ES2825574T3

ES2825574T3 - Ajuste del pH para mejorar la recuperación por descongelación de bancos de células

Info

Publication number: ES2825574T3
Application number: ES15750845T
Authority: ES
Inventors: Angela Meier; Steven Meier; Phillip Duffy; Marcia Coyne; Kara Calhoun
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-07-09
Filing date: 2015-07-09
Publication date: 2021-05-17
Anticipated expiration: 2035-07-09
Also published as: JP2017521075A; BR112017000142A2; HRP20201663T1; IL249659B; AU2015287760A1; CA2953154C; JP6826975B2; AU2015287760B2; EP3166401A1; US10602739B2; CN106686977A; ZA201700178B; RU2017104107A; US20170112122A1; EP3777535A1; RU2714759C2; RU2017104107A3; SI3166401T1; JP2020072668A; US20200315162A1

Abstract

Un procedimiento para congelar células CHO para su almacenamiento que comprende congelar las células CHO en un medio de congelación, en el que el medio de congelación comprende una solución tamponada y un agente crioprotector, y en el que el pH del medio de congelación se ajusta a un pH de 7,5 a 8,5 antes de la congelación.

Description

DESCRIPCIÓN

Ajuste del pH para mejorar la recuperación por descongelación de bancos de células

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a procedimientos para congelar células de ovario de hámster chino para su almacenamiento en bancos de células y congelar medios para su uso en la congelación de dichas células. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los bancos de células se producen acumulando primero células en un procedimiento de cultivo celular por lotes/perfusión y, a continuación, recolectando las células para almacenarlas en bancos de células. El procedimiento implica tres fases: acumulación celular, recolección y concentración celular, y almacenamiento en bancos de células. Una etapa del procedimiento de recolección sirve para concentrar el fluido de cultivo celular final o para extraer las células del fluido de cultivo celular mediante centrifugación. Un procedimiento posterior de agrupamiento y llenado sirve para preparar ampollas de bancos de células para su almacenamiento a largo plazo. Estos procedimientos tradicionales pueden dar como resultado una viabilidad inconsistente o escasa después de la descongelación para líneas celulares seleccionadas. Resulta imprescindible para el procedimiento de almacenamiento en bancos de células una alta viabilidad celular después de la descongelación de las células congeladas. Por tanto, son deseables procedimientos mejorados de congelación de células para el almacenamiento en bancos de células. Sería beneficioso un medio de cultivo celular para congelar células que permita una mayor viabilidad celular cuando se descongelan después del almacenamiento en bancos de células. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en el presente documento son solo para referencia.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona los siguientes modos de realización:

1. Un procedimiento para congelar células CHO para su almacenamiento que comprende congelar las células CHO en un medio de congelación, en el que el medio de congelación comprende una solución tamponada y un agente crioprotector, y en el que el pH del medio de congelación se ajusta a un pH de 7,5 a 8,5 antes de la congelación.

2. El procedimiento del modo de realización 1, en el que el pH del medio de congelación se ha ajustado a a) un pH de 7,5 a 8,3; o

b) un pH de aproximadamente 7,5.

3. El procedimiento del modo de realización 2, en el que las células se combinan con un medio de congelación antes y/o después del ajuste del pH.

4. El procedimiento de uno cualquiera de los modos de realización 2-3, que comprende además una etapa de medición de

a) un pH inicial del medio de congelación que contiene las células antes de ajustar el pH del medio de congelación; o

b) el pH ajustado del medio de congelación; o

c) el pH ajustado del medio de congelación, en el que, si el pH medido del medio de congelación está por debajo de un pH objetivo, se repite la etapa de ajuste y la etapa de medición hasta que el pH ajustado del medio de congelación sea de 7,5 a 8,3.

5. El procedimiento del modo de realización 2 o 4, en el que el pH se ajusta por adición de

a) una base; o

b) una base, en el que la base se selecciona del grupo que consiste en carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, sal de sodio de HEPES, hidróxido de sodio e hidróxido de potasio.

6. El procedimiento del modo de realización 5, en el que el pH del medio de congelación se ajusta por adición de

a) una base al medio de congelación de acuerdo con la siguiente fórmula Vbase = Cbase*Vp (pHt - pHi), en la que Cbase es un coeficiente específico de la base, Vbase es un volumen de la base que hay que añadir al medio de congelación, Vp es el volumen del medio de congelación, pHt es el pH objetivo y pHi es el pH inicial; o b) una base al medio de congelación de acuerdo con la siguiente fórmula Vbase = Cbase*Vp (pHt - pHi), en la que Cbase es un coeficiente específico de la base, Vbase es un volumen de la base que hay que añadir al medio de congelación, Vp es el volumen del medio de congelación, pHt es el pH objetivo y pHi es el pH inicial, en el que el pH del medio de congelación se ajusta añadiendo carbonato de sodio al medio de congelación de acuerdo con la siguiente fórmula VNa2CO3 = 0,0085Vp (pHt - pHi), en la que VNa2CO3 es un volumen de carbonato de sodio 1 M que hay que añadir al medio de congelación, Vp es el volumen del medio de congelación, pHt es el pH objetivo y pHi es el pH inicial.

7. El procedimiento del modo de realización 6, en el que el pH objetivo es de 7,5 a 8,5, de 7,5 a 8,3 o 7,5.

8. El procedimiento de uno cualquiera de los modos de realización 1-7, en el que las células CHO están en un medio que tiene un pH de 6,2 a 6,6 antes de que las células CHO se combinen con un medio de congelación.

9. El procedimiento de uno cualquiera de los modos de realización 1 -8, en el que el agente crioprotector es a) DMSO, glicerol, propanodiol, etilenglicol o un azúcar; o

b) DMSO o glicerol, y el DMSO o el glicerol en el medio de congelación antes de la congelación están en una concentración del 5 % al 12,5 % en volumen; o

c) DMSO o glicerol, en el que el DMSO o el glicerol en el medio de congelación antes de congelar las células están en una concentración del 5 % al 10 % en volumen.

10. El procedimiento de uno cualquiera de los modos de realización 1-9, en el que el medio de congelación que contiene las células CHO tiene una densidad celular del 8 % al 28 % del volumen de células empaquetadas (PCV) antes de la congelación.

11. El procedimiento de uno cualquiera de los modos de realización 1-10 que comprende además una etapa de enfriamiento del fluido de cultivo celular durante el procedimiento de recolección celular y concentración antes de que las células CHO se combinen con

a) un medio de congelación; o

b) un medio de congelación, en el que el fluido de cultivo celular se enfría a una temperatura igual o inferior a aproximadamente 20 °C; o

c) un medio de congelación, en el que el fluido de cultivo celular se enfría a una temperatura igual o inferior a aproximadamente 10 °C.

12. Una población de células CHO para congelar células CHO que comprende una solución tamponada, un agente crioprotector y células CHO que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en el que el medio tiene un pH de 7,5 a 8,5 antes de congelar las células.

13. Un banco de células que comprende una pluralidad de recipientes y cada recipiente contiene (a) un medio de congelación que comprende una solución tamponada y un agente crioprotector, y (b) células CHO que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en el que el medio de congelación tiene un pH de 7,5 a 8,5 antes de congelar la célula.

14. El banco de células del modo de realización 13, en el que los recipientes son ampollas.

15. El banco de células del modo de realización 13 o 14, en el que las células CHO comprenden a) un ácido nucleico que codifica un polipéptido; o

b) comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en el que el polipéptido es una proteína terapéutica, preferentemente en el que la proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una enzima y una proteína de fusión receptora.

BREVE SUMARIO DE LA DIVULGACIÓN

En un aspecto, se proporciona en el presente documento un procedimiento para mejorar la recuperación por descongelación de bancos de células que comprende congelar células de ovario de hámster chino para su almacenamiento en bancos de células en un medio de congelación, en el que el medio de congelación comprende una solución tamponada y un agente crioprotector, y en el que el medio de congelación tiene un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5 antes de la congelación o se ha ajustado a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5 antes de la congelación.

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un procedimiento de almacenamiento de células de ovario de hámster chino que comprende congelar las células en un medio de congelación, en el que el medio de congelación comprende una solución tamponada y un agente crioprotector, y en el que el medio de congelación tiene un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5 antes de la congelación o se ha ajustado a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5 antes de la congelación.

En algunos modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente o en el presente documento, el medio de congelación tiene un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,3 o de aproximadamente 7,5 antes de la congelación.

En algunos modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente o en el presente documento, el pH del medio de congelación se ha ajustado a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8 o de aproximadamente 7,5. En algunos modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente o en el presente documento, las células de ovario de hámster chino se combinan con un medio de congelación antes y/o después del ajuste del pH. En algunos modos de realización, el pH ajustado es un pH objetivo o un pH medido. En algunos modos de realización, el pH objetivo es de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5, o es cualquiera de los pH o está en cualquiera de los intervalos de pH descritos en el presente documento. En algunos modos de realización, el pH medido es de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5, o es cualquiera de los pH o está en cualquiera de los intervalos de pH descritos en el presente documento. En algunos modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente o en el presente documento, el procedimiento comprende además una etapa de medición de un pH inicial del medio de congelación que contiene las células de ovario de hámster chino antes de ajustar el pH del medio de congelación. En algunos modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente o en el presente documento, el procedimiento comprende además una etapa de medición del pH ajustado del medio de congelación. En algunos modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente o en el presente documento, si el pH medido del medio de congelación está por debajo de un pH objetivo, el procedimiento comprende repetir la etapa de ajuste y la etapa de medición hasta que el pH ajustado del medio de congelación sea de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5 o sea cualquiera de los pH o esté en cualquiera de los intervalos de pH descritos en el presente documento.

En algunos modos de realización de los procedimientos descritos en el presente documento o anteriormente, el pH se ajusta añadiendo una base. En algunos modos de realización, la base se selecciona del grupo que consiste en carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, sal de sodio de HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazinaetanosulfónico), hidróxido de sodio e hidróxido de potasio. En algunos modos de realización, el pH del medio de congelación se ajusta añadiendo una base al medio de congelación de acuerdo con la siguiente fórmula Vbase = Cbase*Vp (pHt - pHi), en la que Cbase es un coeficiente específico de la base, Vbase es un volumen de la base que hay que añadir al medio de congelación, Vp es el volumen del medio de congelación, pHt es el pH objetivo y pHi es el pH inicial. En algunos modos de realización, el pH del medio de congelación se ajusta añadiendo carbonato de sodio al medio de congelación de acuerdo con la siguiente fórmula VNa2CO3 = 0,0085Vp (pHt - pHi), en la que VNa2CO3 es un volumen de carbonato de sodio 1 M que hay que añadir al medio de congelación, Vp es el volumen del medio de congelación, pHt es el pH objetivo y pHi es el pH inicial. En algunos modos de realización, el pH objetivo es un pH de entre aproximadamente 7,5 y aproximadamente 8,5, aproximadamente 7,5 y aproximadamente 8,3 o es cualquiera de los pH o está en cualquiera de los intervalos de pH descritos en el presente documento. En algunos modos de realización, el pH objetivo es 7,5.

En algunos modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente o en el presente documento, las células de ovario de hámster chino están en un medio que tiene un pH de aproximadamente 6,2 a aproximadamente 6,6 antes de que las células se combinen con un medio de congelación.

En algunos modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente o en el presente documento, el agente crioprotector es DMSO (dimetilsulfóxido), glicerol, propanodiol, etilenglicol, una macromolécula, un azúcar o una combinación de los mismos. En algunos modos de realización, el DMSO o el glicerol en el medio de congelación antes de la congelación están en una concentración de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 12,5 % en volumen. En algunos modos de realización, el DMSO o el glicerol en el medio de congelación antes de congelar las células de ovario de hámster chino está en una concentración de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 10 % en volumen.

En algunos modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente o en el presente documento, el medio de congelación que contiene las células de ovario de hámster chino tiene una densidad celular de aproximadamente el 8 % a aproximadamente el 28 % del volumen de células empaquetadas (PCV) antes de la congelación.

En algunos modos de realización del procedimiento descrito anteriormente o en el presente documento, el procedimiento comprende además una etapa de enfriamiento del fluido de cultivo celular durante el procedimiento de recolección celular y concentración antes de que las células de ovario de hámster chino se combinen con un medio de congelación. En algunos modos de realización, el fluido de cultivo celular se enfría a una temperatura igual o inferior a aproximadamente 20 °C. En algunos modos de realización, el fluido de cultivo celular se enfría a una temperatura igual o inferior a aproximadamente 10 °C.

En otro aspecto, se proporciona aquí un procedimiento para congelar células de ovario de hámster chino para su almacenamiento o mejorar la recuperación por descongelación de bancos de células que comprende (a) ajustar el pH de un medio de congelación que contiene células a un pH de aproximadamente 6,7 a aproximadamente 8,5, en el que el medio de congelación comprende una solución tamponada y un agente crioprotector; y (b) congelar las células.

En algunos modos de realización, el pH se ajusta a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,3 o de aproximadamente 7,5. En algunos modos de realización, el pH ajustado es un pH objetivo o un pH medido. En algunos modos de realización, el pH objetivo es de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5, o es cualquiera de los pH o está en cualquiera de los intervalos de pH descritos en el presente documento. En algunos modos de realización, el pH objetivo es de aproximadamente 7,5. En algunos modos de realización, el pH medido es de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5, o es cualquiera de los pH o está en cualquiera de los intervalos de pH descritos en el presente documento.

En algunos modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente o en el presente documento, el procedimiento comprende además una etapa de medición de un pH inicial del medio de congelación que contiene las células de ovario de hámster chino antes de ajustar el pH del medio de congelación. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además una etapa de medición del pH ajustado del medio de congelación. En algunos modos de realización, si el pH medido del medio de congelación está por debajo de un pH objetivo, el procedimiento comprende repetir la etapa de ajuste y la etapa de medición hasta que el pH ajustado del medio de congelación sea de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,3, o sea cualquiera de los pH o esté en cualquiera de los intervalos de pH descritos en el presente documento.

En algunos modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente o en el presente documento, el pH se ajusta añadiendo una base. En algunos modos de realización, la base se selecciona del grupo que consiste en carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, sal de sodio de HEPES, hidróxido de sodio e hidróxido de potasio. En algunos modos de realización, el pH del medio de congelación se ajusta añadiendo una base al medio de congelación de acuerdo con la siguiente fórmula Vbase = Cbase*Vp (pHt - pHi), en la que Cbase es un coeficiente específico de base, Vbase es un volumen de la base que hay que añadir al medio de congelación, Vp es el volumen del medio de congelación, pHt es el pH objetivo y pHi es el pH inicial. En algunos modos de realización, el pH del medio de congelación se ajusta añadiendo carbonato de sodio al medio de congelación de acuerdo con la siguiente fórmula VNa2CO3 = 0,0085Vp (pHt - pHi), en la que VNa2CO3 es un volumen de carbonato de sodio 1 M que hay que añadir al medio de congelación, Vp es el volumen del medio de congelación, pHt es el pH objetivo y pHi es el pH inicial. En algunos modos de realización, el pH objetivo es de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5, o es cualquiera de los pH o está en cualquiera de los intervalos de pH descritos en el presente documento. En algunos modos de realización, el pH objetivo es de aproximadamente 7,5.

En algunos modos de realización, las células de ovario de hámster chino están en un medio que tiene un pH de aproximadamente 6,2 a aproximadamente 6,6 antes de que las células se combinen con un medio de congelación.

En algunos modos de realización, el agente crioprotector en el medio de congelación es DMSO, glicerol, propanodiol, etilenglicol, una macromolécula, un azúcar o una combinación de los mismos. En algunos modos de realización, el DMSO o el glicerol en el medio de congelación que contiene las células de ovario de hámster chino antes de la congelación están en una concentración de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 12,5 % en volumen. En algunos modos de realización, el DMSO o el glicerol en el medio de congelación que contiene las células de ovario de hámster chino antes de congelar las células están en una concentración de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 10 % en volumen.

En algunos modos de realización, el medio de congelación que contiene las células de ovario de hámster chino tiene una densidad celular de aproximadamente el 8 % a aproximadamente el 28 % del volumen de células empaquetadas (PCV) antes de la congelación.

En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además una etapa de enfriamiento del fluido de cultivo celular durante el procedimiento de recolección y concentración celular antes de que las células de ovario de hámster chino se combinen con un medio de congelación. En algunos modos de realización, el fluido de cultivo celular se enfría a una temperatura igual o inferior a aproximadamente 20 °C o igual o inferior a aproximadamente 10 °C.

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un procedimiento para congelar células de ovario de hámster chino para su almacenamiento o mejorar la recuperación por descongelación de bancos de células que comprende (a) ajustar el pH de un medio de congelación a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5, en el que el medio de congelación comprende un solución tamponada y un agente crioprotector; (b) combinar las células con el medio de congelación para formar una población de células; y (c) congelar las células en la población de células.

En algunos modos de realización, el pH se ajusta a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,3 o de aproximadamente 7,5. En algunos modos de realización, el pH ajustado es un pH objetivo o un pH medido. En algunos modos de realización, el pH objetivo es de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5, o es cualquiera de los pH o está en cualquiera de los intervalos de pH descritos en el presente documento. En algunos modos de realización, el pH medido es de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5, o es cualquiera de los pH o está en cualquiera de los intervalos de pH descritos en el presente documento.

En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además una etapa de medición del pH ajustado del medio de congelación. En algunos modos de realización, si el pH medido del medio de congelación está por debajo de un pH objetivo, el procedimiento comprende además repetir la etapa de ajuste y la etapa de medición hasta que el pH ajustado del medio de congelación sea de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5 o sea cualquiera de los pH o esté en cualquiera de los intervalos de pH descritos en el presente documento.

En algunos modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente o en el presente documento, el pH se ajusta añadiendo una base. En algunos modos de realización, la base se selecciona del grupo que consiste en carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, sal de sodio de HEPES, hidróxido de sodio e hidróxido de potasio.

En algunos modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente o en el presente documento, células de ovario de hámster chino están en un medio que tiene un pH de aproximadamente 6,2 a aproximadamente 6,6 antes de que las células se combinen con un medio de congelación.

En algún modo de realización de los procedimientos descritos anteriormente o en el presente documento, el agente crioprotector en el medio de congelación es DMSO, glicerol, propanodiol, etilenglicol, una macromolécula, un azúcar o una combinación de los mismos. En algún modo de realización, el DMSO o el glicerol en la población de células está en una concentración de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 12,5 % en volumen, o de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 10 % en volumen.

En algunos modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente o en el presente documento, la población de células contiene las células (por ejemplo, células de mamífero o células de insecto) a una densidad celular de aproximadamente el 8 % a aproximadamente el 28 % del volumen de células empaquetadas (PCV).

En algunos modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente o en el presente documento, el procedimiento comprende además una etapa de enfriamiento del fluido de cultivo celular durante el procedimiento de recolección y concentración celular antes de que las células de ovario de hámster chino se combinen con un medio de congelación. En algunos modos de realización, el fluido de cultivo celular se enfría a una temperatura igual o inferior a aproximadamente 20 °C. En algunos modos de realización, el fluido de cultivo celular se enfría a una temperatura igual o inferior a aproximadamente 10 °C.

En algunos modos de realización de los procedimientos descritos anteriormente o en el presente documento, las células de ovario de hámster chino comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido. En algunos modos de realización, el polipéptido es una proteína terapéutica. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una enzima y una proteína de fusión receptora.

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una población de células de ovario de hámster chino para congelar células que comprende una solución tamponada, un agente crioprotector y células de ovario de hámster chino que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en el que el medio tiene un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5 o de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,3 (o tiene cualquiera de los pH o está en cualquiera de los intervalos de pH descritos en el presente documento) antes de congelar las células. En algunos modos de realización, las células de ovario de hámster chino comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido. En algunos modos de realización, el polipéptido es una proteína terapéutica. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una enzima y una proteína de fusión receptora.

En otro aspecto, se divulga en el presente documento un banco de células que comprende una pluralidad de recipientes y cada recipiente contiene (a) un medio de congelación que comprende un tampón y un agente crioprotector, y (b) células de ovario de hámster chino que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en el que el medio de congelación tiene un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5 o de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,3 (o tiene cualquiera de los pH o está en cualquiera de los intervalos de pH descritos en el presente documento) antes de congelar la célula. En algunos modos de realización, los recipientes son ampollas. En algunos modos de realización, las células de ovario de hámster chino comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido. En algunos modos de realización, el polipéptido es una proteína terapéutica. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una enzima y una proteína de fusión receptora.

Se debe entender que una, algunas o la totalidad de las propiedades de los diversos modos de realización descritos en el presente documento se pueden combinar para formar otros modos de realización de la presente invención. Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes para un experto en la técnica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 muestra un ejemplo de un flujo de procedimiento de almacenamiento de células en bancos de células.

Las FIGS. 2A-2B muestran los resultados de viabilidad del día 1 de paso de descongelación (FIG. 2A) y del crecimiento del día 4 (PCV) (FIG. 2B) para bancos de células generados a partir de poblaciones de pH ajustado a un pH inicial de 6,6 o 6,3.

Las FIGS. 3A-3F muestran la viabilidad del día 1 de paso de descongelación (FIGS. 3A, 3C y 3E) y la tasa de crecimiento global por PCV (FIGS. 3B, 3D y 3F) frente al pH de almacenamiento y el efecto de ajustar el pH a un intervalo de pH objetivo en nueve líneas celulares de CHO, produciendo cada una un anticuerpo diferente (anticuerpos 1-9).

Las FIGS. 4A-4B muestran las tendencias de la densidad de células viables de paso de descongelación (VCD) o de recuento de células viables (VCC) (FIG. 4A) y de viabilidad (%) (FIG. 4B), que demuestran el efecto de ajustar el pH a 7,5 desde un pH inicial de la población de 6,3 frente a la ausencia de ajuste del pH.

La FIG. 5 muestra la proporción del volumen de células empaquetadas viables (VPCV) con respecto al recuento de células viables (VCC), que es un medio indirecto de estimación del tamaño de las células, durante el procedimiento de agrupación. Los datos muestran el efecto de la adición de medios de congelación (FM) y del ajuste del pH a un pH de 7,3, 7,6 u 8,0 sobre el tamaño celular. Una proporción mayor indica un tamaño de célula más grande.

Las FIGS. 6A-6B muestran los resultados de la tasa de crecimiento global del paso de descongelación por PCV para bancos de células generados a partir de poblaciones con pH ajustado a un pH inicial de 6,4 (pH objetivo de 6,2) o 6,6 (pH objetivo de 6,7) en t0 (FIG. 6A) y t2 (2 horas) (FIG. 6B).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En el presente documento se proporcionan procedimientos para mejorar la recuperación por descongelación de bancos de células que comprende congelar células de ovario de hámster chino para su almacenamiento en bancos de células en un medio de congelación, en el que el medio de congelación comprende una solución tamponada y un agente crioprotector, y en el que el medio de congelación tiene un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5 antes de la congelación.

También se proporcionan en el presente documento procedimientos para congelar células de ovario de hámster chino para su almacenamiento que comprenden congelar las células en un medio de congelación, en el que el medio de congelación comprende una solución tamponada y un agente crioprotector, y en el que el medio de congelación tiene un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5 antes de la congelación.

También se proporcionan en el presente documento procedimientos para congelar células de ovario de hámster chino para su almacenamiento o mejorar la recuperación por descongelación de bancos de células que comprende (a) ajustar el pH de un medio de congelación que contiene las células a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5, en el que el medio de congelación comprende una solución tamponada y un agente crioprotector; y (b) congelar las células.

También se proporcionan en el presente documento procedimientos para congelar células de ovario de hámster chino para su almacenamiento o mejorar la recuperación por descongelación de bancos de células que comprende (a) ajustar el pH de un medio de congelación a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5, en el que el medio de congelación comprende un solución tamponada y un agente crioprotector; (b) combinar las células con el medio de congelación para formar una población de células; y (c) congelar las células en la población de células.

También se proporcionan en el presente documento poblaciones de células eucariotas para congelar células de ovario de hámster chino que comprenden una solución tamponada, un agente crioprotector y células de ovario de hámster chino que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en el que el medio tiene un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5 antes de congelar las células.

También se proporcionan en el presente documento bancos de células que comprenden una pluralidad de recipientes y cada recipiente contiene (a) un medio de congelación que comprende un tampón y un agente crioprotector, y (b) células de ovario de hámster chino que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en el que el medio de congelación tiene un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5 antes de congelar la célula.

I. Definiciones

Los términos "medio" y "medio de cultivo celular" se refieren a una solución usada para mantener las células. El medio puede comprender además una fuente de nutrientes usada para el crecimiento celular. Como se entiende por un experto en la técnica, la fuente de nutrientes puede contener componentes requeridos por la célula para su crecimiento y/o supervivencia o puede contener componentes que contribuyan al crecimiento y/o supervivencia de las células. Las vitaminas, los aminoácidos esenciales o no esenciales y los oligoelementos son ejemplos de componentes en el medio.

Un "medio nutritivo basal" se refiere a un medio que comprende los nutrientes básicos necesarios para el crecimiento y la supervivencia celular. Los ejemplos de un medio nutritivo basal incluyen el medio esencial mínimo de Eagle (e Me M) y el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM).

Un "medio de cultivo celular químicamente definido" o "CDM" es un medio con una composición específica que está libre de productos derivados de un animal o una planta, tales como, por ejemplo, suero animal y peptona vegetal. Como se entendería por un experto en la técnica, se puede usar un c Dm en un procedimiento de producción de polipéptidos, con lo que una célula está en contacto con, y segrega un polipéptido en, el CDM. Por tanto, se entiende que una composición puede contener un CDM y un producto de polipéptido y que la presencia del producto de polipéptidos no hace que el CDM sea químicamente indefinido.

Un "medio de cultivo celular químicamente indefinido" se refiere a un medio cuya composición química no se puede especificar y que puede contener uno o más productos derivados de fuentes animales o vegetales, tales como, por ejemplo, suero animal o peptona vegetal. Como se entendería por un experto en la técnica, un medio de cultivo celular químicamente indefinido puede contener un producto derivado de un animal o de una planta como fuente de nutrientes.

Un "medio de congelación", "medio de congelación celular" o "medio de cultivo celular para congelación" se refiere a una solución tamponada que contiene un agente crioprotector. Se puede usar un medio de congelación para congelar células (por ejemplo, células de mamíferos o células de insectos) contenidas en el medio de congelación. Una "solución tamponada", como se usa en el presente documento, se refiere a una solución salina de pH tamponado, isotónica y con base de agua, que actúa para preservar la integridad de la membrana celular y sirve como vehículo para uno o más agentes crioprotectores. Un medio de congelación también puede contener componentes adicionales que se encuentran en el medio de cultivo celular. Los ejemplos de tampones pueden incluir tampón de bicarbonato, PBS (solución salina tamponada con fosfato), HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanosulfónico), MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico), TES (ácido N-[tris(hidroximetil)metil]-2-aminoetanosulfónico), TRIS (tris(hidroximetil)aminometano), TEST (combinado TES/TRIS) y una combinación de los mismos. Los ejemplos de medio pueden incluir el medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) y el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). Los agentes crioprotectores protegen las células del daño por congelación y se pueden clasificar como "penetrantes", capaces de atravesar la membrana plasmática (por ejemplo, glicerol, dimetil sulfóxido (DMSO), propanodiol, etilenglicol, etc.) o "no penetrantes" (por ejemplo, macromoléculas, azúcares, etc.).

"Cultivar" una célula se refiere a poner en contacto una célula con un medio de cultivo de células en condiciones adecuadas para la supervivencia y/o el crecimiento y/o la proliferación de la célula.

Un "cultivo por lotes" se refiere a un cultivo en el que todos los componentes para el cultivo de células (incluyendo las células y todos los nutrientes de cultivo) se suministran al recipiente de cultivo al comienzo del procedimiento de cultivo.

La frase "cultivo de células por lotes alimentados", como se usa en el presente documento, se refiere a un cultivo por lotes en el que las células y el medio de cultivo se suministran inicialmente al recipiente de cultivo, y se suministran nutrientes de cultivo adicionales, de forma continua o en incrementos separados, al cultivo durante el procedimiento de cultivo, con o sin recuperación periódica de células y/o productos antes de la finalización del cultivo.

Un "cultivo por perfusión" es un cultivo mediante el que las células se restringen en el cultivo, por ejemplo, mediante filtración, encapsulación, anclaje a microtransportadores, etc., y el medio de cultivo se introduce y elimina continua o intermitentemente del recipiente de cultivo.

El "almacenamiento de células en bancos de células" o "almacenamiento en bancos de células" es un procedimiento mediante el cual las células se congelan a temperaturas bajo cero (crioconservadas) para detener las reacciones enzimáticas/químicas, manteniendo por tanto las células en un estado viable para su uso posterior. Las células congeladas se pueden almacenar a menos de aproximadamente 0 °C (por ejemplo, a -20 °C, -70 °C, -80 °C o menos) para su uso posterior. Por ejemplo, las células se pueden almacenar en ampollas colocadas en la fase de vapor dentro de un congelador que contiene nitrógeno líquido a -196 °C.

Un "recipiente de cultivo" se refiere a un envase usado para cultivar una célula. El recipiente de cultivo puede ser de cualquier tamaño siempre que sea útil para el cultivo de células.

El término "valor", como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad total de polipéptido expresado de forma recombinante producido por un cultivo de células, dividida entre una cantidad dada de volumen del medio. El valor se expresa típicamente en unidades de miligramos de polipéptido por mililitro de medio.

Un "ácido nucleico", como se usa de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluye ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, bases o nucleótidos modificados y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se pueda incorporar en un polímero mediante ADN o ARN polimerasa, o mediante una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si están presentes, se puede conferir una modificación a la estructura de los nucleótidos antes o después del ensamblaje del polímero.

Un "ácido nucleico aislado" significa y engloba una secuencia no natural, recombinante o una natural fuera de o separada de su contexto habitual. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta en la forma o configuración en la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que de manera ordinaria expresan la proteína donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.

Una proteína “aislada” (por ejemplo, un anticuerpo aislado) es una que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían en usos de investigación, de diagnóstico o terapéuticos de la proteína, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. La proteína aislada incluye la proteína in situ dentro de células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno natural de la proteína no estará presente. Normalmente, sin embargo, la proteína aislada se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

Un polipéptido "purificado" significa que el polipéptido se ha incrementado en pureza, de modo que exista en una forma que sea más pura de la que existe en su entorno natural y/o cuando inicialmente se produce y/o sintetiza y/o amplifica en condiciones de laboratorio. La pureza es un término relativo y no significa necesariamente pureza absoluta.

"Contaminantes" se refiere a materiales que son diferentes del producto de polipéptido deseado. El contaminante incluye, sin limitación: materiales de la célula huésped, tales como proteína de célula huésped; ácido nucleico; una variante, fragmento, agregado o derivado del polipéptido deseado; otro polipéptido; endotoxina; contaminante vírico; componente en los medios de cultivo de células, etc. Los contaminantes también pueden incluir materiales introducidos por el procedimiento de purificación, tal como la proteína A lixiviada.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y se puede interrumpir por moléculas distintas a aminoácidos. Los términos también engloban un polímero de aminoácido que se ha modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcado. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los ejemplos de polipéptidos englobados dentro de la definición en el presente documento incluyen proteínas de mamífero, tales como, por ejemplo, renina; una hormona del crecimiento, incluyendo la hormona del crecimiento humana y la hormona del crecimiento bovina; factor de liberación de la hormona del crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación, tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular y factor de von Willebrand; factores anticoagulación, tales como proteína C; factor natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como urocinasa o activador del plasminógeno de la orina humana o de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (quimiocina de regulación por activación, expresada y secretada normalmente por linfocitos T); proteína inflamatoria de macrófagos (MIP-1-alfa) humana; una seroalbúmina, tal como seroalbúmina humana; sustancia inhibidora mulleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropinas de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; DNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico, tal como factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF), neurotrofina 3, 4, 5 o 6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento nervioso, tal como NGF-p; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos, tal como FGF-alfa y FGF-beta; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento y transformación (TGF), tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4 o TGF-p5; factor de crecimiento insulínico I y II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento insulínico (IGFBP); proteínas CD, tales como CD3, CD4, CD8, CD19 y CD20; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón, tal como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de linfocitos T; proteínas de superficie de membrana; factor de aceleración de la degradación; antígeno vírico, tal como, por ejemplo, una parte de la envoltura del virus del SIDA; proteínas de transporte; receptores de referencia; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas, tales como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor, tal como CA125 (antígeno de cáncer de ovario) o receptor h ER2, HER3 o HER4; inmunoadhesinas; y fragmentos y/o variantes de cualquiera de las proteínas enumeradas anteriormente, así como anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpo, que se unen a una proteína, incluyendo, por ejemplo, cualquiera de las proteínas enumeradas anteriormente.

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, siempre que presenten la actividad biológica deseada. Un anticuerpo puede ser humano, humanizado y/o con afinidad madurada.

El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos frente a un sitio antigénico único. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos, ya que se pueden sintetizar sin contaminar por otros anticuerpos. El modificador «monoclonal» no se debe interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usarán de acuerdo con la invención se pueden producir mediante una variedad de técnicas, que incluyen, por ejemplo, el procedimiento del hibridoma (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo y col., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed. 1988); Hammerling y col., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, Ny , 1981), procedimientos de ADN recombinante en células bacterianas, animales o vegetales eucariotas (véase, por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 4.816.567), tecnologías de presentación en fagos (véase, por ejemplo, Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol.

222:581-597 (1992); Sidhu y col, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee y col., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004) y Lee y col., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)), y tecnologías para producir anticuerpos humanos o similares a humanos en animales que tienen parte o la totalidad de los loci de inmunoglobulina humana o genes que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (véanse, por ejemplo, los documentos WO1998/24893; WO1996/34096; WO1996/33735; WO1991/10741; Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits y col., Nature 362:255-258 (1993); Bruggemann y col., Year in Immunol. 7:33 (1993); las patentes de EE. UU. n.° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425 y 5.661.016; Marks y col., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg y col., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-813 (1994); Fishwild y col., Nature Biotechnol. 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14:826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995).

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica del ingrediente activo sea eficaz y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto al que se administraría la formulación. Dichas formulaciones son estériles.

Los vehículos, excipientes o estabilizadores "farmacéuticamente aceptables" son aquellos que no son tóxicos para la célula o el mamífero expuesto a los mismos en las dosis y concentraciones empleadas (Remington's Pharmaceutical Sciences (20.a edición), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Filadelfia, PA). A menudo, el vehículo fisiológicamente aceptable es una solución acuosa de pH tamponado. Los ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como Tween™, polietilenglicol (PEG) y Pluronics™.

Como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno/a" y "el/la" incluyen las referencias plurales a menos que el contenido lo indique claramente de otro modo. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un compuesto" incluye opcionalmente una combinación de dos o más de dichos compuestos, y similares.

Se entiende que los aspectos y modos de realización de la invención descrita en el presente documento incluyen "que comprende", "que consiste en" y "que consiste esencialmente en" aspectos y modos de realización.

La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) modos de realización que están dirigidos a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que se refiere a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X". Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo.

Donde los aspectos o modos de realización de la invención se describen en términos de un grupo de Markush u otro agrupamiento de alternativas, la presente invención no solo engloba todo el grupo enumerado como un todo, sino cada miembro del grupo individualmente y todos los subgrupos posibles del grupo principal, sino también el grupo principal en el que están ausentes uno o más de los miembros del grupo. La presente invención también prevé la exclusión explícita de uno o más de cualquiera de los miembros del grupo en la invención reivindicada.

II. Procedimientos y usos de la invención

En el presente documento se proporcionan procedimientos para congelar células para almacenarlas en bancos de células o almacenarlas en un medio de congelación de células. También se proporcionan en el presente documento procedimientos para mejorar la recuperación por descongelación de bancos de células. Los procedimientos comprenden una etapa de congelación de células en un medio de congelación, en el que el medio de congelación comprende una solución tamponada y un agente crioprotector, y en el que el medio de congelación que contiene las células tiene un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5 o de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,3 antes de la congelación. Los procedimientos pueden comprender además una etapa de ajuste del pH del medio de congelación a aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5 o a aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,3. Los procedimientos proporcionados en el presente documento son útiles para preparar bancos de células maestros (MCB) y bancos de células de trabajo (WCB). En algunos modos de realización, los procedimientos descritos en el presente documento mejoran la viabilidad celular y/o el crecimiento celular después de la descongelación.

Las células de ovario de hámster chino que se van a usar en el procedimiento de congelación y almacenamiento en bancos de células se pueden preparar mediante un procedimiento que involucra protocolos de cultivo celular y concentración conocidos en la técnica. El procedimiento puede incluir acumulación celular, recolección y concentración celular antes del almacenamiento en bancos de células. La acumulación celular se puede producir mediante varios procedimientos. Un ejemplo puede usar un biorreactor controlado por procedimiento para la acumulación celular; sin embargo, también se pueden usar otros procedimientos / recipientes de cultivo (por ejemplo, matraces en T, matraces de agitación, frascos de cultivo rotatorios, recipientes de agitación, etc.). La recolección y la concentración celular se pueden realizar mediante centrifugación seguida de resuspensión del sedimento celular en un medio de congelación. En otro ejemplo, las células se pueden recolectar y concentrar en una sola etapa por medio de un filtro de fibra hueca (HFF). La concentración celular también se puede lograr mediante el uso de dispositivos/membranas de perfusión alternativos para eliminar el medio del fluido de cultivo celular (por ejemplo, membranas de perfusión flotantes, sedimentadores celulares, centrifugadoras de circulación continua, etc.). En algunos modos de realización del procedimiento descrito en el presente documento, el fluido del procedimiento de recolección y concentración celular o el fluido de cultivo celular recolectado se enfría a una temperatura igual o inferior a aproximadamente 20 °C (por ejemplo, igual o inferior a aproximadamente cualquiera de 19 °C, 18 °C, 17 °C, 16 °C, 15 °C, 14 °C, 13 °C, 12 °C, 11 °C y 10 °C).

Las células sedimentadas o concentradas se pueden combinar con un medio de congelación antes de congelar las células. En algunos modos de realización, las células sedimentadas se pueden resuspender en un medio de congelación. En algunos modos de realización se puede añadir un medio de congelación que contiene agente crioprotector concentrado a las células recolectadas y concentradas o las células recolectadas y concentradas se pueden añadir a un medio de congelación que contiene agente crioprotector concentrado para el almacenamiento en bancos de células. Un medio de congelación puede comprender una solución tampón y un agente crioprotector.

En algunos modos de realización, el tampón en el medio puede comprender un tampón zwitteriónico. En algunos modos de realización, el tampón en el medio puede comprender un tampón seleccionado de tampón de bicarbonato, PBS (solución salina tamponada con fosfato), HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazinaetanosulfónico), MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico), TES (ácido N-[tris(hidroximetil)metil]-2-aminoetanosulfónico), TRIS (tris(hidroximetil)aminometano), TEST (combinado TES/TRIS) y una combinación de los mismos. En algunos modos de realización, la concentración de tampón en el medio de congelación antes de congelar las células es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. En algunos modos de realización, el medio de congelación antes de congelar las células contiene aproximadamente de 10 mM a aproximadamente 35 mM de bicarbonato de sodio (por ejemplo, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 30 mM o aproximadamente 35 mM, incluyendo cualquier concentración entre estos valores). En algunos modos de realización, el medio de congelación antes de congelar las células contiene aproximadamente de 10 mM a aproximadamente 50 mM de HEPES (por ejemplo, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 35 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 45 mM o aproximadamente 50 mM, incluyendo cualquier concentración entre estos valores). En algunos modos de realización, el medio de congelación antes de congelar las células contiene de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 12 mM de PBS (por ejemplo, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 11 mM o aproximadamente 12 mM, incluyendo cualquier concentración entre estos valores). En algunos modos de realización, el medio de congelación antes de congelar las células contiene de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM de MOPS (por ejemplo, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 12 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 18 mM o aproximadamente 20 mM, incluyendo cualquier concentración entre estos valores). En algunos modos de realización, el medio de congelación antes de congelar las células contiene de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 30 mM de TES (por ejemplo, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 25 mM o aproximadamente 30 mM, incluyendo cualquier concentración entre estos valores). En algunos modos de realización, el medio de congelación antes de congelar las células contiene de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 30 mM de TRIS (por ejemplo, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 25 mM o aproximadamente 30 mM, incluyendo cualquier concentración entre estos valores). En algunos modos de realización, el medio de congelación antes de congelar las células contiene de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 30 mM de TEST (por ejemplo, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 25 mM o aproximadamente 30 mM, incluyendo cualquier concentración entre estos valores). En algunos modos de realización, un agente crioprotector es un agente penetrante o un agente no penetrante. En algunos modos de realización, un agente crioprotector es un agente seleccionado de un grupo que consiste en glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), propanodiol, etilenglicol y azúcares. En algunos modos de realización, el medio de congelación añadido a las células recolectadas y concentradas es un medio de congelación concentrado. En algunos modos de realización, el medio de congelación que contiene agente crioprotector concentrado puede contener un 20-30 % (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO) o glicerol. En algunos modos de realización, se vierte el medio de congelación concentrado (por ejemplo, 1 parte en volumen de medio de congelación (que contiene agente crioprotector concentrado): 3 partes de fluido de cultivo celular) en las células recolectadas y concentradas. En algunos modos de realización, el medio de congelación que contiene las células antes de congelar las células contiene de aproximadamente 5 % a aproximadamente 12,5 % de DMSO o glicerol.

En algunos modos de realización, un medio de congelación puede comprender además componentes adicionales encontrados en el medio de cultivo celular. En algunos modos de realización, el medio de congelación puede contener medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) o medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM).

En algunos modos de realización, el procedimiento de preparación de una célula de ovario de hámster chino para su congelación puede comprender además una etapa de ajuste del pH de un medio de congelación o un medio de congelación que contiene agente crioprotector concentrado, en el que el pH se ajusta a de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5 antes de que las células sedimentadas o las células concentradas se combinen con el medio de congelación o el medio de congelación que contiene el agente crioprotector concentrado. En algunos modos de realización, el procedimiento de preparación de células de ovario de hámster chino para su congelación comprende además una etapa de ajuste del pH del medio de congelación que contiene las células, en el que el pH del medio de congelación se ajusta a de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5. En algunos modos de realización, el pH ajustado es un pH objetivo o un pH medido.

En determinados modos de realización, la densidad celular antes de la congelación se mide por el volumen de células empaquetadas (PCV). En algunos modos de realización, el medio de congelación que comprende células que se van a almacenar en bancos de células tiene una densidad celular del 8 % al 28 % (por ejemplo, aproximadamente cualquiera del 8 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % o 28 %) de PCV antes de la congelación. En algunos modos de realización, la densidad celular en el medio de congelación antes de la congelación puede ser de aproximadamente el 21 % de PCV.

En algunos modos de realización, las células en un medio de congelación se dispensan en ampollas o bolsas de un solo uso antes de la congelación. En un modo de realización ejemplar, el procedimiento implica: dispensar la suspensión celular en ampollas de vidrio esterilizadas en autoclave que se colocan en hielo usando una jeringa esterilizada en autoclave, sellar las ampollas, realizar una prueba de integridad y congelar las ampollas en un congelador de velocidad controlada y, a continuación, transferir las ampollas a un congelador de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

En algunos modos de realización, la viabilidad celular después de la descongelación mejora mediante el uso de los procedimientos descritos en el presente documento. En algunos modos de realización, la viabilidad celular se incrementa en al menos aproximadamente cualquiera de un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % u 85 % en comparación con la viabilidad celular después de congelar en un medio de congelación con un pH de 6,7 o menor y/o sin enfriar el cultivo celular de recolección durante el procedimiento de recolección y la descongelación.

Ajuste de pH

De acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento, el pH del medio de congelación (que contiene o no contiene las células) se puede ajustar, por ejemplo, añadiendo una base al medio. En algunos modos de realización, el pH del medio de congelación se ajusta a un pH que está por encima de aproximadamente 7,5.

En algunos modos de realización, el pH del medio de congelación se ajusta a un pH (un pH objetivo o un pH medido) de entre aproximadamente 7,5 y aproximadamente 8,5. En algunos modos de realización, el pH de los medios de congelación se ajusta a un pH de entre aproximadamente 7,5 y aproximadamente 8,3, entre aproximadamente 7,6 y aproximadamente 8,3, entre aproximadamente 7,7 y aproximadamente 8,3 o entre aproximadamente 7,8 y aproximadamente 8,3. En algunos modos de realización, el pH de los medios de congelación se ajusta a un pH (un pH objetivo o un pH medido) de entre aproximadamente 7,5 y aproximadamente 7,8. En algunos modos de realización, el pH objetivo o el pH medido es de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,3. En algunos modos de realización, el pH objetivo o el pH medido es de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 7,8 (por ejemplo, un pH de aproximadamente 7,5). En algunos modos de realización, si el primer ajuste de pH no es suficiente para incrementar el pH de modo que esté en el intervalo del pH objetivo (por ejemplo, un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 7,7), se realiza un segundo ajuste de pH. En algunos modos de realización, se puede realizar más de un ajuste de pH.

La base añadida para ajustar el pH puede ser cualquier base que los expertos en la técnica conozcan bien, pero en modos de realización ejemplares, la base es carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, sal de sodio de HEPES, hidróxido de sodio o hidróxido de potasio.

El pH de los medios de congelación se puede medir en cualquier punto antes de la congelación y el pH se puede ajustar en cualquier momento antes de la congelación. En algunos modos de realización, el pH del medio de congelación se mide y/o ajusta antes de la combinación con las células que se van a almacenar en bancos de células. En otros modos de realización, el pH del medio de congelación se mide y/o ajusta después de la combinación con las células que se van a almacenar en bancos de células. En algunos modos de realización, el pH del medio de congelación se mide y/o ajusta más de una vez. En algunos modos de realización, el pH del medio de congelación se mide y/o ajusta dos veces, tres veces o más antes de la congelación. En otros modos de realización, el pH del medio de congelación se mide y/o ajusta antes y después de la combinación con las células que se van a almacenar en bancos de células. En algunos modos de realización, el pH se ajusta de acuerdo con la siguiente ecuación: Vbase = Cbase*Vp (pHt - pHi), en la que Cbase es un coeficiente específico de base, Vbase es un volumen de la base que hay que añadir al medio de congelación, Vp es el volumen del medio de congelación, pHt es el pH objetivo y pHi es el pH inicial. Como se usa en el presente documento, el pH inicial es el pH del medio de congelación que contiene las células (es decir, después de que se combine con las células) pero antes de que el pH se ajuste para la congelación. Cbase representa un coeficiente específico que depende del tipo y la concentración de la base elegida para el ajuste de pH. El coeficiente Cbase se puede obtener dependiendo de la elección de la base. En un modo de realización ejemplar, donde la base es carbonato de sodio 1 M, el ajuste de pH se realiza de acuerdo con la Ecuación 1 a continuación:

Ecuación 1: Cálculo del volumen base que hay que añadir para el ajuste de pH

VNaC03 = 0,0085 Vp, (pHt - pHi),

en la que VNa2CO3 es un volumen de carbonato de sodio 1 M que hay que añadir al medio de congelación, Vp es el volumen del medio de congelación, pHt es el pH objetivo y pHi es el pH inicial. El pH inicial es el pH del medio de congelación que contiene las células (es decir, después de que se combine con las células) pero antes de que el pH se ajuste para la congelación. El pH objetivo del medio de congelación puede ser un pH superior al pH fisiológico, tal como un pH superior a 7,5. En algunos modos de realización, el pH objetivo del medio de congelación está entre 7,5 y 8,3. En algunos modos de realización, el pH objetivo del medio de congelación está entre 7,5 y 7.8. En algunos modos de realización, el pH objetivo del medio de congelación es cualquiera de 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7.9, 8,0, 8,1, 8,2 u 8,3.

El pH del medio de congelación se puede medir usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el pH del medio se puede medir en los analizadores BioProfile® 400 (Nova Biomedical) o BioProfile® FLEX (Nova Biomedical). Como se usa en el presente documento, todas las referencias al pH en esta solicitud, incluyendo el pH medido, el pH objetivo, el pH ajustado y el pH inicial, se refieren a una medición de pH realizada con la temperatura de muestra ajustada a aproximadamente 37 °C (por ejemplo, entre 36 °C y 38 °C o entre 35 °C y 39 °C).

III. Medios de congelación

Los medios de congelación celular proporcionados en el presente documento pueden encontrar su uso en procedimientos (por ejemplo, un procedimiento para congelar células de ovario de hámster chino y/o un procedimiento para mejorar la recuperación por descongelación de bancos de células que comprenden células de ovario de hámster chino) y en composiciones (por ejemplo, una población de células que comprende una solución tamponada, un agente crioprotector y células de ovario de hámster chino).

En algunos modos de realización, un medio de congelación descrito en el presente documento comprende una solución tamponada y un crioprotector. En algunos modos de realización, el tampón comprende un tampón zwitteriónico. En algunos modos de realización, el tampón incluye PBS, HEPES, TES, TRIS y TEST.

El medio de congelación puede comprender cualquier crioprotector conocido en la técnica y descrito en el presente documento, tal como d Ms O, glicerol, etilenglicol, macromoléculas no penetrantes, azúcares, etc. En algunos modos de realización, la concentración de DMSO o glicerol en el medio de congelación celular es del 5 % al 12,5 % en volumen (v/v) después de la combinación con las células que se van a almacenar en bancos de células. En algunos modos de realización, el medio de congelación se puede proporcionar añadiendo un medio de congelación que contiene tampones concentrados y/o crioprotector en células concentradas. En algunos modos de realización, el agente crioprotector concentrado en el medio de congelación puede contener de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 30 % (v/v) de DMSO o glicerol.

En algunos modos de realización, un medio de congelación puede comprender componentes adicionales encontrados en el medio de cultivo celular. En algunos modos de realización, se pueden añadir F10 de Ham (Sigma), medio esencial mínimo ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio Eagle modificado de Dulbecco ([DMEM], Sigma) que son adecuados para cultivar células de mamífero al medio de congelación descrito en el presente documento para congelar células de mamífero. Además, se puede complementar o modificar como se detalla en el presente documento cualquiera de los medios descritos en Ham y Wallace, Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes y Sato, Anal. Biochem., 102:255 (1980), Vijayasankaran y col., Biomacromolecules, 6:605:611 (2005), Patkar y col., J Biotechnology, 93:217-229 (2002), las patentes de EE. UU. n.° 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; o 4.560.655; el documento WO90/03430; el documento WO87/00195; reedición de la patente de EE. UU. n.° 30.985; o la patente de EE. UU. n.° 5.122.469.

Como se entendería por el experto en la técnica, el medio de congelación celular detallado en el presente documento puede comprender otros componentes que son útiles para el cultivo o la congelación de las células. Por ejemplo, se entiende que los medios pueden comprender componentes adicionales tales como aminoácidos (por ejemplo, glutamina, arginina o asparagina), vitaminas (incluyendo, pero sin limitarse a, vitaminas B, tales como una o más de vitamina B1, vitamina B2, vitamina B3, vitamina B6, vitamina B7, vitamina B9 o vitamina B12), metales de transición (incluyendo, pero sin limitarse a, níquel, hierro (por ejemplo, hierro férrico o hierro ferroso) o zinc) y otros componentes de medios. Cualquier medio proporcionado en el presente documento también se puede complementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), iones (tales como sodio, cloruro, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos normalmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. En algunos aspectos, un medio de congelación proporcionado en el presente documento contiene proteínas derivadas de una planta o un animal. En algunos modos de realización, un medio de congelación proporcionado en el presente documento está libre de proteínas derivadas de una planta o un animal. T ambién se puede incluir cualquier otro complemento necesario a concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la técnica.

El medio de congelación celular (una población de células) como se describe en el presente documento comprende células CHO. Los tipos de células ejemplares que se pueden usar en los procedimientos descritos en el presente documento incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células de mieloma murino NS0, células humanas PER.C6® e hibridomas. En otro modo de realización ejemplar, estas células son células de insecto, tales como High Five™, S2 (Schneider 2), Sf9 y Sf21. En algunos modos de realización, las células son células recombinantes que comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido (por ejemplo, una proteína terapéutica). Como apreciaría un experto en la técnica, estas células pueden comprender además plásmidos recombinantes u otros compuestos biológicos útiles. En algunos modos de realización, las células que se van a almacenar en bancos de células pueden ser útiles para la producción de proteínas terapéuticas y productos biológicos tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, enzimas, proteínas de fusión receptoras o fragmentos de los mismos.

IV. Células eucariotas y bancos de células

También se proporciona en el presente documento un banco de células que comprende una pluralidad de recipientes y cada recipiente conteniendo un medio de congelación que contiene una célula de ovario de hámster chino que comprende un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo) que codifica un polipéptido, en el que el medio tiene un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5 antes de congelar la célula. El banco de células puede ser un Prebank, un banco de células maestro (MCB) o un banco de células de trabajo (WCB). Un Prebank puede comprender recipientes congelados (por ejemplo, almacenados en un congelador de nitrógeno líquido) (por ejemplo, ampollas que contienen células que producen un polipéptido específico a partir del cual se prepara un MCB. Un MCB puede comprender recipientes congelados (por ejemplo, almacenados en un congelador de nitrógeno líquido) (por ejemplo, ampollas) que contienen cultivos celulares derivados del subcultivo del Prebank y de los cuales se derivan todas las células posteriores para la producción. Los MCB se producen y almacenan de acuerdo con cGMP y se pueden usar para la producción del producto de polipéptido. Un WCB puede comprender recipientes congelados (por ejemplo, almacenados en un congelador de nitrógeno líquido) (por ejemplo, ampollas) que contienen un cultivo celular derivado del subcultivo del MCB. Los MCB se producen y almacenan de acuerdo con cGMP y se pueden usar para la producción del producto de polipéptido. En algunos modos de realización, los recipientes son ampollas.

Las células de ovario de hámster chino que se pueden congelar en un medio de congelación y almacenar como se describe en el presente documento pueden ser útiles para producir un polipéptido. La célula es una célula de ovario de hámster chino (CHO). Las células CHO pueden incluir, pero no se limitan a, células CHO DHFR- (Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)), por ejemplo, ATCC® CRL-9096™; y CHO-K1 (ATCC® CRL-61™).

En algunos modos de realización, las células de ovario de hámster chino comprenden un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo) que codifica un polipéptido y las células son útiles para producir el polipéptido. En algunos modos de realización, el ácido nucleico se introduce en las células. Se puede usar cualquier procedimiento conocido en la técnica para introducir un ácido nucleico en una célula. Por ejemplo, las células se pueden transformar con vectores (por ejemplo, un vector de expresión) que comprenden uno o más ácidos nucleicos que codifican el polipéptido. En algunos modos de realización, la célula es una línea celular estable. En algunos modos de realización, el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una enzima y una proteína de fusión receptora.

Los ejemplos de polipéptidos incluyen proteínas de mamífero, tales como, por ejemplo, renina; una hormona del crecimiento, incluyendo la hormona del crecimiento humana y la hormona del crecimiento bovina; factor de liberación de la hormona del crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación, tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular y factor de von Willebrand; factores anticoagulación, tales como proteína C; factor natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como urocinasa o activador del plasminógeno de la orina humana o de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (quimiocina de regulación por activación, expresada y secretada normalmente por linfocitos T); proteína inflamatoria de macrófagos (MIP-1-alfa) humana; una seroalbúmina, tal como seroalbúmina humana; sustancia inhibidora mulleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropinas de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; DNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico, tal como factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF), neurotrofina 3, 4, 5 o 6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento nervioso, tal como NGF-p; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos, tal como FGF-alfa y FGF-beta; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento y transformación (TGF), tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4 o TGF-p5; factor de crecimiento insulínico I y II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento insulínico (IGFBP); proteínas CD, tales como CD3, CD4, CD8, CD19 y CD20; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón, tal como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de linfocitos T; proteínas de superficie de membrana; factor de aceleración de la degradación; antígeno vírico, tal como, por ejemplo, una parte de la envoltura del virus del SIDA; proteínas de transporte; receptores de referencia; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas, tales como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor, tal como CA125 (antígeno de cáncer de ovario) o receptor HER2, HER3 o HER4; inmunoadhesinas; y fragmentos y/o variantes de cualquiera de las proteínas enumeradas anteriormente, así como anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpo, que se unen a una proteína, incluyendo, por ejemplo, cualquiera de las proteínas enumeradas anteriormente.

En algunos modos de realización, las células de ovario de hámster chino comprenden un ácido nucleico que codifica un anticuerpo. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la invención se pueden producir mediante una variedad de técnicas, que incluyen, por ejemplo, el procedimiento del hibridoma (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo y col., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed. 1988); Hammerling y col., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, NY, 1981)), procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.816.567), tecnologías de presentación en fagos (véase, por ejemplo, Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Sidhu y col., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee y col., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004) y Lee y col., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), y tecnologías para producir anticuerpos humanos o similares a humanos en animales que tienen partes o la totalidad de los loci de inmunoglobulina humana o genes que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (véanse, por ejemplo, los documentos WO1998/24893; WO1996/34096; WO1996/33735; WO1991/10741; Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits y col., Nature 362:255-258 (1993); Bruggemann y col., Year in Immunol. 7:33 (1993); las patentes de EE. UU. n.° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425 y 5.661.016; Marks y col., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg y col., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild y col., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol.

14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, un anticuerpo derivado de una colección o un anticuerpo multiespecífico. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los ejemplos de fragmento de unión a antígeno incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. El fragmento Fab contiene los dominios variables de la cadena pesada y ligera y también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxílico del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para un Fab' en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También son conocidos otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo. "Fv" es el mínimo fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de unión a antígeno completo. Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenarios" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica única. En general, el polipéptido scFv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios Vh y VL, que posibilita que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de los scFv, véase, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology o f Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York, 1994), pág. 269-315. Muchos de los procedimientos para purificar un anticuerpo descritos anteriormente se pueden adaptar adecuadamente para purificar un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno.

En algunos modos de realización, los anticuerpos codificados por el ácido nucleico en la célula de ovario de hámster chino incluyen anticuerpos terapéuticos y de diagnóstico. Los anticuerpos dentro del alcance de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: anticuerpos anti-HER2 que incluyen Trastuzumab (HERCEPTIN®) (Carter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992), patente de EE. UU. n.° 5.725.856); anticuerpos anti-CD20 tales como anti-CD20 quimérico "C2B8" como en la patente de EE.UU. n.° 5.736.137 (RITUXAN®), una variante quimérica o humanizada del anticuerpo 2H7 como en la patente de EE.UU. n.° 5.721.108B1 o Tositumomab (BeXx AR®); anti-IL-8 (St John y col., Chest, 103:932 (1993), y la publicación internacional n.° WO95/23865); anticuerpos anti-VEGF que incluyen anticuerpos anti-VEGF humanizados y/o con afinidad madurada tales como el anticuerpo anti-VEGF humanizado huA4.6.1 AVASTIN® (Kim y col., Growth Factors, 7:53-64 (1992), la publicación internacional n.° WO96/30046 y WO98/45331, publicada el 15 de octubre de 1998); anticuerpos anti-PSCA (documento WO01/40309); anticuerpos anti-CD40, que incluyen S2C6 y variantes humanizadas de los mismos (documento WO00/75348); anti-CD11a (patente de Ee . UU. n.° 5.622.700, documento WO98/23761, Steppe y col., Transplant Intl. 4:3-7 (1991), y Hourmant y col., Transplantation 58:377-380 (1994)); anti-IgE (Presta y col., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993), y la publicación internacional n.° WO95/19181); anti-CD18 (patente de EE. UU. n.° 5.622.700, emitida el 22 de abril de 1997, o como en el documento WO97/26912, publicado el 31 de julio de 1997); anti-IgE (incluyendo E25, E26 y E27; patente de EE. UU. n.° 5.714.338, emitida el 3 de febrero de 1998 o la patente de EE. UU. n.° 5.091.313, emitida el 25 de febrero de 1992, el documento WO93/04173 publicado el 4 de marzo de 1993, o la solicitud internacional n.° PCT/US98/13410 presentada el 30 de junio de 1998, patente de EE. UU. n.° 5.714.338); anticuerpo anti-receptor Apo-2 (documento WO98/51793 publicado el 19 de noviembre de 1998); anticuerpos anti-TNF-a que incluyen cA2 (Re M iCa DE®), CDP571 y MAK-195 (véase la patente de EE. UU. n.° 5.672.347 emitida el 30 de septiembre de 1997, Lorenz y col., J. Immunol. 156(4): 1646-1653 (1996), y Dhainaut y col., Crit. Care Med. 23(9):1461-1469 (1995)); anti-factor tisular (TF) (patente europea n.° 0420 937 B1, concedida el 9 de noviembre de 1994); antiintegrina a4p7 humana (documento WO98/06248, publicado el 19 de febrero de 1998); anti-EGFR (anticuerpo 225 quimerizado o humanizado, como en el documento WO 96/40210, publicado el 19 de diciembre de 1996); anticuerpos anti-CD3, tales como OKT3 (patente de EE. UU. n.° 4.515.893, emitida el 7 de mayo de 1985); anticuerpos anti-CD25 o anti-tac, tales como CHI-621 (SIMULECT®) y (ZENAPAX®) (véase la patente de EE. UU. n.° 5.693.762, emitida el 2 de diciembre de 1997); anticuerpos anti-CD4, tales como el anticuerpo cM-7412 (Choy y col., Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996)); anticuerpos anti-CD52, tales como CAMPATH-1H (Riechmann y col., Nature 332:323-337 (1988)); anticuerpos anti-receptor de Fc, tales como el anticuerpo M22 dirigido contra FcY.gamma.RI como en Graziano y col., J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995); anticuerpos frente al antígeno carcinoembrionario (CEA), tales como hMN-14 (Sharkey y col., Cancer Res. 55(23 Suppl): 5935s-5945s (1995); anticuerpos dirigidos frente a células epiteliales de mama, incluyendo huBrE-3, hu-Mc 3 y CHL6 (Ceriani y col., Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995); y Richman y col., Cancer Res. 55 (23 Supp): 5916s-5920s (1995)); anticuerpos que se unen a células de carcinoma de colon, tales como C242 (Litton y col., Eur J. Immunol. 26(1): 1-9 (1996)); anticuerpos anti-CD38, por ejemplo, AT13/5 (Ellis y col., J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)); anticuerpos anti-CD33, tales como Hu M195 (Jurcic y col., Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995) y Cm A-676 o CDP771; anticuerpos anti-CD22, tales como LL2 o LymphoCide (Juweid y col., Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s (1995)); anticuerpos anti-EpCAM, tales como 17-1A (PANOREX®); anticuerpos anti-GplIb/IIIa, tales como abciximab o Fab c7E3 (REOPRO®); anticuerpos anti-RSV, tales como Me DI-493 (SYNAGIS®); anticuerpos anti-CMV, tales como PROTOVlR®; anticuerpos anti-VIH, tales como PRO542; anticuerpos antihepatitis, tales como el anticuerpo anti-Hep B OSTAVlR®; anticuerpo anti-CA125 OvaRex; anticuerpo anti-epítopo de GD3 idiotípico BEC2; anticuerpo anti-avp3 VITAXIN®; anticuerpo anti-carcinoma de células renales humano, tal como ch-G250; ING-1; anticuerpo anti-17-1A humano (3622W94); anticuerpo anti tumor colorrectal humano (A33); anticuerpo anti-melanoma humano R24 dirigido contra gangliósido GD3; anticuerpos anti-carcinoma de células escamosas humano (SF-25); y anti-antígeno leucocitario humano (HLA), tales como Smart ID10 y el anticuerpo anti-HLA DR Oncolym (Lym-1). Los antígenos diana preferentes para el anticuerpo en el presente documento son: receptor HER2, VEGF, IgE, CD20, CD11a y CD40.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no para limitar la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Efecto del pH de la población, la temperatura de retención y el tiempo de retención sobre la viabilidad de las células descongeladas

Procedimiento de adición de base para controlar el pH de almacenamiento en banco (Estudio a pequeña escala n.° 1)

Se realizó un estudio para evaluar la viabilidad de realizar un ajuste de pH simple en el peor de los casos y en las condiciones típicas de la población (pH inicial objetivo de 6,2 y 6,7, respectivamente) para potenciar la recuperación por descongelación. Se estudiaron varios objetivos de ajuste de pH para determinar el pH óptimo del almacenamiento en bancos de células. El pH se midió usando el instrumento BioProfile® 400 (Nova Biomedical) con la temperatura ajustada a 37 °C. De forma similar, los cálculos de pH usando la Ecuación 1 se basaron en una temperatura de muestra de 37 °C.

Las células se sedimentaron por centrifugación. Las poblaciones de células se generaron para cada condición de ensayo mediante la resuspensión de las células a 100 x 106 células/ml en medios gastados. Las poblaciones de células se agitaron a 37 °C con o sin membranas permeables a los gases para el intercambio de CO2/O2 para llevar el pH a las condiciones iniciales de pH (ya sea 6,2 o 6,7). Al alcanzar los pH objetivo iniciales, las poblaciones se enfriaron rápidamente a <10 °C y se añadió medio de congelación de DMSo al 20 % (v/v) (1:3 partes de fluido de cultivo celular). Los ajustes de pH se realizaron usando la Ecuación 1 para calcular los volúmenes de carbonato de sodio 1 M que es necesario añadir para alcanzar el pH objetivo de 6,9, 7,1 y 7,3 y se tomó una medición final de pH fuera de línea para confirmar un incremento apropiado de pH antes de la generación del banco simulado (el pH del banco real fue de 6,9, 7,1/7,2 y 7,5).

Los resultados de descongelación mostraron una mejora drástica en la viabilidad el día 1 de hasta el 68 % (del ^{24 % al 92 % para el ajuste de pH de 6,2 a 7,5) (FIG.}2a ^{), y una mejora en el día 4 de PCV de hasta el 0,64 % (de}0,17 % a 0,81 % para el ajuste de pH de 6,2 a 7,5) (FIG. 2B).

Ecuación 1: Cálculo del volumen base que hay que añadir para el ajuste de pH

VNa2CO3 = 0,0085 Vp (pHt - pHi),

en el que VNa2C03 = Volumen de carbonato de sodio 1 M que hay que añadir, Vp = Volumen de la población, pHt = pH objetivo, pHi = pH inicial.

Procedimiento de adición de base para controlar el pH de almacenamiento en banco (estudios adicionales de pH a pequeña escala)

Siguiendo procedimientos similares a los descritos anteriormente, se ejecutaron varios estudios para estudiar el efecto del ajuste del pH en líneas celulares adicionales.

Se seleccionó un total de nueve líneas celulares de CHO que cubren diversos tipos de células (DP12, CHO-K1). En los días previos al almacenamiento en los bancos de células, las células se mantuvieron de acuerdo con los protocolos estándar. Las células se sedimentaron mediante centrifugación y se generaron poblaciones simuladas de aproximadamente 60-90 ml para cada condición de prueba resuspendiendo en medio gastado al 28 % de volumen de células empaquetadas (PCV). Las poblaciones se agitaron a 37 °C con o sin membranas permeables a los gases para el intercambio de CO2/O2 para llevar el pH a las condiciones iniciales de pH (ya sea 6,2 o 6,7). Estos dos puntos de ajuste de pH iniciales se eligieron para simular el peor de los casos potenciales y las condiciones típicas experimentadas durante y después de la concentración en filtro de fibra hueca. Tras alcanzar los pH objetivo iniciales, las poblaciones se enfriaron rápidamente a <10 °C y se añadió medio de congelación DMSO al 20 % (v/v) (1:3 partes de fluido de cultivo celular) para alcanzar un PCV final del 21 %. Los ajustes de pH se realizaron después de usar la Ecuación 1 para calcular el volumen de carbonato de sodio 1 M que es necesario añadir para el ajuste del pH a 7,0, 7,3, 7,6 u 8,0. Se tomó una medición final de pH fuera de línea para confirmar un incremento apropiado en el pH antes de la generación del banco de células.

Todos los casos se descongelaron por duplicado con una ampolla descongelando en cada recipiente. Los resultados demostraron que todos los tipos de células previamente expuestos a un pH más bajo se podían recuperar cuando el pH se ajusta a valores superiores a 7,3 antes de almacenarse en los bancos de células. Cada línea celular demostró una sensibilidad diferente al pH de almacenamiento en banco de células. El ajuste a un pH de aproximadamente 7,5 dio como resultado una viabilidad el día 1 de las células descongeladas superior al 80 % en la mayoría de los casos (FIGS. 3A-3F y FIGS. 4A-4B). Las tasas de crecimiento después de la descongelación solo se vieron afectadas en el extremo inferior del intervalo de pH sometido a prueba. De forma interesante, el extremo superior del intervalo de pH sometido a prueba (cerca de 8,0 - 8,2) no tuvo un impacto negativo en la recuperación por descongelación a pesar de ser significativamente mayor que el pH fisiológico normal.

Los estudios (ensayo de los tipos de células CHO-K1) se ampliaron para obtener más información sobre la exposición a largo plazo a un pH alto. Estos estudios sometieron a prueba bancos simulados congelados inmediatamente después (t0) del ajuste de pH (similar a todos los casos previos de prueba a pequeña escala) y en un segundo momento dos horas después (t2). Durante la retención de 2 horas, las poblaciones en miniatura (aproximadamente 10 ml por caso) se mantuvieron en tubos Falcon® sumergidos en hielo. Hubo una ligera deriva del pH durante la etapa de retención que dio como resultado un cambio de hasta 0,2 unidades de pH. Los resultados de estos estudios indicaron que una exposición de dos horas a los intervalos de pH sometidos a prueba en este estudio no tenía ningún impacto (un ejemplo se muestra en las FIGS. 6A-6B).

Procedimientos para enfriar el fluido de cultivo celular durante la recolección

Se adoptó un procedimiento de "recolección por bombeo lento" en combinación con un intercambiador de calor de enfriamiento para introducir la capacidad de enfriamiento en el procedimiento tradicional de almacenamiento en bancos de células. Específicamente, el procedimiento de "recolección por bombeo lento" requería reducir el caudal de recolección típico de aproximadamente 4 l/min a 600 ml/min para que coincidiera con las tasas de recolección registradas para los ciclos de producción tradicionales de almacenamiento en bancos de células. Se insertó una línea de intercambiador de calor de enfriamiento, tubo de silicona curada con platino tamaño 15 de 15' de longitud completamente sumergida en hielo, en la ruta de flujo de recolección. Las tendencias de temperatura obtenidas durante un ciclo simulado con agua demostraron que el "procedimiento de recolección refrigerada" podía reducir las temperaturas de cultivo a aproximadamente 12 °C dentro de los primeros 30 minutos antes de la concentración en filtro de fibra hueca. En base a los datos a 10 °C, esta capacidad de enfriamiento probablemente suspendería el metabolismo celular y evitaría una deriva de pH bajo.

Resultados del estudio de confirmación del procedimiento

Procedimiento de almacenamiento en bancos de células. Los bancos de células se produjeron acumulando primero células CHO adaptadas a la suspensión en un procedimiento de cultivo celular por lotes/perfusión y, a continuación, recolectando células para su almacenamiento en bancos de células. La fuente inicial de células era un MCB (para la generación de WCB). El procedimiento implicó tres fases: acumulación celular, recolección y concentración celular, y almacenamiento en bancos de células. El propósito de la etapa de acumulación de células era generar el número de células requerido para la producción de un MCB o WCB de tamaño completo (ampollas de 420 x 1 ml o 10 ml, respectivamente) en un solo lote. Las células se cultivaron en medios selectivos de cultivo celular durante el escalado inicial y durante un procedimiento en biorreactor oscilante. Una etapa del procedimiento de recolección sirvió para concentrar el fluido de cultivo celular final a través de un filtro de fibra hueca (HFF) a las densidades celulares requeridas para el almacenamiento en bancos de células. Un procedimiento posterior de agrupamiento y llenado sirvió para preparar ampollas de bancos de células para su almacenamiento a largo plazo. El procedimiento de agrupamiento se mantuvo en hielo de modo que se mantuviera un determinado intervalo de temperatura (aproximadamente 5-10 °C). El flujo de procedimiento para el procedimiento se muestra en la FIG. 1.

Los procedimientos de recolección y concentración celular se ejecutaron usando un cartucho de filtro de fibra hueca. Las tendencias de pH fuera de línea mostraron que el "procedimiento de recolección refrigerada" era eficaz para reducir la caída de pH durante la concentración celular en aproximadamente 0,35 unidades de pH (de ~6,30 a 6,66 para los procedimientos originales y "refrigerados", respectivamente). Después del ajuste del pH, se crearon bancos de células enfriadas en los puntos de tiempo temprano (0 min) y tardío (120 min) para verificar el impacto transitorio del pH de retención de la población de células.

Los bancos de células resultantes se evaluaron para determinar el rendimiento en cultivo primario. Las ampollas del banco de células se descongelaron en matraces de agitación en lugar de biorreactores usando una dilución en serie 1:250 (1:10, a continuación 1:25). Los resultados de la descongelación demostraron con éxito que el procedimiento actual (recolección enfriada y ajuste de pH) podía proporcionar bancos con un rendimiento de descongelación aceptable. Mientras que el banco de células generado a partir del procedimiento original experimentó una disminución en la viabilidad, estos nuevos bancos de células fueron consistentes y mostraron un 79,1 a 85,3 % de viabilidad en el día 1 (aproximadamente 65 % de mejora). No se observó ningún impacto adverso cuando las células se mantuvieron a un pH elevado a lo largo del tiempo.

El análisis mostró que las células de las poblaciones con pH ajustados a valores más altos tenían un tamaño más pequeño (FIG. 5). Este cambio observado en el tamaño podía indicar que un pH más alto causa deshidratación celular (posiblemente debido a un incremento de la presión osmótica o a una potenciada elasticidad de la membrana celular que permite la contracción celular o a ambas).

Conclusiones

Se determinó que el pH de almacenamiento en banco de células es el factor más crítico para el rendimiento tras la descongelación, afectando a las viabilidades el día 1 de las células descongeladas hasta en un 65 %. Asimismo, las mejoras del procedimiento conseguidas en el procedimiento de recolección y almacenamiento en bancos de células se diseñaron para mitigar la exposición celular a un pH bajo y para mejorar el control sobre el pH de almacenamiento en banco de células. Finalmente, se introdujeron dos mejoras en el proceso, que incluyen: 1) enfriar el fluido de cultivo celular durante la recolección con un intercambiador de calor de tubos de silicona; y 2) usar una etapa de ajuste de pH para incrementar el pH de almacenamiento en banco de células a 7,5.

Claims

REIVINDICACIONES

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el pH del medio de congelación se ha ajustado a a) un pH de 7,5 a 8,3; o

b) un pH de aproximadamente 7,5.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que las células se combinan con un medio de congelación antes y/o después del ajuste del pH.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2-3, que comprende además una etapa de medición de

b) el pH ajustado del medio de congelación; o

5. El procedimiento de las reivindicaciones 2 o 4, en el que el pH se ajusta por adición de

a) una base; o

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el pH del medio de congelación se ajusta por adición de

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el pH objetivo es de 7,5 a 8,5, de 7,5 a 8,3 o 7,5.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que las células CHO están en un medio que tiene un pH de 6,2 a 6,6 antes de que las células CHO se combinen con un medio de congelación.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el agente crioprotector es a) DMSO, glicerol, propanodiol, etilenglicol o un azúcar; o

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el medio de congelación que contiene las células CHO tiene una densidad celular del 8 % al 28 % del volumen de células empaquetadas (PCV) antes de la congelación.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 que comprende además una etapa de enfriamiento del fluido de cultivo celular durante el procedimiento de recolección celular y concentración antes de que las células CHO se combinen con

a) un medio de congelación; o

14. El banco de células de la reivindicación 13, en el que los recipientes son ampollas.

15. El banco de células de la reivindicación 13 o 14, en el que las células CHO comprenden

a) un ácido nucleico que codifica un polipéptido; o

b) un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en el que el polipéptido es una proteína terapéutica, preferentemente en el que la proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una enzima y una proteína de fusión receptora.