는 측정된 pH이다. 일부 구현예에서, 표적 pH는 약 6.7 내지 약 8.5이거나, 본원에 기술된 pH 범위 중 임의의 pH이다. 일부 구현예에서, 표적 pH는 약 7.5이다. 일부 구현예에서, 측정된 pH는 약 6.7 내지 약 8.5이거나, 본원에 기술된 pH 범위 중 임의의 pH이다.

상기 또는 본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, 상기 방법은, 동결 배지의 pH 조정 전에 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충 세포)를 함유하는 동결 배지의 초기 pH를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 동결 배지의 조정된 pH를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 배지의 측정된 pH가 표적 pH 미만일 경우, 상기 방법은, 동결 배지의 조정된 pH가 약 6.7 내지 약 8.5이거나, 약 7.2 내지 약 8.3이거나, 또는 본원에 기술된 pH 범위 중 임의의 pH이 될 때까지 조정 단계 및 측정 단계를 반복하는 단계를 포함한다.

상기 또는 본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, pH는 염기를 첨가함에 의하여 조정된다. 일부 구현예에서, 염기는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 탄산나트륨, 중탄산나트륨, HEPES 나트륨 염, 수산화나트륨, 및 수산화칼륨. 일부 구현예에서, 동결 배지의 pH는, 식 V_base = C_base*V_p (pH_t - pH_i)에 따라 동결 배지에 염기를 첨가함으로써 조정되고, 여기서 C_base 는 염기-특정 계수이고, V_base 는 동결 배지에 첨가되는 염기의 용적이고, V_p 는 동결 배지의 용적이고, pH_t 는 표적 pH이며, 그리고 pH_i 는 초기 pH이다. 일부 구현예에서, 동결 배지의 pH는, 식 V_Na2CO3 = 0.0085V_p (pH_t - pH_i)에 따라 동결 배지에 탄산나트륨을 첨가함으로써 조정되고, 여기서 V_Na2CO3 는 동결 배지에 첨가되는 1M 탄산나트륨의 용적이고, V_p 는 동결 배지의 용적이고, pH_t 는 표적 pH이며, 그리고 pH_i 는 초기 pH이다. 일부 구현예에서, 표적 pH는 약 6.7 내지 약 8.5이거나, 본원에 기술된 pH 범위 중 임의의 pH이다. 일부 구현예에서, 표적 pH는 약 7.5이다.

일부 구현예에서, 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충 세포)는, 세포가 동결 배지와 조합되기 전에, 약 6.2 내지 약 6.6의 pH를 갖는 배지 내에 있다.

일부 구현예에서, 동결 배지 내의 동결방지제는 DMSO (디메틸 설폭시드), 글리세롤, 프로판디올, 에틸렌 글리콜, 거대분자, 당, 또는 이의 조합이다. 일부 구현예에서, 동결 전 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충 세포)를 함유하는 동결 배지 내의 DMSO 또는 글리세롤의 농도는 약 5 용적% 내지 약 12.5 용적%이다. 일부 구현예에서, 세포 동결 전 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충 세포)를 함유하는 동결 배지 내의 DMSO 또는 글리세롤의 농도는 약 5 용적% 내지 약 10 용적%이다.

일부 구현예에서, 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충 세포)를 함유하는 동결 배지는, 동결 전 약 8% 내지 약 28%의 충전 세포 용적 (PCV)의 세포 밀도를 갖는다.

일부 구현예에서, 상기 방법은, 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충 세포)가 동결 배지와 조합되기 전에, 세포 수거 및 농축 동안 세포 배양 유체를 냉각하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 유체는 약 20℃ 이하 또는 약 10℃ 이하의 온도로 냉각된다.

또 다른 구현예에서, 저장 또는 세포 은행의 해동 회수를 개선하기 위하여, 진핵생물 세포 (예컨대, 포유동물 세포, 곤충세포 등)을 동결하는 방법이 본원에 제공되며, 이는 하기 단계를 포함한다: (a) 동결 배지의 pH를 약 6.7 내지 약 8.5의 pH로 조정하는 단계 (상기 동결 배지는 완충액 및 동결방지제를 포함함); (b) 상기 세포와 동결 배지를 조합하여 세포 풀을 형성하는 단계; 및 (c) 상기 세포를 동결하는 단계.

일부 구현예에서, pH는 하기의 pH로 조정된다: 약 6.7 내지 약 8.3, 약 6.8 내지 약 8.3, 약 6.9 내지 약 8.3, 약 7.0 내지 약 8.3, 약 7.1 내지 약 8.3, 약 7.2 내지 약 8.3, 약 7.3 내지 약 8.3, 약 7.4 내지 약 8.3, 약 7.5 내지 약 8.3, 약 7.2 내지 약 8.0, 약 7.2 내지 약 7.8, 또는 약 7.5. 일부 구현예에서, 조정된 pH는 표적 pH 또는 측정된 pH이다. 일부 구현예에서, 표적 pH는 약 6.7 내지 약 8.5이거나, 본원에 기술된 pH 범위 중 임의의 pH이다. 일부 구현예에서, 측정된 pH는 약 6.7 내지 약 8.5이거나, 본원에 기술된 pH 범위 중 임의의 pH이다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 동결 배지의 조정된 pH를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 배지의 측정된 pH가 표적 pH 미만일 경우, 상기 방법은, 동결 배지의 조정된 pH가 약 6.7 내지 약 8.5이거나, 또는 본원에 기술된 pH 범위 중 임의의 pH이 될 때까지 조정 단계 및 측정 단계를 반복하는 단계를 추가로 포함한다.

상기 또는 본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, pH는 염기를 첨가함에 의하여 조정된다. 일부 구현예에서, 염기는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 탄산나트륨, 중탄산나트륨, HEPES 나트륨 염, 수산화나트륨, 및 수산화칼륨.

상기 또는 본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, 동결 배지 내의 동결방지제는 DMSO, 글리세롤, 프로판디올, 에틸렌 글리콜, 거대분자, 당, 또는 이의 조합이다. 일부 구현예에서, 세포 풀 내의 DMSO 또는 글리세롤의 농도는 약 5 용적% 내지 약 12.5 용적%, 또는 약 5 용적% 내지 약 10 용적%이다.

상기 또는 본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, 세포 풀은 약 8% 내지 약 28%의 충전 세포 용적 (PCV)의 세포 밀도에서의 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충 세포)를 함유한다.

상기 또는 본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, 세포는 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 뮤린 골수종 세포, PER.C6® 인간 세포, 또는 혼성세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 곤충 세포, 예컨대 High Five^TM, S2 (Schneider 2), Sf9, 및 Sf21이다. 상기 또는 본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충 세포)는, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 치료 단백질이다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 항체, 항체 단편, 효소, 및 수용체 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다.

또 다른 구현예에서, 세포를 동결하기 위한 진핵생물 세포 풀 (예컨대, 포유동물 세포 풀, 곤충세포 풀)이 본원에 제공되며, 이는 완충액, 동결방지제, 및 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 진핵생물 세포를 포함하며, 여기서 상기 배지는 세포 동결 전에 약 6.7 내지 약 8.5, 또는 약 7.2 내지 약 8.3의 pH (또는 본원에 기술된 pH 범위 중 임의의 pH)를 갖는다. 일부 구현예에서, 세포는 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 뮤린 골수종 세포, PER.C6® 인간 세포, 또는 혼성세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 곤충 세포, 예컨대 High Five^TM, S2 (Schneider 2), Sf9, 및 Sf21이다. 일부 구현예에서, 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충 세포)는, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 치료 단백질이다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 항체, 항체 단편, 효소, 및 수용체 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다.

또 다른 구현예에서, 복수의 용기를 포함하는 세포 은행이 본원에 제공되며, 각 용기는 하기를 함유한다: (a) 완충제 및 동결방지제를 포함하는 동결 배지, 및 (b) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 진핵생물 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충세포) (여기서, 상기 동결 배지는 세포 동결 전에 약 6.7 내지 약 8.5, 또는 약 7.2 내지 약 8.3의 pH (또는 본원에 기술된 pH 범위 중 임의의 pH)를 가짐). 일부 구현예에서, 용기는 앰플이다. 일부 구현예에서, 세포는 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 뮤린 골수종 세포, PER.C6® 인간 세포, 또는 혼성세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 곤충 세포, 예컨대 High Five^TM, S2 (Schneider 2), Sf9, 및 Sf21이다. 일부 구현예에서, 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충 세포)는, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 치료 단백질이다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 항체, 항체 단편, 효소, 및 수용체 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다.

본원에 기재된 다양한 구현예의 특징 중 하나, 일부 또는 모두는 조합되어 본 발명의 다른 구현예를 형성할 수 있음이 이해되어야 한다. 본 발명의 이들 및 다른 측면은 당해기술의 숙련가에게 분명할 것이다.

도 1은 세포 보관 공정 흐름의 예시를 나타낸다.
도 2a- 2b 는 해동 계대 제1일 생존률 (도 2a) 및 제4일 성장 (PCV) (도 2b) 결과를 나타낸다 (6.6 또는 6.3의 초기 pH에서의 pH 조정된 풀로부터 생성된 세포 은행에 대하여).
도 3A- 3F 는 해동 계대 제1일 생존률 (도 3A, 3C, 3E) 및 하기의 전체 성장 비율: PCV (도 3B, 3D, 및 3F) 대 보관 pH, 및 상이한 항체 (항체 1-9)를 각각 생산하는 9개 CHO 세포주에 걸친 표적 pH의 범위로 pH를 조정하는 효과를 나타낸다.
도 4A- 4B 는 해동 계대 생능 세포 밀도 (VCD) 또는 생능 세포 계수 (VCC) (도 4A) 및 생존률 (%) (도 4B) 경향을 나타내며, 이는 pH 조정이 없는 것과 비교하여, 6.3의 초기 풀 pH로부터 7.5로 pH를 조정하는 것에 대한 효과를 예증한다.
도 5 는 생능 충전 세포 용적 (VPCV) 대 생능 세포 계수 (VCC)의 비율을 나타내며, 이는 풀링 공정 동안 세포 크기를 추산하는 간접적 수단이다. 데이터는, 동결 배지 (FM) 첨가 및 pH 7.3, 7.6 또는 8.0로의 pH 조정의 세포 크기 상에서의 효과를 나타낸다. 보다 큰 비율은 보다 큰 세포 크기를 표지한다.
도 6a- 6b 는 6.4 (표적 6.2) 또는 6.6 (표적 6.7)의 초기 pH에서 pH 조정된 풀로부터 생성된 세포 은행에 대한 PCV 결과에 의한 해동 계대 전체 성장 비율을 나타낸다 (t0 (도 6a) 및 t2 (2 시간) (도 6b) 에서).

동결 배지 내에서의 보관을 위한 진핵생물 세포 (예컨대, 포유동물 세포, 곤충세포 등)을 동결하는 단계를 포함하는, 세포 은행의 해동 회수를 개선하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 상기 동결 배지는 완충액 및 동결방지제를 포함하고, 상기 동결 배지는 동결 전에 약 6.7 내지 약 8.5의 pH를 갖는다.

또한 동결 배지 내에서 세포를 동결하는 단계를 포함하는, 저장을 위하여 진핵생물 세포 (예컨대, 포유동물 세포, 곤충세포 등)을 동결하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 상기 동결 배지는 완충액 및 동결방지제를 포함하고, 상기 동결 배지는 동결 전에 약 6.7 내지 약 8.5의 pH를 갖는다.

또한, 저장 또는 세포 은행의 해동 회수를 개선하기 위하여, 진핵생물 세포 (예컨대, 포유동물 세포, 곤충세포 등)을 동결하는 방법이 본원에 제공되며, 이는 하기 단계를 포함한다: (a) 세포를 함유하는 동결 배지의 pH를 약 6.7 내지 약 8.5의 pH로 조정하는 단계 (상기 동결 배지는 완충액 및 동결방지제를 포함함); 및 (b) 상기 세포를 동결하는 단계.

또한, 저장 또는 세포 은행의 해동 회수를 개선하기 위하여, 진핵생물 세포 (예컨대, 포유동물 세포, 곤충세포 등)을 동결하는 방법이 본원에 제공되며, 이는 하기 단계를 포함한다: (a) 동결 배지의 pH를 약 6.7 내지 약 8.5의 pH로 조정하는 단계 (상기 동결 배지는 완충액 및 동결방지제를 포함함); (b) 상기 세포와 동결 배지를 조합하여 세포 풀을 형성하는 단계; 및 (c) 상기 세포를 동결하는 단계.

또한, 진핵생물 세포 (예컨대, 포유동물 세포, 곤충세포, 등)를 동결하기 위한 진핵생물 세포 풀이 본원에 제공되며, 이는 완충액, 동결방지제, 및 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 진핵생물 세포를 포함하며, 여기서 상기 배지는 세포 동결 전에 약 6.7 내지 약 8.5의 pH를 갖는다.

또한, 복수의 용기를 포함하는 세포 은행이 본원에 제공되며, 각 용기는 하기를 함유한다: (a) 완충제 및 동결방지제를 포함하는 동결 배지, 및 (b) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 진핵생물 세포 (예컨대, 포유동물 세포, 곤충세포 ) (여기서, 상기 동결 배지는 세포 동결 전에 약 6.7 내지 약 8.5의 pH를 가짐).

Ⅰ. 정의

용어 "배지" 및 "세포 배양 배지"는 세포의 유지에 사용되는 용액을 지칭한다. 배지는 추가로 세포 성장에 사용되는 영양 공급원을 포함할 수 있다. 당해기술의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 영양 공급원은 세포가 성장 및/또는 생존에 필요로 하는 성분을 함유할 수 있거나 세포 성장 및/또는 생존에 도움이 되는 성분을 함유할 수 있다. 비타민, 필수 또는 비-필수 아미노산, 미량 원소가 배지 성분의 예이다.

“기본 영양 배지”는 세포 성장 및 생존에 요구되는 기본적 영양분을 포함하는 배지를 지칭한다. 기본 영양 배지의 예시는 하기를 포함한다: 이글스(Eagle's) 최소 필수 배 (EMEM) 및 둘베코(Dulbecco's) 변형된 이글스 배지 (DMEM).

“화학적으로 정의된 세포 배양 배지” 또는 “CDM”은 동물 또는 식물 예컨대 동물 혈청 및 식물 펩톤으로부터 유도된 산물이 없는 명시된 조성물을 갖는 배지이다. 본 분야의 숙련가에 의하여 이해될 것과 같이, CDM은 폴리펩티드 생산 공정에서 사용될 수 있으며, 여기서 세포는 CDM과 접촉하고, 이에 폴리펩티드를 분비한다. 따라서, 조성물은 CDM 및 폴리펩티드 산물을 함유할 수 있고, 폴리펩티드 산물의 존재는 CDM으로 하여금 화학적으로 비정의되도록 하지 않는다.

“화학적으로 비정의된 세포 배양 배지”는 동물 또는 식물 공급원 예컨대 동물 혈청 및 식물 펩톤으로부터 유도된 하나 이상의 산물을 함유할 수 있고, 이의 화학적 조성물이 명시될 수 없는 배지를 지칭한다. 본 분야의 숙련가에 의하여 이해될 것과 같이, 화학적으로 비정의된 세포 배양 배지는 동물 또는 식물로부터 유도된 산물을 영양 공급원으로서 함유할 수 있다.

"동결 배지" 및 "세포 동결 배지", 또는 “동결을 위한 세포 배양 배지”는 동결방지제를 함유하는 완충액을 지칭한다. 동결 배지는, 동결 배지 내에 함유된 세포 (예컨대 포유동물 세포 또는 곤충 세포)를 동결하기 위하여 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, “완충액”은 수계, 등장성, pH 완충된 염 용액을 지칭하며, 이는 세포 막의 완전성을 보존하고, 하나 이상의 동결방지제에 대한 담체로서 작용하기 위하여 작용한다. 동결 배지는 또한 세포 배양 배지에서 발견될 수 있는 추가 성분을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 배지 내의 완충제는 하기를 포함할 수 있다: 중탄산염 완충제, PBS (인산염 완충 식염수), HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판설폰산), TES (N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄설폰산), TRIS (트리스(하이드록시메틸)아미노에탄), TEST (TES/TRIS 콤보), 및 이의 조합. 배지의 예시는 하기를 포함할 수 있다: 이글스(Eagle's) 최소 필수 배 (EMEM) 및 둘베코(Dulbecco's) 변형된 이글스 배지 (DMEM). 동결방지제는 동결 손상으로부터 세포를 보호하고, 하기로 분류될 수 있다: “침투” (혈장 막을 관통할 수 있는 것, 예컨대, 글리세롤, 디메틸 설폭시드 (DMSO), 프로판디올, 에틸렌 글리콜, 등), 또는 “비-침투” (예컨대, 거대분자, 당, 등).

세포의 "배양"은 세포의 생존력 및/또는 성장 및/또는 증식에 적합한 조건 하에 세포를 세포 배양 배지와 접촉시키는 것을 나타낸다.

"뱃치 배양"은 세포 배양을 위한 모든 성분 (세포 및 모든 배양 영양소를 포함)이 배양 과정을 개시할 때 배양 용기에 공급되는 배양법을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, 어구 "유가식(fed batch) 세포 배양"은 세포 및 배양 배지가 배양 용기에 초기에 공급되고, 배양 종료 전에 주기적인 세포 및/또는 생성물 수거의 존재 또는 부재 하에 추가의 배양 영양소를 배양 공정 동안 연속적으로 또는 별개의 증분으로 배양물에 공급하는 뱃치 배양법을 나타낸다.

"관류 배양"은, 세포가, 예를 들면, 여과, 캡슐화, 마이크로캐리어로의 앵커링(anchoring) 등에 의해 배양물에 구속되고, 배양 배지는 배양 용기로부터 연속적으로 또는 간헐적으로 도입되고 제거되는 배양법이다.

“세포 보관” 또는 “보관”은, 세포가 영하의 온도로 동결 (동결보존)되어 효소적/화학적 반응을 중지시켜 이후 사용을 위하여 생능 상태에서 세포를 유지하는 공정이다. 동결된 세포는 이후 사용을 위하여 약 0℃ 미만 (예컨대, -20℃, -70℃, -80℃, 또는 그 미만)에서 저장될 수 있다. 예를 들면, 세포는 -196 ℃에서 액체 질소를 함유하는 동결기 내의 증기 상으로 배치된 앰플 내 저장될 수 있다.

"배양 용기"는 세포를 배양하는데 사용되는 용기를 지칭한다. 배양 용기는 그것이 세포의 배양에 유용하기만 하다면 임의의 크기일 수 있다. 　

본원에 사용된 바와 같이 용어 "역가"는 세포 배양에 의해 생산된 재조합으로 발현된 폴리펩티드의 총량을 주어진 양의 배지 용적으로 나눈 수치를 나타낸다. 역가는 전형적으로 배지 밀리리터당 폴리펩티드 밀리그램 단위로 표시된다.

본원에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같이 "핵산,"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라아제에 의하여, 또는 합성 반응에 의하여, 폴리머로 포함될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 이의 유사체를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 폴리머의 어셈블리 이전 또는 이후 부여될 수 있다.

“단리된 핵산”은 이의 통상적인 문맥 이외의 것 또는 이와 개별적인 비-천연 발생, 재조합, 또는 천연 발생 서열을 의미하고, 포괄한다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 설정 이외의 것이다. 따라서 단리된 핵산 분자는 이것이 천연 세포 내에 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나 단리된 핵산 분자에는, 예를 들면 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 있는, 단백질을 대개 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자가 포함된다.

"단리된" 단백질 (예를 들어, 단리된 항체)는 이의 자연 환경의 성분으로부터 동정 및 분리되고/되거나 회수된 것이다. 그 천연 환경의 오염물질 성분은 단백질에 대한 연구, 진단적 또는 치료적 사용을 방해할 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질이 포함될 수 있다. 단리된 단백질은 재조합 세포 내에서 원위치로 단백질을 포함하는데, 이는 단백질의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나 일반적으로, 단리된 단백질은 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

“정제된” 폴리펩티드는, 폴리펩티드의 순수성이 증가되어, 이로써 이것이 천연 환경 및/또는 실험실 조건 하에서 초기 생산되고/되거나 합성되고/되거나 증폭될 경우에서 존재하는 것보다 더욱 순수한 형태로 존재한다는 것을 의미한다. 순수성은 상대적인 용어이며, 절대적인 순수성을 필연적으로 의미하지 않는다.

“오염물질”은 목적 폴리펩티드 산물과 상이한 물질을 지칭한다. 오염물질은 비제한적으로 하기를 포함한다: 숙주 세포 물질, 예컨대 숙주 세포 단백질; 핵산; 변이체, 목적 폴리펩티드의 단편, 응집체 또는 유도체; 기타 폴리펩티드; 내독소; 바이러스 오염물질; 세포 배양 배지 성분, 등. 오염물질은 또한, 정제 공정에 의하여 도입된 물질, 예컨대 침출된 단백질 A를 포함할 수 있다.

용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 폴리머를 나타내는데 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 폴리머는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 그리고 이는 비-아미노산에 의하여 저해될 수 있다. 상기 용어는 또한 천연적으로 또는 처치(intervention); 예를 들어, 이황화 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예를 들어, 표지화 성분을 사용한 콘주게이트에 의해 변형된 아미노산 폴리머를 포괄한다. 예를 들면, 아미노산 (예를 들면, 비천연 아미노산 등 포함)의 하나 이상의 유사체, 뿐만 아니라 당해기술에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 또한 상기 정의내에 포함된다. 본원의 정의 내에 포함되는 폴리펩티드의 예는 포유동물 단백질, 예를 들면, 예컨대 하기를 포함한다: 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함하는 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰빌레브란트 인자; 항-응고 인자 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨 이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예컨대 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (활성화에 대해 조절된 일반적으로 T-세포 발현된 및 분비된); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러관 억제 물질(Muellerian-inhibiting substance); 릴락신 A-쇄; 릴락신 B-쇄; 프로릴락신; 마우스 성선자극호르몬-관련된 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련된 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자를 위한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 신경친화성 인자 예컨대 골-유도된 신경친화성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자 예컨대 NGF-b; 혈소판-유도된 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 포함하는, 형질전환 성장 인자 (TGF) 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBPs); CD 단백질 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도성 인자; 면역독소; 골 형성 단백질 (BMP); 인터페론 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 집락 자극 인자 (CSF), 예를 들면, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터루킨 (ILs), 예를 들면, IL-1 내지 IL-10; 수퍼록사이드 디스무타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들면, AIDS 봉입체의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 아드레신; 조절 단백질; 인테그린 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련된 항원 예컨대 CA125 (난소암 항원) 또는 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 면역접합체; 및 임의의 상기-열거된 단백질의 단편 및/또는 변이체 뿐만 아니라, 예를 들면, 임의의 상기-열거된 단백질을 포함하는 단백질에 결합하는, 항체 단편을 포함하는 항체.

용어 "항체"는 본원에서 광범위한 의미로 사용되며, 구체적으로는 단클론성 항체 (전장 단클론성 항체 포함), 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내기만 한다면 항체 단편을 포함한다. 항체는 인간, 인간화된 및/또는 친화성 성숙된(affinity matured) 항체일 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 균질 항체 집단으로부터 수득된 항체를 나타낸다, 즉 집단을 이루는 개별 항체는 소량 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단클론성 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해 유도된다. 더구나, 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 유도되는 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 그들의 특이성 이외에도, 단클론성 항체는 이들이 다른 항체에 의해서 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "단클론성"은 임의의 특정한 방법에 의해 항체의 생산을 요하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단클론성 항체는, 예를 들면 혼성세포 방법을 포함하는 다양한 기술 (예컨대, Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 세균, 진핵 동물 또는 식물 세포에서의 재조합 DNA 방법 (참고: 예컨대, 미국 특허 No. 4,816,567); 파지-디스플레이 기술 (참고: 예컨대, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol . 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol . Biol . 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol . Biol . 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl . Acad . Sci . USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol . Methods 284(1-2): 119-132 (2004), 및 인간 면역글로불린 유전자좌(locus) 또는 인간 면역글로불린 서열을 인코딩하는 유전자의 일부 또는 모두를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하기 위한 기술 (참고: 예를 들면, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol . 7:33 (1993); 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; and 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol . 14: 826 (1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol . 13: 65-93 (1995)에 의하여 제조될 수 있다.

용어 "약제학적 제형"은 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 허용하는 형태이고, 제형이 투여될 대상체에 허용 불가능하게 독성이 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 그러한 제형은 무균성일 수 있다.

“약제학적으로 허용가능한” 담체, 부형제, 또는 안정제는, 이용된 투여량 및 농도에서 이에 노출되는 세포 또는 포유동물에 비독성인 것이다 (Remington's Pharmaceutical Sciences (20^th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). 생리학적으로 허용가능한 담체는, 종종, 수성 pH 완충액이다. 생리학적으로 허용되는 담체의 예는 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 겔라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 다른 탄수화물; 킬레이팅제, 예를 들어, EDTA; 당 알콜, 예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예를 들어, 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 및 Pluronics™ 을 포함한다.

본 명세서 및 첨부된 청구항들에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 ("a," "an," 및 "the")는, 그 내용이 다르게 명확히 지시되지 않으면, 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "화합물"에 대한 언급은 2개 또는 그 초과의 그와 같은 화합물의 조합 등을 임의로 포함한다.

본원에 기재된 발명의 측면 및 구현예는 "포함하는(comprising)", "구성되는(consisting) 및 "~로 본질적으로 구성되는"의 측면 및 구현예를 포함하는 것으로 이해된다.

본원에서 "약(about)" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 상기 값 또는 파라미터 그 자체에 관한 구현예를 포함한다 (그리고 기술한다). 예를 들면, "약 X"를 언급하는 기술은 "X"의 언급을 포함한다. 수치적 범위는 상기 범위를 한정하는 숫자를 포함한다.

본 발명의 양태 또는 구현예가 마쿠쉬 군 또는 기타 군의 대안물에 기술되는 경우, 본 발명은 전체로서 열거된 전체 군 뿐만 아니라, 상기 군의 각 개별 구성원 및 주요 군의 모든 가능한 하위 그룹, 또한 상기 그룹 구성원 중 하나 이상이 부재한 주요 군을 포괄한다. 본 발명은 또한 청구된 발명 내의 군 구성원 중 임의의 하나 이상의 명백한 제외를 예상한다.

Ⅱ. 본 발명의 방법 및 용도

세포 동결 배지에서의 보관 또는 저장을 위하여 세포를 냉각하는 방법이 본원에 제공된다. 또한 본원에 제공된 것은 세포 은행의 해동 회수를 개선하는 방법이다. 동결 배지에서 세포를 동결하는 방법으로서, 동결 배지 내에서 상기 진핵생물 세포를 동결하는 단계를 포함하고, 상기 동결 배지는 완충액 및 동결방지제를 포함하고, 세포를 함유하는 상기 동결 배지는 동결 전에 약 6.7 내지 약 8.5 또는 약 6.7 내지 약 8.3의 pH를 갖는다. 방법은 추가로 동결 배지의 pH를 약 6.7 내지 약 8.5 또는 약 6.7 내지 약 8.3까지 조정하는 단계를 포함한다. 본원에 제공된 방법은 마스터 세포 은행 (MCB) 및 제조용 세포 은행 (WCB)를 제조하는데 유용하다. 일부 구현예에서, 한편 본원에서 기재된 바와 같은 방법은 해동 후 세포 생존률 및/또는 세포 성장을 개선한다.

동결 및 보관 공정에서 사용될 진핵생물 세포 (예컨대, 포유동물 세포, 곤충 세포 등)는 본 분야에 공지된 세포 배양 및 농축 프로토콜을 수반한 공정에 의하여 제조될 수 있다. 이러한 방법은 하기의 3 단계를 포함할 수 있다: 세포 보관 전 세포 축적, 수거 및 세포 농축. 세포 축적은 몇몇 방법에 의하여 발생할 수 있다. 일 예시에서 세포 축적을 위한 공정 조절된 생물반응기를 사용될 수 있으나; 기타 방법/배양 용기가 또한 사용될 수 있다 (예컨대, T-플라스크, 진탕 플라스크, 롤러 보틀, 스피너 용기 등). 수거 및 세포 농축은 원심분리 이후 동결 배지 내의 세포 펠렛의 재현탁에 의하여 수행될 수 있다. 또 다른 예시에서, 세포는 중공 섬유 필터 (HFF)를 통하여 단일 단계에서 수거 및 농축될 수 있다. 세포 농축은 또한, 세포 배양 유체 (예컨대, 부유 관류 막, 세포 침강수조, 연속 순환 원심분리물 등)으로부터 배지를 제거하기 위하여 대안적 관류 막/장치의 사용에 의하여 달성될 수 있다. 본원에 기술된 방법 중 일부 구현예에서, 수거 및 세포 농축 공정 또는 수거된 세포 배양 유체는 약 20℃ (예컨대, 하기 중 임의의 것 이하: 약 19℃, 18℃, 17℃, 16℃, 15℃, 14℃, 13℃, 12℃, 11℃, 및 10℃)의 온도로 냉각된다.

펠렛화되거나 농축된 세포는 세포 냉각 전 동결 배지와 이후 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 펠렛화된 세포는 동결 배지 내에서 재현탁될 수 있다. 일부 구현예에서, 농축된 동결방지제를 함유하는 동결 배지는 수거 및 농축된 세포에 첨가될 수 있거나, 또는 수거 및 농축된 세포는 세포 보관을 위하여 농축된 동결방지제를 함유한 동결 배지에 첨가될 수 있다. 동결 배지는 완충액 또는 동결방지제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 동결 배지 내의 완충제는 쌍성이온 완충제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 완충제는 하기로부터 선택된 완충제를 포함할 수 있다: 중탄산염 완충제, PBS (인산염 완충 식염수), HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판설폰산), TES (N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄설폰산), TRIS (트리스(하이드록시메틸)아미노에탄), TEST (TES/TRIS 콤보), 및 이의 조합. 일부 구현예에서, 세포 동결 전 동결 배지 내의 완충제 농도는 약 10 mM 내지 약 50 mM이다. 일부 구현예에서, 세포 동결 전 동결 배지는 하기를 함유한다: 약 10 mM 내지 약 35 mM의 중탄산나트륨 (예컨대, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 또는 약 35 mM (이들의 값 중 임의의 농도 포함)). 일부 구현예에서, 세포 동결 전 동결 배지는 하기를 함유한다: 약 10 mM 내지 약 50 mM의 HEPES (예컨대, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 또는 약 50 mM, (이들의 값 중 임의의 농도 포함)). 일부 구현예에서, 세포 동결 전 동결 배지는 하기를 함유한다: 약 10 mM 내지 약 12 mM PBS (예컨대, 약 10 mM, 약 11 mM, 또는 약 12 mM (이들의 값 중 임의의 농도 포함)). 일부 구현예에서, 세포 동결 전 동결 배지는 하기를 함유한다: 약 10 mM 내지 약 20 mM의 MOPS (예컨대, 약 10 mM, 약 12 mM, 약 15 mM, 약 18 mM, 또는 약 20 mM (이들의 값 중 임의의 농도 포함)). 일부 구현예에서, 세포 동결 전 동결 배지는 하기를 함유한다: 약 10 mM 내지 약 30 mM의 TES (예컨대, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 또는 약 30 mM (이들의 값 중 임의의 농도 포함)). 일부 구현예에서, 세포 동결 전 동결 배지는 하기를 함유한다: 약 10 mM 내지 약 30 mM의 TRIS (예컨대, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 또는 약 30 mM (이들의 값 중 임의의 농도 포함)). 일부 구현예에서, 세포 동결 전 동결 배지는 하기를 함유한다: 약 10 mM 내지 약 30 mM의 TEST (예컨대, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 또는 약 30 mM (이들의 값 중 임의의 농도 포함)). 일부 구현예에서, 동결방지제는 침투제 또는 비-침투제이다. 일부 구현예에서, 동결방지제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 제제이다: 글리세롤, 디메틸 설폭시드 (DMSO), 프로판디올, 에틸렌 글리콜 및 당. 일부 구현예에서, 수거 및 농축된 세포에 첨가된 동결 배지는 농축된 동결 배지이다. 일부 구현예에서, 농축된 동결방지제를 함유하는 동결 배지는 20-30% (v/v) 디메틸설폭시드 (DMSO) 또는 글리세롤을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 농축된 동결 배지는 (예컨대, 하기 용적의 1 부분 동결 배지 (농축된 동결방지제 함유): 3 부분 세포 배양 유체) 수거 및 농축된 세포에 부어진 동결 배지이다. 일부 구현예에서, 세포 동결 전 세포를 함유하는 동결 배지는 약 5% 내지 약 12.5%의 DMSO 또는 글리세롤을 함유한다.

일부 구현예에서, 동결 배지는 또한 세포 배양 배지에서 발견될 수 있는 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 동결 배지는 하기를 함유할 수 있다: 이글스(Eagle's) 최소 필수 배 (EMEM) 또는 둘베코(Dulbecco's) 변형된 이글스 배지 (DMEM).

일부 구현예에서, 동결을 위하여, 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충세포)를 제조하는 방법은 추가로 하기 단계를 포함한다: 동결 배지 또는 농축된 동결방지제를 함유하는 동결 배지의 pH를 조정하는 단계 (상기 pH는 상기 펠렛화된 세포 또는 농축된 세포가 동결 배지 또는 농축된 동결방지제를 함유하는 동결 배지와 조합되기 전에 약 6.7 내지 약 8.5로 조정됨). 일부 구현예에서, 동결을 위하여, 세포 (예컨대, 포유동물 세포, 곤충세포 등)를 제조하는 방법은 추가로 하기 단계를 포함한다: 세포를 함유하는 동결 배지의 pH를 조정하는 단계 (동결 배지의 pH는 약 6.7 내지 약 8.5로 조정됨). 일부 구현예에서, 조정된 pH는 표적 pH 또는 측정된 pH이다.

특정 구현예에서, 동결 전 세포 밀도는 충전 세포 용적 (PCV)에 의하여 측정된다. 일부 구현예에서, 저장될 세포를 포함하는 동결 배지는 동결 전 하기의 PCV 세포 밀도를 갖는다: 8% 내지 28% (예컨대, 약 8%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 28% 중 임의의 것). 일부 구현예에서, 동결 전 동결 배지 내의 세포 밀도는 약 21% PCV일 수 있다.

일부 구현예에서, 동결 배지 내의 세포는 동결 전 앰플 또는 단일-사용 백에 분배될 수 있다. 예시적 구현예에서, 상기 공정은 하기를 포함한다: 오토클레이브를 자가-충전 주사기를 사용한 습식 얼음 상에 배치된 오토클레이브 유리 앰플로 세포 현탁제를 분배하는 것, 앰플을 밀봉하는 것, 통합 시험을 수행하는 것, 속도-조절 냉각기 내 앰플을 동결하는 것, 및 이후 장기 보관을 위하여 액체 질소 냉각기에 앰플을 전달하는 것.

일부 구현예에서, 해동 후 세포 생존률은 본원에 기술된 방법을 사용함에 의하여 개선된다. 일부 구현예에서, 수거 공정 및 해동 동안 수거 세포 배양물의 냉각 없이, 및/또는 6.7의 pH를 갖는 동결 배지 내에 동결 후의 세포 생존률과 비교하여, 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 85% 중 임의의 것 만큼 증가한다.

pH 조정

본원에 기술된 방법에 따라서, (세포 함유 또는 비함유) 동결 배지의 pH는 예를 들어, 배지에 염기를 첨가함에 의하여 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 동결 배지의 pH는 약 6.7 초과인 pH로 조정된다. 일부 구현예에서, 동결 배지의 pH는 약 6.7 내지 약 8.5의 pH (표적 pH 또는 측정된 pH)로 조정된다. 일부 구현예에서, 동결 배지의 pH는 하기 pH로 조정된다: 약 6.8 내지 약 8.3, 약 6.9 내지 약 8.3, 약 7.0 내지 약 8.3, 약 7.1 내지 약 8.3, 약 7.2 내지 약 8.3, 약 7.3 내지 약 8.3, 약 7.4 내지 약 8.3, 약 7.5 내지 약 8.3, 약 7.6 내지 약 8.3, 약 7.7 내지 약 8.3, 또는 약 7.8 내지 약 8.3 일부 구현예에서, 동결 배지의 pH (표적 pH 또는 측정된 pH)는 하기 pH로 조정된다: 약 7.2 내지 약 7.8. 일부 구현예에서, 표적 pH 또는 측정된 pH는 약 7.2 내지 약 8.3이다. 일부 구현예에서, 표적 pH 또는 측정된 pH는 약 7.2 내지 약 7.8 (예컨대 약 7.5의 pH)이다. 일부 구현예에서, 제1 pH 조정은 표적 pH 범위 (예컨대, 약 7.3 내지 약 7.7의 pH)로의 pH를 증가하기에 충분하지 않을 경우, 제2 pH 조정이 수행된다. 일부 구현예에서, 1 초과의 pH 조정이 수행될 수 있다.

pH를 조정하기 위하여 첨가된 염기는 본 분야에 숙련가에게 잘 알려진 임의의 염기일 수 있으나, 예시적 구현예에서, 염기는 탄산나트륨, 중탄산나트륨, HEPES 나트륨 염, 수산화나트륨, 및 수산화칼륨이다.

동결 배지의 pH는 동결 전 임의의 시점에서 측정될 수 있고, pH는 동결 전 임의의 시점에서 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 동결 배지의 pH는 저장될 세포로의 조합 전 측정되고/되거나 조정된다. 다른 구현예에서, 동결 배지의 pH는 저장될 세포로의 조합 후 측정되고/되거나 조정된다. 일부 구현예에서, 동결 배지의 pH는 1회 초과로 측정되고/되거나 조정된다. 일부 구현예에서, 동결 배지의 pH는 동결 전 2, 3회 이상 측정되고/되거나 조정된다. 다른 구현예에서, 동결 배지의 pH는 저장될 세포로의 조합 전과 후에 측정되고/되거나 조정된다. 일부 구현예에서, pH는 하기 공식에 따라 조정된다: V_base = C_base*V_p (pH_t - pH_i), 여기서 C_base 는 염기-특정 계수이고, V_base 는 동결 배지에 첨가되는 염기의 용적이고, V_p 는 동결 배지의 용적이고, pH_t 는 표적 pH이며, 그리고 pH_i 는 초기 pH이다. 본원에 사용된 바와 같이, 초기 pH는, pH가 동결을 위하여 조정되기 전에, 세포를 함유하는 동결 배지의 pH (즉, 이것이 세포에 조합된 후) 이다. C_base 는 pH 조정을 위하여 선택된 염기의 유형 및 농도에 따라 달라지는 특정 계수를 나타낸다. C_base 계수는 염기의 선택에 따라 수득될 수 있다. 예시적 구현예에서, 염기는 1M 탄산나트륨일 경우, pH 조정은 하기 식 1에 따라 수행된다:

식 1: pH 조정을 위하여 첨가된 염기 용적의 산출

여기서 V_Na2CO3 는 동결 배지에 첨가되는 1M 탄산나트륨의 용적이고, V_p 는 동결 배지의 용적이고, pH_t 는 표적 pH이며, 그리고 pH_i 는 초기 pH이다. 초기 pH는, pH가 동결을 위하여 조정되기 전에, 세포를 함유하는 동결 배지의 pH (즉, 이것이 세포에 조합된 후) 이다. 동결 배지의 표적 pH는 생리학적 pH 예컨대 7.2 초과의 pH인 pH일 수 있다. 일부 구현예에서, 동결 배지의 표적 pH는 7.2 내지 8.3이다. 일부 구현예에서, 동결 배지의 표적 pH는 7.2 내지 7.8이다. 일부 구현예에서, 동결 배지의 표적 pH는 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 및 8.3 중 임의의 것에서의 것이다.

동결 배지의 pH는 본 분야에 공지된 방법들을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 배지의 pH는 하기 상에 측정될 수 있다: BioProfile® 400 (Nova Biomedical) 또는 BioProfile® FLEX (Nova Biomedical) 분석기. 본원에 사용된 바와 같이, 본 출원에서의 pH에 대한 모든 참조사항 (측정된 pH, 표적 pH, 조정된 pH 및 초기 pH)은 하기로 조정된 샘플 온도로 수행된 pH 측정을 지칭한다: 약 37℃ (예컨대, 36℃ 및 38℃ 또는 35℃ 및 39℃).

Ⅲ. 동결 배지

본원에 제공된 세포 동결 배지는 하기에서의 사용을 발견할 수 있다: 방법 (예컨대 진핵생물 세포 (예컨대, 포유동물 세포, 곤충세포 등)을 동결하는 방법); 및/또는 진핵생물 세포 (예컨대, 포유동물 세포, 곤충세포 등)를 포함하는 세포 은행의 해동 회수를 개선하는 방법, 및 조성물 (예컨대, 완충액, 동결방지제 및 진핵생물 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충세포)를 포함하는 세포 풀).

일부 구현예에서, 본원에 기술된 동결 배지는 완충액 및 동결방지제를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충제는 쌍성이온 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 완충제는 PBS, HEPES, TES, TRIS, 및 TEST를 포함한다.

동결 배지는 본 분야에 공지되고 본원에 기술된 임의의 동결 방지제, 예컨대 DMSO, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 비-침투성 거대분자, 당 등을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 저장될 세포와의 조합 후 세포 동결 배지 내의 DMSO 또는 글리세롤의 농도는 5%-12.5% 용적% (v/v)이다. 일부 구현예에서, 동결 배지는 농축된 완충제 및/또는 동결방지제를 함유하는 동결배지를 농축된 세포에 첨가함에 의하여 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 농축된 동결방지제를 함유하는 동결 배지는 약 20% 내지 약 30% (v/v)의 DMSO 또는 글리세롤을 함유할 수 있다.

일부 구현예에서, 동결 배지는 또한 세포 배양 배지에서 발견될 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 포유동물 세포를 배양하기에 적합한 Ham's F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코 변형된 이글 배지 ([DMEM], Sigma)가 포유동물 세포를 동결하기 위한, 본원에 기술된 동결 배지에 첨가될 수 있다. 또한, 임의의 배지가 하기에 기술되며: Ham and Wallace, Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes and Sato, Anal. Biochem., 102:255 (1980), Vijayasankaran et al., Biomacromolecules., 6:605:611 (2005), Patkar et al., J Biotechnology, 93:217-229 (2002), 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 또는 4,560,655; WO 90/03430; WO 87/00195; 미국 특허 번호 Re. 30,985; 또는 미국 특허 번호 5,122,469 (이들 모두의 개시내용은 그 전체가 참고로써 본원에 편입되어 있음), 본원에 상세화된 바와 같이 보충 또는 변형될 수 있다.

숙련가에 의하여 이해될 것과 같이, 본원에서 상세화된 세포 동결 배지는 세포 배양 또는 동결에 유용한 기타 성분을 포함할 수 있다.　 예를 들어, 배지는 예컨대 하기와 같은 추가 성분을 포함할 수 있다는 것이 이해된다: 예컨대 아미노산 (예컨대, 글루타민, 아르기닌, 또는 아스파라긴), 비타민 (비제한적으로 하기를 포함: 비타민 B 예컨대 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B7, 비타민 B9, 또는 비타민 B12 중 하나 이상의 임의의 것), 전이 금속 (비제한적으로 하기를 포함: 니켈, 철 (예컨대, 제2철 철 또는 제1철 철), 또는 아연), 및 기타 배지 성분. 본원에 제공된 임의의 배지는 또한 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 이온 (예컨대 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 버퍼 (예컨대 HEPES), 뉴클레오시드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상적으로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 상응하는 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 제공된 동결 배지는 식물 또는 동물로부터 유래된 단백질을 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 동결 배지는 식물 또는 동물로부터 유래된 단백질을 함유하지 않는다. 임의의 다른 필수적인 보충물을 또한 당해기술의 숙련가에게 공지된 적절한 농도로 포함할 수 있다.

본원에 기술된 세포 동결 배지 (세포 풀)은 추가로 저장될 하나 이상의 세포를 추가로 포함할 수 있다. 예시적 구현예에서, 이러한 세포는 포유동물 세포 예컨대 CHO 세포이다. 본원에 기술된 방법에서 용도를 발견할 수 있는 예시적 세포 유형은 하기를 포함한다: 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 뮤린 골수종 세포, PER.C6® 인간 세포, 또는 혼성세포. 또 다른 예시적 구현예에서, 이러한 세포는 곤충 세포, 예컨대 High Five^TM, S2 (Schneider 2), Sf9, 및 Sf21이다. 일부 구현예에서, 세포는 폴리펩티드 (예컨대 치료 단백질)을 암호화하는 이종성 핵산을 포함하는 재조합 세포이다. 본 분야의 숙련가가 이해할 것과 같이, 이러한 세포는 추가로 재조합 플라스미드 또는 기타 유용한 생물학적 화합물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 저장될 세포는 하기의 생산에 유용할 수 있다: 치료 단백질, 및 생물학적 산물 예컨대 항체, 항체 단편, 효소, 수용체 융합 단백질, 또는 이의 단편.

IV. 진핵생물 세포 및 세포 은행

또한 본원에 제공된 것은 세포 은행으로서, 복수의 용기를 포함하고, 각 용기는 하기를 함유한다: 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 (예컨대, 이종성 핵산)을 포함하는 진핵생물 세포 (예컨대 포유동물 세포, 곤충 세포, 등)를 함유하는 동결 배지 (여기서, 상기 배지는 세포 동결 전에 약 6.7 내지 약 8.5의 pH를 가짐). 세포 은행은 예비은행, 마스터 세포 은행 (MCB) 또는 제조용 세포 은행 (WCB)일 수 있다. 예비은행은 하기를 포함할 수 있다: MCB가 제조된 특정 폴리펩티드를 생산하는 세포를 함유하는 동결 (예컨대 액체 질소 동결기에 저장)된 용기 (예컨대, 앰플)을 포함할 수 있다. MCB는 하기를 포함할 수 있다: 예비은행의 하위배양물로부터 유래되고, 생산을 위하여 모든 차후 세포가 유래된 세포 배양물을 함유하는 동결 (예컨대 액체 질소 동결기에 저장)된 용기 (예컨대 앰플). MCB는 cGMP에 따라 생산 및 저장될 수 있고, 폴리펩티드 산물의 생성을 위하여 사용될 수 있다. WCB는 하기를 포함할 수 있다: MCB의 하위배양물 유래의 세포 배양물을 함유하는 동결 (예컨대 액체 질소 동결기에 저장)된 용기 (예컨대 앰플). WCB는 cGMP에 따라 생산 및 저장될 수 있고, 폴리펩티드 산물의 생성을 위하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 용기는 앰플이다.

본원에 기술된 바와 같이 동결 배지 내에서 동결될 수 있고, 저장될 수 있는 진핵생물 세포 (예컨대, 포유동물 세포, 곤충 세포 등)는 폴리펩티드 생산을 위하여 유용하고/하거나 배양될 수 있는 임의의 진핵생물 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. CHO 세포는 비제한적으로 하기를 포함할 수 있다: DHFR^- CHO 세포 (Urlaub et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 77:4216 (1980)), 예컨대, ATCC^® CRL-9096^TM; 및 CHO-K1 (ATCC^® CRL-61^TM).

포유동물 세포의 다른 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 변형된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주 (예를 들면, 293개 세포 또는 현탁 배양물 내 성장을 위하여 하위-클로닝된 293개 세포, Graham et al., J. Gen Virol . 36:59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol . Reprod . 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y . Acad . Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2). 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 골수종 세포주 예컨대 NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들면, 하기를 참조한다: Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268.

일부 구현예에서, 세포는 곤충 세포주, 예컨대 High Five^TM, S2 (Schneider 2), Sf9, 및 Sf21이다.

일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충 세포)는, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 (예컨대, 이종성 핵산)을 포함하고, 세포는 폴리펩티드 생산에 유용하다. 일부 구현예에서, 핵산은 세포 내로 도입된다. 세포내로의 핵산 도입을 위한 본 분야에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포는 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는, 벡터 (예컨대, 발현 벡터)로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 안정한 세포주이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 항체, 항체 단편, 효소, 및 수용체 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다.

폴리펩티드의 예는 포유동물 단백질, 예를 들면, 예컨대 하기를 포함한다: 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함하는 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰빌레브란트 인자; 항-응고 인자 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨 이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예컨대 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (활성화에 대해 조절된 일반적으로 T-세포 발현된 및 분비된); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러관 억제 물질(Muellerian-inhibiting substance); 릴락신 A-쇄; 릴락신 B-쇄; 프로릴락신; 마우스 성선자극호르몬-관련된 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련된 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자를 위한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 신경친화성 인자 예컨대 골-유도된 신경친화성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자 예컨대 NGF-b; 혈소판-유도된 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 포함하는, 형질전환 성장 인자 (TGF) 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP); CD 단백질 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도성 인자; 면역독소; 골 형성 단백질 (BMP); 인터페론 예컨대 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 집락 자극 인자 (CSF), 예를 들면, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터루킨 (IL), 예를 들면, IL-1 내지 IL-10; 수퍼록사이드 디스무타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들면, AIDS 봉입체의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 아드레신; 조절 단백질; 인테그린 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련된 항원 예컨대 CA125 (난소암 항원) 또는 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 면역접합체; 및 임의의 상기-열거된 단백질의 단편 및/또는 변이체 뿐만 아니라, 예를 들면, 임의의 상기-열거된 단백질을 포함하는 단백질에 결합하는, 항체 단편을 포함하는 항체.

일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충 세포)는, 항체를 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 단클론성 항체이다. 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 항체의 특징을 시사하며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단클론성 항체는, 예를 들면 혼성세포 방법을 포함하는 다양한 기술 (예컨대, Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법 (참고: 예컨대, 미국 특허 No. 4,816,567), 파지-디스플레이 기술 (참고: 예컨대, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol . 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol . Biol . 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol . Biol . 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl . Acad . Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol . Methods 284(1-2): 119-132 (2004)), 및 인간 면역글로불린 유전자좌(locus) 또는 인간 면역글로불린 서열을 인코딩하는 유전자의 일부 또는 모두를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하기 위한 기술 (참고: 예를 들면, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl . Acad . Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol . 7:33 (1993); 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; and 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol . 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol . 14: 826 (1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol . 13: 65-93 (1995)에 의하여 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 인간화된 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 라이브러리-유도된(library-derived) 항체 또는 다중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 이의 항원-결합 단편이다. 항원-결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇 개의 잔기를 부가함으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 그룹을 갖는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 본래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다. "Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. "단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하며, 그것은 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다. scFv의 재고를 위해, 예를 들어, 하기를 참고한다:

, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315. 상기 기재된 항체를 정제하는 복수의 방법은 항원-결합 항체 단편을 정제하기 위해 적절하게 조정될 수 있다.

일부 구현예에서, 세포 (예컨대, 포유동물 세포 또는 곤충 세포)서의 핵산에 의하여 암호화된 항체는 치료적 또는 진단적 항체를 포함한다. 본 발명의 범위 내의 항체는 비제한적으로 하기를 포함한다: 트라스투주맙 (HERCEPTIN®)을 포함하는 항-HER2 항체 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992), 미국 특허 No. 5,725,856); 항-CD20 항체 예컨대 키메라성 항-CD20 "C2B8” (미국 특허 번호 5,736,137에 기술됨; RITUXAN®), 2H7 항체의 키메라성 또는 인간화된 변이체 (미국 특허 번호 5,721,108B1, 또는 토시투모맙 (BEXXAR®); 항-IL-8 (St John et al., Chest, 103:932 (1993), 및 국제공개 번호 WO 95/23865에 기술됨); 인간화된 및/또는 친화도 성숙된 항-VEGF 항체, 예컨대 항-VEGF 항체 huA4.6.1 AVASTIN®를 포함하는 항-VEGF 항체 (Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992), 국제공개 번호 WO 96/30046, 및 WO 98/45331, (1998년 10월 15일 공개)); 항-PSCA 항체 (WO01/40309); 항-CD40 항체 (S2C6 및 이의 인간화된 변이체 포함 (WO00/75348); 항-CD11a (미국 특허 번호 5,622,700, WO 98/23761, Steppe et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991), 및 Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)); 항-IgE (Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993), 및 국제공개번호 WO 95/19181); 항-CD18 (미국 특허 번호 5,622,700 (1997년 4월 22일 발행), 또는 WO 97/26912 (1997년 7월 31일 공개)); 항-IgE (하기를 포함: E25, E26 및 E27; 미국 특허 번호 5,714,338 (1998년 2월 3일 발행) 또는 미국 특허 번호 5,091,313 (1992년 2월 25일 발행), WO 93/04173 (1993년 3월 4일 공개), 또는 국제 출원 번호 PCT/US98/13410 (1998년 6월 30일 출원), 미국 특허 번호 5,714,338); 항-아포-2 수용체 항체 (WO 98/51793 (1998년 11월 19일 공개)); 항-TNF-α 항체 (cA2 포함) (REMICADE®), CDP571 및 MAK-195 (참고: 미국 특허 번호 5,672,347 (1997년 9월 30일 발행), Lorenz et al., J. Immunol. 156(4):1646-1653 (1996), 및 Dhainaut et al., Crit. Care Med. 23(9):1461-1469 (1995)); 항-조직 인자 (TF) (유럽 특허 번호 0 420 937 B1 (1994년 11월 9일 등록); 항-인간 α₄β₇ 인테그린 (WO 98/06248 (1998년 2월 19일 공개); 항-EGFR (키메라화된 또는 인간화된 225 항체, WO 96/40210, 1996년 12월 19일 공개); 항-CD3 항체 예컨대 OKT3 (미국 특허 번호 4,515,893, 1985년 5월 7일 발행); 항-CD25 또는 항-tac 항체 예컨대 CHI-621 (SIMULECT®) 및 (ZENAPAX®) (참고: 미국 특허 번호 5,693,762, 1997년 12월 2일 발행); 항-CD4 항체 예컨대 cM-7412 항체 (Choy et al., Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996)); 항-CD52 항체 예컨대 캄파쓰-1H (Riechmann et al., Nature 332:323-337 (1988)); 항-Fc 수용체 항체 예컨대 Fc.감마.RI 지향된 M22 항체 (Graziano et al., J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995)); 항-암종배아 항원 (CEA) 항체 예컨대 hMN-14 (Sharkey et al., Cancer Res. 55(23 Suppl): 5935s-5945s (1995); 유방 상피 세포 지향된 항체 (huBrE-3, hu-Mc 3 및 CHL6 포함) (Ceriani et al., Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995); 및 Richman et al., Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995)); 결장 암종 세포 예컨대 C242에 결합하는 항체 (Litton et al., Eur J. Immunol. 26(1): 1-9 (1996)); 항-CD38 항체, 예를 들면 AT 13/5 (Ellis et al., J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)); 항-CD33 항체 예컨대 Hu M195 (Jurcic et al., Cancer Res 55(23 Suppl)5908s-5910s (1995) 및 CMA-676 또는 CDP771; 항-CD22 항체 예컨대 LL2 또는 림포사이드(Lymphocide) (Juweid et al., Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s (1995)); 항-EpCAM 항체 예컨대 17-1A (PANOREX®); 항-GpIIb/IIIa 항체 예컨대 압식시맙 또는 c7E3 Fab (REOPRO®); 항-RSV 항체 예컨대 MEDI-493 (SYNAGIS®); 항-CMV 항체 예컨대 PROTOVIR®; 항-HIV 항체 예컨대 PRO542; 항-간염 항체 예컨대 항-Hep B 항체 OSTAVIR®; 항-CA 125 항체 오바렉스(OvaRex); 항-이디오타입 GD3 에피토프 항체 BEC2; 항-αvβ3 항체 VITAXIN®.; 항-인간 신장 세포 암종 항체 예컨대 ch-G250; ING-1; 항-인간 17-1A 항체 (3622W94); 항-인간 결장직장 종양 항체 (A33); GD3 강글리오사이드 지향된 항-인간 흑색종 항체 R24; 항-인간 편평상피-세포 암종 (SF-25); 및 항-인간 백혈구 항원 (HLA) 항체 예컨대 스마트(Smart) ID10 및 항-HLA DR 항체 온코림(Oncolym) (Lym-1). 본원의 항체에 대한 바람직한 표적 항원은 하기이다: HER2 수용체, VEGF, IgE, CD20, CD11a, 및 CD40.

하기 예는 본 발명을 예시하기 위해 그러나 제한하지 않기 위해 제공된다.

실시예

실시예 1: 해동된 세포 생존률에 대한, 풀 pH, 보유 온도 및 보유 시간의 효과

보관 pH를 조절하기 위한 염기 첨가 방법 ( 소범위 연구 #1)

연구를, 해동 회수를 개선하기 위하여, 가장 불량한 경우로부터의 단순 pH 조정 및 전형적인 풀 조건 (6.2 및 6.7의 표적화된 초기 pH 각각)을 수행하는 실행가능성을 측정하기 위하여 실행하였다. 복수의 pH 조정 표적을, 최적 보관 pH를 측정하기 위하여 연구하였다. pH를 37℃로 설정된 온도로 BioProfile® 400 (Nova Biomedical) 기기를 사용하여 측정하였다. 유사하게, 식 1을 사용한 pH 산출은 37℃의 샘플 온도를 기준으로 한다.

세포를 원심분리를 통해 펠렛화하였다. 세포 풀을 각 시험 조건에 대해 사용한 배지 중 세포를 100x10⁶ 세포/mL를 재현탁함에 의하여 생성하였다. 세포 풀을, pH를 초기 pH 조건 (6.2 또는 6.7)으로 구동하기 위하여, CO₂/O₂ 교환을 위한 가스 투과성 막의 존재 또는 부재 하에서 37℃에서 진탕하였다. 초기 pH 표적에 도달할 경우, 풀을 재빨리 <10℃로 냉각하고, 20% (v/v) DMSO 동결 배지를 첨가하였다 (1:3 부분 세포 배양 유체). pH 조정을 식 1을 사용하여 수행하여 6.9, 7.1, 및 7.3의 표적 pH로의 1M 탄산나트륨의 필요 용적을 산출하고, 최종 오프라인 pH 측정을 모방 은행 생성 (실제 보관 pH는 6.9, 7.1/7.2 및 7.5이었음) 이전의 pH에서의 적절한 증가를 확인하기 위하여 수행하였다.

해동 결과는 하기를 나타냈다: 68% 이하의 제1일 생존률에서의 현저한 개선 (pH 6.2 내지 7.5로의 조정을 위하여 24% 내지 92%) (도 2a), 0.64% 이하의 제4일 PCV에서의 현저한 개선 (pH 6.2 내지 7.5로의 조정을 위하여 0.17% 내지 0.81%) (도 2b).

식 1: pH 조정을 위하여 첨가된 염기 용적의 산출

여기서 V_Na2CO3 는 첨가되는 1M 탄산나트륨의 용적이고, V_p 는 풀의 용적이고, pH_t 는 표적 pH이며, pHi 는 초기 pH이다,

저장 pH를 조절하기 위한 염기 첨가 방법 (추가의 소범위 pH 연구)

상기 기술된 유사한 절차에 따라, 몇몇의 연구가 추가 세포주에서의 pH 조정의 효과를 연구하기 위해 실행하였다.

총 9개 CHO 세포주 (다양한 세포 유형 (DP12, CHO-K1) 포함)를 선택하였다. 보관 이전 시간에서는, 세포를 표준 프로토콜에 따라 유지하였다. 세포를 원심분리를 통하여 펠렛화하고, 대략 60-90 mL의 모방 풀을 각 시험 조건에 대해 사용한 배지 중 28% 충전 세포 용적 (PCV)까지 재현탁함에 의하여 생성하였다. 풀을, pH를 초기 pH 조건 (6.2 또는 6.7)으로 구동하기 위하여, CO₂/O₂ 교환을 위한 가스 투과성 막의 존재 또는 부재 하에서 37℃에서 진탕하였다. 이러한 2개의 초기 pH 설정 시점을 가장 불량한 경우를 시뮬레이션하기 위하여 선택하였고, 전형적인 조건을 중공-섬유 필터 농축 동안 및 이후 수행하였다. 초기 pH 표적에 도달할 경우, 풀을 재빨리 <10℃로 냉각하고, 20% (v/v) DMSO 동결 배지를 21%의 최종 PCV에 도달하기 위하여 첨가하였다 (1:3 부분 세포 배양 유체). pH 조정을, 식 1을 사용하여 7.0, 7.3, 7.6, 또는 8.0의 표적 pH로의 조정을 위한 1M 탄산나트륨의 필요 용적을 산출한 후 수행하였다. 최종 오프라인 pH 측정을 세포 은행 생성 이전의 pH에서의 적절한 증가를 확인하기 위하여 수행하였다.

모든 경우에서, 1개 앰플을 각 용기에 해동하여, 2부로 해동하였다. 결과를 하기를 예증하였다: 보다 낮은 pH로 이전에 노출된 전체 세포 유형은, 보관 전 7.3 초과의 pH 값으로 조정될 경우, 회수될 수 있다. 각 세포주는 보관 pH에 대한 상이한 민감도를 예증하였다. 대략 7.5의 pH로의 조정은 하기를 유발하였다: 대부분의 경우 80% 초과의 제1일 해동 생존률 (도 3A-3F 및 도 4A- 4B). 해동 후 성장 비율은 시험된 pH 범위의 하부 단부에서만 영향을 받았다. 흥미롭게도, 시험된 pH 범위의 상부 단부 (8.0 - 8.2 근접)에서는 정상 생리학적 pH를 현저하게 초과함에도 불구하고 해동 회수에 부정적인 영향을 받지 않았다.

(CHO-K1 세포 유형을 시험하는) 연구는 높은 pH에 대한 장기간 노출에 관한 보다 많은 정보를 포집하기 위해 연장되었다. 이러한 연구는 하기를 시험하였다: 모방 은행 ((t0) pH 조정 (전체 이전의 소규모 시험 케이스와 유사함) 직후 및 2 시간 (t2) 후 제2 시점에서 동결됨). 2시간의 보유 동안, 미니어쳐 풀 (경우 당 대략 10 mL)를 습식 얼음에 잠긴 Falcon® 튜브 내에 보유하였다. 0.2 pH 단위 이하의 변화를 유발하는 보유 단계에 걸쳐 경미한 pH 이동이 존재했다. 이러한 연구로부터의 결과는, 이러한 연구에서 시험된 pH 범위에 대한 2시간의 노출이 영향이 없다는 것을 표지하였다 (일 예시는 하기에 나타난다: 도 6A-6B).

수거 동안 세포 배양 유체를 냉각하는 방법

냉각 열교환기와 조합된 “느린 펌프 수거” 공정을 냉각 능력을 전통적 세포 보관 공정에 도입하기 위하여 선택하였다. 특히, “느린 펌프 수거” 공정은 전형적 수거 유동 속도를 대략 4L/min 내지 600mL/min으로 감소시켜 전통적 세포 보관 생산 수행에 대하여 기록된 수거 속도와 매칭하는 것을 요구한다. 냉각 열교환기 라인, 습식 얼음 내에 완전히 잠긴, 15’길이의 크기 15 백금-경화된 실리콘 튜빙을 수거 유동통로에 삽입하였다. 물로의 모방 수행 동안 수득된 온도 경향은, 상기 “냉각 수거 공정”이 중공-섬유 필터 농축 전에 처음 30분 내에서 대략 12℃로 배양 온도를 감소시킬 수 있다는 것을 예증하였다. 10℃에서의 데이터를 기준으로, 냉각 능력은 세포 대사를 연기하고 낮은 pH 이동을 예방할 가능성이 크다.

공정 확인 연구 결과

세포 보관 공정. 세포 은행은 뱃치/관류 세포 배양 공정에서 우선 현탁-적응된 CHO 세포를 축적하고, 이후 보관을 위하여 세포를 수거함으로써 생산된다. 세포의 초기 공급원은 MCB 유래 (WCB 생성을 위한)의 것이다. 이러한 공정은 하기의 3 단계를 포함한다: 세포 축적, 수거 및 세포 농축, 및 세포 보관. 세포 축적 단계의 목적은 단일 뱃치 내의 전체 크기의 MCB 또는 WCB (420 x 1 mL 또는 10 mL 앰플 각각)의 생산을 위하여 요구되는 세포 수를 생성하기 위한 것이다. 세포를 초기 규모 확대 동안의, 그리고 생물반응기 진탕 공정 동안의 선택적 시드 트레인 배지 (selective seed train media)에서 배양하였다. 수거 공정 단계는 보관을 위하여 요구되는 세포 밀도까지, 중공 섬유 필터 (HFF)를 통하여 최종 세포 배양 유체를 농축하기 위하여 작용한다. 차후의 풀링(pooling) 및 충전 공정은 장기간 보관을 위하여 세포 은행 앰플을 제조하기 위하여 작용한다. 풀링 공정을, 특정 온도 범위 (약 5-10℃)가 유지되도록 습식 얼음 상에서서 유지하였다. 상기 공정에 대한 공정 유통도는 도 1에 나타난다.

수거 및 세포 농축 공정은 중공-섬유 필터 카트리지를 사용하여 수행하였다. 오프라인 pH 경향은 하기를 나타내었다: “냉각 수거 공정”은 세포 농축 동안 대략 0.35 pH 단위 만큼 pH를 감소시키는데 효과적이다 (본래의 것 및 “냉각” 공정 각각에 대해 ~6.30 내지 6.66). pH 조정 후, 냉각된 세포 은행을, 세포 풀 보유 pH의 일시적 영향에 대해 확인하기 위하여 조기 (제0분) 및 후기 (제120분)에서 생성하였다.

생성된 세포 은행을 1차 배양물 내에서의 성능에 대해 평가하였다. 세포 은행 앰플을 일련의 1:250 희석 (1:10, 이후 1:25)을 사용하여 생물반응기보다 진탕 플라스크로 해동하였다. 해동 결과는 현 공정 (냉각된 수거 및 pH 조정)은 허용가능한 해동 성능을 갖는 은행의 전달에 있어 가능하다는 것을 성공적으로 하기를 예증하였다. 한편, 원래의 공정으로부터 생성된 세포 은행은 생존률에서의 감소를 나타내었으며, 이러한 새로운 세포 은행은 일치성을 보였고, 제1일 생존률에서 79.1 - 85.3% 범위였다 (대략적으로 65% 개선). 세포가 시간에 걸쳐 상승된 pH에서 보유됨에 따라 부정적 영향은 관찰되지 않았다.

분석은 보다 높은 pH로 조정된 풀 유래의 세포가 크기가 보다 작았다는 것을 나타내었다 (도 5). 이러한 관찰된 크기 이동은, 보다 높은 pH가 세포 탈수를 유발하였다는 것을 표지한다 (가능하게는, 증가된 삼투압 또는 증진된 세포 막 탄성 (세포 수축 또는 둘 모두를 가능하게 함)).

결론

보관 pH는 제1 해동 생존률을 65% 이하만큼 영향을 미치는, 해동-후 성능에 매우 중요하다는 것이 측정되었다. 따라서, 수거 및 보관 절차에 대해 제조된 공정 증진은 보관 pH 상에서 대조군을 개선하고 세포 노출을 낮은 pH로 이동시키기 위해 설계되었다. 최종적으로 2개의 개선점이 하기를 포함한 공정에 도입되었다: 1) 실리콘 튜빙 열교환기로의 수거 동안 세포 배양 유체를 냉각하는 것; 및 2) 7.5로 보관 pH를 증가시키기 위한 pH 조정 단계를 사용하는 것.

Claims

세포 은행의 해동 회수를 개선하는 방법으로서,
동결 배지 내에서의 보관을 위하여 포유동물 세포를 동결하는 단계를 포함하고,
상기 동결 배지는 완충액 및 동결방지제를 포함하고, 상기 동결 배지는 동결 전에 약 6.7 내지 약 8.5의 pH를 갖는, 방법.
보관을 위하여 포유동물 세포를 동결하는 방법으로서,
동결 배지 내에서 상기 포유동물 세포를 동결하는 단계를 포함하고,
상기 동결 배지는 완충액 및 동결방지제를 포함하고, 상기 동결 배지는 동결 전에 약 6.7 내지 약 8.5의 pH를 갖는, 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 동결 배지는 동결 전 약 6.7 내지 약 8.3, 약 7.2 내지 약 7.8, 또는 약 7.5의 pH를 갖는, 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 동결 배지의 상기 pH는 약 6.7 내지 약 8.5의 pH로 조정된, 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 동결 배지의 상기 pH는 약 6.7 내지 약 8.3 또는 약 7.2 내지 약 7.8의 pH로 조정된, 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 동결 배지의 상기 pH는 약 7.5의 pH로 조정된, 방법.
청구항 4 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 pH 조정 전에 및/또는 후에 동결 배지와 조합되는, 방법.
청구항 4 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조정된 pH는 표적 pH 또는 측정된 pH인, 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 표적 pH는 약 6.7 내지 약 8.3인, 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 측정된 pH는 약 6.7 내지 약 8.3인, 방법.
청구항 4 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결 배지의 pH 조정 전에 상기 세포를 함유하는 상기 동결 배지의 초기 pH를 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
청구항 4 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결 배지의 상기 조정된 pH를 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 동결 배지의 상기 측정된 pH가 표적 pH 미만일 경우, 상기 동결 배지의 상기 조정된 pH가 약 6.7 내지 약 8.3이 될 때까지 상기 조정 단계 및 상기 측정 단계를 반복하는, 방법.
청구항 4 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 염기 첨가에 의하여 조정되는, 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 염기는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법: 탄산나트륨, 중탄산나트륨, HEPES 나트륨 염, 수산화나트륨, 및 수산화칼륨.
청구항 14 또는 15에 있어서, 상기 동결 배지의 상기 pH는, 식 V_base = C_base*V_p (pH_t - pH_i)에 따라 상기 동결 배지에 염기를 첨가함으로써 조정되고, 식 중, C_base 는 염기-특정 계수이고, V_base 는 상기 동결 배지에 첨가되는 상기 염기의 용적이고, V_p 는 상기 동결 배지의 용적이고, pH_t 는 상기 표적 pH이며, 그리고 pH_i 는 상기 초기 pH인, 방법.
청구항 16에 있어서, 상기 동결 배지의 상기 pH는, 식 V_Na2CO3 = 0.0085V_p (pH_t - pH_i)에 따라 상기 동결 배지에 탄산나트륨을 첨가함으로써 조정되고, 식 중, V_Na2CO3 는 상기 동결 배지에 첨가되는 1M 탄산나트륨의 용적이고, V_p 는 상기 동결 배지의 용적이고, pH_t 는 상기 표적 pH이며, 그리고 pH_i 는 상기 초기 pH인, 방법.
청구항 16 또는 17에 있어서, 상기 표적 pH는 6.7 내지 8.3, 7.2 내지 7.8, 또는 7.5인, 방법.
청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는, 상기 포유동물 세포가 동결 배지와 조합되기 전에, 약 6.2 내지 약 6.6의 pH를 갖는 배지 내에 있는, 방법.
청구항 1 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결방지제는 DMSO, 글리세롤, 프로판디올, 에틸렌 글리콜, 또는 당인, 방법.
청구항 20에 있어서, 동결방지제는 DMSO 또는 글리세롤이고, 동결 전 상기 동결 배지 내의 상기 DMSO 또는 상기 글리세롤의 농도는 약 5 용적% 내지 약 12.5 용적%인, 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 세포의 동결 전 상기 동결 배지 내의 상기 DMSO 또는 상기 글리세롤의 농도는 약 5 용적% 내지 약 10 용적%인, 방법.
청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포를 함유하는 상기 동결 배지는, 동결 전 약 8% 내지 약 28%의 충전 세포 용적 (PCV)의 세포 밀도를 갖는, 방법.
청구항 1 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 동결 배지와 조합되기 전에, 세포 수거 및 농축 공정 동안 세포 배양 유체를 냉각하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
청구항 24에 있어서, 상기 세포 배양 유체는 약 20℃ 이하의 온도로 냉각되는, 방법.
청구항 24에 있어서, 상기 세포 배양 유체는 약 10℃ 이하의 온도로 냉각되는, 방법.
저장을 위하여 포유동물 세포를 동결하는 방법으로서,
(a) 포유동물 세포를 함유하는 동결 배지의 pH를 약 6.7 내지 약 8.5의 pH로 조정하는 단계 (여기서 상기 동결 배지는 완충액 및 동결방지제를 포함함); 및
(b) 상기 포유동물 세포를 동결하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 27에 있어서, 상기 pH는 약 6.7 내지 약 8.3 또는 약 7.2 내지 약 7.8의 pH로 조정되는, 방법.
청구항 27에 있어서, 상기 pH는 약 7.5의 pH로 조정되는, 방법.
청구항 27 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조정된 pH는 표적 pH 또는 측정된 pH인, 방법.
청구항 30에 있어서, 상기 표적 pH는 약 6.7 내지 약 8.3인, 방법.
청구항 30에 있어서, 상기 측정된 pH는 약 6.7 내지 약 8.3인, 방법.
청구항 27에 있어서, 상기 동결 배지의 pH 조정 전에 상기 세포를 함유하는 상기 동결 배지의 초기 pH를 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
청구항 27 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결 배지의 상기 조정된 pH를 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
청구항 34에 있어서, 상기 동결 배지의 상기 측정된 pH가 표적 pH 미만일 경우, 상기 동결 배지의 상기 조정된 pH가 약 6.7 내지 약 8.5이 될 때까지 상기 조정 단계 및 상기 측정 단계를 반복하는, 방법.
청구항 27 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 염기 첨가에 의하여 조정되는, 방법.
청구항 36에 있어서, 상기 염기는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법: 탄산나트륨, 중탄산나트륨, HEPES 나트륨 염, 수산화나트륨, 및 수산화칼륨.
청구항 36 또는 37에 있어서, 상기 동결 배지의 상기 pH는, 식 V_base = C_base*V_p (pH_t - pH_i)에 따라 상기 동결 배지에 염기를 첨가함으로써 조정되고, 식 중, C_base 는 염기-특정 계수이고, V_base 는 상기 동결 배지에 첨가되는 상기 염기의 용적이고, V_p 는 상기 동결 배지의 용적이고, pH_t 는 상기 표적 pH이며, 그리고 pH_i 는 상기 초기 pH인, 방법.
청구항 36 또는 37에 있어서, 상기 동결 배지의 상기 pH는, 식 V_Na2CO3 = 0.0085V_p (pH_t - pH_i)에 따라 상기 동결 배지에 탄산나트륨을 첨가함으로써 조정되고, 식 중, V_Na2CO3 는 상기 동결 배지에 첨가되는 1M 탄산나트륨의 용적이고, V_p 는 상기 동결 배지의 용적이고, pH_t 는 상기 표적 pH이며, 그리고 pH_i 는 상기 초기 pH인, 방법.
청구항 38 또는 39에 있어서, 상기 표적 pH는 6.7 내지 8.3, 7.2 내지 7.8, 또는 7.5인, 방법.
청구항 27 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는, 상기 포유동물 세포가 동결 배지와 조합되기 전에, 약 6.2 내지 약 6.6의 pH를 갖는 배지 내에 있는, 방법.
청구항 27 내지 41 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결방지제는 DMSO, 글리세롤, 프로판디올, 에틸렌 글리콜, 또는 당인, 방법.
청구항 42에 있어서, 상기 동결방지제는 DMSO 또는 글리세롤이고, 동결 전 상기 포유동물 세포를 함유하는 상기 동결 배지 내의 상기 DMSO 또는 상기 글리세롤의 농도는 약 5 용적% 내지 약 12.5 용적%인, 방법.
청구항 43에 있어서, 상기 세포의 동결 전 상기 포유동물 세포를 함유하는 상기 동결 배지 내의 상기 DMSO 또는 상기 글리세롤의 농도는 약 5 용적% 내지 약 10 용적%인, 방법.
청구항 27 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포를 함유하는 상기 동결 배지는, 동결 전 8% 내지 28%의 충전 세포 용적 (PCV)의 세포 밀도를 갖는, 방법.
청구항 27 내지 45 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 동결 배지와 조합되기 전에, 세포 수거 및 농축 공정 동안 세포 배양 유체를 냉각하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
청구항 46에 있어서, 상기 세포 배양 유체는 약 20℃ 이하의 온도로 냉각되는, 방법.
청구항 46에 있어서, 상기 세포 배양 유체는 약 10℃ 이하의 온도로 냉각되는, 방법.
저장을 위하여 포유동물 세포를 냉각하는 방법으로서,
(a) 동결 배지의 pH를 약 6.7 내지 약 8.5의 pH로 조정하는 단계 (여기서 상기 동결 배지는 완충액 및 동결방지제를 포함함);
(b) 상기 포유동물 세포와 상기 동결 배지를 조합하여 세포 풀을 형성하는 단계; 및
(c) 상기 포유동물 세포를 상기 세포 풀 내에서 동결하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 49에 있어서, 상기 pH는 약 6.7 내지 약 8.3 또는 약 7.2 내지 약 7.8의 pH로 조정되는, 방법.
청구항 49에 있어서, 상기 pH는 약 7.5의 pH로 조정되는, 방법.
청구항 49 내지 51 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조정된 pH는 표적 pH 또는 측정된 pH인, 방법.
청구항 52에 있어서, 상기 표적 pH는 약 6.7 내지 약 8.3인, 방법.
청구항 52에 있어서, 상기 측정된 pH는 약 6.7 내지 약 8.3인, 방법.
청구항 49 내지 54 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결 배지의 상기 조정된 pH를 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
청구항 49에 있어서, 상기 동결 배지의 상기 측정된 pH가 표적 pH 미만일 경우, 상기 동결 배지의 상기 조정된 pH가 약 6.7 내지 약 8.5이 될 때까지 상기 조정 단계 및 상기 측정 단계를 반복하는, 방법.
청구항 49 내지 56 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH는 염기 첨가에 의하여 조정되는, 방법.
청구항 57에 있어서, 상기 염기는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법: 탄산나트륨, 중탄산나트륨, HEPES 나트륨 염, 수산화나트륨, 및 수산화칼륨.
청구항 49 내지 58 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는, 상기 포유동물 세포가 동결 배지와 조합되기 전에, 약 6.2 내지 약 6.6의 pH를 갖는 배지 내에 있는, 방법.
청구항 49 내지 59 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결방지제는 DMSO, 글리세롤, 프로판디올, 에틸렌 글리콜, 또는 당인, 방법.
청구항 60에 있어서, 상기 동결방지제는 DMSO 또는 글리세롤이고, 상기 세포 풀 내의 상기 DMSO 또는 상기 글리세롤의 농도는 약 5 용적% 내지 약 12.5 용적%인, 방법.
청구항 61에 있어서, 상기 세포 풀 내의 상기 DMSO 또는 상기 글리세롤의 농도는 약 5 용적% 내지 약 10 용적%인, 방법.
청구항 49 내지 62 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 풀은 약 8% 내지 약 28%의 충전 세포 용적 (PCV)의 세포 밀도에서 상기 포유동물 세포를 함유하는, 방법.
청구항 49 내지 63 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 동결 배지와 조합되기 전에, 세포 수거 및 농축 공정 동안 세포 배양 유체를 냉각하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
청구항 64에 있어서, 상기 세포 배양 유체는 약 20℃ 이하의 온도로 냉각되는, 방법.
청구항 64에 있어서, 상기 세포 배양 유체는 약 10℃ 이하의 온도로 냉각되는, 방법.
청구항 1 내지 66 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 뮤린 골수종 세포, PER.C6® 인간 세포, 또는 혼성세포인, 방법.
청구항 1 내지 67 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는, 방법.
청구항 68에 있어서, 상기 폴리펩티드는 치료 단백질인, 방법.
청구항 69에 있어서, 상기 치료 단백질은 항체, 항체 단편, 효소, 및 수용체 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
포유동물 세포를 동결하기 위한 포유동물 세포 풀로서,
완충액, 동결방지제, 및 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 포함하고,
상기 배지는 상기 세포의 동결 전에 약 6.7 내지 약 8.5의 pH를 갖는, 세포 풀.
청구항 71에 있어서, 상기 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 뮤린 골수종 세포, PER.C6® 인간 세포, 또는 혼성세포인, 세포 풀.
청구항 71 또는 72에 있어서, 상기 포유동물 세포는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는, 세포 풀.
청구항 73에 있어서, 상기 폴리펩티드는 치료 단백질인, 세포 풀.
청구항 74에 있어서, 상기 치료 단백질은 항체, 항체 단편, 효소, 및 수용체 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는, 세포 풀.
세포 은행으로서,
복수의 용기를 포함하고,
각 용기는
(a) 완충액 및 동결방지제를 포함하는 동결 배지, 및
(b) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포 (여기서 상기 동결 배지는 상기 세포의 동결 전에 약 6.7 내지 약 8.5의 pH를 가짐)를 함유하는, 세포 은행.
청구항 76에 있어서, 상기 용기는 앰플인, 세포 은행.
청구항 76 또는 77에 있어서, 상기 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 뮤린 골수종 세포, PER.C6® 인간 세포, 또는 혼성세포인, 세포 은행.
청구항 76 내지 78 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는, 세포 은행.
청구항 79에 있어서, 상기 폴리펩티드는 치료 단백질인, 세포 은행.
청구항 80에 있어서, 상기 치료 단백질은 항체, 항체 단편, 효소, 및 수용체 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는, 세포 은행.