JP4765813B2 - 二重鎖dna量の電気化学的測定方法 - Google Patents
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しかしながら、この様なマイクロリアクターを利用した測定系を蛍光測定法に適用しようとした場合、光軸の設定や蛍光検出に高精度が要求され、また、何よりも検出装置が高価で大型化してしまう問題があった。
この方法では、例えば、配列特異的な増幅反応後の試料に二重鎖DNA結合性物質として一定の過剰量のヘキスト33258(商標)を添加し、二重鎖DNAに結合していない遊離のヘキスト33258の特定電位における酸化電流を電気化学的に測定し二重鎖DNA量を求めるが、蛍光法の場合のように、蛍光標識された特殊で高価なインターカレーターや固定化されたプローブも必要なく、また、それ故に検出装置が小型で低価格であることから、汎用分野への応用が期待される技術である。
(1)被検物質である二重鎖DNAを含む試料溶液に、該二重鎖DNAと結合する二重鎖DNA結合性物質を該二重鎖DNAに対して過剰量加えて反応させた後、結合していない遊離の二重鎖DNA結合性物質の量を電気化学的に測定して二重鎖DNA量を求める二重鎖DNAの測定方法において、二重鎖DNA結合性物質の酸化電位と異なる酸化電位を有する物質を標準物質として試料溶液に一定量加え、各々の酸化電位で電気化学的測定を行うことによって得られる電気量の比率から二重鎖DNA量を求めることを特徴とする、二重鎖DNA量の電気化学的測定方法。
(2)二重鎖DNA結合性物質がビスベンズイミド誘導体である、(1)に記載の二重鎖DNA量の電気化学的測定方法。
(3)ビスベンズイミド誘導体がヘキスト33258(商標)である、(2)に記載の二重鎖DNA量の電気化学的測定方法。
(4)標準物質の酸化電位が−100mVから500mVである、(1)に記載の二重鎖DNA量の電気化学的測定方法。
(5)標準物質がアスコルビン酸である、(1)に記載の二重鎖DNA量の電気化学的測定方法。
本発明で測定される二重鎖DNAを含む試料は、特に限定されるものではないが、例えば、特定のDNA配列の存在を検出するためには、そのDNA配列に対して相補的に結合するプライマーを加えてPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)を行った後、反応液中の二重鎖DNAの増幅量を測定することで存在の有無を確認することができる。この様な特定のDNA配列を検出するための酵素的増幅法にはPCR法の他、LAMP法(Loop−Mediated Isothermal Amplification)等が例示されるが、二重鎖DNAを増幅できる方法であればどの様な方法でも利用可能である。
実施例1
塩基数80bpから4900bpの電気泳動用のDNAマーカーを用い、DNA濃度が0〜30ng/μLのTris(hydroxymethyl)methyl−3−aminopropanesulfonic acid(TAPS)緩衝液溶液(10mM、pH8.5)を調製した。これらのDNA溶液40μLにヘキスト33258(商標:ヘキスト社製)水溶液(300μM)5μLとアスコルビン酸水溶液(2mM)5μLを加え電気化学的測定を行った。電気化学的測定には、Ag/AgClを参照極とし、作用極に黒鉛電極(電極面積1mm2)と対極にSUS304(電極面積2mm2)を用いて200mV、20秒間のC.C.測定を行い、引き続いて500mV、20秒間のC.C.測定を行った。各DNA濃度で測定した200mV、20秒間のC.C.測定で得られた積算電気量Q200と、500mV、20秒間のC.C.測定で得られた積算電気量Q500の比Q500/Q200を求め、Q500/Q200とDNA濃度の検量線(R2=0.96)を作成した。
次に、濃度不明のDNA試料35μLに、100mMのTAPS緩衝液(pH8.5)5μL、ヘキスト33258水溶液(300μM)5μL、及びアスコルビン酸水溶液(2mM)5μLを加え、上記同様の電気化学的測定を行いQ500/Q200を求めた。検量線より、この試料のDNA量は、20±2ng/μl(n=4)と分かった。
10mMのTAPS、50mMのKCl、1.5mMのMgCl2、各0.2mMのdNTP(デオキシリボヌクレオチド三燐酸=dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、0.25U/10μLのTaqDNApolymerase、及び各0.2μMのプライマー(λDNA0.5Kbpを増幅するセンスプライマーとアンチセンスプライマー)の組成で調製されたpH8.5のPCR用反応液40μLを(A)(B)2本の200μL容PCR用チューブに入れた。一方のチューブ(A)にλDNAを含む試料0.1μLを添加し、もう一方のチューブ(B)に滅菌蒸留水0.1μLを添加して、65℃から95℃の間で30サイクルのPCR反応を行った。
次に、(A)(B)それぞれにヘキスト33258水溶液(300μM)5μLとアスコルビン酸水溶液(2mM)5μLを加え電気化学的測定を行った。電気化学的測定には、参照極をAg/AgClとし、作用極(約1mm2)、対極(約2mm2)ともに金電極を用い、200mVにおける20秒間のC.C.測定を行い、引き続いて450mVにおける20秒間のC.C.測定を行いQ450/Q200(各C.C.測定における積算電気量比)を求めた。予め、実施例1で示した検量線の作成法に準じて作成しておいたλDNA検量線(Q450/Q200に対するDNA濃度、R2=0.97)よりλDNA量を求めた結果、(A)のλDNA濃度は28±2ng/μL(n=4)、(B)の濃度は0〜3ng/μL(n=4)であった。
実施例1におけるC.C.測定を自然電位から900mVのLSV(リニアスイープボルタンメトリー)とし、自然電位から200mVまでの積算電気量Q0−200と自然電位から450mVまでの積算電気量Q0−450の比(Q0−200/Q0−450)を求め、得られたQ0−200/Q0−450を基に検量線(R2=0.95)を作成した。次に、C.C.測定をLSVとした以外は実施例1と同様にして、実施例1で使用した濃度不明のDNA試料を測定しQ0−200/Q0−450を求めた。作成した上記検量線よりDNA濃度を求めたところ、19±2ng/μL(n=4)であった。
作用電極を黒鉛電極から真空蒸着装置で金を蒸着させたポリイミドフィルムを用いた金蒸着電極(電極面積約1mm2)に換えた以外は、実施例1と同様に操作を行った。予め作成した検量線(R2=0.96)より、濃度不明の試料は、DNA濃度20±2ng/μL(n=4)となり、実施例1と同様の結果を得た。
実施例1において用いたアスコルビン酸水溶液を添加せず、そのまま500mV、20秒間のC.C.測定を行った。DNA濃度0ng/μLの積算電気量と各DNA濃度の積算電気量の差を基に検量線(R2=0.75)を作成したが差の値のばらつきが大きく20ng/μL以下の濃度範囲での定量性は得られなかった。次に、実施例1で使用した濃度不明の試料を用い、同じく500mV、20秒間のC.C.測定を行い、積算電気量を基に検量線よりDNA濃度を求めたが、15〜25ng/μLの範囲の濃度であることは判明したが正確な濃度は分からなかった。
実施例2において使用したアスコルビン酸水溶液を添加せず、450mV、20秒間のC.C.測定を行うことによってλDNAによる検量線の作成を試みたが、ブランク値とのばらつきが大きく、定量性のある検量線を作成することができなかった。そこで、検体ごとに使用する作用極の面積と電気抵抗を正確に計測し、その値に基づいて積算電気量を補正する処理を行い、検量線(R2=0.96)を作成した。
次に、測定検体ごとに使用する電極の作用極面積と電極抵抗を正確に計測したうえ、実施例2と同様にPCR反応を行った後、アスコルビン酸水溶液を添加せず、450mV、20秒間のC.C.測定を行い、作用極面積による補正を行った後、上記検量線よりλDNA濃度を求めた。(A)と同様の操作を行った試料のλDNA濃度は、25±2ng/μL(n=4)、(B)と同様の操作を行った試料は0〜3ng/μL(n=4)であった。実施例2と同様に、試料中のλDNAの量を確認できたが、検体ごとに使用する作用極面積を正確に計測しなければならず、実施例2の測定時間の3倍の時間を要した。
実施例4においてアスコルビン酸水溶液を添加せず500mV、20秒間のC.C.測定を行ったが、使用した作用電極の金蒸着処理ロットによって、ブランク値との差のばらつきが大きく、定量性のある検量線を作成することができなかった。そこで、同一の金蒸着処理ロットの電極を用い、かつ電極面積を正確に計測し、更に、電極抵抗を測定し、面積と電極抵抗による補正を行って検量線(R2=0.96)を作成した。検量線を作成した物と同一の金蒸着処理ロットの電極を用い、電極面積を正確に計測し、面積の補正を行って、実施例4と同様にして濃度不明の試料の測定を行ったところ、19±2ng/μl(n=4)の濃度であることが分かった。しかしながら、検量線作成と実際の測定に使用する作用電極について、金蒸着処理ロットを揃えたうえ、作用極面積を正確に計測し、更に電極抵抗を正確に測定し補正しなければならず、測定には実施例4の測定時間の3倍を要した。
Claims (5)
- 被検物質である二重鎖DNAを含む試料溶液に、該二重鎖DNAと結合する二重鎖DNA結合性物質を該二重鎖DNAに対して過剰量加えて反応させた後、結合していない遊離の二重鎖DNA結合性物質の量を電気化学的に測定して二重鎖DNA量を求める二重鎖DNAの測定方法において、二重鎖DNA結合性物質の酸化電位と異なる酸化電位を有する物質を標準物質として試料溶液に一定量加え、各々の酸化電位で電気化学的測定を行うことによって得られる電気量の比率から二重鎖DNA量を求めることを特徴とする、二重鎖DNA量の電気化学的測定方法。
- 二重鎖DNA結合性物質がビスベンズイミド誘導体である、請求項1に記載の二重鎖DNA量の電気化学的測定方法。
- ビスベンズイミド誘導体がヘキスト33258(商標)である、請求項2に記載の二重鎖DNA量の電気化学的測定方法。
- 標準物質の酸化電位が−100mVから500mVである、請求項1に記載の二重鎖DNA量の電気化学的測定方法。
- 標準物質がアスコルビン酸である、請求項1に記載の二重鎖DNA量の電気化学的測定方法。
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