BR112017000142B1 - Métodos para melhorar a recuperação por descongelamento de bancos de células e para congelamento de células cho para armazenamento, grupo de células cho para o congelamento de células de mamíferos, e banco de células - Google Patents

Abstract

são fornecidos aqui os métodos de congelamento de células de mamífero para o armazenamento ou melhoria da recuperação de criopreservação dos bancos de células compreendendo congelamento de células de mamíferos em um meio de congelamento tendo um ph de 6,7 a 8,5.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do pedido provisório n° de série U.S. 62/022.392, depositado em 9 de julho de 2014, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a métodos de congelamento de células (tais como células de mamíferos) para armazenamento e congelamento de meios para utilização em congelamento de células. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Os bancos de células são produzidos pelas primeiras célu las que se acumulam em um processo de cultura de células de batela- da/perfusão e então coleta de células para armazenamento. O processo envolve três fases: acúmulo de células, coleta e concentração de células e armazenamento de células. Uma etapa de processo de coleta serve para concentrar o fluido de cultura celular final ou para extrair as células do fluido de cultura de células utilizando centrifugação. Um processo de reunião e enchimento posterior serve para preparar ampolas do banco de células para armazenamento a longo prazo.

[004] Estes métodos tradicionais podem resultar na viabilidade pós-descongelamento inconsistente ou pobre para selecionar linhas celulares. É imperativo ao processo de bancos de células a necessidade de uma alta viabilidade celular após o descongelamento das células congeladas. Assim, os métodos melhorados de congelamento células para bancos de células são desejáveis. Meio de cultura de células para congelamento de células que permite uma maior viabilidade das células quando descongeladas depois do armazenamento seria benéfico.

[005] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes cita dos aqui estão incorporados em sua totalidade por meio deste por referência para todos os efeitos.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Em um aspecto, aqui fornecido um método para melhorar a recuperação de descongelamento de bancos de células compreendendo congelamento de células eucarióticas (por exemplo, células de mamífero, células de insetos, etc.) para armazenamento em um meio de congelamento, em que o meio de congelamento compreende uma solução tamponada e um agente crioprotetor, e em que o meio de congelamento tem um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,5 antes do congelamento ou que tenha sido ajustado para um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,5 antes do congelamento.

[007] Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método de con gelamento de células eucarióticas (por exemplo, células de mamífero, células de insetos, etc.) para armazenamento que compreende o congelamento das células em um meio de congelamento, em que o meio de congelamento compreende uma solução tamponada e um agente crioprotetor, e em que o meio de congelamento tem um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,5 antes do congelamento ou que tenha sido ajustado para um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,5 antes do congelamento.

[008] Em algumas modalidades dos métodos acima descritos ou aqui, o meio de congelamento tem um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,3, cerca de 6,8 a cerca de 8,3, cerca de 6,9 a cerca de 8,3, cerca de 7,0 a cerca de 8,3, cerca de 7,1 a cerca de 8,3, cerca de 7,2 a cerca de 8,3, cerca de 7,3 a cerca de 8,3, cerca de 7,4 a cerca de 8,3, cerca de 7,5 a cerca de 8,3, cerca de 7,2 a cerca de 8,0, cerca de 7,2 a cerca de 7,8, ou cerca de 7,5 antes do congelamento.

[009] Em algumas modalidades dos métodos acima descritos ou aqui, o pH do meio de congelamento, foi ajustado para um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,5, cerca de 6,7 a cerca de 8,3, cerca de 6,8 a cerca de 8,3, cerca de 6,9 a cerca de 8,3, cerca de 7,0 a cerca de 8,3, cerca de 7,1 a cerca de 8,3, cerca de 7,2 a cerca de 8,3, cerca de 7,3 a cerca de 8,3, cerca de 7,4 a cerca de 8,3, cerca de 7,5 a cerca de 8,3, cerca de 7,2 a cerca de 8,0, cerca de 7,2 a cerca de 7,8, ou cerca de 7,5. Em algumas modalidades dos métodos descritos acima ou aqui, as células (por exemplo, células de mamífero ou células de insetos) são combinadas com um meio de congelamento, antes e/ou após o ajuste de pH. Em algumas modalidades, o pH ajustado é um pH alvo ou um pH medido. Em algumas modalidades, o pH alvo é de cerca de 6,7 a cerca de 8,5, ou qualquer do pH ou em quaisquer intervalos de pH aqui descritos. Em algumas modalidades, o pH é medido cerca de 6,7 a cerca de 8,5, ou qualquer do pH ou em quaisquer intervalos de pH aqui descritos. Em algumas modalidades dos métodos descritos acima ou aqui, o método compreende ainda uma etapa de medição de um valor de pH inicial do meio de congelamento contendo as células (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) antes de ajustar o pH do meio de congelamento. Em algumas modalidades dos métodos descritos acima ou aqui, o método compreende ainda uma etapa de medir o pH ajustado do meio de congelamento. Em algumas modalidades dos métodos acima descritos ou aqui, se o pH medido do meio de congelamento estiver abaixo de um pH alvo, o método compreende a repetição da etapa de ajuste e da etapa de medição até que o pH ajustado do meio de congelamento seja de cerca de 6,7 a cerca de 8,5, ou qualquer do pH ou em quaisquer intervalos de pH aqui descri- tos.

[0010] Em algumas modalidades dos métodos aqui descritos ou acima, o pH é ajustado por adição de uma base. Em algumas modalidades, a base é selecionada a partir do grupo que consiste em carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, sal de sódio HEPES (ácido 4-(2- hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico), hidróxido de sódio e hidróxido de potássio. Em algumas modalidades, o pH do meio de congelamento é ajustado por adição de uma base ao meio de congelamento de acordo com a seguinte fórmula Vbase = Cbase*Vp (pHt - pHi), em que Cbase é um coeficiente específico de bases, Vbase é um volume da base para adicionar ao meio de congelamento, Vp é o volume do meio de congelamento, pHt é o pH alvo e o pHi é o pH inicial. Em algumas modalidades, o pH do meio de congelamento é ajustado por adição de carbonato de sódio ao meio de congelamento de acordo com a seguinte fórmula VNa2CO3 = 0,0085Vp (pHt - pHi), em que VNa2CO3 é um volume de carbonato de sódio 1 M a adicionar ao meio de congelamento, Vp é o volume do meio de congelamento, pHt é o pH alvo, e o pHi é o pH inicial. Em algumas modalidades, o pH alvo é um pH entre cerca de 6,7 a cerca de 8,5, cerca de 7,2 a cerca de 8,3, ou qualquer do pH ou em quaisquer intervalos de pH aqui descritos. Em algumas modalidades, o pH alvo é 7,5.

[0011] Em algumas modalidades dos métodos descritos acima ou aqui, as células (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) estão em um meio que tem um pH de cerca de 6,2 a cerca de 6,6 antes das células serem combinadas com um meio de congelamento.

[0012] Em algumas modalidades dos métodos descritos acima ou aqui, o agente crioprotetor é de DMSO (sulfóxido de dimetil), glicerol, propanodiol, etileno glicol, uma macromolécula, um açúcar ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o DMSO ou gli- cerol no meio de congelamento antes da congelação está em uma concentração de cerca de 5% a cerca de 12,5% em volume. Em algumas modalidades, o DMSO ou glicerol no meio de congelamento antes do congelamento das células (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) está a uma concentração de cerca de 5% a cerca de 10% em volume.

[0013] Em algumas modalidades dos métodos descritos acima ou aqui, o meio de congelamento contendo as células (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) tem uma densidade celular de cerca de 8% a cerca de 28% de volume de células compactadas (PCV) antes do congelamento.

[0014] Em algumas modalidades do método descrito acima ou aqui, o método compreende ainda uma etapa de arrefecimento do fluido de cultura de células durante a coleta de células e o processo de concentração antes das células (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) serem combinadas com um meio de congelamento. Em algumas modalidades, o fluido da cultura de células é resfriado a uma temperatura igual ou inferior a cerca de 20 °C. Em algumas modalidades, o fluido da cultura de células é resfriado a uma temperatura igual ou inferior a cerca de 10 °C.

[0015] Em um outro aspecto, fornecido aqui é um método de con gelamento de células eucarióticas (por exemplo, células de mamífero, células de insetos, etc.) para o armazenamento ou melhora da recuperação de descongelamento de bancos de células compreendendo (a) ajustar o pH de um meio de congelamento contendo as células para um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,5, em que o meio de congelamento compreende uma solução tamponada e um agente crioprotetor; e (b) congelar as células.

[0016] Em algumas modalidades, o pH foi ajustado para um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,3, cerca de 6,8 a cerca de 8,3, cerca de 6,9 a cerca de 8,3, cerca de 7,0 a cerca de 8,3, cerca de 7,1 a cerca de 8,3, cerca de 7,2 a cerca de 8,3, cerca de 7,3 a cerca de 8,3, cerca de 7,4 a cerca de 8,3, cerca de 7,5 a cerca de 8,3, cerca de 7,2 a cerca de 8,0, cerca de 7,2 a cerca de 7,8, ou cerca de 7,5. Em algumas modalidades, o pH ajustado é um pH alvo ou um pH medido. Em algumas modalidades, o pH alvo é de cerca de 6,7 a cerca de 8,5 ou qualquer do pH ou em quaisquer intervalos de pH aqui descritas. Em algumas modalidades, o pH alvo é 7,5. Em algumas modalidades, o pH é medido cerca de 6,7 a cerca de 8,5 ou qualquer do pH ou em quaisquer intervalos de pH aqui descritos.

[0017] Em algumas modalidades dos métodos descritos acima ou aqui, o método compreende ainda uma etapa de medição de um valor de pH inicial do meio de congelamento contendo as células (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) antes de ajustar o pH do meio de congelamento. Em algumas modalidades, o método compreende ainda uma etapa de medir o pH ajustado do meio de congelamento. Em algumas modalidades, se o pH medido do meio de congelamento estiver abaixo de um pH alvo, o método compreende a repetição da etapa de ajuste e da etapa de medição até que o pH ajustado do meio de congelamento seja de cerca de 6,7 a cerca de 8,5, cerca de 7,2 a cerca de 8,3, ou qualquer dos pH ou em quaisquer intervalos de pH aqui descritas.

[0018] Em algumas modalidades dos métodos aqui descritos ou acima, o pH é ajustado por adição de uma base. Em algumas modalidades, a base é selecionada a partir do grupo que consiste em carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, sal de sódio HEPES, hidróxido de sódio e hidróxido de potássio. Em algumas modalidades, o pH do meio de congelamento é ajustado por adição de uma base ao meio de congelamento de acordo com a seguinte fórmula Vbase = Cbase*Vp (pHt - pHi), em que Cbase é um coeficiente específico de bases, Vbase é um volume da base para adicionar ao meio de congelamento, Vp é o vo- lume do meio de congelamento, pHt o pH alvo e o pHi é o pH inicial. Em algumas modalidades, o pH do meio de congelamento é ajustado por adição de carbonato de sódio ao meio de congelamento de acordo com a seguinte fórmula VN92CO3 = 0,0085Vp (pHt - pHi), em que VN92CO3 é um volume de carbonato de sódio a 1M para adicionar ao meio de congelamento, Vp é o volume do meio de congelamento, pHt é o pH alvo e o pHi é o pH inicial. Em algumas modalidades, o pH alvo é de cerca de 6,7 a cerca de 8,5 ou qualquer do pH ou em quaisquer intervalos de pH aqui descritos. Em algumas modalidades, o pH alvo é 7,5.

[0019] Em algumas modalidades, as células (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) estão em um meio que tem um pH de cerca de 6,2 a cerca de 6,6 antes das células serem combinadas com um meio de congelamento.

[0020] Em algumas modalidades, o agente crioprotetor no meio de congelamento é de DMSO, glicerol, propanodiol, etileno glicol, uma macromolécula, um açúcar ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o DMSO ou glicerol no meio de congelamento contendo as células antes do congelamento (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) está a uma concentração de cerca de 5% a cerca de 12,5% em volume. Em algumas modalidades, o DMSO ou glicerol no meio de congelamento contendo as células antes do congelamento das células (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) está a uma concentração de cerca de 5% a cerca de 10% em volume.

[0021] Em algumas modalidades, o meio de congelamento con tendo as células (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) tem uma densidade celular de cerca de 8% a cerca de 28% de volume de células compactadas (PCV) antes do congelamento.

[0022] Em algumas modalidades, o método compreende ainda uma etapa de arrefecimento do fluido de cultura de células durante a coleta de células e o processo de concentração antes das células (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) serem combinadas com um meio de congelamento. Em algumas modalidades, o fluido da cultura de células é resfriado a uma temperatura igual ou inferior a cerca de 20 °C, ou abaixo de cerca de 10 °C.

[0023] Em um outro aspecto, é fornecido aqui um método de con gelamento de células eucarióticas (por exemplo, células de mamífero, células de insetos, etc.) para armazenamento ou melhora da recuperação de descongelamento de bancos de células compreendendo (a) ajustar o pH de um meio de congelamento para um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,5, em que o meio de congelamento compreende uma solução tamponada e um agente crioprotetor; (b) combinar as células com o meio de congelamento para formar um conjunto de células; e (c) congelar as células no conjunto de células.

[0024] Em algumas modalidades dos métodos acima descritos ou aqui, o pH do meio de congelamento, foi ajustado para um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,3, cerca de 6,8 a cerca de 8,3, cerca de 6,9 a cerca de 8,3, cerca de 7,0 a cerca de 8,3, cerca de 7,1 a cerca de 8,3, cerca de 7,2 a cerca de 8,3, cerca de 7,3 a cerca de 8,3, cerca de 7,4 a cerca de 8,3, cerca de 7,5 a cerca de 8,3, cerca de 7,2 a cerca de 8,0, cerca de 7,2 a cerca de 7,8, ou cerca de 7,5. Em algumas modalidades, o pH ajustado é um pH alvo ou um pH medido. Em algumas modalidades, o pH alvo é de cerca de 6,7 a cerca de 8,5 ou qualquer do pH ou em quaisquer intervalos de pH aqui descritos. Em algumas modalidades, o pH é medido de cerca de 6,7 a cerca de 8,5 ou qual-quer do pH ou em quaisquer intervalos de pH aqui descritos.

[0025] Em algumas modalidades, o método compreende ainda uma etapa de medir o pH ajustado do meio de congelamento. Em algumas modalidades, se o pH medido do meio de congelamento estiver abaixo de um pH alvo, o método ainda compreende a repetição da etapa de ajuste e da etapa de medição até que o pH ajustado do meio de congelamento seja de cerca de 6,7 a cerca de 8,5 ou qualquer dos pH ou em quaisquer intervalos de pH aqui descritos.

[0026] Em algumas modalidades dos métodos aqui descritos ou acima, o pH é ajustado por adição de uma base. Em algumas modalidades, a base é selecionada a partir do grupo que consiste em carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, sal de sódio HEPES, hidróxido de sódio e hidróxido de potássio.

[0027] Em algumas modalidades dos métodos descritos acima ou aqui, as células (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) estão em um meio que tem um pH de cerca de 6,2 a cerca de 6,6 antes das células serem combinadas com um meio de congelamento.

[0028] Em algumas modalidades, dos métodos acima descritos ou aqui, o agente crioprotetor no meio de congelamento é DMSO, glicerol, propanodiol, etileno glicol, uma macromolécula, um açúcar ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o DMSO ou gli- cerol no conjunto de células está a uma concentração de cerca de 5% a cerca de 12,5% em volume, ou cerca de 5% a cerca de 10% em volume.

[0029] Em algumas modalidades dos métodos descritos acima ou aqui, o conjunto de células contém as células (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) a uma densidade celular de cerca de 8% a cerca de 28% de volume de células compactadas (PCV).

[0030] Em algumas modalidades dos métodos descritos acima ou aqui, o método compreende ainda uma etapa de resfriamento de fluido de cultura de células durante a coleta de células e o processo de concentração antes das células (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) serem combinadas com um meio de congelamento. Em algumas modalidades, o fluido da cultura de células é resfriado a uma temperatura igual ou inferior a cerca de 20 °C. Em algumas mo- dalidades, o fluido da cultura de células é resfriado a uma temperatura igual ou inferior a cerca de 10 °C.

[0031] Em algumas modalidades dos métodos descritos acima ou aqui, as células são células de mamífero, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), células de mieloma murino NS0, células humanas PER.C6®, ou hibridomas. Em algumas modalidades, as células são células de insetos, tais como High FiveTM, S2 (Schneider 2), Sf9 e Sf21. Em algumas modalidades dos métodos descritos acima ou aqui, as células (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) compreendem um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é uma proteína terapêutica. Em algumas modalidades, a proteína terapêutica é selecionada do grupo que consiste em um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma enzima, e uma proteína de fusão do receptor.

[0032] Em um outro aspecto, é aqui fornecido um conjunto de cé lulas eucarióticas (por exemplo, um conjunto de células de mamíferos, ou um conjunto de células de inseto) para congelamento de células que compreendem uma solução tamponada, um agente crioprotetor, e células eucarióticas compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, em que o meio tem um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,5 ou cerca de 7,2 a cerca de 8,3 (ou qualquer um dos pH ou em quaisquer intervalos de pH aqui descritos) antes do congelamento das células. Em algumas modalidades, as células são células de mamífero, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), células de mieloma murino NS0, células humanas PER.C6®, ou hibridomas. Em algumas modalidades, as células são células de insetos, tais como High FiveTM, S2 (Schneider 2), Sf9 e Sf21. Em algumas modalidades, as células (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) compreendem um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é uma proteína terapêutica. Em algumas modalidades, a proteína terapêutica é selecionada do grupo que consiste em um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma enzima e uma proteína de fusão do receptor.

[0033] Em um outro aspecto, é aqui fornecido um banco de células que compreende uma pluralidade de recipientes e cada recipiente contém (a) um meio de congelamento que compreende um tampão e um agente crioprotetor, e (b) células eucarióticas (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) que compreendem um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, em que o meio de congelamento tem um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,5 ou cerca de 7,2 a cerca de 8,3 (ou qualquer um dos pH ou em quaisquer intervalos de pH aqui descritos) antes do congelamento da célula. Em algumas modalidades, os recipientes são ampolas. Em algumas modalidades, as células são células de mamífero, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), células de mieloma murino NS0, células humanas PER.C6®, ou hibri- domas. Em algumas modalidades, as células são células de insetos, tais como High FiveTM, S2 (Schneider 2), Sf9 e Sf21. Em algumas modalidades, as células (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) compreendem um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é uma proteína terapêutica. Em algumas modalidades, a proteína terapêutica é selecionada do grupo que consiste em um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma enzima, e uma proteína de fusão do receptor.

[0034] Deve-se entender que uma, algumas, ou todas as proprie dades das várias modalidades descritas aqui podem ser combinadas para formar outras modalidades da presente invenção. Esses e outros aspectos da invenção se tornarão evidentes para alguém versado na técnica.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0035] FIG. 1 mostra um exemplo de um fluxo de processo de bancos de células.

[0036] FIGs. 2A-2B mostram viabilidade de passagem de descon gelamento no dia 1 (FIG. 2A) e resultados do crescimento no dia 4 (PCV) (FIG. 2B) para os bancos de células gerados a partir de conjuntos pH ajustados a pH inicial de 6,6 ou 6,3.

[0037] FIGs. 3A-3F mostram viabilidade de passagem de descon gelamento no dia 1 (FIGs. 3A, 3C e 3E) e taxa de crescimento global de PCV (FIGs. 3B, 3D, e 3F) vs. pH de armazenamento e o efeito de ajustar o pH a um intervalo de pHs alvos em nove linhas celulares de CHO que produzem cada um anticorpo diferente (anticorpos 1-9).

[0038] FIGs. 4A-4B mostram passagem de descongelamento de densidade de células viáveis (VCD) ou contagem de células viáveis (VCC) (FIG. 4A) e tendências de viabilidade (%) (FIG. 4B) que demonstram o efeito de ajustar o pH para 7,5 a partir de um pH de conjunto inicial de 6,3 vs. nenhum ajuste do pH.

[0039] FIG. 5 mostra a relação entre o volume de células viáveis embalada (VPCV) para contagem de células viáveis (VCC), que é um meio indireto de estimar o tamanho das células, durante o processo de agrupamento. Os dados mostram o efeito da adição do meio de congelamento (FM) e ajuste do pH para um pH de 7,3, 7,6 ou 8,0 no tamanho da célula. Uma proporção maior indica um tamanho de célula grande.

[0040] FIGs. 6A-6B mostra resultados da taxa de crescimento glo bal PCV da passagem de descongelamento para os bancos de células gerados a partir de pH de conjuntos ajustadas a um pH inicial de 6,4 (meta de 6,2) ou 6,6 (meta de 6,7) em t0 (FIG. 6A) E t2 (2 horas) (FIG. 6B).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0041] São aqui fornecidos métodos para melhorar a recuperação de descongelamento de bancos de células compreendendo congela- mento de células eucarióticas (por exemplo, células de mamífero, células de insetos, etc.) para armazenamento em um meio de congelamento, em que o meio de congelamento compreende uma solução tamponada e um agente crioprotetor e em que o meio de congelamento tem um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,5 antes do congelamento.

[0042] Neste documento, também estão fornecidos métodos de congelamento de células eucarióticas (por exemplo, células de mamífero, células de insetos, etc.) para armazenamento que compreende o congelamento das células em um meio de congelamento, em que o meio de congelamento compreende uma solução tamponada e um agente crioprotetor e em que o meio de congelamento tem um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,5 antes do congelamento.

[0043] Neste documento, também estão fornecidos métodos de congelamento de células eucarióticas (por exemplo, células de mamífero, células de insetos, etc.) para o armazenamento ou melhora da recuperação de descongelamento de bancos de células compreendendo (a) ajustar o pH de um meio de congelamento contendo as células para um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,5, em que o meio de congelamento compreende uma solução tamponada e um agente criopro- tetor; e (b) congelar as células.

[0044] Neste documento, também estão fornecidos métodos de congelamento de células eucarióticas (por exemplo, células de mamífero, células de insetos, etc.) para armazenamento ou melhora da recuperação de descongelamento de bancos de células compreendendo (a) ajustar o pH de um meio de congelamento para um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,5, em que o meio de congelamento compreende uma solução tamponada e um agente crioprotetor; (b) combinar as células com o meio de congelamento para formar um conjunto de células; e (c) congelar as células no conjunto de células.

[0045] Também são fornecidos aqui conjuntos de células eucarió- ticas para o congelamento de células eucarióticas (por exemplo, células de mamífero, células de insetos, etc.) compreendendo uma solução tamponada, um agente crioprotetor, e células eucarióticas compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, em que o meio tem um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,5 antes do congelamento das células.

[0046] Também são fornecidos aqui bancos de células compreen dendo uma pluralidade de recipientes e cada recipiente contém (a) um meio de congelamento que compreende um tampão e um agente crio- protetor, e (b) células eucarióticas (por exemplo, células de mamífero, células de insetos, etc.) que compreendem um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, em que o meio de congelamento tem um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,5 antes do congelamento da célula.

I. Definições

[0047] Os termos "meio" e "meio de cultura celular" referem-se a uma solução utilizada para manter as células. O meio pode ainda compreender uma fonte de nutriente utilizada para as células em crescimento. Como é entendido por uma pessoa com conhecimentos na técnica, a fonte de nutrientes pode conter componentes exigidos pela célula para o crescimento e/ou sobrevivência ou podem conter componentes que auxiliam no crescimento e/ou sobrevivência celular. Vitaminas, aminoácidos essenciais ou não essenciais, e oligoelementos são exemplos de componentes do meio.

[0048] Um "meio nutriente basal" se refere a um meio compreen dendo os nutrientes básicos necessários para o crescimento e sobrevivência celular. Exemplos de um meio nutriente basal incluem Meio Mínimo Essencial de Eagle (EMEM) e Meio Eagle Modificado de Dul- becco (DMEM).

[0049] Um "meio de cultura celular quimicamente definido" ou "CDM" é um meio com uma composição especificada que é livre de produtos derivados de origem animal ou vegetal, como por exemplo soro animal e peptona vegetal. Como seria entendido por uma pessoa versada na técnica, um CDM pode ser utilizado em um processo de produção de polipeptídeo em que uma célula se encontra em contato com, e segrega um polipeptídeo no CDM. Assim, entende-se que uma composição pode conter um CDM e um produto polipeptídico e que a presença do produto polipeptídico não torna o CDM quimicamente indefinidos.

[0050] Um "meio de cultura celular indefinido quimicamente" se refere a um meio cuja composição química não pode ser especificada e que pode conter um ou mais produtos derivados de origem animal ou vegetal, por exemplo soro de animal ou planta peptona. Como seria entendido por uma pessoa versada na técnica, um meio de cultura celular indefinido quimicamente pode conter um produto derivado de um animal ou de uma planta como uma fonte de nutriente.

[0051] Um "meio de congelamento", "meio de congelamento celu lar" ou "meio de cultura celular para congelamento" se refere a uma solução tamponada que contém um agente crioprotetor. Um meio de congelamento pode ser utilizado para células de congelamento (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) contidos no meio de congelamento. Uma "solução tamponada", tal como aqui utilizado, refere-se a uma solução à base de água isotônica, de pH tamponado de sal, o qual atua de modo a preservar a integridade da membrana celular e serve como um transportador para um ou mais agentes crio- protetores. Um meio de congelamento podem também conter componentes adicionais encontrados no meio de cultura celular. Exemplos de tampões podem incluir tampão de bicarbonato, PBS (fosfato salino tamponado), HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1- piperazinoetanossulfônico), MOPS (ácido 3-(N-morfolino) ácido propa- nossulfônico), TES (N-[tris(hidroximetil)metil]-2-aminoetanossulfônico), Tris(tris(hidroximetil)aminometano), TEST (combo de TES/TRIS), e uma combinação dos mesmos. Exemplos de um meio podem incluir Meio Mínimo Essencial de Eagle (EMEM) e Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM). Os agentes crioprotetores protegem as células de dano por congelamento e podem ser classificados como (por exemplo, glicerol, sulfóxido de dimetil (DMSO), propanodiol, etilenoglicol, etc.) "permeando", capazes de atravessar a membrana plasmática ou "não permeando" (por exemplo, macromoléculas, açúcares, etc.).

[0052] A "cultura" de uma célula refere-se ao contato de uma célu la com um meio de cultura celular em condições adequadas para a sobrevivência e/ou crescimento e/ou a proliferação da célula.

[0053] "Cultura de batelada" refere-se a uma cultura em que todos os componentes para a cultura de células (incluindo as células e todos os nutrientes da cultura) são fornecidos ao vaso de cultura no início do processo de cultura.

[0054] A frase "cultura celular em bateladas descontínuos alimen tados", tal como aqui utilizado se refere a uma cultura em bateladas em que as células e meio de cultura são fornecidas ao vaso de cultura inicialmente e nutrientes de cultura adicionais são alimentados, continuamente ou em incrementos discretos, para a cultura durante o processo de cultura, com ou sem coleta celular e/ou de produto antes do término da cultura.

[0055] "Cultura de perfusão" é uma cultura, através da qual as cé lulas são contidas na cultura através de, por exemplo, filtração, encap-sulamento, ancoragem a microtransportadores etc. e o meio de cultura é continuamente ou intermitentemente introduzido e removido do vaso de cultura.

[0056] "Armazenamento de células" ou "armazenamento" é um processo pelo qual as células são congeladas a temperaturas subzero (criopreservadas) para interromper reações enzimáticas/químicas, mantendo assim as células em um estado viável para utilização posterior. As células congeladas podem ser armazenadas a menos de cerca de 0 °C (por exemplo, a -20 °C, -70 °C, -80 °C, ou inferior) para utilização posterior. Por exemplo, as células podem ser armazenadas em ampolas colocadas na fase de vapor de um congelador contendo nitrogênio líquido a -196 °C.

[0057] "Vaso de cultura" refere-se a um recipiente utilizado para a cultura de uma célula. O vaso de cultura pode ser de qualquer tamanho, desde que seja útil para a cultura de células.

[0058] O termo "título", tal como aqui utilizado refere-se à quanti dade total de polipeptídeo expresso de forma recombinante produzido por uma cultura celular dividida por uma dada quantidade de volume de meio. O título é tipicamente expresso em unidades de miligramas de polipeptídeo por mililitro de meio.

[0059] Um "ácido nucleico", conforme utilizado permutavelmente aqui, referem-se a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonu- cleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases e/ou seus análogos ou qualquer substrato que pode ser incorporado a um polímero por DNA ou RNA polimerase ou por uma reação sintética. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se estiver presente, a modificação da estrutura do nucleotídeo pode ser transmitida antes ou após a montagem do polímero.

[0060] Um "ácido nucleico isolado" significa e inclui uma sequência de ocorrência não natural, recombinante ou de ocorrência natural fora de seu contexto normal. Uma molécula de ácido nucleico isolada é outra que não sob a forma ou a configuração não se encontra na natureza. Moléculas de ácido nucleico isoladas distinguem-se, portanto, da molécula de ácido nucleico tal como existe em células naturais. No en- tanto, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que vulgarmente expressam proteína onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está em uma localização diferente da das células naturais cromossômicas.

[0061] Uma proteína "isolada" (por exemplo, um anticorpo isolado) é um que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que interfeririam na pesquisa, nos diagnósticos ou usos terapêuticos para a proteína e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteicos ou não proteicos. A proteína isolada inclui a proteína in situ nas células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural da proteína não esteja presente. Normalmente, contudo, a proteína isolada será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

[0062] Um polipeptídeo "purificado" significa que o polipeptídeo foi aumentado em grau de pureza, de tal modo que existe em uma forma que é mais pura do que existe no seu ambiente natural e/ou quando inicialmente produzido e/ou sintetizado e/ou amplificado sob condições de laboratório. A pureza é um termo relativo e não significa necessariamente pureza absoluta.

[0063] "Contaminantes" se referem a materiais que são diferentes daqueles s do produto polipeptídico desejado. O contaminante inclui, sem limitação: materiais de células hospedeiras, tais como a proteína da célula hospedeira; ácido nucleico; uma variante, fragmento, derivado ou agregado do polipeptídeo desejado; outro polipeptídeo; endoto- xina; contaminante viral; componente de meios de cultura de células, etc. Os contaminantes podem também incluir materiais introduzidos pelo processo de purificação, tais como a Proteína A lixiviada.

[0064] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são utilizados permu- tavelmente aqui para se referir aos polímeros de aminoácidos de qual- quer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados, e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também englobam um polímero de ami- noácido que tenha sido modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, pela formação da ligação de dissulfeto, glicosilação, lipi- dação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, como conjugação com um componente de marcação. Estão também incluídos na definição, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, ami- noácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica. Exemplos de polipeptídeos englobados pela definição aqui incluem proteínas de mamíferos, tais como, por exemplo, renina; um hormônio de crescimento, incluindo hormônio de crescimento humano e hormônio de crescimento bovino; fator de liberação de hormônio de crescimento; hormônio da paratireoide; hormônio estimulador da tireoide; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; insulina de cadeia A; insulina cadeia-B; pró-insulina; hormônio folículo estimulante; calcitonina; hormônio luteinizante; glucagon; fatores de coagulação tais como fator VIIIC, fator IX, fator tecidual, e fator de von Willebrand; fatores antico- agulação tais como Proteína C; fator natriurético atrial; surfactante pulmonar; um ativador de plasminogênio, tal como uroquinase ou urina ou ativador do plasminogênio humano de tipo tecidual (t-PA); bombe- sina; trombina; fator de crescimento hematopoiético; fator de necrose tumoral-alfa e -beta; encefalinase; RANTES (regulado na ativação normalmente expresso e segregado por células T); proteína inflamatória de macrófagos humanos (MIP-1-alfa); uma albumina do soro tal como albumina do soro humano; substância inibidora Muellerian; rela- xina de cadeia A; relaxina de cadeia B; prorelaxina; peptídeo associado a gonadotropina de camundongo; proteína microbiana, tal como beta-lactamase; DNase; IgE; um antígeno associado a citotóxico linfó- cito T (CTLA), tal como CTLA-4; inibina; ativina; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormônios ou fatores de crescimento; proteína A ou D; fatores reumatoides; um fator neurotrófi- co tal como fator neurotrófico derivado de osso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, ou -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ou NT-6), ou um fator de crescimento de nervos tal como NGF-b; fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF); fator de crescimento de fibroblastos, tais como aFGF e bFGF; fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento transfor- mante (TGF) tal como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-β1, TGF- β2, TGF-β3, TGF-β4 ou TGF-β5; fator de crescimento semelhante à insulina-I e -II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de ligação a fator de crescimento semelhante à insulina (IGFBP); proteínas CD tais como CD3, CD4, CD8, CD19 e CD20; eritropoietina; fatores osteoindutores; imunotoxinas; uma proteína morfogenética óssea (BMP); um interferon tal como interferon-alfa, -beta, e -gama; fatores estimuladores de colônias (CSFs), por exemplo, M-CSF, GM-CSF e G-CSF; interleucinas (IL), por exemplo, IL-1 a IL-10; dismutação de superoxido; receptores de células T; proteínas de membrana de superfície; fator de aceleração de decaimento; antígeno viral tal como, por exemplo, uma porção do envelope da AIDS; proteínas de transporte; receptores de endereçamento; adressinas; proteínas reguladoras; in- tegrinas tais como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, um ICAM, VLA-4 e VCAM; um antígeno associado a um tumor, tais como CA125 (antíge- no do câncer do ovário) ou HER2, HER3 ou HER4; imunoadesinas; e fragmentos e/ou variantes de qualquer uma das proteínas acima listadas bem como os anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpos, ligação a uma proteína, incluindo, por exemplo, qualquer uma das proteínas acima listadas.

[0065] O termo "anticorpo" é utilizado aqui no seu sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anti- corpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada. Um anticorpo pode ser humano, humanizado e/ou maturado por afinidade.

[0066] O termo "anticorpo monoclonal" utilizado aqui se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto pelas mutações de ocorrência natural possíveis que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com preparações de anticorpo (policlonal), as quais incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos em que eles podem ser sintetizados não contaminados por outros anticorpos. O modificador "monoclonal", não é para ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988);Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybri- domas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), recombinant DNA methods in bacterial, eukaryotic animal or plant cells (ver, por exemplo, U.S. Pat. No. 4.816.567); phage-display technologies (ver, por exemplo, Clack- son et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 101(34): 12467-12472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004) e technologies for producing human or human-like antibodies in animals that have parts or all of the human immunoglobulin loci or genes encoding human immunoglobulin sequences (ver, por exemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); Pat. US Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; e 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

[0067] O termo "formulação farmacêutica" se refere a uma prepa ração em cuja forma permite que a atividade biológica do ingrediente ativo seja eficaz, e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos a um indivíduo ao qual a formulação será administrada. Tais formulações são estéreis.

[0068] Transportadores "farmaceuticamente aceitáveis", excipien- tes ou estabilizadores são aqueles que são não tóxicos para a célula ou mamífero exposto aos mesmos, nas dosagens e concentrações utilizadas (Remington's Pharmaceutical Sciences (20° edição), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). Frequentemente, o transportador fisiologicamente aceitável é uma solução tamponada de pH aquoso. Os exemplos de transportadores aceitáveis incluem tampões, como fosfato, citrato e outros ácido orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico; polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona, aminoácidos, tais como glicina, glutamina, aspara- ginas, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos, incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelan- tes, tais como EDTA; álcoois de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; e/ou surfactantes aniônicos, tais como Tween™, glicol polietileno (PEG) e Pluronics™.

[0069] Conforme utilizado neste relatório descritivo e nas reivindi cações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o(a)" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente de outra forma. Assim, por exemplo, referência a "um composto" inclui opcionalmente uma combinação de duas ou mais de tais compostos, e semelhantes.

[0070] Entende-se que aspectos e modalidades da invenção des critos aqui incluem "compreendendo", "consistindo" e "consistindo es-sencialmente de" aspectos e modalidades.

[0071] Referência a "cerca de" um valor ou parâmetro aqui inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas a esse valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição, que se refere a "cerca de X" inclui a descrição de "X". Intervalos numéricos são inclusivos dos números que definem o intervalo.

[0072] Onde os aspectos ou modalidades da invenção são descri tos em termos de um grupo Markush ou outro agrupamento de alternativas, a presente invenção engloba não só a todo o grupo listado como um todo, mas cada membro do grupo individualmente e todos os subgrupos possíveis do grupo principal, mas também o grupo principal na ausência de um ou mais dos membros do grupo. A presente invenção também prevê a exclusão expressa de um ou mais de qualquer dos membros do grupo na invenção reivindicada.

II. Métodos e Utilizações da invenção

[0073] São aqui fornecidos métodos de células para o armazena mento ou armazenamento em um meio de congelamento celular. Também são fornecidos aqui métodos para melhorar a recuperação de descongelamento dos bancos de células. Os métodos compreendem uma etapa de congelamento de células em um meio de congelamento, em que o meio de congelamento compreende uma solução tampona- da e um agente crioprotetor, e em que o meio de congelamento contendo as células tem um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,5 ou cerca de 6,7 a cerca de 8,3 antes do congelamento. Os métodos podem ainda compreender uma etapa de ajustar o pH do meio de congelamento a cerca de 6,7 a cerca de 8,5 ou cerca de 6,7 a cerca de 8,3. Os métodos aqui fornecidos são úteis para a preparação de bancos de células mestre (MCBs) e bancos de células de trabalho (WCBS). Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos melhoram a viabilidade celular e/ou crescimento das células após descongelamento.

[0074] As células eucarióticas (por exemplo, células de mamífero, células de insetos, etc.) para ser utilizadas no congelamento e armazenadas em bancos podem ser preparadas por um processo envolvendo protocolos de cultura de células e concentração conhecida na técnica. O método pode incluir o acúmulo de células, a coleta, e a concentração de células antes de armazenamento de células. O acúmulo celular pode ocorrer por vários métodos. Um exemplo pode utilizar um biorreator controlado por processo para acúmulo de células; no entanto, outros métodos/vasos de cultura podem ser utilizados, bem como (por exemplo, frascos-T, frascos de agitação, frascos roller, vasos giratórios, etc.). Coleta e concentração de células pode ser realizada por centrifugação seguida de ressuspensão do sedimento celular em meio de congelamento. Em outro exemplo, as células podem ser colhidas e concentradas em uma única etapa através de um filtro de fibra oca (HFF). Concentração de células pode também ser conseguida através da utilização de membranas/dispositivos de perfusão alternativa para remover o meio de fluido de cultura celular (membranas de perfusão, decantadores celulares, centrífugas de circulação contínua, etc. por exemplo, flutuante). Em algumas modalidades do método aqui descrito, o processo de coleta e concentração das células ou do fluido da cultura de células coletado é resfriado a uma temperatura igual ou inferior a cerca de 20 °C (por exemplo, igual ou inferior a cerca de qualquer de 19 °C, 18 °C, 17 °C, 16 °C, 15 °C, 14 °C, 13 °C, 12 °C, 11 °C e 10 °C).

[0075] As células sedimentadas ou concentradas podem, então, ser combinadas com um meio de congelamento antes do congelamento das células. Em algumas modalidades, as células sedimentadas podem ser ressuspensas em meio de congelamento. Em algumas modalidades, um meio de congelamento contendo agente crioprotetor concentrado pode ser adicionado para as células coletadas e concentradas ou as células coletadas e concentradas podem ser adicionadas a um meio de congelamento contendo agente crioprotetor concentrado para armazenamento de células. Um meio de congelamento pode compreender uma solução tampão e um agente crioprotetor. Em algumas modalidades, o tampão no meio pode compreender um tampão zwitteriônico. Em algumas modalidades, o tampão no meio pode compreender um tampão selecionado a partir de tampão de bicarbonato, PBS (fosfato salino tamponado), HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil) -1- piperazinoetanossulfônico), MOPS (ácido 3- (N-morfolino) propanos- sulfônico), TES (N- [tris (hidroximetil) metil] -2-aminoetanossulfônico), Tris (tris (hidroximetil) aminometano), TEST (combinação de TES/TRIS), e uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a concentração de tampão no meio de congelamento, antes do congelamento das células é de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, o meio de congelamento antes do congelamento das células contém cerca de 10 mM a cerca de 35 mM de bicarbonato de sódio (por exemplo, cerca de 10 mM, cerca de 15 mM, cerca de 20 mM, cerca de 25 mM, cerca de 30 mM, ou cerca de 35 mM, incluindo qualquer concentração entre estes valores). Em algumas modalidades, o meio de congelamento antes do congelamento das células contém cerca de 10 mM a cerca de 50 mM de HEPES (por exemplo, cerca de 10 mM, cerca de 15 mM, cerca de 20 mM, cerca de 25 mM, cerca de 30 mM, cerca de 35 mM, cerca de 40 mM , cerca de 45 mM, ou cerca de 50 mM, incluindo qualquer concentração entre estes valores). Em algumas modalidades, o meio de congelamento antes do congelamento das células contém cerca de 10 mM a cerca de 12 mM PBS (por exemplo, cerca de 10 mM, cerca de 11 mM, ou cerca de 12 mM, incluindo qualquer concentração entre estes valores). Em algumas modalidades, o meio de congelamento antes do congelamento das células contém cerca de 10 mM a cerca de 20 mM MOPS (por exemplo, cerca de 10 mM, cerca de 12 mM, cerca de 15 mM, cerca de 18 mM, ou cerca de 20 mM, incluindo qualquer concentração entre estes os valores). Em algumas modalidades, o meio de congelamento antes do congelamento das células contém cerca de 10 mM a cerca de 30 mM TES (por exemplo, cerca de 10 mM, cerca de 15 mM, cerca de 20 mM, cerca de 25 mM, ou cerca de 30 mM, incluindo qualquer concentração entre estes valores). Em algumas modalidades, o meio de congelamento antes do congelamento das células contém cerca de 10 mM a cerca de 30 mM TRIS (por exemplo, cerca de 10 mM, cerca de 15 mM, cerca de 20 mM, cerca de 25 mM, ou cerca de 30 mM incluindo qualquer concentração entre estes valores). Em algumas modalidades, o meio de congelamento antes do congelamento das células contém cerca de 10 mM a cerca de 30 mM TEST (por exemplo, cerca de 10 mM, cerca de 15 mM, cerca de 20 mM, cerca de 25 mM, ou cerca de 30 mM, incluindo qualquer concentração entre estes valores). Em algumas modalidades, um agente crioprotetor é um agente permeador ou um agente não permeador. Em algumas modalidades, um agente crioprotetor é um agente selecionado a partir de um grupo que consiste de glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), propanodiol, etileno glicol, e açúcares. Em algumas modalidades, o meio de congelamento adicionado para as células coletadas e concentradas é um meio de congelamento concentrado. Em algumas modalidades, o meio de congelamento contendo agente crioprotetor concentrado pode conter de 20-30% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO) ou de glicerol. Em algumas modalidades, o meio de congelamento concentrado é vertido (por exemplo, 1 parte de meio de congelamento (contendo o agente crio- protetor concentrado) volume: 3 partes de fluido de cultura celular) para as células coletadas e concentradas. Em algumas modalidades, o meio de congelamento contendo as células antes do congelamento das células contém cerca de 5% a cerca de 12,5% de DMSO ou glice- rol.

[0076] Em algumas modalidades, um meio de congelamento pode ainda compreender componentes adicionais encontrados no meio de cultura celular. Em algumas modalidades, o meio de congelamento pode conter Meio Mínimo Essencial de Eagle (EMEM) ou Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM).

[0077] Em algumas modalidades, o método de preparação de uma célula (tal como uma célula de mamífero ou uma célula de inseto) para congelamento pode compreender ainda uma etapa de ajuste do pH de um meio de congelamento ou um meio de congelamento contendo um agente crioprotetor concentrado, em que o pH é ajustado a cerca de 6,7 a cerca de 8,5 antes das células peletizadas ou células concentradas serem combinadas com o meio de congelamento ou o meio de congelamento contendo agente crioprotetor concentrado. Em algumas modalidades, o método de preparação de células (tais como células de mamífero ou células de inseto) para congelamento compreende ainda uma etapa de ajustar o pH do meio de congelamento, contendo as células, em que o pH do meio de congelamento é ajustado para cerca de 6,7 a cerca de 8,5. Em algumas modalidades, o pH ajustado é um pH alvo ou um pH medido.

[0078] Em certas modalidades, a densidade de células antes do congelamento é medida por volume celular compactado (PCV). Em algumas modalidades, o meio de congelamento que compreende células a ser armazenado tem uma densidade celular de 8% a 28% (por exemplo, cerca de qualquer um de 8%, 10%, 15%, 20%, 25% ou 28%) de PCV antes do congelamento. Em algumas modalidades, a densidade celular no meio de congelamento antes do congelamento pode ser de cerca de 21% de PVC.

[0079] Em algumas modalidades, as células em um meio de con gelamento são dispensadas em ampolas ou sacos de utilização única antes do congelamento. Em uma modalidade exemplificativa, o processo envolve: distribuir a suspensão de células em ampolas de vidro autoclavadas, que são colocadas em gelo úmido utilizando uma seringa de autoenchimento autoclavada, selando as ampolas, realizando um teste de integridade, e congelamento de ampolas em um congelador com velocidade controlada e em seguida, a transferência de ampolas para um congelador de nitrogênio líquido durante o armazenamento a longo prazo.

[0080] Em algumas modalidades, a viabilidade das células após descongelamento é melhorada utilizando os métodos aqui descritos. Em algumas modalidades, a viabilidade das células é aumentada em pelo menos cerca de qualquer de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ou 85% em comparação com a viabilidade celular após congelada em um meio de congelamen- to, com um pH de 6,7 ou inferior e/ou sem arrefecimento da coleta de cultura celular durante o processo de coleta e descongelamento.

Ajuste do pH

[0081] De acordo com os métodos tal como aqui descrito, o pH do meio de congelamento (contendo ou não contendo as células) pode ser ajustado, por exemplo, por adição de uma base ao meio. Em al- gumas modalidades, o pH do meio de congelamento é ajustado a um pH que é superior a cerca de 6,7. Em algumas modalidades, o pH do meio de congelamento é ajustado a um valor de pH (pH alvo ou um pH medido) entre cerca de 6,7 e cerca de 8,5. Em algumas modalidades, o pH do meio de congelamento é ajustado para um pH entre cerca de 6,8 a cerca de 8,3, entre 7,0 a cerca de 8,3, entre 7,2 a cerca de 8,3, entre 7,4 a cerca de 8,3, entre de 8,3, entre cerca de de 8,3, entre cerca de de 8,3, entre cerca de de 8,3, entre cerca de 7,6 a cerca de 8,3, entre cerca de 7,7 a cerca de 8,3, ou entre cerca de 7,8 a cerca de 8,3 Em algumas formas de realização, o pH do meio de congelamento é ajustado a um valor de pH (pH alvo ou um pH medido) entre cerca de 7,2 a cerca de 7,8. Em algumas modalidades, o pH alvo ou pH medido é de cerca de 7,2 a cerca de 8,3. Em algumas modali-dades, o pH alvo ou pH medido é de cerca de 7,2 a cerca de 7,8 (por exemplo, pH de cerca de 7,5). Em algumas modalidades, se o primeiro ajuste do pH não é suficiente para aumentar o pH para ficar com o in-tervalo de pH alvo (por exemplo, pH de cerca de 7,3 a cerca de 7,7), é realizado um segundo ajuste do pH. Em algumas modalidades, mais do que um ajuste de pH pode ser realizado.

[0082] A base adicionada para ajustar o pH pode ser qualquer ba se que é bem conhecida para os versados na técnica, mas em modali-dades exemplificativas, a base é carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, HEPES sal de sódio, hidróxido de sódio, ou hidróxido de potás- sio.

[0083] O pH dos meios de congelamento pode ser medido em qualquer ponto antes do congelamento e o pH pode ser ajustado a qualquer momento antes do congelamento. Em algumas modalidades, o pH do meio de congelamento é medido e/ou ajustado antes da com-binação com as células a ser armazenadas. Em outras modalidades, o pH do meio de congelamento é medido e/ou modificado após a combi-nação com as células a ser armazenadas. Em algumas modalidades, o pH do meio de congelamento é medido e/ou ajustado mais do que uma vez. Em algumas modalidades, o pH do meio de congelamento é medido e/ou ajustados por duas vezes, três vezes, ou mais, antes do congelamento. Em outras modalidades, o pH do meio de congelamento é medido e/ou ajustado antes da combinação com as células a ser armazenadas. Em algumas modalidades, o pH é ajustado de acordo com a seguinte equação: Vbase = Cbase*Vp (pHt - pHi), em que Cbase é um coeficiente específico de bases, Vbase é um volume da base para adicionar ao meio de congelamento, Vp é o volume do meio de conge-lamento, pHt é o pH alvo, e o pHi é o pH inicial. Tal como aqui utilizado, o pH inicial é o pH do meio de congelamento contendo as células (isto é, depois de ser combinado com as células), mas antes o pH é ajustado para congelamento. Cbase representa um coeficiente específico que depende do tipo e da concentração de base escolhida para ajuste do pH. O coeficiente Cbase pode ser obtido dependendo da escolha da base. Em uma modalidade exemplificativa, em que a base é carbonato de sódio 1M, o ajuste do pH é realizado de acordo com a Equação 1, abaixo: Equação 1: Cálculo do volume de base para adicionar Ajuste do pH

[0084] em que VNa2CO3 é um volume de carbonato de sódio 1 M a adicionar ao meio de congelamento, Vp é o volume do meio de conge-lamento, pHt é o pH alvo, e o pHi é o pH inicial. O pH inicial é o pH do meio de congelamento contendo as células (isto é, depois de ser com-binado com as células), mas antes do pH ser ajustado para congela-mento. O pH alvo do meio de congelamento pode ser um pH que é superior a um pH fisiológico, tal como um pH acima de 7,2. Em algumas modalidades, o pH alvo do meio de congelamento está entre 7,2 e 8,3. Em algumas modalidades, o pH alvo do meio de congelamento está entre 7,2 e 7,8. Em algumas modalidades, o pH alvo do meio de congelamento está, em qualquer de 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, e 8,3.

[0085] O pH do meio de congelamento pode ser medido utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o pH do meio pode ser medido em analisadores BioProfile® 400 (Nova Biomedical) ou BioPro-file® FLEX (Nova Biomedical). Tal como aqui utilizado, todas as refe-rências a pH neste pedido, incluindo pH medido, pH alvo, pH ajustado, e o pH inicial referem-se a uma medição de pH tirado com a temperatura da amostra ajustada para cerca de 37°C (por exemplo, entre 36°C e 38°C ou entre 35°C e 39°C). III. Meios de Congelamento

[0086] Meio de congelamento de células aqui fornecido pode en contrar utilidade em métodos (por exemplo, um método de congelamento de células eucarióticas (por exemplo, células de mamífero, células de insetos, etc.); e/ou um método de melhorar a recuperação de descongelamento de bancos de células compreendendo células euca- rióticas (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto)) e nas composições (por exemplo, um conjunto de células compreendendo uma solução tamponada, um agente crioprotetor, e células eucarióti- cas (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto)).

[0087] Em algumas modalidades, um meio de congelamento aqui descrito compreende uma solução tamponada e um crioprotetor. Em algumas modalidades, o tampão compreende um tampão zwitteriôni- co. Em algumas modalidades, o tampão inclui PBS, HEPES, TES, TRIS, e TEST.

[0088] O meio de congelamento pode compreender qualquer agente crioprotetor conhecido na técnica e aqui descrito, tal como DMSO, glicerol, etileno glicol, macromoléculas não permeantes, açú-cares, etc. Em algumas modalidades, a concentração de DMSO ou glicerol no meio de congelamento celular é 5% -12,5% em volume (v/v) após a combinação com as células a ser armazenadas. Em algumas modalidades, o meio de congelamento pode ser fornecido pela adição de um meio de congelamento contendo tampões e/ou crioprotetor concentrado em células concentradas. Em algumas modalidades, o agente crioprotetor concentrado em meio de congelamento pode conter cerca de 20% a cerca de 30% (v/v) de DMSO ou glicerol.

[0089] Em algumas modalidades, um meio de congelamento pode compreender componentes adicionais encontrados no meio de cultura celular. Em algumas modalidades, F10 de Ham (Sigma), Meio Mínimo Essencial ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio Eagle Modificado de Dulbecco ([DMEM], Sigma) que são adequados para a cultura de células de mamíferos, podem ser adicionados para o meio de con-gelamento para congelar células de mamíferos aqui descritas. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham e Wallace, Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes e Sato, Anal. Biochem., 102: 255 (1980), Vijayasankaran et al, Biomacromolecules, 6:605: 611 (2005), Patkar et al, J. Biotechnology, 93:217-229 (2002), Pat. Nos. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; ou 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/00195; Pat. US No. Re. 30.985; ou US Pat. No. 5.122.469, as divulgações de todas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade, podem ser complementados ou modificados tal como aqui descrito.

[0090] Como seria entendido por um especialista na matéria, o meio de congelamento celular aqui descrito pode compreender outros componentes que são úteis para a cultura de células ou congelamento. Por exemplo, entende-se que os meios de comunicação podem compreender componentes adicionais, tais como aminoácidos (por exemplo, glutamina, arginina, ou asparagina), vitaminas (incluindo, mas não limitados a vitaminas B, tais como qualquer um ou mais de vitamina B1, vitamina B2, vitamina B3, vitamina B6, vitamina B7, vitamina B9, vitamina B12 ou), metais de transição (incluindo mas não se limitando ao níquel, de ferro (por exemplo, ferro férrico ou ferroso), ou de zinco), e outros componentes dos meios. Qualquer um desses meios pode ser suplementado conforme necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), íons (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleosídeos (tais como adenosina e timidina), oligoelementos (definidos como compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais na gama micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Em alguns aspectos, um meio de congelamento aqui fornecido contém proteínas derivadas de uma planta ou um animal. Em algumas modalidades, um meio de congelamento é aqui fornecido livre de proteínas derivadas de uma planta ou um animal. Quaisquer outros suplementos necessários também podem ser incluídos em concentrações apropriadas que serão conhecidas por aqueles versados na técnica.

[0091] O meio de congelamento de células (um conjunto de célu las) tal como aqui descrito pode ainda compreender uma ou mais células a ser depositadas. Em uma modalidade exemplificativa, estas células são células de mamífero, tais como células CHO. Tipos de células exemplificativos que podem encontrar utilização nos métodos aqui descritos incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), células de mieloma de murino NS0, células humanas PER.C6® e hibridomas. Em uma outra modalidade exemplificativa, estas células são células de insetos, tais como High FiveTM, S2 (Schneider 2), Sf9 e Sf21. Em al-gumas modalidades, as células são células recombinantes compreen-dendo um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo (por exemplo, uma proteína terapêutica).Como um especialista na técnica iria apreciar, estas células podem ainda compreender plasmídeos re- combinantes ou outros compostos biológicos úteis. Em algumas moda-lidades, as células a serem armazenadas podem ser úteis para a pro-dução de proteínas terapêuticas e produtos biológicos, tais como anti-corpos, fragmentos de anticorpos, enzimas, proteínas de fusão do re-ceptor, ou fragmentos dos mesmos. IV. Células Eucarióticas e Bancos de Células

[0092] É também aqui fornecido um banco de células que compre ende uma pluralidade de recipientes e cada recipiente contendo um meio de congelamento contendo uma célula eucariótica (por exemplo, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, etc.), que compreende um ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico heterólogo,) que codifica um polipeptídeo, em que o meio tem um pH de cerca de 6,7 a cerca de 8,5 antes de congelamento da célula. O banco de células pode ser um Prebank, um banco de células mestre (MCB), ou de um banco de células de trabalho (WCB). Um Prebank pode compreender recipientes congelados (por exemplo, armazenados no congelador de nitrogênio líquido) (por exemplo, ampolas) contendo células que produzem um polipeptídeo específico a partir do qual um MCB está preparado. Um disjuntor pode compreender recipientes congelados (por exemplo, armazenados no congelador de nitrogênio líquido) (por exemplo, ampolas) contendo uma cultura de células derivadas a partir da subcultura do Prebank e a partir do qual todas as células para a produção de subsequências são derivadas. Os MCBs são produzidos e armazenados de acordo com cGMPs e podem ser utilizados para a produção do produto polipeptídico. Um WCB pode compreender reci-pientes congelados (por exemplo, armazenados no congelador de ni-trogênio líquido) (por exemplo, ampolas) contendo uma cultura de células derivadas a partir da subcultura do MCB. WCBs são produzidos e armazenados de acordo com cGMPs e podem ser utilizados para a produção do produto polipeptídico. Em algumas modalidades, os reci-pientes são ampolas.

[0093] As células eucarióticas (por exemplo, células de mamífero, células de insetos, etc.) que podem ser congeladas em um meio de congelamento e armazenadas como aqui descrito pode incluir quaisquer células eucarióticas que podem ser cultivadas e/ou são úteis para a produção de um polipeptídeo. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de mamífero, tal como células de Ovário de Hamster Chinês (CHO). Células CHO podem incluir, mas não estão limitadas a, células DHFR- CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 77:4216 (1980)), por exemplo, ATCC® CRL-9096TM; e CHO-K1 (ATCC® CRL-61TM).

[0094] Outros exemplos de células de mamíferos incluem, sem limitação, a linha de rim de macaco CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim embrionária humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de filhotes de hamster (BHK, ATCC CCL-10); células sertoli de camundongos (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde Africano (VE- RO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HE- LA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato bufalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linha de hepatoma humano (Hep G2). Outras linhas de células hospedeiras de mamífero úteis incluem linhas de células de mieloma, tais como NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhas de células hospedeiras de mamífero adequadas para a produção de anticorpos, ver, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).

[0095] Em algumas modalidades, a célula é uma linha celular de inseto, tal como High FiveTM, S2 (Schneider 2), Sf9 e Sf21.

[0096] Em algumas modalidades, as células aqui descritas (por exemplo, célula de mamífero, ou células de inseto) compreendem um ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico heterólogo) que codifica um polipeptídeo e as células são úteis para a produção do polipep- tídeo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é introduzido nas células. Podem ser utilizados quaisquer métodos conhecidos na técnica para introdução de um ácido nucleico para uma célula. Por exemplo, as células podem ser transformadas com vetores (por exemplo, um vetor de expressão) compreendendo um ou mais ácidos nucleicos que codificam o polipeptídeo. Em algumas modalidades, a célula é uma linha de células estável. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma enzima, e uma proteína de fusão do receptor.

[0097] Exemplos de polipeptídeos de mamífero incluem proteínas, tais como, por exemplo, renina; um hormônio de crescimento, incluindo o hormônio do crescimento humano e hormônio de crescimento bovino; fator de liberação de hormônio de crescimento; hormônio da pa- ratireoide; hormônio estimulador da tireoide; lipoproteínas; alfa-1- antitripsina; insulina de cadeia A; insulina cadeia-B; pró-insulina; hor- mônio folículo estimulante; calcitonina; hormônio luteinizante; glucagon; fatores de coagulação tais como fator VIIIC, fator IX, fator tecidu- al, e fator de von Willebrands; fatores anticoagulação tais como Proteína C; fator natriurético atrial; surfactante pulmonar; um ativador de plasminogênio, tal como uroquinase ou urina ou ativador do plasmino- gênio humano de tipo tecidual (t-PA); bombesina; trombina; fator de crescimento hematopoiético; fator de necrose tumoral-alfa e -beta; en- cefalinase; RANTES (regulado na ativação normalmente expresso e secretado por células T); proteína inflamatória de macrófagos humanos (MIP-1-alfa); uma albumina do soro tal como albumina do soro humano; substância inibidora Muellerian; relaxina de cadeia A; relaxina de cadeia-B; prorelaxina; peptídeo associado a gonadotropina de camundongo; uma proteína microbiana, tal como beta-lactamase; DNase; IgE; um linfócito T citotóxico antígeno associado (CTLA), tal como CTLA-4; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormônios ou fatores de crescimento; proteína A ou D; fatores reumatoides; um fator neurotrófico tal como fator neurotrófico derivado de osso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, ou -6 (NT-3, NT-4, NT-5 ou NT-6), ou um fator de crescimento neural tal como NGF-b; fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF); fator de crescimento de fibroblastos, tais como aFGF e bFGF; fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento transformante (TGF) tal como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, ou TGF-β5; fator de crescimento semelhante a insulina-I e -II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de ligação a fator de crescimento semelhante a insulina (IGFBP); proteínas CD tais como CD3, CD4, CD8, CD19 e CD20; eritropoietina; fatores osteoindu- tores; imunotoxinas; uma proteína morfogenética óssea (BMP); um interferon tal como interferon-alfa, -beta, e -gama; fatores estimuladores de colônias (CSFs), por exemplo, M-CSF, GM-CSF e G-CSF; inter- leucinas (IL), por exemplo, IL-1 a IL-10; dismutação de superoxido; re-ceptores de células T; proteínas de membrana de superfície; fator de aceleração de decaimento; antígeno viral tal como, por exemplo, uma porção do envelope da AIDS; proteínas de transporte; receptores de homing; adressinas; proteínas reguladoras; integrinas tais como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, um ICAM, VLA-4 e VCAM; um antíge- no associado a um tumor, tais como CA125 (antígeno do câncer do ovário) ou HER2, HER3 ou HER4; imunoadesinas; e fragmentos e/ou variantes de qualquer uma das proteínas acima listadas bem como os anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpos, ligação a uma proteína, incluindo, por exemplo, qualquer uma das proteínas acima listadas.

[0098] Em algumas modalidades, as células aqui descritas (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) compreendem um ácido nucleico que codifica um anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população subs-tancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, Nova Iorque, 1981)), métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, Pat. n° U.S. 4.816.567), tecnologias de exibição de fagos (ver, por exemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004) e tecnologias para a produção de anticorpos humanos ou similares a humanos em animais que possuem parte ou todos os loci de imunoglobulinas humanas ou genes que codificam as sequências de imunoglobulinas humanas (ver, por exemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); Pat. n° U.S. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995). Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo humano, um anticorpo derivado de biblioteca ou um anticorpo multiespecífico. Em algumas modalidades, o anticorpo é um fragmento de ligação ao antígeno. Exemplos de fragmentos de antígeno incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e fragmentos Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. O fragmento Fab contém os domínios variáveis de cadeia pesada e leve e contém também o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos Fab' diferem de fragmentos Fab pela adição de poucos resíduos na extremidade carboxi terminal do domínio CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação neste documento para Fab' no qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes carregam um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab', os quais têm cisteínas de dobradiça entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos. "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de ligação ao antígeno completo. Frag-mentos de anticorpos "Fv de cadeia simples" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipeptídeo scFv adicionalmente compreende um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL o qual permite que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação ao antígeno. Para uma análise de scFv, ver Pluckthün, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., (Springer-Verlag, Nova York, 1994), pág. 269-315. Muitos dos métodos para a purificação de um anticorpo descrito acima pode ser convenientemente adaptado para a purificação de um fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno.

[0099] Em algumas modalidades, os anticorpos codificados pelo ácido nucleico nas células (por exemplo, células de mamífero ou células de inseto) incluindo anticorpos de diagnóstico e terapêuticos. Os anticorpos dentro do âmbito da presente invenção incluem, mas não estão limitados aos: anticorpos anti-HER2 incluindo Trastuzumab (HERCEPTIN®) (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:42854289 (1992), Pat. n° U.S. 5.725.856); anticorpos anti-CD20, tais como anti-CD20 quimérico "C2B8", como na Pat. n° U.S. 5.736.137 (RITU- XAN®), uma variante humanizado ou quimérico do anticorpo 2H7 como na Pat. n° U.S. 5.721.108B1, ou Tositumomab (BEXXAR®); anti-IL- 8 (St John et al, Chest., 103: 932 (1993), e Publicação Internacional n° WO 95/23865); anticorpos anti-VEGF, incluindo anticorpos anti-VEGF humanizado e/ou maturado por afinidade tal como o anticorpo anti- VEGF humanizado huA4.6.1 Avastin® (Kim et al, Growth Factors, 7:53-64 (1992), Publicação Internacional n° WO 96/30046, e WO 98/45331, publicado em 15 de outubro de 15, 1998); anticorpos anti- PSCA (WO01/40309); anticorpos anti-CD40, incluindo S2C6 e variantes humanizados destes (documento WO00/75348); anti-CD11a (Pat. n° U.S. 5.622.700, WO 98/23761, Steppe et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991), e Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)); anti-IgE (Presta et al., J. Immunol. 151: 2623-2632 (1993), e Publicação Internacional n° WO 95/19181); anti-CD18 (Pat. n° U.S. 5.622.700, concedido em 22 de abril de 1997, ou como em WO 97/26912, publicado em 31 de julho de 1997); anti-IgE (incluindo E25, E26 e E27; Pat. n° U.S. 5.714.338, concedido em 3 de fevereiro de 1998 ou Pat. n° U.S. 5.091.313, concedido em 25 de fevereiro de 1992, WO 93/04173 publicado em 4 de março de 1993, ou Pedido de Patente Internacional n° PCT/US98/13410 depositado em 30 de junho de 1998, Pat. n° U.S. 5,714,338); anticorpo anti-receptor de Apo-2 (WO 98/51793 publicado em 19 de novembro de 1998); anticorpos anti-TNF-α incluindo o cA2 (REMICADE®), CDP571 e MAK-195 (Veja, Pat. n° U.S. 5,672,347 emitido em 30 de setembro de 1997, Lorenz et al., J. Immunol. 156(4):1646-1653 (1996), e Dhainaut et al., Crit. Care Med. 23 (9): 1461-1469 (1995)); Anti-Fator Tecidual (TF) (Patente de Invenção Europeia n° 0 420 937 B1 concedido e 9 de novembro de 1994); integrina anti-humana α4β7 (WO 98/06248 publicado em 19 de fevereiro de 1998); anti-EGFR (anticorpo quimerizado ou humanizado 225 como em WO 96/40210 publicado em 19 de dezembro de 1996); anticorpos anti-CD3, tais como OKT3 (Pat. n° U.S. 4.515.893 emitido 07 de maio de 1985); anticorpos anti-tac como CHI-621 (SIMULECT®) e (ZENA- PAX®) anti-CD25 ou (Consulte Pat. n° U.S. 5.693.762 emitido em 2 de dezembro de 1997); anticorpos anti-CD4, tais como o anticorpo cM- 7412 (Choy et al, Arthritis Rheum 39 (1): 52-56 (1996)); anticorpos anti-CD52, tais como CAMPATH-1H (Riechmann et al., Nature 332: 323337 (1988)); anticorpos anti-receptor de Fc, tais como o anticorpo M22 direcionado contra Fc.gamma.RI como em Graziano et al., J. Immunol. 155 (10): 4996-5002 (1995); anticorpos de antígeno anti- carcinoembrionário (CEA), tais como hMN-14 (Sharkey et al, Cancer Res 55 (23 Supl): 5935s-5945s (1995); anticorpos direcionados contra as células epiteliais da mama incluindo huBrE-3, hu-Mc 3 e CHL6 (Ce- riani et al., Cancer Res. 55 (23): 5852s-5856s (1995); e Richman et al., Cancer Res. 55 (23 Supl): 5916s-5920s (1995)); anticorpos que se ligam as células do carcinoma do cólon, tais como C242 (Litton et al., Eur J. Immunol. 26 (1): 1-9 (1996)); anticorpos anti-CD38, por exemplo, AT 13/5 (Ellis et al., J. Immunol. 155 (2): 925-937 (1995)); anticorpos anti-CD33, tais como Hu M195 (Jurcic et al, Cancer Res 55 (23 Supl): 5908s-5910s (1995) e CMA-676 ou CDP771; anticorpos anti- CD22, tais como LL2 ou Lymph °Cide (Juweid et al, Cancer Res 55 (23 Supl): 5899s-5907s (1995)), anticorpos anti-EpCAM como o 17-1A (PANOREX®); anticorpos anti-GPIIb/IIIa como abciximab ou Fab c7E3 (ReoPro®); anticorpos anti-RSV, tais como MEDI-493 (SYNAGIS®); anticorpos anti-CMV, tais como PROTOVIR®; anticorpos anti-HIV, tais como PRO542; anticorpos anti-hepatite, tais como o anticorpo antihepatite B OSTAVIR®; anticorpo anti-CA 125 OvaRex; anti-idiotípico epítopo GD3 BEC2; anticorpo anti-aVβ3 VITAXIN®; anticorpo carcinoma de células renais anti-humana, tal como CH-G250; ING-1; anticorpo 17-1A anti-humano (3622W94); anticorpo anti-humano do tumor colorretal (A33); anticorpo anti-humano de melanoma R24 direcionado contra gangliosídeo GD3; carcinoma de células escamosas anti- humano (SF-25), e de antígenos de leucócitos anti-humano (HLA) anticorpos como o Smart ID10 e o anticorpo anti-HLA DR Oncolym (Lym- 1). Os antígenos alvos preferidos para o anticorpo aqui são: receptor HER2, VEGF, IgE, CD20, CD11a e CD40.

[00100] Os Exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar, mas não para limitar a invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Efeito do pH no agrupamento, Manter a Temperatura e Manter o Tempo sobre a viabilidade celular descongelada Método de Adição de Base para pH de Armazenamento de Controle (Estudo de Pequena Escala # 1)

[00101] Um estudo foi executado para avaliar a viabilidade de realizar um ajuste de pH simples a partir do pior caso e as condições para o agrupamento típico (pH alvo inicial de 6,2 e 6,7, respectivamente) para melhorar a recuperação degelo. Várias metas de ajuste de pH foram estudadas para determinar pH de armazenamento ideal. O pH foi medido utilizando o instrumento BioProfile® 400 (Nova Biomedical) com a temperatura ajustada para 37 °C. Da mesma forma, os cálculos de pH usando a Equação 1 baseiam-se uma temperatura de amostra de 37 °C.

[00102] As células foram sedimentadas através de centrifugação. Os agrupamentos de células foram gerados para cada condição de teste por ressuspensão de células para 100x106 células/mL em meio gasto. Os agrupamentos de células foram agitados a 37 °C com ou sem gás de membranas permeáveis para CO2/O2 troca de conduzir pH para rubricar condições de pH (seja 6,2 ou 6,7). Ao atingir os objetivos iniciais de pH, agrupamentos foram rapidamente resfriados a <10 °C e 20% (v/v) do meio de congelamento DMSO foi adicionado (1:3 partes de fluido de cultura de células). AjusteAjustes de pH foram realizados utilizando a equação 1 para calcular os volumes necessários de adição de carbonato de sódio a 1M para atingir o pH de 6,9, 7,1, e 7,3 e uma medição desligada de pH final foi feita para confirmar a um aumento apropriado do pH antes da geração simulada de banco (pH de armazenamento atual foi 6,9, 7,1/7,2 e 7,5).

[00103] Os resultados de descongelamento mostraram uma melhoria dramática no dia 1 de viabilidade de até 68% (de 24% a 92% para o ajuste de pH 6,2 a 7,5) (FIG. 2A), e melhoria no dia 4 PCV de até 0,64% (de 0,17% a 0,81% para o ajuste de pH 6,2 a 7,5) (FIG. 2B). Equação 1:

Cálculo do volume de base para adicionar Ajuste ao pH VNa 2 CO 3 = 0.0085 • Vp •( PHt - PHt ) ,

[00104] Onde VNa2CO3 = Volume de Carbonato de Sódio 1M para adicionar, Vp = Volume de agrupamento, pHt = pH alvo, pHi = pH inicial, Método de Adição de Base para controle de pH no armazenamento (Pequena escala adicional de estudos de pH)

[00105] Seguindo procedimentos semelhantes aos descritos acima, vários estudos foram executados para estudar o efeito do ajuste de pH em linhas de células adicionais.

[00106] Foram selecionados um total de nove linhas celulares de CHO que cobrem vários tipos de células (DP12, CHO-K1). Nos dias anteriores à banca, as células foram mantidas de acordo com protocolos padrão. As células foram sedimentadas através de centrifugação e agrupamentos simulados de aproximadamente 60-90 ml foram gerados para cada condição de teste por ressuspensão em meio gasto para hematócrito 28% (PCV). Os agrupamentos de células foram agitados a 37 °C com ou sem gás de membranas permeáveis para CO2/O2 troca de conduzir pH para rubricar condições de pH (seja 6,2 ou 6,7). Estes dois pontos de ajuste de pH iniciais foram escolhidos para simular o pior caso potencial e as condições típicas experimentadas durante e após a concentração do filtro de fibra oca. Ao atingir os objetivos iniciais de pH, os agrupamentos foram rapidamente resfriados a <10 °C e 20% (v/v) do meio de congelamento DMSO foi adicionado (1:3 partes da cultura de células de fluido), para alcançar um hematócrito final de 21%. AjusteAjustes de pH foram realizados após usar a Equação 1 para calcular o volume necessário de adição de carbonato de sódio 1M para ajuste do pH a 7,0, 7,3, 7,6 ou 8,0. Uma medição desli-gada de pH final foi feita para confirmar um aumento apropriado do pH antes da geração do banco de células.

[00107] Todos os casos foram descongelados em duplicado com uma ampola de descongelamento em cada recipiente. Os resultados demonstraram que todos os tipos de células previamente expostos para baixar o pH poderiam recuperar quando ajustado para valores de pH acima de 7,3 antes do armazenamento. Cada linha de células demonstrou sensibilidade diferente para pH bancário. Ajuste a um pH de aproximadamente 7,5 resultou no dia 1 de descongelamento acima de 80% na maioria dos casos (FIGs. 3A-3F e FIGs. 4A-4B). As taxas de crescimento após descongelação só foram impactadas na extremidade inferior do intervalo de pH testados. Curiosamente, a extremidade su-perior do intervalo de pH testado (perto 8,0-8,2) não afetou negativa-mente a recuperação do degelo apesar de ser significativamente maior do que o pH fisiológico normal.

[00108] Os estudos (ensaios dos tipos de células CHO-K1) foram expandidos para capturar mais informações sobre a exposição em longo prazo a pH elevado. Esses estudos testaram bancos simulados congelados imediatamente após (t0) o ajuste de pH (semelhante a todos os casos de teste em pequena escala anteriores) e em um segundo ponto de tempo de duas horas mais tarde (t2). Durante as duas horas de espera, os agrupamentos em miniatura (cerca de 10 mL por caso) foram realizados em tubos FALCON® submersos em gelo húmido. Houve uma ligeira variação do pH, através da etapa de retenção que resultou em uma alteração de até 0,2 unidades de pH. Os resultados desses estudos indicaram que uma exposição de duas horas aos intervalos de pH testados neste estudo não teve impacto (um exemplo é mostrado nas FIGs. 6A-6B). Métodos para refrigerar o fluido da cultura celular durante a coleta

[00109] Um processo de "coleta de bombeamento lento", em combinação com um trocador de calor de arrefecimento foi adotado para introduzir a capacidade de refrigeração para o processo de armazenamento de células tradicionais. Especificamente, o processo de "coleta de bomba lenta" necessário para redução da taxa de fluxo de coleta típica de cerca de 4L/min a 600 mL/min para coincidir com taxas de coleta registradas para execuções tradicionais de produção de armazenamento de células. Uma linha de trocador de calor de arrefecimento, de comprimento 15' de tamanho 15 da tubulação de silicone curado com platina totalmente submersa em gelo húmido, foi inserido no trajeto de escoamento da coleta. Tendências de temperatura obtidas durante uma execução com água simulada demonstraram que o "processo de coleta refrigerado" foi capaz de reduzir as temperaturas de cultura de cerca de 12 °C nos primeiros 30 minutos antes da concentração de filtro de fibra oca. Com base em dados a 10 °C, esta capacidade de refrigeração provavelmente suspende o metabolismo celular e impede uma deriva de baixo pH. Resultados do Estudo de Confirmação do Processo

[00110] Processo de armazenamento de células. Bancos de células são produzidos pelas primeiras células que se acumulam em um processo de cultura de células de batelada/perfusão e então coleta de células para armazenamento. A fonte inicial de células foi de um MCB (para a geração de WCB). O processo envolveu três fases: acúmulo de células, coleta e concentração de células e armazenamento de células. O objetivo da etapa de acúmulo de células foi gerar o número de células necessário para a produção de um MCB de tamanho completo ou WCB (420 x 1 mL ou 10 ampolas ml, respectivamente) de uma só vez. As células foram cultivadas em meio seletivo com semente durante o aumento de escala inicial e durante um processo de biorreator de balanço. Uma etapa do processo de coleta serviu para concentrar o fluido de cultura celular final através de um filtro de fibra oca (HFF) para densidades celulares necessárias para o armazenamento. Um processo de reunião e preenchimento posterior serviu para preparar ampolas do banco de células para armazenamento em longo prazo. O processo de agrupamento foi realizado em gelo húmido de tal modo que foi mantida uma determinada faixa de temperatura (cerca de 5-10 °C). O fluxo do processo para o processo é mostrado na FIG. 1.

[00111] Os processos de coleta e concentração de células foram executados usando um cartucho de filtro de fibra oca. Tendências de pH offline mostrou que o "processo de coleta refrigerado" foi eficaz na redução da queda do pH durante a concentração de células em cerca de 0,35 unidades de pH (de ~6,30 a 6,66 para processos originais e "refrigerados", respectivamente). Após ajuste do pH, os bancos de cé-lulas refrigerados foram criados em intervalo de tempo precoce (0 min) e tardia (120 min) para verificar se há impacto transitório de pH de re-tenção de agrupamento de células.

[00112] Os bancos de células resultantes foram avaliados quanto ao desempenho em cultura primária. Ampolas de banco de células foram descongeladas em frascos de agitação, em vez de biorreatores usando uma série de 1:250 de diluição (1:10, depois 1:25). Resultados de descongelamento com sucesso demonstraram que o processo atual (coleta gelada e ajuste do pH) foi capaz de entregar bancos com o desempenho de degelo aceitável. Enquanto que, o banco de células gerado a partir do processo original experimentou uma diminuição da viabilidade, esses novos bancos de células foram consistentes e varia-ram de 79,1-85,3% em dia 1 viabilidade (cerca de 65% de melhoria). Não se observou qualquer impacto adverso, uma vez que as células foram mantidas a pH elevado ao longo do tempo.

[00113] A análise mostrou que as células dos agrupamentos ajustados a pHs mais elevados eram menores em tamanho (FIG. 5). Essa mudança observada em tamanho pode indicar que um pH mais elevado provoca a desidratação celular (possivelmente devido a um aumento da pressão osmótica ou elasticidade melhorada da membrana celular, permitindo encolhimento celular, ou ambos).

Conclusões

[00114] O pH no armazenamento foi determinado como sendo o mais crítico para o desempenho pós-descongelamento, impactando as viabilidades do dia 1 de descongelamento em até 65%. Como tal, me-lhorias de processo introduzidas no processo de coleta e armazenamento foram concebidas para reduzir a exposição de células a pH baixo e para melhorar o controle sobre o pH no armazenamento. Em última análise, dois aprimoramentos foram introduzidos no processo, incluindo: 1) resfriar o fluido de cultura de células durante a coleta com tubo de silicone trocador de calor; e 2) utilizar uma etapa de ajuste de pH para aumentar o pH de armazenamento para 7,5.

Claims (35)

1. Método para melhorar a recuperação por descongelamento de bancos de células, caracterizado pelo fato de que compreende o congelamento de células CHO para armazenamento em um meio de congelamento, em que o meio de congelamento compreende uma solução tamponada e um agente crioprotetor, e em que o pH do meio de congelamento foi ajustado para um pH de 7,5 a 8,5 antes do congelamento.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH do meio de congelamento foi ajustado para um pH de 7,5.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri-zado pelo fato de que as células são combinadas com um meio de congelamento, antes e/ou após o ajuste de pH.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um método de congelamento de células CHO para armazenamento, compreendendo ajustar o pH de um meio de congelamento contendo células CHO para um pH de 7,5 a 8,5, antes do congelamento das células CHO, em que o meio de congelamento compreende uma solução tamponada e um agente crioprotetor.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o pH é ajustado a um pH de 7,5 a 8,3.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o pH é ajustado para um pH de 7,5.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de medir um pH inicial do meio de congelamento contendo as células antes de ajustar o pH do meio de congelamento.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o pH do meio de congelamento é ajustado mediante adição de uma base ao meio de congelamento de acordo com a seguinte fórmula Vbase = Cbase*Vp (pHt - pHi), em que Cbase é um coeficiente base-específico, Vbase é um volume da base para adicionar ao meio de congelamento, Vp é o volume do meio de congelamento, pHt é o pH alvo e o pHi é o pH inicial.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o pH do meio de congelamento é ajustado mediante adição de carbonato de sódio ao meio de congela-mento de acordo com a seguinte fórmula VNa2CO3 = 0,0085Vp (pHt - pHi), em que VNa2CO3 é um volume de carbonato de sódio a 1M para adicionar ao meio de congelamento, Vp é o volume do meio de congelamento, pHt é o pH alvo e pHi é o pH inicial.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracte-rizado pelo fato de que o pH alvo é 7,5 a 8,3.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda ajustar o pH de um meio de congelamento a um pH de 7,5 a 8,5 e combinar as células CHO com o meio de congelamento para formar um conjunto de células antes de congelar as células CHO no grupo de células, em que o meio de congelamento compreende uma solução tamponada e um agente crioprotetor; .

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o pH é ajustado para um pH de 7,5.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o pH ajustado é um pH alvo ou um pH medido.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o pH alvo é 7,5 a 8,3.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que o pH medido é 7,5 a 8,3.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de medir o pH ajustado do meio de congelamento.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que se o pH medido do meio de congelamento estiver abaixo de um pH alvo, é repetida a etapa de ajuste e a etapa de medição até que o pH ajustado do meio de congelamento seja de 7,5 a 8,5.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o pH é ajustado pela adição de uma base.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a base é selecionada do grupo que consiste em carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, sal de sódio HEPES, hidróxido de sódio e hidróxido de potássio.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que as células CHO estão em um meio com um pH de 6,2 a 6,6 antes que as células CHO sejam combinadas com o meio de congelamento.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o agente crioprotetor é DMSO, glicerol, propanodiol, etileno glicol ou açúcar.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o agente crioprotetor é DMSO ou glicerol e o DMSO ou glicerol no meio de congelamento antes do congelamento das células ou o conjunto de células está em uma concentração de 5% a 12,5% em volume.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o DMSO ou glicerol no meio de congelamento antes do congelamento das células ou do conjunto de células está em uma concentração de 5% a 10% em volume.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o meio de congelamento ou o conjunto de células contém as células CHO a uma densidade celular de 8% a 28% do volume celular compactado (PCV).

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de resfriamento do fluido de cultura de células durante o processo de colheita e concentração de células antes que as células CHO sejam combinadas com o meio de congelamento.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o fluido de cultura de células é resfriado a uma temperatura igual ou inferior a 20°C.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o fluido de cultura de células é resfriado a uma temperatura igual ou inferior a 10°C.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que as células CHO compreendem um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma proteína terapêutica.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é selecionada do grupo consistindo em um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma enzima e uma proteína de fusão do receptor.

31. Grupo de células CHO para o congelamento de células de mamíferos, caracterizado pelo fato de que compreende uma solução tamponada, um agente crioprotetor e células CHO que compreendem um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, em que o meio tem um pH de 7,5 a 8,5 antes do congelamento das células.

32. Banco de células, caracterizado pelo fato de que com-preende uma pluralidade de recipientes e cada recipiente contém (a) um meio de congelamento que compreende uma solução tamponada e um agente crioprotetor, e (b) células CHO que compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, em que o meio de congelamento tem um pH de 7,5 a 8,5 antes do congelamento da célula.

33. Banco de células, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que os recipientes são ampolas.

34. Grupo de células, de acordo com a reivindicação 31, ou banco de células, de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma proteína terapêutica.

35. Banco de células, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é selecionada do grupo consistindo em um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma enzima e uma proteína de fusão do receptor.

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