TWI580692B - 經修飾纖維黏連蛋白片段或變體及其用途 - Google Patents
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Description
本發明大體上係關於細胞生物學，且特定言之，細胞外基質蛋白(extracellular matrix protein)與整合素(integrin)之功能及相互作用。更特定言之，本發明係關於作為整合素(尤其整合素α5β1及整合素αvβ3)之特定拮抗劑的人類纖維黏連蛋白(fibronectin)片段及/或其變體。隨本文所提交之序列txt文件以全文引用之方式併入本文中。
整合素為介導細胞-基質及細胞-細胞相互作用的醣蛋白膜受體家族。整合素為雜二聚體，由α及β次單元組成。迄今為止已描述至少24種不同整合素雜二聚體，包括18種α次單元及8種β次單元。整合素藉助於與不同細胞外基質(ECM)蛋白的特定相互作用來介導細胞之固著及遷移。另外，細胞存活、***及分化亦依賴於有效之細胞-ECM結合(Morgan等人2009,IUBMB Life,61：731-38)。
整合素α5β1及αvβ3聚集在培養細胞之黏附接觸處。整合素-ECM複合物不僅用以維持固著及遷移所需的細胞-細胞及細胞-基質之相互作用，細胞-ECM複合物之形成亦藉由在細胞內部補充酶及接附蛋白形成動力學複合物來觸發整合素介導之細胞內信號傳導。整合素之細胞內信號輸出可影響基因表現、細胞存活、分化及增殖。整合素已牽涉許多病理性狀況(諸如血管生成及腫瘤發展)。
已知若干整合素與纖維黏連蛋白藉助於纖維黏連蛋白中存在之Arg-Gly-Asp(RGD)基元(motif)而相互作用。此等整合素包括5種αv整合素(αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6及αvβ8)及兩種β1整合素(α5β1及α8β1)(Smith,W.,2008,J.Allergy Clin.Immunol. 121：S375-S379)。纖維黏連蛋白為高分子量(約440kDa)的細胞外基質醣蛋白，其與整合素以及其他細胞外基質蛋白結合。纖維黏連蛋白以在C末端由雙硫鍵鍵聯的兩個單體之二聚體形式存在。各纖維黏連蛋白單體之分子量為230-250kDa，含有三種類型之域：類型I、II及III。類型I及II域由鏈內雙硫鍵穩定，而類型III域不含有任何雙硫鍵。缺乏雙硫鍵可使得FN類型III域之結構具有柔性。
各域含有多個經組織以沿纖維黏連蛋白單體之長度方向形成功能性及結合蛋白質之區的模組。舉例而言，需要類型I域中之模組以用於引發纖維黏連蛋白受質組裝，而類型I及類型III域兩者中之模組對與其他纖維黏連蛋白分子結合而言為至關重要的。RGD基元位於類型III域之模組10(FNIII 10)中，且構成纖維黏連蛋白與整合素α5β1及αvβ3之結合位點。類型III域模組9(FNIII 9)中之序列，尤其PHSRN協同環，促使纖維黏連蛋白與整合素α5β1結合。纖維黏連蛋白之整合素αvβ3結合不需要模組9之協同效應。
因為整合素在調控多種細胞功能中之作用，所以已研究使用整合素拮抗劑治療疾病的可行性。舉例而言，實驗使用整合素αIIbβ3(活化血小板凝集之整合素)之拮抗劑作為用於治療血栓症相關之局部缺血性血管疾病的抗凝劑(Coller等人，2008,Blood,112：3011-25)。解整合素(disintegrin)(諸如蛇毒蛋白(Rhodostomin))為在蛇毒液中天然發現的抑制整合素介導之血小板凝集及細胞黏附的較小蛋白質整合素拮抗劑家族。然而，解整合素不具有特異性，且具有高度免疫原性。其與纖維黏連蛋白競爭結合細胞表面上含有β1及β3之整合素，且無差別
地抑制整合素α5β1、αvβ3及整合素αIIbβ3之活性。因此，使用解整合素作為整合素α5β1及αvβ3之拮抗劑具有高出血風險，歸因於其aIIbβ3拮抗劑活性防止血小板凝集及血液凝固。
類似地，假結核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)蛋白侵襲素為結合整合素之蛋白。細菌侵襲素蛋白藉由與整合素結合來促使細菌進入細胞。使用侵襲素作為整合素拮抗劑有問題，因為細菌蛋白質可能具有高度免疫原性，且因為侵襲素蛋白之特異性不確定。
在高濃度下，FNIII 9-10在一定程度上模擬全長纖維黏連蛋白分子之生物活性(van der Walle等人，2002,Protein Engineering 15：1021-24)。FNIII9-10與其他ECM蛋白競爭結合整合素。與解整合素相比，該等包含整合素之結合域的截短之纖維黏連蛋白分子或片段(例如FNIII 10或FNIII 9-10)對人類具有較少免疫原性，且具有更高特異性，且因此不造成出血。然而，在使用截短之纖維黏連蛋白作為整合素拮抗劑時存在困難。困難之一為穩定性及溶解性。單獨的人類FNIII 9或FNIII 9-10在結構上不穩定(參見van der Walle，文獻同前)。此外，高濃度下之FNIII 9-10為不溶的，此對其大規模製備及生產呈現較大挑戰。因此，需要經較好設計的具有低免疫原性、高特異性且穩定性及溶解性增強之整合素拮抗劑。
本發明尤其提供不受先前技術中所發現之限制妨礙的整合素拮抗劑及其用途。
本發明者未預期地發現，本文所揭示的突變或經修飾之人類纖維黏連蛋白(FN)片段呈現整合素拮抗劑活性。另外，與具有野生型序列之FN片段相比，本文所揭示的FNIII 10或FNIII 9-10突變體或變體顯示溶解性及穩定性增加。
在人類FN中，RGD基元位於很大程度上無序且移動性的類型III
域10之環中，推測彈性(flexibility)對其功能而言為至關重要的。本發明者未預期地發現，在FNIII 10內藉由引入經改造之雙硫鍵來增加域內剛性賦予經改良之溶解性及穩定性，且/或維持或改良針對整合素α5β1及/或整合素αvβ3之拮抗劑活性。在某些特定實施例中，本發明之FNIII片段在pH 7.0之溶液中呈現至少約20至約24mg/mL的溶解度。在某些其他特定實施例中，本發明之FNIII片段呈現至少約7至約27mg/mL之溶解度。在某些特定實施例中，在不存在自由胺基酸Arg及Glu的情況下達成溶解度。在某些其他實施例中，與具有野生型人類序列之FNIII片段相比，本發明之FNIII片段所展示之溶解度增加約10%至約300%，尤其約20%至約280%，25%至約250%，30%至約200%，20%至約150%。
雖然對與整合素αvβ3結合而言並非必需，但咸信模組9對整合素α5β1之結合提供協同性增強。本發明者未預期地發現，在存在FNIII 9的情況下，藉助於側接RGD基元之兩個Cys取代(例如包含式Cys-X8-Cys，此外例如包含式Cys1490X2RGDX3Cys1499)而在模組10中引入之雙硫鍵可改良FNIII 9-10變體之溶解性及穩定性，且增加整合素α5β1之拮抗劑活性。此外，本發明者意外地發現，在側接RGD基元之FNIII模組10(例如包含式Cys-X7-Cys，此外例如包含式Cys1491XRGDX3Cys1499)中的經改造雙硫鍵可改良FNIII 10變體之溶解性及穩定性，及其對整合素αvβ3之拮抗劑活性。此外，本發明者意外地發現，在FNIII 9-10之情形下，具有包含例如式Cys-X7-Cys及此外例如式Cys1491XRGDX3Cys1499之Cys取代的變體展現對整合素αvβ3而非整合素α5β1的結合特異性。
因此，在一個態樣中，本發明提供一種經分離之多肽，其包含經修飾之人類纖維黏連蛋白片段，該蛋白片段包含人類纖維黏連蛋白類型III域模組10(FNIII10)，其中該FNIII 10包含Arg-Gly-Asp(RGD)
基元及兩個Cys取代以形成雙硫鍵，其中一個Cys取代在RGD基元之N-末端，而另一個Cys取代在RGD基元之C-末端，且其中該FNIII 10包含與SEQ ID NO：2至少85%，至少90%，至少95%或至少98%同源性的胺基酸序列。在某些具體實施例中，多肽抑制或能夠抑制整合素α5β1或整合素αvβ3活性，而不抑制整合素aIIbβ3活性。在本申請案通篇中，經修飾之人類纖維黏連蛋白片段可視情況進一步包含人類纖維黏連蛋白之其他模組及/或域。在某些實施例中，經修飾之人類纖維黏連蛋白進一步包含類型III域模組9，且人類纖維黏連蛋白類型III域模組9及10(FNIII 9-10)包含與SEQ ID NO：4至少85%、至少90%、至少95%或至少98%同源性的胺基酸序列。在某些其他實施例中，FNIII 9-10視情況在模組9中之胺基酸位置1408處進一步包含Leu經Pro取代。
在某些實施例中，兩個Cys取代由約6至約9個胺基酸殘基分離，且側接RGD基元。在某些其他實施例中，兩個Cys取代由7或8個胺基酸殘基分離。在某些實施例中，兩個Cys取代位於胺基酸位置1487-1501內。在某些其他實施例中，FNIII 10在胺基酸位置1491、1492、1496、1497或1498處進一步包含至少一個胺基酸取代，且其中位置1491處之胺基酸取代為Arg或Ile，位置1492處之胺基酸取代為Ala或Pro，位置1496處之胺基酸取代為Met、Asn或Trp，位置1497處之胺基酸取代為Asn，且位置1498處之胺基酸取代為Asp或Glu。本申請案通篇所使用之胺基酸編號係基於全長人類纖維黏連蛋白蛋白質(SEQ ID NO：74)之胺基酸編號。舉例而言，基於SEQ ID NO：74之序列的胺基酸位置1491處之Thr殘基係指如SEQ ID NO：2中所示之FNIII 10的胺基酸位置76處的Thr殘基。
在某些特定實施例中，Cys取代為胺基酸位置1491處之Thr經Cys取代(T1491C)及胺基酸位置1499處之Ser經Cys取代(S1499C)。在某些
實施例中，FNIII 10包含式C1491X1(n)RGDX2(n)C1499，其中該n為1、2或3，其中X1及X2可代表相同或不同之胺基酸殘基。在某些特定實施例中，FNIII 10包含式C1491X1(1)RGDX2(3)C1499。在某些特定實施例中，多肽抑制整合素αvβ3活性。
在其他實施例中，FNIII 10包含式Cys1491-X1-Arg-Gly-Asp-X2-X3-X4-Cys1499，其中X1為Gly、Ala或Pro；X2為Ser、Met、Asn或Trp；X3為Pro或Asn；且X4為Ala、Asp或Glu。在某些特定實施例中，X1為Pro，X2為Met，X3為Pro，且X4為Asp。在某些其他特定實施例中，X1為Pro，X2為Trp，X3為Asn，且X4為Glu。在其他特定實施例中，X1為Ala，X2為Asn，X3為Pro，且X4為Asp。在某些特定實施例中，X1為Gly，X2為Ser，X3為Pro，且X4為Ala。在某些其他實施例中，多肽具有SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12之胺基酸序列。在某些特定實施例中，多肽具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列。在某些其他特定實施例中，多肽選擇性抑制或能夠選擇性抑制整合素αvβ3活性。
在某些其他實施例中，其中經修飾之人類纖維黏連蛋白片段進一步包含人類纖維黏連蛋白類型III域模組9(FNIII 9)，該模組視情況可在胺基酸位置1408處包含Leu經Pro取代，且其中FNIII 9及FNIII 10(FNIII 9-10)包含與SEQ ID NO：4之胺基酸序列至少85%，至少90%，至少95%或至少98%同源性的胺基酸序列。在某些實施例中，多肽具有SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26之胺基酸序列。在某些特定實施例中，多肽具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列。
在某些其他實施例中，Cys取代為在胺基酸位置1490處Val經Cys取代(V1490C)及在胺基酸位置1499處Ser經Cys取代(S1499C)，其中經修飾之人類纖維黏連蛋白片段視情況可進一步包含人類纖維黏連蛋白
類型III域模組9，該模組視情況可在胺基酸位置1408處進一步包含Leu經Pro取代。在某些實施例中，FNIII 10包含式Cys1490-X1-X2-Arg-Gly-As-X3-Pro-X4-Cys1499，其中X1為Thr、Arg或Ile；X2為Gly、Ala或Pro；X3為Phe、Arg、Asp、Ser、Met或Asn；且X4為Ala或Asp。在某些特定實施例中，X1為Arg，X2為Ala，X3為Asn，且X4為Asp。在某些其他實施例中，多肽具有SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：110之胺基酸序列。在某些特定實施例中，多肽具有SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：110之胺基酸序列。在某些特定實施例中，多肽選擇性抑制或能夠選擇性抑制整合素α5β1活性。在某些實施例中，Cys取代為在胺基酸位置1490處之Val經Cys取代(V1490C)及在胺基酸位置1499處之Ser經Cys取代(S1499C)，其中經修飾之人類纖維黏連蛋白片段視情況可進一步包含人類纖維黏連蛋白類型III域模組9，該模組視情況可在胺基酸位置1408處進一步包含Leu經Pro取代，及視情況的在胺基酸位置1341處之Asn經Ala取代、在胺基酸位置1377處之His經Pro取代、在胺基酸1376處之Pro經Lys取代或在胺基酸位置1376處之Pro經Asp取代。在某些特定實施例中，多肽具有SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113或SEQ ID NO：114之胺基酸序列。在某些特定實施例中，多肽選擇性抑制或能夠選擇性抑制整合素α5β1活性。
認為FNIII 9-10域間鍵聯之彈性使人類FN蛋白中發生大規模構形變化。藉由FNIII 9-10界面處鍵聯之延伸來使FNIII 9及FNIII 10部分結構解偶導致模組9之協同結合的損失(Altroff等人，2004,J.Biological Chemistry,279：55995-56003)。前述結果顯示藉由跨模組9與10之接合處的雙硫鍵來引入的域間剛性藉助於與整合素α5β1結合來消除FNIII 9-10之協同細胞黏附活性，且減少其與不依賴於FNIII 9之整合素αvβ3
結合的親和性(Altroff等人，文獻同前)。
然而，本發明者未預期地發現，由非共價鍵產生的模組9與10之間的域間鍵聯維持其與整合素α5β1的結合親和性。非共價鍵聯可為FNIII 9及FNIII 10提供恰當定向，且促使與整合素α5β1結合。
因此，在另一個態樣中，本發明提供包含經修飾之人類纖維黏連蛋白片段的經分離之多肽，該蛋白片段包含人類纖維黏連蛋白類型III域模組9及人類纖維黏連蛋白類型III域模組10(FNIII 9-10)，其中FNIII 9視情況可在胺基酸位置1408處包含Leu經Pro取代，其中FNIII 9及/或FNIII 10包含至少一個胺基酸取代，其中FNIII 9及FNIII 10中之胺基酸殘基形成非共價鍵，且其中FNIII 9及FNIII 10包含與SEQ ID NO：4之胺基酸序列至少85%，至少90%，至少95%或至少98%同源且並非SEQ ID NO NO：64的胺基酸序列。在某些特定實施例中，多肽抑制或能夠抑制整合素α5β1活性。
根據本發明之此態樣，在某些實施例中，FNIII 9及FNIII 10中之胺基酸取代形成域間雙硫鍵。在某些其他實施例中，FNIII 9及FNIII 10中之胺基酸取代形成域間氫鍵。在某些特定實施例中，FNIII 9中之胺基酸取代為在胺基酸位置1340處之Ala經Asp取代(A1340D)，且FNIII 10中之胺基酸取代為在胺基酸位置1442處之Val經Lys取代(V1442K)(圖4)。在某些另外的實施例中，多肽具有SEQ ID NO：40之胺基酸序列。在某些其他實施例中，FNIII 10中之胺基酸取代為在胺基酸位置1491處之Thr經Arg取代(T1491R)。在某些特定實施例中，在胺基酸位置1341處之Asn與在位置1491處之胺基酸殘基之間形成非共價域間鍵聯。在某些另外的實施例中，多肽具有SEQ ID NO：72之胺基酸序列。
在另一個態樣中，本發明提供包含經修飾之人類纖維黏連蛋白片段的經分離之多肽，該蛋白片段包含其中含有式Val1490-X1-X2-Arg-
Gly-Asp-X3-X4-X5-X6-Ser1500之人類纖維黏連蛋白類型III域模組10(FNIII 10)，其中X1為Thr或Arg；X2為Ala或Pro；X3為Met、Trp或Asn；X4為Pro或Asn；X5為Asp或Glu；且X6為Ser或Gly，其中經修飾之纖維黏連蛋白片段包含與SEQ ID NO：2至少85%，至少90%，至少95%或至少98%同源且並非SEQ ID NO：50的胺基酸序列。在某些特定實施例中，X1為Thr；X2為Pro；X3為Met；X4為Pro；X5為Asp；且X6為Ser。在某一個其他特定實施例中，X1為Thr；X2為Ala；X3為Asn；X4為Pro；X5為Asp；且X6為Ser。在另外的實施例中，X1為Arg；X2為Ala；X3為Asn；X4為Pro；X5為Asp；且X6為Ser。在某些特定實施例中，多肽抑制或能夠抑制整合素α5β1活性及/或整合素αvβ3活性。在某些其他實施例中，多肽具有SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：54之胺基酸序列。在某些特定實施例中，多肽具有SEQ ID NO：48之胺基酸序列。
根據本發明之此態樣，在某些實施例中，經修飾之纖維黏連蛋白片段進一步包含人類纖維黏連蛋白類型III域模組9(FNIII 9)，該模組視情況可在胺基酸位置1408處包含Leu經Pro取代，且其中FNIII 9及FNIII 10(FNIII 9-10)包含與SEQ ID NO：4之胺基酸序列至少85%，至少90%，至少95%或至少98%同源的胺基酸序列。在某些特定實施例中，多肽具有SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：62之胺基酸序列。在某些特定實施例中。多肽具有SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：62之胺基酸序列。
本文所描述之所有實施例可與其他實施例組合，除非自上下文明確瞭解其不能組合。舉例而言，包含其中含有域內雙硫鍵之FNIII 9-10的經修飾之纖維黏連蛋白片段可進一步包含FNIII 9與FNIII 10之間的經改造之域間鍵聯。亦理解本發明涵蓋可其他組合。
在另一個態樣中，提供包含本文所描述之多肽的組合物。在又
另一個態樣中，本發明提供包含本發明之多肽及醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑的醫藥組合物。在某些特定實施例中，醫藥組合物包含治療有效量的描述於上述各態樣中之多肽。
在另一個態樣中，本發明提供抑制整合素介導之細胞黏附、生長、遷移或分化的方法，其包含使細胞與有效量的本發明之多肽接觸的步驟，其中該整合素包含αvβ3及/或α5β1整合素。根據本發明之此等態樣，在某些實施例中，整合素為整合素αvβ3。在某些另外的實施例中，多肽具有SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：56之胺基酸序列。在某些特定實施例中，多肽具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列。在某些其他另外的實施例中，整合素為整合素α5β1，且多肽具有SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：58之胺基酸序列。在某些特定實施例中，多肽具有SEQ ID NO：32之胺基酸序列。
在又另一個態樣中，本發明提供抑制哺乳動物中整合素介導之細胞黏附、生長、遷移或分化的方法，其包含向有需要之哺乳動物投與包含本文所描述之本發明多肽的醫藥組合物的步驟，其中該整合素為αvβ3或α5β1。在另外的態樣中，本發明提供抑制或治療哺乳動物中腫瘤生長、腫瘤發展或腫瘤轉移的方法，其包含向哺乳動物投與包含本文所描述之本發明多肽的醫藥組合物的步驟，其中該腫瘤表現αvβ3或α5β1。在某些實施例中，醫藥組合物包含治療有效量的本文所描述之本發明多肽。根據此等態樣，在某些實施例中，整合素為整合素αvβ3，且多肽具有SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：56之胺基酸序列。在某些其他實施例中，整合素為整合素α5β1，且多肽具有SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID
NO：42、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：72之胺基酸序列。在某些特定實施例中，哺乳動物為人類。
在又另一個態樣中，本發明提供抑制哺乳動物中血管生成相關疾病的方法，其包含向有需要之哺乳動物投與包含本文所描述之本發明多肽的醫藥組合物，其中該血管生成相關疾病為癌症、黃斑變性、水腫或關節炎。根據此態樣，在某些特定實施例中，血管生成相關疾病包含由整合素αvβ3及/或α5β1介導之疾病；在某些其他實施例中，醫藥組合物包含其中含有SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：72之胺基酸序列的多肽。
在又另一個態樣中，本發明提供包含編碼本文所描述之本發明多肽的核苷酸序列的經分離之多核苷酸。在某些實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：61之核苷酸序列。在某些特定實施例中，多核苷酸包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：61之核苷酸序
列。
在另外的態樣中，本發明提供包含本文所描述之本發明多核苷酸的表現載體，或包含該表現載體之宿主細胞。在另一個態樣中，本發明提供製備多肽之方法，其包含以下步驟：(a)在對自表現載體編碼之多肽的表現有效的條件下培養本文提供之宿主細胞；及(b)自培養物回收多肽。在某些特定實施例中，在不含自由Arg及/或Glu之緩衝劑中回收經分離之多肽。
由以下特定較佳具體實施例之更詳細說明及申請專利範圍，本發明之特定實施例將變得明顯。
圖1說明T1491C與S1499C取代之間RGD環區中形成有經改造之域內二硫鍵的例示性經修飾之人類FNIII 10。
圖2顯示野生型人類FNIII 9-10(SEQ ID NO：4)與來自於以下不同哺乳動物種類之直系同源物的胺基酸序列比對：黑猩猩(基因庫寄存編號：XP_003309506)(SEQ ID NO：66)；牛(DAA32456)(SEQ ID NO：67)；野豬(XP_003133691)(SEQ ID NO：68)；小鼠(BAE28040)(SEQ ID NO：69)及大鼠(EDL75262)(SEQ ID NO：70)。圖例「*」相同；「：」保守性取代；「.」半保守性取代。
圖3A-C顯示如NMR(圖3A)、示差掃描熱量測定及硫酸銨沈澱(圖3B、3C)所示的野生型突變FN片段之熱穩定性及溶解性。在圖3B中：FNIII 9-10 L1408P-中間峰，正方形：FNIII 9-10 L1408P(RARGDNPD)-左峰，三角形；及FNIII 9-10 L1408P(CRARGDNPDC)-右峰，圓形。在圖3C中：FNIII 10-中間峰，圓形；FNIII 10(PRGDMPD)蛋白質(SEQ ID NO：48)-左峰，正方形；及FNIII 10(CPRGDMPDC)蛋白質(SEQ ID NO：6)-右峰，三角形。
圖4顯示在模組9中A1340D取代與模組10中V1422K取代之間形成
有經改造之域間氫鍵的例示性經修飾之FNIII 9-10的圖示。
圖5A展示基於電腦之模型，其顯示FNIII 9與整合素α5次單元之間的相互作用表面(右組)。顯示相互作用之可能點。圖5B顯示FNIII 9-10 L1408P-CRA(SEQ ID NO：32)-整合素結合之複合物的電腦對接模型及基於所計算之對接能量的結合整合素之選擇性。
圖6A-C顯示藉由Ni2+螯合層析來純化不同FNIII 9-10變體的結果。在存在或不存在還原劑2-巰基乙醇的情況下，藉由量測A280(吸光度)(左)及FNIII 9-10變體之SDS凝膠電泳(右)的考馬斯藍染色影像來分析溶離概況，該變體呈單體或由分子間S-S鍵形成之二聚體形式。
圖7A-D顯示各種FNIII片段對細胞遷移、細胞存活及細胞生長之作用結果。圖7A-左組展示概述FNIII 9-10 L1408P(CRARGDNPDC)(SEQ ID NO：32)對A549細胞遷移之抑制作用的條形圖，而右組展示概述FNIII 10(CPRGDMPDC)蛋白質(SEQ ID NO：6)對A375細胞之抑制作用的條形圖。圖7B展示顯示各種FNIII變體誘導的A375黑色素瘤細胞中之G1停滯的條形圖。圖7C及7D分別展示顯示各種FNIII片段誘導的A375細胞及A549細胞中之凋亡。
圖8A-B展示9,10Fn3變體之熱穩定性(A)及溶解性(B)。
圖9A-B展示FN-III10變體之熱穩定性(A)及溶解性(B)。
圖10A-B展示9,10Fn3變體(整合素α5β1特異性拮抗劑)抑制VEGF誘導之管形成(A)，而9,10Fn3變體不抑制bFGF誘導之管形成(B)。
圖11展示FN-III9-10(CRARGDNPDC)變體(SEQ ID NO：32)(整合素α5β1特異性拮抗劑)抑制VEGF誘導之血管生成。
圖12展示FN-III10(CPRGDMPDC)變體(SEQ ID NO：6)(整合素αvβ3特異性拮抗劑)抑制bFGF誘導之血管生成。
圖13展示FN-III9-10(CRARGDNPDC)變體(SEQ ID NO：32)以劑量
依賴性方式抑制攜帶A375之NOD-SCID小鼠中的腫瘤生長。
圖14A-C展示FN-III10(CPRGDMPDC)變體(SEQ ID NO：6)以劑量依賴性方式抑制攜帶A549之NOD-SCID小鼠中的腫瘤生長。
本文中引用的所有公開文獻、專利及專利申請案在此併入作為參考。
本案中，除非另有所述，所利用的技術可見於任何數篇已知文獻，如：Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Sambrook,et al.,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press)與PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Innis,et al.1990.Academic Press,San Diego,CA)。除非提供特別定義，本文中所述關於分子生物學、遺傳工程、分析化學、合成有機化學及藥物與醫藥化學的名稱、實驗程序與技術為技藝中已知且通常使用者。標準技術可用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及遞送與病患治療。
除非另有所需，單數用語包括複數且複數用語包括單數。例如，一個「多肽」亦指一或多個多肽。
如下所述，本發明提供一種經分離之多肽，其包含經修飾之人類纖維黏連蛋白片段，該蛋白片段包含人類纖維黏連蛋白類型III域模組10(FNIII10)，其中該FNIII 10包含Arg-Gly-Asp(RGD)基元，其中該經修飾之人類纖維黏連蛋白片段包含至少一個胺基酸取代，及其中該經修飾之人類纖維黏連蛋白片段包含與SEQ ID NO：2至少85%，至少90%，至少95%或至少98%同源性的胺基酸序列。在某些具體實施例中，該經修飾之人類纖維黏連蛋白進一步包含FNIII 9，視情況在胺基酸位置1408處進一步包含Leu經Pro取代，及其中該經修飾之人類纖維黏連蛋白片段包含與SEQ ID NO：4至少85%、至少90%、至少95%或至少98%同源性的胺基酸序列。本案中所使用的胺基酸編號跟隨全長
成熟人類纖維黏連蛋白(SEQ ID NO：74)的胺基酸編號。全長人類纖維黏連蛋白cDNA及蛋白質序列係分別基於GenBank Accession Numbers NM_212476(SEQ ID NO：73)and NP_997641(SEQ ID NO：74)。
本發明亦包含經分離之多肽，其包含經修飾之纖維黏連蛋白片段包含，除本發明經修飾之FNIII 10或經修飾之FNIII 9-10，額外的纖維黏連蛋白模組及域，包括但不限於纖維黏連蛋白類型III域之模組6、模組7及/或模組8。具一或多個本文中描述的本發明突變之全長FN多肽亦包含於本發明範圍內。
人類纖維黏連蛋白經由RGD基序結合整合素α5β1及整合素αvβ3，其位於FNIII 10。參見圖1。然而，FNIII 10單獨對整合素αvβ3僅顯示低親和性。本發明未預期地發現將形成於FNIII 10中兩個Cys取代間之鏈內雙硫鍵導入RGD環可增進FNIII 10的整合素結合及/或拮抗活性。再者，亦未預期地發現包含式Cys1491XRGDX3Cys1499的Cys取代增進本文中FNIII 10或FNIII 9-10的整合素αvβ3拮抗活性。在另一方面，相較於野生型序列之FNIII 9-10，包含式Cys1490X2RGDX3Cys1499的經修飾的FNIII 9-10呈現相等或更優異的整合素α5β1拮抗活性。在特定其他實施例，包括保守性胺基酸取代之進一步突變可被導入本文中所述的經修飾纖維黏連蛋白片段，而不影響經修飾纖維黏連蛋白的期望活性。
咸信在高濃度，fniii 9-10在一些程度模擬全長FN生物活性。已知FNIII 9-10或FNIII 10在溶液中為結構上安定的。先前已報導在胺基酸位置1408的Leu經Pro取代(L1408P)增進FNIII 9的安定性。參見van der Walle et al.,supra。先前也報導在FNIII 10之胺基酸位置1422的Asp經Asn取代(D1422N)增進FNIII 10的安定性(Koide A.,et al.Biochemistry 2001,40：10326-10333)。然而，本發明未預期地發現包含，例如，式Cys1491XRGDX3Cys1499的形成於RGD環內的遺傳工程雙
硫鍵增加FN片段FNIII 9-10及FNIII 10的安定性及溶解度，無關於L1408P及/或D1422N取代的存在。本發明亦發現包含式Cys1490X2RGDX3Cys1499的形成於RGD環內的遺傳工程雙硫鍵增加FN片段FNIII 9-10的安定性及溶解度。
不同於特定其他天然存在的整合素β1結合蛋白，如Yersinia pseudotuberculosi之侵襲素，α5β1整合素與FNIII 9-10表面交互作用較不具彈性，由於兩分子間最少的交互作用。參見Hamburger et al.,Science,1999,286：291。已建議FN模組9及FN模組10間的結構上彈性在維持FN生物功能上是重要的。參見Altroff et al.,supra；Van Nhieu et al.1996,J.Biol.Chem. 271：7665-72；及Biochemistry 37：10945(1998)。然而，本發明驚訝地發現FNIII 9與FNIII 10間的經限制域內移動不會影響FNIII 9-10的整合素α5β1拮抗活性。
根據本發明之觀點，在某些具體實施例，本發明提供經分離多肽，該蛋白片段包含經修飾人類纖維黏連蛋白片段，其包含人類纖維黏連蛋白類型III域模組9及人類纖維黏連蛋白類型III域模組10(FNIII 9-10)，其中FNIII 9視情況可在胺基酸位置1408處包含Leu經Pro取代，其中FNIII 9及FNIII 10各自包含至少一個胺基酸取代，其中FNIII 9及FNIII 10中之胺基酸取代形成非共價鍵，且其中FNIII 9及FNIII 10包含與SEQ ID NO：4之胺基酸序列至少85%，至少90%，至少95%或至少98%同源且並非SEQ ID NO NO：64的胺基酸序列。在某些特定實施例中，多肽抑制或能夠抑制整合素α5β1活性。
藉由使用電腦-輔助的三度空間對接模型(docking model)，本發明鑑定出FNIII 9的胺基酸殘基，其涉及與整合素α5次單元的交互作用(圖5，右圖)。對接模型也顯示FNIII 9不會與αIIb或αV次單元交互作用。電腦產生的FNIII 9-10 L1408P CRARGDNPDC(SEQ ID NO：32)說明此FNIII變體顯示對整合素α5β1結合的選擇性，如有利的對接能所
證明(圖5B，下圖)。
除了本文中所述的各種具體實施例，包含經修飾FN片段(其包含不影響期望拮抗劑活性的額外胺基酸取代及其中經修飾FN片段為與對應野生型FN序列至少85%，至少90%，至少95%或至少98%同源)亦包含於本發明內。FN的胺基酸序列在不同哺乳動物物種間具高度保守性。例如，圖2顯示得自人類的FNIII 9-10與得自其他哺乳動物物種的FNIII 9-10之胺基酸序列比對(amino acid alignment)，其序列可得自NCBI(National Center for Biotechnology Information)資料庫。全長的FN序列亦為公眾可獲得者。因此，決定具其他突變的本發明變體是否具額外***、刪除及取代，其包括，但不限於，與SEQ ID NO：2(或SEQ ID NO：4)具至少85%、至少90%、至少95%或至少98%同源，且基於不同哺乳動物物種間的序列保守性維持FN片段的期望活性，為一般技藝人士的能力範圍內。
如本文所使用，用語「經分離蛋白質」或「經分離多肽」是指由核酸，包括，特別是基因組DNA、cDNA、重組DNA、重組RNA，或合成來源的核酸或其部分組合所編碼的蛋白質，其(1)不含至少某些蛋白質，其通常會被發現(2)基本上不含來自相同來源的其他蛋白質，例如，來自相同細胞或物種，(3)由來自不同物種的細胞所表現，(4)已分離自至少約50%的多核苷酸、脂質、碳水化合物，或其它材料，其通常發現於分離自來源細胞，(5)不連接(藉共價或非共價相互作用)至多肽的全部或部份，該多肽係該「經分離多肽」天然連接者，(6)可操作地連接(通過共價或非共價相互作用)至一多肽，該多肽係與它在自然界中不連接者，或(7)不存在於自然界者。較佳地，所述經分離蛋白質實質上不含其他發現於其天然環境且干擾其治療、診斷、預防或研究使用的其他污染性蛋白質或多肽或其它污染物。
如本文所使用，用語「多核苷酸」、「核苷酸」、「寡核苷酸」及「核酸」可互換使用，是指包含DNA、RNA、其衍生物或其組合之核酸。
如本文所使用，用語「多肽」及「蛋白質」可互換使用，是指天然存在及非天然存在的細胞、藉遺傳工程或重組細胞、或藉化學合成產生之蛋白質，且包含具原態蛋白質或原態胺基酸序列或序列之一或多個胺基酸之刪除、添加及/或取代的序列。根據本發明，多肽或蛋白質特別包含其經修飾人類纖維黏連蛋白或其片段或其變體。在某些具體實施例，多肽或蛋白質包含抑制整合素活性之人類纖維黏連蛋白片段或其變體。在某些具體實施例，整合素為整合素α5β1或αvβ3。在特定具體實施例，整合素不為αIIbβ3。
如本文所使用，用語「整合素拮抗劑」或「用於整合素之拮抗劑」是指可抑制、阻斷、中和、減少、消除或干擾整合素活性。在特定具體實施例，拮抗劑藉結合至整合素及結合至其他分子(例如其他ECM蛋白質)隱蔽整合素而抑制整合素活性。在特定其他具體實施例，拮抗劑藉結合至整合素及防止整合素觸發細胞中的下游訊號而抑制整合素活性。
如本文所使用，內文中用語「抑制」整合素活性是指整合素拮抗劑減少整合素活性的性質，其可藉各種功能性測定(包括，但不限於，結合測定、轉移測定、凋亡測定及細胞黏著測定)分析。在本發明之某些具體實施例，多肽包含抑制整合素活性之經修飾纖維黏連蛋白片段，在某些具體實施例，整合素為整合素α5β1。在某些具體實施例，整合素為整合素αvβ3。在某些進一步具體實施例，相較於缺乏多肽拮抗劑控制組，多肽抑制約0%至約100%的整合素活性。
如本文所使用，用語「選擇性抑制」、「差異性抑制」是指一種拮抗劑的性質，其顯示對特定標的分子具差異化選擇性。例如，多肽
包含經修飾FN片段，其抑制整合素αvβ3的活性，但不抑制整合素α5β1活性。在某些具體實施例，多肽包含經修飾纖維黏連蛋白片段包含FNIII 10，最佳另包含FNIII 9，選擇性抑制整合素αvβ3活性；在在某些其它具體實施例，多肽包含經修飾纖維黏連蛋白片段，其包含FNIII 9-10，選擇性抑制整合素α5β1活性。在某些替代實施方案中，多肽包含經修飾纖維黏連蛋白片段含有FNIII 9-10特異性抑制整合素αvβ3與α5β1兩者之活性。
如本文所使用，用語「天然存在的」是指可發現於自然界的對象，例如，存在於生物體(包括病毒)、可分離自天然來源及未被人刻意修飾的多肽或多核苷酸序列。用語「天然存在的」或「天然的」，當與生物材料，如核酸分子、多肽、宿主細胞及類似物，結合使用時，是指發現於自然界且未由人操縱的材料。同樣地，如本文使用，「重組」、「非天然存在的」或「非天然的」是指未發現於自然界或已被人為結構上修飾或合成的材料。
如本文所使用，在核酸序列或多肽序列使用的用語「野生型」是指未被人刻意修飾的天然或天然存在的序列。野生型人類纖維黏連蛋白片段胺基酸序列如SEQ ID NO：74所示。應了解天然存在的等位基因變體可存在於彼等從野生型序列的胺基酸序列變異。野生型人類FN的胺基酸序列示於SEQ ID NO：74作為整個申請案中所用的胺基酸殘基編號的參考。
如本文所使用，用語「蛋白質片段」或「多肽片段」是指多肽或蛋白質，其具有少於相應野生型蛋白質的全長胺基酸序列之胺基酸序列。蛋白質片段可包含從全長蛋白質的N'末端及/或從C'末端的截短物，或從全長蛋白質的內部部分的截短物。在某些具體實施例，多肽的片段保留了全長多肽的期望活性。在某些其它實施例中，相較於全長蛋白質，多肽的片段具有期望的額外或改變的活性。在某些具體實
施例，蛋白質片段是人類纖維黏連蛋白片段，其包含經修飾的人類纖維黏連蛋白片段域III模組10(FNIII 10)或模組9與10(FNIII 9-10)，其包含一或多個本文中所述的修飾。在某些其它實施例中，包含經修飾的人類纖維黏連蛋白，另包括額外的***、刪除或取代並保持期望的活性的多肽也包括在本發明中。
如本文所使用，用語「變體」、「突變」或「經修飾」是指一序列，多核苷酸或多肽序列，其包含野生型序列不同的至少一個取代或變異。在某些具體實施例，變體包含經修飾的人類纖維黏連蛋白片段，其包含人類纖維黏連蛋白類型III域模組10(FNIII 10)，其包含至少一個胺基酸取代。另包含轉錄後修飾之經修飾FN變體亦被考慮且包括於本發明的範圍之內。全長人類FN包含本文中所描述之對應的胺基酸取代，亦被考慮且包括於本發明的範圍之內。
如本文所使用，用語「同源性」或「同源的」是指整體的序列相似性及/或對應的纖維黏連蛋白片段之間的相同性。高的序列同源性表明蛋白質活性的保守性。許多公眾可獲得之演算法或軟體可用於確定序列同源性。確定額外的保守性或非保守性胺基酸取代與序列同源性呈度的適用性係在技藝人士的能力範圍內。
如本文所使用，用語「N-末端至」或「C-末端至」是技藝人士可了解為蛋白質或其片段中兩個或多個胺基酸殘基的相對位置。例如，在肽序列的N-末端至參考胺基酸殘基之胺基酸殘基應被理解為殘基在該肽序列至N-末端的位置，其較參考胺基酸更接近肽序列的N-末端。類似地，胺基酸殘基的C-末端至參考胺基酸殘基應被理解為殘基在該肽序列至C-末端的位置，其較參考胺基酸更接近肽序列的C-末端。
人類FNIII 10和FNIII 9-10變體列於下表1：
如本文所使用，20種一般胺基酸及其縮寫遵循常規用法。參見IMMUNOLOGY--A SYNTHESIS,2nd Edition,(E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.),1991,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.，其被併入本文作為參考。根據某些具體實施例，單個或多個胺基酸取代(在某些具體實施例，保守性胺基酸取代)可在天然存在的序列中做出(在某些具體實施例，在域外多肽的部分形成分子間接觸或包含功能性域)。在某些具體實施例，保守性胺基酸取代不會實質上改變母序列的結構特徵(例如，置換的胺基酸不會破壞特徵化母或天然蛋白質的二級結構，例如螺旋)。技藝中已知的多肽二級及三級結構的實例描述於PROTEINS,STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES(Creighton,Ed.),1984,W.H.New York：Freeman and Company；INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE(Branden and Tooze,eds.),1991,New York：Garland Publishing；and Thornton et at.,1991,Nature 354：105，其每一併入本文作為參考。
基於共同的側鏈性質，天然存在的殘基可分為下列類別：1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；3)酸性：Asp、Glu；4)鹼性：His、Lys、Arg；
5)影響鏈方向的殘基：Gly、Pro；6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
保守性胺基酸取代可包括非天然存在的胺基酸殘基，其典型上通過化學肽合成而不是通過在生物系統中合成。這些包括肽模擬物及胺基酸域的其他反相或倒置的形式。
相反地，非保守性取代涉及此等類中的一個成員從另一個類的成員的交換。此等經取代殘基可被引入到分子的同源或非同源或非保守性區域。
在作出這樣的變化，根據某些具體實施例，可考慮胺基酸的親水性指數。每個胺基酸可基於疏水性與電荷特性，指定親水指數。他們是：異白氨酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；***酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩胺醯胺(-3.5)；天門冬胺酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸-3.9)及精胺酸(-4.5)。(Kyte et al.,1982,J.Mol.Biol. 157：105-131)。
親水胺基酸指數在賦予蛋白質交互生物功能中的重要性是本領域理解的(參見，例如，Kyte et al.,1982,ibid.)。眾所周知，某些胺基酸可被具相似親水指數或分數的其他胺基酸取代，但仍保留了類似的生物活性。在基於親水指數作改變時，在某些具體實施例中，包括胺基酸的親水指數在±2以內的取代。在某些具體實施例中，包括彼等在±1內的取代，並且在某些具體實施例中，包括彼等在±0.5內的取代。
還應當理解的是類似胺基酸的取代可基於親水性而有效進行，特別是，藉此創造具生物功能的蛋白質或肽，產生適用於免疫上的具體實施例。在某些具體實施例中，蛋白質的最大局部平均親水性，如被其相鄰胺基酸的親水性所影響，與其免疫原性和抗原結合或免疫原
性相關，亦即，與該蛋白質的生物性質相關。
如美國第4,554,101號專利所述，此等胺基酸殘基已被指定下列親水性值：精氨酸(+3.0)；離氨酸(+3.0)；天冬胺酸(+3.0±1)；麩胺酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；麩胺醯胺(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(-0.4)；脯胺酸(-0.5±1)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸(-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；***酸(-2.5)及色胺酸(-3.4)。基於相似親水性值作改變時，在某些具體實施例中，包括胺基酸的親水性值在±2以內的取代，在某些具體實施例中，包括彼等在±1以內的取代，並且在某些具體實施例中，包括彼等在±0.5以內的取代。例示性的胺基酸取代列於表2。
技藝人士使用眾所周知的技術可確定本文中所述的該多肽的合適變體。在某些具體實施例中，本領域的技藝人士可識別出不認為是對活性重要的區域而不破壞活性來改變分子的適合區域。在某些具體實施例中，可識別相似多肽中保守性的分子殘基及部分(藉例如序列比對分析)。在某些具體實施例中，即使是對生物活性或結構重要的區域可進行保守性胺基酸取代而不會破壞生物活性或對多肽結構產生不利影響。
此外，本領域的技藝人士可在類似的或相關的多肽中識別出對活性或維持結構具重要性的胺基酸殘基。鑑於這樣的比較，可預測一蛋白質中胺基酸殘基的重要性，其對應於類似蛋白質中對活性或結構具重要性的胺基酸殘基。一技藝人士可選擇化學性質相似的胺基酸取代為此種預測的重要胺基酸殘基。來自不同哺乳動物物種的FNIII 9-10之胺基酸序列比對示於圖2。
本領域的技藝人士還可分析三維結構和胺基酸序列，其相對於相似多肽中的結構。基於此等資訊，本領域的技藝人士可預測相對於它的三維結構的多肽的胺基酸殘基的比對。在某些具體實施例中，本領域的技藝人士可選擇不對預測是蛋白質的表面上胺基酸殘基進行基團改變，因為這些殘基可能參與與其他分子的重要相互作用。此外，本領域技藝人士製造測試變體，其在每一期望的胺基酸殘基含有單一單一胺基酸取代。接著可使用本領域技藝人士已知的活性測定法篩選
變體。此等變體可用於收集有關合適變種的資訊。舉例來說，如發現改變特定胺基酸殘基導致破壞，不希望地降低，或不合適的活性，可避免具此種改變的變體。換言之，基於此種常規實驗收集的資訊，本領域技藝人士可容易地確定胺基酸，其中應避免單獨或與其他突變組合的進一步取代。
20種一般胺基酸，非天然存在的胺基酸如α-,α-二取代胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸及其他非一般性胺基酸的立體異構物(如D-胺基酸)亦可為本發明多肽的適合組份。非一般胺基酸的實例包括但不限於：4-羥基脯氨酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精氨酸及其他類似胺基酸與亞胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。在本文中所使用的多肽符號中，左手方向是胺基末端方向及右手方向是羧基末端方向，根據標準用法和慣例。
在某些其它具體實施例中，包含人類纖維黏連蛋白片段的多肽另包含異源實體以形成融合蛋白。異源實體可便於檢測及/或生產該重組合成的人類纖維黏連蛋白片段。合適的異源實體包括但不限於多-組氨酸標籤、GFP(綠螢光蛋白)標籤、GST(穀胱甘肽S-轉移酶)標籤及麥芽糖結合蛋白標籤、FLAG標籤或HA標籤。篩選合適的標籤及表現所希望蛋白與異源標籤(或抗原表位標籤)的表現載體是在本領域技藝人士的能力範圍內。連接到所希望的抗原表位標籤的標的蛋白可通過PCR製造，其中編碼抗原表位標籤的序列併入引子序列。設計用於結合至異源標記的有興趣蛋白質的重組表現的表現載體是商業上可購得者，例如，pGEX-2KS(GE Healthcare Life Sciences,Piscataway,NJ)與pET21a(Novagen)。在某些具體實施例中，重組合成的多肽純化後位於內置的蛋白酶切割位點的異源實體或抗原表位標籤是藉由例如
蛋白酶切割而去除。
用語「表現載體」是指一種載體，其適於轉形宿主細胞或標的細胞，且包含直接及/或控制***的異源核酸序列的表現的核酸序列。表現包括但不限於，如轉錄過程，轉譯過程及，如內含子存在RNA剪接過程。在某些具體實施例中，表現載體包含多核苷酸序列，其編碼人類纖維黏連蛋白片段或其變體。在某些具體實施例中，表現載體包含多核苷酸序列，其編碼六-組胺酸-結合的人類纖維黏連蛋白片段或其變體。
典型地，用於任何宿主細胞或標的細胞的表現載體含有用於載體維持及選殖及表現外源核苷酸序列的序列。此等序列，在某些具體實施例統稱為「側翼序列」(flanking sequence)，通常包含一或多個如下核苷酸序列：啟動子，一或多個增強子序列，複製起點，轉錄終止序列，含有供體與受體剪接位點的完整內含子序列，編碼多肽分泌的前導序列的序列，核糖體結合位點，多聚腺苷酸化信號序列，包含一或多個用於***編碼擬表現多肽的核酸的限制性內切酶位點的多聚連接子區域(polylinker region)，及選擇標記元件。
用語「轉導」是用來指基因從一細菌轉移到另一細菌，通常藉由噬菌體。「轉導」亦指真核細胞序列藉由病毒(如逆轉錄病毒)的獲得與轉移。
用語「轉染」用於指外來的或外源DNA被細胞攝入，且當外源DNA已被引入細胞膜內時，細胞已經被「轉染」。許多轉染技術是本領域熟知的並且在本文中接露。參見，例如，Graham et al.,1973,Virology 52：456；Sambrook et al.,2001,MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL,3d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Davis et al.,1986,BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(Elsevier)；and Chu et al.,1981,Gene 13：
197。此等技術可用於引入一或多個外源DNA部分至合適的宿主細胞。
如本文中所使用，用語「轉型」是指在細胞的遺傳特性的改變，以及當它已被修飾而含有新DNA時時，細胞已被轉型。例如，一個細胞被轉化，其中它是從它的天然狀態被遺傳性改變。轉染或轉導後，轉型DNA可藉物理地嵌合到細胞的染色體而與細胞DNA重組，可瞬時地維持未被複製的游離元件(episomal element)，或如質體可獨立複製。當DNA與細胞***一起複製時，細胞被穩定轉型。
用語「宿主細胞」用來指在已被引入核酸序列，或能夠被引入核酸序列，接著表現有興趣基因的細胞。該用語包括母細胞的子代，無論該子代在形態學上或基因組成上是否與原母細胞相同，只要該基因是存在的。在較佳具體實施例中，宿主細胞是真核細胞，更佳為哺乳動物細胞，最佳為囓齒類或人類細胞。
在另一方面，本發明提供抑制整合素介導之細胞黏附、生長、遷移或分化的方法，其包含使細胞與有效量的本發明之多肽接觸的步驟，其中該整合素為αvβ3及/或α5β1整合素。在又一方面，本發明提供抑制或治療哺乳動物中腫瘤生長、腫瘤發展或腫瘤轉移的方法，其包含向哺乳動物投與包含本文所描述之本發明多肽的醫藥組合物的步驟，其中該腫瘤表現αvβ3或α5β1。適合腫瘤的非限制性實例包括肺癌，乳腺腫瘤，結腸腫瘤，骨肉瘤，胰腺腫瘤，卵巢腫瘤，子宮頸腫瘤，膠質母細胞瘤，***腫瘤，肝腫瘤及黑色素瘤。在某些具體實施例中，腫瘤表現整合素α5β1，其適合腫瘤的非窮盡性實例包括肺癌，乳癌，結腸癌，黑色素瘤，骨肉瘤和***腫瘤。在某些其它具體實施例中，腫瘤表現整合素αvβ3，及適合腫瘤的非窮盡性的實例包括乳癌，黑色素瘤，胰腺癌，卵巢癌，子宮頸膠質細胞瘤及***腫瘤。
在另一方面，本發明提供抑制哺乳動物中血管生成相關疾病的方法，其包含向有需要之哺乳動物投與包含本文所描述之本發明多肽的醫藥組合物，其中該血管生成相關疾病為癌症，黃斑部病變，水腫，關節炎，多發性硬化症，血管畸形，肥胖，銀屑病，疣，過敏性皮膚炎，AIDS之卡波西肉瘤，糖尿病性視網膜病變，原發性肺動脈高血壓，哮喘，囊性纖維化，發炎性腸道疾病，牙周疾病，肝硬化，子宮內膜異位，卵巢囊腫，子宮出血，骨髓炎或糖尿病腎病。按照此方面，在某些特定的具體實施例中，血管生成相關疾病包括由整合素αvβ3或α5β1介導的疾病。
如本文所使用，分離多肽的用語「有效量」或「治療有效量」是指其量足以達成所述期望結果，例如，抑制整合素介導之細胞黏附、生長、遷移或分化，或者抑制或治療腫瘤生長，腫瘤發展或腫瘤轉移。多肽或化合物構成的「有效量」或「治療有效量」的量取決於多肽或化合物，病症及其嚴重程度，以及待治療的受試者的年齡而變化，但可被本領域技藝人士常規地確定。在某些具體實施例中，受試者是哺乳動物。在某些具體實施例中，所述哺乳動物是人類。
如本文所使用，「治療」涵蓋本文所述的疾病或病症的治療，在哺乳動物，例如人，且包括：(i)抑制疾病或病症，即阻止其發展(ii)減輕疾病或病症，即，引起病症的消退；(iii)減緩疾病的進展，及/或(iv)抑制，減輕或減緩疾病或病症的一或多種症狀的進展。
本發明醫藥組合物的給藥途徑包括口服，注射經由靜脈內、腹膜內、腦內(intraparenchymal)、腦室內、皮下、肌內、眼內、動脈內、門靜脈內、或病灶內途徑；持續釋放系統或植入裝置。該醫藥組合物可經推注或連續輸注給藥，或藉植入裝置給藥。醫藥組合物亦可經以吸收或包埋期望分子的膜，海綿或其它合適的材料移植在其上而局部給藥。使用植入裝置時，該裝置可被植入到任何合適的組織或器
官，並經由擴散，定時釋放丸藥，或連續給藥而遞送期望分子。
本發明多肽可根據已知製備醫藥組合物的方法來調配，其中擬遞送的多肽與藥學上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑結合。合適的載體，稀釋劑和賦形劑及其製備描述於，例如，Genaro,A.O.「Remington：The Science and Practice of Pharmacy.」Lippincott Williams & Wilkins(2005)。
對於體內使用的水性醫藥組合物，無菌無熱原水是較佳的。此等調配物包含有效量的多肽以及合適量的藥學上可接受的載劑，稀釋劑或賦形劑，以製備適合於給予哺乳動物，尤其是人類，的醫藥上可接受的組合物。其為普通技藝人士或醫師的知識範圍內，且擬投藥至哺乳動物之有效量，較佳為人類，進一步教示於在本申請案中，以達到理想的治療效果。
在某些具體實施例中，組合物包含本發明之經修飾FN片段，可進一步包含其它抗癌，抗血管生成及化療藥物，以提供治療效果。
本發明之經修飾FN片段可經化學修飾，以防止或減少蛋白水解降解。用於化學修飾或蛋白質或其片段最適化的方法是本領域熟知的，包括但不限於天然胺基酸殘基被非天然胺基酸殘基取代，胺基酸鍵置換，藉由N-醯化、N-焦麩胺酸，及/或C-醯胺化，及N-末端酯化或聚乙二醇化修飾阻斷N或C-末端。例如參見Vlieghe et al.,2010,Drug Discovery Today,15：40-56。
在另一方面，提供包含本文中所述的本發明多肽，組合物或醫藥組合物之套組。本發明醫藥組合物可為乳劑，凝膠，溶液，懸浮液等。本發明組合物也可經冷凍乾燥以產生易於運輸和貯存的乾燥形式之組合物。本發明組合物可被存儲於密封小瓶，容器，安瓿或類似物等。在該組合物為乾燥形式的情況下，組合物在給藥之前溶解或再懸浮(例如，在無菌蒸餾水或緩衝液)。也可以使用惰性載劑，例如鹽水
或磷酸衝生理食鹽水或任何此種載劑，其中組合物具有合適的溶解度。
下列實施例係說明本發明之特定具體實施例，以及其各種用途。彼等僅為說明性的目的，並且不應被視為限制本發明。
野生型人類FN III 9-10在載體pET21a(Novagen)中選殖及表現。編碼FNIII變體之DNA由優先在大腸桿菌(E.coli)中使用之密碼子組成。藉由聚合酶鏈反應(PCR)用正向引子51-CATATGCATATGCACCACCACCACCACCACGGTCTTGATTCCCCAACT-3'(SEQ ID NO：75)擴增野生型FNIII 9-10編碼序列，該正向引子具有用於親和性純化的Nde I識別位點及六個組胺酸殘基。反向引子為具有Hind III識別位點及TCA(或TTA)終止密碼子的5'-AAGCTTAAGCTTTCATGTTCGGTAATTAATGGAAATTGG-3'(SEQ ID NO：76)。純化PCR產物，且隨後連接於大腸桿菌再結合載體(pET21a(Novagen))之Nde I及Hind III位點。使用重組型質體轉型大腸桿菌DH5α菌株，且在具有LB(1%胰化蛋白(tryptone)、0.5%酵母萃取物、1.0% NaCl、1.0%瓊脂，pH 7.4)及100μg/mL抗生素安比西林(Ampicillin)的瓊脂培養盤上選擇菌落。
藉由PCR使用重疊寡核苷酸策略用含有Nde I及Hind III限制位點之引子來合成及擴增FNIII 9-10變體。各種用於合成或確認變體之引子的核苷酸序列列於表3中。
聚合酶鏈反應根據描述於US2008/0188413中之操作步驟來進行，其以全文引用之方式併入本文中。簡言之，反應按95℃下1分鐘，55℃下1分鐘及72℃下1分鐘進行25次循環。亦使用引子之混合物以產生多個突變位點。在2%瓊脂糖凝膠電泳上分離PCR產物，且藉
由溴化乙錠(ethidium bromide)染色進行目測。純化所需PCR產物，且隨後與酵母轉移載體pPICZαA之Eco RI及Sac II位點連接。使用重組型質體以轉型大腸桿菌(Escherichia coli)XL1-藍菌株，且在含有抗生素勻黴素之瓊脂培養盤上選擇菌落。擴增來自於勻黴素陽性菌落之質體DNA且加以分離，且藉由DNA定序來確認在質體中所含有之FNIII序列。
野生型FNIII 9-10、FNIII 10或其變體的蛋白質表現係使用畢赤酵母(Pichia)EASYCOMPTM轉型套組(Invitrogen)根據製造商之建議加以小幅修改來進行。簡言之，含有編碼FNIII 9-10、FNIII 10或其變體之DNA的總共10μg質體用Sac I消化以使質體線性化。使用畢赤酵母EASYCOMPTM試劑盒，藉由熱休克(heat shock)方法將畢赤酵母菌株
X33用經線性化之構築體轉型。經線性化之構築體在5'AOX1基因座處藉由單交叉來整合。藉由溶細胞酶(Sigma)來裂解畢赤酵母細胞，且藉由PCR來分析以驗證FNIII序列在畢赤酵母基因組中之整合。在含有YPD(1%酵母萃取物、2%蛋白腖、2%葡萄糖及2%瓊脂)及100μg/mL勻黴素的瓊脂培養盤上選擇菌落。為最高FNIII 9-10或FNIII 10蛋白質表現選擇具有多個FNIII***複本的多個菌落。
重組型FNIII 9-10、FNIII 10及變體如下產生：所選擇之菌落於30℃下在含有100μg/mL勻黴素的YPD培養基(1%酵母萃取物、2%蛋白腖及2%右旋糖)中生長。在48小時之後，藉由離心收集細胞，且在1公升的含有極少甲醇之培養基(含有1.34%酵母氮受質(含硫酸銨，不含胺基酸)及4×10-5%生物素)中生長。在2天中添加總共1%甲醇，每24小時添加一次，以誘導FNIII或其變體表現。藉由離心收集上清液，且用5公升緩衝劑A(5mM EDTA、8M尿素及10mM磷酸鈉緩衝劑，pH值7.7)透析兩次。將最終溶液裝入鎳螯合管柱中，且用200mM咪唑之梯度溶離。藉由HPLC(逆相C18 HPLC)來進一步純化重組型FNIII 9-10、FNIII 10及其變體。如由麥黃酮-SDS-PAGE所判定，經純化之重組型FNIII的純度大於95%。若干FNIII變體之表現及純度顯示於圖6中。代表性HPLC概況及具有CPRGDMPDC(SEQ ID NO：20、L1408P(CARGDNPDC)蛋白質(SEQ ID NO：22及L1408P、V1442K取代(SEQ ID NO：28)之序列的FNIII 9-10變體的純度分別顯示於圖6A-C中。
先前顯示在胺基酸位置1408處Leu經Pro取代改良FNIII 9-10之穩定性(van der Walle等人，2002,Protein Engineering 15：1021-24)。藉由一維NMR光譜分析在處於不同pH值的緩衝劑中測試模組10中之域
內雙硫鍵突變的穩定性。在含有50mM自由精胺酸及麩醯胺酸的溶液中，與野生型FNIII 9-10相比，L1408P突變之存在改良FNIII 9-10在pH 5.0下之穩定性。出於增加可達成之最大蛋白質濃度及改良樣品針對沈澱及降解之長期穩定性的目的，添加自由精胺酸及麩醯胺酸(參見Golovanov A.P.等人J.Am.Chem.Soc.126(2004)8933-8939)。然而，在不存在自由精胺酸及麩醯胺酸的情況下，L1408P突變之穩定性在更高pH值(例如pH值6.0(圖3A右下組)或更低pH值(例如pH值3.5)下降低。另一方面，域內雙硫鍵即使在pH值7.5下亦在磷酸鹽緩衝劑中穩定FNIII 9-10，而不需要L1408P突變且不需要自由精胺酸及麩醯胺酸。如圖3A右上方組中所示，具有域內雙硫鍵且不具有L1408P突變的FNIII 9-10(CPRGDMPDC，SEQ ID NO：20)於pH值7.5下，在不含精胺酸及麩醯胺酸之溶液中保持穩定。域內雙硫鍵亦增加FNIII9-10變體之穩定性及溶解性(圖3B)。
亦已顯示在存在50mM自由精胺酸及麩醯胺酸的情況下，於pH值5下，模組10中位置1422處之Asp經Asn取代(SEQ ID NO：65)改良FNIII 10之穩定性。然而，當pH值增加至5.4及6時，D1422N突變之穩定性降低。參見圖3A左下方組。如圖3C中所示，存在於FNIII 10(CPRGDMPDC)蛋白質(SEQ ID NO：6)中之域內雙硫鍵改良FNIII 10之穩定性及溶解性，而不需要D1422N突變(圖3C)。
藉由如先前所述之細胞黏附抑制分析來評估FNIII變體之整合素拮抗劑活性(Zhang等人，1998 J Biol Chem 273：7345-7350)。簡言之，用含有濃度為50-500nM之受質的100μL磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS：10mM磷酸鹽緩衝劑、0.15M NaCl，pH值7.4)塗佈96孔Immulon-2微量滴定培養盤(Costar,Corning,NY)，且在4℃下培育隔夜。用於塗佈之
受質包括：對α5β1為纖維蛋白原(FG)50μg/mL，對αvβ3為玻璃連結蛋白(VN)10μg/mL，而對αIIβ3為纖維黏連蛋白(FN)25μg/mL。藉由在室溫(25℃)下用200μL的1%熱變性牛血清白蛋白(BSA,Calbiochem)在各孔中培育1.5小時來阻斷非特異性蛋白質結合位點。隨後，棄去阻斷熱變性BSA，且用200μL PBS洗滌各孔兩次。
將表現αvβ3(CHO-αvβ3)及α5β1(CHO-α5β1)整合素之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞維持在100μL之經杜爾貝科氏改良之伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)中。CHO-αvβ3及CHO-α5β1均為Y.Takada博士(Scripps Research Institute)之禮物，藉由使用抗新黴素(neomycin)基因之穩定轉染來確立。藉由胰蛋白酶消化來分離在對數期中生長之CHO細胞，且以3×105細胞/毫升用於分析。以0.001-500μM之濃度向培養細胞中添加FNIII 9-10、FNIII 10及其變體，且於37℃下在5% CO2中培育15分鐘。隨後將經處理之細胞添加至經塗佈之培養盤中，且於37℃下在5% CO2中培育1小時。隨後棄去培育溶液，且藉由用200μL PBS洗滌兩次來移除未黏附之細胞。
藉由結晶紫染色來量化所結合之細胞。簡言之，用100μL之10%福馬林來固定孔10分鐘，且乾燥。隨後在室溫下向孔中添加五十微升之0.05%結晶紫，持續20分鐘。用200μL蒸餾水洗滌各孔四次，且乾燥。藉由添加150μL之染色溶液(50%醇及0.1%乙酸)來進行染色。在600nm處讀取所得吸光度，且將讀數與黏附細胞之數量相關聯。抑制定義為%抑制=100-[OD600(FNIII野生型或經變體處理之樣品)/OD600(未處理之樣品)]×100。IC50定義為抑制50%細胞黏附所需之濃度(nM)。因此，較低之IC50指示變體在抑制各別整合素之細胞黏附活性中的特異性或效能較高。結果概述於下表4及5中。
野生型FNIII 10無法與FN有效競爭結合整合素αvβ3，且因此在細胞黏附分析中不顯示整合素αvβ3拮抗劑活性。在胺基酸位置1492-
1451處具有序列PRGDWNEGSK的FNIII 10(SEQ ID NO：50)顯示整合素αvβ3結合活性，且與全長FN競爭結合整合素αvβ3。參見表4及Richards等人，J Mol Biol.2003,326(5)：1475-88。
意外發現，在包含式Cys-X7-Cys之序列中，在RGD環中於側接RGD基元的兩個Cys取代之間(例如在T1491C與S1499C之間)引入雙硫鍵極大地改良整合素αvβ3拮抗劑活性(參見例如表4，SEQ ID NO：6、8及10，與SEQ ID NO：2相比)。另外，經改造之雙硫鍵進一步改良已展現整合素αvβ3拮抗劑活性之FNIII 10變體的整合素αvβ3拮抗劑活性。舉例而言，與不含Cys取代之變體(SEQ ID NO：48)相比，在FNIII 10 PRGDMPD(亦即具有CPRGDMPDC之SEQ ID NO：6)之背景中，側接RGD基元的兩個半胱胺酸取代的整合素αvβ3結合親和性增加7倍，且因此降低抑制50%細胞黏附所需之濃度(SEQ ID NO：6與SEQ ID NO：48之比較結果)。
總體而言，如由細胞黏附分析所量測，在鬆散結構化之RGD環內引入雙硫鍵實質上增加FNIII變體對整合素αvβ3之結合親和性，且因此增加整合素αvβ3拮抗劑活性。
野生型FNIII9-10與整合素α5β1結合但不與整合素αvβ3結合。參見表5中野生型FNIII 9-10(SEQ ID NO：4)之結果。在式C-X7-C中具有側接RGD基元的經改造之雙硫鍵的FNIII 9-10變體有趣的是展現經改變之結合特異性。舉例而言，在胺基酸位置1490-1501處具有胺基酸序列VCPRGDMPDCSK的FNIII 9-10(SEQ ID NO：20)顯示αvβ3拮抗劑活性，而非整合素α5β1拮抗劑活性，即使FNIII 9-10已視為整合素α5β1結合劑。參見表4，比較SEQ ID NO：6及20之結果與表5中的SEQ ID NO：4之結果。
另一方面，在包含式C-X8-C之序列中，由Cys取代形成之域內雙硫鍵不改變FNIII 9-10之結合特異性，而在一些情況下改良與整合素α5β1之結合親和性(參見例如表5，SEQ ID NO：32之結果與SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：63之結果相比)。
先前顯示模組9與10之間的域間雙硫鍵(在L1408P取代之背景中)儘管穩定FNIII 9-10片段，但降低模組9與整合素α5β1結合的協同效應(Altroff等人，文獻同前)。然而，本發明者意外發現，在位置1340及1442處(A1340D及V1442K取代)在經改造之Asp與Lys之間形成有域間鍵聯的FNIII 9-10(在L1408P取代之背景中)維持與整合素α5β1相比之結合親和性(參見表5，SEQ ID NO：40之結果與SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：63之結果相比)。
另外，一些FNIII 9-10變體亦獲得與整合素αvβ3之結合親和性(參
見表4，SEQ ID NO：60之結果與SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：63之結果相比)。
總體而言，在包含式C-X8-C之序列中，在FNIII 9-10之RGD環中引入之雙硫鍵可改良整合素α5β1拮抗劑活性(表5，比較SEQ ID NO：32與SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：63及SEQ ID NO：62之結果)。
在3.8%檸檬酸鈉(1份)中收集來自於至少兩週未接受任何藥物之健康供體的靜脈血液(9份)樣品。以150×g離心血液樣品10分鐘，以獲得富含血小板之血漿(PRP)，且使之靜置5分鐘，且收集PRP。藉由以2000×g離心25分鐘而自剩餘血液中製備僅含少量血小板之血漿(PPP)。在血液學分析器上量測PPP血小板計數，且稀釋至250,000血小板/微升。在Hema Tracer 601聚集度儀中於37℃下培育不同濃度的190μL PRP及10μL FNIII 10或FNIII 9-10變體之溶液或PBS緩衝劑5分鐘。另外添加十微升200μM二磷酸腺苷(ADP)，以藉由光透射來監測血小板凝集之反應。如表4及5中所示，所測試之野生型或變體均不與整合素αIIbβ3結合或促進血小板凝集。
分析FNIII 10或FNIII 9-10變體對整合素介導之生物過程的作用。藉由流動式細胞量測術確認可穩定表現αvβ3或α5β1的人類黑色素瘤細胞A375或A549與FNIII 10 CPRGDMPDC(具有CPRGDMPDC之SEQ ID NO：6)或FNIII 9-10 L1408P CRARGDNPDCSK(SEQ ID NO：32)一起培育，且藉由傳斯維爾分析(transwell assay)來檢測對細胞遷移之
作用。如先前所述進行細胞遷移(趨觸性)分析(Bisanz等人，2005,Model.Mol.Ther. 12：4 634-643)。在室溫下在具有8-μm微孔聚碳酸酯之嵌件(離心)的多孔膜之下表面上塗佈200μL纖維黏連蛋白(50μg/mL)，持續2小時，且隨後在室溫下經受洗滌且用1%(w/v)熱變性BSA阻斷，持續2小時，接著用PBS洗滌兩次。用無血清DMEM組裝腔室，且隨後將1×105個細胞置放於上部腔室上。各實驗均伴隨有由在下表面上用PBS/1%(w/v)BSA塗佈之聚碳酸酯過濾器組成的對照組，且此對照組一致地不展示遷移。在6小時培育之後，用3.7%甲醛固定細胞，且用結晶紫染色。用棉簽移除上部腔室中剩餘之細胞，且對遷移細胞拍照及量化。除在接種時向上部腔室中添加不同劑量之FN-III變體以外，如上所述進行FN-III變體對遷移之抑制。結果概述於圖7A中，其顯示FN III變體抑制細胞遷移。
另外，檢測FNIII 10或FNIII 9-10變體對細胞週期停滯的作用。
如先前所述(Brooks等人，1994,Cell 79：1157-1164)加以一些修改來進行細胞循環分析。簡言之，在接種之後24小時後，當細胞較佳分散時，添加FN-III變體。處理後48小時之後，洗滌漂浮及附接之細胞，且在PBS中收集。以1,000rpm離心細胞10分鐘，且再懸浮於3mL之冷70% PBS中，隨後在-80℃下儲存隔夜。在於4℃下培育45分鐘之後，收集細胞且在4℃下以1,300rpm離心10分鐘。隨後，在37℃下將細胞再懸浮於1mL PI染色溶液(9.4mL PBS中的200μL之1mg/mL碘化丙錠、200μL RNase A及200μL之5%Triton X-100)中，持續15分鐘。如上文所描述使用FACScan流式細胞儀(Becton-Dickinson)量測細胞螢光。結果概述於圖7B中。總體而言，與對照組(PBS)相比，處理FNIII野生型片段引起G1細胞之百分比增加，且處理FN III變體進一步誘導細胞循環停滯(cell cycle arrest)。
此外，分析FNIII或FNIII 9-10變體誘導凋亡之能力。如先前所述
(Maubant等人，2006,Blood 108：3035-3044)加以一些修改來進行細胞凋亡實驗。簡言之，在接種之後24小時後，當細胞較佳分散時，添加FN-III變體。處理後48小時之後，收集漂浮及附接之細胞，且在37℃下使用膜聯蛋白V-AIexa Fluor 488(分子探針)及PI(Sigma)使之經受100μL膜聯蛋白V/碘化丙錠(PI)染色15分鐘。藉由流動式細胞量測術量測所得螢光。用膜聯蛋白V及PI之組合染色細胞揭示未凋亡細胞(膜聯蛋白V-/PI-)、早期凋亡細胞(膜聯蛋白V+/PI-)、晚期凋亡細胞(膜聯蛋白V+/PI+)及壞死細胞(膜聯蛋白V-/PI+)。結果概述於圖7C-7D中。總體而言，FNIII及其變體在表現整合素細胞中誘導凋亡。
已詳細地且參考本發明之特定實施例描述本發明，顯然，在不背離所附申請專利範圍中所定義的本發明之範疇的情況下，可能存在修改及變型。更特定言之，儘管本文鑑別出本發明之一些態樣為尤其有利的，但預期本發明不必限制為本發明之此等特定態樣。
生物治療劑在生產、儲存及向患者輸送期間保持穩定為至關重要的。差示掃描熱量測定(DSC)可精確、快速且容易地量測Tm(蛋白質之熱轉變中點)，已顯示該Tm為生物治療劑在溶液中之相對穩定性的良好指標(Demarest等人，2004；Sanchez-Ruiz等人，1988；Vermeer及Norde,2000)。因此，將DSC應用於：(1)篩選用於調配物之緩衝劑及賦形劑；(2)篩選除活性之外亦具有合理穩定性之治療候選物；及(3)預測蛋白質聚集傾向。出於以上原因，吾等藉由DSC來特徵在於吾等所設計之蛋白的穩定性(9,10Fn3變體及10Fn3變體之Tm)。
使用VP-DSC微量熱計(MicroCal)進行DSC分析。在所製備之緩衝劑中使用3-kDa分子質量截留膜透析樣品，且將樣品之最終濃度調節至約0.7mg/mL。所有實驗均以60℃/小時之掃描速率自20℃加熱至
110℃。在相同實驗條件下獲得緩衝劑-緩衝劑基線，且自樣品跡線中扣除。在配備有DSC分析附加組件(MicroCal)之Origin 7.0(OriginLab Corp,Northampton,MA)中進行資料分析。藉由對比扣除匹配之緩衝劑掃描，接著標準化資料之濃度來校正各蛋白質之過量熱容曲線。藉由自經標準化之資料計算熱變性曲線之頂點來測定轉變中點或熔化溫度(表現為Tm)。
差示散射熱量測定(DSC)實驗已用於藉由監測所關注之分子之溶液的過量熱容(Cp)隨溫度的變化來研究生物大分子之熱誘導轉變(Bruylants等人，2005；Spink,2008)。吾等對一系列經吾等改造之蛋白質進行DSC實驗以比較在PBS緩衝劑中之熱穩定性。因為吾等蛋白質之熱變性過程為不可逆的，所以使用熔化溫度(Tm)而非轉變焓(△H°m)來反映吾等蛋白質之穩定性。熱誘導的此等蛋白質之伸展產生由一個吸熱轉變組成之DSC概況。使用非雙態轉變模型進行DSC跡線之反捲積，得到一個具有Tm之吸熱線。藉由比較實驗及計算跡線來確認模型之擬合。僅具有一個峰之變性曲線通常指示在蛋白質分子中存在一個以上之域，其中各個域以不與彼此獨立的方式經歷變性。對***性蛋白質之DSC實驗分別在FNIII 9-10 L1408P(CRARGDNPDC)變體(SEQ ID NO：32)、FNIH 9-10 L1408P(SEQ ID NO：63)及FNIII 9-10 L1408P(RARGDNPD)變體(SEQ ID NO：62)中展現62.4℃、60.8℃及58.7℃之Tm值(參見表6及圖8A)。FNIII 10野生型(SEQ ID NO：2)、FNIII 10、FNIII 10 PRGDMPD變體(SEQ ID NO：48)及FNIII 10(CPRGDMPDC)變體(SEQ ID NO：6)變體之穩定性分別為80.7℃、74.3℃及85.0℃(參見表7及圖9A)。僅有一個主要吸熱線存在確認由於產物含有或不含雙硫鍵而缺乏異質性。在此研究中，DSC轉變之Tm值為可再現的，且因此可用於反映WT及其突變體之相對熱穩定性。
溶解性為在醫藥學預調配期間所研究之物理化學特性的關注點。對液體劑型發展而言，需要精確溶解性資料以確保成品之穩固性。對固體劑型而言，溶解性資料對確定活體內吸收是否可獲得充分量之藥物為至關重要的。若化合物之水溶性較低，則其在胃腸(GI)滯留時間內吸收可受溶解速率或溶解性限制。可用於增加蛋白質溶解性之方法適用於高解析度結構研究及醫藥學應用。若干研究已成功使用表面殘基的位點導引之突變誘發來改良蛋白質溶解性。此處，吾等藉由研究摺疊蛋白質之RGD環上的突變如何影響其溶解性來研究蛋白質溶解性的內源性決定因素。
使用硫酸銨進行蛋白質沈澱已成功用於量測蛋白質溶解性。(Trevino,S.R.,Scholtz,J.M.及Pace,C.N.(2008).Measuring and increasing protein solubility.Journal of pharmaceutical sciences 97,4155-4166)。儘管硫酸銨沈澱可快速且精確獲得對相同蛋白質之變體
的相對溶解度值資訊。此方法在實驗上可靠，此係因為難以控制之因素(諸如凍乾蛋白質的水/緩衝劑含量，或在實驗過程期間所引入之伴隨離子)由高濃度之鹽掩蔽。此外，此方法產生之沈澱溶液具有界限分明的的水相與固體相，且其僅需要相對較少量之蛋白質(10mg以下)，即使在研究可溶性高之蛋白質時亦如此。
所有量測在室溫下(25℃)如先前所描述而進行(Trevino,S.R.,Scholtz,J.M.及Pace,C.N.(2008).Measuring and increasing protein solubility.Journal of pharmaceutical sciences 97,4155-4166。簡言之，在0.2mL PCR管中將三種溶液(50mM緩衝劑、50mM緩衝劑中之3.0M硫酸銨及50mm緩衝劑中之蛋白質儲備溶液)混合在一起，以得到15μL之最終樣品體積，且具有所需硫酸銨及蛋白質濃度。使樣品平衡>1分鐘，以進行非晶形鹽析過程。隨後將樣品轉移至1.5mL Eppendorf管中，且以16,000g離心1分鐘，以移除聚集。使用495μL之1.1M硫酸銨溶液作為分光光度計之空白。在離心之後，向495μL空白溶液添加5μL樣品，且混合稀釋至一百分之一以用於吸光度量測。
藉由硫酸銨方法測定蛋白質溶解性用於誘導非晶形沈澱(Trevino,S.R.,Scholtz,J.M.及Pace,C.N.(2008).Measuring and increasing protein solubility.Journal of pharmaceutical sciences 97,4155-4166)。蛋白質隨硫酸銨濃度而變化之溶解度曲線用於指示所關注之蛋白質的溶解性。9,10Fn3 L1408P(CRARGDNPDC)變體(SEQ ID NO：32)、野生型蛋白質及9,10Fn3 L1408P(RARGDNPD)變體之溶解度為24.4、19.9及4.0mg/mL(參見表6及圖8B)。10Fn3、10Fn3(PRGDMPD)變體(SEQ ID NO：48)及10Fn3(CPRGDMPDC)變體(SEQ ID NO：6)之溶解度為7.3、5.3及27.8mg/mL(參見表7及圖9B)。各溶解度值重複三次，且因此可用於反映WT及其突變體之相對溶解性。綜合
而言，在整合素α5β1特異性9,10Fn3 L1408P(CRARGDNPDC)變體(SEQ ID NO：32)及整合素αvβ3特異性10Fn3(CPRGDMPDC)變體(SEQ ID NO：6)中結合雙硫鍵增加了其穩定性及溶解性(參見圖8B及9B)。
模擬血管生成之重組階段的常用活體外分析之一為管形成分析(Arnaoutova,I.及Kleinman,H.K.(2010).In vitro angiogenesis：endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.Nature protocols 5,628-635)。該分析量測用適當細胞外基質載體以亞匯合密度接種之內皮細胞形成毛細管狀結構的能力。該能力通常可藉由在培養物培養皿之顯微鏡影像中量測此等毛細管狀結構之數量、長度或面積來量化。鑒於化合物能夠抑制管形成，其應適用於其中腫瘤刺激新血管形成來接收氧氣及營養品以生長超出相對較小尺寸的各種疾病(諸如癌症)。此處，吾等檢測吾等所設計之突變體促進或抑制管形成的能力。
為評估Fn3突變體對bFGF或VEGF介導之活體外內皮管形成的作用，用10μL受質膠(BD Biosciences)塗佈15孔微玻片(ibidi GmbH)。將用Fn3突變體預培育15分鐘之HUVEC添加至含有2%FBS及內皮細胞生長補充劑之M199中的孔中，且最後添加50ng/mL bFGF或20ng/mL VEGF。使用ImajeJ軟體量測總管長度，且與指定時間之對照組相比。藉由配備有N PLAN 10×/0.25物鏡及CCD相機(CoolSNAP fx；Photometries)的倒置式顯微鏡(Leica DM IRE2)來獲得及處理管形成之顯微圖。
已知整合素α5β1涉及VEGF誘導之血管生成。且阻斷整合素α5β1可抑制活體外及活體內的VEGF誘導之血管生成為評估吾等整合素
α5β1特異性拮抗劑是否可抑制毛細管形成及受質膠栓子分析。流動式細胞量測術分析顯示整合素α5β1在HUVEC上過度表現。吾等為此研究選擇FNIII 9-10 L1408P(CRARGDNPDC)變體(SEQ ID NO：32)，因為其具有最強結合及穩固生物物理學特性。FNIII 9-10 L1408P(CRARGDNPDC)變體(SEQ ID NO：32)抑制由受質膠(細胞外基底膜受質)上生長之HUVEC(Kleinman等人，1986)所致的VEGF誘導之毛細管形成，其中IC50值為約1.6μM(圖10A)。然而，9,10Fn3 L1408P(CRARGDNPDC)變體(SEQ ID NO：32)不抑制由受質膠上生長之HUVEC所致的bFGF誘導之毛細管形成(圖10B)。結果表明吾等整合素α5β1特異性拮抗劑可特定地針對HUVECs細胞上之整合素α5β1，且干擾其對VEGF誘導之管形成的影響。
10Fn3(CPRGDMPDC)變體(SEQ ID NO：6)不抑制由受質膠上生長之HUVEC分別所致的VEGF誘導及bFGF誘導之毛細管形成。然而，10Fn3(CPRGDMPDC)變體(SEQ ID NO：6)抑制活體內bFGF誘導之血管生成。除了管形成之外，HUVEC遷移亦涉及血管生成過程。因此，吾等推測，在誘導bFGF之條件下，吾等整合素αvβ3特異性拮抗劑可干擾遷移而非管形成。此在bFGF誘導之傳斯維爾遷移分析中將得到進一步確認。
受質膠栓血管生成分析為偵測裸小鼠中移植凝膠栓中之新形成血管的簡單活體內技術。受質膠受質組合物與基底膜蛋白質類似。其可誘導多種細胞類型(諸如內皮細胞)的分化。血管生成或抗血管生成化合物的活性程度可藉由栓子中顏色與對照組相比的不同來目測評定。可使用多種方法(如血紅蛋白偵測)進行進一步定量。在吾等之情
況中，含有或不含蛋白質之生長因子(VEGF或bFGF)與受質膠混合，隨後注射入小鼠中，以確定蛋白質之抗血管生成活性。
為評估活體內血管生成作用，在C57BL/6小鼠中接近腹部中線處皮下注射含有肝素(500U/mL)的成長因子減少之液體受質膠(0.25mL)以及125ng bFGF/VEGF及Fn3突變體之組合。植入後四天之後，使小鼠安樂死，且以手術方式移除受質膠栓子，用CMOS相機(600D,Canon)拍照，且用血紅蛋白比色分析試劑盒(Cayman)量測各受質膠栓子之血紅蛋白含量。
吾等接著使用受質膠栓分析來量測FNIII 9-10 L1408P(CRARGDNPDC)變體(SEQ ID NO：32)阻斷活體內血管生成的能力。(Passaniti,R.M.Taylor,R.Pili,Y.Guo,P.V.Long,J.A.Haney,R.R.Pauly,D.S.Grant,G.R.Martin.,A simple,quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane,heparin,and fibroblast growth factor.,Lab.Invest.,67(1992)，第519-528頁))。引人注目地，FNIII 9-10 L1408P(CRARGDNPDC)變體(SEQ ID NO：32)抑制血管生成之程度接近於陰性對照組之程度(參見圖11)。其指示整合素α5β1在VEGF誘導之血管生成中起作用，且此生物過程可由吾等所設計之α5β1特異性拮抗劑阻斷。
吾等亦使用受質膠栓分析來量測FNIII 10(CPRGDMPDC)變體(SEQ ID NO：6)阻斷活體內血管生成的能力。引人注目地，FNIII 10(CPRGDMPDC)變體(SEQ ID NO：6)抑制血管生成之程度接近於陰性
對照組之程度(圖12)。其指示整合素αvβ3在bFGF誘導之血管生成中起作用，且此生物過程可由吾等所設計之αvβ3特異性拮抗劑阻斷。
對新穎癌症治療劑之發展的主要臨床前篩選藉由在免疫缺陷嚙齒動物中進行人類癌細胞的異種移植來達成(異種移植物模型)(Christopher L Morton及Peter J Houghton,NATURE PROTOCOLS.2007 247-250)。此等模型已鑑別出臨床上有效之藥劑，且仍為醫藥工業之骨幹。為揭示所提出的治療方法之機制，可藉由腫瘤活體檢查之免疫組織化學染色來鑑別腫瘤之分子特徵。在此研究中，吾等建立兩個異種移植物模型以分別測試兩種整合素拮抗劑之抗腫瘤活性。
為評估FNIII突變體對腫瘤血管生成之作用，對NOD-SCID小鼠進行背側皮下注射1×106人類黑色素瘤/肺瘤細胞。每日一次對小鼠進行皮下注射各種量的大腸桿菌表現之FNIII突變體(5或10毫克/公斤體重)。收集腫瘤，用相機(T30,Sony)拍照，且切片。使用含有Ab之IHC染色針對CD31(BD Biosciences)及Ki-67(Leica)分別檢測瘤內微血管及細胞。使用BX51顯微鏡(Olympus,Tokyo,Japan)獲取影像。量化瘤內微血管密度及細胞。簡言之，使用Image-Pro Plus軟體以10×放大率在腫瘤之各切片中計算微血管及細胞之積分光學密度(IOD)。
所有組織切片經去石蠟、復水，且在10mM Tris-EDTA緩衝劑(pH 9.0)中藉由高壓滅菌經受熱誘導之抗原修復持續6分鐘。用甲醇中之3% H2O2培育5分鐘，之後在TBS中洗滌2次，用蛋白質阻斷劑(NovoLinkTM)培育組織切片5分鐘。隨後將樣品與一級抗體在抗體稀釋劑中混合，且在室溫下培育30分鐘。在TBS中洗滌3次之後，在室溫下用二級抗體培育切片10分鐘。在TBS中洗滌3次之後，使用DAB工作溶液(NovoLinkTM)顯色樣品3分鐘，用0.02%蘇木素複染5分鐘，
與二甲苯一起靜置。最後，使用倒置式顯微鏡(IX71；Olympus,Tokyo,Japan)來目測切片。
統計分析以平均值±SD形式表現資料。of值<.05視為統計顯著。
FNIII 9-10 L1408P(CRARGDNPDC)變體(SEQ ID NO：32)之抗血管生成活性鼓勵吾等測定其是否可抑制病理性血管生成。腫瘤生長為血管生成依賴性的，且已顯示抑制血管生成可抑制腫瘤生長。為研究FNIII 9-10 L1408P(CRARGDNPDC)變體(SEQ ID NO：32)之可能抗腫瘤活性，吾等使用人類A375黑色素瘤異種移植物。流動式細胞量測術分析顯示整合素a5β1在A375腫瘤細胞上過度表現。活體內皮下投與FNIII 9-10 L1408P(CRARGDNPDC)變體(SEQ ID NO：32)產生腫瘤生長之劑量依賴性抑制。在治療3週之後，觀測到腫瘤體積及重量之減少(參見圖13)。為闡明腫瘤負荷中所觀測之不足的細胞基礎，吾等藉由在嵌入石蠟之腫瘤切片上用適當標記進行免疫組織化學研究，來評估FNIII 9-10 L1408P(CRARGDNPDC)變體(SEQ ID NO：32)對增殖及A375誘導之腫瘤血管生成的作用。腫瘤在增殖性狀態中展現極輕微不足，如由量化細胞Ki67表現水準所反映。其符合吾等之活體外結果：FNIII 9-10 L1408P(CRARGDNPDC)變體(SEQ ID NO：32)對腫瘤細胞增殖顯示輕微抑制。所觀測之生長不足的另一個可能解釋可為無法有效補充腫瘤脈管，因為β1整合素先前已涉及促進腫瘤血管生成。為測試此可能性，吾等使用抗CD31抗體對腫瘤進行免疫組織化學分析。有趣地，經蛋白質處理之腫瘤與其常用對應物相比展現不同CD31染色圖案。自經蛋白質處理之腫瘤內全部血管中所觀測之CD31陽性像素之數量平均減少接近二分之一。經FNIII 9-10 L1408P(CRARGDNPDC)變體(SEQ ID NO：32)處理之腫瘤的新血管生成與對
照組腫瘤相比明顯減少(參見圖13)。此等結果反映在A375誘導之腫瘤中觀測到腫瘤浸潤之血管的平均直徑減少，且表明供應至此等腫瘤之全部血液量減少。其符合吾等之活體外結果：FNIII 9-10 L1408P(CRARGDNPDC)變體(SEQ ID NO：32)對管形成及受質膠栓子分析顯示顯著抑制。總而言之，此等觀測指示，由整合素α5β1拮抗劑處理所致的A375誘導之腫瘤生長及發展中的不足與減少血管生成相關但不與減少腫瘤細胞存活相關。
FNIII 10(CPRGDMPDC)變體(SEQ ID NO：6)之抗血管生成活性鼓勵吾等測定其是否可抑制病理性血管生成。為研究10Fn3(CPRGDMPDC)變體(SEQ ID NO：6)之可能抗腫瘤活性，吾等使用人類A549黑色素瘤異種移植物。流動式細胞量測術分析顯示整合素αvβ3不在A549腫瘤細胞上過度表現。意外地，活體內皮下投與FNIII 10(CPRGDMPDC)變體(SEQ ID NO：6)產生腫瘤生長之劑量依賴性抑制。在治療3週之後，觀測到腫瘤體積及重量之減少(參見圖14)。為闡明腫瘤負荷中所觀測之缺陷的細胞基礎，吾等藉由在嵌入石蠟之腫瘤切片上用適當標記進行免疫組織化學研究，來評估FNIII 10(CPRGDMPDC)變體(SEQ ID NO：6)對增殖及A375誘導之腫瘤血管生成的作用。腫瘤在增殖性狀態中展現顯著不足，如由量化細胞Ki67表現水準所反映(參見圖14)。
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<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(282)
<400> 7
<210> 8
<211> 94
<212> PRT
<213> 人類
<400> 8
<210> 9
<211> 282
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(282)
<400> 9
<210> 10
<211> 94
<212> PRT
<213> 人類
<400> 10
<210> 11
<211> 282
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(282)
<400> 11
<210> 12
<211> 94
<212> PRT
<213> 人類
<400> 12
<210> 13
<211> 282
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(282)
<400> 13
<210> 14
<211> 94
<212> PRT
<213> 人類
<400> 14
<210> 15
<211> 282
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(282)
<400> 15
<210> 16
<211> 94
<212> PRT
<213> 人類
<400> 16
<210> 17
<211> 282
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(282)
<400> 17
<210> 18
<211> 94
<212> PRT
<213> 人類
<400> 18
<210> 19
<211> 552
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(552)
<400> 19
<210> 20
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 20
<210> 21
<211> 552
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(552)
<400> 21
<210> 22
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 22
<210> 23
<211> 552
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(552)
<400> 23
<210> 24
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 24
<210> 25
<211> 552
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(552)
<400> 25
<210> 26
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 26
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<211> 552
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(552)
<400> 27
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<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 28
<210> 29
<211> 552
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(552)
<400> 29
<210> 30
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 30
<210> 31
<211> 552
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(552)
<400> 31
<210> 32
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 32
<210> 33
<211> 552
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(552)
<400> 33
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<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 34
<210> 35
<211> 552
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(552)
<400> 35
<210> 36
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 36
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<211> 552
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(552)
<400> 37
<210> 38
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 38
<210> 39
<211> 552
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(552)
<400> 39
<210> 40
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 40
<210> 41
<211> 552
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(552)
<400> 41
<210> 42
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 42
<210> 43
<211> 552
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(552)
<400> 43
<210> 44
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 44
<210> 45
<211> 552
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(552)
<400> 45
<210> 46
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 46
<210> 47
<211> 282
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(282)
<400> 47
<210> 48
<211> 94
<212> PRT
<213> 人類
<400> 48
<210> 49
<211> 282
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(282)
<400> 49
<210> 50
<211> 94
<212> PRT
<213> 人類
<400> 50
<210> 51
<211> 282
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(282)
<400> 51
<210> 52
<211> 94
<212> PRT
<213> 人類
<400> 52
<210> 53
<211> 282
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(282)
<400> 53
<210> 54
<211> 94
<212> PRT
<213> 人類
<400> 54
<210> 55
<211> 552
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(552)
<400> 55
<210> 56
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 56
<210> 57
<211> 552
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(552)
<400> 57
<210> 58
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 58
<210> 59
<211> 552
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(552)
<400> 59
<210> 60
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 60
<210> 61
<211> 552
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(552)
<400> 61
<210> 62
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 62
<210> 63
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 63
<210> 64
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 64
<210> 65
<211> 94
<212> PRT
<213> 人類
<400> 65
<210> 66
<211> 184
<212> PRT
<213> 黑猩猩
<400> 66
<210> 67
<211> 184
<212> PRT
<213> 牛
<400> 67
<210> 68
<211> 184
<212> PRT
<213> 豬
<400> 68
<210> 69
<211> 184
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<400> 69
<210> 70
<211> 184
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 70
<210> 71
<211> 552
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(552)
<400> 71
<210> 72
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 72
<210> 73
<211> 8272
<212> DNA
<213> 人類
<220>
<221> CDS
<222> (360)..(7154)
<400> 73
<210> 74
<211> 2265
<212> PRT
<213> 人類
<400> 74
<210> 75
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 75
<210> 76
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 76
<210> 77
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> synthetic primer
<400> 77
<210> 78
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 78
<210> 79
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 79
<210> 80
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 80
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 81
<210> 82
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 82
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 83
<210> 84
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 84
<210> 85
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 85
<210> 86
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 86
<210> 87
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 87
<210> 88
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 88
<210> 89
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 89
<210> 90
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 90
<210> 91
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 91
<210> 92
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 92
<210> 93
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 93
<210> 94
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 94
<210> 95
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 95
<210> 96
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 96
<210> 97
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 97
<210> 98
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 98
<210> 99
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 99
<210> 100
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 100
<210> 101
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 101
<210> 102
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 102
<210> 103
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 103
<210> 104
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 104
<210> 105
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 105
<210> 106
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 106
<210> 107
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 107
<210> 108
<211> 185
<212> PRT
<213> 人類
<400> 108
<210> 109
<211> 185
<212> PRT
<213> 人類
<400> 109
<210> 110
<211> 185
<212> PRT
<213> 人類
<400> 110
<210> 111
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 111
<210> 112
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 112
<210> 113
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 113
<210> 114
<211> 184
<212> PRT
<213> 人類
<400> 114
Claims (62)
- 一種經分離之多肽，其包含經修飾之人類纖維黏連蛋白片段，該蛋白片段包含人類纖維黏連蛋白類型III域模組10(FNIII10)，其中該FNIII 10包含Arg-Gly-Asp(RGD)基元及兩個Cys取代以形成雙硫鍵，其中一個Cys取代在RGD基元之N-末端，而另一個Cys取代在RGD基元之C-末端，且其中該FNIII 10包含與SEQ ID NO：2至少85%同源性的胺基酸序列，其中該兩個Cys取代由約6至約9個胺基酸殘基分離。
- 如請求項1之多肽，其中該多肽抑制整合素α5β1或整合素αvβ3活性，而不抑制整合素aIIbβ3活性。
- 如請求項1之多肽，其中該兩個Cys取代由7或8個胺基酸殘基分離。
- 如請求項1之多肽，其中該FNIII 10在胺基酸位置1491、1492、1496、1497或1498處進一步包含至少一個胺基酸取代，且其中位置1491處之胺基酸取代為Arg或Ile，位置1492處之胺基酸取代為Ala或Pro，位置1496處之胺基酸取代為Met、Asn或Trp，位置1497處之胺基酸取代為Asn，且位置1498處之胺基酸取代為Asp或Glu。
- 如請求項4之多肽，其中該兩個Cys取代為胺基酸位置1491處之Thr經Cys取代及胺基酸位置1499處之Ser經Cys取代，且其中該FNIII 10包含式Cys1491-X1-Arg-Gly-Asp-X2-X3-X4-Cys1499，其中X1為Gly、Ala或Pro；X2為Ser、Met、Asn或Trp；X3為Pro或Asn；且X4為Ala、Asp或Glu。
- 如請求項5之多肽，其中多肽具有SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
- 如請求項5之多肽，其中X1為Pro，X2為Met，X3為Pro，且X4為Asp。
- 如請求項7之多肽，其中多肽具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
- 如請求項5之多肽，其中該經修飾之人類纖維黏連蛋白片段另包含人類纖維黏連蛋白類型III域模組9(FNIII 9)，該模組視情況可在胺基酸位置1408處包含Leu經Pro取代，且其中FNIII 9及FNIII 10(FNIII 9-10)包含與SEQ ID NO：4之胺基酸序列至少85%同源性的胺基酸序列。
- 如請求項9之多肽，其中該多肽具有SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26之胺基酸序列。
- 如請求項10之多肽，其中該多肽具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列。
- 如請求項5之多肽，其中該多肽抑制整合素αvβ3活性。
- 如請求項4之多肽，其中該經修飾之人類纖維黏連蛋白片段另包含人類纖維黏連蛋白類型III域模組9(FNIII 9)，該模組視情況可在胺基酸位置1408處包含Leu經Pro取代，且其中FNIII 9及FNIII 10(FNIII 9-10)包含與SEQ ID NO：4之胺基酸序列至少85%同源性的胺基酸序列。
- 如請求項13之多肽，其中該兩個Cys取代為在胺基酸位置1490處Val經Cys取代及在胺基酸位置1499處Ser經Cys取代，其中該FNIII 10包含式Cys1490-X1-X2-Arg-Gly-Asp-X3-Pro-X4-Cys1499，其中X1為Thr、Arg或Ile；X2為Gly、Ala或Pro； X3為Phe、Arg、Asp、Ser、Met或Asn；且X4為Ala或Asp。
- 如請求項14之多肽，其中該多肽具有SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：110之胺基酸序列。
- 如請求項14之多肽，其中X1為Arg，X2為Ala，X3為Asn，且X4為Asp。
- 如請求項16之多肽，其中該多肽具有SEQ ID NO：32之胺基酸序列。
- 如請求項14之多肽，其中該多肽抑制整合素α5β1活性。
- 如請求項14之多肽，其中該人類纖維黏連蛋白類型III域模組9(FNIII 9)視情況的在胺基酸位置1341處之Asn經Ala取代、在胺基酸位置1377處之His經Pro取代、在胺基酸1376處之Pro經Lys取代或在胺基酸位置1376處之Pro經Asp取代。
- 如請求項14之多肽，其中該多肽具有SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113或SEQ ID NO：114之胺基酸序列。
- 如請求項19之多肽，其中該多肽抑制整合素α5β1活性。
- 一種經分離之多肽，其包含經修飾之人類纖維黏連蛋白片段，該蛋白片段包含人類纖維黏連蛋白類型III域模組9及人類纖維黏連蛋白類型III域模組10(FNIII 9-10)，其中FNIII 9視情況可在胺基酸位置1408處包含Leu經Pro取代，其中FNIII 9及FNIII 10各包含至少一個胺基酸取代，其中FNIII 9及FNIII 10中之胺基酸取代形成非共價鍵，且其中FNIII 9及FNIII 10包含與SEQ ID NO：4之胺基酸序列至少85%同源且並非SEQ ID NO NO：64的胺基酸序列，其中該FNIII 9中之胺基酸取代為在胺基酸位置1340處之Ala經Asp取代，且FNIII 10中之胺基酸取代為在胺基酸位置1442處 之Val經Lys取代。
- 如請求項22之多肽，其中該FNIII 9及FNIII 10中之胺基酸取代形成域間雙硫鍵。
- 如請求項22之多肽，其中該FNIII 9及FNIII 10中之胺基酸取代形成域間氫鍵。
- 如請求項22之多肽，其中該多肽具有SEQ ID NO：40之胺基酸序列。
- 如請求項23之多肽，其中該多肽抑制整合素α5β1活性。
- 一種經分離之多肽，其包含經修飾之人類纖維黏連蛋白片段，該蛋白片段包含人類纖維黏連蛋白類型III域模組9及人類纖維黏連蛋白類型III域模組10(FNIII 9-10)，其中FNIII 9在胺基酸位置1373或1379包含至少一個胺基酸取代，且其中FNIII 9及FNIII 10(FNIII 9-10)包含與SEQ ID NO：4之胺基酸序列至少85%同源的胺基酸序列，其中該胺基酸取代為在胺基酸位置1373處之Asp經Arg取代或在胺基酸位置1379處之Arg經Asp取代。
- 如請求項23之多肽，其中該FNIII 9在胺基酸位置1408處另包含Leu經Pro取代。
- 如請求項27之多肽，其中其中該FNIII 9在胺基酸位置1373處之Asp經Arg取代以及在胺基酸位置1379處之Arg經Asp取代。
- 如請求項28之多肽，其中該多肽具有SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：46之胺基酸序列。
- 如請求項30之多肽，其中該多肽具有SEQ ID NO：42之胺基酸序列。
- 如請求項27之多肽，其中該多肽抑制整合素αvβ3活性。
- 一種經分離之多肽，其包含經修飾之人類纖維黏連蛋白片段，該蛋白片段包含其中含有式Val1490-X1-X2-Arg-Gly-Asp-X3-X4-X5- X6-Ser1500之人類纖維黏連蛋白類型III域模組10(FNIII 10)，其中X1為Thr或Arg；X2為Ala或Pro；X3為Met、Trp或Asn；X4為Pro或Asn；X5為Asp或Glu；且X6為Ser或Gly，其中經修飾之纖維黏連蛋白片段包含與SEQ ID NO：2至少85%同源且並非SEQ ID NO：5O的胺基酸序列。
- 如請求項33之多肽，其中該多肽具有SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：54之胺基酸序列。
- 如請求項34之多肽，其中該多肽具有SEQ ID NO：48之胺基酸序列。
- 如請求項33之多肽，其中該經修飾之人類纖維黏連蛋白片段另包含人類纖維黏連蛋白類型III域模組9(FNIII 9)，該模組視情況可在胺基酸位置1408處包含Leu經Pro取代，且其中FNIII 9及FNIII 10(FNIII 9-10)包含與SEQ ID NO：4之胺基酸序列至少85%同源的胺基酸序列。
- 如請求項36之多肽，其中該多肽具有SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：62之胺基酸序列。
- 如請求項37之多肽，其中該多肽具有SEQ ID NO：62之胺基酸序列。
- 如請求項33之多肽，其中該多肽抑制整合素α5β1活性及/或整合素αvβ3活性。
- 一種醫藥組合物，包含治療有效量之如請求項1-39中任一項之多肽，及醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
- 一種如請求項40之醫藥組合物之用途，其係用於製造抑制哺乳 動物中整合素介導之細胞黏附、生長、遷移或分化之藥物，其中該整合素為αvβ3或α5β1。
- 如請求項41之用途，其中該整合素為αvβ3。
- 如請求項42之用途，其中該多肽具有SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：60之胺基酸序列。
- 如請求項41之用途，其中該整合素為α5β1。
- 如請求項44之用途，其中該多肽具有SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：62之胺基酸序列。
- 一種如請求項40之醫藥組合物之用途，其係用於製造抑制哺乳動物中腫瘤生長或腫瘤轉移之藥物，其中該腫瘤表現整合素α5β1或αvβ3。
- 如請求項46之用途，其中該多肽具有如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：62之胺基酸序列。
- 如請求項46之用途，其中該腫瘤為肺癌，乳腺腫瘤，結腸腫瘤，骨肉瘤，胰腺腫瘤，卵巢腫瘤，子宮頸腫瘤，膠質母細胞瘤，***腫瘤，肝腫瘤及黑色素瘤。
- 一種如請求項40之醫藥組合物之用途，其係用於製造抑制哺乳動物中腫瘤發展之藥物，其中該腫瘤表現整合素αvβ3或α5β1。
- 如請求項49之用途，其中該整合素為αvβ3且該多肽具有如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：60之胺基酸序列。
- 如請求項49之用途，其中該整合素為α5β1且該多肽具有如SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：72之胺基酸序列。
- 如請求項49之用途，其中該腫瘤為肺癌，乳腺腫瘤，結腸腫瘤，骨肉瘤，胰腺腫瘤，卵巢腫瘤，子宮頸腫瘤，膠質母細胞瘤，***腫瘤，肝腫瘤及黑色素瘤。
- 一種如請求項40之醫藥組合物之用途，其係用於製造抑制哺乳動物中腫瘤轉移之藥物，其中該腫瘤表現整合素αvβ3或α5β1。
- 如請求項53之用途，其中該醫藥組合物包含具有如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、或SEQ ID NO：62之胺基酸序列之多肽。
- 如請求項53之用途，其中該腫瘤為肺癌，乳腺腫瘤，結腸腫瘤，骨肉瘤，胰腺腫瘤，卵巢腫瘤，子宮頸腫瘤，膠質母細胞瘤，***腫瘤，肝腫瘤及黑色素瘤。
- 一種如請求項40之醫藥組合物之用途，其係用於製造抑制哺乳動物中血管生成相關疾病之藥物，其中該血管生成相關疾病為癌症，黃斑部病變，水腫或關節炎。
- 如請求項56之用途，其中該醫藥組合物包含具有如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：68之胺基酸序列之 多肽。
- 一種經分離之多核苷酸，其包含編碼如請求項1-39中任一項之多肽之核苷酸序列。
- 如請求項53之多核苷酸，其中該多核苷酸包含如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：61之核苷酸序列。
- 一種表現載體，其包含如請求項58之多核苷酸。
- 一種宿主細胞，其包含如請求項60之表現載體。
- 一種製備如請求項1-39中任一項之多肽之方法，其包含以下步驟：(a)在對自表現載體編碼之多肽的表現有效的條件下培養本文提供之宿主細胞；及(b)自培養物回收多肽。
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