CN104603262A - 使人胚胎干细胞分化为胰腺内分泌细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及处理多能细胞的方法，其中通过用GSK-3B酶活性抑制剂处理所述多能细胞，可使所述多能细胞在培养物中有效扩增和分化。

Description

使人胚胎干细胞分化为胰腺内分泌细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年6月14日提交的美国临时专利申请序列号61/741,776的权益，所述美国临时专利申请全文以引用方式并入本文用于任何目的。
技术领域
本发明涉及处理多能细胞的方法，其中通过用GSK-3B酶活性抑制剂处理多能细胞，可使该多能细胞在培养物中有效扩增和分化。
背景技术
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能细胞(例如胚胎干细胞)产生功能性β细胞。
在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的一组细胞。诸如例如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段为形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标志物，例如HNF-3β、GATA-4、Mixl1、CXCR4和SOX-17。
定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层的细胞可表达胰-十二指肠同源盒基因PDX-1。在不存在PDX-1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因此，PDX-1的表达标志着胰腺器官形成中的关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰腺内胚层的分化。
产生足够量的细胞物质用于移植需要可在培养物中有效扩增并有效分化成所关注的组织(例如功能性β细胞)的细胞物质来源。
培养人胚胎干细胞的当前方法较复杂；它们需要使用外源因子或化学成分确定的培养基以便使细胞增殖而不丧失其多能性。此外，胚胎干细胞的分化通常导致细胞在培养物中扩增减少。
例如，Cheon等人(BioReprod DOI：10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公开了一种无饲养细胞的无血清培养***，其中胚胎干细胞维持在补充有能引发胚胎干细胞自我更新的不同生长因子的未经调理的血清替代(SR)培养基中。
又如，US20050233446公开了一种可用于培养干细胞的成分确定的培养基，所述干细胞包括未分化的灵长类原始干细胞。在溶液中，该培养基与被培养的干细胞基本上等渗。在给定的培养物中，特定的培养基包含基础培养基和各为一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸，所述bFGF、胰岛素和抗坏血酸为支持原始干细胞进行基本上非分化性生长所必需。
又如，WO2005086845公开了一种维持未分化的干细胞的方法，所述方法包括使干细胞暴露于转化生长因子-β(TGFβ)蛋白家族的成员、成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族的成员或烟酰胺(NIC)，所述成员或烟酰胺的量足以维持细胞处于未分化状态达足以实现所需结果的一段时间。
已知糖原合成酶激酶-3(GSK-3)的抑制剂可促进成体干细胞的增殖和扩增。在一个实例中，Tateishi等人(Biochemical and Biophysical Research Communications(2007)352：635)表明，抑制GSK-3可增强从新生儿或成人心脏回收并具有间质特征的人心脏干细胞(hCSC)的生长和存活。
例如，Rulifson等人(PNAS 144，6247-6252，(2007))声称“Wnt信号传导刺激胰岛β细胞增殖”。
又如，WO2007016485报道，添加GSK-3抑制剂至非胚胎干细胞(包括多潜能成体祖细胞)的培养物可导致在扩增期间维持多能表型，并导致更强的分化响应。
又如，US2006030042利用通过添加Wnt或GSK-3酶活性的小分子抑制剂来抑制GSK-3的方法，来在不使用饲养细胞层的情况下维持胚胎干细胞。
又如，WO2006026473报道添加GSK-3B抑制剂，通过转录激活c-myc和稳定c-myc蛋白来使多能细胞保持稳定。
又如，WO2006100490报道使用含有GSK-3抑制剂和gp130激动剂的干细胞培养基来维持多能干细胞(包括小鼠或人胚胎干细胞)的自我更新群体。
又如，Sato等人(Nature Medicine(2004)10：55-63)表明，用特异性药理性化合物抑制GSK-3可维持胚胎干细胞的未分化表型以及维持多能状态特异性转录因子例如Oct-3/4、Rex-1和Nanog的表达。
又如，Maurer等人(Journal of Proteome Research(2007)6：1198-1208)表明，用GSK-3抑制剂处理成体神经元干细胞可显示出神经元分化的增强，特别是通过促进β-连环蛋白靶基因的转录和使细胞凋亡降低。
又如，Gregory等人(Annals of the New York Academy of Sciences(2005)1049：97-106)报道，GSK-3B的抑制剂可增强体外成骨作用。
又如，Feng等人(Biochemical and Biophysical Research Communcations(2004)324：1333-1339)表明，胚胎干细胞向造血分化与Wnt/β-连环蛋白途径的下调相关，其中Wnt为GSK3的天然抑制剂。
因此，仍然非常需要开发用于处理多能干细胞而使得多能干细胞可被扩增以满足当前临床需要，同时保持分化为胰腺内分泌细胞、胰腺激素表达细胞或胰腺激素分泌细胞的潜能的方法。
发明内容
本发明提供了通过用GSK-3B酶活性抑制剂处理多能细胞而使多能细胞扩增和分化的方法。
在一个实施例中，本发明提供了使多能细胞扩增和分化的方法，该方法包括以下步骤：
a.培养多能细胞，以及
b.用GSK-3B酶活性抑制剂处理所述多能细胞。
在一个实施例中，所述多能细胞分化成可表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
多能细胞可以为人胚胎干细胞，或者它们可以为根据60/913475中公开的方法衍生自人胚胎干细胞的表达多能标志物的细胞。
在一个实施例中，GSK-3B酶活性抑制剂为式(I)的化合物：
在一个实施例中，GSK-3B酶活性抑制剂为式(II)的化合物：
在一个实施例中，GSK-3B酶活性抑制剂为式(III)的化合物：
附图说明
图1示出了一系列浓度的化合物#221对细胞数目的作用(图1A)和对Sox-17表达的作用(图1B)，其中细胞数目通过所观察到的细胞核的数目 确定，Sox-17表达通过免疫荧光染色的强度确定。结果用IN Cell Analyzer1000(GE Healthcare)从人胚胎干细胞系H1的细胞(白色柱条)或从人胚胎干细胞系H9的细胞(黑色柱条)获得。
图2示出了一系列浓度的化合物#206对细胞数目的作用(图2A)和对Sox-17表达的作用(图2B)，其中细胞数目通过所观察到的细胞核的数目确定，Sox-17表达通过免疫荧光染色的强度确定。结果用IN Cell Analyzer1000(GE Healthcare)从人胚胎干细胞系H1的细胞(白色柱条)或从人胚胎干细胞系H9的细胞(黑色柱条)获得。
图3示出了一系列浓度的化合物#223对细胞数目的作用(图3A)和对Sox-17表达的作用(图3B)，其中细胞数目通过所观察到的细胞核的数目确定，Sox-17表达通过免疫荧光染色的强度确定。结果用IN Cell Analyzer1000(GE Healthcare)从人胚胎干细胞系H1的细胞(白色柱条)或从人胚胎干细胞系H9的细胞(黑色柱条)获得。
图4示出了一系列浓度的化合物#47对细胞数目的作用(图4A)和对Sox-17表达的作用(图4B)，其中细胞数目通过所观察到的细胞核的数目确定，Sox-17表达通过免疫荧光染色的强度确定。结果用IN Cell Analyzer1000(GE Healthcare)从人胚胎干细胞系H1的细胞(白色柱条)或从人胚胎干细胞系H9的细胞(黑色柱条)获得。
图5示出了一系列浓度的化合物#103对细胞数目的作用(图5A)和对Sox-17表达的作用(图5B)，其中细胞数目通过所观察到的细胞核的数目确定，Sox-17表达通过免疫荧光染色的强度确定。结果用IN Cell Analyzer1000(GE Healthcare)从人胚胎干细胞系H1的细胞(白色柱条)或从人胚胎干细胞系H9的细胞(黑色柱条)获得。
图6示出了一系列浓度的化合物#133对细胞数目的作用(图6A)和对Sox-17表达的作用(图6B)，其中细胞数目通过所观察到的细胞核的数目确定，Sox-17表达通过免疫荧光染色的强度确定。结果用IN Cell Analyzer1000(GE Healthcare)从人胚胎干细胞系H1的细胞(白色柱条)或从人胚胎干细胞系H9的细胞(黑色柱条)获得。
图7示出了一系列浓度的化合物#136对细胞数目的作用(图7A)和对Sox-17表达的作用(图7B)，其中细胞数目通过所观察到的细胞核的数目确定，Sox-17表达通过免疫荧光染色的强度确定。结果用IN Cell Analyzer 1000(GE Healthcare)从人胚胎干细胞系H1的细胞(白色柱条)或从人胚胎干细胞系H9的细胞(黑色柱条)获得。
图8示出了一系列浓度的化合物#198对细胞数目的作用(图8A)和对Sox-17表达的作用(图8B)，其中细胞数目通过所观察到的细胞核的数目确定，Sox-17表达通过免疫荧光染色的强度确定。结果用IN Cell Analyzer1000(GE Healthcare)从人胚胎干细胞系H1的细胞(白色柱条)或从人胚胎干细胞系H9的细胞(黑色柱条)获得。
图9示出了在用所示化合物根据实例8中所述的方法处理过的细胞上，CXCR4在细胞表面上的表达，该表达通过免疫荧光染色和流式细胞检测分析测定。
图10示出了在用所示化合物根据实例8中所述的方法处理过的细胞中，CXCR4(图10A)、HNF-3β(图10B)和Sox-17(图10C)的表达，该表达通过实时PCR测定。
图11示出了一系列浓度的所示化合物对细胞数目的作用(图11A)和对Pdx-1表达的作用(图11B)，其中使用IN Cell Analyzer 1000(GE Healthcare)，细胞数目通过所观察到的细胞核的数目确定，Pdx-1表达通过免疫荧光染色的强度确定。细胞根据实例9中所述的方法进行处理。
图12示出了一系列浓度的所示化合物对Pdx-1表达(白色柱条)和HNF-6表达(黑色柱条)的作用，所述Pdx-1表达通过实时PCR测定。细胞根据实例9中所述的方法进行处理。
图13示出了一系列浓度的所示化合物对细胞数目的作用(图13A)和对胰岛素表达的作用(图13B)，其中使用IN Cell Analyzer 1000(GE Healthcare)，细胞数目通过所观察到的细胞核的数目确定，胰岛素表达通过免疫荧光染色的强度确定。细胞根据实例10中所述的方法进行处理。
图14示出了一系列浓度的所示化合物对Pdx-1表达(白色柱条)和胰岛素表达(黑色柱条)的作用，所述表达通过实时PCR测定。细胞根据实例10中所述的方法进行处理。
图15示出了一系列浓度的所示化合物对细胞数目的作用(图15A)和对胰岛素表达的作用(图15B)，其中使用IN Cell Analyzer 1000(GE Healthcare)，细胞数目通过所观察到的细胞核的数目确定，胰岛素表达通过免疫荧光染色的强度确定。细胞根据实例11中所述的方法进行处理。
具体实施方式
将本发明的具体实施方式部分分成以下几个分部分，来描述或举例说明本发明的某些特征、实施例或应用，这是为了使公开内容清楚起见，并非限制本发明。
定义
干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞的特征还在于：其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多种胚层的组织和注入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的话)组织形成的能力。
根据它们的发育潜能将干细胞分为：(1)全能干细胞，意指能够产生所有胚胎或胚外细胞类型；(2)多能干细胞，意指能够产生所有胚胎细胞类型；(3)多潜能干细胞，意指能够产生某一亚群的细胞谱系，但这些细胞都位于特定的组织、器官或生理***内(例如，造血干细胞(HSC)能够产生包括HSC(自我更新)、血细胞限制性寡能祖细胞和为血液正常组分的所有细胞类型和成分(如血小板)的子代；(4)寡能干细胞，意指能够产生比多潜能干细胞更为有限的某一亚群细胞谱系；以及(5)单能干细胞，意指能够产生单种细胞谱系(如精原干细胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化的细胞或诱导分化的细胞为已经在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，且在正常环境下不能分化成另一细胞类型或回复到分化程度较低的细胞类型。去分化指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)程度较低的地位的过程。如本文所用，“细胞的谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特异性标志物是指与所关注谱系的细胞表型特异性相关并能够用于评价非定向细胞向所关注谱系的分化的特征。
“β-细胞谱系”是指对于转录因子PDX-1和下列转录因子中的至少一种具有阳性基因表达的细胞：NGN-3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl-1、HNF-3β、MAFA、Pax4和Pax6。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞包括β细胞。
本文所用的“表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞”指表达至少一种下列标志物的细胞：SOX-17、GATA-4、HNF-3β、GSC、Cerl、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4CD48、脱中胚蛋白(eomesodermin，EOMES)、DKK4、FGF 17、GATA-6、CXCR4、C-Kit、CD99或OTX2。表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细胞。
本文所用的“表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞”是指表达至少一种下列标志物的细胞：PDX-1、HNF-1β、PTF-1α、HNF-6或HB9。表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内胚层细胞。
本文所用的“表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞”指表达至少一种下列标志物的细胞：NGN-3、NeuroD、Islet-1、PDX-1、NKX6.1、Pax-4、Ngn-3或PTF-1α。表达胰内分泌系特征性标志物的细胞包括胰内分泌细胞、胰激素表达细胞、胰激素分泌细胞和β细胞系的细胞。
本文所用的“定形内胚层”指具有在原肠胚形成过程中从上胚层产生的细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达下列标志物：HNF-3β、GATA-4、SOX-17、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99和Mixl1。
本文所用的“胚外内胚层”指表达至少一种下列标志物的细胞群体：SOX-7、AFP和SPARC。
本文所用的“标志物”为在所关注的细胞中差异表达的核酸或多肽分子。关于这一点，差异表达意指阳性标志物的水平增加，而阴性标志物的水平降低。与其他细胞相比，所关注细胞中的核酸或多肽标志物的可检测水平足够高或足够低，使得可以使用本领域已知的多种方法识别所关注细胞，并将所关注细胞与其他细胞区相区分。
本文所用的术语“中内胚层细胞”指表达至少一种下列标志物的细胞：CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、SOX-17、DKK4、HNF-3β、GSC、FGF17、GATA-6。
如本文所用，“胰腺内分泌细胞”或“胰腺激素表达细胞”指能够表达至少一种下列激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰腺多肽。
本文所用的“胰腺激素分泌细胞”指能够分泌至少一种下列激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
如本文所用，“前原条细胞”指表达至少一种下列标志物的细胞：Nodal或FGF8。
本文所用的“原条细胞”指表达至少一种下列标志物的细胞：Brachyury、Mix-like同源盒蛋白或FGF4。
在一个实施例中，本发明提供了使多能细胞扩增和分化的方法，该方法包括用GSK-3B酶活性抑制剂处理多能细胞。
在一个实施例中，本发明提供了使多能细胞扩增和分化的方法，该方法包括以下步骤：
c.培养多能细胞，以及
d.用GSK-3B酶活性抑制剂处理所述多能细胞。
在一个实施例中，所述多能细胞分化成可表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
定形内胚层谱系特征性标志物选自SOX17、GATA4、Hnf-3β、GSC、Cerl、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99和OTX2。本发明中还考虑的是衍生自多能细胞的表达至少一种定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞为原条前体细胞。在一个替代方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞为中内胚层细胞。在一个替代方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞为定形内胚层细胞。
可将多能细胞用GSK-3B酶活性抑制剂处理约1至约72小时。另选地，可将多能细胞用GSK-3B酶活性抑制剂处理约12至约48小时。另选地，可将多能细胞用GSK-3B酶活性抑制剂处理约48小时。
在一个实施例中，GSK-3B酶活性抑制剂以约100nM至约100μM的浓度使用。另选地，GSK-3B酶活性抑制剂以约1μM至约10μM的浓度使用。另选地，GSK-3B酶活性抑制剂以约10μM的浓度使用。
适用于本发明方法的化合物
在一个实施例中，GSK-3B酶活性抑制剂为式(I)的化合物：
其中：
R1为苯基、取代的苯基(其中所述苯基取代基选自C1-5烷基、卤素、硝基、三氟甲基和腈)或嘧啶基；
R2为苯基、取代的苯基(其中所述苯基取代基选自C1-5烷基、卤素、硝基、三氟甲基和腈)或嘧啶基(其任选地被C1-4烷基取代)，并且R1和R2中的至少一者为嘧啶基；
R3为氢、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、C1-5烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳基C1-5烷氧基羰基、芳基C1-5烷基、取代的芳基C1-5烷基(其中一个或多个芳基取代基独立地选自C1-5烷基、C1-5烷氧基、卤素、氨基、C1-5烷基氨基和二C1-5烷基氨基)、邻苯二甲酰亚胺基C1-5烷基、氨基C1-5烷基、二氨基C1-5烷基、琥珀酰亚胺基C1-5烷基、C1-5烷基羰基、芳基羰基、C1-5烷基羰基C1-5烷基和芳氧基羰基C1-5烷基；
R4为-(A)-(CH2)q-X；
A为亚乙烯基、亚乙炔基或
R5选自氢、C1-5烷基、苯基和苯基C1-5烷基；
q为0-9；
X选自氢、羟基、乙烯基、取代的乙烯基(其中一个或多个乙烯基取代基各自选自氟、溴、氯和碘)、乙炔基、取代的乙炔基(其中乙炔基取代基选自氟、溴、氯和碘)、C1-5烷基、取代的C1-5烷基(其中一个或多个烷基取代基各自选自C1-5烷氧基、三卤代烷基、邻苯二甲酰亚胺基和氨基)、C3-7环烷基、C1-5烷氧基，取代的C1-5烷氧基(其中烷基取代基选自 邻苯二甲酰亚胺基和氨基)、邻苯二甲酰亚胺基氧基、苯氧基、取代的苯氧基(其中一个或多个苯基取代基各自选自C1-5烷基、卤素和C1-5烷氧基)、苯基、取代的苯基(其中一个或多个苯基取代基各自选自C1-5烷基、卤素和C1-5烷氧基)、芳基C1-5烷基、取代的芳基C1-5烷基(其中一个或多个芳基取代基各自选自C1-5烷基、卤素和C1-5烷氧基)、芳氧基C1-5烷基氨基、C1-5烷基氨基、二C1-5烷基氨基、腈、肟、苄氧基亚氨基、C1-5烷氧基亚氨基、邻苯二甲酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、C1-5烷基羰氧基、苯基羰氧基、取代的苯基羰氧基(其中一个或多个苯基取代基各自选自C1-5烷基、卤素和C1-5烷氧基)、苯基C1-5烷基羰氧基(其中一个或多个苯基取代基各自选自C1-5烷基、卤素和C1-5烷氧基)、氨基羰氧基、C1-5烷基氨基羰氧基、二C1-5烷基氨基羰氧基、C1-5烷氧基羰氧基、取代的C1-5烷氧基羰氧基(其中一个或多个烷基取代基各自选自甲基、乙基、异丙基和己基)、苯氧基羰氧基、取代的苯氧基羰氧基(其中一个或多个苯基取代基各自选自C1-5烷基、C1-5烷氧基和卤素)、C1-5烷硫基、取代的C1-5烷硫基(其中烷基取代基选自羟基和邻苯二甲酰亚胺基)、C1-5烷基磺酰基、苯基磺酰基、取代的苯基磺酰基(其中一个或多个苯基取代基各自选自溴、氟、氯、C1-5烷氧基和三氟甲基)；条件是如果A为q为0，并且X为H，则R3可不为2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基；以及它们药学上可接受的盐。
本发明的实例包括其中R1为取代的苯基，并且R2为嘧啶-3-基的式(I)的化合物。
本发明的实例包括其中R1为4-氟代苯基的式(I)的化合物。
本发明的实例包括其中R3为氢、芳基C1-5烷基或取代的芳基C1-5烷基的式(I)的化合物。
本发明的实例包括其中R3为氢或苯基C1-5烷基的式(I)的化合物。
本发明的实例包括其中A为亚乙炔基，并且q为0-5的式(I)的化合物。
本发明的实例包括其中X为琥珀酰亚胺基、羟基、甲基、苯基、C1-5烷基磺酰基、C3-6环烷基、C1-5烷基羰氧基、C1-5烷氧基、苯基羰氧基、C1-5烷基氨基、二C1-5烷基氨基或腈的式(I)的化合物。
共同转让的美国专利6,214,830中公开了式(I)的化合物，将该专利的全部公开内容以引用的方式并入本文。
本发明的实例包括式(I)的化合物，其中所述化合物选自下表A中所列的化合物：
表A
式(I)的化合物
表A-续
本发明的实例包括其中化合物为下式表示的化合物A-5的式(I)的化合物：
在一个实施例中，GSK-3B酶活性抑制剂为式(II)的化合物：
其中：
R选自Ra、-C1-8烷基-Ra、-C2-8烯基-Ra、-C2-8炔基-Ra和氰基；
Ra选自环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；
R1选自氢、-C1-8烷基-R5、-C2-8烯基-R5、-C2-8炔基-R5、-C(O)-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-O-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-C(O)- NH(C1-8烷基-R9)、-C(O)-NH(芳基-R8)、-C(O)-N(C1-8烷基-R9)2、-SO2-(C1-8)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-环烷基-R6、-杂环基-R6、-芳基-R6和-杂芳基-R6；其中杂环基和杂芳基经由杂环基或杂芳基环碳原子在一个位置处连接到氮杂吲哚氮原子；
R5为1至2个独立地选自下列的取代基：氢、-O-(C1-8)烷基、-O-(C1-8)烷基-OH、-O-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基、-O-(C1-8)烷基-NH2、-O-(C1-8)烷基-NH(C1-8烷基)、-O-(C1-8)烷基-N(C1-8烷基)2、-O-(C1-8)烷基-S-(C1-8)烷基、-O-(C1-8)烷基-SO2-(C1-8)烷基、-O-(C1-8)烷基-SO2-NH2、-O-(C1-8)烷基-SO2-NH(C1-8烷基)、-O-(C1-8)烷基-SO2-N(C1-8烷基)2、-O-C(O)H、-O-C(O)-(C1-8)烷基、-O-C(O)-NH2、-O-C(O)-NH(C1-8烷基)、-O-C(O)-N(C1-8烷基)2、-O-(C1-8)烷基-C(O)H、-O-(C1-8)烷基-C(O)-(C1-8)烷基、-O-(C1-8)烷基-CO2H、-O-(C1-8)烷基-C(O)-O-(C1-8)烷基、-O-(C1-8)烷基-C(O)-NH2、-O-(C1-8)烷基-C(O)-NH(C1-8烷基)、-O-(C1-8)烷基-C(O)-N(C1-8烷基)2、-C(O)H、-C(O)-(C1-8)烷基、-CO2H、-C(O)-O-(C1-8)烷基、-C(O)-NH2、-C(NH)-NH2、-C(O)-NH(C1-8烷基)、-C(O)-N(C1-8烷基)2、-SH、-S-(C1-8)烷基、-S-(C1-8)烷基-S-(C1-8)烷基、-S-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基、-S-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基-OH、-S-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基-NH2、-S-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基-NH(C1-8烷基)、-S-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基-N(C1-8烷基)2、-S-(C1-8)烷基-NH(C1-8烷基)、-SO2-(C1-8)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-8烷基)、-SO2-N(C1-8烷基)2、-N-R7、氰基、(卤代基)1-3、羟基、硝基、氧代基、-环烷基-R6、-杂环基-R6、-芳基-R6和-杂芳基-R6；
R6为1至4个独立地选自下列的连接到碳或氮原子的取代基：氢、-C1-8烷基、-C2-8烯基、-C2-8炔基、-C(O)H、-C(O)-(C1-8)烷基、-CO2H、-C(O)-O-(C1-8)烷基、-C(O)-NH2、-C(NH)-NH2、-C(O)-NH(C1-8烷基)、-C(O)-N(C1-8)烷基)2、-SO2-(C1-8)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-8烷基)、-SO2-N(C1-8烷基)2、-(C1-8)烷基-N-R7、-(C1-8)烷基-(卤代基)1-3、-(C1-8)烷基-OH、-芳基-R8、-(C1-8)烷基-芳基-R8和-(C1-8)烷基-杂芳基-R8；条件是当R6连接到碳原子时，R6还选自-C1-8烷氧基、-(C1-8)烷氧基-(卤代基)1-3、-SH、-S-(C1-8)烷基、-N-R7、氰基、卤代基、羟基、硝基、氧代基和-杂芳基-R8；
R7为2个独立地选自下列的取代基：氢、-C1-8烷基、-C2-8烯基、-C2-8炔基、-(C1-8)烷基-OH、-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基、-(C1-8)烷基-NH2、-(C1-8)烷 基-NH(C1-8烷基)、-(C1-8)烷基-N(C1-8烷基)2、-(C1-8)烷基-S-(C1-8)烷基、-C(O)H、-C(O)-(C1-8)烷基、-C(O)-O-(C1-8)烷基、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-8烷基)、-C(O)-N(C1-8烷基)2、-SO2-(C1-8)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-8烷基)、-SO2-N(C1-8烷基)2、-C(N)-NH2、-环烷基-R8、-(C1-8)烷基-杂环基-R8、-芳基-R8、-(C1-8)烷基-芳基-R8和-(C1-8)烷基-杂芳基-R8；
R8为1至4个独立地选自下列的连接到碳或氮原子的取代基：氢、-C1-8烷基、-(C1-8)烷基-(卤代基)1-3和-(C1-8)烷基-OH；条件是当R8连接到碳原子时，R8还选自-C1-8烷氧基、-NH2、-NH(C1-8烷基)、-N(C1-8烷基)2、氰基、卤代基、-(C1-8)烷氧基-(卤代基)1-3、羟基和硝基；
R9为1至2个独立地选自下列的取代基：氢、-C1-8烷氧基、-NH2、-NH(C1-8烷基)、-N(C1-8烷基)2、氰基、(卤代基)1-3、羟基和硝基；
R2为1个选自下列的连接到碳或氮原子的取代基：氢、-C1-8烷基-R5、-C2-8烯基-R5、-C2-8炔基-R5、-C(O)H、-C(O)-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-8烷基-R9)、-C(O)-N(C1-8烷基-R9)2、-C(O)-NH(芳基-R8)、-C(O)-环烷基-R8、-C(O)-杂环基-R8、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-杂芳基-R8、-CO2H、-C(O)-O-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-SO2-(C1-8)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-环烷基-R6、-芳基-R6和-(C1-8)烷基-N-R7；条件是当R2连接到碳原子时，R2还选自-C1-8烷氧基-R5、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、氧代基、-杂环基-R6和-杂芳基-R6；
R3为1至3个独立地选自下列的连接到碳原子的取代基：氢、-C1-8烷基-R10、-C2-8烯基-R10、-C2-8炔基-R10、-C1-8烷氧基-R10、-C(O)H、-C(O)-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-8烷基-R9)、-C(O)-N(C1-8烷基-R9)2、-C(O)-环烷基-R8、-C(O)-杂环基-R8、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-杂芳基-R8、-C(NH)-NH2、-CO2H、-C(O)-O-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-SO2-(C1-8)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、-环烷基-R8、-杂环基-R8、-芳基-R8和-杂芳基-R8；
R4为1至4个独立地选自下列的连接到碳原子的取代基：氢、-C1-8烷基-R10、-C2-8烯基-R10、-C2-8炔基-R10、-C1-8烷氧基-R10、-C(O)H、-C(O)-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-8烷基-R9)、-C(O)-N(C1-8烷基-R9)2、-C(O)-环烷基-R8、-C(O)-杂环基-R8、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-杂芳基-R8、-C(NH)-NH2、-CO2H、-C(O)-O-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、- SH、-S-(C1-8)烷基-R10、-SO2-(C1-8)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-8烷基-R9)、-SO2-N(C1-8烷基-R9)2、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、-环烷基-R8、-杂环基-R8、-芳基-R8和-杂芳基-R8；
R10为1至2个独立地选自下列的取代基：氢、-NH2、-NH(C1-8烷基)、-N(C1-8烷基)2、氰基、(卤代基)1-3、羟基、硝基和氧代基；并且
Y和Z独立地选自O、S、(H，OH)和(H，H)；条件是Y和Z中的一者为O，并且另一者选自O、S、(H，OH)和(H，H)；以及它们药学上可接受的盐。
本发明的实施例包括其中R选自Ra、-C1-4烷基-Ra、-C2-4烯基-Ra、-C2-4炔基-Ra和氰基的式(II)的化合物。
本发明的实施例包括其中Ra选自杂环基、芳基和杂芳基的式(II)的化合物。
在一个实施例中，Ra选自二氢-吡喃基、苯基、萘基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、氮杂吲哚基、吲唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、二苯并呋喃基和二苯并噻吩基。
本发明的实施例包括其中R1选自氢、-C1-4烷基-R5、-C2-4烯基-R5、-C2-4炔基-R5、-C(O)-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-O-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-C(O)-NH(C1-4烷基-R9)、-C(O)-NH(芳基-R8)、-C(O)-N(C1-4烷基-R9)2、-SO2-(C1-4)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-环烷基-R6、-杂环基-R6、-芳基-R6和-杂芳基-R6的式(II)的化合物；其中杂环基和杂芳基经由杂环基或杂芳基环碳原子在一个位置处连接到氮杂吲哚氮原子。
在一个实施例中，R1选自氢、-C1-4烷基-R5、-芳基-R6和-杂芳基-R6；其中杂芳基经由杂芳基环碳原子在一个位置处连接到氮杂吲哚氮原子。
在一个实施例中，R1选自氢、-C1-4烷基-R5和-萘基-R6。
本发明的实施例包括其中R5为1至2个独立地选自下列的取代基的式(II)的化合物：氢、-O-(C1-4)烷基、-O-(C1-4)烷基-OH、-O-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基、-O-(C1-4)烷基-NH2、-O-(C1-4)烷基-NH(C1-4烷基)、-O-(C1-4)烷基-N(C1-4烷基)2、-O-(C1-4)烷基-S-(C1-4)烷基、-O-(C1-4)烷基-SO2-(C1-4)烷基、-O-(C1-4)烷基-SO2-NH2、-O-(C1-4)烷基-SO2-NH(C1-4烷基)、-O-(C1-4)烷基-SO2-N(C1-4烷基)2、-O-C(O)H、-O-C(O)-(C1-4)烷基、-O-C(O)-NH2、-O-C(O)-NH(C1-4烷基)、-O-C(O)-N(C1-4烷基)2、-O-(C1-4)烷基-C(O)H、-O-(C1-4)烷基-C(O)-(C1-4)烷基、-O-(C1-4)烷基-CO2H、-O-(C1-4)烷基-C(O)-O-(C1-4)烷基、-O-(C1-4)烷基- C(O)-NH2、-O-(C1-4)烷基-C(O)-NH(C1-4烷基)、-O-(C1-4)烷基-C(O)-N(C1-4烷基)2、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基、-CO2H、-C(O)-O-(C1-4)烷基、-C(O)-NH2、-C(NH)-NH2、-C(O)-NH(C1-4烷基)、-C(O)-N(C1-4烷基)2、-SH、-S-(C1-4)烷基、-S-(C1-4)烷基-S-(C1-4)烷基、-S-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基、-S-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基-OH、-S-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基-NH2、-S-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基-NH(C1-4烷基)、-S-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基-N(C1-4烷基)2、-S-(C1-4)烷基-NH(C1-4烷基)、-SO2-(C1-4)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-4烷基)、-SO2-N(C1-4烷基)2、-N-R7、氰基、(卤代基)1-3、羟基、硝基、氧代基、-环烷基-R6、-杂环基-R6、-芳基-R6和-杂芳基-R6。
在一个实施例中，R5为1至2个独立地选自下列的取代基：氢、-O-(C1-4)烷基、-N-R7、羟基和-杂芳基-R6。
在一个实施例中，R5为1至2个独立地选自下列的取代基：氢、-O-(C1-4)烷基、-N-R7、羟基、-咪唑基-R6、-***基-R6和-四唑基-R6。
本发明的实施例包括其中R6为1至4个独立地选自下列的连接到碳或氮原子的取代基的式(II)的化合物：氢、-C1-4烷基、-C2-4烯基、-C2-4炔基、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基、-CO2H、-C(O)-O-(C1-4)烷基、-C(O)-NH2、-C(NH)-NH2、-C(O)-NH(C1-4烷基)、-C(O)-N(C1-4)烷基)2、-SO2-(C1-4)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-4烷基)、-SO2-N(C1-4烷基)2、-(C1-4)烷基-N-R7、-(C1-4)烷基-(卤代基)1-3、-(C1-4)烷基-OH、-芳基-R8、-(C1-4)烷基-芳基-R8和-(C1-4)烷基-杂芳基-R8；条件是当R6连接到碳原子时，R6还选自-C1-4烷氧基、-(C1-4)烷氧基-(卤代基)1-3、-SH、-S-(C1-4)烷基、-N-R7、氰基、卤代基、羟基、硝基、氧代基和-杂芳基-R8。
在一个实施例中，R6为氢。
本发明的实施例包括其中R7为2个独立地选自下列的取代基的式(II)的化合物：氢、-C1-4烷基、-C2-4烯基、-C2-4炔基、-(C1-4)烷基-OH、-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基、-(C1-4)烷基-NH2、-(C1-4)烷基-NH(C1-4烷基)、-(C1-4)烷基-N(C1-4烷基)2、-(C1-4)烷基-S-(C1-4)烷基、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基、-C(O)-O-(C1-4)烷基、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-4烷基)、-C(O)-N(C1-4烷基)2、-SO2-(C1-4)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-4烷基)、-SO2-N(C1-4烷基)2、-C(N)-NH2、-环烷基-R8、-(C1-4)烷基-杂环基-R8、-芳基-R8、-(C1-4)烷基-芳基-R8和-(C1-4)烷基-杂芳基-R8。
在一个实施例中，R7为2个独立地选自下列的取代基：氢、-C1-4烷基、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基、-C(O)-O-(C1-4)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-4烷基)和-SO2-N(C1-4烷基)2。
本发明的实施例包括其中R8为1至4个独立地选自下列的连接到碳或氮原子的取代基的式(II)的化合物：氢、-C1-4烷基、-(C1-4)烷基-(卤代基)1-3和-(C1-4)烷基-OH；条件是当R8连接到碳原子时，R8还选自-C1-4烷氧基、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、氰基、卤代基、-(C1-4)烷氧基-(卤代基)1-3、羟基和硝基。
在一个实施例中，R8为氢。
本发明的实施例包括其中R9为1至2个独立地选自下列的取代基的式(II)的化合物：氢、-C1-4烷氧基、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、氰基、(卤代基)1-3、羟基和硝基。
在一个实施例中，R9为氢。
本发明的实施例包括其中R2为1个选自下列的连接到碳或氮原子的取代基的式(II)的化合物：氢、-C1-4烷基-R5、-C2-4烯基-R5、-C2-4炔基-R5、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-4烷基-R9)、-C(O)-N(C1-4烷基-R9)2、-C(O)-NH(芳基-R8)、-C(O)-环烷基-R8、-C(O)-杂环基-R8、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-杂芳基-R8、-CO2H、-C(O)-O-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-SO2-(C1-4)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-环烷基-R6、-芳基-R6和-(C1-4)烷基-N-R7；条件是当R2连接到碳原子时，R2还选自-C1-4烷氧基-R5、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、氧代基、-杂环基-R6和-杂芳基-R6。
在一个实施例中，R2为1个选自下列的连接到碳或氮原子的取代基：氢、-C1-4烷基-R5、-C2-4烯基-R5、-C2-4炔基-R5、-CO2H、-C(O)-O-(C1-4)烷基-R9、-环烷基-R6、-芳基-R6和-(C1-4)烷基-N-R7；条件是当R2连接到氮原子时，未形成季铵盐；并且条件是当R2连接到碳原子时，R2还选自-C1-4烷氧基-R5、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、氧代基、-杂环基-R6和-杂芳基-R6。
在一个实施例中，R2为1个选自下列的连接到碳或氮原子的取代基：氢、-C1-4烷基-R5和-芳基-R6；条件是当R2连接到氮原子时，未形成季铵盐；并且条件是当R2连接到碳原子时，R2还选自-N-R7、卤素、羟基和-杂芳基-R6。
本发明的实施例包括其中R3为1至3个独立地选自下列的连接到碳原子的取代基的式(II)的化合物：氢、-C1-4烷基-R10、-C2-4烯基-R10、-C2-4炔基-R10、-C1-4烷氧基-R10、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-4烷基-R9)、-C(O)-N(C1-4烷基-R9)2、-C(O)-环烷基-R8、-C(O)-杂环基-R8、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-杂芳基-R8、-C(NH)-NH2、-CO2H、-C(O)-O-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-SO2-(C1-8)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-N-R7、-(C1-4)烷基-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、-环烷基-R8、-杂环基-R8、-芳基-R8和-杂芳基-R8。
在一个实施例中，R3为1个选自下列的连接到碳原子的取代基：氢、-C1-4烷基-R10、-C2-4烯基-R10、-C2-4炔基-R10、-C1-4烷氧基-R10、-C(O)H、-CO2H、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、氰基、卤素、羟基和硝基。
在一个实施例中，R3为1个选自下列的连接到碳原子的取代基：氢、-C1-4烷基-R10、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、卤素和羟基。
本发明的实施例包括其中R4为1至4个独立地选自下列的连接到碳原子的取代基的式(II)的化合物：氢、-C1-4烷基-R10、-C2-4烯基-R10、-C2-4炔基-R10、-C1-4烷氧基-R10、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-4烷基-R9)、-C(O)-N(C1-4烷基-R9)2、-C(O)-环烷基-R8、-C(O)-杂环基-R8、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-杂芳基-R8、-C(NH)-NH2、-CO2H、-C(O)-O-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-SH、-S-(C1-4)烷基-R10、-SO2-(C1-4)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-4烷基-R9)、-SO2-N(C1-4烷基-R9)2、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、-环烷基-R8、-杂环基-R8、-芳基-R8和-杂芳基-R8。
在一个实施例中，R4为1至4个独立地选自下列的连接到碳原子的取代基：氢、-C1-4烷基-R10、-C2-4烯基-R10、-C2-4炔基-R10、-C1-4烷氧基-R10、-C(O)H、-CO2H、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、氰基、卤素、羟基、硝基、-环烷基、-杂环基、-芳基和-杂芳基。
在一个实施例中，R4为1至4个独立地选自下列的连接到碳原子的取代基：氢、C1-4烷基-R10、C1-4烷氧基-R10、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、卤素和羟基。
在一个实施例中，R4为1至4个独立地选自下列的连接到碳原子的取代基：氢、C1-4烷基-R10、C1-4烷氧基-R10、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、氯、氟和羟基。
本发明的实施例包括其中R10为1至2个独立地选自下列的取代基的式(II)的化合物：氢、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、氰基、(卤代基)1-3、羟基、硝基和氧代基。
在一个实施例中，R10为1至2个独立地选自氢和(卤代基)1-3的取代基。
在一个实施例中，R10为1至2个独立地选自氢和(氟代基)3的取代基。
本发明的实施例包括其中Y和Z独立地选自O、S、(H，OH)和(H，H)的式(II)的化合物；条件是Y和Z中的一者为O，并且另一者选自O、S、(H，OH)和(H，H)。
在一个实施例中，Y和Z独立地选自O和(H，H)；条件是Y和Z中的一者为O，并且另一者选自O和(H，H)。
在一个实施例中，Y和Z独立地选自O。
共同转让的美国专利7,125,878中公开了式(II)的化合物，将该专利的全部公开内容以引用的方式并入本文。
本发明的实例包括式(II)的化合物，其中所述化合物选自下表B中所列的化合物：
表B
式(II)的化合物
表B-续
本发明的实例包括其中化合物选自下列化合物的式(II)的化合物：
在一个实施例中，GSK-3B酶活性抑制剂为式(III)的化合物：
其中
A和E独立地选自氢取代的碳原子和氮原子；其中独立地选自1H-吲哚、1H-吡咯并[2，3-b]吡啶、1H-吡唑并[3，4-b]吡啶和1H-吲唑；
Z选自O；另选地，Z选自二氢；其中每个氢原子通过单键连接；
R4和R5独立地选自任选地被氧代基取代的C1-8烷基、C2-8烯基和C2-8炔基；
R2选自-C1-8烷基-、-C2-8烯基-、-C2-8炔基-、-O-(C1-8)烷基-O-、-O-(C2-8)烯基-O-、-O-(C2-8)炔基-O-、-C(O)-(C1-8)烷基-C(O)-(其中任何前述烷基、烯基和炔基连接基团为任选地被1至4个独立地选自下列的取代基取代的直碳链：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、-C(O)O-(C1-8)烷基、-C1-8烷基-C(O)O-(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基、羟基(C1-8)烷基和氧代基；并且其中任何前述烷基、烯基和炔基连接基团任选地被一个至两个独立地选自下列的取代基取代：杂环基、芳基、杂芳基、杂环基(C1-8)烷基、芳基(C1-8)烷基、杂芳基(C1-8)烷基、螺环烷基和螺杂环基(其中任何前述环烷基、杂环基、芳基和杂芳基取代基任选地被1和4个独立地选自下列的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和 C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基；并且其中任何前述杂环基取代基任选地被氧代基取代))、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基(其中环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被1至4个独立地选自下列的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基；并且其中杂环基任选地被氧代基取代)、-(O-(CH2)1-6)0-5-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-、-(O-(CH2)1-6)0-5-NR6-、-O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-NR6-、-(O-(CH2)1-6)0-5-S-、-O-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-S-、-NR6-、-NR6-NR7-、-NR6-(CH2)1-6-NR7-、-NR6-(CH2)1-6-NR7-(CH2)1-6-NR8-、-NR6-C(O)-、-C(O)-NR6-、-C(O)-(CH2)0-6-NR6-(CH2)0-6-C(O)-、-NR6-(CH2)0-6-C(O)-(CH2)1-6-C(O)-(CH2)0-6-NR7-、-NR6-C(O)-NR7-、-NR6-C(NR7)-NR8-、-O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-、-S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-、-S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-、-NR6-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-NR7-和-SO2-(其中R6、R7和R8独立地选自氢、C1-8烷基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基(C1-8)烷基、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、羟基(C1-8)烷基、杂环基(C1-8)烷基、芳基(C1-8)烷基和杂芳基(C1-8)烷基(其中前述杂环基、芳基和杂芳基取代基任选地被1至4个独立地选自下列的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基；并且其中杂环基任选地被氧代基取代))；条件是如果A和E选自氢取代的碳原子，则R2选自-C2-8炔基-、-O-(C1-8)烷基-O-、-O-(C2-8)烯基-O-、-O-(C2-8)炔基-O-、-C(O)-(C1-8)烷基-C(O)-(其中任何前述烷基、烯基和炔基连接基团为任选地被1至4个独立地选自下列的取代基取代的直碳链：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、-C(O)O-(C1-8)烷基、-C1-8烷基-C(O)O-(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢 和C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基、羟基(C1-8)烷基和氧代基；并且其中任何前述烷基、烯基和炔基连接基团任选地被1至2个独立地选自下列的取代基取代：杂环基、芳基、杂芳基、杂环基(C1-8)烷基、芳基(C1-8)烷基、杂芳基(C1-8)烷基、螺环烷基和螺杂环基(其中任何前述环烷基、杂环基、芳基和杂芳基取代基任选地被1至4个独立地选自下列的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基；并且其中任何前述杂环基取代基任选地被氧代基取代))、环烷基(其中环烷基任选地被1至4个独立地选自下列的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基)、-(O-(CH2)1-6)1-5-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-、-(O-(CH2)1-6)1-5-NR6-、-O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-NR6-、-(O-(CH2)1-6)0-5-S-、-O-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-S-、-NR6-NR7-、-NR6-(CH2)1-6-NR7-、-NR6-(CH2)1-6-NR7-(CH2)1-6-NR8-、-NR9-C(O)-、-C(O)-NR9-、-C(O)-(CH2)0-6-NR6-(CH2)0-6-C(O)-、-NR6-(CH2)0-6-C(O)-(CH2)1-6-C(O)-(CH2)0-6-NR7-、-NR6-C(O)-NR7-、-NR6-C(NR7)-NR8-、-O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-、-S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-、-S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-和-NR6-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-NR7-(其中R6、R7和R8独立地选自氢、C1-8烷基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基(C1-8)烷基、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、羟基(C1-8)烷基、杂环基(C1-8)烷基、芳基(C1-8)烷基和杂芳基(C1-8)烷基(其中前述杂环基、芳基和杂芳基取代基任选地被1至4个独立地选自下列的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基；并且其中杂环基任选地被氧代基取 代)；并且其中R9选自C1-8烷基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基(C1-8)烷基、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、羟基(C1-8)烷基、杂环基(C1-8)烷基、芳基(C1-8)烷基和杂芳基(C1-8)烷基(其中前述杂环基、芳基和杂芳基取代基任选地被1至4个独立地选自下列的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基；并且其中杂环基任选地被氧代基取代))；并且
R1和R3独立地选自氢、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基(其中烷基、烯基和炔基任选地被选自下列的取代基取代：C1-8烷氧基、烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、(卤代基)1-3、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基、羟基(C1-8)烷基和氧代基)、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基羰基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、C1-8烷硫基、芳基、杂芳基(其中芳基和杂芳基任选地被选自下列的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氨基(C1-8)烷基(其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基)、氨基(被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代)、氰基、卤素、羟基和硝基；以及它们药学上可接受的盐。
在一个实施例中，式(III)的化合物为选自下列的化合物以及它们药学上可接受的盐：
其中所有其他变量如之前定义。
在一个实施例中，式(III)的化合物为选自下列的化合物以及它们药学上可接受的盐：
其中所有其他变量如之前定义。
共同转让的美国专利6,828,327中公开了式(III)的化合物，将该专利的全部公开内容以引用的方式并入本文。
本发明的实例包括式(III)的化合物，其中所述化合物选自下表C中所列的化合物：
表C
式(III)的化合物
表C-续
本发明的一个实例包括其中化合物选自下列的式(III)的化合物：
本发明的其他实例包括选自下表D中所列的化合物的化合物：
表D
另外的化合物
表D-续
本发明的另一个实例包括选自下列的化合物：
适于根据本发明方法处理的细胞
适用于本发明的多能细胞表达至少一种选自下列的多能标志物：ABCG2、cripto、FoxD3、Connexin43、Connexin45、Oct4、SOX-2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tral-60和Tral-81。
在一个实施例中，多能细胞为胚胎干细胞。在一个替代实施例中，多能细胞为衍生自胚胎干细胞的表达多能标志物的细胞。在一个实施例中，胚胎干细胞为人胚胎干细胞。
人胚胎干细胞的分离、扩增和培养人胚胎干细胞的表征：人胚胎干细胞可表达阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4以及可用称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标志物中的一种或多种(Thomson等人，Science282：1145，1998)。人胚胎干细胞体外分化导致丧失SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的表达(如果存在的话)，并增加SSEA-1的表达。未分化的人胚胎干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，该酶可通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用Vector Red作为底物显影来检测，如生产商(Vector Laboratories，Burlingame Calif)所描述的。未分化的多能干细胞还通常表达Oct-4和TERT，这可通过RT-PCR检测。
增殖的人胚胎干细胞的另一理想表型为分化成所有三个胚层即内胚层、中胚层和外胚层组织的细胞的潜能。可以例如通过下列方式来确定干细胞的多能性：将细胞注射入SCID小鼠，用4％的多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后对其进行组织学检验，找出来自三个胚层的细胞类型的证据。另选地，多能性可通过这样来确定：产生胚状体并评价该胚状体是否存在与三个胚层相关的标志物。
可以使用标准G带显带技术并与相应灵长类物种的已公开的核型进行比较来分析增殖的人胚胎干细胞系的核型。希望获得具有“正常核型”(其意指细胞为整倍体)的细胞，其中所有人染色体都存在并且无明显的改变。
人胚胎干细胞的来源：可以使用的人胚胎干细胞的类型包括已建立的衍生自妊娠后形成的组织的人胚胎细胞系，这些组织包括在妊娠期任何时间(通常但不是必须在妊娠前大约10-12周)采集的胚前组织(例如胚泡)、胚胎组织或胎儿组织。非限制性实例是确立的人胚胎干细胞系或人胚胎生殖细胞系，例如人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCell)。还考虑的是在这类细胞的初始建立或稳定期间使用本发明的组合物，在这种情形中，源细胞将会为直接取自源组织的原代多能细胞。另外合适的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群体的细胞。同样合适的是突变型人胚胎干细胞系，例如BG0lv(BresaGen，Athens，GA)。
在一个实施例中，人胚胎干细胞如Thomson等人所述制备(美国专利5,843,780；Science 282：1145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38：133 ff.，1998；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：7844，1995)。
人胚胎干细胞的培养：在一个实施例中，将人胚胎干细胞在基本上不含饲养细胞，但仍支持人胚胎干细胞增殖而不进行大量分化的培养***中培养。使用通过此前培养另一细胞类型而调理过的培养基来支持人胚胎干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。另选地，用化学成分确定的培养基来支持人胚胎干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。
在一个替代实施例中，将人胚胎干细胞最初在饲养细胞层上培养，该饲养细胞可以多种方式支持人胚胎干细胞。然后将人胚胎转移至基本上无饲养细胞、但仍支持人胚胎干细胞增殖而不进行大量分化的培养***中培养。
适用于本发明的调理培养基的实例在US20020072117、US6642048、WO2005014799和Xu等人(Stem Cells 22：972-980，2004)中有所公开。
适用于本发明的化学成分确定的培养基的实例可在US20070010011找到。
合适的培养基可用下列组分制备，例如达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(DMEM)，Gibco#11965-092；敲除达尔伯克(氏)改良伊格 尔(氏)培养基(KO DMEM)，Gibco#10829-018；Ham′s F12/50％DMEM基础培养基；200mM L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050；β-巯基乙醇，Sigma#M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco#13256-029。
在一个实施例中，将人胚胎干细胞接种在合适的培养基质上，该培养基质在根据本发明方法处理前进行了处理。在一个实施例中，处理物为细胞外基质组分，例如衍生自基底膜或可形成粘附分子受体-配体配偶体的部分的那些。在一个实施例中，合适的培养基质为(Becton Dickenson)。为来自Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的可溶性制品，其在室温下胶凝而形成重构的基底膜。
其他胞外基质组分和组分混合物适合作为替代物。这可以包括层粘连蛋白、纤粘蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等等，它们可以单独使用或多种组合使用。
可在存在促进细胞存活、增殖和保持理想特性的培养基的情况下，以合适的分布将多能干细胞接种于所述基质上。所有这些特性可得益于对接种分布的认真考虑并可容易地由本领域技术人员确定。
衍生自人胚胎干细胞的表达多能标志物的细胞的分离、扩增和培养
在一个实施例中，可表达多能标志物的细胞通过包括以下步骤的方法而衍生自人胚胎干细胞：
a.培养人胚胎干细胞，
b.使所述人胚胎干细胞分化成表达定形内胚层细胞特征性标志物的细胞，以及
c.移出细胞，随后将它们在低氧条件下在组织培养基材上培养，在培养所述细胞之前该组织培养基材未用蛋白质或细胞外基质进行预处理。
在一个实施例中，可表达多能标志物的细胞通过包括以下步骤的方法而衍生自人胚胎干细胞：
a.培养人胚胎干细胞，以及
b.移出细胞，随后将它们在低氧条件下在组织培养基质上培养，该组织培养基质没有用蛋白质或细胞外基质进行预处理。
细胞在低氧条件下在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基质上的培养
在一个实施例中，将细胞在低氧条件下，在未用细胞外基质涂覆的组织培养基质上培养约1至约20天。在一个替代实施例中，将细胞在低氧条件下，在未用细胞外基质涂覆的组织培养基质上培养约5至约20天。在一个替代实施例中，将细胞在低氧条件下，在未用细胞外基质涂覆的组织培养基质上培养约15天。
在一个实施例中，低氧条件是约1％的O2至约20％的O2。在一个替代实施例中，低氧条件是约2％的O2至约10％的O2。在一个替代实施例中，低氧条件是约3％的O2。
可将细胞在低氧条件下，在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基质上在含有血清、激活素A和Wnt配体的培养基中培养。另选地，该培养基还可含有IGF-1。
该培养基可具有在约2％至约5％的范围内的血清浓度。在一个替代实施例中，血清浓度可以为约2％。
激活素A可以约1pg/mL至约100μg/mL的浓度使用。在一个替代实施例中，该浓度可以为约lpg/ml至约1μg/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约1pg/ml至约100ng/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约50ng/ml至约100ng/ml。在一个替代实施例中，该浓度可以为约100ng/ml。
Wnt配体可选自Wnt-1、Wnt-3a、Wnt-5a和Wnt-7a。在一个实施例中，Wnt配体为Wnt-1。在一个替代实施例中，Wnt配体为Wnt-3a。
Wnt配体可以约1ng/mL至约1000ng/mL的浓度使用。在一个替代实施例中，Wnt配体可以约10ng/mL至约100ng/mL的浓度使用。在一个实施例中，Wnt配体的浓度为约20ng/mL。
IGF-1可以约1ng/mL至约100ng/mL的浓度使用。在一个替代实施例中，IGF-1可以约10ng/mL至约100ng/mL的浓度使用。在一个实施例中，IGF-1的浓度为约50ng/mL。
通过本发明方法衍生的表达多能标志物的细胞能够在培养物中、在低氧条件下、在未用蛋白质或细胞外基质预处理过的组织培养基材上扩增。
通过本发明方法衍生的表达多能标志物的细胞可表达至少一种选自下列的多能标志物：ABCG2、cripto、FoxD3、Connexin43、Connexin45、 Oct4、SOX-2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tral-60和Tral-81。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的进一步分化
可以通过本领域的任何方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，还通过下述方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞：用成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除含有成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基，随后将细胞在含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基中进行培养。该方法的一个实例在D’Amour等人，Nature Biotechnology，24：1392-1401，(2006)有所公开。
胰腺内胚层谱特征性标志物选自Pdx1、HNF-1β，PTF1a、HNF-6、HB9和PROX1。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞为胰腺内胚层细胞。
表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的进一步分化
可以通过本领域的任何方法，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
胰腺内分泌谱系的特有标志物选自NGN-3、NeuroD、Islet-1、Pdx-1、NKX6.1、Pax-4、Ngn-3和PTF-1α。在一个实施例中，胰腺内分泌细胞能够表达以下激素中的至少一种：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰内分泌系特征性标志物的细胞为胰内分 泌细胞。胰腺内分泌细胞可以为胰腺激素表达细胞。另选地，胰腺内分泌细胞可以为胰腺激素分泌细胞。
在本发明的一个方面，胰腺内分泌细胞为表达β细胞谱系特征性标志物的细胞。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞表达Pdx1和至少一种下列转录因子：NGN-3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl-1、HNF-3β、MAFA、Pax4和Pax6。在本发明的一个方面，表达β细胞谱系特征性标志物的细胞为β细胞。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的检测
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成可通过在特定方案前后检测标志物的存在情况来确定。多能干细胞通常不表达这类标志物。因而，当细胞开始表达它们时即检测到多能干细胞的分化。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些包括定量逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern印迹、原位杂交(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑，2001增刊))以及免疫测定法，例如切片材料的免疫组织化学分析，Western印迹，以及用于未受损细胞中容易获得的标志物的流式细胞分析(FACS)(参见例如Harlow和Lane的“Using Antibodies：A Laboratory Manual”，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。
可用于检测某些蛋白质标志物的抗体的实例在表IA和表IB中列出。应该指出的是，针对表IA和表IB所列抗体识别的相同标志物的替代抗体是可获得的，或可容易开发的。还可以采用这种替代抗体来评价根据本发明的分离细胞中标志物的表达。
例如，多能干细胞的特征是本领域技术人员所熟知的，并且多能干细胞的其他特征不断地被鉴别。多能干细胞标志物包括(例如)一种或多种下列物质的表达：ABCG2、cripto、FoxD3、Connexin43、Connexin45、Oct4、Sox2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tral-60、Tral-81。
在用本发明方法处理多能干细胞后，可通过将处理过的细胞群体暴露于特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物(例如CXCR4)来进行纯化。
表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的检测
胰腺内胚层谱系特征性标志物是本领域技术人员所熟知的，并且其他胰腺内胚层谱系特征性标志物不断被鉴别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得胰腺内胚层谱系特征性特性。胰腺内胚层谱系的特异性标志物包括一种或多种转录因子，例如Hlxb9、PTF-1a、PDX-1、HNF-6、HNF-1β的表达。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些包括定量逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern印迹、原位杂交(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑，2001增刊))以及免疫测定法，例如切片材料的免疫组织化学分析，Western印迹、以及用于未受损细胞中容易获得的标志物的流式细胞分析(FACS)(参见例如Harlow和Lane的“Using Antibodies：A Laboratory Manual”，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。
可用于检测某些蛋白质标志物的抗体的实例在表IA和表IB中列出。应该指出的是，针对表IA和表IB所列抗体识别的相同标志物的替代抗体是可获得的，或可容易开发的。还可以采用这种替代抗体来评价根据本发明的分离细胞中标志物的表达。
表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的检测
胰腺内分泌谱系特征性标志物是本领域技术人员所熟知的，并且其他胰腺内分泌谱系特征性标志物不断被鉴别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得胰腺内分泌谱系特征性特性。胰腺内分泌谱系的特异性标志物包括一种或多种转录因子，例如NGN-3、NeuroD、Islet-1的表达。
β细胞谱系特征性标志物是本领域技术人员熟知的，并且其他的β细胞谱系特征性标志物有待继续辨别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得β细胞谱系特征性特性。β细胞谱系特异性特征包括一种或多种转录因子例如Pdx1(胰十二指肠同源盒基因-1)、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1、Pax6、Pax4、NeuroD、Hnflb、Hnf-6、Hnf-3β和MafA等的表达。这些转录因子在内分泌细胞鉴别领域中已得到公认。参见例如Edlund(Nature Reviews Genetics 3：524-632(2002))。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。另选地，可以通过将处理过的细胞群暴露于特别地识别以下蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来测定分化效率，该标志物由表达β细胞谱系特征性标志物的细胞表达。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些包括定量逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern印迹、原位杂交(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑，2001增刊))以及免疫测定法，例如切片材料的免疫组织化学分析，Western印迹，以及用于未受损细胞中容易获得的标志物的流式细胞分析(FACS)(参见例如Harlow和Lane的“Using Antibodies：A Laboratory Manual”，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。
可用于检测某些蛋白质标志物的抗体的实例在表IA和表IB中列出。应该指出的是，针对表IA和表IB所列抗体识别的相同标志物的替代抗体是可获得的，或可容易开发的。还可以采用这种替代抗体来评价根据本发明的分离细胞中标志物的表达。
本发明进一步通过下列实例举例说明，但不受限于下列实例。
实例1
人胚胎干细胞培养物
干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞的特征还在于：其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多种胚层的组 织和注入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的话)组织形成的能力。
从WiCell Research Institute，Inc.，(Madison，WI)获得人胚胎干细胞系H1、H7和H9，并根据该来源公司提供的说明进行培养。简而言之，在ES细胞培养基中，在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养细胞，所述培养基由补充有20％的Knockout血清替代品、100nM的MEM非必需氨基酸、0.5mM的β-巯基乙醇、2mM的L-谷氨酰胺和4ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(全部得自Invitrogen/GIBCO)的DMEM/F12(Invitrogen/GIBCO)组成。衍生自E13至13.5小鼠胚胎的MEF细胞从Charles River购得。将MEF细胞在补充有10％FBS(Hyclone)、2mM谷氨酰胺和100mM MEM非必需氨基酸的DMEM培养基中扩增。用10μg/ml丝裂霉素C(Sigma，St.Louis，MO)处理亚汇合的MEF细胞培养物3小时以使细胞***停滞，然后用胰蛋白酶进行处理并以2×104/cm2接种于0.1％的牛明胶涂覆的培养皿上。将传代两次至四次的MEF细胞用作饲养层。将铺在MEF细胞饲养层上的人胚胎干细胞在增湿的组织培养箱中于37℃在含5％的CO2的大气中培养。当汇合时(接种后大约5-7天)，用1mg/ml IV型胶原酶(Invitrogen/GIBCO)处理人胚胎干细胞5-10分钟，然后用5ml吸管轻轻刮落。将细胞以900rpm离心5分钟，然后将沉淀物以细胞在新鲜培养基中是1∶3至1∶4的比率重悬，并再次接种。
同时，将H1、H7和H9人胚胎干细胞也接种于包被有低生长因子MATRIGELTM(BD Biosciences)的1∶30稀释物的板上并在补充有8ng/mL的bFGFMEF调理培养基中培养。将在MATRIGELTM上培养的细胞用胶原酶IV(Invitrogen/GIBCO)、分散酶(BD Biosciences)或Liberase酶(Source)进行常规的传代。将该人胚胎干细胞培养中的一些在低氧条件(大约3％的O2)下孵育。
实例2
衍生自人胚胎干细胞的可表达多能标志物的细胞的衍生和培养
将来自人胚胎干细胞系H1和H9多个传代(第30-54代)的细胞在低氧条件(大约3％的O2)下培养至少三代。根据实例1将细胞在补充有8ng/mL bFGF的MEF-CM中培养并接种于包被有MATRIGEL的板上。
然后用补充有0.5％FBS、20ng/mL WNT-3a(目录号1324-WN-002，R&D Systems，MN)和100ng/mL激活素-A(R&D Systems，MN)的DMEM/F12培养基处理细胞两天，然后用补充有2％FBS和100ng/mL激活素-A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理3至4天。该方案导致定形内胚层标志物显著上调。
然后将细胞用TrypLETM Express溶液(Invitrogen，CA)处理5分钟。将脱离的细胞重悬于DMEM-F12+2％FBS培养基中，离心回收，并用血球计进行计数。将脱离的细胞以1000-10,000个细胞/cm2接种组织培养聚苯乙烯(TCPS)处理过的培养瓶上并在标准组织培养箱中，于37℃在低氧条件(大约3％的O2)下在DMEM-F12+2％FBS+100ng/mL激活素-A+20ng/mL WNT-3A中培养。该TCPS培养瓶未用MATRIGEL或其他细胞外基质蛋白包被。每日更换培养基。在某些培养物中，该培养基还补充有10-50ng/mL的IGF-I(胰岛素生长因子-I，购自R&D Systems，MN)或1X ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒，购自Invitrogen，Ca)。在某些培养条件下，基础培养基(DM-F12+2％FBS)还补充有0.1mM的巯基乙醇(Invitrogen，CA)和非必需氨基酸(1X，NEAA，购自Invitrogen，CA)。
在培养5至15天后，明显的细胞集落呈现出被大量扩大的细胞围绕，这些扩大的细胞看起来处于衰老状态。在大约50至60％汇合时，通过在室温下暴露于TrypLETM Express溶液5分钟来使培养物传代。将脱离的细胞重悬于DMEM-F12+2％的FBS培养基中，通过离心来回收，并以10,000个细胞/cm2接种于组织培养聚苯乙烯(TCPS)处理过的培养瓶上的DMEM-F12+2％FBS+100ng/ml的激活素A+20ng/ml的WNT-3A+/-50ng/ml的IGF-I中。该培养基将进一步称为“生长培养基”。
实例3A
从人胚胎干细胞的单细胞悬浮液衍生可表达多能标志物的细胞
将来自人胚胎干细胞系H1第33代和H9第45代的细胞在低氧条件(大约3％的O2)下培养至少三代。将细胞培养于补充有8ng/ml的bFGF的MEF-CM中，并根据实例1接种于MATRIGEL包被的板上。在大约60％汇合时，使培养物暴露于TrypLETM Express溶液(Invitrogen，CA)5分钟。将脱离的细胞重悬于DMEM-F12+2％的FBS培养基中，离心回收，并用血球计进行计数。将脱离的细胞以1000至10,000个细胞/cm2接种于组 织培养聚苯乙烯(TCPS)处理过的培养瓶上并在标准组织培养箱中，于37℃在低氧条件(大约3％的O2)下在DM-F12+2％的FBS+100ng/mL的激活素-A+20ng/mL的WNT-3A+50ng/mL的IGF-I+0.1mM巯基乙醇(Invitrogen，CA)和非必需氨基酸(1X，NEAA，购自Invitrogen，CA)中培养。该TCPS培养瓶未用MATRIGEL或其他细胞外基质蛋白包被。每日更换培养基。将第一代细胞称为P1。
实例3B
可用于衍生自人胚胎干细胞的可表达多能标志物的细胞的扩增的多种生长培养基
已经在下列培养基组合物中成功培养衍生自人胚胎干细胞的可表达多能标志物的细胞至少2-30代：
1.DM-F12+2％FBS+100ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A
2.DM-F12+2％FBS+100ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A+50ng/mL IGF-I
3.DM-F12+2％FBS+100ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A+10ng/mL IGF-I
4.DM-F12+2％FBS+50ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A+50ng/mL IGF-I
5.DM-F12+2％FBS+50ng/mL AA+10ng/mL WNT-3A+50ng/mL IGF-I
6.DM-F12+2％FBS+50ng/mL AA+20ng/mL WNT-3A+10ng/mL IGF-I
7.DM-F12+2％FBS+100ng/mL AA+10ng/mL WNT-3A+10ng/mL IGF-I
8.HEScGRO确定培养基(Chemicon，CA)
上面列出的培养基的基础组分可用类似的培养基例如RPMI、DMEM、CRML、KnockoutTMDMEM和F12替代。
实例4
GSK-3β酶活性抑制剂对表达多能标志物的细胞的活力的作用
可表达多能标志物的细胞的衍生和维持按已在实例2中描述的进行。使细胞在补充有2％FCS(Invitrogen)、100ng/mL激活素A、20ng/mL  Wnt-3a和50ng/mL IGF(R&D Biosystems)的DMEM：F12中生长。将细胞以10,000个细胞/cm2的密度接种于Falcon聚苯乙烯培养瓶上并在37℃、5％CO2、低氧条件下以单层培养物培养。在达到60-70％汇合后，通过用PBS洗涤该单层并用TrypLE(Invitrogen)孵育3-5分钟使细胞脱离以及单个细胞散开而进行传代。
用来自专有小分子库的测试化合物进行筛选，选择它们抑制GSK-3B酶活性的能力。使来自该库的化合物以96孔板的形式作为50mM HEPES、30％DMSO中的1mM母液供使用。对于测定法，将表达多能标志物的细胞洗涤、计数并在底部透明、孔黑色的96孔板(Costar)中以每孔20,000个细胞的接种密度接种于标准的培养基中。该接种密度此前确定可在过夜培养物中产生最佳的单层形成。在接下来的一天，移除培养基，用PBS漂洗细胞单层三次，并将测试化合物以80μl等分试样加入孔中，各等分试样以10μM的最终测定浓度稀释到测定培养基中。在测定的第2天，将培养基从每孔移除并更换为稀释到测定培养基中的测试化合物的新鲜等分试样。在培养的第1天和第2天，测定培养基包含补充有0.5％的FCS和100ng/ml的激活素A的DMEM：F12。在培养的第3天和第4天，将培养基从每孔移除并更换为补充有2％的FCS和100ng/ml的激活素A的DMEM：F12(无测试化合物)。在测定的第4天，将15μl的MTS(Promega)加至每个孔，将板在37℃下孵育1.5至4小时，然后在SpectraMax(Molecular Devices)仪器上于490nm处读取光密度。对每个重复组(duplicate set)，计算由平均值、标准偏差和变异系数组成的统计学度量。对每个试验孔，计算相对于阳性对照(在培养的第1和第2天用激活素A和Wnt3a处理的孔)的毒性。
表II为所有筛选结果的汇编。最初在该测定中以汇合单层的形式接种表达多能标志物的细胞；因此，结果代表四天培养期内的毒性量度。结果以对照的活力百分数表示，证明了在所使用的10μM筛选浓度下一些化合物具有不同程度的毒性。在此基于细胞的测定法中更大比例的化合物具有极少的毒性或者没有可测量的毒性。
将一小批选定的化合物在窄的剂量滴定范围内重复进行试验，这同样是使用表达多能标志物的细胞按上述类似测定法进行。表III为这些结果的汇总，显示了一系列毒性和非毒性化合物的可变剂量滴定效应。
实例5
用高内涵筛选测定法测定的GSK-3β酶活性抑制剂对人胚胎干细胞的分化和增殖的作用
人胚胎干细胞(H9系)的维持按实例1中所述进行。将细胞集落维持在未分化、多能状态，平均每四天传代一次。传代是这样进行：使细胞培养物在37℃下暴露于胶原酶溶液(1mg/mL；Sigma-Aldrich)10至30分钟，然后用移液管头小心刮擦以回收细胞簇。让细胞簇借重力沉淀下来，然后进行洗涤以除去残余的胶原酶。将细胞簇以1∶3的比例分传以进行常规维持培养，或以1∶1比例分传以立即进行测试。将所用的人胚胎干细胞系以小于50代的传代数目进行维持，并例行评估核型表型是否正常和支原体污染是否存在。
将本测定中所用的细胞簇均匀重悬于正常培养基中，并以100μl/孔的体积接种到MATRIGEL包被的96孔Packard VIEWPLATES(PerkinElmer)上。补充有8ng/mL的bFGF的MEF调理培养基用于初始接种和回收。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在整个测试期间，将板在加湿箱中维持在37℃、5％的CO2下。
用来自专有小分子库的测试化合物进行筛选，选择它们抑制GSK-3B酶活性的能力。使来自该库的化合物以96孔板的形式作为50mM HEPES、30％DMSO中的1mM母液供使用。将筛选化合物以三次重复组或两次重复组进行测试。如下开始初级筛选测定法：从每个孔抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清。回加80至100μl/孔的测试体积，其含有补充有0.5％的FCS(HyClone)和100ng/ml的激活素A(R&D Biosystems)及10μM的测试化合物的DMEM：F12基础培养基(Invitrogen)。阳性对照孔含有相同的基础培养基，但用10-20ng/mL的Wnt3a(R&D Biosystems)替代测试化合物。阴性对照孔含有基础培养基，同时含0.5％的FCS和仅激活素A(仅AA)，或者含0.5％的FCS但不含激活素A或Wnt3a(无处理)。在测定的第2天，抽吸各孔并再供应相同的溶液。在第3天和第4天，抽吸所有测定孔，并转换为补充有2％的FCS和100ng/ml的激活素A的DMEM：F12(无测试化合物或Wnt3a)；将平行阴 性对照孔保持在含2％的FCS和激活素A(仅AA)或者含2％的FCS但不含激活素A(无处理)的DMEM：F12基础培养基中。
在培养结束时，将96孔板中的细胞用4％多聚甲醛在室温下固定20分钟，用PBS洗涤三次，然后用0.5％Triton X-100在室温下透化处理20分钟。另选地，将细胞用冰冷70％乙醇在-20℃下固定过夜，用PBS洗涤三次，然后用Triton X-100在4℃下透化处理5分钟。固定和透化处理后，将细胞再次用PBS洗涤三次，然后用PBS中的4％的鸡血清(Invitrogen)在室温下封端30分钟。将一抗(山羊抗人Sox17和山羊抗人HNF-3β；R&D Systems)在4％鸡血清中1∶100稀释，在室温下加至细胞中保持一小时。将Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes)在PBS中1∶200稀释，并在用PBS洗涤细胞三次后加入。为对细胞核进行复染，在室温下加入5mM Draq5(Alexis Biochemicals)保持五分钟。将细胞用PBS洗涤一次，并保留在100mL/孔PBS中以用于成像。
用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)对细胞进行成像，对于用Draq5和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。用阳性对照孔和只用二抗染色作为无处理阴性对照的孔来优化曝光时间。每孔获取12个视野，以补偿处理和染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.6(GE Healthcare)软件测量Sox-17和HNF-3β的总细胞数目和总细胞密度。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的***情况。计算三次重复测试的平均值和标准偏差。总蛋白质表达以总强度或积分强度报告，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在300至3000之间且形状系数大于或等于0.4的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以Wnt3a/激活素A阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。
表IV为所有筛选结果的代表性汇总。表V得自该筛选的命中化合物的列表。强效命中化合物被定义为大于或等于对照值的120％；中效命中化合物被定义为落在对照值的60-120％的区间内。大量的化合物在本测定中能引起增殖响应。同时，大量的化合物在本测定中能引起分化，这由Sox17和Hnf-3b转录因子的蛋白质表达测量。
实例6
用读板仪测定法测定的GSK-3β酶活性抑制剂对人胚胎干细胞的增殖的作用
人胚胎干细胞(H9或H1系)的维持按实例1中所述进行。将细胞集落维持在未分化、多能状态，平均每四天传代一次。传代是这样进行：使细胞培养物在37℃下暴露于胶原酶溶液(1mg/mL；Sigma-Aldrich)10至30分钟，然后用移液管头小心刮擦以回收细胞簇。让细胞簇沉淀下来，洗涤以除去残余的胶原酶。将细胞簇以1∶3单层面积的比例分传以进行常规培养，或者以1∶1比例分传以立即进行测试。将用于这些实例的人胚胎干细胞系以小于50的传代数目进行维持，并例行评估核型表型是否正常和支原体污染是否存在。
将测定中所用的细胞簇均匀重悬于正常培养基中，并以100μl/孔的体积接种到MATRIGEL包被的96孔Packard VIEWPLATES(PerkinElmer)上。补充有8ng/mL bFGF的MEF调理培养基用于初始接种和回收。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在整个测试期间，将板在加湿箱中维持在37℃、5％CO2下。
如下开始初级筛选测定法：从每个孔抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清。回加80-100μl/孔的测试体积，其含有补充有0.5％的FCS(HyClone)和100ng/ml的激活素A(R&D Biosystems)及10μM测试化合物的DMEM：F12基础培养基(Invitrogen)。阳性对照孔含有相同的培养基，但用10-20ng/mL的Wnt3a(R&D Biosystems)替代测试化合物。阴性对照孔含有基础培养基加上0.5％的FCS，但无激活素A或Wnt3a。将筛选化合物重复测试三次。在测定的第2天，抽吸各孔并再供应相同的溶液。在第3和第4天，抽吸所有的测定孔并转成补充有2％FCS和100ng/mL激活素A的DMEM：F12，但阴性对照孔例外，其维持在含2％FCS的DMEM：F12基础培养基中。
在测定的第4天，将15-20μl的MTS(Promega)加至每个孔，将板在37℃下孵育1.5至4小时。用Molecular Devices的分光光度读板仪于OD490处测定密度读数。计算各重复组的平均读数以及标准偏差和变异系数。将实验孔与激活素A/Wnt3a阳性对照进行比较以计算对照值百分数，作为增殖的度量。
表VI为所有筛选结果的代表性汇总。表VII为得自该筛选的命中化合物的列表。强效命中化合物被定义为大于或等于对照值的120％；中效命中化合物被定义为落在对照值的60-120％的区间内。大量的化合物在本测定中能引起增殖响应。
实例7
GSK-3β酶抑制剂对人胚胎干细胞的分化和增殖的作用：先导化合物的剂量滴定
确认从初级筛选鉴定到的命中化合物的活性并通过剂量滴定进一步分析活性范围，这是重要的。获得选择的初级筛选命中化合物亚组的新样品干粉，将其增溶以制备新鲜储备试剂，并稀释到二级确认测定中以评估对人胚胎干细胞的作用。
两种人胚胎干细胞(H1和H9)按实例1中所述进行。将细菌集落在MatrigelTM(Invitrogen)包被的聚苯乙烯塑料(用MatrigelTM于DMEM：F12中的1∶30稀释液包被表面)上维持在未分化、多能状态。细胞平均每四天通过酶促传代进行分传。传代是这样进行的：使细胞单层在37℃下暴露于胶原酶溶液(1mg/ml；Sigma-Aldrich)10至60分钟，然后用移液管头小心刮擦以回收细胞簇。让细胞簇借重力沉淀下来，然后进行洗涤以除去残余的胶原酶。将细胞簇以1∶3比例分传以进行维持培养，或者以1∶1比例分传以随后进行测试。将人胚胎干细胞系以小于50代进行维持，并例行评估核型表型是否正常和支原体污染是否存在。
用于测定的细胞的制备：将用于本测试的H1或H9人胚胎干细胞系的细胞簇均匀重悬于培养基中，并以100μl/孔的体积接种到MatrigelTM包被的96孔Packard VIEWPLATES(PerkinElmer)上。补充有8ng/mL的bFGF的MEF调理培养基用于初始接种和增殖。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在接种后让培养物增殖一至三天，然后再开始测试。在测定期间，将板在加湿箱中维持在37℃、5％的CO2下。
化合物和测定培养基的制备：将从初级筛选得到的命中化合物亚组用于后续研究和随后的二级测定法。将二十个作为干粉可利用的化合物在DMSO中增溶成10mM原液，并在-20℃下干燥保藏备用。在临测定前，将化合物原液在补充有0.5％的FCS(HyClone)和100ng/ml的激活素A(R&D  Biosystems)的DMEM：F12基础培养基(Invitrogen)中进行1∶1000稀释以制备10μM测试化合物。将此稀释液同样在补充有0.5％的FCS(HyClone)和100ng/mL的激活素A的DMEM：F12基础培养基中进一步进行系列两倍稀释，以给每种化合物制作七点稀释曲线。
二级筛选测定法：如下开始测试：从每个孔中的细胞单层抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清。回加100μl/孔的测试体积，其含有培养基加上0.5％的FCS和不同浓度的抑制剂化合物加上100ng/mL的激活素A，无Wnt3a。阳性对照孔含有相同的基础培养基加上0.5％的FCS和加上20ng/mL的Wnt3a(R&D Biosystems)，无测试化合物。阴性对照孔含有相同的基础培养基加上0.5％的FCS，无激活素A、Wnt3a或测试化合物。在测定的第2天，将测定孔抽吸，并再次供应相同浓度的测试化合物或对照溶液。在第3和第4天，将所有的测定孔抽吸并供应补充有2％的FCS和100ng/mL的激活素A但无测试化合物或Wnt3a的DMEM：F12。在第3和第4天，将平行的阴性对照孔维持在补充有2％FCS的DMEM：F12基础培养基中。
测定评估：在培养结束时，将96孔板中的细胞用PBS洗涤两次，然后用4％多聚甲醛在室温下固定20分钟，用PBS再洗涤三次，然后用0.5％的Triton X-100在室温下透化处理20分钟。在固定和透化处理后，将细胞再用PBS洗涤三次，然后用PBS中的4％的鸡血清(Invitrogen)在室温下封端30分钟。将一抗(山羊抗人Sox17；R&D Systems)在4％的鸡血清中1∶100稀释，在室温下加至细胞中保持一小时。将Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes)在PBS中1∶200稀释，并在用PBS洗涤细胞三次后加至每个孔。为对细胞核进行复染，在室温下加入2μg/ml的Hoechst 33342(Invitrogen)保持十分钟。将细胞用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。
用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)对细胞进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。用阳性对照孔和只用二抗染色作为无处理阴性对照的孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿处理和染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件获得每个孔的总细胞数目和总Sox-17密度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100- 300)和核大小确定细胞核的***情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总Sox17蛋白质表达以总强度或积分强度报告，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在300至3000之间且形状系数大于或等于0.4的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以Wnt3a/激活素A阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。
结果
显示了八种GSK-3B酶抑制剂的结果，其中活性得到确认，效价通过本二级测定法中的滴定来确定。所给出的数据显示了化合物对细胞数目和Sox17强度的作用，其中各个数据点是从重复组取平均值，并据以挖掘来自相同视野和孔的每个参数。在本实例中，Sox17表达指示定形内胚层分化。用H1人胚胎干细胞系取得的细胞数目和Sox17强度的结果分别在表VIII和表IX中显示。H9人胚胎干细胞系的结果在表X和表XI中显示。将细胞数目和Sox17强度的阳性对照值归一化为1.000。两种细胞系的细胞数目阴性对照值均小于0.388，Sox17强度阴性对照值均小于0.065。在图1至8中提供了这些数据的图示，比较了两种人胚胎干细胞系，并包括每种化合物的剂量滴定。细胞数目示于分图A中；Sox 17强度示于分图B中。这些数据证实每种化合物都可促进hES细胞增殖和定形内胚层分化并确定了最佳活性范围。
实例8
GSK-3β酶抑制剂对与定形内胚层相关的另外标志物的表达的作用
证明除了转录因子Sox17之外先导化合物还能诱导其他指示定形内胚层分化的标志物，这是重要的。对选定的命中化合物亚组测试它们促进CXCR4(一种表面受体蛋白)和HNF-3β(一种同样与定形内胚层分化相关的转录因子)的表达的能力。
用于测定的细胞的制备：将用于本测定的H1人胚胎干细胞系的细胞簇均匀重悬于培养基中，并以2ml/孔的体积接种到MATRIGELTM包被(1∶30稀释)的6孔板(Corning)上。补充有8ng/mL的bFGF的MEF调理培养基用于初始接种和增殖。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在接种后让培养物增殖一至三天，然后再开始测试。在测试期间，将板维持在37℃、5％的CO2下。
化合物和测定培养基的制备：将从初级筛选得到的七个命中化合物亚组用于后续研究和随后的二级测定法。将纯化合物在DMSO中增溶成10mM原液，并在-20℃下干燥保藏备用。在临测试前，将化合物原液在补充有0.5％的FCS(HyClone)和100ng/ml的激活素A(R&D Biosystems)的DMEM：F12基础培养基(Invitrogen)中稀释至在1μM至5μM之间的终浓度。
测定：如下开始测试：从每个孔中的细胞单层抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清。回加2mL/孔的测试体积，其含有培养基加上0.5％的FCS和不同浓度的抑制剂化合物加上100ng/mL的激活素A，无Wnt3a。阳性对照孔含有相同的基础培养基和0.5％的FCS加上100ng/mL的激活素A和20ng/mL Wnt3a(R&D Biosystems)，无测试化合物。阴性对照孔含有基础培养基加上0.5％的FCS，无激活素A、Wnt3a或测试化合物。在测定的第2天，将测定孔抽吸，并再次供应相同浓度的测试化合物或对照溶液。在第3和第4天，将所有的测定孔抽吸并供应补充有2％的FCS和100ng/mL激活素A但无测试化合物或Wnt3a的DMEM：F12。在第3和第4天，将平行的阴性对照孔维持在补充有2％的FCS的DMEM：F12基础培养基中。
测定评估：在培养结束时，将细胞单层用PBS洗涤，并通过与TrypLETM Express溶液(Invitrogen，CA)一起孵育5分钟从培养板收获。将细胞重悬于MEF调理培养基中，分成两等份样品。一组样品进一步用各种荧光标记抗体染色，并进行流式细胞术(FACS)分析。另一平行组样品进行定量PCR。
将用于FACS分析的细胞洗涤到PBS中，并在4℃下在稀释于PBS和BD FACS染色缓冲液中的0.125％人γ球蛋白(Sigma目录号G-4386)中封端15分钟。用直接缀合到荧光标记且对CD9PE(BD#555372)、CD99PE(Caltag#MHCD9904)或CXCR-4APC(R&D Systems目录号FAB 173A)有特异性的抗体，将细胞的等分试样(各自大约为105个细胞)在4℃下染色30分钟。在BD FACS染色缓冲液中进行一系列洗涤后，将细胞用7-AAD(BD#559925)染色以评估活力，并在BD FACS Array仪器(BD Biosciences)上进行分析，收集至少10,000个事件。用针对PE和APC两者的小鼠IgG1k同种型对照抗体来测量(gate)阳性细胞百分数。
将用于定量PCR的细胞进行处理，以供RNA提取、纯化和cDNA合成。RNA样品通过在含乙醇的高盐缓冲液存在下结合到硅胶膜(RNA小量提取试剂盒(Rneasy Mini Kit)，Qiagen，CA)然后洗涤除去污染物来进行纯化。用TURBO无DNA试剂盒(Ambion，Inc.)进一步纯化RNA，将高质量的RNA在水中洗脱。通过分光光度计上的A260和A280读数评估收率和纯度。使用Applied Biosystems，Inc.(ABI，CA)大容量cDNA库试剂盒由纯化的RNA制成cDNA拷贝。
除非另有规定，否则实时PCR扩增和定量用的所有试剂均购自ABI。实时PCR反应用ABI PRISM 7900序列检测***进行。将TAQMAN UNIVERSAL PCR MASTER MIX(ABI，CA)与20ng的逆转录RNA一起用于20μl的总反应体积中。每种cDNA样品进行两次以校正吸量误差。引物和FAM标记的TAQMAN探针以200nm的浓度使用。用ABI之前开发的人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)内源对照品，将每种靶标基因的表达水平进行归一化。引物和探针组如下所列：CXCR4(Hs00237052)、GAPDH(4310884E)、HNF3b(Hs00232764)、SOX17(探针部分编号450025、正向和反向引物部分编号4304971)。
在50℃下初始孵育2分钟然后95℃下孵育10分钟后，将样品进行40次的两阶段循环：变性步骤，95℃下15秒，然后退火/延伸步骤，60℃下1分钟。用GENEAMP 7000序列检测***软件进行数据分析。对于每种引物/探针组，测定Ct值，Ct值为荧光强度达到扩增指数区中间的特定值时的循环数。用比较Ct方法来计算相对基因表达水平。简而言之，对于每种cDNA样品，从所关注基因的Ct值减去内源对照Ct值而得到变化的Ct值(ΔCt)。靶标的归一化量计算为2-ΔCt，假设扩增为100％的效率。最终的数据为相对于基准样品表示的。
结果
图9显示了在用各种GSK3抑制剂处理后，表达CXCR4表面受体的阳性细胞百分数的FACS分析。相对于无处理的细胞群体(阴性对照)或用激活素A和Wnt3处理的细胞(阳性对照)，显示了每个化合物的在1μM和5μM之间的两个浓度。图10的分图a、b和c显示了CXCR4、Sox17和HNF3β(它们也被认为是定形内胚层的标志物)的实时PCR数据。ACS和实时PCR分析都证明，相对于无处理的对照细胞，在分化的细胞中观察到 这些标志物的每一种都显著增加。这些定形内胚层标志物的表达水平在一些情况中与阳性对照相当，这表明GSK3抑制剂在这个分化阶段可代替Wnt3a。
实例9
GSK-3β酶抑制剂对胰腺内胚层的形成的作用
证明在定形内胚层诱导过程中用GSK3β抑制剂处理不会妨碍其他细胞类型(例如胰腺内胚层)随后的分化，这是重要的。对选择的命中化合物亚组测试它们促进PDX1和HNF6(与胰腺内胚层相关的关键转录因子)的表达的能力。
人胚胎干细胞(H1和H9系)的维持按实例1中所述进行。将细胞集落维持在未分化、多能状态，平均每四天传代一次。传代是这样进行的：使细胞培养物在37℃下暴露于胶原酶溶液(1mg/mL；Sigma-Aldrich)10至30分钟，然后用移液管头小心刮擦以回收细胞簇。让细胞簇借重力沉淀下来，然后进行洗涤以除去残余的胶原酶。将细胞簇以1∶3比例分传以进行例行维持培养，或者以1∶1比例分传以随后进行测试。将所用的人胚胎干细胞系以小于50代进行维持，并例行评估核型表型是否正常和支原体污染是否存在。
测定的细胞制备：将本测定中所用的H1人胚胎干细胞系的细胞簇均匀重悬于培养基中，并以1ml/孔的体积接种到MATRIGELTM包被(1∶30稀释)的24孔板(黑孔；Arctic White)上。补充有8ng/mL的bFGF的MEF调理培养基用于初始接种和增殖。在第二个实验，将来自H9系的hES细胞簇接种在96孔板中小鼠胚胎饲养(MEF)层上，所述层之前通过用丝裂霉素C(Sigma Chemical Co)处理使其失活。MEF单层上hES细胞的培养基组成是：DMEM：F12，含20％Knockout血清替代品(Invitrogen)，补充有极限必需氨基酸(Invitrogen)、L-谷氨酰胺和2-巯基乙醇。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在接种后让培养物增殖一至三天，然后再开始测试。在测试期间，将板维持在37℃、5％CO2下。
化合物和测定培养基的制备：将从初级筛选得到的八种命中化合物亚组用于后续研究和随后的二级测定法。将纯化合物在DMSO中增溶成 10mM原液，并在-20℃下干燥保藏备用。在临测定前，将化合物原液在含添加物的基础培养基中稀释至在1μM和5μM之间的最终浓度。
测定：在本测定法中，仅在定形内胚层分化步骤的第1和第2天包括GSK3抑制剂，取代Wnt3a。如以上实例7和实例8中所述，通过从每个孔中的细胞单层抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清，来开始MATRIGELTM上的胚胎干细胞培养。为分化成定形内胚层，加入测试体积(对于24孔板为0.5ml/孔，对于96孔板为100ml/孔)，其含有DMEM：F12培养基加上0.5％的FCS和不同浓度的抑制剂化合物加上100ng/ml的激活素A，无Wnt3a。阳性对照孔含有相同的基础培养基加上0.5％FCS和加上100ng/mL激活素A和20ng/mL Wnt3a(R&D Biosystems)，无测试化合物。阴性对照孔含有相同的基础培养基加上0.5％FCS，无激活素A、Wnt3a或测试化合物。在测定的第2天，将测定孔抽吸，并再次供应相同浓度的测试化合物或对照溶液。在第3和第4天，将所有的测定孔抽吸并供应补充有2％FCS和100ng/mL激活素A但无测试化合物或Wnt3a的DMEM：F12。在第3和第4天，将平行的阴性对照孔维持在补充有2％FCS的DMEM：F12基础培养基中。为分化成胰腺内胚层，将细胞处理三天，每日供应含有2％的FCS加上0.25μM KAAD环巴胺(EMD Biosciences)和20ng/ml的FGF7(R&D Biosystems)的DMEM：F12基础培养基。然后将细胞再处理四天，每日供应含有1％的B27(Invitrogen)、0.25μM的KAAD环巴胺、2μM视黄酸(RA；Sigma-Aldrich)和20ng/ml的FGF7的DMEM：F12。平行的阴性对照孔自始至终维持在补充有2％FCS(阶段2)或1％B27(阶段3)但无任何其他添加物的DMEM：F12基础培养基中。
使H9人胚胎细胞的平行培养物在MEF饲养层上生长并分化成胰腺内胚层。通过将细胞培养于包含RPMI-1640(Invitrogen)(第1天不含血清并且第2天和第3天含0.2％的FCS)及不同浓度的抑制剂化合物和100ng/ml的激活素A的培养基中，来实现定形内胚层分化。阳性对照孔含有相同的基础培养基(加入或不加入血清)，且含100ng/ml的激活素A和20ng/ml的Wnt3a(R&D Biosystems)，无测试化合物。阴性对照孔含有相同的基础培养基(加入或不加入血清)，无激活素A、Wnt3a或测试化合物。在测定的第2天，将测定孔抽吸，并再次供应相同浓度的测试化合物 或对照溶液。在第3天，将所有的测定孔抽吸并供应补充有2％FCS和100ng/mL激活素A但无测试化合物和Wnt3a的RPMI-1640。在第3天，将平行的阴性对照孔维持在补充有2％FCS的RPMI-1640基础培养基中。通过将细胞处理四天，每日供应含有2％FCS加上0.25mM KAAD环巴胺(EMD Biosciences)和50ng/mL FGF 10(R&D Biosystems)的RPMI-1640基础培养基，使细胞分化成胰腺内胚层。随后，将细胞处理三天时间，每日供应含有1％B27(Invitrogen)、0.25mM KAAD环巴胺、2mM视黄酸(RA；Sigma-Aldrich)和50ng/mL FGF10的RPMI-1640。平行的阴性对照孔自始至终维持在补充有2％FCS(阶段2)或1％B27(阶段3)但无任何其他添加物的RPMI-1640基础培养基中。
测定评估：在分化结束时，如实例8中所述通过实时PCR检查细胞的基因表达。对于高含量荧光染色，将96孔板中的细胞用PBS洗涤两次，然后用4％多聚甲醛在室温下固定20分钟，再用PBS洗涤三次，然后用0.5％Triton X-100在室温下透化处理20分钟。在固定和透化处理后，将细胞再用PBS洗涤三次，然后用PBS中的4％鸡血清(Invitrogen)在室温下封端30分钟。将一抗(山羊抗人Pdx1；Santa Cruz)在4％鸡血清中1∶100稀释，在室温下加到细胞中保持两小时。将Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes)在PBS中1∶200稀释，并在用PBS洗涤细胞三次后加至每个孔。为对细胞核进行复染，在室温下加入2μg/ml的Hoechst 33342(Invitrogen)保持十分钟。将细胞用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。
用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)对细胞进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。用阳性对照孔和只用二抗染色的孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿处理和染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件获得每个孔的总细胞数目和总Pdx1强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的***情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总Pdx1蛋白质表达以总强度或积分强度报告，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在300至3000之间的接受标准来去除背景。通过将每个 孔的总强度除以Wnt3a/激活素A阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。
将用于定量PCR的细胞在RLT缓冲液(Qiagen)中裂解，然后进行处理以供RNA提取、纯化和cDNA合成。RNA样品通过在含乙醇的高盐缓冲液存在下结合到硅胶膜(RNA小量提取试剂盒，Qiagen，CA)然后洗涤除去污染物来进行纯化。用TURBO无DNA试剂盒(Ambion，Inc.)进一步纯化RNA，将高质量的RNA在水中洗脱。通过分光光度计上的A260和A280读数评估收率和纯度。使用Applied Biosystems，Inc.(ABI，CA)大容量cDNA库试剂盒由纯化的RNA制成cDNA拷贝。
除非另有规定，否则实时PCR扩增和定量用的所有试剂均购自ABI。实时PCR反应用ABI PRISM 7900序列检测***进行。将TAQMAN UNIVERSAL PCR MASTER MIX与20ng的逆转录RNA一起用于20μl的总反应体积中。每种cDNA样品进行两次以校正吸量误差。引物和FAM标记的TAQMAN探针以200nm的浓度使用。用ABI之前开发的人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)内源对照品，将每种靶标基因的表达水平进行归一化。引物和探针组如下所列：PDX1(Hs00236830_ml)、GAPDH(4310884E)和HNF6(Hs00413554_ml)。
在50℃下初始孵育2分钟然后95℃下孵育10分钟后，将样品进行40次的两阶段循环：变性步骤，95℃下15秒，然后退火/延伸步骤，60℃下1分钟。用序列检测***软件进行数据分析。对于每种引物/探针组，测定Ct值，Ct值为荧光强度达到扩增指数区中间的特定值时的循环数。用比较Ct方法来计算相对基因表达水平。简而言之，对于每种cDNA样品，从所关注基因的Ct值减去内源对照Ct值而得到变化的Ct值(ΔCt)。靶标的归一化量计算为2-ΔCt，假设扩增为100％的效率。最终的数据为相对于基准样品表示的。
结果
显示了八种GSK-3β酶抑制剂的结果。图11中给出的来自高内涵分析的数据显示了对H1hES细胞系的细胞数目(分图A)和Pdx1强度(分图B)的作用，其中各个数据点是从重复样品组取平均值，并据以挖掘来自相同视野和孔的每个参数。图12给出的来自实时PCR的数据显示了这些小分子抑制剂对两种转录因子Pdx1和HNF6的诱导表达的作用。在这些实例 中，Pdx1和HNF6表达指示胰腺内胚层分化。GSK3β抑制剂化合物在这些测定法中在细胞谱系定向的早期阶段中能代替Wnt3a；所得细胞在分化的随后各相续阶段中能维持形成胰腺内胚层的能力。
实例10
GSK-3β酶抑制剂对胰腺内分泌细胞的形成的作用
证明在定形内胚层诱导过程中用GSK3抑制剂处理不会妨碍其他细胞类型(例如胰腺内分泌细胞或产胰岛素细胞)随后的分化，这是重要的。对选定的命中化合物亚组测试了它们促进胰激素的表达的能力。
用于测定的细胞制备：使按照实例9中所述的方法获得的胰腺内胚层细胞(在96孔板和24孔板上培养)随后暴露于会造成这些细胞分化成表达胰激素的细胞的物质。
如以上实例7-9中所述，通过从每个孔中的细胞单层抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清，来开始MATRIGELTM上的H1人胚胎干细胞系培养物的测定。为分化成定形内胚层，加入测试体积(对于24孔板为0.5ml/孔，对于96孔板为100ml/孔)，其含有培养基加上0.5％的FCS和不同浓度的抑制剂化合物加上100ng/ml的激活素A，无Wnt3a。阳性对照孔含有相同的基础培养基和0.5％FCS加上100ng/mL激活素A和20ng/mL Wnt3a(R&D Biosystems)，无测试化合物。阴性对照孔含有相同的基础培养基加上0.5％FCS，无激活素A、Wnt3a或测试化合物。在测定的第2天，将测定孔抽吸，并再次供应相同浓度的测试化合物或对照溶液。在第3、第4和第5天，将所有的测定孔抽吸并供应补充有2％FCS和100ng/mL激活素A但无测试化合物或Wnt3a的DMEM：F12。在第3、第4和第5天，将平行的阴性对照孔维持在补充有2％FCS的DMEM：F12基础培养基中。为分化成胰腺内胚层，将细胞处理三天，每日供应含有2％的FCS加上0.25μM的KAAD环巴胺(EMD Biosciences)和20ng/ml的FGF7(R&D Biosystems)的DMEM：F12基础培养基。随后将细胞处理四天，每日供应含有1％的B27(Invitrogen)、0.25μM的KAAD环巴胺、2μM视黄酸(RA；Sigma-Aldrich)和20ng/ml的FGF7的DMEM：F12。在阶段2和阶段3期间，将平行的阴性对照孔维持在补充有2％FCS或1％B27但无任何其他添加物的DMEM：F12基础培养基中。在胰腺内胚层形成后，再将细胞处理六天时 间，每日供应含有1％的B27加上1μM的DAPT(γ分泌酶抑制剂：EMD Biosciences)和50ng/ml的毒蜥外泌肽4(Sigma-Aldrich)的DMEM：F12基础培养基。然后将细胞再处理三天时间，每日供应含有1％B27、50ng/mL毒蜥外泌肽4、50ng/mL IGF(R&D Biosystems)和50ng/mL HGF(R&D Biosystems)的DMEM：F12基础培养基。平行的阴性对照孔自始至终维持在补充有1％B27但无任何其他添加物的DMEM：F12基础培养基中。
测定评估：在培养结束时，如以上实例7和实例8中所述对细胞进行处理，以通过高内涵分析或实时PCR进行评估。
对于高含量荧光染色，将96孔板中的细胞用PBS洗涤两次，然后用4％多聚甲醛在室温下固定20分钟，再用PBS洗涤三次，然后用0.5％Triton X-100在室温下透化处理20分钟。在固定和透化处理后，将细胞再用PBS洗涤三次，然后用PBS中的4％鸡血清(Invitrogen)在室温下封端30分钟。将一抗(豚鼠抗猪胰岛素，可与人胰岛素交叉反应；DakoCytomation)在4％山羊血清中1∶500稀释，然后在室温下加到细胞中保持一小时。将细胞用PBS洗涤三次，然后用在4％山羊血清中1∶100稀释的Alexa Fluor 488缀合的二抗(山羊抗豚鼠IgG；Molecular Probes)染色。为对细胞核进行复染，在室温下加入2μg/ml的Hoechst 33342(Invitrogen)保持十分钟。将细胞用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。
用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)对细胞进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。用阳性对照孔和只用二抗染色的孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿处理和染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件获得每个孔的总细胞数目和总胰岛素强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的***情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总胰岛素蛋白质表达以总强度或积分强度报告，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在300至3000之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以Wnt3a/激活素A阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个三次重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。
将用于定量PCR的细胞在RLT缓冲液(Qiagen)中裂解，然后进行处理以供RNA提取、纯化和cDNA合成。RNA样品通过在含乙醇的高盐缓冲液存在下结合到硅胶膜(RNA小量提取试剂盒，Qiagen，CA)然后洗涤除去污染物来进行纯化。用TURBO无DNA试剂盒(Ambion，INC)进一步纯化RNA，将高质量的RNA在水中洗脱。通过分光光度计上的A260和A280读数评估收率和纯度。使用Applied Biosystems，Inc.(ABI，CA)大容量cDNA库试剂盒由纯化的RNA制成cDNA拷贝。
除非另有规定，否则实时PCR扩增和定量用的所有试剂均购自ABI。实时PCR反应用7900序列检测***来进行。将UNIVERSAL PCR MASTER(ABI，CA)与20ng的逆转录RNA一起用于20ml的总反应体积中。每种cDNA样品进行两次以校正吸量误差。引物和FAM标记的探针以200nm的浓度使用。用ABI之前开发的人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)内源对照品，将每种靶标基因的表达水平进行归一化。引物和探针组如下所列：PDX1(Hs00236830_ml)、胰岛素(Hs00355773)和GAPDH(4310884E)。
在50℃下初始孵育2分钟然后95℃下孵育10分钟后，将样品进行40次的两阶段循环：变性步骤，95℃下15秒，然后退火/延伸步骤，60℃下1分钟。用序列检测***软件进行数据分析。对于每个引物/探针组，Ct值确定为荧光强度达到扩增指数区中部中的特定值时的循环数。使用比较性Ct法计算相对基因表达水平。简而言之，对于每种cDNA样品，从所关注基因的Ct值减去内源对照Ct值而得到变化的Ct值(ΔCt)。靶标的归一化量计算为2-ΔCt，假设扩增为100％的效率。最终的数据是相对于基准样品表示的。
结果
显示了八种GSK-3B酶抑制剂的结果。图13中给出的来自高内涵分析的数据显示了化合物对H1 hES细胞系的细胞数目(分图A)和胰岛素强度(分图B)的作用，其中各个数据点是从三次重复组取平均值，并据以挖掘来自相同视野和孔的每个参数。图14中给出的来自实时PCR的数据显示了化合物对Pdx1的胰岛素的作用。在这些实例中，Pdx1和胰岛素表达指示胰腺内胚层的分化和激素阳性细胞的产生。选择性GSK3β抑制剂化合物在这些测定法中在细胞谱系定向的早期阶段中能代替Wnt3a，且在分化的随 后各相续阶段中能诱导和维持胰岛β细胞形成，这由胰岛素免疫染色和实时PCR两者明显看出。
实例11
GSK-3β酶抑制剂对胰腺内分泌细胞的形成的累加效果
证明GSK3β抑制剂如果在细胞命运定向的多个时期中加入的话，该抑制剂所进行的处理能改进胰岛β细胞分化，这是重要的。将选定的命中化合物亚组通过相续定时加入以提高与胰腺激素阳性细胞相关的胰岛素表达来进行测试。
用于测定的细胞的制备：用于测定的细胞制备：使按照实例9和实例10中所述的方法获得的胰腺内胚层细胞(在96孔板上培养)随后暴露于会造成这些细胞分化成表达胰激素的细胞的物质。
如以上实例7-9中所述，通过从每个孔中的细胞单层抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清，来开始MATRIGELTM上的H1人胚胎干细胞系培养物的测定。为分化成定形内胚层，加入测试体积(对于96孔板为100μl/孔)，其含有培养基加上0.5％的FCS和不同浓度的抑制剂化合物加上100ng/ml激活素A，无Wnt3a。阳性对照孔含有相同的基础培养基和0.5％FCS加上100ng/mL激活素A和20ng/mL Wnt3a(R&D Biosystems)，无测试化合物。阴性对照孔含有相同的基础培养基加上0.5％FCS，无激活素A、Wnt3a或测试化合物。在测定的第2天，将测定孔抽吸，并再次供应相同浓度的测试化合物或对照溶液。在第3、第4和第5天，将所有的测定孔抽吸并供应补充有2％FCS和100ng/mL激活素A但无测试化合物或Wnt3a的DMEM：F12。在第3、第4和第5天，将平行的阴性对照孔维持在补充有2％FCS的DMEM：F12基础培养基中。为分化成胰腺内胚层，将细胞处理三天，每日供应含有2％的FCS加上0.25μM KAAD环巴胺(EMD Biosciences)和20ng/ml FGF7(R&D Biosystems)的DMEM：F12基础培养基。随后将细胞处理四天，每日供应含有1％的B27(Invitrogen)、0.25μM的KAAD环巴胺、2μM视黄酸(RA；Sigma-Aldrich)和20ng/ml的FGF7的DMEM：F12。平行的阴性对照孔自始至终维持在补充有2％FCS或1％B27但无任何其他添加物的DMEM：F12基础培养基中。在胰腺内胚层形成后，再将细胞处理六天时间，隔日供应含有1％的B27加上1μM的DAPT(γ分泌酶抑制剂：EMD  Biosciences)和50ng/ml的毒蜥外泌肽4(Sigma-Aldrich)及1μM的TGFβR1抑制剂II(ALK5抑制剂；EMD Biosciences)的DMEM：F12基出培养基。在这六天时间中，将GSK3β抑制剂回加到各个孔，在分化开始时使用与之前的处理相同的浓度。然后再将细胞处理三天时间，隔日供应含有1％B27、50ng/ml毒蜥外泌肽4、50ng/ml IGF(R&D Biosystems)和50ng/ml HGF(R&D Biosystems)及1μM TGFβR1抑制剂II(ALK5抑制剂；EMD Biosciences)的DMEM：F12基础培养基。在这三天时间中，将GSK3β抑制剂回加到各个孔，在分化开始时使用与之前的处理相同的浓度。平行组的阳性对照孔在20ng/mL Wnt3a存在或不存在下进行处理。平行的阴性对照孔自始至终维持在补充有1％B27但无任何其他添加物的DMEM：F12基础培养基中。
测定评估：在培养结束时，如以上实例10中所述对细胞进行处理，以通过高内涵分析进行评估。
对于高含量荧光染色，将96孔板中的细胞用PBS洗涤两次，然后用4％多聚甲醛在室温下固定20分钟，再用PBS洗涤三次，然后用0.5％Triton X-100在室温下透化处理20分钟。在固定和透化处理后，将细胞再用PBS洗涤三次，然后用PBS中的4％鸡血清(Invitrogen)在室温下封端30分钟。将一抗(豚鼠抗猪胰岛素，可与人胰岛素交叉反应；DakoCytomation)在4％山羊血清中1∶500稀释，然后在室温下加到细胞中保持一小时。将细胞用PBS洗涤三次，然后用在4％山羊血清中1∶100稀释的Alexa Fluor 488缀合的二抗(山羊抗豚鼠IgG；Molecular Probes)染色。为对细胞核进行复染，在室温下加入2μg/ml的Hoechst 33342(Invitrogen)保持十分钟。将细胞用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。
用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)对细胞进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。用阳性对照孔和只用二抗染色的孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿处理和染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件获得每个孔的总细胞数目和总胰岛素强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的***情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总胰岛素蛋 白质表达以总强度或积分强度报告，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在300至3000之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以Wnt3a/激活素A阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个三次重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。
结果
显示了八种GSK-3B酶抑制剂的结果。图15中给出的来自高内涵分析的数据显示了化合物对H1 hES细胞系的细胞数目(分图A)和胰岛素强度(分图B)的作用，其中各个数据点是从三次重复组取平均值，并据以挖掘来自相同视野和孔的每个参数。在这些实例中，胰岛素表达指示向激素阳性胰腺细胞的分化。选择性GSK3β抑制剂化合物在这些测定法中在细胞谱系定向的早期阶段中能代替Wnt3a，且当在分化的随后各阶段加入时似乎能促进胰岛素表达相对于阳性对照样品而言得到提高。
将本文通篇中所引用的出版物的全文以引用的方式并入本文。尽管已通过参考实例和优选的实施例对本发明的多个方面进行了阐述，但应当理解，本发明的范围不由前面的描述限定，而是由专利法的原理正确解释的权利要求书所限定。
表IA：用于FACS和免疫染色分析的一抗列表。
表IB：用于FACS和免疫染色分析的缀合二抗列表。
表II：GSK-3B酶活性抑制剂对表达多能标志物的细胞的活力的作用。
表II：续
表II：续
表II：续
表II：续
表II：续
表II：续
表II：续
表II：续
表III：GSK-3B酶活性抑制剂对表达多能标志物的细胞的活力的作用。
表III-续
表III-续
表VI：GSK-3B酶活性抑制剂对人胚胎干细胞增殖的作用。
表VI：续
表VI：续
表VI：续
表VI：续
表VI：续
表VI：续
表VI：续
表VI：续
表VII：GSK-3B酶活性抑制剂对人胚胎干细胞增殖的作用。
表VIII：GSK-3B酶活性抑制剂对人胚胎干细胞系H1增殖的剂量依赖性作用。
表IX：GSK-3B酶活性抑制剂对人胚胎干细胞系H1分化的剂量依赖性作用。
表X：GSK-3B酶活性抑制剂对人胚胎干细胞系H9细胞增殖的剂量依赖性作用。
表XI：GSK-3B酶活性抑制剂对人胚胎干细胞系H9细胞分化的剂量依赖性作用。
表XII-表格上化合物与化合物之间的关系
化合物编号 表格化合物
15 C-12
230 D-13a
221 D-6a
232 D-8a
165 C-6
223 D-11a
47 B-40
6 C-2
163 C-5
185 B-16
231 D-7a
2 C-1
148 D-31a
10 C-29
16 B-11
226 D-12a
11 C-26
165 C-6
163 C-5
206 D-4a
6 C-2
47 B-40
2 C-1
230 D-13a
15 C-12
185 B-16
232 D-8a
10 C-29
11 C-26
3 C-31
11 C-26
12 B-2
17 B-14
18 B-15
19 B-21
22 B-30
23 B-33
26 B-34
27 B-36
28 D-9a
表XII续
化合物编号 表格化合物
33 B-29
34 B-28
48 B-41
52 D-15a
55 D-16a
74 B-42
78 D-17a
82 D-18a
94 B-43
98 B-44
101 D-19a
103 D-20a
105 D-21a
110 D-22a
111 D-23a
112 D-24a
127 D-25a
133 D-26a
136 D-27a
139 D-28a
144 D-29a
145 D-30a
150 D32a
158 A-5
164 C-4
168 C-3
175 B-4
180 C-28
182 B-18
183 B-19
198 D-2A
216 D-5A
233 D-14a
241 B-25
242 B-24
2 C-1
6 C-2
10 C-29
11 C-26
15 C-12
16 B-11
47 B-40
148 D-31A
表XII续
化合物编号 表格化合物
163 C-5
165 C-6
166 D-3a
185 B-16
206 D-4A
221 D-6a
223 D-11a
226 D-12a
230 D-13a
231 D-7a
232 D-8a
表XIII-所测试的其他化合物的化学式

Claims (126)

1.一种使多能细胞扩增和分化的方法，所述方法包括以下步骤：
a. 培养多能细胞，以及
b. 用GSK-3B酶活性抑制剂处理所述多能细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能细胞为胚胎干细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能细胞为衍生自胚胎干细胞的表达多能标志物的细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述表达多能标志物的细胞表达选自下列多能标志物中的至少一种：ABCG2、cripto、FoxD3、Connexin43、Connexin45、Oct4、SOX-2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60和Tra1-81。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中将所述多能细胞用GSK-3B酶活性抑制剂处理约1至约72小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其中将所述多能细胞用GSK-3B酶活性抑制剂处理约12至约48小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其中将所述多能细胞用GSK-3B酶活性抑制剂处理约48小时。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述GSK-3B酶活性抑制剂以约100nM至约100μM的浓度使用。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述GSK-3B酶活性抑制剂以约1μM至约10μM的浓度使用。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述GSK-3B酶活性抑制剂以约10μM的浓度使用。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述GSK-3B酶活性抑制剂为式(I)的化合物：
式(I)。
13.根据权利要求12所述的方法，其中R1为苯基；取代的苯基，其中所述苯基取代基选自C1-5烷基、卤素、硝基、三氟甲基和腈；或嘧啶基。
14.根据权利要求12所述的方法，其中R2为苯基；取代的苯基，其中所述苯基取代基选自C1-5烷基、卤素、硝基、三氟甲基和腈；或任选地被C1-4烷基取代的嘧啶基，并且R1和R2中的至少一者为嘧啶基。
15.根据权利要求12所述的方法，其中R3为氢；2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基；C1-5烷氧基羰基；芳氧基羰基；芳基C1-5烷氧基羰基；芳基C1-5烷基；取代的芳基C1-5烷基，其中所述一个或多个芳基取代基独立地选自C1-5烷基、C1-5烷氧基、卤素、氨基、C1-5烷基氨基和二C1-5烷基氨基；邻苯二甲酰亚胺基C1-5烷基；氨基C1-5烷基；二氨基C1-5烷基；琥珀酰亚胺基C1-5烷基；C1-5烷基羰基；芳基羰基；C1-5烷基羰基C1-5烷基；和芳氧基羰基C1-5烷基。
16.根据权利要求12所述的方法，其中R4为-(A)-(CH2)q-X。
17.根据权利要求16所述的方法，其中A为亚乙烯基、亚乙炔基或。
18.根据权利要求17所述的方法，其中R5选自氢、C1-5烷基、苯基和苯基C1-5烷基。
19.根据权利要求16所述的方法，其中q为0-9。
20.根据权利要求16所述的方法，其中X选自氢；羟基；乙烯基；取代的乙烯基，其中一个或多个乙烯基取代基各自选自氟、溴、氯和碘；乙炔基；取代的乙炔基，其中所述乙炔基取代基选自氟、溴、氯和碘；C1-5烷基；取代的C1-5烷基，其中所述一个或多个烷基取代基各自选自C1-5烷氧基、三卤代烷基、邻苯二甲酰亚胺基和氨基；C3-7环烷基；C1-5烷氧基；取代的C1-5烷氧基，其中所述烷基取代基选自邻苯二甲酰亚胺基和氨基；邻苯二甲酰亚胺基氧基；苯氧基；取代的苯氧基，其中所述一个或多个苯基取代基各自选自C1-5烷基、卤素和C1-5烷氧基；苯基；取代的苯基，其中所述一个或多个苯基取代基各自选自C1-5烷基、卤素和C1-5烷氧基；芳基C1-5烷基；取代的芳基C1-5烷基，其中所述一个或多个芳基取代基各自选自C1-5烷基、卤素和C1-5烷氧基；芳氧基C1-5烷基氨基；C1-5烷基氨基；二C1-5烷基氨基；腈；肟；苄氧基亚氨基；C1-5烷氧基亚氨基；邻苯二甲酰亚胺基；琥珀酰亚胺基；C1-5烷基羰氧基；苯基羰氧基；取代的苯基羰氧基，其中所述一个或多个苯基取代基各自选自C1-5烷基、卤素和C1-5烷氧基；苯基C1-5烷基羰氧基，其中所述一个或多个苯基取代基各自选自C1-5烷基、卤素和C1-5烷氧基；氨基羰氧基；C1-5烷基氨基羰氧基；二C1-5烷基氨基羰氧基；C1-5烷氧基羰氧基；取代的C1-5烷氧基羰氧基，其中所述一个或多个烷基取代基各自选自甲基、乙基、异丙基和己基；苯氧基羰氧基；取代的苯氧基羰氧基，其中所述一个或多个苯基取代基各自选自C1-5烷基、C1-5烷氧基和卤素；C1-5烷硫基；取代的C1-5烷硫基，其中所述烷基取代基选自羟基和邻苯二甲酰亚胺基；C1-5烷基磺酰基；苯基磺酰基；取代的苯基磺酰基，其中所述一个或多个苯基取代基各自选自溴、氟、氯、C1-5烷氧基和三氟甲基；条件是如果A为，q为0，并且X为H，则R3可不为2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基；以及它们药学上可接受的盐。
21.根据权利要求12所述的方法，其中R1为取代的苯基，并且R2为嘧啶-3-基。
22.根据权利要求12所述的方法，其中R1为4-氟苯基。
23.根据权利要求12所述的方法，其中R3为氢、芳基C1-5烷基或取代的芳基C1-5烷基。
24.根据权利要求12所述的方法，其中R3为氢或苯基C1-5烷基。
25.根据权利要求16所述的方法，其中A为亚乙炔基，并且q为0-5。
26.根据权利要求16所述的方法，其中X为琥珀酰亚胺基、羟基、甲基、苯基、C1-5烷基磺酰基、C3-6环烷基、C1-5烷基羰氧基、C1-5烷氧基、苯基羰氧基、C1-5烷基氨基、二C1-5烷基氨基或腈。
27.根据权利要求12所述的方法，其中式I的化合物为4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基丁炔-1-基)-1-(3-苯基丙基)-5-(4-吡啶基)咪唑。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述GSK-3B酶活性抑制剂为式(II)的化合物：
式(II)。
29.根据权利要求28所述的方法，其中R选自Ra、-C1-8烷基-Ra、-C2-8烯基-Ra、-C2-8炔基-Ra和氰基。
30.根据权利要求29所述的方法，其中Ra选自环烷基、杂环基、芳基和杂芳基。
31.根据权利要求28所述的方法，其中R1选自氢、-C1-8烷基-R5、-C2-8烯基-R5、-C2-8炔基-R5、-C(O)-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-O-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-C(O)-NH(C1-8烷基-R9)、-C(O)-NH(芳基-R8)、-C(O)-N(C1-8烷基-R9)2、-SO2-(C1-8)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-环烷基-R6、-杂环基-R6、-芳基-R6和-杂芳基-R6；其中杂环基和杂芳基经由杂环基或杂芳基环碳原子在一个位置处连接到氮杂吲哚氮原子。
32.根据权利要求31所述的方法，其中R5为1至2个独立地选自下列的取代基：氢、-O-(C1-8)烷基、-O-(C1-8)烷基-OH、-O-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基、-O-(C1-8)烷基-NH2、-O-(C1-8)烷基-NH(C1-8烷基)、-O-(C1-8)烷基-N(C1-8烷基)2、-O-(C1-8)烷基-S-(C1-8)烷基、-O-(C1-8)烷基-SO2-(C1-8)烷基、-O-(C1-8)烷基-SO2-NH2、-O-(C1-8)烷基-SO2-NH(C1-8烷基)、-O-(C1-8)烷基-SO2-N(C1-8烷基)2、-O-C(O)H、-O-C(O)-(C1-8)烷基、-O-C(O)-NH2、-O-C(O)-NH(C1-8烷基)、-O-C(O)-N(C1-8烷基)2、-O-(C1-8)烷基-C(O)H、-O-(C1-8)烷基-C(O)-(C1-8)烷基、-O-(C1-8)烷基-CO2H、-O-(C1-8)烷基-C(O)-O-(C1-8)烷基、-O-(C1-8)烷基-C(O)-NH2、-O-(C1-8)烷基-C(O)-NH(C1-8烷基)、-O-(C1-8)烷基-C(O)-N(C1-8烷基)2、-C(O)H、-C(O)-(C1-8)烷基、-CO2H、-C(O)-O-(C1-8)烷基、-C(O)-NH2、-C(NH)-NH2、-C(O)-NH(C1-8烷基)、-C(O)-N(C1-8烷基)2、-SH、-S-(C1-8)烷基、-S-(C1-8)烷基-S-(C1-8)烷基、-S-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基、-S-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基-OH、-S-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基-NH2、-S-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基-NH(C1-8烷基)、-S-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基-N(C1-8烷基)2、-S-(C1-8)烷基-NH(C1-8烷基)、-SO2-(C1-8)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-8烷基)、-SO2-N(C1-8烷基)2、-N-R7、氰基、(卤代基)1-3、羟基、硝基、氧代基、-环烷基-R6、-杂环基-R6、-芳基-R6和-杂芳基-R6。
33.根据权利要求31所述的方法，其中R6为1至4个独立地选自下列的连接到碳或氮原子的取代基：氢、-C1-8烷基、-C2-8烯基、-C2-8炔基、-C(O)H、-C(O)-(C1-8)烷基、-CO2H、-C(O)-O-(C1-8)烷基、-C(O)-NH2、-C(NH)-NH2、-C(O)-NH(C1-8烷基)、-C(O)-N(C1-8)烷基)2、-SO2-(C1-8)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-8烷基)、-SO2-N(C1-8烷基)2、-(C1-8)烷基-N-R7、-(C1-8)烷基-(卤代基)1-3、-(C1-8)烷基-OH、-芳基-R8、-(C1-8)烷基-芳基-R8和-(C1-8)烷基-杂芳基-R8；条件是当R6连接到碳原子时，R6还选自-C1-8烷氧基、-(C1-8)烷氧基-(卤代基)1-3、-SH、-S-(C1-8)烷基、-N-R7、氰基、卤代基、羟基、硝基、氧代基和-杂芳基-R8。
34.根据权利要求33所述的方法，其中R7为2个独立地选自下列的取代基：氢、-C1-8烷基、-C2-8烯基、-C2-8炔基、-(C1-8)烷基-OH、-(C1-8)烷基-O-(C1-8)烷基、-(C1-8)烷基-NH2、-(C1-8)烷基-NH(C1-8烷基)、-(C1-8)烷基-N(C1-8烷基)2、-(C1-8)烷基-S-(C1-8)烷基、-C(O)H、-C(O)-(C1-8)烷基、-C(O)-O-(C1-8)烷基、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-8烷基)、-C(O)-N(C1-8烷基)2、-SO2-(C1-8)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-8烷基)、-SO2-N(C1-8烷基)2、-C(N)-NH2、-环烷基-R8、-(C1-8)烷基-杂环基-R8、-芳基-R8、-(C1-8)烷基-芳基-R8和-(C1-8)烷基-杂芳基-R8。
35.根据权利要求31所述的方法，其中R8为1至4个独立地选自下列的连接到碳或氮原子的取代基：氢、-C1-8烷基、-(C1-8)烷基-(卤代基)1-3和-(C1-8)烷基-OH；条件是当R8连接到碳原子时，R8还选自-C1-8烷氧基、-NH2、-NH(C1-8烷基)、-N(C1-8烷基)2、氰基、卤代基、-(C1-8)烷氧基-(卤代基)1-3、羟基和硝基。
36.根据权利要求31所述的方法，其中R9为1至2个独立地选自下列的取代基：氢、-C1-8烷氧基、-NH2、-NH(C1-8烷基)、-N(C1-8烷基)2、氰基、(卤代基)1-3、羟基和硝基。
37.根据权利要求28所述的方法，其中R2为1个选自下列的连接到碳或氮原子的取代基：氢、-C1-8烷基-R5、-C2-8烯基-R5、-C2-8炔基-R5、-C(O)H、-C(O)-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-8烷基-R9)、-C(O)-N(C1-8烷基-R9)2、-C(O)-NH(芳基-R8)、-C(O)-环烷基-R8、-C(O)-杂环基-R8、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-杂芳基-R8、-CO2H、-C(O)-O-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-SO2-(C1-8)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-环烷基-R6、-芳基-R6和-(C1-8)烷基-N-R7；条件是当R2连接到碳原子时，R2还选自-C1-8烷氧基-R5、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、氧代基、-杂环基-R6和-杂芳基-R6。
38.根据权利要求28所述的方法，其中R3为1至3个独立地选自下列的连接到碳原子的取代基：氢、-C1-8烷基-R10、-C2-8烯基-R10、-C2-8炔基-R10、-C1-8烷氧基-R10、-C(O)H、-C(O)-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-8烷基-R9)、-C(O)-N(C1-8烷基-R9)2、-C(O)-环烷基-R8、-C(O)-杂环基-R8、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-杂芳基-R8、-C(NH)-NH2、-CO2H、-C(O)-O-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-SO2-(C1-8)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、-环烷基-R8、-杂环基-R8、-芳基-R8和-杂芳基-R8。
39.根据权利要求38所述的方法，其中R10为1至2个独立地选自下列的取代基：氢、-NH2、-NH(C1-8烷基)、-N(C1-8烷基)2、氰基、(卤代基)1-3、羟基、硝基和氧代基。
40.根据权利要求28所述的方法，其中R4为1至4个独立地选自下列的连接到碳原子的取代基：氢、-C1-8烷基-R10、-C2-8烯基-R10、-C2-8炔基-R10、-C1-8烷氧基-R10、-C(O)H、-C(O)-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-8烷基-R9)、-C(O)-N(C1-8烷基-R9)2、-C(O)-环烷基-R8、-C(O)-杂环基-R8、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-杂芳基-R8、-C(NH)-NH2、-CO2H、-C(O)-O-(C1-8)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-SH、-S-(C1-8)烷基-R10、-SO2-(C1-8)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-8烷基-R9)、-SO2-N(C1-8烷基-R9)2、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、-环烷基-R8、-杂环基-R8、-芳基-R8和-杂芳基-R8。
41.根据权利要求40所述的方法，其中R10为1至2个独立地选自下列的取代基：氢、-NH2、-NH(C1-8烷基)、-N(C1-8烷基)2、氰基、(卤代基)1-3、羟基、硝基和氧代基。
42.根据权利要求28所述的方法，其中Y和Z独立地选自O、S、(H,OH)和(H,H)；条件是Y和Z中的一者为O，并且另一者选自O、S、(H,OH)和(H,H)；以及它们药学上可接受的盐。
43.根据权利要求28所述的方法，其中R选自Ra、-C1-4烷基-Ra、-C2-4烯基-Ra、-C2-4炔基-Ra和氰基。
44.根据权利要求29所述的方法，其中Ra选自杂环基、芳基和杂芳基。
45.根据权利要求29所述的方法，Ra选自二氢-吡喃基、苯基、萘基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、氮杂吲哚基、吲唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、二苯并呋喃基和二苯并噻吩基。
46.根据权利要求28所述的方法，其中R1选自氢、-C1-4烷基-R5、-C2-4烯基-R5、-C2-4炔基-R5、-C(O)-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-O-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-C(O)-NH(C1-4烷基-R9)、-C(O)-NH(芳基-R8)、-C(O)-N(C1-4烷基-R9)2、-SO2-(C1-4)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-环烷基-R6、-杂环基-R6、-芳基-R6和-杂芳基-R6；其中杂环基和杂芳基经由杂环基或杂芳基环碳原子在一个位置处连接到氮杂吲哚氮原子。
47.根据权利要求28所述的方法，其中R1选自氢、-C1-4烷基-R5、-芳基-R6和-杂芳基-R6；其中杂芳基经由杂芳基环碳原子在一个位置处连接到氮杂吲哚氮原子。
48.根据权利要求28所述的方法，其中R1选自氢、-C1-4烷基-R5和-萘基-R6。
49.根据权利要求31所述的方法，其中R5为1至2个独立地选自下列的取代基：氢、-O-(C1-4)烷基、-O-(C1-4)烷基-OH、-O-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基、-O-(C1-4)烷基-NH2、-O-(C1-4)烷基-NH(C1-4烷基)、-O-(C1-4)烷基-N(C1-4烷基)2、-O-(C1-4)烷基-S-(C1-4)烷基、-O-(C1-4)烷基-SO2-(C1-4)烷基、-O-(C1-4)烷基-SO2-NH2、-O-(C1-4)烷基-SO2-NH(C1-4烷基)、-O-(C1-4)烷基-SO2-N(C1-4烷基)2、-O-C(O)H、-O-C(O)-(C1-4)烷基、-O-C(O)-NH2、-O-C(O)-NH(C1-4烷基)、-O-C(O)-N(C1-4烷基)2、-O-(C1-4)烷基-C(O)H、-O-(C1-4)烷基-C(O)-(C1-4)烷基、-O-(C1-4)烷基-CO2H、-O-(C1-4)烷基-C(O)-O-(C1-4)烷基、-O-(C1-4)烷基-C(O)-NH2、-O-(C1-4)烷基-C(O)-NH(C1-4烷基)、-O-(C1-4)烷基-C(O)-N(C1-4烷基)2、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基、-CO2H、-C(O)-O-(C1-4)烷基、-C(O)-NH2、-C(NH)-NH2、-C(O)-NH(C1-4烷基)、-C(O)-N(C1-4烷基)2、-SH、-S-(C1-4)烷基、-S-(C1-4)烷基-S-(C1-4)烷基、-S-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基、-S-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基-OH、-S-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基-NH2、-S-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基-NH(C1-4烷基)、-S-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基-N(C1-4烷基)2、-S-(C1-4)烷基-NH(C1-4烷基)、-SO2-(C1-4)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-4烷基)、-SO2-N(C1-4烷基)2、-N-R7、氰基、(卤代基)1-3、羟基、硝基、氧代基、-环烷基-R6、-杂环基-R6、-芳基-R6和-杂芳基-R6。
50.根据权利要求31所述的方法，其中R5为1至2个独立地选自下列的取代基：氢、-O-(C1-4)烷基、-N-R7、羟基和-杂芳基-R6。
51.根据权利要求31所述的方法，其中R5为1至2个独立地选自下列的取代基：氢、-O-(C1-4)烷基、-N-R7、羟基、-咪唑基-R6、-***基-R6和-四唑基-R6。
52.根据权利要求31所述的方法，其中R6为1至4个独立地选自下列的连接到碳或氮原子的取代基：氢、-C1-4烷基、-C2-4烯基、-C2-4炔基、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基、-CO2H、-C(O)-O-(C1-4)烷基、-C(O)-NH2、-C(NH)-NH2、-C(O)-NH(C1-4烷基)、-C(O)-N(C1-4)烷基)2、-SO2-(C1-4)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-4烷基)、-SO2-N(C1-4烷基)2、-(C1-4)烷基-N-R7、-(C1-4)烷基-(卤代基)1-3、-(C1-4)烷基-OH、-芳基-R8、-(C1-4)烷基-芳基-R8和-(C1-4)烷基-杂芳基-R8；条件是当R6连接到碳原子时，R6还选自-C1-4烷氧基、-(C1-4)烷氧基-(卤代基)1-3、-SH、-S-(C1-4)烷基、-N-R7、氰基、卤代基、羟基、硝基、氧代基和-杂芳基-R8。
53.根据权利要求31所述的方法，其中R6为氢。
54.根据权利要求33所述的方法，其中R7为2个独立地选自下列的取代基：氢、-C1-4烷基、-C2-4烯基、-C2-4炔基、-(C1-4)烷基-OH、-(C1-4)烷基-O-(C1-4)烷基、-(C1-4)烷基-NH2、-(C1-4)烷基-NH(C1-4烷基)、-(C1-4)烷基-N(C1-4烷基)2、-(C1-4)烷基-S-(C1-4)烷基、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基、-C(O)-O-(C1-4)烷基、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-4烷基)、-C(O)-N(C1-4烷基)2、-SO2-(C1-4)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-4烷基)、-SO2-N(C1-4烷基)2、-C(N)-NH2、-环烷基-R8、-(C1-4)烷基-杂环基-R8、-芳基-R8、-(C1-4)烷基-芳基-R8和-(C1-4)烷基-杂芳基-R8。
55.根据权利要求33所述的方法，其中R7为2个独立地选自下列的取代基：氢、-C1-4烷基、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基、-C(O)-O-(C1-4)烷基、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-4烷基)和-SO2-N(C1-4烷基)2。
56.根据权利要求31所述的方法，其中R8为1至4个独立地选自下列的连接到碳或氮原子的取代基：氢、-C1-4烷基、-(C1-4)烷基-(卤代基)1-3和-(C1-4)烷基-OH；条件是当R8连接到碳原子时，R8还选自-C1-4烷氧基、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、氰基、卤代基、-(C1-4)烷氧基-(卤代基)1-3、羟基和硝基。
57.根据权利要求31所述的方法，其中R8为氢。
58.根据权利要求31所述的方法，其中R9为1至2个独立地选自下列的取代基：氢、-C1-4烷氧基、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、氰基、(卤代基)1-3、羟基和硝基。
59.根据权利要求31所述的方法，其中R9为氢。
60.根据权利要求28所述的方法，其中R2为1个选自下列的连接到碳或氮原子的取代基：氢、-C1-4烷基-R5、-C2-4烯基-R5、-C2-4炔基-R5、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-4烷基-R9)、-C(O)-N(C1-4烷基-R9)2、-C(O)-NH(芳基-R8)、-C(O)-环烷基-R8、-C(O)-杂环基-R8、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-杂芳基-R8、-CO2H、-C(O)-O-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-SO2-(C1-4)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-环烷基-R6、-芳基-R6和-(C1-4)烷基-N-R7；条件是当R2连接到碳原子时，R2还选自-C1-4烷氧基-R5、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、氧代基、-杂环基-R6和-杂芳基-R6。
61.根据权利要求28所述的方法，其中R2为1个选自下列的连接到碳或氮原子的取代基：氢、-C1-4烷基-R5、-C2-4烯基-R5、-C2-4炔基-R5、-CO2H、-C(O)-O-(C1-4)烷基-R9、-环烷基-R6、-芳基-R6和-(C1-4)烷基-N-R7；条件是当R2连接到氮原子时，未形成季铵盐；并且条件是当R2连接到碳原子时，R2还选自-C1-4烷氧基-R5、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、氧代基、-杂环基-R6和-杂芳基-R6。
62.根据权利要求28所述的方法，其中R2为1个选自下列的连接到碳或氮原子的取代基：氢、-C1-4烷基-R5和-芳基-R6；条件是当R2连接到氮原子时，未形成季铵盐；并且条件是当R2连接到碳原子时，R2还选自-N-R7、卤素、羟基和-杂芳基-R6。
63.根据权利要求28所述的方法，其中R3为1至3个独立地选自下列的连接到碳原子的取代基：氢、-C1-4烷基-R10、-C2-4烯基-R10、-C2-4炔基-R10、-C1-4烷氧基-R10、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-4烷基-R9)、-C(O)-N(C1-4烷基-R9)2、-C(O)-环烷基-R8、-C(O)-杂环基-R8、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-杂芳基-R8、-C(NH)-NH2、-CO2H、-C(O)-O-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-SO2-(C1-8)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-N-R7、-(C1-4)烷基-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、-环烷基-R8、-杂环基-R8、-芳基-R8和-杂芳基-R8。
64.根据权利要求28所述的方法，其中R3为1个选自下列的连接到碳原子的取代基：氢、-C1-4烷基-R10、-C2-4烯基-R10、-C2-4炔基-R10、-C1-4烷氧基-R10、-C(O)H、-CO2H、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、氰基、卤素、羟基和硝基。
65.根据权利要求28所述的方法，其中R3为1个选自下列的连接到碳原子的取代基：氢、-C1-4烷基-R10、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、卤素和羟基。
66.根据权利要求28所述的方法，其中R4为1至4个独立地选自下列的连接到碳原子的取代基：氢、-C1-4烷基-R10、-C2-4烯基-R10、-C2-4炔基-R10、-C1-4烷氧基-R10、-C(O)H、-C(O)-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-NH2、-C(O)-NH(C1-4烷基-R9)、-C(O)-N(C1-4烷基-R9)2、-C(O)-环烷基-R8、-C(O)-杂环基-R8、-C(O)-芳基-R8、-C(O)-杂芳基-R8、-C(NH)-NH2、-CO2H、-C(O)-O-(C1-4)烷基-R9、-C(O)-O-芳基-R8、-SH、-S-(C1-4)烷基-R10、-SO2-(C1-4)烷基-R9、-SO2-芳基-R8、-SO2-NH2、-SO2-NH(C1-4烷基-R9)、-SO2-N(C1-4烷基-R9)2、-N-R7、氰基、卤素、羟基、硝基、-环烷基-R8、-杂环基-R8、-芳基-R8和-杂芳基-R8。
67.根据权利要求28所述的方法，其中R4为1至4个独立地选自下列的连接到碳原子的取代基：氢、-C1-4烷基-R10、-C2-4烯基-R10、-C2-4炔基-R10、-C1-4烷氧基-R10、-C(O)H、-CO2H、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、氰基、卤素、羟基、硝基、-环烷基、-杂环基、-芳基和-杂芳基。
68.根据权利要求28所述的方法，其中R4为1至4个独立地选自下列的连接到碳原子的取代基：氢、C1-4烷基-R10、C1-4烷氧基-R10、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、卤素和羟基。
69.根据权利要求28所述的方法，其中R4为1至4个独立地选自下列的连接到碳原子的取代基：氢、C1-4烷基-R10、C1-4烷氧基-R10、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、氯、氟和羟基。
70.根据权利要求38和41所述的方法，其中R10为1至2个独立地选自下列的取代基：氢、-NH2、-NH(C1-4烷基)、-N(C1-4烷基)2、氰基、(卤代基)1-3、羟基、硝基和氧代基。
71.根据权利要求38和41所述的方法，其中R10为1至2个独立地选自氢和(卤代基)1-3的取代基。
72.根据权利要求38和41所述的方法，其中R10为1至2个独立地选自氢和(氟代基)3的取代基。
73.根据权利要求28所述的方法，其中Y和Z独立地选自O、S、(H,OH)和(H,H)；条件是Y和Z中的一者为O，并且另一者选自O、S、(H,OH)和(H,H)。
74.根据权利要求28所述的方法，其中Y和Z独立地选自O和(H,H)；条件是Y和Z中的一者为O，并且另一者选自O和(H,H)。
75.根据权利要求28所述的方法，其中Y和Z独立地选自O。
76.根据权利要求28所述的方法，其中式II的化合物为3-[1-(3-羟丙基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]-4-[2-(三氟甲基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮。
77.根据权利要求28所述的方法，其中式II的化合物为3-[1-(3-羟丙基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]-4-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮。
78.根据权利要求28所述的方法，其中式II的化合物为3-[1-(3-羟基-丙基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2,5-二酮。
79.根据权利要求28所述的方法，其中式II的化合物为3-(2,4-二甲氧基-嘧啶-5-基)-4-[1-(3-羟基-丙基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]-吡咯-2,5-二酮。
80.根据权利要求28所述的方法，其中式II的化合物为4-{3-[4-(2,4-二甲氧基-嘧啶-5-基)-2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-3-基]-吡咯并[2,3-b]吡啶-1-基}-丁腈。
81.根据权利要求28所述的方法，其中式II的化合物为4-{3-[4-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-3-基]-吡咯并[2,3-b]吡啶-1-基}-丁腈。
82.根据权利要求28所述的方法，其中式II的化合物为3-(2,4-二甲氧基-嘧啶-5-基)-4-(1-苯乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-吡咯-2,5-二酮。
83.根据权利要求1所述的方法，其中所述GSK-3B酶活性抑制剂为式(III)的化合物：
式(III)。
84.根据权利要求83所述的方法，其中A和E独立地选自氢取代的碳原子和氮原子；其中独立地选自1H-吲哚、1H-吡咯并[2,3-b]吡啶、1H-吡唑并[3,4-b]吡啶和1H-吲唑。
85.根据权利要求83所述的方法，其中Z选自O；另选地，Z选自二氢；其中每个氢原子通过单键连接。
86.根据权利要求83所述的方法，其中R4和R5独立地选自任选地被氧代基取代的C1-8烷基、C2-8烯基和C2-8炔基。
87.根据权利要求83所述的方法，其中R2选自-C1-8烷基-、-C2-8烯基-、-C2-8炔基-、-O-(C1-8)烷基-O-、-O-(C2-8)烯基-O-、-O-(C2-8)炔基-O-、-C(O)-(C1-8)烷基-C(O)-（其中任何前述烷基、烯基和炔基连接基团为任选地被1至4个独立地选自下列的取代基取代的直碳链：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、-C(O)O-(C1-8)烷基、-C1-8烷基-C(O)O-(C1-8)烷基、氨基（被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、氨基(C1-8)烷基（其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基、羟基(C1-8)烷基和氧代基；并且其中任何前述烷基、烯基和炔基连接基团任选地被1至2个独立地选自下列的取代基取代：杂环基、芳基、杂芳基、杂环基(C1-8)烷基、芳基(C1-8)烷基、杂芳基(C1-8)烷基、螺环烷基和螺杂环基（其中任何前述环烷基、杂环基、芳基和杂芳基取代基任选地被1至4个独立地选自下列的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基（被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、氨基(C1-8)烷基（其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基；并且其中任何前述杂环基取代基任选地被氧代基取代））、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基（其中环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被1至4个独立地选自下列的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基（被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、氨基(C1-8)烷基（其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基；并且其中杂环基任选地被氧代基取代）、-(O-(CH2)1-6)0-5-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-、-(O-(CH2)1-6)0-5-NR6-、-O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-NR6-、-(O-(CH2)1-6)0-5-S-、-O-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-S-、-NR6-、-NR6-NR7-、-NR6-(CH2)1-6-NR7-、-NR6-(CH2)1-6-NR7-(CH2)1-6-NR8-、-NR6-C(O)-、-C(O)-NR6-、-C(O)-(CH2)0-6-NR6-(CH2)0-6-C(O)-、-NR6-(CH2)0-6-C(O)-(CH2)1-6-C(O)-(CH2)0-6-NR7-、-NR6-C(O)-NR7-、-NR6-C(NR7)-NR8-、-O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-、-S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-、-S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-、-NR6-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-NR7-和-SO2-（其中R6、R7和R8独立地选自氢、C1-8烷基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基(C1-8)烷基、氨基(C1-8)烷基（其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、羟基(C1-8)烷基、杂环基(C1-8)烷基、芳基(C1-8)烷基和杂芳基(C1-8)烷基（其中前述杂环基、芳基和杂芳基取代基任选地被1至4个独立地选自下列的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基（被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、氨基(C1-8)烷基（其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基；并且其中杂环基任选地被氧代基取代））；条件是如果A和E选自氢取代的碳原子，则R2选自-C2-8炔基-、-O-(C1-8)烷基-O-、-O-(C2-8)烯基-O-、-O-(C2-8)炔基-O-、-C(O)-(C1-8)烷基-C(O)-（其中任何前述烷基、烯基和炔基连接基团为任选地被1至4个独立地选自下列的取代基取代的直碳链：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、-C(O)O-(C1-8)烷基、-C1-8烷基-C(O)O-(C1-8)烷基、氨基（被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、氨基(C1-8)烷基（其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基、羟基(C1-8)烷基和氧代基；并且其中任何前述烷基、烯基和炔基连接基团任选地被1至2个独立地选自下列的取代基取代：杂环基、芳基、杂芳基、杂环基(C1-8)烷基、芳基(C1-8)烷基、杂芳基(C1-8)烷基、螺环烷基和螺杂环基（其中任何前述环烷基、杂环基、芳基和杂芳基取代基任选地被1至4个独立地选自下列的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基（被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、氨基(C1-8)烷基（其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基；并且其中任何前述杂环基取代基任选地被氧代基取代））、环烷基（其中环烷基任选地被1至4个独立地选自下列的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基（被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、氨基(C1-8)烷基（其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基）、-(O-(CH2)1-6)1-5-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-、-(O-(CH2)1-6)1-5-NR6-、-O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-NR6-、-(O-(CH2)1-6)0-5-S-、-O-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-O-、-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-S-、-NR6-NR7-、-NR6-(CH2)1-6-NR7-、-NR6-(CH2)1-6-NR7-(CH2)1-6-NR8-、-NR9-C(O)-、-C(O)-NR9-、-C(O)-(CH2)0-6-NR6-(CH2)0-6-C(O)-、-NR6-(CH2)0-6-C(O)-(CH2)1-6-C(O)-(CH2)0-6-NR7-、-NR6-C(O)-NR7-、-NR6-C(NR7)-NR8-、-O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-、-S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-、-S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-和-NR6-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-NR7-（其中R6、R7和R8独立地选自氢、C1-8烷基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基(C1-8)烷基、氨基(C1-8)烷基（其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、羟基(C1-8)烷基、杂环基(C1-8)烷基、芳基(C1-8)烷基和杂芳基(C1-8)烷基（其中前述杂环基、芳基和杂芳基取代基任选地被1至4个独立地选自下列的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基（被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、氨基(C1-8)烷基（其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基；并且其中杂环基任选地被氧代基取代）；并且其中R9选自C1-8烷基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基(C1-8)烷基、氨基(C1-8)烷基（其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、羟基(C1-8)烷基、杂环基(C1-8)烷基、芳基(C1-8)烷基和杂芳基(C1-8)烷基（其中前述杂环基、芳基和杂芳基取代基任选地被1至4个独立地选自下列的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基（被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、氨基(C1-8)烷基（其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基；并且其中杂环基任选地被氧代基取代））。
88.根据权利要求83所述的方法，其中R1和R3独立地选自氢、C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基（其中烷基、烯基和炔基任选地被选自下列的取代基取代：C1-8烷氧基、烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基（被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、氨基(C1-8)烷基（其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、(卤代基)1-3、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基、羟基(C1-8)烷基和氧代基）、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基羰基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、C1-8烷硫基、芳基、杂芳基（其中芳基和杂芳基任选地被选自下列的取代基取代：C1-8烷基、C1-8烷氧基、烷氧基(C1-8)烷基、羧基、羧基(C1-8)烷基、氨基（被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、氨基(C1-8)烷基（其中氨基被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、卤素、(卤代基)1-3(C1-8)烷基、(卤代基)1-3(C1-8)烷氧基、羟基和羟基(C1-8)烷基）、氨基（被独立地选自氢和C1-4烷基的取代基取代）、氰基、卤素、羟基和硝基；以及它们药学上可接受的盐。
89.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为6,7,9,10,12,13,15,16-八氢-23H-5,26:17,22-二次甲基-5H-二吡啶并[2,3-k:3',2'-q]吡咯并[3,4-n][1,4,7,10,19]三氧二氮杂环二十一碳烯-23,25(24H)-二酮。
90.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为10,11,13,14,16,17,19,20,22,23-十氢-9,4:24,29-二次甲基-1H-二吡啶并[2,3-n:3',2'-t]吡咯并[3,4-q][1,4,7,10,13,22]四氧二氮杂环二十四碳烯-1,3(2H)-二酮。
91.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为10,11,13,14,16,17,19,20,22,23,25,26-十二氢-9,4:27,32-二次甲基-1H-二吡啶并[2,3-q:3',2'-w]吡咯并[3,4-t][1,4,7,10,13,16,25]五氧二氮杂环二十七碳烯-1,3(2H)-二酮。
92.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为6,7,9,10,12,13-六氢-20H-5,23:14,19-二次甲基-5H-二苯并[h,n]吡咯并[3,4-k][1,4,7,16]二氧二氮杂环十八碳烯-20,22(21H)-二酮。
93.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为6,7,9,10,12,13,15,16-八氢-23H-5,26:17,22-二次甲基-5H-二苯并[k,q]吡咯并[3,4-n][1,4,7,10,19]三氧二氮杂环二十一碳烯-23,25(24H)-二酮。
94.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为10,11,13,14,16,17,19,20,22,23-十氢-9,4:24,29-二次甲基-1H-二苯并[n,t]吡咯并[3,4-q][1,4,7,10,13,22]四氧二氮杂环二十四碳烯-1,3(2H)-二酮。
95.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为化合物1a。
96.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为3-[1-[3-[(2-羟乙基)甲基氨基]丙基]-1H-吲唑-3-基]-4-[1-(3-吡啶基)-1H-吲哚-3-基]-1H-吡咯-2,5-二酮。
97.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为3,5-二氯-N-[3-氯-4-[(3,4,12,12a-四氢-1H-[1,4]噻嗪并[3,4-c][1,4]苯并二氮杂-11(6H)-基)羰基]苯基]-苯甲酰胺。
98.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为3-[1-(2-羟基-乙基)-1H-吲哚-3-基]-4-(1-吡啶-3-基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮。
99.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为3-(2-甲氧基-苯基)-4-(1-吡啶-3-基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮。
100.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈。
101.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为3-(5-氯-1-甲基-1H-吲哚-3-基)-4-[1-(3-咪唑-1-基-丙基)-1H-吲唑-3-基]-吡咯-2,5-二酮。
102.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为3-(5-氯-1-甲基-1H-吲哚-3-基)-4-[1-(3-[1,2,3]***-1-基-丙基)-1H-吲唑-3-基]-吡咯-2,5-二酮。
103.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为3-[1-(3-羟基-丙基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]-4-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-吡咯-2,5-二酮。
104.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为化合物10a。
105.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为3-[1-(3-羟基-3-甲基-丁基)-1H-吲唑-3-基]-4-(1-吡啶-3-基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮。
106.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为3-[1-(2-羟基-乙基)-1H-吲唑-3-基]-4-(1-嘧啶-5-基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮。
107.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为3-[1-(2-羟基-乙基)-1H-吲哚-3-基]-4-(1-嘧啶-5-基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2,5-二酮。
108.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为(11Z)-8,9,10,13,14,15-六氢-2,6:17,21-二(次甲基)吡咯并[3,4-h][1,15,7]二氧氮杂环二十三碳烯-22,24(1H,23H)-二酮。
109.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为3-(5-氯-1-吡啶-3-基-1H-吲哚-3-基)-4-[1-(3-羟基-丙基)-1H-吲唑-3-基]-吡咯-2,5-二酮。
110.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为3-(2-甲氧基-苯基)-4-[1-(3-甲氧基-丙基)-1H-吡咯并[3,2-c]吡啶-3-基]-吡咯-2,5-二酮。
111.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为3-[1-(3-羟基-丙基)-1H-吲唑-3-基]-4-[1-(四氢-吡喃-4-基)-1H-吲哚-3-基]-吡咯-2,5-二酮。
112.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为2-{3-[4-(5-氯-1-甲基-1H-吲哚-3-基)-2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-3-基]-吲唑-1-基}-N-(2-羟基-乙基)-乙酰胺。
113.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为4-(3-氯-苯基)-6-(3-二甲基氨基-丙基)-5,6-二氢-4H-2,4,6-三氮杂-环戊并[c]芴-1,3-二酮。
114.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为14-乙基-6,7,9,10,13,14,15,16-八氢-12H,23H-5,26:17,22-二次甲基二苯并[k,q]吡咯并[3,4-n][1,4,7,10,19]二氧三氮杂环二十一碳烯-23,25(24H)-二酮。
115.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为14-苄基-6,7,9,10,13,14,15,16-八氢-12H,23H-5,26:17,22-二(次甲基)二苯并[k,q]吡咯并[3,4-n][1,4,7,10,19]二氧三氮杂环二十一碳烯-23,25(24H)-二酮。
116.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为3-(1-{2-[2-(2-羟基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-1H-吲哚-3-基)-4-[1-(2-羟基-乙基)-1H-吲哚-3-基]-吡咯-2,5-二酮。
117.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为6,7,8,9,10,11,12,13-八氢-8,11-二甲基-5,23:14,19-二次甲基-20H-二苯并[k,q]吡咯并[3,4-n][1,4,7,10]四氮杂环十八碳烯-20,22(21H)-二酮。
118.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为7,8,9,10,12,13,16,17,18,19-十氢-8,17-二甲基-15H,26H-5,29:20,25-二次甲基-6H-二苯并[k,q]吡咯并[3,4-n][1,4,7,10,19,22]二氧四氮杂环二十四碳烯-26,28(27H)-二酮。
119.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为14-(2-呋喃基甲基)-6,7,9,10,13,14,15,16-八氢-12H,23H-5,26:17,22-二(次甲基)二苯并[k,q]吡咯并[3,4-n][1,4,7,10,19]二氧三氮杂环二十一碳烯-23,25(24H)-二酮。
120.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为14-(2-噻吩基甲基)-6,7,9,10,13,14,15,16-八氢-12H,23H-5,26:17,22-二(次甲基)二苯并[k,q]吡咯并[3,4-n][1,4,7,10,19]二氧三氮杂环二十一碳烯-23,25(24H)-二酮。
121.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为14-(1-萘基甲基)-6,7,9,10,13,14,15,16-八氢-12H,23H-5,26:17,22-二(次甲基)二苯并[k,q]吡咯并[3,4-n][1,4,7,10,19]二氧三氮杂环二十一碳烯-23,25(24H)-二酮。
122.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为14-(吡啶-4-基甲基)-6,7,9,10,13,14,15,16-八氢-12H,23H-5,26:17,22-二(次甲基)二苯并[k,q]吡咯并[3,4-n][1,4,7,10,19]二氧三氮杂环二十一碳烯-23,25(24H)-二酮。
123.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为3-[1-(2-{2-[2-(1,2,3,4-四氢-萘-1-基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基)-1H-吲哚-3-基]-4-{1-[2-(1,2,3,4-四氢-萘-1-基氨基)-乙基]-1H-吲哚-3-基}-吡咯-2,5-二酮。
124.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为3-[1-(3-二甲基氨基-苯基)-1H-吲哚-3-基]-4-[1-(2-羟基-乙基)-1H-吲唑-3-基]-吡咯-2,5-二酮。
125.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为3-[5-氯-1-(6-二甲基氨基-吡啶-3-基)-1H-吲哚-3-基]-4-[1-(2-羟基-乙基)-1H-吲唑-3-基]-吡咯-2,5-二酮。
126.根据权利要求83所述的方法，其中式(III)的化合物为5-(5-氯-3-{4-[1-(2-羟基-乙基)-1H-吲唑-3-基]-2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-3-基}-吲哚-1-基)-烟酸甲酯。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109890805A (zh) * 2016-08-18 2019-06-14 新加坡国立大学 用于造血干细胞和祖细胞的产生、增殖和分化的取代的唑衍生物

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160083343A1 (en) 2013-03-15 2016-03-24 Global Blood Therapeutics, Inc Compounds and uses thereof for the modulation of hemoglobin
DE202014011287U1 (de) 2013-06-11 2019-02-06 The President And Fellows Of Harvard College SC-ß Zellen und Zusammensetzungen zur Erzeugung der Zellen
EA202092627A1 (ru) 2013-11-18 2021-09-30 Глобал Блад Терапьютикс, Инк. Соединения и их применения для модуляции гемоглобина
WO2016100898A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived b cells and uses thereof
EP3234110B1 (en) 2014-12-18 2024-02-28 President and Fellows of Harvard College METHODS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED ß CELLS AND USES THEREOF
CN107614678B (zh) 2014-12-18 2021-04-30 哈佛学院校长同事会 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法
KR102516844B1 (ko) 2016-11-16 2023-04-04 시나타 세라퓨틱스 엘티디 만능성 줄기 세포 분석
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
US10093741B1 (en) 2017-05-05 2018-10-09 Fusion Pharmaceuticals Inc. IGF-1R monoclonal antibodies and uses thereof
RU2019139432A (ru) 2017-05-05 2021-06-07 Сентр фор Проуб Девелопмент энд Коммерсиализэйшн Фармакокинетическая оптимизация бифункциональных хелатов и их применение
WO2018204872A2 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Fusion Pharmaceuticals Inc. Igf-1r monoclonal antibodies and uses thereof
KR101966523B1 (ko) * 2017-05-29 2019-04-05 차의과학대학교 산학협력단 오가노이드 배양을 위한 조성물 및 방법
US10391156B2 (en) 2017-07-12 2019-08-27 Viacyte, Inc. University donor cells and related methods
AU2018370029A1 (en) 2017-11-15 2020-07-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Islet cell manufacturing compositions and methods of use
KR20210018919A (ko) * 2018-06-08 2021-02-18 노파르티스 아게 약물 산물 효능을 측정하기 위한 세포-기반 분석
WO2020033879A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Semma Therapeutics, Inc. Stem cell derived islet differentiation
US10724052B2 (en) 2018-09-07 2020-07-28 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
CN114364791A (zh) 2019-09-05 2022-04-15 克里斯珀医疗股份公司 通用供体细胞
CA3150235A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Alireza Rezania UNIVERSAL DONOR CELLS
EP4271796A1 (en) 2020-12-31 2023-11-08 CRISPR Therapeutics AG Universal donor cells

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060030042A1 (en) * 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
WO2007030870A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-22 Es Cell International Pte Ltd Cardiomyocyte production
WO2009132063A2 (en) * 2008-04-24 2009-10-29 Centocor Ortho Biotech Inc. Pluripotent cells
CN102105580A (zh) * 2008-04-24 2011-06-22 森托科尔奥索生物科技公司 多潜能细胞的处理

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8741643B2 (en) * 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060030042A1 (en) * 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
WO2007030870A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-22 Es Cell International Pte Ltd Cardiomyocyte production
WO2009132063A2 (en) * 2008-04-24 2009-10-29 Centocor Ortho Biotech Inc. Pluripotent cells
CN102105580A (zh) * 2008-04-24 2011-06-22 森托科尔奥索生物科技公司 多潜能细胞的处理

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
POUTON.COLIN W.ET AL: "EMBRYONIC STEM CELLS AS A SOURCE OF MODELS FOR DRUG DISCOVERY", 《NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109890805A (zh) * 2016-08-18 2019-06-14 新加坡国立大学 用于造血干细胞和祖细胞的产生、增殖和分化的取代的唑衍生物
CN109890805B (zh) * 2016-08-18 2023-04-04 新加坡国立大学 用于造血干细胞和祖细胞的产生、增殖和分化的取代的唑衍生物

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