KR20170005494A - 잠복 바이러스 감염에 대한 치료제를 전달하는 조성물 및 방법 - Google Patents

잠복 바이러스 감염에 대한 치료제를 전달하는 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20170005494A
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스티븐 알. 퀘이크
지안빈 왕
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더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

본 발명은 항바이러스 치료제의 전달 방법 및 조성물을 제공한다. 방법 및 조성물은 예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대, 아데노바이러스, AAV 및 복제 무능력 HSV를 사용하여 관심 세포 내로 항바이러스 치료제의 표적화된 전달을 제공한다. 이들 및 다른 전달 시스템은 뉴클레아제 또는 세포-치사 유전자를 엔코딩하는 DNA 벡터를 전달하는 비히클로서 사용될 수 있다. 이러한 전달 방법은 또한 네이키드 DNA 또는 RNA, 단백질 생성물, 세포-치사 유전자를 추진하는, 바이러스 잠복 상태에서만 활성인 프로모터를 함유하는 플라스미드 또는 다른 치료제를 전달하는데 사용될 수 있다.

Description

잠복 바이러스 감염에 대한 치료제를 전달하는 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS OF DELIVERING TREATMENTS FOR LATENT VIRAL INFECTIONS}
관련 출원(들)의 상호 참조
본 출원은 2014년 5월 30일 출원된 미국 특허 가출원 번호 제 62/005,395호 및 2014년 7월 25일 출원된 미국 특허 가출원 제 62/029,072호 둘 모두의 우선권 및 이익을 주장하며, 이의 내용은 본원에 참고로 통합된다.
발명의 분야
본 발명은 바이러스-감염된 세포에 치료제를 전달하는 것에 관한 것이다.
배경
바이러스 감염은 심각한 의학적 문제이다. 예를 들어, 헤르페스는 성인의 90 % 이상이 감염되었던 널리 퍼진 인간 병원체이다. 잠복기 때문에 일단 감염되면 숙주는 증상을 나타내지 않을지라도 무기한으로 헤르페스 바이러스를 수반한다. 유사하게는, 인간 파필로마바이러스 또는 HPV는 인간의 75% 이상이 감염될 수 있는 인간 군집에서 일반적인 바이러스이다. 바이러스 감염이 암으로 이어질 수 있다는 점은 특히 문제가 된다. 예를 들어, HPV의 숙주 DNA로의 통합은 암, 특히 자궁 경부암을 유발하는 것으로 알려져 있다. 엡스타인-바르 바이러스 (Epstein-Barr virus, EBV)는 감염성 단핵구증 (전염단핵구증)을 유발할 뿐만 아니라 호지킨 림프종 (Hodgkin 's lymphoma) 및 버킷 림프종 (Burkitt 's lymphoma)과 같은 암과 관련이 있다.
바이러스 단백질을 표적으로 하는 약물을 개발하려는 노력이 있지만 그 노력은 완전히 성공하지 못하였다. 예를 들어, 바이러스가 잠복 상태에 있고 이의 단백질을 활동적으로 발현하지 않는 경우에는 표적으로 할 것이 없다. 또한, 바이러스 감염을 근절하기 위한 어떠한 노력도 숙주 세포 기능을 방해하는 경우 유용하지 않다. 예를 들어, 바이러스 복제를 방지하는 효소는 숙주 전반의 세포에서 게놈 복제를 방해하는 경우 도움이 되지 않는다.
개요
본 발명은 바이러스에 감염된 숙주 세포에서 바이러스 감염을 선택적으로 치료하기 위한 방법 및 치료제를 제공한다. 치료는 숙주 세포의 치사를 초래하는 것을 포함할 수 있으나, 단지 감염된 세포의 치사만 초래하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 치료는 세포 치사를 초래하는 단백질에 대한 유전자를 전달하는 것을 포함할 수 있으며, 여기에서 유전자는 감염 바이러스의 게놈으로부터 프로모터와 같은 바이러스 조절 요소의 조정하에 있거나 바이러스 복제 기점을 포함하는 벡터에 엔코딩된다. 바이러스가 존재하는 경우, 이러한 유전자가 발현될 것이며, 유전자 생성물이 세포의 치사를 초래할 것이다. 유전자는 아폽토시스에서 중요한 단백질을 코딩할 수 있거나, 유전자는 숙주 게놈을 분해하는 뉴클레아제를 코딩할 수 있다.
대안으로, 치료는 숙주 세포 기능을 방해하지 않고 바이러스 감염을 제거하는 항바이러스 치료제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 치료는 바이러스 핵산을 표적으로 하는 표적화 가능한 뉴클레아제를 포함할 수 있다. 표적화 가능한 뉴클레아제는 바이러스 프로모터 또는 복제 기점과 같은 바이러스 조절 요소의 제어하에 있는 유전자에서 제공될 수 있다. 본 발명은 예를 들어, 아데노 바이러스, AAV 및 복제 무능 HSV와 같은 바이러스 벡터를 사용하여 관심 세포 내로 항바이러스 치료제의 표적화된 전달을 제공한다. 이들 및 기타 전달 시스템은 뉴클레아제 또는 세포 독성 유전자 카세트를 엔코딩하는 핵산 (DNA, RNA, 합성 핵산 예컨대, PNA, LNA 등) 벡터로 전달하는 비히클로서 사용될 수 있다. 본 발명의 전달 방법은 항바이러스 유전자 편집 서열을 함유하는 벡터를 전달하는데 유용하다. 본 발명은 또한 네이키드 DNA 또는 RNA, 단백질 생성물, 세포-치사 유전자 작제물을 제어하는, 바이러스 잠복 상태에서만 활성인 프로모터 또는 다른 조절 서열을 함유하는 플라스미드를 전달하거나 치료제 (예를 들어, 세포독성 단백질)의 발현을 고려한다.
특정 양태에서, 본 발명은 바이러스 감염을 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 조성물은 치료제에 대한 유전자를 포함하는 벡터 및 바이러스에 감염된 세포 내에서 치료제를 발현시키는 서열을 포함한다. 서열은 바이러스의 게놈으로부터의 조절 요소 (예를 들어, 프로모터 및 복제 기점)일 수 있다.
치료제는 바이러스-감염된 세포의 치사를 선택적으로 유발하는 메카니즘을 제공할 수 있다. 특정 구체예에서, 치료제는 바이러스-감염된 세포의 치사를 유발하는 단백질을 포함한다. 치료제는 바이러스-감염된 세포의 치사를 선택적으로 유발하는 단백질일 수 있다. 예를 들어, 세포에서 결핍된 세포 아폽토시스 경로를 회복시키는 단백질이 사용될 수 있다. 유전자는 예를 들어, BAX, BAK, BCL-2, 또는 알파-헤모리신일 수 있다. 바람직하게는, 치료제는 바이러스에 감염된 세포에서 아폽토시스를 유도하고 감염되지 않은 세포에서 아폽토시스를 유도하지 않는다.
일부 구체예에서, 치료제는 표적화 가능한 뉴클레아제이고 서열은 바이러스의 게놈으로부터 비롯된다. 예를 들어, 표적화 가능한 뉴클레아제는 cas9 엔도뉴클레아제일 수 있고 벡터는 복수의 가이드 RNA를 추가로 코딩할 수 있다. 가이드 RNA는 바이러스에 의해 감염된 세포의 게놈을 표적으로 하도록 설계될 수 있다.
특정 구체예에서, 프로모터는 바이러스에 의한 잠복 감염 상태에 있는 세포 내에서만 치료제를 발현시킨다.
벡터는 예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스, 알파바이러스, 백시니아 바이러스, 또는 아데노-관련 바이러스와 같은 바이러스 벡터일 수 있다. 벡터는 플라스미드를 포함할 수 있다. 벡터는 나노 입자, 양이온성 지질, 양이온성 폴리머, 금속성 나노입자, 나노막대(nanorod), 리포솜, 미셀, 마이크로버블, 세포-침투성 펩티드 또는 리포스피어(liposphere)를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 바이러스 감염을 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 조성물은 항바이러스 치료제 및 바이러스에 감염된 세포 내에서 치료제를 활성화시키는 조절 요소를 포함하는 벡터를 포함한다. 항바이러스 치료제는 선택적으로 표적화 가능한 뉴클레아제 (예를 들어, cas9, ZFN, TALENS, 메가뉴클레아제)에 대한 유전자일 수 있으며, 조절 요소는 바이러스의 게놈으로부터 비롯될 수 있다 (예를 들어, 프로모터 또는 복제 기점). 벡터는 뉴클레아제를 바이러스 게놈으로부터의 핵산에 대하여 표적화시키는 가이드 RNA를 엔코딩할 수 있다. 특정 구체예에서, 가이드 RNA는 인간 게놈에서 완벽하게 매칭되는 것을 갖지 않도록 설계된다. 가이드 RNA는 뉴클레아제를 바이러스 게놈의 조절 요소에 대하여 표적화시킬 수 있다. 임의의 적합한 바이러스 예컨대, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스, 타입 1, 헤르페스 심플렉스, 타입 2, 수두-대상포진 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, 인간 헤르페스바이러스, 타입 8, 인간 파필로마바이러스, BK 바이러스, JC 바이러스, 천연두, B형 간염 바이러스, 인간 보카바이러스, 파르보바이러스 B19, 인간 아스트로바이러스, 노르워크 바이러스, 콕사키바이러스, A형 간염 바이러스, 폴리오바이러스, 리노바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스, C형 간염 바이러스, 황열병 바이러스, 뎅기열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 풍진 바이러스, E형 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인플루엔자 바이러스, 구아나리토 바이러스, 주닌 바이러스, 라사 바이러스, 마추포 바이러스, 사비아 바이러스, 크리미아-콩고 출혈열 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르버그 바이러스, 홍역 바이러스, 멈프스 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스, 헨드라 바이러스, 니파 바이러스, 광견병 바이러스, D형 간염, 로타바이러스, 오르비바이러스, 콜티바이러스 또는 반나 바이러스가 치료될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예는 함께 바이러스 게놈 물질을 표적으로 하고 이를 선택적으로 편집하거나 파괴하는 CRISPR/Cas9 뉴클레아제 및 가이드 RNA (gRNA)를 사용한다. CRISPR (클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부)은 파아지 감염으로부터 박테리아를 보호하는 박테리아 면역 시스템의 자연-발생 요소이다. 가이드 RNA는 CRISPR/Cas9 복합체를 바이러스 표적 서열에 국한시킨다. 복합체의 결합은 Cas9 엔도뉴클레아제를 바이러스 게놈 표적 서열로 국한시켜 바이러스 게놈에서 파괴를 일으킨다. 바람직한 구체예에서, 가이드 RNA는 바이러스 핵산을 파괴하고 그것이 기능적으로 재조합될 기회를 감소시키기 위해 바이러스 게놈 상의 다중 부위를 표적으로 하도록 설계된다.
본 발명은 바이러스에 감염된 세포 (전체 조직 포함) 내로 CRISPR/gRNA/Cas9 복합체 또는 다른 치료제를 표적 전달하는 방법을 제공한다. 본 발명의 CRISPR/gRNA/Cas9 복합체는 바이러스, 비-바이러스 또는 다른 벡터에 의해 전달될 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스, 알파바이러스, 백시니아 바이러스, 또는 아데노-관련 바이러스를 포함한다. 전달은 또한 나노입자, 양이온성 지질, 양이온성 폴리머, 금속 나노입자, 나노막대, 리포솜, 미셀, 마이크로버블, 세포-침투성 펩티드 또는 리포스피어와 같은 비-바이러스 벡터에 의해 수행될 수 있다. 일부 비-바이러스 벡터는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 코팅되어 비-바이러스 벡터의 옵소닌화 및 응집을 감소시키고 망상내피계에 의한 제거를 최소화하여, 정맥내 투여 후 연장된 순환 수명을 유도할 수 있다. 본 발명의 양태는 증가된 조직-투과 효과를 위한 전달 벡터에 에너지의 적용을 제공한다 (예를 들어, 초음파). 본 발명은 전신 전달 및 국소 전달 둘 모두를 고려한다.
본 발명의 양태는 CRISPR/gRNA/Cas9 복합체가 바이러스 게놈 물질은 표적으로 하고, 숙주의 게놈 물질은 표적으로 하지 않도록 설계되게 한다. 잠복 바이러스는 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 6 및 7, 헤르페스 심플렉스 바이러스 타입 1 및 2, 수두-대상포진 바이러스, 홍역 바이러스 또는 인간 파포바바이러스일 수 있다. 본 발명의 양태는 CRISPR/gRNA/Cas9 복합체가 잠복 또는 활성인 임의의 바이러스를 표적으로 하도록 설계되게 한다.
제시된 방법은 바이러스 게놈 편집 또는 파괴를 허용하여, 감염되지 않은 세포에 대한 세포 독성이 관찰되지 않으면서, 감염된 세포에서 바이러스가 증식될 수 없게 하고/거나 아폽토시스를 유도한다. 본 발명의 양태는 바이러스 게놈 물질 (DNA 또는 RNA)을 선택적으로 표적으로 하는 CRISPR/gRNA/Cas9 복합체를 제공하고, 바이러스 게놈을 함유하는 세포에 CRISPR/gRNA/Cas9 복합체를 전달하고, 바이러스를 무력화시키기 위해 바이러스 게놈을 절단하는 것을 포함한다. 제시된 방법은 바이러스 게놈 기능의 치료제 표적화된 파괴 또는 바람직한 구체예에서, 바이러스 게놈에서 엔도뉴클레아제 작용을 위한 다중 부위를 표적화함으로써 야기된 다중 파괴를 통한 바이러스 핵산의 분해를 가능하게 한다. 본 발명의 양태는 감염된 세포에서 세포 증식을 완전히 억제하고/거나 세포 아폽토시스를 유도하는 CRISPR/gRNA/Cas9 복합체 칵테일의 형질감염을 제공한다. 본 발명의 추가적인 양태 및 이점은 이하의 상세한 설명을 고려할 때 명백해질 것이다.
본 발명의 양태는 바이러스 감염을 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 뉴클레아제에 대한 유전자, 뉴클레아제를 바이러스의 게놈에 대하여 표적화시키는 서열, 및 특이적 유형의 세포 내에서 벡터로부터 전사를 촉진하는 프로모터를 포함하는 벡터를 포함한다. 조성물은 수두 대상포진 바이러스에 의한 감염을 치료하는데 사용될 수 있으며, 즉, 싱글레스 또는 대상포진 후 신경통을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 신경 세포이고, 프로모터는 신경 세포 내에서 선택적으로 유전자의 발현을 일으킨다. 프로모터는 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 또는 혈소판-유래 성장 인자 (PGDF) 프로모터일 수 있다. 특정 구체예에서, 바이러스는 수두 대상포진 바이러스이다. 서열은 바이러스의 게놈에서 조절 요소를 표적으로 하도록 설계될 수 있으며, 바람직하게는, 인간 게놈에서 어떠한 정확하게 매칭되는 것이 없다. 뉴클레아제는 cas9 엔도뉴클레아제일 수 있다. 일부 구체예에서, 서열은 벡터 내의 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부 (CRISPR) 영역 내에 있고, CRISPR 영역은 바이러스의 게놈 내의 복수의 표적과 매칭되는 복수의 가이드 RNA를 엔코딩한다. 말초 신경계 내에서 전사를 촉진하는 프로모터가 사용될 수 있다. 아데노바이러스 벡터, rAAV-기재 벡터, 또는 플라스미드와 같은 임의의 적합한 벡터가 사용될 수 있다.
도 1a-1c는 EBV-표적화 CRISPR/Cas9 설계를 나타낸다. (도 1a) [Cong L et al. (2013) Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science 339:819-823]로부터 채택된, CRISPR/Cas 플라스미드의 개략도. (도 1b) 라지(Raji) 세포에서의 형질감염 효율에 대한 oriP의 효과. Cas9 및 Cas9-oriP 플라스미드 둘 모두는 스크램블링된 가이드 RNA를 갖는다. (도 1c) CRISPR 가이드 RNA는 EBV 기준 게놈을 따라 표적화한다. 녹색, 적색 및 청색은 3개의 상이한 표적 서열 카테고리를 나타낸다.
도 2a-2f는 CRISPR/Cas9 유도된 큰 결실을 나타낸다. (도 2a) 가이드 RNA sgEBV2 및 PCR 프라이머 위치 주변의 게놈 컨텍스트. (도 2b) sgEBV2에 의해 유도된 큰 결실. 레인 1-3은 각각 sgEBV2 처리 전, 처리 후 5 일 및 7 일째이다. (도 2c) 가이드 RNA sgEBV3/4/5 및 PCR 프라이머 위치 주변의 게놈 컨텍스트. (도 2d) sgEBV3/5 및 sgEBV4/5에 의해 유도된 큰 결실. 레인 1 및 2는 sgEBV3/5 처리 전 및 처리 후 8일째 3F/5R PCR 앰플리콘이다. 레인 3 및 4는 sgEBV4/5 처리 전 및 처리 후 8일째 4F/5R PCR 앰플리콘이다. (도 2e 및 f) Sanger 시퀀싱에 의해 sgEBV3/5 (도 2e) 및 sgEBV4/5 (도 2f) 처리 8일 후에 게놈 절단 및 복구 결찰을 확인하였다. 청색과 백색 배경은 복구 결찰전 두 끝을 강조 표시한 것이다.
도 3a-3m은 EBV 게놈 파괴에 의한 세포 증식 억제를 나타낸다. (도 3a) 상이한 CRISPR 처리 후 세포 증식 곡선. 5개의 독립적인 sgEBV1-7 처리가 도시된다. (도 3b-d) sgEBV1-7 처리 전 (도 3b), 처리 후 5일 (도 3c) 및 8일 (도 3d)의 유동 세포측정 산란 신호. (도 3e-g) sgEBV1-7 처리 전 (도 3e), 처리 후 5일 (도 3f) 및 8일 (도 3g)의 Annexin V Alexa647 및 DAPI 염색 결과. 청색 및 적색은 (도 3b-d)의 하위군집 P3 및 P4에 대응한다. (도 3h 및 i) 현미경 검사는 sgEBV1-7 처리 후 아폽토시스 세포 형태를 나타내었다. (도 3j-m) sgEBV1-7 처리 전 (도 3j) 및 후 (도 3k-m)의 핵 형태.
도 4a-4e는 CRISPR 처리 후 EBV 로드 정량화를 나타낸다. (도 4a) 디지털 PCR에 의한 다양한 CRISPR 처리 후 EBV 로드. Cas9 및 Cas9-oriP는 2개 복제물을 갖고, sgEBV1-7은 5개의 복제물을 가졌다. (도 4b 및 c) 전체-게놈 증폭을 위한 포획된 단일 세포의 현미경사진. (도 4d) 처리 전 단일 세포로부터의 EBV 정량적 PCR Ct 값의 히스토그램. (도 4e) sgEBV1-7 처리 후 7일에 단일의 생 세포로부터의 EBV 정량적 PCR Ct 값의 히스토그램. (도 4d) 및 (도 4e)의 적색 점선은 세포 당 하나의 EBV 게놈의 Ct 값을 나타낸다.
도 5는 EBV CRISPR의 SURVEYOR 검정을 나타낸다. 레인 1: NEB 100bp 래더; 레인 2: sgEBV1 대조군; 레인 3: sgEBV1; 레인 4: sgEBV5 대조군; 레인 5: sgEBV5; 레인 6: sgEBV7 대조군; 레인 7: sgEBV7; 레인 8: sgEBV4.
도 6은 EBV-네거티브 버킷 림프종 DG-75를 사용한 CRISPR 세포독성 시험을 보여준다.
도 7은 일차 인간 폐 섬유아세포 IMR-90을 이용한 CRISPR 세포 성 시험을 나타낸다.
도 8은 ZFN의 사용을 보여준다.
도 9는 본 발명의 방법을 도시한다.
도 10은 HBV 게놈의 지도이다.
도 11은 바이러스 치료제 전달 결과를 보여준다.
도 12는 특정 구체예에 따른 조성물을 보여준다.
상세한 설명
본 발명은 일반적으로 바이러스 감염을 표적으로 하는 치료제를 전달하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 도 9는 본 발명의 방법을 도시한다. 도 12는 특정 구체예에 따른 조성물을 보여준다. 일부 구체예에서, 조성물은 도 12에 도시된 바와 같이 치료제 (예를 들어, 뉴클레아제 또는 아폽토시스-관련 유전자) 및 바이러스-추진 프로모터에 대한 유전자를 적어도 포함하는 플라스미드와 같은 벡터를 포함한다. 조성물은 선택적으로, 가이드 RNA, 기타 프로모터, 복제 기점, 기타 또는 이들의 조합물 중 하나 이상을 선택적으로 포함할 수 있다. 본 발명은 관심 세포로의 뉴클레아제 또는 기타 세포독성 요소의 효과적인 전달을 허용하는 방법 및 조성물을 제공한다. 방법 및 조성물은 예를 들어, 아데노바이러스, AAV 및 복제 무능 HSV와 같은 바이러스 벡터를 사용하여 관심 세포 내로 항바이러스 치료제의 표적화된 전달을 제공한다. 이들 및 다른 전달 시스템은 뉴클레아제 또는 세포-치사 유전자를 엔코딩하는 DNA 벡터를 전달하는 비히클로서 사용될 수 있다. 이러한 전달 방법은 또한 네이키드 DNA 또는 RNA, 단백질 생성물, 세포-치사 유전자를 유도하는 잠복 바이러스 상태에서만 활성인 프로모터를 함유하는 플라스미드, 또는 다른 치료제를 전달하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 바이러스 및 바이러스-감염된 세포를 특이적으로 표적화 하도록 설계된다.
본 발명에 의해 고려되는 치료 중 하나는 바이러스 게놈을 표적화하기 위한 뉴클레아제의 사용이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 관심 세포 내로 뉴클레아제를 전달하는 것을 포함한다. 뉴클레아제는 바이러스 게놈에서 결실을 전체적으로 일으켜 바이러스 게놈이 그 자신을 복제할 수 있는 능력을 감소시킴으로써 세포 내 잠복 바이러스를 무력화시키거나 파괴시킬 수 있는 능력을 갖는다. 구체예에서, 치료제는 바이러스를 무력화시키거나 파괴시키기 위해 바이러스 게놈 내에서 삽입, 결실 또는 재배열을 유발하는, CRISPR/Cas 및 가이딩된 RNA 복합체를 포함한다.
본 발명은 일반적으로 가이딩된 뉴클레아제 시스템을 사용하여 바이러스 감염을 선택적으로 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 단일- 또는 이중-가닥 파괴, 절단, 분해 또는 편집과 같은 뉴클레아제 활성을 통해 세포 내에서 바이러스 핵산을 무력화시키거나 파괴시키는데 사용된다. 본 발명의 방법은 게놈에서 큰 또는 반복된 결실을 전체적으로 일으키는데 이용될 수 있으며, 이는 전체 게놈을 재구성할 확률을 감소시킨다.
i. 감염된 세포 치료
도 9는 바이러스로 감염된 세포를 치료하는 방법을 도시한다. 본 발명의 방법은 환자의 생체내 치료에 적용 가능하며, 예컨대, 감염된 세포에서 아폽토시스를 개시하거나 잠복 바이러스 감염과 관련된 바이러스의 유전자를 분해시킴으로써 바이러스에 감염된 임의의 세포를 치료하는데 사용될 수 있다. 방법은 예를 들어, 세포 배양물 또는 세포 샘플을 제조 또는 처리하기 위해 시험관 내에서 이용될 수있다. 생체내에서 사용될 경우, 세포는 임의의 적합한 생식 세포주 또는 체세포일 수 있으며, 본 발명의 조성물은 환자 신체의 특정 부위에 전달되거나 전신 전달될 수 있다. 전신으로 전달되는 경우, 본 발명의 조성물 내에 조직-특이적인 프로모터를 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 환자가 간에 국한된 잠복 바이러스 간염을 갖는 경우, 간 조직-특이적 프로모터는 표적화된 뉴클레아제를 코딩하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 포함될 수 있다.
ii. 치료제
본 발명의 방법 및 조성물은 감염된 세포의 치사를 선택적으로 일으키거나 감염된 세포에 방해받지 않으면서 바이러스를 선택적으로 표적으로 하는데 이용될 수 있다.
1. 아폽토틱
일부 구체예에서, 본 발명은 숙주 세포 그러나, 단지 감염된 숙주 세포의 치사만을 일으키는데 사용될 수 있는 치료제 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 치료는 세포 치사를 초래하는 단백질에 대한 유전자를 전달하는 것을 포함할 수 있으며, 여기에서 유전자는 감염 바이러스의 게놈으로부터 프로모터와 같은 바이러스 조절 요소의 조정하게 있거나 유전자는 바이러스 복제 기점을 포함하는 벡터에 엔코딩된다. 바이러스가 존재하는 경우, 유전자가 발현되고 유전자 생성물이 세포의 치사를 초래할 것이다. 유전자는 아폽토시스에서 중요한 단백질을 코딩할 수 있거나 유전자는 숙주 게놈을 분해하는 뉴클레아제를 코딩할 수 있다.
벡터 내에서 엔코딩된 치료제가 제공될 수 있으며, 여기에서 벡터는 또한, 바이러스에 의해 감염되는 세포 내에서 치료제를 발현시키는 서열을 엔코딩한다. 서열은 바이러스의 게놈으로부터의 조절 요소 (예를 들어, 프로모터 및 복제 기점)일 수 있다. 치료제는 바이러스-감염된 세포의 치사를 선택적으로 유발하는 메커니즘을 제공할 수 있다. 예를 들어, 세포에서 결함이 있는 아폽토시스 경로를 회복시키는 단백질이 사용될 수 있다. 유전자는 예를 들어, BAX, BAK, BCL-2, 또는 알파-헤모리신일 수 있다. 바람직하게는, 치료제는 바이러스에 감염된 세포에서 아폽토시스를 유도하고 감염되지 않은 세포에서는 아폽토시스를 유도하지 않는다.
소수의 세포가 감염되며 전체 세포 (및 잠복 바이러스 게놈)를 제거하기에 충분할 경우, 본 발명의 양태는 잠복 바이러스 상태에서 활성인 프로모터를 함유하는 벡터의 투여를 고려하며, 여기에서 프로모터는 세포-치사 유전자를 구동시킨다. HSV는 수천에서 수만개의 뉴런만이 잠복 감염된 것으로 추산되기 때문에 이러한 접근법에서 특히 흥미로운 표적이다. 참조로 통합된 문헌 [Hoshino et al., 2008, The number of herpes simplex virus-infected neurons and the number of viral genome copies per neuron correlate with latent viral load in ganglia, Virology 372(1):56-63] 참조. 세포-치사 유전자의 예는 아폽토시스 이펙터 예컨대, BAX 및 BAK, 및 세포 또는 미토콘드리아 막의 무결성을 파괴하는 단백질, 예컨대, 알파 헤모리신을 포함한다. (Bayles, "Bacterial programmed cell death: making sense of a paradox," Nature Reviews Microbiology 12 pp.63-69 (2014)). 잠복 감염된 세포에서만 활성화되는 프로모터를 갖는다는 것은 이러한 맥락에서 사용될 수 있을 뿐만 아니라 감염된 세포에 특이적인 활성을 만들어 뉴클레아제 치료제의 선택성을 증가시키는데 사용될 수 있다; 이러한 프로모터의 예로 잠복기-관련 프로모터 1 (Latency-Associated Promoter 1) 또는 "LAP1"이 있다. (Preston and Efstathiou, "Molecular Basis of HSV Latency and Reactivation", in Human Herpesviruses: Biology, Therapy and Immunoprophylaxis 2007.)
일부 구체예에서, 본 발명은 아폽토시스를 촉진시키는 적어도 하나의 유전자 및 바이러스 게놈과 관련된 적어도 하나의 프로모터를 엔코딩하는 바이러스 벡터, 플라스미드, 또는 다른 코딩 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 아폽토시스 조절인자 Bcl-2는 미토콘드리아 외부 막 침투화 (MOMP)를 제어하는 단백질의 패밀리이며, Bax, BAD, Bak, Bok, Bcl-rambo, Bcl-xs 및 BOK/Mtd와 같은 프로-아폽토틱 단백질을 포함한다.
bcl-2-유사 단백질 4로도 알려진 아폽토시스 조절인자 BAX는 인간에서 BAX 유전자에 의해 엔코딩되는 단백질이다. BAX는 Bcl-2 유전자 패밀리의 구성원이다. 이러한 단백질은 BCL2와 헤테로다이머를 형성하며, 아폽토틱 활성인자로서 작용한다. 이 단백질은 미토콘드리아 전압-의존성 음이온 채널 (VDAC)과 상호 작용하고 이의 개방을 증가시키고, 이는 막 전위의 손실과 사이토크롬 c의 방출로 이어지는 것으로 보고된다.
Bcl-2 상동성 길항제/킬러는 인간에서 크로모좀 6의 BAK1 유전자에 의해 엔코딩되는 단백질이다. 이 단백질은 미토콘드리아에 국한되며, 아폽토시스를 유도하는 작용을 한다. 이는 미토콘드리아 전압-의존성 음이온 채널과 상호 작용하고 이의 개방을 증가시키고, 이는 막 전위의 손실과 사이토크롬 c의 방출로 이어진다.
이러한 패밀리에 속하는 단백질을 엔코딩하는 인간 유전자는 하기를 포함한다: BAK1, BAX, BCL2, BCL2A1, BCL2L1, BCL2L2, BCL2L10, BCL2L13, BCL2L14, BOK, 및 MCL1.
2. 항바이러스제
본 발명의 방법은 파괴를 위해 바이러스 핵산을 특이적으로 표적화하기 위해 프로그램 가능하거나 표적화 가능한 뉴클레아제를 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부 (CRISPR) 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 다른 엔도- 또는 엑소-뉴클레아제, 또는 이의 조합물을 포함하는 임의의 적합한 표적화 뉴클레아제가 사용될 수 있다. 참조로 통합된 문헌 [Schiffer, 2012, Targeted DNA mutagenesis for the cure of chronic viral infections, J Virol 88(17):8920-8936] 참조.
CRISPR 방법론은 CRISPR-관련 뉴클레아제 (Cas9)를 사용하며, 이는 가이드로서 작은 RNA(gRNA)와 복합되어 임의의 게놈 위치에서 프로토스페이서(protospacer) 인접 모티프 (PAM)의 업스트림을 서열-특이적 방식으로 DNA 절단한다. CRISPR은 crRN 및 tracrRNA로 알려진 별도의 가이드 RNA를 사용할 수 있다. 이들 두 개의 분리된 RNA는 단일 RNA로 결합되어 짧은 가이드 RNA의 디자인을 통해 부위-특이적 포유류 게놈 절단을 가능하게 한다. Cas9 및 가이드 RNA (gRNA)는 공지된 방법으로 합성될 수 있다. Cas9/가이드-RNA (gRNA)는 비-특이적 DNA 절단 단백질인 Cas9, 및 표적에 혼성화되고 Cas9/gRNA 복합체를 구성하기 위한 RNA 올리고를 사용한다. 문헌 [Chang et al., 2013, Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos, Cell Res 23:465-472; Hwang et al., 2013, Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system, Nat. Biotechnol 31:227-229; Xiao et al., 2013, Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENS and CRISPR/Cas in zebrafish, Nucl Acids Res 1-11] 참조.
CRISPR (클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부)은 박테리아에서 발견되며 박테리아를 파지 감염으로부터 보호하는 것으로 여겨진다. 이는 최근에 진핵생물 DNA에서 유전자 발현을 변경시키는 수단으로 사용되었지만, 항-바이러스 치료법 또는 더욱 광범위하게는, 게놈 물질을 파괴시키는 방법으로는 제안되지 않았다. 오히려, 이는 표적화된 세포 또는 세포 군집의 DNA에서 전사를 증가시키거나 감소시키는 방법으로서 삽입 또는 결실을 도입하는데 사용되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Horvath et al., Science (2010) 327:167-170; Terns et al., Current Opinion in Microbiology (2011) 14:321-327; Bhaya et al. Annu Rev Genet (2011) 45:273-297; Wiedenheft et al. Nature (2012) 482:331-338); Jinek M et al. Science (2012) 337:816-821; Cong L et al. Science (2013) 339:819-823; Jinek M et al. (2013) eLife 2:e00471; Mali P et al. (2013) Science 339:823-826; Qi LS et al. (2013) Cell 152:1173-1183; Gilbert LA et al. (2013) Cell 154:442-451; Yang H et al. (2013) Cell 154:1370-1379; and Wang H et al. (2013) Cell 153:910-918)] 참조. 또한, 계류중인 미국 가출원 62/005,395에서 이는 항-바이러스 치료제로서 또는 보다 광범위하게 게놈 물질을 파괴하는 방법으로서 제안되었다.
본 발명의 한 양태에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 게놈의 적어도 2개 위치에서 이중 가닥 파괴를 일으킨다. 이들 2개의 이중 가닥 파괴는 게놈 단편이 결실되게 한다. 바이러스 복구 경로가 양 말단을 어닐링하더라도, 게놈에 여전히 결실이 있을 것이다. 이러한 메카니즘을 이용하는 하나 이상의 결실은 바이러스 게놈을 무력화시킬 것이다. 그 결과 숙주 세포는 바이러스 감염으로부터 자유로울 것이다.
본 발명의 구체예에서, 뉴클레아제는 표적 바이러스의 게놈을 절단한다. 뉴클레아제는 핵산의 뉴클레오티드 서브유닛 사이의 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있는 효소이다. 엔도뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드 사슬 내의 포스포디에스테르 결합을 절단하는 효소이다. 일부 예컨대, 데옥시리보뉴클레아제 I은 상대적으로 비특이적으로 (서열에 관계없이) DNA를 절단하는 반면, 일반적으로 제한 엔도뉴클레아제 또는 제한 효소로 불리는 많은 효소는 매우 특이적인 뉴클레오티드 서열만을 절단한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, Cas9 뉴클레아제가 본 발명의 조성물 및 방법에 혼입되지만, 임의의 뉴클레아제가 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, Cas9 뉴클레아제는 게놈을 절단하는데 사용된다. Cas9 뉴클레아제는 게놈에서 이중 가닥 파괴를 유도할 수 있다. Cas9 뉴클레아제는 2개의 기능성 도메인: RuvC 및 HNH을 가지며 각각 다른 가닥을 절단한다. 이들 도메인 둘 모두가 활성인 경우, Cas9는 게놈에서 이중 가닥 파괴를 일으킨다.
본 발명의 일부 구체예에서, 게놈 내로의 삽입은 무력화 또는 변형된 게놈 발현을 일으키도록 설계될 수 있다. 추가적으로, 삽입/결실은 또한 이중 가닥 파괴에서 하나를 발생시키거나 이중 가닥 파괴 중 하나의 다운스트림을 생성하기 위해 리딩 프레임을 이동시킴으로써 조기 정지 코돈을 도입하는데 사용된다. NHEJ 복구 경로의 이러한 결과 중 임의의 결과를 이용하여 표적 유전자를 파괴할 수 있다. CRISPR/gRNA/Cas9 시스템의 사용에 의해 도입된 변화는 게놈에 대해 영구적이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 삽입이 CRISPR/gRNA/Cas9 복합체에 의해 야기된다. 바람직한 구체예에서, 수많은 삽입이 게놈에서 야기되어 바이러스를 무력화시킨다. 본 발명의 한 양태에서, 삽입 수는 게놈이 복구될 확률을 낮춘다.
본 발명의 일부 구체예에서, 적어도 하나의 결실이 CRISPR/gRNA/Cas9 복합체에 의해 야기된다. 바람직한 구체예에서, 수많은 결실이 게놈에서 야기되어 바이러스를 무력화시킨다. 본 발명의 한 양태에서, 결실 수는 게놈이 복구될 확률을 낮춘다. 매우 바람직한 구체예에서, 본 발명의 CRISPR/Cas9/gRNA 시스템은 현저한 게놈 파괴를 유발하는데, 이는 바이러스 게놈의 효과적인 파괴를 유도하는 반면 숙주 게놈을 손상시키지 않은 채 남겨둔다.
TALEN은 본질적으로 어떠한 서열도 표적으로 할 수 있는 DNA-결합 도메인에 융합된 비특이적 DNA-절단 뉴클레아제를 이용한다. TALEN 기술에 있어서, 표적 부위가 동정되고 발현 벡터가 만들어진다. 선형화된 발현 벡터 (예를 들어, Notl에 의한)는 mRNA 합성을 위한 주형으로 사용될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 키트 예컨대, Life Technologies (Carlsbad, CA)의 mMESSAGE mMACHINE SP6 전사 키트가 사용될 수 있다. 문헌 [Joung & Sander, 2013, TALENs: a wideliy applicable technology for targeted genome editing, Nat Rev Mol Cell Bio 14:49-55] 참조.
TALEN 및 CRISPR 방법은 표적 부위에 대한 일-대-일 관계를 제공하며, 즉, TALE 도메인의 탠덤 반복부의 하나의 단위가 표적 부위에서 하나의 뉴클레오타이드를 인식하고, CRISPR/Cas 시스템의 crRNA, gRNA 또는 sgRNA가 DNA 표적에서 상보적 서열로 혼성화된다. 방법은 하나의 gRNA를 갖는 한 쌍의 TALEN 또는 Cas9 단백질을 사용하여 표적에서 이중-가닥 파괴를 생성하는 것을 포함할 수 있다. 이어서 파괴는 비-상동 말단-결합 또는 상동성 재조합 (HR)을 통해 수리된다.
도 8은 ZFN이 바이러스 핵산을 절단하는데 사용됨을 보여준다. 간단하게는, ZFN 방법은 감염된 숙주 세포에 표적화된 ZFN (305) 및 선택적으로, 적어도 하나의 액세서리 폴리뉴클레오티드를 엔코딩하는 적어도 하나의 벡터 (예를 들어, RNA 분자)를 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 참조로 통합된 웨인스테인의 미국 공개 2011/0023144 참조. 세포는 표적 서열 (311)을 포함한다. 세포는 ZFN (305)의 발현을 허용하도록 인큐베이션되는데, 여기에서 이중-가닥 절단(317)이 ZFN (305)에 의한 표적화된 크로모좀 서열 (311) 내로 도입된다. 일부 구체예에서, 도너 폴리뉴클레오티드 또는 교환 폴리뉴클레오티드 (321)가 도입된다. 무관한 서열로 바이러스 핵산의 일부를 교체하는 것은 바이러스 핵산의 전사 또는 복제를 완전히 방해할 수 있다. 교환 폴리뉴클레오티드 (321)와 함께 표적 DNA (311)는 에러가 발생하기 쉬운 비-상동성 말단-결합 DNA 복구 프로세스 또는 상동성-지향 DNA 복구 프로세스에 의해 복구될 수 있다.
전형적으로, ZFN은 DNA 결합 도메인 (즉, 아연 핑거) 및 절단 도메인 (즉, 뉴클레아제)을 포함하고, 이러한 유전자는 mRNA (예를 들어, 5' 캡핑, 폴리아데닐화 또는 둘 모두)로서 도입될 수 있다. 아연 핑거 결합 도메인은 선택된 임의의 핵산 서열을 인지하고 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 참조로 통합된 문헌 [Qu et al., 2013, Zinc-finger-nucleases mediate specific and efficient excision of HIV-1 proviral DAN from infected and latently infected human T cells, Nucl Ac Res 41(16):7771-7782] 참조. 조작된 아연 핑거 결합 도메인은 자연-발생 아연 핑거 단백질과 비교하여 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 비제한적으로, 합리적인 설계 및 다양한 선택 유형을 포함한다. 아연 핑거 결합 도메인은 아연 핑거 인식 영역 (즉, 아연 핑거)을 통해 표적 DNA 서열을 인식하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 참조로 통합된 미국 특허 번호 6,607,882; 6,534,261 및 6,453,242 참조. 아연 핑거 인식 영역을 선택하는 예시적인 방법은 파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 포함할 수 있으며, 미국 특허 5,789,538; 미국 특허 5,925,523; 미국 특허 6,007,988; 미국 특허 6,013,453; 미국 특허 6,410,248; 미국 특허 6,140,466; 미국 특허 6,200,759; 및 미국 특허 6,242,568에 개시되어 있으며, 이들 각각은 참고 문헌으로 인용된다.
ZFN은 또한 절단 도메인을 포함한다. ZFN의 절단 도메인 부분은 임의의 적합한 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제 예컨대, 제한 엔도뉴클레아제 및 호밍 엔도뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Belfort & Roberts, 1997, Homing endonucleases: keeping the house in order, Nucleic Acids Res 25(17):3379-3388] 참조. 절단 도메인은 절단 활성을 위한 다이머화를 필요로 하는 효소로부터 유래될 수 있다. 2개의 ZFN이 절단에 필요할 수 있는데, 각 뉴클레아제가 활성 효소 다이머의 모노머를 포함하기 때문이다. 대안적으로, 단일 ZFN은 두 모노머 모두를 포함하여 활성 효소 다이머를 생성시킬 수 있다. 존재하는 제한 엔도뉴클레아제는 결합 부위에 또는 그 근처에서 DNA의 서열-특이적 결합 및 절단이 가능할 수 있다. 특정 제한 효소 (예를 들어, 타입 IIS)는 인지 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하며 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 갖는다. 예를 들어, 다이머로서 활성인 타입 IIS 효소 Fokl는 한 가닥에서 효소의 인지 부위로부터 9개 뉴클레오티드 및 또 다른 가닥에서는 이의 인지 부위로부터 13개 뉴클레오티드에서 DNA의 이중-가닥 절단을 촉매한다. ZFN에 사용된 FokI 효소는 절단 단량체로 간주될 수 있다. 따라서, FokI 절단 도메인을 사용하는 표적화된 이중-가닥 절단에 있어서, FokI 절단 모노머를 각각 포함하는 2개의 ZFN은 활성 효소 다이머를 재구성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 각각 참조로 통합된 문헌 [Wah, et al., 1998, Structure of FokI has implications for DNA cleavage, PNAS 95:10564-10569]; 미국 특허 5,356,802; 미국 특허 5,436,150; 미국 특허 5,487,994; 미국 공개 2005/0064474; 미국 공개 2006/0188987; 및 미국 공개 2008/0131962 참조.
ZFN을 이용한 바이러스 표적화는 서열을 포함하는 적어도 하나의 도너 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 도너 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는, 크로모좀에서의 통합 부위의 어느 한 측면과 서열 유사성을 공유하는 업스트림 및 다운스트림 서열에 의해 측면 인접하여 도입될 서열을 포함한다. 도너 폴리뉴클레오티드의 업스트림 및 다운스트림 서열은 관심 크로모좀 서열과 도너 폴리뉴클레오티드 사이의 재조합을 촉진하도록 선택된다. 전형적으로, 도너 폴리뉴클레오티드는 DNA일 것이다. 도너 폴리뉴클레오티드는 DNA 플라스미드, 박테리아 인공 크로모좀 (BAC), 효모 인공 크로모좀 (YAC), 바이러스 벡터, 선형 DNA 조각, PCR 단편, 네이키드 핵산일 수 있으며, 전달 비히클 예를 들어, 리포솜을 사용할 수 있다. 도너 폴리뉴클레오티드의 서열은 엑손, 인트론, 조절 서열 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 이중 가닥 파괴는 요망되는 서열이 크로모좀에 혼입되도록 도너 폴리뉴클레오티드와의 상동성 재조합을 통해 복구된다. 크로모좀 서열을 변형시키는 ZFN-매개된 과정에서, ZFN에 의해 크로모좀 서열 내로 도입된 이중 가닥 파괴는 교환 폴리 뉴클레오티드와의 상동성 재조합을 통해 복구되어, 교환 폴리뉴클레오티드에서의 서열은 크로모좀 서열의 일부와 교환될 수 있다. 이중 가닥 파괴의 존재는 상동성 재조합 및 파괴의 복구를 용이하게 한다. 교환 폴리뉴클레오티드는 물리적으로 통합될 수 있거나, 대안적으로, 교환 폴리뉴클레오티드는 파괴의 복구를 위한 주형으로서 사용될 수 있으며, 이는 교환 폴리뉴클레오티드의 서열 정보와 크로모좀 서열의 해당 부분의 서열 정보의 교환을 유도한다. 따라서, 바이러스 핵산 부분이 교환 폴리뉴클레오티드의 서열로 전환될 수 있다. ZFN 방법은 ZFN을 엔코딩하는 핵산 분자 및 선택적으로 적어도 하나의 교환 폴리뉴클레오티드 또는 적어도 하나의 도너 폴리뉴클레오티드를 감염된 세포에 전달하기 위해 벡터를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
메가뉴클레아제는 큰 인식 부위 (12 내지 40개 염기쌍의 이중-가닥 DNA 서열)에 의해 특성결정된 엔도데옥시리보뉴클레아제이며; 그 결과 이러한 부위는 일반적으로 임의의 주어진 게놈에서 단지 한 번만 발생한다. 예를 들어, I-SceI 메가뉴클레아제에 의해 인식되는 18-염기쌍 서열은 우연에 의해 한번 밝혀지게 되는 인간 게놈 크기의 20 배의 게놈을 평균적으로 요구할 것이다 (단 단일의 불일치를 갖는 서열은 인간-크기 게놈 마다 약 3 회 발생함). 따라서, 메가뉴클레아제는 가장 특이적인 자연 발생 제한 효소로 간주된다. 메가뉴클레아제는 서열 및 구조 모티프를 기반으로 하여 5개 계열로 구분될 수 있다: LAGLIDADG, GIY-YIG, HNH, His-Cys 박스 및 PD-(D/E)XK. 가장 잘 연구된 계통은 독립된 구성원이 또한 존재하지만 일반적으로 인트론 또는 인테인 (intein) 내에서 엔코딩된 LAGLIDADG 단백질의 계통으로, 이는 모든 생명계에서 발견되었다. 서열 모티프인 LAGLIDADG는 효소 활성에 필수적인 요소를 나타낸다. 어떤 단백질은 그런 모티프를 하나만 함유하는 반면 다른 단백질은 두 개를 함유하였다; 두 경우 모두에서 모티프에 이어서, 다른 계통 구성원과 서열 유사성이 없거나 거의 없는 ~75-200개 아미노산 잔기가 온다. 결정 구조는 LAGLIDADG 계열에 대한 서열 특이성 및 절단 메카니즘의 모드를 나타낸다: (i) 특이성 접촉은 연장된 β-가닥을 DNA의 주요 홈으로 매장함으로써 야기되고, DNA 결합 새들(saddle)은 DNA의 나선형 트위스트를 모방한 피치 및 윤곽을 가지며; (ii) 단백질과 DNA 사이의 완전한 수소 결합 가능성은 결코 완전히 실현되지 않으며; (iii) 특징적인 4-nt 3'-OH 오버행을 생성하기 위한 절단이 마이너 홈에 걸쳐 발생하며, 여기서 끊기는 포스페이트 결합은 중심 "4-염기" 영역에서 DNA의 왜곡에 의해 단백질 촉매 코어에 더 가깝게 되며; (iv) 절단은 제안된 2-금속 메커니즘을 통해 발생하고, 때로는 독특한 "금속 공유" 패러다임을 수반하며; (v) 마지막으로, 추가적 친화력 및/또는 특이성 접촉은 코어 α/β 폴드의 외부 영역에서 "맞춰진" 스캐폴드로부터 발생할 수 있다. 참조로 통합된 문헌 [Silva et al., 2011, Meganucleases and other tools for targeted genome engineering, Curr Gene Ther 11(1):11-27] 참조.
본 발명의 일부 구체예에서, 주형 서열은 게놈에 삽입된다. 게놈 DNA에 뉴클레오티드 변형을 도입하기 위해, 원하는 서열을 함유하는 DNA 복구 주형이 HDR 동안 존재해야 한다. DNA 주형은 일반적으로 gRNA/Cas9와 함께 세포 내로 형질감염된다. 각 상동성 암(arm)의 길이와 결합 위치는 도입되는 변화의 크기에 의존적이다. 적합한 주형의 존재하에, HDR은 Cas9 유도된 이중 가닥 파괴에서 특이적 뉴클레오티드 변화를 도입할 수 있다.
본 발명의 일부 구체예는 번형된 버젼의 뉴클레아제를 사용할 수 있다. 단일의 비활성 촉매 도메인 즉, RvC- 또는 HNH-를 함유하는 번형된 버젼의 Cas9 효소는 '닉카아제'로 불린다. 오직 하나의 활성 뉴클레아제 도메인으로, Cas9 닉카아제는 표적 DNA의 단지 한 가닥만을 절단하여, 단일-가닥 파괴 또는 '닉 (nick)'을 발생시킨다. 비활성 dCas9 (RuvC- 및 HNH-)와 유사하게, Cas9 닉카아제는 gRNA 특이성에 기초하여 DNA에 여전히 결합 할 수 있지만, 닉카아제는 DNA 가닥 중 하나만을 절단할 것이다. CRISPR 플라스미드의 대부분은 S. 피오게네스로부터 유래되며, RuvC 도메인은 D10A 돌연변이에 의해 불활성화될 수 있으며 HNH 도메인은 H840A 돌연변이에 의해 불활성화될 수 있다.
단일-가닥의 파괴 또는 닉은 일반적으로 온전한 상보적 DNA 가닥을 주형으로 사용하여 HDR 경로를 통해 신속하게 복구된다. 그러나, Cas9 닉카아제에 의해 도입된 2개의 근위의 마주보는 가닥 닉은 종종 '이중 닉' 또는 '이중 닉카아제' CRISPR 시스템으로 지칭되는 이중 가닥 파괴로 취급된다. 이중-닉 유도된 이중 가닥 파괴는 유전자 표적에 대한 원하는 효과에 따라 NHEJ 또는 HDR에 의해 복구될 수 있다. 이들 이중 가닥 파괴에서, 삽입 및 결실은 CRISPR/Cas9 복합체에 의해 초래된다. 본 발명의 한 양태에서, 결실은 2개의 이중 가닥 파괴부를 서로 근접하게 위치시킴으로써 야기되며, 이에 의해 게놈의 단편이 결실되게 한다.
iii. 표적 모이어티
뉴클레아제는 작동시키기 위해 gRNA의 표적 특이성을 사용할 수 있다. 아래에 설명된 바와 같이, 가이드 RNA 또는 단일 가이드 RNA는 바이러스 게놈을 표적으로 하도록 특별히 고안된다.
본 발명의 CRISPR/Cas9 유전자 편집 복합체는 바이러스 게놈을 표적으로 하는 가이드 RNA와 최적으로 작용한다. 가이드 RNA (gRNA) 또는 단일 가이드 RNA (sgRNA)는 바이러스 게놈 파괴를 유발하기 위해 CRISPR/Cas9 복합체를 바이러스 게놈으로 유도한다. 본 발명의 양태에서, CRISPR/Cas9/gRNA 복합체는 세포 내에서 특이적 바이러스를 표적으로 하도록 설계된다. 임의의 바이러스는 본 발명의 조성물을 사용하여 표적화될 수 있음을 이해해야 한다. CRISPR/Cas9/gRNA 복합체의 개발 및 설계에서 바이러스 게놈의 특정 영역을 확인하는 것이 도움이 된다.
본 발명의 한 양태에서, CRISPR/Cas9/gRNA 복합체는 세포 내에서 잠복 바이러스를 표적으로 하도록 설계된다. 일단 세포 내부에서 형질감염되면, CRISPR/Cas9/gRNA 복합체는 반복된 삽입 또는 결실을 일으켜 게놈을 무능력하게 만들거나 삽입 또는 결실 횟수로 인해 복구 가능성이 현저하게 감소한다.
예로서, 인간 헤르페스바이러스 4 (HHV-4)라고도 불리는 엡스타인-바르 바이러스 (EBV)는 본 발명의 CRISPR/Cas9/gRNA 복합체에 의해 세포에서 불활성화된다. EBV는 헤르페스 패밀리의 바이러스이며, 인간에서 가장 흔한 바이러스 중 하나이다. 바이러스는 직경이 약 122nm 내지 180nm이며 단백질 캡시드에 감싸진 DNA의 이중 나선으로 구성된다. 이러한 예에서, 라지 세포주는 적절한 시험관내 모델로 사용된다. 라지 세포주는 조혈 기원으로부터의 최초의 연속적인 인간 세포주이며, 세포주는 가장 광범위하게 연구된 EBV 모델 중 하나인 반면 엡스타인-바르 바이러스의 비정상적인 변형을 일으킨다. 라지 세포에서 EBV 게놈을 표적으로 하기 위해서는 EBV에 대한 특이성을 갖는 CRISPR/Cas9 복합체가 필요하다. Addgene, Inc.로부터 입수한 U6 프로모터 구동 키메라 가이드 RNA (sgRNA) 및 유비쿼터스 프로모터 구동 Cas9로 구성된 EBV-표적화 CRISPR/Cas9 플라스미드의 설계. 상업적으로 입수가능한 가이드 RNA 및 Cas9 뉴클레아제는 본 발명과 함께 사용할 수 있다. Cas9 단백질 후 융합된 EGFP 마커는 Cas9-파지티브 세포의 선택을 허용하였다 (도 1a).
본 발명의 양태에서, 가이드 RNA는 특정 바이러스 게놈을 표적으로 하기 위해 상업적으로 구매되었는지의 여부에 상관없이 설계된다. 바이러스 게놈을 확인하고 바이러스 게놈의 선택된 부분을 표적으로 하기 위한 가이드 RNA를 개발하고 본 발명의 조성물에 혼입시킨다. 본 발명의 양태에서, 바이러스의 특정 균주의 기준 게놈은 가이드 RNA 디자인을 위해 선택된다.
예를 들어, EBV 게놈을 표적으로 하는 가이드 RNA는 본 예에서 시스템의 성분이다. 예를 들어, EBV와 관련하여, B95-8 균주로부터의 기준 게놈이 디자인 가이드로 사용되었다. EBV와 같은 대상 게놈 내에서, 선택된 영역 또는 유전자에서 표적화된다. 예를 들어, 6개의 영역은 상이한 게놈 편집 목적에 대해 7개의 가이드 RNA 디자인으로 표적화될 수 있다 (도 1c 및 표 S1).
표 S1. 가이드 RNA 표적 서열
가이드 RNA 서열
sgEBV1 GCCCTGGACCAACCCGGCCC (SEQ ID NO: 1)
sgEBV2 GGCCGCTGCCCCGCTCCGGG (SEQ ID NO: 2)
sgEBB3 GGAAGACAATGTGCCGCCA (SEQ ID NO: 3)
sgEBV4 TCTGGACCAGAAGGCTCCGG (SEQ ID NO: 4)
sgEBV5 GCTGCCGCGGAGGGTGATGA (SEQ ID NO: 5)
sgEBV6 GGTGGCCCACCGGGTCCGCT (SEQ ID NO: 6)
sgEBV7 GTCCTCGAGGGGGCCGTCGC (SEQ ID NO: 7)
EBV와 관련하여, EBNA1은 감염의 잠재 및 용해 모드 모두에서 발현되는 유일한 핵 엡스테인-바르 바이러스 (EBV) 단백질이다. EBNA1은 잠복 감염에서 여러 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있지만, EBNA1은 유전자 조절 및 잠복 게놈 복제를 포함한 많은 EBV 기능에 중요하다. 따라서, 가이드 RNA sgEBV4 및 sgEBV5는 게놈의 이러한 전체 영역을 제거하기 위해 EBNA1 코딩 영역의 양 말단을 표적으로 하도록 선택되었다. 이러한 "구조적" 표적은 EBV 게놈을 더 작은 조각으로 체계적인 분해를 가능하게 한다. EBNA3C 및 LMP1은 숙주 세포 형질전환에 필수적이며, 가이드 RNA인 sgEBV3 및 sgEBV7은 이들 두 단백질의 5' 엑손을 각각 표적으로 하도록 설계되었다.
iv. 세포로의 도입
본 발명의 방법은 세포 내로 뉴클레아제 및 서열-특이적 표적화 모이어티를 도입시키는 것을 포함한다. 뉴클레아제는 서열-특이적 표적화 부분에 의해 바이러스 핵산으로 표적화 되며, 이어서 여기에서 숙주 게놈의 방해를 받지 않고 바이러스 핵산을 절단한다. 임의의 적합한 방법을 이용하여 감염된 세포 또는 조직에 뉴클레아제를 전달할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 엔코딩하는 유전자는 주사, 경구 또는 유체역학적 전달에 의해 전달될 수 있다. 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 엔코딩하는 유전자는 전신 순환계로 전달될 수 있거나 다르게는, 특이적 조직 유형으로 국소화되어 전달될 수 있다.
일부 바이러스 감염은 단지 소수의 세포에만 영향을 미치며, 표적화된 전달 방법을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, HSV는 대략 20,000 뉴런을 잠복 감염시키는 것으로 추정되었다. 이러한 및 기타 바이러스 감염에 있어서, 관심 세포만을 표적으로 하는 치료제를 갖는 것이 중요할 수 있다. 세포 친화성 및 특이성 증가는 치료학적 전달 효율을 크게 향상시킬 수 있다.
뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 엔코딩하는 유전자는 조직 특이적 프로모터를 사용하는 것과 같은 단지 특정 조건하에서만 활성화되도록 변형되거나 프로그래밍될 수 있어서 엔코딩된 뉴클레아제가 우선적으로 또는 특정 조직 유형에서만 전사되게 한다.
일부 구체예에서, 특이적 CRISPR/Cas9/gRNA 복합체가 세포 내로 도입된다. 가이드 RNA는 바이러스 게놈 서열의 적어도 하나의 카테고리를 표적으로 하도록 고안된다. 잠복 감염 이외에, 본 발명은 또한, 바이러스 게놈이 패키징되기 전에 또는 방출된 후에 바이러스 게놈을 표적으로 함으로써 활성적으로 복제하는 바이러스를 제어하는데 사용될 수 있다.
사전패키징된 GFP-Cas9-아데노바이러스는 Vector Biolabs (Philadelphia, PA)로부터 입수가능하다. EBV를 표적으로 하는 서열과 같은 다양한 표적화 gRNA 서열은 아데노바이러스 주로 패키징될 수 있다. gRNA 서열은 CRISPR/Cas9 복합체와 함께 또는 별도로 수용될 수 있다.
일부 구체예에서, 가이드 RNA의 칵테일이 세포 내로 도입될 수 있다. 가이드 RNA는 바이러스 게놈 서열의 다양한 카테고리를 표적으로 하도록 고안된다. 게놈을 따라 여러 영역을 표적으로 함으로써, 다중 위치에서의 이중 가닥 파괴는 게놈을 단편화시키고, 복구의 가능성을 저하시킨다. 복구 메커니즘을 사용해도 큰 결실은 바이러스를 무력화시키는 경향이 있다.
일부 구체예에서, 여러 가이드 RNA가 첨가되어 상이한 카테고리의 서열을 표적으로 하도록 칵테일을 생성시킨다. 예를 들어, 3개의 상이한 카테고리의 서열을 표적으로 하는 CRISPR 칵테일에 2, 5, 7 또는 11개의 가이드 RNA가 존재할 수 있다. 그러나, 임의의 수의 gRNA는 칵테일 내로 도입되어 서열 카테고리를 표적으로 할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 서열 카테고리는 각각 게놈 구조, 숙주 세포 형질전환, 및 감염 잠복기에 중요하다.
본 발명의 일부 양태에서, 시험관내 실험은 바이러스 게놈 내에서 가장 필수적인 표적의 결정을 허용한다. 예를 들어, 게놈의 효과적인 무력화를 위한 가장 중요한 표적을 이해하기 위해, 가이드 RNA의 서브세트가 모델 세포로 형질감염된다. 검정은 어떤 가이드 RNA 또는 어떤 칵테일이 필수 카테고리 서열을 표적으로 하는데 가장 효과적인지를 결정할 수 있다.
이들 제제는 바이러스 벡터 (하기 추가로 기술된 예)의 일부로서 또는 DNA 또는 RNA와 같이 네이키드로서 전달될 수 있다. 네이키드 핵산은 분해를 피하기 위해 변형될 수 있다.
또 다른 가능성은 시그널링 분자에 융합되거나 표면 상에 시그널링 분자가 있는 소포내로 패키징되거나 나노 입자, 소포로 패키징되거나 콜로이드에 부착된 단백질 생성물 자체를 전달하는 것이다. 이러한 전달 방법의 예는 이전에 암에서 연구되었지만 잠복 바이러스 감염에 대한 국소 전달에는 적용되지 않았다. (예를 들어, 문헌 [Alexis et al, “Nanoparticle Technologies for Cancer Therapy” in Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology 197, 2010] 참조). 기타 전달 방법이 하기 상세히 기술된다. HSV 및 기타 바이러스가 감염시키는 세포 및 조직에 있어서 고도로 국소화된 HSV 및 기타 바이러스에 대해, 이들 치료제는 국소 주입 또는 크림으로서 전달될 수 있다.
본 발명의 기타 구체예에서, 물리적 접근법은 잠복 감염을 갖는 세포를 제거하는데 사용될 수 있으며, 이들이 HSV와 같은 질병에 국한된다는 점을 이용한다. 한 접근법은 감염된 세포를 이미지화시키고 (예를 들어, 바이러스 단백질에 대한 또는 바이러스 게놈에 대한 형광 마커, 또는 바이러스 잠복 프로모터에 의해 유도된 형광 단백질을 사용하여), 이어서 열, 광 또는 고주파 방사를 사용하여 이들 세포를 제거하는 것이다. 직접적인 조영제는 또한 감염된 세포 쪽으로 사용될 수 있다. 형광 분자 대신에, 반도체 또는 금속 나노입자, 콜로이드, 또는 광 또는 고주파와 강력하게 상호 작용하는 다른 구조물이 사용될 수 있다. 크림 또는 주사로 국부적으로 적용될 수 있다. 이들 물질은 감염된 세포가 다중 입자를 끌어당겨 가장 높은 효과를 나타낼 수 있도록 협력 효과를 잠재적으로 활용할 수 있다. 유사한 접근법이 암 치료에 사용되었다 (예를 들어, 문헌 [Jain et al “Gold nanoparticles as novel agents for cancer therapy,” Br J Radiol Feb 2012 85(1010):101-113] 참조). 본 발명은 이들 기법을 잠복 바이러스 감염의 치료에 적용한다.
또 다른 구체예에서, 단일 세포 분해능을 갖는 고도로 국소화된 방식으로 방사선의 이미징 및 전달을 가능하게 하는 광섬유 내시경과 같은 미세수술 도구를 사용하여 표지되고 감염된 세포를 절제할 수 있다. (문헌 [Barretto RP and Schnitzer MJ. “In Vivo Optical Microendoscopy for Imaging Cells Lying Deep within Live Tissue.” Cold Spring Harb Protoc. 2012(10) and Llewellyn ME, Barretto RPJ, Delp SL & Schnitzer MJ. (2008) Minimally invasive high-speed imaging of sarcomere contractile dynamics in mice and humans. Nature. 454 784-788] 참조).
예를 들어, EBV 게놈 표적화의 경우, CRISPR 칵테일에 있는 7개의 가이드 RNA는 EBV 게놈 구조, 숙주 세포 형질전환 및 감염 잠복기 각각에 중요한 것으로 확인된 3개의 상이한 카테고리의 서열을 표적으로 하였다. 효과적인 EBV 치료에 가장 중요한 표적을 이해하기 위해, 라지 세포를 가이드 RNA의 서브세트로 형질감염시켰다. sgEBV4/5가 EBV 게놈을 85%만큼 감소시켰으나, 이들은 전체 칵테일만큼 효과적으로 세포 증식을 억제할 수 없었다 (도 3a). 구조 서열 (sgEBV1/2/6)을 표적으로 하는 가이드 RNA는 전체 EBV 로드를 제거할 수 없음에도 불구하고 (26% 감소) 세포 증식을 완전히 중단시킬 수 있다. 높은 게놈 편집 효율 및 증식 저지를 고려할 때 (도 2), sgEBV1/2/6에서 잔여 EBV 게놈 징후는 온전한 게놈으로 인한 것이 아니라 EBV 게놈 이외에서 분해된 자유-부유 DNA 즉, 거짓 파지티브로 인한 것으로 의심되었다.
일단 CRISPR/Cas9/gRNA 복합체가 작제되면, 복합체는 세포 내로 도입된다. 복합체가 시험관내 모델 또는 생체내 모델에서 세포 내로 도입될 수 있음을 인식해야 한다. 본 발명의 양태에서, CRISPR/Cas9/gRNA 복합체는 형질감염 후 바이러스의 온전한 게놈을 유지하지 않도록 설계되며, 복합체는 효율적인 형질감염을 위해 설계된다.
본 발명의 양태는 CRISPR/Cas9/gRNA가 바이러스 벡터 및 비-바이러스 벡터를 포함하는 다양한 방법에 의해 세포 내로 형질감염될 수 있게 한다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함 할 수 있다. CRISPR/Cas9/gRNA 복합체의 세포 내로의 전달을 수행하기 위해 임의의 바이러스 벡터를 본 발명에 혼입시킬 수 있음을 인식해야 한다. 일부 바이러스 벡터는 소화 또는 무능력을 목적으로 설계된 CRISPR/Cas9/gRNA 복합체에 따라 다른 것보다 더욱 효과적 일 수 있다. 본 발명의 양태에서, 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 복제 및 유지에 필수적인 복제 기점과 같은 필수 구성요소를 함유한다.
본 발명의 한 양태에서, 바이러스 벡터는 세포 내로 복합체를 전달하기 위한 전달 벡터로서 사용된다. 전달 벡터로서의 바이러스 벡터의 용도는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 그 내용이 참조로 통합되는 미국 공개 2009/0017543 (Wilkes et al.) 참조.
레트로바이러스는 mRNA 게놈 (5' 캡 및 3' 폴리A 테일을 포함)의 형태로 핵산을 저장하고 절대 기생충으로서 숙주 세포를 표적으로하는 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 당 분야의 일부 방법에서, 레트로바이러스는 핵산을 세포 내로 도입시키는데 사용되었다. 일단 숙주 세포의 세포질에 들어가면, 바이러스는 자신의 역전사 효소를 이용하여 RNA 게놈으로부터 DNA를 생산하는데, 이는 통상적인 패턴의 역, 따라서 레트로 (retro) (거꾸로)이다. 이어서 이러한 새로운 DNA는 인테그라제 효소에 의해 숙주 세포 게놈에 통합되며, 그 지점에서 레트로바이러스 DNA는 프로바이러스로 불린다. 예를 들어, 몰로니 설치류 백혈병 바이러스와 같은 재조합 레트로바이러스는 안정적인 방식으로 숙주 게놈 내로 통합될 수 있는 능력을 갖는다. 이들은 호스트 게놈으로의 통합을 허용하는 역전사 효소를 함유한다. 레트로바이러스 벡터는 복제 가능할 수 있거나 복제 결함일 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 레트로바이러스는 세포로의 형질감염을 수행하기 위해 혼입되지만, CRISPR/Cas9/gRNA 복합체는 바이러스 게놈을 표적으로 하도록 설계된다.
본 발명의 일부 구체예에서, 레트로바이러스의 하위부류인 렌티바이러스는 바이러스 벡터로서 사용된다. 다른 레트로바이러스가 분열하는 세포만 감염시킬 수 있기 때문에, 렌티바이러스는 렌티바이러스의 독특한 특징인 비분열 세포의 게놈으로의 이들의 통합 능력이 제공된 전달 비히클 (벡터)로 채택될 수 있다. RNA 형태의 바이러스 게놈은 바이러스가 세포로 유입되어 DNA를 생성할 경우 역-전사되며, 이는 이어서 바이러스 인테그라제 효소에 의해 무작위적 위치에서 게놈 내로 삽입된다. 이제 프로바이러스라고 불리는 벡터는 게놈에 잔존하며 세포가 분열할 때 세포의 자손에게 전달된다.
렌티바이러스와 반대로, 아데노바이러스 DNA는 게놈에 통합되지 않으며 세포 분열 동안 복제되지 않는다. 아데노바이러스 및 관련 AAV는 숙주의 게놈에 통합되지 않기 때문에 전달 벡터로서 잠재적인 접근법이 될 것이다. 본 발명의 일부 양태에서, 표적화될 바이러스 게놈 만이 숙주 세포가 아닌 CRISPR/Cas9/gRNA 복합체에 의해 영향을 받는다. 아데노-관련 바이러스 (AAV)는 인간 및 일부 다른 영장류를 감염시키는 작은 바이러스이다. AAV는 분열 세포와 비-분열 세포 모두를 감염시킬 수 있으며, 이의 게놈을 숙주 세포의 게놈으로 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 유전자 요법 벡터로서의 이의 잠재적 용도로 인해, 연구자들은 자가-상보적 아데노-관련 바이러스 (scAAV)로 불리는 변형된 AAV를 만들었다. AAV는 DNA의 단일 가닥을 패키징하고 두 번째-가닥 합성 과정을 필요로 하는 반면, scAAV는 함께 어닐링되어 이중 가닥 DNA를 형성하는 두 가닥 모두를 패키징한다. 두 번째 가닥 합성을 생략함으로써, scAAV는 세포에서 신속한 발현을 가능하게 한다. 그렇지 않으면, scAAV는 이의 AAV 상대의 많은 특징을 수반한다. 본 발명의 방법은 전달 벡터의 수단으로서 헤르페스바이러스, 폭스바이러스, 알파바이러스 또는 백시니아 바이러스를 혼입시킬 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 비-바이러스 벡터는 형질감염을 수행하는데 사용될 수 있다. 핵산의 비-바이러스 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 마이크로인젝션, 바이오리스틱스, 비로솜, 리포솜, 미셀, 면역리포솜, 다가양이온 또는 지질: 핵산 컨쥬게이트, 네이키드 DNA, 인공 비리온 및 DNA 흡수 강화제를 포함한다. 리포펙션은 미국 특허 번호 5,049,386, 4,946,787; 및 4,897,355에 기술되어 있으며, 리포펙션 시약은 시중에서 판매된다 (예를 들어, Transfectam 및 Lipofectin). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 미국 특허 7,166,298 (Jessee) 또는 미국 특허 6,890,554 (Jessee)에 기재된 것들을 포함하며, 이의 각 내용은 참조로 통합된다. 전달은 세포 (예를 들어, 시험관내 또는 생체외 투여) 또는 표적 조직 (예를 들어, 생체 내 투여)으로 이루어질 수 있다.
합성 벡터는 전형적으로 음으로 하전된 핵산과 복합되어 대략 100 nm의 직경을 갖는 입자를 형성할 수 있는 양이온성 지질 또는 폴리머를 기반으로 한다. 복합체는 뉴클레아제에 의한 분해로부터 핵산을 보호한다. 게다가, 세포 및 지방 전달 전략은 적절한 세포하 구획에서의 내재화, 방출 및 분포에 대한 요구를 다뤄야 한다. 전신 전달 전략은 추가적인 장애 예를 들어, 양이온 전달 비히클과 혈액 성분의 강한 상호작용, 망상내피계에 의한 흡수, 신장 여과, 독성 및 관심 세포로의 캐리어의 표적화 능력과 직면하게 된다. 양이온성 비-바이러스의 표면을 개질시키는 것은 혈액 성분과의 상호 작용을 최소화하고, 망상내피계 흡수를 감소시키며, 이들의 독성을 감소시키고 표적 세포와의 이들의 결합 친화도를 증가시킬 수 있다. 혈장 단백질의 결합 (옵소닌화라고도 함)은 RES가 순환 나노입자를 인식하는 주요 메커니즘이다. 예를 들어, 간에서 쿠퍼 (Kupffer) 세포와 같은 대식세포는 스캐빈저 수용체를 통해 옵소닌화된 나노입자를 인식한다.
본 발명의 일부 구체예에서, 비-바이러스 벡터는 표적 전달 및 형질감염을 수행하도록 변형된다. 페길화 (즉, 폴리에틸렌글리콜로의 표면 변형)는 비-바이러스 벡터의 옵소닌화 및 응집을 감소시키고, 망상내피계에 의한 제거를 최소화시키는데 사용되는 우세한 방법이며, 이는 정맥내 (i.v.) 투여 후 연장된 순환 수명을 유도한다. 따라서, 페길화된 나노입자는 종종 "스텔스(stealth)" 나노입자로 불린다. 순환으로부터 신속하게 제거되지 않는 나노입자는 감염된 세포와 직면할 기회를 가질 것이다.
그러나, 표면 상의 PEG는 표적 세포에 의한 흡수를 감소시킬 수 있으며 생물학적 활성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 페길화된 성분의 원위 말단으로의 표적화하는 리간드를 부착시키는 것이 필요하며; 리간드는 표적 세포 표면 상의 수용체로의 결합을 허용하도록 PEG "쉴드(shield)"를 넘어서 돌출된다. 양이온성 리포솜이 유전자 담체로서 사용될 때, 중성 헬퍼 지질의 적용은 핵산의 방출에 도움이 되며, 또한 엔도솜 탈출을 가능하게 하는 육각형 상 형성을 촉진시킨다. 본 발명의 일부 구체예에서, 중성 또는 음이온성 리포솜은 핵산의 전신 전달 및 실험 동물 모델에서 치료 효과를 얻기 위해 개발된다. 새로운 양이온성 지질 및 폴리머의 설계와 합성, 및 유전자와 펩티드, 표적화 리간드, 폴리머 또는 환경적으로 민감한 모이어티의 공유적 또는 비공유적 결합은 또한, 비-바이러스 벡터가 직면하게 되는 문제점을 해결하는데 있어서 많은 주목을 끌고 있다. 전달 벡터에서 무기 나노입자 (예를 들어, 금속 나노입자, 산화철, 인산칼슘, 인산마그네슘, 인산망간, 이중 수산화물, 탄소 나노튜브 및 양자점)의 적용은 많은 다양한 방법으로 준비되고 표면-작용기화될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 조직 및 외부 자극의 독특한 환경에 반응하는 표적화된 방출 제어 시스템이 이용된다. 금 나노막대는 근적외선 영역에서 강한 흡수 밴드를 가지며, 흡수된 광 에너지는 이어서 금 나노막대에 의해 열, 소위 '광열 효과'로 전환되어 불린다. 근적외선 광이 조직 깊숙이 침투할 수 있기 때문에 제어 방출을 위해 금 나노막대의 표면이 핵산으로 변형될 수 있다. 변형된 금 나노막대가 근적외선에 의해 조사될 때, 광열 효과에 의해 유도된 열-변성으로 인해 핵산이 방출된다. 방출되는 핵산의 양은 광 조사의 힘 및 노출 시간에 의존적이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 리포솜은 세포 또는 조직 내로의 형질 감염을 수행하는데 사용된다. 본원에서 사용된 바와 같은 "리포솜"은 지질, 특히 이중층 막의 내부의 소수성 영역과 접촉하는 소수성 모이어티 및 막의 외부 극성 표면을 향해 배향된 헤드 기 모이어티를 가지며, 물에서 지질 이중층 구조로 자발적으로 배열될 수 있는 소포-형성 지질로 구성된 작고 구형인 소포를 지칭한다. 소포-형성 지질은 전형적으로 2개의 탄화수소 사슬, 특히 아실 사슬, 및 머리 기 (극성 또는 비극성)를 갖는다. 소포-형성 지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산, 포스파티딜이노시톨 및 스핑고마이엘린과 같은 인지질을 포함하여 자연 발생 지질 또는 합성 오리진으로 구성되며, 여기서 2개의 탄화수소 사슬은 전형적으로 약 14-22개 탄소 원자 길이를 가지며, 불포화도가 다양하다. 아실 사슬의 포화도가 다양한 상기 언급된 지질 및 인지질은 상업적으로 수득되거나 공개된 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물에 사용하기 위한 다른 적합한 지질은 리포솜에 또한 사용될 수 있는 콜레스테롤 및 이의 다양한 유사체와 같은 당지질 및 스테롤을 포함한다.
리포솜과 유사하게, 미셀은 지질로 구성된 작은 구형 소포이지만, 지질 분자의 친수성 헤드 영역이 주위 용매와 접촉하여 미셀의 중심에서 소수성 단일-테일 영역을 분리시킨 지질 단일층으로 배열된다. 이러한 상은 이중층에서 단일-테일 지질의 패킹 거동에 의해 초래된다.
핵산의 리포솜 제형의 약리학은 핵산이 리포솜 이중층 내부에 캡슐화되는 정도에 의해 주로 결정된다. 캡슐화된 핵산은 뉴클레아제 분해로부터 보호되는 반면, 단순히 리포솜의 표면과 결합된 물질은 보호되지 않는다. 캡슐화된 핵산은 온전한 리포솜의 연장된 순환 수명 및 생체분포를 공유하는 반면, 표면 결합된 것들은 일단 리포솜으로부터 분리되면 네이키드 핵산의 약리학을 채택한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 복합체는 리포솜에 캡슐화된다. 소분자 약물과 달리, 핵산은 주로 핵산의 큰 크기와 친수성으로 인하여 온전한 지질 이중층을 가로지를 수 없다. 따라서, 핵산은 에탄올 점적 방법 (SALP에서와 같이), 역-상 증발 방법 및 에탄올 희석 방법 (SNALP에서와 같이)과 같은 통상적인 수동적 로딩 기술로 리포솜 내에 포획될 수 있다.
일부 구체예에서, 선형 폴리에틸렌이민 (L-PEI)은 이의 다기능성 및 비교적 높은 형질 감염 효율로 인해 비-바이러스 벡터로 사용된다. L-PEI는 생체 내에서 종양뿐만 아니라 폐, 뇌, 췌장, 망막, 방광과 같은 광범위한 기관에 유전자를 효율적으로 전달하는데 사용되었다. L-PEI는 시험관 내에서 및 생체 내에서 핵산을 효율적으로 응축, 안정화 및 전달할 수 있다.
마이크로버블과 조합된 저-강도 초음파는 최근에 안전한 유전자 전달 방법으로 많은 주목을 받았다. 초음파는 조직-투과성 효과를 보여준다. 이는 비-침습적이며 부위-특이적이며, 전신 전달 후 종양을 파괴하는 반면 비표적화된 기관은 영향을 받지 않은 채 남겨둘 수 있다. 초음파-매개된 마이크로버블 파괴는 약물 및 핵산을 다른 조직에 비침습적으로 전달하는 혁신적인 방법으로 제안되었다. 마이크로버블은 특정 관심 영역에 도달할 때까지 약물 또는 유전자를 운반하는데 사용되며, 이어서 초음파를 사용하여 마이크로버블을 파열시켜 생활성 물질의 부위-특이적 전달을 유발한다. 또한, 글라이코칼릭스 손상 또는 내피 기능장애를 갖는 혈관 부위로 부착하는 알부민-코팅된 마이크로버블의 능력은 초음파가 없을 때조차도 약물을 전달할 수 있는 또 다른 가능한 메커니즘이다. 참조로 통합된 문헌 [Tsutsui et al., 2004, The use of microbubbles to target drug delivery, Cardiovasc Ultrasound 2:23] 참조. 초음파-촉발된 약물 전달에서, 조직-투과성 효과는 초음파 조영제인 가스-충진 마이크로버블을 사용하여 강화될 수 있다. 핵산 전달을 위한 마이크로버블의 사용은, 표적 영역을 통한 이들의 미세혈관 통과 동안 집중된 초음파 빔에 의한 DNA-로딩된 마이크로버블의 파괴가 비-표적화된 영역을 보존하면서 마이크로버블 쉘의 파괴시에 국소화된 형질도입을 초래할 것이라는 가설에 기초한다.
초음파-매개된 전달 이외에, 자성 표적화 전달법이 전달에 이용될 수 있다. 자성 나노입자는 일반적으로 핵산 전달을 이미지화하기 위한 유전자 벡터에 포획된다. 핵산 캐리어는 초음파 및 자기장, 즉 자성 및 음향 활성 리포스피어 (MAAL) 둘 모두에 반응적일 수 있다. 기본적인 전제는, 치료제가 자성 마이크로- 또는 나노입자에 부착되거나 그 안에 캡슐화된다는 것이다. 이들 입자는 기능화될 수 있는 폴리머 또는 금속 코팅을 갖는 자성 코어를 가질 수 있거나, 기공 내에 침전된 자성 나노입자를 함유하는 다공성 폴리머로 이루어질 수 있다. 폴리머 또는 금속 코팅을 작용기화시킴으로써, 예를 들어, 표적화된 화학 요법을 위한 세포독성 약물 또는 치료학적 DNA를 부착시켜 유전적 결함을 수정하는 것이 가능하다. 부착되면, 입자/치료제 복합체는 혈류 내로 주입되고, 표적 근처에 주사 부위에 위치시킨 카테터를 종종 사용한다. 일반적으로 높은 자기장, 높은 경사도의 희토류 자석에서 나오는 자기장은 표적 부위에 집중되며, 이들이 자기장에 유입될 때 입자 상의 힘은 이들이 표적에서 포획 분출되게 한다.
기존의 리포솜에 비해, 세포 독성과 조합된 향상된 형질감염 효율을 제공하는 합성 양이온 폴리머-기반 나노 입자 (~ 100 nm 직경)가 개발되었다. 다양한 물리적 및 화학적 특성을 지닌 지질 분자로 구성된 별개의 층을 폴리머 나노입자 제형에 혼입시키는 것은 세포 막과의 보다 양호한 융합 및 세포 내로의 진입, 세포 내부의 분자의 향상된 방출, 및 나노입자 복합체의 감소된 세포내 분해를 유도하였다.
일부 구체예에서, 특히, 리포솜, 알부민-기재 입자, 페길화된 단백질, 생분해성 폴리머-약물 복합물, 폴리머 미셀, 덴드리머와 같은 복합체는 전신 요법용 나노-시스템에 컨주게이팅된다. 참조로 통합된 문헌 [Davis et al., 2008, Nanotherapeutic particles: an emerging treatment modality for cancer, Nat Rev Drug Discov. 7(9):771-782] 참조. 리포솜과 같은 순환하는 긴 거대분자 담체는 종양 혈관으로부터의 우선적인 혈관외 유출을 위한 향상된 투과성 및 보유 효과를 이용할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 복합체는 세포에 전달하기 위해 리포솜 또는 폴리머솜에 컨주게이팅되거나 이 안으로 캡슐화된다. 예를 들어, 리포솜 안트라사이클린은 고도로 효율적인 캡슐화를 달성하였으며, 리포솜 다우노루비신 및 페길화된 리포솜 독소루비신과 같은 크게 연장된 순환을 갖는 버젼을 포함한다. 문헌 [Krishna et al., Carboxymethylcellulose-sodium based transdermal drug delivery system for propranolol, J Pharm Pharmacol. 1996 Apr; 48(4):367-70] 참조.
리포솜 전달 시스템은 안정한 제형을 제공하며, 향상된 약물동력학 및 조직에 '수동적' 또는 '생리학적' 표적화 정도를 제공한다. 친수성 및 소수성 물질 예컨대, 잠재적 화학요법제의 캡슐화는 공지되어 있다. 예를 들어, 합성 지질을 포함하는 비경구 투여가능한 리포솜 제형을 기재하는 미국 특허 번호 5,466,468 (Schneider); 인지질에 컨쥬게이팅된 뉴클레오시드 유사체를 기재하는 미국 특허 번호 5,580,571 (Hostetler et al.); 약제학적 활성 화합물이 적어도 하나의 양친매성 및 극성 지질 성분 및 적어도 하나의 비극성 지질 성분을 포함하는 규정된 지질 시스템에 함유된 헤파린 또는 이의 단편인 약제 조성물을 기재하는 미국 특허 번호 5,626,869 (Nyqvist) 참조.
리포솜 및 폴리머로솜은 복수의 용액 및 화합물을 함유할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 복합체는 폴리머솜에 커플링되거나 캡슐화된다. 인공 소포의 한 부류로서, 폴리머솜은 양극성 합성 블록 코폴리머를 사용하여 제조되어 소포 막을 형성하는, 용액을 둘러싸는 작은 속이 빈 구체이다. 일반적인 폴리머솜은 이들의 코어에 수용액을 함유하고, 약물, 효소, 다른 단백질 및 펩티드, 및 DNA 및 RNA 단편과 같은 민감한 분자를 캡슐화하고 보호하는데 유용하다. 폴리머솜 막은 생물학적 시스템에서 발견되는 것과 같이 외부 물질로부터 캡슐화된 물질을 분리하는 물리적 장벽을 제공한다. 폴리머로솜은 공지된 기술에 의해 이중 에멀젼으로부터 생성될 수 있다 (문헌 [Lorenceau et al., 2005, Generation of Polymerosomes from Double-Emulsions, Langmuir 21(20):9183-6] 참조).
본 발명의 일부 구체예는 유전자 건 또는 바이올리스틱 입자 전달 시스템을 제공한다. 유전자 건은 유전자 정보를 갖는 세포를 주입하는 장치로, 페이로드(payload)는 플라스미드 DNA로 코팅된 중금속의 원소 입자일 수 있다. 이러한 기법은 또한, 바이오발리스틱 또는 바이오리스틱으로서 언급될 수 있다. 유전자 총은 또한 DNA 백신을 전달하는데 사용되었다. 유전자 총은 DNA 플라스미드, 형광 단백질, 염료 등과 같은 매우 다양한 유기 및 비-유기 종으로 세포를 형질감염시킬 수 있다.
본 발명의 양태는 전달 벡터의 수많은 용도를 제공한다. 전달 벡터의 선택은 표적화된 세포 또는 조직 및 CRISPR/Cas9/gRNA의 특이적 구성을 기반으로 한다. 예를 들어, 상기 논의된 EBV 예에서, 림프구는 리포펙션에 내성인 것으로 공지되어 있기 때문에, 뉴클레오펙션 (기질을 세포 핵 및 세포질 내로 직접적으로 전달하기 위한, 뉴클레오펙터로 불리는 장치에 의해 생성된 전기 파라미터와 세포-유형 특이적 시약의 조합)이 라지 세포로의 DNA 전달을 위해 필요하였다. Lonza pmax 프로모터는 라지 세포 내에서 강력한 발현을 제공하므로 Cas9 발현을 추진한다. 뉴클레오펙션 24시간 후, 명백한 EGFP 신호가 형광 현미경을 통해 작은 비율의 세포로부터 관찰되었다. EGFP-양성 세포 군집은 극적으로 감소하지만, 뉴클레오펙션 48시간 후 <10%의 형질감염 효율이 측정되었다 (도 1b). 복제 서열의 EBV 오리진을 포함하는 CRISPR 플라스미드인 oriP는 >60%의 형질감염 효율을 나타냈다 (도 1b).
본 발명의 양태는 표적화된 전달을 위해 CRISPR/Cas9/gRNA 복합체를 이용한다. 흔히 알려진 경로로는 경피, 점막경유, 비, 안구 및 폐 경로를 포함한다. 약물 전달 시스템은 리포솜, 프로리포솜, 마이크로스피어, 겔, 프로드러그, 사이클로덱스트린 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 양태는 폐에서 특이적 부위 또는 세포 군집의 표적화를 위해 에어로졸 내로 이송될 생분해성 폴리머로 구성된 나노입자를 이용하며, 이는 허용가능한 기간 내에서 소정의 방식 및 분해로 약물 방출을 제공한다. 제어된-방출 기법 (CRT) 예컨대, 피부를 통해 약물을 전달하기 위한 경피 및 점막경유 제어된-방출 전달 시스템, 비 및 구강 에어로졸 스프레이, 약물-함침된 로젠지, 캡슐화된 셀, 경구 연질 겔, 이온도입 장치 (inotophoretic device), 다양한 프로그램가능한 이식된 약물-전달 장치가 표적화 되고 제어된 전달을 달성하는 본 발명의 복합체와 함께 이용된다.
v. 핵산 분해
세포 내부로 도입되면, CRISPR/Cas9/gRNA 복합체는 핵산을 표적으로 한다. 본 발명의 양태에서, 복합체는 바이러스 게놈에 대해 표적화된다. 잠복 감염 이외에, 본 발명은 또한 바이러스 게놈이 패키징되기 전에 또는 방출 후에 바이러스 게놈을 표적화함으로써 활동적으로 복제 바이러스를 제어하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 잠복 바이러스 게놈을 표적으로 하는 뉴클레아제 예컨대, Cas9를 사용하며, 이에 의해 증식 기회를 감소시킨다. 뉴클레아제는 gRNA (예를 들어, crRNA + tracrRNA 또는 sgRNA)와의 복합체를 형성할 수 있다. 복합체는 표적화된 방식으로 바이러스 핵산을 절단하여 바이러스 게놈을 무력화시킨다. 상기 논의된 바와 같이, Cas9 엔도뉴클레아제는 바이러스 게놈에서 이중 가닥 파괴를 초래한다. 바이러스 게놈에 따라 표적화된 수개의 위치에 의해 그리고, 단일 가닥 파괴를 초래하지 않으나 이중 가닥 파괴를 초래함으로써, 게놈은 게놈을 따라 여러 위치에서 효과적으로 절단된다. 바람직한 구체예에서, 작은 결실이 초래되거나 작은 단편이 게놈으로부터 제거되어, 천연 복구 메카니즘이 게놈을 함께 연결시킨다 하더라도, 게놈은 무력화된 상태가 되도록 이중 가닥 파괴를 설계된다.
세포 내로의 도입 후, CRISPR/Cas9/gRNA 복합체는 바이러스 게놈, 유전자, 전사체, 또는 기타 바이러스 핵산에 작용한다. CRISPR에 의해 생성된 이중-가닥 DNA 파괴는 작은 결실로 복구된다. 이들 결실은 단백질 코딩을 방해하고 따라서 넉아욱 효과를 발생시킨다.
뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 엔코딩하는 유전자는 형질감염에 의해 감염된 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, 감염된 세포는 (단일 조각 또는 별도의 조각 상의) Cas9 및 gRNA를 엔코딩하는 DNA로 형질감염될 수 있다. gRNA는 바이러스 게놈을 따라 하나 또는 수개의 위치에 Cas9 엔도뉴클레아제를 국한시키도록 설계된다. Cas9 엔도뉴클레아제는 게놈에서 이중 가닥 파괴를 초래하여, 바이러스 게놈으로부터 작은 단편이 결실되게 한다. 복구 메카니즘을 이용한다 하더라도, 결실은 바이러스 게놈을 무력화된 상태가 되게 한다.
더 높은 세포 친화도 (예를 들어, RGD knob) 및 특이성을 갖는 조작된 바이러스 입자는 전달 효율을 크게 개선시킬 수 있다. 선형 DNA 대신에 환형 DNA의 전달이 또한 유익한데, 환형 DNA가 복제 기점을 갖는 에피솜으로서 복제할 수 있기 때문이다.
본 발명의 양태는 표적화된 전달을 위해 CRISPR/Cas9/gRNA 복합체를 이용한다. 흔히 알려진 경로로는 경피, 점막경유, 비, 안구 및 폐 경로를 포함한다. 약물 전달 시스템은 리포솜, 프로리포솜, 미셀, 마이크로스피어, 겔, 프로드러그, 사이클로덱스트린 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 양태는 폐에서 특이적 부위 또는 세포 군집의 표적화를 위해 에어로졸 내로 이송될 생분해성 폴리머로 구성된 나노입자를 이용하며, 허용가능한 기간 내에서 소정의 방식 및 분해로 약물 방출을 제공한다. 제어된-방출 기법 (CRT) 예컨대, 피부를 통해 약물을 투여하기 위한 경피 및 점막경유 제어된-방출 전달 시스템, 비 및 구강 에어로졸 스프레이, 약물-함침된 로젠지, 캡슐화된 셀, 경구 연질 겔, 이온도입 장치, 및 다양한 프로그램가능한 이식된 약물-전달 장치가 표적화되고 제어된 전단을 달성하는 본 발명의 복합체와 함께 이용된다. 참조 통합
다른 문헌 예컨대, 특허, 특허 출원, 특허 공개, 저널, 도서, 논문, 웹 내용에 대한 참조 및 인용은 그 기재내용 전반에 걸쳐 이루어졌다. 모든 이러한 문헌은 모든 목적에 있어서 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
등가물
본원에 도시되고 기술된 것들 이외에, 본 발명의 다양한 변형 및 이의 많은 추가의 구체예는, 본원에 언급된 과학 및 특허 문헌에 대한 참조를 포함하여, 본 문헌의 전체 내용으로부터 당업자에게 자명해질 것이다. 본 명세서의 내용은 이의 다양한 구체예 및 이의 균등물에서 본 발명의 실시에 적용될 수 있는 중요한 정보, 예시 및 지침을 함유한다.
실시예
실시예 1: 표적화 EBV
버킷 림프종 세포주인 라지, 나말와(Namalwa) 및 DG-75는 ATCC로부터 얻고, ATCC 권고에 따라 10% FBS 및 PSA가 보충된 RPMI 1640에서 배양하였다. 인간 일차 폐 섬유아세포 IMR-90을 Coriell로부터 수득하고 10% FBS 및 PSA가 보충된 고급 DMEM/F-12에서 배양하였다.
문헌 [Cong L et al. (2013) Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems Science 339:819-823]에 기술된 바와 같이, U6 프로모터 추진된 키메라 가이드 RNA (sgRNA) 및 유비쿼터스 프로모터 추진된 Cas9로 구성된 플라스미드를 부가유전자로부터 수득하였다. Cas9 단백질 후 융합된 EGFP 마커는 Cas9-양성 세포의 선택을 허용하였다 (도 1a). 본 발명자들은 더욱 효율적인 Pol-III 전사 및 보다 안정한 줄기-루프 구조를 위한 변형된 키메라 가이드 RNA 디자인을 채택하였다 (Chen B et al. (2013) Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System. Cell 155:1479-1491).
본 발명자들은 Addgene, Inc.로부터 pX458을 수득하였다. 합성 인트론 (pmax)을 갖는 변형된 CMV 프로모터를 Lonza 제어 플라스미드 pmax-GFP로부터 PCR 증폭시켰다. 개질된 가이드 RNA sgRNA(F+E)를 IDT로부터 주문하였다. EBV 복제 기점인 oriP를 B95-8 형질전환된 림프아구 세포주 GM12891로부터 PCR 증폭시켰다. 본 발명자들은 원래의 CAG 프로모터, sgRNA 및 f1 오리진을 대체하기 위해 pmax, sgRNA (F + E) 및 oriP를 pX458로 클로닝시키는 표준 클로닝 프로토콜을 사용하였다. 본 발명자들은 B95-8 기준을 기반으로 하는 EBV sgRNA를 설계하였으며, IDT로부터 DNA 올리고를 주문하였다. pX458에서 원래의 sgRNA 플레이스 홀더는 음성 대조군으로 사용된다.
림프구는 리포펙션에 내성인 것으로 공지되어 있으며, 따라서 본 발명자들은 라지 세포로의 DNA 전달을 위한 뉴클레오펙션을 사용하였다. 본 발명자들은 라지 세포 내에서 강력한 발현을 제공하기 때문에 Lonza pmax 프로모터를 선택하여 Cas9 발현을 추진하였다. 본 발명자들은 DNA 전달을 위해 Lonza 뉴클레오펙터 II를 사용하였다. 5백만 라지 또는 DG-75 세포를 각 100ul 반응에서 5ug 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포주 키트 V 및 프로그램 M-013은 Lonza 권고에 따라 사용하였다. IMR-90의 경우, T-030 또는 X-005 프로그램을 사용하여 100ul 용액 중의 5ug 플라스미드로 1백만 세포를 형질감염시켰다. 뉴클레오펙션 24시간 후, 본 발명자들은 형광 현미경을 통해 작은 비율의 세포의 명백한 EGFP 신호를 관찰하였다. 그러나, 그 후 EGFP-양성 세포 군집은 극적으로 감소하였으며, 본 발명자들은 뉴클레오펙션 48시간 후 <10%의 형질감염 효율을 측정하였다 (도 1b). 본 발명자들은 이러한 형질감염 효율 감소가 세포 분열로의 플라스미드 희석에 기인한다고 생각했다. 숙주 세포 내에서 플라스미드 수준을 활성적으로 유지하기 위해, 본 발명자들은 복제 서열의 EBV 오리진인 oriP를 포함하도록 CRISPR 플라스미드를 재설계하였다. 세포 내부의 활성 플라스미드 복제로, 형질감염 효율은 >60%로 증가하였다 (도 1b).
EBV 게놈을 표적으로 하는 가이드 RNA를 설계하기 위해, 본 발명자들은 B95-8 균주로부터의 EBV 기준 게놈에 의존하였다. 본 발명자들은 상이한 게놈 편집 목적을 위해 7개의 가이드 RNA 설계를 갖는 6개의 영역을 표적화시켰다 (도 1c 및 표 S1). EBNA1은 유전자 조절 및 잠복 게놈 복제를 포함한 많은 EBV 기능에 중요하다. 본 발명자들은 게놈의 이러한 전체 영역을 절제하기 위해 EBNA1 코딩 영역의 양 말단에 대한 가이드 RNA sgEBV4 및 sgEBV5를 표적화시켰다. 가이드 RNA sgEBV1, 2 및 6은 반복 영역에 속하므로 적어도 하나의 CRISPR 절단의 성공률이 배가된다. 이러한 "구조적" 표적은 EBV 게놈의 더 작은 조각으로의 체계적인 분해를 가능하게 한다. EBNA3C 및 LMP1은 숙주 세포 형질전환에 필수적이며, 본 발명자들은 각각 이들 두 단백질의 5' 엑손을 각각 표적으로 하도록 가이드 RNA인 sgEBV3 및 sgEBV7을 설계하였다.
EBV 게놈 편집. CRISPR에 의해 생성된 이중-가닥 DNA 파괴는 작은 결실로 복구된다. 이러한 결실은 단백질 코딩을 방해하여 녹아웃 효과를 만든다. SURVEYOR 검정을 통해 개별 부위의 효율적 편집을 확인하였다 (도 5). 각 가이드 RNA에 의해 유도된 독립적인 작은 결실 이외에도, 표적화 부위 사이의 큰 결실은 EBV 게놈을 체계적으로 파괴할 수 있다. 가이드 RNA sgEBV2는 12개의 125-bp 반복 단위를 갖는 영역을 표적으로 한다 (도 2a). 전체 반복 영역의 PCR 증폭은 ~ 1.8-kb 밴드를 제공하였다 (도 2b). sgEBV2 형질감염 5 일 또는 7 일 후, 본 발명자들은 동일한 PCR 증폭으로부터 ~ 0.4-kb 밴드를 얻었다 (도 2b). ~ 1.4-kb 결실은 첫 번째 반복 단위에서의 절단과 마지막 반복 단위에서의 절단 사이의 복구 결찰의 예측된 생성물이다 (도 2a).
sgRNA 표적에 측면 인접한 DNA 서열을 Phusion DNA 중합효소로 PCR 증폭시켰다. SURVEYOR 검정은 제조업자의 지시에 따라 수행되었다. 큰 결실을 갖는 DNA 앰플리콘을 TOPO 클로닝시키고 단일 콜로니를 생거(Sanger) 시퀀싱에 사용하였다. EBV 로드는 Fluidigm BioMark에서 Taqman 디지털 PCR로 측정하였다. 보존된 인간 유전자좌를 표적으로 하는 Taqman 검정을 인간 DNA 표준화에 사용하였다. Fluidigm C1으로부터의 단일-세포 전체-게놈 증폭 산물 1ng을 EBV 정량적 PCR에 사용하였다.
본 발명자들은 독특한 표적 사이의 영역을 제거하는 것이 가능하다는 것을 추가로 증명하였다 (도 2c). sgEBV4-5 형질감염 6일 후, 전체 측면인접 영역 (프라이머 EBV4F 및 5R을 지님)의 PCR 증폭은 예상된 2kb의 훨씬 약한 밴드와 함께 보다 짧은 앰플리콘을 유도하였다 (도 2d). 앰플리콘 클론의 생거 시퀀싱은 2개의 예상 절삭 부위의 직접 연결을 확인시켰다 (도 2f). sgEBV3-5를 사용한 유사한 실험에서도 EBNA3C에서 EBNA1로의 심지어 더 큰 결실이 유도되었다 (도 2d-e).
EBV 게놈 파괴로의 세포 증식 저지. CRISPR 형질감염 2일 후, 본 발명자들은 추가 배양을 위해 EGFP-양성 세포를 유통 분류하고 매일 생세포를 계수하였다. 예상한 바와 같이, oriP 또는 sgEBV가 없는 Cas9 플라스미드로 처리된 세포는 며칠 내에 EGFP 발현을 잃었으며, 처리되지 않은 대조군과 유사한 속도로 증식되었다 (도 3a). Cas9-oriP 및 스크램블링된 가이드 RNA를 갖는 플라스미드는 8일 후에 EGFP 발현을 유지하였으며, 세포 증식 속도는 감소되지 않았다. 혼합된 칵테일 sgEBV1-7로 처리하면 측정 가능한 세포 증식이 일어나지 않았고, 총 세포 수는 일정하게 유지되거나 감소되었다 (도 3a). 유동 세포측정 산란 신호는 sgEBV1-7 처리 후 세포 형태의 변화를 명확하게 드러났고, 대부분의 세포가 과립화가 증가함에 따라 크기가 줄어들었기 때문이다 (도 3b-d, 군집 P4에서 P3으로 이동). 군집 P3에서 세포는 또한, DAPI 염색에 의한 손상된 막 투과성을 입증하였다 (도 3e-g). 특히 다중 가이드 RNA에 의한 CRISPR 세포독성의 가능성을 배제하기 위해, 본 발명자들은 EBV 음성 버킷 림프종 세포주 DG-75 (도 6) 및 일차 인간 폐 섬유아세포 IMR90 (도 7)의 2개의 다른 샘플로의 동일한 처리를 수행하였다. 형질감염 후 8일 및 9일에 세포 증식률은 처리되지 않은 대조군으로부터 변화하지 않았으며, 이는 무시할만한 세포독성을 시사한다.
이전의 연구들은 EBV 종양형성 능력이 숙주 세포 아폽토시스의 방해로 인한 것으로 여겼다 (Ruf IK et al. (1999) Epstein-Barr Virus Regulates c-MYC, Apoptosis, and Tumorigenicity in Burkitt Lymphoma. Molecular and Cellular Biology 19:1651-1660). 따라서, EBV 활동을 억제하는 것은 아폽토시스 과정을 회복시키며, 이는 본 발명자들의 실험에서 관찰된 세포 치사를 설명할 수 있다. Annexin V 염색은 온전한 세포막 그러나 노출된 포스파티딜세린을 갖는 세포의 별개의 하위군집을 나타냈으며, 이는 아폽토시스를 통한 세포 치사를 시사한다 (도 3e-g). 명 시야(bright field) 현미경 검사는 명백한 아폽토틱 세포 형태 (도 3h-i)를 나타냈으며 형광 염색은 과감한 DNA 단편화를 입증하였다 (도 3j-m). 그러나, 이러한 증거는 EBV 게놈 파괴 후 정상적인 숙주 세포의 아폽토시스 경로가 회복되었음을 시사한다.
하위군집에서 EBV의 완전한 제거. 세포 증식 제지와 EBV 게놈 편집 간의 잠재적 연관성을 연구하기 위해, 본 발명자들은 디지털 PCR 표적화 EBNA1을 사용하여 여러 샘플에서 EBV 로드를 정량화하였다. 보존된 인간 체세포 유전자좌를 표적으로 하는 또 다른 Taqman 검정은 인간 DNA 표준화를 위한 내부 대조군의 역할을 하였다. 평균적으로, 각 처리되지 않은 라지 세포는 EBV 게놈의 42개 복사체를 갖는다 (도 4a). oriP 또는 sgEBV가 결여된 Cas9 플라스미드로 처리된 세포는 처리되지 않은 대조군으로부터의 EBV 로드 차이에 있어서 명백한 차이를 갖지 않았다. oriP는 가지나 sgEBV는 갖지 않는 Cas9-플라스미드로 처리된 세포는 EBV 부하가 ~50% 감소하였다. 이 실험으로부터의 세포가 증식 속도에 있어서 어떠한 차이도 나타내지 않는다는 이전의 관찰과 관련하여, 본 발명자들은 아마도 플라스미드 복제 동안 EBNA1 결합에 대한 경쟁으로 인한 것으로 이를 해석한다. 형질 감염에 대한 가이드 RNA 칵테일 sgEBV1-7의 첨가는 EBV 로드를 현저히 감소시켰다. 생세포와 사세포 둘 모두는 처리되지 않은 대조군에 비해 >60% EBV 감소하였다.
본 발명들이 동일한 몰 비의 7개의 가이드 RNA를 제공하였으나, 플라스미드 형질감염 및 복제 과정은 매우 확률적인 것 같다. 일부 세포는 치료 효율에 영향을 줄 수 있는 가이드 RNA 칵테일의 상이한 서브셋 또는 혼합물을 필연적으로 수용할 것이다. 이러한 효과를 제어하기 위해, 본 발명자들은 자동화된 마이크로유체 시스템을 사용한 단일-세포 전체-게놈 증폭을 사용함으로써 단일 세포 수준으로 EBV 로드를 측정하였다. 본 발명자들은 새로 배양된 라지 세포를 마이크로유체 칩에 로딩하고 81개의 단일 세포를 포획하였다 (도 4b). sgEBV1-7 처리된 세포에 있어서, 본 발명자들은 형질감염 8일 후에 생 세포를 유동 분류하고 91개의 단일 세포를 포획하였다 (도 4c). 제조업자의 지시에 따라, 본 발명자들은 각 단일 세포 반응 챔버로부터 ~150 ng의 증폭된 DNA를 수득하였다. 품질 관리 목적으로 본 발명자들은 각 단일 세포 증폭 산물에 대해 4-유전자좌 인간 체세포 DNA 정량적 PCR을 수행하고 (Wang J, Fan HC, Behr B, Quake SR (2012) Genome-wide single-cell analysis of recombination activity and de novo mutation rates in human sperm. Cell 150: 402-412), 적어도 하나의 유전자좌로부터 양성 증폭을 필요로 하였다. 69개의 처리되지 않은 단일-세포 생성물이 품질 관리를 통과하였으며, 거의 모든 세포가 상당량의 EBV 게놈 DNA를 나타내는 EBV 로드의 로그-정규 분포 (도 4d)를 나타내었다. 본 발명자들은 단일의 통합된 EBV 게놈을 함유하는 나말와 버킷 림프종 세포의 서브클론으로 정량적 PCR 검정을 수정하였다. 단일-복사 EBV 측정값은 29.8의 Ct를 제공하며, 이는 본 발명자들이 대량의 디지털 PCR 측정값과 일치하는, 69개의 라지 단일 세포 샘플의 평균 Ct가 세포 당 42 EBV 복사체에 상응한다는 것을 측정가능하게 하였다. sgEBV1-7 처리된 샘플에 있어서, 71개의 단일-세포 생성물이 품질 관리를 통과하였으며 EBV 로드 분포가 극적으로 더 넓었다 (도 4e). 22개의 세포가 처리되지 않은 세포와 동일한 EBV 로드를 갖는 반면, 19개의 세포는 검출 가능한 EBV를 갖지 않았고, 나머지 30개의 세포는 처리되지 않은 샘플로부터 현격한 EBV 로드 감소를 나타내었다.
EBV 처리를 위한 필수 표적. 본 발명자들의 CRISPR 칵테일에 있는 7개의 가이드 RNA는 EBV 게놈 구조, 숙주 세포 형질전환 및 감염 잠복기 각각에 중요한 3개의 상이한 카테고리의 서열을 표적으로 한다. 효과적인 EBV 치료에 가장 중요한 표적을 이해하기 위해, 본 발명자들은 라지 세포를 가이드 RNA의 서브세트로 형질감염시켰다. sgEBV4/5가 EBV 게놈을 85%만큼 감소시켰으나, 이들은 전체 칵테일만큼 효과적으로 세포 증식을 억제할 수 없었다 (도 3a). 구조 서열 (sgEBV1/2/6)을 표적화시키는 가이드 RNA는 전체 EBV 로드를 제거할 수 없음에도 불구하고 (26% 감소) 세포 증식을 완전히 중단시킬 수 있다. 높은 게놈 편집 효율 및 증식 저지를 고려할 때 (도 2), 본 발명자들은 sgEBV1/2/6에서 잔여 EBV 게놈 징후는 온전한 게놈으로 인한 것이 아니라 EBV 게놈 이외에서 분해된 자유-부유 DNA 즉, 거짓 파지티브로 인한 것으로 의심하였다. 본 발명자들은 EBV 게놈 구조의 전체적 파괴가 EBV 치료에 특이적인 주요 단백질을 표적으로 하는 것보다 더욱 효과적임을 드러낸 것으로 결론 내렸다.
추가적인 정보 예컨대, 프라이머 설계가 문헌 [Wang and Quake, 2014, RNA-guided endonuclease provides a therapeutic strategy to cure latent herpesviridae infection, PNAS 111(36):13157-13162] 및 PNAS 웹사이트에서 온라인으로 공개된 그러한 기사에 대한 Supporting Information에 기재되어 있으며, 이들 문헌 둘 모두의 내용은 모든 목적상 참조로서 통합된다.
실시예 2: B형 간염 바이러스 ( HBV ) 표적화
본 발명의 방법 및 재료는 특이적 유전자 물질 예컨대, B형 간염 바이러스 (HBV)와 같은 잠복 바이러스 게놈에 대하여 표적화된 엔도뉴클레아제를 적용하는데 이용될 수 있다. 본 발명은 표적 세포 (예를 들어, 간세포) 내로 핵산 (예컨대, DNA 플라스미드)의 효과적이고 안전한 전달을 추가로 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명의 방법은 표적 HBV로의 유체역학적 유전자 전달을 이용한다.
도 10은 HBV 게놈을 도해한다. HBV 게놈에 대한 문자열 (즉, 게놈의 중요한 특징부를 확인하는 문자열)을 수용하고, 이들 특징부 중 하나 안에 위치한, 효소 분해에 의해 표적화하기 위한 후보 예컨대, 바이러스 복제 기점, 말단 반복부, 복제 인자 결합 부위, 프로모터, 코딩 서열 및 반복 영역을 선택하는 것이 바람직할 수 있다.
헤파드나비리대 과의 프로토타입 구성원인 HBV는 표면 항원 (HBsAg)을 함유하는 외부 지질단백질 코트 (또한, 엔벨로프로 불림)에 의해 둘러싸인 27nm 뉴클레오캡시드 코어 (HBcAg)로 이루어진, 42nm의 부분적으로 이중 가닥인 DNA 바이러스이다. 바이러스는 3 내지 3.3 kb의 이완된 환형의 부분적으로 이중인 DNA, 및 비리온 DNA 주형에서 갭을 복구할 수 있으며 역전사효소 활성을 갖는 비리온-관련된 DNA-의존성 중합효소를 함유하는 엔벨로핑된 비리온을 포함한다. HBV는 중합효소 (P), 코어 (C), 표면 (S) 및 X 단백질을 엔코딩하는 4개의 중복 ORF를 갖는 대략 3200bp의 환형이며 부분적으로 이중-가닥인 DNA 바이러스이다. 감염시, 바이러스 뉴클레오캡시드는 세포로 유입되어 핵에 도달하며, 여기에서 바이러스 게놈이 전달된다. 핵에서, 제 2-가닥 DNA 합성이 완료되며 두 가닥 모두에서의 갭이 복구되어 공유적으로 밀폐된 환형의 DNA 분자를 생성하고, 이는 3.5, 2.4, 2.1 및 0.7kb 길이인 4개의 바이러스 RNA의 전사에 대해 주형 역할을 한다. 이들 전사체는 폴리아데닐화되어 세포질로 운반되며, 여기에서 이들은 바이러스 뉴클레오캡시드 및 프리코어 항원 (C, 프리-C), 중합효소 (P), 엔벨로프 L (대), M (중), S (소)), 및 전사성 트랜스액티베이팅 단백질 (X)로 번역된다. 엔벨로프 단백질은 그들 자체를 세포질 그물 (ER)의 지질 막에 내재 막 단백질로서 삽입시킨다. 전체 게놈에 걸쳐 있으며 프리게노믹 RNA (pgRNA)라고 불리는 3.5kb 종은 HBV 중합효소 및 단백질 키나제와 함께 코어 입자 내에 패키징되며, 여기에서 이는 네거티브-가닥 DNA의 역전사를 위한 주형의 역할을 한다. RNA에서 DNA로의 전환은 입자 내부에서 일어난다.
HBV 게놈상의 염기쌍의 번호는 제한 효소 EcoR1에 대한 절단 부위, 또는 EcoR1 부위가 존재하지 않는 경우 상동 부위를 기초로 한다. 그러나, 코어 단백질의 개시 코돈 또는 RNA 프리게놈의 첫 번째 염기를 기준으로 하는 다른 넘버링 방법이 또한 이용된다. HBV 게놈의 모든 염기 쌍은 HBV 단백질 중 적어도 하나를 엔코딩하는 것에 관여한다. 그러나, 게놈은 전사 수준을 조절하고, 폴리아데닐화 부위를 결정하고, 심지어 뉴클레오캡시드 내로의 캡슐화를 위한 특이적 전사체를 표시하는 유전자 요소를 또한 함유한다. 4개의 ORF는 다양한 인-프레임 개시 코돈의 사용을 통해 7개의 상이한 HBV 단백질의 전사 및 번역을 유도한다. 예를 들어, 작은 B형 간염 표면 단백질은 adw 게놈의 155번 위치의 ATG에서 리보솜이 번역을 시작하는 경우 생성된다. 중간의 B형 간염 표면 단백질은 리보솜이 3211번 위치의 업스트림 ATG에서 시작되는 경우, 생성되며, 이는 단백질의 5' 말단에 55개의 아미노산 추가를 발생시킨다.
ORF P는 게놈의 대부분을 차지하고 B형 간염 중합효소 단백질을 엔코딩한다. ORF S는 3개의 표면 단백질을 엔코딩한다. ORF C는 e형 간염과 코어 단백질 둘 모두를 엔코딩한다. ORF X는 B형 간염 X 단백질을 엔코딩한다. HBV 게놈은 바이러스 복제가 발생하는데 필요한 많은 중요한 프로모터 및 신호 영역을 함유한다. 4개의 ORF 전사는 4개의 프로모터 요소 (preS1, preS2, 코어 및 X) 및 2개의 인핸서 요소 (Enh I 및 Enh II)에 의해 제어된다. 모든 HBV 전사체는 게놈에서 1916-1921에 걸친 영역에 위치한 공통의 아데닐화 신호를 공유한다. 생성된 전사체는 3.5 뉴클레오티드 내지 0.9 뉴클레오티드 길이 범위이다. 코어/프리게놈 프로모터의 위치로 인해, 폴리아데닐화 부위는 차별적으로 이용된다. 폴리아데닐화 부위는 정형 진핵생물 폴리아데닐화 신호 서열 (AATAAA)과 대조적으로 헥사뉴클레오티드 서열 (TATAAA)이다. TATAAA는 비효율적으로 작동하는 것으로 공지되어 있으며 (9), HBV에 의한 차별화된 사용에 적합하다.
C, X, P, 및 S라고 불리는, 게놈에 의해 엔코딩된 4개의 알려진 유전자가 있다. 코어 단백질은 유전자 C (HBcAg)에 대해 코딩되며, 이의 개시 코돈 앞에 예비-코어 단백질이 생성되는 업스트림 인-프레임 AUG 개시 코돈이 선행된다. HBeAg은 예비-코어 단백질의 단백질분해 과정에 의해 생성된다. DNA 중합효소는 유전자 P에 의해 엔코딩된다. 유전자 S는 표면 항원 (HBsAg)을 코딩하는 유전자이다. HBsAg 유전자는 하나의 긴 오픈 리딩 프레임이지만 유전자를 pre-S1, pre-S2 및 S의 세 섹션으로 나누는 3개의 인-프레인 개시 (ATG) 코돈을 함유한다. 다중 개시 코돈 때문에, 대, 중, 소 (pre-S1 + pre-S2 + S, pre-S2 + S, 또는 S)로 불리는 3개의 상이한 크기의 폴리펩티드가 생성된다. 유전자 X에 의해 코딩된 단백질의 기능은 완전히 이해되지는 않았지만 이는 간암 발병과 관련이 있다. 이는 세포 성장을 촉진시키고 성장 조절 분자를 불활성화시키는 유전자를 자극한다.
도 10을 참조로 하여, HBV는 PreS1을 갖는 숙주 세포에 결합함으로써 이의 감염 사이클을 시작한다. PreS1에 대한 가이드 RNA는 코딩 서열의 5' 말단에 위치한다. 엔도뉴클레아제 분해는 삽입/결실을 도입할 것이며, 이는 PreS1 번역의 프레임 이동으로 이어진다. HBV는 양 말단 모두에 동일한 반복부 DR1 및 DR2, 및 5' 말단의 RNA 캡시드화 신호 엡실론을 갖는 긴 RNA 형태를 통해 이의 게놈을 복제한다. 중합효소 유전자의 역전사효소 도메인 (RT)은 RNA를 DNA로 전환시킨다. Hbx 단백질은 숙주 세포 기능뿐만 아니라 바이러스 복제의 중요한 조절 인자이다. RT에 대한 RNA에 의해 가이드된 분해는 삽입/결실을 도입할 것이며, 이는 RT 번역의 프레임 이동을 유도한다. 가이드 RNA sgHbx 및 sgCore는 Hbx 및 HBV 코어 단백질의 코딩에서 프레임 이동을 유도할 뿐만 아니라 DR2-DR1-엡실론을 함유하는 전체 영역을 결실시킨다. 조합된 4개의 sgRNA는 또한, HBV 게놈의 작은 조각으로의 전체적 파괴로 이어질 수 있다.
HBV는 RNA 중간체의 역전사에 의해 이의 게놈을 복제한다. RNA 주형은 먼저 단일-가닥 DNA 종 (마이너스-가닥 DNA)으로 전환되고, 이는 후속하여 플러스-가닥 DNA 합성을 위한 주형으로서 사용된다. HBV에서 DNA 합성은 플러스-가닥 DNA 합성을 위한 RNA 프라이머를 사용하며, 이는 단일-가닥 DNA 상의 내부 위치에서 대부분 개시된다. 프라이머는 RN아제 H 절단을 통해 생성되며, 이는 RNA 주형의 5' 말단으로부터 서열 독립적 측정이다. 이러한 18 nt RNA 프라이머는 12 nt 직접 반복부 DR1 내부에 위치한 프라이머의 3' 말단을 이용하여 마이너스-가닥 DNA의 3' 말단에 어닐링된다. 대부분의 플러스-가닥 DNA 합성은 프라이머 전위의 결과로서 마이너스-가닥 DNA의 또 다른 말단 근처에 위치한 12 nt 직접 반복부 DR2로부터 개시된다. 플러스-가닥 프라이밍 부위가 결과물을 갖는다. 원위 프라이밍은 이중 선형 (DL) DNA 게놈을 발생시키는 반면, DR2로부터의 프라이밍은 환형화로 불리는 제 2 주형 스위치의 완료 후 이완된 환형 (RC) DNA 게놈의 합성으로 이어질 수 있다. 헤파드나바이러스가 플러스-가닥 DNA 합성을 프라이밍 하기 위해 이러한 복잡성을 추가하는 이유는 분명하지 않지만, 프라이머 전좌의 메커니즘은 잠재적인 치료학적 표적이다. 헤파드나바이러스 (인간 병원체, B형 간염 바이러스 포함) 만성 담체 상태의 유지에 바이러스 복제가 필요하기 때문에, 복제를 이해하고 치료학적 표적을 밝히는 것은 담체에서 질환을 제한하는데 중요하다.
일부 구체예에서, 본 발명의 시스템 및 방법은 PreS1과 같은 특징부 내의 뉴클레오티드 스트링(string)을 발견함으로써 HBV 게놈을 표적으로 한다. PreS1에 대한 가이드 RNA는 코딩 서열의 5' 말단에 위치한다. 이와 같이, 이는 코딩 서열의 5'-대부분의 표적 중 하나를 나타내므로 표적화에 우수한 후보이다. 엔도뉴클레아제 분해는 삽입/결실을 도입할 것이며, 이는 PreS1 번역의 프레임 이동을 유도한다. HBV는 양 말단 모두에 동일한 반복부 DR1 및 DR2, 및 5' 말단의 RNA 캡시드화 시그널 엡실론을 갖는 긴 RNA 형태를 통해 이의 게놈을 복제한다. 중합효소 유전자의 역전사효소 도메인 (RT)은 RNA를 DNA로 전환시킨다. Hbx 단백질은 숙주 세포 기능뿐만 아니라 바이러스 복제의 중요한 조절 인자이다. RT에 대한 RNA에 의해 가이드된 분해는 삽입/결실을 도입할 것이며, 이는 RT 번역의 프레임 이동을 유도한다. 가이드 RNA sgHbx 및 sgCore는 Hbx 및 HBV 코어 단백질의 코딩에서 프레임 이동을 유도할뿐만 아니라 DR2-DR1-엡실론을 함유하는 전체 영역을 결실시킨다. 조합된 4개의 sgRNA는 또한, HBV 게놈의 작은 조각으로의 전체적인 파괴로 이어질 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 도 10에 도시된 HBV 게놈과 같은 게놈 내의 주요 특징부에 대해 하나 또는 수개의 가이드 RNA를 생성하는 것을 포함한다.
도 10은 CRISPR 가이드 RNA에 의해 표적화된 HBV 게놈의 주요 부분을 보여준다. 세포에서 CRISPR 활성을 달성하기 위해, cas9 및 가이드 RNA를 코딩하는 발현 플라스미드가 관심 세포 (예를 들어, HBV DNA를 운반하는 세포)에 전달된다. 시험관내 검정에서 입증하기 위해, 항-HBV 효과는 세포 증식, 성장 및 형태를 모니터링하고 세포에서 DNA 완전성 및 HBV DNA 로드를 분석함으로써 평가될 수 있다. 기술된 방법은 시험관내 검정을 사용하여 검증될 수 있다. 입증하기 위해, 시험관내 검정은 표적 영역의 측면 인접하는 cas9 단백질 및 DNA 앰플리콘으로 수행된다. 여기서, 표적이 증폭되고, 앰플리콘을 cas9 및 표적화를 위해 선택된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 gRNA와 함께 배양한다. 도 11에 도시된 바와 같이, DNA 전기 영동은 표적 부위에서 강한 분해를 보여준다.
도 11은 HBV에 대한 시험관내 CRISPR 검정으로부터 생성된 겔을 보여준다. 레인 1, 3 및 6: RT에 측면 인접한 HBV 게놈, Hbx-Core 및 PreS1의 PCR 앰플리콘. 레인 2, 4, 5 및 7: sgHBV-RT, sgHBV-Hbx, sgHBV-Core, sgHBV-PreS1로 처리된 PCR 앰플리콘. 특히 레인 5 및 7에서 가시적인 다중 단편의 존재는 sgHBV-Core 및 sgHBV-PreS1이 HBV의 맥락에서 특히 매력적인 표적을 제공하고 본 발명의 시스템 및 방법의 사용이 시험관내 유효성 검정에 의해 효과적인 것으로 입증될 수 있다.
실시예 3 : 수두-대상 포진 요법
싱글레스 (Shingles) - 때때로 대상포진, 조스터(zoster), 수두 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 타입 3 (HHV-3) 또는 조나로 알려짐 -는 환자에게 커다란 통증을 수반하는 물집 및 발진을 특징으로 하는 바이러스 질환이며, 이러한 통증은 4 내지 6주 만큼 길게 지속된다. 발진은 종종 옆구리에 특징적인 줄무늬로 나타난다. 어떤 사람은 대상포진후 신경통 (postherpetic neuralgia)이라고 불리는 병태가 수개월 또는 수년 지속될 수 있는 지속적인 신경통을 앓게 된다.
싱글레스 및 대상포진후 신경통은 인간 내에서 수두대상 포진 바이러스 (VZV)의 재활성화와 관련된다. VZV는 인간에게만 영향을 미치며 젊은 사람들에게는 수두의 원인이다. VZV는 신경을 감염시키고 다양한 증상을 유발한다. 1차 감염 (수두) 후, 바이러스는 뇌 신경 신경절, 후두 신경절 및 자율 신경절을 포함하여 신경계에서 휴면 상태가 된다. 환자가 수두에서 회복된 후 수년이 지나면, VZV는 재활성화되어 많은 신경적 병태를 초래할 수 있다.
뉴클레아제에 대한 유전자, 바이러스의 게놈에 대한 뉴클레아제를 표적으로 하는 서열, 및 특이적 유형의 세포 내에서 벡터로부터 전사를 촉진하는 프로모터를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물은 싱글레스 또는 대상포진후 신경통과 같은 병태를 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다. 수두 대상포진 바이러스와 같은 감염을 치료하기 위한 본 발명의 방법 및 조성물의 사용은 뉴런과 같은 특이적 세포 유형으로 뉴클레아제를 전달하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 뉴런 및 다른 세포 유형에 대한 벡터를 표적화시키는 것을 포함한다. 임의의 적합한 표적화 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 표적화는 참조로 통합된 문헌 [Glatzel et al., 2000, Adenoviral and adeno-associated viral transfer of genes to the peripheral nervous system PNAS 97(1):442-447]에 기술된 바와 같은 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (11) 또는 라우스 육종 바이러스 (RSV) 인핸서리프로모터 (pRcRSV, Invitrogen)를 사용하여 또는 미세수술을 포함할 수 있다. 프로모터에 있어서, 또한 참조로 통합된 문헌 [Liu et al., 2004, CMV enhancer/human PDGF-beta promoter for neuron specific transgene expression, Gene Ther 11(1):52-60] 참조. 뉴런 표적화에 대한 추가적인 논의에 있어서, 참조로 통합된 문헌 [Sapunar et al., 2012, Dorsal root ganglion―a potential new therapeutic target for neuropathic pain, J Pain Res 5:31-38] 참조. 뉴론 (및 바람직하게는, DRG)에 대해 특이적으로 표적화 가능한 활성 뉴클레아제를 전달하는 것은 싱글레스 또는 대상포진 후 신경통을 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있다. 신경 세포에서, 프로모터는 신경 세포 내에서 선택적으로 유전자의 발현을 일으킨다. 프로모터는 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 또는 혈소판-유래 성장 인자 (PGDF) 프로모터일 수 있다.
표적화 서열은 바이러스의 게놈에서 조절 요소를 표적으로 하도록 설계될 수 있으며, 바람직하게는, 인간 게놈에서 어떠한 정확한 일치도 결여된다. 표적화 서열은 gRNA를 코딩하는 벡터의 일부일 수 있다. 뉴클레아제는 cas9 엔도뉴클레아제일 수 있다. 일부 구체예에서, 서열은 벡터 내의 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부 (CRISPR) 영역 내에 있고, CRISPR 영역은 바이러스의 게놈 내의 복수의 표적과 일치하는 복수의 가이드 RNA를 엔코딩한다.

Claims (40)

  1. 바이러스 감염을 치료하기 위한 조성물로서, 치료제에 대한 유전자 및 바이러스에 의해 감염된 세포 내에서 치료제를 발현시키는 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 치료제가 바이러스-감염된 세포의 치사를 선택적으로 유발하는 메카니즘을 제공하는 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 치료제가 바이러스-감염된 세포의 치사를 선택적으로 유발하는 단백질을 포함하는 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 단백질이 세포에서 결함이 있는 아폽토틱 경로를 회복시키는 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 치료제가 표적화 가능한 뉴클레아제를 포함하며, 서열은 바이러스의 게놈으로부터 비롯되는 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 표적화 가능한 뉴클레아제가 Cas9 엔도뉴클레아제이며, 벡터는 복수의 가이드 RNA를 추가로 엔코딩하는 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 가이드 RNA 중 하나 이상이 바이러스에 의해 감염된 세포의 게놈을 표적으로 하도록 설계된 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 서열이 바이러스의 게놈으로부터의 조절 요소인 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 조절 요소가 프로모터 및 복제 기점으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  10. 제 1항에 있어서, 치료제가 바이러스-감염된 세포의 치사를 유발하는 단백질을 포함하는 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 유전자가 BAX, BAK, BCL-2 및 알파-헤모리신으로 구성된 군으로부터 선택된 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 서열이 바이러스의 게놈으로부터의 프로모터인 조성물.
  13. 제 10항에 있어서, 서열이 바이러스의 복제 기점을 포함하는 조성물.
  14. 제 1항에 있어서, 치료제가 바이러스에 의해 감염된 세포에서 아폽토시스를 유도하고, 감염되지 않은 세포에서는 아폽토시스를 유도하지 않는 조성물.
  15. 제 1항에 있어서, 프로모터가 바이러스에 의해 잠복 감염 상태에 있는 세포 내에서만 치료제를 발현시키는 조성물.
  16. 제 1항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터인 조성물.
  17. 제 14항에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스, 알파바이러스, 백시니아 바이러스 및 아데노-관련 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
  18. 제 1항에 있어서, 벡터가 플라스미드, 나노입자, 양이온성 지질, 양이온성 폴리머, 금속성 나노입자, 나노로드, 리포솜, 미셀, 마이크로버블, 세포-침투성 펩티드 또는 리포스피어로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함하는 조성물.
  19. 바이러스 감염을 치료하기 위한 조성물로서, 조성물이 항바이러스 치료제 및 바이러스에 감염된 세포 내에서 치료제를 활성화시키는 조절 요소를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물.
  20. 제 19항에 있어서, 항바이러스 치료제가 표적화 가능한 뉴클레아제에 대한 유전자를 포함하며, 조절 요소는 바이러스의 게놈으로부터 비롯되는 조성물.
  21. 제 20항에 있어서, 조절 요소가 프로모터 및 복제 기점으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  22. 제 20항에 있어서, 뉴클레아제가 Cas9 엔도뉴클레아제인 조성물.
  23. 제 20항에 있어서, 뉴클레아제가 아연-핑거 뉴클레아제, 전사 활성화 인자-유사 이펙터 뉴클레아제, 및 메가뉴클레아제로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
  24. 제 20항에 있어서, 벡터가 뉴클레아제를 바이러스의 게놈으로부터의 핵산에 대하여 표적화시키는 가이드 RNA를 추가로 엔코딩하는 조성물.
  25. 제 24항에 있어서, 가이드 RNA가 인간 게놈에서 완전하게 매칭되지 않도록 설계되는 조성물.
  26. 제 19항에 있어서, 항바이러스 치료제가 표적화 가능한 뉴클레아제에 대한 유전자를 포함하는 조성물.
  27. 제 26항에 있어서, 뉴클레아제가 Cas9 엔도뉴클레아제인 조성물.
  28. 제 27항에 있어서, 벡터가 뉴클레아제를 바이러스의 게놈으로부터의 핵산에 대하여 표적화시키는 하나 이상의 가이드 RNA를 추가로 엔코딩하는 조성물.
  29. 제 28항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA가 인간 게놈에서 완전하게 매칭되지 않도록 설계된 조성물.
  30. 제 29항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA가 바이러스의 게놈에서 조절 요소를 표적으로 하도록 설계된 조성물.
  31. 제 28항에 있어서, 바이러스가 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스, 타입 1, 헤르페스 심플렉스, 타입 2, 수두-대상포진 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, 인간 헤르페스바이러스, 타입 8, 인간 파필로마바이러스, BK 바이러스, JC 바이러스, 천연두, B형 간염 바이러스, 인간 보카바이러스, 파르보바이러스 B19, 인간 아스트로바이러스, 노르워크 바이러스, 콕사키바이러스, A형 간염 바이러스, 폴리오바이러스, 리노바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스, C형 간염 바이러스, 황열병 바이러스, 뎅기열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 풍진 바이러스, E형 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인플루엔자 바이러스, 구아나리토 바이러스, 주닌 바이러스, 라사 바이러스, 마추포 바이러스, 사비아 바이러스, 크리미아-콩고 출혈열 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르버그 바이러스, 홍역 바이러스, 멈프스 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스, 헨드라 바이러스, 니파 바이러스, 광견병 바이러스, D형 간염, 로타바이러스, 오르비바이러스, 콜티바이러스 및 반나 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 조성물.
  32. 바이러스 감염을 치료하기 위한 조성물로서, 뉴클레아제에 대한 유전자, 뉴클레아제를 바이러스 게놈에 대하여 표적화시키는 서열, 및 특이적 유형의 세포 내에서 벡터로부터 전사를 촉진하는 프로모터를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물.
  33. 제 32항에 있어서, 세포가 신경 세포이고, 프로모터는 신경 세포 내에서 선택적으로 유전자의 발현을 추가로 일으키는 조성물.
  34. 제 33항에 있어서, 프로모터가 사이토메갈로바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 또는 혈소판-유래 성장 인자 (PGDF) 프로모터를 포함하는 조성물.
  35. 제 33항에 있어서, 바이러스가 수두 대상포진 바이러스인 조성물.
  36. 제 35항에 있어서, 서열이 바이러스의 게놈에서 조절 요소를 표적으로 하도록 설계되며, 인간 게놈에서 어떠한 정확하게 매칭되는 것이 없는 조성물.
  37. 제 36항에 있어서, 뉴클레아제가 Cas9 엔도뉴클레아제인 조성물.
  38. 제 37항에 있어서, 서열이 벡터 내의 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat: CRISPR) 영역 내에 있고, CRISPR 영역은 바이러스의 게놈 내의 복수의 표적과 매칭되는 복수의 가이드 RNA를 엔코딩하는 조성물.
  39. 제 32항에 있어서, 프로모터가 말초 신경계 내에서 전사를 촉진하는 조성물.
  40. 제 39항에 있어서, 벡터가 아데노바이러스 벡터 또는 rAAV-기재 벡터를 포함하는 조성물.
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