JP7399876B2 - 病態治療のためのＲＮＡエディターのｍＲＮＡ駆動型発現 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月１６日出願の米国仮特許出願第６２／６５８，０４６号の恩典及び優先権を主張し、当該出願の全体は、許容される限りにおいて、参照により本明細書に援用される。

連邦政府の助成による研究に関する記載
本発明は、ＤＡＲＰＡの認可を受けたＷ９１１ＮＦ－１５－０６０９の下、政府支援によって行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

配列表の参照
２０１９年４月１５日に提出された配列表（２０１９年４月１５日作成、ファイル名「０６４４８９０４６ＰＣＴ＿ＳＴ２５」、サイズ３０，１２３バイトのテキストファイル）は、米国特許法施行規則（３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．）１．５２条（ｅ）（５）に従って、参照により本明細書に援用される。

発明の分野
本発明は概して、ウイルス（例えば、ＲＮＡウイルス）における標的配列を特異的に切断する組成物に関する。

発明の背景
ヒトに感染することが知られているウイルスは２１９種存在し（Ｗｏｏｌｈｏｕｓｅ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ，３６７：２８６４－２８７１（２０１２）（非特許文献1））、このうち２１４種がＲＮＡウイルスである（Ｗｏｏｌｈｏｕｓｅ，Ｍ．Ｅ．Ｊ． ａｎｄ Ｂｒｉｅｒｌｅｙ，Ｌ．，Ｓｃｉ Ｄａｔａ，５：１８００１７（２０１８）（非特許文献2））。ウイルス感染症は、世界全体における死亡数のおよそ６．６％を占めると推定されている（Ｌｏｚａｎｏ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３８０：２０９５－２１２８（２０１２）（非特許文献3））。ウイルス種を治療する薬物が（１９６３～２０１６年にかけて）約９０種しか存在せず、治療対象のウイルス種が９種に過ぎないことは、憂慮すべき問題である（Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ，Ｅ．ａｎｄ Ｌｉ，Ｇ．，Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ，２９：６９５－７４７（２０１６）（非特許文献4））。また、承認済みワクチンについても、対象となるのはわずか１５種のウイルス種である。再集合、抗原シフト、及びドリフトは、ワクチン開発の障害となり、様々な抗ウイルス薬に対する耐性をもたらす（Ｋｉｍｂｅｒｌｉｎ，Ｄ．Ｗ．ａｎｄ Ｗｈｉｔｌｅｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，３７：４０３－４２１（１９９６）（非特許文献5）；Ｉｒｗｉｎ，Ｋ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ Ｅｖｏｌ，２：ｖｅｗ０１４（２０１６）（非特許文献6））。これらの要因が、エピデミックやパンデミックの一因となる。このように、ヒトの健康は、新興及び再興のウイルス感染症によって絶えず脅威にさらされている（Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｈ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，６：２５３ｐｓ２１０（２０１４）（非特許文献7））。近年、ニパ（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｄｉｓｅａｓｅ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｎｅｗｓ：Ｎｉｐａｈ ｖｉｒｕｓ－Ｉｎｄｉａ（２０１８）（非特許文献8））、ジカ（Ｂａｕｄ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３９０：２０９９－２１０９（２０１７）（非特許文献9））、及びエボラ（Ｇｉｒｅ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４５：１３６９－１３７２（２０１４）（非特許文献10））が発生していること、ならびに今後インフルエンザのパンデミックが生じる可能性があること（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４５９：９３１－９３９（２００９）（非特許文献11））は、新たなクラスの抗ウイルス薬を開発する正当な根拠となる（Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ，Ｅ．ａｎｄ Ｌｉ，Ｇ．，Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ，２９：６９５－７４７（２０１６）（非特許文献12））。

現在の創薬は、小分子及び中和抗体に焦点が絞られているが、これらが機能的アウトカムを得るには高用量や頻回の再投薬が必要となる（Ｋａｍａｔｈ，Ａ．Ｖ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２１－２２：７５－８３（２０１６）（非特許文献13）；Ｂａｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ，５１：１１９－１３５（２０１２）（非特許文献14））。したがって、広スペクトルかつ柔軟で、複数のウイルス種または系統にわたって有効な抗ウイルス薬のニーズに応えることは極めて重要である。このような属性は、遺伝子ツールを用いた抗ウイルス剤の設計により達成することができる。遺伝子ツールには、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｗａｙｅｎｇｅｒａ，Ｍ．，Ｔｈｅｏｒ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ Ｍｏｄｅｌ，８：２３（２０１１）（非特許文献15））、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Ｋｈａｌｉｌｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ，２１：３１０－３２１（２０１５）（非特許文献16））、メガヌクレアーゼ（Ｇｒｏｓｓｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，１９：６９４－７０２（２０１１）（非特許文献17））、及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（Ｓｏｐｐｅ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ｌｅｂｂｉｎｋ，Ｒ．Ｊ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２５：８３３－８５０（２０１７）（非特許文献18））があり、これらはウイルス感染病原体に対して使用されている。これらの遺伝子エディターは、ＤＮＡウイルスを直接的に標的としたり、ウイルス宿主を間接的に標的としてウイルスにとって不可欠な宿主遺伝子を抑制または修飾したりするのに用いられている。また、これらのツールは、宿主ゲノム内で一体化している潜伏ウイルスを活性化または不活性化するためにも使用されている（Ｓｏｐｐｅ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ｌｅｂｂｉｎｋ，Ｒ．Ｊ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２５：８３３－８５０（２０１７）（非特許文献19））。これらの分子ツールはＤＮＡウイルスには適しているが、ＲＮＡウイルスに対して利用する場合は効果が小さい。

そのため、本発明の目的は、ウイルス複製を阻害するための組成物及びそれを使用する方法を提供することにある。

本発明のもう１つの目的は、宿主細胞または対象におけるウイルスを治療または不活性化するための組成物及びそれを使用する方法を提供することにある。

Ｗｏｏｌｈｏｕｓｅ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ，３６７：２８６４－２８７１（２０１２） Ｗｏｏｌｈｏｕｓｅ，Ｍ．Ｅ．Ｊ． ａｎｄ Ｂｒｉｅｒｌｅｙ，Ｌ．，Ｓｃｉ Ｄａｔａ，５：１８００１７（２０１８） Ｌｏｚａｎｏ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３８０：２０９５－２１２８（２０１２） Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ，Ｅ．ａｎｄ Ｌｉ，Ｇ．，Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ，２９：６９５－７４７（２０１６） Ｋｉｍｂｅｒｌｉｎ，Ｄ．Ｗ．ａｎｄ Ｗｈｉｔｌｅｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，３７：４０３－４２１（１９９６） Ｉｒｗｉｎ，Ｋ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ Ｅｖｏｌ，２：ｖｅｗ０１４（２０１６） Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｈ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，６：２５３ｐｓ２１０（２０１４） Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｄｉｓｅａｓｅ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｎｅｗｓ：Ｎｉｐａｈ ｖｉｒｕｓ－Ｉｎｄｉａ（２０１８） Ｂａｕｄ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３９０：２０９９－２１０９（２０１７） Ｇｉｒｅ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４５：１３６９－１３７２（２０１４） Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４５９：９３１－９３９（２００９） Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ，Ｅ．ａｎｄ Ｌｉ，Ｇ．，Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ，２９：６９５－７４７（２０１６） Ｋａｍａｔｈ，Ａ．Ｖ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２１－２２：７５－８３（２０１６） Ｂａｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ，５１：１１９－１３５（２０１２） Ｗａｙｅｎｇｅｒａ，Ｍ．，Ｔｈｅｏｒ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ Ｍｏｄｅｌ，８：２３（２０１１） Ｋｈａｌｉｌｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ，２１：３１０－３２１（２０１５） Ｇｒｏｓｓｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，１９：６９４－７０２（２０１１） Ｓｏｐｐｅ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ｌｅｂｂｉｎｋ，Ｒ．Ｊ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２５：８３３－８５０（２０１７） Ｓｏｐｐｅ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ｌｅｂｂｉｎｋ，Ｒ．Ｊ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２５：８３３－８５０（２０１７）

本明細書では、宿主細胞または対象からのウイルスを治療及び不活性化するための組成物及び方法が提供される。当該組成物及び方法は、宿主生物から、宿主の遺伝物質の完全性を妨害することなく、ウイルスまたは他の外来遺伝物質を除去するのに使用することができる。

ＲＮＡウイルスをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで不活性化するための例示的な組成物は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸配列と、ＲＮＡウイルスゲノム内の標的核酸配列に相補的な少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む。１つの実施形態において、単離核酸コンストラクトは、ｍＲＮＡコンストラクトである。ｍＲＮＡコンストラクトは修飾を含むことができ、例えば、核局在化配列、５’キャップ、３’ポリ（Ａ）テール、あるいは修飾核酸塩基、例えば、Ｎ１－メチルプソイドウリジン－５’－三リン酸、２’－Ｏ－メチルアデノシン－５’－三リン酸、もしくは２’－Ｏ－メチルウリジン－５’－三リン酸、またはこれらの組合せを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型ＲＮａｓｅである。ＲＮＡ誘導型ＲＮａｓｅは、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ１３ａであり得る。

１つの実施形態において、本開示の組成物は、インフルエンザウイルスまたは呼吸器合胞体ウイルスなどのＲＮＡウイルスの治療に使用することができる。ＲＮＡウイルスは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスまたはプラス鎖ＲＮＡウイルスであり得る。

いくつかの実施形態において、単離核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の配列を有する。別の実施形態において、単離核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載の配列を有する。

また、本開示のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸配列と、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物も提供される。

また、本開示の組成物を使用する方法も提供される。１つの実施形態は、その必要のある対象におけるウイルス感染症を治療する方法であって、少なくとも、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸配列と、ＲＮＡウイルスゲノム内の標的核酸配列に相補的な少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む、医薬組成物を、対象におけるウイルス複製を阻害するのに有効な量で、対象に投与することによって治療する、方法を提供する。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはＣａｓ１３ａであることができ、ガイドＲＮＡコンストラクトは、ウイルス遺伝子を標的とすることができる。１つの実施形態において、ウイルス遺伝子は、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、イオンチャネル（Ｍ２）、マトリックスタンパク質（Ｍ１）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）、核外輸送タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）、またはＲＮＡポリメラーゼＰＢ１、ＰＢ２、もしくはＰＡである。
[本発明1001]
ＲＮＡウイルスをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで不活性化するための組成物であって、
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸配列と、
ＲＮＡウイルスゲノム内の標的核酸配列に相補的な少なくとも1つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と
を含む、組成物。
[本発明1002]
単離核酸コンストラクトがｍＲＮＡコンストラクトである、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
前記単離核酸コンストラクトが核局在化配列をさらに含む、本発明1001または本発明1002の組成物。
[本発明1004]
前記単離核酸コンストラクトが5’キャップ及び3’ポリ（Ａ）テールをさらに含む、本発明1001～1003のいずれかの組成物。
[本発明1005]
前記単離核酸コンストラクトが修飾核酸塩基をさらに含む、本発明1001～1004のいずれかの組成物。
[本発明1006]
前記修飾核酸塩基が、Ｎ1－メチルプソイドウリジン－5’－三リン酸、2’－Ｏ－メチルアデノシン－5’－三リン酸、もしくは2’－Ｏ－メチルウリジン－5’－三リン酸、またはこれらの組合せである、本発明1005の組成物。
[本発明1007]
前記ヌクレアーゼがＲＮＡ誘導型ＲＮａｓｅである、本発明1001～1006のいずれかの組成物。
[本発明1008]
前記ヌクレアーゼがＣａｓヌクレアーゼである、本発明1001～1006のいずれかの組成物。
[本発明1009]
前記ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ13ａである、本発明1008の組成物。
[本発明1010]
前記ＲＮＡウイルスがインフルエンザウイルスまたは呼吸器合胞体ウイルスである、本発明1001～1008のいずれかの組成物。
[本発明1011]
前記ＲＮＡウイルスがマイナス鎖ＲＮＡウイルスである、本発明1001の組成物。
[本発明1012]
前記ＲＮＡウイルスがプラス鎖ＲＮＡウイルスである、本発明1001の組成物。
[本発明1013]
前記単離核酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1に記載の配列を有する、本発明1001の組成物。
[本発明1014]
前記単離核酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2に記載の配列を有する、本発明1001の組成物。
[本発明1015]
本発明1001の組成物と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[本発明1016]
その必要のある対象におけるウイルス感染症を治療する方法であって、少なくとも、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸配列と、ＲＮＡウイルスゲノム内の標的核酸配列に相補的な少なくとも1つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む医薬組成物を、前記対象におけるウイルス複製を阻害するのに有効な量で、前記対象に投与することを含む、方法。
[本発明1017]
前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼがＣａｓ13ａである、本発明1016の方法。
[本発明1018]
ガイドＲＮＡコンストラクトがウイルス遺伝子を標的とする、本発明1016の方法。
[本発明1019]
前記ウイルス遺伝子が、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、イオンチャネル（Ｍ2）、マトリックスタンパク質（Ｍ1）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）、核外輸送タンパク質（ＮＳ1及びＮＳ2）、またはＲＮＡポリメラーゼＰＢ1、ＰＢ2、もしくはＰＡである、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記ＲＮＡウイルスがインフルエンザウイルスである、本発明1016の方法。
[本発明1021]
前記ＲＮＡウイルスが呼吸器合胞体ウイルスである、本発明1020の方法。

図１Ａは、Ｃａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ａ－ＮＬＳのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を用いたＲＮＡ切断アッセイの概略図である。Ｃａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ａ－ＮＬＳを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡを、ウサギ網状赤血球翻訳系を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物を、ｃｒＲＮＡ、その対応する標的ＲＮＡ、及び、ＲＮａｓｅ活性により切断時に蛍光を発するＲＮａｓｅ ａｌｅｒｔ基質と共に混合した。 図１Ｂ及び１Ｃは、インフルエンザウイルスのＰＢ１遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡ（ＣＲ）（ｇＰＢ１）及びその特異的標的ＲＮＡ（ＴＲ）を用いた、Ｃａｓ１３ａ（図１Ｂ）及びＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ（図１Ｃ）の標的特異的ＲＮＡ切断を示す棒グラフである。非標的ｃｒＲＮＡ（ＮＴ－ＣＲ）を陰性対照として使用した。Ｃａｓ１３ａのＲＮＡ切断活性は室温で９０分間測定し、ブランク対照としてｍｏｃｋ翻訳産物を使用した。平均ＲＦＵは、３連の平均として表されている。 図１Ｂの説明を参照。 図１Ｄ及び１Ｅは、対応するＣＲ及びＴＲの存在下または不在下におけるＰＢ１遺伝子に対するＣａｓ１３ａ（図１Ｄ）及びＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ（図１Ｅ）のＲＮＡ切断活性を示す、変性ゲルの代表的画像である。 図１Ｄの説明を参照。 図２Ａ～２Ｋは、ｇＰＢ１（図２Ａ）、ＰＢ１＿４．１（図２Ｂ）、ＨＡ１．１（図２Ｃ）、ＮＡ１．１（図２Ｄ）、ＮＰ１．１（図２Ｅ）、ＰＢ２＿１．１（図２Ｆ）、ＮＮ２＿１．１（図２Ｇ）、ＭＭ１．１（図２Ｈ）、ＰＢ１＿２．１（図２Ｉ）、ＰＢ１＿３．１（図２Ｊ）、及び非標的対照（図２Ｋ）についての、インフルエンザ遺伝子に対するＣａｓ１３ａのＲＮＡ切断活性を示す折れ線グラフである。 図２－１の説明を参照。 図２－１の説明を参照。 図２－１の説明を参照。 図３Ａ～３Ｈは、対応するｔｒＲＮＡの存在下または不在下における様々なＩＶＡ遺伝子フラグメントに対するｃｒＲＮＡのＲＮＡ切断活性を示す、変性ゲルの代表的画像である。四角枠及び矢印は、分解されたＲＮＡを表す。 図３－１の説明を参照。 図４Ａは、Ｃａｓ１３ａ及び／またはＣａｓ１３ａ－ＮＬＳによるＩＶＡ ＲＮＡ切断の機序の概略図である。 図４Ｂ～図４Ｋは、Ｖｉｒｏｍｅｒ Ｒｅｄを用いたＡ５４９細胞内のＣａｓ１３及びＣａｓ１３ａ－ＮＬＳの発現動態を示す蛍光顕微鏡画像である。Ｃａｓ１３はＶ５タグを用いて染色し、核はＤＡＰＩを用いて染色している。 図５Ａ～図５ＩＩは、Ｎｅｏｎエレクトロポレーション（図５Ａ～５Ｌ）、Ｖｉｒｏｍｅｒ Ｒｅｄ（図５Ｍ～５Ｘ）、及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（図５Ｙ～５ＩＩ）を用いた場合の、ＭＤＣＫ細胞及びＡ５４９細胞におけるＣａｓ１３ａの発現動態を示す蛍光顕微鏡画像である。細胞に１μｇのＣａｓ１３ａ ｍＲＮＡを形質移入した。細胞を２、４、６、１６、または２４時間時に固定し、抗Ｖ５及びＤＡＰＩ核染色で染色した。スケールバー＝２０μｍ。 図５－１の説明を参照。 図５－１の説明を参照。 図６Ａは、図６Ｂ～６ＥのＡ５４９細胞におけるＩＶＡ阻害を試験するための実験設定の概略図である。図６Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ａ５４９細胞）においてＰＢ１ ＩＶＡ遺伝子を標的とする様々なｃｒＲＮＡ（ｇＰＢ１、ＰＢ１＿２．１、ＰＢ１＿３．１、及びＰＢ１＿４．１）を用いた場合のＣａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ａ－ＮＬＳのＲＮＡ切断活性を決定するために定量化されたＰＢ１遺伝子コピーを示す棒グラフである。図６Ｃは、ＰＢ１遺伝子を標的としないｃｒＲＮＡ（ＨＡ１．１、ＮＡ１．１、ＮＰ１．１、ＮＮ２．１、及びＭＭ２．１）を用いた場合の、ＰＢ１遺伝子に対するＣａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ａ－ＮＬＳのＲＮＡ切断活性を示す棒グラフである。図６Ｄ～６Ｅは、異なるＩＶＡ分節を標的とする全ｃｒＲＮＡの比較を示す棒グラフであり、標的指向性ｃｒＲＮＡについて、それぞれのＩＶＡ遺伝子に対する比較による減少率（％）として表されている。全てのデータポイントは３連（ｎ＝３）の平均であり、エラーバーは標準偏差を表す（^＊ｐ≦０．０５、^＊＊ｐ≦０．００５、^＊＊＊ｐ≦０．００１、または^＊＊＊＊ｐ≦０．０００１）。多重比較については、チューキーの多重比較検定（図６Ｂ及び６Ｃ）またはシダックの多重比較検定（図６Ｄ及び６Ｅ）を適用した。 図６Ａの説明を参照。 図６Ａの説明を参照。 図６Ａの説明を参照。 図６Ａの説明を参照。 図７Ａ～７Ｈは、Ｃａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ａ－ＮＬＳが、いずれかのタンパク質をコードするｍＲＮＡならびにＩＶＡ遺伝子ＰＢ１のゲノム用のｃｒＲＮＡ（ｇＰＢ１）及びメッセンジャーＲＮＡ用のｃｒＲＮＡ（ｍＰＢ１）を感染前に４時間形質移入した細胞においてＩＶＡ感染を阻害することを示す、代表的な蛍光顕微鏡画像である。形質移入し感染させた細胞のＩＶＡ Ｍ２タンパク質、ＩＶＡを標的とするＦＩＳＨ、Ｃａｓ１３ａ Ｖ５、及び核について染色した。 図７－１の説明を参照。 図８Ａは、Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ用量及びウイルス感染を最適化するための実験設定の概略図である。 図８Ｂは、ＩＶＡ力価に対するＣａｓ１３ａ及びｃｒＲＮＡの用量応答アッセイを示す棒グラフである。 図８Ｃ及び８Ｄは、ＭＯＩ ０．０１（図８Ｃ）及びＭＯＩ ０．１（図８Ｄ）におけるＣａｓ１３ａ及びｇＰＢ１がＩＶＡに及ぼす効果を示す棒グラフである。 図８Ｃの説明を参照。 図９は、ヒト初代気管支／気管上皮細胞において、Ｃａｓ１３ａ（１μｇ）ならびにｃｒＲＮＡ ｇＰＢ１及び／またはｍＰＢ１（１００ｎＭ）を形質移入し、次にＩＶＡを感染させた場合のＰＢ１コピー数を示す棒グラフである。 図１０Ａは、Ａ５４９細胞におけるＩＶＡ阻害を試験するための実験設定の概略図である。図１０Ｂ～１０Ｃは、Ｃａｓ１３ａ（図１０Ｂ）またはＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ（図１０Ｃ）と、ＩＶＡ ＰＢ１遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡ（ｇＰＢ１及びｍＰＢ１）とを形質移入した細胞における経時的なＰＢ１遺伝子コピー数を示す棒グラフである。図１０Ｄは、感染Ａ５４９細胞におけるＩＶＡ阻害を試験するための実験設定の概略図である。図１０Ｅ～１０Ｆは、Ｃａｓ１３ａ（図１０Ｅ）またはＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ（図１０Ｆ）と、ＩＶＡ ＰＢ１遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡ（ｇＰＢ１及びｍＰＢ１）とを形質移入した細胞における経時的なＰＢ１遺伝子コピー数を示す棒グラフである。図１０Ｇは、遅延感染アッセイの実験設定の概略図である。図１０Ｈは、遅延感染モデルにおけるＰＢ１遺伝子コピー数を示す棒グラフである。Ｃａｓ１３とＣＲ ｇＰＢ１及びｍＰＢ１とを細胞に２４時間形質移入し、次いでＩＶＡを８時間感染させた。図１０Ｉは、Ａ５４９細胞をＩＶＡ（ＭＯＩ ０．０１）に２４時間感染させ、その後Ｃａｓ１３ａとｃｒＲＮＡ（ｇＰＢ１及びｍＰＢ１）とを形質移入した場合の実験設定の概略図である。図１０Ｊは、ＩＶＡ（ＭＯＩ ０．０１）に２４時間感染させ、その後Ｃａｓ１３ａとｃｒＲＮＡ（ｇＰＢ１及びｍＰＢ１）とを形質移入した細胞におけるＰＢ１遺伝子コピー数を示す棒グラフである。全てのデータポイントは３連（ｎ＝３）の平均であり、エラーバーは標準偏差を表す。全ての統計解析は、適切な試験後測定値との多重比較による分散分析を用いて実施した（ｂ～ｃ及びｅ～ｆについてはチューキー多重比較検定による通常の二元配置ＡＮＯＶＡ、Ｈ及びＪについてはダネット多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ）。（^＊ｐ≦０．０５、^＊＊ｐ≦０．００５、^＊＊＊ｐ≦０．００１、または^＊＊＊＊ｐ≦０．０００１）。 図１０Ａの説明を参照。 図１０Ａの説明を参照。 図１０Ａの説明を参照。 図１０Ａの説明を参照。 図１０Ａの説明を参照。 図１０Ａの説明を参照。 図１０Ａの説明を参照。 図１０Ａの説明を参照。 図１０Ａの説明を参照。 図１１Ａは、Ａ５４９細胞における予防的ＲＳＶ阻害を試験するための実験設定の概略図である。図１１Ｂは、Ｃａｓ１３ａ形質移入後のＲＳＶに感染した細胞におけるプラーク形成を示す棒グラフである。図１１Ｃは、Ａ５４９細胞における感染後ＲＳＶ阻害を試験するための実験設定の概略図である。図１１Ｄは、Ｃａｓ１３ａ形質移入前にＲＳＶに感染させた細胞におけるプラーク形成を示す棒グラフである。全てのデータポイントは３連（ｎ＝３）の平均であり、エラーバーは標準偏差を表す。統計解析は、チューキー多重比較検定による分散分析を用いて実施した（^＊ｐ≦０．０５、^＊＊ｐ≦０．００５、^＊＊＊ｐ≦０．００１、または^＊＊＊＊ｐ≦０．０００１）。 図１１Ａの説明を参照。 図１１Ａの説明を参照。 図１１Ａの説明を参照。

発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本開示は、本明細書で説明される組成物及び方法ならびに説明される実験条件に限定されるものではなく、そのためこれらは変化し得るということを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、ある特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、このような用語が限定的であるようには意図されていないことも理解されたい。

別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。ただし、本明細書に記載のものと同様または同等である任意の組成物、方法、及び物質は、本発明の実施または試験で使用することができる。言及される全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書に援用される。

本明細書において、「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「当該（ｔｈｅ）」という用語、ならびに本発明を説明する文脈における（特に、以下の請求項の文脈における）同様の指示語は、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を網羅するものと解釈されるべきである。

本明細書における値範囲の記載は、単に、範囲内に収まる個々の値を個別に言及する簡略的方法として供するように意図されており、本明細書で別段の指示がない限り、個々の値は、本明細書で個別に記載されているかのように本明細書に援用される。

「約（ａｂｏｕｔ）」という用語の使用は、記載された値をおよそ＋／－１０％の範囲で上回るまたは下回る値を説明するように意図されている。他の実施形態において、値は、記載された値をおよそ＋／－５％の範囲で上回るまたは下回る値を範囲とし得る。他の実施形態において、値は、記載された値をおよそ＋／－２％の範囲で上回るまたは下回る値を範囲とし得る。他の実施形態において、値は、記載された値をおよそ＋／－１％の範囲で上回るまたは下回る値を範囲とし得る。前述の範囲は、文脈によって明確にされるように意図されており、さらなる限定を意味するものではない。本明細書で説明されている全ての方法は、本明細書で別段の指示がない限り、または別段に文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。あらゆる例、または本明細書で示される例示的な言葉（例えば、「～などの（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本明細書をより良好に明らかにすることを意図したものに過ぎず、別の形で特許請求されない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。本明細書中のいかなる語も、本明細書の実施に不可欠な任意の特許請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。

本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ」とは、天然であっても非天然であってもよいリボ核酸を意味する。例えば、ＲＮＡには、修飾されたかつ／または非天然の成分、例えば、１つ以上の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーが含まれ得る。ＲＮＡには、キャップ構造、鎖終結ヌクレオシド、ステムループ、ポリＡ配列、及び／またはポリアデニル化シグナルが含まれ得る。ＲＮＡは、目的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有し得る。例えば、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり得る。特定のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳、例えば、哺乳類細胞内でのｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ翻訳は、コードされたポリペプチドをもたらすことができる。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用することができ、ペプチド結合によって互いに連結した少なくとも３個のアミノ酸の連なりを意味する。ペプチドとは、個別のペプチドもペプチドの集合も意味し得る。ペプチドには、天然アミノ酸、非天然アミノ酸（すなわち、自然界には存在しないが、ポリペプチド鎖に組み込むことができる化合物）、及び／またはアミノ酸類似体が含まれ得る。また、ペプチド内のアミノ酸のうちの１つ以上は、化学的実体（例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基；結合、官能化、またはその他の修飾のためのリンカーなど）の付加によって修飾されてもよい。修飾には、ペプチドの環化、Ｄ－アミノ酸の組込みなどが含まれ得る。

「配列同一性パーセント（％）」という用語は、配列をアラインメントし、必要に応じギャップを導入して最大のパーセント配列同一性を達成した後、参照核酸配列内のアミノ酸核酸と同一である候補配列内のヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージとして定義される。パーセント配列同一性を決定することを目的としたアラインメントは、当業者の技量範囲内の様々な方法で、例えば、公的に入手可能なコンピューターソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ））を使用して、達成することができる。アラインメントを測定するための適切なパラメーターは、比較対象配列の全長にわたる最大アラインメントの達成に必要な任意のアルゴリズムも含めて、公知の方法によって決定することができる。

本明細書の目的において、所与の核酸配列Ｄに対する、所与のヌクレオチドまたはアミノ酸配列Ｃの配列同一性％（これは代替的に、所与の配列Ｄに対して特定の配列同一性％を有するまたは含む所与の配列Ｃ、と表現することができる）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｗ／Ｚ
（式中、Ｗは、配列アラインメントプログラムにより、当該プログラムのＣ及びＤについてのアラインメントにおいて同一の一致としてスコア付けされたヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｚは、Ｄにおけるヌクレオチドまたはアミノ酸の総数である）。配列Ｃの長さが配列Ｄの長さに等しくない場合、Ｄに対するＣの配列同一性％は、Ｃに対するＤの配列同一性％に等しくないことが理解されよう。

「ゲノム編集」とは、生物のゲノム内でＤＮＡが挿入、欠失、修飾、または置換される遺伝子工学の１つのタイプを意味する。これは、細胞または生物のＤＮＡに特定の変化をもたらす方法である。最も広く使用されているゲノム編集の１つは、改変ヌクレアーゼゲノム編集である。改変ヌクレアーゼは、ＤＮＡ配列の特定の部位で切断する酵素であり、この切断が細胞によって修復されると、ある変化が配列に導入される。改変ヌクレアーゼの例示的なタイプとしては、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられる。

本明細書で使用する場合、「ＣＲＩＳＰＲ」または「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）」という用語は、塩基配列の複数の短い直接反復を含むＤＮＡ座位の頭字語を意味する。各反復は、一連の塩基及びそれに続く逆の一連の塩基、次いで「スペーサーＤＮＡ」として知られているおよそ３０塩基対を含む。スペーサーはＤＮＡの短いセグメントであり、しばしば細菌ウイルスやその他の外来の遺伝因子に由来し、将来の侵入に対する適応防御を促進するために過去の曝露の「記憶」として機能し得る。

「ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ」または「Ｃａｓ」とは、ヌクレオチド塩基を付加または欠失できるようにゲノム内の特定の位置でＤＮＡを切断する酵素を意味する。

「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」とは、目的の標的ＤＮＡ領域を認識し、編集するためにＣａｓヌクレアーゼをその領域に導く、特定のＲＮＡ配列を意味する。

本明細書で使用する場合、「治療する」、「治療すること」、「治療」、及び「治療的使用」という用語は、疾患または障害の１つ以上の症状の消失、減少、または緩和を意味する。本明細書で使用する場合、「治療有効量」とは、このような症状の臨床的に意義のある消失、減少、または緩和を媒介するのに十分な治療剤の量を意味する。効果は、その大きさがレシピエント対象の健康または予後に影響を及ぼすのに十分である場合、臨床的に意義のあるものとする。治療有効量とは、疾患の発症の遅延または最小化、例えば、癌の拡散の遅延または最小化に十分な治療剤の量を意味し得る。また、治療有効量は、疾患の治療または管理において治療的利益をもたらす治療剤の量も意味し得る。

本明細書で使用する場合、「予防剤」という用語は、障害または疾患の任意の症状を検出する前に、障害または疾患の予防で使用され得る薬剤を意味する。「予防有効」量とは、このような保護を媒介するのに十分な予防剤の量である。また、予防有効量は、疾患の防止において予防的利益をもたらす予防剤の量も意味し得る。

本明細書で使用する場合、「個体」、「宿主」、「対象」、及び「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、限定されるものではないが、ヒト、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）、ならびにその他の実験動物を含めた哺乳類を意味する。

本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される担体」という用語は、任意の標準的な医薬担体、例えば、リン酸緩衝食塩液、水、及び乳濁液（例えば、油／水または水／油乳濁液）、ならびに様々なタイプの湿潤剤を包含する。

本明細書で使用する場合、「プラス鎖ＲＮＡウイルス」または「センス鎖ＲＮＡウイルス」とは、遺伝子情報が、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）及びタンパク質をコードするプラス（またはセンス）鎖である１本鎖ＲＮＡからなる、ウイルスである。

本明細書で使用する場合、「マイナス鎖ＲＮＡウイルス」または「アンチセンス鎖ＲＮＡウイルス」とは、遺伝子情報が、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）をコードしないマイナスまたはアンチセンス鎖である１本鎖ＲＮＡからなる、ウイルスである。

本明細書で使用する場合、ウイルスの「不活性化」という用語は、そのウイルスが複製できないこと、ゲノムが欠失、断片化、分解、遺伝子的に不活性化していること、あるいは、ウイルスが伝達可能であること、または他の任意の細胞もしくは対象に感染することを防止し、その結果ｉｎ ｖｉｖｏでのウイルスのクリアランスをもたらす、他の任意の物理的、生物学的、化学的、または構造的な徴候を意味する。場合によっては、ウイルスゲノムのフラグメントは検出可能であり得るが、そのウイルスは複製も感染も不可能である。

「標的核酸」配列という用語は、オリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズするように設計された核酸を意味する。検出されるべきなのは標的核酸の有無であり、定量化されるべきなのは標的核酸の量である。標的核酸は、標的に向けられた対応するオリゴヌクレオチドの核酸配列に相補的な配列を有する。

ＩＩ．ウイルス複製を阻害するための組成物
本明細書では、宿主細胞または対象におけるウイルスを治療または不活性化するための組成物が提供される。例示的な組成物には、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸と、ウイルスにおける標的配列に相補的なガイドＲＮＡとが含まれる。１つの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、宿主細胞内のウイルスをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで破壊及び抑制するために、ウイルス核酸配列を特異的に標的とする。任意の好適なヌクレアーゼ系を使用することができ、例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、その他のエンドもしくはエキソヌクレアーゼ、またはこれらの組合せが挙げられる。１つの実施形態において、ヌクレアーゼ系はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓである。

Ａ．ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ
本開示の組成物は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクトを含む。１つの実施形態において、核酸コンストラクトは、ｍＲＮＡコンストラクトである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲ系は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）と呼ばれるヌクレアーゼを用いており、このヌクレアーゼはガイドとしての低分子ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体化し、任意のゲノム位置におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の上流で配列特異的にＤＮＡを切断する。ＣＲＩＳＰＲは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡとして知られている別々のガイドＲＮＡを使用してもよい。これら２つの別々のＲＮＡは、短いガイドＲＮＡの設計による部位特異的な哺乳類ゲノム切断を可能にするために、組み合わせて１つのＲＮＡとなっている。Ｃａｓ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、公知の方法によって合成することができる。Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、非特異的ＤＮＡ切断タンパク質Ｃａｓと、標的とハイブリダイズするためのＲＮＡオリゴヌクレオチドとを使用して、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体を動員する（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２３：４６５－４７２（２０１３）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３１：２２７－２２９（２０１３））。

ＣＲＩＳＰＲ系は２つのクラスを含み、これらは５つの型と１６の亜型とに細分される。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＩＩ型またはＩＶ型系とすることができる。好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（またはＣａｓＤ）、Ｃａｓｈ、Ｃａｓｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａｌ、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ（またはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（またはＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（またはＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（またはＣａｓＣ）、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｉ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚｉ、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆｉ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６が挙げられる。

１つの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来する。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に属し、標的ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼ活性が強力である。Ｃａｓ９は、約２０塩基対（ｂｐ）のユニークな標的配列（スペーサーと呼ばれる）を含む成熟ｃｒＲＮＡと、プレｃｒＲＮＡのリボヌクレアーゼＩＩＩ支援プロセシングのガイドとして機能するトランス活性化したスモールＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とによって誘導される。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的ＤＮＡ上の相補的配列（プロトスペーサーと呼ばれる）との間の相補的塩基対を介して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに導く。Ｃａｓ９は、トリヌクレオチド（ＮＧＧ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識して切断部位（ＰＡＭから３番目のヌクレオチド）を特定する。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、別々に発現させてもよく、天然のｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣するように合成ステムループ（ＡＧＡＡＡＵ）を介し操作して人工的融合スモールガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）にしてもよい。このようなｓｇＲＮＡは、ｓｈＲＮＡと同様に、合成しても、直接のＲＮＡ形質移入用にｉｎ ｖｉｔｒｏ転写しても、Ｕ６またはＨ１促進ＲＮＡ発現ベクターから発現させてもよいが、人工的ｓｇＲＮＡの切断効率は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを別々に発現させた系の切断効率よりも低い。

１つの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃまたはＣａｓ１３ｄなどのＶＩ型ＲＮａｓｅである。１つの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼはＣａｓ１３ａである。Ｃａｓ１３酵素は、原核生物のＣＲＩＳＰＲ適応免疫系に関連するＲＮＡ誘導型ＲＮＡエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓ１３ヌクレアーゼはＣａｓ９と同様に機能し、約６４ｎｔのガイドＲＮＡを使用して標的特異性をコードする。Ｃａｓ１３タンパク質は、ｃｒＲＮＡ内の短いヘアピンを認識することによりガイドＲＮＡと複合体を形成し、標的特異性は、標的領域に対して相補的な２８～３０ｎｔのスペーサーによってコードされる。プログラム可能なＲＮａｓｅ活性に加えて、全てのＣａｓ１３ヌクレアーゼは、標的転写物を認識及び切断した後に副次的活性を示し、スペーサーに対する相補性にかかわらず、付近の任意の転写物を非特異的に分解する。Ｃａｓ１３ヌクレアーゼを発現する例示的なバクテリアとしては、限定されるものではないが、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｉａ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ、Ｈｅｒｂｉｎｉｘ ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、及びＬｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓが挙げられる。１つの実施形態において、Ｃａｓ１３酵素は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｉａ ｗａｄｅｉ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｉａ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ、またはＬｅｐｔｏｔｒｉｃｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓ由来のＣａｓ１３ａである。

ある特定の実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、少なくとも１つのＲＮＡ認識ドメイン及び／またはＲＮＡ結合ドメインを含む。ＲＮＡ認識ドメイン及び／またはＲＮＡ結合ドメインは、ガイドＲＮＡと相互作用する。また、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメイン（すなわち、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、ＲＮａｓｅドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、及びその他のドメインも含むことができる。

いくつかの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、野生型ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、修飾ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、または野生型もしくは修飾ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのフラグメントであり得る。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、核酸結合親和性及び／もしくは特異性を増加させ、酵素活性を改変し、かつ／またはタンパク質の別の特性を変化させるように修飾することができる。例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ）ドメインは、修飾、欠失、または不活性化することができる。代替的に、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、融合タンパク質の機能に必須でないドメインを除去するように切断してもよい。また、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、融合タンパク質のエフェクタードメインの活性を最適化するように切断または修飾してもよい。

いくつかの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ１３タンパク質またはそのフラグメントに由来してもよい。他の実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、修飾Ｃａｓ１３タンパク質に由来してもよい。例えば、タンパク質の１つ以上の特性（例えば、ヌクレアーゼ活性、親和性、安定性など）を改変するようにＣａｓ１３タンパク質のアミノ酸配列を修飾することができる。代替的に、修飾Ｃａｓ１３タンパク質が野生型Ｃａｓ１３タンパク質よりも小さくなるように、ＲＮＡ誘導型切断に関与しないＣａｓ１３タンパク質のドメインをタンパク質から除去してもよい。

１つの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクトは、ｍＲＮＡコンストラクトである。

１つの実施形態において、Ｃａｓ１３ａをコードする核酸コンストラクトは、以下の核酸配列を有する。

下線付きの配列は制限部位を表し、太字かつ大文字の配列は５’ＵＴＲを表し、二重下線付きの配列はコード領域を表す。

別の実施形態において、Ｃａｓ１３ａをコードする核酸コンストラクトは、核局在配列を含み、以下のような核酸配列を有する。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の核酸１～２７は５’ｐＭＡ７ベクター配列を表し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の核酸２８～３３はＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を表し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の核酸３４～５３はＴ７プロモーターを表し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の核酸５４～９７は５’ＵＴＲを表し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の核酸１０１～１２１はＳＶ４０核局在化配列（ＮＬＳ）を表し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の核酸１２２～１２７はＧＳリンカーを表し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の核酸１２８～３６０４はＬｂｕ Ｃａｓ１３ａコドン最適化を表し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の核酸３６０５～３６１０はＧＳリンカーを表し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の核酸３６１１～３６５２はＶ５タグを表し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の核酸３６５３～３６５８はＧＳリンカーを表し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の核酸３６５９～３６７９はＳＶ４０ ＮＬＳを表し、核酸３６８０～３３６８５は終止コドンを表し、核酸３６８６～３７７８は３’ＵＴＲを表し、核酸３７７９～３７８６はＮｏｔＩ制限部位を表し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の核酸３７８７～３８０３は３’ｐＭＡ７ベクター配列を表す。

１つの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクトは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対し少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を有する。別の実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクトは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対し少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の配列同一性を有する核酸配列を有する。

１．修飾
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする本開示の核酸コンストラクトは、安定性を高め、免疫原性を減少させるように修飾することができる。１つの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクトは、例えば核酸コンストラクトに核局在配列を付加することにより、送達標的を改変するように修飾される。例示的な核局在配列としては、限定されるものではないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）ラージＴ抗原

、ヌクレオプラスミン

が挙げられる。

天然のｍＲＮＡは、５’末端にキャップ構造、３’末端にポリアデニル酸残基の長い配列（ポリ（Ａ）テール）を有し、これらはＤＮＡの転写後に付加される。修飾を伴わない合成ｍＲＮＡは、５’末端のキャップも３’末端のポリ（Ａ）テールも有しない。１つの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクトは、安定性を高め免疫原性を減少させるように５’キャップ構造及び３’ポリ（Ａ）テールで修飾される。５’キャップは、７－メチルグアノシンキャップ（例えば、キャップ０、キャップ１、キャップ２、キャップ３、もしくはキャップ４）またはＬＮＡ修飾キャップ類似体であり得る。ｍＲＮＡをヌクレアーゼ分解から保護するために、ポリ（Ａ）テールを３’ＵＴＲに付加してもよい。１つの実施形態において、ポリ（Ａ）テールは２５～１０００ヌクレオチドを有する。別の実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、または１０００ヌクレオチドを有する。

天然のＲＮＡは、４種の塩基性リボヌクレオチド：ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、及びＧＴＰから合成される。１つの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクトは、リボヌクレオチドに対する修飾を含むことができる。適切な修飾としては、コドンが同じアミノ酸をコードし、ただし野生型バージョンの核酸に認められるコドンよりも安定するような、コドンの１つ以上のヌクレオチドの改変が挙げられる。例えば、ＲＮＡの安定性と、シチジン（Ｃ）及び／またはウリジン（Ｕ）残基の数が多いこととの逆比例関係が実証されており、また、Ｃ及びＵ残基がないＲＮＡがほとんどのＲＮａｓｅに対して安定していることが分かっている。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ配列中のＣ及び／またはＵ残基の数は減少する。別の実施形態において、Ｃ及び／またはＵ残基の数は、特定のアミノ酸をコードする１つのコドンを、同じまたは関連するアミノ酸をコードする別のコドンで置換することにより、減少する。本発明のｍＲＮＡ核酸に対し企図されている修飾には、プソイドウリジンの組込みも含まれる。プソイドウリジンをｍＲＮＡ核酸に組み込むことにより、安定性及び翻訳能力が増強されることに加え、ｉｎ ｖｉｖｏの免疫原性が低下し得る。

別の実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする本開示の核酸コンストラクトは、翻訳後修飾ヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、修飾ヌクレオシドを組み込むことにより、ｍＲＮＡコンストラクトの安定性が高まり、かつその免疫原性が減少し得る。１つの実施形態において、シチジン及び／またはウリジンは、修飾ヌクレオシドによって置き換えられる。例示的な修飾ヌクレオシド塩基としては、限定されるものではないが、５－メチルシチジン、２’－Ｏ－メチルシチジン、プソイドウリジン、Ｎ^６－メチルアデノシン、Ｎ^６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、Ｎ^６，Ｎ^６，２’－Ｏ－トリメチルアデノシン、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン、７－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、Ｎ^２，７－ジメチルグアノシン、Ｎ^２，Ｎ^２，７－トリメチルグアノシンが挙げられる。１つの実施形態において、合成ｍＲＮＡは、Ｎ１－メチルプソイドウリジン－５’－三リン酸、２’－Ｏ－メチルアデノシン－５’－三リン酸、または２’－Ｏ－メチルウリジン－５’－三リン酸と共に組み込まれる。

１つの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクトは、５’－及び３’－末端側非翻訳領域（ＵＴＲ）（例えば、アルファ－及びベータ－グロビンＵＴＲ）の組込みによって最適化される。末端側ＵＴＲは、ＲＮＡの安定性及び翻訳能力を増強する。安定している任意のネイティブｍＲＮＡ分子（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、クエン酸回路酵素）及びウイルスＲＮＡ（例えば、アルファウイルスなど）に由来する３’または５’配列は、核酸コンストラクトの安定性を高めるために、核酸分子の３’及び／または５’領域内に組み込むことができる。

Ｂ．ガイドＲＮＡ
本発明に従うガイドＲＮＡ配列は、センスまたはアンチセンス配列であり得る。ガイドＲＮＡ配列は、概してプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。ＰＡＭの配列は、使用されるＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの特異性要件に応じて変化し得る。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系において、標的ＤＮＡは、典型的には５’－ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の直前にある。したがって、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭ配列は、ＡＧＧ、ＴＧＧ、ＣＧＧ、またはＧＧＧであり得る。ガイドＲＮＡの特異的配列は変化し得るが、その配列に関係なく、有用なガイドＲＮＡ配列となるのは、オフターゲット効果を最小化すると同時に、高効率及びウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）の完全な除去を達成する配列である。ガイドＲＮＡ配列の長さは、約２０～約６０またはそれ以上のヌクレオチド、例えば、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０またはそれ以上のヌクレオチドに変動し得る。

ガイドＲＮＡ配列は、単一の配列として、または１つ以上の異なる配列の組合せ（例えば、多重構成）として構成することができる。多重構成は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の異なるガイドＲＮＡの組合せを含むことができる。したがって、いくつかの実施形態において、少なくとも１つのｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列は、２つの異なるｇＲＮＡ配列をコードすることができる。他の実施形態において、あるポリヌクレオチドはあるｇＲＮＡをコードし、第２のポリヌクレオチドは第２のｇＲＮＡをコードし、第３のポリヌクレオチドは第３のｇＲＮＡをコードする、などとなり、各ｇＲＮＡは、標的核酸配列の異なる配列に相補的である。他の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、２つ以上の異なるｇＲＮＡ配列をコードする。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、重複する標的核酸配列を有する複数のｇＲＮＡ配列をコードする。

本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集複合体は、ウイルスゲノムを標的とするガイドＲＮＡと共に最適に作用する。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）としては、限定されるものではないが、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、他の任意の標的指向性オリゴヌクレオチド、またはこれらの任意の組合せを挙げることができる。ｇＲＮＡは、ウイルスゲノムを破壊させるためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体をウイルスゲノムに導く。１つの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体は、細胞内のウイルス（例えばＲＮＡウイルス）を標的とするように設計される。本発明の組成物を用いて任意のウイルスを標的とし得ることを理解されたい。ウイルスゲノムの特異的領域の同定は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体を開発及び設計する一助となる。１つの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体は、細胞内の活性ウイルスを標的とするように設計される。別の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体は、細胞内の潜伏ウイルスを標的とするように設計される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体は、ひとたび細胞内に形質移入すると、繰り返し挿入もしくは欠失を引き起こして、ウイルスゲノムを無力化するか、または挿入もしくは欠失の数によって修復の可能性を顕著に減少させる。

本開示の組成物は、ＲＮＡウイルス（例えば、インフルエンザウイルスまたは呼吸器合胞体ウイルス）における標的配列に相補的なガイドＲＮＡをコードする配列を含むことができる。Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、及びＣ型インフルエンザウイルスは、それぞれＡ型インフルエンザウイルス属、Ｂ型インフルエンザウイルス属、及びＣ型インフルエンザウイルス属の唯一のメンバーである。これらのウイルスは膜に封入されたウイルスであり、そのゲノムは、ＲＮＡのネガティブセンス（すなわち、マイナス）鎖（（－）ＲＮＡ）が分節化したものである。１０個のインフルエンザウイルス遺伝子が、Ａ株及びＢ株の１本鎖ＲＮＡの８本の分節上に、そしてＣ株の７本の分節上に存在する。これらの分節のサイズは様々であり（８９０～２３４１ヌクレオチド）、各々が異なるｍＲＮＡ合成の鋳型となる。インフルエンザウイルスビリオンは、これらの鋳型からのｍＲＮＡ合成に必要なウイルス特異的ＲＮＡポリメラーゼを含み、このような特異的ポリメラーゼの不在下では、インフルエンザウイルスＲＮＡのマイナス鎖は感染性を有しない。ｍＲＮＡの転写開始は、インフルエンザウイルスのｍＲＮＡポリメラーゼが細胞のｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体の５’末端から１２～１５ヌクレオチドを取り込み、借用したオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するときに生じる。このプロセスは、ウイルスのｍＲＮＡ上に５’キャップ構造を配置することから、「キャップスナッチング」と称される。概して、このプロセスを通じて作製されるｍＲＮＡは、１つのタンパク質のみをコードする。Ｍ遺伝子及びＮＳ遺伝子のウイルスＲＮＡ分節は、スプライシングされたｍＲＮＡもコードし、その結果、これら２つの分節の各々については２つの異なるタンパク質が産生される。インフルエンザウイルスＲＮＡの複製は核内で行われ、３つの異なるＲＮＡ種の合成を伴う。

ナイーブ細胞の感染後、マイナス鎖ビリオンＲＮＡ（ＶＲＮＡ）は核に輸送され、翻訳用のＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が合成される。このとき、ウイルスがコードする酵素が、キャップの付いている細胞ｍＲＮＡ前駆体分子から切断した、５’末端の１０～１３ヌクレオチドからなるプライマーが使用される（すなわち、キャップスナッチング）。各ｍＲＮＡの合成は、ゲノム分節の末端付近まで続き、末端でひと続きのオリゴ（Ｕ）に遭遇してポリ（Ａ）テールが付加される。専用のウイルスｍＲＮＡは翻訳のために細胞質に輸送され、十分なウイルスタンパク質が核内に輸送された後、新生ウイルス粒子用のＶＲＮＡの合成が開始される。ＶＲＮＡの正確なアンチゲノムコピーが合成される（ｃＲＮＡと称される）。これはゲノムＶＲＮＡの完全な相補配列であり、新たなＶＲＮＡを産生するための鋳型として機能する。

１つの実施形態において、ウイルスはＡ型インフルエンザである。Ａ型インフルエンザは、負の極性を有する分節化したＲＮＡウイルスである。ゲノム分節は、３つのポリメラーゼポリペプチド（ＰＡ、ＰＢ１、及びＰＢ２）ならびにＮＰ（核タンパク質）という４つのタンパク質の複合体によって複製される。８本のゲノム分節全ての５’及び３’末端配列領域は、遺伝子型内で高度に保存されている。Ａ型インフルエンザウイルスは、その表面糖タンパク質の抗原性及び遺伝的性質に従って下位分類することができ、これまでに１５種のヘマグルチニン（ＨＡ）亜型及び９種のノイラミニダーゼ（ＮＡ）亜型が同定されている。全ての公知のＨＡ及びＮＡ亜型を有するウイルスが鳥類宿主から単離されているが、ヒトのエピデミックを引き起こしているのはＨ１Ｎ１（１９１８）、Ｈ２Ｎ２（１９５７／５８）、及びＨ３Ｎ２のウイルスのみである。

１つの実施形態において、ガイドＲＮＡは、ウイルス複製に関与する遺伝子を標的とするように設計される。ウイルスのポリメラーゼは、ウイルスゲノムの複製及び転写で中心的役割を果たしている。ウイルス複製に必要な例示的なウイルス成分としては、限定されるものではないが、ウイルス核タンパク質、ＲＮＡポリメラーゼ、及びリンタンパク質が挙げられる。１つの実施形態において、ガイドＲＮＡは、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、イオンチャネル（Ｍ２）、マトリックスタンパク質（Ｍ１）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）、核外輸送タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）、またはＲＮＡポリメラーゼＰＢ１、ＰＢ２、もしくはＰＡを標的とする。１つの実施形態において、ガイドＲＮＡは、Ａ型インフルエンザウイルスのＰＢ１を標的とする。別の実施形態において、ガイドＲＮＡはｈＲＳＶを標的とする。別の実施形態において、ガイドＲＮＡは、任意のＲＮＡウイルス（フィロウイルス、フラビウイルス、ピコルナウイルス、カリシウイルス、トガウイルス、アレナウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アストロウイルス、レトロウイルスなどを含む）のゲノムを標的とし、また、ＤＮＡまたはＲＮＡゲノムを有する任意のウイルス由来のｍＲＮＡを標的とすることができる。

いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの混合物を細胞内に導入することができる。当該ガイドＲＮＡは、多数のカテゴリーのウイルスゲノム配列を標的とするように設計されている。ゲノム上のいくつかの領域を標的とすることにより、複数の位置の２本鎖切断がゲノムを断片化し、修復の可能性を低下させる。修復機構を伴う場合であっても、大きな欠失によってウイルスが無力化される。

いくつかの実施形態において、数種のガイドＲＮＡを添加して、異なるカテゴリーの配列を標的とする混合物を創出する。例えば、３つの異なるカテゴリーの配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ混合物中に２、５、７、または１１種のガイドＲＮＡが存在し得る。ただし、複数カテゴリーの配列を標的とするのに任意の数のｇＲＮＡを混合物中に導入することができる。好ましい実施形態において、配列のカテゴリーは、ゲノム構造、宿主細胞形質転換、及び感染潜伏期のそれぞれにおいて重要である。

Ｃ．医薬組成物
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする本開示の核酸と、ウイルスにおける標的配列に相補的なガイドＲＮＡとを含む、医薬組成物が提供される。本開示の組成物を含む医薬組成物は、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）、または皮下注射）、経皮（受動的に、またはイオン導入もしくはエレクトロポレーションを用いて）、あるいは経粘膜（経鼻、経膣、経直腸、または舌下）の投与経路または生分解性挿入物の使用による投与向けとすることができ、また、各投与経路に適した剤形で製剤化することができる。１つの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸及びガイドＲＮＡは、同じ医薬組成物に含まれる。別の実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸及びガイドＲＮＡは、別々の医薬組成物で製剤化される。

いくつかのｉｎ ｖｉｖｏアプローチにおいて、本明細書で開示される組成物は、治療有効量で対象に投与される。的確な用量は、対象依存的な変数（例えば、年齢、免疫系健康状態など）、疾患、及びもたらされる治療などの様々な因子に応じて変動する。

本開示の組成物については、さらなる研究が行われるに伴って、様々な患者における様々な状態の治療のための適切な用量レベルに関する情報が明らかになり、当業者は、治療状況、年齢、及びレシピエントの全般的健康状態を考慮して妥当な投薬を把握することができる。選択される用量は、所望の治療効果、投与経路、及び所望の治療期間に依存する。本開示の活性化可能なヌクレアーゼ組成物については、概して１日に０．００１～２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量レベルが哺乳類に投与される。概して、静脈内注射または点滴の場合、用量はより少なくてもよい。

１．非経口投与用製剤
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸とガイドＲＮＡとを含む、本明細書で開示される組成物は、水溶液で、非経口注射によって投与される。また、製剤は、懸濁液または乳濁液の形態をとってもよい。概して、活性化可能なヌクレアーゼ組成物の有効量を含む医薬組成物が提供され、この医薬組成物は、任意選択で、医薬的に許容される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、及び／または担体を含む。このような組成物は、任意選択で、以下のうちの１つ以上を含む：希釈剤、滅菌水、様々な緩衝内容物（例えば、トリス－ＨＣｌ、酢酸、リン酸）やｐＨ及びイオン強度の緩衝食塩水；添加剤、例えば、界面活性剤及び可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ ２０（ポリソルベート２０）、ＴＷＥＥＮ ８０（ポリソルベート８０））、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、ならびに防腐剤（例えば、チメロサール（Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、ベンジルアルコール）、ならびに増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）。非水性溶媒またはビヒクルの例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油及びトウモロコシ油などの植物油、ゼラチン、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルがある。製剤は、凍結乾燥し、使用直前に再溶解／再懸濁することができる。製剤の滅菌は、例えば、細菌保持フィルターによる濾過、組成物中への滅菌剤の組込み、組成物の照射、または組成物の加熱によって行うことができる。

２．経口投与用製剤
いくつかの実施形態において、組成物は経口送達用に製剤化される。経口用固体剤形は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄ．２００６（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）のＣｈａｐｔｅｒ ４５で概説されている。固体剤形としては、錠剤、カプセル、丸薬、トローチもしくはロゼンジ、カシェ剤、ペレット、粉末、または顆粒、あるいはポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸など）の粒子調製物への材料の組込み、またはリポソームへの材料の組込みが挙げられる。このような組成物は、本開示物の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、ｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼし得る。組成物は、液体形態で調製されてもよく、乾燥粉末（例えば、凍結乾燥）形態をとってもよい。リポソームまたはプロテイノイドカプセル化を使用して組成物を製剤化してもよい。リポソームカプセル化を使用することができ、リポソームを様々なポリマーで誘導体化することができる（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。概して、製剤は、ペプチド（またはその化学修飾形態）と、胃環境でペプチドを保護し腸内で生物学的活性物質を放出する不活性成分とを含む。

薬剤は、誘導体の経口送達が効果的であるように化学修飾することができる。概して、企図される化学修飾は、成分分子自体に対する少なくとも１つの部分の結合であり、この部分は、胃もしくは腸から血流への取込み、または腸粘膜への直接の取込みを可能にする。また、成分（１つまたは複数）の全体的安定性の増加や体内の循環時間の増加も所望される。ＰＥＧ化は、医薬使用のための例示的な化学修飾である。使用され得る他の部分としては、プロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、カルボキシルメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロリン、ポリ－１，３－ジオキソラン、及びポリ－１，３，６－チオキソカン（ｔｉｏｘｏｃａｎｅ）が挙げられる［例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ（１９８１）“Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ－Ｅｎｚｙｍｅ Ａｄｄｕｃｔｓ，”Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ．Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）ｐｐ．３６７－３８３；及びＮｅｗｍａｒｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５－１８９を参照］。

別の実施形態は、医薬的に許容される乳濁液、溶液、懸濁液、及びシロップを含めた経口投与用の液体剤形を提供し、このような剤形は、不活性希釈剤；アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤、及び懸濁化剤；ならびに甘味剤、香味剤、及び芳香剤を含めた他の構成成分を含むことができる。

制御放出経口用製剤が望ましい場合がある。薬剤は、拡散または浸出機構による放出を可能にする不活性マトリックス、例えばゴムの中に組み込むことができる。緩やかに変性するマトリックスを製剤に組み込んでもよい。制御放出の別の形態は、Ｏｒｏｓ治療システム（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．）に基づくものである。すなわち、薬物は、浸透圧効果によって水が侵入し単一の小開口部から薬物を押し出すことができる半透膜に封入する。

経口製剤については、放出の位置は、胃、小腸（十二指腸、空腸、もしくは回腸）、または大腸とすることができる。いくつかの実施形態において、この放出は、薬剤（もしくは誘導体）を保護することにより、または胃環境以外（例えば、腸内）で薬剤（もしくは誘導体）を放出することにより、胃環境の有害な影響を回避する。十分な胃の抵抗性を確保するには、少なくともｐＨ５．０まで不透過性であるコーティングが必須である。腸溶コーティングとして使用される、より一般的な不活性成分の例には、セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ ５０、ＨＰＭＣＰ ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ３０Ｄ（商標）、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ（商標）、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ（商標）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｓ（商標）、及びＳｈｅｌｌａｃ（商標）がある。これらのコーティングは、混合フィルムとして使用することができる。

３．局所投与用製剤
本開示の組成物は、局所適用することができる。局所投与用の製剤としては、限定されるものではないが、エアロゾル送達、皮膚パッチ、局所用ゲルまたはローションが挙げられる。

組成物は、約５ミクロン未満の空気力学的直径を有するエアロゾルまたは噴霧乾燥粒子として送達する場合、吸入しながら肺に送達し、肺上皮内層を横断して血流に移動させることができる。

治療製品を肺に送達するために設計された広範な機械的デバイスを使用することができ、このようなデバイスとしては、限定されるものではないが、ネブライザー、定量吸入器、及び粉末吸入器が挙げられ、これらの全ては当業者に周知されている。市販されているデバイスのいくつかの具体例としては、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）；Ａｃｏｒｎ ＩＩネブライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏ．）；Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器（Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，Ｎ．Ｃ．）；及びＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）がある。Ｎｅｋｔａｒ、Ａｌｋｅｒｍｅｓ、及びＭａｎｎｋｉｎｄはいずれも、承認済みまたは臨床試験中の吸入可能なインスリン粉末調製物を有しており、この技術は、本明細書で説明されている製剤に適用できると考えられる。

粘膜投与用の製剤は、典型的には噴霧乾燥した薬物粒子であり、錠剤、ゲル、カプセル、懸濁液、または乳濁液に組み込むことができる。標準的な医薬添加物は、任意の製剤業者から入手可能である。

経皮用製剤も調製することができる。経皮用製剤は、典型的には、軟膏、ローション、スプレー、またはパッチであり、これらの全ては、標準的な技術を用いて調製することができる。経皮用製剤は、浸透促進剤を含めることが必要となり得る。

４．制御送達ポリマーマトリックス
本明細書で開示される組成物は、制御放出製剤で投与することもできる。制御放出ポリマーデバイスは、ポリマーデバイスの留置（ロッド、シリンダー、フィルム、ディスク）または注射（マイクロ粒子）の後、全身に長期間放出するように作製することができる。マトリックスは、ミクロスフェアなどの微粒子の形態をとることができ、この場合、薬剤は固体ポリマーマトリックスまたはマイクロカプセル内で分散し、コアはポリマーシェルとは異なる材料であり、ペプチドは、事実上液体でも固体でもよいコア内で分散または懸濁している。本明細書で特に定義されない限り、マイクロ粒子、ミクロスフェア、及びマイクロカプセルは互換的に使用される。代替的に、ポリマーは、ナノメートルから４センチメートルの範囲の薄いスラブもしくはフィルムとして、粉砕もしくは他の標準的技術によって産生した粉末として、またはヒドロゲルなどのゲルとしてであっても、流延することができる。

非生分解性マトリックスも生分解性マトリックスも、融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする核酸の送達に使用することができるが、いくつかの実施形態では生分解性マトリックスの方が好ましい。これらは天然ポリマーであっても合成ポリマーであってもよいが、いくつかの実施形態では、分解及び放出プロファイルのキャラクタリゼーションがより良好であることにより、合成ポリマーの方が好ましい。ポリマーは、放出が所望される期間に基づいて選択される。いくつかの場合には線形放出が最も有用であり得るが、他の場合にはパルス放出または「バルク放出」がより有効な結果をもたらし得る。ポリマーは、ヒドロゲル（典型的には、最大約９０重量％の水を吸収する）の形態をとることができ、また任意選択で、多価イオンまたはポリマーで架橋することができる。

マトリックスは、溶媒蒸発、噴霧乾燥、溶媒抽出、及びその他の当業者に知られている方法によって形成することができる。生分解性ミクロスフェアは、薬物送達用のミクロスフェアを作製するために開発された方法（例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｒ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，５：１３－２２（１９８７）；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，６：２７５－２８３（１９８７）；及びＭａｔｈｉｏｗｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．，３５：７５５－７７４（１９８８）で説明されている方法）のいずれかを用いて調製することができる。

デバイスは、留置領域または注射領域を治療するために局所放出用に製剤化することができ、この場合、典型的には、全身治療（すなわち、全身送達）用の用量よりもはるかに少ない用量を送達する。このような製剤は、皮下、筋肉内、脂肪内に留置または注射しても、嚥下してもよい。

ＩＩＩ．使用方法
本開示の組成物及び方法は、宿主細胞または対象からのウイルスの治療及び不活性化に使用することができる。本発明の方法は、宿主生物から、宿主の遺伝物質の完全性を妨害することなく、ウイルスまたはその他の外来遺伝物質を除去するのに使用することができる。ヌクレアーゼを使用してウイルス核酸をターゲティングし、それによってウイルス複製もしくは転写を妨害することができ、またはさらに宿主ゲノムからウイルス遺伝物質を切り取ることもできる。ヌクレアーゼは、ウイルス核酸が細胞内に粒子として存在するとき、またはウイルス核酸が宿主ゲノム内に組み込まれているときに、宿主物質に作用することなくウイルス核酸のみを除去するように特異的に標的とすることができる。ウイルス核酸のターゲティングは、ヌクレアーゼが破壊するウイルスゲノム物質を標的とし、宿主細胞ゲノムを標的としない配列特異的部分（例えば、ガイドＲＮＡ）を用いて行われ得る。いくつかの実施形態において、共にウイルスゲノム物質を標的とし、ウイルスゲノム物質を選択的に編集または破壊する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が使用される。ＣＲＩＳＰＲは、ファージ感染から細菌を保護する細菌免疫系の天然の要素である。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体をウイルス標的配列に局在化させる。複合体の結合によって、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがウイルスゲノムの標的配列に局在化され、ウイルスゲノムを切断する。その他のヌクレアーゼ系も使用することができ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、または宿主の遺伝物質の通常機能を妨害することなくウイルス核酸を分解もしくは妨害するのに使用され得るその他の任意のヌクレアーゼ系がこれに含まれる。

組成物は、ウイルス生活環における任意の形態または任意の段階のウイルス核酸をターゲティングするのに使用することができる。ターゲティングされたウイルス核酸は、宿主細胞内に独立した粒子として存在し得る。好ましい実施形態において、ウイルス感染は潜伏性であり、ウイルス核酸は宿主ゲノム内に組み込まれている。任意の好適なウイルス核酸を切断及び消化の標的にすることができる。

ある特定の実施形態において、細胞または対象におけるウイルスを治療または不活性化する方法は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクトの治療有効量と、ウイルスゲノム内の標的核酸配列に対し相補性を有する少なくとも１つのガイドＲＮＡとを含む医薬組成物を、細胞に接触させることまたは対象に投与することを含む。

他の実施形態において、細胞または対象におけるウイルスの複製を阻害する方法は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸配列の治療有効量と、ウイルスゲノム内の標的核酸配列に対し相補性を有する少なくとも１つのガイドＲＮＡとを含む医薬組成物を、細胞に接触させることまたは対象に投与することを含む。

１つの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする本開示の核酸コンストラクトは、対象に投与され、核酸がヌクレアーゼに翻訳されるまで活性化されない。１つの実施形態において、核酸はｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは、所望のタンパク質の迅速な翻訳や迅速なクリアランスという利点を有すると同時に、ゲノム統合、垂直及び水平伝達、体内での長期間持続性などの安全性上の懸念を回避する。

ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクト及びガイドＲＮＡコンストラクトは、同時または順次送達することができる。１つの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクト及びガイドＲＮＡコンストラクトは、同じ医薬組成物で同時に送達される。別の実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクト及びガイドＲＮＡコンストラクトは、別々の医薬組成物で同時に投与される。また別の実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクト及びガイドＲＮＡコンストラクトは、順次投与される。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼコンストラクトをコードする核酸コンストラクトは、ガイドＲＮＡコンストラクトの１、２、３、４、５、６、７、８、１２、または２４時間前に投与することができる。

１つの実施形態において、本開示の組成物は、１日１回、１日２回、または１日３回、対象に投与することができる。別の実施形態において、組成物は、１週間に１回、１週間に２回、または１週間に３回、対象に投与される。

Ａ．治療対象となる疾患
１．ウイルス感染
本開示の組成物は、ウイルスに感染した対象におけるウイルス負荷を減少させるのに使用することができる。１つの実施形態において、本開示の組成物は、ウイルス負荷の減少に有効な量で、ウイルス感染を有する対象に投与される。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクト及びガイドＲＮＡコンストラクトは、同じ医薬組成物で、または２つの別々の組成物で、同時に投与することができる。別の実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクト及びガイドＲＮＡコンストラクトは、２つの別々の組成物で順次投与される。１つの実施形態において、対象は、活性化可能なヌクレアーゼ組成物を１、２、３、４、５、６、７、８週間、または８週間超投与される。対象のウイルス負荷が、もはや対象が感染していないことを示す範囲内であることをウイルス力価が示すまで、対象に活性化可能なヌクレアーゼ組成物を投与することができる。

本開示の組成物は、予防的に使用することができる。１つの実施形態において、本開示の組成物は、ウイルスに曝露した可能性があるがウイルスの症状を示さない対象、例えば、ウイルスのアウトブレイクまたはエピデミックが発生している地域に居住する対象に投与される。このような実施形態では、対象のウイルス感染を防止するのに有効な量の本開示の組成物を含む医薬組成物が、対象に投与される。１つの実施形態において、組成物は、ウイルスアウトブレイクの期間中、対象に投与される。組成物は、１日１回、１日２回、または１日３回、対象に投与することができる。別の実施形態において、組成物は、１週間に１回、１週間に２回、または１週間に３回、対象に投与される。

ａ．ＲＮＡウイルス
１つの実施形態は、その必要のある対象におけるウイルス感染を治療するまたは減少させる方法を提供する。１つの実施形態において、本開示の組成物は、ＲＮＡウイルスを治療するのに使用することができる。例示的な方法は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸コンストラクトと、ＲＮＡウイルス遺伝子を標的とする配列を有するガイドＲＮＡとを含む組成物を、その必要のある対象に投与することを含む。ヒトにおける疾患を引き起こす例示的なＲＮＡウイルスとしては、限定されるものではないが、西ナイルウイルス、エボラウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、デングウイルス、黄熱病ウイルス、インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、ハンタウイルス、マールブルグウイルス、ヘンドラウイルス、ニパ（Ｎｉｐｈａ）ウイルス、チクングニアウイルス、アデノウイルス、ヒトサル痘ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、リフトバレーウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、及びエンテロウイルスが挙げられる。

１つの実施形態は、プラス鎖ＲＮＡでウイルスを治療する方法を提供する。プラス鎖ＲＮＡを有するウイルスは、そのゲノムを直接ｍＲＮＡとして利用することができ、宿主リボソームによる翻訳は、分節化していないウイルスゲノムが細胞に侵入するとすぐに生じる。発現したウイルス遺伝子の１つは、プラス鎖ゲノムからマイナス鎖ＲＮＡを創出するＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ（またはＲＮＡレプリカーゼ）をもたらす。マイナス鎖ＲＮＡは、さらなるプラス鎖ＲＮＡの鋳型として使用することができ、このプラス鎖ＲＮＡはｍＲＮＡとして、または新たに形成されるウイルスのゲノムとして使用することができる。１つの実施形態において、ガイドＲＮＡコンストラクトは、ＲＮＡレプリカーゼのウイルス遺伝子を標的とする。

別の実施形態において、本開示の活性化可能なヌクレアーゼは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスを治療するのに使用することができる。マイナス鎖ＲＮＡウイルスには、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、及びエボラウイルスなど多くのメンバーが含まれる。マイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムは直接ｍＲＮＡとして使用することができないため、ウイルスはカプシド内にＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼを保有しなければならない。宿主細胞に侵入すると、ポリメラーゼが生成したプラス鎖ＲＮＡは、タンパク質産生用のｍＲＮＡとして使用される。１つの実施形態において、ガイドＲＮＡは、ウイルスのゲノムＲＮＡ（マイナス鎖）、プラス鎖中間体、またはメッセンジャーＲＮＡを標的とするように設計される。

ｂ．ＤＮＡウイルス
別の実施形態において、本開示の組成物は、ＤＮＡウイルスを治療または防止するのに使用することができる。例示的なＤＮＡウイルスとしては、限定されるものではないが、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、及びパルボウイルスが挙げられる。ＤＮＡウイルスは、カプシドと呼ばれるタンパク質を含む外殻によって保護された一連のＤＮＡ遺伝子から構成される。カプシドは、宿主内に侵入するとＤＮＡ遺伝子を保護する。感受性細胞に侵入すると、ビリオンは分解されてウイルスゲノムを細胞内に放出し、その時点でウイルスＤＮＡ内の遺伝子が転写され、ウイルスのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）が産生される。ｍＲＮＡは、宿主の正常な細胞機能の改変を担うタンパク質に翻訳される。１つの実施形態において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする本開示の核酸コンストラクトは、タンパク質に翻訳される前のＤＮＡウイルスのｍＲＮＡを標的とする。

実施例１．Ｃａｓ１３ａはｃｒＲＮＡ及び標的ＲＮＡが共に存在する場合にＲＮＡを切断する
材料及び方法：
Ｃａｓ１３ａコンストラクトの設計及び合成：レプトトリキア・ブッカリス（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓ）配列由来のＣａｓ１３ａを、Ａｄｄｇｅｎｅ ｐ２ＣＴ－Ｈｉｓ－ＭＢＰ－Ｌｂｕ＿Ｃ２Ｃ２＿ＷＴ（プラスミド番号８３４８２）から得た。ｐＭＡ７ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）において、野生型Ｃａｓ１３ａをＶ５タグと共にクローニングし、マウスアルファグロビン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０８３９５５）由来の３’ＵＴＲを付加した。また、Ｖ５タグをコードするｇＢｌｏｃｋｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、Ｃａｓ１３ａコンストラクトに核局在化配列（３’及び５’）ならびにＶ５タグを付加して、Ｃａｓ１３ａ－Ｖ５－ＮＬＳバージョンを作成した（図１Ａの概略図）。

Ｎｏｔ－Ｉ ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を一晩用いてプラスミドを線状化し、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＰＣＲ精製してから、製造業者の指示に従ってＴ７ ｍＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ ｍＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｌｌ Ｓｃｒｉｐｔ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を行った。等モル比のＡＴＰ、ＧＴＰ、及びＣＴＰを、Ｎ_１－メチルプソイドウリジン－５′－三リン酸（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に使用した。２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼを用いてＲＮＡにキャップを付け、続いてポリＡテールを付加した（いずれも製造業者の指示に従った）。次いで、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｍＲＮＡを精製し、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で１時間処理し、再度精製した。精製したｍＲＮＡのＲＮＡ濃度を測定し、さらなる使用まで－８０℃で保存した。翻訳効率を高めかつ自然免疫応答を軽減するように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写プロセス中にｍＲＮＡを修飾した。

ＤＮＡ二重鎖を用いたｃｒＲＮＡ合成：Ａ型インフルエンザウイルスＷＳＮ／３３（ＩＶＡ）に対応する複数のｃｒＲＮＡ（ＣＲ）及び標的ＲＮＡ（ｔｒＲＮＡまたはＴＲ）を設計し、合成するか（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）または施設内でｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、精製した（表１）。当該ｃｒＲＮＡは、Ｌ．ｂｕｃｃａｌｉｓ Ｃａｓ１３ａが特異的に認識する保存的なダイレクトリピート（ＤＲ）からなる。

（表１）インフルエンザウイルス遺伝子由来のｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列（ＣＲ）及びそれぞれの標的ＲＮＡ配列（ＴＲ）。

ＮＥＢ ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて、ＤＮＡ二重鎖（表２）をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写した。ＲＮＡは、１μｇのＤＮＡ二重鎖鋳型、ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ各１０ｍＭ）、１０×反応緩衝液、Ｔ７ポリメラーゼを用いて合成し、３７℃で１６時間インキュベートした。この２０μｌの反応体積に対し、１μｌのＤＮａｓｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加し、３７℃で１５分間インキュベートし、次に７５℃で１０分間熱不活性化した。ＲＮＡを等体積の２×ＲＮＡローディング色素と混合し、６５℃で５分間加熱し、直ちに氷上に１０分間置いた後、それを電気泳動用に１５％ ＴＢＥ－ウレアゲル（Ｎｏｖｅｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にロードした。ゲルをＳＹＢＲ（商標）ｇｏｌｄ核酸ゲル染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３０分間染色した。ＲＮＡゲルをＵＶ照射下でゲルから切り取り、１ｍＬゲル溶出緩衝液に入れた。切り取ったゲルを－８０℃で凍結し、次に水浴中６５℃（１０分）で解凍し、これをさらに２回繰り返した。ＲＮＡ洗浄及び濃縮装置（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてゲル溶出緩衝液からＲＮＡを精製した。

（表２）インフルエンザ及びＲＳＶ遺伝子由来のｃｒＲＮＡ（ＣＲ）をコードするＤＮＡ二重鎖のヌクレオチド配列

ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳されたＣａｓ１３ａのＲＮＡ切断活性：
様々なｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡに対するＣａｓ１３ａ活性を評価するため、ウサギ網状赤血球ライセート系を製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）の指示に従って用いて、Ｃａｓ１３ａ ｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳した。ＲＮａｓｅＡｌｅｒｔ（登録商標）－１基質を、Ａ５４９細胞ＲＮＡ（１００ｎｇ）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ＢＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）、酵母ｔＲＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）、０．０１％ Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０、及び５％グリセロール１９からなるＲＮＡ処理緩衝液中のｃｒＲＮＡ（５００ｎＭ）、ｔｒＲＮＡ（５００ｎＭ）と混合した。この混合物を、９６ウェルプレートウェル中の翻訳されたＣａｓ１３ａライセート（５μｌ）に低温で添加し、ピペットを用いてウェルを混合した。全ての試薬調製及び添加は氷上で行った。蛍光測定値（励起４８５±２０ｎｍ／発光５２８±２０ｎｍ）を室温で１０分間隔で９０分間記録した。次いで、ＲＮＡ切断産物（最終産物）を１５％ウレアＴＢＥゲルで泳動した。ゲルをＳＹＢＲｇｏｌｄで３０分間染色し、ＵＶ照射下で可視化した。

細胞株及びウイルス：全ての細胞株及びウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ．Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。ヒト肺上皮細胞Ａ５４９（ＣＣＬ１８５）、ＭＤＣＫ、及び正常ヒト初代気管支／気管上皮細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ－３００－０１０（商標））をＡＴＣＣ推奨の培地で成長させた。インフルエンザウイルスストックはＭＤＣＫ細胞内で調製し、ＲＳＶストックはＨＥｐ－２細胞内で調製した。インフルエンザウイルスについて簡潔に説明すると、ＭＤＣＫ細胞を１７５ｍｍ_２中で１００％コンフルエンスまで成長させ、翌日、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ウイルスの１：１０００希釈物を５ｍｌのＥＭＥＭに添加した。次いで、細胞をロッカー上で室温で１時間、ウイルスと共にインキュベートした。次いで、２５ｍｌの培地を細胞に添加した。細胞を７２時間、または細胞変性効果が重度になるまで観察した。１０００ｘｇで１０分間細胞を遠心分離することによってウイルスを回収した。標準的なプラークアッセイによってウイルス力価を決定した。ＲＳＶストック調製については、ＨＥｐ－２細胞をコンフルエントになるまで培養し、３ｍｌのウイルスストックをロッカー上で室温で１時間インキュベートした。次いで、７ｍｌのＤＭＥＭを細胞に添加し、５～６日間、または完全な細胞変性効果が見られるまでインキュベートした。１０００ｘｇで１０分間細胞を遠心分離することによって上清からウイルスを回収した。標準的なプラークアッセイによってウイルス力価を決定した。

ｍＲＮＡ形質移入の最適化：
Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏｓ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及びＶｉｒｏｍｅｒ Ｒｅｄ（Ｌｉｐｏｃａｌｙｘ ＧｍｂＨ）の形質移入法に対し、ＭＤＣＫ及びＡ５４９細胞株におけるＣａｓ１３ａ ｍＲＮＡの形質移入をアッセイした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００及びＶｉｒｏｍｅｒ Ｒｅｄ形質移入実験については、細胞をカバーガラス（１２ｍｍ）上に一晩播種し（１２５，０００細胞／ウェル）、翌日、各製造業者のプロトコルに従って１μｇのＣａｓ１３ａ ｍＲＮＡを形質移入した。Ｎｅｏｎ（登録商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍについては、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍのＡ５４９及びＭＤＣＫ用の組込みプログラムを用いて細胞に１μｇのＣａｓ１３ａ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、培地を含むカバーガラス上に播種した。形質移入細胞を、形質移入から２、４、６、１６、及び２４時間後に４％パラホルムアルデヒドで固定した（１０分）。細胞をトリトンＸ－１００（０．１％）で５分間透過処理した後、５％のＢＳＡで１時間ブロックした。ウサギ抗Ｖ５（Ａｂｃａｍ ａｂ９１１６）一次抗体及びロバ抗ウサギＡ４８８（Ａ２１２０６ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）二次抗体を、それぞれ１時間インキュベートした。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｕｌｔｒａｖｉｅｗ ＥＲＳ Ｓｐｉｎｎｉｎｇ Ｄｉｓｋ顕微鏡で細胞を可視化した。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗ウイルスアッセイ：２４ウェルプレート内で、ダルベッコ最小必須培地中で成長するＡ５４９細胞に、Ｖｉｒｏｍｅｒ Ｒｅｄを用いて、Ｃａｓ１３ａをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）及びｃｒＲＮＡ（１００ｎＭ）または非標的ｃｒＲＮＡ（ＮＴ－ＣＲ）（１００ｎＭ）を形質移入した。４時間の形質移入後、０．０１のＭＯＩまたは０．１のＭＯＩのＡ型インフルエンザウイルスＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）を細胞に添加した。形質移入の２４／４８／７２時間後にＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔを用いて総ＲＮＡを抽出した。ｈｉｇｈ－ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標），Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｃＤＮＡを調製した。Ｃａｓ１３ａ系の抗ウイルス活性を、全ての処置群のウイルス遺伝子（表３）に対し測定した。また、上記と同じ実験設定でウイルス阻害も顕微鏡的に観察されたが、細胞はカバースリップ上に播種されていた。Ｃａｓ１３ａ媒介性ＩＶＡ阻害の活性は、経時的免疫蛍光法及び蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためのＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ推奨のプロトコルを用いて実証した。次いで、細胞に対し、１：２５０抗Ｖ５タグＡｂ（Ａｂｃａｍ ａｂ９１１６）及び１：５００抗Ｍ２タンパク質Ａｂ（Ａｂｃａｍ ａｂ５４１６）を用いてＣａｓ１３ａ－Ｖ５及びＩＶＡ Ｍ２タンパク質をプローブし、続いてＩＶＡゲノムを標的とするＦＩＳＨプローブを行った（表４）。

（表３）本試験で使用したプライマー及びプローブ（５’→３’）。

（表４）インフルエンザウイルスＡ（ＷＳＮ／３３）を標的とする、Ｑｕａｓｅｒ（登録商標）６７０色素で標識した蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）Ｓｔｅｌｌａｒｉｓ（登録商標）プローブ

ＩＶＡに対するＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡ系を異なる条件下で評価してその有効性を決定した。最初にＡ５４９細胞をＩＶＡ（ＭＯＩ ０．０１）に４時間感染させ、次いで細胞を洗浄し、その後にＶｉｒｏｍｅｒ Ｒｅｄを用いてＣａｓ１３ａ（１μｇ）及びｃｒＲＮＡ（１００ ｎＭ）を形質移入した。感染から２４／４８／７２時間後にＲＮＡを抽出した。別の実験設定では、細胞にＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡを２４時間形質移入し、次いでＩＶＡ（ＭＯＩ ０．０１）で８時間感染させ、ＲＮＡをこれらの細胞から細胞を抽出した。上述のようにｃＤＮＡ及びｑＰＣＲを実施した。

プラークアッセイ：
Ｃａｓ１３ａ ｍＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ（ＲＳＶ＿１．１及びＲＳＶ＿ｍ１．１）ならびにＲＳＶで処置した細胞からの上清を１４０００ｘｇで５分間遠心分離した。上清を収集し、２４ウェルプレート内のＶｅｒｏ細胞単層上に５０μｌ／ウェルを１時間（１５分毎に断続的に揺動）置いた。単層に、２％ ＦＢＳならびに１００Ｕ ｍＬ－１ペニシリン及び１００ｍｇ ｍＬ－１ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を伴った２×ＤＭＥＭ中２．４％ Ａｖｉｃｅｌ（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ ＲＣ－４８１）を１：１の比で含むＡｖｉｃｅｌ－ＤＭＥＭオーバーレイ培地を添加し、６日間インキュベートした。培地を除去し、１×ＰＢＳで洗浄した後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。細胞を３７℃で５％ ＢＳＡで３０分間ブロックし、続いて３７℃で抗ＲＳＶ（ヤギポリクローナル）一次抗体で染色した。３０分後、細胞を洗浄し、ＨＲＰ結合体化二次抗体（ロバ抗ヤギ）を３７℃で３０分間インキュベートした。ＴｒｕｅＢｌｕｅ（商標）ペルオキシダーゼ基質を用いて室温で１０分間、プラークを展開した。ＴｒｕｅＢｌｕｅを除去し、細胞を水ですすぎ、プラークを風乾し、カウントした。

ＩＶＡ感染中のＣａｓ１３ａ形質移入細胞のＲＮＡシークエンシング：ＲＮＡ－Ｓｅｑ実験については、一晩成長させたＡ５４９細胞に、Ｖｉｒｏｍｅｒ Ｒｅｄを用いたＣａｓ１３ａ（１μｇ）及びｃｒＲＮＡ（１００ ｎＭ）を形質移入し、４時間後に細胞をＩＶＡ（ＭＯＩ ０．０１）に感染させ、対照として、形質移入細胞のセットを非感染のまま維持した。形質移入の８時間後及び２４時間後に、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ての処置群からＲＮＡを抽出した。ｇＰＢ１及びｍＰＢ１ ｃｒＲＮＡ処置群におけるＩＶＡ ＰＢ１コピーの減少を確認した後に、ＲＮＡ試料をＲＮＡ－Ｓｅｑに使用した。ＲＮＡを定量化し、次いでＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ｒＲＮＡ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてｒＲＮＡを枯渇させた。ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ＩＩ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）を用いてＲＮＡライブラリーを調製した。これらのライブラリーをＱｕｂｉｔ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量化し、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で完全性を満たしたら、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００上で、ペアエンド７５、ｍｉｄ ｏｕｔｐｕｔランで試料をシークエンシングした。Ｂｏｗｔｉｅ２を用いてリードを参照ヒトゲノムＵＣＳＣ（ｈｇ３８）とアラインメントし、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓを用いて対照及び処置試料における転写物の差次的遺伝子発現を比較した。重要な遺伝子の差次的発現におけるｌｏｇ２値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて表した。

統計解析：全ての実験は、生物学的３連の平均として表される。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０４を用いて全てのデータを解析した。統計解析は、適切な仮説検定と共に通常の一元配置または二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて群間で実施し、個別の図面の見出しで説明されている。

結果：
ウサギ網状赤血球ライセートを用いて、Ｃａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ（核局在配列を有するバージョン）ｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳し、これを使用して、ＩＶＡ ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡと連携した発現Ｃａｓ１３ａタンパク質のＲＮＡ切断活性を評価した（図１Ａ）。ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、ＩＶＡのゲノム分節に由来した（表１）。ＲＮａｓｅＡｌｅｒｔ（商標）基質蛍光をＲＮＡ切断の出力とした。Ｃａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ａ－ＮＬＳによるＲＮＡ切断によって生じた蛍光は、それぞれ最初の１０分間及び２０分間に最大まで増加し、次いで、標的ＲＮＡが枯渇したために経時的に徐々に減少した。ＲＮＡ切断の全体的な傾向は、Ｃａｓ１３ａ（図１Ｂ）及びＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ（図１Ｃ）で共に類似した。ＲＮＡ切断は、１５％ ＴＢＥ－ウレアゲルを用いてゲル電気泳動によってライセートを調べたときにも観察された（図１Ｄ及び１Ｅ）。これらの結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳Ｃａｓ１３ａ媒介性のＲＮＡ切断が特異的であり、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡ両方が存在する場合にのみ生じたことを示している。ｃｒＲＮＡ、ＮＴ－ＣＲ、またはＣａｓ１３ａ ｍＲＮＡは、単独では標的ＲＮＡを切断しない。これらの結果は、精製したＣａｓ１３ａタンパク質を使用したときの特異的活性化という過去の知見（Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５３８：２７０－２７３（２０１６））を確証するものである。Ｃａｓ１３ａ活性をアッセイするための切断緩衝液中に酵母ｔＲＮＡまたは細胞ＲＮＡが存在した場合、蛍光または切断されたＲＮＡ産物が生じず、これにより、標的ＲＮＡに対するＣａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡの特異性が示された。これらの設計されたｃｒＲＮＡは、対応するｔｒＲＮＡが存在する場合にのみ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳されたＣａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ａ－ＮＬＳによるＲＮＡ切断を示した（図２Ａ～２Ｋ及び３Ａ～３Ｈ）。

実施例２．ｍＲＮＡ形質移入の最適化
結果：
次いで、インフルエンザ感染の細胞モデルでＣａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ系を評価した（図４Ａ）。ＭＤＣＫ及びＡ５４９細胞株において、形質移入剤、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ、及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を用いたｍＲＮＡ送達、ならびにＮｅｏｎ（登録商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを用いたエレクトロポレーションによるｍＲＮＡ送達を評価した。Ｃａｓ１３ａ発現を２、４、６、１６、及び２４時間時点で評価した（図５Ａ～５ＩＩ）。Ｃａｓ１３ａ発現は、全ての形質移入剤及び細胞タイプにおいて、形質移入から２時間後という早期に観察された。しかし、形質移入から１６時間後、Ｃａｓ１３ａ発現は、Ｎｅｏｎ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００で形質移入した全ての細胞株で減少した。Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ形質移入細胞は、２４時間時にも発現を示した。この結果に基づき、以後の実験にはＶｉｒｏｍｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ及びＡ５４９細胞株を選択した。免疫蛍光法を用いると、Ｃａｓ１３ａが主に細胞質内に局在していたのに対し、Ｃａｓ１３ａ－ＮＬＳは細胞質（Ｃａｓ１３ａがまだ合成中であるため）と、４８時間時には核内と、両方に存在することが観察された（図４Ｂ～４Ｋ）。

実施例３．様々なＩＶＡ分節を標的とするｃｒＲＮＡのスクリーニング
結果：
ＩＶＡのポリメラーゼ（ＰＢ１）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、ならびに核外輸送タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）、ならびにＭ２タンパク質を含めたＩＶＡの様々なゲノム分節を標的とするｃｒＲＮＡを設計した（図６Ａ～６Ｃ）。Ｃａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ａ－ＮＬＳのｍＲＮＡ及び各ｃｒＲＮＡをＡ５４９細胞に同時形質移入し、次に当該細胞をインフルエンザウイルスに感染させた（感染多重度ＭＯＩ ０．０１）。ポリメラーゼがＩＶＡ複製に不可欠なタンパク質であることを考慮し、ポリメラーゼ構成成分ＰＢ１を標的とするいくつかのｃｒＲＮＡを設計した。最初に、これらのｃｒＲＮＡをＣａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ａ－ＮＬＳの両方で試験した。試験したｃｒＲＮＡのうち、ｇＰＢ１が、ＰＢ１遺伝子コピー減少に最も効果的であった。他のＩＶＡ遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡを試験したところ、ＰＢ１遺伝子コピーの有意な減少が観察され、このことからウイルス感染性に対する全体的な効果が示唆された。ＩＶＡは核内に局在するため、Ｃａｓ１３ａを核局在化シグナル（ＮＬＳ）ありまたはなしで試験した。

試験した全てのｃｒＲＮＡのうちｇＰＢ１の場合に、最も高い阻害がＣａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ａ－ＮＬＳの両方において見られ、７２．４５％及び７１．９％の阻害が認められた（図６Ｂ）。ＰＢ１を標的としない他のｃｒＲＮＡもＰＢ１コピーを減少させたが、より小さな程度であった。非ＰＢ１ ｃｒＲＮＡのうち、ＨＡ１．１は、Ｃａｓ１３ａにおいて２７．７％、Ｃａｓ１３ａ－ＮＬＳにおいて４９．８７％、ＰＢ１コピーを減少させた（図６Ｃ）。

Ｃａｓ１３ａとＣａｓ１３－ＮＬＳとの間の有意差は、ｇＰＢ１及びＰＢ１＿４．１の場合には観察されなかった。しかし、他の全てのｃｒＲＮＡでは、Ｃａｓ１３ａ－ＮＬＳの方が有効であった。Ｃａｓ１３ａとＣａｓ１３－ＮＬＳとの間の有意差は、ウイルスゲノムが、核内に高度に局在することにより、Ｃａｓ１３ａ－ＮＬＳ及びｃｒＲＮＡによって容易にターゲティングされる、初期感染の間にアッセイが実施されたという事実によって説明される。Ｃａｓ１３ａにＮＬＳがある場合もない場合も、全てのｃｒＲＮＡのうちｇＰＢ１が最も有効であった。

これらのｃｒＲＮＡがＰＢ１遺伝子に及ぼす影響を評価した後、それらの親遺伝子に及ぼす影響を評価した。このために、Ｃａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ及び様々なｃｒＲＮＡを細胞に形質移入し、次いでＩＶＡを感染させた。翌日、（ｃｒＲＮＡが標的とした）親ウイルス遺伝子のコピー数の減少率（％）を、感染のみの対照と比較して解析した。この場合も、ｇＰＢ１ ｃｒＲＮＡを使用した場合にＰＢ１遺伝子コピー数の最も大きな減少が観察され、７５％の減少であったのに対し、他の全てのｃｒＲＮＡは、それぞれの遺伝子のコピー数においてほぼ５０％の減少を示した（図６Ｄ及び６Ｅ）。

これらのｃｒＲＮＡがその親遺伝子コピー数に影響を及ぼすかどうかをさらに確認するため、図６Ａで説明されているように細胞に形質移入し感染させた後にＲＴ－ｑＰＣＲを実施した。最も効率的なｃｒＲＮＡはＮＡ１．１であり、特にＣａｓ１３ａ－ＮＬＳと共に使用したときに効率的であった（図６Ｄ）。ＰＢ１を標的とするｃｒＲＮＡの、それらの親遺伝子を阻害する能力を調べた。試験したｃｒＲＮＡのうち、最も高い阻害は、Ｃａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ａ－ＮＬＳの両方におけるｇＰＢ１（７９％）であり、その次がＣａｓ１３ａを用いた場合のＰＢ１＿３．１（６２．９％）であった。

これらの結果から、試験した中ではｇＰＢ１配列がＩＶＡに対して最も有効なｃｒＲＮＡであることが証明され、そのためさらなる実験ではこれを使用した。

実施例４．ｃｒＲＮＡはＩＶＡ ｍＲＮＡを標的とするようにプログラムできる
結果：
スクリーニングした全てのｃｒＲＮＡの中で、ＰＢ１ゲノム分節を標的とするｃｒＲＮＡ（ｇＰＢ１）は、ウイルスＲＮＡコピー数を最も効率的に減少させ（図６Ｂ及び６Ｅ）、他のウイルスタンパク質に影響を及ぼすことが分かった。このことをｉｎ ｓｉｔｕで実証するため、Ｃａｓ１３ａ、ＩＶＡ Ｍ２タンパク質（ウイルス集合または分解部位２４を示す）に対する免疫蛍光法を実施し、次にＩＶＡゲノム可視化のために蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を実施した。Ｃａｓ１３ａまたはＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ ｍＲＮＡのいずれかと、ＰＢ１部位を標的とするｃｒＲＮＡ（ｇＰＢ１、及びＰＢ１ ｍＲＮＡを標的とするｍＰＢ１）とを形質移入した細胞は、ＩＶＡ感染の減少を示すＭ２タンパク質の減少（図７Ａ～７Ｈ）と、サイトゾル内のウイルス感染部位へのＣａｓ１３ａの局在化とを示した。このデータから、ポリメラーゼ遺伝子を標的とすることにより、他のウイルスタンパク質を阻害し、そのためより高い阻害効果を達成できたことが明らかである。

実施例５．ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡ用量及びウイルス感染の最適化
結果：
Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡの用量応答アッセイ
細胞におけるＩＶＡ阻害に要するＲＮＡ用量を決定するため、Ｃａｓ１３ａ ｍＲＮＡ及びｇＰＢ１（ｃｒＲＮＡ）の濃度を試験した。Ｃａｓ１３ａ ｍＲＮＡ及びｇＰＢ１の濃度を増加して形質移入した細胞は、ＩＶＡ感染の逆比例を示した。用量依存的ＩＶＡ阻害は２００ｎＭのｇＰＢ１まで観察され、ｃｒＲＮＡをさらに増加してもＩＶＡ感染は減少しなかった。最も低い組合せ（Ｃａｓ１３ａ ｍＲＮＡ（０．５μｇ）及びｇＰＢ１（２５ｎＭ））ならびに最も高い組合せ（Ｃａｓ１３ａ ｍＲＮＡ（３μｇ）及びｇＰＢ１（３００ｎＭ））において、ＩＶＡ感染は、それぞれ０．３５ｌｏｇ（５５％）及び０．４８ｌｏｇ（６６％）ＰＢ１コピー減少した（図８Ａ～８Ｂ）。最も大きな阻害は、２μｇのＣａｓ１３ａ及び１００ｎＭのｇＰＢ１で見られた（７６．７８％）。しかし、適度でありその上効率的なＣａｓ１３ａ ｍＲＮＡ（１μｇ）及びｇＰＢ１（１００ｎＭ）の用量を、以後の全ての細胞におけるＩＶＡ実験に使用した。

Ａ５４９細胞におけるウイルス感染の最適化
次に、Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ系の性能をキャラクタリゼーションするため、多くの実験条件を調べた。ＭＯＩの効果を評価し、ＰＢ１を標的とするＣａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡは、形質移入から２４時間後にインフルエンザウイルス遺伝子コピーを０．７７～１．２６ｌｏｇ（２１％～７２．４％）減少できることが示された（図８Ｂ）。ＭＯＩ ０．０１（図８Ｃ）及び０．１（図８Ｄ）（いずれも生理的に適切なＭＯＩである）でｇＰＢ１を試験することにより、最適なウイルス力価を評価した。ＭＯＩ ０．０１における阻害は、ｇＰＢ１、ｍＰＢ１、及びｇＰＢ１＋ｍＰＢ１についてそれぞれ８５．８％、８６．６％、及び９２．５％であった。同様に、ＭＯＩ ０．１におけるＰＢ１コピー数の減少は、ｇＰＢ１、ｍＰＢ１、及びｇＰＢ１＋ｍＰＢ１についてそれぞれ８６．７％、８３．１％、及び９４．５％であった。

実施例６．Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ形質移入細胞は、用量及び時間依存的にＩＶＡ感染を減少させた。
結果：
感染中におけるウイルスＲＮＡの時間依存的分解を調べた（図１０Ａ）。ｇＰＢ１またはｍＰＢ１のいずれかを標的とすることにより、Ｃａｓ１３ａ（図１０Ｂ）及びＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ（図１０Ｃ）の両方において、ウイルスコピーは２４時間時に０．９６～１．２１ｌｏｇ（８９．２％～９３．９％）、４８時間時に１．８８～２．６ｌｏｇ（９８．６％～９９％）減少したが、さらに７２時間時にウイルスＲＮＡコピーは３．５３～３．８ｌｏｇ（９９．９７％～９９．９８％）減少した。Ｃａｓ１３ａの持続的効果はＩＶＡ複製を妨げ、ウイルスＲＮＡコピーを最大７２時間減少させるため、このデータは注目に値する。

実施例７．Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ系は前感染細胞におけるＩＶＡ感染を減少させる。
結果：
Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ系が、シミュレートされた「予防的方式」でＩＶＡ感染を軽減することから、既にＩＶＡに感染した細胞の感染を減少させるＣａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ系の能力を評価した。ＩＶＡ（ＭＯＩ ０．０１）に４時間感染させた細胞に、その後、Ｃａｓ１３ａ／Ｃａｓ１３ａ－ＮＬＳ ｍＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ（ｇＰＢ１及びｍＰＢ１）を形質移入し（図１０Ｄ）、ＩＶＡに対する効果を７２時間モニターした。形質移入から４８時間後のＣａｓ１３ａ（図１０Ｅ）またはＣａｓ１３ａ－ＮＬＳ（図１０Ｆ）でＩＶＡコピー数の最大０．７４ｌｏｇ（８３．３％）の減少が観察され、７２時間後には１．４７ｌｏｇ（９３．９％）の減少が観察された。ＩＶＡ感染に対するＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡの効率は、細胞にＣａｓ１３ａ ｍＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを２４時間形質移入し（Ｃａｓ１３ａの発現減少が予測される）（図１０Ｇに基づく）、次いでインフルエンザウイルスに８時間感染させることによって評価した（図１０Ｈ）。この条件下では、依然として最大０．３ｌｏｇ（６３％）のＩＶＡの減少が観察され、したがって、Ｃａｓ１３ａ媒介性ＩＶＡ標的指向性のロバストネスを強調するものであった。同様に、持続的感染がＣａｓ１３ａ媒介性ＲＮＡ標的指向性に及ぼす効果を評価した。ここでは、細胞を２４時間感染させ、次に形質移入し、形質移入から８時間後のウイルスコピー数を評価した（図１０Ｉ）。この場合も、ウイルス力価における最大４９％の有意な減少が観察された（図１０Ｊ）。したがって、これらの実験から、Ｃａｓ１３ａが予防的治療及び感染後治療の両方においてＩＶＡ阻害に有効であることが示された。また、正常なヒト初代気管支／気管上皮細胞モデルにおいて、Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ系がＩＶＡを最大６２％有効に阻害することも観察された（図９）。形質移入の効率が細胞タイプによって異なることから、Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡによるＩＶＡの阻害も細胞タイプによって異なる。一次細胞は通常は形質移入が困難であるが、ここでは、このアプローチがヒト一次細胞に適用できるという概念実証が示される。

実施例８．Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡは、ｈＲＳＶ感染のような他のウイルスを標的とするようにプログラムできる。
結果：
Ｃａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡ系は、特異的ｃｒＲＮＡの設計を通じて様々なウイルス性病原体を標的とする可能性をもたらす。これを実証するため、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のゲノム（ｇＲＳＶ）及びＭ２ ｍＲＮＡ（ＲＳＶ－Ｍ２）の両方に対してｃｒＲＮＡを設計した。Ｃａｓ１３ａ ｍＲＮＡ及び両方のｃｒＲＮＡを形質移入した細胞は、予防（図１１Ａ～１１Ｂ）及び感染後（図１１Ｃ～１１Ｄ）の両方でＲＳＶ力価の減少を示した。Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡを感染前に投与したときには、最大０．５５ｌｏｇ（７１％）の減少が認められた（図１０Ｂ）。しかし、形質移入前にＲＳＶに感染させた場合、Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡは、一緒にもたらされたｇＲＳＶ及びｍ１．１におけるＲＳＶ力価を０．３～０．４４ｌｏｇ（６３．５％）減少させ、一方、個別にもたらされたゲノム（ｇＲＳＶ）及びＲＳＶ ｍＲＮＡ（ＲＳＶ－Ｍ２）を標的とするｃｒＲＮＡの場合、ウイルス力価は、それぞれ５１．３％及び４９．７％であった（図１０Ｄ）。ｈＲＳＶにおいて予防による約７１％のノックダウンが観察されたが、これらのデータはＭ２／Ｌ遺伝子末端配列のみに基づく第一世代ガイドで得られたことに注意すべきである。これらの結果は、天然の感染よりも著しく高いＭＯＩ １において阻害が見られるため、有望である。加えて、Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡを投与した細胞では、プラークの数が減少しただけでなく、プラークのサイズも減少した。このことは、細胞間の拡散が少ないことと、より多くの干渉性欠陥（ＤＩ）粒子が生成される可能性とを示すものである。全体としては、ｈＲＳＶゲノム及びｍＲＮＡに対する将来的なバイアスなしのガイドスクリーニングはノックダウンの改善をもたらす可能性があるため、この結果単独でも極めて有望である。これらの知見は、いくつかのウイルス性病原体に適用可能な見込みのある、抗ウイルスアプローチとしてのＣａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡシステムの可能性を示すものである。

実施例９．Ｃａｓ１３ａが媒介するオフターゲットＲＮＡ切断は検出されなかった。
結果：
Ｃａｓ１３ａ活性は、ＩＶＡ ＲＮＡの切断において特異的であり、いかなる検出可能なオフターゲットＲＮＡ切断ももたらさなかった。送達から８及び２４時間にＣａｓ１３ａ ｍＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ（ＰＢ１）を形質移入した細胞のトランスクリプトームプロファイルは、ＩＶＡ感染の有無にかかわらず、ｍＲＮＡレベルにおける内在性遺伝子発現に有意な変化を示さなかった（図１２Ａ～１２Ｌ）。同様に、オフターゲット活性なしの特異的な内在性ｍＲＮＡノックダウンは、過去にＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ Ｃａｓ１３ａ（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５５０：２８０－２８４（２１０７））で報告されている。進行中の転写及びＣａｓ１３ａ媒介性分解は、遺伝子発現の有意な変化を推測するのに互いを打ち消す可能性があるため、Ｃａｓ１３ａにおける任意の考えられるオフターゲット活性をＲＮＡ－Ｓｅｑによって決定するのは困難であり得るという議論も考えられる。しかし、Ｌｂｕ Ｃａｓ１３ａは、ＲＮＡ結合（ｃｒＲＮＡ及び標的ＲＮＡ）ならびにＲＮａｓｅ活性という別個の活性を有する。Ｃａｓ１３ａはミスマッチのｃｒＲＮＡ－標的に結合することができるが、ＲＮＡ切断はもたらさない（Ｔａｍｂｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，２４：１０２５－１０３６（２０１８））。ＲＮａｓｅ活性は、ｃｒＲＮＡ及び標的ＲＮＡが相補的であるときにのみ活性化されるため、Ｃａｓ１３ａのオフターゲット活性は除外され得る。

以上の明細書では、本発明を本発明のある特定の実施形態と関連させて説明し、多くの詳細を例示の目的で示してきたが、本発明には追加の実施形態の余地があること、そして本明細書で説明されている詳細のいくつかは、本発明の基本原理から逸脱することなくかなりの程度で変動し得ることは、当業者にとっては明らかであろう。

本明細書で引用されている全ての参考文献は、その全体が参照により援用される。本発明は、その趣旨または本質的な属性から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化することができ、したがって、本発明の範囲を示すものとしては、上記の明細書ではなく、添付の特許請求の範囲を参照すべきである。

Claims (13)

1. ＲＮＡウイルスをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで不活性化するための組成物であって、
   ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸コンストラクトと、
   ＲＮＡウイルスゲノム内の標的核酸配列に相補的な少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コンストラクトと
   を含み、
   該単離核酸コンストラクトがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の配列を有する、組成物。
2. ＲＮＡウイルスをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで不活性化するための組成物であって、
   ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸コンストラクトと、
   ＲＮＡウイルスゲノム内の標的核酸配列に相補的な少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コンストラクトと
   を含み、
   該単離核酸コンストラクトがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載の配列を有する、組成物。
3. 前記単離核酸コンストラクトが核局在化配列をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
4. 前記ＲＮＡウイルスがインフルエンザウイルスまたは呼吸器合胞体ウイルスである、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
5. 前記ＲＮＡウイルスがマイナス鎖ＲＮＡウイルスである、請求項１または２に記載の組成物。
6. 前記ＲＮＡウイルスがプラス鎖ＲＮＡウイルスである、請求項１または２に記載の組成物。
7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
8. 少なくとも、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸コンストラクトと、ＲＮＡウイルスゲノム内の標的核酸配列に相補的な少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コンストラクトとを含む、その必要のある対象におけるウイルス感染症を治療するための医薬組成物であって、
   該単離核酸コンストラクトがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載の配列を有する、医薬組成物。
9. 少なくとも、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸コンストラクトと、ＲＮＡウイルスゲノム内の標的核酸配列に相補的な少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コンストラクトとを含む、その必要のある対象におけるウイルス感染症を治療するための医薬組成物であって、
   該単離核酸コンストラクトがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載の配列を有する、医薬組成物。
10. ガイドＲＮＡコンストラクトがウイルス遺伝子を標的とする、請求項８または９に記載の医薬組成物。
11. 前記ウイルス遺伝子が、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、イオンチャネル（Ｍ２）、マトリックスタンパク質（Ｍ１）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）、核外輸送タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）、またはＲＮＡポリメラーゼＰＢ１、ＰＢ２、もしくはＰＡである、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 前記ＲＮＡウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項８～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
13. 前記ＲＮＡウイルスが呼吸器合胞体ウイルスである、請求項８～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。

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