KR20150127216A - 암의 치료 및 암 약물 내성의 예방 방법 - Google Patents

암의 치료 및 암 약물 내성의 예방 방법 Download PDF

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마리 클래손
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본원은 본원에 기재된 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제)를 사용하여 암 약물 내성을 치료하고/거나 예방하는 방법을 제공한다.

Description

암의 치료 및 암 약물 내성의 예방 방법{METHODS OF TREATING CANCER AND PREVENTING CANCER DRUG RESISTANCE}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은, 그의 내용이 본원에 참조로 포함되는 2013년 3월 14일에 출원된 미국 특허 출원 번호 61/785,645를 우선권 주장한다.
기술분야
본원은 본원에 기재된 바와 같은 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제)를 사용하여 암 약물 내성을 치료하고/거나 예방하는 방법을 제공한다.
암 약물에 대한 비교적 빠른 내성의 획득이 성공적인 암 요법에 대한 주요한 난관으로 남아있다. 이러한 약물 내성에 대한 분자적 기반을 설명하기 위한 상당한 노력으로 약물 유출, 표적의 약물 결합-결핍 돌연변이체의 형성, 대안적 생존 경로의 개입 및 후성적 변이를 비롯한 다양한 메카니즘이 밝혀졌다. 이러한 메카니즘은 일반적으로 약물 치료 동안 선택되는 종양 세포 집단 내의 드문 확률의 내성-부여 유전자 변경의 존재를 반영하는 것으로 믿어진다. 문헌 [Sharma et al., Cell 141(1):69-80 (2010)] 참조. 암 요법에서 증가하여 관찰되는 현상은 소위 "재-치료 반응"이다. 예를 들어, EGFR (표피 성장 인자 수용체) 티로신 키나제 억제제 (TKI)로의 치료에 잘 듣다가 이후에 요법 실패를 겪는 몇몇 비-소세포 폐암 (NSCLC) 환자는 "휴약기" 이후 EGFR TKI 재-치료에 대한 제2 반응을 입증한다. 문헌 [Kurata et al., Ann. Oncol. 15:173-174 (2004); Yano et al., Oncol . Res. 15:107-111 (2005)] 참조. 유사한 재-치료 반응이 몇몇 다른 항암 작용제에 대해 잘 규명되어 있다. 문헌 [Cara and Tannock, Ann. Oncol. 12:23-27 (2001)] 참조. 이러한 발견은 암 약물에 대한 후천적 내성이 그의 메카니즘 기반에 대한 규명이 남아 있는 가역적인 "약물-저항성" 상태를 수반할 수 있음을 암시한다.
다양한 인간 종양 세포주 내의 가역적인 "약물-저항성" 세포 집단의 존재는 IGF-1 수용체 신호전달 및 히스톤 데메틸라제 KDM5A를 필요로 하는 변경된 염색질 상태의 개입을 통해 유지되는 것으로 여겨진다. 몇몇 특정한 내성-부여 돌연변이가 많은 암 환자에서 실제로 확인되었지만, 획득 약물 내성, 약물 내성에 대한 돌연변이적 및 비-돌연변이적 메카니즘의 상대적 기여도, 및 종양 세포 하위집단의 역할을 입증하는 것이 다소 불명확하게 남아있다. 암 세포 집단 내 이질성 및 약물 치료에 대해 내성인 암 세포의 발생을 성공적으로 해결하기 위한 신규한 치료 방법이 필요하다.
개요
본원은 예를 들어, 개체에서 암을 치료하고/거나 약물 내성을 예방하기 위해 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제)를 사용하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 개체는 암 요법제 (예를 들어, 표적 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)로의 치료를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 개체는 암 요법제로의 치료 전에 염색질 개질제의 조절제의 투여를 포함하는 치료를 시작한다. 일부 실시양태에서, 개체는 염색질 개질제의 조절제 및 암 요법제를 포함하는 치료를 동시에 받는다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제는 암 감수성의 기간을 늘리고/거나 암 내성의 발생을 지연시킨다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 암 요법제 (예를 들어, 표적 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)을 사용하는 조합 요법을 제공한다.
특히, 본원은 개체에게 (a) 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 암 요법제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 염색질 조절제 및 암 요법제의 각각의 양은 암 감수성의 기간을 증가시키고/거나 암 요법제에 대한 암 세포 내성의 발생을 지연시키는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제 및 암 요법제의 각각의 양은 암 요법제를 포함하는 암 치료의 효능을 증가시키는 데 효과적이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제 및 암 요법제의 각각의 양은 염색질 개질제의 조절제 없이 (부재 하에) 유효량의 암 요법제를 투여하는 것을 포함하는 표준 치료와 비교하여 증가된 효능에 효과적이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제 및 암 요법제의 각각의 양은 염색질 개질제의 조절제 없이 (부재 하에) 유효량의 암 요법제를 투여하는 것을 포함하는 표준 치료과 비교하여 증가된 반응 (예를 들어, 완전 반응)에 효과적이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제는 염색질 개질제의 길항제이다.
또한 본원은 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 유효량의 암 요법제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 요법제를 포함하는 암 치료의 효능을 증가시키는 방법을 제공한다.
본원은 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 유효량의 암 요법제를 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법으로, 상기 암 치료가 유효량의 암 요법제를 염색질 개질제 없이 (부재 하에) 투여하는 것을 포함하는 표준 치료와 비교하여 증가된 효능을 갖는 것인, 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본원은 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 유효량의 암 요법제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 요법제에 대해 내성인 암의 발생을 지연시키고/거나 예방하는 방법을 제공한다.
본원은 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 유효량의 암 요법제를 투여하는 것을 포함하는, 암 요법제에 대한 내성 발생 가능성이 증가된 암에 걸린 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
본원은 또한 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 유효량의 암 요법제를 투여하는 것을 포함하는, 암에 걸린 개체에서 암 요법제에 대한 감수성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본원은 또한 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 (b) 유효량의 암 요법제를 투여하는 것을 포함하는, 암에 걸린 개체에서 암 요법제 감수성의 기간을 연장시키는 방법을 제공한다.
본원은 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 유효량의 암 요법제를 투여하는 것을 포함하는, 암에 걸린 개체에서 암 요법제에 대한 반응의 지속기간을 연장시키는 방법을 제공한다.
임의의 방법 중 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제는 염색질 개질제의 길항제이다.
임의의 방법 중 일부 실시양태에서, 염색질 개질제는 폴리콤 억제 복합체 (PRC)의 구성원이다. 일부 실시양태에서, PRC의 구성원은 폴리콤 억제 복합체 1 (PRC1)의 구성원이다. 일부 실시양태에서, PRC1의 구성원은 RING1B, CBX3, CBX6, 및 CBX8 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, PRC의 구성원은 폴리콤 억제 복합체 2 (PRC2)의 구성원이다. 일부 실시양태에서, PRC2의 구성원은 EZH2, SUZ12, 및/또는 EED이다. 일부 실시양태에서, PRC2의 구성원은 EZH2이다. 일부 실시양태에서, PRC2의 구성원은 SUZ12이다. 일부 실시양태에서, PRC2의 구성원은 EED이다.
임의의 방법 중 일부 실시양태에서, 염색질 개질제는 EZH2 억제제이다. 일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 소분자 EZH2 억제제이다. 일부 실시양태에서, 소분자 EZH2 억제제는 N-((4,6-디메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-일)메틸)-5-(에틸(테트라히드로-2H-피란-4-일)아미노)-4-메틸-4'-(모르폴리노메틸)-[1,1'-비페닐]-3-카르복스아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 일부 실시양태에서, 소분자 EZH2 억제제는 (S)-1-(sec-부틸)-N-((4,6-디메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-일)메틸)-3-메틸-6-(6-(피페라진-1-일)피리딘-3-일)-1H-인돌-4-카르복스아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
임의의 방법 중 일부 실시양태에서, 염색질 개질제는 뉴클레오솜 재형성 및 탈아세틸화 복합체 (NuRD)의 구성원이다. 일부 실시양태에서, NuRD의 구성원은 CHD4, RBBP4, HDAC1, HDAC2, 및 HDAC3 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, NuRD의 구성원은 HDAC2 및/또는 HDAC3이다.
임의의 방법 중 일부 실시양태에서, 염색질 개질제는 유비퀴틴-접합 효소이다. 일부 실시양태에서, 유비퀴틴-접합 효소는 UBE2A 및/또는 UBE2B이다.
임의의 방법 중 일부 실시양태에서, 염색질 개질제는 ATRX, MYST4, CDYL, LRWD1, CHD7, PHF10, PHF12, PHF23, CHD1, MGEA5, MLLT10, SIRT4, TP53BP1, BRDT, CBX6, EVI1, GTF3C4, HIRA, MPHOSPH8, NCOA1, RBBP5, TDRD7, 및 ZCWPW1 중 하나 이상이다. 임의의 방법 중 일부 실시양태에서, 염색질 개질제는 ATRX, MYST4, CDYL, LRWD1, CHD7, PHF10, PHF12, PHF23, 및 CHD1 중 하나 이상이다. 임의의 방법 중 일부 실시양태에서, 염색질 개질제는 MGEA5, MLLT10, SIRT4, TP53BP1, ATRX, BRDT, CBX6, CHD1, EVI1, GTF3C4, HIRA, MPHOSPH8, NCOA1, RBBP5, TDRD7, 및 ZCWPW1 중 하나 이상이다.
임의의 방법 중 일부 실시양태에서, 암 요법제는 표적화 요법제이다. 일부 실시양태에서, 표적화 요법제는 EGFR 길항제이다. 임의의 방법 중 일부 실시양태에서, EGFR 길항제는 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민 및/또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 일부 실시양태에서, EGFR 길항제는 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민이다.
임의의 방법 중 일부 실시양태에서, 암 요법제는 화학요법제이다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 탁산이다. 일부 실시양태에서, 탁산은 파클리탁셀이다.
일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제 및 암 요법제는 부수적으로 투여된다.
임의의 방법 중 일부 실시양태에서, 암은 폐암이다. 일부 실시양태에서, 폐암은 NSCLC이다.
도 1 ┃ 약물 저항성 지속자 (DTP)에 대한 siRNA 스크린을 처음에 인간 비소세포 폐암 세포주 PC9를 사용하여 실시간 전면생장률 측정 (에센 인큐사이트(ESSEN Incucyte) 판독) 및 세포 생존율 종점 판독 (싸이퀀트 다이렉트(Cyquant Direct) 세포 증식 검정)을 사용하여 개발하고 수행하였다. 스크린은 약물 처리 후 DTP의 생존 및 회복을 기초로 개발하였다. 스크린은 3개의 상: 형질감염, 약물 또는 배지 처리 및 회복 상으로 이루어진다. 최종 세포 수는 싸이퀀트 다이렉트 세포 증식 검정 신호를 기초로 측정하였다.
도 2A-B ┃ siRNA 스크린을 완전히 독립된 조건에서 2회 실행하였다. 두 siRNA 스크린 실행에 대해 Z-팩터를 비-표적 대조군 (NTC)에 대해 배지 및 에를로티닙 처리 조건 사이의 차이, 뿐만 아니라 에를로티닙 처리 조건에서 비-표적 대조군 및 양성 대조군 (HDAC3 siRNA 단일 3) 사이의 차이를 기초로 계산하였다. 이들 조건을 비교한 두 스크린 Z-팩터 값은 탁월한 검정을 입증하는 0.5 내지 1이었다.
도 3A-D ┃ 세포 수/웰은 배지 및 에를로티닙 처리 둘 다에서 모든 조건에 대해 평균 세포 수/웰/플레이트에 의해 정규화되었다. 2개의 상이한 플레이트에 걸쳐 수행된 2개의 웰 사이의 상관관계를 계산하였다.
도 4A-B ┃ 두 siRNA 스크린에 대해 Z-팩터를 비-표적 대조군 (NTC)에 대해 배지 및 에를로티닙 처리 조건 사이의 차이, 뿐만 아니라 에를로티닙 처리 조건에서 비-표적 대조군 및 양성 대조군 (HDAC3 siRNA 단일 3) 사이의 차이를 기초로 계산하였다. 이들 조건을 비교한 두 스크린 Z-팩터 값은 탁월한 검정을 입증하는 0.5 내지 1이었다.
도 5A-O ┃ 다양한 염색질 개질제에 대한 siRNA 스크린 실행 #1 및 2에서의 세포 수/웰은 A: ATRX, B: UBE2A, C:UBE2B, D:MYST4, E:EZH2, F:HDAC2, G:HDAC3, H:CDYL, I:LRWD1, J:CHD7, K:PHF10, L:PHF12, M:PHF23, N:CHD1, O:RING1B에 나타낸 바와 같다. 4종의 상이한 특정한 siRNA (다마콘 si게놈(Dharmacon siGenome) siRNA)를 갖는 배지 (모 세포: 다이아몬드 기둥) 및 에를로티닙 (약물 저항성 지속자 (DTP): 단색 회색 기둥) 조건 중 세포 수를 비-표적 대조군 (NTC)에 대한 데이터와 함께 제시하였다.
도 6 ┃ 4개의 상이한 특정한 siRNA (다마콘 si게놈 siRNA)/유전자를 사용한, PC9 모세포 (단색 회색 기둥: 배지 조건) 및 DTP (다이아몬드 기둥: 에를로티닙 조건) 세포 수에 대한 폴리콤 그룹 (PcG) 다중단백질 PRC1-유사 복합체 (PRC1)의 다양한 필수 성분: RING1B, CBX2, CBX3, CBX4, CBX6, CBX7, CBX8의 siRNA 녹다운의 효과. 데이터를 유사한 처리 조건에서의 비-표적 (NTC) 및 siTOX 대조군에 대한 데이터와 함께 제시하였다.
도 7 ┃ 4개의 상이한 특정 siRNA (다마콘 si게놈 siRNA)/유전자를 사용한, PC9 모세포 (단색 회색 기둥: 배지 조건) 또는 DTP (다이아몬드 기둥: 에를로티닙 조건) 세포 수에 대한 PRC1 및 2의 다양한 성분: EZH1, EZH2, SUZ12, EED, RBBP4, HDAC1, HDAC2의 siRNA 녹다운의 효과. 배아 외배엽 발달 (EED) 단백질 및 HDAC1에 대해 8개의 상이한 특정한 siRNA (다마콘 si게놈 (x4) 및 온-타겟 플러스(On-Target Plus: OTP)(x4) siRNA)를 사용하였다. 데이터를 유사한 처리 조건에서의 비-표적 (NTC) 및 siTOX 대조군에 대한 데이터와 함께 제시하였다.
도 8A-C ┃ 8개의 상이한 특정한 siRNA (다마콘 si게놈 (x4) 및 온-타겟 플러스 (OTP)(x4))/유전자를 사용한, PC9 모세포 (흑색 기둥: 배지 조건) 또는 DTP (연회색 기둥: 에를로티닙 조건) 세포 수에 대한 PRC2 복합체의 필수 성분: EZH2 (A), SUZ12 (B) 및 EED (C)의 siRNA 녹다운의 효과. 데이터를 유사한 처리 조건에서의 비-표적 (NTC) 및 siTOX 대조군에 대한 데이터와 함께 제시하였다.
도 9A-C ┃ 8개의 상이한 특정한 siRNA (다마콘 si게놈 (x4) 및 온-타겟 플러스 (OTP)(x4))/유전자를 사용한, H1299 모세포 (흑색 기둥: 배지 조건) 또는 DTP (연회색 기둥: 파클리탁셀 조건) 세포 수에 대한 PRC2 복합체의 필수 성분: EZH2 (A), SUZ12 (B) 및 EED (C)의 siRNA 녹다운의 효과. 데이터를 유사한 처리 조건에서의 비-표적 (NTC) 및 siTOX 대조군에 대한 데이터와 함께 제시하였다.
도 10A-C ┃ 8개의 상이한 특정한 siRNA (다마콘 si게놈 (x4) 및 온-타겟 플러스 (OTP)(x4))/유전자를 사용한, 에를로티닙의 존재 하에 (연회색 기둥) 또는 부재 하에 (흑색 기둥) 처리된 PC9 약물 저항성 형성 지속자 (DTEP)에 대한 PRC2 복합체의 필수 성분: EZH2 (A), SUZ12 (B) 및 EED (C)의 siRNA 녹다운의 효과. 데이터를 유사한 처리 조건에서의 비-표적 (NTC) 및 siTOX 대조군에 대한 데이터와 함께 제시하였다.
도 11A-C ┃ 배양된 인간 급성 골수성 백혈병에서 용량-의존성 방식 (0.2-1 μM)으로 EZH2 수준을 감소시키고 히스톤 H3 상의 리신 27의 트리메틸화를 억제하는, 이전에 기재된 바와 같은 3-데아자네플라노신 A (DZNep), 3-데아자아데노신의 시클로펜테닐 유사체의 효과 (Fiskus, W. et al. (2009) Blood 114(13), 2733-2743). DZNep를 0.625 내지 40 μM (A) 범위의 농도에서 시험하였다. PC9 세포를 (DTP) (DMSO/에를로티닙 또는 DZNep/에를로티닙)로 또는 에를로티닙 (모세포)(DMSO/배지 또는 DZNep/배지) 없이 72시간 동안 처리하기 전에 DZNep (DZNep/배지 또는 DZNep/에를로티닙) 또는 DMSO 대조군 (DMSO/배지 또는 DMSO/에를로티닙)으로 48시간 동안 처리하였다. 세포 수를 48-72시간 후에 배지 단독 중 회복 상에서 측정하였다. PC9 모세포 (단색 회색 기둥: 배지 조건) 또는 DTP (다이아몬드 기둥: 에를로티닙 조건) 세포 수에 대한 5 (B) 및 0.625 μM (C)에서의 DZNep의 효과.
도 12 ┃ 8개의 상이한 특정한 siRNA (다마콘 si게놈 (x4) 및 온-타겟 플러스 (OTP)(x4))/유전자를 사용한, PC9 모세포 (단색 회색 기둥: 배지 조건) 또는 DTP (다이아몬드 기둥: 에를로티닙 조건) 세포 수에 대한 히스톤 데아세틸라제 NuRD 복합체의 필수 성분 (CHD4, MBD3, RBBP4, HDAC1, HDAC2)의 siRNA 녹다운의 효과. 데이터를 유사한 처리 조건에서의 비-표적 (NTC) 및 siTOX 대조군에 대한 데이터와 함께 제시하였다.
도 13A-B ┃ 4개의 상이한 특정한 siRNA (다마콘 si게놈)/유전자를 사용한, H1299 모세포 (X 축: 배지 조건) 또는 DTP (Y 축: 파클리탁셀 조건)에 따른 Z 스코어 (NTC 대조군/플레이트에 대한 데이터에 대해 정규화한 후 모든 스크린 플레이트에 걸쳐 NTC 대조군을 기초로 계산함)에 있어서 다른 염색질 개질제 (연회색 점)과 비교한 ATRX (단어와 함께 진회색 점)의 siRNA 녹다운의 효과. 데이터를 유사한 처리 조건에서의 비-표적 (NTC)(오른쪽 진회색 점) 및 siTOX 대조군 (왼쪽 진회색 점)에 대한 데이터와 함께 제시하였다.
도 14A-B ┃ (A) 에를로티닙 처리를 사용하여 PC9 세포에서 확인되는 양성 siRNA의 표. (B) 파클리탁셀 처리를 사용하여 H1299 세포에서 확인되는 양성 siRNA의 표.
도 15A-C ┃ PC9 DTP에서 히스톤 H3K27me3은 증가한 반면 H3K27Ac는 감소하였다. (A) 번역후 변형의 히스톤 H3 꼬리 및 아미노산 위치의 도식. SUZ12, EZH2, 및 EED, 메틸레이트 K27를 포함하는 PRC2 복합체. (B) 웨스턴 블롯에 의해 나타낸 바와 같이 모세포 PC9 세포주와 비교한 PC9 DTP에서 히스톤 H3K27me3은 증가한 반면 H3K27Ac는 감소하였다. (C) 질량 분광측정법에 의해 측정된 바와 같이 모세포 PC9 세포주와 비교한 PC9 DTP에서 히스톤 H3K27me3은 증가한 반면 H3K27Ac는 감소하였다.
도 16A-C ┃ 다양한 모델에서 DTP는 HDAC 억제제에 대한 증가된 감수성을 나타내었다. (A) 배지 단독에서 또는 25 nM의 HDAC 억제제 TSA의 존재 하에 2.5 Gy로 처리된 SKBR3. (B) 배지 단독 또는 25 nM의 HDAC 억제제 TSA의 존재 하에 10 Gy로 처리된 SKBR3. (C) 배지 단독 또는 25 nM의 HDAC 억제제 TSA 존재 하에 1 μM 라파티닙으로 처리된 SKBR3.
도 17A-C ┃ HDAC (1), 2 및 3은 약물 저항성의 발생과 관계된다. HDAC2 및 3에 대한 siRNA 뿐만 아니라 HDAC1/2 또는 3인 억제제는 약물-저항성 상태를 편중되게 억제한다. (A-B) 4개의 상이한 특정한 siRNA/유전자를 사용한 PC9 모세포 (연회색 기둥: 배지 조건) 또는 DTP (진회색: 에를로티닙 조건) 세포 수에 대한 HDAC2 및 HDAC3의 필수 성분의 siRNA 녹다운의 효과. 데이터를 유사한 처리 조건에서의 비-표적 (NTC) 및 siTOX 대조군에 대한 데이터와 함께 제시하였다. (C) (C1) G946, HDAC1/2 편중된 억제제, 및 (C2) G877, HDAC3 편중된 억제제의 효과. G946 및 G877을 50 nM 및 5 μM의 농도로 각각 시험하였다. PC9 세포를 (DTP) (DMSO/에를로티닙 또는 HDAC 억제제/에를로티닙) (C1 및 C2)로 30 일 동안 또는 에를로티닙 (모세포) (DMSO/배지 또는 HDAC 억제제/배지) (데이터 나타내지 않음) 없이 처리하였다. 에를로티닙 농도 1 μM.
도 18 ┃ PC9 이종이식편에서의 에를로티닙 반응에 대한 TSA (0.5 mg/kg)를 사용한 HDAC 억제의 효과.
도 19A-B ┃ EZH2, PRC2의 구성원이 약물-저항성의 확립에 관계된다. EZH2 또는 및 EZH2 억제제의 소분자 억제제 (GSK126)에 대한 siRNA는 둘 다 약물-저항성 상태를 억제한다. (A) 8개의 상이한 특정한 siRNA (다마콘 si게놈 (x4) 및 온-타겟 플러스 (OTP)(x4))/유전자를 사용한, PC9 모세포 (연회색 기둥: 배지 조건) 또는 DTP (진회색: 에를로티닙 조건) 세포 수에 대한 EZH2의 siRNA 녹다운의 효과. 데이터를 유사한 처리 조건에서의 비-표적 (NTC) 및 siTOX 대조군에 대한 데이터와 함께 제시하였다. (B) GSK126의 효과를 1 μM 농도에서 시험하였다. PC9 세포를 (DTP) (DMSO/에를로티닙 또는 GSK126/에를로티닙) (B, 하단 왼쪽 및 오른쪽 각각)로 30 일 동안 또는 에를로티닙 (모세포) (DMSO/배지 또는 GSK126/배지) (B, 상단 왼쪽 및 오른쪽 각각) 없이 처리하기 전에 GSK126 (배지로 또는 에를로티닙으로) 또는 DMSO 대조군 (DMSO/배지 또는 DMSO/에를로티닙)으로 4일 동안 처리하였다.
도 20A-D ┃ EZH2 억제제 (GSK126)는 약물-저항성 상태를 억제한다. (A) 에를로티닙으로 처리된 PC9 DTP에서의 히스톤 H3K27me3의 증가는 웨스턴 블롯에 의해 나타낸 바와 같이 EZH2 소분자 억제제 (GSK126)에 의해 0.1, 0.5, 및 2.5 μM에서 억제된다. (B) nuc-red PC9 세포를 0.1, 0.5, 또는 2.5 μM 농도의 DMSO/에를로티닙 또는 GSK126/에를로티닙으로 (진회색 기둥) 또는 에를로티닙 없이 (DMSO/배지 또는 GSK126/배지) (연회색 기둥)로 처리하고, 인큐사이트(IncuCyte)™으로 제9일 및 제3일에 각각 분석하였다. (C) nuc-red PC9 세포를 2.5 μM의 DMSO/에를로티닙 또는 GSK126/에를로티닙으로 9일 동안 처리하고, 이미지화하였다. (D) nuc-red PC9 세포를 2.5 μM의 DMSO/에를로티닙 또는 GSK126/에를로티닙으로 30일 동안 처리하고, 기엠사(Giemsa)로 염색하였다. 도 20A-D에 대해 에를로티닙 농도 1 μM.
도 21A-B ┃ EZH2 억제제 (GSK126 및 EPZ-6438)는 약물-저항성 상태를 억제한다. (A) PI3K 억제제, GDC-0908로 처리된 EVSAT DTP 중 히스톤 H3K27me3의 증가는 웨스턴 블롯에 의해 나타낸 바와 같이 EZH2 소분자 억제제 (0.1, 0.5, 및 2.5 μM의 GSK126 및 0.05, 0.1, 및 0.5 μM의 EPZ-6438)에 의해 억제된다. (B) nuc-red EVSAT 세포를 0.1, 0.5, 또는 2.5 μM의 DMSO/GDC-0908, GSK126/GDC-0908 또는 0.05, 0.1, 및 0.5 μM의 EPZ-6438/GDC-0908으로 (진회색 기둥) 또는 GDC-0908 없이 (DMSO/배지, GSK126/배지, EPZ-6438/배지) (연회색 기둥) 처리하고, 인큐사이트™으로 제9일 및 제3일에 각각 분석하였다. 도 21A-B에 대해 GDC-0908 농도 2 μM.
도 22A-D ┃ EZH2 억제제 (EPZ-6438)는 약물-저항성 상태를 억제한다. (A) 에를로티닙으로 처리한 PC9 DTP 중 히스톤 H3K27me3에서의 증가는 웨스턴 블롯에 의해 나타낸 바와 같이 0.05, 0.1, 0.5, 1, 및 1.5 μM의 EZH2 소분자 억제제 (EPZ-6438)에 의해 억제된다. (B) nuc-red PC9 세포를 0.05, 0.1, 0.5, 1, 및 1.5 μM의 DMSO/에를로티닙 또는 EPZ-6438/에를로티닙으로 (진회색 기둥) 또는 에를로티닙 없이 (DMSO/배지 또는 EPZ-6438/배지) (연회색 기둥) 처리하고, 인큐사이트™으로 제9일 및 제3일에 각각 분석하였다. (C) nuc-red PC9 세포를 1 μM의 DMSO/에를로티닙 또는 EPZ-6438/에를로티닙으로 9일 동안 처리하고, 이미지화하였다. (D) nuc-red PC9 세포를 0.05, 0.1, 또는 1.0 μM의 DMSO/에를로티닙 또는 EPZ-64386/에를로티닙으로 30일 동안 처리하고, 기엠사로 염색하였다. 도 22A-D에 대해 에를로티닙 농도 1 μM.
I. 정의
관심 폴리펩티드의 "길항제" ("억제제"로 상호교환가능하게 칭해짐)는 관심 폴리펩티드의 활성화 또는 기능을 방해하는, 예를 들어 관심 폴리펩티드에 의해 매개되는 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나 또는 중화시키는 작용제이다. 예를 들어, 폴리펩티드 X의 길항제는 폴리펩티드 X에 의해 매개되는 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나 또는 중화시키는 임의의 분자를 지칭할 수 있다. 억제제의 예는 항체; 리간드 항체; 소분자 길항제; 안티센스 및 억제 RNA (예를 들어, shRNA) 분자를 포함한다. 바람직하게는, 억제제는 관심 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 소분자이다. 특정한 실시양태에서, 억제제는 관심 폴리펩티드에 대한 결합 친화도 (해리 상수)가 약 1,000 nM 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 억제제는 관심 폴리펩티드에 대한 결합 친화도가 약 100 nM 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 억제제는 관심 폴리펩티드에 대한 결합 친화도가 약 50 nM 이하이다. 특정한 실시양태에서, 억제제는 관심 폴리펩티드에 공유 결합된다. 특정한 실시양태에서, 억제제는 1,000 nM 이하의 IC50으로 관심 폴리펩티드의 신호전달을 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 억제제는 500 nM 이하의 IC50으로 관심 폴리펩티드의 신호전달을 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 억제제는 50 nM 이하의 IC50으로 관심 폴리펩티드의 신호전달을 억제한다. 특정 실시양태에서, 길항제는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과로 관심 폴리펩티드의 발현 수준 또는 생물학적 활성을 감소시키거나 또는 억제한다. 일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드는 염색질 개질제이다. 일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드는 EGFR이다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 달리 나타내지 않는 한 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 비롯한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 폴리펩티드를 지칭한다. 이 용어는 "전장"의 비프로세싱된 폴리펩티드, 뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 생성된 임의의 형태의 폴리펩티드를 포괄한다. 이 용어는 또한 폴리펩티드의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포괄한다.
"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 존재하는 경우에 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후에, 예컨대 표지와의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은, 예를 들어 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드를 유사체로 "캡" 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 예를 들어 비하전된 연결 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 하전된 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것, 펜던트 모이어티, 예컨대 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 삽입제 (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)을 갖는 것, 킬레이트화제 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)을 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형된 연결 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 갖는 것, 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드(들)의 비변형된 형태를 포함한다. 추가로, 당 내에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실 기가, 예를 들어 포스포네이트 기, 포스페이트 기로 대체되거나, 표준 보호 기로 보호되거나, 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결이 만들어지도록 활성화되거나, 또는 고체 또는 반고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH가 인산화되거나 또는 아민 또는 1 내지 20개 탄소 원자의 유기 캡핑 기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 일반적으로 관련 기술분야에 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사형, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비-시클릭 유사체 및 무염기 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결이 대안적인 연결 기로 대체될 수 있다. 이들 대안적인 연결 기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), "(O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H이거나 또는 임의로 에테르 (-O-) 연결을 함유하는 치환 또는 비치환 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아랄딜임)로 대체되는 실시양태를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 상기 기재는 RNA 및 DNA를 비롯한, 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
용어 "소분자"는 약 2000 달톤 이하, 바람직하게는 약 500 달톤 이하의 분자량을 갖는 임의의 분자를 지칭한다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가를 위한 방법의 검토에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
용어 관심 항체의 항-폴리펩티드 및 관심 폴리펩티드에 "결합하는 항체"는 항체가 관심 폴리펩티드의 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 관심 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 관심 단백질의 관련되지 않은 비-폴리펩티드에 대한 관심 항체의 항-폴리펩티드의 결합 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA)에 의해 측정 시 관심 폴리펩티드에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, 관심 폴리펩티드에 결합하는 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 관심 항체의 항-폴리펩티드는 여러 종으로부터의 관심 폴리펩티드들에서 보존되는 관심 폴리펩티드의 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드는 염색질 개질제이다. 일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드는 EGFR이다.
"차단 항체" 또는 "길항제 항체"는 그가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 또는 감소시키는 항체이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 비롯한, 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법으로 측정될 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적인 설명적 및 예시적 실시양태가 하기 기재된다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭하고, 반대로 참조 항체는 경쟁 검정에서 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단한다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 다른 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 이러한 집단을 구성하는 개별 항체는 일반적으로 소량으로 존재할 수도 있는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 포함하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 생성되는 가능한 변이체 항체를 제외하고는 동일하고/거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로서 간주되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술, 이러한 방법 및 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 사용하여 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 배제된다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
"면역접합체"는 세포독성제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
본원에 사용된 용어 "표적화된 치료제"는 관심 폴리펩티드(들)에 결합하여 특정한 관심 폴리펩티드(들)의 활성 및/또는 활성화를 억제하는 치료제를 지칭한다. 이러한 작용제의 예는 관심 폴리펩티드에 결합하는 항체 및 소분자를 포함한다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물을 지칭한다. 화학요법제의 예는 알킬화제 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)®); 알킬 술포네이트 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민 (알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸로멜라민 포함); 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (하이캄틴(HYCAMTIN)®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); CDP323, 경구 알파-4 인테그린 억제제; 디네미신 (디네미신 A 포함); 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 연관 색소단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (아드리아마이신(ADRIAMYCIN)®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사 (독실(DOXIL)®), 리포솜 독소루비신 TLC D-99 (미오세트(MYOCET)®), peg화 리포솜 독소루비신 (케릭스(CAELYX)®), 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물 예컨대 메토트렉세이트, 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®), 테가푸르 (유프토랄(UFTORAL)®), 카페시타빈 (젤로다(XELODA)®), 에포틸론, 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (JHS 내츄럴 프로덕츠(Natural Products), 미국 오레곤주 유진); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)®), 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제제 (아브락산(ABRAXANE)™), 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 작용제 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 (예를 들어, 엘록사틴(ELOXATIN)®), 및 카르보플라틴; 튜불린 중합이 미세관 형성을 형성하는 것을 방지하는 빈카 (빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®), 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®), 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®), 및 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®) 포함); 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 류코보린; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산 (벡사로텐 (탈그레틴(TARGRETIN)®) 포함); 비스포스포네이트 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 에티드로네이트 (디드로칼(DIDROCAL)®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타(ZOMETA)®), 알렌드로네이트 (포사맥스(FOSAMAX)®), 파미드로네이트 (아레디아(AREDIA)®), 틸루드로네이트 (스켈리드(SKELID)®), 또는 리세드로네이트 (악토넬(ACTONEL)®); 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 및 상기 임의의 작용제의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 2종 이상의 상기 작용제의 조합물, 예컨대 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어); 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)™에 의한 치료 요법에 대한 약어)을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제 또는 방지하고/거나 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제 또는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제), 성장 억제제, 효소 및 그의 단편, 예컨대 핵산분해 효소, 항생제, 및 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함), 및 하기 개시된 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하는 것으로 의도된다. 다른 세포독성제는 하기 기재되어 있다. 종양사멸제는 종양 세포의 파괴를 유발한다.
"개체 반응" 또는 "반응"은 (1) 질환 진행 (예를 들어, 암 진행)의 어느 정도까지의 억제, 예를 들어 지연 및 완전한 정지; (2) 종양 크기의 감소; (3) 인접한 말초 기관 및/또는 조직으로의 암 세포 침윤의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지); (4) 전이의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지); (5) 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)와 연관된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 완화; (6) 무진행 생존 기간의 증가; 및/또는 (7) 치료 후 주어진 시점에서의 감소된 사망률을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 개체에게 이익을 나타내는 임의의 종점을 사용하여 평가될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 동일한"은 통상의 기술자가 2개의 값 (예를 들어, Kd 값 또는 발현)에 의해 측정된 생물학적 특성과 관련하여 이들 2개의 값 사이의 차이를 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 없거나 또는 전혀 없는 것으로 간주할 정도로, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 값의 함수로서, 예를 들어 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만 및/또는 약 10% 미만이다.
본원에 사용된 어구 "실질적으로 상이한"은 통상의 기술자가 2개의 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특성과 관련하여 이들 2개의 값 사이의 차이를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주할 정도로, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서, 예를 들어 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과 및/또는 약 50% 초과이다.
물질/분자, 예를 들어 제약 조성물의 "유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 유효한 양을 지칭한다.
물질/분자의 "치료 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 중량, 개체에서 원하는 반응을 유도하기 위한 물질/분자의 능력과 같은 인자에 따라 상이할 수 있다. 또한, 치료 유효량은 물질/분자의 임의의 독성 또는 유해한 효과보다 치료상 유익한 효과가 능가하는 양이다. "예방 유효량"은 원하는 예방 결과 달성에 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 유효한 양을 지칭한다. 전형적으로, 그러나 반드시는 아니지만, 예방 용량은 질환의 보다 초기 단계 전에 또는 보다 초기 단계에서 대상체에 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 것이다.
용어 "제약 제제"는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태로 존재하며, 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 비독성인, 활성 성분 이외의 다른 제약 제제 내의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 어구 "제약상 허용되는 염"은 화합물의 제약상 허용되는 유기 또는 무기 염을 지칭한다.
본원에 사용된 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)는 치료할 개체의 자연적 과정을 변경시키려는 임상 개입을 지칭하고, 임상 병리상태의 예방을 위해 또는 그 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 축소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 발생을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 지연시키는데 사용된다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
용어 "부수적으로"는 개별 치료 효과가 제시간에 중첩되도록 일시적으로 충분히 근접한 둘 이상의 치료제의 투여를 지칭하는 것으로 사용된다. 따라서, 공동 투여는 하나 이상의 작용제(들)의 투여를 하나 이상의 다른 작용제(들)의 투여를 중단한 후에 계속하는 경우의 투여 요법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 부수적인 투여는 공동으로, 순차적으로, 및/또는 동시에 수행된다.
"감소시키거나 또는 억제하는"은 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과의 전체 감소를 유발하는 능력을 의미한다. 감소시키거나 또는 억제하는은 치료할 장애의 증상, 전이의 존재 또는 크기, 또는 원발성 종양의 크기를 지칭할 수 있다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 상업용 패키지 내에 통상적으로 포함되어 있으며 이러한 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기사항 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는 지침서를 지칭하도록 사용된다.
"제조품"은 하나 이상의 시약, 예를 들어 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)를 치료하기 위한 의약 또는 본원에 기재된 바이오마커를 특이적으로 검출하기 위한 프로브를 포함하는 임의의 제조품 (예를 들어, 패키지 또는 용기) 또는 키트이다. 특정 실시양태에서, 제조품 또는 키트는 본원에 기재된 방법을 수행하기 위한 유닛으로서 판촉되거나, 배급되거나 또는 판매된다.
통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에서 "약"의 값 또는 파라미터에 대한 지칭은 그 값 또는 파라미터 자체에 대한 실시양태를 포함(하고 이를 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 지칭하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본원에 기재된 본 발명의 측면 및 실시양태는 측면 및 실시양태로 "로 이루어지는" 및/또는 "로 본질적으로 이루어지는" 것을 포함하는 것으로 이해된다. 본원에 사용된 단수 형태는 달리 나타내지 않는 한 복수 대상을 포함한다.
II. 방법 및 용도
본원은, 예를 들어 암을 치료하고 약물 내성을 방지하기 위한 염색질 개질제의 조절제를 사용하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 개체는 암 요법제 (예를 들어, 표적 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)에 의한 치료를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 개체는 암 요법제에 의한 치료 전에 염색질 개질제의 조절제의 투여를 포함하는 치료를 시작한다. 일부 실시양태에서, 개체는 염색질 개질제의 조절제를 포함하는 치료 및 상기 암 요법제를 동시에 받는다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제는 암 감수성의 기간을 증가시키고/거나 암 내성의 발생을 지연시킨다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제는 염색질 개질제의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 EZH2, SUZ12, 및/또는 EED의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 HDAC2 및/또는 HDAC3의 길항제이다.
또한 본원은 염색질 개질제의 조절제 및 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)를 이용하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제는 염색질 개질제의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 EGFR 길항제 또는 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀)이다.
특히, 본원은 개체에게 (a) 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)를 투여하는 것을 포함하는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제 및 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)의 각각의 양은 암 감수성의 기간을 증가시키고/거나 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)에 대한 세포 내성의 발생을 지연시키는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제 및 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)의 각각의 양은 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)를 포함하는 암 치료의 효능을 증가시키는데 효과적이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제 및 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)의 각각의 양은 유효량의 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)를 염색질 개질제의 조절제 없이 (부재 하에) 투여하는 것을 포함하는 표준 치료와 비교하여 증가된 효능에 대해 효과적이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제 및 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)의 각각의 양은 유효량의 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)를 염색질 개질제의 조절제 없이 (부재 하에) 투여하는 것을 포함하는 표준 치료와 비교하여 증가된 반응 (예를 들어, 완전 반응)에 대해 효과적이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제 및 암 요법제는 부수적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 EGFR 길항제이다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 (a) 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 (b) EGFR 길항제를 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR 길항제는 에를로티닙 및/또는 게피티닙이다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 탁산이다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 (a) 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 (b) 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제는 염색질 개질제의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 EZH2, SUZ12, 및/또는 EED의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 HDAC2 및/또는 HDAC3의 길항제이다.
본원은 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 유효량의 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)를 포함하는 암 치료의 효능을 증가시키는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제 및 암 요법제가 부수적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 EGFR 길항제이다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 (a) 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 (b) EGFR 길항제를 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR 길항제는 에를로티닙 및/또는 게피티닙이다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 탁산이다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 (a) 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 (b) 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제는 염색질 개질제의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 EZH2, SUZ12, 및/또는 EED의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 HDAC2 및/또는 HDAC3의 길항제이다.
본원은 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 유효량의 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)를 투여하는 것을 포함하는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 암 치료는 유효량의 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)를 염색질 개질제의 조절제 없이 (부재 하에) 투여하는 것을 포함하는 표준 치료와 비교하여 증가된 효능을 갖는다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제 및 암 요법제가 부수적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 EGFR 길항제이다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 (a) 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 (b) EGFR 길항제를 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR 길항제는 에를로티닙 및/또는 게피티닙이다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 탁산이다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 (a) 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 (b) 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제는 염색질 개질제의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 EZH2, SUZ12, 및/또는 EED의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 HDAC2 및/또는 HDAC3의 길항제이다.
또한, 본원은 게체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 유효량의 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)에 대해 내성인 암의 발생을 지연시키고/거나 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제 및 암 요법제가 부수적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 EGFR 길항제이다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 (a) 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 (b) EGFR 길항제를 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR 길항제는 에를로티닙 및/또는 게피티닙이다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 탁산이다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 (a) 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 (b) 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제는 염색질 개질제의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 EZH2, SUZ12, 및/또는 EED의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 HDAC2 및/또는 HDAC3의 길항제이다.
본원은 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 유효량의 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)를 투여하는 것을 포함하는 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)에 대한 내성 발생의 증가된 가능성을 갖는 암을 앓는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제 및 암 요법제가 부수적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 EGFR 길항제이다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 (a) 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 (b) EGFR 길항제를 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR 길항제는 에를로티닙 및/또는 게피티닙이다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 탁산이다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 (a) 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 (b) 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제는 염색질 개질제의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 EZH2, SUZ12, 및/또는 EED의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 HDAC2 및/또는 HDAC3의 길항제이다.
본원은 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 유효량의 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)을 투여하는 것을 포함하는 암을 앓는 개체에서 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)에 대한 감수성을 증가시키는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제 및 암 요법제가 부수적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 EGFR 길항제이다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 (a) 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 (b) EGFR 길항제를 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR 길항제는 에를로티닙 및/또는 게피티닙이다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 탁산이다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 (a) 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 (b) 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제는 염색질 개질제의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 EZH2, SUZ12, 및/또는 EED의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 HDAC2 및/또는 HDAC3의 길항제이다.
또한, 본원은 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 유효량의 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)를 투여하는 것을 포함하는 암을 앓는 개체에서 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법) 감수성의 기간을 연장시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제 및 암 요법제가 부수적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 EGFR 길항제이다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 (a) 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 (b) EGFR 길항제를 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR 길항제는 에를로티닙 및/또는 게피티닙이다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 탁산이다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 (a) 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 (b) 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제는 염색질 개질제의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 EZH2, SUZ12, 및/또는 EED의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 HDAC2 및/또는 HDAC3의 길항제이다.
본원은 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 유효량의 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)을 투여하는 것을 포함하는 암을 앓는 개체에서 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)에 대한 반응의 지속기간을 연장시키는 방법을 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제 및 암 요법제가 부수적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 EGFR 길항제이다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 (a) 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 (b) EGFR 길항제를 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR 길항제는 에를로티닙 및/또는 게피티닙이다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 탁산이다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 (a) 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 (b) 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제는 염색질 개질제의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 EZH2, SUZ12, 및/또는 EED이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 HDAC2 및/또는 HDAC3의 길항제이다.
개선된 암의 치료를 제공하는 것 이외에도, 본원에 기재된 특정 조합물의 투여는 상이한 치료를 받은 동일한 환자에 의해 경험된 삶의 질과 비교하여 환자의 삶의 질을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 개체에게 본원에 기재된 바와 같이 염색질 개질제의 길항제 및 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)의 조합을 투여하는 것은 동일한 환자가 요법으로서 단지 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)를 받을 경우에 경험할 삶의 질과 비교하여 개선된 삶의 질을 제공할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 조합에 의한 조합 요법은 필요한 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)의 용량을 낮춤으로써 치료와 연관된 부작용 (예를 들어 오심, 구토, 탈모, 발진, 감소된 식욕, 체중 감소 등)을 줄일 수 있다. 조합은 또한 종양 부담 및 연관된 유해 사례, 예컨대 통증, 기관 기능장애, 체중 저하 등의 감소를 유발할 수 있다. 따라서, 한 측면은 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)에 의해 암을 치료받는 환자의 삶의 질을 개선시키기 위한 치료 용도를 위한 염색질 개질제의 길항제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 표적화 요법은 EGFR 길항제이다. 일부 실시양태에서, EGFR 길항제는 에를로티닙 및/또는 게피티닙이다. 일부 실시양태에서, 화학요법은 탁산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 EZH2, SUZ12, 및/또는 EED의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 HDAC2 및/또는 HDAC3의 길항제이다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제는 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자, 또는 폴리뉴클레오티드이다. 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자, 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 EZH2, SUZ12, 및/또는 EED의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 HDAC2 및/또는 HDAC3의 길항제이다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 요법제는 표적화 요법제이다. 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 요법제는 화학요법제이다. 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암 요법제는 방사선요법제이다.
본원에 사용된 요법에 대한 내성을 갖는 암은 요법에 대해 반응성이지 않고/거나 요법에 대해 유의한 반응 (예를 들어, 부분 반응 및/또는 완전 반응)을 생성하는 능력이 감소된 암을 포함한다. 내성은 치료 방법의 도중에 발생하는 획득 내성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 획득 약물 내성은 일시적 및/또는 가역적 약물 저항성이다. 요법에 대한 일시적 및/또는 가역적 약물 내성은 치료 방법의 중단 후에 요법에 대한 감수성을 회복시킬 수 있는 약물 내성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 획득 내성은 영구적 내성이다. 요법에 대한 영구적 내성은 약물 내성을 부여하는 유전적 변화를 포함한다.
본원에 사용된 요법에 대한 감수성을 갖는 암은 반응성이고/거나 유의한 반응 (예를 들어, 부분 반응 및/또는 완전 반응)를 생성할 수 있는 암을 포함한다.
요법에 대한 내성의 획득 및/또는 감수성의 유지를 평가 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고 실시예에 기재되어 있다. 약물 내성 및/또는 감수성은 (a) 참조 암 세포 또는 세포 집단을 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제)의 존재 및/또는 부재 하에 암 요법제에 노출시키고/거나 (b) 예를 들어 암 세포 성장, 세포 생존율, 수준 및/또는 백분율 아폽토시스, 및/또는 반응 중 하나 이상에 대해 검정함으로써 결정될 수 있다. 약물 내성 및/또는 감수성은 시간에 걸쳐 및/또는 암 요법제의 다양한 농도에서 및/또는 염색질 개질제의 길항제의 양으로 측정될 수 있다. 약물 내성 및/또는 감수성은 추가로 측정되고/거나 참조 세포주 (예를 들어, PC9 및/또는 H1299), 예를 들어 세포주의 모세포, 약물 저항성 지속자 세포, 및/또는 약물 저항성 확대된 지속자 세포와 비교될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 생존율은 싸이퀀트 다이렉트(CyQuant Direct) 세포 증식 검정에 의해 검정될 수 있다. 내성의 획득 및/또는 감수성 유지의 변화, 예컨대 약물 저항성은 실시예 및 샤르마(Sharma) 등의 문헌에 기재된 바와 같이 약물 저항성 지속자의 성장을 검정함으로써 평가될 수 있다. 내성의 획득 및/또는 감수성의 유지의 변화, 예컨대 영구적 내성 및/또는 확대된 내성자는 실시예 및 샤르마 등의 문헌에 기재된 바와 같이 약물 저항성 확대된 지속자의 성장을 검정함으로써 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 내성은 약물 저항성 지속자 및/또는 약물 저항성 확대된 지속자에서 IC50, EC50 또는 종양 성장 감소의 변화에 의해 나타내어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 변화는 약 50%, 100% 및/또는 200% 중 어느 하나보다 더 크다. 추가로, 내성의 획득 및/또는 감수성의 유지의 변화는, 예를 들어 요법에 대한 반응, 반응의 지속기간 및/또는 진행까지의 시간, 예를 들어 부분 반응 및 완전 반응을 평가함으로써 생체내에서 평가될 수 있다. 내성의 획득 및/또는 감수성의 유지의 변화는 개체의 집단에서 요법에 대한 반응, 반응의 지속기간 및/또는 진행까지의 시간의 변화, 예를 들어 부분 반응 및 완전 반응의 수를 기초로 할 수 있다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 폐암, 유방암, 결장직장암, 결장암, 흑색종, 및/또는 췌장암이다. 일부 실시양태에서, 암은 결장직장암이다. 일부 실시양태에서, 암은 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암 (NSCLC))이다. 일부 실시양태에서, 암은 췌장암이다. 일부 실시양태에서, 암은 유방암이다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종이다. 일부 실시양태에서, 암은 CD133 양성이다. 일부 실시양태에서, 암은 CD24 양성이다. 일부 실시양태에서, 암은 높은 수준의 H3K27 트리메틸화를 갖는다. 일부 실시양태에서, 암은 증가하는 수준의 H3K27 트리메틸화를 발생시킬 위험성이 있다. 일부 실시양태에서, 암은 낮은 수준의 H3K27 아세틸화를 갖는다. 일부 실시양태에서, 암은 감소하는 수준의 H3K27 아세틸화를 발생시킬 위험성이 있다.
염색질 개질제의 길항제 및 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)를 포함하는 치료 방법을 시작할 때 본원에 기재된 임의의 조합 요법 방법에서의 암은 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)를 단독으로 포함하는 치료 방법에 대해 감수성 (감수성의 예는 반응성이고/거나 유의한 반응 (예를 들어, 부분 반응 및/또는 완전 반응)을 생성할 수 있는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않음)일 수 있다. 염색질 개질제의 길항제 및 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)를 포함하는 치료 방법을 시작할 때 본원에 기재된 임의의 조합 요법 방법에서의 암은 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)를 단독으로 포함하는 치료 방법에 대해 내성 (내성의 예는 반응성이지 않고/거나 유의한 반응 (예를 들어, 부분 반응 및/또는 완전 반응)을 생성할 수 없는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않음)이 아닐 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 표적화 요법제이고, 표적화 요법제는 EGFR의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 화학요법제이고, 화학요법제는 탁산이다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 개체는 인간일 수 있다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 조합 요법은 부수적으로 투여될 수 있다. 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 조합 요법은 조합 투여 (여기서 2종 이상의 치료제가 동일한 또는 개별 제제에 포함됨) 및 개별 투여를 포괄할 수 있고, 이 경우에 염색질 개질제의 길항제 및 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)의 투여는 추가의 치료제 및/또는 아주반트의 투여 전에, 동시에, 순차적으로, 공동으로 및/또는 후에 일어날 수 있다. 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 염색질 개질제는 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법) 전에, 및/또는 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 방사선 요법 및/또는 추가의 치료제를 추가로 포함한다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법 및/또는 화학요법, 및/또는 방사선요법)는 경구, 비경구, 폐내 및 비강내를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 원하는 경우에 국부 치료를 위해 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 부분적으로는 투여가 단기간인지 또는 장기간인지의 여부에 따라, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)는 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화되고, 투약되고, 투여될 수 있다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료할 특정한 장애, 치료할 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 진료의에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 염색질 개질제의 길항제 및 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)는 해당 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제제화될 필요는 없지만, 임의로 그와 함께 제제화된다. 이러한 기타 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 염색질 개질제의 길항제 및 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 인자들에 좌우된다. 이는 일반적으로 상기 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 경로로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본원에 기재된 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)의 적절한 투여량 (단독으로, 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합되어 사용되는 경우에)은 치료할 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 염색질 개질제의 길항제 및 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 염색질 개질제의 길항제 및 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 좌우될 것이다. 염색질 개질제의 길항제 및 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 일반적으로 상태에 따라 질환 증상의 원하는 저해가 일어날 때까지 지속될 것이다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 (예를 들어, 환자가 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 염색질 개질제의 길항제 및 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)를 투여받도록) 투여될 수 있다. 보다 높은 초기 부하 용량을 투여한 후, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 예시적인 투여 요법은 투여를 포함한다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 (a) 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 (b) 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 (a) 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 (b) EGFR 길항제를 포함한다.
임의의 상기 제제 또는 치료 방법은 염색질 개질제 및/또는 EGFR 길항제와 같은 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
III. 치료 조성물
본원은 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 조합물은 단독으로 투여된 표적화된 치료의 효능을 증가시킨다. 특정 실시양태에서, 조합물은 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)에 대한 내성 암의 발생을 지연시키고/거나 예방한다. 특정 실시양태에서, 조합물은 암을 가진 개체에서 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법, 및/또는 방사선요법)에 대한 감수성의 기간을 연장시킨다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제 및/또는 암 요법제 (예를 들어, 표적 요법)는 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자, 및/또는 폴리뉴클레오티드이다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 조절제는 염색질 개질제의 길항제이다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 염색질 개질제는 폴리콤 억제 복합체 (PRC)의 구성원이다. 일부 실시양태에서, PRC의 구성원은 폴리콤 억제 복합체 1 (PRC1)의 구성원이다. 일부 실시양태에서, PRC1의 구성원은 RING1B, CBX3, CBX6, 및 CBX8 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, PRC의 구성원은 폴리콤 억제 복합체 2 (PRC2)의 구성원이다. 일부 실시양태에서, PRC2의 구성원은 EZH2 및/또는 EED이다. 일부 실시양태에서, PRC2의 구성원은 EZH2이다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 염색질 개질제는 뉴클레오솜 재형성 및 탈아세틸화 복합체 (NuRD)의 구성원이다. 일부 실시양태에서, NuRD의 구성원은 CHD4, RBBP4, HDAC1, HDAC2, 및 HDAC3 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, NuRD의 구성원은 HDAC2 및/또는 HDAC3이다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 염색질 개질제는 유비퀴틴-접합 효소이다. 일부 실시양태에서, 유비퀴틴-접합 효소는 UBE2A 및/또는 UBE2B이다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 염색질 개질제는 ATRX, MYST4, CDYL, LRWD1, CHD7, PHF10, PHF12, PHF23, CHD1, MGEA5, MLLT10, SIRT4, TP53BP1, BRDT, CBX6, EVI1, GTF3C4, HIRA, MPHOSPH8, NCOA1, RBBP5, TDRD7, 및 ZCWPW1 중 하나 이상이다. 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 염색질 개질제는 ATRX, MYST4, CDYL, LRWD1, CHD7, PHF10, PHF12, PHF23, 및 CHD1 중 하나 이상이다. 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 염색질 개질제는 MGEA5, MLLT10, SIRT4, TP53BP1, ATRX, BRDT, CBX6, CHD1, EVI1, GTF3C4, HIRA, MPHOSPH8, NCOA1, RBBP5, TDRD7, 및 ZCWPW1 중 하나 이상이다.
다양한 인간 염색질 개질제의 아미노산 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 공중이 이용가능하다. 예를 들어, ATRX (예를 들어, 엔트레즈 ID 546; 유니프롯비디(UniProtBD)/스위스-프롯(Swiss-Prot) P46100-1, P46100-2, P46100-3, P46100-4, P46100-5, 및/또는 P46100-6), UBE2A (예를 들어, 엔트레즈 ID 7319; 유니프롯비디/스위스-프롯 49459-1, P49459-2, 및/또는 P49459-3), UBE2B (예를 들어, 엔트레즈 ID 7320; 유니프롯비디/스위스-프롯 P63146), MYST4 (예를 들어, 엔트레즈 ID 23522; 유니프롯비디/스위스-프롯 Q8WYB5-1, Q8WYB5-2, 및/또는 Q8WYB5-3), EZH2 (예를 들어, 엔트레즈 ID 2146; 유니프롯비디/스위스-프롯 Q15910-1, Q15910-2, Q15910-3, Q15910-4, 및/또는 Q15910-5), HDAC2 (예를 들어, 엔트레즈 ID 3066; 유니프롯비디/스위스-프롯 Q92769 ), HDAC3 (예를 들어, 엔트레즈 ID 8841; 유니프롯비디/스위스-프롯 O15379-1 및/또는 O15379-2), CDYL (예를 들어, 엔트레즈 ID 9425; 유니프롯비디/스위스-프롯 Q9Y232-1, Q9Y232-2, Q9Y232-3, 및/또는 Q9Y232-4), LRWD1 (예를 들어, 엔트레즈 ID 222229; 유니프롯케이비/스위스-프롯 Q9UFC0), CHD7 (예를 들어, 엔트레즈 ID 55636; 유니프롯비디/스위스-프롯 Q9P2D1-1 및/또는 Q9P2D1-2), PHF10 (예를 들어, 엔트레즈 ID 55274; 유니프롯비디/스위스-프롯 Q8WUB8-1, Q8WUB8-2, 및/또는 Q8WUB8-3), PHF12 (예를 들어, 엔트레즈 ID 57649; 유니프롯비디/스위스-프롯 Q96QT6-1, Q96QT6-2, Q96QT6-3, 및/또는 Q96QT6-4), PHF23 (예를 들어, 엔트레즈 ID 79142; 유니프롯비디/스위스-프롯 Q9BUL5-1, 및/또는 Q9BUL5-2), CHD1 (엔트레즈 ID 1105; 유니프롯케이비/스위스-프롯 O14646-1 및/또는 O14646-2), RING1B (예를 들어, 엔트레즈 ID 6045; 유니프롯비디/스위스-프롯 Q99496), EED (예를 들어, 엔트레즈 ID 8726; 유니프롯비디/스위스-프롯 O75530-1, O75530-2, 및/또는 O75530-3), CBX3 (예를 들어, 엔트레즈 ID 11335; 유니프롯비디/스위스-프롯 Q13185), CBX6 (예를 들어, 엔트레즈 ID 23466; 유니프롯비디/스위스-프롯 O95503), CBX8 (예를 들어, 엔트레즈 ID 57332; 유니프롯비디/스위스-프롯 Q9HC52), CHD4 (예를 들어, 엔트레즈 ID 1108; 유니프롯비디/스위스-프롯 Q14839-1 및/또는 Q14839-2), RBBP4 (예를 들어, 엔트레즈(Entrez) ID 5928; 유니프롯비디/스위스-프롯 Q09028-1, Q09028-2, Q09028-3, 및/또는 Q09028-4), MGEA5 (예를 들어, 유니프롯비디/스위스-프롯 B4DYV7), MLLT10 (예를 들어, 유니프롯비디/스위스-프롯 P55197-1, P55197-2, 및/또는 P55197-3), SIRT4 (예를 들어, 유니프롯비디/스위스-프롯 Q9Y6E7), TP53BP1 (예를 들어, 유니프롯비디/스위스-프롯 Q12888-1 및/또는 Q12888-2), BRDT (예를 들어, 유니프롯비디/스위스-프롯 Q58F21-1, Q58F21-2, Q58F21-3, Q58F21-4, 및/또는 Q58F21-5), GTF3C4 (예를 들어, 유니프롯비디/스위스-프롯 Q05CN7), EVI (예를 들어, 유니프롯비디/스위스-프롯 Q9UBK3), HIRA (예를 들어, 유니프롯비디/스위스-프롯 P54198-1 및/또는 P54198-2), MPHOSPH8 (예를 들어, 유니프롯비디/스위스-프롯 Q99549-1 및/또는 Q99549-2), NCOA1 (예를 들어, 유니프롯비디/스위스-프롯 Q15788-1, Q15788-2, 및/또는 Q15788-3), RBBP5 (예를 들어, 유니프롯비디/스위스-프롯 Q15291-1 및/또는 Q15291-2), TDRD7 (예를 들어, 유니프롯비디/스위스-프롯 Q8NHU6-1, Q8NHU6-2, 및/또는 Q8NHU6-3), 및/또는 ZCWPW1 (예를 들어, 유니프롯비디/스위스-프롯 Q9H0M4-1, Q9H0M4-2, Q9H0M4-3, Q9H0M4-4, 및/또는 Q9H0M4-5)을 참조한다.
EZH2 억제제의 예는 WO1996/035784에 기재된 바와 같은 항체, WO2004/052392에 기재된 바와 같은 결합 폴리펩티드, WO2011/140325, WO2011/140324, WO2012/034132, WO2012/005805, WO2013049770, U.S. 8,410,088, US20120071418, WO2012050532, WO2007149782, 문헌 [Verma et al. ACS Med . Chem . Lett. 3(12):1091-1096 (2012)]에서의 결합 소분자, WO2011/111072, WO2012/050532, WO2003/070887 및/또는 일반적으로 WO2009/006577, WO2011/103016, WO2005/034845에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 히스톤 H3 K27 트리-메틸화를 억제한다. 일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 히스톤 H3 K27 트리-메틸화를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 히스톤 H3 K27 디, 모노, 및/또는 비-메틸화 중 하나 이상을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 히스톤 H3 K27 아세틸화의 증가를 유도한다. 일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 이소리퀴리티게닌이다. 일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 DZNeP 및/또는 그의 제약상 허용되는 염 및/또는 유도체이다. 일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 GSK343 및/또는 그의 제약상 허용되는 염 및/또는 유도체이다.
일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 GSK126 및/또는 그의 제약상 허용되는 염 및/또는 유도체 (문헌 [McCabe et al. Nature 492:108-112 (2012)]에 기재된 GSK126)이다. 일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 CAS#1346574-57-9 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 (S)-1-(sec-부틸)-N-((4,6-디메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-일)메틸)-3-메틸-6-(6-(피페라진-1-일)피리딘-3-일)-1H-인돌-4-카르복스아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 일부 실시양태에서, EZH2 억제제는
Figure pct00001
또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 GSK926 및/또는 그의 제약상 허용되는 염 및/또는 유도체이다.
일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염이다.
<화학식 I>
Figure pct00002
상기 식에서, X 및 Z는 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, (C6-C10)비시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 할로, 시아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb -CONRaNRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -NRaNRaRb, -NRaNRaC(O)Rb, -NRaNRaC(O)NRaRb, -NRaNRaC(O)ORa, -ORa, -OC(O)Ra, 및 -OC(O)NRaRb로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 H 또는 할로이고;
R1은 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C6-C10)비시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, CONRaNRaRb이고;
R3은 수소, (C1-C8)알킬, 시아노, 트리플루오로메틸, -NRaRb, 또는 할로이고;
R6은 수소, 할로, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, -B(OH)2, 치환 또는 비치환된 (C2-C8)알키닐, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐-(C1-C8)알킬, (C6-C10)비시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬, 시아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -CONRaNRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -NRaNRaRb, -NRaNRaC(O)Rb, -NRaNRaC(O)NRaRb, -NRaNRaC(O)ORa, -ORa, -OC(O)Ra, -OC(O)NRaRb로 이루어진 군으로부터 선택되고;
여기서 임의의 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 기는 -O(C1-C6)알킬(Rc)1 -2, -S(C1-C6)알킬(Rc)1 -2, -(C1-C6)알킬(Rc)1 -2, (C1-C8)알킬-헤테로시클로알킬, (C3-C8)시클로알킬-헤테로시클로알킬, 할로, (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -ORa, -OC(O)Ra, -OC(O)NRaRb, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C1-C4)알킬, 및 헤테로아릴(C1-C4)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되고;
여기서 상기 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C1-C4)알킬, 또는 헤테로아릴(C1-C4)알킬의 임의의 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티는 할로, (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -ORa, -OC(O)Ra, 및 -OC(O)NRaRb로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되고;
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C6-C10)비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴이고, 여기서 상기 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기는 할로, 히드록실, (C1-C4)알콕시, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, -CO2H, -CO2(C1-C4)알킬, -CONH2, -CONH(C1-C4)알킬, -CON((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬), -SO2(C1-C4)알킬, -SO2NH2 -SO2NH(C1-C4)알킬, 또는 -SO2N((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되거나;
또는 Ra 및 Rb는 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 산소, 질소, 및 황으로부터 선택된 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하는, 5-8 원 포화 또는 불포화 고리를 나타내고, 여기서 상기 고리는 (C1-C4)알킬, (C1-C4)할로알킬, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, 히드록실, 옥소, (C1-C4)알콕시, 및 (C1-C4)알콕시(C1-C4)알킬로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되고,
여기서 상기 고리는 (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리에 임의로 융합되거나;
또는 Ra 및 Rb는 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리에 임의로 융합된 6- 내지 10-원 가교된 비시클릭 고리계를 나타내고;
각각의 Rc는 독립적으로 (C1-C4)알킬아미노, -NRaSO2Rb, -SORa, -SO2Ra, -NRaC(O)ORa, -NRaRb, 또는 -CO2Ra이다.
일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 염이다.
<화학식 II>
Figure pct00003
상기 식에서, X 및 Z는 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, (C6-C10)비시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 할로, 시아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -CONRaNRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -NRaNRaRb, -NRaNRaC(O)Rb, -NRaNRaC(O)NRaRb, -NRaNRaC(O)ORa, -ORa, -OC(O)Ra, 및 -OC(O)NRaRb로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 H 또는 할로이고;
R1은 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C6-C10)비시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -CONRaNRaRb이고;
R2는 수소, (C1-C8)알킬, 트리플루오로메틸, 알콕시, 또는 할로이고, 여기서 상기 (C1-C8)알킬은 아미노, 및 (C1-C3)알킬아미노로부터 선택된 1 내지 2개의 기에 의해 치환될 수 있고;
R7은 수소, (C1-C3)알킬, 또는 알콕시이고; R3은 수소, (C1-C8)알킬, 시아노, 트리플루오로메틸, -NRaRb, 또는 할로이고;
R6은 수소, 할로, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, -B(OH)2, 치환 또는 비치환된 (C2-C8)알키닐, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐-(C1-C8)알킬, (C6-C10)비시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬, 시아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -CONRaNRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -NRaNRaRb, -NRaNRaC(O)Rb, -NRaNRaC(O)NRaRb, -NRaNRaC(O)ORa, -ORa, -OC(O)Ra, -OC(O)NRaRb로 이루어진 군으로부터 선택되고;
여기서 임의의 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 기는 -0(C1-C6)알킬(Rc)1 -2, -S(C1-C6)알킬(Rc)1 -2, -(C1-C6)알킬(Rc)1 -2, (C1-C8)알킬-헤테로시클로알킬, (C3-C8)시클로알킬-헤테로시클로알킬, 할로, (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노, -CORa, -CO2Ra,-CONRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -ORa, -OC(O)Ra, -OC(O)NRaRb, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C1-C4)알킬, 및 헤테로아릴(C1-C4)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되고;
여기서 상기 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C1-C4)알킬, 또는 헤테로아릴(C1-C4)알킬의 임의의 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티는 할로, (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -ORa, -OC(O)Ra, 및 -OC(O)NRaRb로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되고;
각각의 Rc는 독립적으로 (C1-C4)알킬아미노, -NRaSO2Rb, -SORa, -SO2Ra, -NRaC(O)ORa, -NRaRb, 또는 -CO2Ra이고;
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C6-C10)비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴이고, 여기서 상기 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기는 할로, 히드록실, (C1-C4)알콕시, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, -CO2H, -CO2(C1-C4)알킬, -CONH2, -CONH(C1-C4)알킬, -CON((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬), -SO2(C1-C4)알킬, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4)알킬, 또는 -SO2N((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되거나;
또는 Ra 및 Rb는 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 산소, 질소, 및 황으로부터 선택된 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하는, 5-8 원 포화 또는 불포화 고리를 나타내고, 여기서 상기 고리는 (C1-C4)알킬, (C1-C4)할로알킬, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, 히드록실, 옥소, (C1-C4)알콕시, 및 (C1-C4)알콕시(C1-C4)알킬로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되고, 여기서 상기 고리는 (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리에 임의로 융합되거나;
또는 Ra 및 Rb는 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리에 임의로 융합된 6- 내지 10- 원 가교된 비시클릭 고리계를 나타낸다.
일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 S-아데노실-L-호모시스테인 또는 그의 제약상 허용되는 염 및/또는
Figure pct00004
또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 하기 화학식 III의 화합물 또는 그의 염이다.
<화학식 III>
Figure pct00005
상기 식에서, X 및 Z는 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, (C6-C10)비시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 할로, 시아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -CONRaNRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -NRaNRaRb, -NRaNRaC(O)Rb, -NRaNRaC(O)NRaRb, -NRaNRaC(O)ORa, -ORa, -OC(O)Ra, 및 -OC(O)NRaRb로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 H 또는 할로이고;
R1은 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C6-C10)비시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -CONRaNRaRb이고;
R3은 수소, (C1-C8)알킬, 시아노, 트리플루오로메틸, -NRaRb, 또는 할로이고;
R6은 수소, 할로, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐-(C1-C8)알킬, (C6-C10)비시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환된 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬, 시아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -CONRaNRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -NRaNRaRb, -NRaNRaC(O)Rb, -NRaNRaC(O)NRaRb, -NRaNRaC(O)ORa, -ORa, -OC(O)Ra, -OC(O)NRaRb로 이루어진 군으로부터 선택되고;
여기서 임의의 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 기는 할로, (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노, -CORa, -CO2Ra -CONRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -ORa, -OC(O)Ra, -OC(O)NRaRb, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C1-C4)알킬, 및 헤테로아릴(C1-C4)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되고;
여기서 상기 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C1-C4)알킬, 또는 헤테로아릴(C1-C4)알킬의 임의의 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티는 할로, (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -ORa, -OC(O)Ra, 및 -OC(O)NRaRb로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되고;
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C6-C10)비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴이고, 여기서 상기 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기는 할로, 히드록실, (C1-C4)알콕시, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, -CO2H, -CO2(C1-C4)알킬, -CONH2, -CONH(C1-C4)알킬, -CON((C1-C4)알킬)(C1-C4알킬), -SO2(C1-C4)알킬, -SO2NH2 -SO2NH(C1-C4)알킬, 또는 -SO2N((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되거나;
또는 Ra 및 Rb는 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 산소, 질소, 및 황으로부터 선택된 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하는, 5-8 원 포화 또는 불포화 고리를 나타내고, 여기서 상기 고리는 (C1-C4)알킬, (C1-C4)할로알킬, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, 히드록실, 옥소, (C1-C4)알콕시, 및 (C1-C4)알콕시(C1-C4)알킬로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되고, 여기서 상기 고리는 (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리에 임의로 융합되거나;
또는 Ra 및 Rb는 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리에 임의로 융합된 6- 내지 10-원 가교된 비시클릭 고리계를 나타낸다.
일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 문헌 [Verma et al. ACS Med. Chem. Letters 3:1091-1096 (2012)]에 기재된 EZH2 억제제이다. 일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 하기 화학식 IV의 화합물이다.
<화학식 IV>
Figure pct00006
Figure pct00007
일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 하기 화학식 Ig의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
<화학식 Ig>
Figure pct00008
상기 식에서, R2, R4 및 R12는 각각 독립적으로 C1-6 알킬이고;
R6은 C6-C10 아릴 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이고, 이들 각각은 1개 이상의 -Q2-T2로 임의로 치환되고, 여기서 Q2는 결합 또는 할로, 시아노, 히드록실 또는 C1-C6 알콕시로 임의로 치환된 C1-C3 알킬 링커이고, T2는 H, 할로, 시아노, -ORa, -NRaRb, -(NRaRbRc)+A-, -C(O)Ra, -C(O)ORa, -C(O)NRaRb, -NRbC(O)Ra, -NRbC(O)ORa, -S(O)2Ra, -S(O)2NRaRb, 또는 RS2이고, 여기서 각각의 Ra, Rb 및 Rc는 독립적으로 H 또는 RS3이고, A-는 제약상 허용되는 음이온이고, 각각의 RS2 및 RS3은 독립적으로 C1-C6 알킬, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로시클로알킬, 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이거나, 또는 Ra 및 Rb는 이들이 부착되어 있는 N 원자와 함께 0 또는 1개의 추가의 헤테로원자를 갖는 4 내지 12-원 헤테로시클로알킬 고리를 형성하고, 각각의 RS2, RS3, 및 Ra 및 Rb에 의해 형성된 4 내지 12-원 헤테로시클로알킬 고리는 1개 이상의 -Q3-T3으로 임의로 치환되고, 여기서 Q3은 결합 또는 할로, 시아노, 히드록실 또는 C1-C6 알콕시로 각각 임의로 치환된 C1-C3 알킬 링커이고, T3은 할로, 시아노, C1-C6 알킬, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로시클로알킬, 5- 또는 6-원 헤테로아릴, ORd, COORd, -S(O)2Rd, -NRdRe, 및 -C(O)NRdRe로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각의 Rd 및 Re는 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이거나, 또는 -Q3-T3은 옥소이거나; 또는 임의의 2개의 이웃하는 -Q2-T2는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 N, O 및 S로부터 선택된 1-4개의 헤테로원자를 임의로 함유하는 5- 또는 6-원 고리를 형성하고 할로, 히드록실, COOH, C(O)O-C1-C6 알킬, 시아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 디-C1-C6 알킬아미노, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로시클로알킬, 및 5- 또는 6-원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
R7은 -Q4-T4이고, 여기서 Q4는 결합, C1-C4 알킬 링커, 또는 C2-C4 알케닐 링커 (각각의 링커는 할로, 시아노, 히드록실 또는 C1-C6 알콕시로 임의로 치환됨)이고, T4는 H, 할로, 시아노, NRfRg, -ORf, -C(O)Rf, -C(O)ORf, -C(O)NRfRg, -C(O)NRfORg, -NRfC(O)Rg, -S(O)2Rf, 또는 RS4이고, 여기서 각각의 Rf 및 Rg는 독립적으로 H 또는 RS5이고, 각각의 RS4 및 RS5는 독립적으로 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로시클로알킬, 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이고, 각각의 RS4 및 RS5는 1개 이상의 -Q5-T5로 임의로 치환되고, 여기서 Q5는 결합, C(O), C(O)NRk, NRkC(O), S(O)2, 또는 C1-C3 알킬 링커이고, Rk는 H 또는 C1-C6 알킬이고, T5는 H, 할로, C1-C6 알킬, 히드록실, 시아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 디-C1-C6 알킬아미노, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로시클로알킬, 5- 또는 6-원 헤테로아릴, 또는 S(O)qRq이고, 여기서 q는 0, 1, 또는 2이고, Rq는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로시클로알킬, 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이고, T5가 H, 할로, 히드록실, 또는 시아노인 경우를 제외하고 T5는 할로, C1-C6 알킬, 히드록실, 시아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 디-C1-C6 알킬아미노, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로시클로알킬, 및 5- 또는 6-원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되거나; 또는 -Q5-T5는 옥소이고;
R8은 H, 할로, 히드록실, COOH, 시아노, RS6, ORS6, 또는 COORS6이고, 여기서 RS6은 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C8 시클로알킬, 4 내지 12-원 헤테로시클로알킬, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 또는 디-C1-C6 알킬아미노이고, RS6은 할로, 히드록실, COOH, C(O)O-C1-C6 알킬, 시아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 및 디-C1-C6 알킬아미노로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되거나; 또는 R7 및 R8은 이들이 부착되어 있는 N 원자와 함께 0 내지 2개의 추가의 헤테로원자를 갖는 4 내지 11-원 헤테로시클로알킬 고리를 형성하고, R7 및 R8에 의해 형성된 4 내지 11-원 헤테로시클로알킬 고리는 1개 이상의 -Q6-T6으로 임의로 치환되고, 여기서 Q6은 결합, C(O), C(O)NRm, NRmC(O), S(O)2, 또는 C1-C3 알킬 링커이고, Rm은 H 또는 C1-C6 알킬이고, T6은 H, 할로, C1-C6 알킬, 히드록실, 시아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 디-C1-C6 알킬아미노, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로시클로알킬, 5- 또는 6-원 헤테로아릴, 또는 S(O)pRp이고, 여기서 p는 0, 1, 또는 2이고, Rp는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로시클로알킬, 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이고, T6이 H, 할로, 히드록실, 또는 시아노인 경우를 제외하고 T6은 할로, C1-C6 알킬, 히드록실, 시아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 디-C1-C6 알킬아미노, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로시클로알킬, 및 5- 또는 6-원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되거나; 또는 -Q6-T6은 옥소이다.
일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
<화학식 II>
Figure pct00009
상기 식에서, Q2는 결합 또는 메틸 링커이고, T2는 H, 할로, -ORa, -NRaRb, -(NRaRbRc)+A-, 또는 -S(O)2NRaRb이고, R7은 각각 1개의 -Q5-T5로 임의로 치환된 피페리디닐, 테트라히드로피란, 시클로펜틸, 또는 시클로헥실이고 R8은 에틸이다.
일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 화학식 IIa의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
<화합물 IIa>
Figure pct00010
상기 식에서, 각각의 Ra 및 Rb는 독립적으로 H 또는 RS3이고, RS3은 C1-C6 알킬, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로시클로알킬, 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이거나, 또는 Ra 및 Rb는 이들이 부착되어 있는 N 원자와 함께 0 또는 1개의 추가의 헤테로원자를 갖는 4 내지 12-원 헤테로시클로알킬 고리를 형성하고, 각각의 RS3과, Ra 및 Rb에 의해 형성된 4 내지 12-원 헤테로시클로알킬 고리는 1개 이상의 -Q3-T3으로 임의로 치환되고, 여기서 Q3은 결합 또는 각각 할로, 시아노, 히드록실 또는 C1-C6 알콕시로 임의로 치환된 C1-C3 알킬 링커이고, T3은 할로, 시아노, C1-C6 알킬, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12-원 헤테로시클로알킬, 5- 또는 6-원 헤테로아릴, ORd, COORd, -S(O)2Rd, -NRdRe, 및 -C(O)NRdRe로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각의 Rd 및 Re는 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이거나, 또는 -Q3-T3은 옥소이고;
R7은 -Q4-T4이고, 여기서 Q4는 결합, C1-C4 알킬 링커, 또는 C2-C4 알케닐 링커 (각각의 링커는 할로, 시아노, 히드록실 또는 C1-C6 알콕시로 임의로 치환됨)이고, T4는 H, 할로, 시아노, NRfRg, -ORf, -C(O)Rf, -C(O)ORf, -C(O)NRfRg, -C(O)NRfORg, -NRfC(O)Rg, -S(O)2Rf, 또는 RS4이고, 여기서 각각의 Rf 및 Rg는 독립적으로 H 또는 RS5이고, 각각의 RS4 및 RS5는 독립적으로 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 7-원 헤테로시클로알킬, 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이고, 각각의 RS4 및 RS5는 1개 이상의 -Q5-T5로 임의로 치환되고, 여기서 Q5는 결합, C(O), C(O)NRk, NRkC(O), S(O)2, 또는 C1-C3 알킬 링커이고, Rk는 H 또는 C1-C6 알킬이고, T5는 H, 할로, C1-C6 알킬, 히드록실, 시아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 디-C1-C6 알킬아미노, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 7-원 헤테로시클로알킬, 5- 또는 6-원 헤테로아릴, 또는 S(O)qRq이고, 여기서 q는 0, 1, 또는 2이고, Rq는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 7-원 헤테로시클로알킬, 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이고, T5가 H, 할로, 히드록실, 또는 시아노인 경우를 제외하고 T5는 할로, C1-C6 알킬, 히드록실, 시아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 디-C1-C6 알킬아미노, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 7-원 헤테로시클로알킬, 및 5- 또는 6-원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되거나; 또는 -Q5-T5는 옥소이고; 단 R7은 H가 아니고;
R8은 H, 할로, 히드록실, COOH, 시아노, RS6, ORS6, 또는 COORS6이고, 여기서 RS6은 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 또는 디-C1-C6 알킬아미노이고, RS6은 할로, 히드록실, COOH, C(O)O-C1-C6 알킬, 시아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 및 디-C1-C6 알킬아미노로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되거나; 또는 R7 및 R8은 이들이 부착되어 있는 N 원자와 함께 4 내지 11-원 헤테로시클로알킬 고리를 형성하고 이는 0 내지 2개의 추가의 헤테로원자를 갖고 1개 이상의 -Q6-T6으로 임의로 치환되고, 여기서 Q6은 결합, C(O), C(O)NRm, NRmC(O), S(O)2, 또는 C1-C3 알킬 링커이고, Rm은 H 또는 C1-C6 알킬이고, T6은 H, 할로, C1-C6 알킬, 히드록실, 시아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 디-C1-C6 알킬아미노, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 7-원 헤테로시클로알킬, 5- 또는 6-원 헤테로아릴, 또는 S(O)pRp이고, 여기서 p는 0, 1, 또는 2이고 Rp는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 7-원 헤테로시클로알킬, 또는 5- 또는 6-원 헤테로아릴이고, T6이 H, 할로, 히드록실, 또는 시아노인 경우를 제외하고 T6은 할로, C1-C6 알킬, 히드록실, 시아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 디-C1-C6 알킬아미노, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 7-원 헤테로시클로알킬, 및 5- 또는 6-원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되거나; 또는 -Q6-T6은 옥소이다.
일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 화합물 B:
Figure pct00011
또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 EPZ-6438이다. 일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 그 전문이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Knutson et al. PNAS 110(9):7922-7927 (2013)]에 기재된 바와 같은 EPZ-6438이다. 일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 CAS#: 1403254-99-8 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 N-((4,6-디메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-일)메틸)-5-(에틸(테트라히드로-2H-피란-4-일)아미노)-4-메틸-4'-(모르폴리노메틸)-[1,1'-비페닐]-3-카르복스아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 일부 실시양태에서, EZH2 억제제는 화합물 Z:
Figure pct00012
또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
본원은 또한 본원에 기재된 방법에서 유용한 HDAC 억제제를 제공한다. 히스톤 데아세틸라제 (HDAC)는 히스톤 상의 ε-N-아세틸 리신 아미노산으로부터 아세틸 기 (O=C-CH3)를 제거한 효소의 한 부류이다. HDAC는 서열 동일성 및 도메인 체계성에 따라 달라지는 4개의 클래스로 분류된다. 클래스 1 HDAC는 HDAC1, HDAC2, HDAC3 및 HDAC8을 포함한다. 클래스 IIA HDAC는 HDAC4, HDAC5, HDAC7 및 HDAC9를 포함한다. 클래스 IIB HDAC는 HDAC6 및 HDAC7을 포함한다. 클래스 III HDAC는 시르투인 (SIRT1-7)을 포함한다. 클래스 IV HDAC는 HDAC11을 포함한다. 일부 실시양태에서, HDAC 억제제는 클래스 I 및 클래스 II HDAC를 억제하는 트리코스타틴 A (TSA) 및/또는 수베로일아닐리드 히드록삼산 (SAHA)을 포함한다. 일부 실시양태에서, HDAC 억제제는 HDAC 1, 2, 3 및 8을 억제하는 MS-275이다. 일부 실시양태에서, HDAC 억제제는 스크립타이드이다. 일부 실시양태에서, HDAC 억제제는 HDAC 클래스 1 억제제이다. 일부 실시양태에서, HDAC 억제제는 클래스 I 중 1개, 2개, 3개 또는 4개의 HDAC의 데아세틸라제 활성을 억제한다. 일부 실시양태에서, HDAC 억제제는 HDAC1, 2 및 3의 데아세틸라제 활성을 억제하지만, HDAC8의 데아세틸라제 활성은 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, HDAC 억제제는 HDAC3의 데아세틸라제 활성을 억제하지만, HDAC 1, 2 및/또는 8의 데아세틸라제 활성은 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, HDAC 억제제는 HDAC2의 데아세틸라제 활성을 억제하지만, HDAC 1, 3 및/또는 8의 데아세틸라제 활성은 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, HDAC 억제제는 HDAC1 및 2의 데아세틸라제 활성을 억제하지만, HDAC 3 및/또는 8의 데아세틸라제 활성은 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, HDAC 억제제는 히스톤 H3 K27 탈아세틸화를 억제한다 (H3 K27 아세틸화를 증가시킴). 일부 실시양태에서, HDAC 억제제는 히스톤 H3 K27 트리-메틸화의 증가를 야기한다.
일부 실시양태에서, HDAC 억제제는 G946 또는 그의 제약상 허용되는 염이며, 여기서, G946은
Figure pct00013
이다.
일부 실시양태에서, HDAC 억제제는 G877 또는 그의 제약상 허용되는 염이며, 여기서, G877은
Figure pct00014
이다.
일부 실시양태에서, HDAC 억제제는 (I) 히드록삼산 (예컨대 트리코스타틴 A (TSA), 옥삼플라틴, 및 히드록삼산계 하이브리드 극성 화합물, 예컨대 수베로일아닐리드 히드록삼산 (SAHA) 및 피록사미드; (II) 에폭시케톤-함유 아미노산 (2S,9S)-2-아미노-8-옥소-9,10-에폭시데카노일 (Aoe)을 갖는 시클릭 테트라펩티드 (예컨대 트라폭신 A 및 B, Cyl-1 및 Cyl-2, HC-독소, WF-3161, 클라미도신); (III) Aoe를 갖지 않는 시클릭 테트라펩티드 (예컨대 아피시딘 및 뎁시펩티드 FR-901228); 및/또는 (IV) 단쇄 및 방향족 지방산 (예컨대 부티레이트, 4-페닐부티레이트 및 발프로산); (V) 벤즈아미드 (예컨대 MS-275) 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, HDAC 억제제는 기비노스타트 (ITF2357), LAQ 824, 벨리노스타트 (PXD 101), PCI 24781, 로미뎁신 (FK 228), 엔티노스타트 (MS275-SNDX275), 모세티노스타트 (MGCD0103), YM753, 발프로산 (VPA), 비로노스타트 (SAHA), 타세디날리엔 (CI 994) 중 하나 이상이다. HDAC 억제제의 예로는 그 전문이 참조로 포함된 US7399787, US2009023786, US2009/270351, US2009/076101, US2009/239849, US2009/069391, US2009/215813, WO2009/045385, WO2009/020589, WO2009/005638, WO2009/002495, US2009/012075, US2009/118291, EP2091525, WO2009/014941, US2009/209596, WO2009/003625, WO2009/117831 및/또는 WO2009/126877이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본원은 또한 본원에 기재된 방법에서 유용한 EGFR 길항제를 제공한다. EGFR은, 문헌 [Ullrich et al., Nature (1984) 309:418425]에 기재되어 있으며, 대안적으로는 Her-1 및 c-erbB 유전자 산물로도 지칭되는, 수용체 티로신 키나제 폴리펩티드인 표피 성장 인자 수용체뿐만 아니라 그의 변이체, 예컨대 EGFRvIII를 의미한다. EGFR의 변이체는 또한 결실, 치환 및 삽입 변이체, 예를 들어 문헌 [Lynch et al. (NEJM 2004, 350:2129)], [Paez et al. (Science 2004, 304:1497)], [Pao et al. (PNAS 2004, 101:13306)]에 기재된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR은 야생형 EGFR이며, 일반적으로 천연 EGFR 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, EGFR 길항제는 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자, 및/또는 폴리뉴클레오티드이다.
예시적인 EGFR 길항제 (항-EGFR 항체)로는 항체, 예컨대 니모투주맙 (YM 바이오사이언시스), 완전 인간 ABX-EGF (파니투무맙, 아브게닉스 인크.)로 공지된 인간화 모노클로날 항체, 및 E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 및 E7.6.3으로 공지되고 US 6,235,883에 기재된 완전 인간 항체; MDX-447 (메다렉스 인크.)이 포함된다. 페르투주맙 (2C4)은 HER2에 직접 결합하지만 HER2-EGFR 이량체화를 방해하여 EGFR 신호전달을 억제하는 인간화 항체이다. EGFR에 결합하는 항체의 다른 예로는 GA201 (RG7160; 로슈 글리카르트 아게), MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (미국 특허 제4,943,533호 (Mendelsohn et al.) 참조) 및 그의 변이체, 예컨대 키메라화 225 (C225 또는 세툭시맙; 에르부틱스(ERBUTIX)®) 및 재성형 인간 225 (H225) (WO 96/40210 (임클론 시스템 인크.) 참조); IMC-11F8, 완전 인간, EGFR-표적 항체 (임클론); II형 돌연변이체 EGFR에 결합하는 항체 (미국 특허 제5,212,290호); 미국 특허 제5,891,996호에 기재된 EGFR에 결합하는 인간화 및 키메라 항체; 및 EGFR에 결합하는 인간 항체, 예컨대 ABX-EGF (WO98/50433 (아브게닉스) 참조); EMD 55900 (문헌 [Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)]); EGFR 결합에 대해 EGF 및 TGF-알파와 경쟁하는 EGFR에 대해 지시된 인간화 EGFR 항체 EMD7200 (마투주맙); 및 mAb 806 또는 인간화 mAb 806 (문헌 [Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)])이 포함된다. 항-EGFR 항체는 세포독성제와 접합할 수 있으므로 면역접합체를 생성할 수 있다 (예를 들어, EP659,439A2 (머크 페이턴트 게엠베하) 참조). 일부 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 세툭시맙이다. 일부 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 파니투무맙이다. 일부 실시양태에서, 항-EGFR 항체는 잘루투무맙, 니모투주맙 및/또는 마투주맙이다.
본 방법에서 유용한 항-EGFR 항체는 충분한 친화도 및 특이성으로 EGFR에 결합하여 EGFR 활성을 감소 또는 억제할 수 있는 임의의 항체를 포함한다. 선택되는 항체는 통상적으로 EGFR에 대해 충분히 강한 결합 친화도를 가질 것이며, 예를 들어, 항체는 100 nM 내지 1 pM의 Kd 값으로 인간 c-met에 결합할 수 있다. 항체 친화도는 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 기재 검정 (예컨대, PCT 출원 공개 제WO2005/012359호에 기재된 비아코어(BIAcore) 검정); 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA); 및 경쟁 검정 (예를 들어, RIA)에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항-EGFR 항체는 EGFR/EGFR 리간드 활성이 관여하는 질환 또는 상태를 표적화하고 이를 방해하는데 있어서 치료제로서 사용될 수 있다. 또한, 항체에 예를 들어 치료제로서의 그의 유효성을 평가하기 위해 다른 생물학적 활성 검정을 행할 수 있다. 이러한 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 항체에 대한 표적 항원 및 목적하는 용도에 따라 좌우된다. 일부 실시양태에서, EGFR 아암(arm)은 백혈구 상의 유발 분자, 예컨대 T-세포 수용체 분자 (예를 들어 CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예컨대 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)에 결합하는 아암과 조합하여 세포 방어 메카니즘을 EGFR-발현 세포에 집중시킬 수 있다. 또한, 이중특이적 항체를 사용하여 세포독성제를 EGFR를 발현하는 세포에 국한되게 할 수 있다. 이들 항체는 EGFR-결합 아암 및 세포독성제 (예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)와 결합하는 아암을 보유한다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.
예시적인 EGFR 길항제는 또한 소분자, 예컨대 US5616582, US5457105, US5475001, US5654307, US5679683, US6084095, US6265410, US6455534, US6521620, US6596726, US6713484, US5770599, US6140332, US5866572, US6399602, US6344459, US6602863, US6391874, WO9814451, WO9850038, WO9909016, WO9924037, WO9935146, WO0132651, US6344455, US5760041, US6002008 및/또는 US5747498에 기재된 화합물을 포함한다. 특정한 소분자 EGFR 길항제는 OSI-774 (CP-358774, 에를로티닙, OSI 파마슈티칼스); PD 183805 (CI 1033, 2-프로펜아미드, N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-6-퀴나졸리닐]-, 디히드로클로라이드, 화이자 인크.); 이레사(Iressa)® (ZD1839, 게피티닙, 아스트라제네카); ZM 105180 ((6-아미노-4-(3-메틸페닐-아미노)-퀴나졸린, 제네카); BIBX-1382 (N8-(3-클로로-4-플루오로-페닐)-N2-(1-메틸-피페리딘-4-일)-피리미도[5,4-d]피리미딘-2,8-디아민, 베링거 잉겔하임); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-페닐에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀); (R)-6-(4-히드록시페닐)-4-[(1-페닐에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘); CL-387785 (N-[4-[(3-브로모페닐)아미노]-6-퀴나졸리닐]-2-부틴아미드); EKB-569 (N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-3-시아노-7-에톡시-6-퀴놀리닐]-4-(디메틸아미노)-2-부텐아미드); 라파티닙 (타이커브(Tykerb), 글락소스미스클라인); ZD6474 (작티마(Zactima), 아스트라제네카); CUDC-101 (큐리스(Curis)); 카네르티닙 (CI-1033); AEE788 (6-[4-[(4-에틸-1-피페라지닐)메틸]페닐]-N-[(1R)-1-페닐에틸]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민, WO2003013541, 노파르티스) 및 PKI166 (4-[4-[[(1R)-1-페닐에틸]아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀, WO9702266 노파르티스)을 포함한다. 일부 실시양태에서, EGFR 길항제는 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민 및/또는 그의 제약상 허용되는 염 (예를 들어, N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민-HCl)이다. 일부 실시양태에서, EGFR 길항제는 게피티닙 및/또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 일부 실시양태에서, EGFR 길항제는 라파티닙 및/또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 일부 실시양태에서, EGFR 길항제는 게피티닙 및/또는 에를로티닙이다.
일부 실시양태에서, EGFR 길항제는 EGFR에 대한 특이적 억제제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제는 EGFR 길항제가 EGFR 및 하나 이상의 다른 표적 폴리펩티드를 억제하는 이중 억제제 또는 범 억제제일 수 있다.
본원은 또한 본원에 기재된 방법에서 유용한 탁산을 제공한다. 탁산은 튜불린에 결합하여 미세관 조립 및 안정화를 촉진시키고/거나 미세관 탈중합을 방지할 수 있는 디테르펜이다. 본원에 포함되는 탁산은 탁소이드 10-데아세틸바카틴 III 및/또는 그의 유도체이다. 탁산의 예로는 파클리탁셀 (즉, 탁솔, CAS # 33069-62-4), 도세탁셀 (즉, 탁소테레, CAS #114977-28-5), 라로탁셀, 카바지탁셀, 밀라탁셀, 테세탁셀 및/또는 오라탁셀이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 탁산은 도세탁셀이다. 일부 실시양태에서, 탁산은 크레모포르(Cremophor) (예를 들어, 탁솔(Taxol)®) 내지 트윈(Tween), 예컨대 폴리소르베이트 80 (예를 들어, 탁소테레(Taxotere)®)으로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 탁산은 리포솜 캡슐화된 탁산이다. 일부 실시양태에서, 탁산은 탁산의 전구약물 형태 및/또는 접합체 형태 (예를 들어, 파클리탁셀에 공유적으로 접합된 DHA, 파클리탁셀 폴리글루멕스, 및/또는 리놀레일 카르보네이트-파클리탁셀)이다. 일부 실시양태에서, 파클리탁셀은 실질적으로 계면활성제 없이 (예를 들어, 크레모포르 및/또는 트윈 - 예컨대, 토코솔 파클리탁셀(Tocosol Paclitaxel)의 부재 하에) 제제화된다. 일부 실시양태에서, 탁산은 알부민-코팅된 나노입자 (예를 들어, 아브락산(Abraxane) 및/또는 ABI-008)이다. 일부 실시양태에서, 탁산은 탁솔®이다.
A. 항체
본원은, 본원에 기재된 방법에서 유용한 관심 폴리펩티드, 예컨대 염색질 개질제 및/또는 EGFR에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 임의의 상기 실시양태에서, 항체는 인간화되어 있다. 또한, 임의의 상기 실시양태에 따른 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 비롯한 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항체는 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디(diabody), 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 "무손상 IgG1" 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다.
추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항체는 하기 섹션에 기재된 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다:
1. 항체 친화도
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤　1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 한 실시양태에서, Kd는 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 한 실시양태에서, RIA는 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행하였다. 예를 들어, 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 계열 적정된 비표지된 항원의 존재하에 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지된 항원과 평형화시키고, 이어서 항-Fab 항체-코팅된 플레이트를 사용하여 결합된 항원을 포획함으로써 측정하였다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)] 참조). 검정에 대한 조건을 확립하기 위하여, 마이크로타이터(MICROTITER)® 멀티-웰 플레이트 (써모 사이언티픽)를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스) 5 μg/ml로 밤새 코팅하고, 후속적으로 PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민을 사용하여 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단하였다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]에서의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함)의 계열 희석액과 혼합하였다. 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하였으나, 확실히 평형에 도달하도록 하기 위해 인큐베이션을 보다 긴 기간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 지속시킬 수 있다. 이후, 상기 혼합물을 포획 플레이트로 이동시켜 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션하였다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리소르베이트 20 (트윈-20®)으로 8회 세정하였다. 플레이트를 건조시키는 경우, 150 μl/웰의 섬광계 (마이크로신트(MICROSCINT)-20™; 팩커드)를 첨가하고, 판을 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 계수기 (팩커드)로 10분 동안 계수하였다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁적 결합 검정에서 사용하였다.
또 다른 실시양태에 따르면, Kd는 비아코어(BIACORE)® 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정한다. 예를 들어, 비아코어®-2000 또는 비아코어®-3000 (뉴저지주 피스카타웨이 소재의 비아코어, 인크.)을 사용한 검정은 약 10 반응 단위 (RU)의 고정화 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 수행하였다. 한 실시양태에서, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시켰다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 μg/ml (대략 0.2 μM)까지 희석한 후, 5 μl/분의 유량으로 주입하여 대략 10 반응 단위 (RU)의 커플링된 단백질을 획득하였다. 항원의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단하였다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2배 계열 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 25℃의 0.05% 폴리소르베이트 20 (트윈-20™) 계면활성제 (PBST)를 함유하는 PBS에 대략 25 μl/분의 유량으로 주입하였다. 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)은 간단한 일대일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 회합 및 해리 센소그램을 동시에 적합화시켜 계산하였다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비로 계산하였다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의한 온-레이트가 106 M-1s-1 을 초과하는 경우, 온-레이트는 분광계, 예컨대 스톱-플로우 장착된 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-AMINCO™ 분광광도계 (써모스펙트로닉)에서 측정할 때 농도가 증가하는 항원의 존재하에, pH 7.2의 PBS 중의 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용함으로써 측정될 수 있다.
2. 항체 단편
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌 [Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 제5,571,894호 및 동 제5,587,458호를 참조한다. 재이용 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고, 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의를 위해, 미국 특허 제5,869,046호를 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트리아바디(triabody) 및 테트라바디(tetrabody)는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체 (메사추세츠주 월섬 소재의 도만티스, 인크.; 예를 들어, 미국 특허 제6,248,516호 참조)이다.
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 무손상 항체의 단백질분해적 소화 및 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있다.
3. 키메라 항체 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 교체된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성을 감소시키는 반면, 모세포 비-인간 항체의 특이성 및 친화도는 보유한다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 부분)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화도를 회복시키거나 개선시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 이의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에 개관되어 있고, 추가로 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 문헌 [Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 제5,821,337호, 동 제7,527,791호, 동 제6,982,321호 및 동 제7,087,409호; 문헌 [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] (특이성-결정 영역 (SDR) 이식을 기재함); 문헌 [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)] ("재표면화"를 기재함); 문헌 [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] ("FR 셔플링"을 기재함); 및 문헌 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005)] 및 문헌 [Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] (FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근법을 기재함)에 기재되어 있다.
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역으로는 "최적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)] 및 문헌 [Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)] 및 문헌 [Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
4. 인간 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 관련 기술분야에서 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)] 및 문헌 [Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원성 시험투여에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로, 내인성 이뮤노글로불린 유전자좌를 대체하거나, 또는 염색체외 존재하거나 또는 동물의 염색체 내로 무작위 통합된 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어, 미국 특허 제6,075,181호 및 동 제6,150,584호 (제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술을 기재함); 미국 특허 제5,770,429호 (휴맵(HuMab)® 기술을 기재함); 미국 특허 제7,041,870호 (K-M 마우스(MOUSE)® 기술을 기재함) 및 미국 특허 출원 공개 제US 2007/0061900호 (벨로시마우스(VelociMouse)® 기술을 기재함)를 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과 조합함으로써 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체를 제조하기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]; 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147:86 (1991)] 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술에 의해 생성된 인간 항체는 또한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은 예를 들어, 미국 특허 제7,189,826호 (하이브리도마 세포주로부터 모노클로날 인간 IgM 항체의 제조를 기재함) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마를 기재함)에 기재된 것을 들 수 있다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Hist. & Histopath., 20(3):927-937 (2005)] 및 [Vollmers and Brandlein, Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택되는 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이어서, 상기 가변 도메인 서열을 목적으로 하는 인간 불변 도메인과 조합할 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기술은 하기에 기재된다.
5. 라이브러리-유래된 항체
항체는 목적하는 활성(들)을 갖는 항체에 대한 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리의 생성 및 목적하는 결합 특성을 갖는 항체에 대한 상기 라이브러리의 스크리닝에 대한 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 문헌 [Hoogenboom et al. Methods Mol. Biol. 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 개관되어 있고, 추가로 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554]; [Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)]; [Marks and Bradbury, Methods Mol. Biol. 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 개별적으로 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위로 재조합된 다음, 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로, 단일쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서의 항체 단편을 나타낸다. 면역 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이, 미감염(naive) 레퍼토리를 클로닝하여 (예를 들어, 인간으로부터), 단일원의 항체를 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 항원 및 또한 자기 항원에 제공할 수 있다. 최종적으로, 미감염 라이브러리는 또한 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 랜덤 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열을 달성함으로써 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재한 특허 공개물로는 예를 들어 미국 특허 제5,750,373호, 및 미국 특허 공개 제2005/0079574호, 동 제2005/0119455호, 동 제2005/0266000호, 동 제2007/0117126호, 동 제2007/0160598호, 동 제2007/0237764호, 동 제2007/0292936호 및 동 제2009/0002360호가 포함된다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
6. 다중특이적 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 관심 폴리펩티드, 예컨대 염색질 개질제 및/또는 EGFR이고, 다른 것은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 관심 폴리펩티드, 예컨대 염색질 개질제 및/또는 EGFR의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 관심 폴리펩티드, 예컨대 염색질 개질제 및/또는 EGFR을 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화시키기 위해 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로 제조될 수 있다.
다중특이적 항체의 제조 기술로는 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 조합의 재조합 공-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)], WO 93/08829, 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "노브-인-홀(knob-in-hole)" 공학 (예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호 참조)이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 다중-특이적 항체는 또한, 항체 Fc-이종이량체 분자의 제조를 위한 정전기적 스티어링 효과의 조작 (WO　2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교 (예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 비-특이적 항체의 생성을 위한 류신 지퍼의 사용 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 "디아바디" 기술의 사용 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용 (예를 들어, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조)에 의해; 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같이 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조할 수 있다.
"옥토퍼스(Octopus) 항체"를 비롯한, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 가지도록 조작된 항체는 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US　2006/0025576A1 참조).
본원의 항체 또는 단편은 또한 관심 폴리펩티드, 예컨대 염색질 개질제 및/또는 EGFR 및 또 다른 상이한 항원 (예를 들어 US　2008/0069820 참조)에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다.
7. 항체 변이체
a) 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변경된다. 항체에의 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로, Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에의 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 이중안테나 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산뿐만 아니라 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정한 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성시키기 위해 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결핍된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고도의 만노스 구조물)의 합계에 대한 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균적인 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역의 대략 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 나타내지만, Asn297은 또한 항체 내의 부차적 서열 변이로 인해 위치 297의 약 ±3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294 내지 300에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, US 특허 공개 제US 2003/0157108호 (Presta, L.); 동 제US 2004/0093621호 (교와 핫코 고교 가부시키가이샤)를 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 관한 공개물의 예로는 하기가 포함된다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; 문헌 [Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; US 특허 출원 제US 2003/0157108 A1호 (Presta, L); 및 WO　2004/056312 A1 (Adams et al., 특히 실시예 11)), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]; 문헌 [Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 항체 변이체가 추가로 제공된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 제6,602,684호 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
b) Fc 영역 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 생체내 항체의 반감기는 중요하지만 특정 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 또는 해로운 적용에 대해 바람직한 후보가 되도록 하는 일부 이펙터 기능 (모든 이펙터 기능은 아님)을 보유하는 항체 변이체를 포함한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행하여, 항체는 FcγR 결합이 결핍되어 있지만 (이에 따라 아마도 ADCC 활성이 결핍될 것임) FcRn 결합 능력을 보유하고 있는 것을 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 단지 Fc(RIII)만을 발현하는 반면, 단핵구는 Fc(RI), Fc(RII) 및 Fc(RIII)를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 제464면, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예는 미국 특허 제5,500,362호 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 및 [Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)] 참조); 동 제5,821,337호 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법에 대한 악티(ACTI)™ 비-방사성 세포독성 검정 (캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 셀테크놀로지, 인크.) 및 시토톡스(CytoTox) 96® 비-방사성 세포독성 검정 (위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포로는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 또한, C1q 결합 검정을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없으며 이에 따라 CDC 활성이 부족함을 확인할 수 있다. 예를 들어, WO　2006/029879 및 WO　2005/100402에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]; [Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 [Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 클리어런스/반감기 측정은 또한 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 제6,737,056호). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체 (잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함)를 포함한다 (미국 특허 제7,332,581호).
FcR에 대해 개선되거나 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제6,737,056호; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조). 특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 제6,194,551호, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, Fc 영역에서 변경이 일어나면, C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)이 변경된다 (즉, 개선되거나 또는 감소된다).
증가된 반감기, 및 모체 IgG를 태아에게 전달하는 원인이 되는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대해 개선된 결합을 갖는 항체는 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 내부에 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 제7,371,826호). Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 WO 94/29351을 참조한다.
c) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시양태에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 배치되고, 이를 사용하여 항체를 본원에 추가로 기재된 바와 같은 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기 잔기 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트(Kabat) 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 미국 특허 제7,521,541호에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
B. 면역접합체
본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소에 접합된 관심 폴리펩티드, 예컨대 염색질 개질제 항체 또는 EGFR에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체가 본원에 추가로 제공된다.
한 실시양태에서, 면역접합체는 메이탄시노이드 (미국 특허 제5,208,020호, 동 제5,416,064호 및 유럽 특허 EP 0 425 235 참조); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 제5,635,483호, 동 제5,780,588호 및 동 제7,498,298호 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체 (미국 특허 제5,712,374호, 동 제5,714,586호, 동 제5,739,116호, 동 제5,767,285호, 동 제5,770,701호, 동 제5,770,710호, 동 제5,773,001호, 및 동 제5,877,296호; 문헌 [Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)]; 및 [Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라시클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (문헌 [Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)]; [Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)]; [Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)]; [Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)]; [Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)]; [King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 제6,630,579호 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 약물에 항체가 접합되어 있는 항체-약물 접합체 (ADC)이다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하나 이에 제한되지 않는 효소적 활성 독소 또는 그의 단편에 접합되는 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사성접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 제조에 대해 이용가능하다. 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 방사성접합체가 검출용으로 사용되는 경우, 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 Tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)용 스핀 표지, 예컨대 재차 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합하기 위한 예시적인 킬레이트화제이다 (WO94/11026 참조). 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 제5,208,020호)가 사용될 수 있다.
본원의 면역접합체 또는 ADC는 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하나 이에 제한되지 않는, 상업적으로 입수가능한 (예를 들어, 미국 일리노이주 록포드 소재의 피어스 바이오테크놀로지, 인크.로부터) 가교-링커 시약으로 제조된 상기 접합체를 명백하게 고려하나 이에 제한되지 않는다.
C. 결합 폴리펩티드
결합 폴리펩티드는 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위해 또한 제공되는 관심 폴리펩티드, 예컨대 염색질 개질제 및/또는 EGFR에 바람직하게는 특이적으로 결합하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드는 염색질 개질제 길항제 및/또는 표적화 요법제 (예를 들어, EGFR 길항제)이다. 결합 폴리펩티드는 공지된 폴리펩티드 합성 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있거나, 또는 재조합 기술을 사용하여 제조 및 정제될 수 있다. 결합 폴리펩티드는 통상적으로 적어도 약 5개 아미노산의 길이, 대안적으로 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개 또는 그 초과의 아미노산의 길이이며, 여기서, 이러한 결합 폴리펩티드는 본원에 기재된 표적, 예를 들어, 염색질 개질제 또는 EGFR에 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있다. 결합 폴리펩티드는 널리 공지된 기술을 사용하여 과도한 실험 없이 동정될 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 폴리펩티드에 대해 폴리펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 기술이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있음을 주목한다 (예를 들어, 미국 특허 제5,556,762호, 동 제5,750,373호, 동 제4,708,871호, 동 제4,833,092호, 동 제5,223,409호, 동 제5,403,484호, 동 제5,571,689호, 동 제5,663,143호; PCT 공개 제WO 84/03506호 및 동 제WO84/03564호; 문헌 [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)]; [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)]; [Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)]; [Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)]; [Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378]; [Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832]; [Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352:624]; [Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581]; [Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363] 및 [Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668] 참조).
펩티드 라이브러리를 생성하고 이들 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 또한 미국 특허 제5,723,286호, 동 제5,432,018호, 동 제5,580,717호, 동 제5,427,908호, 동 제5,498,530호, 동 제5,770,434호, 동 제5,734,018호, 동 제5,698,426호, 동 제5,763,192호 및 동 제5,723,323호에 개시되어 있다.
D. 결합 소분자
상기 기재된 방법에서 사용하기 위한 염색질 개질제의 소분자 길항제, 표적화 요법 (예를 들어, 소분자 EGFR 길항제), 및/또는 화학요법 (예를 들어, 탁산)으로서 유용한 결합 소분자가 본원에 제공된다.
결합 소분자는 바람직하게는, 본원에 기재된 바와 같은 염색질 개질제 및/또는 EGFR에 바람직하게는 특이적으로 결합하는, 본원에 정의된 바와 같은 결합 폴리펩티드 또는 항체 이외의 다른 유기 분자이다. 결합 유기 소분자는 공지된 방법론을 사용하여 확인 및 화학적으로 합성될 수 있다 (예를 들어, PCT 공개 제WO00/00823호 및 동 제WO00/39585호 참조). 결합 유기 소분자는 통상적으로 크기가 약 2000 달톤 미만, 대안적으로 크기가 약 1500 달톤 미만, 750 달톤 미만, 500 달톤 미만, 250 달톤 미만 또는 200 달톤 미만이며, 여기서 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있는 상기 유기 소분자는 널리 공지된 기술을 사용하여 과도한 실험 없이 동정될 수 있다. 이와 관련하여, 관심 폴리펩티드에 결합할 수 있는 분자에 대해 유기 소분자 라이브러리를 스크리닝하는 기술이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있음을 주목한다 (예를 들어, PCT 공개 제WO00/00823호 및 동 제WO00/39585호 참조). 결합 유기 소분자는 예를 들어, 알데히드, 케톤, 옥심, 히드라존, 세미카르바존, 카르바지드, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, N-치환된 히드라진, 히드라지드, 알콜, 에테르, 티올, 티오에테르, 디술피드, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 우레아, 카르바메이트, 카르보네이트, 케탈, 티오케탈, 아세탈, 티오아세탈, 아릴 할라이드, 아릴 술포네이트, 알킬 할라이드, 알킬 술포네이트, 방향족 화합물, 헤테로시클릭 화합물, 아닐린, 알켄, 알킨, 디올, 아미노 알콜, 옥사졸리딘, 옥사졸린, 티아졸리딘, 티아졸린, 엔아민, 술폰아미드, 에폭시드, 아지리딘, 이소시아네이트, 술포닐 클로라이드, 디아조 화합물, 산 클로라이드 등일 수 있다.
E. 길항제 폴리뉴클레오티드
본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드 길항제가 또한 본원에 제공된다. 폴리뉴클레오티드는 안티센스 핵산 및/또는 리보자임일 수 있다. 안티센스 핵산은 관심 유전자, 예컨대 본원에 기재된 염색질 개질제 유전자 및/또는 EGFR 유전자의 RNA 전사체의 적어도 일부에 상보적인 서열을 포함한다. 그러나, 절대 상보성은 바람직하기는 하지만, 요구되지는 않는다.
본원에서 지칭되는 "RNA의 적어도 일부에 상보적인" 서열은 RNA와 혼성화하여 안정한 이중나선을 형성할 수 있도록 충분한 상보성을 갖는 서열을 의미하며, 이중 가닥 안티센스 핵산의 경우, 이중나선 DNA의 단일 가닥을 시험할 수 있거나, 또는 삼중나선 형태를 검정할 수 있다. 혼성화 능력은 안티센스 핵산의 상보성 정도 및 길이 둘 다에 따라 좌우될 것이다. 일반적으로, 혼성화 핵산이 길수록 RNA와의 염기 미스매치가 많아지고, 안정한 이중나선 (또는 경우에 따라 삼중나선일 수 있음)을 함유하고 계속 형성할 수 있다. 통상의 기술자는 혼성화된 복합체의 융점을 결정하기 위해 표준 절차를 사용하여 허용가능한 미스매치 정도를 확인할 수 있다.
메시지의 5' 말단, 예를 들어 AUG 개시 코돈까지 및 이를 포함하는 5' 비번역 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드는 번역을 억제하는데 가장 효율적으로 작동해야 한다. 그러나, mRNA의 3' 비번역 서열에 상보적인 서열이 또한 mRNA의 번역을 억제하는데 유효한 것으로 밝혀졌다. 일반적으로, 문헌 [Wagner, R., 1994, Nature 372:333-335]를 참조한다. 따라서, 유전자의 5'- 또는 3'-비번역된 비-코딩 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 안티센스 접근법에서 사용하여 내인성 mRNA의 번역을 억제할 수 있다. mRNA의 5' 비번역 영역에 상보적인 폴리뉴클레오티드는 AUG 개시 코돈의 상보체를 포함해야 한다. mRNA 코딩 영역에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오티드는 보다 덜 효율적인 번역 억제제이지만, 본 발명에 따라 사용될 수 있다. mRNA의 5'-, 3'- 또는 코딩 영역에 혼성화되도록 설계되는지 여부에 관계없이, 안티센스 핵산은 적어도 6개 뉴클레오티드의 길이를 가져야 하며, 바람직하게는 6 내지 약 50개 범위의 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드이다. 구체적 측면에서, 올리고뉴클레오티드는 10개 이상의 뉴클레오티드, 17개 이상의 뉴클레오티드, 25개 이상의 뉴클레오티드, 또는 50개 이상의 뉴클레오티드이다.
F. 항체 및 결합 폴리펩티드 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입하거나, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 내 잔기로부터의 결실 및/또는 이들 내로의 삽입 및/또는 이들의 치환을 포함한다. 최종 구축물이 목적하는 특성, 예를 들어 항원-결합을 보유하도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 행하여 최종 구축물에 도달할 수 있다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체 및/또는 결합 폴리펩티드 변이체가 제공된다. 치환성 돌연변이유발에 대한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 표 1에서 "바람직한 치환"의 표제 아래에 제시된다. 보다 더 실질적인 변화는 표 1에서 "예시적인 치환"의 표제 아래에 제공되며, 아미노산 측쇄 부류에 관해서는 하기에 추가로 기재된 바와 같다. 아미노산 치환을 관심 항체 및/또는 결합 폴리펩티드 내에 도입하여, 생성물을 목적하는 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝할 수 있다.
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아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
G. 항체 및 결합 폴리펩티드 유도체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 및/또는 결합 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 유도체화에 적합한 모이어티로는 수용성 중합체가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예로는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 그의 안정성으로 인해 제조상 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드에 부착되어 있는 중합체의 수는 달라질 수 있고, 하나 초과의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체 및/또는 결합 폴리펩티드 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 고려사항을 기초로 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 방사선에의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티에 대한 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌 [Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체 및/또는 결합 폴리펩티드-비단백질성 모이어티에 근접한 세포가 사멸되는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
IV. 목적하는 기능을 갖는 염색질 개질제의 길항제를 스크리닝하고/거나 확인하는 방법
항체, 결합 폴리펩티드 및/또는 소분자를 비롯한, 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 관심 폴리펩티드, 예컨대 염색질 개질제 및/또는 EGFR의 추가의 길항제는 상기에 기재되어 있다. 본원에 제공된 항-염색질 개질제 항체, 결합 폴리펩티드 및/또는 결합 소분자와 같은 추가의 길항제는 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정에 의해 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인, 스크리닝 또는 특성화될 수 있다.
특정 실시양태에서, 염색질 개질제 폴리펩티드의 원자 좌표를 포함하는 메모리를 포함하는 컴퓨터 시스템이 염색질 개질제의 리간드 결합 부위에 결합하는 화합물을 합리적으로 확인하기 위한 모델로서 유용하다. 이러한 화합물은 예를 들어 신생으로, 또는 공지된 화합물의 변형에 의해 설계될 수 있다. 다른 경우, 결합 화합물은 염색질 개질제의 분자 모델과의 "도킹" 여부를 결정하기 위해 공지된 화합물을 시험함으로써 확인될 수 있다. 이러한 도킹 방법은 일반적으로 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
결정 구조 데이터의 분석에 의해 다양한 염색질 개질제-결합 화합물의 결합 모델을 개발하기 위해 염색질 개질제 결정 구조 데이터를 컴퓨터-모델링 기술과 함께 사용할 수 있다. 부위 모델은 부위 표면의 3차원 토포그래피, 및 반 데르 발스 접촉, 정전기 상호작용 및 수소-결합 기회를 비롯한 인자를 특성화한다. 이어서, 컴퓨터 시뮬레이션 기술을 사용하여, 모델 부위와 상호작용하도록 설계되는 양성자, 히드록실 기, 아민 기, 2가 양이온, 방향족 및 지방족 관능기, 아미드 기, 알콜 기 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 관능기에 대한 상호작용 위치를 맵핑한다. 이들 기는, 부위에 특이적으로 결합할 것으로 기대되는 후보 화합물 또는 약물작용발생단으로 설계될 수 있다. 따라서, 약물작용발생단 설계는, 비록 일반적으로 약물작용발생단은 비-공유 메카니즘을 통해 부위와 상호작용하지만, 수소 결합, 반 데르 발스, 정전기 및 공유 상호작용을 비롯한 임의의 또는 모든 이용가능한 유형의 화학적 상호작용을 통해 부위와 상호작용하는 약물작용발생단에 속하는 후보 화합물의 능력을 고려하는 것을 포함한다.
염색질 개질제 폴리펩티드에 결합하는 약물작용발생단 또는 후보 화합물의 능력은 컴퓨터 모델링 기술을 사용하는 실제 합성에 더하여 분석될 수 있다. 단지 표적 (예를 들어, 염색질 개질제 폴리펩티드 결합 부위)에 충분한 결합 에너지 (한 예로, 대략 10-2 M 또는 보다 견고한 표적과의 해리 상수에 상응하는 결합 에너지)로 결합하는 컴퓨터 모델링에 의해 제시되는 후보만이 합성될 수 있고, 염색질 개질제 폴리펩티드에 결합하여 염색질 개질제를 억제하는, 적용가능한 경우, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되고/거나 본원에 기재된 바와 같은 효소 검정을 사용하여 효소 기능을 억제하는 그의 능력에 대해 시험될 수 있다. 따라서, 컴퓨터 평가 단계는 적절한 친화도로 염색질 개질제 폴리펩티드에 결합하지 않는 화합물의 불필요한 합성을 피한다.
염색질 개질제 약물작용발생단 또는 후보 화합물은 컴퓨터로 평가될 수 있고, 화학 물질 또는 단편을 염색질 개질제 폴리펩티드 상의 개별적 결합 표적 부위와 회합하는 그의 능력에 대해 스크리닝하고 선택하는 일련의 단계에 의해 설계될 수 있다. 통상의 기술자는 화학 물질 또는 단편을 염색질 개질제 폴리펩티드, 보다 구체적으로는 염색질 개질제 폴리펩티드 상의 표적 부위와 회합하는 그의 능력에 대해 스크리닝하는 여러 방법들 중 하나를 사용할 수 있다. 방법은 관련 기술분야에 공지된 염색질 개질제 폴리펩티드 좌표 또는 상기 좌표의 하위세트를 기재로, 예를 들어 컴퓨터 스크린 상의 표적 부위의 육안 검사에 의해 개시될 수 있다.
암 세포 사멸을 유도하는 길항제를 선택하기 위해, 예를 들어 아이오딘화프로피듐 (PI), 트리판 블루 또는 7AAD 흡수에 의해 지시된 바와 같은 막 완전성의 손실이 표준물질과 비교하여 평가될 수 있다. PI 흡수 검정은 보체 및 면역 이펙터 세포의 부재 하에 수행될 수 있다. 종양 세포를 단독 배지 또는 적절한 조합 요법제를 함유하는 배지와 인큐베이션한다. 세포를 3일 기간 동안 인큐베이션한다. 각각의 처리 후에 세포를 세척하고, 35 mm 여과기-캡핑된 12×75 튜브 (튜브당 1 ml, 처리군당 3개의 튜브)로 분취하여 세포괴를 제거한다. 이어서, 튜브에 PI (10 μg/ml)를 넣는다. 샘플은 팩스캔(FACSCAN)® 유동 세포측정기 및 팩스컨버트(FACSCONVERT)® 셀퀘스트 소프트웨어 (벡톤 디킨슨)를 사용하여 분석할 수 있다. PI 흡수에 의해 측정될 때 단독 배지 및/또는 단독요법과 비교하여 통계적으로 유의한 수준의 세포 사멸을 유도하는 길항제를 세포 사멸-유도 항체, 결합 폴리펩티드 또는 결합 소분자로 선택할 수 있다.
임의의 스크리닝 및/또는 확인 방법의 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 후보 길항제는 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자, 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 항체이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제는 소분자이다.
V. 제약 제제
본원에 기재된 바와 같은 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및/또는 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법, 화학요법 및/또는 방사선요법)의 제약 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기 항체를 하나 이상의 임의의 제약상 허용되는 담체 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조한다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제 및/또는 표적화 요법제는 결합 소분자, 항체, 결합 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 EGFR 길항제이다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 화학요법이다. 일부 실시양태에서, 화학요법은 탁산이다. 일부 실시양태에서, 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 탁산은 도세탁셀이다. 제약상 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 이는 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 다른 탄수화물 (글루코스, 만노스, 또는 덱스트린 포함); 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 예시적인 제약상 허용되는 담체는 간질성 약물 분산액 작용제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (힐레넥스(HYLENEX)®, 백스터 인터내셔널, 인크.)을 추가로 포함한다. rHuPH20을 비롯한 특정의 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 US 특허 공개 제2005/0260186호 및 동 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 1종 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조 제제는 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 항체 제제로는 미국 특허 제6,171,586호 및 WO2006/044908에 기재된 것이 포함되며, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본원의 제제는 또한, 필요에 따라 치료될 특정한 적응증에 대한 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 악영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 적합하게는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 존재한다.
활성 성분은 예를 들어, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼에서 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포착될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
서방형 제제가 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예로는 염색질 개질제의 길항제 및/또는 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법 및/또는 화학요법)을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 멸균 상태이다. 멸균성은 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
VI. 제조품
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 동반된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등이 포함된다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 조성물 자체를 수용하거나 또는 조성물을 증상의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 조합하여 수용하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내 1종 이상의 활성제는 본원에 기재된 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제)이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택 증상을 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조품은 (a) 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제)를 포함하는 조성물을 내부에 함유시킨 제1 용기; 및 (b) 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법 및/또는 화학요법)를 포함하는 조성물을 내부에 함유시킨 제2 용기를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제조품은 용기, 상기 용기 상의 라벨, 및 상기 용기 내에 함유된 조성물을 포함하며, 여기서 조성물은 하나 이상의 시약 (예를 들어, 하나 이상의 바이오마커에 결합하는 1차 항체 또는 본원에 기재된 바이오마커 중 하나 이상에 대한 프로브 및/또는 프라이머), 조성물이 샘플 내 하나 이상의 바이오마커의 존재를 평가하는데 사용될 수 있음을 나타내는 용기 상의 라벨, 및 샘플 내 하나 이상의 바이오마커의 존재를 평가하기 위한 시약 사용에 대한 지침서를 포함한다. 제조품은 추가로 샘플의 제조 및 시약의 활용에 대한 지침서 및 물질 세트를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제조품은 시약, 예컨대 1차 및 2차 항체 둘 다를 포함할 수 있으며, 여기서 2차 항체는 표지, 예를 들어 효소적 표지에 접합된다. 일부 실시양태에서, 제조품은 본원에 기재된 바이오마커 중 하나 이상에 대한 프로브 및/또는 프라이머를 하나 이상 포함한다.
임의의 제조품의 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제 및/또는 암 요법제 (예를 들어, 표적화 요법)는 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 탁산이다. 일부 실시양태에서, 탁산은 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 암 요법제는 EGFR 길항제이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제 및/또는 EGFR 길항제는 소분자이다. 일부 실시양태에서, EGFR 소분자 길항제는 에를로티닙 및/또는 게피티닙이다. 일부 실시양태에서, 염색질 개질제의 길항제 및/또는 EGFR 길항제는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 단편이고, 항체 단편은 염색질 개질제 및/또는 억제제에 결합한다.
본 발명의 상기 실시양태의 제조품은 추가로, 조성물이 특정한 증상을 치료하는데 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 비롯한 상업용으로 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
제조품 중 다른 임의의 성분은 하나 이상의 완충제 (예를 들어, 차단 완충제, 세척 완충제, 기질 완충제 등), 다른 시약, 예컨대 효소적 표지에 의해 화학적으로 변경된 기질 (예를 들어, 발색체), 에피토프 복구 용액, 대조 샘플 (양성 및/또는 음성 대조군), 대조 슬라이드(들) 등을 포함한다.
임의의 상기 제조품은 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 암 요법제 (예를 들어, EGFR 길항제 또는 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀)) 대신에 또는 이들 이외에 본원에 기재된 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적 설명을 고려하여 다양한 다른 실시양태가 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1
암 세포의 표준 치료 또는 표적화 약물 치료 동안 암 세포의 생존을 유발하는 염색질 변경에 관여하는 유전자 산물을 확인하기 위해, 히스톤 질량 분광측정법 및 siRNA 스크리닝을 개시하였다. 특히, 모세포인 세포 및 약물 저항성 집단 (DTP) 세포의 히스톤 질량 분광측정법을 사용하여 모세포 세포주와 비교하여 DTP에서 변경된 히스톤 꼬리 변형을 확인하였다. 또한, 대략 300개의 염색질 개질제의 siRNA 라이브러리를 스크리닝하였으며, 이는 히스톤 데메틸라제, 메틸트랜스퍼라제 히스톤 아세틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제, 브로모도메인 함유 단백질, 유비퀴나제 및 데유비퀴나제 효소, 및 히스톤 샤페론 (각 유전자에 대해 4개의 상이한 siRNA 서열)을 포함한다.
물질 및 방법
세포 배양
모든 세포를 37℃에서 5% CO2 하에 5% 태아 소 혈청 (FBS) 및 L-글루타민으로 보충된 RPMI 배지 (고농도 글루코스)에서 유지하였다.
세포 생존율 검정
3×104개의 세포를 12-웰 클러스터 접시의 각 웰에 플레이팅하였다. 플레이팅한지 24시간 후, 배지를 제거하고, 약물을 함유하는 배지로 교체하였다. 미처리 세포가 전면생장에 도달할 때까지 신선한 배지를 2일마다 교체하였다. 이어서, 배지를 제거하고, 세포를 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 세척한 다음, PBS 중 4% 포름알데히드로 15분 동안 고정시켰다. 이어서, 세포를 PBS로 세척하고, 형광 핵산 염색제인 사이토(Syto)60 (PBS 중의 1 nM; 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes))으로 15분 동안 염색하였다. 염료를 제거하고, 세포 단층을 PBS로 세척하고, 오디세이(Odyssey) 적외선 이미저 (Li-Cor 바이오사이언스즈(Li-Cor Biosciences))를 사용하여 700nm에서 형광 정량화를 수행하였다.
약물-저항성 지속자(persister) (DTP)의 생성
약물-감수성 세포 (예를 들어, PC9 및 H1299)를 확립된 IC50 값을 100배 초과하는 농도의 본원에 기재된 바와 같은 관련 약물로 3회의 라운드 동안 처리하였고, 각각의 처리는 72시간 지속하였다. 관련 약물 처리의 3번째 라운드의 종료시 접시 상에 부착된 채 남아있는 생존 세포를 DTP인 것으로 하고, 분석을 위해 수집하였다.
세포 수확 및 단백질 분석
세포 용해물을 라에믈리(Laemmli) 샘플 완충제 중에서 제조하고, 상기 기재된 이뮤노블롯팅에 의해 분석하였다. H3에서의 변형에 대한 상업용 항체 (활성 모티프 및 셀 시그널링 테크놀로지스)를 사용하여 세포 용해물을 분석하였다.
siRNA 라이브러리 생성
브로모, 크로모 및 PHD 영역 및 온톨로지(ontology) 키워드 (예를 들어 아세틸트랜스퍼라제, 데아세틸라제, 메틸트랜스퍼라제, 데메틸라제)에 대한 데이터베이스 서치 (예를 들어, Pfam), 및 문헌 조사를 통해, 후성학 공간에서 300개의 유전자를 표적화하는 siRNA 라이브러리를 조립하였다 (표 2 참조). 표적 mRNA 상의 구별된 영역을 표적화하는 4개의 단일 siRNA를 비변형 si게놈 siRNA로서 이용하였다.
siRNA 스크리닝 방법
세포 (예를 들어, PC9 및 H1299)를 흑색 96 웰 투명 바닥 플레이트 (코닝(Corning), 카탈로그 #3603)에서 12.5 nM 최종 농도로 다마(Dharma)FECT 1 형질감염 지질 (다마콘(Dharmacon), 카탈로그 #T-2001) 0.0625 ul 및 단일 siRNA (다마콘 si게놈)를 사용하여 1000개 세포/웰로 역형질감염시켰다. 후속적으로, 세포 (예를 들어, PC9 및 H1299)를 48-72시간 동안 형질감염시킨 후, 형질감염 배지를 배지 중 1 uM 관련 약물 처리물 또는 배지 단독으로 교체하였다. 인큐베이션 72시간 후, 배지+/-약물을 신선한 배지로 교체하여 관련 약물 처리 후 잔존하는 약물 저항성 지속자 (DTP)가 회수되도록 하였다 (회수 단계). 회수 단계 3일 수, 제조업체 프로토콜에 따라 싸이퀀트(CyQUANT) 다이렉트 세포 증식 검정 (몰레큘라 프로브스)을 사용하여 최종 세포 생존율을 측정하였다. 싸이퀀트 형광 신호를 GE 인 세포 분석기(IN Cell Analyzer) 2000 (4× 배율)을 사용하여 검출하고, GE 디벨로퍼 툴박스(Developer Tollbox) 1.9.1을 사용하여 개발된 영상 분석 알고리즘을 사용하여 웰 당 세포 수로서 정량화하였다. 후속적으로, 스크리닝 데이터를 마이크로소프트 엑셀로 프로세싱하였다. 전체 Epi300 siRNA 스크린을 각 세포주에 대해 완전히 독립된 조건에서 2회 실행시켰다.
3-데아자네플라노신 A (DZNep) 세포 처리
PC9 세포를 흑색 96 웰 투명 바닥 플레이트 (코닝, 카탈로그 #3603)에 1000개 세포/웰로 분산시킨 후, 40 미만 내지 0.625 μM의 다양한 농도의 3-데아자네플라노신 A (DZNep)로 처리하였다. DZNep의 처리 48시간 후, 배지를 신선한 배지 단독 또는 1 μM 에를로티닙의 존재하에 교체하였다. 인큐베이션 72시간 후, 배지+/-에를로티닙을 신선한 배지로 교체하여 약물 처리 후 잔존하는 약물 저항성 지속자 (DTP)가 회수되도록 하였다. 회수 단계 3일 수, 제조업체 프로토콜에 따라 싸이퀀트 다이렉트 세포 증식 검정 (몰레큘라 프로브스)을 사용하여 최종 세포 생존율을 측정하였다. 싸이퀀트 형광 신호를 GE 인 세포 분석기 2000 (4× 배율)을 사용하여 검출하고, GE 디벨로퍼 툴박스 1.9.1을 사용하여 개발된 영상 분석 알고리즘을 사용하여 웰 당 세포 수로서 정량화하였다. 후속적으로, 스크리닝 데이터를 마이크로소프트 엑셀로 프로세싱하였다. 전체 Epi300 siRNA 스크린을 각 세포주에 대해 완전히 독립된 조건에서 2회 실행시켰다.
스크린 품질 평가
스크린의 품질은 비-표적 대조군 (NTC)에 대한 배지와 관련 약물 처리 조건 사이의 차이, 및 관련 약물 처리 조건에서 비-표적 대조군과 양성 대조군 (HDAC3 siRNA 단일 3) (다마콘, 카탈로그 #D-003496-03) 사이의 차이를 기초로 계산된 Z-팩터를 사용하여 평가하였다. 이들 조건을 비교한 스크린들에 대한 Z-팩터 값은 0.5 내지 1이었다.
질량 분광측정법 샘플 제조
10,000,000개 세포를 갖는 샘플을 용해시키고, 활성 모티프 히스톤 정제 키트 (world wide web activemotif.com/catalog/171.html)를 사용하여 히스톤을 세포 용해물로부터 단리하였다. 단리후 단백질 정량화를 큐비트(Qubit) 형광 플랫폼 (인비트로젠)을 사용하여 수행하였다. 표적 수율은 5,000,000개 세포 당 정제된 히스톤이 적어도 20 μg 이상이다. 이어서, 샘플을 유도체화하고, d0/d10 프로피온산 무수물을 사용한 이원 비교 및 트립신 분해를 실시하였다. 구체적으로, 각 샘플의 5 μg의 분취물을 d0 프로피온산 무수물과 함께 유도체화하여 리신 및 모노-메틸화 리신 잔기를 차단하였다. 대조 샘플로는 15 μg을 사용하였다. 샘플을 트립신으로 분해시켰다. 대조 샘플을 d0 프로피온산 무수물을 사용하여 (노출된 펩티드 N-말단 상에서) 재유도체화시켰다. 시험 샘플을 d10 프로피온산 무수물을 사용하여 (노출된 N-말단 상에서) 재유도체화시켰다. 각 시험 샘플을 독립적으로 대조 샘플과 1:1로 풀링하였다. 이어서, 샘플에 멀티-효소 분해를 행하였다. 샘플 당 3개 효소 세트를 사용하여 특성화될 PTM 부위 주위에 거대 펩티드를 생성시키고, 수반되는 중복 서열 커버리지를 모든 부위에 생성시켰다.
질량 분광측정법
펩티드 분해를 LTQ 오르비트랩 벨로스(Orbitrap Velos) 탠덤 질량 분광계에서 데이터-의존성 모드로 나노 LC/MS/MS에 의해 분석하였다. CID, HCD 및 ETD 단편화 체계를 사용하여 데이터를 수득하였다. 데이터 수득 후, 매스코트(Mascot) (매트릭스 사이언스)를 사용하여 데이터베이스 서치하여 아세틸화, 메틸화, 디메틸화, 트리메틸화, 인산화 및 유비퀴틴화를 결정하였다. 신생 서열화를 비롯한 수동식 데이터 분석을 사용하여 추정 인실리코(in-silico) 지시를 확인하고, 매스코트와 매칭되지 않는 변형된 펩티드에 대한 미가공 데이터 정보를 얻었다. 정확한 질량 완전 스캔 LC/MS 데이터를 통합하여 샘플 사이의 변형된 펩티드의 상대 존재비를 측정하였다. 트립신-분해된 프로피오닐화 샘플을 d0/d5 쌍을 비교함으로써 각 LC/MS 실행 이내에 정량화하였다 (문헌 [Garcia et al., JPR, 8, 5367-5374 (2009)]의 실시에 따름). 다른 효소 샘플은 LC/MS 실행 사이에 표지 없이 정량화되었다.
이종이식 종양 연구
PC9 세포를 성장 배지 (RPMI 1640, 10% 열-불활성화 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민)에서 80% 전면생장률로 배양시킨 다음 트립신화하고, PBS로 1회 세척하고, 행크 평형 염 용액(Hank's Balanced Salt Solution; HBSS) 또는 HBSS와 매트리겔 [감소된 성장 인자; 카탈로그 #356231 (펜실베니아주 웨스트 그로브 소재의 BD 바이오사이언시스)]의 1:1 혼합물에 5×107 개 세포/ml의 최종 농도로 재현탁시켰다. 각 이종이식 종양 모델을 면역손상 마우스의 후방 우측 측복부에 피하 (s.c.) 접종된 5×106 개 세포 (100 μL)를 사용하여 확립하였다. PC-9 및 PC-9-GFP 세포를 누드 (nu/nu) 마우스 (캘리포니아주 홀리스터 소재의 찰스 리버 래보러토리즈)의 매트리겔을 함유한 HBSS에 이식하였다. 종양 부피가 대략 100 내지 200 mm3에 이르렀을 때, 마우스를 유사한 크기의 종양을 갖는 동물군에서 분리하고, 그룹화한 날 후에 처치를 개시하였다. 마우스에 에를로티닙 (처음 4회의 용량은 7.5% 캅티솔로 50 mg/kg이며, 이후 7.5% 캅티솔 35 mg/kg으로 낮춤) 및/또는 TSA (0.5 mg/kg)을 함유한 경구 위관영양 (PO) 및 적절한 비히클 대조군을 일주일에 5 일 동안 (QD) 투여하였다.
결과
siRNA 스크린을 전개시키고, 약물 저항성 지속자 (DTP)에서 인간 비소세포 폐암 세포주 PC9를 사용하여 실행하였다 (도 1). PC9 DTP 세포를 제조하고, 상기 기재된 바와 같이 스크리닝하였다. 웰 당 세포 수를 배지 및 관련 약물인 에를로티닙 처리 둘 다에서의 모든 조건 (1200개 단일 siRNA)에 대해 평균 세포수/웰/플레이트로 정규화하였다. 스크린의 품질은 비-표적 대조군 (NTC)에 대한 배지와 에를로티닙 처리 조건 사이의 차이, 및 에를로티닙 처리 조건에서 비-표적 대조군과 양성 대조군 (HDAC3 siRNA 단일 3) (다마콘, 카탈로그 #D-003496-03) 사이의 차이를 기초로 계산된 Z-팩터를 사용하여 평가하였다 (도 2). 이들 조건을 비교한 스크린들에 대한 Z-팩터 값은 0.5 내지 1이었다. 상이한 플레이트에 걸쳐 수행된 2개의 웰 사이의 상관관계를 계산하였다 (도 3). 복제 플레이트 사이의 강한 상관관계 (R2>0.8)가 관찰되었다.
양성 히트(positive hit)는 배지 조건 vs. 에를로티닙 조건에서 특이적 유전자 녹다운 효과를 기준으로 정의되었다. 컷-오프(cut-off) 값을 양성 대조군 (HDAC3 siRNA 단일 3) 및 음성 대조군 (비-표적 대조군)의 편차를 기초로 측정하여, 배지 조건에서의 최소 효과 및 에를로티닙 조건에서의 세포 생존율에 대한 강한 영향을 미치는 양성 히트를 이끌어냈다 (도 4). 3개 이상의 단일 siRNA가 스크린에서 양성 히트로 스코어링된 유전자에 대해 순차적으로 상기 정의된 컷-오프를 기초로 효력이 있어야 한다.
먼저, 표적을 양성 siRNA 히트로 선택하였다. 각각의 개별적 히트에 대한 미가공 데이터를 도 5A1-O2에 기재하였다. 단일 siRNA 표적화 ATRX 중 어떤 것도 배지 조건에서 유의한 영향을 미치지 못한 반면, 그들 전부는 에를로티닙의 존재하에 세포 생존율을 상당히 감소시켰다 (도 5A1-2). 유사 4/4 양성 siRNA 결과가 UBE2A (도 5B1-2), MYST4 (도 5D1-2), EZH2 (도 5E1-2), CHD7 (도 5J1-2), 및 CHD1 (도 5N1-2)에 대해 관찰되었다. UBE2B (도 5C1-2), HDAC2 (도 5F1-2), HDAC3 (도 5G1-2), CDYL (도 5H1-2), LRWD1 (도 5I1-2), PHF10 (도 5K1-2), PHF12 (도 5L1-2), PHF23 (도 5M1-2), 및 RING1B (도 5O1-2)가 포함된 다른 양성 siRNA 히트는, siRNA 중 하나가 배지 조건에서 세포 생존율에 약간의 영향을 미치기 때문에 3/4 양성 siRNA 히트로 분류되었다.
siRNA 스크린 데이터를 기초로 하여 다음의 유전자가 약물 저항성 지속자 표현형에 관여하는 것으로 확인되었다: ATRX, UBE2A, UBE2B, MYST4, EZH2, HDAC2, HDAC3, CDYL, LRWD1, CHD7, PHF10, PHF12, PHF23, CHD1, RING1B, EED, CBX3, CBX6, CBX8, CHD4, 및 RBBP4 (도 14A에 제시된 바와 같음).
제2 siRNA 스크린을 전개시키고, DTP에서 인간 폐 선암종 암 세포주 H1299를 사용하여 실행하였다. H1299 DTP 세포를 제조하고, 에를로티닙 대신에 약물로서 탁산, 파클리탁셀을 사용하여 PC9/에를로티닙 스크린에 대해 상기 기재된 바와 같이 스크리닝하였다. ATRX에 대한 결과를 도 13에 나타내었다. 도 14B에 제시된 바와 같이, 탁산, 파클리탁셀을 사용한 H1299 세포에서의 제2 siRNA 스크린으로 약물 저항성 지속자 표현형에 관여하는 유전자가 확인되었다: MGEA5, MLLT10, SIRT4, TP53BP1, ATRX, BRDT, CBX6, CHD1, EVI1, GTF3C4, HIRA, MPHOSPH8, NCOA1, RBBP5, TDRD7, 및 ZCWPW1. HDAC2는 H1299 세포로 시험된 제1 실행에서 4개 siRNA 중 3개가, 제2 실행에서 4개 중 2개가 양성인 반면, HDAC3은 파클리탁셀로 처리된 H1299에서는 음성이었다 (데이터는 제시되지 않음). 또한, H1299 세포주에서 EZH2 및 SUZ12 둘 다는 히트로서 확인되었다 (6/8 양성 siRNA 히트) (도 9).
폴리콤 억제 복합체 1 및 2
각각 폴리콤 억제 복합체 1 (PRC1) 및 폴리콤 억제 복합체 2 (PRC2)의 성분인 RING1B 및 EZH2가 PC9 DTP 세포의 siRNA 스크린에서 양성 히트로 확인되었기 때문에, 이들 복합체 성분이 약물 저항성 지속에 관여하는지를 조사하는 추가의 연구를 수행하였다.
PRC1 복합체의 몇몇 추가 성분을 4개의 단일 siRNA (다마콘 si게놈)/유전자를 사용하여 녹다운시켰다 (도 6). 3/4 양성 siRNA 히트로서의 RING1B의 확인에 추가로, CBX3, CBX6 및 CBX8을 또한, 배지에서 어떠한 영향도 없는 에를로티닙의 존재하에 세포 생존율을 감소시키는 4개 siRNA 중 적어도 2개와 관련시켰다.
PRC2 복합체의 몇몇 추가 성분을 또한 조사하였다. 비변형 siRNA (다마콘 si게놈) 이외에, 추가의 siRNA 서열을 EZH2, EED 및 SUZ12에 대한 PC9 세포에서 변형된 siRNA (다마콘 온-타겟 플러스)와 같이 시험하였다 (도 8). 이러한 접근법을 사용하여, PC9 세포에서 EZH2는 6/8, EED는 5/8, 및 SUZ12는 6/8 양성 siRNA 히트로서 확인되었다. 파클리탁셀 (1 uM)로 처리되거나 처리되지 않은 인간 비-소세포 폐 암종 세포주 H1299에서 상이한 PRC2 성분의 녹다운 효과 (도 9). H1299 세포주에서, EZH2 및 SUZ12 둘 다는 히트 (6/8 양성 siRNA 히트)로서 확인되었다. EED는 8개 양성 siRNA 중 단지 2개가 확인되지 않았다. 흥미롭게도, 이들 유전자 중 어떤 것도 PC9 DTEP에서 양성 히트가 아니었다 (도 10).
EZH2 및 EED를 비롯한 PRC2가 에를로티닙에 대하여 DTP 세포의 유지에 관여하는지를 추가로 입증하기 위해, EZH2의 억제에 의해 PRC2를 방해하는 것으로 상기 제시된 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제제인 3-데아자네플라노신 A (DZNep)의 영향을 상기 기재된 바와 같이 시험하였다. 도 11A에 제시된 바와 같이, 0.625 내지 10 uM의 증가하는 농도의 DZNep로의 PC9 DTP 세포의 처리는 배지 단독에서 세포 생존율에 대해 최소 효과를 나타냈다. 단일 작용제로서 DZNep의 유의한 영향은 PC9 DTP 세포에서 20 및 40 uM와 같은 농도에서 관찰되었다. 에를로티닙과 조합된 DZNep는 0.625 uM만큼 낮은 농도로도 PC9 DTP 세포 생존율을 매우 크게 감소시킨다. DZNep가 0.625 (도 11B) 및 5 uM (도 11C)에서는 PC9 DTP 세포 생존율에 대해 그 자체가 영향을 미치지 않더라도, 이들 농도는 에를로티닙 단독과 비교하여 각각 75.8 및 87.5% 세포 사멸을 초래하였다. 이들 결과는 EZH2 및 EED 녹다운 효과와 상관관계가 있으며, DTP의 유지에 대한 PRC2의 영향을 추가로 확립하였다.
뉴클레오솜 재형성 및 히스톤 데아세틸라제 NuRD 복합체
NuRD 복합체의 몇몇 성분을 또한 다중 단일 siRNA (다마콘 si게놈 또는 온-타겟 플러스)를 사용하여 조사하였다. 조사된 상이한 성분들 중, 8개의 단일 siRNA 표적화 CHD4 중 4개가 에를로티닙의 존재하에서 PC9 DTP 세포 생존율을 명백하게 감소시킨 반면, 배지에는 영향을 미치지 않았다. 이는 DTP를 유지하는데 CHD4가 관여함을 나타낸다. 4개의 단일 siRNA 표적화 RBBP4 중 3개가 배지에서의 PC9 DTP 세포 생존율에 약간 영향을 미치는 반면, 에를로티닙의 존재 하의 PC9 DTP 세포 생존율을 상당히 감소시켰다. 이는 DTP를 유지하는데 RBBP4 또한 관여하는 것을 강력히 시사한다.
히스톤 질량 분광측정법 샘플 제조 및 분석
PC9 및 PC9 DTP 세포 샘플을 상기 기재된 바와 같이 제조하고 분석하였다. 이 연구는 히스톤 꼬리 변형에서의 유의한 변화를 보여준다. 구체적으로, 리신 잔기 K9, K18 및 K27에서 히스톤 H3의 아세틸화 패턴의 변경이 존재한다. 또한, 리신 잔기 K4, K9 및 K27에서 히스톤 H3의 메틸화 패턴의 변경이 존재한다.
히스톤 질량 분광측정법에 의해 확인된 히스톤 번역후 변형은 양성 siRNA 스크린 히트와 일관되었다. 특히, 양성 siRNA 스크린 히트는 질량 분광측정법에 의해 측정된 바와 같이, PC9와 비교하여 PC9 DTP 세포에서 변경되는 특이적 히스톤 H3 변형의 조절제이다. 예를 들어, 질량 분광측정법에 의해 측정된 바와 같이, PC9 세포에 비해 PC9 DTP 세포에서 히스톤 H3K4 메틸화는 감소되고 (예를 들어, 트리-메틸화와 비교하여 비메틸화, 모노 및 디-메틸화의 증가), 히스톤 H3K9 메틸화는 증가되었다 (예를 들어, 디, 모노 또는 비메틸화와 비교하여 트리-메틸화의 증가). 이 발견과 일치하게, 양성 siRNA 스크린 히트, ATRX는 낮은 히스톤 H3K4 메틸화 및 높은 히스톤 H3K9 메틸화의 판독기이고, 또 다른 양성 siRNA 스크린 히트인 CHD7은 히스톤 H3K4 비메틸화의 잠재적 판독기이다. 유사하게, 양성 siRNA 스크린 PRC1 성분 히트 RING1B 및 CBX 단백질은 웨스턴 블롯 및 질량 분광측정법에 의해 제시된 바와 같이, PC9 세포에 비해 PC9 DTP 세포에서 증가되는 메틸화 히스톤 H3K27 (예를 들어, 디, 모노 또는 비메틸화와 비교하여 트리-메틸화의 증가)을 판독한다. 도 15B 및 15C를 참조한다. 추가로 그리고 메틸화 히스톤 H3K27의 변경과 일치하게, 히스톤 H3K27 아세틸화 패턴은 웨스턴 블롯 및 질량 분광측정법에 의해 제시된 바와 같이 감소되었다. 도 15B 및 15C를 참조한다. H3K4 트리메틸화의 감소, 및 H3K9 트리메틸화 및 H3K27 트리메틸화의 증가가 질량 분광측정법 및 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다 (본원 데이터 및 데이터는 제시되지 않음).
약물 저항성에서의 히스톤 데아세틸라제의 역할
약물 저항성에서의 히스톤 데아세틸라제의 역할을 설명하기 위해, 그의 역할을 추가 모델에서 추가로 시험하였다. 클래스 I 및 II HDAC 억제제 TSA를 2.5 Gy 및 10 Gy의 방사선요법과 함께 SKBR3 세포에서 시험하였다. 도 16A-B에서 제시된 바와 같이, HDAC 억제제 TSA는 유의한 영향을 미치고, 방사선요법 약물 저항성 세포를 제거한다. 유사하게, TSA는 라파티닙 감수성 및 DTP 형성에 유의한 영향을 미치는 것으로 도 17C에 나타나 있다.
약물 저항성의 확립에서의 HDAC의 역할을 추가 조사하기 위해, HDAC2 및 3에 대한 siRNA, 및 HDAC1/2 또는 3 편중된 억제제를 약물-저항성 상태의 파괴에 대한 그의 능력에 대해 시험하였다. 도 17A-B에 제시된 바와 같이, HDAC2 및 HDAC3 발현의 siRNA 녹다운은 에를로티닙과 조합된 PC9 DTP 형태에서 상당한 감소를 야기하였다. 또한, 도 17C에 제시된 바와 같이, HDAC 소분자 억제제 G946, HDAC1/2 편중된 억제제, 및 G877, HDAC3 편중된 억제제는 에를로티닙과 PC9 DTP의 세포 성장을 감소시키는데 효과적이다.
PC9 이종이식편 연구를 위해, 마우스에 PC9 세포를 접종하고, 종양이 100 내지 200 mm3 크기로 성장되게 한 다음, 이를 4개 처치군, 즉, 비히클 대조군, 트리코스타틴 A (TSA) 대조군, 에를로티닙 단독, 및 에를로티닙 + TSA 군으로 나누었다. 도 18에 제시된 바와 같이, TSA 단독은 종양 성장에 영향을 미치지 않는 반면, 에를로티닙 + TSA를 조합함으로써 종양 재발을 상당히 지연시켰다.
약물 저항성에서의 PRC2 및 EZH2의 역할
약물 저항성의 확립에서의 EZH2의 역할을 추가 조사하기 위해, EZH2에 대한 siRNA, 및 소분자 억제제를 약물-저항성 상태의 파괴에 대한 그의 능력에 대해 시험하였다. 도 19A에 제시된 바와 같이, EZH2 발현의 siRNA 녹다운은 에를로티닙과 조합된 PC9 DTP 형태에서 상당한 감소를 야기하였다. 도 20A, 21A 및 22A에 제시된 바와 같이, GSK126 및 EPZ-6438은 타르세바로 처리된 PC9 세포 및 PI3 키나제 억제제 GDC-0908로 처리된 EVSAT 세포에서 H3K27 트리메틸화를 감소시키는데 효과적이다. 또한, 도 19B 및 20-B-D에 제시된 바와 같이, EZH2 소분자 억제제 GSK126은 에를로티닙과 PC9 DTP의 용량 의존성 방식으로 세포 성장을 감소시키는데 효과적이다. 유사하게, 도 22B-D에 제시된 바와 같이, EZH2 소분자 억제제 EPZ-6438은 에를로티닙과 PC9 DTP의 용량 의존성 방식으로 세포 성장을 감소시키는데 효과적이다. EZH2 억제제는 다른 약물 저항성 모델, 예컨대 유방암 세포주 EVSAT (red) GDC-0908 DTP, 유방암 세포주 SKBR3 (red) 라파티닙 DTP, 유방암 세포주 BT474 (red) 라파티닙 DTP, 흑색종 세포주 M14 Mek 억제제/파클리탁셀 DTP, 및 결장암 세포주 colo205 AZ628 DTP에 대해 효과적이다. 예를 들어 도 21B에 제시된 바와 같이, EZH2 소분자 억제제, GSK126 및 EPZ-6438은 PI3 키나제 억제제 GDC-0980과 EVSAT DTP의 용량 의존성 방식으로 세포 성장을 감소시키는데 효과적이다.
상기 발명은 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 예시 및 실시예로서 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그의 전문이 명백하게 참조로 포함된다.
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Claims (26)

  1. 개체에게 (a) 염색질 개질제의 조절제 및 (b) EGFR 길항제 또는 탁산을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 염색질 개질제의 조절제 및 EGFR 길항제 또는 탁산의 각각의 양이 암 감수성의 기간을 증가시키고/거나 EGFR 길항제 또는 탁산에 대한 세포 내성의 발생을 지연시키는데 효과적인 것인 방법.
  3. 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 유효량의 EGFR 길항제 또는 유효량의 탁산을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 EGFR 길항제 또는 탁산을 포함하는 암 치료의 효능을 증가시키는 방법.
  4. 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 유효량의 EGFR 길항제 또는 유효량의 탁산을 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법으로, 상기 암 치료가 유효량의 EGFR 길항제 또는 유효량의 탁산을 염색질 개질제의 길항제 없이 (부재 하에) 투여하는 것을 포함하는 표준 치료와 비교하여 증가된 효능을 갖는 것인, 개체에서 암을 치료하는 방법.
  5. 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 유효량의 EGFR 길항제 또는 유효량의 탁산을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 EGFR 길항제 또는 탁산에 대해 내성인 암의 발생을 지연시키고/거나 예방하는 방법.
  6. 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 유효량의 EGFR 길항제 또는 유효량의 탁산을 투여하는 것을 포함하는, EGFR 길항제 또는 탁산에 대한 내성 발생 가능성이 증가된 암에 걸린 개체를 치료하는 방법.
  7. 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 및 (b) 유효량의 EGFR 길항제 또는 유효량의 탁산을 투여하는 것을 포함하는, 암에 걸린 개체에서 EGFR 길항제 또는 탁산에 대한 감수성을 증가시키는 방법.
  8. 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 (b) 유효량의 EGFR 길항제 또는 유효량의 탁산을 투여하는 것을 포함하는, 암에 걸린 개체에서 EGFR 길항제 또는 탁산 감수성의 기간을 연장시키는 방법.
  9. 개체에게 (a) 유효량의 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 (b) 유효량의 EGFR 길항제 또는 유효량의 탁산을 투여하는 것을 포함하는, 암에 걸린 개체에서 EGFR 길항제 또는 탁산에 대한 반응의 지속기간을 연장시키는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 염색질 개질제의 조절제가 염색질 개질제의 길항제인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 염색질 개질제의 조절제가 항체 억제제, 소분자 억제제, 결합 폴리펩티드 억제제, 및/또는 폴리뉴클레오티드 길항제인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 염색질 개질제의 조절제가 폴리콤 억제 복합체 2 (PRC2)의 구성원의 길항제인 방법.
  13. 제12항에 있어서, PRC2의 구성원의 길항제가 EZH2, EED 및/또는 SUZ12의 길항제인 방법.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 염색질 개질제의 조절제가 폴리콤 억제 복합체 1 (PRC1)의 구성원의 길항제인 방법.
  15. 제14항에 있어서, PRC1의 구성원의 길항제가 RING1B, CBX3, CBX6, 및/또는 CBX8의 길항제인 방법.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 염색질 개질제의 조절제가 NURD 복합체의 구성원의 길항제인 방법.
  17. 제16항에 있어서, NURD 복합체의 구성원의 길항제가 CHD4 및/또는 RBBP4의 길항제인 방법.
  18. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제)가 HDAC1, HDAC2 및/또는 HDAC3의 길항제인 방법.
  19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 염색질 개질제의 조절제가 ATRX, MYST4, CDYL, LRWD1, CHD7, PHF10, PHF12, PHF23, CHD1, MGEA5, MLLT10, SIRT4, TP53BP1, ATRX, BRDT, CBX6, CHD1, EVI1, GTF3C4, HIRA, MPHOSPH8, NCOA1, RBBP5, TDRD7 및 ZCWPW1 중 하나 이상의 길항제인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, EGFR 길항제를 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, EGFR 길항제가 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염인 방법.
  22. 제20항에 있어서, EGFR 길항제가 게피티닙 및/또는 에를로티닙인 방법.
  23. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 탁산을 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 탁산이 파클리탁셀 또는 도세탁셀인 방법.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 염색질 개질제의 조절제 (예를 들어, 염색질 개질제의 길항제) 및 EGFR 길항제 또는 탁산이 부수적으로 투여되는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암 (NSCLC) 및/또는 유방암인 방법.
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