KR20160078998A - 항-알파-시누클레인 항체 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-인간 알파-시누클레인 항체 및 그의 사용 방법을 제공한다.

Description

항-알파-시누클레인 항체 및 사용 방법{ANTI-alpha-SYNUCLEIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
본 발명은 항-인간 알파-시누클레인 항체 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
파킨슨병은 흑질선조체계의 도파민(DA) 뉴런의 진행성 상실 및 루이소체(LB) 및 신경돌기(LN), 주로 섬유상 알파-시누클레인 응집체로 구성된 단백질성 뉴런내 함유물의 존재를 특징으로 한다. 알파-시누클레인은, 뇌에서 도파민작동성 뉴런 기능을 조절하는데 중심 역할을 하고 PD 병태생리학에 결정적으로 관련되는 것으로 생각되는 단백질이다. 실제로, 알파-시누클레인이 LB의 주요 단백질 성분이라는 사실 외에, 유전학적 연구는 상기 알파-시누클레인 유전자 중의 몇몇 점 돌연변이 및 상기 유전자의 증식이 PD의 가족성 형태를 유발함을 보였다. 다수의 증거는 도파민작동성 시냅스에서 알파-시누클레인 병리학이 PD 뇌에서의 뉴런 세포 기능장애의 개시 및 퇴행에 기초가 될 수 있음을 가리키고 있다(문헌[Bellucci, A., et al., Brain Res. 1432 (2012) 95-113]).
알파-시누클레인의 침착물인 루이소체는 파킨슨병(PD)의 병리학적 징후이다(문헌[Goedert, M., Nat. Rev. Neurosci 2 (2001) 492-501]). 산발성 PD와 관련된 뇌 병리학의 병기결정이 문헌[Braak et al., Neurobiology of aging 24 (2003) 197-211])에 보고되어 있다.
알파-시누클레인 섬유성 응집체는 루이소체 및 루이 신경돌기의 주요 성분이다. 최근의 과학 연구는 알파-시누클레인의 전섬유성 올리고머가 파킨슨병의 진행에 핵심적인 기여인자일 수 있음을 암시하고 있다(문헌[Luk, K.C., et al., Science 338 (2012) 949-953]; 문헌[Auluck, P.K., et al., Science 295 (2002) 865-868]; 문헌[Bodner, R.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 4246-4251]; 문헌[Bucciantini, M., et al., J. Biol. Chem. 279 (2004) 31374-31382]; 문헌[El-Agnaf, O.M., et al., FASEB J. 20 (2006) 419-425]; 문헌[Kayed, R., et al., Science 300 (2003) 486-489]; 문헌[Lashuel, H.A., et al., J. Mol. Biol. 322 (2002) 1089-1102]; 문헌[Masliah, E., et al., Science 287 (2000) 1265-1269]).
카이(Chai, Y-J.) 등은 알파-시누클레인의 분비된 올리고머성 형태가 다수의 막 수송 단계에 영향을 미침을 보고한다(문헌[FEBS Lett. 587 (2013) 452-459]). PD에서 신경퇴행의 중요한 매개체인 알파-시누클레인에 의해 유도된 BV-2 세포의 엑소좀이 창(Chang, C.) 등(문헌[Neurosci. Lett. 548 (2013) 190-195])에 의해 보고된다. 펭(Feng, R.L.) 등은 알파-시누클레인이 세포 취약성에서 알파-시누클레인 올리고머의 잠재적인 역할인 막 전도도의 변경을 매개함을 보고한다(문헌[Eur. J. Neurosci. 32 (2010) 10-17]). 리(Lee, H-J.) 등은 자기소화(autophagic) 실패가 알파-시누클레인의 외포작용 및 세포간 전달을 촉진함을 보고한다(문헌[Exp. Mol. Med. 45 (2013) e22]). 루이소체를 갖는 치매, 파킨슨병 및 파킨슨병 치매에서 알파-시누클레인 응집의 시냅스 병리학이 슐츠-채퍼(Schulz-Schaeffer, W.J.)(문헌[Acta Neuropathol. 120 (2010) 131-143])에 의해 보고된다.
인간 뇌 중의 대다수의 알파-시누클레인은 N-말단 아세틸화되며(문헌[Kellie, J.F., et al., Sci. Rep. 4 (2014) 5797]) 상기 N-말단 아세틸화는 알파-시누클레인의 응집을 억제한다(문헌[Bartels, T., et al., PLoS One 9 (2014) e103727]).
재조합 알파-시누클레인의 상이한 올리고머성 형태들이 보고되었다: A형 올리고머(세포독성, Ca++ 유입에 영향), C형 올리고머(응집체 시딩 종), 지질과 혼합된 피브릴(세포내 응집체의 응집 시딩), 3중 프롤린(TP) 돌연변이체 A30P/A56P/A76P(독성 올리고머를 우세하게 형성한다)(문헌[예를 들어 문헌[Danzer, K.M., et al., J. Neurosci. 27 (2007) 9220-9232]; 문헌[Danzer, K.M., et al. J. Neurochem. 111 (2009) 192-203]; 문헌[Luk, C.K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009) 20051-20056]; 문헌[Desplates, P., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009) 13010-13015]; 문헌[Karpinar, D.P., et al., EMBO J. 28 (2009) 3256-3268]; 문헌[Lee, H-J., et al., J. Biol. Chem. 285 (2010) 9262-9272]; 문헌[Hansen, C., et al., J. Clin. Invest. 121 (2011) 715-725]을 참조하시오).
병리학적 알파-시누클레인 전달은 비-트랜스제닉 마우스에서 파킨슨-형 신경퇴행을 개시시킨다(문헌[Luk, K.C., et al., Science 338 (2012) 949-953]). 알파-시누클레인 올리고머에 의해 유도된 시딩은 알파-시누클레인 병리학의 확산 및 알파 시누클레인 올리고머의 엑소좀성 세포-세포 전달에 대한 증거를 제공한다(문헌[Danzer, K.M., et al., J. Neurochem. 111 (2009) 192-203]; 문헌[Mol. Neurodegen. 7 (2012) 42]에 보고됨). 브래이디(Braidy) 등은 시험관내에서 1차 인간 태아 장 뉴런에서의 알파-시누클레인 전달 및 미토콘드리아 독성을 보고한다(문헌[Neurotox. Res. (2013) epub on October 5, 2013]). 데스플레츠(Desplats, P.) 등은 알파-시누클레인의 뉴런-뉴런 전달을 통한 함유물 형성 및 뉴런 세포사를 보고한다(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009) 13010-13015]). 뉴런으로부터 성상교세포로의 알파-시누클레인의 직접적인 전달은 시누클레인병증에서 염증 반응을 야기한다(문헌[Lee et al., J. Biol. Chem. 285 (2010) 9262-9272]에 보고됨). 리(Lee, S-J.) 등은 알파-시누클레인 응집체의 세포-세포 전달을 보고한다(문헌[Meth. Mol. Biol. 849 (2012) 347-359]; 문헌[Nat. Rev. Neurol. 6 (2010) 702-706]). 알파-시누클레인 응집 시드의 가능한 전달에 의한 알파-시누클레인 병리학의 진행에 대해 있을 수 있는 가장 강력한 증거는 11 내지 16년 더 일찍 뇌에 이식된 태아 뉴런 중에 루이 병리학을 나타낸 몇몇 PD 환자의 뇌의 사후 분석으로부터 나온다(문헌[Li, J-Y., et al., Nat. Med. 14 (2008) 501-503]).
응집된 알파-시누클레인은 생체내에서 도파민작동성 신경독성을 매개한다(문헌[Periquet, M., et al., J. Neurosci. 27 (2007) 3338-3346]). 피에리(Pieri, L.) 등은 섬유성 알파-시누클레인 및 헌팅틴 엑손 1 조립체가 세포에 독성임을 보고한다(문헌[Biophys. J. 102 (2012) 2894-2905]). 반 루이젠(Van Rooijen) 등은 기전의 연구에서 올리고머성 알파-시누클레인의 막 침투성을 보고한다(문헌[PLoS One 5 (2010) e14292]).
매우 최근에, 와그너(Wagner) 등은 세포 분석 및 알파-시누클레인 트랜스제닉 마우스 모델에서 소분자 Anle138b가 파킨슨병의 질병-변형 요법에 유용할 수도 있는 보호성 알파-시누클레인 올리고머 조절제로서 작용함을 입증하였다(문헌[Wagner, J, et al., Acta Neuropathol. 125 (2013) 795-813]). 린치(Lynch, S.M.) 등은 알파-시누클레인의 비-아밀로이드 성분에 대한 scFv 세포내항체(intrabody)가 세포내 응집 및 독성을 감소시킴을 보고한다(문헌[J. Mol. Biol. 377 (2008) 136-147]). 파킨슨병 및 관련 질환에 대한 신규 치료로서 알파-시누클레인 응집 및 독성의 억제제를 설계하기 위한 전략이 엘 아그나프(El-Agnaf, O.M.) 등(문헌[FASEB J. (2004)])에 의해 보고된다. 에마디(Emadi, S.) 등은 인간 단쇄 항체 단편에 의한 알파-시누클레인의 응집 억제, 및 응집을 억제하고 알파-시누클레인-유도된 독성을 방지하는 올리고머성 알파-시누클레인에 대한 인간 단쇄 항체 단편의 단리를 보고한다(문헌[Biochem. 43 (2004) 2871-2878; J. Mol. Biol. 368 (2007) 1132-1144]). 스미스(Smith) 등은 알파-시누클레인 응집 및 신경독성에 대한 정맥내 면역글로불린의 효과를 보고한다(문헌[Int. Immunopharmacol. 14 (2012) 550-557]). 파킨슨병 및 다른 시누클레인병증에 대한 치료 전략으로서 세포내 및 세포외 알파-시누클레인을 표적화하는 것이 베크렐리스와 스테파니스(문헌[Vekrelis, K. and Stefanis, L., Expert. Opin. Ther. Targets 16 (2012) 421-432])에 의해 보고된다.
각각의 트랜스제닉 마우스에서 대뇌 시누클레인병증의 항체-지원된 제거가 능동(문헌[Masliah, E., et al., Neuron 46 (2005) 857-868]) 및 수동(문헌[Masliah, E., et al., PLoS One 6 (2011) e19338]) 면역화 패러다임에서 입증되었다. 특이 항체에 의한 세포외 알파-시누클레인의 결합은 세포-세포 응집 전달을 방지한다(문헌[Bae, E-J., et al. (J. Neurosci. 32 (2012) 13454-13469]에 보고되었다).
루이소체 질환의 치료를 위한 알파-시누클레인 에피토프의 미모토프의 용도가 WO 2011/020133에 보고되어 있다. WO 2007/011907에서 알파-시누클레인 항체 및 이와 관련된 방법이 보고된다. 고도로 하전된 프로테아좀 재표적화 서열에의 융합은 다양한 항-시누클레인 세포내항체의 효능 및 용해성 세포질 발현을 증가시킨다(문헌[Joshi et al. MABS 4 (2012) 686-693]에 보고됨). 에마디(Emadi) 등(문헌[J. Mol. Biol. 368 (2007) 1132-1144])은 응집을 억제하고 알파-시누클레인-유도된 독성을 방지하는 올리고머성 알파-시누클레인에 대한 인간 단쇄 항체 단편의 단리를 보고한다. 알파-시누클레인의 형태학적으로 다른 올리고머 형태의 검출이 에마디 등(문헌[J. Biol. Chem. 284 (2009) 11048-11058])에 의해 보고된다. 조우(Zhou) 등(문헌[Mol. Ther. 10 (2004) 1023-1031])은 인간 단쇄 Fv 세포내항체가 과발현된 알파-시누클레인의 이상 세포 효과를 차단함을 보고한다. 상기 알파-시누클레인에 대한 항체가 살아있는 세포에서 올리고머화를 감소시킴이 나스트롬(Nasstrom) 등(문헌[PLoS One 6 (2011) e27230])에 의해 보고된다. 원시섬유-결합 항체, 및 파킨슨병, 루이소체를 갖는 치매 및 다른 알파-시누클레인병증에 대한 치료 및 진단 방법에서의 그의 용도가 WO 2011/104696에 보고된다. 원자력 현미경검사 및 파지 디스플레이 기술을 사용하는 특정한 단백질 형태에 대한 재조합 항체의 단리가 발크호르다리안(Barkhordarian) 등(문헌[Prot. Eng. Des. Select. 19 (2006) 497-502])에 의해 보고된다. 문헌[Kvam et al., PLoS One 4 (2009) e5727]은 생세포에서 섬유성 폴리글루타민 단백질의 입체구조 표적화가 응집 및 세포독성을 점증시킴을 보고한다.
본 발명은 항-인간 알파-시누클레인 항체 및 그의 사용 방법을 제공한다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 인간 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하는 항체이며, 여기에서 상기 인간 알파-시누클레인은 자유 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는다.
"자유 N-말단 메티오닌 잔기"란 용어는, 폴리펩타이드의 N-말단에 위치하고 상기 폴리펩타이드의 나머지에 접합되는 아미드-결합을 제외하고 변형되지 않은 상기 폴리펩타이드 중의 메티오닌 잔기를 나타낸다. 상기와 같은 자유 N-말단 메티오닌 잔기는 하나의 실시태양에서 변형되지 않은 메티오닌 잔기이다. 상기와 같은 자유 N-말단 메티오닌 잔기는 하나의 실시태양에서 자유 아미노기를 갖는다. 인간 알파-시누클레인은 서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간 및 마우스 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하며, 여기에서 상기 인간 및 마우스 알파-시누클레인은 자유 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는다.
하나의 실시태양에서 상기 알파-시누클레인은 단량체성 알파-시누클레인이다.
하나의 실시태양에서, 상기 알파-시누클레인은 단량체성 및 올리고머성 알파-시누클레인이다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 중쇄에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프 또는 중복 에피토프에 결합한다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 중쇄에 서열번호 21, 22 및 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 23 내지 25의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프 또는 중복 에피토프에 결합한다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 서열번호 26의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 27의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체와 동일한 에피토프 또는 중복 에피토프에 결합한다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 중쇄에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 중쇄에 서열번호 21, 22 및 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 23 내지 25의 HVR을 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 서열번호 26의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 27의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 인간화시킴으로써 획득되었다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하고, 여기에서 각각의 HVR 중에 0 내지 3개의 아미노산 잔기가 변화되었다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인에 서열번호 21, 22 및 17의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 23 내지 25의 HVR을 포함하고, 여기에서 각각의 HVR 중에 0 내지 3개의 아미노산 잔기가 변화되었다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이고 중쇄 가변 도메인은 서열번호 26의 중쇄 가변 도메인으로부터 유래되고 경쇄 가변 도메인은 서열번호 27의 경쇄 가변 도메인으로부터 유래된다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 중쇄에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프 또는 중복 에피토프에 결합하는 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 서열번호 26의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 27의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체와 동일한 에피토프 또는 중복 에피토프에 결합하는 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 중쇄에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하는 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 중쇄에 서열번호 21, 22 및 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 23 내지 25의 HVR을 포함하는 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 서열번호 26의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 27의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체로부터 획득된 변형 항체이다.
하나의 실시태양에서 상기 변형 항체는 서열번호 26의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 27의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 인간화시킴으로써 획득된 인간화된 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 중쇄 가변 도메인에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하는 인간화된 항체이고, 여기에서 각각의 HVR 중에 0 내지 3개의 아미노산 잔기가 변화되었다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 중쇄 가변 도메인에 서열번호 21, 22 및 17의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 23 내지 25의 HVR을 포함하는 인간화된 항체이고, 여기에서 각각의 HVR 중에 0 내지 3개의 아미노산 잔기가 변화되었다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 중쇄 가변 도메인이 서열번호 26의 중쇄 가변 도메인으로부터 유래되고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 27의 경쇄 가변 도메인으로부터 유래되는 인간화된 항체이다.
모든 선행 태양들의 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈에 접합된다.
하나의 실시태양에서, 상기 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈은 LRP1, LRP8, 인간 트랜스페린 수용체 또는 인간 인슐린-유사 성장인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편이다.
모든 선행 태양들의 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 단클론 항체이다.
모든 선행 태양들의 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 인간화된 항체 또는키메릭 항체이다.
모든 선행 태양들의 하나의 실시태양에서, 상기 항체는
a) 인간 하위부류 IgG1의 전장 항체, 또는
b) 인간 하위부류 IgG4의 전장 항체, 또는
c) 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는 인간 하위부류 IgG1의 전장 항체,
d) 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G를 갖는 인간 하위부류 IgG4의 전장 항체,
e) 2개의 중쇄 모두에 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G 및 하나의 중쇄에 돌연변이 T366W 및 S354C 및 각각의 다른 중쇄에 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 하위부류 IgG1의 전장 항체, 또는
f) 2개의 중쇄 모두에 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G 및 하나의 중쇄에 돌연변이 T366W 및 S354C 및 각각의 다른 중쇄에 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 하위부류 IgG4의 전장 항체
이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역임
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역임
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 26의 비-인간(토끼) 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 27의 비-인간(토끼) 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역임
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역임
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역임
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 26의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 27의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역임
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하는 제1 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 T366W 및 S354C 또는 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
b) 상기 항체가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 제2 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하거나, 또는 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
c) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역임
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하는 제1 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 T366W 및 S354C 또는 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
b) 상기 항체가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 제2 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하거나, 또는 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
c) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역임
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하는 제1 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 26의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 T366W 및 S354C 또는 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
b) 상기 항체가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 제2 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 26의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하거나, 또는 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
c) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 27의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역임
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
하나의 실시태양에서 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 단편은, 서열번호 56의 중쇄 가변 도메인의 인간화된 형태인 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 57의 경쇄 가변 도메인의 인간화된 형태인 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
모든 선행 태양들의 하나의 실시태양에서 상기 항체는
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시키고/시키거나,
iv) 자유 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하고 변형된 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는 알파-시누클레인에는 특이적으로 결합하지 않는다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 인간 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하는 항체이며, 여기에서 상기 항체는
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킨다.
모든 태양 및 실시태양 중 하나의 실시태양에서 상기 인간 뉴런 세포는 테트라사이클린-조절된, v-myc-과발현 인간 중뇌-유래된 세포주이다. 모든 태양 및 실시태양 중 하나의 실시태양에서 상기 인간 뉴런 세포는 룬트 인간 중뇌(LUHMES) 세포이다.
하나의 실시태양에서 상기 카스파제 활성은 카스파제 3 및/또는 카스파제 7 활성이다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 시누클레인병증의 치료에 사용하기 위한 것이다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 파킨슨병의 치료에 사용하기 위한 것이다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 효과기 기능 잠재성이다. 하나의 실시태양에서 상기 항체는 효과기 기능이 없다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 아미노산 서열 GKNEEGAPQEG(서열번호 1)로 이루어지는 펩타이드에 특이적으로 결합한다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 10-09 M 미만 10-07 M 초과의 단량체성 인간 알파-시누클레인에 대한 결합 친화성을 갖는다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 단량체성 및 올리고머성 인간 알파-시누클레인에 특이적으로 결합한다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 중쇄 가변 도메인에 서열번호 2 내지 4의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 5 내지 7의 HVR을 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 중쇄 가변 도메인에 서열번호 8, 9 및 4의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 10 내지 12의 HVR을 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 서열번호 13으로 이루어지는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 14로 이루어지는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 서열번호 13으로 이루어지는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 14로 이루어지는 경쇄 가변 도메인을 인간화시킴으로써 획득되었다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인에 서열번호 2 내지 4의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 5 내지 7의 HVR을 포함하고, 여기에서 각각의 HVR 중에 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인에 서열번호 8, 9 및 4의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 10 내지 12의 HVR을 포함하고, 여기에서 각각의 HVR 중에 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이고 중쇄 가변 도메인은 서열번호 13으로 이루어지는 중쇄 가변 도메인으로부터 유래되고 경쇄 가변 도메인은 서열번호 14로 이루어지는 경쇄 가변 도메인으로부터 유래된다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 중쇄에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 중쇄에 서열번호 21, 22 및 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 23 내지 25의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 서열번호 26으로 이루어지는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 27로 이루어지는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 서열번호 26으로 이루어지는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 27로 이루어지는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 인간화시킴으로써 획득되었다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하고, 여기에서 각각의 HVR 중에 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인에 서열번호 21, 22 및 17의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 23 내지 25의 HVR을 포함하고, 여기에서 각각의 HVR 중에 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이고 중쇄 가변 도메인은 서열번호 26으로 이루어지는 중쇄 가변 도메인으로부터 유래되고 경쇄 가변 도메인은 서열번호 27로 이루어지는 경쇄 가변 도메인으로부터 유래된다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 중쇄에 서열번호 28 내지 30의 HVR 및 경쇄에 서열번호 31 내지 33의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 중쇄에 서열번호 28, 34 및 30의 HVR 및 경쇄에 서열번호 35 내지 37의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 서열번호 38로 이루어지는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 39로 이루어지는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 서열번호 38로 이루어지는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 39로 이루어지는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 인간화시킴으로써 획득되었다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인에 서열번호 28 내지 30의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 31 내지 33의 HVR을 포함하고, 여기에서 각각의 HVR 중에 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인에 서열번호 28, 34, 및 30의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 35 내지 37의 HVR을 포함하고, 여기에서 각각의 HVR 중에 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이고 중쇄 가변 도메인은 서열번호 38로 이루어지는 중쇄 가변 도메인으로부터 유래되고 경쇄 가변 도메인은 서열번호 39로 이루어지는 경쇄 가변 도메인으로부터 유래된다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 섬유성 인간 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하며 비-섬유성 인간 알파-시누클레인에는 결합하지 않는다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈에 접합된다.
하나의 실시태양에서, 상기 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈은 LRP1, LRP8, 인간 트랜스페린 수용체 또는 인간 인슐린-유사 성장인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편이다.
하나의 실시태양에서, 상기 항체는 단클론 항체이다.
하나의 실시태양에서, 상기 항체는 인간화된 항체 또는 키메릭 항체이다.
하나의 실시태양에서, 상기 항체는 인간 알파-시누클레인에 결합하고,
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시키는
항체 단편이다.
하나의 실시태양에서 상기 항체는
a) 인간 하위부류 IgG1의 전장 항체, 또는
b) 인간 하위부류 IgG4의 전장 항체, 또는
c) 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는 인간 하위부류 IgG1의 전장 항체,
d) 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G를 갖는 인간 하위부류 IgG4의 전장 항체,
e) 2개의 중쇄 모두에 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G 및 하나의 중쇄에 돌연변이 T366W 및 S354C 및 각각의 다른 중쇄에 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 하위부류 IgG1의 전장 항체, 또는
f) 2개의 중쇄 모두에 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G 및 하나의 중쇄에 돌연변이 T366W 및 S354C 및 각각의 다른 중쇄에 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 하위부류 IgG4의 전장 항체
이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
c) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 4의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
c) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 13의 비-인간(토끼) 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 14의 비-인간(토끼) 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
c) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
c) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
c) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 26의 비-인간(토끼) 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 27의 비-인간(토끼) 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
c) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 31, 서열번호 32 및 서열번호 33의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
c) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 28, 서열번호 34 및 서열번호 30의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 35, 서열번호 36 및 서열번호 37의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
c) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 38의 비-인간(토끼) 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 39의 비-인간(토끼) 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
c) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
c) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 4의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
c) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 13의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 14의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
c) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
c) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
c) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 26의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 27의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
c) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 31, 서열번호 32 및 서열번호 33의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
c) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 28, 서열번호 34 및 서열번호 30의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 35, 서열번호 36 및 서열번호 37의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
c) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 38의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 39의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
c) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하는 제1 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 T366W 및 S354C 또는 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
b) 상기 항체가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 제2 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하거나, 또는 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
c) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
d) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하는 제1 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 4의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 T366W 및 S354C 또는 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
b) 상기 항체가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 제2 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 4의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하거나, 또는 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
c) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
d) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하는 제1 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 13의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 T366W 및 S354C 또는 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
b) 상기 항체가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 제2 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 13의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하거나, 또는 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
c) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 14의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
d) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하는 제1 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 T366W 및 S354C 또는 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
b) 상기 항체가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 제2 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하거나, 또는 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
c) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
d) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하는 제1 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 T366W 및 S354C 또는 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
b) 상기 항체가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 제2 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하거나, 또는 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
c) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
d) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하는 제1 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 26의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 T366W 및 S354C 또는 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
b) 상기 항체가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 제2 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 26의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하거나, 또는 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
c) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 27의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
d) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하는 제1 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 T366W 및 S354C 또는 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
b) 상기 항체가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 제2 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하거나, 또는 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
c) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 31, 서열번호 32 및 서열번호 33의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
d) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하는 제1 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 28, 서열번호 34 및 서열번호 30의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 T366W 및 S354C 또는 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
b) 상기 항체가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 제2 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 28, 서열번호 34 및 서열번호 30의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하거나, 또는 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
c) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 35, 서열번호 36 및 서열번호 37의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
d) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
a) 항체가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하는 제1 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 38의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 T366W 및 S354C 또는 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
b) 상기 항체가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 제2 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 38의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하거나, 또는 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
c) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 39의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역이고,
d) 상기 항체가
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킴
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체이다.
하나의 실시태양에서 상기 항체 단편은 서열번호 56의 중쇄 가변 도메인의 인간화된 형태인 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 57의 경쇄 가변 도메인의 인간화된 형태인 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 본 발명에 보고된 바와 같은 항체를 암호화하는 단리된 핵산이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 본 발명에 보고된 바와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 항체를 생산하도록 본 발명에 보고된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 상기 항체의 생성 방법이다.
하나의 실시태양에서 상기 방법은 상기 세포 또는 배양 배지로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 제형이다.
하나의 실시태양에서 상기 약학 제형은 추가의 치료제를 추가로 포함한다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 시누클레인병증의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 파킨슨병의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하는데 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하는데 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 뉴런 세포 또는 신경교 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시키는데 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 약제의 제조에서 본 발명에 보고된 바와 같은 항체의 용도이다.
하나의 실시태양에서 상기 약제는 파킨슨병 치료용이다.
하나의 실시태양에서 상기 약제는 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성의 억제용이다.
하나의 실시태양에서 상기 약제는 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달의 억제용이다.
하나의 실시태양에서 상기 약제는 뉴런 세포 또는 신경교 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성의 감소용이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 파킨슨병이 있는 개인에게 유효량의 본 발명에 보고된 바와 같은 항체를 투여함을 포함하는 상기 개인의 치료 방법이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 개인에게 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하기에 유효한 양의 본 발명에 보고된 바와 같은 항체를 투여함을 포함하는, 상기 개인에서 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하는 방법이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 개인에게 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하기에 유효한 양의 본 발명에 보고된 바와 같은 항체를 투여함을 포함하는, 상기 개인에서 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하는 방법이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성의 억제에서 본 발명에 보고된 바와 같은 항-인간 알파 시누클레인 항체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달의 억제에서 본 발명에 보고된 바와 같은 항-인간 알파 시누클레인 항체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 뉴런 세포 또는 신경교 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성의 감소에서 본 발명에 보고된 바와 같은 항-인간 알파 시누클레인 항체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 항체를 파킨슨병의 치료에 사용할 수 있다. 상기 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 항체는 독성 올리고머성 알파-시누클레인의 확산을 억제하거나, 또는 뉴런 및 신경교 세포에 의한 독성 올리고머성 알파-시누클레인의 흡수를 억제하거나, 또는 신경염증을 감소시킨다.
본 발명에 보고된 바와 같은 항체에 의해, 시누클레인병증 및 신경병증의 진행의 억제/감소가 영향을 받을 수 있다.
본 발명에 보고된 바와 같은 항체를 파킨슨병의 발병으로부터 보호하는데 사용하거나 또는 심지어 파킨슨병의 진행을 정지시키는데 사용할 수 있다.
하나의 실시태양에서 본 발명에 보고된 바와 같은 항체는 i) 알파-시누클레인 트랜스제닉 마우스 및 파킨슨병 환자의 뇌 절편상의 알파-시누클레인에 결합하고/하거나; LUHMES 세포 중의 알파-시누클레인을 표지한다.
본 발명에 보고된 바와 같은 항체를 시누클레인병증의 치료에 사용할 수 있다. 일부 시누클레인병증은 1형 뇌 철분 축적을 갖는 신경퇴행(NBIA1), 순수성 자율신경 실조증, 다운 증후군, 괌 복합체(complex of Guam), 및 다수의 루이소체 질환, 예를 들어 확산성 루이소체병(DLBD), 알쯔하이머병의 루이소체 변형(LBVAD), 몇몇 형태의 고세병 및 파킨슨병 치매(PDD)이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 인간 알파-시누클레인 중의 서열번호 1의 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 서열번호 13의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 14의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 서열번호 26의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 27의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 서열번호 38의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 39의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체이다.
도 1: 항-알파-시누클레인-항체 0017의 농도 의존적인 결합 특이성; 레인: 1) 섬유성 알파-시누클레인 제제, 2) 3중-프롤린 돌연변이 알파-시누클레인 올리고머, 3) A형 알파-시누클레인 올리고머, 4) C형 알파-시누클레인 올리고머.
도 2: 항-알파-시누클레인-항체 0018의 농도 의존적인 결합 특이성; 레인: 1) 섬유성 알파-시누클레인 제제, 2) 3중-프롤린 돌연변이 알파-시누클레인 올리고머, 3) A형 알파-시누클레인 올리고머, 4) C형 알파-시누클레인 올리고머.
도 3: 항-알파-시누클레인-항체 0081의 농도 의존적인 결합 특이성; 레인: 1) 섬유성 알파-시누클레인 제제, 2) 3중-프롤린 돌연변이 알파-시누클레인 올리고머, 3) A형 알파-시누클레인 올리고머, 4) C형 알파-시누클레인 올리고머.
도 4: 알파-시누클레인[A30P]-트랜스제닉 마우스의 뇌간에서 알파-시누클레인 염색; 신선한 동결된 10 ㎛ 시상 뇌 절편; 40x 확대; 모두 동일한 조명 조건에서의 상; 화살촉은 루이 신경돌기-유사 함유물을 가리킨다.
도 5: 파킨슨병 환자(A), 파킨슨병을 동시에 앓고 있는 알쯔하이머병 환자(B) 및 진행성 핵상마비(PSP, 타우병증)(C)의 인간 뇌피질 중 항체 0017 및 0018의 염색; 화살표: 루이소체 유사 함유물; 화살촉: 루이 신경돌기-유사 함유물.
도 6: 15개월 된 알파-시누클레인 돌연변이 A30P 트랜스제닉 마우스내로 특이성 mAb(5일 동안 2 x 60 ㎎/㎏ 항체 또는 PBS)의 급성 말초 주사시 알파-시누클레인 돌연변이 A30P 트랜스제닉 마우스에서 대뇌 알파-시누클레인 병리의 표지; 신선한 동결된 20 ㎛ 시상 뇌 절편을 항-쥐 IgG1-항체-AF555 접합체 또는 각각의 항-알파-시누클레인 항체 및 항-쥐 IgG1-항체-AF555 접합체로 염색하였다; 뇌간 영역의 40x 확대; 모두 필적하는 조명하의 상; 화살표: 루이소체 유사 함유물; 화살촉: 루이 신경돌기-유사 함유물.
도 7: LUHMES 세포에 대한 SHSY5Y 세포로부터의 재조합 알파-시누클레인의 컨디셔닝된 배지의 세포 독성; (A) 항체 0017; (B) 항체 0018; (C) 항체 12F4(기준).
도 8: 재조합적 알파-시누클레인 발현 SHSY5Y 세포로부터의 컨디셔닝된 배지에 의한 LUHMES 세포의 처리; 신선하게 도말된 LUHMES 세포에 대한, a) 대조용 배지 = LUHMES 세포에 대한 분화 배지 및 b) 컨디셔닝된 배지 = 재조합 알파-시누클레인 발현 SHSY5Y 세포로부터 6일 후 수확된 LUHMES 분화 배지에 의한 처리.
도 9: 항체 0017 및 0018은 세포외 배지로부터 알파-시누클레인 올리고머를 면역고갈시킬 수 있으며 이에 의해 상기 항체는 알파-시누클레인 올리고머의 독성을 감소시킨다.
도 10: 실시예 11에 따라 측정된 바와 같은 용융 전이(빈 원, 40 ℃ - 최고값) 및 상응하는 적합성(실선)의 원 데이터.
도 11: 항-알파 시누클레인-항체-혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈 접합체의 급성 말초 주사시 알파-시누클레인 돌연변이 A30P 트랜스제닉 마우스에서 뇌 알파-시누클레인 병리, 맥관구조 및 실질조직의 표지.
도 12: 파킨슨병 환자의 뇌 절편의 면역조직화학적으로 분석된 동결절편의 공초점 현미경검사 분석(모든 상에 대해 동일한 환경): (A) 항체 0017, (B) 항체 0018, (C) 12F4 기준 항체.
도 13: 항체 0018의 셀루스팟스(CelluSpots)(상표) 에피토프 지도화.
도 14: 항체 0018에의 단량체성(N-말단 자유(1) 및 N-말단 His-태그된(2)) 및 이량체성(3) 알파-시누클레인의 결합. 도시된 결과는 5개 농도의 적정이다. 1: 단량체, 자유 N-말단, 4.2 ㎎/㎖, 결코 해동되지 않음; 2: 단량체, His-태그된 N-말단, 4.8 ㎎/㎖; 3. 이량체, 자유 N-말단, 1.6 ㎎/㎖.
I. 정의
본 발명의 목적을 위한 "수용체 인간 프레임워크"는 하기에 정의되는 바와 같은, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로 부터 유래된" 수용체 인간 프레임워크는 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 일부 실시태양에서, 상기 VL 수용체 인간 프레임워크는 상기 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서일이 일치한다.
"친화성"은 분자(예를 들어 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 상대(예를 들어 항원)간의 비-공유성 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본 발명에 사용되는 바와 같이 "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원들(예를 들어 항원 및 항체)간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화성을 지칭한다. 분자 X의 그의 상대 Y에 대한 친화성을 일반적으로는 해리 상수(Kd)에 의해 나타낼 수 있다. 친화성을 당해 분야에 공지된 통상적인 방법, 예를 들어 본 발명에 개시된 방법들에 의해 측정할 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 구체적인 예시적이고 전형적인 실시태양들을 하기에 개시한다.
"친화성 성숙된" 항체는 하나 이상의 고가변 영역(HVR) 중에 하나 이상의 변경을 갖지 않는 모 항체에 비해, 상기 변경을 갖는 항체를 지칭하며, 상기와 같은 변경은 항원에 대한 항체의 친화성을 개선시킨다.
"항-인간 알파-시누클레인 항체" 및 "인간 항-시누클레인에 결합하는 항체"란 용어는 상기 항체가 인간 알파-시누클레인을 표적화하는 진단제 및/또는 치료제로서 유용하기에 충분한 친화성으로 인간 알파-시누클레인에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 관련되지 않은 비-인간 알파-시누클레인 단백질에의 항-인간 알파-시누클레인 항체의 결합 정도는 예를 들어 방사성면역분석(RIA)에 의해 측정시 인간 알파-시누클레인에 대한 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이다.
본 발명에서 "항체"란 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며 다양한 항체 구조물들, 예를 들어 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들어 이중특이성 항체), 및 항체 단편(목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한)을 포함한다.
"항체 단편"은 완전 항체가 결합하는 항원에 결합하는 상기 완전 항체의 일부를 포함하는 상기 완전 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어 scFv); 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중특이성 항체를 포함한다.
기준 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 항원상의 상기 기준 항체와 동일한 잔기와 결합 상호작용을 갖는 항체를 지칭한다. 상기 결합 상호작용을 상기 항체-항원 복합체의 표면 플라스몬 공명 및 돌연변이된 항원 또는 X-선 구조 분석을 사용하여 측정할 수 있다.
"키메릭" 항체란 용어는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 출처 또는 종으로부터 유래하는 반면 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 출처 또는 종으로부터 유래하는 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 상기 항체의 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5개의 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 다수는 하위부류(아이소타입)들, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 세분될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류들에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 칭한다.
"효과기 기능"은 항체의 Fc-영역에 기인할 수 있는 생물 활성들을 지칭하며, 상기 활성들은 상기 항체 부류에 따라 변한다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
작용제, 예를 들어 약학 제형의 "유효량"은 목적하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 성취하기에 필요한 투여량에서 및 상기에 필요한 기간 동안 상기 성취에 유효한 양을 지칭한다.
본 발명에서 "Fc-영역"이란 용어는 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 한정하는데 사용된다. 상기 용어는 고유 서열 Fc-영역 및 변형 Fc-영역을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 상기 중쇄의 카복시-말단까지 연장된다. 그러나, 상기 Fc-영역의 C-말단 리신(Lys447) 및 때때로 C-말단 리신-글리신 다이펩타이드(Gly446Lys447)는 존재할 수도, 존재하지 않을 수도 있다. 본 발명에서 달리 명시되지 않는 한, 상기 Fc-영역 또는 불변 영역 중 아미노산 잔기들의 넘버링은 문헌[Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242]에 개시된 바와 같은 EU 넘버링 시스템(또한 EU 표시라 칭함)에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 고가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 상응하게, 상기 HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기의 순서로 존재한다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"전장 항체", "완전 항체" 및 "전체 항체"란 용어들은 본 발명에서 본 발명에 정의된 바와 같은 Fc-영역을 함유하는 중쇄를 갖거나 또는 고유 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하는데 호환적으로 사용된다.
"숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"이란 용어는 호환적으로 사용되며 상기와 같은 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이들은 계대의 수와 상관 없이 1차 형질전환된 세포 및 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일할 필요는 없으며, 돌연변이를 함유할 수도 있다. 원래 형질전환된 세포에 대해 선별되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손은 본 발명에 포함된다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시 가장 통상적으로 존재하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위그룹으로부터이다. 일반적으로, 상기 서열의 하위그룹은 문헌[Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3]에서와 같은 하위그룹이다. 하나의 실시태양에서, VL의 경우, 상기 하위 그룹은 상기 문헌[Kabat et al.,]에서와 같은 하위그룹 카파 I이다. 하나의 실시태양에서, VH의 경우, 상기 하위 그룹은 상기 문헌[Kabat et al.,]에서와 같은 하위그룹 III이다.
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메릭 항체를 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기에서 상기 HVR(예를 들어 CDR)의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 항체의 것들에 상응하며, 상기 FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화된 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "고가변 영역" 또는 "HVR"이란 용어는 서열이 고가변성이고("상보성 결정 영역" 또는 "CDR") 구조적으로 한정된 고리("고가변 고리)를 형성하고/하거나, 항원-접촉 잔기("항원 접촉부")를 함유하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역들을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH 중 3개(H1, H2, H3) 및 VL 중 3개(L1, L2, L3)를 포함한다.
본 발명에서 HVR은
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에 존재하는 고가변 고리들(문헌[Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917]);
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3)에 존재하는 CDR(문헌[Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242]);
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3)에 존재하는 항원 접촉부(문헌[MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)]); 및
(d) (a), (b) 및/또는 (c)의 조합, 예를 들어 HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3).
달리 명시되지 않는 한, 가변 도메인 중의 HVR 잔기 및 다른 잔기(예를 들어 FR 잔기)를 본 발명에서 상기 카밧(Kabat) 등에 따라 넘버링한다.
"면역접합체"는 하나 이상의 이종 분자(들), 예를 들어 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈에 접합된 항체이다.
"개인" 또는 "피실험자"는 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로 가축(예를 들어 소, 양, 개, 고양이 및 말), 영장류(예를 들어 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 개인 또는 피실험자는 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시태양에서, 항체를 예를 들어 전기영동(예를 들어 SDS-PAGE, 등전점 전기영동(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되는 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제시킨다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 리뷰를 위해서, 예를 들어 문헌[Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848(2007) 79-87]을 참조하시오.
"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은, 통상적으로 핵산 분자를 함유하지만 상기 핵산 분자가 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재하는 세포 중에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
"항-인간 알파-시누클레인 항체를 암호화하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자(또는 그의 단편), 예를 들어 단일 벡터 또는 별도의 벡터 중의 상기와 같은 핵산 분자(들)를 지칭하며, 상기와 같은 핵산 분자(들)는 숙주 세포 중의 하나 이상의 위치에 존재한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "단클론 항체"란 용어는 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 획득되는 항체를 지칭한다, 즉 상기 집단을 포함하는 개별적인 항체들은 동일하고/하거나, 상기 단클론 항체의 생성 중 발생할 수 있는 가능한 변이체 항체(상기와 같은 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다)를 제외하고 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 상기 항원상의 단일 결정인자에 대한 것이다. 따라서, "단클론"이라는 수식어구는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 획득된다는 항체의 특징을 가리키며, 임의의 특정한 방법에 의한 상기 항체의 생성을 요구하는 것으로서 해석해서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체를 다양한 기법들, 예를 들어 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 상기 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 부분을 함유하는 트랜스제닉 동물을 사용하는 방법에 의해 제조할 수 있으며, 상기와 같은 방법 및 단클론 항체의 다른 예시적인 제조 방법들은 본 발명에 개시되어 있다.
"고유 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어 고유 IgG 항체는 다이설파이드-결합되는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N-에서부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 영역(VH)(또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라 칭한다)에 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-에서부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 영역(VL)(또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라 칭한다)에 이어서 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄를 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 근거로, 카파(κ) 및 람다(λ)라 칭하는 2가지 유형 중 하나로 지정할 수 있다.
"패키지 삽입물"이란 용어는 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 용량, 투여, 복합 요법, 금기 및/또는 경고에 관한 정보를 함유하는 상기 치료 제품의 상업적인 패키지 중에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하는데 사용된다.
기준 폴리펩타이드 서열에 관한 "아미노산 서열 일치성 퍼센트(%)"는, 필요한 경우 최대의 서열 일치성 퍼센트를 성취하기 위해서, 및 상기 서열 일치성의 부분으로서 어떠한 보존적인 치환도 고려하지 않고, 서열과 도입 틈을 정렬시킨 후에, 기준 폴리펩타이드 서열 중의 아미노산 잔기들과 일치하는 후보 서열 중의 아미노산 잔기들의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 일치성 퍼센트를 측정하기 위한 정렬은 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식들로, 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALGN 또는 메그얼라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 성취될 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 서열들을 정렬시키기에 적합한 매개변수들, 예를 들어 비교하는 서열들의 전체길이에 대해 최대의 정렬을 성취하기 위해 필요한 임의의 연산을 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해서, 아미노산 서열 일치성%를 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성시킨다. 상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 저술되었으며, 소스 암호는 미국 저작권 관청(미국 워싱톤 D.C. 20559 소재)에 사용자 문서와 함께 제출되었다(이때 상기 코드는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다). 상기 ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공개적으로 입수할 수 있거나, 또는 상기 소스 암호로부터 편집될 수 있다. 상기 ALIGN-2 프로그램을, 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여, UNIX 실행 시스템상에서 사용하기 위해 편집해야 한다. 모든 서열 비교 매개변수들은 상기 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다.
ALIGN-2를 아미노산 서열 비교를 위해 사용하는 경우에, 주어진 아미노산 서열 A의 주어진 아미노산 서열 B에의, 상기 B와의, 또는 상기 B에 대한 아미노산 서열 일치성%(이는 한편으로 주어진 아미노산 서열 B에, 상기 B와, 또는 상기 B에 대해 일정한 아미노산 서열 일치성%를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)를 하기와 같이 계산한다:
100 x X/Y 분수
상기에서, X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2의 정렬에서 상기 프로그램에 의해 일치성 합치로서 채점되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 중 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 아미노산 서열 일치성%는 B 대 A의 아미노산 서열 일치성%와 동일하지 않음을 알 것이다. 달리 구체적으로 서술되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 아미노산 서열 일치성% 값들은 상기 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞의 단락에 개시된 바와 같이 획득된다.
"약학 제형"이란 용어는 제형 중에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태로 존재하고 상기 제형이 투여되는 환자에게 허용 가능하지 않게 독성인 추가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용 가능한 담체"는 환자에게 무독성인, 활성 성분 이외의 약학 제형 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 비제한적으로 완충제, 부형제, 안정제, 또는 보존제를 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "인간 알파-시누클레인"이란 용어는 고유의 인간 알파-시누클레인(UniProt P37840)을 지칭한다. 상기 용어는 "전장", 가공되지 않은 인간 알파-시누클레인뿐만 아니라 세포에서 가공으로부터 생성되는 임의의 형태의 인간 알파-시누클레인을 포함한다. 상기 용어는 또한 인간 알파-시누클레인의 천연 변이체, 예를 들어 돌연변이체, 이어맞추기 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 상기 인간 알파-시누클레인의 아미노산 서열을 서열번호 40에 나타낸다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "치료"(및 "치료하다" 및 "치료하는"과 같은 그의 문법상 어미변화)는 치료 중인 개인의 자연적인 과정을 변경시키고자 하는 임상적 중재를 지칭하며, 예방을 위해서 또는 임상적 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로 질병의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질병의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질병 진행속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체를 사용하여 질병의 발생을 지연시키거나 또는 질병의 진행을 늦춘다.
"가변 영역" 또는 "가변 도메인"이란 용어는 항원에 대한 항체의 결합과 관련된 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 고유 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조들을 가지며, 이때 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 고가변 영역(HVR)을 포함한다(예를 들어 문헌[Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91]을 참조하시오). 단일의 VH 또는 VL 도메인이면 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱 또한, 특정 항원에 결합하는 항체를, 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별하기 위해 상기 항원에 결합하는 상기 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리시킬 수 있다(예를 들어 문헌[Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887]; 문헌[Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628]을 참조하시오).
본 발명에 사용된 바와 같은 "벡터"란 용어는 결합된 또 다른 핵산을 전파할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조물로서 벡터뿐만 아니라 상기 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈내에 통합된 벡터를 포함한다. 몇몇 벡터는 상기 벡터가 작동적으로 연결되는 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 상기와 같은 벡터를 본 발명에서 "발현 벡터"라 칭한다.
II. 조성물 및 방법
하나의 태양에서, 본 발명은 부분적으로, 본 발명에 보고된 바와 같은 항체를 뇌의 신경 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 독성을 감소/제거하기 위해 사용할 수 있다는 발견을 기본으로 한다. 몇몇 태양에서, 인간 알파-시누클레인에 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 예를 들어 시누클레인병증 및 신경병증, 특히 파킨슨병 및 파킨슨병을 동시에 앓고 있는 알쯔하이머병의 진단 또는 치료에 유용하다.
A. 예시적인 항-인간 알파-시누클레인 항체
본 발명에 보고된 바와 같은 항체를, 신중한 면역화 방법 및 특이적인 결합 성질을 갖는 항체의 목적성 선택을 적용함으로써 획득하였다.
먼저 토끼를 재조합 알파-시누클레인의 다양한 조립체 및 응집체의 혼합물로 면역시켰다. 단리된 B-세포 클론을 ELISA에 의해 특성화시키고 가장 좋은 결합제를 선택하였다. 다음 단계에서 상기 항체를, 펩타이드 배열 방법을 사용하여 에피토프 지도화하고 예를 들어 웨스턴 블럿을 사용하여 단량체성 및 올리고머성 재조합 알파-시누클레인에 대한 그의 선택성을 측정함으로써 특성화하였다. 또한 상기 항체의 인간 신경 세포 중의 재조합 알파-시누클레인 및 생리학적 알파-시누클레인 및 인간 알파-시누클레인 트랜스제닉 마우스 및 파킨슨병 환자의 뇌 절편 중의 병리학적 알파-시누클레인에의 결합을 측정하였다. 이전에 개략된 데이터를 근거로 후보를 선택하고, 말초 주사 후 병적인 알파-시누클레인에의 급성 생체내 결합을 측정하였다. 그 후에 가장 효율적인 결합제를 선택하였다. 상기 선택된 가장 효율적인 결합제에 의해 Thy1-(A30P)aSYN 트랜스제닉 마우스에서의 알파-시누클레인 병리의 제거 및/또는 알파-시누클레인 병리 진행의 정지를 측정할 것이다.
한 가지 바람직한 항체는 항체 0017이다. 상기 항체는 넓은 알파-시누클레인 특이성 결합 프로파일을 갖는다, 즉 상기 항체는 단량체성 및 응집된(올리고머성) 인간 알파-시누클레인에 결합한다. 도 1에서 인간 알파-시누클레인의 단량체성 및 다수의 응집된 형태에 대한 항체 0017의 농도 의존적인 결합을 도시한다. 상기 항체 0017은 이전에 개략된 바와 같은 과정에 의해 선택된 토끼 항체 233의 가변 도메인 및 쥐 불변 영역을 갖는 키메릭 항체이다.
또 다른 바람직한 항체는 항체 0018이다. 상기 항체는 알파-시누클레인 응집 의존성 결합 프로파일을 갖는다, 즉 상기 항체는 단량체성, 이량체성 및 올리고머성 인간 알파-시누클레인에 결합하며, 이때 상기 N-말단 메티오닌 잔기가 예를 들어 아세틸화 또는 비오틴화에 의해 변형되는 경우 단량체성 인간 및 마우스 알파-시누클레인에 대한 결합이 감소하거나 또는 존재하지 않는다. 도 2에서 상이하게 응집된 형태의 인간 알파-시누클레인에 대한 항체 0018의 농도 의존성 결합을 도시한다. 상기 올리고머 결합 특성은 0.5 ㎍/㎖ 이하의 항체 농도에서 명백해진다. 상기 항체 0018은 이전에 개략된 바와 같은 과정에 의해 선택된 토끼 항체 064의 가변 도메인 및 쥐 불변 영역을 갖는 키메릭 항체이다.
인간 알파-시누클레인상의 항체 0018의 결합 부위의 측정을 위해 N-말단 변형된 펩타이드를 사용하는 경우 결합을 검출할 수 없었다. 따라서 항체 0018의 에피토프 분석을, α-시누클레인(1-140), β-시누클레인(60-134), γ-시누클레인(60-127) 및 N-아세틸화된 α-시누클레인 펩타이드(1-15)의 서열들에 상응하는 중복되는, 고정화된 펩타이드 단편의 라이브러리(길이: 15 아미노산, 이동: 1 아미노산)에 의해서, 및 ELISA-기재 검출 방법을 사용하여 수행하였다(실시예 14 및 도 13을 참조하시오).
항체 0018은 상기 펩타이드 배열상에 존재하는 짧은(15 아미노산 길이) 단량체성 알파-시누클레인 펩타이드에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 항체 0018은 가장 끝에 있는 알파-시누클레인의 N-말단에서 에피토프를 인식한다. 상기 N-말단 아미노산 메티오닌(M, MET)은, 그의 제거(또는 차단)가 항체 0018 결합을 완전히 없애기 때문에, 결합에 필수적이다. 더욱이 상기 N-말단 메티오닌 아미노산 잔기가 N-아세틸화에 의해 캡핑되는 경우 결합을 관찰할 수 없다. 이는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 확인된다(도 14를 참조하시오).
또 다른 바람직한 항체는 항체 0081이다. 상기 항-알파 시누클레인-항체 0081은 블럿상의 모든 형태의 알파-시누클레인의 면역반응성의 동등한 감소와 함께 항체 0018의 용량-의존적인 반응성 패턴 회상을 나타낸다(도 3).
도 4에서 알파-시누클레인 돌연변이 A30P 트랜스제닉 마우스의 시상 뇌 절편에서의 항체 0017 및 0018 및 기준 항체 12F4의 상이한 염색 양상을 도시한다.
도 5에서 파킨슨병 환자(A), 파킨슨병을 동시에 앓고 있는 알쯔하이머병 환자(B) 및 진행성 핵상마비(C)의 인간 뇌피질에서의 항체 0017 및 0018의 상이한 염색 양상을 도시한다. 항체 0017의 적용은 루이소체 및 루이 신경돌기 염색뿐만 아니라 확산성 실질조직을 생성시켰다. 항체 0018은 보다 약한 실질조직 염색을 나타내며 대개는 루이소체 및 루이 신경돌기를 염색한다. 따라서, 항체 0017 및 0018은 파킨슨병 환자의 뇌 절편에서 알파-시누클레인 응집체에 대해 상이한 염색 패턴을 나타낸다.
도 6에서 특이성 mAb의 급성 말초 주사시의 알파-시누클레인 돌연변이 A30P 트랜스제닉 마우스에서 대뇌 알파-시누클레인 병리의 표지를 도시한다. 항-알파 시누클레인 항체(5일 동안 2 x 60 ㎎/㎏) 또는 PBS를 15개월 된 알파-시누클레인 돌연변이 A30P 트랜스제닉 마우스에 적용하였다. 신선한 동결된 20 ㎛ 시상 뇌 절편을 항-쥐 IgG1-항체-AF555 접합체 또는 각각의 항-알파-시누클레인 항체 및 항-쥐 IgG1-항체-AF555 접합체로 염색하였다.
도 7로부터 항체 0017 및 0018이 세포외 배지로부터 알파-시누클레인 올리고머를 면역고갈시킬 수 있고 이에 의해 상기 항체가 알파-시누클레인 올리고머의 독성을 감소시킴을 알 수 있다.
하나의 태양에서, 본 발명은 인간 알파-시누클레인에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 항-인간 알파-시누클레인 항체는
·서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 결합하고 단량체성 알파-시누클레인에는 결합하지만 섬유성 알파-시누클레인에는 결합하지 않거나, 또는
서열번호 26 및 27 또는 서열번호 38 및 39의 한 쌍의 가변 도메인을 갖는 항체와 동일한 에피토프에 결합하고 섬유성 알파-시누클레인에는 결합하지만 단량체성 알파-시누클레인에는 결합하지 않으며,
·뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 독성을 억제하고,
·알파-시누클레인 응집의 세포-세포 전달을 억제하고,
·알파-시누클레인 유도된 카스파제 활성(예를 들어 LUHMES 세포에서)을 감소시킨다.
하나의 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 적어도 하나, 또는 둘, 또는 셋, 또는 넷, 또는 다섯, 또는 여섯개의 HVR을 포함하는 항-인간 알파-시누클레인 항체를 제공한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 적어도 하나, 또는 둘, 또는 셋, 또는 넷, 또는 다섯, 또는 여섯개의 HVR을 포함하는 항-인간 알파-시누클레인 항체를 제공한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 적어도 하나, 또는 둘, 또는 셋, 또는 넷, 또는 다섯, 또는 여섯개의 HVR을 포함하는 항-인간 알파-시누클레인 항체를 제공한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 적어도 하나, 또는 둘, 또는 셋, 또는 넷, 또는 다섯, 또는 여섯개의 HVR을 포함하는 항-인간 알파-시누클레인 항체를 제공한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 적어도 하나, 또는 둘, 또는 셋, 또는 넷, 또는 다섯, 또는 여섯개의 HVR을 포함하는 항-인간 알파-시누클레인 항체를 제공한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 중에서 선택된 적어도 하나, 또는 둘, 또는 셋, 또는 넷, 또는 다섯, 또는 여섯개의 HVR을 포함하는 항-인간 알파-시누클레인 항체를 제공한다.
하나의 태양에서, 본 발명은
i) (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 및
ii) (a) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 및
iii) (a) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 및
iv) (a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 및
v) (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 및
vi) (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
중에서 선택된 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 셋 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 상기 항체는
i) (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 또는
ii) (a) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 또는
iii) (a) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 또는
iv) (a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 또는
v) (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 또는
vi) (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 항체는
i) (a) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
ii) (a) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
iii) (a) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
iv) (a) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
v) (a) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
vi) (a) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
중에서 선택된 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 셋 모두의 VL HVR을 추가로 포함한다.
추가의 실시태양에서, 상기 항체는
i) (a) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
ii) (a) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
iii) (a) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
iv) (a) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
v) (a) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
vi) (a) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함한다.
하나의 태양에서, 본 발명은
i) (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는
ii) (a) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는
iii) (a) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는
iv) (a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는
v) (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는
vi) (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 항체를 제공한다.
상기 실시태양들 중 어느 하나에서, 상기 항-알파 시누클레인 항체는 인간화된다. 하나의 실시태양에서, 항-인간 알파-시누클레인 항체는 상기 실시태양들 중 어느 하나에서와 같은 HVR을 포함하며, 수용체 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 추가로 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 VH 또는 VL은 기준 서열에 대한 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-인간 알파-시누클레인 항체는 인간 알파-시누클레인에 결합하는 능력은 유지한다.
몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 3개의 아미노산이 이전에 본 발명에 개시된 바와 같이 각각의 HVR 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명에 제공된 항-인간 알파-시누클레인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
예를 들어, 몇몇 실시태양에서,
a) 서열번호 13의 VH 서열 및 서열번호 14의 VL 서열, 또는
b) 서열번호 26의 VH 서열 및 서열번호 27의 VL 서열, 또는
c) 서열번호 38의 VH 서열 및 서열번호 39의 VL 서열
을 포함하는 항-인간 알파-시누클레인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
몇몇 실시태양에서, 서열번호 40의 아미노산 101 내지 111로 이루어지는 인간 알파-시누클레인의 단편내의 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
몇몇 실시태양에서, 서열번호 40의 아미노산 1 내지 15로 이루어지는 인간 알파-시누클레인의 단편내의 자유 N-말단 에피토프(자유 N-말단 메티오닌 잔기)에 결합하는 항체를 제공한다.
하나의 실시태양에서 인간 알파-시누클레인의 잔기 1 내지 15 및 188 내지 195내의 입체구조 에피토프에 결합하는 자유 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는 인간 알파-시누클레인에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 추가의 태양에서, 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 항-인간 알파-시누클레인 항체는 키메릭, 인간화된 또는 인간 항체를 포함한 단클론 항체이다. 하나의 실시태양에서, 항-인간 알파-시누클레인 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 다이아바디, 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 전장 항체, 예를 들어 완전한 IgG1 또는 IgG4 항체 또는 본 발명에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 아이소타입이다.
추가의 태양에서, 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 항-인간 알파-시누클레인 항체는 하기 섹션 1 내지 7에 개시된 바와 같은 특징들 중 어느 하나를 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다:
1. 항체 친화성
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체는 ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, 또는 1 nM 내지 100 nM(예를 들어 10-7 M 이하, 예를 들어 10-7 M 내지 10-9 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
하나의 실시태양에서, Kd를 방사성 표지된 항원 결합 분석(RIA)에 의해 측정한다. 하나의 실시태양에서 RIA를 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원으로 수행한다. 예를 들어 항원에 대한 FAB의 용액 결합 친화성을, 표지되지 않은 항원의 적정 시리즈의 존재하에서 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시키고, 이어서 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정한다(예를 들어 문헌[Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293(1999) 865-881]을 참조하시오). 상기 분석에 대한 조건들을 확립시키기 위해서, 마이크로티터(MICROTITER)(등록상표) 다중-웰 플레이트(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 나트륨 카보네이트(pH 9.6) 중의 5 ㎍/㎖의 포획 항-Fab 항체(카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅하고, 후속으로 실온(대략 23 ℃)에서 2 내지 5시간 동안 PBS 중의 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 차단한다. 비-흡착성 플레이트(눙크(Nunc) #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM[125I]-항원을 관심 Fab의 일련의 희석물과 혼합한다(예를 들어 문헌[Presta, L.G. et al., Cancer Res. 57(1997) 4593-4599]에서 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치하게). 이어서 상기 관심 Fab를 밤새 배양한다; 그러나, 상기 배양을 평형에 도달하도록 보다 오랜 기간(예를 들어 약 65 시간) 동안 계속할 수도 있다. 그 후에, 상기 혼합물을 실온에서(예를 들어 1시간 동안) 배양을 위해 포획 플레이트로 옮긴다. 이어서 상기 용액을 제거하고 상기 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리솔베이트 20(트윈-20(등록상표))으로 8회 세척한다. 상기 플레이트가 건조되었을 때, 150 ㎕/웰의 섬광제(마이크로신트(MICROSCINT)-20(상표); 패카드(Packard))를 가하고, 상기 플레이트를 10분 동안 탑카운트(TOPCOUNT)(상표) 감마 카운터(패카드)상에서 카운트한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 경쟁 결합 분석에 사용하기 위해 선택한다.
또 다른 실시태양에 따라, Kd를 비아코어(BIACORE)(등록상표) 표면 플라스몬 공명 분석을 사용하여 측정한다. 예를 들어, 비아코어(등록상표)-2000 또는 비아코어(등록상표)-3000(비아코어(BIAcore) 인코포레이티드, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 사용하는 분석을 25 ℃에서 고정화된 항원 CM5 칩과 함께 약 10 응답 단위(RU)로 수행한다. 하나의 실시태양에서, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 비아코어 인코포레이티드)을 공급자의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 4.8)로 5 ㎍/㎖(약 0.2 μM)로 희석한 후에 5 ㎕/분의 유량으로 주입하여 대략 10 응답 단위(RU)의 결합된 단백질을 성취한다. 상기 항원의 주입에 이어서, 1 M 에탄올아민을 주입하여 반응되지 않은 그룹들을 차단한다. 동역학적 측정을 위해서, Fab의 2배 연속 희석물(0.78 nM 내지 500 nM)을 25 ℃에서 대략 25 ㎕/분의 유량으로 0.05% 폴리솔베이트 20(트윈-20(상표)) 계면활성제(PBST)와 함께 PBS 중에서 주입한다. 결합율(kon) 및 해리율(koff)을 결합 및 해리 센서그램을 동시에 정합시킴으로써 간단한 1 대 1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(비아코어(등록상표) 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수(Kd)를 koff/kon 비로서 계산한다(예를 들어 문헌[Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293(1999) 865-881]을 참조하시오). 상기 온-율이 상기 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 106 M-1s-1을 초과하는 경우, 상기 온-율을 분광계, 예를 들어 스탑-플로우(stop-flow) 구비된 분광광도계(아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments) 또는 교반식 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-AMINCO(상표) 분광광도계(써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정되는 바와 같이 증가하는 농도의 항원의 존재하에서 25 ℃에서 PBS(pH 7.2) 중의 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 형광 방출 강도(여기 = 295 ㎚; 방출 = 340 ㎚, 16 ㎚ 통과 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기법을 사용하여 측정할 수 있다.
2. 항체 단편
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 비제한적으로 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편, 및 하기에 개시되는 다른 단편들을 포함한다. 몇몇 항체 단편의 리뷰를 위해서, 문헌[Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134]을 참조하시오. scFv 단편의 리뷰를 위해서 예를 들어 문헌[Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315]; 또한 WO 93/16185; 미국특허 제 5,571,894 호 및 미국특허 제 5,587,458 호를 참조하시오. 구조 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의에 대해서, 미국특허 제 5,869,046 호를 참조하시오.
다이아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어 EP 0 404 097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134]; 및 문헌[Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448]을 참조하시오. 트라이아바디 및 테트라바디가 또한 문헌[Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134)]에 개시되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부 또는 경쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 단편이다. 몇몇 실시태양에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(문헌[Domantis, Inc., Waltham, MA]; 예를 들어 미국특허 제 6,248,516 호를 참조하시오).
항체 단편을 본 발명에 개시된 바와 같은 다양한 기법들, 예를 들어 비제한적으로 완전 항체의 단백질분해 절단뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예를 들어 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 파지)에 의한 생산에 의해 제조할 수 있다.
3. 키메릭 및 인간화된 항체
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체는 키메릭 항체이다. 몇몇 키메릭 항체들이 예를 들어 미국특허 제 4,816,567 호; 및 문헌[Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855)]에 개시되어 있다. 일례로, 키메릭 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메릭 항체는 상기 부류 또는 하위 부류가 모 항체의 부류 또는 하위 부류로부터 변화된 "부류 변환된(switched)" 항체이다. 키메릭 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 키메릭 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화성은 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR, 예를 들어 CDR(또는 그의 부분들)이 비-인간 항체로부터 유래되고 FR(또는 그의 부분들)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 일부 실시태양에서, 인간화된 항체 중의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화성을 복원하거나 개선시키기 위해서 비-인간 항체(예를 들어 HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화된 항체 및 그의 제조 방법들이 예를 들어 문헌[Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633]에 리뷰되어 있으며, 예를 들어 문헌[Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329]; 문헌[Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]; 미국특허 제 5,821,337 호, 미국특허 제 7,527,791 호, 미국특허 제 6,982,321 호 및 미국특허 제 7,087,409 호; 문헌[Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34](특이성 결정 영역(SDR) 이식을 개시함); 문헌[Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498]("재표면화"를 개시함); 문헌[Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60]("FR 셔플링"을 개시함); 및 문헌[Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68] 및 문헌[Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260](FR 셔플링으로의 "유도된 선택" 접근을 개시함)에 추가로 개시되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 비제한적으로 "최적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308]을 참조하시오); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289]; 및 문헌[Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632]을 참조하시오); 인간 성숙(체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식세포계열 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633]을 참조하시오); 및 FR 라이브러리 선별로부터 유도된 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684] 및 문헌[Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618)]을 참조하시오)을 포함한다.
4. 인간 항체
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 기법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 인간 항체는 문헌[van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374] 및 문헌[Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459]에 일반적으로 개시되어 있다.
인간 항체를, 항원 공격에 응답하여 완전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 완전 항체를 생성하도록 변형시킨 트랜스제닉 동물에게 투여함으로써 제조할 수 있다. 상기와 같은 동물은 전형적으로는 인간 면역글로불린 유전자좌의 일부 또는 전부를 함유하며, 상기 자리는 내인성 면역글로불린 유전자좌로 대체되거나 또는 염색체외에 존재하거나 또는 상기 동물의 염색체내로 무작위로 삽입된다. 상기와 같은 트랜스제닉 마우스에서, 상기 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법의 리뷰에 대해서, 문헌[Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125]을 참조하시오. 또한 예를 들어 제노마우스(XENOMOUSE)(상표) 기술을 개시하는 미국특허 제 6,075,181 호 및 미국특허 제 6,150,584 호; 휴맵(HUMAB)(등록상표) 기술을 개시하는 미국특허 제 5,770,429 호; 케이엠 마우스(K-M MOUSE)(등록상표) 기술을 개시하는 미국특허 제 7,041,870 호; 및 벨로시마우스(VELOCIMOUSE)(등록상표) 기술을 개시하는 US 2007/0061900을 참조하시오. 상기와 같은 동물들로부터 생성된 완전 항체로부터의 인간 가변 영역들을 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과의 조합에 의해 추가로 변형시킬 수도 있다.
인간 항체를 또한 하이브리도마-기재 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 단클론 항체의 생성을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 개시되었다(예를 들어 문헌[Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005]; 문헌[Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63]; 및 문헌[Boerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95]을 참조하시오). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 또한 문헌[Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562]에 개시되어 있다. 추가의 방법은 예를 들어 미국특허 제 7,189,826 호(하이브리도마 세포주로부터 단클론 인간 IgM 항체의 생성을 개시한다) 및 문헌[Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268](인간-인간 하이브리도마를 개시한다)에 개시된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트라이오마(Trioma) 기술)이 또한 문헌[Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937] 및 문헌[Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191]에 개시되어 있다.
인간 항체를 또한, 인간-유래된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성시킬 수 있다. 이어서 상기와 같은 가변 도메인 서열을 목적하는 인간 불변 도메인과 병용할 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기법을 하기에 개시한다.
5. 라이브러리-유래된 항체
본 발명의 항체를 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 선별함으로써 단리할 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성시키고 상기와 같은 라이브러리를 목적하는 결합 특성을 갖는 항체들에 대해 선별하는 다양한 방법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기와 같은 방법들은 예를 들어 문헌[Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37]에 리뷰되어 있으며 예를 들어 문헌[McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554]; 문헌[Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628]; 문헌[Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597]; 문헌[Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175]; 문헌[Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310]; 문헌[Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093]; 문헌[Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472]; 및 문헌[Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132]에 추가로 개시되어 있다.
몇몇 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리를 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝하고 파지 라이브러리에 무작위로 재조합시키고, 이어서 상기 라이브러리를 문헌[Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455]에 개시된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 선별할 수 있다. 파지는 전형적으로 단쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 표시한다. 면역된 출처로부터의 라이브러리들은 하이브리도마 제작의 필요 없이 면역원에 대한 고-친화성 항체를 제공한다. 한편으로, 미경험 레퍼토리를 문헌[Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734]에 개시된 바와 같이 클로닝하여(예를 들어 인간으로부터) 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기-항원에 대한 단일 출처의 항체를 제공할 수 있다. 최종적으로, 미경험 라이브러리를 또한, 줄기세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도로 가변성인 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내에서 재배열을 수행함으로써 합성적으로 제조할 수 있다(문헌[Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388]에 개시되어 있다). 인간 항체 파지 라이브러리를 개시하는 특허 공보들은 예를 들어 미국특허 제 5,750,373 호, 및 US　2005/0079574, US　2005/0119455, US　2005/0266000, US　2007/0117126, US　2007/0160598, US　2007/0237764, US　2007/0292936, 및 US　2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본 발명에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
6. 다중특이성 항체
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체는 다중특이성 항체, 예를 들어 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 단클론 항체이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 결합 특이성 중 하나는 인간 알파-시누클레인에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 몇몇 실시태양에서, 이중특이성 항체는 인간 알파-시누클레인의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이성 항체를 또한 인간 알파-시누클레인을 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화시키기 위해 사용할 수 있다. 이중특이성 항체를 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조할 수 있다.
다중특이성 항체의 제조 기법은 비제한적으로 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현(문헌[Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540], WO 93/08829, 및 문헌[Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659]을 참조하시오), 및 "놉-인투-홀"(knob-into-hole) 공학(예를 들어 미국특허 제 5,731,168 호를 참조하시오)을 포함한다. 다중특이성 항체를 또한, 항체 Fc-이종이량체성 분자의 제조를 위해 정전기적 조향(steering) 효과를 조작하고(WO 2009/089004); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합시키고(예를 들어 미국특허 제 4,676,980 호, 및 문헌[Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83]을 참조하시오); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이성 항체를 생성시키고(예를 들어 문헌[Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553]을 참조하시오); 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 "다이아바디" 기술을 사용하고(예를 들어 문헌[Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448]을 참조하시오); 단쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하고(예를 들어 문헌[Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374]을 참조하시오); 예를 들어 문헌[Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69]에 개시된 바와 같이 삼중특이성 항체를 제조함으로써 제조할 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본 발명에 포함된다(예를 들어 US　2006/0025576을 참조하시오).
본 발명에서 항체 또는 단편은 또한 인간 알파-시누클레인뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 Fab" 또는 "DAF"를 포함한다(예를 들어 US 2008/0069820을 참조하시오).
본 발명에서 항체 또는 단편은 또한 WO　2009/080251, WO　2009/080252, WO　2009/080253, WO　2009/080254, WO　2010/112193, WO　2010/115589, WO　2010/136172, WO　2010/145792, 및 WO 2010/145793에 개시된 다중특이성 항체들을 포함한다.
7. 항체 변이체
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체를 고려한다. 예를 들어, 상기 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질들을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체를, 상기 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 적합한 변형을 도입시키거나, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기와 같은 변형은 예를 들어 상기 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기들의 결실, 및/또는 상기 서열내로의 잔기들의 삽입 및/또는 상기 서열내에서 잔기들의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 최종 구조물에 도달하도록 수행할 수 있으나, 단 최종 구조물은 목적하는 특성, 예를 들어 항원-결합성을 가져야 한다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체를 제공한다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환을 표 1에서 "바람직한 치환"의 제목하에 나타낸다. 보다 실질적인 변화를 표 1에 "예시적인 치환"의 제목하에, 및 하기에 추가로 개시하는 바와 같이 아미노산 측쇄 부류와 관련하여 제공한다. 아미노산 치환을 관심 항체에 도입시키고 생성물을 목적하는 활성, 예를 들어 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별할 수 있다.
원래 잔기 예시적인 치환 보존적 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
아미노산들을 공통 측쇄 성질에 따라 분류할 수도 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적인 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류에 대해 교환함을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 모 항체(예를 들어 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 고가변 영역 잔기를 치환시킴을 수반한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택되는 상기 생성되는 변이체(들)는 모 항체에 비해 몇몇 생물학적 성질들(예를 들어 증가된 친화성, 감소된 면역원성)의 변형(예를 들어 개선)을 갖고/갖거나, 상기 모 항체의 몇몇 생물학적 성질들을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화성 성숙된 항체이며, 상기 항체를 편의상, 예를 들어 파지 디스플레이-기재 친화성 성숙 기법, 예를 들어 본 발명에 개시된 것들을 사용하여 생성시킬 수 있다. 간단히, 하나 이상의 HVR 잔기를 돌연변이시키고 변이체 항체를 파지상에 표시하고 특정한 생물학적 활성(예를 들어 결합 친화성)에 대해 선별한다.
변경(예를 들어 치환)을, 예를 들어 항체 친화성을 개선시키기 위해 HVR에서 수행할 수 있다. 상기와 같은 변경을 HVR "핫스폿", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 암호화된 잔기(예를 들어 문헌[Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196]을 참조하시오), 및/또는 항원과 접촉하는 잔기에서 수행할 수 있으며, 이때 생성되는 변형 VH 또는 VL을 결합 친화성에 대해 시험한다. 2차 라이브러리로부터의 제작 및 재선택에 의한 친화성 성숙이 예를 들어 문헌[Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37]에 개시되었다. 친화성 성숙의 일부 실시태양에서, 다양한 방법들 중 임의의 방법(예를 들어 오류유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오타이드-지시된 돌연변이유발)에 의해 성숙화용으로 선택된 가변 유전자내에 다양성을 도입시킨다. 이어서 2차 라이브러리를 생성시킨다. 이어서 상기 라이브러리를 목적하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 선별한다. 다양성을 도입시키는 또 다른 방법은 HVR-지시된 접근법을 포함하며, 상기 접근법에서 다수의 HVR 잔기들(예를 들어 한 번에 4 내지 6개의 잔기)이 무작위화된다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기를 예를 들어 알라닌 주사 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 특이적으로 확인할 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3을 종종 표적화한다.
몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이, 상기와 같은 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어 본 발명에 제공되는 바와 같은 보존적 치환)를 HVR에서 수행할 수 있다. 상기와 같은 변경은 예를 들어 상기 HVR 중의 항원 접촉 잔기들의 밖에서 있을 수 있다. 상기에 제공된 변형 VH 및 VL 서열의 몇몇 실시태양에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법을 문헌[Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244(1989) 1081-1085]에 개시된 바와 같이 "알라닌 주사 돌연변이유발"이라 칭한다. 상기 방법에서, 표적 잔기들(예를 들어 하전된 잔기, 예를 들어 arg, asp, his, lys 및 glu)의 잔기 또는 그룹이 확인되며 이들을, 상기 항원과 항체와의 상호작용이 영향을 받는지를 측정하기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 치환시킨다. 추가의 치환을 상기 아미노산 위치들에 도입시켜 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증할 수 있다. 한편으로, 또는 추가로, 항체와 항원간의 접촉 지점들을 확인하기 위한 상기 항원-항체 복합체의 결정 구조. 상기와 같은 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기들을 치환용 후보로서 표적화하거나 제거할 수 있다. 변이체를, 상기 변이체가 목적하는 성질을 함유하는지를 측정하기 위해서 선별할 수도 있다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기에서부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드까지의 길이 범위에 이르는 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기들의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소(예를 들어 ADEPT를 위한) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드에의 항체의 N- 또는 C-말단에의 융합을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체를 상기 항체가 글리코실화되는 정도가 증가하거나 또는 감소하도록 변경시킨다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실을 편의상 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 수행할 수 있다.
상기 항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 상기에 부착된 탄수화물을 변경시킬 수도 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 고유 항체는 전형적으로 상기 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 일반적으로 부착되는 분지된, 이중촉각 올리고사카라이드를 포함한다(예를 들어 문헌[Wright, A. and Morrison, S.L., et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조하시오). 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물들, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코스아민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산뿐만 아니라 상기 이중촉각 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 중 GlcNAc에 부착된 퓨코스를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체에서 상기 올리고사카라이드의 변형을 몇몇 개선된 성질들을 갖는 항체 변이체를 생성시키기 위해 수행할 수도 있다.
하나의 실시태양에서, Fc 영역에 부착된(직접 또는 간접적으로) 퓨코스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체를 제공한다. 예를 들어, 상기와 같은 항체 중 퓨코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 상기 퓨코스의 양을, 예를 들어 WO 2008/077546에 개시된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 측정된 바와 같이 Asn297에 부착된 모든 당구조물들(예를 들어 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 구조물)의 합에 대해, Asn297에서 상기 당 쇄 중 퓨코스의 평균량을 계산함으로써 측정한다. Asn297은 상기 Fc 영역 중 대략 297번(Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라진 잔기를 지칭하나; Asn297은 또한 297번 위치의 상류 또는 하류 대략 ±3 아미노산에, 즉 항체 중 작은 서열 변동으로 인해 294 내지 300번 위치에 위치할 수도 있다. 상기와 같은 퓨코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어 US 2003/0157108; US 2004/0093621을 참조하시오. "탈퓨코실화된" 또는 "퓨코스-결핍된" 항체 변이체에 관한 발행물들의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; 문헌[Okazaki, A. et al . J. Mol . Biol. 336:1239-1249 (2004)]; 문헌[Yamane-Ohnuki, N. et al ., Biotech . Bioeng. 87: 614-622 (2004)]. 탈퓨코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 퓨코실화 결함 Lec13 CHO 세포(문헌[Ripka, J. et al . Arch . Biochem . Biophys . 249:533-545 (1986)]; US 2003/0157108; 및 WO　2004/056312(특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예를 들어 알파-1,6-퓨코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들어 문헌[Yamane-Ohnuki, N. et al . Biotech . Bioeng . 87: 614-622 (2004)]; 문헌[Kanda, Y. et al ., Biotechnol . Bioeng ., 94:680-688 (2006)]; 및 WO 2003/085107을 참조하시오)를 포함한다.
이등분된 올리고사카라이드, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이중촉각 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 항체 변이체를 추가로 제공한다. 상기와 같은 항체 변이체는 감소된 퓨코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체의 예는 예를 들어 WO 2003/011878; 미국특허 제 6,602,684 호; 및 US 2005/0123546에 개시되어 있다. 상기 Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 중에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체를 또한 제공한다. 상기와 같은 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 개시되어 있다.
c) Fc-영역 변이체
몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 변형을 본 발명에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입시켜 Fc 영역 변이체를 생성시킬 수 있다. 상기 Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 일부(전부는 아닌) 효과기 기능(이는 항체 변이체를, 생체내에서 항체의 반감기가 중요하지만 몇몇 효과기 기능(예를 들어 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 유해한 용도에 바람직한 후보로 만든다)을 갖는 항체 변이체를 고려한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어 Fc 수용체(FcR) 결합 분석을, 항체가 FcγR 결합은 없지만(따라서 ADCC 활성이 없는 듯하다) FcRn 결합 능력은 유지함을 확실히 하기 위해 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포, NK 세포는 Fc(RIII 만을 발현하는 반면, 단세포는 Fc RI, Fc RII 및 Fc RIII을 발현한다. 조혈세포상의 FcR 발현이 문헌[Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu . Rev . Immunol. 9:457-492 (1991)]의 464 페이지, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적인 예들이 미국특허 제 5,500,362 호(예를 들어 문헌[Hellstrom, I. et al . Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 83:7059-7063 (1986)]을 참조하시오) 및 문헌[Hellstrom, I et al ., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 82:1499-1502 (1985)]; 미국특허 제 5,821,337 호(문헌[Bruggemann, M. et al ., J. Exp. Med . 166:1351-1361 (1987)]을 참조하시오)에 개시되어 있다. 한편으로, 비-방사성 분석 방법을 사용할 수도 있다(예를 들어 유식 세포측정을 위한 ACTI(상표) 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 참조하시오). 상기와 같은 분석에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 관심 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들어 문헌[Clynes R., et al. Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수도 있다. C1q 결합 분석을 또한, 항체가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 없음을 확인하기 위해서 수행할 수 있다. 예를 들어 WO　2006/029879 및 WO　2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조하시오. 보체 활성화를 평가하기 위해서, CDC 분석을 수행할 수도 있다(예를 들어 문헌[Gazzano-Santoro, H. et al ., J. Immunol . Methods 202:163-171 (1996)]; 문헌[Cragg, M.S. et al ., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 문헌[Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)]을 참조하시오). FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 측정을 또한 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다(예를 들어 문헌[Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18:1759-1769 (2006)]을 참조하시오).
감소된 효과기 기능을 갖는 항체들은 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국특허 제 6,737,056 호). 상기와 같은 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체(알라닌으로의 잔기 265 및 297의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함(미국특허 제 7,332,581 호))를 포함한다.
FcR에 대한 개선된 또는 감소된 결합을 갖는 몇몇 항체 변이체들이 개시되어 있다(예를 들어 미국특허 제 6,737,056 호; WO 2004/056312, 및 문헌[Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276: 6591-6604 (2001)]을 참조하시오).
몇몇 실시태양에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 상기 Fc 영역의 298, 333 및/또는 334번 위치(잔기의 EU 넘버링)의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시태양에서, 예를 들어 미국특허 제 6,194,551 호, WO　99/51642, 및 문헌[Idusogie, E.E. et al . J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000)]에 개시된 바와 같이, Fc 영역에서, 변경된(즉 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적인 세포독성(CDC)을 생성시키는 변경을 수행한다.
증가된 반감기 및 신생아 Fc 수용체(RcRn)(모 IgG의 태아로의 전달을 맡고 있다)(문헌[Guyer, R.L. et al ., J. Immunol . 117:587-593 (1976)] 및 문헌[Kim J.K. et al ., J. Immunol . 24:2429-2434 (1994)])에의 개선된 결합을 갖는 항체들이 US 2005/0014934에 개시되어 있다. 상기 항체들은 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 상기 Fc 영역을 포함한다. 상기와 같은 Fc 변이체들은 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 및 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434에서의 치환(미국특허 제 7,371,826 호)을 갖는 것들을 포함한다.
또한 Fc 영역 변이체의 다른 예들에 관한 문헌[Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322:738-740 (1988)]; 미국특허 제 5,648,260 호; 미국특허 제 5,624,821 호; 및 WO 94/29351을 참조하시오.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
몇몇 실시태양에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 "티오MAb"를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 치환된 잔기는 상기 항체의 접근 가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기가 상기 항체의 접근 가능한 부위에 위치되며 이를 사용하여 본 발명에 추가로 개시된 바와 같이 상기 항체를 다른 부분, 예를 들어 약물 부분 또는 링커-약물 부분에 접합시켜 면역접합체를 생성시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 하기의 잔기들 중 임의의 하나 이상을 시스테인으로 치환시킬 수도 있다: 경쇄의 V205(카밧 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체를 예를 들어 미국특허 제 7,521,541 호에 개시된 바와 같이 생성시킬 수 있다.
e) 항체 유도체
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체를 당해 분야에 공지되고 쉽게 입수할 수 있는 추가적인 비단백질성 부분을 함유하도록 추가로 변형시킬 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 부분은 비제한적으로 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 그의 수 중 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며 분지되거나 분지되지 않을 수도 있다. 상기 항체에 부착된 중합체들의 수는 변할 수 있으며, 하나보다 많은 중합체가 부착되는 경우, 이들 중합체는 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 상기 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형을 비제한적으로, 개선시키고자 하는 상기 항체의 특정한 성질, 상기 항체 유도체를 한정된 조건하에서 치료법에 사용할 것인지의 여부 등을 포함한 고려사항을 기준으로 결정할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 방사선에의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 부분의 접합체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 비단백질성 부분은 탄소 나노튜브이다(문헌[Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 상기 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 비제한적으로 통상적인 세포에는 해롭지 않지만 상기 비단백질성 부분을 상기 항체-비단백질성 부분에 근접한 세포를 죽이는 온도로 가열하는 파장을 포함한다.
f) 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈과의 융합
단클론 항체는 신경학적 또는 중추 신경계(CNS) 질환의 치료를 위한 막대한 치료학적 잠재성을 갖지만, 그의 뇌로의 통과는 혈액-뇌-장벽(BBB)에 의해 제한된다. 과거의 연구들은 혈류 중에서 순환하는 IgG의 매우 적은 비율(대략 0.1%)이 상기 BBB를 통과하여 CNS로 가는 것을 입증하였으며(문헌[Felgenhauer, K., Klin. Wschr. 52(1974) 1158-1164]), 이때 상기 항체의 CNS 농도는 확고한 효과를 허용하기에는 불충분할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체를, 당해 분야에 공지되고 쉽게 입수할 수 있는 하나 이상의 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈을 함유하도록 추가로 변형시킬 수 있다.
상기 하나 이상의 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈을 경쇄 또는 중쇄의 임의의 말단에 융합시킬 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈을 중쇄의 C-말단에 융합시킨다.
상기 중쇄의 C-말단은 아미노산 잔기 PGK로 끝나는 완전한 C-말단일 수 있다. 상기 중쇄의 C-말단은 상기 C-말단 아미노산 잔기들 중 하나 또는 2개가 제거된 단축된 C-말단일 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 중쇄의 C-말단은 PG로 끝나는 단축된 C-말단이다.
상기 하나 이상의 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈을 직접 또는 링커 펩타이드를 통해 각각의 항체쇄에 융합시킬 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 링커 펩타이드는 아미노산 서열 GGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 41)를 갖는다.
상기 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈은 항체 scFv 단편일 수 있다. 하나의 실시태양에서 상기 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈은 N- 에서 C-말단 순서로 경쇄 가변 도메인 - 경쇄 불변 도메인 - 링커 펩타이드 - 중쇄 가변 도메인 - 중쇄 불변 도메인 1을 포함하는 scFv이다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈은 (G4S)6 링커 펩타이드를 갖는 항-트랜스페린 수용체-항체 8D3의 scFv 단편 또는 그의 인간화된 변이체이다.
그의 인간화된 변이체란 용어는 쥐 8D3 항체의 CDR을 인간 프레임워크상에, 프레임워크 영역(FR) 및/또는 고가변 영역(HVR) 각각에서 서로 독립적으로 1 내지 3개의 돌연변이를 임의로 도입시켜 이식함으로써 획득된 분자를 나타낸다.
하나의 태양에서, 본 발명은 항-인간 알파-시누클레인 항체, 2개의 펩타이드 링커 및 혈액-뇌-장벽 수용체에 결합하는 2개의 1가 결합 존재를 포함하는 항-인간 알파-시누클레인 항체 융합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기에서 상기 링커는 상기 항-인간 알파-시누클레인 항체를 상기 혈액-뇌-장벽 수용체에 결합하는 1가의 결합 존재에 결합시킨다.
하나의 태양에서, 본 발명은 항-인간 알파-시누클레인 항체, 펩타이드 링커 및 혈액-뇌-장벽 수용체에 결합하는 하나의 1가 결합 존재를 포함하는 항-인간 알파-시누클레인 항체 융합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기에서 상기 링커는 상기 항-인간 알파-시누클레인 항체를 상기 혈액-뇌-장벽 수용체에 결합하는 1가의 결합 존재에 결합시킨다.
하나의 실시태양에서 상기 혈액-뇌-장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 존재는 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
하나의 실시태양에서, 상기 혈액-뇌-장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 존재는 혈액-뇌-장벽 수용체 리간드, scFv, Fv, scFab, VHH, 하나의 바람직한 실시태양에서 scFv 및 scFab로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 분자를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 혈액-뇌-장벽 수용체는 트랜스페린 수용체, 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장인자 수용체, 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8, 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1 및 헤파린-결합 상피 성장인자-유사 성장인자로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 혈액-뇌-장벽 수용체는 트랜스페린 수용체이다.
하나의 실시태양에서, 상기 혈액-뇌-장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 존재는 상기 트랜스페린 수용체에 대한 하나의 scFab 또는 하나의 scFv, 보다 특히 서열번호 52, 53 및 54의 아미노산 서열내에 포함된 트랜스페린 수용체 중의 에피토프를 인식하는 scFab 또는 scFv를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 혈액-뇌-장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 존재는 상기 링커에 의해 상기 항-인간 알파-시누클레인 항체의 중쇄의 C-말단 단부에 결합된다.
하나의 실시태양에서, 상기 펩타이드 링커는 적어도 15 아미노산의 길이, 보다 바람직하게는 18 내지 25 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열이다.
하나의 실시태양에서, 상기 항-인간 알파-시누클레인 항체는 전장 항체, 하나의 바람직한 실시태양에서 전장 IgG이다. 전장 항체란 용어는 2개의 항체 경쇄 폴리펩타이드 및 2개의 항체 중쇄 폴리펩타이드로 이루어지는 항체를 나타내며 여기에서 상기 두 항체 중쇄 폴리펩타이드 중에 C-말단 리신 잔기(K)는 존재하거나 존재하지 않을 수 있다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 항-인간 알파-시누클레인 항체 융합 폴리펩타이드는 뇌 효과기 존재로서 전장 IgG 항-인간 알파-시누클레인 항체, 서열 GGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 41)의 링커 및 혈액 뇌 수용체로서 인간 트랜스페린 수용체에 결합하는 1가 결합 존재로서 하나의 scFab를 포함하며, 여기에서 상기 scFab는 상기 링커에 의해 상기 전장 항-인간 알파-시누클레인 항체의 중쇄 중 하나의(Fc 부분의) C-말단 단부에 결합되고, 상기 scFab는 서열번호 52, 53 및 54의 아미노산 서열내에 포함된 인간 트랜스페린 수용체 중의 에피토프를 인식한다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 항-인간 알파-시누클레인 항체 융합 폴리펩타이드는 뇌 효과기 존재로서 전장 IgG 항-인간 알파-시누클레인 항체, 서열 GGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 41)의 링커 및 혈액 뇌 수용체로서 인간 트랜스페린 수용체에 결합하는 1가 결합 존재로서 하나의 scFv를 포함하며, 여기에서 상기 scFab는 상기 링커에 의해 상기 전장 항-인간 알파-시누클레인 항체의 중쇄 중 하나의(Fc 부분의) C-말단 단부에 결합되고, 상기 scFab는 서열번호 52, 53 및 54의 아미노산 서열내에 포함된 인간 트랜스페린 수용체 중의 에피토프를 인식한다.
하나의 실시태양에서, 상기 항-인간 알파-시누클레인 항체의 제1 중쇄는 제1 이량체화 모듈을 포함하고 상기 항체의 제2 중쇄는 제2 이량체화 모듈을 포함하여 상기 2개 중쇄의 이종이량체화를 허용한다.
하나의 실시태양에서, 상기 항-인간 알파-시누클레인 항체의 제1 중쇄의 제1 이량체화 모듈은 놉-중쇄이고 상기 항-인간 알파-시누클레인 항체의 제2 중쇄의 이량체화 모듈은 홀-중쇄(놉-인투-홀 전략에 따른)이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 항-인간 알파-시누클레인 항체 융합 폴리펩타이드를 약제로서 사용할 수 있으며, 특히 상기 폴리펩타이드를 신경학적 질환, 예를 들어 파킨슨병의 치료에 사용할 수 있다.
본 발명에 보고된 바와 같은 항-인간 알파-시누클레인 항체 융합 폴리펩타이드를, 상기 항-인간 알파-시누클레인 항체(뇌 효과기 존재)를 상기 혈액 뇌 장벽을 통해 수송하는데 사용할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 인간 트랜스페린 수용체에 결합하는 1가 결합 존재로서 scFab에 Fc-영역의 C-말단 단부에서 결합하는 항-인간 알파-시누클레인 항체의 중쇄는 N- 에서 C-말단 방향으로 하기의 구조를 갖는다:
·IgG 중쇄,
·상기 IgG 중쇄의 Fc-영역의 C-말단 단부를 scFab의 VL 도메인의 N-말단 단부에 결합시키는, 하나의 바람직한 실시태양에서 아미노산 서열 GGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 41)을 갖는 펩타이드 링커,
·상기 scFab의 가변 경쇄 도메인(VL) 및 C-카파 경쇄 도메인,
·상기 scFab의 C-카파 경쇄 도메인의 C-말단 단부를 상기 scFab의 VH 도메인의 N-말단 단부에 결합시키는, 하나의 바람직한 실시태양에서 아미노산 서열 (G4S)6GG(서열번호 55)를 갖는 펩타이드 링커,
·상기 scFab 항체의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 IgG CH1 중쇄 도메인.
하나의 실시태양에서, 인간 트랜스페린 수용체에 결합하는 1가 결합 존재로서 scFv에 Fc-영역의 C-말단 단부에서 결합하는 항-인간 알파-시누클레인 항체의 중쇄는 N- 에서 C-말단 방향으로 하기의 구조를 갖는다:
·IgG 중쇄,
·상기 IgG 중쇄의 Fc-영역의 C-말단 단부를 scFv의 VL 도메인의 N-말단 단부에 결합시키는, 하나의 바람직한 실시태양에서 아미노산 서열 GGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 41)을 갖는 펩타이드 링커,
·가변 경쇄 도메인(VL),
·상기 가변 경쇄 도메인의 C-말단 단부를 상기 scFv의 VH 도메인의 N-말단 단부에 결합시키는, 하나의 바람직한 실시태양에서 아미노산 서열 (G4S)6GG(서열번호 55)를 갖는 펩타이드 링커,
·상기 scFv 항체 단편의 가변 중쇄 도메인(VH).
두 번째 태양에서 본 발명은 뇌 효과기 존재를, CH2-CH3 Ig 존재, 펩타이드 링커 및 뇌-혈액-장벽 수용체에 대한 하나의 scFab 또는 scFv를 포함하는 혈액-뇌-장벽을 통과하여 수송하는 융합 폴리펩타이드를 제공하며, 여기에서 상기 scFab 또는 scFv는 상기 펩타이드 링커에 의해 상기 CH2-CH3 Ig 존재의 C-말단 단부에 결합된다.
하나의 실시태양에서, 상기 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈/혈액-뇌-장벽 수용체에 대한 scFab 또는 scFv는 인간화된 항-트랜스페린 수용체 항체 8D3으로부터 유래한다(예를 들어 문헌[Boado, R.J., et al., Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1251-1258]을 참조하시오). 쥐 중쇄 가변 도메인은
EVQLVESGGG LVQPGNSLTL SCVASGFTFS NYGMHWIRQA PKKGLEWIAM IYYDSSKMNY ADTVKGRFTI SRDNSKNTLY LEMNSLRSED TAMYYCAVPT SHYVVDVWGQ GVSVTVSS
(서열번호 56)의 아미노산 서열을 갖는다.
쥐 경쇄 가변 도메인(변체 1)은
DIQMTQSPAS LSASLEEIVT ITCQASQDIG NWLAWYQQKP GKSPQLLIYG ATSLADGVPS RFSGSRSGTQ FSLKISRVQV EDIGIYYCLQ AYNTPWTFGG GTKLELK
(서열번호 57)의 아미노산 서열을 갖고,
쥐 경쇄 가변 도메인(변체 2)은
DIQMTQSPAS LSASLEEIVT ITCQASQDIG NWLAWYQQKP GKSPQLLIYG ATSLADGVPS RFSGSRSGTQ FSLKISRVQV EDIGIYYCLQ AYNTPWTFGG GTKVEIK
(서열번호 58)의 아미노산 서열을 갖는다.
하나의 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈
하나의 태양에서, 상기 항-인간 알파 시누클레인 항체 융합 폴리펩타이드는 정확히 하나의 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈을 포함하며, 여기에서 상기 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈은 쥐 항-인간 트랜스페린 수용체 항체 8D3의 인간화된 가변 도메인을 포함하고, 이때 상기 쥐 항-인간 트랜스페린 수용체 항체 8D3의 인간화된 가변 도메인을 포함하는 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈은 상기 항-인간 알파-시누클레인 항체를 상기 혈액-뇌-장벽을 통과하여 수송한다. 상기 항-인간 트랜스페린 수용체 항체 8D3의 가변 도메인은 서열번호 56 및 57의 아미노산 서열을 갖는다.
하나 또는 2개의 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈
하나의 태양에서 상기 항-인간 알파 시누클레인 항체 융합 폴리펩타이드는 하나 또는 2개의 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈(들)을 포함하며, 여기에서 상기 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈은 혈액-뇌-장벽 수용체(BBB-R)에 낮은 친화성으로 결합하는 항체로부터 유도되고, 이때 상기 혈액-뇌-장벽 수용체에 낮은 친화성으로 결합하는 항체로부터 유도된 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈은 상기 항-인간 알파-시누클레인 항체를 상기 혈액-뇌-장벽을 통과하여 수송한다.
또 다른 태양에서, 상기 BBB-R은 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장인자 수용체(IGF 수용체), 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질(LRP8), 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1(LRP1), 및 헤파린-결합 상피 성장인자-유사 성장인자(HB-EGF)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 또 다른 상기와 같은 태양에서, 상기 BBB-R은 인간 BBB-R이다. 하나의 상기와 같은 태양에서, 상기 BBB-R은 TfR이다. 또 다른 상기와 같은 태양에서, 상기 BBB-R은 TfR이고, 상기 항체는 TfR 활성을 억제하지 않는다. 또 다른 상기와 같은 태양에서, 상기 BBB-R은 TfR이고 상기 항체는 TfR의 트랜스페린에의 결합을 억제하지 않는다.
또 다른 태양에서, 상기 항체는 상기 BBB-R의 그의 고유 리간드 중 하나 이상에의 결합을 손상시키지 않는다. 또 다른 상기와 같은 태양에서, 상기 항체는 인간 트랜스페린 수용체(hTfR)에, 상기 항체가 상기 hTfR의 인간 트랜스페린에의 결합을 억제하지 않는 방식으로 특이적으로 결합한다.
또 다른 태양에서, 상기 항-BBB-R 항체는 약 1 nM 내지 약 100 μM의 BBB-R에 대한 IC50을 갖는다. 또 다른 상기와 같은 태양에서, 상기 IC50은 약 5 nM 내지 약 100 μM이다. 또 다른 상기와 같은 태양에서, 상기 IC50은 약 50 nM 내지 약 100 μM이다. 또 다른 상기와 같은 태양에서, 상기 IC50은 약 100 nM 내지 약 100 μM이다. 또 다른 태양에서, 상기 항체는 약 5 nM 내지 약 10 μM의 BBB-R에 대한 친화성을 갖는다. 또 다른 상기와 같은 태양에서, 상기 항체는 항-인간 알파-시누클레인 항체에 결합될 때 약 30 nM 내지 약 1 μM의 BBB-R에 대한 친화성을 갖는다. 또 다른 상기와 같은 태양에서, 상기 항체는 항-인간 알파-시누클레인 항체에 결합될 때 약 50 nM 내지 약 1 μM의 BBB-R에 대한 친화성을 갖는다. 하나의 태양에서, 상기 BBB-R에 대한 상기 항-BBB-R 항체 또는 항-인간 알파-시누클레인 항체 융합 폴리펩타이드의 친화성을 스캐차드 분석을 사용하여 측정한다. 또 다른 태양에서, 상기 BBB-R에 대한 상기 항-BBB-R 항체 또는 항-인간 알파-시누클레인 항체 융합 폴리펩타이드의 친화성을 비아코어 분석을 사용하여 측정한다. 또 다른 태양에서, 상기 BBB-R에 대한 상기 항-BBB-R 항체 또는 항-인간 알파-시누클레인 항체 융합 폴리펩타이드의 친화성을 경쟁 ELISA를 사용하여 측정한다.
항체 융합 폴리펩타이드를 함유하는 혈액-뇌-장벽 셔틀의 용도
또 다른 실시태양에서, 본 발명에서 항-인간 알파 시누클레인 항체에의 CNS의 노출을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 항-인간 알파 시누클레인 항체를 BBB-R에 낮은 친화성으로 결합하는 항체 또는 항체 단편에 결합시키고, 이에 의해 상기 항-인간 알파 시누클레인 항체에의 CNS의 노출이 증가한다. 또 다른 태양에서, 상기 항-인간 알파 시누클레인 항체에의 CNS 노출의 증가를 상기 BBB-R에 대해 강하된 친화성을 갖지 않는 전형적인 항체와 결합된 항-인간 알파 시누클레인 항체의 CNS 노출과 비교하여 측정한다. 또 다른 태양에서, 상기 항-인간 알파 시누클레인 항체에의 CNS 노출의 증가를 투여후 혈청 중에서 발견되는 양과 비교된, 상기 CNS 중에서 발견된 항-인간 알파 시누클레인 항체의 양의 비로서 측정한다. 또 다른 상기와 같은 태양에서, 상기 CNS 노출의 능가는 0.1%를 초과하는 비를 생성시킨다. 또 다른 태양에서, 상기 항-인간 알파 시누클레인 항체에의 CNS 노출의 증가를 결합된 항-BBB-R 항체의 부재하에서의 항-인간 알파 시누클레인 항체의 CNS 노출과 비교하여 측정한다. 또 다른 태양에서, 상기 항-인간 알파 시누클레인 항체에의 CNS 노출의 증가를 영상화에 의해 측정한다. 또 다른 태양에서, 상기 항-인간 알파 시누클레인 항체에의 CNS 노출의 증가를 하나 이상의 생리학적 증상들의 변화와 같은 간접적인 정보에 의해 측정한다.
피실험자에게 투여되는 항-인간 알파 시누클레인 항체의 CNS 중에서의 체류의 증가 방법으로, 상기 항-인간 알파 시누클레인 항체를 BBB-R에 낮은 친화성으로 결합하는 항체 또는 항체 단편에 결합시키며, 따라서 상기 항-인간 알파 시누클레인 항체의 CNS 중에서의 체류가 증가한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 피실험자의 CNS에서 유효하도록 항-인간 알파 시누클레인 항체의 약동학 및/또는 약역학을 최적화시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 항-인간 알파 시누클레인 항체를 BBB-R에 낮은 친화성으로 결합하는 항체 또는 항체 단편에 결합시키고, 이때 상기 항체 또는 항체 단편을 상기 항-인간 알파 시누클레인 항체에의 결합 후에 상기 BBB-R에 대한 그의 친화성이, 상기 CNS에서의 상기 항-인간 알파 시누클레인 항체의 약동학 및/또는 약역학을 최적화하는, 상기 BBB를 통과하는 상기 항-인간 알파 시누클레인 항체에 접합된 항체 또는 항체 단편의 수송량을 생성시키도록 선택한다.
또 다른 실시태양에서 본 발명은 포유동물을, BBB-R에 결합하고 항-인간 알파 시누클레인 항체에 결합하는 항체 또는 항체 단편으로 치료함을 포함하는, 상기 포유동물에서 신경학적 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 항체는 상기 BBB-R에 대해 낮은 친화성을 갖도록 선택되었고 이에 의해 상기 항체 및 결합된 항-인간 알파 시누클레인 항체의 CNS 흡수를 개선시킨다. 하나의 실시태양에서, 상기 치료는 질환 증상의 감소 또는 제거를 생성시킨다. 또 다른 태양에서, 상기 치료는 상기 신경학적 질환의 개선을 생성시킨다.
모든 선행 태양들 중 하나의 실시태양에서, 상기 항-BBB-R 항체는 약 1 nM 내지 약 100 μM의 BBB-R에 대한 IC50을 갖는다. 또 다른 상기와 같은 실시태양에서, 상기 IC50은 약 5 nM 내지 약 100 μM이다. 또 다른 상기와 같은 실시태양에서, 상기 IC50은 약 50 nM 내지 약 100 μM이다. 또 다른 상기와 같은 실시태양에서, 상기 IC50은 약 100 nM 내지 약 100 μM이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 약 5 nM 내지 약 10 μM의 BBB-R에 대한 친화성을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 항-인간 알파-시누클레인 항체에 결합될 때 약 30 nM 내지 약 1 μM의 BBB-R에 대한 친화성을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 항-인간 알파-시누클레인 항체에 결합될 때 약 50 nM 내지 약 1 μM의 BBB-R에 대한 친화성을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 상기 BBB-R에 대한 상기 항-BBB-R 항체 또는 항-인간 알파-시누클레인 항체 융합 폴리펩타이드의 친화성을 스캐차드 분석을 사용하여 측정한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 BBB-R에 대한 상기 항-BBB-R 항체 또는 항-인간 알파-시누클레인 항체 융합 폴리펩타이드의 친화성을 비아코어 분석을 사용하여 측정한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 BBB-R에 대한 상기 항-BBB-R 항체 또는 항-인간 알파-시누클레인 항체 융합 폴리펩타이드의 친화성을 경쟁 ELISA를 사용하여 측정한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 항-인간 알파 시누클레인 항체 융합 폴리펩타이드를 표지한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항-BBB-R 항체 또는 단편은 그의 고유 리간드 중 하나 이상에 대한 상기 BBB-R의 결합을 손상시키지 않는다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항-BBB-R 항체는 hTfR의 인간 트랜스페린에의 결합을 억제하지 않는 방식으로 상기 hTfR에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항-인간 알파 시누클레인 항체 융합 폴리펩타이드를 포유동물에게 투여한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 포유동물은 인간이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 포유동물은 신경학적 질환을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 상기 신경학적 질환은 알쯔하이머병(AD), 뇌졸중, 치매, 근이영양증(MD), 다발성 경화증(MS), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 낭성 섬유증, 엔젤만 증후군, 리들 증후군, 파킨슨병, 픽병, 파제트병, 암 및 외상성 뇌 손상으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체를 예를 들어 미국특허 제 4,816,567 호에 개시된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명에 개시된 항-인간 알파-시누클레인 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 상기와 같은 핵산은 항체(예를 들어 상기 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)의 VH을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상기와 같은 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어 발현 벡터)를 제공한다. 추가의 실시태양에서, 상기와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 상기 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 상기 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 상기 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예를 들어 이들 벡터로 형질전환되었다). 하나의 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 진핵생물, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프양 세포(예를 들어 Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 하나의 실시태양에서, 항-인간 알파-시누클레인 항체의 제조 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 항체의 발현에 적합한 조건하에서, 상기에 제공된 바와 같은, 상기 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 임의로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수함을 포함한다.
항-인간 알파-시누클레인 항체의 재조합 생성을 위해서, 예를 들어 상술한 바와 같은, 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 상기와 같은 핵산을 통상적인 과정을 사용하여(예를 들어 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 탐침을 사용함으로써) 쉽게 단리하고 서열분석할 수 있다.
항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본 발명에 개시된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체를, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 세균에서 생성시킬 수 있다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현에 대해서, 예를 들어 미국특허 제 5,648,237 호, 미국특허 제 5,789,199 호 및 미국특허 제 5,840,523 호를 참조하시오. (또한 에스케리키아 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 개시하는 문헌[Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254]을 참조하시오). 발현 후에, 상기 항체를 용액 분획 중 세균 세포 페이스트로부터 단리하고 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 외에, 진핵 미생물, 예를 들어 섬유상 진균 또는 효모, 예를 들어 글리코실화 경로가 "인간화되어" 부분적인 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생산하는 진균 및 효모 균주가 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414]; 및 문헌[Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215]을 참조하시오.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포이다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.
식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어 미국특허 제 5,959,177 호, 미국특허 제　6,040,498 호, 미국특허 제 6,420,548 호, 미국특허 제 7,125,978 호 및 미국특허 제　6,417,429 호(트랜스제닉 식물에서 항체를 생성시키기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)(상표) 기술을 개시한다)를 참조하시오.
척추동물 세포를 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어 현탁액에서 증식시키기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통; 인간 배아 신장 계통(예를 들어 문헌[Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74]에 개시된 바와 같은 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들어 문헌[Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252]에 개시된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 래트 간세포(BRL 3A); 인간 폐세포(W138); 인간 간세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예를 들어 문헌[Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68]에 개시된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예를 들어 DHFR- CHO 세포(문헌[Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220]); 및 골수종 세포주, 예를 들어 Y0, NS0 및 Sp2/0를 포함한다. 항체 생산에 적합한 몇몇 포유동물 숙주 세포주에 대한 리뷰에 대해서, 예를 들어 문헌[Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268]을 참조하시오.
C. 분석
본 발명에 제공된 항-인간 알파-시누클레인 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 분석에 의해 그의 물리/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인하거나, 선별하거나 특성화할 수 있다.
1. 결합 분석 및 다른 분석
하나의 태양에서, 본 발명의 항체를 예를 들어 공지된 방법, 예를 들어 ELISA, 알파LISA, 웨스턴 블럿, 항체 또는 역상 배열 등에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다.
예시적인 ELISA 또는 알파LISA 분석에서, 용액(세포 상등액, 세포 또는 조직 용해물, 체액 등) 중의 알파-시누클레인을, 알파-시누클레인 또는 특정 입체구조의 알파-시누클레인상의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체 및 알파-시누클레인의 제2 에피토프 또는 입체구조에 특이적으로 결합하는 검출 존재에 결합된 검출 항체에 의해 결합시킨다. 판독은 검출 개체(화학발광, 형광, 에너지 이동 유도된 발광 등)에 근거한다. 일부 예에서 동일 항체를 포획 및 검출 항체와 동일한 분석에 사용하여 알파-시누클레인의 응집된 형태를 검출할 수 있다(예를 들어 문헌[Tokuda, T. et al., Neurology 75(2010) 1766-1772]을 참조하시오).
항체 배열의 경우에, 항체를 유리 또는 나이트로셀룰로스 칩상에 스폿팅한다. 상기 슬라이드를 차단하고 알파-시누클레인 함유 용액과 함께 배양하고, 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고 결합된 항체를 형광 표지된 상응하는 2차 항체로 검출한다. 상기 형광 신호를 형광 슬라이드 스캐너에 의해 측정한다. 유사하게 역상 배열에 대해서, 재조합 알파-시누클레인, 세포 상등액, 세포 또는 조직 용해물, 체액 등을 유리 또는 나이트로셀룰로스 칩상에 스폿팅한다. 상기 슬라이드를 차단하고 개별적인 배열을 알파-시누클레인상의 특이적인 에피토프에 대한 항체와 함께 배양한다. 결합되지 않은 항체를 세척하고 결합된 항체를 형광 표지된 상응하는 2차 항체로 검출한다. 상기 형광 신호를 형광 슬라이드 스캐너에 의해 측정한다(문헌[Dernick, G., et al., J. Lipid Res. 52(2011)2323-2331]).
웨스턴 블럿의 예에서, 응집된 재조합 알파-시누클레인 또는 세포 상등액, 세포 또는 조직 용해물, 체액 등으로부터 유래된 알파-시누클레인을 SDS PAGE 또는 고유 젤 조건에서 분자량에 의해 분리시키고 나이트로셀룰로스 또는 PVDF 멤브레인상에 블럿팅한다. 차단 후에 상기 멤브레인을 알파-시누클레인의 아미노산 서열 또는 입체구조에 특이적인 항체와 함께 배양한다. 그 후에 상기 멤브레인을 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거한다. 결합된 항체를 화학발광 또는 형광 또는 다른 검출 수단용 검출 개체에 결합된 상응하는 2차 항체에 의해 검출한다. 알파-시누클레인의 아미노산 서열에 특이적인 항체는 에피토프가 응집에 의해 가려지지 않는 한 다양한 응집된 형태 및 따라서 분자량의 알파-시누클레인에 결합할 것이다. 다른 한편으로, 입체구조 특이적 항체는 특정한 분자량에서만 밴드를 드러내는 알파-시누클레인의 단지 몇몇의 응집된 형태만을 검출할 것이다(예를 들어 문헌[Towbin, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350-4353]; 문헌[Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203]을 참조하시오).
또 다른 태양에서, 경쟁 분석을 사용하여 인간 알파-시누클레인에의 결합에 대해 항체 0017, 항체 0018 또는 항체 0081과 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기와 같은 경쟁 항체는 항체 0017, 항체 0018 및 항체 0081과 같은 본 발명에 보고된 바와 같은 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예를 들어 선형 또는 입체구조 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프의 지도화에 대한 상세한 예시적인 방법들이 문헌[Morris, G.E. (ed.), Epitope Mapping Protocols, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996)]에 제공되어 있다.
예시적인 경쟁 분석에서, 고정화된 인간 알파-시누클레인을 인간 알파 시누클레인에 결합하는 표지된 제1 항체(예를 들어 항체 0017, 항체 0018 또는 항체 0081) 및 인간 알파-시누클레인에의 결합에 대해 상기 제1 항체와 경쟁하는 능력에 대해 시험하고자 하는 표지되지 않은 제2 항체를 포함하는 용액 중에서 배양한다. 대조용으로서, 고정화된 인간 알파-시누클레인을, 상기 표지된 제1 항체는 포함하지만 상기 표지되지 않은 제2 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 배양한다. 상기 제1 항체의 인간 알파-시누클레인에의 결합을 허용하는 조건하에서 배양 후에 과잉의 결합되지 않은 항체를 제거하고, 고정화된 인간 알파-시누클레인과 결합된 표지의 양을 측정한다. 고정화된 인간 알파-시누클레인과 결합된 표지의 양이 대조용 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소하는 경우, 이는 상기 제2 항체가 인간 알파-시누클레인에의 결합에 대해서 상기 제1 항체와 경쟁함을 암시한다(예를 들어 문헌[Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)]을 참조하시오).
2. 활성 분석
하나의 태양에서, 생물학적 활성을 갖는 항-인간 알파-시누클레인 항체를 확인하기 위한 분석을 제공한다. 생물학적 활성은 예를 들어 알파-시누클레인 유도된 세포독성으로부터의 보호/상기 독성의 감소/억제 및/또는 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달로부터의 보호/상기 전달의 감소/억제, 및/또는 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성의 감소를 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 생체외에서 상기와 같은 생물학적 활성을 갖는 항체를 또한 제공한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항체를 상기와 같은 생물학적 활성에 대해 시험한다.
상기 보호성 생물학적 활성을, 수령 뉴런 세포에서 세포사를 유발하는 분비된 알파-시누클레인을 함유하는 컨디셔닝된 배지를 가함으로써 평가할 수 있다. 상기 독성을 본 발명에 개시된 바와 같은 보호 항체의 첨가에 의해 역전시킬 수 있다. 분비된 알파-시누클레인의 독성 성질은 앞서 확립되었다(문헌[Emmanouilidou, E., et al., J. Neurosci., 30 (2010) 6838-6851]).
D. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
몇몇 실시태양에서, 본 발명에서 제공된 항-인간 알파-시누클레인 항체 중 어느 하나는 생물학적 샘플 중의 인간 알파-시누클레인의 존재를 검출하기에 유용하다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "검출하는"이란 용어는 정량적인 또는 정성적인 검출을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예를 들어 뇌 조직을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-인간 알파-시누클레인 항체를 제공한다. 추가의 태양에서, 생물학적 샘플 중의 인간 알파-시누클레인의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플을 상기 항-인간 알파-시누클레인 항체의 인간 알파-시누클레인에의 결합을 허용하는 조건하에서 본 발명에 개시된 바와 같은 항-인간 알파-시누클레인 항체와 접촉시키고, 상기 항-인간 알파-시누클레인 항체와 인간 알파-시누클레인간에 복합체가 형성되는 지를 검출함을 포함한다. 상기와 같은 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 항-인간 알파-시누클레인 항체를 사용하여, 예를 들어 인간 알파-시누클레인이 환자의 선택을 위한 생물마커인 경우, 항-인간 알파-시누클레인 항체에 의한 요법에 적격인 피실험자를 선택한다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 질환은 1형 뇌 철분 축적을 갖는 신경퇴행(NBIA1), 순수성 자율신경 실조증, 다운 증후군, 괌 복합체, 및 다수의 루이소체 질환, 예를 들어 확산성 루이소체병(DLBD), 알쯔하이머병의 루이소체 변형(LBVAD), 몇몇 형태의 고세병 및 파킨슨병 치매(PDD)를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 표지된 항-인간 알파-시누클레인 항체를 제공한다. 표지는 비제한적으로 직접 검출되는 표지 또는 부분(예를 들어 형광성, 발색성, 전자-밀집성, 화학발광성 및 방사성 표지)뿐만 아니라, 예를 들어 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 부분들, 예를 들어 효소 또는 리간드를 포함한다. 예시적인 표지는 비제한적으로 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예를 들어 희토 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리페라제, 예를 들어 개똥벌레 루시페라제 및 세균 루시페라제(미국특허 제 4,737,456 호), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제(과산화 수소를 사용하여 염료 전구체, 예를 들어 HRP를 산화시키는 효소와 결합된), 락토퍼옥시다제, 또는 미세퍼옥시다제, 비오틴/아비딘, 회전 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함한다.
E. 약학 제형
본 발명에 개시된 바와 같은 항-인간 알파-시누클레인 항체의 약학 제형을, 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기와 같은 항체를 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성이며, 상기 담체는 비제한적으로 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제(예를 들어 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 본 발명에서 예시적인 약학적으로 허용 가능한 담체는 간질성 약물 분산제, 예를 들어 용해성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 용해성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예를 들어 rHuPH20(하이레넥스(HYLENEX)(등록상표), 박스터 인터내셔널 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함한 몇몇 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 미국특허 공보 2005/0260186 및 2006/0104968에 개시되어 있다. 하나의 태양에서, sHASEGP를 하나 이상의 추가적인 클리코스아미노글리카나제, 예를 들어 콘드로이티나제와 병용한다.
예시적인 동결건조된 제형들이 미국특허 제 6,267,958 호에 개시되어 있다. 수성 항체 제형은 미국특허 제 6,171,586 호 및 WO 2006/044908에 개시된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본 발명의 제형은 또한 치료하려는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 성분들, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, [[상기 항-인간 알파-시누클레인 항체와 병용할 수도 있는 목록 약물들]]을 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기와 같은 활성 성분들은 의도하는 목적에 유효한 양으로 함께 적합하게 존재한다.
활성 성분을 예를 들어 코아세르베이션 기법에 의해서 또는 계면 중합에 의해서 제조된 미세캡슐, 예를 들어 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어 리포솜, 알부민 미소구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐) 중의 또는 거대유화액 중의 각각의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메트아크릴레이트) 미세캡슐 중에 포집할 수 있다. 상기와 같은 기법들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
서방성 제제를 제조할 수도 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 상기 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질(상기 기질은 성형품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐의 형태이다)을 포함한다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행될 수 있다.
F. 치료 방법 및 조성물
본 발명에 제공된 항-인간 알파-시누클레인 항체 중 어느 하나를 치료 방법에 사용할 수 있다.
하나의 태양에서, 약제로서 사용하기 위한 항-인간 알파-시누클레인 항체를 제공한다. 추가의 태양에서, 파킨슨병의 치료에 사용하기 위한 항-인간 알파-시누클레인 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-인간 알파-시누클레인 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 개인에게 유효량의 항-인간 알파-시누클레인 항체를 투여함을 포함하는, 파킨슨병이 있는 개인의 치료 방법에 사용하기 위한 상기 항-인간 알파-시누클레인 항체를 제공한다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 상기 방법은 상기 개인에게 유효량의, 예를 들어 하기에 개시하는 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 투여함을 추가로 포함한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명은 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하거나, 또는 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하거나, 또는 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시키는데 사용하기 위한 항-인간 알파-시누클레인 항체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 개인에게 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하거나, 또는 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하거나, 또는 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시키기에 유효한 항-인간 알파-시누클레인 항체를 투여함을 포함하는, 상기 개인에서 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하거나, 또는 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하거나, 또는 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시키는데 사용하기 위한 상기 항-인간 알파-시누클레인 항체를 제공한다. 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 "개인"은 바람직하게는 인간이다.
추가의 태양에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에서 항-인간 알파-시누클레인 항체의 용도를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 약제는 파킨슨병 치료용이다. 추가의 실시태양에서, 상기 약제는 파킨슨병이 있는 개인에게 유효량의 상기 약제를 투여함을 포함하는 파킨슨 병의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 상기 방법은 상기 개인에게 유효량의, 예를 들어 하기에 개시하는 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 투여함을 추가로 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 약제는 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하거나, 또는 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하거나, 또는 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시키기 위한 것이다. 추가의 실시태양에서, 상기 약제는 개인에게 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하거나, 또는 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하거나, 또는 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시키기에 유효한 양의 상기 약제를 투여함을 포함하는, 상기 개인에서 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유발된 세포독성을 억제하거나, 또는 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하거나, 또는 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 "개인"은 인간일 수 있다.
추가의 태양에서, 본 발명은 파킨슨병의 치료 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 방법은 상기와 같은 파킨슨병이 있는 개인에게 유효량의 항-인간 알파-시누클레인 항체를 투여함을 포함한다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 상기 방법은 상기 개인에게 유효량의, 하기에 개시하는 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 투여함을 추가로 포함한다. 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 "개인"은 인간일 수 있다.
추가의 태양에서, 본 발명은 개인에서 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하거나, 또는 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하거나, 또는 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 방법은 상기 개인에게 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유발된 세포독성을 억제하거나, 또는 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하거나, 또는 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시키기에 유효한 양의 항-인간 알파-시누클레인 항체를 투여함을 포함한다. 하나의 실시태양에서, "개인"은 인간이다.
추가의 태양에서, 본 발명은 예를 들어 상기 치료 방법들 중 어느 하나에 사용하기 위한, 본 발명에 제공된 항-인간 알파-시누클레인 항체 중 어느 하나를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 약학 제형은 본 발명에 제공된 항-인간 알파-시누클레인 항체 중 어느 하나 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약학 제형은 본 발명에 제공된 항-인간 알파-시누클레인 항체 중 어느 하나, 및 예를 들어 하기에 개시하는 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체를 치료법에서 단독으로 또는 다른 작용제들과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 적어도 하나의 추가적인 치료제와 함께 투여할 수 있다.
상기에 나타낸 상기와 같은 복합 요법은 병행 투여(이때 2개 이상의 치료제를 동일한 또는 별도의 제형 중에 포함시킨다), 및 별도 투여(이 경우에 본 발명의 항체의 투여를 추가적인 치료제 또는 치료제들의 투여 전에, 상기 투여와 동시에, 및/또는 상기 투여에 이어서 수행할 수 있다)를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항-인간 알파-시누클레인 항체의 투여 및 추가적인 치료제의 투여는 서로 약 1개월 이내에, 또는 약 1, 2 또는 3주 이내에, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일 이내에 일어난다.
본 발명의 항체(및 임의의 추가적인 치료제)를 임의의 적합한 수단, 예를 들어 비경구, 폐내 및 비내, 및 국소 치료를 원하는 경우, 병변내 투여에 의해 투여할 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 부분적으로 투여가 짧은지 또는 만성적인지에 따라, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 본 발명에서는 비제한적으로 다양한 시점들에 걸친 단일 또는 수회 투여, 일시 투여, 및 펄스 주입을 포함한 다양한 투여 스케줄이 고려된다.
본 발명의 항체를 양호한 의학적 실행과 일관되는 방식으로 제형화하고, 복용시키고, 투여할 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 인자들은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개인 환자의 임상적 조건, 질환의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 인자들을 포함한다. 상기 항체는 문제의 질환을 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와, 필요하지는 않지만, 임의로 제형화한다. 상기와 같은 다른 작용제의 유효량은 상기 제형 중에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 치료제의 유형, 및 상기에 논의된 다른 인자들에 따라 변한다. 이들은 본 발명에 개시된 바와 동일한 투여량으로 및 투여 경로에 따라, 또는 본 발명에 개시된 투여량의 대략 1 내지 99%, 또는 실험적으로/임상적으로 적합한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 및 임의의 경로에 의해 일반적으로 사용된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해서, 본 발명의 항체의 적합한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 함께 사용될 때)은 치료되는 질병의 유형, 항체의 유형, 상기 질병의 중증도 및 과정, 상기 항체가 예방 또는 치료 목적으로 사용되는지의 여부, 선행 치료법, 환자의 임상 병력 및 상기 항체에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 변할 것이다. 상기 항체를 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여한다. 상기 질병의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/㎏ 내지 15 ㎎/㎏(예를 들어 0.5 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏)의 항체가, 예를 들어 1회 이상의 분리 투여에 의한 것이든 또는 연속 주입에 의한 것이든 간에, 상기 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 임의의 전형적인 1일 투여량은 상기 언급한 인자들에 따라 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸쳐 반복된 투여를 위해서, 상기 조건에 따라, 상기 치료를 일반적으로는 질병 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 지속할 수 있다. 상기 항체의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏(또는 이들의 임의의 조합)의 1회 이상의 용량을 상기 환자에게 투여할 수 있다. 상기와 같은 용량을 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다(예를 들어 상기 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 상기 항체를 수령하도록) 투여할 수 있다. 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서 하나 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수도 있다. 그러나, 다른 복용 섭생이 유용할 수도 있다. 상기 치료법의 진행을 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터한다.
상기 제형들 및 치료 방법들 중 어느 하나를 항-인간 알파-시누클레인 항체 대신에 또는 상기 항체 외에 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행할 수 있는 것으로 생각된다.
III. 제조 물품
본 발명의 또 다른 태양에서, 상술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품을 제공한다. 상기 제조 물품은 용기 및 상기 용기 상의 또는 상기 용기와 결합된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질들, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로, 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 함께 유지하며 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들어 상기 용기는 정맥내 용액 주머니 또는 피하주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 상기 조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체이다. 상기 표지 또는 패키지 삽입물은 상기 조성물이 선택 상태의 치료에 사용됨을 가리킨다. 더욱이, 상기 제조 물품은 (a) 조성물이 함유된 제1 용기(여기에서 상기 조성물은 본 발명의 항체를 포함한다); 및 (b) 조성물이 함유된 제2 용기(여기에서 상기 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시태양에서 제조 물품은 상기 조성물을 사용하여 특정 상태를 치료할 수 있음을 가리키는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 제조 물품은 약학적으로 허용 가능한 완충제, 예를 들어 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 물품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직할 수 있는 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수도 있다.
상기 제조 물품 중 임의의 물품이 항-인간 알파-시누클레인 항체 대신에 또는 상기 항체 외에 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 생각된다.
IV. 구체적인 실시태양
1. 인간 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하는 항체로, 상기 항체는
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) LUHMES 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시킨다.
2. 1항에 따른 항체로, 카스파제 활성이 카스파제 3 및/또는 카스파제 7 활성임을 특징으로 하는 항체.
3. 1항 또는 2항에 따른 항체로, 시누클레인병증의 치료에 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 항체.
4. 3항에 따른 항체로, 파킨슨병의 치료에 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 항체.
5. 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 아미노산 서열 GKNEEGAPQEG(서열번호 1)로 이루어지는 펩타이드에 특이적으로 결합함을 특징으로 하는 항체.
6. 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 10E-09M 미만 10E-07M 초과의 단량체성 인간 알파-시누클레인에 대한 결합 친화성을 가짐을 특징으로 하는 항체.
7. 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 단량체성 및 올리고머성 인간 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하고 섬유성 인간 알파-시누클레인에는 결합하지 않음을 특징으로 하는 항체.
8. 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 중쇄 가변 도메인에 서열번호 2 내지 4의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 5 내지 7의 HVR을 포함함을 특징으로 하는 항체.
9. 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 중쇄 가변 도메인에 서열번호 8, 9 및 4의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 10 내지 12의 HVR을 포함함을 특징으로 하는 항체.
10. 8항 또는 9항에 따른 항체로, 서열번호 13으로 이루어지는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 14로 이루어지는 경쇄 가변 도메인을 포함함을 특징으로 하는 항체.
11. 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 서열번호 13으로 이루어지는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 14로 이루어지는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 인간화시킴으로써 획득되었음을 특징으로 하는 항체.
12. 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인에 서열번호 2 내지 4의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 5 내지 7의 HVR을 포함하고, 여기에서 각각의 HVR 중에 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있음을 특징으로 하는 항체.
13. 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인에 서열번호 8, 9 및 4의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 10 내지 12의 HVR을 포함하고, 여기에서 각각의 HVR 중에 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있음을 특징으로 하는 항체.
14. 1항 내지 7항, 12항 및 13항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 인간화된 항체이고 중쇄 가변 도메인이 서열번호 13으로 이루어지는 중쇄 가변 도메인(으로부터 유래된)의 인간화된 형태이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 14로 이루어지는 경쇄 가변 도메인(으로부터 유래된)의 인간화된 형태임을 특징으로 하는 항체.
15. 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 중쇄에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합함을 특징으로 하는 항체.
16. 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 중쇄에 서열번호 21, 22 및 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 23 내지 25의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합함을 특징으로 하는 항체.
17. 15항 또는 16항에 따른 항체로, 서열번호 26으로 이루어지는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 27로 이루어지는 경쇄 가변 도메인을 포함함을 특징으로 하는 항체.
18. 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 서열번호 26으로 이루어지는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 27로 이루어지는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 인간화시킴으로써 획득되었음을 특징으로 하는 항체.
19. 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하고, 여기에서 각각의 HVR 중에 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있음을 특징으로 하는 항체.
20. 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인에 서열번호 21, 22 및 17의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 23 내지 25의 HVR을 포함하고, 여기에서 각각의 HVR 중에 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있음을 특징으로 하는 항체.
21. 1항 내지 4항, 19항 및 20항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 인간화된 항체이고 중쇄 가변 도메인이 서열번호 26으로 이루어지는 중쇄 가변 도메인(으로부터 유래된)의 인간화된 형태이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 27로 이루어지는 경쇄 가변 도메인(으로부터 유래된)의 인간화된 형태임을 특징으로 하는 항체.
22. 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 중쇄에 서열번호 28 내지 30의 HVR 및 경쇄에 서열번호 31 내지 33의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합함을 특징으로 하는 항체.
23. 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 중쇄에 서열번호 28, 34 및 30의 HVR 및 경쇄에 서열번호 35 내지 37의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합함을 특징으로 하는 항체.
24. 22항 또는 23항에 따른 항체로, 서열번호 38로 이루어지는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 39로 이루어지는 경쇄 가변 도메인을 포함함을 특징으로 하는 항체.
25. 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 서열번호 38로 이루어지는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 39로 이루어지는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 인간화시킴으로써 획득되었음을 특징으로 하는 항체.
26. 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인에 서열번호 28 내지 30의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 31 내지 33의 HVR을 포함하고, 여기에서 각각의 HVR 중에 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있음을 특징으로 하는 항체.
27. 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인에 서열번호 28, 34 및 30의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 35 내지 37의 HVR을 포함하고, 여기에서 각각의 HVR 중에 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있음을 특징으로 하는 항체.
28. 1항 내지 4항, 26항 및 27항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 인간화된 항체이고 중쇄 가변 도메인이 서열번호 38로 이루어지는 중쇄 가변 도메인(으로부터 유래된)의 인간화된 형태이고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 39로 이루어지는 경쇄 가변 도메인(으로부터 유래된)의 인간화된 형태임을 특징으로 하는 항체.
29. 1항 내지 4항 및 15항 내지 28항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 섬유성 인간 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하며 비-섬유성 인간 알파-시누클레인에는 결합하지 않음을 특징으로 하는 항체.
30. 1항 내지 29항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈에 접합됨을 특징으로 하는 항체.
31. 30항에 따른 항체로, 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈이 LRP1, LRP8, 인간 트랜스페린 수용체 또는 인간 인슐린-유사 성장인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편임을 특징으로 하는 항체.
32. 1항 내지 31항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 단클론 항체임을 특징으로 하는 항체.
33. 1항 내지 32항 중 어느 한 항에 따른 항체로, 인간화된 항체 또는 키메릭 항체임을 특징으로 하는 항체.
34. 1항 내지 33항 중 어느 한 항에 따른 항체로,
인간 알파-시누클레인에 결합하고
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) LUHMES 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시키는
항체 단편임을 특징으로 하는 항체.
35. 1항 내지 34항 중 어느 한 항에 따른 항체로,
a) 인간 하위부류 IgG1의 전장 항체, 또는
b) 인간 하위부류 IgG4의 전장 항체, 또는
c) 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는 인간 하위부류 IgG1의 전장 항체,
d) 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G를 갖는 인간 하위부류 IgG4의 전장 항체,
e) 2개의 중쇄 모두에 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G 및 하나의 중쇄에 돌연변이 T366W 및 S354C 및 각각의 다른 중쇄에 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 하위부류 IgG1의 전장 항체, 또는
f) 2개의 중쇄 모두에 돌연변이 S228P 및 P329G 및 하나의 중쇄에 돌연변이 T366W 및 S354C 및 각각의 다른 중쇄에 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 하위부류 IgG4의 전장 항체
임을 특징으로 하는 항체.
36. 1항 내지 35항 중 어느 한 항에 따른 항체를 암호화하는 단리된 핵산.
37. 36항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
38. 항체를 생산하도록 37항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체의 생성 방법.
39. 38항에 따른 방법으로, 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
40. 1항 내지 35항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 제형.
41. 40항에 따른 약학 제형으로, 추가의 치료제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 약학 제형.
42. 약제로서 사용하기 위한 1항 내지 35항 중 어느 한 항에 따른 항체.
43. 시누클레인병증의 치료에 사용하기 위한 1항 내지 35항 중 어느 한 항에 따른 항체.
44. 파킨슨병의 치료에 사용하기 위한 1항 내지 35항 중 어느 한 항에 따른 항체.
45. 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유발된 세포독성을 억제하는데 사용하기 위한 1항 내지 35항 중 어느 한 항에 따른 항체.
46. 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하는데 사용하기 위한 1항 내지 35항 중 어느 한 항에 따른 항체.
47. 뉴런 세포 또는 신경교 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시키는데 사용하기 위한 1항 내지 35항 중 어느 한 항에 따른 항체.
48. 약제의 제조에서 1항 내지 35항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
49. 48항의 용도에서, 약제가 파킨슨병 치료용인 용도.
50. 48항의 용도에서, 약제가 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유발된 세포독성의 억제용인 용도.
51. 48항의 용도에서, 약제가 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달의 억제용인 용도.
52. 48항의 용도에서, 약제가 뉴런 세포 또는 신경교 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성의 감소용인 용도.
53. 파킨슨병이 있는 개인에게 유효량의 1항 내지 35항 중 어느 한 항에 따른 항체를 투여함을 포함하는 상기 개인의 치료 방법.
54. 개인에게 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하기에 유효한 양의 1항 내지 35항 중 어느 한 항에 따른 항체를 투여함을 포함하는, 상기 개인에서 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하는 방법.
55. 개인에게 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하기에 유효한 양의 1항 내지 35항 중 어느 한 항에 따른 항체를 투여함을 포함하는, 상기 개인에서 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하는 방법.
56. 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성의 억제에서 1항 내지 35항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 알파 시누클레인 항체의 용도.
57. 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달의 억제에서 1항 내지 35항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 알파 시누클레인 항체의 용도.
58. 뉴런 세포 또는 신경교 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성의 감소에서 1항 내지 35항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 알파 시누클레인 항체의 용도.
59. 인간 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하고,
i) (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 및
ii) (a) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 및
iii) (a) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 및
iv) (a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 및
v) (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 및
vi) (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
중에서 선택된 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 셋 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 항체.
60. 인간 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하고, VH HVR 서열로서
i) (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 또는
ii) (a) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 또는
iii) (a) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 또는
iv) (a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 또는
v) (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 또는
vi) (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
을 포함하는 항체.
61. 59항 또는 60항에 따른 항체로,
i) (a) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
ii) (a) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
iii) (a) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
iv) (a) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
v) (a) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
vi) (a) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
중에서 선택된 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 셋 모두의 VL HVR 서열을 또한 포함함을 특징으로 하는 항체.
62. 60항에 따른 항체로, VL HVR 서열로서
i) (a) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
ii) (a) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
iii) (a) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
iv) (a) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
v) (a) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
vi) (a) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 또한 포함함을 특징으로 하는 항체.
63. 인간 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하고, HVR 서열로서
i) (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는
ii) (a) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는
iii) (a) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는
iv) (a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는
v) (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는
vi) (a) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
을 포함하는 항체.
64. 인간 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하는 항체에서, 상기 인간 알파-시누클레인이 유리 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는 항체.
65. 64항에 따른 항체에서, 인간 및 마우스 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하며, 여기에서 상기 인간 및 마우스 알파-시누클레인이 자유 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는 항체.
66. 64항 또는 65항에 따른 항체에서, 알파-시누클레인이 단량체성 알파-시누클레인인 항체.
67. 64항 또는 65항에 따른 항체에서, 알파-시누클레인이 올리고머성 알파-시누클레인인 항체.
68. 64항 내지 67항 중 어느 한 항에 따른 항체에서, 알파-시누클레인이 단량체성 및 올리고머성 알파-시누클레인인 항체.
69. 64항 내지 68항 중 어느 한 항에 따른 항체에서, 중쇄에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
70. 64항 내지 69항 중 어느 한 항에 따른 항체에서, 중쇄에 서열번호 21, 22 및 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 23 내지 25의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
71. 64항 내지 70항 중 어느 한 항에 따른 항체에서, 서열번호 26의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 27의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
72. 64항 내지 68항 중 어느 한 항에 따른 항체에서, 중쇄에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하는 항체.
73. 64항 내지 68항 중 어느 한 항에 따른 항체에서, 중쇄에 서열번호 21, 22 및 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 23 내지 25의 HVR을 포함하는 항체.
74. 64항 내지 68항 중 어느 한 항에 따른 항체에서, 서열번호 26의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 27의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 인간화시킴으로써 획득된 항체.
75. 64항 내지 68항 중 어느 한 항에 따른 항체에서, 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하고, 여기에서 각각의 HVR 중에 0 내지 3개의 아미노산 잔기가 변화된 항체.
76. 64항 내지 68항 중 어느 한 항에 따른 항체에서, 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인에 서열번호 21, 22 및 17의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 23 내지 25의 HVR을 포함하고, 여기에서 각각의 HVR 중에 0 내지 3개의 아미노산 잔기가 변화된 항체.
77. 64항 내지 68항 중 어느 한 항에 따른 항체에서, 인간화된 항체이고 중쇄 가변 도메인이 서열번호 26의 중쇄 가변 도메인으로부터 유래되고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 27의 경쇄 가변 도메인으로부터 유래된 항체.
78. 중쇄에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
79. 중쇄에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하는 항체.
80. 중쇄에 서열번호 21, 22 및 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 23 내지 25의 HVR을 포함하는 항체.
81. 서열번호 26의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 27의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체로부터 획득된 (변형) 항체.
82. 64항 내지 68항 중 어느 한 항에 따른 항체에서, 서열번호 26의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 27의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 인간화시킴으로써 획득된 인간화된 항체인 항체.
83. 중쇄 가변 도메인에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하는 (인간화된) 항체이고, 여기에서 각각의 HVR 중에 0 내지 3개의 아미노산 잔기가 변화된 (인간화된) 항체.
84. 중쇄 가변 도메인에 서열번호 21, 22 및 17의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 23 내지 25의 HVR을 포함하는 (인간화된) 항체이고, 여기에서 각각의 HVR 중에 0 내지 3개의 아미노산 잔기가 변화된 (인간화된) 항체.
85. 중쇄 가변 도메인이 서열번호 26의 중쇄 가변 도메인으로부터 유래되고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 27의 경쇄 가변 도메인으로부터 유래되는 (인간화된) 항체.
86. 64항 내지 85항 중 어느 한 항에 따른 항체에서, 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈에 접합된 항체.
87. 86항에 따른 항체에서, 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈이 LRP1, LRP8, 인간 트랜스페린 수용체 또는 인간 인슐린-유사 성장인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편인 항체.
88. 64항 내지 87항 중 어느 한 항에 따른 항체에서, 단클론 항체인 항체.
89. 64항 내지 88항 중 어느 한 항에 따른 항체에서, 인간화된 항체 또는 키메릭 항체인 항체.
90. 64항 내지 89항 중 어느 한 항에 따른 항체에서,
a) 인간 하위부류 IgG1의 전장 항체, 또는
b) 인간 하위부류 IgG4의 전장 항체, 또는
c) 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는 인간 하위부류 IgG1의 전장 항체,
d) 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G를 갖는 인간 하위부류 IgG4의 전장 항체,
e) 2개의 중쇄 모두에 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G 및 하나의 중쇄에 돌연변이 T366W 및 S354C 및 각각의 다른 중쇄에 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 하위부류 IgG1의 전장 항체, 또는
f) 2개의 중쇄 모두에 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G 및 하나의 중쇄에 돌연변이 T366W 및 S354C 및 각각의 다른 중쇄에 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 하위부류 IgG4의 전장 항체
인 항체.
91. a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역임
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체.
92. a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역임
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체.
93. a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 26의 비-인간(토끼) 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 27의 비-인간(토끼) 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역임
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체.
94. a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역임
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체.
95. a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역임
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체.
96. a) 항체가 2개의 항체 중쇄를 포함하고 각각의 상기 중쇄가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 26의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
b) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 27의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역임
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체.
97. a) 항체가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하는 제1 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 T366W 및 S354C 또는 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
b) 상기 항체가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 제2 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하거나, 또는 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
c) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역임
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체.
98. a) 항체가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하는 제1 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 T366W 및 S354C 또는 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
b) 상기 항체가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 제2 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 17의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하거나, 또는 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
c) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR에서 서로 독립적으로 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기가 변화되며,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역임
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체.
99. a) 항체가 N-에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 또는 scFv 항체 단편을 포함하는 제1 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 26의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 T366W 및 S354C 또는 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
b) 상기 항체가 N- 에서 C-말단 방향으로 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 제2 항체 중쇄를 포함하고, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 26의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역이고, C-말단 리신 잔기가 존재하거나 부재할 수 있으며,
iii) 상기 불변 영역이 아미노산 변화 L234A, L235A 및 P329G를 포함하고,
iv) 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하거나, 또는 상기 불변 영역이, 상기 제1 항체 중쇄가 아미노산 변화 T366W 및 S354C를 포함하는 경우 아미노산 변화 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 포함하며,
c) 상기 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하고 각각의 상기 경쇄가 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기에서
i) 상기 가변 도메인이 서열번호 27의 토끼 가변 도메인의 인간화된 형태이고,
ii) 상기 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역임
을 특징으로 하는 항-인간 알파-시누클레인 항체.
100. 94항 내지 99항 중 어느 한 항에 따른 항체에서, 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 단편이, 서열번호 56의 중쇄 가변 도메인의 인간화된 형태인 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 57의 경쇄 가변 도메인의 인간화된 형태인 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
101. 64항 내지 100항 중 어느 한 항에 따른 항체에서,
i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시키고/시키거나,
iv) 자유 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하고 변형된 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는 알파-시누클레인에는 특이적으로 결합하지 않는
항체.
V. 실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예들이다. 다양한 다른 실시태양들을, 상기에 제공된 일반적인 설명을 제공하여 실행할 수 있는 것으로 생각된다.
실시예 1
물질 및 방법
재조합 DNA 기법
표준 방법을 사용하여 문헌[Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 개시된 바와 같이 DNA를 조작하였다. 분자 생물학 시약을 제조사의 설명서에 따라 사용하였다.
유전자 및 올리고뉴클레오타이드 합성
목적하는 유전자 분절을 진아트 게엠베하(Geneart GmbH)(독일 레겐스브루크 소재)에서 화학 합성에 의해 제조하였다. 상기 합성된 유전자 단편을 증식/증폭을 위해 에스케리키아 콜라이 플라스미드내로 클로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 한편으로, 짧은 합성 DNA 단편을, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드의 어닐링에 의해 또는 PCR을 통해 조립하였다. 각각의 올리고뉴클레오타이드를 메타비온 게엠베하(metabion GmbH)(독일 플라네그-마르틴스리드 소재)에 의해 제조하였다.
시약
모든 상업적인 화학물질, 항체 및 키트를 달리 서술되지 않는 한 제조사의 프로토콜에 따라 제공된 바와 같이 사용하였다.
세포 클론
항체 0017 = ASYN-233HC_110-IV = aSyn.S019.006A08
항체 0018 = ASYN-064HC_110-II = aSyn.S003.006A11
항체 0081 = ASYN-235HC_110-IV = aSyn.S019.005A08
항체 0070 = 항체 0017 + 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈
항체 0076 = 항체 0018 + 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈
실시예 1
항원의 제조
물질
단백질:
- 동결건조된 인간 야생형 알파-시누클레인(100 ㎍, 200 ㎍, 또는 500 ㎍ 분액);
- 인간 돌연변이 TP 알파-시누클레인(8.2 ㎎/㎖, 50 mM HEPES/100 mM NaCl에서 투석됨)
완충제 및 용액(실온에서 보관되고 직사광선 노출로부터 보호됨):
- PB 모액(5x): 250 mM 포스페이트 완충제, pH 7.0(0.22 ㎛ 여과됨)
- EtOH 모액: 절대 에탄올 분석전 등급(EMSURE)(메르크(Merck); 카탈로그 번호 1.00989.1000)
- HPLC 등급 수(리크로솔브(LiChrosolv), 메르크)
- 50 mM HEPES/100 mM NaCl, pH 7.4(0.22 ㎛ 여과됨)
- TBS(50 mM 트리스/100 mM NaCl) pH 7.0(0.22 ㎛ 여과됨)
- BioPORTER 단백질 전달 시약(겔란티스(Genlantis), 카탈로그 번호 BP502424)
A1-올리고머의 제조
문헌[Danzer, K.M., et al., J. Neurosci. 27 (2007) 9220-9232], 및 문헌[Danzer, K.M., et al., J. Neurochem. 111 (2009) 192-203]을 참조하시오.
동결건조된 알파-시누클레인을 HPLC 수에 용해시켜 알파-시누클레인 중의 약 70 μM 용액(100 ㎍ 단백질당 100 ㎕)을 수득하였다. 상기 용액을 30초 동안 튜브 부유 장치를 사용하여 수욕 초음파기에서 초음파 처리하였다. 그 후에 500 ㎕의 HPLC 등급 수, 200 ㎕의 250 mM PB pH 7.0, 200 ㎕의 분석전 절대 EtOH을 가하였다. 상기 혼합물을 10초 동안 최대 속도로 와동시켰다. 그 후에 50 mM PB pH 7.0/20% 에탄올 중의 100 ㎍/㎖의 알파-시누클레인 용액이 생성되었다. 비교 샘플용으로 알파-시누클레인 부재하의 동일 완충제를 혼합하였다. 상기 용액을 실온에서 뉴테이터(nutator)상에서 4시간 동안 진탕시켰다. 진탕 후 상기 용액을 드라이-아이스상에서 즉시 동결건조를 위해 동결시켰다. 상기 동결건조를 일정한 회전하에(예를 들어 스피드백(Speedvac)에서) 실온에서 밤새 수행하였다. 상기 동결건조물을 10% 에탄올과 함께 0.5 ㎖의 50 mM PB pH 7.0 중에 재현탁시켰다. 상기 에탄올을 뚜껑이 열린 흄 후드(에펜도르프 써모믹서(Eppendorf Thermomixer) 5436, 속도 5)에서 24시간 동안 20 내지 21 ℃에서 증발시켰다. 그 후에 뚜껑을 닫고 실온에서 6일 동안 계속 진탕시켰다. A1-올리고머를 비바스핀(Vivaspin) 500(30 kD 컷오프)으로 1 ㎎/㎖ 까지 농축시키고 면역화를 위해 모았다. 장기간 보관을 위해서 상기 올리고머를 -80 ℃에서 유지시켰다. 적합한 올리고머 형성을 위한 품질 조절을 SDS-PAGE 및 EM에 의해 수행하였다.
C1-올리고머의 제조
문헌[Danzer, K.M., et al., J. Neurosci. 27 (2007) 9220-9232], 및 문헌[Danzer, K.M., et al., J. Neurochem. 111 (2009) 192-203]을 참조하시오.
동결건조된 알파-시누클레인을 HPLC 등급 수에 용해시켜 약 70 μM 농도의 용액(100 ㎍ 단백질당 100 ㎕)을 수득하였다. 상기 용액을 30초 동안 튜브 부유 장치를 사용하여 수욕 초음파기에서 초음파 처리하였다. 그 후에 500 ㎕의 HPLC 등급 수, 200 ㎕의 250 mM PB pH 7.0, 200 ㎕의 분석전 절대 에탄올을 가하였다. 상기 혼합물을 10초 동안 최대 속도로 와동시켰다. 50 mM PB pH 7.0/20% 에탄올 중의 100 ㎍/㎖의 알파-시누클레인 용액이 생성되었다. 대조용 샘플용으로 알파-시누클레인 부재하의 동일 완충제를 혼합하였다. 상기 용액을 실온에서 뉴테이터상에서 16시간 동안(예를 들어 밤새) 진탕시켰다. C1-올리고머를 비바스핀 500(30 kD 컷오프)으로 1 ㎎/㎖까지 농축시키고 면역화를 위해 모았다. 장기간 보관을 위해서 상기 올리고머를 -80 ℃에서 유지시켰다. 적합한 올리고머 형성을 위한 품질 조절을 SDS-PAGE 및 EM에 의해 수행하였다.
TP 돌연변이 알파- 시누클레인 올리고머의 제조
문헌[Karpinar, D.P., et al., EMBO J. 28 (2009) 3256-3268]으로부터 적합하게 하였다.
50 mM HEPES/100 mM NaCl pH 7.4 중의 8.2 ㎎/㎖(약 590 mM) TP 알파-시누클레인 100 ㎕ 분액을 37 ℃(200 rpm)에서 6일 동안 2 x 5 ㎜ 미세 자기 교반막대로 교반하였다. 적합한 올리고머 형성을 위한 품질 조절을 SDS-PAGE 및 EM에 의해 수행하였다.
알파- 시누클레인 피브릴 형성 및 BioPORTER와의 혼합
문헌[Adapted from to Luk, K.C., et al., Biochem. 46 (2007) 12522-12526], 및 문헌[Luk, K.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009) 20051-20056]으로부터 적합하게 하였다.
동결건조되고 진공처리된 알파-시누클레인 분액(-80 ℃로부터)을 진공 주머니의 개방 없이 10 내지 15분 동안 실온(RT)으로 만들었다. 이러는 동안 오비탈 튜브 믹서를 37 ℃로 예열하였다. 그 후에 상기 튜브를 함유하는 주머니를 개방하고 필요한 경우 상기 튜브 밖의 물방울을 닦아내었다. 100 ㎍의 동결건조된 알파-시누클레인을 100 ㎕ TBS pH 7에 용해시켰다. 상기 튜브를 오비탈 튜브 믹서에 넣고 37 ℃/1000 rpm에서 96시간 동안 배양하였다. 그 후에 상기 튜브를 실온에서 10분 동안 최대 속도(20,000 g)로 회전시켰다. 상기 상등액 중 90 ㎕를 제거하였다. 펠릿을 90 ㎕의 신선한 TBS(약 1 ㎎/㎖ 농도로 추정됨)로 재현탁하였다. 적합한 피브릴 형성에 대한 품질 조절을 SDS-PAGE 및 EM에 의해 수행하였다. 장기간 보관을 위해서 상기 샘플을 -80 ℃에서 유지시켰다.
면역화 직전에 1 ㎎/㎖ 웰 현탁된 피브릴 100 ㎕를 20 ㎕ BioPORTER 시약 건조-필름에 가하고 와동 및 수욕 초음파처리에 의해 격렬히 혼합하였다. 상기 용액을 면역화에 사용하기 전에 실온에서 10분 동안 배양하였다.
실시예 2
토끼의 면역화
3마리의 뉴질랜드 백색 토끼를 알파-시누클레인 C1 올리고머, 알파-시누클레인 피브릴 및 알파-시누클레인 TP 돌연변이 올리고머(1차 면역화를 위한 각 성분 400 ㎍; 연속적인 면역화를 위한 각 성분 200 ㎍; 제조는 실시예 1을 참조하시오)의 혼합물로 면역화시켰다. 동물은 완전 프로인트 항원보강제로 유화시킨 면역원을, 0일째에 피내 적용에 의해서 및 7, 14, 35, 63 및 91일째에 교번하는 근육내 및 피하 적용에 의해 수령하였다. 혈액(평가된 전혈 부피의 10%)을 21, 41, 69 및 97일째에 채혈하였다. 혈청을 제조하고, 이를 ELISA에 의한 역가 측정에 사용하였다(하기 참조). 말초 단핵세포를 단리하고, 이를 B-세포 클로닝 과정에서 항원-특이성 B-세포의 공급원으로서 사용하였다(실시예 3 및 4).
혈청 역가의 측정
역가를 상기 면역원 혼합물의 각 성분에 대해서 별도로 측정하였다. 알파-시누클레인 C1 올리고머, 알파-시누클레인 피브릴 및 알파-시누클레인 TP 돌연변이 올리고머를 PBS(포스페이트 완충된 염수 용액) 중에서, 0.6 ㎍/㎖, 100 ㎕/웰로 96-웰 눙크 맥시솝(Maxisorb) 플레이트상에 고정화시킨 다음; 상기 플레이트를 PBS 중의 2% 크로테인C(CroteinC) 200 ㎕/웰로 차단시키고; PBS 중의 0.5% 크로테인C 중의 일련의 항혈청 희석액, 100 ㎕/웰을 중복 적용하고; PBS 중의 0.5% 크로테인C 중의 1:16,000 희석된 HRP-접합된(양고추냉이 퍼옥사다제-접합된) 당나귀 항-토끼 IgG 항체(잭슨 임뮤노리써치(Jackson Immunoresearch)) 100 ㎕/웰로 검출하였다. 모든 단계에 대해서, 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 모든 단계 사이에서, 플레이트를 PBS 중의 0.05% 트윈 20으로 3회 세척하였다. 신호를 용해성 BM 블루 POD 기질(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH), 독일 만하임 소재), 100 ㎕/웰의 첨가에 의해 발생시키고, 1M HCl, 100 ㎕/웰의 첨가에 의해 정지시켰다. 흡광도를 기준으로서 690 ㎚에 대해, 450 ㎚에서 판독하였다. 역가는 최대절반 신호를 생성시키는 항혈청의 희석으로서 정의되었다.
실시예 3
항-인간 알파-시누클레인 항체 생산 B-세포의 단리
토끼 말초 혈액 단핵세포(PBMC)의 단리
3마리의 토끼(실시예 2에 개시된)를 혈액의 공급원으로서 사용하였다. EDTA 함유 전혈을 1xPBS(포스페이트 완충 염수; PAA, 오스트리아 파싱 소재)로 2배 희석한 후에 제조사의 명세서에 따라 림프분해성(lympholyte) 포유동물(체다레인 레보라토리즈(Cedarlane Laboratories), 캐나다 온타리오주 벌링톤 소재)을 사용하여 밀도 원심분리시켰다. 상기 PBMC를 1xPBS로 2회 세척하였다.
EL -4 B5 배지
10% FCS(하이클론(Hyclone), 미국 유타주 로간 소재), 2 mM 글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(PAA, 오스트리아 파싱 소재), 2 mM 나트륨 피루베이트, 10 mM HEPES(PAN 바이오테크(Biotech), 독일 아이덴바흐 소재) 및 0.05 mM β-머캅토에탄올(깁코, 스코틀랜드 페이슬리 소재)이 보충된 RPMI 1640(판 파이오테크(Pan Biotech), 독일 아이덴바흐 소재).
대식세포/ 단핵세포의 고갈
멸균 6-웰 플레이트(세포 배양 등급)를 사용하여 비특이적 부착을 통해 대식세포 및 단핵세포를 고갈시켰다. 각 웰을 4 ㎖ 배지 및 상기 면역된 토끼로부터 6x106 이하의 PBMC로 최대로 충전하고 배양기에서 37 ℃에서 1시간 동안 결합되게 하였다. 상등액 중의 세포(말초 혈액 림프구(PBL))를 항원 패닝 단계를 위해 사용하였다.
플레이트의 코팅
멸균 세포 배양 6-웰 플레이트를 4 ℃에서 밤새 카보네이트 완충제(0.1M 나트륨 바이카보네이트, 34 mM 이나트륨 수소 카보네이트, pH 9.55) 중의 2개의 상이한 인간 알파-시누클레인 올리고머(1 ㎍/㎖ C1 올리고머 및 1 ㎍/㎖ TP 돌연변이 올리고머)의 혼합물로 코팅하였다. 플레이트를 사용 전에 멸균 PBS로 3회 세척하였다.
인간 알파- 시누클레인 올리고머에 대한 B-세포의 농축
인간 알파-시누클레인 올리고머로 코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트를 배지 4 ㎖ 당 6x106 이하의 PBL로 시딩하고 배양기에서 37 ℃에서 1시간 동안 결합되게 하였다. 상기 알파-시누클레인 올리고머에 대한 농축 단계 후에, 부착되지 않은 세포를, 상기 웰을 1xPBS로 1 내지 2회 조심스럽게 세척하여 제거하였다. 남아있는 점착성 세포를 배양기에서 37 ℃에서 10분 동안 트립신에 의해 탈착시켰다. 트립신처리를 EL-4 B5 배지로 정지시켰다. 상기 세포를 면역 형광 염색시까지 얼음상에서 유지시켰다.
면역 형광 염색 및 유식 세포측정
항-IgG 항체 FITC 접합체(AbD 세로텍(Serotec), 독일 뒤셀도르프 소재)를 단세포 분류에 사용하였다. 표면 염색을 위해서, 상기 고갈 및 농축 단계로부터의 세포를 PBS 중의 항-IgG 항체 FITC 접합체와 함께 배양하고 암실에서 4 ℃에서 45분 동안 배양하였다. 염색 후에 상기 PBMC를 빙냉 PBS로 2배 세척하였다. 최종적으로 상기 PBMC를 빙냉 PBS 중에 재현탁시키고 즉시 FACS 분석을 수행하였다. 5 ㎍/㎖ 농도의 프로피디움 요오다이드(BD 파밍겐(Pharmingen), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 상기 FACS 분석전에 가하여 죽은 세포와 생세포를 구분하였다.
컴퓨터 및 FACSDiva 소프트웨어(BD 바이오사이언시즈, 미국 소재)가 구비된 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) FACSAria를 단세포 분류에 사용하였다.
B-세포 배양
토끼 B-세포의 배양물을 문헌[Zubler et al. , J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183]에 개시된 바와 유사한 방법에 의해 제조하였다. 간단히, 단세포 분류된 토끼 B-세포를 96-웰 플레이트에서 판솔빈(Pansorbin) 세포(1:100000)(칼바이오켐(Calbiochem)(메르크), 독일 다름스타트 소재), 5% 토끼 흉선세포 상등액(충전물 20100908, 사내 생산) 및 감마-조사된 쥐 EL-4-B5 흉선종 세포(2.5x104/웰)를 함유하는 200 ㎕/웰 EL-4 B5 배지와 함께 5% CO2 하에 37 ℃에서 7일 동안 배양하였다. 상기 B-세포 배양물의 상등액을 선별을 위해 제거하였다. 병행하여, 남아있는 세포의 mRNA를 100 ㎕ RLT 완충제(퀴아겐(Qiagen), 독일 힐덴 소재) 중에서 즉시 보존하고, 용해물을 -80 ℃에서 동결시켰다.
실시예 4
항체 가변 도메인 암호화 핵산의 측정
V-도메인의 PCR 증폭 및 서열분석
전체 RNA를 제조사의 프로토콜에 따라 뉴클레오스핀(NucleoSpin) 8/96 RNA 키트(마슈레이&나겔(Macherey&Nagel); 카탈로그 번호 740709.4, 740698)를 사용하여 제조하였다. 모든 단계를 epMotion 5075 액체 처리 시스템(에펜도르프)상에서 수행하였다. RNA를 60 ㎕의 RNAse 자유수로 용리시켰다. 6 ㎕의 RNA를 사용하여, 제조사의 설명서에 따라 슈퍼스크립트 III 퍼스트-스트랜드 신세시스 슈퍼믹스(Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix)(인비트로젠; 카탈로그 번호 18080-400) 및 올리고 dT-프라이머를 사용하여 역 트랜스크립타제 반응에 의해 cDNA를 생성시켰다. 4 ㎕의 cDNA를 사용하여, 중쇄의 경우 프라이머 rbHCfinal.up(AAGCTTGCCACCATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTC; 서열번호 42) 및 rbHCfinal.do(CCATTGGTGAGGGTGCCCGAG; 서열번호 43) 및 경쇄의 경우 rbLCfinal.up(AAGCTTGCCACCATGGACAYGAGGGCCCCCACTC; 서열번호 44) 및 rbLCfinal.do(CAGAGTRCTGCTGAGGTTGTAGGTAC; 서열번호 45)를 사용하여 50 ㎕의 최종 부피로 애큐프라임 슈퍼믹스(AccuPrime SuperMix)(인비트로젠; 카탈로그 번호 12344-040)로 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역(VH 및 VL)을 증폭시켰다. 상기 PCR 조건은 하기와 같았다: 94 ℃에서 5분 동안 고온 출발; 94 ℃에서 20초, 70 ℃에서 20초, 68 ℃에서 45초의 35 주기, 및 68 ℃에서 7분 동안 최종 연장.
상기 50 ㎕ PCR 용액 중 8 ㎕를 2% 48 E-Gel(인비트로젠; 카탈로그 번호 G8008-02)상에 로딩하였다. 양성 PCR 반응물을 제조사의 프로토콜에 따라 뉴클레오스핀 엑스트랙트(NucleoSpin Extract) II 키트(마슈레이&나겔; 카탈로그 번호 740609250)를 사용하여 세정하고 50 ㎕ 용리 완충제 중에서 용리시켰다. 12 ㎕의 정제된 PCR 산물을, 중쇄의 경우 rbHCfinal.up 및 rbHCfinal.do 및 경쇄의 경우 rbLCfinal.up 및 rbLCfinal.do를 사용하여 양방향으로 직접 서열분석하였다.
실시예 5
토끼 항-인간 알파-시누클레인 항체의 인간화
상기 토끼 항-인간 알파-시누클레인 항체를 표준 기법, 예를 들어 CDR 그래프트화에 따라 인간화시킬 수 있다.
실시예 6
재조합 발현 벡터의 생성
a) 마우스 IgG1 불변 영역을 사용하는 면역글로불린 중쇄 발현용 벡터의 생성
마우스 IgG1 불변 영역(CH1, 힌지, CH2, CH3) 및 토끼로부터 유래된 항-알파 시누클레인-항체 VH 도메인을 포함하는 마우스 IgG1 암호화 융합 유전자를, 상기 각 항-알파-시누클레인-특이성 항체 VH 도메인을 암호화하는 DNA 단편을 상기 마우스 IgG1 불변 영역을 암호화하는 서열 요소에 융합시킴으로써 조립하였다.
상기 마우스 IgG1 불변 영역은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00001
(서열번호 46)
상기 발현 벡터는 또한, 에스케리키아 콜라이에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기원, 및 에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 포함하였다.
상기 항체 중쇄의 전사 단위는 5'에서 3' 방향으로 하기의 기능 요소들을 포함한다:
- 인트론 A를 포함하는 인간 거대세포바이러스(P-CMV)로부터의 초기 인헨서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-번역되지 않은 영역(5'UTR),
- 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 중쇄 가변(VH) 도메인 암호화 핵산,
- 마우스 IgG1 불변 영역 암호화 핵산, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).
b) 마우스 Ig- 카파 불변 영역을 사용하는 면역글로불린 경쇄 발현용 벡터의 생성
마우스 Ig-카파 불변 영역(CL-카파) 및 토끼로부터 유래된 항-알파 시누클레인-항체 VL(카파) 도메인을 포함하는 마우스 카파 경쇄 암호화 융합 유전자를, 상기 각 항-알파-시누클레인-항체 VL(카파) 도메인을 암호화하는 DNA 단편을 상기 마우스 Ig-카파 불변 영역을 암호화하는 서열 요소에 융합시킴으로써 조립하였다.
상기 마우스 Ig-카파 불변 영역은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00002
(서열번호 47)
상기 발현 벡터는 또한, 에스케리키아 콜라이에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기원, 및 에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 포함하였다.
상기 항체 카파 경쇄의 전사 단위는 5'에서 3' 방향으로 하기의 기능 요소들을 포함한다:
- 인트론 A를 포함하는 인간 거대세포바이러스(P-CMV)로부터의 초기 인헨서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-번역되지 않은 영역(5'UTR),
- 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 경쇄 가변(VL) 도메인 암호화 핵산,
- 마우스 Ig-카파 불변 영역 암호화 핵산, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).
c) 마우스 Ig- 람다 불변 영역을 사용하는 면역글로불린 경쇄 발현용 벡터의 생성
마우스 Ig-람다 불변 영역(CL-람다) 및 토끼로부터 유래된 항-알파 시누클레인-항체 VL(람다) 도메인을 포함하는 마우스 람다 경쇄 암호화 융합 유전자를, 상기 각 항-알파-시누클레인-항체 VL(람다) 도메인을 암호화하는 DNA 단편을 상기 마우스 Ig-람다 불변 영역을 암호화하는 서열 요소에 융합시킴으로써 조립하였다.
상기 마우스 Ig-람다 불변 영역은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00003
(서열번호 48)
상기 발현 벡터는 또한, 에스케리키아 콜라이에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기원, 및 에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 포함하였다.
상기 항체 람다 경쇄의 전사 단위는 5'에서 3' 방향으로 하기의 기능 요소들을 포함한다:
- 인트론 A를 포함하는 인간 거대세포바이러스(P-CMV)로부터의 초기 인헨서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-번역되지 않은 영역(5'UTR),
- 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 가변 경쇄(VL) 도메인 암호화 핵산,
- 마우스 Ig-람다 불변 영역 암호화 핵산, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).
d) 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈에 접합된 면역글로불린 쇄 발현용 벡터의 생성
IgG 중쇄 구조물을 암호화하는 발현 벡터의 경우에, 상기 분자의 IgG 부분은 게놈 기구 중에 존재하였다, 즉 인트론이 상기 신호 펩타이드 중에, 상기 VH 및 CH1 도메인 사이에, 상기 CH1 도메인 및 힌지 영역 사이에, 상기 힌지 영역 및 CH2 도메인 사이에, 및 상기 CH2 및 CH3 도메인 사이에 존재하였다. 거기에(C-말단/3' 단부에) 뇌 셔틀 모듈을 암호화하는 cDNA 요소를 융합시켰다. 완전 항체 분자당 단지 하나의 뇌 셔틀 모듈을 갖는 항체 분자를 생성시키기 위해서 "놉-인투-홀" 기술을 사용하였다.
상기 홀-중쇄는 하기의 돌연변이: T366W를 포함한다.
상기 놉-중쇄는 하기의 돌연변이: T366S/L368A/Y407V를 포함한다.
임의로 인공 다이설파이드 결합을 상기 홀-중쇄의 잔기 354 및 상기 놉-중쇄의 잔기 349 사이에 도입시킬 수 있다. 추가로 필요한 돌연변이는 상기 홀-중쇄에서 S354C 및 상기 놉-중쇄에서 Y349C이다.
Ig 경쇄 구조물을 암호화하는 발현 벡터의 경우에, 상기 분자의 Ig-카파 또는 Ig-람다 부분은 게놈 기구 중에 존재하였다, 즉 인트론이 상기 신호 펩타이드 중에 및 상기 VL 및 CL 도메인 사이에 존재하였다.
발현시키고자 하는 목적하는 유전자를 포함하는 발현 단위/카세트 외에, 상기 기본/표준 포유동물 발현 플라스미드는 하기를 함유한다
i) "홀" 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 불변 영역을 사용하는 셔틀 모듈을 함유하는 면역글로불린 중쇄 발현용 벡터의 생성
인간 IgG1 불변 영역(CH1, 힌지, CH2, CH3) 및 토끼로부터 유래된 항-알파 시누클레인-항체 VH 도메인을 포함하는 인간 IgG1 암호화 융합 유전자를, 상기 각 항-알파-시누클레인-항체 VH 도메인을 암호화하는 DNA 단편을 상기 "홀" 돌연변이를 함유하는 인간 IgG1 불변 영역을 암호화하는 서열 요소에 융합시킴으로써 조립하였다. 상기 구조물은 게놈 기구 중에 존재하였다, 즉 인트론이 상기 신호 펩타이드 중에, 상기 VH 및 CH1 도메인 사이에, 상기 CH1 도메인 및 힌지 영역 사이에, 상기 힌지 영역 및 CH2 도메인 사이에, 및 상기 CH2 및 CH3 도메인 사이에 존재하였다.
상기 인간 Ig1 불변 영역은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
(서열번호 49)
상기 인간 Ig1 홀 불변 영역은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
(서열번호 50)
상기 발현 벡터는 또한, 에스케리키아 콜라이에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기원, 및 에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 포함하였다.
상기 홀-항체 중쇄의 전사 단위는 5'에서 3' 방향으로 하기의 기능 요소들을 포함한다:
- 인간 거대세포바이러스(P-CMV)로부터의 초기 인헨서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-번역되지 않은 영역(5'UTR),
- 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 중쇄 가변(VH) 도메인 암호화 핵산,
- "홀" 돌연변이 암호화 핵산을 갖는 인간 IgG1 불변 영역,
- 임의로 뇌-혈액-장벽 셔틀 모듈 암호화 핵산에 융합된 GS-링커 암호화 핵산, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).
ii) "놉" 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 불변 영역을 사용하는 셔틀 모듈을 함유하는 면역글로불린 중쇄 발현용 벡터의 생성
인간 IgG1 불변 영역(CH1, 힌지, CH2, CH3) 및 토끼로부터 유래된 항-알파 시누클레인-항체 VH 도메인을 포함하는 인간 IgG1 암호화 융합 유전자를, 상기 각 항-알파-시누클레인-항체 VH 도메인을 암호화하는 DNA 단편을 상기 "놉" 돌연변이를 함유하는 인간 IgG1 불변 영역을 암호화하는 서열 요소에 융합시킴으로써 조립하였다. 상기 구조물은 게놈 기구 중에 존재하였다, 즉 인트론이 상기 신호 펩타이드 중에, 상기 VH 및 CH1 도메인 사이에, 상기 CH1 도메인 및 힌지 영역 사이에, 상기 힌지 영역 및 CH2 도메인 사이에, 및 상기 CH2 및 CH3 도메인 사이에 존재하였다.
상기 인간 Ig1 놉 불변 영역은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLSC AVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLV SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
(서열번호 51)
상기 발현 벡터는 또한, 에스케리키아 콜라이에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기원, 및 에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 포함하였다.
상기 놉-항체 중쇄의 전사 단위는 5'에서 3' 방향으로 하기의 기능 요소들을 포함한다:
- 인간 거대세포바이러스(P-CMV)로부터의 초기 인헨서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-번역되지 않은 영역(5'UTR),
- 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 중쇄 가변(VH) 도메인 암호화 핵산,
- "놉" 돌연변이 암호화 핵산을 갖는 인간 IgG1 불변 영역,
- 임의로 뇌-혈액-장벽 셔틀 모듈 암호화 핵산에 융합된 GS-링커 암호화 핵산, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).
iii) 인간 Ig- 카파 불변 영역을 사용하는 면역글로불린 카파 경쇄 발현용 벡터의 생성
인간 Ig-카파 불변 영역(CL-카파) 및 토끼로부터 유래된 항-알파 시누클레인-항체 VL(카파) 도메인을 포함하는 인간 Ig-카파 경쇄 암호화 융합 유전자를, 상기 각 항-알파-시누클레인-항체 VL(카파) 도메인을 암호화하는 DNA 단편을 상기 인간 Ig-카파 불변 영역을 암호화하는 서열 요소에 융합시킴으로써 조립하였다. 상기 구조물은 게놈 기구 중에 존재하였다, 즉 인트론이 상기 신호 펩타이드 중에, 및 상기 VL(카파) 및 CL-카파 도메인 사이에 존재하였다.
상기 발현 벡터는 또한, 에스케리키아 콜라이에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기원, 및 에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 포함하였다.
상기 항체 카파 경쇄의 전사 단위는 5'에서 3' 방향으로 하기의 기능 요소들을 포함한다:
- 인간 거대세포바이러스(P-CMV)로부터의 초기 인헨서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-번역되지 않은 영역(5'UTR),
- 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 경쇄 가변(VL) 도메인 암호화 핵산,
- 인간 IgG 카파 불변 영역,
- 임의로 뇌-혈액-장벽 셔틀 모듈 암호화 핵산에 융합된 GS-링커 암호화 핵산, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).
iv) 인간 Ig- 람다 불변 영역을 사용하는 면역글로불린 람다 경쇄 발현용 벡터의 생성
인간 Ig-람다 불변 영역(CL-람다) 및 토끼로부터 유래된 항-알파 시누클레인-항체 VL(람다) 도메인을 포함하는 인간 Ig-람다 경쇄 암호화 융합 유전자를, 상기 각 항-알파-시누클레인-항체 VL(람다) 도메인을 암호화하는 DNA 단편을 상기 인간 Ig-람다 불변 영역을 암호화하는 서열 요소에 융합시킴으로써 조립하였다. 상기 구조물은 게놈 기구 중에 존재하였다, 즉 인트론이 상기 신호 펩타이드 중에, 및 상기 VL(람다) 및 CL-람다 도메인 사이에 존재하였다.
상기 발현 벡터는 또한, 에스케리키아 콜라이에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기원, 및 에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 포함하였다.
상기 항체 람다 경쇄의 전사 단위는 5'에서 3' 방향으로 하기의 기능 요소들을 포함한다:
- 인간 거대세포바이러스(P-CMV)로부터의 초기 인헨서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-번역되지 않은 영역(5'UTR),
- 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 경쇄 가변(VL) 도메인 암호화 핵산,
- 인간 IgG 람다 불변 영역,
- 임의로 뇌-혈액-장벽 셔틀 모듈 암호화 핵산에 융합된 GS-링커 암호화 핵산, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).
실시예 7
항-인간 알파-시누클레인 항체의 재조합 생성
항체를 F17 배지(인비트로젠 코포레이션)에서 배양된 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포(인간 배아 신장 세포주 293-유래된)에서 생성시켰다. 실시예 6에 개시된 바와 같이 각 벡터의 형질감염을 위해서 "293-유리" 형질감염 시약(노바겐)을 사용하였다. 상기 항체 및 항체-혈액-뇌-장벽 셔틀-융합물을 개별적인 발현 플라스미드로부터 발현시켰다. 형질감염을 제조사의 설명서에 명시된 바와 같이 수행하였다. 재조합 항체-함유 세포 배양 상등액을 형질감염 후 3 내지 7일째에 수확하였다. 상등액을 정제시까지 저온(예를 들어 -80 ℃)에서 보관하였다.
예를 들어 HEK293 세포에서의 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반적인 정보는 문헌[Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203]에 제공되어 있다.
실시예 8
재조합 항-인간 알파-시누클레인 항체의 정제
항체-함유 배양 상등액을 여과하고 2개의 크로마토그래피 단계에 의해 정제하였다.
상기 항체를 PBS(1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl), pH 7.4로 평형화시킨 HiTrap MabSelectSuRe(GE 헬쓰케어)를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 포획하였다. 결합되지 않은 단백질을 평형화 완충제로 세척하여 제거하고, 상기 항체를 25 mM 시트레이트 완충제, pH 3.1로 회수하고, 이를 용리 직후에 1M 트리스-염기, pH 9.0으로 pH 6.0으로 조절하였다.
슈퍼덱스(Superdex) 200(상표)(GE 헬쓰케어)상에서 크기 배제 크로마토그래피를 2차 정제 단계로서 사용하였다. 상기 크기 배제 크로마토그래피를 20 mM 히스티딘 완충제, 0.14 M NaCl, pH 6.0에서 수행하였다. 상기 항체 함유 용액을 바이오맥스(Biomax)-SK 멤브레인(밀리포어(Millipore), 미국 매사추세츠주 빌레리카 소재)이 구비된 울트라프리(Ultrafree)-CL 원심분리 필터 유닛으로 농축시키고 -80 ℃에서 보관하였다.
배양 상등액 리터당 평균 수율
항체 배양 상등액 리터당 평균 수율
0017 10 ㎎
0018 9.2 ㎎
0070 6.1 ㎎
0076 7.3 ㎎
0081 15 ㎎
12F4-셔틀 14.3 ㎎
실시예 9
표면 플라스몬 공명을 사용하는 결합 특이성의 특성화
비아코어 2000, 3000 또는 T200 장비(GE 헬쓰케어, 비아코어, 스웨덴 웁살라 소재)를 모든 개시된 방법들에 적용하였다. 모든 고정화 단계 및 결합 분석을 25 ℃에서 수행하였다. 고정화 및 결합 분석을 각각 5 또는 30 ㎕ 분-1에서 수행하였다(특별히 언급하지 않는 한).
a) 고정화된 단클론 항체에의 단량체성 알파- 시누클레인 결합의 특성화
완충제:
고정화 완충제: pH 7.5에서 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0.05% 폴리솔베이트 20(P20)
포획 및 결합 완충제: 10 mM Hepes, pH 7.5, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% P20
포획 항체상의 고정화된 단클론 항체에의 정제된 단량체성 α- 시누클레인 - 헥 사His의 결합 분석
i) 염소 항-마우스 면역글로불린 IgG(포획 항체)의 고정화
염소 항-마우스 IgG(마우스 항체 포획 키트; 카탈로그 번호 BR-1008-38; GE 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라 소재)의 고정화를 pH 7.5에서 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0.05% P20을 함유하는 완충제 중에서 수행하였다. 첫 번째 단계에서 CM5 센서 칩 표면의 카복실기를, 상기 센서 표면을 0.2M N-에틸-N-다이메틸 아미노 폴리카보다이이미드(EDC) 및 0.05M N-하이드록시숙신이미드(NHS)의 용액과 7분간 접촉시킴으로써 반응성 숙신이미드 에스터로 전환시켰다. 상기 활성화 후에, 상기 센서 표면을 10 mM 나트륨 아세테이트 완충제(pH 5.0) 중의 염소 항-마우스 IgG 30 ㎍/㎖과 3분 접촉시켰다. IgG를 약 3000 RU(응답 단위)의 수준으로 고정화시켰다. 최종적으로, 상기 표면상의 과잉의 활성화된 카복실기를 에탄올아민(1 M, pH 8.5, 7 분)으로 급냉시켰다.
ii) 항-알파 시누클레인 항체의 포획
상기 단클론 항-알파 시누클레인 항체(실행 완충제 중의 100 nM 용액)를 200 내지 250 RU의 포획 항체량에 도달할 때까지 상기 고정화된 IgG 항체상에 포획시켰다. 상기 센서 칩의 하나의 채널을 기준 채널로서 고정화된 염소 항-마우스 항체와 함께 사용하였다.
iii) N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 단량체성 알파-시누클레인의 결합 실험
결합 실험을 pH 7.5에서 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% P20을 함유하는 완충제 중에서 수행하였다. 상기 정제된 단량체성 알파-시누클레인-헥사His를 포획된 단클론성 항-알파 시누클레인-항체의 표면상에서 334 nM까지 적정하였다(5개 점, 2의 희석 인자). 정제된 단량체성 알파-시누클레인-헥사His의 각 적정 후에, 알파-시누클레인 및 단클론성 항-알파 시누클레인-항체의 복합체를 10 mM 글리신-HCl 용액(pH 1.7)의 짧은 펄스로 상기 칩으로부터 제거하였다. 그 후에 새로운 단클론성 항-알파 시누클레인 항체를 상기 칩 표면상에 포획하였다.
b) NTA ( 나이트릴로트라이아세트산 ) 칩상에 His -태그를 통해 고정화된 단량체 성 알파-시누클레인에의 단클론성 항-알파 시누클레인-항체 결합의 특성화
완충제:
고정화 완충제: 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0.05% P20, pH 7.5
결합 완충제: 10 mM Hepes, pH 7.5, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% P20
i) NTA 센서 표면상의 정제된 단량체성 알파-시누클레인의 고정화
NTA(나이트릴로트라이아세트산) 센서 표면상의 단량체성 α-시누클레인-헥사His(N-말단)의 고정화를 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0.05% P20을 함유하는 실행 완충제(pH 7.5)에서 수행하였다. NTA 센서 표면을 먼저 매번 1 분간 0.35 M EDTA 5 ㎕/분의 유량으로 3회 세척하였다. 그 후에, 상기 센서 표면에, 상기 칩 표면을 실행 완충제 중의 500 μM NiCl2와 1분 접촉시킴으로써 Ni2 +-이온을 로딩하고 추가로 0.2 M EDA 및 0.05 M NHS 용액으로 7분 동안 활성화시켰다. 더욱 또한, 실행 완충제(<0.1 ㎍/㎖) 중의 헥사His 표지된 알파-시누클레인을 상기 센서 표면과 접촉시켜 저밀도 표면(5 RU 이하)을 성취하여 알파-시누클레인에의 단클론성 항체-알파 시누클레인-항체의 1가 결합을 추가로 검출할 수 있게 한다. 최종적으로, 남아있는 활성 에스터기를 5분 동안 1 M 트리스(pH 7.5)로 탈활성화시켰다. 고정화된 알파-시누클레인이 없는 유동 채널을 기준 채널로서 사용하였다.
ii) 단클론성 항체와 고정화된 α-시누클레인과의 결합 분석
결합 분석을 pH 7.5에서 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% P20을 함유하는 완충제 중에서 수행하였다. 상기 단클론성 항-알파 시누클레인-항체를 예/아니오 결합 반응에 대해서 100 nM의 단일 농도로 분석하거나 또는 실행 완충제 중에서 100 nM 이하의 농도로 적정하여(2의 희석 인자로 5개 농도의 단일 주입) 단량체성 알파-시누클레인에 대한 결합 동역학 및 친화성을 평가하였다. 항-알파 시누클레인-항체의 각 농도에 대한 결합 곡선의 모니터 후에, 상기 알파-시누클레인 표면을 100 mM 인산(2 x 1 분)의 2회의 짧은 펄스로 재생시켜 상기 결합된 항체를 세척하고 또 다른 항체 결합의 모니터를 가능하게 하였다.
c) L1 센서상의 DOPC:DOPS 리포솜상에 고정화된 단량체성 알파- 시누클레인에 의 단클론성 항-알파 시누클레인-항체 결합의 특성화
완충제: 고정화 및 결합 완충제: 50 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5
i) DOPC:DOPS 리포솜의 제조
클로로폼 중의 지질 DOPC:DOPS(1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린:1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린)의 25 ㎎/㎖(7:3(w/w) 혼합물을 진공 후드하에 아르곤 스트림으로 유리 플라스크 중에서 증발시켜 상기 플라스크 벽상에 지질 필름을 획득하였다. 상기 지질 필름을 Hepes 완충제(50 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.5) 중에서 수화시켜 5 mM 완충제 지질 용액을 수득하였다. 상기 지질 용액을, 100 ㎚ 압출기-필터를 통해 상기 지질 용액을 15회 통과시킴으로써 미니-압출기(아반티 폴리 리피즈(Avanti Polar Lipids), 미국 알라바스터 소재)로 압출하여 리포솜 용액을 수득하였다. 리포솜의 품질 및 크기를 동적 광 산란에 의해 입증하였다.
ii) DOPC:DOPS 리포솜상의 정제된 단량체성 α-시누클레인의 고정화
DOPC:DOPS 리포솜상의 알파-시누클레인-헥사His(N-말단 태그)의 고정화를 pH 7.5에서 50 mM Hepes, 150 mM NaCl을 함유하는 완충제 중에서 수행하였다. L1 센서 표면의 모든 유동 채널을 먼저 20 mM 챕스(Chaps) 용액으로 1분 세척하여 안정한 기준선을 획득하였다. 상기 압출에 의해 수득한 DOPC:DOPS 리포솜 용액을 실행 완충제 중에서 5-회 희석하고 모든 유동 채널의 센서 표면상에 로딩하여 약 300 RU의 고정화 수준을 획득하였다. 모든 유동 채널을 다음 단계에 BSA(소 혈청 알부민) 용액 0.1 ㎎/㎖로 차단하여 상기 센서 표면상/표면에의 알파-시누클레인의 비특이적인 결합을 감소시켰다. 알파-시누클레인을 실행 완충제 중에서 5.0 ㎍/㎖의 농도로 희석하고 상기 선택된 유동 채널상의 리포솜상에 저밀도(<30 RU)로 고정화시켜 알파-시누클레인에의 1가 항체 결합의 검출을 가능하게 하였다. 고정화된 리포솜을 갖지만 알파-시누클레인은 없는 유동 채널을 기준 항체로서 사용하였다.
iii) DOPC:DOPS 리포솜상의 고정화된 알파- 시누클레인에의 단클론성 항체의 결합 분석
상기 결합 분석에서 각 항체를 예/아니오 결합 반응에 대해서 100 nM의 단일 농도로 분석하거나 또는 실행 완충제 중에서 활성 및 기준 채널에 대해 100 nM 이하의 농도로 적정하여(2의 희석 인자로 5개 점) 알파-시누클레인에 대한 결합 동역학 및 친화성을 평가하였다. 항체 결합의 모니터 후에 상기 센서 표면을 리포솜의 다음 고정화를 위해 20 mM 챕스로 1분간 재생시키고 실행 완충제로 평형화시켰다.
d) 알파- 시누클레인 예비형성된- 피브릴(PFF)에의 단클론성 항-알파 시누클레 인-항체의 특성화
완충제:
고정화 완충제: 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0.05% P20, pH 7.5
결합 완충제: 10 mM Hepes, pH 7.5, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% P20
i) NTA 센서 표면상의 α-시누클레인 예비형성된-피브릴의 고정화
알파-시누클레인 PFF(N-말단 헥사His-태그 표지된 알파-시누클레인 및 표지되지 않은 알파-시누클레인을 1:10 비로 함유한다)의 His-태그 고정화를 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0.05% P20을 함유하는 실행 완충제(pH 7.5)에서 수행하였다. NTA 센서 표면을 먼저 1 분간 0.35 M EDTA 용액 5 ㎕/분의 유량으로 세척하였다. 그 후에, 상기 센서 표면에, 상기 표면을 실행 완충제 중의 500 μM NiCl2와 1분 접촉시킴으로써 Ni2 +-이온을 로딩하고 추가로 0.2 M EDA 및 0.05 M NHS 용액으로 7분 동안 활성화시켰다. 실행 완충제 중의 알파-시누클레인 PFF의 희석된 용액을 상기 센서 표면과 접촉시켜 상기 센서 표면상의 다양한 피브릴 밀도를 성취하였다(약 20 RU, 약 200 RU 및 약 2000 RU). 남아있는 활성 에스터의 유리기를 5분 동안 1 M 트리스(pH 7.5)로 탈활성화시켰다. 알파-시누클레인 피브릴이 없는 유동 채널 중 하나를 기준 채널로서 사용하였다.
ii) 단클론성 항체의 고정화된 PFF에의 결합 분석
각각의 항-알파 시누클레인-항체의 결합을 4개의 채널 모두에서 병행하여 100 nM 이하의 농도로 적정 실험하여(2의 희석 인자, 5개 점) 모니터하였다. 각 항체에 대한 결합 곡선의 모니터 후에, 상기 알파-시누클레인 PFF 표면을 100 mM 인산(2 x 1 분)의 짧은 펄스로 재생시켜 상기 결합된 항체를 세척하였다.
결과:
상술한 바와 같은 SPR에 의해 측정된 바와 같은, 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈과의 융합물로서 또한 본 발명에 보고된 바와 같은 상이한 알파-시누클레인-항체 및 몇몇 기준 항체의 결합을 하기 표에 나타낸다.
상이한 알파-시누클레인 형태에의 항-알파-시누클레인 항체의 결합
항체 단량체성 알파- 시누클레인에의 결합 리포솜 중의 단 량체성 알파- 시 누클레인에의 결합 알파- 시누클레 인 예비형성된 피브릴에의 결합
고정화된 항체 고정화된 시누클레인
0017 예 예 예 예
0018 아니오 아니오 아니오 예
0070 시험 안 됨 예 시험 안 됨 예
0076 시험 안 됨 아니오 시험 안 됨 예
0081 시험 안 됨 아니오 시험 안 됨 예
sc211 (기준) 예 예 예 예
12F4 (기준) 아니오 아니오 아니오 예
12F4-셔틀 (기준) 시험 안 됨 예 시험 안 됨 예
4B12 (기준) 예 예 예 예
syn1 (기준) 예 예 예 예
- 항체 0070은 항체 0017과 항-트랜스페린 수용체-항체 8D3의 scFv와의 혈액-뇌-장벽 셔틀 융합물이다;
- 항체 0076은 항체 0018과 항-트랜스페린 수용체-항체 8D3의 scFv와의 혈액-뇌-장벽 셔틀 융합물이다.
실시예 10
면역조직화학 분석 및 세포독성 분석
PD 뇌 절편의 면역조직화학 분석
인간 파킨슨병 환자 뇌의 동결절편(10 ㎛)을 5.0 ㎍/㎖의 항체 0017, 항체 0018 또는 항체 0057(쥐 Fc)의 1차 IgG로 염색하고 5.0 ㎍/㎖의 토끼 항-알파-시누클레인 항체(셀 시그널링(Cell Signaling); 카탈로그 번호 2628S)로 대조염색하였다.
2차 항체로서, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 접합된 염소 항-마우스 IgG 항체(H+L)(인비트로젠, 카탈로그 번호 A11001) 및 알렉스 플루오르 594 접합된 염소 항-토끼 IgG 항체(H+L)(고도로 교차-흡착된, 인비트로젠, 카탈로그 번호 A11037)를 사용하였다.
시편을 63x 렌즈 1.2NA, 1.6x 줌, 핀홀@1.0AU를 사용하는 레이카(LEICA) 공초점 현미경(SP5x)상에서 영상화하였다.
알렉사 488은 497 ㎚(10% WLL)에서 여기되고; 505-571 ㎚(98% HyD)에서 방출되었다.
알렉사 594는 590 ㎚(8% WLL)에서 여기되고; 596-680 ㎚(92% HyD)에서 방출되었다.
상들을 5x 선 평균화에 의해 평균하였다.
결과는 도 12를 참조하시오.
치료학적 항체에 의한 알파 시누클레인 매개된 독성 보호에 대한 인간 신경세포(LUHMES) 기능성 세포 모델
LUHMES 세포를 하기에 상세히 개시되는 바와 같이 384 웰 플레이트에서 5일 동안 분화시켰다. 시딩 후 24시간째에 LUHMES 분화 배지에서 증식하는 SHSY5Y 세포로부터 컨디셔닝된 세포 배양 상등액을 상기 플레이트에 1:1 희석비로 가하여 엑소좀 매개된 알파-시누클레인 독성을 유도하였다. 대조용 배양물에 LUHMES 분화 배지를 제공하였다. 시험하고자 하는 항체를 컨디셔닝된 SHSY5Y 배지와 함께 10 ㎍/㎖의 최종 농도로 가하였다. 세포 생육력을 추가로 4일 후에 셀티터글로(CellTiterGlo) 분석(프로메가(Promega), 카탈로그 번호 REF G7571)에 의해 측정하였다. 생육력 값을 CPS 수로서 나타내었다.
세포 배양 방법
코팅제, 배지 및 첨가제:
- 폴리-L-오르니틴: 시그마-알드리치, 카탈로그 번호 P-3655-100 ㎎
- 피브로넥틴(용액): 시그마-알드리치, 카탈로그 번호 F-1141-5 ㎎
- 어드밴스드(Advanced) DMEM/F-12: 깁코/인비트로젠, 카탈로그 번호 12634-010
- N-2: 깁코/인비트로젠, 카탈로그 번호 17502048 또는 PAA F005-004
- L-글루타민: 시그마-알드리치, 카탈로그 번호 G7513
- FGF: R&D 시스템스, 카탈로그 번호 4114-TC (1 ㎎)
- GDNF: R&D 시스템스, 카탈로그 번호 212-GD (50 ㎍)
- 테트라사이클린: 시그마-알드리치, 카탈로그 번호 T-7660
- cAMP: 시그마-알드리치, 카탈로그 번호 D0627
LUHMES 배양 및 분화:
코팅제(모든 플레이트 및 플라스크는 넌클론(Nunclon)이어야 한다):
Figure pct00004
상기 코팅 용액을 플레이트 및 플라스크내로 여과하였다(T75 플라스크: 7 ㎖; T175 플라스크: 14 ㎖; 96-웰 플레이트; 50 ㎕/웰, 24-웰-플레이트: 250 ㎕/웰, 12-웰-플레이트: 500 ㎕/웰, 6 웰-플레이트: 1 ㎖/웰). 상기 플레이트 및 플라스크를 37 ℃에서 적어도 3시간 동안(또는 밤새) 배양하였다. 배양 후에 상기 코팅-용액을 흡출하였다. 플라스크를 밀리 Q 수로 2회 세척하였다. 상기 플레이트 및 플라스크를 사용 전에 층류 벤치하에서 건조시켰다.
증식-배지:
Figure pct00005
분화 배지:
Figure pct00006
계대배양 :
75 ㎠ 플라스크에서 증식-배지 중에서 배양된 세포를, 상기 세포가 80%의 세포밀집도에 도달했을 때 분할하였다. 먼저 상기 세포를 10 ㎖의 PBS로 2회 세척하였다. 이어서 4 ㎖의 ATV-트립신을 가하였다(2 ㎖의 상기 2x ATV-트립신 모액을 혼합한 후에 2 ㎖의 PBS와 혼합한다). 상기 세포를 37 ℃에서 3분 동안 배양하였다. 세포가 탈착되었을 때 21 ㎖의 첨가제 없는 어드밴스드 DMEM/F12 배지를 가하였다. 상기 세포-현탁액을 300 x g에서 5분 동안 50 ㎖ 팔콘(Falcon) 튜브에서 원심분리시켰다. 상등액을 제거하고 세포를 5 ㎖의 첨가제 없는 어드밴스드 DMEM/F12 배지 중에 재현탁시켰다. 상기 세포를 노이바우어(Neubauer)-챔버에서 카운트하였다.
계대배양을 위해서 상기 세포를 2, 3 또는 4일 후에 분할하였다. 목표가 2일인 경우, 2*106 세포(분할 1:5)를 75 ㎠ 플라스크에 시딩하였다. 3일-배양의 경우 1*106 세포(분할 1:10) 및 4일-배양의 경우 500,000 세포(분할 1:20)이면 충분하다. 세포를 10 ㎖의 증식-배지를 함유하는 75 ㎠ 플라스크에 시딩하였다.
예비-분화:
LUHMES 세포의 예비-분화가 175 ㎠ 플라스크에서 일어났다. 따라서 6*106 세포를 20 ㎖의 증식 배지에 시딩하였다. 24시간의 부착 및 증식 후에 상기 배지를 교환하였다. 증식 배지를 분화 배지로 교체하였다. 추가로 48시간 후에 상기 예비-분화를 마쳤다.
세포를 다중-웰 플레이트에 시딩하였다. 따라서 상기 배지를 흡출하였다. 세포를 10 ㎖의 PBS로 2회 세척하였다. 그 후에 8 ㎖의 ATV-트립신을 가하였다(4 ㎖의 상기 2x ATV-트립신 모액을 혼합한 후에 4 ㎖의 PBS와 혼합한다). 세포를 37 ℃에서 3 내지 5분 동안 배양하였다. 42 ㎖의 첨가제 없는 어드밴스드 DMEM/F12를 가하였다. 상기 세포-현탁액을 300 x g에서 5분 동안 50 ㎖ 팔콘 튜브에서 원심분리시켰다. 상등액을 제거하고 세포를 10 ㎖의 분화 배지에 재현탁시켰다. 세포를 노이바우어-챔버에서 카운트하였다.
분화:
추가의 분화를 코팅된 세포 배양 플레이트에서 수행하였다.
Figure pct00007
상기 세포를 분화 배지로 희석하고 적합한 부피의 분화 배지로 세포 배양 플레이트에 시딩하였다. 추가로 72시간 후에 분화가 완료된다. 결과에 대해서 도 7 및 9를 참조하시오.
실시예 11
열 안정성
단클론 항-알파-시누클레인 항체(2 μM)의 변성점(융점, Tm)을 리포터 형광단으로서 사이프로 오렌지를 사용하여 열 이동 분석에 의해 측정하였다.
상기 용융 전이를 볼츠만(Boltzmann) s자 방정식에 정합시키고 최대 절반 신호 진폭에서의 변곡점을 항체의 절반이 변성되는 융점 Tm으로서 정의하였다(도 10). 60 ℃ 내지 75 ℃의 Tm-값을 측정하였다.
선택된 항-알파- 시누클레인 항체의 융점( T m )
Tm[℃]
mAb His - 완충제 DPBS TBS
0017 69.7 73.6 73.0
0018 69.2 71.9 71.8
0057 63.9 66.6 65.7
실시예 12
에피토프 지도화
에피토프 지도화를 맞춤 제작된 펩스타(PepStar)(상표) 펩타이드 미세배열(JPT 펩타이드 테크놀로지스에 의해 제공됨)상에서 수행하였다. 펩타이드 서열은 15 아미노산 잔기의 길이를 가졌으며 인간 알파-시누클레인의 전체 서열을 포함하도록 설계되었다(UniProt 수탁 번호: P37840). 이웃하는 펩타이드는 11 아미노산의 중복 서열을 가졌다. 추가의 펩타이드는 질병-관련된 알파-시누클레인 돌연변이(A30P, A53T, E57K)의 공지된 부위를 갖는 서열 및 설치류 알파-시누클레인에 대한 교차-반응성을 평가하기 위한 서열을 포함한다. 더욱 또한, 1차 및 2차 항체의 반응성 및 특이성에 대한 대조용으로서 작용하는 12개 펩타이드/단백질을 스폿팅하였다. 단백질은 하기와 같았다: 소 혈청 알부민, 인간 IgG, 토끼 IgG, 마우스 IgG, 인간 타우 단백질, 인간 알파-시누클레인, 인간 베타-시누클레인, 인간 감마-시누클레인, 인간 IgM, 마우스 IgM, 포스포-타이로신 펩타이드, 인간 알파-삼중 프롤린 돌연변이된-시누클레인(A30P, A56P, A76P).
에피토프 지도화를 제조사의 설명서에 따라 수행하였다.
펩타이드 지도화에 따른 선택된 항-알파- 시누클레인 항체의 데이터
항체 에피토프
0017 aa97-111: KDQLGKNEEGAPQEG
aa101-15: GKNEEGAPQEGILED
선형 에피토프, 예측된 종 및 동형 교차-반응성 없음
0018 검출된 펩타이드 없음, TP 시누클레인의 검출
12F4 (기준 항체) 검출된 펩타이드 없음, TP 시누클레인의 검출
syn211 (기준 항체) aa113-127: LEDMPVDPDNEAYEM
aa117-:131 PVDPDNEAYEMPSEE
TP 시누클레인의 검출
실시예 13
항-알파 시누클레인 항체-혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈 접합체에 의한 알파-시누클레인 병리의 급성 생체내 표지
연구 설계
15-개월 된 Thy1-(A30P)알파-시누클레인 트랜스제닉 마우스(칼레(Kahle) 마우스; n=3/그룹) 및 야생형 대조용(n=1/그룹)의 3개 그룹을 3개의 상이한 항-알파 시누클레인-항체-혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈 접합체로 주사하였다:
- 항체 0070 -> 항체 0017-scFab8D3 접합체
- 항체 0076 -> 항체 0018-scFab8D3 접합체
- 기준 -> 12F4-scFab8D3 접합체
하나의 트랜스제닉 마우스 및 하나의 야생형 마우스를 주사하지 않은 대조용으로서 포함시켰다. 상기 연구는 총 14마리의 마우스를 포함하였다.
뇌 조직에서 결합된 mAb -뇌 셔틀의 염색/검출
뇌 중의 표적 점유를 20 ㎛ 크라이오스탯 뇌 절편(4/마우스; 아세톤 고정되고, NGS로 차단됨)상의 AF555-태그된 항-huIgG-항체로 검출하였다. 동시-염색을 수행하였다: 혈관(항-포도칼릭신, AF647); DAPI.
결과
뇌간의 실질: 큰 신경돌기/알파-시누클레인 축적된 구조에서부터 시냅스 염색과 유사한 확산성 반점 염색까지 다양하다.
신경돌기 병리(= 상기 마우스 모델에서 주요 병리학적 특징)는 뇌간으로 제한되며 마우스에 따라 대단히 가변적이다.
전체 뇌 및 또한 비-트랜스제닉 마우스에서: 대개 반점 염색; 시냅스 염색과 유사함.
도 11을 참조하시오.
실시예 14
셀루스팟스(CelluSpots)(상표) 합성 및 에피토프 지도화
항체 0018의 에피토프 분석을 위한 펩타이드 배열을 인타비스 셀루스팟스(Intavis CelluSpots)(상표) 기술에 의해 제조하였다. 상기 접근법에서, 펩타이드를 합성 후 용해되는 변형된 셀룰로스 원반상에서 자동화된 합성기(인타비스 멀티펩(MultiPep) RS)로 합성하였다. 이어서 거대분자 셀룰로스에 공유 결합된 채로 있는 개별적인 펩타이드의 용액들을 코팅된 현미경 슬라이드상에 스폿팅하였다. 상기 셀루스팟스(상표) 합성을 384-웰 합성 플레이트에서 아미노-변형된 셀룰로스 원반상에서 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 화학을 사용하여 단계적으로 수행하였다. 각각의 커플링 주기에서, 상응하는 아미노산을 DMF 중의 DIC/HOBt 용액으로 활성화시켰다. 커플링 단계 사이에서, 반응되지 않은(즉 유리) 아미노기를 아세트산 무수물, 다이아이소프로필에틸 아민 및 1-하이드록시벤조트라이아졸의 혼합물로 캡핑하였다. 상기 합성의 완료시, 상기 셀룰로스 원반을 96-웰 플레이트로 옮기고 측쇄 탈보호를 위해 트라이플루오로아세트산(TFA), 다이클로로메탄, 트라이아이소프로필실란(TIS) 및 물의 혼합물로 처리하였다. 상기 절단 용액의 제거 후에, 상기 셀룰로스 결합된 펩타이드를 TFA, TFMSA(트라이플루오로 에탄설폰산), TIS 및 물의 혼합물로 용해시키고, 다이아이소프로필 에테르로 침전시키고 DMSO에 재-현탁시킨다. 이들 펩타이드 용액을 후속으로 인타비스 슬라이드 스폿팅 로봇을 사용하여 인타비스 셀루스팟스(상표) 슬라이드상에 스폿팅하였다.
에피토프 분석을 위해서, 상기 제조된 슬라이드를 에탄올로 세척하고 그 후에 TBS(트리스-완충된 염수 용액; 50 mM 트리스, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 8)로 세척한 후에 차단 단계를 TBS, 0.1% 트윈-20 중의 5 ㎖의 10x 웨스턴 차단 시약(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 만하임 소재), 2.5 g 슈크로스로 4 ℃에서 16시간 동안 수행하였다. TBS-T(TBS + 0.1% 트윈-20)로 세척 후에, 상기 슬라이드를 주변 온도에서 2시간 동안 0.1% 트윈-20을 포함하는 TBS 중의 항체 0018의 용액(1 ㎍/㎖)과 배양하였다. 세척 후에, 상기 슬라이드를 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 접합된 항-마우스 또는 항-토끼 2차 항체(TBS-T 중의 1:20000)와 함께 검출을 위해 배양한 다음 DAB(3,3'-다이아미노벤지딘) 기질/퍼옥사이드 완충제(로슈 다이아그노스틱스 GmbH, 독일 만하임 소재)와 배양하였다. ELISA-양성 SPOT를 정량분석하고 상응하는 펩타이드 서열의 지정을 통해 항체 결합 에피토프를 확인하였다.
상기 발명을 명확한 이해를 위해 예시 및 실시예에 의해 일부 상세히 개시하였지만, 상기 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석해서는 안 된다. 본 발명에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 명세는 내용 전체가 특별히 참고로 포함된다.
<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> ANTI-alpha-SYNUCLEIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> Case P31869 <140> PCT/EP2014/074840 <141> 2014-11-18 <150> EP 13193892.0 <151> 2013-11-21 <160> 58 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human alpha-synuclein fragment <400> 1 Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 <400> 2 Tyr Ala Met Ile 1 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 <400> 3 Pro Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 <400> 4 Arg Asp Gly Thr Asp Lys Thr Phe Asn Ile 1 5 10 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 <400> 5 Asn Val Tyr Gly Asp Asn 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 <400> 6 Glu Ala Ser Lys Leu Ala 1 5 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 <400> 7 Gly Glu Phe Leu Cys Thr Thr Ser Asp Cys 1 5 10 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 <400> 8 Ser Tyr Ala Met Ile 1 5 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 <400> 9 Val Ile Tyr Pro Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 <400> 10 Gln Ala Ser Gln Asn Val Tyr Gly Asp Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 <400> 11 Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 <400> 12 Gln Gly Glu Phe Leu Cys Thr Thr Ser Asp Cys Phe Thr 1 5 10 <210> 13 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable domain <400> 13 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Ile Asn Ser Tyr Ala 20 25 30 Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Val Ile Tyr Pro Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Val Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Asp 85 90 95 Gly Thr Asp Lys Thr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Leu 115 <210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable domain <400> 14 Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Val Tyr Gly Asp Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Leu Cys Thr 85 90 95 Thr Ser Asp Cys Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Gly Val Val Val Arg 100 105 110 <210> 15 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 <400> 15 Arg Tyr Ala 1 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 <400> 16 Asn Ser Ser Gly Ala 1 5 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 <400> 17 Trp Thr Tyr Asp Asp Tyr Gly Asp Phe Gln Gly Phe Asn Ile 1 5 10 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 <400> 18 Ser Val Tyr Asn Asn Asn Asp Leu Ala 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 <400> 19 Arg Ala Ser Lys Leu Ala 1 5 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 <400> 20 Gly Gly Tyr Asp Asp Asp Ala Asp Met Gly Ala 1 5 10 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 <400> 21 Arg Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 <400> 22 Val Ile Asn Ser Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 <400> 23 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Claims (27)

  1. 인간 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하는 항체로, 상기 인간 알파-시누클레인이 자유 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    인간 및 마우스 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하고, 상기 인간 및 마우스 알파-시누클레인이 자유 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는 항체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    알파-시누클레인이 단량체성 및/또는 올리고머성 알파-시누클레인인 항체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 26의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 27의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄에 서열번호 21, 22 및 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 23 내지 25의 HVR을 포함하는 항체.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 26의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 27의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 인간화시킴으로써 획득된 항체.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간화된 항체이고 중쇄 가변 도메인에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하고, 각각의 HVR 중에 0 내지 3개의 아미노산 잔기가 변화된 항체.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간화된 항체이고 중쇄 가변 도메인이 서열번호 26의 중쇄 가변 도메인으로부터 유래되고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 27의 경쇄 가변 도메인으로부터 유래된 항체.
  10. 중쇄에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  11. 중쇄에 서열번호 21, 22 및 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 23 내지 25의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  12. 중쇄에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하는 항체.
  13. 중쇄에 서열번호 21, 22 및 17의 HVR 및 경쇄에 서열번호 23 내지 25의 HVR을 포함하는 항체.
  14. 서열번호 26의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 27의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체로부터 획득된 항체.
  15. 중쇄 가변 도메인에 서열번호 15 내지 17의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 18 내지 20의 HVR을 포함하는 인간화된 항체로, 각각의 HVR 중에 0 내지 3개의 아미노산 잔기가 변화된 인간화된 항체.
  16. 중쇄 가변 도메인에 서열번호 21, 22 및 17의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 23 내지 25의 HVR을 포함하는 인간화된 항체로, 각각의 HVR 중에 0 내지 3개의 아미노산 잔기가 변화된 인간화된 항체.
  17. 중쇄 가변 도메인이 서열번호 26의 중쇄 가변 도메인으로부터 유래되고 경쇄 가변 도메인이 서열번호 27의 경쇄 가변 도메인으로부터 유래된 인간화된 항체.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈에 접합된 항체.
  19. 제 18 항에 있어서,
    혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈이 LRP1, LRP8, 인간 트랜스페린 수용체 또는 인간 인슐린-유사 성장인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편인 항체.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 인간 하위부류 IgG1의 전장 항체, 또는
    b) 인간 하위부류 IgG4의 전장 항체, 또는
    c) 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는 인간 하위부류 IgG1의 전장 항체,
    d) 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G를 갖는 인간 하위부류 IgG4의 전장 항체,
    e) 2개의 중쇄 모두에 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G 및 하나의 중쇄에 돌연변이 T366W 및 S354C 및 각각의 다른 중쇄에 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 하위부류 IgG1의 전장 항체, 또는
    f) 2개의 중쇄 모두에 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G 및 하나의 중쇄에 돌연변이 T366W 및 S354C 및 각각의 다른 중쇄에 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 하위부류 IgG4의 전장 항체
    인 항체.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 인간 뉴런 및 신경교 세포에서 알파-시누클레인 유도된 세포독성을 억제하고/하거나,
    ii) 뉴런과 신경교 세포간의 올리고머성 인간 알파-시누클레인의 세포-세포 전달을 억제하고/하거나,
    iii) 인간 뉴런 세포에서 알파-시누클레인-유도된 카스파제 활성을 감소시키고/시키거나,
    iv) 자유 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하고 변형된 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는 알파-시누클레인에는 특이적으로 결합하지 않는
    항체.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 제형.
  23. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로서 사용하기 위한 항체.
  24. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    시누클레인병증의 치료에 사용하기 위한 항체.
  25. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    파킨슨병의 치료에 사용하기 위한 항체.
  26. 약제의 제조에서 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
  27. 제 26 항에 있어서,
    약제가 파킨슨병 치료용인 용도.
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