KR20160079780A - 생체분자를 서열화하는 디바이스들, 시스템들 및 방법들 - Google Patents

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토모지 카와이
마사테루 타니구치
타카히토 오시로
마크 올덤
에릭 에스. 노드먼
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퀀텀 바이오시스템즈 가부시키가이샤
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Abstract

단백질 샘플들을 서열화하기 위한 디바이스들, 시스템들 및 방법들이 제공된다. 일부 예들에서, 단량체가 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이를 통과할 때 발생되는 전류들은 몇 개의 상이한 거리들 각각에 대해 측정되며, 이로써, 복수의 종류들의 단량체들이 동정될 수 있고 미리결정된 정확도로 순서화되는 유사한 전극간 거리(들)을 이용하여 측정되는 전류로부터 획득되며 하나 또는 그 초과의 기준 물질들의 사용에 의해 추가로 정규화되는 터닐링 전류로부터 획득되는 검출된 물리량에 기초하는 인지된 단량체의 기준 물리량에 비교할 때, 단체들이 동정된다.

Description

생체분자를 서열화하는 디바이스들, 시스템들 및 방법들 {BIOMOLECULE SEQUENCING DEVICES, SYSTEMS AND METHODS}
[0001] 본 출원은 2013년 9월 18일자로 출원된 일본특허출원 일련번호 JP 2013-193498호 및 2013년 9월 24일자로 출원된 JP 2013-197443호를 우선권으로 청구하며, 이들 특허출원들 각각은 인용에 의해 본원에 완전히 포함된다.
[0002] 현재 생체분자(biomolecule)의 하나 또는 그 초과의 단량체(monomer)들을 동정(identify)하는데 이용가능한 방법들이 존재한다. 단량체들은 생체분자들의 엘리먼트(element)들, 예컨대 단백질에 포함된 아미노산 단량체들, 핵산에 포함된 뉴클레오티드 단량체들, 및 당사슬에 포함된 단당류 단량체들을 포함할 수 있다. 단량체를 동정하는 방법으로서, 단량체 측정을 이용하는 동정 방법들이 있으며, 여기서는 예를 들어, 광 또는 전기가 프로브 신호로 이용된다. 단량체 측정을 이용하는 단량체를 동정하는 방법에서는, 타겟 샘플을 전기활성도(electroactivity)를 갖는 프로브 분자 또는 전기형광 분자(fluorescent molecule)로 변형시킴으로써 특정 단량체가 검출될 수 있다. 예를 들어, 단백질들에 대한 서열들(sequences)은, 예를 들어, 효소 약화에 기반을 둔 HPLC(high performance liquid chromatography), 질량 분석법(mass spectrometry), x-레이 결정 구조 분석, 및 에드만 분해법(Edman degradation)과 같은 다양한 방법들을 이용함으로써 결정된다.
[0003] 그러나, 프로브 분자로 샘플을 변형시킴으로써 단량체를 검출하기 위한 앞서 언급된 방법들은, 화학 수식(chemical modification)이 요구될 수 있고 임의의 이러한 변형을 이용한 효율성은 불충분할 수 있다는 점에서 문제점들을 갖는다. 게다가, 앞서 언급된 방법들은 단지 특정한 화학 종만을 검출할 수 있고 다양한 분자 종을 함유하는 바이오-샘플을 이용하여 수행되는 생체분자 서열화(sequencing) 프로세스에는 적용되지 못할 수도 있다.
[0004] 나노갭 전극 쌍들을 이용하는 나노 전류 측정, 예컨대 터널링 전류 측정을 이용하는 단량체 동정 방법에서, 측정 결과는 측정 방법 및/또는 측정 조건들에 의존하여 달라질 수 있기 때문에, 이는 측정된 신호들을 표준화시킬 필요가 있을 수 있다. 따라서, 예를 들어, 인용에 의해 본원에 완전히 포함되는 JP2011-163934A 및 JP2008-32529A에 설명된 바와 같은 표준화 방법을, 터널링 전류 측정을 이용하는 생체분자 서열화 시스템에 적용함으로써 ―여기서, 상대 컨덕턴스는 내부 기준 물질(또는 기준 샘플)로서의 역할을 하는 샘플 분자 자체를 활용함―, 측정된 신호들의 간접(indirect) 표준화가 수행될 수 있다.
[0005] 그러나, 내부 기준 물질을 충분히 측정하기 위해, 측정 시간은 연장된다. 또한, 앞서 설명된 표준화는 미지의(unknown) 분자를 함유하는 샘플에는 적용되지 않을 수도 있다. 따라서, 미지의 분자를 함유하는 샘플이 측정되거나 검출될 경우, 분리(separation) 단계, 정제(refinement) 단계 등이 이용될 수 있다. 종래의 표준화 방법이 나노갭 전극 디바이스를 이용하는 나노 전류 측정에 적용될 때, 샘플들 및 조건들은 제한될 수도 있다.
[0006] 본 개시내용은 생체분자들(예를 들어, 생체분자 고분자들)에서의 단량체들의 동정(identification) 및 생체분자들의 서열화에 유용할 수 있는 방법들, 장치들 및 컴퓨터 프로그램들을 제공한다. 일부 실시예들은, 분리 단계, 정제 단계 등과 같은 단계를 필요로 하지 않고, 미지의 분자를 함유하는 샘플에 대해, 나노갭 전극들을 이용하는 나노 전류 측정을 활용하여 단량체를 동정할 수 있는 컴퓨터 프로그램("프로그램"), 장치 및 표준화된 생체분자 서열화를 제공하기 위한 방법을 포함한다.
[0007] 본원에서 제공되는 디바이스들, 시스템들 및 방법들은, 표준화될 수 있는 고감도의(highly sensitive) 측정된 신호들을 이용하여 다양한 종류들의 단량체를 동정할 수 있다.
[0008] 일부 경우들에서, 생체분자 서열화 방법은, 샘플에 함유될 수 있는 동정될 적어도 하나 또는 그 초과의 종들의 단량체 및 기준 물질이 각각 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이를 통과할 수 있을 때 흐르는 나노 전류들(예를 들어, 터널링 전류들)에 대응하는 신호들을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 샘플은, 샘플에 첨가되는 기준 물질 및 동정될 하나 또는 그 초과의 종류들의 단량체를 포함할 수 있고, 이에, 기준 물질이 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이를 통과할 때 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이를 흐르는 나노 전류에 대응하는 기준 물질의 신호의 크기가 인지되며, 신호의 크기의 변동은 미리결정된 변동 범위 내에 속하며; 복수의 측정된 신호들에 포함될 수 있는 기준 물질을 표시하는 기준 신호를 이용함으로써, 단량체의 종류의 동정이 복수의 신호들에 포함되는 추가 신호에 의해 표시될 수 있다.
[0009] 따라서, 측정 방법 및 측정 조건들에 의존하여 측정 결과가 달라질 수 있는, 나노갭 전극 쌍(들)을 이용하는 나노 전류 측정 방법의 경우에도, 기준 물질을 표시하는 안정한 신호가 획득될 수 있다. 따라서, 미지의 분자를 함유하는 샘플에 대해, 나노갭 전극 쌍(들)을 이용하는 나노 전류 측정을 활용하는 생체분자 서열화가, 분리 단계, 정제 단계 등과 같은 단계들을 필요로 하지 않고, 실행될 수 있도록, 표준화가 수행된다.
[0010] 또한, 기준 물질은 전기 전도도(electric conductivity)를 가질 수 있으며, 기준 물질은 동정될 단량체와 결합될 필요가 없을 수 있고, 기준 물질은 배향과 상관없이 동일한 형상의 화합물들로 구성될 수 있다. 따라서, 동정될 단량체를 표시하는 신호로부터 쉽게 구별될 수 있는 기준 물질을 표시하는 신호를 획득하는 것이 가능하다.
[0011] 또한, 기준 물질은, 기준 물질이 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 사이를 통과할 때, 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 사이의 공간(space)에 대해 동일한 포지션 배향을 갖는 물질들(matters)로 구성될 수 있다. 따라서, 상이한 측정들에 대한 기준 물질(들)을 표시하는 신호들의 크기들이 균일하게 나타나게 될 수 있다.
[0012] 또한, 기준 물질은 구 형상을 갖는 화합물들로 구성될 수 있다. 따라서, 전극들의 구조와 상관없이, 상이한 측정들에 대한 기준 물질을 표시하는 신호들의 크기들은 균일하게 나타나게 될 수 있다.
[0013] 또한, 기준 물질은 금속 나노입자들 또는 풀러린들(fullerenes)을 포함할 수 있다.
[0014] 또한, 샘플에 대하여 기준 물질의 농도는, 복수의 신호들에 대하여 기준 물질을 표시하는 신호의 레이트가 미리결정된 레이트 범위내에 속하도록 최적화될 수 있다. 따라서, 기준 물질을 표시하는 신호가 안정하게 검출될 수 있고, 기준 물질을 표시하는 신호가 잡음 발생으로부터 방지될 수 있다.
[0015] 또한, 단량체의 종류를 동정할 때, 추가의 신호에 의해 표시되는 단량체의 종류는, 기준 물질을 표시하는 신호에 대한 복수의 신호들의 상대 값들, 및 신호들의 상대 값들과 단량체의 종류 간의 미리결정된 관계에 기초하여 동정될 수 있다.
[0016] 또한, 나노 전류들에 대응하는 신호들을 측정할 때, 나노 전류들에 대응하는 신호들은, 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 사이의 복수의 상이한 거리들을 이용하여 동정될 수 있는 복수의 상이한 기준 물질들을 함유하는 샘플에 대해, 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 사이의 상이한 거리들을 이용하여 복수의 조건들 각각에 대해 측정될 수 있고; 그리고 단량체의 종류를 동정할 때, 복수의 측정된 신호들에 포함될 수 있는 추가 신호 및 관련 조건에 대응하는 기준 물질을 표시하는 신호가 각각의 조건에 대해 서로 비교될 수 있고, 그리고 추가 신호에 의해 표시되는 단량체의 종류는 각각의 조건으로부터 발생하는 비교에 기초하여 동정될 수 있다. 따라서, 보다 정밀한 동정이 실행될 수 있다.
[0017] 또한, 본원에서 설명되는 것과 같은 생체분자 서열화 장치는, 샘플이 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 사이를 통과할 때 나노 전류가 흐르도록 로케이팅된 나노갭 전극 쌍(들)의 한 쌍의 전극들 ―샘플은, 샘플에 첨가되는 기준 물질 및 동정될 하나 또는 그 초과의 종류들의 단량체를 포함할 수 있고, 이에, 기준 물질이 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이를 통과할 때 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 사이를 흐를 수 있는 나노 전류에 대응하는 기준 물질과 연관된 신호의 크기가 인지되며, 신호의 크기의 변동은 미리결정된 변동 범위 내에 속함―; 샘플에 함유될 수 있는 동정될 단량체 및 기준 물질이 나노갭 전극쌍(들)의 전극들 사이를 각각 통과할 수 있을 때 흐르는 나노 전류들에 대응하는 신호들을 측정하도록 구성된 측정 유닛; 및 측정 유닛에 의해 측정되는 복수의 측정된 신호들에 포함될 수 있는 기준 물질을 표시하는 기준 신호로서 이용하여, 복수의 신호들에 함유된 추가 신호에 의해 표시되는 단량체의 종류를 동정하도록 구성된 동정 유닛을 포함할 수 있다.
[0018] 또한, 생체분자 서열화 프로그램은, 샘플에 함유될 수 있는 동정될 하나 또는 그 초과의 종류들의 단량체 및 기준 물질이 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 사이를 각각 통과할 수 있는 때 흐르는 나노 전류들에 대응하는 신호들을 측정하고―샘플은, 샘플에 첨가되는 기준 물질 및 동정될 하나 또는 그 초과의 종류들의 단량체를 포함할 수 있고, 이에, 기준 물질이 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 사이를 통과할 수 있을 때 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이를 흐르는 나노 전류에 대응하는 기준 물질의 신호의 크기가 인지되며, 신호의 크기의 변동은 미리결정된 변동 범위 내에 속함―; 그리고 복수의 측정된 신호들에 포함될 수 있는 기준 물질을 표시하는 기준 신호를 이용함으로써, 복수의 신호들에 포함된 추가 신호에 의해 표시되는 단량체의 종류를 동정하도록, 컴퓨터에 의해 실행가능하다.
[0019] 일부 실시예들에서, 생체분자 서열화 장치는, 생체분자를 형성하도록 결합된(bound) 적어도 하나 또는 그 초과의 종류들의 단량체들을 포함하는 생체분자가 전극 쌍의 전극들 사이를 통과할 때 터널링 전류가 흐를 수 있도록 배치된 전극 쌍; 생체분자가 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이를 통과할 때 발생되는 터널링 전류를 측정하도록 구성된 측정 유닛 ―나노갭 전극 쌍의 전극들 간의 상이한 통로들은 나노갭 전극 쌍의 전극들에 대한 상이한 공간(spacing)(들)을 가질 수 있음―; 및 다수의 종류들의 단량체들 각각을 미리결정된 정확도로 동정할 수 있는 전극간 거리를 이용하여 측정되는 터널링 전류로부터 획득되는 적어도 하나의 인지된(known) 종류의 단량체의 기준 물리량(reference physical quantity)에 기초하여 그리고 기준 물리량에 대응하는 전극간 거리를 이용하여 측정 유닛에 의해 측정되는 터널링 전류로부터 획득되는 검출된 물리량에 기초하여, 생체분자를 포함하는 적어도 하나의 종류의 단량체를 동정하는 동정 유닛을 포함한다.
[0020] 일부 실시예들, 전극 쌍은, 생체분자를 형성하도록 결합된 적어도 하나 또는 그 초과의 종류들의 단량체들을 포함하는 생체분자가 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이를 통과할 때 터널링 전류가 흐를 수 있도록 배치될 수 있다. 측정 유닛은, 생체분자가 전극 쌍의 전극들 사이를 통과할 때 발생되는 터널링 전류를 측정할 수 있으며, 여기서 나노갭 쌍은 시간에 걸쳐 다수의 전극 갭 공간들을 가질 수 있다.
[0021] 동정 유닛은, 다수의 종류들의 단량체들을 미리결정된 정확도로 동정할 수 있는 전극간 거리를 이용하여 측정되는 터널링 전류로부터 획득되는 적어도 하나의 인지된 종류의 단량체들의 기준 물리량에 기초하여 그리고 기준 물리량에 대응하는 전극간 거리를 이용하여 측정 유닛에 의해 측정되는 터널링 전류로부터 획득되는 검출된 물리량에 기초하여, 생체분자를 포함하는 적어도 하나의 종류의 단량체들을 동정할 수 있다.
[0022] 앞서 언급된 바와 같이, 다수의 전극간 거리들을 이용하여 전극 쌍들 사이를 생체분자가 여러 번 통과할 때 발생되는 터널링 전류를 측정함으로써, 그리고 다수의 종류들의 단량체들 각각을 미리결정된 정확도로 동정할 수 있는 전극간 거리를 이용하여 측정되는 터널링 전류로부터 획득되는 적어도 하나의 인지된 종류의 단량체들의 기준 물리량을 이용함으로써, 생체분자를 포함하는 단량체들이 간단한 구성 및 높은 정확도로 동정될 수 있다.
[0023] 생체분자는 생체고분자들(biopolymers), 예컨대, 단백질들, 펩티드들, 핵산들 및 당사슬들을 포함할 수 있다. 추가로, 생체분자를 포함하는 단량체들은, 단백질들 또는 펩티드들을 포함하는 아미노산들, 핵산들을 포함하는 뉴클레오티드들, 리보핵산들을 포함하는 리보뉴클레오티드들, 및 당사슬들을 포함하는 단당류들을 포함할 수 있다.
[0024] 생체분자 서열화 장치는, 전극 쌍의 전극간 거리를 변경시킴으로써, 생체분자가 더 잘 검출될 수 있도록, 전극 쌍을 제어하도록 구성된 제어 유닛을 더 포함할 수 있다. 따라서, 단일 전극 쌍을 이용함으로써, 다수의 상이한 전극간 거리들을 이용한 터널링 전류들이 측정되고 생체분자를 특성화시키는데 활용될 수 있다.
[0025] 생체분자 서열화 장치는 각각이 상이한 전극간 거리를 갖는 다수의 전극 쌍들을 활용할 수 있다. 따라서, 상이한 전극들로부터의 터널링 전류들은 상이한 정보를 제공하며, 여기서 각각의 전극은 상이한 전극간 거리를 가질 수 있어, 동시적으로 상이한 전극간 거리들의 측정을 허용한다.
[0026] 또한, 동정 유닛은, 미리결정된 전극간 거리와 상이한 전극간 거리를 이용하여 측정되는 터널링 전류로부터 획득되는 검출된 물리량에 기초하여, 미리결정된 전극간 거리를 이용하여 측정되는 터널링 전류로부터 획득되는 검출된 물리량에 기초하여 동정될 수 없는 단량체(들)의 종류를 동정할 수 있다.
[0027] 검출된 물리량 및 기준 물리량과 관련하여, 다양한 값들, 예컨대 터널링 전류의 전류 값들 및 컨덕턴스들이 이용될 수 있다. 전극 쌍에 인가되는 전압이 일정하면, 터널링 전류와 연관된 전류 값들 및 컨덕턴스들 둘 다가 균등하게 활용될 수 있다.
[0028] 생체분자 서열화 방법은, 생체분자가 전극 쌍의 전극들 사이를 여러 번 통과할 때 터널링 전류가 흐를 수 있도록 배치되는 전극 쌍의 전극들 사이를, 적어도 하나 또는 그 초과의 종류들의 연결된 단량체들을 갖는 생체분자가 통과할 때 발생되는 터널링 전류를 측정하는 단계 ―상이한 시기들 중 적어도 일부는 전극 쌍에 대한 상이한 전극간 거리를 가짐―; 및 다수의 종류들의 단량체들 각각을 미리결정된 정확도로 동정할 수 있는 전극간 거리를 이용하여 측정되는 터널링 전류로부터 획득되는 적어도 하나의 인지된 종류의 단량체들에 대한 기준 물리량에 기초하여, 그리고 기준 물리량에 대응하는 전극간 거리를 활용하여 측정 유닛에 의해 측정되는 터널링 전류로부터 획득되는 검출된 물리량에 기초하여, 생체분자를 포함하는 적어도 하나의 종류의 단량체들을 동정하는 단계를 포함할 수 있다.
[0029] 생체분자 서열화 프로그램은, 생체분자가 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이를 여러 번 통과할 때 터널링 전류가 흐를 수 있도록 배치될 수 있는 전극 쌍의 전극들 사이를 적어도 하나 또는 그 초과의 종류들의 연결된 단량체들이 통과할 때 발생되는 터널링 전류를 측정하고 ―상기 나노갭 전극 쌍들 사이를 통하는 상이한 통로들(passages) 중 일부는 나노갭 전극 쌍이 전극 쌍에 대해 상이한 전극간 거리들을 갖도록 설정되는 동안 발생함―; 그리고 다수의 종류들의 단량체들 각각을 미리결정된 정확도로 동정할 수 있는 전극간 거리를 이용하여 측정되는 터널링 전류로부터 획득되는 적어도 하나의 인지된 종류의 단량체들에 대한 기준 물리량에 기초하여, 그리고 기준 물리량에 대응하는 전극간 거리를 이용하여 측정 유닛에 의해 측정되는 터널링 전류로부터 획득되는 검출된 물리량에 기초하여, 생체분자를 포함하는 적어도 하나의 종류의 단량체들을 동정하도록, 컴퓨터에 의해 실행가능할 수 있다.
[0030] 일부 실시예들에서, 생체분자 서열화 장치, 방법 및 컴퓨터 프로그램은, 다수의 상이한 전극간 거리를 이용하여 생체분자가 전극 쌍의 전극들 사이를 통과할 때 발생되는 터널링 전류를 측정함으로써 그리고 다수의 종류들의 단량체들 각각을 미리결정된 정확도로 동정할 수 있는 전극간 거리를 이용하여 측정되는 터널링 전류로부터 획득되는 적어도 하나의 인지된 종류의 단량체들의 기준 물리량을 이용함으로써, 높은 정확도로 그리고 간단한 구성을 활용하여 생체분자를 포함하는 단량체들을 동정하는데 활용될 수 있다.
[0031] 본 개시내용의 양상은, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은, (a) 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 포함하는 채널을 제공하는 단계 ―복수의 세트들의 나노갭 전극들의 각각의 세트는 2개의 나노갭 전극들을 포함하고, 적어도(at least), 복수의 세트들의 나노갭 전극들의 서브세트는 상이한 전극간 거리들을 가짐―; (b) 채널을 통하게 생체분자를 지향시키는 단계; (c) 생체분자가 채널을 통하게 지향될 때 나노전류들에 대응하는 신호들을 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 이용하여 측정하는 단계 ―신호들은 생체분자의 복수의 단량체들에 대응함―; (d) (c)에서 측정되는 신호들을 하나 또는 그 초과의 기준들에 비교함으로써, 복수의 단량체들을 컴퓨터 프로세서를 이용하여 동정하는 단계를 포함한다.
[0032] 실시예에서, 동정하는 단계는 신호들의 상대 값과 하나 또는 그 초과의 기준들 간의 주어진(given) 또는 미리결정된 관계를 이용하는 단계를 포함한다. 다른 실시예에서, 복수의 세트들의 나노갭 전극들은, 상이한 전극간 갭 거리들을 갖는, 제 1 세트의 나노갭 전극들 및 제 2 세트의 나노갭 전극들을 포함한다. 다른 실시예에서, 방법은, 다른 전극간 거리에 대한 나노전류를 보간(interpolate)하기 위해, 주어진 세트의 나노갭 전극들의 전극간 거리를 이용하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시예에서, 방법은, 개별 단량체 퀄리티 콜들(quality calls)을 이용하는 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 이용한 다수의 측정들로부터의 데이터를 이용하여 생체분자의 컨센서스 서열(consensus sequence)을 발생시키는 단계를 더 포함한다. 다른 실시예에서, 방법은, 상이한 전극간 거리들에서 복수의 세트들의 나노갭 전극들에 대한 나노전류들에 대응하는 신호들을 측정하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시예들에서, 방법은, 최대한(at most), 복수의 세트들의 나노갭 전극들의 서브세트로부터의 신호들을 측정하는 단계, 및 최대한, 복수의 세트들의 나노갭 전극들의 서브세트 이용하여 측정된 신호들을 이용하여 복수의 단량체들 중 주어진 단량체를 동정하는 단계를 포함한다. 다른 실시예에서, 나노전류들은 터널링 전류들을 포함한다.
[0033] 실시예에서, 생체분자는 펩티드 샘플이다. 다른 실시예에서, 방법은 (b) 단계 이전에 펩티드 샘플을 변성시키는(denaturing) 단계 및/또는 분해하는(cleaving) 단계를 더 포함한다.
[0034] 실시예에서, 나노갭 전극들의 세트들의 각각의 세트는, 최대한, 생체분자의 복수의 단량체들의 서브세트를 검출하는데 적절한 전극간 거리를 갖는다. 다른 실시예에서, 생체분자는 핵산 분자이다.
[0035] 본 개시내용의 다른 양상에서, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 시스템은, 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 포함하는 채널 ―복수의 세트들의 나노갭 전극들의 각각의 세트는 2개의 나노갭 전극들을 포함하며, 적어도, 복수의 세트들의 서브세트는 상이한 전극간 거리들을 가짐―; 및 채널을 통하게 생체분자를 지향시키기 위한 유체 흐름 유닛; 나노갭 전극들에 커플링되는 컴퓨터 프로세서를 포함하며, 컴퓨터 프로세서는, (a) 생체분자가 채널을 통하게 지향될 때 나노전류들에 대응하는 신호들을 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 이용하여 측정하고 ―신호들은 생체분자의 복수의 단량체들에 대응함―; 그리고 (b) (a)에서 측정되는 신호들을 하나 또는 그 초과의 기준들에 비교함으로써, 복수의 단량체들을 동정하도록 프로그래밍된다.
[0036] 실시예에서, 컴퓨터 프로세서는 신호들의 상대 값과 하나 또는 그 초과의 기준들 간의 미리결정된 관계를 이용하여 복수의 단량체들을 동정하도록 프로그래밍된다. 다른 실시예에서, 복수의 세트들의 나노갭 전극들은 상이한 전극간 갭 거리들을 갖는, 제 1 세트의 나노갭 전극들 및 제 2 세트의 나노갭 전극들을 포함한다. 다른 실시예에서, 컴퓨터 프로세서는, 다른 전극간 거리에 대한 나노전류를 보간(interpolate)하기 위해, 주어진 세트의 나노갭 전극들의 전극간 거리를 이용하도록 프로그래밍된다. 다른 실시예에서, 컴퓨터 프로세서는, 개별 단량체 퀄리티 콜들(quality calls)을 이용하는 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 이용한 다수의 측정들로부터의 데이터를 이용하여 생체분자의 컨센서스 서열을 발생시키도록 프로그래밍된다. 다른 실시예에서, 세트들의 나노갭 전극들의 각각의 세트는, 최대한, 생체분자의 복수의 단량체들의 서브세트를 검출하는데 적절한 전극간 거리를 갖는다. 다른 실시예에서, 컴퓨터 프로세서는, 상이한 전극간 거리들에서 복수의 세트들의 나노갭 전극들에 대한 나노전류들에 대응하는 신호들을 측정하도록 프로그래밍된다. 다른 실시예들에서, 컴퓨터 프로세서는, 최대한, 복수의 세트들의 나노갭 전극들의 서브세트로부터의 신호들을 측정하고, 그리고 최대한, 복수의 세트들의 나노갭 전극들의 서브세트를 이용하여 측정된 신호들을 이용하여 복수의 단량체들 중 주어진 단량체를 동정하도록 프로그래밍된다.
[0037] 본 개시내용의 다른 양상은 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 방법을 제공하며, 상기 방법은, (a) 가변적인 전극간 거리를 갖는 적어도 하나의 세트의 나노갭 전극들을 포함하는 채널을 제공하는 단계; (b) 채널을 통하게 펩티드 샘플 및 적어도 하나의 기준 샘플을 지향시키는 단계 ―기준 샘플은 나노갭 전극들에 의해 측정되는 나노전류에 대응하는 미리결정된 신호 프로파일을 가짐―; (c) 단백질 샘플 및 기준 샘플이 채널을 통하게 지향될 때 나노전류들에 대응하는 신호들을 상이한 전극간 거리들에서 나노갭 전극들을 이용하여 측정하는 단계 ―신호들은 기준 샘플과 연관된 기준 신호들을 포함함―; 및 (d) (c) 단계에서 측정되는 신호들을 기준 신호들에 비교함으로써 컴퓨터 프로세서를 이용하여 하나 또는 그 초과의 단량체들을 동정하는 단계를 포함한다.
[0038] 실시예에서, 기준 샘플은 펩티드 샘플과 별개이다. 다른 실시예에서, 기준 샘플은 하나 또는 그 초과의 단량체들의 미리결정된 서열을 갖는 기준 펩티드 샘플이다. 다른 실시예에서, 기준 샘플은, 기준 샘플이 나노갭 전극들 사이를 통과할 때, 나노갭 전극들 간의 공간에 대해 동일한 배향을 갖는 서브유닛들을 포함한다. 다른 실시예에서, 기준 샘플은 실질적으로 구 형상(spherical shape)을 갖는다. 다른 실시예에서, 기준 샘플은 금속 나노입자들 또는 풀러린들을 포함한다. 다른 실시예에서, 동정하는 단계는 신호들의 상대 값과 기준 신호들 간의 미리결정된 관계를 이용하는 단계를 포함한다.
[0039] 실시예에서, 채널은 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 포함하며, 각각의 세트는 적어도 2개의 나노갭 전극들을 포함한다. 다른 실시예에서, 복수의 세트들의 나노갭 전극들은 상이한 전극간 갭 거리들을 갖는, 제 1 세트의 나노갭 전극들 및 제 2 세트의 나노갭 전극들을 포함한다.
[0040] 실시예에서, 방법은, 개별 단량체 퀄리티 콜들(quality calls)을 이용하는 나노갭 전극들을 이용한 다수의 측정들로부터의 데이터를 이용하여 펩티드 샘플의 컨센서스 서열(consensus sequence)을 발생시키는 단계를 더 포함한다. 다른 실시예에서, 방법은, 적어도, 나노갭 전극들 사이의 복수의 상이한 거리들의 서브세트에 대응하는 복수의 상이한 기준 샘플들을 제공하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시예에서, 방법은, (b) 단계 이전에 펩티드 샘플을 변성시키는 단계 및/또는 분해하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시예에서, 기준 샘플은 제 1 펄스 듀레이션과 연관되며 펩티드 샘플은 제 1 펄스 듀레이션과 상이한 제 2 펄스 듀레이션과 연관된다.
[0041] 실시예에서, 신호 프로파일은 신호의 크기를 포함한다. 다른 실시예에서, 신호의 크기는 미리결정된 크기이다. 다른 실시예에서, 펩티드 샘플 및 적어도 하나의 기준 샘플은 채널을 통하게 교대로(alternately) 그리고 순차적으로(sequentially) 지향된다. 다른 실시예에서, (c) 단계는, (i) 나노갭 전극들의 전극간 거리를 변경하는 단계 및 (ii) 상이한 전극간 거리들에서 신호들의 개별 측정들을 수행하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시예에서, 나노전류들은 터널링 전류들을 포함한다.
[0042] 본 개시내용의 다른 양상에서, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 시스템은, 가변적인 전극간 거리를 갖는 적어도 하나의 세트의 나노갭 전극들을 포함하는 채널; 채널을 통하게 펩티드 샘플 및 적어도 하나의 기준 샘플을 지향시키는 유체 흐름 유닛 ―기준 샘플은 나노갭 전극들에 의해 측정되는 나노전류에 대응하는 미리결정된 신호 프로파일을 가짐―; 및 나노갭 전극들에 커플링되는 컴퓨터 프로세서를 포함하며, 컴퓨터 프로세서는, (i) 펩티드 샘플 및 기준 샘플이 채널을 통하게 지향될 때 나노전류들에 대응하는 신호들을 가변 전극간 거리들에서 나노갭 전극들을 이용하여 측정하고, 그리고 (ii) (i)에서 측정되는 신호들을 기준 신호들에 비교함으로써 하나 또는 그 초과의 단량체들을 동정하도록 프로그래밍된다.
[0043] 실시예에서, 기준 샘플은 하나 또는 그 초과의 단량체들의 미리결정된 서열을 갖는 기준 펩티드 샘플이다. 다른 실시예에서, 컴퓨터 프로세서는 신호들의 상대 값과 기준 신호들 간의 미리결정된 관계를 이용하여 하나 또는 그 초과의 단량체들을 동정하도록 프로그래밍된다.
[0044] 실시예에서, 채널은 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 포함하며, 각각의 세트는 적어도 2개의 나노갭 전극들을 포함한다. 다른 실시예에서, 복수의 세트들의 나노갭 전극들은 상이한 전극간 갭 거리들을 갖는, 제 1 세트의 나노갭 전극들 및 제 2 세트의 나노갭 전극들을 포함한다. 다른 실시예에서, 컴퓨터 프로세서는 개별 단량체 퀄리티 콜들(quality calls)을 이용하는 나노갭 전극들을 이용한 다수의 측정들로부터의 데이터를 이용하여 펩티드 샘플의 컨센서스 서열을 발생시키도록 프로그래밍된다. 다른 실시예에서, 유체 흐름 시스템은 제 1 펄스 듀레이션에서의 기준 샘플 및 제 1 펄스 듀레이션과 상이한 제 2 펄스 듀레이션에서의 단백질 샘플을 제공한다. 다른 실시예에서, 컴퓨터 프로세서는, (i) 나노갭 전극들의 전극간 거리를 변경하고 그리고 (ii) 상이한 전극간 거리들에서 신호들의 개별 측정들을 수행하도록 프로그래밍된다.
[0045] 본 개시내용의 다른 양상은, 하나 또는 그 초과의 컴퓨터 프로세서에 의해 실행될 때, 위에서의 또는 본원 어딘가에서의 방법들 중 임의의 것을 구현하는 기계-실행가능한 코드를 포함하는 컴퓨터 판독가능한 매체를 제공한다.
[0046] 일부 실시예들, 컴퓨터 판독가능한 매체는, 하나 또는 그 초과의 컴퓨터 프로세서들에 의해 실행될 때, 하나 또는 그 초과의 아미노산 단량체들을 갖는 단백질 샘플의 서열화를 위한 방법을 구현하는 기계 실행가능한 코드를 포함하며, 상기 방법은, (a) 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 포함하는 채널을 통하게 생체분자를 지향시키는 단계 ―복수의 세트들의 나노갭 전극들의 각각의 세트는 2개의 나노갭 전극들을 포함하고, 적어도, 복수의 세트들의 나노갭 전극들의 서브세트는 상이한 전극간 거리들을 가짐―; (b) 생체분자가 채널을 통하게 지향될 때 나노전류들에 대응하는 신호들을 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 이용하여 측정하는 단계 ―신호들은 생체분자의 복수의 단량체들에 대응함―; 및 (c) (b) 단계에서 측정되는 신호들을 하나 또는 그 초과의 기준들에 비교함으로써, 복수의 단량체들을 동정하는 단계를 포함한다.
[0047] 일부 실시예들에서, 컴퓨터 판독가능한 매체는 하나 또는 그 초과의 컴퓨터 프로세서들에 의해 실행될 때, 하나 또는 그 초과의 아미노산 단량체들을 갖는 단백질 샘플의 서열화를 위한 방법을 구현하는 기계 실행가능한 코드를 포함하며, 상기 방법은, (a) 가변적인 전극간 거리를 갖는 적어도 하나의 세트의 나노갭 전극들을 포함하는 채널을 통하게 펩티드 샘플 및 적어도 하나의 기준 샘플을 지향시키는 단계 ―기준 샘플은 나노갭 전극들에 의해 측정되는 나노전류에 대응하는 미리결정된 신호 프로파일을 가짐―; (b) 단백질 샘플 및 기준 샘플이 채널을 통하게 지향될 때 나노전류들에 대응하는 신호들을 상이한 전극간 거리들에서 나노갭 전극들을 이용하여 측정하는 단계 ―신호들은 기준 샘플과 연관된 기준 신호들을 포함함―; 및 (c) (b) 단계에서 측정되는 신호들을 기준 신호들에 비교함으로써 하나 또는 그 초과의 단량체들을 동정하는 단계를 포함한다.
[0048] 본 개시내용의 추가 양상들 및 장점들은 하기의 상세한 설명으로부터 당업자들에게 쉽게 명백해질 것이고, 여기서는 본 개시내용의 단지 예시적 실시예들만이 도시되고 설명된다. 인식될 바와 같이, 본 개시내용은 다른 그리고 상이한 실시예들이 가능할 수 있고, 그 몇몇 상세사항들은, 모두 본 개시내용을 벗어남 없이, 다양하고 명확한 측면들에서 변형들이 가능하다. 따라서, 도면들 및 설명은, 제한적인 것이 아니라, 당연히 예시적인 것으로 간주되어야 한다.
인용에 의한 포함
[0049] 본 명세서에 언급된 모든 공개물들, 특허들, 및 특허 출원들은, 각각의 개별 공개물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 마치 인용에 의해 포함되는 것으로 표시되는 것과 동일한 범위로 인용에 의해 본원에 포함된다.
[0050] 본 발명의 신규한 특징들은 첨부된 청구항들에서 상세히 설명된다. 본 발명의 원리들이 활용되는 예시적 실시예들을 설명하는 하기 상세한 설명, 및 첨부 도면들(또는 본원에서 도("figure" 및 "FIG."))을 참조로 본 발명의 특징들 및 장점들의 더 잘 이해될 것이다.
[0051] 도 1은 생체분자 서열화 장치의 구조를 도시하는 개략도이다;
[0052] 도 2는 제어 유닛의 기능 구조를 도시하는 블록도이다;
[0053] 도 3은 컨덕턴스-시간 프로파일의 개략적 예를 도시하는 도면이다;
[0054] 도 4는 상대 컨덕턴스 테이블의 예를 도시하는 도면이다;
[0055] 도 5는 생체분자 서열화를 도시하는 도면이다;
[0056] 도 6은 컨덕턴스 히스토그램의 예를 도시하는 도면이다;
[0057] 도 7은 컨덕턴스 히스토그램의 예를 도시하는 도면이다;
[0058] 도 8은 기준 물질(또는 기준 샘플)의 농도의 최적화를 도시하는 도면이다;
[0059] 도 9는 생체분자 서열화 프로세스를 도시하는 흐름도이다;
[0060] 도 10은 생체분자 서열화 장치의 구조를 도시하는 개략도이다;
[0061] 도 11은 제어 유닛에 대한 기능 구조를 도시하는 블록도이다;
[0062] 도 12는 전극들 간의 상이한 거리들에 대한 아미노산의 컨덕턴스들을 도시하는 도면이다;
[0063] 도 13은 상대 컨덕턴스 테이블의 예를 도시하는 도면이다;
[0064] 도 14는 생체분자 서열화 방법을 설명하기 위한 도면이다;
[0065] 도 15는 단량체 동정 프로세스를 도시하는 흐름도이다;
[0066] 도 16은 생체분자 서열화 장치의 구성을 도시하는 개략도이다;
[0067] 도 17은 제어 유닛의 기능적 구성을 도시하는 블록도이다;
[0068] 도 18은 펄스 동안의 컨덕턴스 및 펄스 듀레이션 시간을 도시하는 도면이다;
[0069] 도 19는 최대 컨덕턴스의 히스토그램의 일 예를 도시하는 도면이다;
[0070] 도 20은 펄스 듀레이션 시간의 히스토그램의 일 예를 도시하는 도면이다;
[0071] 도 21은 컨덕턴스 히스토그램의 일 예를 도시하는 도면이다;
[0072] 도 22는 상이한 전극간 거리들에 대한 기준 물리량을 도시하는 도면이다;
[0073] 도 23a-23c는 사전 준비(preliminary preparation)를 위한 절차들을 도시하는 도면들이다;
[0074] 도 24는 생체분자 서열화 프로세스를 도시하는 흐름도이다;
[0075] 도 25는 동정 프로세스를 도시하는 흐름도이다;
[0076] 도 26은 아미노산 종류에 대한 확률 밀도 함수의 계산을 설명하는데 이용되는 컨덕턴스 히스토그램을 도시하는 도면이다;
[0077] 도 27은 동정된 종류들의 아미노산들의 배정(assignment)을 설명하기 위한 도면이다;
[0078] 도 28은 상이한 전극간 거리들에 대한 상이한 타입들의 아미노산들의 동정을 도시하는 도면이다;
[0079] 도 29는 생체분자 서열화 장치의 구성을 도시하는 개략도이다;
[0080] 도 30은 제어 유닛의 기능적 구성을 도시하는 블록도이다;
[0081] 도 31은 생체분자 서열화 프로세스를 도시하는 흐름도이다;
[0082] 도 32는 변형된(modified) 아미노산들의 컨덕턴스 분리를 도시하는 도면이다; 그리고
[0083] 도 33은 본 개시내용의 디바이스들, 시스템들 및 방법들을 구현하도록 프로그래밍되거나 아니면 이를 구현하도록 구성된 컴퓨터 제어 시스템을 도시한다.
[0084] 본 발명의 다양한 실시예들이 본원에서 도시되고 설명되었지만, 이러한 실시예들은 단지 예로써 제공되는 것임이 당업자들에게는 명백할 것이다. 다수의 변동들, 변경들 및 치환들은 본 발명을 이탈하지 않고 당업자들에게 상기될 수 있다. 본원에 설명되는 본 발명의 실시예들에 대한 다양한 대안들이 채용될 수 있음을 이해해야 한다.
[0085] 본원에서 이용되는 용어 "갭"은 일반적으로 재료내에 형성되거나 아니면 제공되는 구멍(pore), 채널 또는 통로를 지칭한다. 재료는 기판과 같은 고체 상태 재료일 수 있다. 갭은 감지 회로 또는 감지 회로에 커플링되는 전극에 인접하게 또는 가까이에 배치될 수 있다. 일부 예들에서, 갭은 대략 0.1 nm(nanometers) 내지 약 1000 nm의 특징 폭 또는 직경을 갖는다. 몇 나노미터 폭을 갖는 갭은 "나노갭(nanogap)"(또한 본원에서 "나노 채널)으로 지칭될 수 있다. 일부 상황들에서, 나노갭은 약 0.1 nm(nanometers) 내지 50 nm, 0.5 nm 내지 30 nm, 또는 0.5 nm 내지 10 nm, 0.5 nm 내지 5 nm, 또는 0.5 nm 내지 2 nm, 또는 2 nm 이하, 1 nm, 0.9 nm, 0.8 nm, 0.7 nm, 0.6 nm, 또는 0.5 nm인 폭을 갖는다. 일부 경우들에서, 나노갭은 적어도 약 0.5 nm, 0.6 nm, 0.7 nm, 0.8 nm, 0.9 nm, 1 nm, 2 nm, 3 nm, 4 nm, 또는 5 nm인 폭을 갖는다. 일부 경우들에서, 나노갭의 폭은 생체분자의 서브유닛(예를 들어, 단량체) 또는 생체분자의 직경 미만일 수 있다.
[0086] 본원에서 이용되는 용어 "전류"는 일반적으로 전기 전류를 지칭한다. 몇 마이크로 또는 나노 암페어인 전류는 "나노 전류"(또한, 본원에서 "나노전류")로 지칭될 수 있다. 일부 예들에서, 전류는 터널링 전류이거나 이를 포함한다.
[0087] 본원에서 이용되는 용어 "전극"은 일반적으로 전기 전류를 측정하는데 이용될 수 있는 재료를 지칭한다. 전극은 다른 전극으로의 또는 다른 전극으로부터의 전기 전류를 측정하는데 이용될 수 있다. 일부 상황들에서, 전극들은 채널(예를 들어, 나노갭)에 배치될 수 있고 채널에 걸쳐 전류를 측정하는데 이용될 수 있다. 전류는 터널링 전류일 수 있다. 이러한 전류는 나노갭을 통해 생체분자(예를 들어, 단백질)의 흐름을 검출할 때 검출될 수 있다. 일부 경우들에서, 전극들에 커플링되는 감지 회로는 전극들에 걸쳐 인가 전압을 제공하여 전류를 발생시킨다. 대안적으로 또는 부가로, 전극들은 생체분자(예를 들어, 아미노산 서브유닛 또는 단백질의 단량체)와 연관된 전기 컨덕턴스를 측정하고 그리고/또는 동정하는데 이용될 수 있다. 이러한 경우에, 터널링 전류는 전기 컨덕턴스와 관련될 수 있다.
[0088] 나노갭에 위치되는 전극들은 "나노갭 전극들"로 지칭될 수 있다. 나노갭 전극들은 적어도 2개의 전극들을 포함할 수 있으며, 이들은 예를 들어, 생체분자 또는 전기 컨덕터(예를 들어, 금속 나노입자)와 같이, 전극들을 서로 전기적으로 커플링하는 엔티티(entity)가 없을 경우 서로 전기적으로 절연될 수 있다.
[0089] 본원에서 이용되는 용어 "단백질"은 일반적으로 하나 또는 그 초과의 아미노산 단량체들, 서브유닛들 또는 잔기들(residues)을 갖는 생물학적 분자(biological molecule), 또는 고분자(macromolecule)를 지칭한다. 예를 들어, 50 또는 더 적은 아미노산들을 함유하는 단백질은 "펩티드(peptide)"로 지칭될 수 있다. 아미노산 단량체들은, 예를 들어, 20, 21, 또는 22 천연 발생(naturally occurring) 아미노산들과 같은 임의의 천연 발생 및/또는 합성 아미노산 단량체로부터 선택될 수 있다. 일부 경우들에서, 20 아미노산들은 대상물(subject)의 유전자 코드(genetic code)로 인코딩된다. 일부 단백질들은 약 500 천연 발생 및 비-천연 발생 아미노산들로부터 선택되는 아미노산들을 포함할 수 있다. 일부 상황들에서, 단백질은 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 리신(lysine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트레오닌(threonine), 트립토판(tryptophan) 및 발린(valine), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine), 알라닌(alanine), 아스파라긴(asparagine), 아스파르트 산(aspartic acid), 시스테인(cysteine), 글루타민(glutamine), 글루탐산(glutamic acid), 글리신(glycine), 프롤린(proline), 세린(serin) 및 티로신(tyrosine)으로부터 선택된 하나 또는 그 초과의 아미노산들을 포함할 수 있다.
[0090] 본원에서 이용되는 용어 "핵산"은 일반적으로 하나 또는 그 초과의 핵산 서브유닛들 또는 단량체들을 포함하는 분자를 지칭한다. 핵산은 아데노신(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T) 및 우라실(U), 또는 이들의 변이체로부터 선택된 하나 또는 그 초과의 서브유닛들을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 A, C, G, T 또는 U, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 신장 핵산 스트랜드(growing nucleic acid strand)에 통합될 수 있는 임의의 서브유닛을 포함할 수 있다. 이러한 서브유닛은 A, C, G, T, 또는 U, 또는 하나 또는 그 초과의 상보적 A, C, G, T 또는 U, 또는 상보적 퓨린(즉, A 또는 G, 또는 이들의 변이체) 또는 피리미딘(즉, C, T 또는 U, 또는 이들의 변이체)에 특정된 임의의 다른 서브유닛일 수 있다. 서브유닛은 개별 핵산 염기들 또는 염기들의 그룹들(예를 들어, AA, TA, AT, GC, CG, CT, TC, GT, TG, AC, CA, 또는 이들의 우라실-대응부들)이 분해될 수 있게 할 수 있다. 일부 예들에서, 핵산은 DNA(deoxyribonucleic acid) 또는 RNA(ribonucleic acid) 또는 이들의 유도체들이다. 핵산은 싱글-스트랜딩(single-stranded) 또는 더블 스트랜딩(double stranded)될 수 있다.
[0091] 본 개시내용은, 예를 들어, 펩티드들, 핵산 분자들, 및 당(sugar)들과 같은 생체분자들의 동정을 위한 디바이스들, 시스템들 및 방법들을 제공한다. 핵산 분자들은 DNA(deoxyribonucleic acid), RNA(ribonucleic acid), 및 이들의 변이체들을 포함할 수 있다. 핵산 분자들은 싱글 또는 더블 스트랜딩될 수 있다. 본 개시내용의 생체분자들은 단량체들 또는 개별 서브유닛들을 포함할 수 있다. 단량체들의 예들은 아미노산들 및 뉴클레오티드들을 포함한다.
[0092] 일부 실시예들에서, 터널링 전류는 단량체가 전극들 사이를 통과할 수 있을 때 흐를 수 있고 나노 전류로서 측정될 수 있다. 일부 실시예들에서, 구성 아미노산들(constitute amino acids)은 하나 또는 그 초과의 펩티드들의 서열을 결정하기 위해 동정될 수 있고, 여기서 아미노산들은 하나 또는 그 초과의 단백질들의 분해(degradation)로 인해 발생할 수 있는 하나 또는 그 초과의 펩티드들을 포함할 수 있다.
[0093] 도 1에 도시된 것처럼, 제 1 실시예에 따른 생체분자 서열화 장치(10)는 나노갭 전극 쌍(12), 측정 전력원(18), 전기영동 전극 쌍(20), 전기영동 전력원(22), 전류계(24) 및 제어 유닛(26)을 포함할 수 있다. 이러한 구조들이 본원에서 설명된다.
[0094] 나노갭 전극 쌍(12)은 2개의 전극들을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 유전체(들)(14)상에 형성될 수 있다. 나노갭 전극 쌍의 2개의 전극들은, 샘플(50)에 함유될 수 있는 단량체(52) 또는 기준 물질(또는 기준 샘플)(54)(본원 다른곳에서 상세히 설명됨)이 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이를 통과할 수 있을 때 터널링 전류가 흐를 수 있도록, 서로 이격될 수 있다. 나노갭 전극 쌍(12)을 제조하는 방법이 특별히 제한되는 것은 아니다.
[0095] 측정 전력원(18)은 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들에 전압을 인가하도록 구성될 수 있다. 측정 전력원(18)에 의해 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들에 인가될 수 있는 전압의 크기가 특별히 제한되는 것은 아니며, 이는 0.1 V 내지 2 V, 0.1 V 내지 1.5 V, 0.1 V 내지 1.4 V, 0.1 V 내지 1.3 V, 0.1 V 내지 1.2 V, 0.1 V 내지 1.1 V, 0.25 V 내지 1.1 V, 0.25 V 내지 1 V, 0.25 V 내지 0.75 V, 또는 0.6 V 및 0.85 V일 수 있다. 일부 경우들에서, 전압은, 적어도 약 0.1 V, 0.2 V, 0.3 V, 0.4 V, 0.5 V, 0.6 V, 0.7 V, 0.8 V, 0.9 V, I V, 1.1 V, 1.2 V, 1.3 V, 1.4 V, 1.5 V, 또는 2 V일 수 있다. 대안적으로, 전압은 약 2 V, 1.5 V, 1.4 V, 1.3 V, 1.2 V, 1.1 V, 1 V, 0.9 V, 0.8 V, 0.7 V, 0.6 V, 0.5 V, 0.4 V, 0.3 V, 0.2 V, 또는 0.1 V와 같거나 이 미만일 수 있다. 측정 전력원(18)에 대한 구조가 특별히 제한되는 것은 아니며, 임의의 알려진 전력원 디바이스가 적절히 이용될 수 있다.
[0096] 전기영동 전극 쌍(20)은, 샘플(50)에 함유될 수 있는 단량체(52) 및 기준 물질(54)이 이동일 수 있는 방향(도 1에서 블록 화살표 A로 도시됨)으로 전기장이 형성되도록 위치될 수 있다. 전기장이 쌍의 전기영동 전극들(20) 사이에 형성될 수 있을 때, 단량체(52) 및/또는 기준 물질(54)의 전하에 따라, 단량체(52) 및/또는 기준 물질(54)이 전기장의 방향으로 전기영동방식으로(electrophoretically) 이동할 수 있고; 대안적으로, 단량체(52) 및/또는 기준 물질(54)의 전하에 따라, 단량체(52) 및/또는 기준 물질은 전기영동 전극 쌍에 의해 발생되는 전기영동 필드(electrophoretic filed)와 반대로(oppositely) 이동할 수 있다. 단량체(52) 및/또는 기준 물질(54)은 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이를 통과하도록 이동할 수 있다.
[0097] 전기영동 전력원(22)은 전기영동 전극 쌍(20)에 전압을 인가하도록 구성될 수 있다. 전기영동 전력원(22)에 의해 전기영동 전극 쌍(20)에 인가되는 전압의 크기가 특별히 제한되지 않을 수 있다. 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이를 통과할 수 있는 단량체(52) 및/또는 기준 물질(54)의 속도가 제어될 수 있도록 전압을 적절히 설정하는 것이 가능할 수 있다. 전기영동 전력원(22)의 구조가 특별히 제한되는 것은 아니며, 임의의 공지된 전력원 디바이스가 적절히 이용될 수 있다.
[0098] 전류계(24)는, 측정 전력원(18)에 의해 전압이 인가될 수 있는 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이를 단량체(52) 및/또는 기준 물질(54)이 통과할 수 있을 때 발생될 수 있는 터널링 전류를 측정하도록 구성될 수 있다. 전류계(24)의 구조가 특별히 제한되는 것은 아니며, 임의의 공지된 전류 측정 디바이스가 적절히 이용될 수 있다.
[0099] 제어 유닛(26)은 생체분자 서열화 장치(10)의 각각의 구조들을 제어하도록 구성될 수 있으며, 측정되는 터널링 전류에 대응하는 신호에 기초하여 단량체(52)의 종류를 동정하도록 구성될 수 있다.
[0100] 제어 유닛(26)은, 본원에 설명된 바와 같은 생체분자 서열화 프로그램을 저장할 수 있는 메모리(예컨대, 랜덤 액세스 메모리(RAM) 또는 리드 온리 메모리(ROM)) 및 중앙 처리 장치(CPU) 등을 포함하는 컴퓨터를 포함할 수 있다. 도 2에 도시된 것처럼, 기능적 관점에서, 제어 유닛(26)은 전기영동 제어 유닛(30), 측정 제어 유닛(32) 및 동정 유닛(34)을 포함한다. 각각의 유닛들은 아래에서 상세히 설명된다.
[0101] 전기영동 제어 유닛(30)은, 단량체(52) 및/또는 기준 물질(54)이 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이를 통과될 수 있도록, 전기영동 전력원(22)에 의한 전압 인가를 제어하도록 구성될 수 있다.
[0102] 측정 제어 유닛(32)은, 전류계(24)가 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이를 흐르는 터널링 전류를 측정할 수 있게, 전류계(24)를 제어하도록 구성될 수 있다. 터널링 전류를 측정하는데 활용되는 시간이 제한되는 것은 아니지만, 활용되는 시간은, 예를 들어, 1분, 1 내지 2 분, 2 내지 4 분, 4 내지 10 분, 10 내지 20 분, 20 내지 30 분, 30 내지 40 분, 40 내지 50 분 또는 50 분 내지 1 시간, 1 내지 2 시간, 2 내지 3 시간, 3 내지 5 시간, 5 내지 10 시간 미만, 또는 10 시간을 초과할 수도 있다. 일부 경우들에서, 시간은, 적어도 약 1 초, 10 초, 30 초, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 7 분, 8 분, 9 분, 10 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 또는 12 시간일 수 있다. 대안적으로, 시간은, 약 12 시간 또는 그 미만, 6 시간, 5 시간, 4 시간, 3 시간, 2 시간, 1 시간, 30 분, 20 분, 10 분, 9 분, 8 분, 7 분, 6 분, 5 분, 4 분, 3 분, 2 분, 1 분, 30 초, 10 초, 또는 1 초 또는 이 미만일 수 있다. 또한, 측정 제어 유닛(32)은, 전류계(24)에 의해 측정되는 터널링 전류의 전류 값들을 획득하고, 그리고 획득된 전류 값들로부터 컨덕턴스를 결정하여 컨덕턴스-시간 프로파일을 생성하도록 구성될 수 있다. 컨덕턴스는, 터널링 전류가 측정된 경우, 터널링 전류의 전류 값들을 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들에 인가된 전압(V)으로 나눔으로써 계산될 수 있다. 컨덕턴스의 이용으로, 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이에 인가되는 전압의 값이 측정들 간에 상이하더라도, 통일된 기준(unified reference)을 갖는 프로파일들이 획득될 수 있다. 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이에 인가되는 전압의 값이 측정들 간에 변화없을 경우, 터널링 전류 및 컨덕턴스의 전류 값들은 등가로 취급될 수 있다.
[0103] 대안적으로, 측정 제어 유닛(32)은 전류 증폭기를 이용함으로써 전류계(24)에 의해 측정된 터널링 전류를 증폭시키고, 그 다음 증폭된 전류의 측정을 획득할 수 있다. 전류 증폭기를 이용하여, 터널링 나노 전류의 값이 증폭될 수 있고, 이로 인해 터널링 전류가 고감도(high sensitivity)로 측정될 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 이용가능한 가변 고속 전류 증폭기(Femto GmbH 제조, 카달로그 번호 DHPCA-100)가 전류 증폭기로 이용될 수 있다.
[0104] 동정 유닛(34)은, 측정 제어 유닛(32)에 의해 생성된 컨덕턴스-시간 프로파일에서 나타나는 복수의 신호들에 포함될 수 있는 기준 물질(54)을 표시하는 신호를 참조 신호로 이용하여 동정하도록 구성될 수 있으며, 이에 따라 단량체의 종류는 추가 신호로 표시될 수 있다.
[0105] 도 3은 컨덕턴스-시간 프로파일의 개략적 예를 도시한다. 도 3에 도시된 것처럼, 컨덕턴스-시간 프로파일에 나타나는 복수의 신호들은 피크 값을 갖는 시간 인터벌들일 수 있다. 각각의 피크 및 각각의 피크 값은 하나의 신호에 대응할 수 있다. 따라서, 도 3에 도시된 예에서, 화살표 "A"가 가리키는 시간 인터벌에 하나의 신호가 있고, 화살표 "B"가 가리키는 시간 인터벌에는 4개의 신호들이 있다.
[0106] 또한, 도 3에 도시된 예에서, 화살표 "A"가 가리키는 시간 인터벌의 신호는 기준 물질(54)을 표시하는 신호일 수 있고, 화살표 "B"가 가리키는 시간 인터벌의 신호 그룹에 포함되는 각각의 신호들은 몇 가지 상이한 단량체들(52)을 표시하는 신호들일 수 있다. 일부 실시예들에서, 기준 물질(54)을 표시하는 신호의 컨덕턴스, 및 기준 물질(54)을 표시하는 컨덕턴스 신호에 대해 동정될 각각의 종류의 단량체(52)의 상대 컨덕턴스가 알려질 경우, 각각의 신호에 의해 표시되는 단량체들의 종류들이 동정될 수 있다.
[0107] 구체적으로, 기준 물질(54)에 특정한 컨덕턴스에 대해 동정될 단량체(52)의 상대 컨덕턴스들은 사전에(in advance) 상대 컨덕턴스 테이블(36)에 저장될 수 있다. 도 4는 상대 컨덕턴스 테이블(36)의 예를 도시한다. 도 5에 도시된 것처럼, 동정 유닛(34)은, 컨덕턴스-시간 프로파일에서 나타날 수 있는 기준 물질(54)을 표시하는 신호 이외의 신호들의 컨덕턴스들 및 상대 컨덕턴스 테이블(36)에 저장될 수 있는 동정될 단량체(52)의 상대 컨덕턴스들을 비교하고, 신호 컨덕턴스와 일치하는 상대 컨덕턴스를 갖는 단량체의 종류를 동정하여, 신호에 의해 표시되는 단량체의 종류의 동정이 가능할 수 있다. 상대 컨덕턴스가 신호 컨덕턴스와 둘다 일치하는 것으로 간주될 수 있고, 여기서 상대 컨덕턴스 및 신호 컨덕턴스는 서로 완전히 일치하지만, 또한 이들 간의 차는 임계 값 이하이다.
[0108] 상대 컨덕턴스 값들을 이용하여 신호에 의해 표시되는 단량체(52)의 종류를 동정하기 위해, 기준 물질(54)은 바람직하게 하기의 특성들을 가질 수 있다.
[0109] 터널링 전류와 같은 나노 전류가 갭 전극들을 이용하여 측정될 수 있을 때, 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이를 통과하는 분자와 전극 간의 거리는 측정될 나노 전류의 크기에 영향을 미친다. 따라서, 단량체가 전극들 사이를 통과할 때마다, 단량체가 나노갭 전극 쌍의 전극들에 대한 자신의 포지션을 변경할 때, 측정되는 컨덕턴스(예를 들어, 신호의 크기)는 각각의 측정에 대해 달라질 수 있다. 예를 들어, 도 6에 도시된 것처럼, 복수의 측정들을 통해 획득되는 컨덕턴스들의 히스토그램이 생성되며, 히스토그램에서 큰 편차(variance)를 갖는 물질은 기준 물질(54)로 이용하기에는 적합하지 않다. 따라서, 각각의 측정에 대해 컨덕턴스가 크게 달라지지 않는 물질은 기준 물질(54)로 보다 효과적으로 이용될 수 있다. 도 7에 도시된 것처럼, 예를 들어, 복수의 측정들을 통해 획득되는 컨덕턴스들의 히스토그램에서 작은 편차를 갖는 물질이 기준 물질(54)로 이용하기에 적합하다.
[0110] 측정들 사이에서의 컨덕턴스의 변동들을 감소시키기 위해, 기준 물질의 배향에서의 변동이 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이의 공간(이 공간을 통해, 기준 물질(54)이 전극들 사이를 통과할 수 있음)에 대하여 측정들에 대해 비교적 적은 영향력을 갖는 조성물(composition)을 기준 물질(54)로 활용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 화합물(compound)들이 이용될 수 있는데, 여기서 배향은, 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이의 공간과 화합물의 형상들 간의 관계로 인해, 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이를 화합물이 통과할 때 고유하게 결정될 수 있으며, 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이의 화합물의 어긋난(variant) 배향들은 배제될 수 있다; 대안적으로, 화합물들이 기준 물질(54)로 활용될 수 있으며, 이들의 배향들은 이들이 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이를 통과할 때 변경되지 않도록 전기영동방식으로 제어될 수 있다. 게다가, 기준 물질(54)로 활용될 수 있는 화합물의 형상들이 구형 또는 형상이 충분히 구형일 경우, 기준 물질(54)로 이용되는 화합물의 배향은 기준 물질(54)로 이용되는 화합물과 연관된 측정된 컨덕턴스에 대해 큰 영향을 갖지 않을 수 있고, 기준 물질(54)로 활용되는 화합물과 전극들 사이의 관계를 고려할 어떠한 필요성도 없이, 기준 물질(54)로 활용되는 화합물들의 나노갭 전극 쌍의 전극들에 대한 배향은, 기준 물질(54)로 활용되는 화합물들이 전극들 사이를 통과할 때 사실상(effectively) 변경되지 않을 수 있다.
[0111] 또한, 기준 물질(54)을 표시하는 신호가 기준으로 이용될 수 있기 때문에, 신호는 동정될 단량체(52)를 표시하는 신호와 명확히 구별될 수 있는 것이 바람직하다. 따라서, 기준 물질(54)은 전기 전도도를 갖고, 동정될 단량체와 혼동되지 않을 수 있는 전도도를 가질 수 있는 것이 바람직하다. 또한, 기준 물질(54)과 연관된 신호를 기준으로서 안정하게 만들기 위해, 샘플(50)에 함유될 수 있는 기준 물질은 바람직하게 동일 형상을 갖는 화합물들로 구성될 수 있다. 또한, 도 3에 도시된 것처럼, 기준 물질을 표시하는 신호가 단량체(52)를 표시하는 신호와 현저히 차이가 나는 것이 바람직하기 때문에, 기준 물질은 동정될 단량체(52)의 것과 비교할 때 바람직하게 큰 컨덕턴스를 갖는다.
[0112] 상기 조건들을 고려하여, 금속 나노입자들 또는 풀러린들이 기준 물질들(54)로 이용될 수 있다. 금속 나노입자들은, 예를 들어, 금 나노입자들, 은 나노입자들, 구리 나노입자들, 알루미늄 나노입자들 등일 수 있다. 동정될 단량체(52)의 크기가 약 0.5 nm 내지 2 nm일 수 있을 경우, 풀러린들은 기준 물질들(54)로 적합하게 이용될 수 있다. 한편, 동정될 단량체(52)의 크기가 2 nm 또는 그 초과일 경우, 금 나노입자들과 같은 금속 나노입자들이 기준 물질들(54)로 적합하게 이용될 수 있다.
[0113] 다음, 제 1 실시예에 따른 생체분자 서열화 장치(10)를 이용함으로써 실행되는, 단량체를 동정하는 방법이 설명된다.
[0114] 적어도 하나 또는 그 초과의 종류들의 단량체(52)가 용액에 분해될 수 있다. 용액이 특별히 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 초순수(ultrapure water)가 이용될 수 있다. 초순수는 예를 들어, Millipore Co.에 의해 제조되는 Milli-Q Integral 3, Milli-Q Integral 카달로그 No. 3/5/10/15를 이용하여 제조될 수 있다. 용액에서의 단량체(52)의 농도가 특별히 제한되는 것은 아니며, 이는 약 0.01 μM 내지 1.0 μM, 또는 0.01 μM 내지 0.5 μM일 수 있다. 일부 경우들에서, 용액에서의 단량체(52)의 농도는 약 5 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1.5 μM, 1 μM, 0.5 μM, 0.1 μM, 또는 0.01 μM 미만이다. 대안적으로, 용액에서의 단량체(52)의 농도는 약 0.01 μM, 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 1.5 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 또는 5 μM 을 초과한다.
[0115] 이후, 앞서 언급된 기준 물질들(54)이 단량체(52)가 분해될 수 있는 용액에 첨가될 수 있다. 용액에 있는 기준 물질들(54)의 농도는, 컨덕턴스-시간 프로파일에서 나타나는 복수의 신호들에 대해 기준 물질(54)을 표시하는 신호의 레이트가 미리결정된 레이트 범위 내에 속하도록, 최적화될 수 있다. 도 8에 도시된 것처럼, 기준 물질들(54)의 농도가 낮을 때, 컨덕턴스-시간 프로파일에서 기준 물질(54)을 표시하는 신호들의 수(도 8에 "A"로 표시됨)가 적기 때문에, 기준 물질(54)을 표시하는 신호는 자주 검출될 수 없고, 잠재적으로 단량체(52) 신호 변화들에 대한 효율적 보상을 방해한다. 한편, 기준 물질들(54)의 농도가 잠재적으로 너무 높을 때, 컨덕턴스-시간 프로파일에서 기준 물질(54)을 표시하는 신호들의 수가 많기 때문에, 기준 물질(54) 신호들에는 잡음이 발생할 수 있고 그리고 단량체들(52)의 통로들을 간섭할 수 있다. 따라서, 미리결정된 범위는, 동정의 안정성과 잡음의 감소 간의 밸런스를 고려하여 최적의 수의 신호들을 제공하도록 정의될 수 있다. 일정 시간 기간내에서 요구되는 기준 물질 신호들의 수는 생체분자 서열화 장치의 안정성의 함수일 수 있고, 여기서 온도 의존성 및 안정한 나노갭 전극 쌍 전극 팁들이라 할만한 것이 적은 상태로, 생체분자 서열화 장치가 매우 안정적일 경우, 기준 물질로부터의 신호를 필요로 하지 않고도 상당한 시간 기간들이 허용될 수 있다. 생체분자 서열화 장치가, 예를 들어, 온도 의존적인 경우, 이는 기준 물질로부터의 보다 빈번한 신호들을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 컨덕턴스가 체계적 변화들의 결과로서, 예컨대, 예를 들어 이전의 체계적 조건들하에서 측정될 때의 컨덕턴스들에 비해 2% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 20% 초과, 또는 30% 초과씩 온도가 변할 수 있을 때마다, 기준 물질로부터의 신호를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 체계적 변화들을 결정하기 위해 기준 물질들로부터의 다수의 신호들을 활용하는 것이 필요할 수 있다; 기준 신호들은 균일하게 분포되지 않고, 포아송 분포(Poisson distribution)를 따를 가능성이 있고; 이에, 원하는 양보다 많이 생체분자 서열화 시스템을 체계적으로 변화시킬 가능성, 그리고 이러한 변화를 결정하고 그리고/또는 보상하는데 필요한 기준 물질 신호들의 수 및 기준 물질 신호들의 분포에 관해 미리결정된 신뢰도(statistical confidence)가 달성하기 위해, 기준 물질들로부터의 신호들의 발생 빈도가 보다 빈번한 것이 요구될 있을 수 있다.
[0116] 이후, 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들은 샘플(50)이 그 위에 포지셔닝되게 할 수 있고, 전압이 측정 전력원(18)에 의해 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들에 인가될 수 있고, 그리고 전압이 전기영동 전력원(22)에 의해 전기영동 전극 쌍(20)에 인가될 수 있다. 이후, 제어 유닛(26)을 포함할 수 있는 컴퓨터의 CPU는 ROM에 저장될 수 있는 생체분자 서열화 프로그램을 리트리브하여 이를 실행시킬 수 있고, 이로써 도 9에 도시된 생체분자 서열화 프로세스가 생체분자 서열화 장치(10)에 의해 실행될 수 있다.
[0117] 도 9에 도시된 생체분자 서열화 프로세스의 단계 S10에서, 측정 제어 유닛(32)은, 단량체(52) 및 기준 물질(54)이 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이를 통과할 수 있을 때 발생될 수 있는 터널링 전류가 미리결정된 시간 기간 동안 측정될 수 있도록, 전류계(24)를 제어할 수 있다.
[0118] 이후, 단계 S12에서, 측정 제어 유닛(32)은 측정된 터널링 전류의 전류 값들을 획득할 수 있고, 예를 들어, 도 3에 도시된 컨덕턴스-시간 프로파일을 생성하도록 측정 포인트들에 대해 컨덕턴스들을 계산할 수 있다. 이후, 단계 S14에서, 동정 유닛(34)은 상대 컨덕턴스 테이블(36)로부터 동정될 단량체(52)의 상대 컨덕턴스들을 획득할 수 있다.
[0119] 이후, 단계 S16에서, 동정 유닛(34)은 단계 S12에서 생성된 컨덕턴스-시간 프로파일 및 단계 S14에서 획득된 상대 컨덕턴스들을 비교하여, 각각의 신호에 의해 표시되는 단량체의 종류를 동정할 수 있다. 이후, 단계 S18에서, 동정 유닛(34)은 동정 결과를 출력하고 생체분자 서열화 프로세스가 종료될 수 있다.
[0120] 본원에서 설명된 것처럼, 동정 장치는, 기준 물질로서, 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이를 흐르는 터널링 전류들에 기초하여 생성되는 컨덕턴스-시간 프로파일에서 컨덕턴스의 작은 변화를 갖는 물질을 활용할 수 있다. 컨덕턴스-시간 프로파일에서 기준 물질을 표시하는 신호의 컨덕턴스를 기준으로 이용함으로써, 추가 신호에 의해 표시되는 단량체의 종류가 동정될 수 있다. 따라서, 미지의 분자를 함유하는 샘플에 대해, 나노갭 전극 쌍(들)을 이용하는 나노 전류 측정들을 활용하는 생체분자 서열화가 추가의 단계, 예컨대 분리 단계, 정제 단계 등을 필요로 하지 않고 수행될 수 있도록, 기준 물질이 표준으로 활용될 수 있다.
[0121] 이후 설명되는 도 10에서, 도 1에 유사하게 이용되는 참조 번호들은 도 1의 것들과 동일한 부품들을 지칭하며 이에 대한 상세한 설명은 생략한다.
[0122] 생체분자 서열화 장치는 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 포함할 수 있으며, 각각의 세트는 적어도 2개의 전극들을 포함한다. 도 10에서, 생체분자 서열화 장치(210)는 다수의 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B 및 12C), 측정 전력원(18), 쌍의 전기영동 전극들(20), 전기영동 전력원(22), 전류계(24) 및 제어 유닛(226)을 포함할 수 있다. 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B 및 12C) 각각은 세트의 나노갭 전극들이다. 제어 유닛(226)은 본원 어딘가에서 설명된 제어 유닛(26)과 유사하거나 동일할 수 있다.
[0123] 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B 및 12C)에 대한 구조는 도 1과 관련하여 설명된 나노갭 전극 쌍(12)에 대한 것과 동일할 수 있다. 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B 및 12C)은, 전극들 사이의 중심들이 동일 축에 정렬될 수 있도록, 유전체(들)(14)상에 형성될 수 있다. 단량체(52) 및 기준 물질(54)이 통과할 수 있는 경로는 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B 및 12C)의 각각의 전극들 사이에 정의될 수 있다. 나노갭 전극 쌍들(12A)의 전극들 간의 거리는 d1으로 도시될 수 있고, 나노갭 전극 쌍(12B)의 전극들 사이의 갭은 d2로 도시될 수 있고, 나노갭 전극 쌍(12C)의 쌍의 전극들 사이의 갭은 d3로 도시될 수 있다. 거리들(dl, d2 및 d3)은 서로 상이할 수 있다. 도 10에 도시된 예에서, dl>d2>d3이다. 예를 들어, 거리(dl)는 1.0 nm일 수 있고, 거리(d2)는 0.7 nm일 수 있고 거리(d3)는 0.5 nm일 수 있다.
[0124] 도 11에 도시된 것처럼, 제어 유닛(226)은 전기영동 제어 유닛(30), 측정 제어 유닛(232) 및 동정 유닛(234)을 포함할 수 있다.
[0125] 측정 제어 유닛(232)은, 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B 및 12C)의 전극들 사이에 발생되는 터널링 전류들이 개별적으로 측정될 수 있도록, 전류계(24)를 제어하도록 구성될 수 있다. 또한, 측정 제어 유닛(232)은 전류계(24)에 의해 측정되는 나노갭 전극 쌍들의 전극들 사이의 각각의 거리에 대한 터널링 전류들의 전류 값들을 획득하도록 그리고 나노갭 전극 쌍들의 전극들 사이의 각각의 거리에 대한 컨덕턴스-시간 프로파일을 생성하기 위해 컨덕턴스들을 계산하도록 구성될 수 있다.
[0126] 동정 유닛(234)은, 전극들 사이의 각각의 거리에 대한 컨덕턴스-시간 프로파일에서 나타나는 복수의 신호들에 포함되는 나노갭 전극 쌍들의 전극들 간의 거리(들)에 대응하는 기준 물질(54)을 표시하는 신호(들)를 동정하고, 그리고 동정된 기준 물질(54) 신호(들)에 기초하여 추가의 신호들을 정규화(normalize)시키도록 구성될 수 있다. 이후, 나노갭 전극 쌍들의 전극들 사이의 상이한 거리와 연관된 각각의 거리에 대해 수행되는 비교에 기초하여, 동정 유닛(234)은 정규화된 추가 신호에 의해 표시되는 단량체의 종류를 동정하도록 구성될 수 있다.
[0127] 도 12는, 다수의 종류들의 단량체들(도 12에 도시된 예들에서 아미노산들)에 대한, 전극들 또는 나노갭 전극 쌍들 사이의 상이한 거리들(d)에 대한 상대 컨덕턴스들을 도시한다. 본원에서의 상대 컨덕턴스는, 단량체 종류들(도 12에서 아미노산 종류들) 중에서의 단량체(아미노산)와 연관된 가장 큰 컨덕턴스가 1로 정규화될 수 있을 때, 각각의 단량체(아미노산)에 대한 컨덕턴스를 의미할 수 있다. 도 12에 도시된 예에서, 전극들 간의 거리(d1)는 1.0 nm이고, 전극들 간의 거리(d2)는 0.7 nm이고, 전극들 간의 거리(d3)는 0.4nm이다. 도 12에 도시된 것처럼, 전극들 간의 거리(d)가 0.4 nm일 때, His, Thr, Tyr 및 Trp의 상대 컨덕턴스들은 대략적으로 서로 동일하다. 전극들 간의 거리(d)가 0.7 nm일 때, Cys 및 Pro의 상대 컨덕턴스들은 대략적으로 서로 동일한 것으로 도시되고 Tyr 및 Trp의 상대 컨덕턴스들은 대략적으로 서로 동일한 것으로 도시된다. 전극들 간의 거리(d)가 1.0 nm일 때, Cys, Pro 및 Phe의 상대 컨덕턴스들은 대략적으로 서로 동일한 것으로 도시된다. 상대 컨덕턴스들이 대략적으로 서로 동일할 때, 동정되는 단량체(아미노산)의 종류의 동정 정밀도는 낮을 수 있다.
[0128] 단량체와 연관된 히스토그램은 다른 단량체들과 연관된 히스토그램들과 상이할 수 있거나, 또는 하나 또는 그 초과의 다른 단량체들에 활용되는 히스토그램(들)과 동일하거나 유사할 수 있다. 추가로, 단량체들과 연관된 히스토그램들은 또한 상이한 전극간 거리들(d)에 대해 상이할 수 있다. 히스토그램들로부터 유도되는 함수는 곡선을 생성할 수 있으며, 이는 연속 곡선 또는 불연속 곡선일 수 있으며, 여기서 곡선은 디컨볼루션(deconvolution)을 활용하여 단량체의 종류를 결정하는데 이용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 디컨볼루션 매트릭스는 단량체 타입 및 전극간 거리(d)에 대한 표준으로부터 발생될 수 있다. 일부 실시예들에서, 디컨볼루션은 가능성있는 단량체 종류를 결정하는데 이용될 수 있다. 디컨볼루션에 대한 계산(math)은 알고리즘 개발자들에게 잘 알려져있다. 일부 실시예들에서, 매트릭스 계산 또는 선형 대수학(linear algebra)이 디컨볼루션을 위해 이용될 수 있다.
[0129] 제시된 단량체 결정을 위해, 다수의 상이한 측정들이 제공될 수 있다. 이들 측정들 중 일부는 상이한 전극간 거리들(d)에 대해 이루어질 수 있다. 일부 실시예들에서, 전극간 거리들 중 일부는 관심 단량체에 대한 단량체 종류를 결정하는데 더 적합할 수 있기 때문에, 다른 전극간 거리들에 대한 것보다 이 일부 전극간 거리들에 대한 데이터 품질이 더 나을 수도 있다. 다른 실시예들에서, 단량체를 결정할 때 이용가능한 모든 데이터를 이용하는 것이 바람직할 수도 있다. 일부 실시예들에서, 품질 메트릭은 컨센서스 단량체 결정을 수행할 때 각각의 측정을 가중하는데 이용될 수 있다. 이는 샘플들에 보다 유용할 수 있으며, 여기서 가능한 단량체들의 수는 예컨대 단백질 서열화를 위해서는 많을 수 있지만, 또한 DNA 서열화와 같은 더 적은 수의 단량체들을 갖는 샘플들도 이용될 수 있다.
[0130] 단백질 또는 당의 전기영동 속도(속력 및 방향)는 단량체 조성에 의존할 수 있다. 단백질의 전하는 양성, 음성 또는 중성일 수 있다. 전하 레벨 및 부호(sign)는 pH 및/또는 이온 농도에 의존할 수 있다. 일부 실시예들에서, 전하 대 질량비(charge to mass ratio)는 다수의 단량체들에 대해 상이할 수 있기 때문에, 전기영동 속도는 고분자 서열에 대한 전류 대 시간 프로파일로부터 결정될 수 있다. 일부 실시예들에서, 전기영동 속도는 단량체 조성 값을 발생시키는데 이용될 수 있고 서열 컨센서스 결정을 검사하거나 가중시키는데 활용될 수 있고, 또는 단량체 결정에 활용될 수 있으며, 여기서 테이블 또는 계산에서 비롯될 수 있는 단량체 종류들과 연관된 펄스 듀레이션들은 나노갭 전극 쌍(들)을 통해 고분자 속도에 기초하여 변형될 수 있다.
[0131] 일부 실시예들에서, 품질 메트릭은 디컨볼루션 이후 남아있는 부산물(residual)로부터 발생될 수 있다. 일부 실시예들에서, 품질 메트릭은 물리적 측정들, 예컨대 터널링 전류 레벨, 잡음 레벨, 이벤트 듀레이션 시간 또는 터널링 전류 모드로부터 발생될 수 있다.
[0132] 일부 생체고분자들에 대해 고분자내의 상이한 단량체 포지션들에서 전하가 달라질 수 있기 때문에, 이에 따라, 연관된 전기영동 속도가 변할 수 있다. 중성 분자들에 대해, 전기삼투 흐름(electroosmotic flow)의 결과가 없다면 어떠한 모션도 예상되지 않을 수 있다. 흐름 속력은 용액의 온도에 의존할 수 있고, 따라서, 이 흐름 속력은 상이한 용액 온도들을 가질 수 있는 시스템의 상이한 영역들에서 달라질 수 있다. 일부 실시예들에서, 생체고분자는 전기영동, 전기삼투, 압력 구동 흐름 또는 상기의 것들의 조합들 중 하나를 이용하여 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들을 지나 이동할 수 있다. 일부 실시예들에서, 흐름 특징들의 변경을 위해 샘플의 온도, pH 또는 이온 농도가 달라질 수 있다.
[0133] 따라서, 결정될 가능성이 있는 단량체(들)가 나노갭 전극 쌍들의 전극들 사이의 각각의 거리에 대해 사전에 설정될 수 있다. 동시에, 나노갭 전극 쌍들의 전극들 사이의 각각의 거리에 대해, 전극들 사이의 상이한 거리들에 대응하는, 쉽게 동정될 수 있는 기준 물질(54)이 사전에 선택될 수 있고, 이는 다수의 기준 물질들의 이용을 야기할 수 있고, 여기서 상이한 기준 물질들은 상이한 나노갭 전극 쌍들의 전극들과 연관된 상이한 전극간 거리들에 대한 표준으로 활용될 수 있다. 또한, 전극들 간의 거리에 대응하는 기준 물질(54)의 특정 컨덕턴스에 대해, 동정될 단량체(52)의 상대 컨덕턴스(이는 전극들 사이의 하나 또는 그 초과의 거리들을 활용하여 동정될 수 있음)가 사전에 상대 컨덕턴스 테이블(236)에 저장될 수 있다. 도 13은 상대 컨덕턴스 테이블(236)의 예를 도시한다.
[0134] 도 14는 동정 유닛(234)에 의해 유발될 수 있는 동정 프로세스를 개략적으로 도시한다. 도 14에 도시된 것처럼, 동정 유닛(234)은, 나노갭 전극 쌍들의 전극들 사이의 각각의 거리에 대한 컨덕턴스-시간 프로파일(들)에서 나타날 수 있는, 나노갭 전극 쌍의 전극들 간의 거리에 대응하는 기준 물질(54)을 표시하는 신호 이외의 신호들의 컨덕턴스들과, 동정될 단량체(52)의 상대 컨덕턴스들(이는 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 간의 거리(들)에 대해 동정될 수 있고, 상대 컨덕턴스 테이블(236)에 저장될 수 있음)을 비교하여, 각각의 신호에 표시된 단량체의 종류를 동정할 수 있다. 신호(들)(도 14에 "X"로 도시된 신호)가 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 간의 거리에 대한 컨덕턴스-시간 프로파일에 기초하여 동정될 수 없으면, 동정 유닛(234)은 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 사이의 다른 거리(들)에 대해 다른 컨덕턴스-시간 프로파일에 기초하여 단량체의 종류를 동정할 수 있다.
[0135] 생체분자 서열화 장치(210)를 이용하여 생체분자 서열화 방법이 실행되는 일부 실시예들에서, 도 10과 관련하여 설명되는 것과 유사한 방식으로, 적어도 하나 또는 그 초과의 종류들의 단량체(52)가 용액에서 분해될 수 있다. 이후, 상술된 기준 물질(들)(54)은 단량체(들)(52)가 분해될 수 있는 용액에 첨가될 수 있다. 일부 실시예들에서, 기준 물질(들)(54)이 첨가될 수 있고, 이는 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B 및 12C)의 전극들 간의 거리들(dl, d2 및 d3)에 대응하는 기준 물질로서 유용한 신호들을 제공할 수 있다.
[0136] 이후, 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B 및 12C)은 이들에 도입되는 샘플(50)을 가질 수 있다. 전압이 측정 전력원(18)에 의해 각각의 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B 및 12C)에 인가될 수 있고, 전압은 전기영동 전력원(22)에 의해 전기영동 전극 쌍(20)에 인가될 수 있다. 이후, 제어 유닛(226)을 포함하는 컴퓨터의 CPU가 ROM, RAM, FLASH 또는 다른 저장 매체에 저장될 수 있는 생체분자 서열화 프로그램을 리트리브하여 이를 실행시킬 수 있고, 이로써 도 15에 도시된 생체분자 서열화 프로세스가 생체분자 서열화 장치(210)에 의해 실행될 수 있다
[0137] 도 15에 도시된 생체분자 서열화 프로세스의 단계 S20에서, 측정 제어 유닛(232)은, 단량체(들)(52) 및 기준 물질(들)(54)이 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B 및 12C)의 전극들 사이에 형성된 경로를 통과할 수 있을 때 터널링(또는 터널) 전류들이 발생될 수 있도록, 전류계(24)를 제어할 수 있고, 여기서 측정은 미리결정된 시간 기간 동안 발생할 수 있다.
[0138] 이후, 단계 S22에서, 측정 제어 유닛(232)은 측정된 터널링 전류들의 전류 값들을 획득할 수 있고, 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 사이의 각각의 거리에 대해, 예를 들어, 도 3에 도시된 컨덕턴스-시간 프로파일이 생성될 수 있도록, 각각의 측정 포인트에 대한 컨덕턴스가 계산될 수 있다. 이후, 단계 S24에서, 동정 유닛(234)은 변수(i)를 1의 값으로 설정할 수 있다.
[0139] 이후, 단계 S26에서, 동정 유닛(234)은, 상대 컨덕턴스 테이블(236)로부터, 전극들 간의 거리(di)에 대응하는 단량체(들)(52)에 대한 상대 컨덕턴스, 즉, 나노갭 전극 쌍의 전극들 간의 거리(di)에 대해 동정될 수 있는 동정될 단량체(들)(52)의 상대 컨덕턴스를 획득할 수 있다.
[0140] 이후, 단계 S28에서, 동정 유닛(234)은, 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 간의 거리(di)에 대한 컨덕턴스-시간 프로파일(단계 S22에서 생성될 수 있음) 및 단계 S26에서 획득될 수 있는 상대 컨덕턴스를 비교하여, 각각의 신호에 의해 동정되는 단량체의 종류를 동정할 수 있다.
[0141] 이후, 단계 S30에서, 동정 유닛(234)이 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 간의 모든 거리들(di)에 대해 프로세스가 완료했는지 여부가 결정될 수 있다. 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 간의 프로세싱되지 않은 거리(di)가 있을 경우, 프로그램은 i가 1씩 증분되는 단계 S32로 진행할 수 있고, 프로그램은 단계 S26로 리턴한다. 프로세스가 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 간의 모든 거리들(di)에 대해 완료될 수 있을 때, 프로그램은 동정 유닛(234)이 동정 결과를 출력할 수 있는 단계 S34로 진행할 수 있고, 단량체 동정 프로세스가 완료될 수 있다.
[0142] 본원에서 설명된 것처럼, 생체분자 서열화 장치 및 방법은, 나노갭 전극 쌍들의 전극들 간에 상이한 거리들을 갖는 나노갭 전극 쌍들의 전극들 사이에서 발생되는 터널링 전류들로부터 획득되는 컨덕턴스들을 활용하여, 단일 나노갭 전극 쌍을 활용할 수 있는 생체분자 서열화 시스템 및 방법에 비해 보다 정밀한 그리고/또는 빠른 동정이 실행될 수 있게 할 수 있다.
[0143] 일부 실시예들에서, 나노갭 전극 쌍들은, 전극들 사이의 중심들이 단일 축상에 정렬될 수 있게 각각의 쌍들의 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B 및 12C)이 하나 위에 다른 하나가 적층되는 식으로 적층될 수 있게, 몇 개의 나노갭 전극 쌍들의 전극들 간의 정렬을 제공하도록 수직으로 적층될 수 있다; 다른 실시예들에서, 나노갭 전극 쌍들은, 각각의 나노갭 전극들(12A, 12B 및 12C)이 동일 평면상에 배열될 수 있도록, 몇 개의 나노갭 전극 쌍들의 전극들 간의 정렬을 허용할 수 있게 평면형 표면상에 수평으로 정렬될 수 있다. 추가 실시예들에서, 나노갭 전극 쌍들은 다수의 공통 축들과 배열되어, 병렬 측정들이 수행되도록 허용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B 및 12C)에 전기영동 전극들을 제공함으로써, 예를 들어, 단량체(들)(52) 및 기준 물질(들)(54)은 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B 및 12C)의 각각의 전극들 사이를 순차적으로 통과하도록 제어될 수 있다.
[0144] 일부 실시예들에서, 나노갭 전극 쌍들의 전극들의 전극간 거리들이 전극들 간에 상이한 거리들을 가질 수 있는 본원에 설명된 실시예들 외에, 다른 실시예들에서는, 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 간의 거리를 변화시키기 위한 메커니즘이 제공될 수 있다. 예를 들어, 레버리지(leverage)의 원리가 활용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 전력 포인트, 지원 포인트 및 액션 포인트의 기하학적인 배열(geometric arrangement)을 조절함으로써, 나노갭 전극 쌍의 전극들 간의 거리가 변경될 수 있다. 보다 특정하게, 압전 소자(piezoelectric element)를 활용하여 나노갭 전극 쌍(들)의 일부(part)를 상향 푸싱함으로써, 액션 포인트로 기능하는 나노갭 전극 쌍(들)의 전극의 단부(end)가 이동할 수 있고, 이로써 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 간의 거리가 변경될 수 있다. 일부 실시예들에서, 압전 소자 이동 거리와 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 간의 거리 간의 대응하는 관계에 기초하여, 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 간의 원하는 거리가 설정될 수 있다.
[0145] 일부 실시예들에서, 터널링 전류가 측정될 수 있고, 단량체들의 동정이 본원에 설명된 임의의 생체분자 서열화 방법(나노갭 전극들을 이용한 나노 전류 측정을 이용할 수 있음)을 이용하여 유발될 수 있다. 일부 실시예들에서, 분리 프로세스 또는 정제 프로세스와 같은 프로세싱 단계가 측정 이전에 요구되지 않을 수 있고, 폭넓은(wide) 실험 조건들에 대해 매우 선택적일 수 있는 고도의 정밀한 생체분자 서열화가 수행될 수 있다.
[0146] 예를 들어, 본원에서 설명된 생체분자 서열화 시스템 및/또는 방법이 전형적인 생체고분자 핵산 염기 사슬들을 측정하기 위해 이용될 수 있을 때, 유전자 서열 및 유전자 발현(gene expression) 분석이 보다 정밀하게 그리고 개선된 선택성으로 이루어질 수 있다. 게다가, 본원에서 설명된 생체분자 서열화 시스템 및/또는 방법은 저비용으로 신속한, 고감도 알레르겐(allergen) 검사 및 질병 진단에 적용될 수 있고, 이는 공중 보건, 안전 및 환경의 분야들에서 활용될 수 있다. 도 16에 도시된 일부 실시예들에서, 생체분자 서열화 장치(10)는 나노갭 전극 쌍(12), 전극간 거리 변경 유닛(16), 측정 전력원(18), 전기영동 전극 쌍(20), 전기영동 전력원(22), 전류계(24), 및 제어 유닛(26)을 포함할 수 있다. 이후, 각각의 구조들이 설명될 것이다.
[0147] 나노갭 전극 쌍(12)은 유전체(들)(14)상에 제공되며 전극간 거리(d)를 두고 서로 대면(face)하도록 배치되는 2개의 전극들을 가지며, 여기서 펩티드(50)가 나노갭 전극 쌍(12) 사이를 통과할 때, 터널링 전류가 흐를 수 있다. 전극간 거리(d)가 펩티드(50)를 포함하는 아미노산들(이들은 도 16에서 타원형들로 도시됨)의 분자 직경들보다 실질적으로 더 길 경우, 아주 약간의(very little) 터널링 전류가 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이를 흐를 수 있고, 그리고 동시에 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이에 둘 또는 그 초과의 아미노산들이 진입할 수 있다. 반대로, 전극간 거리(d)가 아미노산들의 분자 직경들에 비해 너무 짧을 경우, 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이에 펩티드(50)가 진입할 수 없다.
[0148] 전극간 거리(d)가 펩티드(50)를 포함하는 아미노산들의 분자 직경에 비해 너무 길거나 또는 너무 짧을 경우, 펩티드(50)를 포함하는 아미노산들의 각각의 아미노산에 대해 터널링 전류를 검출하는 것이 어려울 수 있다. 따라서, 전극간 거리(d)는 펩티드(50)를 포함하는 아미노산들의 분자 직경들보다 길거나, 이들보다 짧거나 또는 이들과 동일할 수 있다. 예를 들어, 전극간 거리는, 펩티드를 포함하는 아미노산들의 분자 직경의 0.5 내지 2배, 펩티드를 포함하는 아미노산들의 분자 직경의 1 내지 1.5배, 또는 펩티드를 포함하는 아미노산들의 분자 직경의 0.8 내지 1배, 또는 펩티드를 포함하는 아미노산들의 분자 직경의 1 내지 1.2배, 또는 단량체의 분자 직경과 전극간 거리 간의 개별 비(respective ratio)일 수 있다.
[0149] 여기서, 아미노산들의 분자 직경은 아미노산들의 종류들에 의존하여 상이할 수 있다. 터널링 전류는 측정될 분자 및 전극들 간의 거리에 의해 영향받을 수 있다. 따라서, 전극간 거리가 고정되는 경우, 다수의 종류들의 아미노산들 각각으로부터 유도되는 터널링 전류는 각각의 아미노산들의 결정이 높은 정확도로 측정되게 허용하지 않을 수 있다. 일부 실시예들에서, 전극간 거리(d)는, 나노갭 전극 쌍(12)이 상이한 시기들에서 몇 개의 상이한 전극간 거리를 갖도록, 전극간 거리 변경 유닛(16)에 의해 변경될 수 있다.
[0150] 전극간 거리 변경 유닛(16)은 나노갭 전극 쌍(12)의 전극간 거리(d)를 변경시키도록 (이후 논의될) 제어 유닛(26)에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 전극간 거리 변경 유닛(16)은, 레버 원리를 이용하여 조절함으로써 전극간 거리(d)가 변경될 수 있는 구성을 가질 수 있다. 예를 들어, 나노제조된 기계적으로 제어가능한 접합 분리(MCBJ: mechanically-controllable break junction)가 적절한 기계적 안정성으로 그리고 피코미터 이하(sub-picometer) 해상도로 전극간 거리를 제어하는데 이용될 수 있다. 나노제조된 기계적으로 제어가능한 접합 분리 방법을 이용함으로써 전극 쌍을 제조하는 방법은, 예를 들어, 인용에 의해 전체가 본원에 포함되는, J. M. van Ruitenbeek, A. Alvarez, I. Pineyro, C. Grahmann, P. Joyez, M. H. Devoret, D. Esteve, and C. Urbina, Rev. Sci. Instrum., 67, 108 (1996)에서 찾아볼 수 있다. 일부 경우들에서, 나노갭 전극 쌍(12)의 일부는 전극 에지 부분이 이동하도록 압전 소자에 의해 푸시업되어(pushed up), 전극간 거리(d)가 변경될 수 있는 구성이 달성될 수 있다. 이 경우, 압전 소자의 푸시-업 거리 및 전극간 거리 간의 관계에 기초하여, 의도된 전극간 거리가 설정될 수 있다. 예를 들어, 0.1nm 만큼 전극간 거리를 넓히기 위해, 압전 소자를 1 ㎛만큼 푸시업함으로써 전극간 거리(d)가 0.1nm 떨어져 이동될 수 있는 구성에서 MCBJ 셋업을 이용하여, 제어 유닛(26)은, 압전 소자가 1 ㎛ 만큼 푸시업될 수 있도록, 전극간 거리 변경 유닛(16)을 제어할 수 있다. 이 MCBJ 셋업 예는 1/10000의 기계적 전환비(conversion ratio)를 갖는다. 앞서 논의된 것처럼, 압전 소자를 이용하는 구성에서, 거리는, 예를 들어, 압전 소자의 최저 동작 제한(lower limit of action)에 따라, 약 0.1 pm(picometers), 0.5 pm, 1 pm, 10 pm, 100 pm, 또는 1000 pm 내로 제어될 수 있다.
[0151] 아미노산들의 직경들은 약 0.5 nm 내지 2 nm, 또는 0.7 nm 내지 1 nm(예를 들어, 0.8 nm)일 수 있다. 일부 경우들에서, 아미노산들의 직경들은 적어도 약 0.5 nm, 0.6 nm, 0.7 nm, 0.8 nm, 0.9 nm, 1 nm, 또는 2 nm일 수 있다. 대안적으로, 아미노산들의 직경들은 약 2 nm, 1 nm, 0.9 nm, 0.8 nm, 0.7 nm, 0.6 nm, 또는 0.5 nm 또는 이 미만일 수 있다. 아미노산들의 직경들이 당업자들에게는 공지되어 있기 때문에, 다수의 전극간 거리들은 전극간 거리 변경 유닛(16)을 이용하여 아미노산들의 분자 직경에 따라 선택될 수 있다.
[0152] 나노갭 전극 쌍(12)을 제조하기 위한 특정 방법들이 제한되는 것은 아니다. 이후, 이의 제조 방법의 일 예가 도시될 것이다.
[0153] 공지된 나노제조된 기계적으로 제어가능한 접합 분리 방법을 이용하여 나노갭 전극 쌍(12)이 제조될 수 있다. 나노제조된 기계적으로 제어가능한 접합 분리 방법은 우수한 기계적 안정성 및 피코미터 이하 분해능으로 전극간 거리를 제어하는 우수한 방법이다. 나노제조된 기계적으로 제어가능한 접합 분리 방법을 이용함으로써 전극 쌍을 제조하는 방법은, 논문, 예를 들어, "J. M. van Ruitenbeek, A. Alvarez, I. Pineyro, C. Grahmann, P. Joyez, M. H. Devoret, D. Esteve, and C. Urbina, Rev. Sci. Instrum., 67, 108 (1996)", or "M. Tsutsui, K. Shoji, M. Taniguchi, and T. Kawai, Nano Lett., 8, 345 (2008)"에서 찾을 수 있다. 전극의 재료에 관해, 다양한 금속들, 예컨대 금이 이용될 수 있다.
[0154] 일부 실시예들에서, 나노갭 전극 쌍(12)은 이후 설명되는 절차에 의해 제조될 수 있다. 먼저, 금의 나노미터 스케일 접합은 공지된 전자 빔 리소그래피 및 리프트-오프 기술을 활용할 수 있는 전자 빔 드로잉(electron beam drawing) 장치 JSM 6500F(카달로그 번호; EOL Ltd.에 의해 제조됨)을 이용하여 폴리이미드-코딩된 가요성 금속 기판상에 패터닝될 수 있다. 이후, 이 접합 아래의 폴리이미드는 반응성 이온 에칭 장치 10NR(카달로그 번호;SAMCO Inc.에 의해 제조됨)을 이용하여 공지된 에칭 방법(예컨대, 반응성 이온 에칭 방법)에 기초하여 에칭에 의해 제거될 수 있다.
[0155] 다음, 기판을 구부림으로써, 금을 포함할 수 있는 나노미터 스케일 브릿지(3-포인트 굽힘 구조를 가짐)가 획득될 수 있다. 일부 실시예들에서, 피에조 액추에이터 APA 150M(카달로그 번호; CEDRAT Technologies에 의해 제조됨)를 활용하여 기판의 굽힘을 정밀하게 제어함으로써, 전극 쌍과 연관된 전극간 거리가 피코미터 이하 해상도로 제어될 수 있다.
[0156] 다음, 제조된 브릿지의 단부들은 브릿지가 부분적으로 분리되도록 풀링될 수 있다. 제조된 브릿지의 단부들은 갭 길이(전극간 거리) 대 타겟 아미노산의 직경과 관련된 길이(이는 약 1 nm일 수 있음)를 설정하기 위해 추가로 풀링될 수 있다. 일부 실시예들에서, 전극 쌍을 형성하는 브릿지 부분의 풀링은 자체-분리(self-breaking) 기술을 활용하여 조절될 수 있고, 이로써 전극 쌍의 전극간 거리가 정밀하게 제어될 수 있다("M. Tsutsui, K. Shoji, M. Taniguchi, and T. Kawai, Nano Lett., 8, 345 (2008)" and "M. Tsutsui, M. Taniguchi, and T. Kawai, Appl. Phys. Lett, 93, 163115 (2008)" 참조).
[0157] 특히, 저항 피드백 방법("M. Tsutsui, K. Shoji, M. Taniguchi, and T. Kawai, Nano Lett., 8, 345 (2008)" and "M. Tsutsui, M. Taniguchi, and T. Kawai, Appl. Phys. Lett., 93, 163115 (2008)" 참조)을 통한 데이터 콜렉션 보드 NIPCIe-6321(카달로그 번호; National Instruments Corp.에 의해 제조됨)를 이용함으로써, 금 나노접합은, 브릿지를 분리시키기 위해 그리고 브릿지에서의 분리가 발생한 포지션을 측정하기 위해, 브릿지에 0.1 V DC 바이어스 전압(Vb)을 인가하는 동안, 직렬로 연결된 10 k 저항을 이용함으로써, 프로그래밍된 접합 풀링 속력을 이용하여 풀링될 수 있다. 이후, 브릿지는 추가로 풀링되어, 브릿지의 분리(breakage)에 의해 형성된 갭 길이(전극간 거리)를 목표 거리로 설정할 수 있다. 따라서, 나노갭 전극 쌍(12)이 형성될 수 있다.
[0158] 측정 전력원(18)은 나노갭 전극 쌍(12)에 전압을 인가할 수 있다. 측정 전력원(18)에 의해 나노갭 전극 쌍(12)에 인가되는 전압이 특별히 제한되는 것은 아니다; 예를 들어, 0.25 내지 0.75 V 범위의 전압이 인가될 수 있다. 측정 전력원(18)의 특정 구성이 특별히 제한되는 것은 아니며, 임의의 공지된 전력원 장치가 적절하게 이용될 수 있다.
[0159] 전기영동 전극 쌍(20)은 펩티드(50)의 이동 방향(도 16에서 화살표 "A")에 따라 정렬되는 전기장을 형성하도록 배치될 수 있다. 전기영동 전극 쌍(20)의 전극들 사이에 전기장이 형성될 때, 펩티드(50)는 전기영동에 의해 전기장의 방향으로 이동할 수 있거나, 또는 펩티드(50)의 순전하(net charge)에 의존하여 전기장의 방향과 반대 방향으로 이동할 수 있으며, 여기서 펩티드의 순전하는 양성 또는 음성일 수 있다. 즉, 펩티드(50)는 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이를 통과하도록 이동할 수 있다.
[0160] 전기영동 전력원(22)은 전기영동 전극 쌍(20)에 전압을 인가할 수 있다. 전기영동 전력원(22)을 이용하여 전기영동 전극 쌍(20)에 인가되는 전압이 특별히 제한되지 않을 수 있고, 따라서, 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이를 통과하는 펩티드(50)의 속력을 제어할 수 있는 전압이 적절하게 설정될 수 있다. 전기영동 전력원(22)에 의해 전기영동 전극 쌍(20)에 인가되는 전압은 예상되는 펩티드(50)의 전하 대 질량비 및 펩티드(50)의 순전하에 의존하여 달라질 수 있다. 전기영동 전력원(22)은 전기영동 전극 쌍(20)의 전극들 사이에 형성된 전기장의 방향이 반전될 수 있도록 전기영동 전극 쌍(20)에 전압을 인가할 수 있고, 이로써 펩티드(50)의 이동 방향이 전기영동 전력원(22)에 의해 인가되는 전기장의 반전(reversal)과 직접 연관되어 반전될 수 있어, 하나 또는 그 초과의 펩티드(들)(50)이 여러 번 측정될 수 있게 허용되며, 여기서 상이한 갭 공간들은 상이한 측정들에 활용될 수 있다. 따라서, 전기영동 전극 쌍(20)의 전극들 사이에서 이동할 수 있는 펩티드(50)의 이동 방향은, 특정 펩티드의 다수 측정들을 허용하도록 반전될 수 있다. 전기영동 전력원(22)의 특정 구성들이 특별히 제한되는 것은 아니며, 임의의 적절한 전력원 장치가 이용될 수 있다.
[0161] 일부 실시예들에서, 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들로 그리고 이 전극들을 통과하게 다른 고분자의 펩티드(50)를 이동시키기 위해 플루이딕 압력(fluidic pressure)이 활용될 수 있고, 여기서 나노갭 전극 쌍은 밀봉된(sealed) 채널에 설치될 수 있다. 펩티드 또는 고분자가 나노갭 전극 쌍(들)에 대해 일 방향으로 이동하게 유도되도록 차동 압력이 인가될 수 있고, 나노갭 전극 쌍(들)에 대해 펩티드(50) 또는 다른 고분자의 반대쪽 흐름을 유도하기 위해, 차동 압력이 반전될 수 있다.
[0162] 전류계(24)는, 측정 전력원(18)을 이용하여 전압이 인가될 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이를 펩티드(50)가 통과할 때 발생될 수 있는 전류(예를 들어, 터널링 전류)를 측정할 수 있다. 앞서 논의된 것처럼, 나노갭 전극 쌍(12)의 전극간 거리(d)는 전극간 거리 변경 유닛(16)에 의해 변경될 수 있다. 전류계(24)는 상이한 전극간 거리들을 활용하여 터널링 전류를 측정할 수 있다. 전류계(24)의 특정 구성이 특별히 제한되는 것은 아니며, 따라서, 임의의 공지된 전류 측정 장치가 적절하게 이용될 수 있다.
[0163] 제어 유닛(26)은 생체분자 서열화 장치(10)를 구성하는 컴포넌트들 각각을 제어할 수 있고, 또한 측정된 터널링 전류에 기초하여 펩티드(50)를 포함하는 아미노산들을 동정할 수 있다.
[0164] 도 17에 도시된 일부 실시예들에서, 제어 유닛(26)은, 이후 논의될 생체분자 서열화 프로그램을 적응(accommodate)시킬 수 있는 CPU(Central Processing Unit), RAM(Random Access Memory), ROM(Read Only Memory), GPU(Graphical Processing Unit) 등이 설치된 컴퓨터로 구성될 수 있다. 일부 실시예들에서, 컴퓨터와 연관된 제어 유닛(26)은 전극간 거리 제어 유닛(30), 측정 제어 유닛(32), 및 동정 유닛(34)을 포함하는 구성에 의해 기능적으로 표현될 수 있다. 이후, 각각의 유닛이 상세히 설명될 것이다.
[0165] 펩티드(50)가 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이를 여러 번 통과하게 하기 위해 ―여기서, 나노갭 전극 쌍(12)의 전극간 거리(d)는, 다양한 여러 전극간 갭 공간들(d)을 사용하여 펩티드(50)의 상이한 측정들이 유발될 수 있도록 변경될 수 있고, 나노갭 전극 쌍(12)의 전극간 거리(d)는 d1임―, 전극간 거리 제어 유닛(30)은, 전기영동 전극 쌍(20)의 전극들 사이의 전기장의 방향이 반전되어 펩티드(50)의 이동이 반전될 수 있고, 추가의 측정들이 수행되게 허용되도록, 전기영동 전력원(22)을 이용하여 인가되는 전압을 제어할 수 있다. 펩티드(50)가 미리결정된 횟수 동안 상이한 방향들로 전극들 사이를 통과하는 것을 완료한 후, 전극간 거리 제어 유닛(30)은 나노갭 전극 쌍(12)의 전극간 거리(d)가 d2(d2≠dl)가 되게 하기 위해 전극간 거리 변경 유닛(16)을 활성화시킬 수 있고, 그리고 미리결정된 횟수 동안 상이한 방향들로 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이를 펩티드(50)가 다시 통과하게 하기 위해 전기영동 전력원(22)을 이용하여 인가되는 전압을 제어할 수 있다. 전극간 거리 제어 유닛(30)은 다양한 여러 전극간 거리들이 활용되게 할 수 있고, 다수의 전극간 거리들(d)(d=dl, d2, d3....)을 갖는 나노갭 전극 쌍(12)에 의해 측정들이 수행되게 허용한다. 거리들은, 예를 들어, dl=l.0 nm, d2=0.7 nm, 및 d3=0.5 nm으로 설정될 수 있다.
[0166] 도 17에 도시된 것처럼, 측정 제어 유닛(32)은 다양한 여러 전극간 거리들에 대한 터널링 전류를 측정하도록 전류계(24)를 제어할 수 있다. 터널링 전류의 측정 시간이 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 및 1 시간의 시간이 이용될 수 있다. 측정 시간은 펩티드(50)의 길이에 따라 적절히 설정될 수 있다. 측정 제어 유닛(32)은 전류계(24)에 의해 측정되는 터널링 전류의 전류 값들을 결정할 수 있고, 이로 인해, 컨덕턴스들이 이렇게 하여 결정된 전류 값들로부터 계산될 수 있어, 컨덕턴스-시간 프로파일이 만들어질 수 있다. 컨덕턴스는, 터널링 전류가 측정되는 시간에, 터널링 전류의 전류 값들을 나노갭 전극 쌍(12)에 인가되는 전압(V)으로 나눔으로써 계산될 수 있다. 계산된 컨덕턴스 값들을 활용함으로써, 나노갭 전극 쌍(12)에 인가되는 전압이 상이한 측정들에 대해 상이할지라도, 통일된 표준에 기초하는 프로파일이 획득될 수 있다. 나노갭 전극 쌍(12)에 인가되는 전압의 값들이 각각의 측정에 대해 일정하게 이루어질 수 있는 일부 실시예들에서, 터널링 전류와 연관된 컨덕턴스 및 전류 값은 동일하게 프로세싱될 수 있다.
[0167] 대안적으로, 측정 제어 유닛(32)은, 전류 증폭기에 의해 터널링 전류가 한번 증폭된 후, 전류계(24)에 의해 측정되는 터널링 전류를 결정할 수 있다. 전류 증폭기를 이용함으로써, 매우 약한 터널링 전류의 값이 증폭될 수 있고, 이로써 터널링 전류가 고감도로 측정될 수 있다. 전류 증폭기와 관련하여, 예를 들어, 상업적으로 이용가능한 고속 가변 전류 증폭기DHPCA-100(카달로그 번호; FEMTO messtechnik GmbH에 의해 제조됨)가 이용될 수 있다.
[0168] 동정 유닛(34)은, 측정 제어 유닛(32)에 의해 구성되는 컨덕턴스-시간 프로파일로부터 획득된 검출되는 물리량들을 기준 물리량 테이블(36)에 저장될 수 있는 인지된 종류들의 아미노산들의 기준 물리량들과 비교함으로써, 펩티드(50)를 포함하는 아미노산들을 동정할 수 있다. 일부 실시예들에서, 검출되는 물리량은 측정 제어 유닛(32)에 의해 구성되는 컨덕턴스-시간 프로파일의 각각의 측정 포인트에서의 컨덕턴스일 수 있다.
[0169] 이후, 기준 물리량 테이블(36)에 저장되는 기준 물리량이 설명될 것이다. 일부 실시예들에서, 각각의 종류의 아미노산들 및 인지된 종류들의 아미노산들과 관련하여 측정되는 각각의 전극간 거리(d)에 대한 상대 컨덕턴스가 기준 물리량으로 이용될 수 있다. 상대 컨덕턴스는 하기의 절차에 의해 사전에 계산될 수 있다.
[0170] 먼저, 생체분자 서열화 장치(10)에서, 전극간 거리 변경 유닛(16)은, 전극간 거리(d)가 dl(예를 들어, dl=1.0 nm)으로 설정될 수 있도록, 전극간 거리 제어 유닛(30)에 의해 제어될 수 있다. 이후, 나노갭 전극 쌍(12)이 용액(이 용액에는, 20 또는 그 초과의 인지된 종류들의 아미노산들 중에서, 하나의 종류의 아미노산들이 분해될 수 있음)에 배치된 후, 전기영동 전력원(22)을 이용하여 전기영동 전극 쌍(20)에 전압이 인가될 수 있고, 측정 전력원(18)을 이용하여 나노갭 전극 쌍(12)에 전압이 인가되어, 아미노산들이 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이를 통과하게 된다. 이후, 아미노산들이 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이를 통과할 때 발생되는 터널링 전류들의 전류 값이 미리결정된 기간 동안(예를 들어, 50분 동안) 전류계(24)에 의해 측정될 수 있다. 이 측정된 전류 값은 컨덕턴스-시간 프로파일을 발생시키도록 측정 제어 유닛(32)에 의해 결정될 수 있다. 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이에 인가되는 전압이 특별히 제한되는 것은 아니며, 이는 예를 들어, 0.25 내지 0.75 V 범위로 구성될 수 있다.
[0171] 다음, 동정 유닛(34)은 측정 제어 유닛(32)에 의해 구성되는 컨덕턴스-시간 프로파일로부터 다수의 펄스들을 검출할 수 있고, 동시에, 검출된 다수의 펄스들 각각에 대한 최대 컨덕턴스(ip) 및 펄스 듀레이션 시간(td)을 검출할 수 있다(도 18 참조). 검출된 펄스들의 수가 제한되는 것은 아니다. 더 많은 펄스들이 아미노산을 특성화시키는데 이용되며, 더 정확하게 기준 물리량이 계산될 수 있다. 또한, 펄스들의 수는, 예를 들어, 터널링 전류의 측정 시간 증가에 의해 그리고 횟수의 증가에 의해 증가될 수 있고, 아미노산은 단일 나노갭 거리를 활용하여 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들을 통해 앞뒤로 이동하게 될 수 있다.
[0172] 최대 컨덕턴스(ip) 및 펄스 듀레이션 시간(td)의 검출을 위한 방법들이 보다 구체적으로 설명될 것이다. 먼저, 컨덕턴스-펄스 프로파일로부터 다수의 펄스들을 검출하는 방법을 설명하기 위해, 터널링 전류가 발생되는 메커니즘이 설명될 것이다.
[0173] 펩티드(50)가 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이에 진입할 때, 먼저, 펩티드(50)를 포함하는 임의의 아미노산들이 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이에 트랩될 수 있다(이후, 이는 제 1 아미노산으로 지칭됨). 제 1 아미노산이 전극들 사이에 트랩되는 시기에, 제 1 아미노산으로부터 유도되는 터널링 전류가 전극 쌍(12)의 전극들 사이에서 발생될 수 있다.
[0174] 이후, 제 1 아미노산이 전극들 사이를 완전히 통과한 후, 다른 아미노산이 전극 쌍(12)의 전극들 사이에 트랩될 수 있다(이후, 이는 제 2 아미노산으로 지칭됨). 제 2 아미노산이 전극들 사이에 트랩될 수 있는 시기에, 제 2 아미노산으로부터 유도되는 터널링 전류가 전극 쌍(12)의 전극들 사이에서 발생될 수 있다. 여기서, 제 2 아미노산은 제 1 아미노산 옆에 위치되는 아미노산일 수도 있고 또는 제 1 아미노산 옆이 아닌 아미노산일 수도 있다.
[0175] 앞서 언급된 바와 같이, 펩티드(50)를 포함하는 아미노산들로부터 유도되는 터널링 전류들은 나노갭 전극 쌍(12)의 전극들 사이에서 발생될 수 있다. 전극들 사이를 아미노산들이 통과할 때(펩티드(50)를 포함하는 마지막 아미노산이 전극들 사이로부터 방출(released)될 때), 전극들 사이에서 발생된 터널링 전류들이 사라질 수 있거나 또는 백그라운드 레벨(background level)로 감소될 수 있다.
[0176] 또한, 동정 유닛(34)은, 컨덕턴스-시간 프로파일의 터널링 전류의 전류 값에 대응하는 컨덕턴스가 베이스 레벨 이상인 영역에서, 컨덕턴스-상승 시간 및 컨덕턴스-하강 시간을 동정함으로써 컨덕턴스-시간 프로파일로부터 펄스를 검출할 수 있다. 베이스 레벨은, 사전에 설정될 수 있거나, 또는 오실로스코프에 의해 컨덕턴스-시간 프로파일을 확인함으로써, 또는 컨덕턴스-시간 프로파일에 대한 베이스 레벨을 최적합(best fit) 특정 컨덕턴스-시간 프로파일로 핏팅(fitting)됨으로써 설정될 수 있는 식이다.
[0177] 일부 실시예들에서, 컨덕턴스-상승 및 컨덕턴스-하강 이벤트들의 결정을 위한 베이스 레벨은 런(run) 전반에 걸쳐 조절될 수 있어, 잠재적으로 나노갭 전극 쌍 전극 팁 변동에서의 변동들에 대해 보상하거나 또는 예상되는 전류 레벨들, 베이스 레벨들 및 트랩핑 타이머 인터벌들에서의 일치 변화(concordant change)들에 따라 온도 변동 유도 갭 공간 변화들을 보상한다.
[0178] 또한, 검출된 펄스들 각각에 대해, 동정 유닛(34)은 펄스 듀레이션 시간(td), 펄스를 검출하도록 동정될 수 있는 컨덕턴스-상승 시간과 컨덕턴스-하강 시간 사이의 시간을 검출하고, 또한 각각의 펄스와 연관된 컨덕턴스의 최대 값, 최대 컨덕턴스(ip)를 검출할 수 있다.
[0179] 도 18에 도시된 일부 실시예들에서, 측정 제어 유닛(32)에 의해 구성되고, 또한 도 3에 도시된 컨덕턴스-시간 프로파일에 대한 확대도로 컨덕턴스-시간 프로파일이 도시되며, 여기서 펄스들, 최대 컨덕턴스(ip), 및 동정 유닛(34)에 의해 검출되는 펄스 듀레이션 시간(td)의 일 예가 도시된다.
[0180] 여기서, 하나의 종류의 아미노산들로부터 유도되는 펄스들이 검출될 수 있다. 그러나, 각각의 펄스에 대해 검출될 수 있는 최대 컨덕턴스(ip) 및 펄스 듀레이션 시간(td)에서는 편차(variance)들이 있을 수 있다. 터널링 전류에서의 펄스는 전극들 사이에서 아미노산의 이동에 의해 야기되는 아미노산과 전극(들) 사이의 거리의 변화로부터 발생될 수 있다. 즉, 전극(들)과 아미노산 간의 거리가 더 짧아질 경우, 터널링 전류는 보다 쉽게 발생될 수 있고, 결과적으로, 터널링 전류의 전류 값들은 증가할 수 있다(컨덕턴스가 증가할 수 있다). 전극들과 아미노산 간의 거리가 더 커질 경우, 터닐링 전류의 발생은 감소할 수 있다(컨덕턴스가 감소할 수 있다). 컨덕턴스가 본원에 설명된 방식으로 증가 및 감소할 수 있기 때문에, 펄스들의 최대 컨덕턴스(ip) 및 펄스 듀레이션 시간(td)의 변동이 발생할 수 있다.
[0181] 따라서, 각각의 펄스에 대한 최대 컨덕턴스(ip) 및 펄스 듀레이션 시간(td)의 모드 값들은 통계적 분석을 이용하여 계산될 수 있다. 예를 들어, 최대 컨덕턴스(ip)의 값들과 이 값을 갖는 펄스들의 수 간의 관계를 도시하는 히스토그램이 형성될 수 있다. 예를 들어, 도 19에 도시된 것과 같은 히스토그램이 형성될 수 있다. 도 19에서, 다수의 종류들의 아미노산들의 히스토그램들이 중첩된다. 미리결정된 함수는 형성된 히스토그램에 핏팅될 수 있고, 모드 값은 핏팅된 함수의 피크 값으로부터 계산될 수 있다. 최대 컨덕턴스(ip)의 모드 값이 피크 컨덕턴스(Ip)로 취해질 수 있다.
[0182] 유사하게, 펄스 듀레이션 시간(td)과 관련하여, 펄스 듀레이션 시간(td)의 값과 이 값을 갖는 펄스들의 수 간의 관계를 도시하는 히스토그램이 형성될 수 있다. 예를 들어, 도 20에 도시된 것과 같은 히스토그램이 형성될 수 있다. 미리결정된 함수는 형성된 히스토그램에 핏팅될 수 있고, 모드 값은 이 핏팅된 함수의 피크 값으로부터 계산될 수 있다. 이 펄스 듀레이션 시간(td)의 모드 값이 피크 펄스 듀레이션 시간(tp)으로 취해질 수 있다.
[0183] 핏팅을 위해 이용될 함수와 관련하여, 가우시안 함수들 및 푸아송 함수들 및/또는 이들의 조합들이 이용될 수 있지만, 가우시안 함수를 이용할 때, 증가된 데이터 프로세싱 속도로 인한 장점이 있기 때문에, 가우시안 함수가 바람직할 수 있다.
[0184] 모드 값을 계산하기 위해 통계적 분석에 이용될 펄스들의 수가 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 이 수는 500개 내지 1000개, 또는 100개 내지 1000개, 또는 10개 내지 10,000개의 범위일 수 있다. 일부 경우들에서, 이용되는 펄스들의 수는 적어도 약 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 1000개, 5000개, 또는 10000개이다. 대안적으로, 이용되는 펄스들의 수는 약 10000개, 5000개, 1000개, 500개, 400개, 300개, 200개, 100개, 90개, 80개, 70개, 60개, 50개, 40개, 30개, 20개, 또는 10개 또는 그 미만이다. 특정 수의 펄스들이 통계적 분석에 이용되는 경우, 모드 값의 통계적 유의성(statistical significance)이 계산될 수 있다. 모드 값은 각각의 아미노산에 내재하며, 이로써, 이 모드 값이 아미노산의 종류를 동정하기 위한 지표(indicator)로 이용될 수 있다.
[0185] 다음, 계산된 피크 컨덕턴스(Ip) 및 베이스 라인 컨덕턴스(Ib)를 이용함으로써, 단일 아미노산 분자의 컨덕턴스가 다음 식(1)에 의해 계산될 수 있다: 단일 아미노산 분자의 컨덕턴스 = (Ip -lb).
[0186] 예를 들어, 도 21에 도시된 것처럼, 측정 포인트들의 컨덕턴스에 관해 형성되는 히스토그램에 나타나는 피크들 중 컨덕턴스가 최저치인 피크에 대응하는 컨덕턴스의 값일 수 있는 베이스 라인 컨덕턴스(Ib)는 베이스 라인 컨덕턴스(Ib)를 결정하는데 이용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 잠재적으로, 상이한 버퍼, 상이한 온도 또는 미리결정된 베이스 라인 컨덕턴스를 발생시키는데 활용되는 조건들과 상이한 다른 가능한 차들의 사용으로 인해, 베이스 라인 컨덕턴스가 미리결정된 베이스 라인 컨덕턴스와 상이할 수 있고, 베이스 라인 컨덕턴스는, 서열 측정이 시작되기 전에, 용액내에 측정될 세트의 펩티드들 또는 다른 고분자들이 있을 수 있는 버퍼와 일치하는 버퍼를 유입시킴으로써, 그리고 새로운 미리결정된 베이스 라인 컨덕턴스를 생성함으로써 발생될 수 있다. 다른 실시예들에서, 베이스 라인 컨덕턴스는 단량체 동정 데이터를 획득하는 동안 포착되는 데이터로부터 결정될 수 있으며, 이는 베이스 라인 콘덕턴스 레벨을 설정하기 위해 펩티드(들)(50) 또는 다른 고분자들 사이에서의 데이터를 활용할 수 있다. 추가 실시예들에서, 예를 들어, 나노갭 전극 쌍에 대한 동작 온도가 안정적이지 않을 수도 있을 경우 또는 버퍼의 이온 농도가 증발로 인해 안정적이지 않을 수도 있을 경우, 베이스라인 컨덕턴스가 안정적이지 않을 수 있고, 베이스 라인 컨덕턴스들은 펩티드(들) 또는 다른 고분자 서열화 프로세스 동안 여러 시간들에서 결정될 수 있다. 추가적 실시예들에서, 베이스 라인 컨덕턴스는, 연속 곡선이 활용될 수 있도록 생성된 데이터에 핏팅될 수 있으며, 여기서 연속 곡선은 펩티드 또는 다른 서열화 프로세스에 걸쳐 시간에 따라 달라질 수 있다.
[0187] 본원에서 언급된 것처럼, 단일 아미노산 분자의 컨덕턴스를 계산하는 프로세스는 전극간 거리(d)를 dl, d2, d3 등으로 변경함으로써 상이한 전극간 거리들(d)과 관련하여 수행될 수 있다. 추가로, 단일 아미노산 분자의 컨덕턴스는 각각의 전극간 거리(d)에 대한 20개 또는 그 초과의 종류들의 아미노산들 모두에 대해 계산될 수 있다.
[0188] 각각의 전극간 거리(d)에 대해, 각각의 단일 아미노산 분자와 연관된 컨덕턴스를 20개 또는 그 초과의 종류들의 아미노산들 모두의 단일 아미노산 분자의 컨덕턴스의 최대값으로 나눔으로써, 각각의 단일 아미노산 분자와 연관된 상대 컨덕턴스(G)가 계산될 수 있다.
[0189] 도 12에서, 상이한 전극간 거리들(d)에 대한 일부 아미노산들의 상대 컨덕턴스들(G)이 도시된다. 도 12에 도시된 것과 같은 비제한적 예들에서, 전극간 거리(d)는 dl=1.0 nm, d2=0.7 nm, 및 d3=0.4 nm일 수 있다. 도 12에 도시된 것처럼, 전극간 거리(d)는 0.4 nm일 수 있고, His, Thr, Tyr, 및 Trp의 상대 컨덕턴스들(G)은 서로 근접할 수 있다. 유사하게, 전극간 거리(d)가 0.7nm일 수 있을 때, Cys 및 Pro의 상대 컨덕턴스들(G), 그리고 Tyr 및 Trp의 상대 컨덕턴스들(G)은 서로 근접할 수 있다. 유사하게, 전극간 거리(d)가 1.0 nm일 수 있을 때, Cys, Pro, 및 Phe의 상대 컨덕턴스들(G)은 서로 근접할 수 있다. 이들 근접한 상대 컨덕턴스들(G)이 아미노산 종류를 동정하는 지표로 이용될 경우, 동정 정확도가 낮아질 수 있다는 위험이 있다.
[0190] 따라서, 상이한 나노갭 전극 쌍들에 대해 측정되는 터널링 전류들로부터 계산될 수 있는 상대 컨덕턴스들(G)가 있는 가운데, 각각의 나노갭 전극 쌍은 상이한 전극간 거리를 가질 수 있고, 각각의 상이한 전극간 거리와 연관된 상이한 상대 컨덕턴스(G)를 가질 수 있고, 이로써 상이한 종류들의 아미노산들이 각각의 전극간 거리와 연관된 상이한 미리결정된 정확도로 동정가능해질 수 있다.
[0191] 아미노산들의 종류들이 특정 상대 컨덕턴스에 의해 미리결정된 정확도로 동정가능한지 여부가, 예를 들어, 하기의 절차에 의해 판단될 수 있다.
[0192] 도 22의 상단 부분의 도면에 도시된 것처럼, d1인 전극간 거리(d)를 통해 측정된 터널링 전류로부터 계산될 수 있는 상대 컨덕턴스들(G)의 값들, 및 피크 펄스 듀레이션 시간(tp)의 값들이 tp-G 공간에 맵핑될 수 있다. 맵핑된 포인트들은 클러스터 분석(cluster analysis)을 이용함으로써 상이한 클래스들로 분류될 수 있다. 클러스터 분석에 대해, 공지된 방법들이 이용될 수 있으며, 여기서, 각각의 클래스에 포함된 각각의 포인트가 다른 포인트들과 모두 분리될 수 있고 그리고 동시에, 각각의 클래스에 포함된 모든 포인트들 중 적어도 하나의 포인트가 잡음 영역(도 22에서 음영이 있는 영역) 외부에 존재한다면, 클래스에 속하는 포인트에 의해 도시된 상대 컨덕턴스(G)는, 아미노산의 종류를 미리결정된 정확도로 동정할 수 있는 상대 컨덕턴스인 것으로 판단된다. 각각의 클래스에 포함된 각각의 포인트가 다른 포인트들과 모두 분리될 수 있는 경우가 한 가지 경우로 설명되며, 여기서, 예를 들어, 포인트들 간의 모든 거리들은 이전에 결정된 임계 값을 초과한다.
[0193] 도 22의 상단 부분의 도면에서, 클래스 0으로 분류되는 아미노산들 K, R, E, 및 D에 대응하는 모든 포인트들뿐만 아니라 클래스 1로 분류되는 아미노산들 W, Y, F, 및 H에 대응하는 모든 포인트들이 분리될 수 있다는 것이 도시된다. 또한, 클래스 0에 포함된 모든 포인트들 및 클래스 1에 포함된 모든 포인트들은 잡음 영역 외부에 존재할 수 있다. 따라서, 클래스 0 및 클래스 1에 포함된 각각의 포인트에 의해 도시된 상대 컨덕턴스들(G)을 이용하여, 각각의 포인트들에 대응하는 아미노산들의 종류들이 미리결정된 정확도로 동정될 수 있다는 것이 판단될 수 있다. 이에 따라, 클래스 0 및 클래스 1에 포함된 각각의 포인트에 대응하는 아미노산들의 종류들 및 각각의 포인트들에 의해 도시된 상대 컨덕턴스들(G)은, 전극간 거리(d)와 관련하여 기준 물리량 테이블에 저장될 수 있다(도 22의 상단 부분의 도면의 예에서, d=dl).
[0194] 도 22의 상단 부분의 도면은 클래스 0 및 클래스 1 이외의 클래스들에 포함된 모든 포인트들는 완전히 분리가능하지 않거나, 또는 클래스들에 포함된 포인트들이 잡음 영역에 존재할 수 있다는 것을 도시한다. 이에 따라, 도 22의 중간 부분의 도면에 도시된 것처럼, 미리결정된 정확도로 동정가능하다고 판단되지 않는 아미노산들, d2일 수 있는 전극간 거리(d)를 이용하여 측정된 터널링 전류들로부터 계산될 수 있는 상대 컨덕턴스들(G)의 값들 및 피크 펄스 듀레이션 시간(tp)의 값들이 tp-G 공간에 맵핑될 수 있다. 맵핑되는 포인트들은 각각의 클래스로 분류될 수 있다. 도 22의 중간 부분의 도면에서는, 아미노산들 P, C, L, 및 N에 대응하는 모든 포인트들은 클래스 2로 분류될 수 있고 그리고 분리될 수 있다는 것이 도시된다. 또한, 클래스 2에 포함된 모든 포인트들은 잡음 영역 외부에 존재할 수 있다. 이에 따라, 클래스 2에 포함된 각각의 포인트에 의해 도시되는 상대 컨덕턴스들(G)에 의해, 각각의 포인트들에 대응하는 아미노산들이 미리결정된 정확도로 동정될 수 있다는 것이 판단될 수 있다. 따라서, 클래스 2에 포함된 각각의 포인트들에 대응하는 아미노산들 및 각각의 포인트들에 의해 도시된 상대 컨덕턴스들(G)이 전극간 거리(d)와 관련하여 기준 물리량 테이블에 저장될 수 있다(도 22의 중간 부분의 도면의 예에서, d=d2).
[0195] 도 22의 중간 부분의 도면은 클래스 2 이외의 클래스들에 포함된 모든 포인트들이 분리가능하지 않거나, 또는 클래스들에 포함된 포인트들이 잡음 영역에 존재할 수 있다는 것을 도시한다. 이에 따라, 도 22의 하단 부분의 도면에 도시된 것처럼, 미리결정된 정확도로 동정가능하다고 판단되지 않는 아미노산들, d3일 수 있는 전극간 거리(d)를 통해 측정된 터널링 전류들로부터 계산될 수 있는 상대 컨덕턴스들(G)의 값들 및 피크 펄스 듀레이션 시간(tp)의 값들이 tp-G 공간에 맵핑될 수 있고; 맵핑되는 포인트들은 각각의 클래스로 분류될 수 있다. 도 22의 하단 부분의 도면에서, 클래스 3으로 분류되는 아미노산들 M. I. T, S, A, 및 V에 대응하는 모든 포인트들뿐만 아니라 클래스 4로 분류되는 아미노산들 G 및 Q에 대응하는 모든 포인트들이 분리될 수 있음을 도시된다. 또한, 클래스 3에 포함된 모든 각각의 포인트들 및 클래스 4에 포함된 모든 포인트들은 잡음 영역 외부에 존재한다. 이에 따라, 클래스 3 및 클래스 4에 포함된 포인트들에 의해 도시되는 상대 컨덕턴스들(G)을 이용하여, 각각의 클래스들에 대응하는 아미노산들이 미리결정된 정확도로 동정될 수 있다는 것이 판단될 수 있다. 따라서, 클래스 3 및 클래스 4에 포함된 각각의 포인트들에 대응하는 아미노산들 및 각각의 포인트들에 의해 도시된 상대 컨덕턴스들(G)이 전극간 거리(d)와 관련하여 기준 물리량 테이블에 저장될 수 있다(도 22의 하단 부분의 도면의 예에서, d=d3).
[0196] 이에 따라, 상기 예들에서, 클래스 0 및 클래스 1에 속하는 아미노산들과 관련하여, dl일 수 있는 전극간 거리(d)를 통해 측정되는 터널링 전류들로부터 계산될 수 있는 상대 컨덕턴스들(G)이 기준 물리량들로 이용될 수 있다. 클래스 2에 속하는 아미노산들과 관련하여, d2일 수 있는 전극간 거리(d)를 통해 측정되는 터널링 전류들로부터 계산될 수 있는 상대 컨덕턴스들(G)이 기준 물리량들로 이용될 수 있다. 그리고, 클래스 3 및 클래스 4에 속하는 아미노산들과 관련하여, d3일 수 있는 전극간 거리(d)를 통해 측정되는 터널링 전류들로부터 계산될 수 있는 상대 컨덕턴스들(G)이 기준 물리량들로 이용될 수 있다.
[0197] 앞서 논의된 것처럼, 상이한 세트들의 나노갭 전극 쌍들을 이용하여 측정되는 전류들(예를 들어, 터널링 전류들)로부터 계산될 수 있는 상대 컨덕턴스들(G)이 있는 가운데, 각각의 나노갭 전극 쌍은 상이한 전극간 거리를 가질 수 있고, 상대 컨덕턴스(G)(상대 컨덕턴스(G)를 이용하여, 아미노산들의 종류들이 미리결정된 정확도(예를 들어, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 초과의 정확도)로 동정될 수 있음)가 각각의 전극간 거리와 관련하여 선택되고 기준 물리량 테이블 또는 매트릭스에 저장될 수 있다. 이는 중간 거리들에 대해 계산(예를 들어, 보간)될 수 있다. 잡음 영역에 있을 수 있는 또는 완전히 결정가능하지 않는 거리들로부터의 데이터가 더 나은 확실성(certainty)을 제공하는데 이용될 수 있다.
[0198] 보간 하에, 다항식 함수, 로그 함수, 지수 함수 또는 임의의 다른 함수 또는 함수들의 조합일 수 있는 주어진 함수는, 기존의 데이터에 대한 최적합(best fit)에 기초한 곡선을 표현하도록 결정될 수 있고, 새로운 데이터 포인트와 곡선 간의 관계는 새로운 데이터 포인트와 연관된 대응 값을 결정하는데 활용될 수 있다. 예에서, 함수는 예를 들어, 기준 물질의 터널링 전류와 전극간 거리 사이에서 결정될 수 있다. 함수는 터널링 전류 이론 및 측정들의 조합에 기초할 수 있으며, 추가 함수는, 예를 들어, 아미노산 또는 핵산 분자(또는 다른 생체분자)의 터널링 전류와 전극간 거리 사이에서 결정될 수 있으며, 여기서 함수는 터널링 전류 이론 및 측정들의 조합으로부터 다시 유도될 수 있다. 기준 물질과 연관된 측정되는 터널링 전류들에 기초하여, 예상되는 터널링 전류가, 예를 들어 아미노산에 대해 결정될 수 있다. 터널링 전류 이론 분석은 최고준위 점유 분자 궤도(highest occupied molecular orbital) 및 최저전위 비점유 분자 궤도(lowest unoccupied molecular orbital) 또는 분자의 분석을 포함할 수 있다.
[0199] 동정 유닛은, 동정될 펩티드를 측정하는 터널링 전류들의 전류 값들에 기초할 수 있는 컨덕턴스-시간 프로파일의 각각의 측정 포인트(검출된 물리량)에서의 컨덕턴스, 및 기준 물리량 테이블에 저장되며 본원에서 언급된 것처럼 계산될 수 있는 인지된 종류들의 아미노산들의 상대 컨덕턴스(G)(기준 물리량)를 비교함으로써 아미노산들을 동정할 수 있고, 이로써, 펩티드를 포함하는 아미노산들의 서열이 결정될 수 있다. 동정 절차(들)의 상세사항이 이후 논의될 것이다.
[0200] 다음, 생체분자 서열화 장치의 동작이 설명될 것이다. 먼저, 도 23a에 도시된 것처럼, 샘플 소스로부터 샘플이 취해질 수 있고, 단백질(들)의 추출 및 정제가 수행될 수 있다. 이후, 도 23b에 도시된 것처럼, 변성제(denaturation agent)(수소 결합 억제제)가 이와 같이 추출되고 정제된 단백질에 첨가되어, 단백질이 3차원 구조에서 선형 구조로 변성될 수 있다. 이후, 도 23c에 도시된 것처럼, 선형 구조로 변성될 수 있는 단백질은, 프로테아제들, 예컨대 트립신, 펩신, 엘라스타제, 디액톡시요오도벤젠(diacetoxyiodobenzene)과 같은 효소들을 이용한 사슬의 선택적 분리(breakage)에 의해, 또는 키모트립신에 의해 또는 화학적 분해제들(chemical cleavage agents), 예컨대 요도소벤젠산(iodosobenzoic acid) 또는 시안화브롬에 의해 펩티드들로 분해될 수 있거나, 또는 초음파 방법, 또는 UV광에 대한 노출을 이용하여 분해될 수 있다; 분해(cleavage)는 온도의 선택에 의해 보조될 수 있으며, 이로써 선택된 온도는 통상적으로 대기(ambient)보다 높을 수 있다.
[0201] 다음, 이렇게 획득된 펩티드들은 용액에서 분해될 수 있다. 용액이 특별히 제한되는 것은 아니며, 기준 물리량들을 측정하기 위해 아미노산들이 분해되는 것과 동일한 용액이 이용될 수 있다. 예를 들어, 초순수가 이용될 수 있다. 초순수는, 예를 들어, 예를 들어, Milli-Q Integral 3/5/10/15(Milli-Q Integral 3의 장치 이름을 갖는, 카달로그 번호: Merck KGaA에 의해 제조됨)를 이용함으로써 마련될 수 있다. 용액에서의 펩티드(50)의 농도가 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 0.01 내지 1.0 μＭ 범위의 농도가 이용될 수 있다. 용액에서 펩티드(50)의 농도는 약 0.01 μＭ 내지 1.0 μＭ, 또는 0.01 μＭ 내지 0.5 μＭ일 수 있다. 일부 경우들에서, 용액에서의 펩티드(50)의 농도는 약 5 μＭ, 4 μＭ, 3 μＭ, 2 μＭ, 1.5 μＭ, 1 μＭ, 0.5 μＭ, 0.1 μＭ, 또는 0.01 μＭ 미만이다. 대안적으로, 용액에서의 펩티드(50)의 농도는 약 0.01 μＭ, 0.1 μＭ, 0.5 μＭ, 1 μＭ, 1.5 μＭ, 2 μＭ, 3 μＭ, 4 μＭ, 또는 5 μＭ보다 크다.
[0202] 펩티드들이 분해된 용액에 나노갭 전극 쌍이 배치된 후, 측정 전력원을 이용하여 나노갭 전극 쌍에 전압이 인가될 수 있고, 전기영동 전력원을 이용하여 나노갭 전극 쌍에 전압이 인가될 수 있다. 이후, 제어 유닛의 부분을 포함할 수 있는 컴퓨터의 CPU가 ROM, RAM, FLASH 또는 다른 적절한 디지털 저장 매체에 저장될 수 있는 생체분자 서열화 프로그램을 판독하고 실행할 수 있으며, 이로써, 도 24에 도시된 것과 같은 생체분자 서열화의 프로세싱이 생체분자 서열화 장치에 의해 실행될 수 있다. 일부 실시예들에서, 생체분자 서열화의 프로세싱은 생체분자 서열화 장치에 의해 실행될 수 있다.
[0203] 도 24에 도시된 것처럼 생체분자 서열화의 프로세싱의 S110 단계에서, 전극간 거리 제어 유닛은 변수 i를 1의 값으로 설정할 수 있다. 이후, 단계 S112에서, 전극간 거리 제어 유닛은, 전극간 거리(d)가 거리(di)로 조절될 수 있도록, 전극간 거리 변경 유닛을 제어할 수 있다. 펩티드(들)이 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이를 통과할 수 있도록, 전기영동 전극 쌍(20)의 전극들 사이에 전압이 인가될 수 있고, 나노갭 전극 상의 전극간 거리(d)는 거리(di)로 설정될 수 있다.
[0204] 다음, 단계 S114에서, 측정 제어 유닛은 전류계를 제어할 수 있고, 거리(di)를 가질 수 있는 전극간 거리(d)를 갖는 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이를 펩티드(들)이 통과할 수 있을 때 발생될 수 있는 터널링 전류의 전류 값들의 측정이 시작된다. 측정 제어 유닛은 측정된 전류 값들을 취할 수 있고 이들을 각각의 측정 포인트의 측정 시간과 연관된 미리결정된 메모리 영역에 저장할 수 있다.
[0205] 이후, 단계 S116에서, 전극간 거리 제어 유닛은, 펩티드(들)가, 거리(di)일 수 있는 전극간 거리(d)를 갖는 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이를 미리정해진 횟수에 대해 방향이 반전되게 초래되었는지 여부를 결정할 수 있다. 전기영동 전력원을 이용하여 구성되는 전기영동 X전압 분극 반전들에 수에 의해 이러한 결정이 이루어질 수 있다. 전기영동 전압 분극 반전들 수가 미리결정된 수에 도달하지 않았을 때, 전기영동 전압 분극 반전 단계(들)은 반복된다. 전기영동 전압 분극 반전들의 수가 미리결정된 수에 도달할 때, 동작은 단계 S118로 이동하고, 측정 제어 유닛은 거리(di)일 수 있는 전극간 거리(d)를 이용한 터널링 전류의 측정을 종료할 수 있고, 그리고 획득된 전류 값들 및 측정 시간으로부터, 예를 들어, 도 18의 상단 도면에 도시된 것처럼, 컨덕턴스-시간 프로파일이 형성될 수 있으며, 이는 이후 전극간 거리(di)와 연관된 미리결정된 메모리 영역에 저장될 수 있다.
[0206] 다음, 단계 S120에서, 전극간 거리 제어 유닛은, 터널링 전류를 측정하는 프로세스가 미리결정된 전극간 거리들(di) 모두에 대한 측정들을 완료했는지 여부를 결정할 수 있다. 임의의 프로세싱되지 않은 전극간 거리들(di)가 있다면, 동작은 단계 S122(여기서 전극간 거리 제어 유닛은 변수 i를 1씩 증분시킬 수 있음)로 이동하고, 동작이 S112로 리턴할 수 있다. 터널링 전류를 측정하는 프로세스가 전극간 거리들(di) 모두에 대해 수행되었다면, 도 25에 도시된 것처럼, 동작은 단계 S124로 이동하여 동정 프로세스를 실행할 수 있다.
[0207] 도 25에 도시된 것처럼 동정 프로세스의 단계 S240에서, 동정 유닛은 변수 i를 1의 값으로 설정할 수 있다. 이후, 단계 S242에서, 동정 유닛은 거리(di)를 가질 수 있는 전극간 거리(d)와 연관된 미리결정된 메모리 영역에 저장된 컨덕턴스-시간 프로파일을 리트리브할 수 있다.
[0208] 다음, 단계 S244에서, 측정 제어 유닛에 의해 결정되는 컨덕턴스-시간 프로파일에 기초하여, 동정 유닛은 각각의 측정 포인트에 대한 컨덕턴스 값과 이 값을 갖는 측정 포인트들의 수 간의 관계를 도시하는 히스토그램을 형성할 수 있다. 이후, 동정 유닛은, 형성된 히스토그램에 미리결정된 함수를 핏팅함으로써, 히스토그램 피크를 검출할 수 있다. 예를 들어, 도 26에 도시된 것처럼, 동정 유닛은 히스토그램에 나타나는 다수의 피크들을 검출할 수 있고 각각의 피크와 연관된 피크 값을 계산할 수 있다. 이후, 동정 유닛은, 계산된 피크 값들을, 전극간 거리(di)에 대응하는 상대 컨덕턴스들(G)(이는 기준 물리 값 테이블에 저장될 수 있는 각각의 아미노산들의 상대 컨덕턴스들(G)일 수 있음)과 비교함으로써 펩티드에 함유된 아미노산들의 타입 및 순서(order)를 동정할 수 있다.
[0209] 일부 실시예들에서, 단계 S244에서 수행되는 동정은 데이터 세트가 발생되는 시간에 수행될 있거나, 또는 프로세싱 후(post processing) 단계로서 수행될 수 있거나, 또는 데이터 스트리밍 단계의 일부로서 수행될 수 있고, 여기서 데이터 프로세싱은 더 많은 데이터를 취하면서 발생한다. 일부 실시예들에서, 동정은 단일 나노갭 전극 공간으로부터의 데이터를 이용하여 수행될 수 있으며, 여기서 단일 나노갭 전극 공간은 전극간 나노갭 전극 쌍 공간을 가질 수 있고, 이는, 다른 이용가능한 나노갭 전극 쌍들로부터의 다른 전극간 나노갭 전극 쌍 공간들 또는 데이터가 활용된 동일 나노갭 전극 쌍에 대한 다른 전극간 갭 공간들보다, 동정되는 단량체를 더 잘 구별할 수 있는 데이터를 생성할 수 있다. 다른 실시예들에서, 동정은 단일 나노갭 전극 쌍 공간을 활용할 수 있으며, 이는, 이용되는 데이터가 명목상 바람직한 전극간 나노갭 전극 쌍 공간이어야 하는 나노갭 전극 쌍 공간에서 비롯된 것이 아니더라도, 최고 확실성의 동정을 제공한다.
[0210] 다른 실시예들에서, 동일한 또는 상이한 전극간 갭 공간들을 갖는 다수의 전극간 나노갭 전극 쌍 공간들로부터의 데이터가 활용될 수 있으며, 이는 하나 또는 몇 개의 나노갭 전극 쌍들에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시예들에서, 활용될 수 있는 나노갭 전극 쌍 데이터는, 도 22와 함께 설명된 것처럼, 부분적으로 또는 완벽히 잡음 대역(noise band) 내에 있을 수 있는 전극간 나노갭 공간을 갖는 전극간 나노갭 전극 쌍 공간들을 포함할 수 있다. 전극간 나노갭 전극 쌍 공간들의 다수의 상이한 조합들이 활용될 수 있어, 최고 품질 스코어가 발생될 수 있다; 추가 실시예들에서는, 요구되는 컴퓨터 프로세싱의 수량(quantity)을 감소시키기 위해 제한된 수의 전극간 나노갭 전극 쌍 공간들이 활용될 수 있으면서도, 여전히 단일 전극간 나노갭 전극 쌍 공간을 활용하는 것에 비해 개선된 품질 스코어를 제공할 수 있다. 일부 실시예들에서, 고정된 수의 전극간 나노갭 전극 공간들이 활용될 수 있는 반면, 다른 실시예들에서는, 전극간 나노갭 전극 갭 공간들의 수가 가변적일 수 있으며, 미리결정된 품질 스코어를 제공하는데 필요한 최소 수(minimum number)의 전극간 나노갭 전극 공간들을 제공하도록 변할 수도 있다.
[0211] 본원에서 설명된 것처럼 일부 실시예들에서, 공칭적으로 고정된 전극간 나노갭 쌍 공간들은, 이용 동안 발생할 수 있는 가능성있는 제조 톨러런스 또는 팁 변형들에 대한 보상없이, 하나 또는 그 초과의 나노갭 전극 쌍들에 대해 제조 및 이용될 것으로 추정될 수 있다. 다른 실시예들에서, 전극간 나노갭 전극 쌍 공간(들)은 기준 물질들 및/또는 단량체들의 측정들의 결과로서 결정될 수 있으며, 여기서, 세트의 데이터가 전극간 나노갭 전극 쌍 공간의 결정 및 배정 이전에 포착될 수 있고, 결정된 전극간 나노갭 전극 쌍 공간이 이후 활용될 수 있다. 추가 실시예들에서, 전극간 나노갭 공간은 현재진행중인 것을 기본으로(ongoing basis), 서열화 프로세스 전반에 걸쳐 주기적으로 또는 연속해서 재평가될 수 있고, 테이블로부터의 개별 값들 또는 보간된 아니면 계산된 예상되는 값들은 기준 물질(들) 및/또는 단량체들에 대해 측정된 값들을 유지하면서 나노갭 전극 쌍에 대해 측정된 값들에 따라(in concordance with) 상이한 나노갭 전극 쌍들과 연관된 배정을 위해 활용될 수 있다. 추가 실시예들에서, 전극간 거리들은 단량체 배정과 함께 결정될 수 있으며, 여기서 전극간 거리는 단량체 배정의 일부로서 배정될 수 있고, 이로써 전극간 나노갭 전극 쌍 공간과 단량체의 조합은 최적의 스코어를 갖는 최적합 메트릭을 제공하기 위해 일정 시간 기간에 걸쳐 조절될 수 있다.
[0212] 일부 실시예들에서, 고정된 데이터량이 본원에 설명된 것처럼 포착될 수 있다; 다른 실시예들에서는, 가변적 데이터량이 포착될 수 있고, 여기서 콘코던트 횡단(concordant traverses) 및 반전의 수는, 단량체 동정에 대한 품질 메트릭일 수 있거나 또는 보다 간단한 메트릭일 수 있는 품질 메트릭, 예컨대 신호 대 잡음 메트릭 또는 단량체 동정에 직접 관련되지 않을 수 있는 다른 메트릭의 함수로써 변할 수 있다.
[0213] 일부 실시예들에서, 서열화 어세이(assay)에 대한 시간 기간은 미리결정될 수 있거나, 또는 고정된 수의 서열화 사이클일 수 있으며, 여기서 단일 또는 세트들의 고분자들이 단일 서열화 사이클을 구성할 수 있는 반복된 측정들로 처리되고, 이로써 복수의 서열화 사이클들은, 단일 또는 세트들의 고분자들의 다수의 세트들이 잠재적으로 다수의 반전 횡단들로 여러 번 측정되는 것을 허용할 수 있다. 다른 실시예들에서, 다수의 서열화 사이클들에 대한 시간 기간은 서열화 프로세스 동안 측정되는 데이터의 함수로써 결정될 수 있고, 여기서, 데이터의 품질, 데이터의 신호 대 잡음, 나노갭 전극 쌍들의 발생 빈도 또는 듀티 사이클(이들은 서열화된 다수의 단량체들과 상관될 수 있음)을 포함할 수 있는 측정 결과들이, 서열화 프로세스가 중단되어야 하는 시기를 결정하기 위해 단독으로 또는 조합되어 활용될 수 있다.
[0214] 일부 실시예들에서, 서열 배정 및 연관된 품질 메트릭 또는 스코어는 각각의 고분자에 대해 결정될 수도 있고, 나노갭 전극 쌍(들)의 각각의 횡단에에 대해 개별적으로 결정될 수도 있다. 다른 실시예들에서, 서열 배정 및 연관된 품질 메트릭 또는 스코어는 나노갭 전극 쌍(들)에 의한 몇 번의(several) 횡단들 및 연관되는 측정들의 함수로써 고분자에 대해 결정될 수 있다. 추가 실시예들에서, 서열 배정은 서열 매핑 또는 어셈블리 프로세스의 일부로써 구성되거나 재평가될 수 있고, 여기서 단량체의 배정이 재평가될 수 있고 그리고 재배정될 수 있다. 특히, 품질 스코어가 다른 고분자들의 동일 포지션에 있는 다른 단량체들과 일치하지 않는 고분자에 대한 단량체 배정과 연관되는 경우, 단량체 배정은 상이한 고분자들의 맵핑 또는 어셈블리를 허용하도록 변경될 수 있으며, 이는 다른식으로도 상당히 잘 정렬될 수 있다.
[0215] 일부 실시예들에서, 배정을 수행할 때, 고분자의 임의의 다른 단량체에 관한 특정 단량체의 가능성에 동등 확률(equal probability)이 부여될 수 있다. 다른 실시예들에서, 특히, 고분자를 재서열화할 때, 이후 모든 단량체 배정들에 적용될 글로벌 확률 분포일 수 있거나, 또는 로컬화 확률 분포(localized probability distribution)일 수 있는 확률 분포가 활용될 수 있고, 로컬 단량체 배정들의 콘텍스트는 확률 분포의 일부일 수 있다.
[0216] 다음, 단계 S246에서, 동정 유닛은, 기준 물리량 테이블에 그의 상대 컨덕턴스들(G)이 저장될 수 있는 각각의 아미노산들에 대응하는 확률 밀도 함수를 계산할 수 있다. 예를 들어, 확률 밀도 함수는 하기의 식(2)에 의해 도시된 가우시안 함수를 이용하여 계산될 수 있다:
Figure pct00001
[0217] 여기서, μ는 아미노산에 대한 상대 컨덕턴스(G)를 나타내며, σ는 표준 편차를 나타낸다. 다른 확률 밀도 함수들, 예컨대 깁스(Gibbs) 분포, 콘웨이-맥스웰-포아송(Conway-Maxwell-Poisson) 분포, Zipf 분포, 또는 임의의 다른 분포 또는 분포들의 조합이 활용될 수 있다.
[0218] 다음, 단계 S248에서, 컨덕턴스-시간 프로파일의 각각의 측정 포인트에서의 컨덕턴스 값들 및 각각의 아미노산에 대한 확률 밀도 함수(이는 단계 S246에서 계산된 확률 밀도 함수일 수 있음)를 이용함으로써, 동정 유닛은, 측정 포인트에서의 컨덕턴스 값이 아미노산과 연관되는 확률을 결정할 수 있으며, 특정 측정 포인트에 대해 확률이 최대화될 수 있는 아미노산의 종류를 배정할 수 있다.
[0219] 다음, 단계 S250에서, 동정 유닛은, 배정된 종류의 아미노산과 연관된 컨덕턴스가 컨덕턴스-시간 프로파일에서 변경되는 전이 포인트(transition point)를 검출할 수 있고, 각각의 검출된 전이 포인트에서 컨덕턴스-시간 프로파일을 인터벌들로 나눌 수 있다. 즉, 각각의 인터벌에 대해, 측정 포인트들은 유사한 데이터 서명들을 갖는 아미노산들로 맵핑된다. 동정 유닛은 Q-값을 활용함으로써 각각의 인터벌에 대한 각각의 아미노산의 배정에 대한 정확도(degree of accuracy)를 결정할 수 있다. Q-값 또는 프레드 품질 스코어(Phred quality score)가, 예를 들어, 하기 식(3)에 의해 표현될 수 있다: Q = -lOlog10P. 여기서, P는 측정 포인트에 배정된 아미노산의 에러 확률일 수 있다. 배정된 아미노산의 확률 값 P* (=1-P)은 각각의 인터벌에 대해 배정된 아미노산의 확률의 시간 통합 값 S1 및 각각의 인터벌에 대한 다른 아미노산들에 대한 확률의 시간 통합 값 S2를 이용함으로써 P*=S1/(S1+S2)로 표현될 수 있다. 이 경우, Q-값이 6 또는 이를 초과할 경우, 인터벌에 배정될 수 있는 아미노산의 확률 값 P*은 75% 또는 그 초과의 정확도를 가질 수 있다.
[0220] Q-값 또는 다른 품질 메트릭은 배정된 단량체(아미노산) 서열에 저장될 수 있고, 무손실 또는 손실 저장 방법, 예컨대, FastQ 포맷을 이용하여 저장될 수 있거나, 또는 SCALCE, Fastqz, Qualcomp, 또는 다른 유사한 알고리즘을 이용하여 저장될 수 있다.
[0221] 일부 실시예들에서, 동정가능한 종류(들)의 아미노산(들)은 각각의 전극간 거리(di)에 대해 상이할 수 있고, 이로써 각각의 인터벌에 대한 컨덕턴스에 의해 도시된 아미노산들의 종류(들)는 특정 전극간 거리(di)에 대해 동정가능한 아미노산(들)의 종류(들)에 반드시 대응되지 않을 수도 있다. 따라서, 아미노산의 배정이 미리결정된 정확도를 갖지 않을 수 있는 경우(여기서, Q-값은 이전에 결정된 임계 값 또는 이를 초과할 수 있음), 동정 유닛은, 아미노산의 종류의 배정이 불명확할 수 있음을 결정할 수 있고, 아미노산을 특정 측정 포인트에 특별히 배정하지 않을 수 있다.
[0222] 다음, 단계 S252에서, 동정 유닛은, 인터벌에 배정되는 아미노산의 통과 시간(passing time)(인터벌의 시간 길이)을 아미노산에 대해 이전에 결정된 통과 시간 파라미터들과 비교함으로써, 인터벌에 배정되는 아미노산의 종류가 정확한지 여부를 결정할 수 있다.
[0223] 여기서, 통과 시간 파라미터는 예를 들어, 다음과 같이 사전에 결정될 수 있고, 여기서, 인지된 아미노산들의 종류의 단일 분자가 나노갭 전극 쌍의 전극들 사이를 통과할 수 있을 때 발생될 수 있는 터널링 전류가 측정될 수 있고, 컨덕턴스-시간 프로파일이 구성될 수 있다. 이후, 컨덕턴스 값들의 변화로부터, 아미노산의 통과 시간이 측정될 수 있다. 터널링 전류는 아미노산의 통과 방향을 변경함으로써 여러 번 측정될 수 있다. 이후, 각각의 측정에 대한 통과 시간이 평균화될 수 있고, 평균 값을 포함하는 미리 정해진 범위내의 값이 특정 아미노산에 대한 통과 시간 파라미터로서 취해질 수 있다.
[0224] 인터벌에 대한 시간 길이가 인터벌에 배정되는 아미노산의 종류들에 대한 통과 시간 파라미터에 포함되는 경우, 동정 유닛은, 인터벌에 배정되는 아미노산들의 종류가 정확할 수 있는지를 결정할 수 있다. 인터벌의 시간 길이가 통과 시간 파라미터에 포함되지 않을 경우, 인터벌에 포함되는 모든 측정 포인트들에 대한 임의의 종류의 아미노산 배정없이, "불명확" 결정이 이루어질 수 있다.
[0225] 다음, 단계 S254에서, 단계 S248로부터 단계 S252까지의 배정 및 결정 결과들에 기초하여, 예를 들어, 도 27에 도시된 것처럼, 홀문자식(single-letter expression) 표현이 인터벌에 대응하는 동정 결과에 연관되는 컨덕턴스-시간 프로파일의 각각의 인터벌에 배정되는 아미노산 종류가 도시된다. 아미노산이 동정되지 않을 때, 인터벌에 대응하는 아미노산 종류가 명확하지 않을 수 있음을 나타내는 문자가 디스플레이될 수 있다(예를 들어, 문자 "X"; "이후 불명확 문자 X"로 지칭됨). 도 27에서, "B"는 베이스 라인을 나타낸다.
[0226] 다음, 단계 S256에서, 동정 유닛은 임의의 이중 판독 서열(들)을 제거할 수 있다. 예를 들어, KRED의 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 경우, 정확한 판독은 KRED이다; 그러나, 펩티드의 이동이 R에서 반전될 수 있는 경우, 이중의 서열, 예컨대 KRKRED가 판독될 가능성이 있다. 따라서, 이중의 서열 부분을 갖는 동정 결과는 잘못 동정된 것으로(misidentified) 결정될 수 있고, 따라서 동정 결과는 "불명확"으로 변경될 수 있다. 즉, 단계 S254에서 부적절하게 동정될 수 있는 컨덕턴스 시간 프로파일과 연관된 문자는 불명확 문자 X로 대체될 수 있다.
[0227] 특정하게, 동정 유닛은 식(3)과 유사한 계산을 활용하여 Q-값을 계산할 수 있고, 여기서 단계 S254에서 배정되는 문자 서열을 갖는 각각의 부분 서열은 베이스 라인 "B"에서 분리될 수 있다. 여기서, P는 특정 부분 서열에 대한 에러 확률일 수 있다. 특정 부분 서열에 대한 확률 값 P*(=l-P)은 부분 서열과 동일한 동정 결과를 갖는 부분 서열에 대한 수 S1 및 다른 동정 결과를 갖는 부분 서열에 대한 수 S2를 이용함으로써 P*=S1/(S1+S2)로 표현될 수 있다. 예를 들어, 분리된 모든 부분 서열들에 대해, 부분 서열 1(XXXAXXXX)이 5번 나타나고 부분 서열 2(XXXLXXXX)가 한번 나타나면, 부분 서열 1에 대한 Q-값은 7.78일 수 있다. 이 Q-값이 이전에 결정된 임계 값 미만이 아닌 경우, 부분 서열 1은 정확한 것으로 결정될 수 있다. 한편, 부분 서열 2는 잘못된 것(misled)으로 결정될 수 있다.
[0228] 다음, 단계 S258에서, 동정 유닛은 서열 프래그먼트들(sequence fragments)을 어셈블리(또는 맵핑)할 수 있다. 재서열화 경우(인지된 서열)에 대해 특정하게, 단계 S254까지의 (본원에서 설명된 것과 같은) 프로세스에서의 단계들에 의해 동정(판독)되는 서열이 기준 서열에 맵핑될 수 있고, 이 동작은 특정 커버리지 깊이(아미노산 당 오버랩되는 판독들의 수)가 달성될 때 종료될 수 있다. 새로운(novo) 서열 동정의 경우, 콘틱(contig)들은 콘코던트 서열들을 병합함으로써 어셈블리될 수 있다.
[0229] 다음, 단계 S260에서, 동정 유닛은, 상이한 전극간 거리들에 대응하는 상대 컨덕턴스들을 이용함으로써 아미노산들을 동정하는 프로세스가 완료되었는지 여부를 결정할 수 있다. 프로세싱되지 않은 전극간 거리들(di)이 존재하는 경우, 동작은 단계 S262로 진행할 수 있고 변수 i는 1씩 증분될 수 있으며, 동작은 단계 S242로 리턴할 수 있다. 따라서, 도 28에 도시된 것처럼, 각각의 인터벌에 대응하는 아미노산들의 종류들은 상이한 전극간 거리들(di)을 이용하여 동정가능한 아미노산들의 상대 컨덕턴스들을 이용함으로써 연속으로 동정될 수 있다. 프로세스가 모든 전극간 거리들(di)에 관련하여 끝났을 때, 펩티드를 포함하는 아미노산들에 대한 서열 결과가 출력될 수 있고, 도 24에 도시된 생체분자 서열화 프로세스는 생체분자 서열화 프로세스를 종료할 수 있다.
[0230] 본원에서 논의된 바와 같이, 일부 실시예들에서, 생체분자 서열화 장치는, 나노갭 전극 쌍의 전극들이 설정될 수 있는 각각의 거리에 대해 나노갭 전극 쌍 사이를 생체분자가 통과할 때 터널링 전류를 발생시키고 이를 측정할 수 있으며, 여기서, 나노갭 전극 쌍의 전극들 간의 각각의 거리는 상이한 전극간 거리를 가질 수 있으며, 전극간 거리에 따라 미리결정된 정확도로 동정가능할 수 있는 아미노산의 물리량을 기준 물리량으로 이용할 수 있으며, 생체분자를 포함하는 단량체들이 간단한 구성 및 높은 정확도로 동정될 수 있다.
[0231] 본원에서 설명된 것처럼, 일부 부품들이 도 1의 생체분자 서열화 장치의 것들과 동일할 수 있는 일부 실시예들에서, 동일한 이들 부품들의 상세한 설명은 동일한 참조 번호들을 이용함으로써 생략될 것이다.
[0232] 도 29에 도시된 것처럼 일부 실시예들에서, 생체분자 서열화 장치(210)는 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B, 및 12C), 측정 전력원(18), 전기영동 전극 쌍(20), 전기영동 전력원(22), 전류계(24), 및 제어 유닛(226)을 포함할 수 있다. 전극 쌍들(12A, 12B, 및 12C)은 상이한 갭 크기들을 가질 수 있고, 이는 상이한 물질들에서 정보를 얻는데(interrogate) 이용될 수 있다(예를 들어, 도 12 참조).
[0233] 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B, 및 12C)의 구성들은 본원 어딘가에서 설명된 것과 같은 나노갭 전극 쌍들(12)과 동일할 수 있다. 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B, 및 12C)은, 전극간 중심들이 동일 축상에 배열될 수 있도록, 유전체(들)(14)를 통해 라미네이팅될 수 있다. 즉, 펩티드(50)가 통과할 수 있는 하나의 통로가 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B, 및 12C)의 전극들 사이에 형성될 수 있다. 나노갭 전극 쌍(12A)에 대한 전극간 거리는 d1일 수 있고, 나노갭 전극 쌍(12B)의 전극간 거리는 d2일 수 있고, 나노갭 전극 쌍(12C)에 대한 전극간 거리는 d3일 수 있으며, 따라서, 전극간 갭 쌍들의 거리들은 서로 상이할 수 있다. 도 29의 예에서, 이들은 dl>d2>d3일 수 있다. 예를 들어, 이들은 dl=l.0 nm, d2=0.7 nm, 그리고 d3=0.5 nm로 설정될 수 있다.
[0234] 다른 실시예들에서, 전극간 갭 거리가 충분한 정밀도로 제어하기 어려울 수 있으며, 세트의 나노갭 전극 쌍들은, 원하는 또는 미리결정된 범위에 걸쳐있을 수 있는 전극간 거리들의 범위로 제조될 수 있으며 그리고 원하는 Q-스코어를 갖는 세트의 단량체들(예를 들어, 아미노산들)을 분해하는데 필요한 전극간 거리들의 수에 대응하는 최소 수와 동일한 나노갭 전극 쌍들의 수를 가질 수 있거나, 또는 전극간 거리들의 최소 수보다 큰 나노갭 전극 쌍들의 수를 가질 수 있고, 여기서 전극간 거리들은 원하는 Q-스코어를 갖는 세트의 단량체들(아미노산들)을 분해하기 위해 충분한 범위의 전극간 거리들에 걸쳐 상이한 충분한 수를 제공할 수 있다. 이용시, 기준 물질(들)은 세트의 나노갭 전극 쌍들의 상이한 나노갭 전극 쌍들에 대한 실제 전극간 거리들을 측정하기 위해 활용될 수 있다.
[0235] 일부 상황들에서, 나노갭은 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 30개, 40개 또는 50개의 전극 쌍들을 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 전극 쌍들 중 적어도 일부는 다른 전극 쌍들과 상이한 갭 크기들을 갖는다. 일부 예들에서, 전극 쌍들은 상이한 갭 크기들을 갖는다.
[0236] 도 30에 도시된 것처럼, 제어 유닛(226)은 전기영동 제어 유닛(231), 측정 제어 유닛(232), 동정 유닛(34), 및 기준 물리량 테이블(36)을 포함하는 구성으로 구성될 수 있다.
[0237] 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B, 및 12C) 각각의 전극들 사이에 형성되는 하나의 통로를 펩티드(50)가 다수의 반전들로 통과를 반복하게 하기 위해, 전기영동 제어 유닛(231)은 전기영동 전극 쌍(20)의 전극들 사이에 형성되는 전기장의 방향이 필드의 분극 반전을 야기하도록 스위칭될 수 있도록, 전기영동 전력원(22)을 이용하여 인가되는 전압을 제어할 수 있다.
[0238] 측정 제어 유닛(232)은, 전류계(24)가 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B, 및 12C) 각각의 전극들 사이에 발생되는 터널링 전류를 측정할 수 있도록 전류계(24)를 제어할 수 있고, 그리고, 이후, 컨덕턴스(들)을 계산하기 위해 전류계(24)에 의해 측정될 수 있는 상이한 전극간 거리들에 대한 터널링 전류의 전류 값들을 활용할 수 있고, 각각의 전극간 거리에 대한 컨덕턴스-시간 프로파일(들)을 발생시킬 수 있다.
[0239] 일부 실시예들에서, 생체분자 서열화 장치(210)가 활용될 수 있으며, 여기서 펩티드(들)(50)이 분해될 수 있는 용액이 마련될 수 있다; 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B, 및 12C)이 용액에 배치될 수 있은 후, 측정 전력원(18)을 이용하여 전압(들)이 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B, 및 12C)에 인가될 수 있고, 동시에, 전기영동 전력원(22)을 이용하여 전압이 전기영동 전극 쌍(20)에 인가될 수 있다. 따라서, 펩티드(50)가 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B, 및 12C)의 전극들 사이에 형성된 통로 사이를 통과할 수 있다.
[0240] 이후, 제어 유닛(226)을 포함하는 컴퓨터의 컴퓨터 프로세서(예를 들어, CPU)는 ROM, RAM, FLASH 또는 다른 저장 매체에 저장될 수 있는 생체분자 서열화 프로그램을 리트리브하고 이를 실행시킬 수 있고 생체분자 서열화 장치(210)를 활용하는 도 31에 도시된 것과 같은 생체분자 서열화 프로세스를 실행할 수 있다. 일부 실시예들에서, 생체분자 서열화 프로세스는 생체분자 서열화 장치(210)에 의해 실행될 수 있다.
[0241] 도 31에 도시된 것과 같은 생체분자 서열화 프로세스와 연관된 단계 S214에서, 측정 제어 유닛(232)은, 전류계(24)를 제어하고, 펩티드(50)가 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B, 및 12C)의 전극들 사이에 형성된 통로를 통과할 때, 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B, 및 12C) 각각의 전극들 사이에 발생될 수 있는 터널링 전류의 전류 값들의 측정을 시작할 수 있다. 측정 제어 유닛(232)은 측정된 전류 값들을 활용하고, 이들을 각각의 측정 포인트에 대한 측정 시간과 연관된, 그리고 측정되는 전류 값 데이터가 나노갭 전극 쌍(12A, 12B, 및 12C) 및 각각의 나노갭 전극 쌍과 연관된 거리들(예를 들어, 전극간 거리들을 표시하는 dl, d2, 및 d3)로부터 발생됨을 표시하는 정보와 연관된 미리결정된 메모리 영역에 저장할 수 있다.
[0242] 다음, 단계 S16에서, 전기영동 제어 유닛(231)은, 펩티드(50)가 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B, 및 12C) 각각의 전극들 사이에 형성되는 통로에 미리 정해진 횟수 동안 횡단할 수 있는지 여부를 결정할 수 있다. 횡단들의 수가 미리결정된 수에 도달하지 않을 수 있는 경우, 추가의 횡단을 가능하게 하기 위해, 전기영동 제어 유닛(231)에 의해, 인가되는 전압의 추가 분극 반전들이 유발될 수 있다. 횡단들의 수가 미리결정된 수에 도달할 때, 동작은 단계 S218로 이동할 수 있고, 측정 제어 유닛(232)은 터널링 전류들의 측정들을 종료할 수 있고, 획득된 전류 값들 및 측정 시간으로부터, 도 18의 상단 도면에 도시된 것과 같은 컨덕턴스-시간 프로파일이 상이한 전극간 거리들에 대해 형성될 수 있고, 미리 정해진 메모리 영역에 저장될 수 있다.
[0243] 다음, 단계 S24에서, 도 25와 연관되어 도시되고 설명되는 것과 같은 동정 프로세스가 실행될 수 있다. 동정 프로세스는 본원에서 설명된 것과 같은 동정 프로세스와 동일할 수 있기 때문에, 이 단계의 설명은 생략된다.
[0244] 일부 실시예들에서, 전기영동 제어 유닛(231)에 의해 수행되는 고정된 수의 측정 횡단들(펩티드(50) 또는 다른 고분자가 제어될 수도 있음)을 이용하기보다, Q-스코어 또는 다른 적절한 메트릭일 수 있는 원하는 품질 메트릭이 달성될 때까지, 펩티드(들)(50) 또는 다른 고분자들의 이동에 대한 프로세스 동안 데이터가 분석될 수 있다. 따라서, 펩티드(들)(50) 또는 다른 고분자가 나노갭 전극 쌍(들)의 전극들 사이를 횡단하는 가변적 횡단들의 수는, 공칭적으로 원하는 품질 스코어를 받기 위해, 선택된 수보다 더 많거나 더 적을 수도 있다.
[0245] 앞서 설명된 것과 같은 일부 실시예들에서, 다수의 나노갭 전극 쌍들을 이용하는 생체분자 서열화 장치는 생체분자 서열화 장치와 유사한 방식으로 활용될 수 있는데 여기서는 간단한 구성 및 높은 정확도로 생체분자를 포함하는 단량체들을 동정하기 위해, 여러 조절된 나노갭 전극 쌍 갭 공간들을 이용하는 조절가능한 나노갭 전극 쌍이 활용할 수 있다. 또한, 상이한 나노갭 전극 쌍 공간들에 대한 터널링 전류들이 동시에 측정될 수 있기 때문에, 터널링 전류들의 측정 시간은 생체분자 서열화 장치와 비교할 때 더 짧아질 수 있고, 여기서 나노갭 거리들은 조절될 필요가 있을 수도 있다.
[0246] 본원에서 설명된 것처럼, 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B, 및 12C)이, 각각의 전극간 중심들이 동일 축 상에 배열될 수 있도록 라미네이팅될 수 있는 구성에 관한 설명이 이루어졌지만, 다른 실시예들에서, 상이한 전극 갭 공간들은, 예를 들어 상이한 채널들과 연관될 수 있다. 예를 들어, 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B, 및 12C)은 동일 평면상에 배치될 수 있다. 이 경우, 예를 들어, 추가의 전기영동 전극들은, 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B, 및 12C) 각각의 전극들 사이를 펩티드(50)가 연속적으로 통과할 수 있도록 시스템을 제어하기 위해, 나노갭 전극 쌍들(12A, 12B, 및 12C)과 연관하여 활용될 수 있다.
[0247] 본원에서 설명된 것처럼, 동정될 펩티드를 포함할 수 있는 20개 또는 그 초과의 종류들의 아미노산들에 대한 참조가 이루어졌다; 그러나, 변형된 아미노산들을 포함하는 추가 종류들의 아미노산들을 동정하는 것이 가능할 수 있다. 변형된 아미노산은 확장된 분자 직경을 가질 수 있다. 따라서, 분자 직경 및 피크 펄스 듀레이션 시간에 근사하게 설정된 전극간 거리(d)를 활용하여 측정된 터널링 전류로부터 계산되는 상대 컨덕턴스가 맵핑될 수 있는 tp-G 공간에서의 포인트는 다른 아미노산들의 포인트들로부터 쉽게 동정될 수 있다; 따라서, 도 32에 개략적으로 도시된 것처럼, 변형된 아미노산은, 아미노산 종류를 동정할 수 있는 지표가 획득될 수 있도록 명확히 분류될 수 있다. 이에 따라, 번형된 아미노산들은 또한, 화학 수식(chemical modification)과 같은 예비 처리 없이, 간단한 구성 및 높은 정확도로 동정될 수 있다. 이와 같은 변형된 아미노산은 활성 또는 비활성 상태의 단백질을 제어할 수 있고, 이에 따라, 이는 질병 진단, 예를 들어, 다양한 형태들의 암과 연관된 N-말단 아세틸화와 관련하여 가장 중요한 표적이 될 수 있다.
[0248] 일부 실시예들에서, 단일 타입의 기준 물질이 활용될 수 있으며, 여기서, 단일 타입의 기준 물질이 다양한 여러 전극간 나노갭 전극쌍 공간들에 적합할 수 있고, 이는 잠재적으로 모두 상이한 전극간 나노갭 전극 쌍 공간들에 대해 본원에서 설명된 것처럼 기준 물질로 유용할 것이다. 다른 실시예들에서, 다수의 기준 물질이 활용될 수 있으며, 여기서 하나 또는 그 초과의 기준 물질들이 전극간 나노갭 전극 쌍 공간들의 거리들의 범위에 따라 이용하기에 더 적합할 수 있지만, 전극간 나노갭 전극 쌍 공간들의 상이한 범위의 거리들에 상이한 하나 또는 그 초과의 기준 물질들이 더 적합할 수도 있다. 기준 물질의 크기의 함수로써, 또는 기준 물질 상의 활성 전자 활성 사이트들 간의 거리의 함수로써 상이한 전극간 나노갭 전극 쌍 공간들에 대해 기준 물질들이 선택될 수 있다.
[0249] 본원에서 설명된 것처럼 일부 실시예들에서, 기준 물질은 전반적으로 구형일 수 있으며, 이로써 전극간 나노갭 전극 액면(par) 공간내에서 기준 물질의 배향이 기준 물질에 의해 발생되는 터널링 전류에 대해 상당한 영향을 미치지 못할 수 있다. 다른 실시예들에서, 기준 물질이 활용될 수 있으며, 여기서의 배향은 그렇게 발생된 터널링 전류에 상당한 영향력을 미칠 수 있지만, 이 기준 물질은, 터널링 전류에서의 상당한 변화를 허용하여 이로써 화합물이 기준 물질로서 동작하는 것을 허용하는 방식으로 나노갭 전극 쌍과의 상호작용이 입체적으로(sterically) 방해될 수 있다. 추가 실시예들에서, 기준 물질이 활용될 수 있으며, 여기서의 배향은 그렇게 발생된 터널링 전류에 상당한 영향력을 미칠 수 있지만, 이 기준 물질은, 터널링 전류에서의 상당한 변화를 허용하여 이로써 화합물이 기준 물질로서 동작하도록 허용하는 방식으로 나노갭 전극 쌍과의 상호작용이 방지되도록, 기준 물질과 연관된 전하에 의해 배향될 수 있다.
[0250] 일부 실시예들에서, 기준 물질은 서열화되는 고분자의 단량체들과 연관된 펄스 듀레이션들과 유사한 펄스 듀레이션을 가질 수 있다. 다른 실시예들에서, 기준 물질은 서열화되는 고분자의 단량체들과 연관된 펄스 듀레이션보다 상당히 더 길거나 또는 이보다 더 짧을 수 있는 펄스 듀레이션을 가질 수 있고, 이 기준 물질의 펄스 듀레이션은, 펄스가 서열화되는 고분자의 단량체와 연관되는지 또는 기준 물질과 연관되는지를 결정하는 추가 팩터로서 활용되게 허용한다.
[0251] 일부 경우들에서, 생체분자를 포함하는 단량체들로서 아미노산들, 및 예시적 생체고분자(생체분자)로서 펩티드(단백질)에 대한 참조가 이루어졌지만, 본 개시내용은 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시예들에서, 생체분자 서열화 장치는 당사슬(들)을 포함하는 단당류들을 동정하고 핵산(들)을 포함하는 뉴클레오티드들을 동정하기 위해 활용될 수 있다.
[0252] 프로그램이 사전에 설치될 수 있지만, 본 개시내용의 디바이스들, 시스템들 및 방법들은, 인터넷, 인트라넷, 또는 다른 네트워크를 통해 리드-인(read-in) 또는 다운로딩될 수 있는 프로그램이 외부 메모리 디바이스, 메모리 매체 등에 저장된 상황들에서 실행될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 대안적으로, 또한, 컴퓨터에 의해 판독가능한 메모리 매체에 저장한 다음에 이 프로그램을 제공하는 것이 가능하다.
[0253] 일부 실시예들에서, 프로그램은 사전에 설치되는 것으로 설명될 수 있지만, 프로그램은 외부 저장 디바이스 또는 저장 매체에 저장될 수 있고, 필요에 따라 판독될 수 있고, 또는 프로그램은 인터넷 연결을 통해 다운로딩될 수 있다. 게다가, 프로그램은 개별적으로 제공되는 컴퓨터 판독가능한 저장 매체에 저장될 수 있다.
[0254] 샘플들 및 시약들(reagents)은 하나 또는 그 초과의 펌프들을 포함할 수 있는 유체 흐름 유닛들을 이용하여 나노갭 전극들 및 세트들의 전극들로 전달될 수 있다. 유체 흐름 유닛은 단일 펌프 또는 일련의 펌프들을 포함할 수 있다. 일부 예들에서, 펌프들은 마이크로펌프들, 예컨대 온-칩 펌프들이다. 유체 흐름 유닛은 유체 흐름을 지향시키기 위한 하나 또는 그 초과의 밸브들을 포함할 수 있다. 유체 흐름 유닛의 펌프들 및 밸브들은 본원 어딘가에서 설명되는 제어 유닛들 및 컴퓨터 제어 시스템들에 의해 제어될 수 있다.
컴퓨터 제어 시스템들
[0255] 본 개시내용은 본 개시내용의 방법들을 구현하도록 프로그램된 컴퓨터 제어 시스템들을 제공한다. 도 33은 단백질과 같은 생체분자를 서열화하도록 프로그래밍되거나 아니면 이를 위해 구성된 컴퓨터 시스템(3301)을 도시한다. 컴퓨터 시스템(3301)은 본원 어딘가에서 설명되는 제어 유닛들(26 및 226)일 수 있다. 컴퓨터 시스템(3301)은 중앙 처리 장치(CPU, 또한 본원에서 "프로세서" 및 "컴퓨터 프로세서")(3305)를 포함하며, 이는 싱글 코어 또는 멀티 코어 프로세서, 또는 병렬 프로세싱을 위한 복수의 프로세서들일 수 있다. 컴퓨터 시스템(3301)은 또한 메모리 또는 메모리 로케이션(3310)(예를 들어, 랜덤-액세스 메모리, 리드-온리 메모리, 플래시 메모리), 전자 저장 유닛(3315)(예를 들어, 하드 디스크), 하나 또는 그 초과의 다른 시스템들과의 통신을 위한 통신 인터페이스(3320)(예를 들어, 네트워크 어댑터) 및 주변 디바이스들(3325), 예컨대 캐시, 다른 메모리, 데이터 저장소 및/또는 전자 디스플레이 어댑터들을 포함한다. 메모리(3310), 저장 유닛(3315), 인터페이스(3320) 및 주변 디바이스들(3325)은 통신 버스(실선들)를 통해 CPU(3305), 예컨대 마더보드와 통신한다. 저장 유닛(3315)은 데이터를 저장하기 위한 데이터 저장 유닛(또는 데이터 저장소)일 수 있다. 컴퓨터 시스템(3301)은 통신 인터페이스(3320)의 보조로 컴퓨터 네트워크("네트워크")(3330)에 동작가능하게 커플링될 수 있다. 네트워크(3330)는 인터넷, 인터넷 및/또는 엑스트라넷, 또는 인터넷과 통신하는 인트라넷 및/또는 엑스트라넷일 수 있다. 일부 경우들에서 네트워크(3330)는 원격통신 및/또는 데이터 네트워크이다. 네트워크(3330)는, 분산형 컴퓨팅, 예컨대 클라우드 컴퓨팅을 가능하게 할 수 있는 하나 또는 그 초과의 컴퓨터 서버들을 포함할 수 있다. 일부 경우들에서 컴퓨터 시스템(3301)의 보조로, 네트워크(3330)는 피어-투-피어 네트워크를 구현할 수 있으며, 이는 클라이언트 또는 서버로서 거동하도록 디바이스들이 컴퓨터 시스템(3301)에 커플링되게 할 수 있다.
[0256] CPU(3305)는 프로그램 또는 소프트웨어에 내장될 수 있는 기계-판독가능한 명령들의 시퀀스를 실행할 수 있다. 명령들은 메모리 로케이션, 예컨대 메모리(3310)에 저장될 수 있다. 본 개시내용의 방법들을 구현하도록 추후 프로그래밍되거나 아니면 이를 위해 CPU(3305)를 구성할 수 있는 명령들이 CPU(3305)로 지향될 수 있다. CPU(3305)에 의해 수행되는 동작들의 예들은, 페치, 디코드, 실행 및 라이트백(writeback)을 포함할 수 있다.
[0257] CPU(3305)는 집적회로와 같은 회로의 일부일 수 있다. 시스템(3301)의 하나 또는 그 초과의 다른 컴포넌트들이 회로에 포함될 수 있다. 일부 경우들에서, 회로는 ASIC(application specific integrated circuit)이다.
[0258] 저장 유닛(3315)은, 파일들, 예컨대 드라이버들, 라이브러리들 및 저장된 프로그램들을 저장한다. 저장 유닛(3315)은 이용자 데이터, 예를 들어 이용자 선호도(preferences) 및 이용자 프로그램들을 저장할 수 있다. 일부 경우들에서 컴퓨터 시스템(3301)은, 예컨대 인트라넷 또는 인터넷을 통해 컴퓨터 시스템(3301)과 통신하는 원격 서버에 로케이팅되는, 컴퓨터 시스템(3301) 외부에 있는 하나 또는 그 초과의 추가 데이터 저장 유닛들을 포함할 수 있다.
[0259] 컴퓨터 시스템(3301)은 네트워크(3330)를 통해 하나 또는 그 초과의 원격 컴퓨터 시스템들과 통신할 수 있다. 예컨대, 컴퓨터 시스템(3301)은 이용자의 원격 컴퓨터 시스템과 통신할 수 있다. 이용자는 네트워크(3330)를 통해 컴퓨터 시스템(3301)에 액세스할 수 있다.
[0260] 본원에서 설명된 것처럼 방법들은, 컴퓨터 시스템(3301)의 전자 저장 로케이션, 예컨대, 예를 들어 메모리(3310) 또는 전자 저장 유닛(3315) 상에 저장되는 기계(예를 들어, 컴퓨터 프로세서) 실행가능한 코드에 의해 구현될 수 있다. 기계 실행가능한 또는 기계 판독가능한 코드는 소프트웨어의 형태로 제공될 수 있다. 이용 동안, 코드는 프로세서(3305)에 의해 실행될 수 있다. 일부 경우들에서, 코드는 저장 유닛(3315)으로부터 리트리브될 수 있고 프로세서(3305)에 의한 쉬운 액세스를 위해 메모리(3310) 상에 저장될 수 있다. 일부 상황들에서, 전자 저장 유닛(3315)은 배제될 수 있고, 기계-실행가능한 명령들은 메모리(3310)에 저장된다.
[0261] 코드는 코드를 실행하도록 적응되는 프로세서를 갖는 기계에서의 이용을 위해 사전-컴파일링되고 구성될 수 있고, 또는 실행시간(runtime) 동안 컴파일링될 수 있다. 코드는 사전-컴파일링 또는 에즈-컴파일링(as-compiled) 방식으로 코드가 실행될 수 있도록 선택될 수 있는 프로그래밍 언어로 공급될 수 있다.
[0262] 본원에 제공되는 시스템들 및 방법들의 양상들, 예컨대 컴퓨터 시스템(3301)이 프로그래밍으로 구체화될 수 있다. 기술의 다양한 양상들은 통상적으로 일 타입의 기계 판독가능한 매체 상에 보유되거나 또는 이로 구체화되는 기계(또는 프로세서) 실행가능한 코드 및/또는 연관된 데이터의 형태의 "제조 물품들" 또는 "물건들"로 간주될 수 있다. 기계-실행가능한 코드는 전자 저장 유닛, 예컨대 메모리(예를 들어, 리드-온리 메모리, 랜덤-액세스 메모리, 플래시 메모리) 또는 하드 디스크에 저장될 수 있다. "저장" 타입 매체는 컴퓨터들, 프로세서들 등의 유형의 메모리, 또는 이들과 연관된 모듈들, 예컨대 다양한 반도체 메모리들, 테입 드라이브들, 디스크 드라이브들 등 중 일부 또는 전부를 포함할 수 있으며, 이들은 소프트웨어 프로그래밍을 위해 임의의 시간에 비-일시적 저장을 제공할 수 있다. 소프트웨어의 전부 또는 부분들은 때로 인터넷 또는 다양한 다른 원격통신 네트워크들을 통해 통신할 수 있다. 예를 들어, 이러한 통신들은, 하나의 컴퓨터 또는 프로세서로부터 다른 컴퓨터 또는 프로세서로, 예를 들어, 관리 서버 또는 호스트 컴퓨터로부터 애플리케이션 서버의 컴퓨터 플랫폼으로 소프트웨어의 로딩을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 소프트웨어 엘리먼트들을 보유(bear)할 수 있는 다른 타입의 매체는, 예컨대 유선 또는 광학적 랜드라인 네트워크들을 통해 그리고 다양한 에어-링크들을 통해, 로컬 디바이스들 사이의 물리적 인터페이스들에 걸쳐 이용되는 광학적, 전기적 및 전자기적 파들을 포함한다. 이러한 파들을 보유하는 물리적 엘리먼트들, 예컨대 유선 또는 무선 링크들, 광학 링크들 등이 또한, 소프트웨어를 보유하는 매체로 간주될 수 있다. 본원에서 이용되는 것처럼, 비-일시적, 유형의 "저장" 매체로 제한되는 것을 아니지만, 예컨대 컴퓨터 또는 기계 "판독가능한 매체"란 용어는 실행을 위해 프로세서에 명령들을 제공하는데 참여하는 임의의 매체를 지칭한다.
[0263] 따라서, 기계(또는 컴퓨터) 판독가능한 매체, 예컨대 컴퓨터-실행가능한 코드(또는 컴퓨터 프로그램)는, 유형의 저장 매체, 반송파 매체 또는 물리적 송신 매체를 포함하지만 이로 제한되는 것은 아닌 다수의 형태들을 취할 수 있다. 비-휘발성 저장 매체는, 예컨대 도면들에 도시된 데이터베이스들 등을 구현하는데 이용될 수 있는 예를 들어, 광학 또는 자기 디스크들(disks), 예컨대 임의의 컴퓨터(들)의 임의의 저장 디바이스들 등을 포함한다. 휘발성 저장 매체는, 동적 메모리, 예컨대 컴퓨터 플랫폼의 메인 메모리를 포함한다. 유형의 송신 매체는, 컴퓨터 시스템내의 버스를 포함하는 와이어들을 비롯한, 동축 케이블들, 구리 와이어 및 광섬유를 포함한다. 반송파 송신 매체는 전자 또는 전자기 신호들, 또는 무선 주파수(RF) 및 적외선(IR) 데이터 통신들 동안 발생되는 것들과 같은 전기 또는 전자기 신호들, 음향 또는 광 파들의 형태를 취할 수 있다. 따라서, 컴퓨터-판독가능한 매체의 일반적 형태들은, 예를 들어, 플로피 디스크, 플렉시블 디스크, 하드 디스크, 자기 테입, 임의의 다른 자기 매체, CD-ROM, DVD 또는 DVD-ROM, 임의의 다른 광학 매체, 펀치 카드들, 페이퍼 테입, 홀들의 패턴들을 갖는 임의의 다른 물리적 저장 매체, RAM, ROM, PROM 및 EPROM, FLASH-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 데이터 또는 명령들을 전송하는 반송파, 이러한 반송파를 전송하는 케이블들 또는 링크들, 또는 컴퓨터가 프로그래밍 코드 및/또는 데이터를 판독할 수 있는 임의의 다른 매체를 포함한다. 이러한 다수의 형태들의 컴퓨터 판독가능한 매체는 실행을 위해 프로세서에 하나 또는 그 초과의 명령들의 하나 또는 그 초과의 시퀀스들을 보유하는데 수반될 수 있다.
[0264] 본 개시내용의 디바이스들, 시스템들 및 방법들은, 예를 들어, JP 2013-36865A, US 2012/0322055A, US 2013/0001082A, US 2012/0193237A, US 2010/0025249A, JP 2011-163934A, JP 2005-257687A, JP 2011-163934A 및 JP 2008-32529A(이들 각각은 인용에 의해 전체가 본원에 포함됨)에 설명된 것들과 같은 다른 디바이스들, 시스템들, 또는 방법들과 조합되고 그리고/또는 이들에 의해 변경될 수 있다.
[0265] 본 발명의 바람직한 실시예들이 본원에 도시되고 설명되지만, 이러한 실시예들이 단지 예로써 제공되는 것임이 당업자들에게는 명백할 것이다. 본 발명이 명세서 내에 제공되는 특정 예들로 제한되게 의도되는 것은 아니다. 본 발명은 앞서 언급된 명세서를 참조로 설명되었지만, 본원의 실시예들의 설명들 및 예시들이 제한적 의미로 해석되는 것을 의미하는 것 아니다. 다양한 변화들, 변경들, 및 치환들이 이제 본 발명을 벗어남 없이 당업자들에게서 이루어질 것이다. 또한, 본 발명의 모든 양상들은 다양한 조건들 및 변수들에 의존하는 본원에 설명된 특정한 묘사들, 구성들 또는 관련 부분들로 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 본원에 설명된 본 발명의 실시예들에 대한 다양한 대체들이 본 발명을 실행하는데 채용될 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 이러한 임의의 대안들, 변경들, 변화들 또는 등가물들을 또한 커버하는 것으로 고려된다. 하기의 청구항들이 본 발명의 범위를 정의하고 이들 청구항들 및 이들의 등가물들의 범위 내의 방법들 및 구조들이 이에 의해 커버되는 것으로 의도된다.

Claims (48)

  1. 복수의 단량체들을 갖는 생체분자(biomolecule)를 서열화하기 위한 방법으로서,
    (a) 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 포함하는 채널을 통하게 상기 생체분자를 지향시키는 단계 ―상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들의 각각의 세트는 2개의 나노갭 전극들을 포함하며, 적어도, 상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들의 서브세트는 상이한 전극간 거리들을 가짐―;
    (b) 상기 생체분자가 상기 채널을 통하게 지향될 때 나노전류들에 대응하는 신호들을 상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 이용하여 측정하는 단계 ―신호들은 상기 생체분자의 상기 복수의 단량체들에 대응함―; 및
    (c) (b) 단계에서 측정된 상기 신호들을 하나 또는 그 초과의 기준들에 비교함으로써, 상기 복수의 단량체들을 컴퓨터 프로세서를 이용하여 동정(identifying)하는 단계
    를 포함하는, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 동정하는 단계는 상기 신호들의 상대 값과 상기 하나 또는 그 초과의 기준들 간의 미리결정된 관계를 이용하는 단계를 포함하는, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들은, 상이한 전극간 갭 거리들을 갖는, 제 1 세트의 나노갭 전극들 및 제 2 세트의 나노갭 전극들을 포함하는, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    다른 전극간 거리에 대한 나노전류를 보간하기 위해, 주어진 세트의 나노갭 전극들의 전극간 거리를 이용하는 단계를 더 포함하는, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    개별 단량체 퀄리티 콜들(quality call)을 이용하는 상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 이용한 다수의 측정들로부터의 데이터를 이용하여 상기 생체분자의 컨센서스 서열(consensus sequence)을 발생시키는 단계를 더 포함하는, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 생체분자는 펩티드 샘플인, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    (a) 단계 이전에, 상기 펩티드 샘플을 변성시키는 단계 및/또는 분해하는(cleaving) 단계를 더 포함하는, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 세트들의 나노갭 전극들의 각각의 세트는, 최대한(at most), 상기 생체분자의 상기 복수의 단량체들의 서브세트를 검출하는데 적합한 전극간 거리를 갖는, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 생체분자는 핵산 분자인, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상이한 전극간 거리들에서 상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들에 대한 나노전류들에 대응하는 신호들을 측정하는 단계를 더 포함하는, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    최대한, 상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들로부터의 신호들을 측정하는 단계, 및 최대한, 상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들의 상기 서브세트를 이용하여 측정되는 상기 신호들을 이용하여 상기 복수의 단량체들 중 주어진 단량체를 동정하는 단계를 더 포함하는, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노전류들은 터널링 전류들을 포함하는, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 방법.
  13. 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 시스템으로서,
    복수의 세트들의 나노갭 전극들을 포함하는 채널 ―상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들의 각각의 세트는 2개의 나노갭 전극들을 포함하며, 적어도, 상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들의 서브세트는 상이한 전극간 거리들을 가짐―;
    상기 채널을 통하게 상기 생체분자를 지향시키기 위한 유체 흐름 유닛; 및
    상기 나노갭 전극들에 커플링되는 컴퓨터 프로세서
    를 포함하며, 상기 컴퓨터 프로세서는,
    (a) 상기 생체분자가 상기 채널을 통하게 지향될 때 나노전류들에 대응하는 신호들을 상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 이용하여 측정하고 ―신호들은 상기 생체분자의 상기 복수의 단량체들에 대응함―; 그리고
    (b) (a)에서 측정된 상기 신호들을 하나 또는 그 초과의 기준들에 비교함으로써 상기 복수의 단량체들을 동정하도록
    프로그래밍되는, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 시스템.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 컴퓨터 프로세서는, 상기 신호들의 상대 값과 상기 하나 또는 그 초과의 기준들 사이의 미리결정된 관계를 이용하여 상기 복수의 단량체들을 동정하도록 프로그래밍되는, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 시스템.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들은, 상이한 전극간 갭 거리들을 갖는, 제 1 세트의 나노갭 전극들 및 제 2 세트의 나노갭 전극들을 포함하는, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 시스템.
  16. 제 13 항에 있어서,
    상기 컴퓨터 프로세서는, 다른 전극간 거리에 대한 나노전류를 보간하기 위해, 주어진 세트의 나노갭 전극들의 전극간 거리를 이용하도록 프로그래밍되는, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 시스템.
  17. 제 13 항에 있어서,
    상기 컴퓨터 프로세서는, 개별 단량체 퀄리티 콜들을 이용하는 상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 이용한 다수의 측정들로부터의 데이터를 이용하여 상기 생체분자의 컨센서스 서열을 발생시키도록 프로그래밍되는, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 시스템.
  18. 제 13 항에 있어서,
    상기 세트들의 나노갭 전극들의 각각의 세트는, 최대한, 상기 생체분자의 상기 복수의 단량체들의 서브세트를 검출하는데 적합한 전극간 거리를 갖는, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 시스템.
  19. 제 13 항에 있어서,
    상기 컴퓨터 프로세서는, 상이한 전극간 거리들에서 상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들에 대한 나노전류들에 대응하는 신호들을 측정하도록 프로그래밍되는, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 시스템.
  20. 제 13 항에 있어서,
    상기 컴퓨터 프로세서는, 최대한, 상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들의 서브세트로부터의 신호들을 측정하고, 그리고 최대한, 상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들의 상기 서브세트를 이용하여 측정되는 상기 신호들을 이용하여 상기 복수의 단량체들 중 주어진 단량체를 동정하도록 프로그래밍되는, 복수의 단량체들을 갖는 생체분자를 서열화하기 위한 시스템.
  21. 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 방법으로서,
    (a) 가변적인 전극간 거리를 갖는 적어도 하나의 세트의 나노갭 전극들을 포함하는 채널을 통하게 상기 펩티드 샘플 및 적어도 하나의 기준 샘플을 지향시키는 단계 ―상기 기준 샘플은 상기 나노갭 전극들에 의해 측정되는 나노전류에 대응하는 미리결정된 신호 프로파일을 가짐―;
    (b) 상기 단백질 샘플 및 기준 샘플이 상기 채널을 통하게 지향될 때 나노전류들에 대응하는 신호들을 상이한 전극간 거리들에서의 상기 나노갭 전극들을 이용하여 측정하는 단계 ―신호들은 상기 기준 샘플과 연관된 기준 신호들을 포함함―; 및
    (c) (b) 단계에서 측정된 상기 신호들을 상기 기준 신호들에 비교함으로써 상기 하나 또는 그 초과의 단량체들을 컴퓨터 프로세서를 이용하여 동정하는 단계
    를 포함하는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 기준 샘플은 상기 펩티드 샘플과 별개인, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 방법.
  23. 제 21 항에 있어서,
    상기 기준 샘플은 하나 또는 그 초과의 단량체들의 미리결정된 서열을 갖는 기준 펩티드 샘플인, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 방법.
  24. 제 21 항에 있어서,
    상기 기준 샘플은, 상기 기준 샘플이 상기 나노갭 전극들 사이를 통과할 때, 상기 나노갭 전극들 사이의 공간(space)에 대해 동일한 배향을 갖는 서브유닛들을 포함하는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 방법.
  25. 제 21 항에 있어서,
    상기 기준 샘플은 실질적으로 구 형상을 갖는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 기준 샘플은 금속 나노입자들 또는 풀러린들(fullerenes)을 포함하는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 방법.
  27. 제 21 항에 있어서,
    상기 동정하는 단계는 상기 신호들의 상대 값과 상기 기준 신호들 간의 미리결정된 관계를 이용하는 단계를 포함하는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 방법.
  28. 제 21 항에 있어서,
    상기 채널은 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 포함하며, 각각의 세트는 적어도 2개의 나노갭 전극을 포함하는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들은, 상이한 전극간 갭 거리들을 갖는, 제 1 세트의 나노갭 전극들 및 제 2 세트의 나노갭 전극들을 포함하는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 방법.
  30. 제 21 항에 있어서,
    개별 단량체 퀄리티 콜들을 이용하는 상기 나노갭 전극들을 이용한 다수의 측정들로부터의 데이터를 이용하여 상기 펩티드 샘플의 컨센서스 서열을 발생시키는 단계를 더 포함하는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 방법.
  31. 제 21 항에 있어서,
    적어도, 상기 나노갭 전극들 간의 상기 복수의 상이한 거리들의 서브세트에 대응하는 복수의 상이한 기준 샘플들을 제공하는 단계를 더 포함하는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 방법.
  32. 제 21 항에 있어서,
    (a) 단계 이전에 상기 펩티드 샘플을 변성시키는 단계 및/또는 분해하는 단계를 더 포함하는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 방법.
  33. 제 21 항에 있어서,
    상기 기준 샘플은 제 1 펄스 듀레이션과 연관되며 상기 펩티드 샘플은 상기 제 1 펄스 듀레이션과 상이한 제 2 펄스 듀레이션과 연관되는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 방법.
  34. 제 21 항에 있어서,
    상기 신호 프로파일은 신호의 크기를 포함하는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 방법.
  35. 제 34 항에 있어서,
    상기 신호의 상기 크기는 미리결정된 크기인, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 방법.
  36. 제 21 항에 있어서,
    상기 펩티드 샘플 및 상기 적어도 하나의 기준 샘플은 교대로 그리고 순차적으로 상기 채널을 통하게 지향되는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 방법.
  37. 제 21 항에 있어서,
    (b) 단계는, (i) 상기 나노갭 전극들의 상기 전극간 거리를 변경하는 단계, 및 (ii) 상기 상이한 전극간 거리들에서 상기 신호들의 개별 측정들을 수행하는 단계를 더 포함하는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 방법.
  38. 제 21 항에 있어서,
    상기 나노전류들은 터널링 전류들을 포함하는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 방법.
  39. 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 시스템으로서,
    가변적인 전극간 거리를 갖는 적어도 하나의 세트의 나노갭 전극들을 포함하는 채널;
    상기 펩티드 샘플 및 적어도 하나의 기준 샘플을 상기 채널을 통하게 지향시키기 위한 유체 흐름 유닛 ―상기 기준 샘플은 상기 나노갭 전극들에 의해 측정되는 나노전류에 대응하는 미리결정된 신호 프로파일을 가짐―; 및
    상기 나노갭 전극들에 커플링되는 컴퓨터 프로세서
    를 포함하며, 상기 컴퓨터 프로세서는, (i) 상기 펩티드 샘플 및 기준 샘플이 상기 채널을 통하게 지향될 때 나노전류들에 대응하는 신호들을 가변적 전극간 거리들에서의 상기 나노갭 전극들을 이용하여 측정하고, 그리고 (ii) (i)에서 측정된 상기 신호들을 상기 기준 신호들에 비교함으로써 상기 하나 또는 그 초과의 단량체들을 동정하도록 프로그래밍되는,
    하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 시스템.
  40. 제 39 항에 있어서,
    상기 기준 샘플은 하나 또는 그 초과의 단량체들의 미리결정된 서열을 갖는 기준 펩티드 샘플인, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 시스템.
  41. 제 39 항에 있어서,
    상기 컴퓨터 프로세서는, 상기 신호들의 상대 값과 상기 기준 신호들 간의 미리결정된 관계를 이용하여 상기 하나 또는 그 초과의 단량체들을 동정하도록 프로그래밍되는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 시스템.
  42. 제 39 항에 있어서,
    상기 채널은 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 포함하며, 각각의 세트는 적어도 2개의 나노갭 전극들을 포함하는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 시스템.
  43. 제 42 항에 있어서,
    상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들은, 상이한 전극간 갭 거리들을 갖는, 제 1 세트의 나노갭 전극들 및 제 2 세트의 나노갭 전극들을 포함하는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 시스템.
  44. 제 39 항에 있어서,
    상기 컴퓨터 프로세서는, 개별 단량체 퀄리티 콜들을 이용하는 상기 나노갭 전극들을 이용한 다수의 측정들로부터의 데이터를 이용하여 상기 펩티드 샘플의 컨센서스 서열을 발생시키도록 프로그래밍되는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 시스템.
  45. 제 39 항에 있어서,
    상기 유체 흐름 시스템은 제 1 펄스 듀레이션에서 상기 기준 샘플을 그리고 상기 제 1 펄스 듀레이션과 상이한 제 2 펄스 듀레이션에서 상기 단백질 샘플을 제공하는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 시스템.
  46. 제 39 항에 있어서,
    상기 컴퓨터 프로세서는, (i) 상기 나노갭 전극들의 상기 전극간 거리를 변경하고 그리고 (ii) 상기 상이한 전극간 거리들에서 상기 신호들의 개별 측정들을 수행하도록 프로그래밍되는, 하나 또는 그 초과의 단량체들을 갖는 펩티드 샘플을 서열화하기 위한 시스템.
  47. 기계 실행가능한 코드를 포함하는 컴퓨터 판독가능한 매체로서,
    상기 기계 실행가능한 코드는, 하나 또는 그 초과의 컴퓨터 프로세서들에 의한 실행시, 하나 또는 그 초과의 아미노산 단량체들을 갖는 단백질 샘플을 서열화하기 위한 방법을 구현하며, 상기 방법은,
    (a) 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 포함하는 채널을 통하게 상기 생체분자를 지향시키는 단계 ―상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들의 각각의 세트는 2개의 나노갭 전극들을 포함하며, 적어도, 상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들의 서브세트는 상이한 전극간 거리들을 가짐―;
    (b) 상기 생체분자가 상기 채널을 통하게 지향될 때 나노전류들에 대응하는 신호들을 상기 복수의 세트들의 나노갭 전극들을 이용하여 측정하는 단계 ―신호들은 상기 생체분자의 상기 복수의 단량체들에 대응함―; 및
    (c) (b) 단계에서 측정된 상기 신호들을 하나 또는 그 초과의 기준들에 비교함으로써 상기 복수의 단량체들을 동정하는 단계
    를 포함하는, 기계 실행가능한 코드를 포함하는 컴퓨터 판독가능한 매체.
  48. 기계 실행가능한 코드를 포함하는 컴퓨터 판독가능한 매체로서,
    상기 기계 실행가능한 코드는, 하나 또는 그 초과의 컴퓨터 프로세서들에 의한 실행시, 하나 또는 그 초과의 아미노산 단량체들을 갖는 단백질 샘플을 서열화하기 위한 방법을 구현하며, 상기 방법은,
    (a) 가변적인 전극간 거리를 갖는 적어도 하나의 세트의 나노갭 전극들을 포함하는 채널을 통하게 상기 펩티드 샘플 및 적어도 하나의 기준 샘플을 지향시키는 단계 ―상기 기준 샘플은 상기 나노갭 전극들에 의해 측정되는 나노전류에 대응하는 미리결정된 신호 프로파일을 가짐―;
    (b) 상기 단백질 샘플 및 기준 샘플이 상기 채널을 통하게 지향될 때 나노전류들에 대응하는 신호들을 상이한 전극간 거리들에서 상기 나노갭 전극들을 이용하여 측정하는 단계 ―신호들은 상기 기준 샘플과 연관된 기준 신호들을 포함함―; 및
    (c) (b) 단계에서 측정된 상기 신호들을 상기 기준 신호들에 비교함으로써 상기 하나 또는 그 초과의 단량체들을 동정하는 단계
    를 포함하는, 기계 실행가능한 코드를 포함하는 컴퓨터 판독가능한 매체.
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