KR20150010932A - 카바페넴의 무세포 제조법 - Google Patents

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다니엘 클레인-마커스차머
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그린라이트 바이오사이언시스, 아이엔씨.
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Abstract

본 발명에서 제공되는 것은 카바페넴, 예를 들면 식(I)의 화합물 또는 그의 염을 발생시키는 무세포 시스템이고, 여기서, R1, R2, R3, R4, R5, 및 R6 는 본원에서 정의된 바와 같다. 또한, 본 발명에서 제공되는 것은 본 발명의 무세포 시스템에 의해 발생된 화합물을 포함한 제약학적 조성물이고, 이들 화합물 및 조성물을 박테리아 감염의 치료제로 사용하는 용도이다.

Description

카바페넴의 무세포 제조법{CELL-FREE PREPARATION OF CARBAPENEMS}
본 출원은 2011년 9월 9일자 출원된 미국 임시 특허출원 U.S.S.N. 61/533,039를 35 U.S.C. § 119(e) 하에서 우선권을 주장한다.
1976년, 토양 박테리아 스트렙토마이세스 카틀레야(Streptomyces cattleya)로부터 얻은 발효 브로스(fermentation broths)가 펩티도글리칸 생합성의 억제제를 위한 스크린에 활성임이 밝혀졌다. 활성 종을 단리하기 위한 최초 시도는 그의 구성분의 화학적 불안정성에 기인하여 어려움이 입증되었다. 많은 시도와 광범위한 정제 후에, 상기 물질은 마침내 첫번째로 단리된 자연 발생 카바페넴 항생제, 티에나마이신(thienamycin)의 구조적 설명을 가능하게 하는 90%를 넘는 순도로 단리되었다. 문헌 [Kahan et al., J. Antibiot. (1979) 32:1-2] 참조.
Figure pct00001
1978년에서 2000년까지, 전체 23번의 티에나마이신의 화학 합성이 보고되고 있으며, 대부분 12 또는 그이상의 순차적 화학 단계 후에 비교적 낮은 수율(예를 들면, 0.2% 내지 10% 수율)로 티에나마이신을 생성한다. 문헌 [Salzmann et al., J. Am. Chem. Soc. (1980) 102:6161; Huang et al., J. Am. Chem. Soc. (1980) 102:2060; Reider et al., Tetrahedron Letters (1982) 23:2293-2296; Desiraju et al., J. Chem. Soc. Chem. Comm. (1984) 494; Evans et al., Tetrahedron Letters (1986) 27:4961; Grieco et al., J. Am. Chem. Soc. (1984) 106:6414; 및 Jacobi et al., J. Org. Chem. (1996) 61:2413] 참조. 스트렙토마이세스 카틀레야로부터 전통적인 발효를 통한 티에나마이신의 생성은 또한 큰 장애, 예를 들면, 낮은 역가 및 발효에 의해 생성된 티에나마이신을 단리하고 정제하는데 어려움에 직면하고 있다. 미국 특허 제3,950,357호 및 제4,006,060호를 참조하며, 이들 각각은 참조를 위해 본원에 포함된다. 티에나마이신은 그의 수성 배지에서의 화학적 불안정성 및 디히드로펩티다제-I(DHP-I)에 대한 생리학적 불안정성에 기인하여 임상적 치료에 부적당한 것으로 여겨지고 있다. 연구자들은 티에나마이신의 우수한 항박테리아 활성을 유지하면서 티에나마이신의 안정성 문제로 규제받지 않은 대안을 찾고자 하고 있다.
이런 카바페넴의 하나인, 이미페넴(imipenem)은 정맥 제품으로서 1985년에 개발되었다. 참조로서 본 명세서에 포함된 미국 특허 제4,194,047호를 참조, 이미페넴은 호기성 및 혐기성 그람 양성 뿐만 아니라 그람 음성 박테리아에 대해 광범위한 활성을 가지며, 원내 감염의 선두 제제의 하나인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 대해 계속적으로 일반적으로 사용되어 오고 있다. 이미페넴의 현재의 제조는 간단한 구성 블럭으로부터 최종 제품까지 전형적으로 낮은 수율인 화학적 합성 경로를 이용하여, 결과적으로 부산물의 수준을 높게 하며, 제조비용을 높게한다. 문헌 [Grabowski, Chirality (2005) 17:S249-S259] 및 여기에 인용된 참고문헌을 참조.
Figure pct00002
기타 유망한 카바페넴 항생제가 사람에서 효과적인 것으로 밝혀졌으며, 예를 들면, 직장 사용을 위한 에르타페넴(ertapenem (INVANZ, Merck)), 메로페넴(meropenem (MERREM, Astra Zeneca)), 파니페넴(panipem), 비아페넴(biapenm), 도리페넴(doripenem(FINIBAX, Johnson & Johnson)), L-646591, 및 ER-35768; 경구적으로 활성인 카바페넴 CL-191121, L-036, DU-6681, 및 R-95867 및 이들의 대응 에스테르 프로드러그 L-084, DZ-2640, 및 CS-834이 있다. 예를 들면, 문헌 [Kumagai et al., Curr. Med. Chem. -Anti-infective Agents (2002) 1:1-14] 참고. 기타 카바페넴은 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 사프트리넴(saftrinem), 테비페넴(tebipenem), 토모페넴(tomopenem), S-4661, SM-216601, GV-129606, ZD-4433, R-83201, BO-2502A, BO-3482, DK-35C, DA-1131, S-4661, L-786,392, L-695256, L-786,392, GV104326, GV-118819, GV 143253, MK-0826, J-110,441, J-111225, FR-21818, DX-8739, CS-023, ME-1036, CP 5068, CL 188624, CL-190294, OCA-983, T-5575, 및 PZ-60을 포함한다. 이들 카바페넴의 대다수는 화학적 합성에 의해 생산된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
따라서,기존 및 새로운 카바페넴 항생제의 생산 및 개발을 위한 보다 효과적이며, 환경 친화적이고, 비용 절감적인 공정에 대한 요구가 여전히 계속되고 있다.
본 발명은 카바페넴 및 그의 중간체의 발생에 유용한 무세포 시스템, 방법 및 조성물을 제공한다.
하나의 양태에서, 제공되는 것은 다음과 같은 것으로부터 하기 식(I-a)의 화합물 또는 그의 염 또는 호변이체 또는 이들의 조합물을 발생할 수 있는 효소의 그룹을 포함하는 세포 용해물;
Figure pct00005
(1) 글루코스 및 글리신 또는 그의 염; 및/또는
(2) 글루코스 및 선택적으로 하기 식(i)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 또는 그의 염; 및/또는
Figure pct00006
(3) 글루코스 및 하기 식(iv)의 프롤린 화합물 또는 그의 염:
Figure pct00007
여기서, R1, R2, R3, R4, R5, 및 R7a 는 본원에서 정의된 바와 같으며,
Figure pct00008
는 단일 또는 이중 결합을 나타낸다.
또 다른 양태에서, 제공되는 것은 하기 식(I-a)의 화합물 또는 그의 염 또는 호변이체 또는 이들의 조합물을 발생하는 방법으로,
Figure pct00009
상기 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다:
하나 이상의 효소를 포함하는 세포 용해물을 제공하는 단계, 여기서 상기 효소는 키나제(예를 들면, 감마-글루타밀 키나제), 디히드로게나제(예를 들면, Glu-5-P 디히드로게나제), 글리콜리시스/아세틸-CoA 생합성 다중효소, 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 베타-산화 다중효소, 크로토닐-CoA 리덕타제, 아세틸-CoA 카르복실라제, 말로닐-CoA 리덕타제, 트레오닌 알도라제, 베타-알라닌 트랜스퍼라제, 프롤린 3-히드록시라제, 프롤린 옥시다제, 카르복시메틸-Pro 신타제(synthase), 카바페남 신테타제(carbapenam synthetase), 베타-락탐 신테타제, 카바페넴 신타제, 트랜스퍼라제, 옥시게나제, 메틸트랜스퍼라제 및 이들의 이소자임으로 이루어진 군에서 선택되고,
여기서 하나 이상의 세포 용해물은 다음과 같은 것과 접촉된다:
(1) 글루코스 및 글리신 또는 그의 염; 및/또는
(2) 글루코스 및 선택적으로 하기 식(i)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 또는 그의 염; 및/또는
Figure pct00010
(3) 글루코스 및 하기 식(iv)의 프롤린 화합물 또는 그의 염:
Figure pct00011
여기서, R1, R2, R3, R4, R5, 및 R7a 는 본원에서 정의된 바와 같으며,
Figure pct00012
는 단일 또는 이중 결합을 나타낸다. 특정 구현예에서,
Figure pct00013
는 단일 결합을 나타낸다. 특정 구현예에서
Figure pct00014
는 이중 결합을 나타낸다. 특정 구현예에서, R1는 수소이다. 특정 구현예에서 R3는 수소 또는 -CH3이다. 특정 구현예에서, R2는 수소, -CH3 또는 -CH2CH3이다. 특정 구현예에서 R4는 수소이다. 특정 구현예에서 R5는 수소 또는 -OH이다.
특정 구현예에서, 세포 용해물은 하나 이상의 효소를 과잉발현하기 위해 조작된 대장균(E.coli) 유기체의 용해물이다. 특정 구현예에서, 상기 세포 용해물은 다른 세포 용해물의 조합물이고, 여기서 각각의 다른 용해물은 하나 이상의 효소, 예를 들면, 하나 이상의 다른 효소 또는 2개 이상의 효소의 다른 조합물을 과잉발현하기 위해 조작된다. 특정 구현예에서, 상기 세포 용해물은 감마-글루타밀 키나제, Glu-5-P 디히드로게나제, 글리콜리시스/아세틸-CoA 생합성 다중효소, 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 베타-산화 다중효소, 크로토닐-CoA 리덕타제, 아세틸-CoA 카르복실라제, 말로닐-CoA 리덕타제, 트레오닌 알도라제, 베타-알라닌 트랜스퍼라제, 프롤린 3-히드록시라제, 프롤린 옥시다제, 카르복시메틸-프로 신타제(synthase), 카바페남 신테타제, 베타-락탐 신테타제, 카바페넴 신타제, 트랜스퍼라제, 옥시게나제, 메틸트랜스퍼라제 및 이들의 이소자임으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소를 과잉발현하기 위해 조작된 세포의 용해물이다. 특정 구현예에서, 감마-글루타밀 키나제, Glu-5-P 디히드로게나제, 글리콜리시스/아세틸-CoA 생합성 다중효소, 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 베타-산화 다중효소, 크로토닐-CoA 리덕타제, 아세틸-CoA 카르복실라제, 말로닐-CoA 리덕타제, 트레오닌 알도라제, 베타-알라닌 트랜스퍼라제, 프롤린 3-히드록시라제, 프롤린 옥시다제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소는 용해(lysing) 전에 세포로 존재된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 효소는 용해 전에 세포의 세포질에서 발견된다. 특정 구현예에서, 카르복실메틸-프로 신타제, 카바페남 신테타제, 베타-락탐 신테타제, 카바페넴 신타제, 트랜스퍼라제, 옥시게나제 및 메틸트랜스퍼라제 및 이들의 이소자임로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소가 용해 전에 세포의 주변세포질 공간에서 격리된다.
특정 구현예에서, 글루코스는 효소적으로 선택적으로 치환된 식(iii)의 CoA 화합물 또는 그의 염으로 전환된다:
Figure pct00015
여기서, -SCoA는 코엔자임 모노라디칼이다.
특정 구현예에서, 글루코스 및 글리신은 아세틸-CoA 카르복실라제, 말로닐-CoA 리덕타제, 트레오닌 알도라제, 키나제 및 디히드로게나제와의 접촉시 효소적으로 식(ii)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드 또는 그의 염으로 전환된다:
Figure pct00016
특정 구현예에서, 식(i)의 선택적으로 치환된 글루타메이트는 키나제 및 디히드로게나제와의 접촉시 식(ii)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드 또는 그의 염으로 전환된다:
Figure pct00017
Figure pct00018
특정 구현예에서, 식(ii)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드 화합물 또는 그의 염은 하기 식(v)의 피롤 화합물 또는 그의 염 및 부산물로서 물을 형성하기 위하여 고리화한다:
Figure pct00019
Figure pct00020
특정 구현예에서, 식(iv)의 프롤린 화합물 또는 그의 염은 프롤린 옥시다제와의 접촉시, 식(v)의 피롤화합물 또는 그의 염으로 전환된다:
Figure pct00021
Figure pct00022
특정 구현예에서, 식(iv)의 프롤린 화합물 또는 그의 염은 프롤린-3-히드록시라제와의 접촉시, 식(iv-a)의 3-히드록실화된 프롤린 화합물 또는 그의 염으로 전환된다:
Figure pct00023
여기서, R5는 수소이다.
Figure pct00024
특정 구현예에서, 식(iv-a)의 3-히드록실화된 프롤린 화합물 또는 그의 염은 프롤린 옥시다제와의 접촉시, 식(v-a)의 3-히드록실화된 피롤 화합물로 효소적으로 전환된다:
Figure pct00025
Figure pct00026
특정 구현예에서, 하기 식(i)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 또는 그의 염은 감마-글루타밀 키나제-GP-리덕타제 다중효소 복합물(예를 들면, E.coli, ProB 및 ProA)과의 접촉시 식(iv)의 프롤린 화합물 또는 그의 염으로 전환된다:
Figure pct00027
Figure pct00028
특정 구현예에서, 효소-함유 세포 용해물은 글루코스 및 글리신의 조합물, 또는 글루코스 및 식(i)의 선택적으로 치환된 글루타메이트의 조합물을 식(iii)의 선택적으로 치환된 CoA 화합물 또는 그의 염, 및 식(ii)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드 또는 그의 염으로 전환한다.
Figure pct00029
여기서, -SCoA는 코엔자임 A 모노라디칼이다.
특정 구현예에서, 상기 식(ii)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드 및 식(ii)의 선택적으로 치환된 CoA 화합물은 주변세포질 공간으로부터 선택적으로 방출된 효소와의 접촉시 식(II-a)의 피롤리디닐 화합물 또는 그의 염을 생성한다.
Figure pct00030
여기서, R7a는 수소이다.
특정 구현예에서, 효소-함유 세포 용해물은 효소-함유 용해물은 글루코스 및 식(iv)의 프롤린 화합물의 조합물을 식(iii)의 선택적으로 치환된 CoA 화합물 또는 그의 염 및 식(v)의 피롤 화합물 또는 그의 염으로 전환한다:
Figure pct00031
여기서 -SCoA는 코엔자임 A 모노라디칼이다.
특정 구현예에서, 식(v)의 피롤 화합물 또는 그의 염 및 식(iii)의 선택적으로 치환된 CoA 화합물은 주변세포질 공간으로부터 선택적으로 방출된 효소와의 접촉시 식(II-a)의 피롤리디닐 화합물 또는 그의 염을 발생한다:
Figure pct00032
여기서, R7a는 수소이다.
특정 구현예에서, 식(II-a)의 피롤리디닐 화합물은 주변세포질 공간으로부터 선택적으로 방출된 효소와 접촉시 식(III-a)의 베타-락탐 화합물 또는 그의 염을 발생시킨다:
Figure pct00033
특정 구현예에서, 식(III-a)의 베타-락탐 화합물은 주변세포질 공간으로부터 선택적으로 방출된 효소와의 접촉시, 식(I-a)의 화합물 또는 그의 염을 발생한다:
Figure pct00034
여기서,
Figure pct00035
는 이중 결합을 나타낸다.
특정 구현예에서, R5가 수소이고,
Figure pct00036
가 이중 결합을 나타내는 경우, 식(I-a)의 화합물 또는 그의 염은 식(I-c)의 티올-함유 화합물 또는 그의 염을 제공하기 위해 트랜스퍼라제 효소와 식 HSR8의 화합물(여기서, R8은 본원에서 정의된 바와 같다)과 접촉된다:
Figure pct00037
Figure pct00038
특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬 또는 선택적으로 치환된 헤테로시클릴이다.
특정 구현예에서,
Figure pct00039
이 이중 결합을 나타내고, R5가 -OH인 경우, 식(I-a)의 화합물 또는 그의 염 또는 호변이체 또는 이들의 조합물은 식(I-e)의 화합물 또는 그의 염을 제공하기 위해 식 R8'-X의 화합물(여기서 X는 이탈기이고, R8'는 본원에서 정의된 바와 같다)과 접촉된다:
Figure pct00040
Figure pct00041
특정 구현예에서, 식(I-e)의 화합물은 식(I-c)의 티올-함유 화합물 또는 그의 염을 제공하기 위하여 식 HSR8의 화합물(여기서, R8은 본원에서 정의된 바와 같다)과 접촉된다:
Figure pct00042
특정 구현예에서, R2가 CH3인 경우, 히드록실화된 화합물을 제공하기 위해 식(I-a)의 화합물이 옥시게나제 효소와 접촉되며, 여기서 R2는 CH2OH이다. 특정 구현예에서, R2가 CH2CH3인 경우, 히드록실화된 화합물을 제공하기 위해 식(I-a)의 화합물이 옥시게나제 효소와 접촉되며, 여기서 R2는 CH(OH)CH3이다.
특정 구현예에서, R1 및 R2 모두가 수소이고, 방법이 화합물을 제공하기 위하여 식(I-a)의 화합물을 메틸트랜스퍼라제(예를 들면, S.cattalya ThnL, ThnP, ThnK 또는 이것의 이소자임)와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서, R2는 알킬, 예를 들면, CH3(메틸, Me) 또는 -CH2CH3(에틸, Et)이다.
또 다른 양태는 본 발명의 무세포 시스템에 의해 제조된 화합물 또는 그의 염 및 선택적으로 제약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 제약적 조성물이다.
또 다른 양태에서 제공되는 것은 본 발명의 무세포 시스템에 의해 발생된 치료적 유효량의 화합물 또는 이것의 제약학적 조성물을 이것을 필요로하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 박테리아 감염 치료 방법이다.
본 발명의 구현예의 보다 상세한 사항은 도면 및 발명의 상세한 설명을 첨부하여 설명된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 잇점은 상세한 설명 및 청구항을 통해 명백해질 것이다.
도 1은 본 발명의 무세포 공정을 일반화시킨 개략도를 나타낸다: E.coli 세포에서 효소의 과잉발현(생체 내 단계); 세포 용해물을 제공하기 위한 E.coli 세포 용해 및 세포 용해물을 사용한 카바페넴의 생성(생체 외 단계).
도 2a는 선택적으로 치환된 글루타메이트("글루타메이트 화합물)로부터 선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드("글루타메이트 세미알데히드 화합물")의 제안된 효소 생성을 나타낸다(단계 a-b, 표 1). 상기 글루타메이트 세미알데히드 화합물은 자발적으로 그 자리에서 피롤 화합물을 형성하기 위해 고리화할 수 있다.
도 2b는 예시적으로 도 2a에서 설명된 방법에 따라서 생성될 수 있는 글루타메이트 세미알데히드 화합물 및 피롤 화합물을 나타낸다.
도 3은 3-히드록시-글루타메이트 세미알데히드의 효소적 생성을 위한 2개의 대안적인 루트를 나타낸다(단계 a, b, c, g, h, i 및/또는 j)
도 4는 글루코스로부터 선택적으로 치환된 CoA 화합물의 효소적 생성을 나타낸다(단계 c-f).
도 5a 및 5b는 글루타메이트 세미알데히드 화합물 및 코엔자임 A(CoA) 화합물로부터 카바페넴의 효소적 생성을 나타낸다. 상기 공정은 티에나마이신 및/또는 카바페넴 생합성 경로 모두로부터 효소를 이용한다(단계 1-3). 상기 E. coli는 E.coli의 주변세포질 공간에서 키-엔트리 효소 카르복시메틸-프로 신타제를 생성하기 위해 조작될 수 있다(CarB, ThnE 또는 이것의 이소자임).
도 6a는 예시적으로 카바페넴을 제공하기 위해 C6 사이드 체인의 효소적 부착 및 이어지는 C6 에틸기의 효소적 히드록실화를 나타낸다.
도 6b는 예시적으로 카바페넴을 제공하기 위해 C2 사이드 체인의 효소적 부착 및 이어지는 C6 에틸기의 효소적 히드록실화를 나타낸다(단계 4-5).
도 7은 예시적으로 카바페넴을 제공하기 위해 R5가 -OH인 식 I의 에놀-케토 호변이화 및 이어지는 C6 에틸기의 선택적 효소적 히드록실화를 나타낸다(단계 5).
도 8은 에놀 형태를 트래핑하고, 이어서 탠덤 마이클(tandem Michael_ 부가-제거 반응을 통해 카바페넴을 제공하기 위해 SHR8로 처리하는 것을 나타낸다.
도 9a 내지 9h는 예를 들어 글루타메이트 세미알데히드 및 말로닐-CoA (도 9a) 또는 에틸말로닐-CoA (도 9b)로부터, 4-메틸글루타메이트 세미알데히드 및 에틸말로닐-CoA (도 9c) 또는 말로닐-CoA (도 9f)로부터, 3-히드록시글루타메이트 세미알데히드 및 에틸말로닐-CoA (도 9d) 또는 말로닐-CoA (도 9g)로부터, 3-히드록시-4-메틸-글루타메이트 세미알데히드 및 에틸말로닐-CoA (도 9e) 또는 말로닐-CoA (도 9h)로부터 본 발명의 방법에 따라 카바페넴 스카폴드(scaffold)의 생성을 나타낸다. 상기 글루타메이트 세미알데히드 화합물을 그 자리에서 피롤을 형성하기 위해 자발적으로 고리화할 수도 있다(도시하지 않음).
도 10은 ProB, ProA 및 CarB 활성(A) 및 LC/MS/MS 특성화(B)을 함유하는 용해물에서 치환된 글루타메이트 및 에틸말로닐-CoA로부터 치환된 카르복시메틸 프롤린(CMP)의 생성을 나타낸다.
도 11은 ProB, ProA, CarB 및 CarA 활성(A) 및 LC/MS/MS 특성화(B)을 함유하는 용해물에서 치환된 글루타메이트 및 말로닐-CoA로부터 치환된 카바페남의 생성을 나타낸다.
도 12는 ProB, ProA, CarB, CarA 및 CarC 활성(A) 및 LC/MS/MS 특성화(B)을 함유하는 용해물에서 치환된 글루타메이트 및 말로닐-CoA로부터 치환된 카바페넴의 생성을 나타낸다.
도 13a는 프롤린 3-히드로실라제(단계 k) 및/또는 프롤린 옥시다제(단계 m)과의 접촉을 통해 프롤린 화합물로부터 피롤 CarB 치환체의 생성을 나타낸다.
도 13b는 도 13a에서 설명된 발명에 따라서 프롤린 화합물로부터 생성될 수 있는 예시적인 피롤 화합물을 나타낸다.
도 13c는 프롤린 3-히드로실라제(단계 k) 및/또는 프롤린 옥시다제(단계 m)과의 접촉을 통해 (S)- 및 (R)-프롤린으로부터 시스 및 트랜스 3-히드록시-3,4-디히드로-2H-피롤-2-카르복실산의 효소적 합성을 나타낸다.
도 13d는 피롤 화합물 및 코엔자임 A 화합물로부터 카바페넴의 효소적 생성을 나타낸다. 상기 공정은 티에나마이신 및/또는 카바페넴 생합성 경로(단계 1-3)로부터 효소를 이용한다. E.coli는 E.coli의 주변세포질 공간에서 키-엔트리 효소 카복시메틸-프로 신타제(CarB, ThnE 또는 이들의 이소자임)을 생성하기 위해 조작될 수 있다.
도 14는 다양한 양의 프롤린 옥시다제 PutA(E.coli) 및 CarB(P. carotovorum)를 함유하는 용해물에서 시스- 또는 트랜스-3-히드록시-프롤린 및 말로닐-CoA로부터 히드록실화된 카복시메틸 프롤린(CMP)의 생성을 나타낸다.
정의
특이적 기능 기들 및 화학 용어의 정의가 이하에 보다 상세히 설명된다. 상기 화학 원소가 원소 주기율표, CAS 버젼, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed에 따라서 정의되고, 특이적 기능 기들은 일반적으로 본원에서 정의된 바와 같다. 추가적으로 유기 화학의 일반적인 원리 뿐만 아니라 특이적 기능 모이어티 및 반응성은 문헌[Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March March’s Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; 및 Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987]에 설명된다.
본원에서 설명된 화합물은 하나 이상의 비대칭 센터를 포함하고, 따라서 다양한 이성질체 형태, 예를 들면 엔안티오머 및/또는 디아스테레오머로 존재할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 설명된 화합물은 개별적인 엔아티오머, 디아스테레오머, 또는 기하학 이성질체의 형태로 존재될 수 있거나 라세미 혼합물 및 하나 이상의 입체이성질체가 풍부한 혼합물을 포함하는 입체이성질체의 혼합물의 형태로 존재될 수 있다. 이성질체들은 이 분야의 당업자에게 공지된 방법, 키랄 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 키랄염의 형성 및 결정화에 의해 혼합물로부터 분리될 수 있거나, 바람직한 이성질체가 비대칭 합성에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Jacques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981); Wilen et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, E.L. Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); and Wilen, S.H. Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972] 참조. 본 발명은 추가적으로 기타 이성질체가 실질적으로 없는 개별적인 이성질체로서, 다양한 이성질체의 혼합물로서 화합물을 포괄한다.
수치의 범위가 기재되는 경우, 이것은 각각의 값과 그 범위내에서 하부-범위를 포함하는 것으로 여겨지며, 예를 들어, "C1-6 알킬'은 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C1-5, C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-5, C2-4, C2-3, C3-6, C3-5, C3-4, C4-6, C4-5, 및 C5-6 알킬을 포함하는 것으로 여겨진다.
본원에서 사용된 "알킬"은 1 내지 10개의 탄소 원자("C1-10 알킬")을 갖는 직쇄 또는 분지된 포화 탄화수소기의 라디칼을 지칭한다. 일부의 구현예에서, 알킬기는 1 내지 9개의 탄소 원자("C1-9 알킬")를 갖는다. 일부의 구현예에서, 알킬기는 1 내지 8개의 탄소 원자("C1-8 알킬")를 갖는다. 일부의 구현예에서, 알킬기는 1 내지 7개의 탄소 원자("C1-7 알킬")를 갖는다. 일부의 구현예에서, 알킬기는 1 내지 6개의 탄소 원자("C1-6 알킬")를 갖는다. 일부의 구현예에서, 알킬기는 1 내지 5개의 탄소 원자("C1-5 알킬")를 갖는다. 일부의 구현예에서, 알킬기는 1 내지 4개의 탄소 원자("C1-4 알킬")를 갖는다. 일부의 구현예에서, 알킬기는 1 내지 3개의 탄소 원자("C1-3 알킬")를 갖는다. 일부의 구현예에서, 알킬기는 1 내지 2개의 탄소 원자("C1-2 알킬")를 갖는다. 일부의 구현예에서, 알킬기는 1개의 탄소 원자("C1 알킬")를 갖는다. 일부의 구현예에서, 알킬기는 2 내지 6개의 탄소 원자("C2-6 알킬")를 갖는다. C1-6의 알킬기의 실예는 메틸(C1), 에틸(C2), n-프로필(C3), 이소프로필(C3), n-부틸(C4), tert-부틸(C4), sec-부틸(C4), 이소-부틸(C4), n-펜틸(C5), 3-펜타닐(C5), 아밀(C5), 네오펜틸(C5), 3-메틸-2-부타닐(C5), 삼차 아밀(C5), 및 n-헥실(C6)을 포함한다. 알킬기의 추가적인 실예는 n-헵틸(C7), n-옥틸(C8) 및 등등을 포함한다. 다르게 표시되지 않는 이상, 알킬기의 각각의 경우는 독립적으로 비치환된("비치환된 알킬") 또는 하나 이상의 치환체로 치환된("치환된 알킬")이다. 특정 구현예에서, 상기 알킬기는 비치환된 C1-10알킬(예를 들면, -CH3)이다. 특정 구현예에서, 알킬기는 치환된 C1-10알킬이다.
"퍼할로알킬(Perhaloalkyl)"는 본원에서 정의된 바와 같은 치환된 알킬기이고, 여기서 수소 원자의 모두는 할로겐, 예를 들면 플루오로, 브로모, 클로로, 또는 아이오도에 의해 독립적으로 대체된다. 일부의 구현예에서, 알킬 모이어티는 1 내지 8개의 탄소 원자("C1-8 퍼할로알킬")을 갖는다. 일부의 구현예에서, 알킬 모이어티는 1 내지 6개의 탄소 원자("C1-6 퍼할로알킬")을 갖는다. 일부의 구현예에서, 알킬 모이어티는 1 내지 4개의 탄소 원자("C1-4 퍼할로알킬")을 갖는다. 일부의 구현예에서, 알킬 모이어티는 1 내지 3개의 탄소 원자("C1-3 퍼할로알킬")을 갖는다. 일부의 구현예에서, 알킬 모이어티는 1 내지 2개의 탄소 원자("C1-2 퍼할로알킬")을 갖는다. 일부의 구현예에서, 수소원자 모두는 플루오로로 교체된다. 일부의 구현예에서, 수소 원자 모두는 클로로로 교체된다. 퍼할로알킬기의 실예는 -CF3, -CF2CF3, -CF2CF2CF3, -CCl3, -CFCl2, -CF2Cl,및 등등을 포함한다.
"헤테로알킬"의 용어는 본원에서 정의된 바와 같은 알킬을 의미하며, 여기서 적어도 하나의 산소, 질소 또는 황 헤테로원자(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 1-2, 1-3, 1-4, 2-4, 3-4, 또는 2-3 헤테로원자 포함)가 알킬 체인의 백본에 존재되며, 예를 들면 알킬 체인의 하나 이상의 탄소원자 사이에 존재한다. 특정 구현예에서 헤테로알킬기는 비치환된 헤테로C1-10 알킬이다. 특정 구현예에서, 헤테로알킬기는 치환된 헤테로C1-10 알킬이다.
본원에서 사용된 "알케닐"은 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖고 하나 이상의 탄소-탄소 이중결합, 예를 들면, 1, 2, 3, 또는 4 이중결합을 갖고, 탄소-탄소 삼중 결합은 없는 직쇄 또는 분지된 비치환된 탄화수소기의 라디칼("C2-10 알케닐")을 의미한다. 일부의 구현예에서, 알케닐기는 2 내지 9개의 탄소원자를 갖는다("C2-9 알케닐"). 일부의 구현예에서, 알케닐기는 2 내지 8개의 탄소원자를 갖는다("C2-8 알케닐"). 일부의 구현예에서, 알케닐기는 2 내지 7개의 탄소원자를 갖는다("C2-7 알케닐"). 일부의 구현예에서, 알케닐기는 2 내지 6개의 탄소원자를 갖는다("C2-6 알케닐"). 일부의 구현예에서, 알케닐기는 2 내지 5개의 탄소원자를 갖는다("C2-5 알케닐"). 일부의 구현예에서, 알케닐기는 2 내지 4개의 탄소원자를 갖는다("C2-4 알케닐"). 일부의 구현예에서, 알케닐기는 2 내지 3개의 탄소원자를 갖는다("C2-3 알케닐"). 일부의 구현예에서, 알케닐기는 2개의 탄소원자를 갖는다("C2 알케닐"). 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합은 내부(예를 들면 2-부테닐) 또는 말단(예를 들면 1-부테닐)에 있을 수 있다. C2-4 알케닐기의 실예는 에테닐(C2), 1-프로페닐(C3), 2-프로페닐(C3), 1-부테닐(C4), 2-부테닐(C4), 부타디에닐(C4), 및 등등을 포함한다. C2-6 알케닐기의 실예는 상기 언급된 C2-4 알케닐기 뿐만 아니라 펜테닐(C5), 펜타디에닐(C5), 헥세닐(C6) 및 등등을 포함한다. 알케닐의 추가 실예는 헵테닐(C7), 옥테닐(C8), 옥타트리에닐(C8) 및 등등을 포함한다. 다르게 특정되지 않는 이상 알케닐기의 각각의 경우는 독립적으로 비치환된("비치환된 알케닐") 또는 하나 이상의 치환체로 치환된("치환된 알케닐")이다. 특정 구현예에서, 상기 알케닐기는 비치환된 C2-10알케닐이다. 특정 구현예에서, 알킬기는 치환된 C2-10알케닐이다.
"헤테로알케닐"은 본원에서 정의된 알케닐기를 말하며, 여기서 적어도 하나의 산소, 질소 또는 황 헤테로원자(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 1-2, 1-3, 1-4, 2-4, 3-4, 또는 2-3 헤테로원자 포함)가 알케닐 체인의 백본에 존재되며, 예를 들면 알케닐 체인의 하나 이상의 탄소원자 사이에 존재한다. 특정 구현예에서 헤테로알케닐기는 비치환된 헤테로C2-10 알케닐이다. 특정 구현예에서, 헤테로알킬기는 치환된 헤테로C2-10 알케닐이다.
본원에서 사용된 "알키닐"은 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖고 하나 이상의 탄소-탄소 삼중결합, 예를 들면, 1, 2, 3, 또는 4 삼중결합을 갖고, 선택적으로 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합, 예를 들면, 1, 2, 3, 또는 4 이중결합을 갖는 직쇄 또는 분지된 비치환된 탄화수소기의 라디칼("C2-10 알키닐")을 의미한다. 하나 이상의 이중 결합을 포함하는 알키닐기는 "엔-인(ene-yne)"로서 나타낸다. 일부의 구현예에서, 알키닐기는 2 내지 9개의 탄소원자를 갖는다("C2-9 알키닐"). 일부의 구현예에서, 알키닐기는 2 내지 8개의 탄소원자를 갖는다("C2-8 알키닐"). 일부의 구현예에서, 알키닐기는 2 내지 7개의 탄소원자를 갖는다("C2-7 알키닐"). 일부의 구현예에서, 알키닐기는 2 내지 6개의 탄소원자를 갖는다("C2-6 알키닐"). 일부의 구현예에서, 알키닐기는 2 내지 5개의 탄소원자를 갖는다("C2-5 알키닐"). 일부의 구현예에서, 알케닐기는 2 내지 4개의 탄소원자를 갖는다("C2-4 알케닐"). 일부의 구현예에서, 알키닐기는 2 내지 3개의 탄소원자를 갖는다("C2-3 알키닐"). 일부의 구현예에서, 알키닐기는 2개의 탄소원자를 갖는다("C2알키닐"). 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합은 내부(예를 들면 2-부티닐) 또는 말단(예를 들면 1-부티닐)에 있을 수 있다. C2-4 알키닐기의 실예는 제한되는 것 없이 에티닐(C2), 1-프로피닐(C3), 2-프로피닐(C3), 1-부티닐(C4), 2-부티닐(C4), 및 등등을 포함한다. C2-6 알키닐기의 실예는 상기 언급된 C2-4 알키닐기 뿐만 아니라 펜티닐(C5), 헥시닐(C6) 및 등등을 포함한다. 추가적인 알키닐기의 실예는 헵티닐(C7), 옥티닐(C8) 및 등등을 포함한다. 다르게 특정되지 않는 이상 알키닐기의 각각의 경우는 독립적으로 비치환된("비치환된 알키닐") 또는 하나 이상의 치환체로 치환된("치환된 알키닐")이다. 특정 구현예에서, 상기 알키닐기는 비치환된 C2-10알키닐이다. 특정 구현예에서, 알킬기는 치환된 C2-10알키닐이다.
"헤테로알키닐"은 본원에서 정의된 알키닐기를 말하며, 여기서 적어도 하나의 산소, 질소 또는 황 헤테로원자(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 1-2, 1-3, 1-4, 2-4, 3-4, 또는 2-3 헤테로원자 포함)가 알키닐 체인의 백본에 존재되며, 예를 들면 알키닐 체인의 하나 이상의 탄소원자 사이에 존재한다. 특정 구현예에서 헤테로알키닐기는 비치환된 헤테로C2-10 알키닐이다. 특정 구현예에서, 헤테로알킬기는 치환된 헤테로C2-10 알키닐이다.
본원에서 사용된 "카르보시클릴(carbocyclyl)"은 3 내지 10개의 고리 탄소 원자("C3-10 카르보시클릴")를 갖고, 비방향족 고리 시스템에서 0개의 헤테로원자를 갖는 비-방향족 시클릭 탄화수소기의 라디칼을 말한다. 일부 구현예에서, 카르보시클릴기는 3 내지 8개의 고리 탄소 원자("C3-8 카르보시클릴")을 갖는다. 일부 구현예에서, 카르보시클릴기는 3 내지 6개의 고리 탄소 원자("C3-6 카르보시클릴")을 갖는다. 일부 구현예에서, 카르보시클릴기는 3 내지 6개의 고리 탄소 원자("C3-6 카르보시클릴")을 갖는다. 일부 구현예에서, 카르보시클릴기는 5 내지 10개의 고리 탄소 원자("C5-10 카르보시클릴")을 갖는다. 예시적인 C3-6 카르보시클릴기는 제한됨 없이 시클로프로필 (C3), 시클로프로페닐 (C3), 시클로부틸 (C4), 시클로부테닐 (C4), 시클로펜틸 (C5), 시클로펜테닐 (C5), 시클로헥실 (C6), 시클로헥세닐 (C6), 시클로헥사디에닐 (C6), 및 등등을 포함한다. 예시적인 C3-8 카르보시클릴기는 제한함 없이 상기 언급된 C3-6 카르보시클릴기 뿐만 아니라 시클로헵틸 (C7), 시클로헵테닐 (C7), 시클로헵타디에닐 (C7), 시클로헵타트리에닐 (C7), 시클로옥틸(C8), 시클로옥테닐 (C8), 바이시클로[2.2.1]헵타닐 (C7), 바이시클로[2.2.2]옥타닐(C8)을 포함한다. 예시적인 C3-10 카르보시클릴기는 제한함 없이 상기 언급된 C3-8 카르보시클릴기 뿐만 아니라 시클로노닐 (C9), 시클로노네닐 (C9), 시클로데실 (C10), 시클로데세닐 (C10), 옥타히드로-1H-인데닐 (C9), 데카히드로나프탈레닐 (C10), 스피로[4.5]데카닐 (C10), 및 등등을 포함한다. 상기 실시예에서 설명하는 바와 같이, 특정 구현예에서, 카르보시클릴기는 모노시클릭("모노시클릭 카르보시클릴") 또는 폴리시클릭(예를 들면, 바이시클릭 시스템과 같은 융합된, 연결된 또는 스피로 고리 시스템("바이시클릭 카르보시클릴") 또는 트리시클릭 시스템("트리시클릭 카르보시클릴"))이고, 포화될 수 있거나 하나 이상의 탄소-탄소 이중결합 또는 삼중 결합을 포함할 수 있다. "카르보시클릴"은 또한 상기 정의된 바와 같은 카르보시클릴 고리가 하나 이상의 아릴 또는 헤테로아릴기와 융합되는 고리 시스템을 또한 포함하고, 여기서 부착점은 카르보시클릴 고리 상에 있고, 일부의 경우에서, 탄소의 수는 카보시클릭 고리 시스템에서 탄소의 수를 계속 지정한다. 다르게 특정되지 않는 이상, 카르보시클릴기의 각각의 경우는 독립적으로 비치환된("비치환된 카르보시클릴") 또는 하나 이상의 치환체로 치환된("치환된 카르보시클릴")다. 특정 구현예에서, 상기 카르보시클릴기는 비치환된 C3-10 카르보시클릴이다. 특정 구현예에서, 상기 카르보시클릴기는 치환된 C3-10 카르보시클릴이다.
일부 구현예에서, "카르보시클릴"은 3 내지 10개의 고리 탄소 원자를 갖는 모노시클릭, 포화된 카르보시클릴기이다("C3-10 시클로알킬"). 일부 구현예에서, 시클로알킬기는 3 내지 8개의 고리 탄소원자("C3-6 시클로알킬")을 갖는다. 일부 구현예에서, 시클로알킬기는 3 내지 6개의 고리 탄소원자("C3-6 시클로알킬")을 갖는다. 일부 구현예에서, 시클로알킬기는 5 내지 6개의 고리 탄소원자("C5-6 시클로알킬")을 갖는다. 일부 구현예에서, 시클로알킬기는 5 내지 10개의 고리 탄소원자("C5-10 시클로알킬")을 갖는다. C5-6 시클로알킬기의 실예는 시클로펜틸(C5) 및 시클로헥실(C5)을 포함한다. C3-6 시클로알킬기의 실예는 상기 언급된 C5-6 시클로알킬기 뿐만 아니라 시클로프로필(C3) 및 시클로부틸(C4)를 포함한다. C3-8 시클로알킬기의 실예는 상기 언급된 C3-6 시클로알킬기 뿐만 아니라 시클로헵틸(C7) 및 시클로옥틸(C8)을 포함한다. 다르게 특정되지 않는 이상, 시클로알킬기의 각각의 경우는 독립적으로 비치환된("비치환된 시클로알킬") 또는 하나 이상의 치환체로 치환된("치환된 시클로알킬")다. 특정 구현예에서, 상기 시클로알킬기는 비치환된 C3-10 시클로알킬이다. 특정 구현예에서, 상기 시클로알킬기는 치환된 C3-10 시클로알킬이다.
본원에서 사용된 "헤테로시클릴(heterocyclyl)"는 고리 탄소 원자와 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 3- 내지 14-원 비-방향족 고리 시스템의 라디칼을 말하고, 여기서, 각각의 헤테로원자는 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된다("3-14 원 헤테로시클릴"). 하나 이상의 질소 원자를 함유하는 헤테로시클릴기에서, 부착점은 원자가가 허용하는 바에 따라 탄소 또는 질소 원자일 수 있다. 헤테로시클릴기기는 모노시클릭("모노시클릭 헤테로시클릴") 또는 폴리시클릭(예를 들면, 바이시클릭 시스템과 같은 융합된, 연결된 또는 스피로 고리 시스템("바이시클릭 헤테로시클릴") 또는 트리시클릭 시스템("트리시클릭 헤테로시클릴"))이고, 포화될 수 있거나 하나 이상의 탄소-탄소 이중결합 또는 삼중 결합을 포함할 수 있다. 헤테로시클릴 폴리시클릭 고리 시스템은 하나 또는 모두의 고리에서 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다. "헤테로시클릴"은 또한 상기 정의된 바와 같은 헤테로시클릴 고리가 하나 이상의 아릴 또는 헤테로아릴기와 융합되는 고리 시스템을 또한 포함하고, 여기서 부착점은 헤테로시클릴 고리 상에 있고, 일부의 경우에서, 탄소의 수는 헤테로시클릭 고리 시스템에서 탄소의 수를 계속 지정한다. 다르게 특정되지 않는 이상, 헤테로시클릴기의 각각의 경우는 독립적으로 비치환된("비치환된 헤테로시클릴") 또는 하나 이상의 치환체로 치환된("치환된 헤테로시클릴")다. 특정 구현예에서, 상기 헤테로시클릴기는 비치환된 3-14원 헤테로시클릴이다. 특정 구현예에서, 상기 헤테로시클릴기는 치환된 3-14원 헤테로시클릴이다.
일부의 구현예에서, 헤테로시클릴기는 고리 탄소원자와 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5 내지 10원 비-방향족 고리 시스템이고, 여기서 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소 및 황에서 선택된다("5-10 원 헤테로시클릴"). 일부의 구현예에서, 헤테로시클릴기는 고리 탄소원자와 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5 내지 8원 비-방향족 고리 시스템이고, 여기서 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소 및 황에서 선택된다("5-8 원 헤테로시클릴"). 일부의 구현예에서, 헤테로시클릴기는 고리 탄소원자와 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5 내지 6원 비-방향족 고리 시스템이고, 여기서 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소 및 황에서 선택된다("5-6 원 헤테로시클릴"). 일부의 구현예에서, 5-6원 헤테로시클릴기는 질소, 산소 및 황에서 선택된 1 내지 3개의 고리 헤테로원자를 갖는다. 일부의 구현예에서, 5-6원 헤테로시클릴은 질소, 산소 및 황에서 선택된 1 내지 2개의 고리 헤테로원자를 갖는다. 일부의 구현예에서, 5-6원 헤테로시클릴은 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 1개의 고리 헤테로원자를 갖는다.
예시적인 1개의 헤테로원자를 포함하는 3-원 헤테로시클릴기는 제한없이, 아질디닐(azirdinyl), 옥시라닐(oxiranyl), 티오레닐(thiorenyl)을 포함한다. 예시적인 1개의 헤테로원자를 포함하는 4-원 헤테로시클릴기는 제한없이, 아제티디닐(azetidinyl), 옥세타닐(oxetanyl) 및 티에타닐(thietanyl)을 포함한다. 예시적인 1개의 헤테로원자를 함유하는 헤테로시클릴기는 제한없이, 테트리히드로퓨라닐, 디히드로퓨라닐, 테트라히드로티오페닐, 디히드로티오페닐, 피롤리디닐, 디히드로피롤릴 및 피롤릴-2,5-디온을 포함한다. 예시적인 2개의 헤테로원자를 함유하는 5원 헤테로시클릴기는 제한없이 디옥소라닐, 옥사티오라닐 및 디티오라닐을 포함한다. 예시적인 3개의 헤테로원자를 함유하는 5원 헤테로시클릴기는 제한없이 트리아졸리닐, 옥사디아졸리닐 및 티아디아졸리닐을 포함한다. 예시적인 1개의 헤테로원자를 함유하는 6원 헤테로시클릴기는 제한없이 피퍼리디닐, 테트라히드로피라닐, 디히드로피리디닐, 및 티아닐을 포함한다. 예시적인 2개의 헤테로원자를 함유하는 6원 헤테로시클릴기는 제한없이 피퍼라지닐, 몰포리닐, 디티아닐, 디옥사닐을 포함한다. 2개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 6원 헤테로시클릴기는 제한없이 트리아지나닐을 포함한다. 1개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 7원 헤테로시클릴기는 제한없이 아제파닐, 옥세파닐 및 티에파닐을 포함한다. 1개의 헤테로원자를 함유하는 예시적인 8원 헤테로시클릴기는 제한없이 아조카닐, 옥세카닐 및 티오카닐을 포함한다. 예시적인 바이시클릭 헤테로시클릴기는 제한없이 인돌리닐, 이소인돌리닐, 디히드로벤조퓨라닐, 디히도벤조티에닐, 테트라-히드로-벤조-티에닐, 테트라히드로벤조퓨라닐, 테트라히드로인돌릴, 테트라히드로퀴놀리닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 옥타히드로크로멘틸(octahydrochromenyl), 옥타히드로이소크로멘틸, 데카히드로나프티리디닐, 데카히드로-1,8-나프티리디닐, 옥타히드로피롤[3,2-b]피롤 인돌리닐, 프탈리미딜, 나프타리미딜, 크로마닐(chromanyl), 크로메닐(chromenyl), 1H-벤조[e][1,4]디아제피닐, 1,4,5,7-테트라히드로피라노[3,4-b]피롤릴, 5,6-디히드로-4H-퓨로[3,2-b]피롤릴, 6,7-디히드로-5H-퓨로[3,4-b]피라닐, 5,7-디히드로-4H-티에노[2,3-c]피라닐, 2,3-디히드로-1H-피롤로[2,3-b]피리디닐, 2,3-디히드로퓨로[2,3-b]피리디닐, 4,5,6,7-테트라히드로-1H-피롤로-[2,3-b]피리디닐, 4,5,6,7-테트라히드로퓨로[3,2-c]피리디닐, 4,5,6,7-테트라히드로티에노[3,2-b]피리디닐, 1,2,3,4-테트라히드로-1,6-나프티리디닐, 및 등등을 포함한다.
본원에서 사용된 "아릴"은 6 내지 14개의 고리 탄소 원자를 갖고 방향족 고리 시스템 내에 제공된 헤테로원자가 없는 모노시클릭 또는 폴리시클릭(예를 들면, 바이시클릭 또는 트리시클릭)4n+2 방향족 고리 시스템(예를 들면, 시클릭 어레이에서 공유된 6, 10 또는 14π 전자를 가짐)의 라디칼을 말한다("C6-14 아릴"). 일부의 구현예에서, 아릴기는 6개의 고리 탄소 원자("C6 아릴", 예를 들면 페닐)을 갖는다. 일부의 구현예에서, 아릴기는 10개의 고리 탄소 원자("C10 아릴", 예를 들면 1-나프틸 및 2-나프틸과 같은 나프틸)을 갖는다. 일부의 구현예에서, 아릴기는 14개의 고리 탄소 원자("C14 아릴", 예를 들면 안트라실)을 갖는다. "아릴"은 또한 상기 정의된 바와 같은 아릴 고리가 하나 이상의 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴기와 융합되는 고리 시스템을 포함하고, 여기서, 라디칼 또는 부착점은 아릴 고리 상에 있고, 이런 경우에서, 탄소 원자 수는 아릴 고리 시스템에서 탄소 원자의 수를 계속적으로 지정한다. 다른 특이적인 상황이 없다면, 아릴기의 각각의 경우는 독립적으로 비치환된("비치환된 아릴") 또는 하나 이상의 치환체로 치환된("치환된 아릴")다. 특정 구현예에서, 상기 아릴기는 비치환된 C6-14 아릴이다. 특정 구현예에서, 상기 아릴기는 치환된 C6-14 아릴이다.
"알알킬(Aralkyl)"은 "알킬"의 부분집합이고, 본원에서 정의된 바와 같은 아릴기에 의해 치환된 본원에서 정의된 바와 같은 알킬기를 말하고, 여기서 부착점은 알킬 모이어티 상에 있다.
본원에서 사용된 "헤테로아릴"은 고리 탄소 원자를 갖고 방향족 고리 시스템 내에 제공된 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5-14원 모노시클릭 또는 폴리시클릭(예를 들면, 바이시클릭 또는 트리시클릭)4n+2 방향족 고리 시스템(예를 들면, 시클릭 어레이에서 공유된 6, 10 또는 14π 전자를 가짐)의 라디칼을 말하고("C6-14 아릴"), 여기서 각각의 헤테로원자는 질소, 산소 및 황("5-14원 헤테로아릴")로부터 독립적으로 선택된다. 하나 이상의 질소 원자를 함유하는 헤테로아릴기에서, 부착점은 원자가에 따라서 탄소 또는 질소 원자일 수 있다. 헤테로아릴 폴리시클릭 고리 시스템은 하나 또는 모두의 고리에서 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다. "헤테로아릴"은 상기 정의된 바와 같은 헤테로아릴 고리가 하나 이상의 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴기로 융합되어지고, 여기서 부착점은 헤테로아릴 고리상에 있고, 이런 경우에서, 고리 멤버의 수는 헤테로아릴 고리 시스템에서 고리 멤버의 수를 계속적으로 지정하는 고리 시스템을 포함한다. "헤테로아릴"은 또한 고리 시스템을 포함하고, 여기서 헤테로아릴 고리는 상기 정의된 바와 같이 하나 이상의 아릴기로 융합되고, 여기서 부착 점은 아릴 또는 헤테로아릴 고리 상에 있고, 이런 경우에서, 고리 멤버의 수는 융합된 폴리시클릭(아릴/헤테로아릴) 고리 시스템에서 고리 멤버의 수를 계속적으로 지정한다. 하나의 고리가 헤테로원자를 함유하지 않는 폴리시클릭 헤테로아릴 기(예를 들면, 인돌릴, 퀴놀리닐, 카바졸릴 및 등등)에서, 부착점은 고리, 즉 헤테로원자를 함유하는 고리(예를 들면, 2-인돌릴) 또는 헤테로원자를 함유하지 않는 고리(예를 들면, 5-인돌릴)일 수 있다.
일부의 구현예에서, 헤테로아릴기는 고리 탄소 원자와 방향족 고리 시스템에서 제공된 1-4 고리 헤테로원자를 갖는 5 내지 10원 방향족 고리 시스템이고, 여기서 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소 및 황으로부터 선택된다("5-10원 헤테로아릴"). 일부의 구현예에서, 헤테로아릴기는 고리 탄소 원자와 방향족 고리 시스템에서 제공된 1 내지 4 고리 헤테로원자를 갖는 5-8원 방향족 고리 시스템이고, 여기서 각각의 헤테로원자는 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된다("5-8원 헤테로아릴"). 일부의 구현예에서, 헤테로아릴기는 고리 탄소 원자와 방향족 고리 시스템에서 제공된 1 내지 4 고리 헤테로원자를 갖는 5-6원 방향족 고리 시스템이고, 여기서 각각의 헤테로원자는 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된다("5-6원 헤테로아릴"). 일부의 구현예에서, 5-6원 헤테로아릴은 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 1 내지 3 고리 헤테로원자를 갖는다. 일부의 구현예에서, 5-6원 헤테로아릴은 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 1 내지 2 고리 헤테로원자를 갖는다. 일부의 구현예에서, 5-6원 헤테로아릴은 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 1 고리 헤테로원자를 갖는다. 다른 특이적인 사황이 없다면, 헤테로아릴기의 각각의 경우는 독립적으로 비치환된("비치환된 헤테로아릴") 또는 하나 이상의 치환체로 치환된("치환된 헤테로아릴")다. 특정 구현예에서, 상기 헤테로아릴기는 비치환된 5-14원 헤테로아릴이다. 특정 구현예에서, 상기 아릴기는 치환된 5-14원 헤테로아릴이다.
1 헤테로원자를 함유하는 예시적인 5원 헤테로아릴기는 제한없이, 피롤릴, 퓨라닐 및 티오페닐을 포함한다. 2 헤테로원자를 함유하는 예시적인 5-원 헤테로아릴기는 제한없이, 이미다졸릴, 피라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 및 이소티아졸릴을 포함한다. 3 헤테로원자를 함유하는 예시적인 5원 헤테로아릴기는 제한없이 트리아졸릴, 옥사디아졸릴, 및 티아디아졸릴를 포함한다. 4 헤테로원자를 함유하는 예시적인 5원 헤테로아릴기는 제한없이 테트라졸릴를 포함한다. 1 헤테로원자를 함유하는 예시적인 6원 헤테로알리기는 제한없이, 피리디닐을 포함한다. 2 헤테로원자를 함유하는 예시적인 6원 헤테로아릴기는 제한없이 피리다지닐, 피리미디닐, 및 피라지닐를 포함한다. 3 또는 4 헤테로원자를 함유하는 예시적인 6원 헤테로알리기는 제한없이 트리아지닐 및 테트라지닐을 각각 포함한다. 1 헤테로원자를 함유하는 예시적인 7원 헤테로아릴기는 제한없이 아제피닐, 옥세피닐, 및 티에피닐을 포함한다. 예시적인 5,6-바이시클릭 헤테로아릴기는 제한없이 인돌릴, 이소인돌릴, 인다졸릴, 벤조트리아졸릴, 벤조티오페닐, 이소벤조티오페닐, 벤조퓨라닐, 벤조이소퓨라닐, 벤지미다졸릴, 벤족사졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤족사디아졸릴, 벤즈티아졸릴, 벤즈이소티아졸릴, 벤즈티아디아졸릴, 인돌리지닐, 및 퓨리닐을 포함한다. 예시적인 6,6-바이시클릭 헤테로알리기는 제한없이 나프티리디닐, 프테리디닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 신놀리닐, 퀴녹살리닐, 프탈라지닐 및 퀴나졸리닐을 포함한다. 예시적인 트리시클릭 헤테로아릴기는 제한없이 페난트리디닐, 디벤조퓨라닐, 카바졸릴, 아크리디닐, 페노티아지닐, 페녹사지닐 및 페날지닐을 함유한다.
"헤테로알알킬"은 "알킬"의 부분집합이고, 본원에서 정의된 바와 같은 헤테로아릴기에 의해 치환된 본원에서 정의된 바와 같은 알킬기이고, 여기서 부착점은 알킬 모이어티 상에 있다.
본원에서 사용된 용어 "부분적으로 불포화된"은 적어도 하나의 이중 또는 삼중 결합을 포함하는 고리 모이어티를 말한다. 상기 용어 "부분적으로 불포화된"은 다중 사이트의 불포화도를 갖는 고리를 포함한다고 여기지만, 본원에서 정의된 바와 같은 방향족기(예를 들면, 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티)를 포함한다고 여겨지지 않는다.
본원에서 정의된 바와 같은 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 카르보시클릴, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴기는 선택적으로 치환된다(즉, 치환된 또는 비치환된). 일반적으로, 용어 "치환된"은 "선택적으로"의 용어가 있든 또는 없든 적어도 하나의 수소가 기(예를 들면, 탄소 또는 질소 원자) 상에 있는 것을 의미하고, 허용되는 치환체, 예를 들면 치환에 의해 안정한 화합물, 예를 들면, 재배치, 고리화, 제거 또는 기타 반응과 같은 것에 의해 자발적으로 변형되지 않는 화합물이 얻어지는 치환체로 교체된다. 다르게 지적되지 않는 이상, "치환된" 기는 기의 하나 이상의 치환가능한 위치에서 치환체를 갖고, 주어진 임의의 구조에서 하나 이상의 위치가 치환되는 경우, 치환체는 각각의 위치에서 동일하거나 다를 수 있다. 본 발명은 안정한 화합물에 도달하기 위하여 이런 임의의 및 모든 조합을 고려한다. 본 발명의 목적을 위해, 질소와 같은 헤테로원자는 본원에서 정의된 바와 같은 헤테로원자의 원자가를 만족하고 안정한 모이어티의 형성을 초래하는 수소 치환체 및/또는 임의의 적합한 치환체를 가질 수 있다.
예시적인 탄소 원자 치환체는 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 할로겐, -CN, -NO2, -N3, -SO2H, -SO3H, -OH, -ORaa, -ON(Rbb)2, -N(Rbb)2, -N(Rbb)3 +X- -N(ORcc)Rbb, -SH, -SRaa, -SSRcc, -C(=O)Raa, -CO2H, -CHO, -C(ORcc)2, -CO2Raa, -OC(=O)Raa, -OCO2Raa, -C(=O)N(Rbb)2, -OC(=O)N(Rbb)2, -NRbbC(=O)Raa, -NRbbCO2Raa, -NRbbC(=O)N(Rbb)2, -C(=NRbb)Raa, -C(=NRbb)ORaa, -OC(=NRbb)Raa, -OC(=NRbb)ORaa, -C(=NRbb)N(Rbb)2, -OC(=NRbb)N(Rbb)2, -NRbbC(=NRbb)N(Rbb)2, -C(=O)NRbbSO2Raa, -NRbbSO2Raa, -SO2N(Rbb)2, -SO2Raa, -SO2ORaa, -OSO2Raa, -S(=O)Raa, -OS(=O)Raa, -Si(Raa)3, -OSi(Raa)3 -C(=S)N(Rbb)2, -C(=O)SRaa, -C(=S)SRaa, -SC(=S)SRaa, -SC(=O)SRaa, -OC(=O)SRaa, -SC(=O)ORaa, -SC(=O)Raa, -P(=O)2Raa, -OP(=O)2Raa, -P(=O)(Raa)2, -OP(=O)(Raa)2, -OP(=O)(ORcc)2, -P(=O)2N(Rbb)2, -OP(=O)2N(Rbb)2, -P(=O)(NRbb)2, -OP(=O)(NRbb)2, -NRbbP(=O)(ORcc)2, -NRbbP(=O)(NRbb)2, -P(Rcc)2, -P(Rcc)3, -OP(Rcc)2, -OP(Rcc)3, -B(Raa)2, -B(ORcc)2, -BRaa(ORcc), C1-10 알킬, C1-10 퍼할로알킬, C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, C3-10 카르보시클릴, 3-14원 헤테로시클릴, C6-14 아릴, 및 5-14원 헤테로아릴를 포함하고, 여기서, 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보시클릴, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5 Rdd 기들로 치환된다;
또는 탄소 원자 상에 2개의 제미널(geminal) 수소가 기 =O, =S, =NN(Rbb)2, =NNRbbC(=O)Raa, =NNRbbC(=O)ORaa, =NNRbbS(=O)2Raa, =NRbb 또는 =NORcc로 교체되고;
Raa의 각각의 경우는 독립적으로 C1-10 알킬, C1-10 퍼할로알킬, C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, C3-10 카르보시클릴, 3-14원 헤테로시클릴, C6-14 아릴 및 5-14원 헤테로아릴로부터 선택되거나, 2개의 Raa기는 3-14원 헤테로시클릴 또는 5-14원 헤테로아릴 고리를 형성하기 위해 합쳐지고, 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보시클릴, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5 Rdd 기로 독립적으로 치환되고;
Rbb의 각각의 경우는 독립적으로 -OH, -ORaa, -N(Rcc)2, -C(=O)Raa, -C(=O)N(Rcc)2, -CO2Raa, -SO2Raa, -C(=NRcc)ORaa, -C(=NRcc)N(Rcc)2, -SO2N(Rcc)2, -SO2Rcc, -SO2ORcc, -SORaa, -C(=S)N(Rcc)2, -C(=O)SRcc, -C(=S)SRcc, -P(=O)2Raa, -P(=O)(Raa)2, -P(=O)2N(Rcc)2, -P(=O)(NRcc)2, C1-10 알킬, C1-10 퍼할로알킬, C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, C3-10 카르보시클릴, 3-4원 헤테로시클릴, C6-14 아릴, 및 5-14원 헤테로아릴로부터 선택되거나, 또는 2개의 Rbb 기들은 3-14원 헤테로시클릴 또는 5-14원 헤테로아릴 고리를 형성하기 위해 합쳐지고, 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보시클릴, 헤테로시클릴, 아릴, 및 헤테로아릴은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5 Rdd 기들로 치환되고;
Rcc의 각각의 경우에서는 수소, C1-10 알킬, C1-10 퍼할로알킬, C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, C3-10 카르보시클릴, 3-14원 헤테로시클릴, C6-14 아릴 및 5-14원 헤테로아릴로부터 선택되거나, 또는 2개의 Rcc 기들은 3-14원 헤테로시클릴 또는 5-14원 헤테로아릴 고릴을 형성하기 위해 합쳐지고, 여기서, 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보시클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5 Rdd 기들로 치환되고;
Rdd의 각각의 경우, 독립적으로, 할로겐, -CN, -NO2, -N3, -SO2H, -SO3H, -OH, -ORee, -ON(Rff)2, -N(Rff)2, -N(Rff)3 +X- -N(ORee)Rff, -SH, -SRee, -SSRee, -C(=O)Ree, -CO2H, -CO2Ree, -OC(=O)Ree, -OCO2Ree, -C(=O)N(Rff)2, -OC(=O)N(Rff)2, -NRffC(=O)Ree, -NRffCO2Ree, -NRffC(=O)N(Rff)2, -C(=NRff)ORee, -OC(=NRff)Ree, -OC(=NRff)ORee, -C(=NRff)N(Rff)2, -OC(=NRff)N(Rff)2, -NRffC(=NRff)N(Rff)2, -NRffSO2Ree, -SO2N(Rff)2, -SO2Ree, -SO2ORee, -OSO2Ree, -S(=O)Ree, -Si(Ree)3, -OSi(Ree)3, -C(=S)N(Rff)2, -C(=O)SRee, -C(=S)SRee, -SC(=S)SRee, -P(=O)2Ree, P(=O)(Ree)2, -OP(=O)(Ree)2, -OP(=O)(ORee)2, C1-6 알킬, C1-6 퍼할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-10 카르보시클릴, 3-10원 헤테로시클릴, C6-10 아릴, 5-10원 헤테로아릴로부터 선택되고 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보시클릴, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5 Rgg 기로 치환되거나, 두개의 제미널 Rdd 치환체는 =O 또는 =S 를 형성하기 위해 합쳐질 수 있고;
각각의 Ree의 경우에서 독립적으로, C1-6 알킬, C1-6 퍼할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-10 카르보시클릴, 3-10원 헤테로시클릴, C6-10 아릴, 및 3-10원 헤테로아릴로부터 선택되고, 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보시클릴, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5 Rgg 기로 치환되고;
각각의 Rff의 경우에서 독립적으로, 수소, C1-6 알킬, C1-6 퍼할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-10 카르보시클릴, 3-10원 헤테로시클릴, C6-10 아릴, 및 3-10원 헤테로아릴로부터 선택되거나, 두 개의 Rff기는 3-14원 헤테로시클릴 또는 5-14원 헤테로아릴 고리를 형성하기 위해 합쳐지고, 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보시클릴, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5 Rgg 기로 치환되고;
각각의 Rgg의 경우는 독립적으로 할로겐, -CN, -NO2, -N3, -SO2H, -SO3H, -OH, -OC1-6알킬, -ON(C1-6 알킬)2, -N(C1-6 알킬)2, -N(C1-6 알킬)3 +X-, -NH(C1-6 알킬)2 +X-, -NH2(C1-6 알킬) +X- -NH3 +X-, -N(OC1-6 알킬)(C1-6 알킬), -N(OH)(C1-6 알킬), -NH(OH), -SH, -SC1-6 알킬, -SS(C1-6 알킬), -C(=O)(C1-6 알킬), -CO2H, -CO2(C1-6 알킬), -OC(=O)(C1-6 알킬), -OCO2(C1-6 알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)N(C1-6 알킬)2, -OC(=O)NH(C1-6 알킬), -NHC(=O)(C1-6 알킬), -N(C1-6 알킬)C(=O)(C1-6 알킬), -NHCO2(C1-6 알킬), -NHC(=O)N(C1-6 알킬)2, -NHC(=O)NH(C1-6 알킬), -NHC(=O)NH2, -C(=NH)O(C1-6 알킬), -OC(=NH)(C1-6 알킬), -OC(=NH)OC1-6 알킬, -C(=NH)N(C1-6 알킬)2, -C(=NH)NH(C1-6 알킬), -C(=NH)NH2, -OC(=NH)N(C1-6 알킬)2, -OC(NH)NH(C1-6 알킬), -OC(NH)NH2, -NHC(NH)N(C1-6 알킬)2, -NHC(=NH)NH2, -NHSO2(C1-6 알킬), -SO2N(C1-6 알킬)2, -SO2NH(C1-6 알킬), -SO2NH2, -SO2C1-6 알킬, -SO2OC1-6 알킬, -OSO2C1-6 알킬, -SOC1-6 알킬, -Si(C1-6 알킬)3, -OSi(C1-6 알킬)3, -C(=S)N(C1-6 알킬)2, C(=S)NH(C1-6 알킬), C(=S)NH2, -C(=O)S(C1-6 알킬), -C(=S)SC1-6 알킬, -SC(=S)SC1-6 알킬, -P(=O)2(C1-6 알킬), -P(=O)(C1-6 알킬)2, -P(=O)(C1-6 알킬)2, -OP(=O)(OC1-6 알킬)2, C1-6 알킬, C1-6 퍼할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-10 카르보시클릴, C6-10 아릴, 3-10원 헤테로시클릴, 5-10원 헤테로시클릴이거나, 또는 2개의 제미널 Rgg 치환체는 =O 또는 =S를 형성하기 위해 합쳐질 수 있고;
여기서, X-는 카운터이온이다.
본원에서 사용된, 용어 "히드록실" 또는 "히드록시"는 -OH기를 말한다. 확장된 용어 "치환된 히드록실" 또는 "치환된 히드록시"은 모분자에 직접적으로 부착된 산소 원자가 수소 이외에 기로 치환된 히드록실기를 말하며, -ORaa, -ON(Rbb)2, -OC(=O)SRaa, -OC(=O)Raa, -OCO2Raa, -OC(=O)N(Rbb)2, -OC(=NRbb)Raa, -OC(=NRbb)ORaa, -OC(=NRbb)N(Rbb)2, -OS(=O)Raa, -OSO2Raa, -OSi(Raa)3, -OP(Rcc)2, -OP(Rcc)3, -OP(=O)2Raa, -OP(=O)(Raa)2, -OP(=O)(ORcc)2, -OP(=O)2N(Rbb)2, 및 -OP(=O)(NRbb)2로부터 선택된 기를 포함하고, 여기서 Raa, Rbb, 및 Rcc 는 본원에서 정의된 바와 같다.
본원에서 사용된 용어 "티올" 또는 "티오"는 -SH기를 말한다. 확장된 용어 "치환된 티올" 또는 "치환된 티오"는 모분자에 직접적으로 부착된 황 원자가 수소 이외의 기로 치환되는 티올기를 말하며, -SRaa, -S=SRcc, -SC(=S)SRaa, -SC(=O)SRaa, -SC(=O)ORaa, 및 -SC(=O)Raa,로부터 선택된 기를 포함하고, 여기서 Raa 및 Rcc 는 본원에서 정의된 바와 같다.
본원에서 사용된 용어 "아미노"는 기 -NH2를 말한다. 확장된 용어 "치환된 아미노기"는 본원에서 정의된 바와 같이 모노치환된 아미노, 이치환된 아미노, 또는 삼치환된 아미노를 말한다. 특정 구현예에서, "치환된 아미노"는 모노치환된 아미노 또는 이치환된 아미노기이다.
본원에서 사용된 용어 "모노치환된 아미노"는 모원자에 직접적으로 부착된 질소 원자가 수소 이외의 기로 치환된 아미노기를 말하며, -NH(Rbb), -NHC(=O)Raa, -NHCO2Raa, -NHC(=O)N(Rbb)2, -NHC(=NRbb)N(Rbb)2, -NHSO2Raa, -NHP(=O)(ORcc)2, 및 -NHP(=O)(NRbb)2로부터 선택된 기를 포함하고, 여기서 Raa, Rbb 및 Rcc는 본원에서 정의된 바와 같고, 여기서, 기 -NH(Rbb)의 Rbb는 수소가 아니다.
본원에서 사용된 용어 "이치환된 아미노"는 모원자에 직접적으로 부착된 질소 원자가 수소 이외의 2개의 기로 치환된 아미노기를 말하며, -N(Rbb)2, -NRbb C(=O)Raa, -NRbbCO2Raa, -NRbbC(=O)N(Rbb)2, -NRbbC(=NRbb)N(Rbb)2, -NRbbSO2Raa, -NRbbP(=O)(ORcc)2, 및 -NRbbP(=O)(NRbb)2로부터 선택된 기를 포함하고, 여기서 Raa, Rbb 및 Rcc는 본원에서 정의된 바와 같고, 단 모원자에 직접적으로 부착된 질소 원자는 수소로 치환된 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어 "삼치환된 아미노"는 모원자에 직접적으로 부착된 질소 원자가 수소 이외의 3개의 기로 치환된 아미노기를 말하며, -N(Rbb)3, -N(Rbb)3 +X-로부터 선택된 기를 포함하고, 여기서 Rbb 및 X-는 본원에서 정의된 바와 같다.
본원에서 사용된 용어 "옥소"는 기 =O를 말하고, "티오옥소"는 기 =S를 말한다.
본원에서 사용된, "카운터이온"은 전기적 중성을 유지하기 위하여 양으로 하전된 사차 아민과 관련된 음으로 하전된 기이다. 예시적으로 카운터이온은 할라이드 이온(예를 들면, F-, Cl- , Br- , I-), NO3 -, ClO4 -, OH-, H2PO4 - HSO4 -, 설포네이트 이온(예를 들면, 메탄설포네이트, 트리플루오로메탄설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 벤젠설포네이트, 1-장뇌 설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 나프탈렌-1-술폰산-5-설포네이트, 에탄-1-술폰산-2-설포네이트, 및 등등), 및 카르복실레이트 이온(예를 들면, 아세테이ㅌ, 에타노에이트, 프로파노에이트, 벤조에이트, 글리세레이트, 락테이트, 타르트레이트, 글리콜레이트, 및 등등)을 포함한다.
질소 원자는 원자가가 허용되는 바에 따라 치환될 수 있거나 비치환될 수 있고, 일차, 이차, 삼차 및 사차 질소 원자를 포함한다. 예시적인 질소 원자 치환체는 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 수소, -OH, -ORaa, -N(Rcc)2, -CN, -C(=O)Raa, -C(=O)N(Rcc)2, -CO2Raa, -SO2Raa, -C(=NRbb)Raa, -C(=NRcc)ORaa, -C(=NRcc)N(Rcc)2, -SO2N(Rcc)2, -SO2Rcc, -SO2ORcc, -SORaa, -C(=S)N(Rcc)2, -C(=O)SRcc, -C(=S)SRcc, -P(=O)2Raa, -P(=O)(Raa)2, -P(=O)2N(Rcc)2, -P(=O)(NRcc)2, C1-10 알킬, C1-10 퍼할로알킬, C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, C3-10 카르보시클릴, 3-14원 헤테로시클릴, C6-14 아릴, 및 5-14원 헤테로아릴을 포함하고, 또는 2개의 Rcc기들은 N 원자에 부착되어 3-4원 헤테로시클릴 또는 5-4원 헤테로아릴 고리를 형성하기 위해 합쳐지고, 여기서, 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보시클릴, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5 Rdd 기로 독립적으로 치환되고, 여기서 Raa, Rbb, Rcc 및 Rdd는 상기에서 정의된 바와 같다.
특정 구현예에서, 질소 원자에 존재하는 치환체는 아미노 보호기이다. 아미노보호기는 이것으로 제한되는 것은 아니지만, -OH, -ORaa, -N(Rcc)2, -C(=O)Raa, -C(=O)N(Rcc)2, -CO2Raa, -SO2Raa, -C(=NRbb)Raa, -C(=NRcc)ORaa, -C(=NRcc)N(Rcc)2, -SO2N(Rcc)2, -SO2Rcc, -SO2ORcc, -SORaa, -C(=S)N(Rcc)2, -C(=O)SRcc, -C(=S)SRcc, C1-10 알킬(예를 들면, 알알킬, 헤테로알알킬), C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, C3-10 카르보시클릴, 3-14원 헤테로시클릴, C6-14 아릴, 및 5-14원 헤테로아릴을 포함하고, 여기서, 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보시클릴, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5 Rdd 기로 독립적으로 치환되고, 여기서 Raa, Rbb, Rcc 및 Rdd는 상기에서 정의된 바와 같다. 아미노 보호기는 이 분야에 잘 알려져 있으며, 문헌[Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene 및 P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999]에 상세히 설명된 것을 포함하고, 이 문헌은 참조로서 포함된다.
이들 및 기타 예시적인 치환체가 상세한 설명, 실시예 및 청구항에 보다 상세히 설명되어 있다. 본 발명은 치환체의 상기 예시적으로 나열한 것에 의해 임의의 방식으로 제한된다고 여겨지지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "염" 또는 "제약학적으로 허용가능한 염"은 과도한 독성, 자극 , 알러지 반응 및 등등 없이 사람 및 하위 동물의 조직과 접촉시 사용하기에 의료적 판단의 범위내에서 적합하고, 합리적인 이점/위험 비율과 어울리는 염들을 말한다. 제약학적으로 허용가능한 염은 이 분야에 잘 알려진 것이다. 예를 들면, S.M. Berge et al.,은 J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19.에서 보다 상세한 제약학적으로 허용가능한 염들을 설명한다. 본 발명의 화합물의 제약학적으로 허용가능한 염은 적합한 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유도된 것들을 포함한다. 제약학적으로 허용가능한 비독성 산 부가 염의 실예는 염산, 브롬산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산으로 형성된 아미노기의 염 또는 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산, 및 말론산과 같은 유기산으로 형성된 또는 이온 교환과 같은 이 분야에서 사용된 기타 방법을 사용하는 것으로 형성된 아미노기의 염이다. 기타 제약학적으로 허용가능한 염은 아디프산염, 알기닌산염, 아스코르브산염, 아스파탐산염, 벤조산염, 중황산염, 보론산염, 부티르산염, 장뇌산염, 캄포술폰산염, 시트르산염, 시클로펜타프로피온산염, 디글루콘산염, 도데실황산염, 에탄술폰산염, 포름산염, 퓨말산염, 글로헵톤산염, 글리세로인산염, 글루콘산염, 헤미황산염, 헵타논산염, 헥사논산염, 요오드산염, 2-히드록시-에탄술폰산염, 락토바이온산염, 락트산염, 라우르산염, 라우릴 황산염, 말산염, 말레인산염, 말론산염, 메탄술폰산염, 2-나프탈렌술폰산염, 니코틴산염, 질산염, 올레산염, 옥살산염, 팔미트산염, 파몬산염, 펙틴산염, 과황산염, 3-페닐프로피온산염, 인산염, 프크른산염, 피발산염, 프로피온산염, 스테아르산염, 숙산삼염, 황산염, 타르타르산염, 티오시안산염, p-톨루엔설폰산염, 운데카논산염, 발레르산염 및 등등을 포함한다. 적절한 염기로부터 유도된 염은 알칼리 금속, 알칼리토 금속, 암모늄 및 N+(C1-4알킬)4염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리토 금속염은 나트륨, 리튬, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 및 등등을 포함한다. 추가로 제약학적으로 허용가능한 염은, 적절한 경우, 할라이드, 히드록사이드, 카르복실산염, 황산염, 인산염, 질산염, 저급 알킬 술폰산염 및 아릴 술폰산염과 같은 카운터이온을 사용하여 형성된 비독성 암모늄, 사차 암모늄, 및 아민 양이온을 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "프로드러그"는 모 화합물을 방출하기 위한 신체 내의 변형을 요구하는 모 화합물의 유도체를 말한다. 특정 경우에서, 프로드러그는 모 화합물에 비하여 개선된 물리적 및/또는 전달 특성을 갖는다. 프로드러그는 전형적으로 제약학적으로 및/또는 제약동력학적으로 기초된 모 화합물과 관련된 특성을 개선시키기 위해 전형적으로 디자인된다. 프로드러그의 이점은 모 화합물과 비교되는 생리학적 pH에서, 예를 들면, 강화된 비경구 투여와 같은 물리적 특성에 있거나 또는 이것은 소화 트랙으로부터 흡수를 강화하거나 이것은 장기간 저장을 위한 약 안정성을 강화할 수도 있다.
본원에서 사용된 용어 "호변이체"는 분자의 다른 원자에 대해서 수소 및 이중 결합이 변화된 위치를 갖는 화합물의 특정 이성질체를 말한다. 호변이체 한쌍이 존재하기 위해, 상호전환에 대한 메카니즘이 있어야 한다. 호변이체의 실예는 케토-에놀 형태, 이민-엔아민 형태, 아미드-이미노 알콜 형태, 아미딘-아미니딘 형태, 니트로소-옥심 형태, 티오 케토-엔티올 형태, N-니트로소-히드록시아조 형태, 니트로-aci-니트로 형태, 및 피리돈-히드록시피리딘 형태를 포함한다.
본원에서 사용된 "무세포"는 본연의 세포가 실질적으로 없는 조성물을 말한다. 이 분야의 당업자들은 용해 후 특정 백분율의 세포, 예를 들면 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만 또는 0.5% 미만이 온전하게 있는 것으로 이해한다.
본원에서 사용된 "단백질"은 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기의 폴리머를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어는 임의의 크기, 구조 또는 기능의 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드를 말한다. 전형적으로, 단백질은 적어도 세개의 아미노산 길이가 될 것이다. 단백질은 개별적인 단백질 또는 단백질의 집합물을 말한다. 본 발명의 단백질은 바람직하게 오로지 천연 아미노산만이 포함되는 것이지만, 이 분야에서 알려진 바와 같은 비-천연 아미노산(즉, 자연에서 발생하지 않지만 폴리펩티드 체인으로 포함될 수 있는 화합물) 및/또는 아미노산 유사물이 대안적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질에 하나 이상의 아미노산이 예를 들면 카보하이드레이트기, 히드록실기, 포스페이트기, 파네실기, 이소파네실기, 지방산기, 접합을 위한 링커, 기능화 또는 기타 변형 등과 같은 화학적 실재물의 부가에 의해 변형될 수 있다. 단백질은 또한 단일 분자 또는 다중 분자 착물일 수 있다. 단백질은 단지 천연 발생 단백질 또는 펩티드의 프래그먼트일 수 있다. 단백질은 자연적으로 발생하는 재조합 또는 합성 또는 임의의 이들의 조합일 수 있다.
본원에서 사용된 "핵산"은 뉴클레오티드의 폴리머를 말한다. 상기 폴리머는 천연 뉴클레오사이드(즉, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘), 뉴클레사이드 유사물(예를 들면, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 4-아세틸시티딘, 5-(카복실히드록시메틸)우리딘, 디히드로우리딘, 메틸프세도우리딘(methylpseudouridine), 1-메틸 아데노신, 1-메틸 구아노신, N6-메틸 아데노신, 및 2-티오시티딘), 화학적으로 변형된 염기, 생물학적으로 변형된 염기(예를 들면, 메틸화된 염기), 삽입된 염기(intercalated base), 변형된 슈거(예를 들면, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 2'-O-메틸시티딘, 아리비노스 및 헥소스), 또는 변형된 인산염기(예를 들면, 포스포로티오에이트 및 5'-N-프로포로아미디트 연결)을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 "이소자임(isozyme)"은 아미노산 서열은 다르지만, 동일한 화학 반응을 촉진하고 출발 물질로부터 동일한 반응 산물을 생성하는 효소를 말한다.
본원에서 사용된 "이탈기(leaving group)"는 헤테로릴틱(heterolytic) 결합 분열에서 전자쌍이 떠난 분자 프래그먼트를 말하고, 여기서 분자 프래그먼트는 음이온 또는 천연 분자이다. 예를 들면, 문헌[Smith, March Advanced Organic Chemistry 6th ed. (501-502)] 참조. 예시적인 이탈기는 이것으로 제한되는 것은 아니지만 할로(예를 들면, 클로로, 브로모, 아이오도) 및 설포닐 치환된 히드록실기(예를 들면, 토실, 메실, 베실)을 포함한다.
"코-엔자임 A 모노라디칼"(-S-CoA)는 다음 식의 기 또는 이것의 염을 말한다:
Figure pct00043

본 발명의 특정 구현예의 상세한 설명
역사적으로, 무세포 시스템은 복합 생물학적 시스템의 천연 능력을 활용하기 위한 유용한 툴이다. 무세포 단백질 합성 시스템(CFPS)는 환자-특이적 백신 후보들 및 제약적 단백질을 포함하여, 생체내에서 제조하기에 어려운 단백질의 합성을 위한 유망한 플랫폼을 제공하기 위해 보여진다. 문헌[Yang et al., Biotechnol. Bioeng. (2005) 89:503-511, 및 Goerke et al., Biotechnol. Bioeng. (2008) 99:351-367] 참조. 이러한 유망한 어플리케이션에도 불구하고, CFPS는 단백질 합성에 요구된 에너지를 발생시키는 그의 능력에 의해 제한적이며, 비싼 에너지 기질의 연속 공급이 요구된다. 포스포에놀피루베이트(PEP) 및 유사한 화합물에 의해 구동된 원-스텝 인산화 반응은 오랜동안 살아있는 단백질 생성을 위해 요구된 에너지를 공급하기 위해 사용되지만, 이 공정은 오로지 한정된 기간 동안 억제 포스페이트를 발생시키는 것과 동시에 ATP의 버스트를 발생시키기 때문에 매우 효과적이지 않다. 예를 들면, 문헌[Swartz, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (2006) 33:476-485] 참조. 최근, 연구자들은 기질 비용을 현격하게 감소시키고, 세포 없이 스케일업을 단순화시키기 위해 산화 포스포릴화와 함께 아미노산 공급을 안정화하고 중앙 신진대사를 활성화하는 무세포 시스템과 관련된 이슈에 주목하고 있다. 예를 들면, 문헌 [Calhoun et al., J. Biotechnol. (2006) 123:193-203; Michel-Reydellet et al., Metabolic Engineering (2004) 6:197-203; Jewett et al., Mol. Syst. Biol. (2008) 4:220; and Calhoun et al., Biotechnology and Bioengineering (2005) 90:606-613] 참조. 이들 시스템은 소유기 분자, 예를 들면 시키믹산(shikimic acid)의 무세포 생성에 채택되고 있다. 예를 들면, PCT 공개 WO2010/074760 참조. 무세포 합성은 무세포 반응의 오픈 특성을 활용하며 화학적 합성 및 화학적 생성에 대한 배양-기초된 접근법 모두에 대해 현저한 이점을 갖고, 이는 i) 높은 정도의 세포독성을 갖는 화학제, 예를 들면 항생제를 생성하는 능력; ii) 생산성을 증가시키는 흥미있는 화학적 생성물에 모든 탄소를 이동시키는 능력; iii) 감소하는 등가물의 플럭스와 전자 캐리어의 리사이클링을 보다 효과적으로 제어하는 능력; iv) 생합성 기질을 직접적으로 부가하는 능력; 및/또는 v) 보다 효과적으로 생성물을 수확하고, 빠르게 스케일업하기 위한 잠재력을 포함한다. 무세포 시스템은 하나의 경로의 독점적 생성을 향해 대부분의 세포의 대사 리소스를 지시할 수 있다. 게다가, 시험관 내에서 세포벽의 부족은 이것이 합성 환경의 제어를 허용하기 때문에 바람직하다. 산화환원 전위, pH, 또는 이온 세기는 또한 세포 성장 또는 생존력에 대해 고려하지 않기 때문에 생체내에서 보다 크게 유연성을 갖는 것으로 변경될 수 있다. 게다가, 생성물의 직접 회수가 보다 용이하게 성취될 수 있다.
본 발명은 다음 식(I)의 화합물 또는 이들의 염 또는 호변이체 또는 이들의 조합물을 발생시키기 위한 방법에 관한 것이다:
Figure pct00044
여기서, R1, R2, R3, 및 R4 의 각각은 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴 및 선택적으로 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되고;
R5는 수소, -OR8, -SR8, -S(=O)R8, -S(=O)2R8, 및 -N(R8)2이고, 여기서 각각의 경우의 R8은 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴 및 선택적으로 치환된 헤테로아릴, -C(=O)R8a, -C(=O)OR8a, -C(=O)SR8a, -C(=O)N(R8b)2, -C(=NR8b)R8a, -C(=NR8b)OR8a, -C(=NR8b)SR8a, -C(=NR8b)N(R8b)2, -C(=S)R8a, -C(=S)OR8a, -C(=S)SR8a, -C(=S)N(R8b)2, -C(=O)NR8bSO2R8a, -S(=O)R8a, -SO2R8a, -SO2N(R8a)2, -Si(R8a)3, -P(=O)(R8a)2, -P(=O)(OR8a)2, -P(=O)(R8a)(OR8a), -P(=O)(R8a)(N(R8b)2), -P(=O)(N(R8b)2)2, -P(=O)2R8a, -P(=O)2OR8a, -P(=O)2N(R8b)2, -B(R8a)2, -B(OR8a)2, 및 -BR8a(OR8a)로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고, 여기서 ,R8a는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 산소 원자에 부착하는 경우 산소 보호기, 및 황 원자에 부착하는 경우 황 보호기로 이루어진 군에서 선택되고, 또는 2개의 R8a기 또는 R8a 및 R8b는 선택적으로 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성하기 위해 합쳐지고; R8b의 각각의 경우는 독립적으로, 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 및 질소 보호기로 이루어진 군에서 선택되거나, 또는 2개의 R8b는 선택적으로 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성하기 위해 합쳐진다.
R6는 독립적으로, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 및 -C(=O)R7으로 이루어진 군에서 선택되고, R7의 경우에서는 수소, -OR7a, -SR7a, 또는 -N(R7b)2로부터 선택되고, 여기서, R7a는 독립적으로, 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 산소 원자에 부착하는 경우 산소 보호기, 및 황 원자에 부착하는 경우 황 보호기로 이루어진 군에서 선택되고, R7b의 각각의 경우는 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 및 질소 보호기로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되거나, 또는 R7b는 선택적으로 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성하기 위해 합쳐지고; 및
Figure pct00045
는 단일 또는 이중 결합을 나타낸다.
Figure pct00046
가 이중 결합을 나타내고, R5가 OH, SH, 또는 NHR8을 나타내는 경우, 식 (I)의 화합물은 적어도 2개의 호변이체(즉, 에놀 및 케토 형태)의 혼합물로서 존재한다:
Figure pct00047
여기서, X는 O, S, 또는 NR8이다.
하나의 양태에서, 방법은 글루코스, 글리신, 및/또는 식(i)의 화합물의 조합물로부터 본 발명의 카바페넴을 발생할 수 있는 하나 이상의 효소를 발현하기 위해 조작되는 세포 또는 세포 그룹을 제공하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 이들 효소는 세포 용해 전에 세포질에서 발견된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 이들 효소는 세포 용해 전에 주변세포질 공간에서 격리된다. 특정 구현예에서, 세포 또는 세포 그룹은 세포질 및 선택적으로 주변세포질 공간으로부터 방출된 효소의 혼합물을 포함하는 세포 용해물을 제공하기 위해 용해된다. 특정 구현예에서, 효소-함유 세포 용해물은 이어서 글루코스, 글리신, 및/또는 식(i)의 화합물이 본원에서 설명된 바와 같이 카바페넴을 발생시키기 위해 공급된다. 특정 구현예에서, 상기 공정은 추가로 폭넓은 카바페넴, 예를 들면, 식(I)에 의해 포함된 화합물을 제공하기 위해, 하나 이상의 추가적 화학적 및/또는 효소적 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 방법은 글루코스 및 식(iv)의 프롤린 화합물의 조합물로부터 본 발명의 카바페넴을 발생할 수 있는 하나 이상의 효소를 발현하기 위해 조작되는 세포 또는 세포 그룹을 제공하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 이들 효소는 세포 용해 공간(lysis space) 전에 세포질에서 발견된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 이들 효소는 세포 용해 전에 주변세포질 공간에서 격리된다. 특정 구현예에서, 세포 또는 세포 그룹은 세포질 및 선택적으로 주변세포질 공간으로부터 방출된 효소의 혼합물을 포함하는 세포 용해물을 제공하기 위해 용해된다. 특정 구현예에서, 효소-함유 세포 용해물은 이어서 글루코스 및 식(iv)의 프롤린 화합물이 본원에서 설명된 바와 같이 카바페넴을 발생시키기 위해 공급된다. 특정 구현예에서, 상기 공정은 추가로 폭넓은 카바페넴, 예를 들면, 식(I)에 의해 포함된 화합물을 제공하기 위해, 하나 이상의 추가적 화학적 및/또는 효소적 단계를 포함한다.
본 발명의 다양한 양태와 관련된 대표적인 효소는 표 1 및 2에서 제공된다. 일부의 구현예에서, 표 1에서 제공된 하나 이상의 효소는 유기체에서 발현된다. 일부 구현에에서, 표 2에서 제공된 하나 이상의 효소는 유기체에서 발현된다. 표 1 및 2는 본 발명의 하나 이상의 단계를 수행하는데 유용한 효소의 비제한 실시예인 것으로 의도된다. 동일한 반응을 유도할 수 있는 또는 출발물질로부터 동일한 반응 생성물을 생성할 수 있는 기타 효소, 예를 들면, 이들의 이소자임은 본 발명의 하나 이상의 방법을 수행하는데 유용한 것으로 여겨진다.
Rxn 설명 유기체들 EC GenBank Uniprot 효소
a 키나제 E. coli 2.7.2.11 AAC73346.1 P0A7B5 ProB
b 디히드로게나제 E. coli 1.2.1.41 AAC73347.1 P07004 ProA
γ-글루타밀 키나제-GP-리덕타제 다중효소 복합체 (ProB + ProA)
c 글리콜리시스; 아세틸-CoA
생합성
다중효소		 E. coli 2.7.1.2 AAC75447.1 P0A6V8 Glk
5.3.1.9 AAC76995.1 P0A6T1 Pgi
2.7.1.11 AAC76898.1 P0A796 PfkA
4.1.2.13 AAC75962.1 P0AB71 Fba
5.3.1.1 AAC76901.1 P0A858 TpiA
1.2.1.12 AAC74849.1 P0A9B2 GapA
2.7.2.3 AAC75963.1 P0A799 Pgk
5.4.2.1 AAC73842.1 P62707 GpmA
4.2.1.11 AAC75821.1 P0A6P9 Eno
2.7.1.40 AAC74924.1 P21599 PykA
2.7.1.40 AAC74746.1 P0AD61 PykF
1.2.4.1 AAC73225.1 P0AFG8 AceE
2.3.1.12 AAC73226.1 P06959 AceF
d 아세틸-CoA
아세틸
트랜스퍼라제		 E. coli에서 발현된/활성인 Rhodobacter sphaeroides, (J. Biosci. Bioeng.(2007) 103:38). 2.3.1.9 ABA79923.1 Q3IZW1 PhaA
e β-산화 다중효소(S-히드라타제 및 3-히드록시아실-CoA 디히드로게나제 활성 E. coli
AAC76849.1 P21177 FadB
f 크로토닐-CoA
리덕타제		 RE. coli에서 발현된/활성인 Rhodobacter sphaeroides, (PNAS (2007) 104:10631). 1.3.1.85 ACJ71669.1 B8XVS5 Ccr
g 아세틸-CoA
카르복실라제		 E. coli 6.4.1.2 AAC73296.1 POABD5
POABD8
P24182
POA9Q5		 AccA, AccB, AccC, AccD
("AccABCD complex)
h 말로닐-CoA
리덕타제		 E. coli에서 발현된 Sulfolobus tokodaii,
(J.Bacteriol.
(2006)188:8551).		 1.2.1.75 BAB67276.1 Q96YK1 Mcr
i 트레오닌
알돌라제		 숙신산 세미알데히드에서 활성인 E. coli, (Tetrahedron (2008) 64:5079). 4.1.2. AAC73957.1 P75823 LtaE
j β-알라닌 트랜사미나제 Pseudomonas putida, 2.6.1.18 P28269 β-알라닌 트랜사미나제
k 프롤린 3-히드록시라제 Streptomyces sp. 1.14.11.28 BAA22406.1 P96010 P3H1
m 프롤린 옥시다제 E. coli 1.5.99.8 AAB59985.1 P09546 PutA
*대안 효소
Rxn 설명 유기체 GenBank Uniprot 효소
1 CMP 신타제 E. coli에서 발현된 P. carotovorum; (Hamed et al.,Chembiochem (2009) 10:246-250 참조); (Sleeman et al., J. Biol. Chem. (2004) 279:6730-6736 참조) AAD38230.1 Q9XB60 CarB
1* CMP 신타제* E. coli에서 발현된 Streptomyces
cattleya;(Hamed et al.,Chembiochem (2009) 10:246-250 참조)		 CAD18973.1 Q83XP9 ThnE*
2
카바페남
신테타제		 E. coli에서 발현된 P. carotovorum (Sleeman et al., J. Biol. Chem. (2004) 279:6730-6736 참조) AAD38229.1 Q9XB61 CarA
2* β-락탐
신테타제*		 S. clavuligerus β-락탐 신테타제에 대해 S.cattleya ThnM 53% 유사성(Chem & Biol. (2003) 10:301) CAD18981.1 Q83XP1 ThnM*
3 카바페넴
신타제		 E. coli 에서 발현된 P. carotovorum;
(Reider et al.,Tetrahedron
Letters (1982) 23:2293-2296 참조);(Stapon et al., J. Am. Chem. Soc. (2003) 125:15746-15747 참조)		 AAD38231.1 Q9XB59 CarC
3* 카바페넴 신타제* E. coli 에서 발현된 Streptomyces cattleya;(Bodner et al. JACS (2009) 131:14345-14354 참조) CAD18975.1 Q83XP7 ThnG*
4 추정
트랜스퍼라제		 S. cattleya; E.coli 글루타티온 트랜스퍼라제에 대해 54% 유사성 (Nunez et al., Chem. Biol. (2003) 10:301-311 참조) CAD18990.1 Q83XN2 ThnV
5 옥시게나제 E.coli 에서 발현된 S. cattleya (ThnQ); 옥시게나제는 또한 단계 2 또는 3의 생성물상에서 반응할 수 있다.(Bodner et al., J. Am. Chem. Soc. (2010) 132:12-13 참조); (Bodner et al. JACS (2009) 131:14345-14354 참조) CAD18985.1 Q83XN7 ThnQ
5* 옥시게나제* 2-옥소글루타레이트 및 Fe(II)-의존 옥시게나제 슈퍼패밀리의 효소*
6 추정
메틸트랜스퍼라제		 S. cattleya AEW99097.1
 F8JNE0
ThnL
6* 추정 메틸트랜스퍼라제* S. cattleya AEW99093.1 F8JNE4 ThnP*
6* 추정 메틸트랜스퍼라제* S. cattleya AEW99098.1 F8JND9
ThnK*
*대안 효소
본원에서 사용된 "글리콜리시스/아세틸-CoA 생합성 다중-효소"는 Glk, Pgi, PfkA, Fba, Tpi, GabP, Pgk, GpmA, Eno, PykA, PykF, AceE, AceF 및 이들의 부분집합으로 이루어진 군에서 선택된 효소의 그룹을 말한다. 이들 효소의 임의의 하나의 이소자임은 또한 "글리콜리시스/아세틸-CoA 생합성 다중-효소"의 범위 내에 포함된다. 효소의 특정한 본 리스트는 단계(c)를 수행하는데 유용한 효소 그룹의 비-제한 실시예이다. 효소의 기타 기는 특정 단계에서 수행하는데 유용한 것으로 밝혀졌고, "글리콜리시스/아세틸-CoA 생합성 다중-효소"의 범위 내에 포함되는 것으로 여겨진다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 효소는 세포용해 전에 세포의 세포질에서 발현되고 선택적으로 격리된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 효소는 주변세포질 공간에서 발현되고 선택적으로 격리된다. 표 1 및 2에서 예시적으로 나열된 효소는 발현시 세포질 또는 주변세포질 공간에서 격리되어지거나 그외에서 격리되어질 수 있다. 특정 구현예에서, 표 2에서 제공된 적어도 하나의 효소는 주변세포질 공간에서 격리된다. 주변세포질 공간에서 효소의 격리는 이 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들면 PCT 출원 번호 PCT/US2011/035639를 참조하고, 이것은 참조로서 본 명세서에 포함된다. 세포 용해물을 제공하기 위하여 세포의 용해시, 격리된 효소는 용해물 또는 다른 용해물에서 또한 존재하는 하나 이상의 기질과 마음껏 반응한다.
특정 구현예에서, 표 1에서 제공된 하나 이상의 효소는 세포질에서 발현되고 선택적으로 격리된다. 특정 구현예에서, 키나제(예를 들면, 감마-글루타밀 키나제, 예를 들면, E. coli 프롤린 생합성으로부터, ProB 또는 이것의 이소자임), 디히드로게나제(예를 들면, Glu-5-P 디히드로게나제, 예를 들면, E. coli 프롤린 생합성, ProA 또는 이것의 이소자임으로부터), 글리콜리시스/아세틸-CoA 생합성 다중효소(예를 들면, Glk, Pgi, PfkA, Fba, Tpi, GabP, Pgk, GpmA, Eno, PykA, PykF, AceE, 및/또는 AceF, 또는 이들의 이소자임으로부터), 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제(예를 들면, R. sphaeroides, PhaA 또는 이것의 이소자임으로부터), 베타-산화 다중효소(예를 들면, E.coli, FadB 또는 이것의 이소자임으로부터), 크로토닐-CoA 리덕타제(예를 들면, R. sphaeroides, Ccr, 또는 이것의 이소자임으로부터), 아세틸-CoA 카르복실라제(예를 들면, E. coli, AccABCD, 또는 이것의 이소자임으로부터), 말로닐-CoA 리덕타제 효소(예를 들면, Sulfolobus tokodaii, E. coli, Mcr 또는 이것의 이소자임에서 발현됨), 트레오닌 알도라제(예를 들면, E. coli, LtaE, 또는 이것의 이소자임에서 발현됨), 베타-알라닌 트랜스퍼라제 효소; 프롤린 3-히드록시라제 효소(예를 들면, P3H1, 또는 이것의 이소자임); 프롤린 옥시다제 효소(예를 들면, PutA 또는 이것의 이소자임), 및 이들의 이소자임으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소는 세포의 용해 전에 세포질에서 발현되고 선택적으로 격리된다. 특정 구현예에서, 세포는 세포 용해물을 제공하기 위해 용해된다.
특정 구현예에서, 표 2에서 제공된 하나 이상의 효소는 주변세포질 공간에서 발현되고 선택적으로 격리된다. 특정 구현예에서, 카르복실메틸-Pro 신타제(예를 들면, Pectobacterium carotovorum 로부터, CarB, 및/또는 Strepomyces cattleya 로부터, 이어서, 또는 이것의 이소자임); 카바페넴 신타제 (예를 들면, P. carotovorum 로부터, CarA, 또는 이것의 이소자임); 베타-락탐 신테타제(예를 들면, Strepomyces cattleya 로부터, ThnM, 또는 이것의 이소자임); 카바페넴 신타제(예를 들면, P. carotovorum 로부터 CarC, 및/또는 Strepomyces cattleya 로부터, ThnG, 또는 이것의 이소자임); 트랜스퍼라제(예를 들면, Strepomyces cattleya 로부터, ThnV 또는 이것의 이소자임); 옥시게나제(예를 들면, Strepomyces cattleya 로부터, ThnQ 또는 이것의 이소자임 또는 2-옥소글루타레이트 및/또는 Fe(II)-의존 옥시게나제 슈퍼패밀리의 효소 또는 이것의 이소자임); 및 메틸트랜스퍼라제 효소(예를 들면, ThnL, ThmP, ThnK 또는 이것의 이소자임); 및 이것의 이소자임은 세포용해전에 주변세포질 공간에서 발현되고 선택적으로 격리된다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 카르복시메틸-Pro-신타제(예를 들면, Pectobacterium carotovorum 로부터, CarB, 및/또는 Strepomyces cattleya 로부터, ThnE) 또는 이것의 이소자임은 주변세포질 공간에서 격리된다. 특정 구현예에서, 카바페남 신테타제(예를 들면, P. carotovorum 로부터, CarA), 또는 이것이 이소자임은 주변세포질 공간에서 격리된다. 특정 구현예에서, 베타-락탐 신테타제(예를 들면, Strepomyces cattleya 로부터, ThnM) 또는 이것의 이소자임은 주변세포질 공간에서 격리된다. 특정 구현예에서, 카바페넴 신타제(예를 들면, P. carotovorum, CarC 로부터 및/또는 Strepomyces cattleya 로부터 , ThnG) 또는 이것의 이소자임은 주변세포질 공간에서 격리된다. 특정 구현예에서, 트랜스퍼라제(예를 들면, Strepomyces cattleya 로부터 ThnV, 또는 이것의 이소자임)은 주변세포질 공간에서 격리된다. 특정 구현예에서 옥시게나제(예를 들면, Strepomyces cattleya 로부터, ThnQ; 또는 2-옥소글루타레이트 및/또는 Fe(II)-의존 옥시게나제 슈퍼패밀리의 효소 또는 이것의 이소자임)은 주변세포질 공간에서 격리된다. 특정 구현예에서, 메틸트랜스퍼라제 효소(예를 들면, ThnL, ThnP, ThnK 또는 이것의 이소자임)은 주변세포질 공간에서 격리된다.
본 발명과 관련된 방법은 임의의 타입의 세포 예를 들면, 원핵 및 진핵 세포로부터의 용해물을 포함한다. 일부의 구현예에서, 세포는 박테리아성 세포, 예를 들면, Escherichia spp., Streptomyces spp., Zymonas spp., Acetobacter spp., Citrobacter spp., Synechocystis spp., Rhizobium spp., Clostridium spp., Corynebacterium spp., Streptococcus spp., Xanthomonas spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Bacillus spp., Alcaligenes spp., Pseudomonas spp., Aeromonas spp., Azotobacter spp., Comamonas spp., Mycobacterium spp., Rhodococcus spp., Gluconobacter spp., Ralstonia spp., Acidithiobacillus spp., Microlunatus spp., Geobacter spp., Geobacillus spp., Arthrobacter spp., Flavobacterium spp., Serratia spp., Saccharopolyspora spp., Thermus spp., Stenotrophomonas spp., Chromobacterium spp., Sinorhizobium spp., Saccharopolyspora spp., Agrobacterium spp., 및 Pantoea spp.이다. 상기 박테리아성 세포는 그람-음성 세포, 예를 들면, 대장균(Escherichia coli (E. coli) )세포 또는 바실러스(Bacillus.)의 종과 같은 그람-양성 세포일 수 있다. 다른 구현예에서, 세포는 효소 세포와 같은 곰팡이 세포, 예를 들면, Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces spp., Pichia spp., Paffia spp., Kluyveromyces spp., Candida spp., Talaromyces spp., Brettanomyces spp., Pachysolen spp., Debaryomyces spp., Yarrowia spp. 및 산업적 폴리플로이드 효모 균주이다. 곰팡이의 기타 비-제한 실예는 include Aspergillus spp., Pennicilium spp., Fusarium spp., Rhizopus spp., Acremonium spp., Neurospora spp., Sordaria spp., Magnaporthe spp., Allomyces spp., Ustilago spp., Botrytis spp., Pectobacterium spp., 및 Trichoderma spp을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 조류(algal) 세포, 식물 세포, 포유류 세포이다. 본 발명과 양립할 수 있는일부의 세포는 본 발명과 관련된 하나 이상의 유전자의 내생 카피 뿐만 아니라 재조합 카피를 발현할 수 있다.
특정 구현예에서, 세포 용해물은 본원에서 설명된 하나 이상의 효소를 과잉발현하기 위해 조작된 E.coli 세포의 용해물이다. 특정 구현예에서, 세포 용해물은 효소의 그룹, 예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 효소를 과잉발현하기 위해 조작된 E.coli의 용해물이다. 특정 구현예에서, 상기 세포 용해물은 다른 세포 용해물의 조합물, 예를 들면 하나 이상의 효소를 과잉발현하기 위해 각각 조작된 다른 유기체로부터 얻어진 예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10 이상의 세포로부터 얻어진 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 이상의 다른 세포 용해물의 조합물이다. 일부의 구현예에서, 다른 유기체로부터의 용해물이 조합된다. 예를 들면, 조작된 E. coli 균주로부터 용해물은 다른 박테리아 균주, 예를 들면, Pectobacterium carotovorum (CarABC 유전자의 소스) 균주 및 또는 Streptomyces cattleya (천연 티에나마이신 생성자)로부터 용해물과 조합될 수 있다. 특정 구현예에서, 다른 조작된 E. coli 균주(예를 들면, 과잉발현하는 다른 생성 경로 단백질)은 모든 과잉발현된 단백질과 단일 조작된 균주를 창출하기 이전에 효소 레벨을 최적화하기 위해 조합된다.
표 1 및 2에서 설명된 바와 같은 다른 효소의 발현 또는 2개 이상의 효소의 다른 조합물의 발현을 포함하는 하나 이상의 다른 용해물의 조합물이 더 고려된다. 특정 구현예에서, 세포 용해물은 키나제(예를 들면, 감마-글루타밀 키나제), 디히드로게나제(예를 들면, Glu-5-P 디히드로게나제), 글리콜리시스/아세틸-CoA 생합성 다중효소, 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 베타-산화 다중효소, 크로토닐-CoA 리덕타제, 아세틸-CoA 카르복실라제, 말로닐-CoA 리덕타제, 트레오닌 알도라제, 베타-알라닌 트랜스퍼라제, 프롤린 3-히드록시라제, 프롤린 옥시다제, 카르복시메틸-Pro 신타제, 카바페남 신테타제, 베타-락탐 신테타제, 카바페넴 신타제, 트랜스퍼라제, 옥시게나제, 메틸트랜스퍼라제, 및 이것의 이소자임으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소를 과잉발현하기 위해 조직된 세포의 용해물이다. 특정 구현예에서, 키나제(예를 들면, 감마-글루타밀 키나제), 디히드로게나제(예를 들면, Glu-5-P 디히드로게나제), 글리콜리시스/아세틸-CoA 생합성 다중효소, 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 베타-산화 다중효소, 크로토닐-CoA 리덕타제, 아세틸-CoA 카르복실라제, 말로닐-CoA 리덕타제, 트레오닌 알도라제, 베타-알라닌 트랜스퍼라제, 프롤린 3-히드록시라제, 프롤린 옥시다제, 및 이것의 이소자임은 세포용해 전에 세포 세포질에 존재한다. 특정 구현예에서, 카르복실메틸-Pro 신타제, 카바페남 신테타제, 베타-락탐 신테타제, 카바페넴 신타제, 트랜스퍼라제, 옥시게나제, 메틸트랜스퍼라제 및 이것의 이소자임으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소는 세포용해 전에 주변세포질 공간에서 격리된다.
카바페넴을 발생하기 위한 무세포 시스템
상기 일반적으로 설명된 바와 같이, 본 발명은 식(I)의 화합물을 제공하기 위해 선택적으로 효소적으로 및/또는 화학적으로 추가적으로 다루어진 카바페넴을 발생하기 위해 무세포 조건을 이용하여 광범위의 카바페넴을 발생하기 위한 방법을 제공한다.
예를 들면, 하나의 양태에서, 제공되는 것은 다음과 같은 것으로부터 하기 식(I-a)의 화합물 또는 그의 염 또는 호변이체 또는 이들의 조합물을 발생할 수 있는 효소의 그룹을 포함하는 세포 용해물(cell lysate) :
Figure pct00048
(1) 글루코스 및 글리신 또는 그의 염; 및/또는
(2) 글루코스 및 선택적으로 하기 식(i)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 또는 그의 염; 및/또는
Figure pct00049
(3) 글루코스 및 하기 식(iv)의 프롤린 화합물 또는 그의 염:
Figure pct00050
여기서, R7a 는 수소이고; R5는 수소, -OR8, -SR8 및 -N(R8)2로 이루어진 군에서 선택되고;
Figure pct00051
는 단일 또는 이중 결합을 나타내고; R1, R2, R3 및 R4는 본원에서 정의된 바와 같다.
또 다른 양태에서, 제공되는 것은 하기 식(I-a)의 화합물 또는 그의 염 또는 호변이체 또는 이들의 조합물을 발생하는 방법으로,
Figure pct00052
상기 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다:
하나 이상의 효소를 포함하는 세포 용해물을 제공하는 단계, 여기서 상기 효소는 키나제(예를 들면, 감마-글루타밀 키나제), 디히드로게나제(예를 들면, Glu-5-P 디히드로게나제), 글리콜리시스/아세틸-CoA 생합성 다중효소, 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 베타-산화 다중효소, 크로토닐-CoA 리덕타제, 아세틸-CoA 카르복실라제, 말로닐-CoA 리덕타제, 트레오닌 알도라제, 베타-알라닌 트랜스퍼라제, 프롤린 3-히드록시라제, 프롤린 옥시다제, 카르복시메틸-프로 신타제(synthase), 카바페남 신테타제(synthetase), 베타-락탐 신테타제, 카바페넴 신타제, 트랜스퍼라제, 옥시게나제, 메틸트랜스퍼라제 및 이들의 이소자임으로 이루어진 군에서 선택되고,
여기서 하나 이상의 세포 용해물은 다음과 같은 것과 접촉된다:
(1) 글루코스 및 글리신 또는 그의 염; 및/또는
(2) 글루코스 및 선택적으로 하기 식(i)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 또는 그의 염; 및/또는
Figure pct00053
(3) 글루코스 및 하기 식(iv)의 프롤린 화합물 또는 그의 염:
Figure pct00054
여기서, R7a 는 수소이고; R5는 수소, -OR8, -SR8 및 -N(R8)2로 이루어진 군에서 선택되고;
Figure pct00055
, R1, R2, R3 및 R4는 본원에서 정의된 바와 같다.
특정 구현예에서, 키나제(예를 들면, 감마-글루타밀 키나제), 디히드로게나제(예를 들면, Glu-5-P 디히드로게나제), 글리콜리시스/아세틸-CoA 생합성 다중효소, 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 베타-산화 다중효소, 크로토닐-CoA 리덕타제, 아세틸-CoA 카르복실라제, 말로닐-CoA 리덕타제, 트레오닌 알도라제, 베타-알라닌 트랜스퍼라제, 프롤린 3-히드록시라제, 프롤린 옥시다제, 및 이것의 이소자임으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소는 세포용해 전에 세포 세포질에 존재한다. 특정 구현예에서, 카르복실메틸-Pro 신타제, 카바페남 신테타제, 베타-락탐 신테타제, 카바페넴 신타제, 트랜스퍼라제, 옥시게나제, 메틸트랜스퍼라제 및 이것의 이소자임으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소는 세포용해 전에 주변세포질 공간에서 격리된다. 특정 구현예에서, 카르복시메틸-Pro 신타제, 카바페남 신테타제, 베타-락탐 신테타제, 트랜스퍼라제, 옥시게나제, 메틸트랜스퍼라제 및 이것의 이소자임으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소는 세포 용해전에 주변세포질 공간에서 격리된다. 특정 구현예에서, 상기 나열된 하나 이상의 효소의 임의의 하나를 발현하기 위해 유전공학적으로 조작된다. 특정 구현예에서, 상기 나열된 하나 이상의 효소의 임의의 하나는 과잉발현, 즉 조작되지 않는 야생형 세포에서 발견된 초과 농도 수준에서 발현된다.
특정 구현예에서, 글루코스 및 글리신은 글리코릴시스/아세틸-CoA 생합성 다중효소, 아세틸-CoA 카르복실라제, 말로닐-CoA 리덕타제, 트레오닌 알도라제, 키나제(예를 들면, 감마-글루타밀 키나제), 디히드로게나제(예를 들면, Glu-5-P 디히드로게나제), 및 이것의 이소자임으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소와 접촉시 식(ii)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드 또는 그의 염(예를 들면, 3-히드록시-글루타메이트 세미알데히드)로 효소적으로 전환된다.
Figure pct00056
특정 구현예에서, 글리코릴시스/아세틸-CoA 생합성 다중효소, 아세틸-CoA 카르복실라제, 말로닐-CoA 리덕타제, 트레오닌 알도라제, 키나제(예를 들면, 감마-글루타밀 키나제), 디히드로게나제(예를 들면, Glu-5-P 디히드로게나제), 및 이것의 이소자임으로 이루어진 군에서 선택된 각각의 효소는 발현된다.
대안적으로, 글루코스 및 글리신은 글리콜리시스/아세틸-CoA 생합성 다중효소, 베타-알라닌 트랜스아미나제 , 트레오닌 알도라제, 키나제(예를 들면, 감마-글루타밀 키나제) 및 디히드로게나제(Glu-5-P 디히드로게나제)와의 접촉시 효소적으로 식(ii)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드 또는 그의 염으로 전환된다. 도 3 참조.
특정 구현예에서, 식(ii)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드 화합물 또는 그의 염은 하기 식(v)의 피롤 화합물 또는 그의 염을 형성하기 위하여 고리화한다. 물은 이 반응의 부산물이다. 특정 구현예에서, 상기 반응은 효소적 촉매없이 수행된다.
Figure pct00057
Figure pct00058
특정 구현예에서, 식(iv)의 프롤린 화합물 또는 그의 염은 프롤린 옥시다제와의 접촉시, 식(v)의 피롤 화합물 또는 그의 염으로 전환된다:
Figure pct00059
Figure pct00060
특정 구현예에서, 식(iv)의 프롤린 화합물 또는 그의 염은 프롤린-3-히드록시라제와의 접촉시, 식(iv-a)의 3-히드록실화된 프롤린 화합물 또는 그의 염으로 전환된다:
Figure pct00061
여기서, R5는 수소이다.
Figure pct00062
특정 구현예에서, 식(iv-a)의 3-히드록실화된 프롤린 화합물 또는 그의 염은 프롤린 옥시다제와의 접촉시, 식(v-a)의 3-히드록실화된 피롤 화합물 또는 그의 염으로 효소적으로 전환된다:
Figure pct00063
Figure pct00064
특정 구현예에서, 프롤린 화합물은 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-메틸프롤린, 3-히드록시-4-메틸프롤린, 및 이것의 염으로 이루어진 군에서 선택된다. 특정 구현예에서, 피롤 화합물은 3,4-디히드로-2H-피롤-2-카르복실산, 3-히드록시-3,4-디히드로-2H-피롤-2-카르복실산, 4-메틸-3,4-디히드로-2H-피롤-2-카르복실산, 3-히드록시-4-메틸-3,4-디히드로-2H-피롤-2-카르복실산 및 이것의 염으로 이루어진 군에서 선택된다. 특정 구현예에서, 상기 프롤린 화합물 및 피롤 화합물은 모두 L 이성질체다.
특정 구현예에서, 식(i)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 또는 그의 염은 감마-글루타밀 키나제-GP-리덕타제 다중효소 복합물(예를 들면, E. coli ProB 및 ProA)과의 접촉시 식(iv)의 프롤린 화합물 또는 그의 염으로 효소적으로 전환된다:
Figure pct00065
Figure pct00066
특정 구현예에서, 글루코스는 식(iii)의 선택적으로 치환된 CoA 화합물 또는 그의 염으로 효소적으로 전환된다:
Figure pct00067
여기서, -SCoA는 코엔자임 A 모노라디칼(-SC21H35N7O16P3)이다. 도 4 참조. 특정 구현예에서, 상기 글루코스는 글리콜리시스/아세틸-CoA 생합성 다중효소, 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 베타-산화 다중효소, 크로토닐-CoA 리덕타제 및 이것의 이소자임로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소와 접촉시 식(iii)의 선택적으로 치환된 CoA 화합물로 전환된다.
특정 구현예에서, 선택적으로 치환된 식(i)의 글루타메이트 또는 그의 염은 식(ii)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드 또는 그의 염으로 효소적으로 전환된다.
Figure pct00068
Figure pct00069
특정 구현예에서, 선택적으로 치환된 식(i)의 글루타메이트 또는 그의 염은 키나제(예를 들면, 감마-글루타밀 키나제) 및 디히드로게나제(예를 들면, Glu-5-P 디히드로게나제)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소와 접촉시 식(ii)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드 또는 그의 염으로 효소적으로 전환된다. 특정 구현예에서, 식(i)의 선택적으로 치환된 글루타메이트는 글루타메이트, 3-히드록시-글루타메이트, 4-메틸글루타메이트, 및 3-히드록시-4-메틸-글루타메이트로 이루어진 군에서 선택되고, 대응하는 식(ii)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드는 글루타메이트 세미알데히드, 3-히드록시-글루타메이트 세미알데히드, 4-메틸글루타메이트 세미알데히드, 및 3-히드록시-4-메틸-글루타메이트 세미알데히드로 이루어진 군에서 선택된다. 예를 들면, 도 2b 참조. 특정 구현예에서 글루타메이트 화합물 및 글루타메이트 세미알데히드는 모두 L 이성질체다.
특정 구현예에서, 세포 용해물은 글루코스 및 글리신의 조합물 또는 그의 염, 또는 글루코스 및 식(i)의 선택적으로 치환된 글루타메이트의 조합물, 또는 그의 염을 식(iii)의 선택적으로 치환된 CoA 화합물 및 식(ii)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드 또는 그의 염으로 전환한다:
Figure pct00070
특정 구현예에서, 식(iii) 및 식(iii)의 화합물 또는 그의 염은 주변세포질 공간에서 방출된 하나 이상의 효소와 접촉시 식(I-a)의 화합물 또는 그의 염으로 전환된다.
특정 구현예에서, 상기 식(ii)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드 및 식(iii)의 선택적으로 치환된 CoA 화합물은 주변세포질 공간으로부터 선택적으로 방출된 효소와의 접촉시 식(II-a)의 피롤리디닐 화합물 또는 그의 염을 생성한다.
Figure pct00071
여기서, R7a는 수소이다.
특정 구현예에서, 상기 식(ii)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드 및 식(iii)의 선택적으로 치환된 CoA 화합물은 주변세포질 공간으로부터 선택적으로 방출된 효소와의 접촉시 식(II-a)의 피롤리디닐 화합물 또는 그의 염을 생성한다.
Figure pct00072
여기서, R7a는 수소이다.
특정 구현예에서, 효소-함유 세포 용해물은 글루코스 및 식(iv)의 프롤린 화합물의 조합물을 식(iii)의 선택적으로 치환된 CoA 화합물 또는 그의 염 및 식(v)의 피롤 화합물 또는 그의 염으로 전환한다:
Figure pct00073
여기서 -SCoA는 코엔자임 A 모노라디칼이다.
특정 구현예에서, 식(v)의 피롤 화합물 또는 그의 염 및 식(iii)의 선택적으로 치환된 CoA 화합물은 주변세포질 공간으로부터 선택적으로 방출된 효소와의 접촉시 식(II-a)의 피롤리디닐 화합물 또는 그의 염을 발생한다:
Figure pct00074
여기서, R7a는 수소이다.
특정 구현예에서,
Figure pct00075
는 단일 결합을 나타낸다. 특정 구현예에서
Figure pct00076
는 이중 결합을 나타낸다.
특정 구현예에서, R1는 수소이다. 특정 구현예에서, R1는 선택적으로 치환된 알킬이다. 특정 구현예에서, R1는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이다. 특정 구현예에서, R1는 선택적으로 치환된 C1-4 알킬이다.. 특정 구현예에서, R1는 선택적으로 치환된 C1-3 알킬이다. 특정 구현예에서, R1는 선택적으로 치환된 C1-2 알킬이다. 특정 구현예에서, R1 는 -CH3이다. 특정 구현예에서 , R1는 수소 및 -CH3로부터 선택된다.
특정 구현예에서, R2는 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬이다. 특정 구현예에서, R2는 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬이다. 특정 구현예에서, R2는 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬이다. 특정 구현예에서, R2는 수소이다. 특정 구현예에서, R2는 선택적으로 치환된 알킬이다. 특정 구현예에서, R2는 선택적으로 치환된 C1-6알킬이다. 특정 구현예에서, R2 는 선택적으로 치환된 C1-4알킬이다. 특정 구현예에서, R2는 선택적으로 치환된 C1-3알킬이다. 특정 구현예에서, R2는 선택적으로 치환된 C1-2알킬이다. 특정 구현예에서 R2는 선택적으로 치환된 C1알킬이다. 특정 구현예에서, R2는 -CH3이다. 특정 구현예에서, R2는 수소, -CH3, -CH2OH, -CH2CH3, -CH(CH3)2, 또는 -CH(OH)CH3로부터 선택된다.
특정 구현예에서, R1는 수소, 및 R2는 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬이다. 특정 구현예에서, R1는 수소, 및 R2는 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬 (예를 들면, -CH3, -CH2OH, -CH2CH3, -CH(CH3)2, 또는 -CH(OH)CH3). 특정 구현예에서, R1는 수소, 및 R2는 수소이다. 특정 구현예에서, R1는 수소, 및 R2는 -CH3, -CH2OH, -CH2CH3, -CH(CH3)2, 또는 -CH(OH)CH3이다. 특정 구현예에서, R1는 수소, 및 R2는 -CH3 또는 -CH2CH3이다. 특정 구현예에서, R1는 수소, 및 R2는 -CH(OH)CH3이다.
특정 구현예에서, R3는 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬이다. 특정 구현예에서, R3는 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬이다. 특정 구현예에서, R3는 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬이다. 특정 구현예에서, R3는 수소이다. 특정 구현예에서, R3는 선택적으로 치환된 알킬이다. 특정 구현예에서, R3는 선택적으로 치환된 C1-6알킬이다. 특정 구현예에서, R3는 선택적으로 치환된 C1-4알킬이다. 특정 구현예에서, R3는 선택적으로 치환된 C1-3알킬이다. 특정 구현예에서, R3는 선택적으로 치환된 C1-2알킬이다. 특정 구현예에서 R3는 -CH3이다. 특정 구현예에서, R3는 수소 또는 -CH3이다.
특정 구현예에서, R4는 수소이다. 특정 구현예에서, R4는 선택적으로 치환된 알킬이다. 특정 구현예에서, R4는 선택적으로 치환된 C1-6알킬이다. 특정 구현예에서, R4는 선택적으로 치환된 C1-4알킬이다. 특정 구현예에서, R4는 선택적으로 치환된 C1-3알킬이다. 특정 구현예에서, R4는 선택적으로 치환된 C1-2알킬이다. 특정 구현예에서 R4는 -CH3이다. 특정 구현예에서, R4는 수소 및 -CH3로부터 선택된다.
특정 구현예에서, R4는 수소이고, R3는 수소이다. 특정 구현예에서, R4는 수소이고, R3는 선택적으로 치환된 알킬이다. 특정 구현예에서, R4는 수소이고, R3는 선택적으로 치환된 C1-6알킬(예를 들면, -CH3, -CH2CH3, -CH(CH3)2)이다. 특정 구현예에서, R4는 수소이고, R3는 -CH3이다.
특정 구현예에서, R5는 수소이다. 특정 구현예에서, R5는 -OR8, 여기서 R8은 본원에서 정의된 바와 같다. 특정 구현예에서, R5는 -OH이다. 특정 구현예에서, R5는 -SR8, 여기서, R8은 본원에서 정의된 바와 같다. 특정 구현예에서, R5는 -SH이다. 특정 구현예에서, R5는 -N(R8)2, 여기서 R8은 본원에서 정의된 바와 같다. 특정 구현예에서, R5는 -NHR8이다. 특정 구현예에서, R5는 -NH2이다. 특정 구현예에서, R5는 수소 또는 -OH이다.
특정 구현예에서, R1은 수소이고; R2는 수소, -CH2 또는 -CH2CH3이고; R3는 수소 또는 -CH3이고; R4는 수소이고; 및 R5는 수소 또는 -OH이다.
예를 들면, 특정 구현예에서, R1 및 R4가 수소인 경우, 식(I-a)의 화합물은 식(I-b)의 화합물 또는 그의 염 또는 호변이체, 또는 그의 조합물이고;
Figure pct00077
선택적으로 치환된 식(i)의 글루타메이트는 식(i-a)의 화합물 또는 그의 염이고;
Figure pct00078
선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드는 식(ii-a)의 화합물 또는 그의 염이고;
Figure pct00079
선택적으로 치환된 CoA 화합물은 식(iii-a)의 화합물 또는 그의 염이고;
Figure pct00080
프롤린 화합물은 식(iv-aa)의 화합물 또는 그의 염이고;
Figure pct00081
피롤 화합물은 식(v-aa)의 화합물 또는 그의 염이다:
Figure pct00082
여기서, R7a는 수소이고, R2, R4 및 R5는 상기에서 정의된 바와 같다.
일반적으로 상기에서 설명된 바와 같이, 특정 구현예에서, 세포 용해물은 글루코스 및 글리신의 조합물, 또는 글루코스 및 선택적으로 치환된 식(i)의 글루타메이트의 조합물을 선택적으로 치환된 식(iii)의 CoA 화합물 및 선택적으로 치환된 식(ii)의 글루타메이트 세미알데히드로 전환한다. 특정 구현예에서, 선택적으로 치환된 식(ii)의 글루타메이트 세미일데히드 및 선택적으로 치환된 식(iii)의 CoA 화합물은 카르복시메틸-Pro 신타제(예를 들면, CarB, 이어서) 또는 이것의 이소자임과과의 접촉시 식(II-a)의 피롤리디닐 화합물 또는 그의 염을 발생시킨다.
Figure pct00083
특정 구현예에서, R1은 수소이다. 특정 구현예에서, R2은 수소, -CH2 또는 -CH2CH3이다. 특정 구현예에서, R3는 수소 또는 -CH3이다. 특정 구현예에서, R4는 수소이다. 특정 구현예에서, R5는 수소 또는 -OH이다.
일반적으로 상기에서 설명된 바와 같이, 특정 구현예에서, 세포 용해물은 글루코스와 선택적으로 치환된 식(iv)의 프롤린의 조합물을 선택적으로 치환된 식(iii)의 CoA 화합물과 식(v)의 피롤 화합물로 전환한다. 특정 구현예에서, 선택적으로 치환된 식(iii)의 CoA 화합물과 식(v)의 피롤 화합물은 식(II-a)의 피롤리디닐 화합물 또는 그의 염을 카르복시메틸-Pro 신타제(예를 들면, CarB, ThnE) 또는 이것의 이소자임과의 접촉시 발생시킨다:
Figure pct00084
특정 구현예에서, R1은 수소이다. 특정 구현예에서, R2은 수소, -CH2 또는 -CH2CH3이다. 특정 구현예에서, R3는 수소 또는 -CH3이다. 특정 구현예에서, R4는 수소이다. 특정 구현예에서, R5는 수소 또는 -OH이다.
특정 구현예에서, R1 및 R4가 수소인 경우, 식(II-a)의 피롤리디닐 화합물은 식(II-b)의 화합물 또는 그의 염이다;
Figure pct00085
특정 또 다른 구현예에서, 식(II-a)의 피롤리디닐 화합물은 식(III-a)의 베타-락탐 화합물 또는 그의 염을 카바페남 신테타제(예를 들면, CarA 또는 이것의 이소자임) 또는 베타-락탐 신테타제(예를 들면, ThnM, 또는 이것의 이소자임)과 접촉시 발생시킨다.
Figure pct00086
특정 구현예에서, R1은 수소이다. 특정 구현예에서, R2은 수소, -CH2 또는 -CH2CH3이다. 특정 구현예에서, R3는 수소 또는 -CH3이다. 특정 구현예에서, R4는 수소이다. 특정 구현예에서, R5는 수소 또는 -OH이다.
특정 구현예에서, R1 및 R4가 수소인 경우, 식(III-a)의 화합물은 식(III-b)의 화합물 또는 그의 염이다:
Figure pct00087
특정 또 다른 구현예에서, 식(III-a)의 베타-락탐 화합물은 식(I-a)의 화합물 또는 그의 염을 카바페넴 신타제(예를 들면, CarC 또는 ThnG) 또는 이것의 이소자임과 접촉시 발생시킨다.
Figure pct00088
여기서,
Figure pct00089
는 이중 결합이다.
특정 구현예에서, R1은 수소이다. 특정 구현예에서, R2은 수소, -CH2 또는 -CH2CH3이다. 특정 구현예에서, R3는 수소 또는 -CH3이다. 특정 구현예에서, R4는 수소이다. 특정 구현예에서, R5는 수소 또는 -OH이다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 식(I)에 포함된 기능화된 카바페넴을 제공하기 위해 하나 이상의 추가적 효소적 및/또는 화학적 단계를 더 포함한다. 예를 들면, 식(I-a)의 카바페넴 스카폴드 상의 하나 이상의 위치가 효소적 및/또는 화학적 방법을 사용하여 더 기능화될 수 있다고 여겨진다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 고려된 추가 효소적 단계는 무세포 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 세포 용해 전에 세포가 무세포 반응에서 카바페넴 스카폴드의 추가적 기능화에 유용한 하나 이상의 추가 효소의 발현을 포함한다.
C2 사이드 체인의 부착
특정 구현예에서, C2 사이드 체인은 효소적 방법에 의해 카바페넴 스카폴드상에 부착된다. 예를 들면, 특정 구현예에서, R5가 수소인 경우, 상기 방법은 식(I-a)의 화합물 또는 그의 염을 트랜스퍼라제 효소 및 하기 식의 화합물과 접촉하여 식(I-c)의 티올-함유 화합물 또는 그의 염을 제공하는 단계를 더 포함한다:
Figure pct00090
여기서,
Figure pct00091
는 이중 결합을 나타낸다.
HS-R 8
여기서, R8은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴 및 선택적으로 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되고:
Figure pct00092
특정 구현예에서, R1은 수소이다. 특정 구현예에서, R2은 수소, -CH2 또는 -CH2CH3이다. 특정 구현예에서, R3는 수소 또는 -CH3이다. 특정 구현예에서, R4는 수소이다.
특정 구현예에서, R1 및 R4가 수소인 경우, 식(I-c)의 티올-함유 화합물은 식(I-d)의 화합물 또는 그의 염이다:
Figure pct00093
특정 구현예에서, 트랜스퍼라제 효소는 세포에 의해 발현된 효소이다. 특정 구현예에서, 트랜스퍼라제 효소는 세포에 의해 발현되고 주변세포질 공간에 의해 격리된 효소이다. 세포를 용해하면, 식 HS-R8의 화합물과 조합해서 효소가 식(I-a)의 화합물과 마음껏 반응한다. 그러나, 특정 구현예에서, 트랜스퍼라제 효소는 세포에 의해 발현하지 않고, 주변세포질 공간에서 격리되지 않는다. 특정 구현예에서, 트랜스퍼라제 효소 및 HS-R8 모두는 세포 용해 후에, 예를 들면, 상기 화합물의 무세포 생성 후에 식(I-a)의 화합물과 모두 접촉된다. 특정 구현예에서, 트랜스퍼라제 효소는 문헌 [Nunez et al. Chemistry and Biology (2003) 10:301 ]에서 설명된 효소이다(예를 들면, Nunez의 표 1 참조, 참조로서 본 명세서에 포함). 특정 구현예에서 트랜스퍼라제 효소는 S.cattleya 트랜스퍼라제 효소이다. 특정 구현예에서, S.cattleya 트랜스퍼라제 효소는 ThnV, ThnE, ThnF, ThnH, ThnR, ThnT, ThnI, ThnU, ThnG, ThnQ, ThnK, ThnL, ThnP, ThnN 및 이것의 이소자임으로 이루어진 군에서 선택된다. 특정 구현예에서, S.cattleya 트랜스퍼라제 효소는 ThnV이다.
특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬 또는 선택적으로 치환된 헤테로시클릴이다.
특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 알킬이다. 특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 C1-6알킬이다. 특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 C1-4알킬이다. 특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 C1-3알킬이다. 특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 C1-2알킬이다.
특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 헤테로알킬이다. 특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 헤테로C1-6알킬이다. 특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 헤테로C1-4알킬이다. 특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 헤테로C1-3알킬이다. 특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 헤테로C1-2알킬이다
특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 헤테로시클릴이다. 특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 5-6원 헤테로시클릴이다. 특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 5원-헤테로시클릴(예를 들면, 피롤리디닐, 피라졸리디닐)이다. 특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 바이시클릭 헤테로시클릴(예를 들면, 피롤로[1,2-c]이미다졸릴이다. 특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 헤테로C1-2알킬이다
예시적인 R8 기들은 다음을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
Figure pct00094
Figure pct00095
및
Figure pct00096
여기서, X는 카운터이온이다.
특정 구현예에서, R8은 식(a), (b) 또는 (c)의 기이다. 특정 구현예에서, R8은 식(a)의 기이다. 특정 구현예에서, R8은 식(b)의 기이다. 특정 구현예에서, R8은 식(c)의 기이다.
대안적으로 특정 구현예에서, C2 사이드 체인은 화학적 방법으로 만들어진다. 예를 들면, 특정 구현예에서, R5는 -OH이고, 상기 방법은 식(I-a)의 화합물 또는 그의 염 또는 호변이체 또는 이것의 조합물을 하기 식의 화합물과 접촉하여 식(I-e)의 화합물 또는 그의 염을 제공하는 단계를 포함한다:
Figure pct00097
여기서,
Figure pct00098
는 이중 결합을 나타내고;
R 8' -X
여기서, X는 이탈기이고;
R8'는 -C(=O)R8a, -C(=O)OR8a, -C(=O)SR8a, -C(=O)N(R8b)2, -C(=NR8b)R8a, -C(=NR8b)OR8a, -C(=NR8b)SR8a, -C(=NR8b)N(R8b)2, -C(=S)R8a, -C(=S)OR8a, -C(=S)SR8a, -C(=S)N(R8b)2, -C(=O)NR8bSO2R8a, -S(=O)R8a, -SO2R8a, -SO2N(R8a)2, -Si(R8a)3, -P(=O)(R8a)2, -P(=O)(OR8a)2, -P(=O)(R8a)(OR8a), -P(=O)(R8a)(N(R8b)2), -P(=O)(N(R8b)2)2, -P(=O)2R8a, -P(=O)2OR8a, -P(=O)2N(R8b)2, -B(R8a)2, -B(OR8a)2, 및 -BR8a(OR8a)로 이루어진 군에서 선택되고, 여기서 ,R8a는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 산소원자에 부착되는 경우 산소보호기 및 황 원자에 부착되는 황보호기로 이루어진 군에서 선택되거나 2개의 R8a기 또는 R8a 및 R8b기는 선택적으로 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성하기 위해 합쳐지고, R8b의 각각의 경우는 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로 알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 및 질소 보호기로 이루어진 군에서 선택되거나, 2개의 R8b는 선택적으로 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성하기 위해 합쳐진다;
Figure pct00099
특정 구현예에서, R1은 수소이다. 특정 구현예에서, R2은 수소, -CH2 또는 -CH2CH3이다. 특정 구현예에서, R3는 수소 또는 -CH3이다. 특정 구현예에서, R4는 수소이다. 특정 구현예에서, X는 -Cl, -Br, 또는 -I이다. 특정 구현예에서 X는 술폰산염이다.
특정 구현예에서, R1 및 R2 모두가 수소인 경우 식(I-e)의 화합물이 식(I-f)의 화합물 또는 그의 염이다:
Figure pct00100
특정 구현예에서, R8'는 -C(=O)R8a, -C(=S)R8a, -SO2R8a, -P(=O)(OR8a)2, -P(=O)(R8a)(OR8a), -P(=O)(R8a)(N(R8b)2), -P(=O)(N(R8b)2)2, -P(=O)2R8a, -P(=O)2OR8a, 및 -P(=O)2N(R8b)2로 이루어진 군에서 선택된다. 특정 구현예에서, R8'는 -C(=O)R8a, 및 -P(=O)(OR8a)2로 이루어진 군에서 선택된다. 특정 구현예에서, R8'는 -C(=O)R8a이다. 특정 구현예에서, R8'는 -P(=O)(OR8a)2이다. 도 8 참조.
특정 구현예에서, 식(I-e)의 화합물은 식 HS-R8의 화합물과 접촉하여 식(I-c)의 티올-함유 화합물 또는 그의 염을 제공하고,
여기서, R8은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴 및 선택적으로 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택된다:
Figure pct00101
특정 구현예에서, R1은 수소이다. 특정 구현예에서, R2은 수소, -CH2 또는 -CH2CH3이다. 특정 구현예에서, R3는 수소 또는 -CH3이다. 특정 구현예에서, R4는 수소이다.
특정 구현예에서, 식(I-e)와 HS-R8 사이에 반응은 텐덤 마이클(tandem Michael) 부가반응, 이어서 기-OR8'의 제거를 포함한다. 특정 구현예에서, 텐덤 마이클 부가-제거 반응은 염기를 더 포함한다.
C2 티올-함유 사이드 체인의 산화
특정 구현예에서, 상기 방법은 카바페넴 스카폴드에 부착된 티올-함유 사이드 체인의 산화를 포함한다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 거기에 부착된 -SR8기는 설피닐 기, -S(=O)R8로 부분적으로 산화되거나, 또는 설포닐 기, -S(=O)2R8로 완전히 산화된다. 황의 설피닐 또는 설포닐기로의 산화는 화학적 및/또는 효소적 방법을 사용할 수 있다. 이런 방법은 이 분야에서 잘 알려진 것이다. 예를 들면, 문헌 [Smith and March March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; 및 Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987]에서 이런 유형의 산화를 위한 유용한 반응 조건 참조.
C6 사이드 체인의 부착
특정 구현예에서, 상기 방법은 효소적 방법에 의해 C6 사이드 체인의 부착을 포함한다. 예를 들면, 특정 구현예에서, R1 및 R2가 모두 H인 경우, 상기 방법은 화합물(R2가 알킬, 예를 들면, n-알킬기, 구체적으로 -CH3, (메틸, Me) 또는 -CH2CH3(에틸, Et))을 제공하기 위해 식(I)의 화합물을 메틸트랜스퍼라제 효소(예를 들면, S.cattalya ThnL, ThnP, ThnK, 또는 이것의 이소자임)과 접촉하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, S-아데노실메티오닌(SAM)은 이들 효소(Thn L/K/P)에 대한 메틸 도너로서 사용된다. 도 6A 참조, 특정 구현예에서, 하나의 메틸기의 부가는 한개의 반응 사이클을 포함하거나, 또는 에틸을 제공하기 위해 순서적으로 부가된 2개의 메틸기는 2개의 반응 사이클을 포함한다. 부가적인 메틸기는 기타 n-알킬기, 예를 들면, n-프로필 및 n-부틸을 형성하기 위해 유사하게 전달될 수 있다.
특정 구현예에서, R1 및 R2가 모두 수소인 경우, 식(I-a) 또는 (I-c)의 화합물과 메틸트랜스퍼라제 효소의 접촉은 식(I-u) 또는 (I-v)의 알킬화된 화합물, 또는 그의 염 또는 호변이체를 제공하고, 여기서 에틸기가 부가된다:
Figure pct00102
특정 구현예에서, R1 및 R4가 모두 수소인 경우, 식(I-u) 및 (I-v)의 화합물은 각각 식(I-w) 및 (I-z)의 화합물 또는 그의 염 또는 그의 호변이체 또는 이것의 조합물이다:
Figure pct00103
특정 구현예에서, 메틸트랜스퍼라제 효소는 세포에 의해 발현된 효소이다. 특정 구현예에서, 메틸트랜스퍼라제 효소는 세포에 의해 발현되고, 주변세포질 공간에서 격리된 효소이다. 세포를 용해함에 따라, 메틸트랜스퍼라제 효소는 식(I-a) 또는 (I-c)의 화합물과 마음껏 반응한다.
그러나, 특정 구현예에서, 메틸트랜스퍼라제 효소는 세포에 의해 발현되지 않고, 주변세포질 공간에서 격리되지 않는다. 특정 구현예에서, 메틸트랜스퍼라제 효소는 세포 용해 후에, 예를 들면, 식(I-a) 또는 (I-c)의 화합물의 무세포 생성 후에 상기 화합물과 접촉된다.
특정 구현예에서, 메틸트랜스퍼라제 효소는 S. cattalya ThnL이다. 특정 구현예에서, 상기 메틸트랜스퍼라제 효소는 S. cattalya ThnP이다. 특정 구현예에서, 상기 메틸트랜스퍼라제 효소는 S. cattalya ThnK이다.
특정 구현예에서, 예를 들면, 메틸 또는 에틸 사이드 체인을 생성하기 위해 2개 이상의 ThnL, ThnP, 및 ThnK가 사용된다. 특정 구현예에서, 예를 들면, 메틸 또는 에틸 사이드 체인을 생성하기 위해 ThnL 및 ThnK가 사용된다. 특정 구현예에서, 예를 들면, 메틸 또는 에틸 사이드 체인을 생성하기 위해 ThnK 및 ThnP가 사용된다. 예를 들면, 메틸 또는 에틸 사이드 체인을 생성하기 위해 모든 ThnL, ThnP, 및 ThnK가 사용된다.
특정 구현예에서,
Figure pct00104
은 이중 결합을 나타내고, R5가 수소 또는 -OH인 경우, 식(I-u)의 알킬화된 화합물은 본 명세서에 설명된 바와 같은 효소적 또는 화학적 방법을 통해 식(I-v)의 화합물로 전환될 수 있다.
C6 사이드 체인의 산화
특정 구현예에서, 상기 방법은 효소적 방법에 의해 C6 사이드 체인의 산화를 포함한다. 예를 들면, 특정 구현예에서, R2가 CH3인 경우, 상기 방법은 화합물(R2가 -CH2OH)인 화합물을 제공하기 위해 식(I)의 화합물을 옥시게나제 효소와 접촉하는 단계를 더 포함한다. 특정 구현예에서, R2가 CH2CH3인 경우, 상기 방법은 화합물(R2가 -CH(OH)CH3)인 화합물을 제공하기 위해 식(I)의 화합물을 옥시게나제와 접촉하는 단계를 더 포함한다. 특정 구현예에서, R2가 CH2CH3인 경우, 식(I-a) 또는 (I-c)의 화합물과 옥시게나제 효소의 접촉은 각각 식(I-g) 또는 (I-h)의 히드록실화된 화합물, 또는 그의 염 또는 호변이체, 또는 그의 조합물를 제공한다:
Figure pct00105
특정 구현예에서, R1 및 R4가 모두 수소인 경우, 식(I-g) 및 (I-h)의 화합물은 각각 식(I-i) 및 (I-j)의 화합물 또는 그의 염 또는 그의 호변이체 또는 이것의 조합물이다:
Figure pct00106
특정 구현예에서, 상기 옥시게나제 효소는 세포에 의해 발현된 효소이다. 특정 구현예에서, 상기 옥시게나제 효소는 세포 용해 전에 세포에 의해 발현되고, 주변세포질 공간에서 격리된 효소이다. 세포를 용해함에 따라, 상기 옥시게나제 효소는 식(I-a) 또는 (I-c)의 화합물과 마음껏 반응한다.
그러나, 특정 구현예에서, 상기 옥시게나제 효소는 세포에 의해 발현되지 않고, 주변세포질 공간에서 격리되지 않는다. 특정 구현예에서, 옥시게나제 효소는 세포 용해 후에, 예를 들면, 식(I-a) 또는 (I-c)의 화합물의 무세포 생성 후에 상기 화합물과 접촉된다. 특정 구현예에서,옥시게나제 효소는 S. cattalya 옥시게나제 효소 또는 2-옥소글루타레이트 및/또는 Fe(II)-의존 옥시게나제 수퍼패밀리의 효소이다. 특정 구현예에서, 상기 옥시게나제 효소는 S. cattalya 옥시게나제 ThnQ이다.
특정 구현예에서,
Figure pct00107
은 이중 결합을 나타내고, R5가 수소 또는 -OH인 경우, 식(I-g)의 히드록실화된 화합물은 본 명세서에 설명된 바와 같은 효소적 또는 화학적 방법을 통해 식(I-h)의 화합물로 전환될 수 있다.
C3 사이드 체인의 기능화
본 발명은 C3 사이드 체인의 효소적 또는 화학적 조작을 더 고려한다.
특정 구현예에서, C3 사이드 체인 기 -C(=O)OR7a(여기서 R7a는 수소)가 에스테르(-C(=O)OR7a, 여기서 R7a는 수소가 아님), 티오에스테르(-C(=O)SR7a) 또는 아미드(-C(=O)NR7b)2)기로 전환된다. 카르복실산기가 에스테르, 티오에스테르 또는 아미드로 전환하는 것은 이 분야에서 알려진 방법, 예를 들면, 활성화된 카르복실산을 발생(예를 들면, 아실 클로라이드 발생 또는 커플링제 사용과 같은)시키고 활성화된 카르복실산을 친핵체(예를 들면, HOR7a, HSR7a, 또는 HN(R7b)2)로 처리하는 것과 같은 화학적 방법 또는 효소적 방법을 통해 사용할 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Smith and March March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; 및 Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987]에서 이런 유형의 전환에 유용한 반응 조건의 실예를 참조.
다른 구현예에서, C3 사이드 체인기 -C(=O)OR7a는 다른 C3 사이드 체인을 제공하기 위해, 하나 이상의 화학적 및/또는 효소적 단계를 통해 합성적으로 더 조작될 수 있고, 여기서, R6는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴 및 선택적으로 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, -C(=O)OR7a는 알데히드 기 -CHO로 환원되고, 선택적으로 예를 들면 위팅(Witting) 조건하에서 선택적으로 치환된 알케닐기, -CH=CH(R7a)(여기서, R7a는 본원에서 정의된 바와 같다)를 제공하기 위해 더 반응되고, 이것은 추가로 합성적으로 조작될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 알데히드 기 -CHO는 일차 아민 H2NR7b와 환원성 아민화를 통해 아민화된 기, -CH2-NH(R7b)(여기서 R7b는 본원에서 정의된 바와 같다)를 제공하기 위해 더 반응될 수 있고, 이것은 더 합성적으로 조작될 수 있다. 여전히 다른 구현예에서, -C(=O)OR7a는 알콜 -CH2OH로 환원될 수 있고, 이것은 활성화된 알킬기 -CH2X로 전환될 수 있고, 여기서 X는 이탈기이고, 이것은 합성적으로 더 조작될 수 있다. 상기는 이런 기들의 단지 실예이며, 이 분야의 당업자들은 공지된 화학적 및/또는 효소적 기술의 조합을 사용하여 접근할 수 있다. 식(I)의 R6의 정의에 의해 포함된 다양한 기타 기능기는 알려진 화학을 사용하여 접근될 수 있다.
식(I)의 화합물의 기타 구현예
최종 생성물 또는 중간체일 수 있는 식(I)의 예시적인 화합물은 본 발명의 무세포 시스템 및 방법에 의해 제조될 수 있다. 다양한 R1, R2, R3, R4, R5 및 R6는 이 분야의 당업자에 의해 인식되어지는 바와 같이 고려되어지고, 공개된 아속(subgenera)는 한정되어진다고 여겨지지 않는다.
예를 들면, 식(I)의 특정 구현예에서, 여기서, R1 및 R4는 수소이고, 화합물은 식(I-k) 또는 그의 염이다:
Figure pct00108
여기서, 〓, R2, R3, R5 및 R6는 본원에서 정의된 바와 같다. 특정 구현예에서, R2가 수소, -CH3, -CH2CH3, -CH2OH, 또는 CH(OH)CH3이다. 특정 구현예에서, R3는 수소 또는 -CH3이다. 특정 구현예에서, R5는 수소, -OR8', -OR8 또는 -SR8이다. 특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로시클릴이다. 특정 구현예에서, R8은 식(a), (b) 또는 (c)의 기이다. 특정 구현예에서, R6는 -C(=O)R7이다. 특정 구현예에서, R7은 -OR7a이다. 특정 구현예에서,
Figure pct00109
는 이중 결합이다.
특정 구현예에서, R5가 -SR8이고, 제공되는 것은 식(I-m)의 화합물 또는 그의 염이다:
Figure pct00110
여기서, R2, R3, R6 및 R8은 본원에서 정의된 바와 같다. 특정 구현예에서,R2는 수소, -CH3, -CH2OH, -CH2CH3, -CH(CH3)2 또는 -CH(OH)CH3이다. 특정 구현예에서, R3는 수소 또는 -CH3이다. 특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로시클릴이다. 특정 구현예에서, R8은 식(a), (b) 또는 (c)의 기이다. 특정 구현예에서, R6는 -C(=O)R7이다. 특정 구현예에서, R7은 -OR7a이다.
(I-m)의 특정 구현예에서, R3가 -CH3이고, 제공되는 것은 식(I-n)의 화합물 또는 그의 염이다:
Figure pct00111
여기서, R2, R6 및 R8은 본원에서 정의된 바와 같다. 특정 구현예에서, R2는 수소, -CH3, -CH2OH, -CH2CH3, -CH(CH3)2 또는 -CH(OH)CH3이다. 특정 구현예에서, R3는 수소 또는 -CH3이다. 특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로시클릴이다. 특정 구현예에서, R8은 식(a), (b) 또는 (c)의 기이다. 특정 구현예에서, R6는 -C(=O)R7이다. 특정 구현예에서, R7은 -OR7a이다.
(I-n)의 특정 구현예에서, R2가 -CH2CH3이고, R3가 -CH3이고, 제공되는 것은 식(I-o)의 화합물 또는 그의 염이다:
Figure pct00112
여기서, R6 및 R8은 본원에서 정의된 바와 같다. 특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로시클릴이다. 특정 구현예에서, R8은 식(a), (b) 또는 (c)의 기이다. 특정 구현예에서, R6는 -C(=O)R7이다. 특정 구현예에서, R7은 -OR7a이다.
(I-n)의 특정 구현예에서, R2가 -CH(OH)CH3이고, R3가 -CH3이고, 제공되는 것은 식(I-p)의 화합물 또는 그의 염이다:
Figure pct00113
여기서, R6 및 R8은 본원에서 정의된 바와 같다. 특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로시클릴이다. 특정 구현예에서, R8은 식(a), (b) 또는 (c)의 기이다. 특정 구현예에서, R6는 -C(=O)R7이다. 특정 구현예에서, R7은 -OR7a이다.
(I-m)의 특정 구현예에서, R3가 수소이고, 제공되는 것은 식(I-q)의 화합물 또는 그의 염이다:
Figure pct00114
여기서, R2, R6 및 R8은 본원에서 정의된 바와 같다. 특정 구현예에서,R2는 -CH3, -CH2OH, -CH2CH3, -CH(CH3)2 또는 -CH(OH)CH3이다. 특정 구현예에서, R8은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로시클릴이다. 특정 구현예에서, R8은 식(a), (b) 또는 (c)의 기이다. 특정 구현예에서, R6는 -C(=O)R7이다. 특정 구현예에서, R7은 -OR7a이다.
(I-q)의 특정 구현예에서, R2가 -CH2CH3이고, R3가 -CH3이고, 제공되는 것은 식(I-r)의 화합물 또는 그의 염이다:
Figure pct00115
여기서, R6 및 R8은 본원에서 정의된 바와 같다. 특정 구현예에서,R8은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로시클릴이다. 특정 구현예에서, R8은 식(a), (b) 또는 (c)의 기이다. 특정 구현예에서, R6는 -C(=O)R7이다. 특정 구현예에서, R7은 -OR7a이다.
(I-q)의 특정 구현예에서, R2가 -CH(OH)CH3이고, R3가 수소이고, 제공되는 것은 식(I-s)의 화합물 또는 그의 염이다:
Figure pct00116
여기서, R6 및 R8은 본원에서 정의된 바와 같다. 특정 구현예에서,R8은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로시클릴이다. 특정 구현예에서, R8은 식(a), (b) 또는 (c)의 기이다. 특정 구현예에서, R6는 -C(=O)R7이다. 특정 구현예에서, R7은 -OR7a이다.
예를 들면, 식(I-s)의 특정 구현예에서, R2가 -CH(OH)CH3이고, R6가 -C(=O)R7이고, R8은 식(b)의 기이고, 제공되는 것은 식(I-t)의 화합물 또는 그의 염이다:
Figure pct00117
식(I-t)의 화합물은 화합물 이미페넴(여기서, R7은 -OH) 또는 이미페넴 유도체(즉, 여기서, R7은 -OR7a, -SH, -SR7a, N(R7b)2, 여기서 R7a는 수소가 아니다). 특정 구현에에서, 이미페넴 유도체는 이미페넴의 프로드러그이다.
기타 식(I)의 예시적인 화합물은 다음 그룹으로부터 선택된다:
Figure pct00118
Figure pct00119
Figure pct00120
Figure pct00121
및
Figure pct00122
및 이것의 염.
재조합 유전자 발현 및 세포 배양
본 발명과 관련된 효소를 코딩하는 유전자는 다양한 소스로부터 얻어질 수 있다. 이 분야의 당업자는 이들 효소에 대한 상동성 유전자가 많은 종에 존재하고, 상동성 서치에 의해 예를 들면, NCBI 인터넷 사이트(www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 사용하는 단백질 BLAST 서치에 의해 동정될 수 있음을 인식할 것이다. 이들 효소에 대해 코딩하는 유전자는 이 분야의 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이 축퇴 프라이머를 사용하여 제공된 효소를 함유한 임의의 소스의 DNA로부터 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 효소를 코딩하는 유전자는 합성될 수 있다. 본원에서 논의된 효소에 대해 코딩하는 유전자는 본 발명의 양태와 상용할 수 있다.
본 발명의 분자의 발현은 이 분야의 당업자에게 알려진 일상적인 방법을 사용하여 결정될 수도 있다. 이들 방법은 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 직접 RNA 증폭, RNA의 cDAA로의 역전사, 실시가 RT-PCR, cDNA의 증폭, 혼성화 및 면역학적 기본 어세이 방법(이것은 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 웨스턴 블롯팅, 면역히스토케미스트리, 항체 샌드위치 캡쳐 어세이, ELISA, 및 효소-연결 면역스팟 어세이(EliSpot 어세이))을 포함한다. 예를 들면, 조직 또는 세포 용해물과 같은 샘플에서 본 발명의 핵산 분자의 레벨의 존재의 결정은 폴리머라제 체인 반응을 포함한 임의의 표준 핵산 결정 어세이를 통해 수행될 수 있거나 라벨화된 혼성 프로브로의 어세이를 통해 수행될 수 있다. 이런 혼성화 방법은 이것으로 제한되는 것은 아니지만 마이크로어레이 기술을 포함한다.
따라서, 본 발명은 효소, 이들 효소를 코딩하는 유전자, 이들의 기능적 변형 및 변형체 뿐만 아니라 이들과 관련된 용도를 포함하는 하나의 양태의 방법을 포함한다. 본 발명의 핵산의 동족체 및 대립유전자(alleles)는 통상적인 기술에 의해 동정될 수 있다. 본 발명에 의해 포함되는 것은 본원에서 설명된 핵산에 엄중한(stringent) 조건하에서 혼성화하는 핵산을 포함하는 방법이다. 본원에서 사용된 상기 용어 "엄중한(stringent) 조건"은 이 분야의 당업자에게 익숙한 파라미터를 말한다. 핵산 혼성화 파라미터는 이런 방법, 예를 들면, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, 또는 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York.을 편찬한 문헌에서 발견할 수 있다. 보다 상세하게, 본원에서 사용된 바와 같은 엄중한 조건은 예를 들면, 혼성화 버퍼(3.5 x SSC, 0.02% 피콜(Ficoll), 0.02% 폴리비닐 피롤리돈, 0.02% 소혈청 알부민, 2.5 mM NaH2PO4 (pH 7), 0.5% SDS, 2 mM EDTA)에서 65℃에서의 혼성화를 말한다. SSC는 0.15M 염화 나트륨/0.015M 시트르산 나트륨, pH 7이고; SDS는 소듐 도데실 설페이트이고; EDTA는 에틸렌디아민테트라아세트산이다. 혼성화 후, DNA가 전사되는 멤브레인이 예를 들면 2 x SSC의 실온에서 세척되고, 이어서 0.1 - 0.5 x SSC/0.1 x SDS에서 최대 68℃의 온도에서 세척된다.
엄중함의 유사한 정도를 얻을 수 있는 사용될 수 있는 기타 조건, 시약 및 등등이 있다. 당업자들은 이런 조건에 친숙할 것이고, 본 발명의 핵산의 동족체 및 대립 유전자의 투명한 동정을 허용하는 방식으로 조건을 조작할 수 있다(예를 들면, 낮은 엄중한 조건을 사용하여). 당업자들은 또한 후에 일상적으로 단리되는 이런 분자를 발현하고, 이어서 적절한 핵산 분자의 단리 및 시퀀싱하기 위한 세포 및 라이브러리를 스크린닝하기 위한 방법과 친숙하다.
일반적으로, 동족체 및 대립 유전자는 전형적으로 핵산 및 폴리펩티드 각각의 서열에 대해 적어도 75% 뉴클레오티드 상동성 및/또는 적어도 80% 아미노산 상동성을 공유할 것이고, 일부의 경우에서 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성 및/또는 적어도 90% 또는 95% 아미노산 상동성을 공유할 것이고, 다른 경우에서 적어도 95% 뉴클레오티드 상동성 및/또는 적어도 99% 핵산 상동성을 공유할 것이다. 일부의 구현예에서, 동족체 및 대립 유전자는 본원에서 설명된 바와 같은 핵산의 서열에 대해 적어도 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 99% 이상의 뉴클레오티드 상동성 및/또는 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 이상의 본원에서 설명된 폴리펩티드의 서열에 대한 상동성을 공유할 것이다.
상기 상동성은 NCBI 인터넷 사이트를 통해 얻을 수 있는 NCBI(Bethesda, Maryland)에 의해 개발된 다양한 공개적으로 시판되는 소프트웨어 툴을 사용하여 계산될 수 있다. 예시적인 툴로는 NCBI 인터넷 사이트(www. ncbi.nlm.nih.gov)에서 구할 수 있는 BLAST 소프트웨어를 포함한다. 페어와이즈(Pairwise) 및 클러스탈(Clustal) W 얼라인먼트(BLOSUM30 매트릭스 세팅) 뿐만 아니라 Kyte-Doolittle hydropathic 분석이 MacVector 시퀀스 분석 소프트웨어(Oxford Molecular Group)을 사용하여 얻어질 수 있다. 상기 핵산의 왓슨-크릭 컴플리멘트(Watson-Crick complements)가 또한 본 발명에 의해 받아들여진다.
유전자를 위한 스크리닝 및 동정화에서, 이 분야에 알려진 기술, 예를 들면, 서던 블롯, 노던 블롯 및 제시된 서열에 혼성화할 수 있는 프라이머를 사용한 폴리머라제 체인 반응과 같은 증폭 프로토콜이 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 천연 물질에 존재하는 핵산에 대안적인 코돈을 포함하는 축퇴 핵산을 포함한다. 예를 들어, 세린 잔기는 코돈 TCA, AGT, TCC, TCG, TCT 및 AGC에 의해 인코딩된다. 6개의 코돈의 각각은 세린 잔기를 코딩하는 목적과 동등하다. 따라서, 임의의 세린-코딩 뉴클레오티드 트리플렛은 세린 잔기가 연장하는 폴리펩티드로 병합하도록 시험관내 또는 생체내에서 직접 단백질 합성 장치로 사용될 수 있다. 유사하게, 기타 아미노산 잔기를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 트리플렛은 이것으로 제한되는 것은 아니지만 CCA, CCC, CCG 및 CCT (프롤린 코돈); CGA, CGC, CGG, CGT, AGA 및 AGG (알기닌 코돈); ACA, ACC, ACG 및 ACT (트레오닌 코돈); AAC 및 AAT (아스파라긴 코돈); 및 ATA, ATC 및 ATT (이소류신 코돈)을 포함한다. 기타 아미노산 잔기는 유사하게 다중 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 유전적 코드의 축퇴에 기인한 코돈 서열에서 생물학적으로 단리된 핵산과 다른 축퇴 핵산을 수용한다. 본 발명은 또한 숙주 세포의 최적 코든 용도를 맞추기 위해 코돈 최적화를 수용한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 치환 및 결실을 포함하는 변형된 핵산 분자를 제공한다. 특정 구현예에서, 이들이 인코딩하는 이들 변형된 핵산 분자 및/또는 폴리펩티드는 비변형된 핵산 분자 및/또는 폴리펩티드의 적어도 하나의 활성 또는 기능, 예를 들면 효소적 활성을 유지한다. 특정 구현예에서, 변형된 핵산 분자는 변형된 폴리펩티드, 바람직하게는 상보적인 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 특정 구현예에서 변형된 및 비 변형된 핵산 분자가 엄중한 조건하에서 혼성화하도록 변형된 핵산 분자는 비 변형된 핵산 분자와 구조적으로 관련되며, 비 변형된 핵산 분자와 충분히 구조적으로 관련된다.
예를 들면, 단일 아미노산 변화를 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 변형된 핵산 분자는 제조될 수 있다. 이들 핵산 분자의 각각은 본원에서 설명되는 바와 같은 유전자 코드의 축퇴에 대응하는 뉴클레오티드 변화를 제외하고 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 뉴클레오티드 치환을 갖는다. 마찬가지로, 2개의 아미노산 변화를 갖는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있는 변형된 핵산 분자는 예를 들면, 2-6 뉴클레오티드 변화를 갖게 제조될 수 있다. 이들과 같은 다양한 변형된 핵산 분자는 이 분야의 당업자에 의해 용이하게 예상될 수 있으며, 예를 들면, 아미노산 2 및 3, 2 및 4, 2 및 5, 2 및 6, 및 등등을 코딩하는 코돈에서 뉴클레오티드의 치환을 포함한다. 상기 실시예에서, 2개의 아미노산의 각각의 조합은 변형된 핵산 분자, 뿐만 아니라 아미노산 치환에 대해 코드하는 모든 뉴클레오티드 치환의 세트에 포함된다. 추가적인 치환(즉, 3 또는 그 이상), 부가 또는 결실(예를 들면, 정지 코돈의 도입 또는 스플라이스 사이트(splice site)을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 추가적인 핵산 분자는 또한 제조될 수 있고, 이 분야의 당업자에 의해 용이하게 예상되는 바에 따라 본 발명에 의해 포함되어진다. 임의의 상기 핵산 또는 폴리펩티드는 본원에서 공개된 핵산 및/또는 폴리펩티드에 대한 구조적 관련성 또는 활성의 보유에 대한 일상적인 실험에 의해 테스트될 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 폴리펩티드의 변이체(variants)를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드의 "변이체"는 폴리펩티드의 일차 아미노산 서열에 하나 이상의 변형를 포함하는 폴리펩티드이다. 효소 변이체를 만드는 변형은 효소로 만들어 질 수 있고, 예를 들면, 1) 효소의 세포 분포를 변경하기 위해, 2) 효소의 활성을 감소 또는 제거하기 위해, 3) 효소의 특성, 발현 시스템에서 단백질의 안정성, 또는 기타 특성을 강화하거나 변경하기 위해, 4) 항원 에피토프 또는 검출가능한 모이어티의 부가와 같이 효소에 신규한 활성 또는 특성을 제공하기 위해, 또는 5) 효소와 효소 기질 사이에 동등한 또는 우수한 결합을 제공하기 위해서이다.
폴리펩티드에의 변형은 일반적으로 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 만들고, 결실, 점 돌연변이, 잘림(truncations), 아미노산 치환 및 아미노산 또는 비-아미노산 잔기의 추가를 포함할 수 있다. 대안적으로, 그러한 변형은 절단, 링커 분자의 첨가, 검출 모이어티, 예를 들면 비오틴의 부가, 지방산의 부가 및 등등에 의해 폴리펩티드로 직접적으로 제조될 수 있다. 변형은 또한 융합 단백질을 받아들인다. 당업자는 단백질 서열에서의 변화의 단백질 입체 구조에 미치는 영향을 예측하는 방법을 잘 알고 있을 것이며, 따라서 알려진 방법에 따라서 변이체 폴리펩티드를 "디자인"할 수 있다. 그러한 방법의 일례는 문헌[Dahiyat and Mayo in Science 278:82-87, 1997]에 의해 설명된 것이고, 이것에 의해 단백질은 처음부터 디자인될 수 있다. 상기 방법은 폴리펩티드 서열의 일부만 변화시키는 공지된 단백질에 적용될 수 있다. Dahiyat and Mayo의 컴퓨터 방법을 적용하여, 폴리펩티드의 특이 변이체가 변이체가 요구된 입체 구조를 유지하는지 결정하기 위해 제안되고 테스트될 수 있다. 폴리 펩티드서열의 일부만을 변경하는 공지된 단백질에 적용될 수 있다.
일반적으로, 변이체는 구체적으로는 원하는 생리 활성과 관련이 없는 폴리펩티드의 피쳐를 변경하기 위해 변형되는 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 시스테인 잔기는 원치않는 이황화(disulfide) 결합을 방지하기 위해, 치환되거나 삭제될 수 있다. 유사하게, 특정 아미노산은 발현 시스템 (예를 들면, KEX2 프로테아제 활성이 존재하는 효모 발현 시스템에서, 이염기성 아미노산 잔기)에서 프로테아제에 의해 단백질가수분해를 제거함으로써 폴리펩티드의 발현을 향상시키기 위해 변경될 수 있다.
폴리펩티드를 코딩하는 핵산 돌연변이는 코딩 서열의 아미노산 리딩 프레임을 유지하고, 바람직하게 이차 구조, 예를 들면 헤어핀 또는 루프를 형성하기 위해 혼성화할 것 같은 핵산에서 영역을 만들지 않으며, 이것은 변이체 폴리펩티드의 발현에 해로울 수 있다.
돌연변이는 아미노산 치환을 선택함으로써 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 선택된 사이트의 무작위 돌연변이 유발에 의해 제조될 수 있다. 이어서, 변이체 폴리펩티드는 발현되고, 돌연변이가 원하는 특성을 가진 변이체 폴리펩티드를 제공하는 지를 확인하는 하나 이상의 활성을 테스트한다. 또한 돌연변이는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해 침묵하지만, 특정 숙주에서 번역을 위한 바람직한 코돈을 제공하는 변이체(또는 비-변이체 폴리펩티드)로 만들어질 수 있다. 예를 들면, E. coli에서 핵산의 번역을 위한 바람직한 코돈은 이 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 여전히 다른 돌연변이는 폴리펩티드의 발현을 강화하기 위해 유전자 또는 cDNA 클론의 비코딩 서열로 만들어질 수 있다. 폴리펩티드의 변이체의 활성은 유전자 인코딩 변이체 폴리펩티드를 박테리아 또는 포유류 발현 벡터로 클로닝하고, 상기 벡터를 적절한 숙주 세포로 도입하고, 변이체 폴리펩티드를 발현하고, 이어서 본원에서 공개된 바와 같은 폴리펩티드의 기능적 능력을 테스트하는 것에 의해 테스트될 수 있다.
당업자들은 또한 상보적 아미노산 치환이 상기 폴리펩티드의 기능적으로 동등한 변이체(즉, 변이체가 폴리펩티드의 기능적 능력들을 유지함)를 제공하기 위해 폴리펩티드에서 만들어질 수 있다. 본원에서 사용된 "상보적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)"은 아미노산 치환이 만들어지는 단백질의 상대적 전하 또는 크기 특징을 변경하지 않는 아미노산 치환을 말한다. 변이체는 이 분야의 당업자에게 알려진 폴리펩티드 서열을 변경하기 위한 방법, 예를 들면, 이런 방법을 제시한 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, or Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York.]을 참조하여 제조될 수 있다. 폴리펩티드의 예시적인 기능적으로 동등한 변이체는 본원에서 공개된 단백질의 아미노사나 서열에서 상보적 아미노산 치환을 포함한다. 아미노산의 상보적 치환은 다음과 같은 기들 :(a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D 내의 아미노산 중에서 만들어진 치환을 포함한다.
일반적으로, 변이체 폴리펩티드를 제조하는 경우 모든 아미노산보다 적은 아미노산이 변화되는 것이 바람직하다. 특정한 아미노산 잔기가 기능을 수여하는 것으로 알려진 경우, 이런 아미노산은 상보적 아미노산 치환으로 교체될 수 없거나 또는 대안적으로 교체될 수 있다. 바람직하게, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 잔기는 변이체 폴리펩티드를 제조하는 경우 변화될 수 있다. 가장 적은 수의 치환이 만들어지는 것이 일반적으로 바람직하다. 따라서, 변이체 폴리펩티드를 발생시키기 위한 하나의 방법은 모든 다른 아미노산을 특별한 단일 아미노산으로 치환하고, 이어서 변이체의 활성을 어세이하고, 이어서 최상의 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드로 상기 공정을 반복하는 것이다.
폴리펩티드의 기능적으로 동등한 변이체를 제조하기 위해 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 상보적 아미노산 치환이 폴리펩티드 코딩하는 핵산의 변경에 의해 만들어질 수 있다. 이런 치환은 이 분야의 당업자에게 다양한 방법에 의해 만들어질 수 있다. 예를 들면, 아미노산 치환은 Kunkel(Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492, 1985)의 방법에 따라서 PCR-지향 돌연변이, 사이트-지향 돌연변이유발에 의해 또는 폴리펩티드 코딩하는 유전자의 화학적 합성에 의해 만들어질 수 있다.
본 발명의 양태는 세포에 있는 하나 이상의 효소의 과잉발현에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 세포는 하나 이상의 효소를 내생적으로 코딩하는 하나 이상의 유전자를 발현한다. 내생적 유전자의 발현은 구성적 또는 유도적 프로모터를 삽입하는 것과 같이 유전자의 프로모터를 변경시킴으로써 증가될 수 있다. 내생적 유전자의 발현은 예를 들면 염색체로 유전자의 카피를 추가로 삽입하여 플라스미드 또는 유전자의 하나 이상의 카피를 발현하는 것과 같이, 세포에서 유전자의 추가적인 카피를 발현시킴으로써 증가 될 수 있다.
본 발명의 양태는 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자의 재조합 발현에 관한 것이다. 일부의 구현예에서, 본 발명과 관련된 효소에 대해 코딩하는 유전자는 재조합 발현 벡터에서 발현된다. 본원에서 사용된 "벡터"는 요구된 서열 또는 서열들이 다른 유전적 환경 사이에서 전송을 위하여 또는 숙주 세포에서 발현을 위해 제한(restriction) 및 결찰(ligation)에 의해 삽입될 수 있는 임의의 수의 핵산일 수 있다. 비록 RNA 벡터가 또한 유용하지만 벡터는 전형적으로 DNA로 구성된다. 벡터는 플라스미드, 포스미드, 파게미드, 바이러스 게놈 및 인공적인 크로모좀을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
클로닝 벡터는 숙주 세포에서 게놈에 자체적으로 복제할 수 있거나 통합되고, 벡터가 결정가능한 방식으로 절단될 수 있고, 요구된 DNA 서열이 새로운 재조합 벡터가 숙주 세포에서 복제하는 그의 능력을 유지하도록 결찰될 수 있는 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 사이트에 의해 추가적으로 특징지워지는 것이다. 플라스미드의 경우, 요구된 서열의 복제는 플라스미드가 숙주 박테리아 내의 카피 수를 증가시킴에 따라서 여러 번 또는 숙주가 유사분열에 의해 재생성하기 전에 숙주마다 한번 일어날 수 있다. 파지의 경우, 복제는 용해 파지 동안 활성적으로 또는 용원성 파지 동안 양성적으로 일어날 수 있다.
발현 벡터는 이것이 조절염기순서로 작동적으로 합쳐지고 RNA 전사로서 발현될 수 있도록 요구된 DNA 서열이 제한 또는 결찰에 의해 삽입될 수 있는 것이다. 벡터는 벡터로 형질전환 또는 형질감염되거나 되지 않는 세포의 동정에 사용하기에 적합한 추가로 하나 이상의 마커 서열을 포함할 수도 있다. 마커는 예를 들면 항생제 또는 기타 화합물에 대한 내성 또는 민감성을 증가 또는 감소시키는 단백질 코딩하는 유전자, 그의 활성이 이 분야에서 알려진 표준 어세이에 의해 검출될 수 있는 효소(예를 들면, 베타-갈락토시다제, 루시퍼라제 또는 알칼리성 포스페타제)을 코딩하는 유전자, 및 형질변형된 또는 형질전환된 세포, 숙주, 클로니 또는 플라그(예를 들면, 그린 형광 단백질)의 표현형에 가시적으로 영향을 미치지는 유전자를 포함한다. 바람직한 벡터는 이들이 작동적으로 합쳐질 수 있는 DNA 세그먼트에서 존재하는 구조적 유전자 산물을 자주적으로 복제 및 발현할 수 있는 것이다.
본원에서 사용된 "코딩 서열 및 조절염기순서가 "작동적으로(operably)" 합쳐진다고 말하는 것은 코딩 서열의 발현 또는 전사가 조절염기순서의 영향 또는 제어하에 위치잡는 방식으로 이들이 공유적으로 결합되는 경우이다. 코딩 서열이 기능적 단백질로 번역되는 것이 요구되는 경우, 2개의 DNA 서열은 5' 조절염기순서에서 프로모터의 유도가 코딩 서열의 전사를 초래하고 2개의 DNA 서열 사이의 연결(linkage)의 특성이 (1) 프레임-쉬프트 돌연변이의 유도를 초래하지 않고, (2) 코딩 서열의 전사를 이끄는 프로모터 영역의 능력을 방해하지 않거나, 또는 (3) 단백질로 번역되어지는 대응 RNA 전사의 능력을 방해하지 않는 경우 작동적으로 합쳐진다고 말해진다. 따라서, 프로모터 영역은 프로모터 영역이 그 DNA 서열의 전사에 얻어진 전사물이 요구된 단백질 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있도록 영향을 미칠 수 있다면 코딩 서열에 작동적으로 합쳐진다.
본 발명의 임의의 효소를 인코딩하는 핵산 분자가 세포에서 발현되는 경우, 다양한 전사 제어 서열(예를 들면, 프로모터/인헨서 서열)이 그의 발현을 이끌기 위해 사용될 수 있다. 상기 프로모터는 천연 프로모터, 예를 들면, 그의 내재성 상황 내의 유전자의 프로모터일 수 있고, 이것은 유전자 발현의 정규적인 조절을 제공한다. 일부의 구현예에서, 프로모터는 구성적이 될 수 있고, 즉 프로모터가 그와 관련된 유전자의 연속적 전사를 위해 비조절되는 것이 허용되는 것이다. 다양한 조건 프로모터는 또한 분자의 존재 또는 부재에 의해 조절된 프로모터와 같이 사용될 수 있다.
유전자 발현을 위해 필요된 조절염기순서의 정밀한 본성은 종 또는 세포 유형 사이에서 변화할 수 있지만, 필요에 따라 일반적으로 전사 및 번역의 개시와 관련된 각각의 5' 비-전사된 및 5' 비-번역된 서열, 예를 들면, TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 및 등등을 포함한다. 특히, 5' 비-전사된 조절염기순서는 작동적으로 합쳐진 유전자의 전사적 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 조절염기순서는 또한 요구되는 바에 따라 인헨서 서열 또는 업스트림 액티베이터(upstream activator) 서열을 포함할 수도 있다. 본 발명의 벡터는 선택적으로 5' 리더 또는 시그널 서열을 포함할 수 있다. 적절한 벡터의 선택 및 다지인은 이 분야의 당업자의 능력 및 재량내이다.
발현을 위해 모든 필요한 요소를 함유하는 발현 벡터는 시판되며, 이 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 참조. 세포는 이종 DNA(또는 RNA)의 세포로 도입되어 유전적으로 조작된다. 이종 DNA(또는 RNA)는 숙주 세포에서 이종 DNA의 발현을 허용하는 전사적 요소의 작동가능한 제어하에서 위치된다. 일부의 구현예에서, 본 발명의 2개 이상의 핵산은 동일한 발현 벡터 또는 플라스미드로 클로닝된다.
본 발명과 관련된 임의의 효소를 인코딩하는 핵산 분자 또는 핵산 분자는 이 분야의 표준 방법 및 기술을 사용하여 세포 또는 세포내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 핵산 분자는 화학적 형질전환 및 전기천공법, 형질도입, 유전자총(particle bombardment)과 같은 표준 프로토콜에 의해 도입될 수 있다. 효소를 코딩하는 핵산 분자를 발현하는 것은 핵산 분자를 게놈으로 통합시켜 성취될 수 있다. 핵산 분자는 이 분야의 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 세포의 게놈성 DNA로 통합될 수 있다.
일부의 구현예에서, 본 발명과 관련된 하나 이상의 유전자는 박테리아 세포에서 재조합적으로 발현된다. 본 발명에 따른 박테리아 세포는 임의의 타입(풍부 또는 최소) 또는 임의의 조성의 배지에서 배양될 수 있다. 일부의 구현예에서, 세포는 LB 배지에서 배양된다. 이 분야의 당업자에게 이해되어지는 바와 같이, 일상적인 최적화는 다양한 타입의 배지의 사용을 허용한다. 선택된 배지는 다양한 추가적인 성분들로 보충될 수 있다. 보충 성분의 비-제한 실예는 글루코스, 항생제, IPTG, 유전자 유도를 위한 테트라사이클린 또는 안하이드로-테트라사이클린(aTc), 및 ATCC 트레이스(Trace) 미네랄 보충을 포함한다. 유사하게, 본 발명의 세포의 배지 및 성장 조건의 다른 양태는 일상적인 실험을 통해 최적화될 수도 있다. 예를 들면, pH 및 온도는 최적화될 수 있는 인자의 비제한 실예이다. 일부의 경우에서, 보충 성분의 농도 및 양이 최적화될 수 있다. 기타 구현예에서, 배지가 하나 이상의 보충 성분으로 얼마큼 보충되어야 하는지 및 배지가 배양되는 시간의 양이 최적화된다.
일부의 구현예에서, 성장 배지는 문헌 [Zawada and Swartz (2006) Biotechnology and Bioengineering 94(4):618]로부터 채택되고, 다음의 하나 이상을 포함한다: 탈이온수, Swartz-Medium Stock, MgSO4 Stock, 티아민 스톡(Thiamine Stock), 미량 금속(Trace Metals), 글루코스(Glucose), 비타민 스톡(Vitamin stocks), 아미노산 스톡(Amino Acids Stock), BASF Industrol DF204 (소포체), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 카르베니실린(Carbenicillin) 및 전배양 접종물(preculture inoculum). 스탁 용액의 대표적인 조성은 실시예 섹션에서 보다 상세히 설명된다. 미량 금속의 비-제한 실예는 붕산, 염화 코발트 수화물, 황산구리 수화물, 황산 망간 수화물, 몰리브덴산 나트륨 이수화물, 황산 아연 칠수화물 및 황산을 포함한다.
비타민의 비-제한 실예는 염화 콜린, 니아신(니코틴산), 피리독신 염산염, 리보플라빈, 파노테닌산 헤미칼슘염, 파라-아미노벤조산(PABA), KOH, 비오틴, 시아노코발라민 및 엽산 이수화물을 포함한다. 아미노산의 비-제한 실예는 이소류신, 류신, 트립토팝 및 발린을 포함한다.
본 발명의 양태와 관련된 세포는 이 분야의 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와같이 다양한 디바이스에서 배양될 수 있다. 일부의 구현예에서, 세포는 바이로리액터, 예를 들면, 독일 율리히의 DASGIP AG에 의해 제공된 바이오리액터에서 배양된다. 일부의 구현예에서, 상기 바이오리액터는 DASGIP AG 바이오리액터, 볼륨 4.0, May 2009이고, 바이오리액터 제조법은 DASGIP 컨트롤 4.0 유저 매뉴얼에 기초된다. 일부의 구현예에서, 용해된 산소 공급 전략은 실시예 섹션에서 설명된 바와 같이 및 문헌[Lee (1996) Trends in Biotechnology, 14(3):98-105]에서 추가로 논의된 바에 따른다.
일부의 구현예에서, 재조합 단백질 발현은 LacI 프로모터의 제어하이고, IPTG의 부가에 의해 유도된다. 다른 유도성 프로모터는 또한 본 발명의 양태와 상용가능하다. 세포는 이 분야의 당업자에게 친숙한 다양한 절차에 따라 수확되어질 수 있다. 예를 들면, 세포는 실시예 섹션에서 추가로 설명되는 바와 같이 연동펌프(peristaltic pump) 시스템에 의해 수확될 수 있다.
본 발명의 양태에 따르면, 무세포 생성을 위한 정화된 용해물이 발생된다. 세포는 이 분야의 당업자에 친숙한 다양한 절차에 따라 용해될 수 있다. 일부의 구현예에서, 수확 다음에, 세포들은 Avestin EmulsiFlex-C3 High Pressure Homogenizer (Avestin, Inc., Ottawa, Ontario, Canada)를 사용하여 20,000 psi에서 단일 패스 균질화기를 통과하여 용해된다. 일부의 구현예에서, 용해물은 2차에 속하고, 추가적으로 더 균질화기를 통과한다. 전체 세포 용해물은 이어서 원심분리를 통과해 정화되고, 무세포 반응이 정화된 용해물에 기질과 보조인자의 부가에 의해 개시된다. 세포 배양, 수확 및 무세포 반응 동안 대표적인 절차가 실시예 섹션에서 제공되고, 이런 프로토콜의 최적화는 이 분야의 당업자에 의해 성취될 수 있다고 이해되어야 한다.
제약적 조성물
본 발명은 또한 상기 설명된 무세포 시스템에 의해 제조된 카바페넴, 예를 들면 식(I)의 화합물 및 선택적으로 제약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
제약적으로 허용가능한 부형제는 요구된 특별한 투여 형태에 적합한 임의의 및 모든 용매, 희석제 또는 기타 액체 비히클, 분산액 또는 현탁액 보조제, 계면활성제, 등장제, 농축제 또는 유화제, 방부제, 고형 결합제, 윤활제 및 등등을 포함한다. 제형화 및/또는 제약적 조성물의 제조에서 일반적인 고려사항은 예를 들면, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980), and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition (Lippincott Williams & Wilkins, 2005)]에서 발견될 수 있다.
본원에서 기재된 제약 조성물은 약리학 분야에서 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 일반적으로 이런 제조 방법은 식(I)의 화합물("활성 성분")을 관련된 하나 이상의 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 합치고, 이어서 필요한 경우 및/또는 요구되는 경우, 제품을 요구된 단일 또는 다중 투여량 유닛으로 성형 및/또는 포장하는 단계를 포함한다.
제약 조성물은 단일 유닛 투여량 및/또는 다수의 단일 유닛 투여량과 같이 벌크로 제조되고, 포장되고 및/또는 고형화될 수 있다. 본원에서 사용된 "유닛 투여량"은 예정된 양의 활성 성분을 포함하는 제약 조성물의 이산(discrete) 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상물에 투여될 수 있는 활성 성분의 투여량 및/또는 이런 투여량의 간단한 분수, 예를 들면 1/2 또는 1/3의 투여량과 일반적으로 동등하다.
활성 성분, 제약학적으로 허용가능한 부형제, 및/또는 임의의 추가 성분의 상대적인 양은 치료되는 대상체의 아이덴티티, 크기 및/또는 증상에 따라 다양해질 것이고, 또한, 조성물이 투여되는 경로에 따라서도 다양해질 것이다. 예를 들어, 조성물은 0.1% 내지 100%(w/w) 활성 성분을 포함한다.
제공된 제약 조성물의 제조에 사용되는 제약학적으로 허용가능한 부형제는 불활성 희석제, 분산제 및/또는 과립화제, 계면 활성제 및/또는 유화제, 붕해제, 결합제, 방부제, 완충제, 윤활제 및/또는 오일을 포함한다. 코코넛 버터와 좌약 왁스, 착색제, 코팅제, 팽윤제, 향미제 및 방향제와 같은 부형제가 조성물에 존재될 수 있다.
예시적인 희석제는 이에 한정하는 것은 아니지만, 탄산 칼슘, 탄산나트륨, 인산 칼슘, 인산이 칼슘, 황산 칼슘, 인산 수소 칼슘, 인산 나트륨 락토오스, 수크로오스, 셀룰로오스, 미결정 셀룰로오스, 카올린, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 소듐 클로라이드, 건조 전분, 옥수수 전분, 가루 설탕 등, 및 이들의 조합을 포함한다.
예시적인 과립화제 및/또는 분산제는 이에 한정하는 것은 아니지만, 감자 전분, 옥수수 전분, 타피오카 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트, 점토, 알긴산, 구아 검, 시트러스 펄프, 한천, 벤토나이트, 셀룰로오스 및 목재 제품, 천연 스폰지, 양이온-교환 수지, 탄산 칼슘, 실리케이트, 탄산나트륨, 가교 폴리(비닐피롤리돈)(포비돈), 소듐 카르복시메틸 전분(나트륨 전분 글리콜레이트), 카르복시메틸 셀룰로오스, 가교 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨(크로스카르멜로스), 메틸 셀룰로오스, 호화 전분(전분 1500), 미세 결정성 전분, 불용성 전분, 칼슘 카르복시 메틸 셀룰로스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트 (비검 (Veegum)), 나트륨 라우릴 설페이트, 사차 암모늄 화합물, 및 이들의 조합물을 포함한다.
예시적인 계면 활성제 및/또는 유화제는 이에 한정하는 것은 아니지만, 천연 유화제(예 : 아카시아, 아가, 알긴산, 알긴산 나트륨, 트라가칸트, 콘드록스(chondrux), 콜레스테롤, 잔탄, 펙틴, 젤라틴, 난황, 카세인, 울 지방, 콜레스테롤, 왁스, 및 레시틴), 콜로이드 점토(예, 벤토나이트(규산 알루미늄) 및 비검 (Veegum)(마그네슘 알루미늄 실리케이트)), 긴 사슬 아미노산 유도체, 고 분자량 알콜(예 : 스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 올레일 알코올, 트리아세틴 모노 스테아레이트, 에틸렌 글리콜 디스테아레이트, 글리세릴 모노 스테아레이트, 프로필렌 글리콜 모노 스테아레이트 , 폴리 비닐 알코올), 카르보머(예, 카르복시 폴리 메틸렌, 폴리 아크릴산, 폴리 아크릴산 중합체, 및 카르복시 비닐 중합체), 카라기난, 셀룰로오스 유도체(예, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 분말 셀룰로오스, 히드 록시메틸 셀룰로오스, 히드록시 프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 , 메틸 셀룰로오스), 소르비탄 지방산 에스테르 (예, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노 라우레이트(트윈 20), 폴리옥시에틸렌 소르비탄(트윈 60) , 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 (트윈 80), 소르비탄 모노 팔미테이트 (스판 40), 소르 비탄 모노스테아레이트(스판 60), 소르비탄 스테아레이트(스판 65), 글리세릴 모노 올레이트, 소르비탄 모노올레이트(스판 80)), 폴리옥시 에틸렌 에스테르(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트(Myrj 45), 폴리옥시 에틸렌 경화 피마자유, 폴리에톡실화 피마자유, 폴리옥시 메틸렌, 스테아르산, 및 솔루톨(Solutol)), 자당 지방산 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스테르류(예, 크레모포어), 폴리옥시에틸렌 에테르(예, 폴리옥시 에틸렌 라우릴 에테르(BRIJ 30)), 폴리(비닐피롤리 돈), 디에틸렌 글리콜 모노라우레이트, 트리에탄올 아민올레이트 , 나트륨 올레에이트, 칼륨 올레에이트, 에틸 올레에이트, 올레인산, 에틸 라우레이트, 소듐 라우릴 설페이트 , 플루로닉 F (68), 폴록사머 188, 세트리모늄 브로마이드, 세틸피리 디늄 클로라이드, 염화 벤잘코늄, 도쿠세이트(docusate) 소듐, 등 및 또는 이들의 조합물을 포함한다.
예시적인 결합제는 이에 한정하는 것은 아니지만, 전분(예, 옥수수 전분 및 전분 페이스트), 젤라틴, 당류(예, 자당, 포도당, 덱스트로오스, 덱스트린, 당밀, 락토스, 락티톨, 만니톨 등), 천연 및 합성 검(예, 아카시아, 알긴산 나트륨, 아이리쉬 모스의 추출물, 팬워(panwar) 검, 가티(ghatti) 검, 이사폴(isapol) 껍질의 점액, 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 결정 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리(비닐피롤리돈), 마그네슘 알루미늄 실리케이트(비검(Veegum)), 및 라치 아라보갈락탄), 알긴산염, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌 글리콜, 무기 칼슘염, 규산, 폴리메타크릴레이트, 왁스, 물, 알코올, 및/또는 이들의 조합물을 포함한다.
예시적인 방부제는 이에 한정하지 않으며, 항산화제, 킬레이트화제, 보존제, 항균성 보존제, 알코올 보존제, 산성 방부제 및 다른 방부제를 포함한다.
예시적인 항산화제는 이에 한정하는 것은 아니지만, 알파 토코페롤, 아스코르브산, 아코빌(acorbyl) 팔미테이트, 부틸화 히드록시 아니솔, 부틸화 히드록시 톨루엔, 모노티오글리세롤(monothioglycerol), 포타슘 메타 비설파이트, 프로피온산, 프로필 갈레이트, 아스코르빈산 나트륨, 아황산수소 나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨을 포함한다.
예시적인 킬레이트화제는 이에 한정하는 것은 아니지만, 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA) 및 이들의 염 및 이의 수화물(예를 들면, 소듐 에데테이트, 디소듐 에데테이트, 트리소듐 에데테이트, 칼슘 디소듐 에데테이트, 디칼륨 에데테이트 등), 시트르산 및 이들의 염 및 이들의 수화물(예를 들면, 시트르산 일 수화물), 푸마르산 및 이들의 염 및 이들의 수화물, 말산 및 이들의 염 및 이들의 수화물, 인산 및 이들의 염 및 수화물, 및 타르타르산 염 및 이들의 수화물을 포함한다. 예시적인 보존제는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 벤질알콜, 브로노폴, 세트리미드(cetrimide), 세틸 피리디늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 클로로 부탄올, 클로로크레졸(chlorocresol), 클로록시레놀(chloroxylenol), 크레졸, 에틸 알코올, 글리세린, 헥 세티 딘, imidurea, 페놀, 페녹시 에탄올, 페닐 에틸 알콜, 페닐메르큐릭 나이트레이트(phenylmercuric ntrate), 프로필렌 글리콜 및 티메로살을 포함한다.
항균성 방부제의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만 부틸 파라벤, 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤, 벤조산, 히드록시 벤조산, 포타슘 벤조에이트, 포타슘 소르베이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 프로피오네이트, 및 소르빈산을 포함한다.
알코올 방부제의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 페놀, 페놀 화합물, 비스페놀, 클로로부탄올, 히드록시 벤조에이트, 및 페닐에틸 알코올을 포함한다.
산성 방부제의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 베타-카로틴, 시트르산, 아세트산, 디히드로 아세트산, 아스코르브산, 소르빈산, 및 피트산을 포함한다.
기타 방부제로는, 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 디테록심(deteroxime) 메실레이트, 세트리미드(cetrimide), 부틸화 히드록시아니솔(BHA), 부틸화 히드록시톨루엔드(BHT), 에틸렌디아민, 소듐 라우릴 설페이트(SLS), 소듐 라우릴 에테르 설페이트(SLES), 소듐 바이설파이트, 소듐 메타바이설파이트, 포타슘 설파이트, 포타슘 메타바이설파이트, 글리단트 플러스, 페노닙(Phenonip), 메틸파라벤, 저몰(Germall) 115, 저마벤(Germaben) II, 네올론(Neolone), 케톤(Kathon), 및 유실(Euxyl)을 포함한다.
완충제의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만 시트레이트 완충액, 아세테이트 완충액, 포스페이트 완충액, 암모늄 클로라이드, 칼슘 카보네이트, 칼슘 클로라이드, 칼슘 시트레이트, 칼슘 글루비오네이트(glubionate), 칼슘 글루셉테이트, 칼슘 글루코네이트, D-글루콘산, 칼슘 글리세로포스페이트, 칼슘 락테이트, 프로판산, 칼슘 레불리네이트(levulinate), 펜탄산, 디베이식 칼슘 포스페이트, 인산, 트리베이식 칼슘 포스페이트, 칼슘 히드록시드 포스페이트, 포타슘 아세테이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 글루코네이트, 포타슘 혼합물, 디베이식 포타슘 포스페이트, 모노베이식 포타슘 포스페이트, 포타슘 포스페이트 혼합물, 소듐 아세테이트, 소듐 바이카보네이트, 소듐 클로라이드, 소듐 시트레이트, 소듐 락테이트, 디베이식 소듐 포스페이트, 모노베이식 소듐 포스페이트, 소듐 포스페이트 혼합물, 트로메타민, 마그네슘 히드록시드, 알루미늄 히드록시드, 알긴산, 발열원이 없는 물, 등장성 식염수, 링거액, 에틸 알코올 등 및 이들의 조합을 포함한다.
윤활제 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 스테아르산, 실리카, 탈크, 맥아, 글리세릴 베하네이트, 수소화 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드, 로이신, 마그네슘 라우릴 설페이트, 소듐 라우릴 설페이트 등, 및 이들의 조합을 포함한다.
천연 오일의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만 아몬드, 살구씨, 아보카도, 바바수, 베르가못, 블랙 커런트 시드, 보리지, 케이드, 카모마일, 카놀라, 캐러웨이, 카나우바, 캐스터, 시나몬, 코코아 버터, 코코넛, 대구 간, 커피, 옥수수, 목화씨, 에뮤, 유칼립투스, 달맞이꽃, 생선, 아마씨, 제라니올, 조롱박, 포도씨, 헤이즐 너트, 히솝, 이소프로필 미리스테이트, 호호바, 쿠쿠이 너트, 라반딘, 라벤더, 레몬, 리트시 쿠베바, 마카데미아 너트, 아욱, 망고씨, 메도우폼 씨, 밍크, 육두구, 올리브, 오렌지, 오렌지 러피, 팜, 팜 커널, 복숭아 커널, 땅콩, 양귀비씨, 호박씨, 유채, 쌀겨, 로즈마리, 홍화, 백단, 사스콰나, 맛, 산자 나무, 참깨, 시어 버터, 실리콘, 콩, 해바라기, 차 나무, 씨슬, 츠바키(tsubaki), 베티버(vetiver), 호두, 밀 배아 오일을 포함한다. 합성 오일의 예로는, 부틸 스테아레이트, 카프릴릭 트리글리세리드, 카프릭 트리글리세리드, 시클로메티콘, 디에틸 세바케이트, 디메치콘 360, 이소프로필 미리스테이트, 미네랄 오일, 옥틸 도데칸올, 올레일 알코올, 실리콘 오일, 및 이들의 조합을 포함한다.
경구 및 비경구 투여용 액상 제형은 제약학적으로 허용가능한 에멀젼, 마이크로 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 활성 성분 이외에, 액상 제형은 예를 들어, 물 또는 다른 용매, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸 포름아미드, 오일(예를 들어, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참깨유), 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물과 같은 가용화제 및 유화제와 같은 본 기술분야에서 통상 사용되는 불활성 희석제를 포함할 수 있다. 불활성 희석제 외에, 경구 조성물은 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 향미제, 및 방향제와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 비경구 투여에 있어서, 활성 성분이 크레모포어™, 알코올, 오일, 변성 오일, 글리콜, 폴리소르베이트, 시클로 덱스트린, 폴리머, 및 이들의 조합과 같은 가용화제와 혼합된다.
주사용 제제, 예를 들어 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사 제제는, 예를 들어 1,3-부탄디올 내 용액으로서 비독성의 비경구적으로 허용 가능한 희석제 또는 용매 내 멸균 주사 용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 허용 가능한 담체 및 용매 중에서 사용될 수 있는 것은 물, 링거액, U.S.P. 및 등장성 소듐 클로라이드 용액이다. 그 외에, 멸균, 고정 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 상기 목적을 위해 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하여 임의의 무자극성 고정 오일이 사용될 수 있다. 그 외에, 올레산과 같은 지방산이 주사제의 제조에 사용된다.
주사용 제제는, 예를 들어 박테리아-보유 필터를 통해 여과하거나, 또는 사용전 멸균수 또는 다른 멸균 주사 매질에 용해 또는 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 멸균제를 혼입함으로써 멸균될 수 있다.
직장 또는 질 투여용 조성물은 통상적으로 활성 성분을, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 좌약 왁스와 같은 상온에서 고체이지만 체온에서 액체이어서 직장 또는 질의 구멍에서 용해하여 활성 성분을 방출하는 적당한 비-자극성 부형제 또는 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있는 좌제이다.
경구 투여용 고체 제형은 캡슐, 정제, 환제, 산제 및 과립제를 포함한다. 상기 고체 제형에서, 활성 성분은, 소듐 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트 및/또는 a)전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨 및 규산과 같은 충전제 또는 증량제, b)예를 들어, 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리디논, 수크로오스 및 아카시아와 같은 결합제, c)글리세롤과 같은 습윤제, d)한천, 칼슘 카보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트, 및 소듐 카보네이트와 같은 붕해제, e)파라핀과 같은 용해 지연제, f)4급 암모늄 화합물과 같은 흡수 촉진제, g)예를 들어, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 습윤제, h)카올린 및 벤토나이트 클레이와 같은 흡수제, 및 i)탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴과 같은 1 이상의 제약학적으로 허용 가능한 불활성 부형제 및 이들의 혼합물과 함께 혼합된다. 캡슐, 정제 및 환제의 경우, 제형은 완충제를 포함할 수 있다.
유사한 유형의 고체 조성물이 락토오스 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질-충전 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 사용될 수 있다. 정제, 당의정, 캡슐, 환제 및 과립제의 고체 제형은 제약학적 제제 기술 분야에서 잘 알려진 장용 코팅 및 기타 코팅과 같은 코팅 및 쉘로 제조될 수 있다. 이들은 임의로 불투명화제를 포함할 수 있고, 활성 성분만을, 바람직하게는, 장관의 특정 부분에서, 임의로 지연된 방식으로, 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 봉입 조성물의 예로는 중합성 물질 및 왁스를 포함한다. 유사한 유형의 고체 조성물이 락토오스 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질-충전 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 사용될 수 있다.
활성 성분은 상기 한 바와 같이 하나 이상의 부형제와 함께 마이크로 캡슐화된 형태로 있을 수 있다. 정제, 당의정, 캡슐, 환제 및 과립제의 고체 제형은 제약학적 제제 기술 분야에서 잘 알려진 장용 코팅, 방출 제어 코팅 및 기타 코팅과 같은 코팅 및 쉘로 제조될 수 있다. 그러한 고체 제형에서 활성 성분은 수크로오스, 락토오스 또는 전분과 같은 적어도 한개의 불활성 희석제와 혼합될 수 있다. 이러한 제형은 통상의 관행대로, 불활성 희석제 이외의 추가적인 물질, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트 및 미세 결정성 셀룰로오스와 같은 정제화 윤활제 및 기타 정제화 보조제를 포함할 수 있다. 캡슐, 정제 및 환제의 경우, 제형은 완충제를 포함할 수 있다. 이들은 임의로 불투명화제를 포함할 수 있고, 활성 성분만을, 또는 바람직하게는, 장관의 특정 부분에서, 임의로 지연된 방식으로, 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 봉입 조성물의 예로는 중합성 물질 및 왁스를 포함한다.
국소 및/또는 경피 투여용 제형은 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제 및/또는 패치제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 활성 성분은 멸균 조건하에서, 요구될 수 있는 제약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 임의의 필요한 방부제 및/또는 완충제와 함께 혼합된다.
본원에 기재된 약학적 조성물을 피내 전달에 사용하기에 적합한 장치는 미국 특허 4,886,499; 5,190,521; 5,328,483; 5,527,288; 4,270,537; 5,015,235; 5,141,496 및 5,417,662에 기재한 바와 같은 짧은 바늘 장치를 포함한다. 피내 조성물은 PCT 공개 WO 99/34850에 기재한 것 및 그의 기능적 균등물과 같은, 피부로 바늘의 효과적인 침투 길이를 제한하는 장치에 의해 투여될 수 있다. 액체 제트 인젝터를 통해 및/또는 각질층을 관통하여 진피에 도달하는 제트를 생성하는 바늘을 통해 액체 백신을 진피에 전달하는 제트 주사 장치가 적합하다. 제트 주사 장치는, 예를 들어, 미국특허 5,480,381; 5,599,302; 5,334,144; 5,993,412; 5,649,912, 5,569,189, 5,704,911, 5,383,851, 5,893,397, 5,466,220, 5,339,163, 5,312,335, 5,503,627, 5,064,413, 5,520,639, 4,596,556, 4,790,824, 4,941,880, 4,940,460; 및 PCT 공개 WO97/37705 및 WO97/13537에 기재되어 있다. 피부의 외층을 통해 진피로 분말 형태의 백신을 촉진하기 위해 압축 가스를 사용하는 볼리스틱 파우더/입자 전달 장치가 적합하다. 대안으로 또는 추가로, 통상의 주사기가 피내 투여의 고전적인 망투 방법(Mantoux method)에 사용될 수 있다.
국소 투여에 적합한 제제는 도포제, 로션, 수중유(oil in water) 및/또는 크림, 연고 및/또는 페이스트와 같은 오일 에멀젼중 물, 및/또는 용액 및/또는 현탁액과 같은 액체 및/또는 반 액체 제제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 활성 성분의 농도가 용매내 활성 성분의 용해도 한계만큼 높을 수 있을지라도, 국소 투여용 제제는, 예를 들어, 약 1 % 내지 약 10 % (w/w) 활성 성분을 포함할 수 있다. 국소 투여용 제제는 본원에 기재된 추가 성분 1 이상을 추가로 포함할 수 있다.
제약학적 조성물은 경구를 통해 폐로 투여하기에 적합한 제제로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 이러한 제제는 활성 성분을 포함하며 약 0.5 내지 약 7 나노미터 또는 약 1 내지 약 6 나노미터 범위의 직경을 갖는 건조 입자를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 편리하게는, 추진제의 흐름이 분말을 분산할 수 있는 건조 분말 저장조를 포함하는 장치를 사용하고 및/또는 밀봉된 컨테이너 내의 저비점 추진제 내에 용해 및/또는 현탁된 활성 성분을 포함하는 장치와 같은 자기 추진 용매/분말 분배 컨테이너를 사용하여 투여하기 위해 건조 분말 형태이다. 이러한 분말은 입자의 98 중량% 이상이 0.5 나노미터보다 큰 직경을 갖고, 갯수로 입자의 95% 이상이 7 나노미터 미만의 직경을 갖는 입자를 포함한다. 또는 입자의 95 중량% 이상이 1 나노미터보다 큰 직경을 갖고, 갯수로 입자의 90% 이상이 6 나노미터 미만의 직경을 갖는다. 건조 분말 조성물은 설탕과 같은 고체 미분말 희석제를 포함하고 편리하게는 단위 제형으로 제공된다.
저비점 추진제는 일반적으로 대기압에서 65°F 이하의 비등점을 갖는 액체 추진제를 포함한다. 일반적으로 추진제는 조성물의 50 내지 99.9%(w/w)를 구성할 수 있으며, 활성 성분은 조성물의 0.1 내지 20%(w/w)를 구성할 수 있다. 추진제는 액상 비-이온성 및/또는 고체 음이온성 계면 활성제 및/또는 고체 희석제(활성 성분을 포함하는 입자와 동일한 순서의 입자 크기를 가질 수 있음)와 같은 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다.
폐 전달을 위해 제형화된 제약학적 조성물은 용액 및/또는 현탁액의 액적(droplet)의 형태로 활성 성분을 제공할 수 있다. 이러한 제제는, 활성 성분을 포함하는, 수성 및/또는 희석 알코올 용액 및/또는 현탁액으로서, 임의로 멸균하여, 제조, 포장, 및/또는 판매될 수 있으며, 임의의 분무 및/또는 원자화 장치를 사용하여 편리하게 투여될 수 있다. 이러한 제제는, 사카린 소듐과 같은 향미제, 휘발성 오일, 완충제, 계면 활성제, 및/또는 메틸히드록시벤조에이트와 같은 방부제를 포함하는 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 투여 경로에 의해 제공되는 액적은 약 0.1 내지 약 200 나노미터 범위의 평균 직경을 가질 수 있다.
폐 전달용으로 유용한 것으로 본원에 기재된 제제는 비강 전달용으로도 유용하다. 비강 투여에 적합한 다른 제제는 활성 성분을 포함하고 약 0.2 내지 500 마이크로미터의 평균 입자를 갖는 거친 분말이다. 이러한 제제는 콧구멍에 가깝게 유지된 분말의 컨테이너로부터 비강 통로를 통해 신속히 흡입함으로써 투여된다. 비강 투여에 적합한 제제는, 예를 들어, 활성성분의 적게는 약 0.1 %(w/w) 부터 많게는 약 100 %(w/w)를 포함할 수 있고, 본원에 기술된 1 이상의 추가의 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 경구 투여에 적합한 제제로 제조, 포장, 및/또는 판매될 수 있다. 이러한 제제는, 예를 들어, 통상의 방법을 사용하여 제조된 정제 및/또는 로젠지의 형태일 수 있고, 예를 들어, 활성 성분 0.1 내지 20 %(w/w), 경구로 용해 및/또는 분해 가능한 조성물을 포함하는 나머지, 및 임의로, 본원에 기재된 하나 이상의 추가 성분을 포함할 수 있다. 또는, 경구 투여에 적합한 제제는 활성 성분을 포함하는 분말 및/또는 에어로졸 및/또는 분무 용액 및/또는 현탁액을 포함할 수 있다. 이러한, 분말, 에어로졸, 및/또는 에어로졸 제제는, 분산될 때, 약 0.1 내지 약 200 나노미터 범위의 평균 입자 및/또는 액적 크기를 가질 수 있고, 추가로 본원에 기재된 1 이상의 추가 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 눈에 투여하기 적합한 제제로 제조, 포장, 및/또는 판매될 수 있다. 이러한 제제는, 예를 들어, 수성 또는 유성 액상 담체 내에 활성 성분 0.1/1.0 %(w/w) 용액 및/또는 현탁액을 포함하는 점안액의 형태일 수 있다. 이러한 점안액은 추가로 완충제, 염, 및/또는 본원에 기재된 하나 이상의 다른 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 다른 안과적으로 투여 가능한 유용한 제제는 미세 결정성 형태 및/또는 리포좀 제제 내에 활성 성분을 포함하는 제제를 포함한다. 점이액 및/또는 점안액은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 생각된다.
본원에서 제공된 제약학적 조성물의 설명은 주로 사람에게 투여하기에 적합한 재약학적 조성물이지만, 이러한 조성물이 일반적으로 모든 종류의 동물에게 투여하기에 적합한 것으로 당업자에게 이해될 것이다. 다양한 동물들에게 투여하기에 적합한 조성물을 제공하기 위해 인간에게 투여하기에 적합한 제약학적 조성물의 변경이 잘 이해되고, 보통의 숙련된 동물 약리학자들은 보통의 실험으로 그러한 변경을 고안하고 및/또는 수행할 수 있다. 약학적 조성물의 배합 및/또는 제조에 있어서 일반적인 고려사항들은, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005]에서 찾을 수 있다.
본 발명에 의해 제약학적 팩 및/또는 키트가 더 포함된다. 제공된 제약학적 팩 및/또는 키트는 제약학적 조성물 및 컨테이너(예를 들어, 바이알, 앰플, 병, 주사기, 및/또는 디스펜서 패키지 또는 다른 적절한 컨테이너)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 팩 및/또는 키트는 임의로 대상체 투여의 제조를 위해 제약학적 조성물의 희석액 또는 현탁액을 위한 적합한 제약학적 부형제를 포함하는 2차 컨테이너를 추가로 포함할 수 있다. 임의로, 사용을 위한 지침이 본 발명의 상기 키트에 추가로 제공된다. 이러한 지침은, 일반적으로, 예를 들어, 투여량 및 투여를 위한 지침을 제공할 수 있다. 다른 구현예에서, 지침은 투여를 위한 특정 컨테이너 및/또는 시스템에 대해 전문적인 지침에 관련한 추가의 상세내용을 더 제공할 수 있다. 또한, 지침은 추가적인 치료와 결합 및/또는 조합하여 사용하기 위한 전문적인 지침을 제공할 수 있다.
치료 및 투여 방법
본 발명은 또한 상기 무-세포 방법에 의해 제조된, 예를 들어, 화학식 (I)의 화합물, 카바페넴, 또는 이의 조성물의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 세균성 감염을 치료하는 방법을 제공한다.
세균성 감염은 호기성 세균, 혐기성 세균, 그람 양성균 뿐만 아니라 그람 음성균으로 부터의 감염을 포함한다. 세균성 감염의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만 그람 양성균(예를 들어, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Listeria, Corynebacteria, 또는 Bacillus 감염) 또는 그람 음성균(예를 들어, E.coli, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Bdellovibrio, 아세트산 세균, Legionella, Wolbachia, Neisseria, Hemophilus, 또는 Kelbsiella 감염) 으로부터의 감염을 포함한다. 특정 구현예에서, 세균성 감염은 슈도모나스 감염이다. 특정 구현예에서, 슈도모나스 감염은 원내 감염의 주요 요인 중 하나인 녹농균(Peudomonas aeruginosa)감염이다.
투여하는 "대상체"는 사람(즉, 모든 연령 그룹의 남성 또는 여성, 예를 들어, 소아 대상체(예를 들어, 유아, 어린이, 청소년) 또는 성인 대상체(예를 들어, 젊은 성인, 중년 성인 또는 노년 성인)) 및/또는 기타 영장류(예를 들어, 사이노몰거스 원숭이, 붉은털 원숭이); 소, 돼지, 말, 양, 염소, 고양이, 및/또는 개와 같은 상업적으로 관련된 포유 동물을 포함한 포유동물; 및/또는 닭, 오리, 거위, 및/또는 칠면조와 같은 상업적으로 관련된 조류를 포함한 조류를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, 다르게 특정되지 않는 이상, 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 대상체가 감염으로 고통받는 동안 발생하는 행동을 고려하며, 이는 감염의 심각도를 감소시키거나, 또는 감염의 진행 속도를 지연하거나 늦춘다.
본원에서 사용된 바와 같이, 다르게 특정되지 않는 이상, 화합물의 "치료학적 유효량"은 감염의 치료 또는 관리에 치료학적 이익을 제공하거나, 또는 감염과 연관된 하나 이상의 증상을 지연 또는 최소화하기에 충분한 양이다. 화합물의 치료학적 유효량은 단독으로 또는 다른 치료와 결합시 치료제의 양을 의미하며, 이것은 감염의 치료 또는 관리에 있어서 치료학적 이익을 제공한다. 용어 "치료학적 유효량"은, 전체적인 치료를 향상시키거나, 증상 또는 감염의 원인을 감소 또는 회피하거나, 또는 다른 치료제의 치료학적 효과를 향상시키는 양을 포함할 수 있다.
본원에서 제공되는 화합물 및 조성물은 경구, 정맥, 근육, 동맥, 골수, 경 막내, 피하, 심실내, 경피, 피내(interdermal), 직장, 질내, 복강내, 외용(분말, 연고, 크림, 및/또는 액적으로서), 점막, 비강, 구강, 장, 설하; 기관 내 점적, 기관지 점적, 및/또는 흡입; 및/또는 구강 스프레이, 비강 스프레이, 및/또는 에어로졸을 포함하여 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 특히 고려되는 경로는 전신 정맥 주사, 혈액 및/또는 림프 공급을 통한 국부적 투여, 및/또는 경구 투여이다. 일반적으로 가장 적절한 투여 경로는 제제의 성질(예를 들어, 위장관 환경에서 안정성), 대상체의 상태(예를 들어, 대상체가 경구 투여를 견딜수 있는지 여부) 등을 포함하는 다양한 인자에 의존할 것이다.
본원에 제공된 화합물 및 조성물은 통상적으로 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화된다. 그러나, 본 발명의 조성물의 일일 총 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것이라고 이해될 것이다. 임의의 특정 대상체에 있어서 특정한 치료학적 유효량 레벨은 치료되는 감염 및 감염의 심각성; 사용되는 특정 활성 성분의 활성; 사용되는 특정 조성물; 대상체의 연령, 체중, 일반적 건강, 성별 및 식사; 투여 시간, 투여 경로, 및 사용되는 특정 활성 성분의 배설 속도; 치료 기간; 사용되는 특정 활성 성분과 배합 또는 병용하여 사용되는 약물; 및 의료 분야에서 잘 알려진 유사 인자를 포함한 다양한 인자에 따를 것이다. 원하는 투여량은 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 하루 걸러, 3일 마다, 매주, 2주 마다, 3주 마다, 또는 4주 마다 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 원하는 투여량이 복수 투여(예를 들어, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회, 또는 그 이상 투여)를 사용하여 전달될 수 있다.
특정 구현예에서, 70kg 성인 인간에게 1일 1회 이상 투여하기 위한 화합물의 치료학적 유효량은 단위 제형 당 본 발명의 화합물 약 0.0001㎎ 내지 약 3000㎎, 약 0.0001mg 내지 약 2000㎎, 약 0.0001㎎ 내지 약 1000㎎, 약 0.001㎎ 내지 약 1000㎎, 약 0.01mg 내지 약 1000㎎, 약 0.1㎎ 내지 약 1000㎎, 약 1㎎ 내지 약 1000㎎, 약 1㎎ 내지 약 100㎎, 약 10㎎ 내지 약 1000㎎, 또는 약 100㎎ 내지 약 1000㎎을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 투여 범위가 제공된 제약학적 조성물을 성인에게 투여하기 위한 가이드를 제공한다고 인식될 것이다. 예를 들어, 어린이 또는 청소년에게 투여될 양은 의사 또는 본 기술 분야에서 숙련된 기술자들에 의해 결정될 수 있고 성인에게 투여되는 것보다 적거나 동일할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 화합물 또는 조성물은 하나 이상의 추가의 치료학적 활성제와 함께 투여될 수 있다고 또한 인식될 것이다. 화합물 또는 조성물은 하나 이상의 추가의 치료학적 활성제와 동시에, 이전에, 또는 이후에 투여될 수 있다. 일반적으로, 각 제제는 투여량으로 및/또는 그 제제에 대해 결정되는 시간 스케쥴에 따라 투여될 것이다. 배합에 사용되는 추가의 치료학적 활성제는 단일 조성물로 함께 투여되거나 상이한 조성물로 개별적으로 투여될 수 있다고 더 인식될 것이다. 식이요법에서 사용하는 특정 배합은 추가의 치료학적 활성제 및/또는 달성되어야 할 원하는 치료 효과와 함께 본 발명의 화합물의 적합성을 고려할 것이다. 일반적으로 배합에서 사용되는 추가의 치료학적 활성제는 그들이 개별적으로 이용되는 레벨을 넘지 않는 레벨로 이용될 것으로 예상된다. 일부 구현예에서, 배합에서 사용되는 레벨은 개별적으로 사용되는 것보다 낮을 것이다.
상기 화합물 또는 조성물은 그들의 생체 이용률을 향상시키고, 대사를 감소 및/또는 변경하고, 배설을 억제하고, 및/또는 신체 내 분포를 변경하는 제제와 함께 투여될 수 있다. 사용되는 치료법이 동일한 장애에 대해 원하는 효과를 달성할 수 있고(예를 들어, 화합물은 항염증제, 항불안제 및/또는 항우울제 등과 함께 투여될 수 있다), 및/또는 다른 효과(예를 들어, 불리한 부작용의 제어)를 달성할 수 있다고 또한 인식될 것이다.
특정한 일 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물, 예를 들어, 이미페넴은, 실라스타틴과 같은 디히드로펩티다제 억제제와 함께 투여될 수 있다.
실시예
본원에 기재된 발명을 더 충분히 이해할 수 있기 위하여,하기 실시예가 설명된다. 이들 실시예는 설명 목적만을 위한 것이며, 어떤 방식으로든 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다고 이해되어야 한다.
카바페넴의 무세포 합성
경제적 기질로부터 원하는 생성물로 효과적 생물 전환을 촉진하는데 필요한 핵심 효소를, 우선 신속히 성장하는 E.Coli 균주에서 유전공학적으로 발현하였다(예를 들어, 표 1 및 표 2에 기재한 효소 참조). 본 발명의 상기 양태는 세포질에서 원하는 경로 효소의 대부분을 생산하기 위해, 주변 세포질에서 제조를 위한 타겟이 된 핵심 엔트리 효소(즉, 생성물에 필요한 대사 경로를 일으키는 첫번째 효소)와 함께 E.Coli의 구획화 구조를 활용하였다. 예를 들어, 본원에 참고로 통합된 PCT 공개 WO 2010/074760 을 참조하라. 이것은 상기 경로가 강력한 성장과 대사 건강을 유지하면서, 온전한 기관에서 활성화되지 않는다(또는 최소로 활성화된다)는 것을 확인시켜준다. 세포는 고속의 산소 전달 및 열 제거를 위해 고안된 발효조에서 상대적으로 높은 세포 밀도로 급속히 성장시켰다. 수확 전, 세포질 및 주변 세포질 모두를 타겟하는 과잉발현된 단백질을 생산하기 위해 배양을 유도하였다.
이미페넴의 무세포 합성 예. 경로 단계 a-f는, 글루타메이트 및 글루코오스로부터 이종(heterologous) 경로 기질 글루타메이트 세미알데히드 및 에틸말로닐-코엔자임 A의 형성을 촉진하고, 순수한 E-Coli 효소(단계 a, b, c, 및 e) 또는 E-Coli 내에서 기능적으로 보여지는 효소(단계 d, f)를 수반한다. 단계 a 및 b는 글루타메이트로부터 글루타메이트 세미알데히드 형성을 촉진한다. 단계 c는 글리코릴틱(glycolytic) 경로를 포함하고 글루코오스로부터 아세틸-코엔자임 A를 공급한다. 단계 d-f는 아세틸-코엔자임 A에서 에틸 말로닐-코엔자임 A(R2=-CH2CH3)의 생산을 위해 필요하다. Rhodobacter sphaeroides 로부터 아세틸-코엔자임 A 아세틸트랜스퍼라제(단계 d) 및 크로토닐-코엔자임 A 리덕타제(단계 f)는 E.Coli에서 아세틸-코엔자임 A, 크로토닐-코엔자임 A 및 CO2로부터 아세토아세틸-코엔자임 A 및 에틸말로닐-코엔자임 A 각각의 형성을 촉진하는 것을 보여주었다. 문헌[Sato et al., J. Biosci. Bioeng. (2007) 103:38-44; Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2007) 104:10631-10636; Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2009) 106:8871-8876]을 참조. 또한, 크로토닐-코엔자임 A는 순수한 E. Coli FadB 또는 다른 이종 효소를 사용하여 아세토아세틸-코엔자임 A(단계 e)로 부터 E. Coli에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Atsumi et al.. Metab. Eng. (2008) 10:305-311]를 참조. 글루타메이트 세미알데히드 및 에틸말로닐 코엔자임 A로부터 이미페넴으로의 경로(단계 1-5)는 티에나마이신 및 카바페넴 생합성 경로 모두로부터 효소를 결합한다. 예를 들어, 문헌[Williamson et al., J Biol Chem (1985) 260:4637-4647; Stapon et al., J. Am. Chem. Soc.(2003) 125:15746-15747; Rodriguez et al., J Antibiot (2010) 63:135-138; Rodriguez et al., Mol Microbiol (2008) 69:633-645]; 및 표 2에 인용된 참고 문헌을 참조.
다른 카바페넴 화합물이 상기 설명 다음으로 고려되며, 가이드로서, 예를 들어, 도 9a-9h를 참조하라. 고려되는 하나의 특정한 카바페넴 중간체가 글루코오스 및 글리신으로부터 제공될 수 있다(도 3-5a 및 9d의 조합 참조). 핵심 단계는 트레오닌 알도라제를 사용하여 글리신 및 말로닉 세미알데히드로부터 3-히드록시글루타메이트의 생산 및 3-히드록시글루타메이트 세미알데히드 및 에틸말로닐-CoA로부터 카바페넴 코어의 형성을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Riva et al., Tetrahedron (2008) 64:5079]를 참조.
C2-사이드 체인의 부착
티에나마이신으로의 S. cattleya 경로에서, C-2 위치에서 카바페넴 핵에의 판테테인의 부착은 ThnV에 의해 추정적으로 촉진된다. 예를 들어, 문헌[Nunez et al., Chem. Biol. (2003) 10:301-311]을 참조. ThnV는 글루타티온 트랜스퍼라제에 서열 유사성에 기초한 카바페넴 핵의 C-2 위치에서 티올-함유 사이드 체인의 축합을 촉진하도록 제안되었다. 이 가설은 E. Coli에서 thnV 유전자 (E. Coli에서 발현을 위해 코돈- 최적화된)를 발현함으로써 그리고 카바페넴 핵(R2=CH2CH3)에 판테테인을 결합하는 이종 단백질의 능력을 평가함으로써 테스트될 수 있다. 유전자를 인코딩하는 ThnV의 서열(EMBL 기탁 번호 AJ421798로부터 수득)은 화학적으로 합성될 수 있으며, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 통한 정제를 위해 C-말단 및 N-말단 6xHis 태그 모두를 포함하도록 변형될 수 있다. thnV 유전자는 S. cattleya 게놈의 높은(>70%) GC 함량으로 인해 E. Coli에서 발현을 위한 최적화된 코돈일 수 있다. 합성 유전자는 C-말단 및 N-말단 6xHis 태그를 부여하는 발현 벡터에 서브 클로닝될 수 있다. 벡터의 pDuet 패밀리는 상업적 이용가능성(노바겐, Inc.), 서브 클로닝의 용이성, 및 유전자 발현에 대한 엄격한 제어로 인해 합성 유전자의 T7-기반 발현에 사용될 수 있다. 발현 레벨은 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)의 다양한 레벨의 사용을 통해서 뿐만 아니라, 다른 벡터 간의 카피수 변화의 사용을 통해 변경될 수 있다(pDuet 벡터는 동일한 발현 기기를 공유하지만, 약 10 내지 >100 카피수/세포의 범위로 카피수가 변한다). E. Coli 균주 BL21(DE3)는 서브 클로닝 유전자를 함유하는 플라스미드로 형질 전환될 수 있으며, 형질 전환체는 적절한 항생제를 사용하여 선택될 수 있다. 배양물은 0.1-1mM의 IPTG로 발현을 유도하기 이전에 풍부한 합성 배지에서 중간 광학 밀도(OD600 0.5-1)로 성장할 수 있다. 세포는 이어서 수확되고 고압 균질기를 사용하여 용해하기 전에 농축될 수 있다. 전장 단백질의 발현은 적절한 표준을 갖는 변성 단백질 겔 전기 영동으로 확인될 수 있다.
C2기(예를 들어,-SR8 기)를 화학적으로 또는 효소적으로, 대응하는 티올의 마이클 첨가를 통해 부착할 수 있다. C2 기의 예로는, 판테테인 및 N-포르미미도일 시스테아민 뿐만 아니라, 본원에 기재된 다른 것들(예를 들어, 도 6 참조)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 판테테인은 문헌[Mandel et al., Org Lett (2004) 6:4801-4803]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. N-포름이미도일 시스테아민은 미국특허 제4,292,436호 및 제4,329,481호에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. C2-C3 이중 결합은 메틸렌 디클로라이드의 존재 하에서 산화로 재도입될 수 있다 (상기 Bateson 참조). C2기는 에놀 형태의 트래핑, 이어서 마이클 첨가 및 제거를 통해 부착될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Rabasseda et al., Drugs Fut(1994) 19:631] 및 US 20090312539를 참조.
유전자의 화학적 합성
표 3에 기재된 효소를 위해 코딩하는 유전자는 E-Coli에서 발현을 위해 코돈-최적화로 화학적으로 합성될 수 있다. 유전자는 발현된 단백질의 정제를 위해 C- 및 N-말단 6xHis 태그로 합성될 수 있다. P. carotovorum(CarB, CarA, CarC)로 부터 효소 및 S. cattleya로 부터 동족체(ThnE, ThnM, ThnG)가 각 효소적 단계 1-3 동안 테스트될 수 있다.
화학적으로 합성된 유전자로 부터 발현/정제된 효소 목록
단계 효소 설명 유기체 GenBank
1 CarB 카르복시메틸프롤린 합성효소 P. carotovorum AAD38230.1
1 ThnE 카르복시메틸프롤린 합성효소 S. cattleya CAD18973.1
2 CarA 카바페남 합성효소 P. carotovorum AAD38229.1
2 ThnM b-락탐 합성효소 S. cattleya CAD18981.1
3 CarC 카바페넴 합성효소 P. carotovorum AAD38231.1
3 ThnG 추정 카바페넴 합성효소 S. cattleya CAD18975.1
기질의 화학적 합성
순수한 카바페넴(R2= H), 6-메틸 카바페넴(R2=CH3), 및 6-에틸 카바페넴(R2= CH2CH3) 기질이 4-알릴-아자티딘-2온, 4-알릴-3-메틸아자티딘-2온 및 4-알릴-3-에틸아자티딘-2온 각각으로부터 제조되었다. 예를 들어, 문헌[Bateson et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I (1990) 1793-1801]을 참조.
표 4는 비-순수 기질에 대한 효소 활성을 테스트하기 위해 화학적으로 합성될 화합물을 나타낸다. 말로닐-코엔자임 A, ATP, 및 2-케토글루타르산을 포함하여, 기타 필요한 기질이 상업적 공급자로부터 얻어질 것이다.
주문-합성된 화합물의 리스트
화합물 설명 구조
a (S)-2-아미노-5-옥소펜타논산(글루타메이트 세미알데히드) CarB의 순수 기질(단계1)
Figure pct00123
b (2S)-2-아미노-3-히드록시-5-옥소펜타논산(3-히드록시-글루타메이트 세미알데히드) CarB/ThnE의 원하는 기질(단계1)
Figure pct00124
c 에틸말로닐-코엔자임 A CarB/ThnE의 원하는 기질(단계1)
Figure pct00125
d (5R)-6-에틸-3,7-디옥소-1-아자비시클로[3.2.0]헵탄-2-카르복실산 CarB/ThnE 기질b,c와CarC/ThnG(단계3)의 원하는 생성물
Figure pct00126
d를 수득하게 되면, 화합물의 항균 활성을 평가하기 위해 초기 테스트가 수행될 것이다. 항균 활성의 테스트는 E.Coli의 β-락탐 감응 균주(예를 들어, SC12155, X580)를 넣은 플레이트 상에 d의 농도를 변화시키면서 스폿팅하는 것으로 이루어질 것이다. 성장 억제의 영역의 모양은 원하는 기질 b 및 c와 함께 개시된 짝을 이룬 효소 반응에서 d를 생산하는 동안 간단하고 신속한 분석을 가능하게 하면서 d의 항균 활성을 확인해 줄 것이다. 예를 들어, 문헌[Sleeman and Schofield, J. Biol. Chem.(2004) 279:6730]를 참조. 항균 활성이 관찰되지 않는 경우, 비-순수 기질 상에 효소 활성을 확인하기 위하여 LC/MS 분석이 이용될 것이다.
a 및 말로닐-CoA의 수득시, 정제된 CarB, CarA, 및 CarC의 순수 활성이, 결합된 CarB/CarA/CarC 반응의 항균 활성을 평가함으로써 입증될 것이다. 예를 들어, 문헌[Sleeman and Schofield, J. Biol. Chem. (2004) 279:6730]을 참조. 각 단백질의 N- 및 C-말단 6xHis 버전 모두 CarB, CarA, 및 CarC의 Thn 동족체(ThnE, ThnM, ThnG)와 함께 테스트될 것이다.
CarB, CarA, 및 CarC 효소(및 Thn 동족체)의 순수 활성이 입증되면, 결합된 CarB/CarA/CarC 반응이 기질 b 및 c와 함께 테스트될 것이다. 항생작용(d가 항균 활성을 보유하는 경우) 및 LC/MS 분석이 d의 생성을 확인하기 위하여 이용될 것이다.
화학적 기질 상에 트랜스퍼라제 효소의 테스팅
정제된 ThnV(고정된 니켈 친화성 수지 칼럼을 사용하여) 뿐만 아니라 고밀도(OD600~100) 크루드 용해물 모두와 함께 생화학 반응이 준비될 것이다. 반응은 50mM 트리스-HCl, pH 7.5 내에 1-5mM 농도 범위로 화학적으로 합성된 판테테인, N-포름이미도일 시스테아민, 및 카바페넴 기질을 포함할 것이다. 효소 활성을 위한 금속 보조인자의 요건은 1-5mM 2가(Mg2+, Mn2+, Cu2+, Fe2+, Zn2+, Ca2+, 및 Co2+) 및 1가(K+, Na+, 및 Li+) 금속의 첨가에 의해 결정될 것이다. 반응은 3-15 분 동안 37℃에서 배양될 것이다; 예를 들어, 1g/L-h 이미페넴 생산성은 50% 기질 변환 동안 10분의 반응 시간을 필요로 하는 0.05mM 이미페넴/분에 해당한다. 각 카바페넴 핵에 판테테인 또는 N-포름이미도일 시스테아민의 혼입은, 공통 카바페넴 발색단의 최대 흡광도 300nm에서 UV 검출과 함께 역상 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC)에서 각각의 생성물 피크의 증가에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 문헌[Bodner et al., J Am. Chem. Soc. (2010) 132:12-13; Myers et al., Antimicrob. Agents. Chemother.(1984) 26:78-81]을 참조. 비-순수 N-포름이미도일 시스테아민 사이드체인의 5% 결합 레벨은 단백질 진화 기술이 원하는 생성물을 더 높은 수율로 얻기 위하여 이용될 수 있음을 나타낸다. 마이어스(Myers) 등은(상기) HPLC를 통한 카바페넴 유도체의 최소 검출 한계가 1mM, 또는 50μΜ의 5%의 최소 목표 훨씬 아래인 1μM이라고 보고한다. 생성물 피크에 대응하는 분획을 수거하고, 전기분무 이온화 질량 분석기(ESI-MS)를 사용하여 더 확인될 것이다.
본 프로젝트는 효율적으로 비-순수 기질을 수용하기 위해 이종 효소 뿐만 아니라 가공된 효소의 사용을 통해 신규한 카바페넴 항생제의 생산을 또한 용이하게 할 수 있는 새로운, 저-비용의 제조 플랫폼을 제공할 것이다. 예를 들어, 문헌[Dietrich et al., ACS Chem Biol (2009) 4:261-267; Tracewell et al., Curr Opin Chem Biol (2009) 13:3-9]를 참조.
세포 성장을 위한 방법
시드 배양물이 가공된 균주의 해동된 워킹 스톡 1㎖와 함께 적절한 항생제(들)와 LB 100㎖를 접종함으로써 제조된다. 시드 배양물은 7시간 동안 37℃ 300rpm 으로 배양된다. 시드 배양물은 합성 성장 배지 1L를 접종하기 위해 사용된다(예를 들어, 문헌[Zawada and Swartz, Biotechnology and Bioengineering 94(4):618, 2006]에 기재된 바와 같이). 시작 광학 밀도(OD)는 0.03 이다. 하기 표에 기재된 바와 같이 DO-기반의 공급 전략이 사용된다; 공급 용액은 200㎖ 공급 당 500㎎/㎖ 글루코오스, 0.15%(v/v) BASF Industrol DF204 소포제, 및 7.69㎖ 1M MgS04를 함유한다. DO-기반의 공급 전략은 하기 참고문헌을 기초로 한다: Lee, SY, 1996. High cell-density culture of Escherichia coli. Trends in Biotechnology. 14, 3, 98-105. 단백질 발현은 광학 밀도가 10-20에 도달할 때 0.8mM IPTG를 첨가하여 1시간 동안 유도된다. 세포 수확 전, 교반, 통기 및 공급을 유지하면서, 배양물의 온도는 0.25-0.5시간에 걸쳐 37℃ 내지 10℃까지 감소된다.
발효 과정 인자들
온도 37℃
DO 셋트포인트 30%; 컨트롤러 셋팅 P=0.20, Ti=300s
DO 캐스케이드 컨트롤러 캐스케이드 0-50% →500-1100rpm; 50-100% → 21-60% O2
pH 셋트포인트 7; 오토리셋 Yi(체크안함)
통기 60L/h(1vvm)
교반 500-1100rpm(캐스케이드)
펌프 B NH4OH 15%(7.4M)
펌프 C 공급 용액; DO-기반 공급 전략: 6㎖ 쇼트(shots) 공급을 위해 유속 @40㎖/h; 트리거 ON: DO>55%; 트리거 OFF:DO<40%
세포 용해물의 제조 방법
4℃에서 30-60분 동안 8000xg에서 원심분리하여 약 10℃ 배양액을 수확했다. 세포 펠렛을 10-50mM 포타슘 포스페이트, pH 8.5에서 광학 밀도 100-250로 재현탁했다.
유도된 효소의 최적 레벨이 축적되면, 배양액이 농축되고 용해되어, 주변 세포질적으로 발현된 핵심 효소(들)을 방출한다. 최적화된 화학적 환경은 세포 용해 동안 형성된 내부 막 소포에 의해 촉매된 호흡을 활성화할 것이다. 예를 들어, 문헌[Jewett et al., Mol. Syst. Biol. (2008) 4:220]를 참조. 이것은 합성 경로에 있어서 ATP의 충분한 공급을 제공하고 또한 NAD+ 및/또는 NADP+를 재순환하기 위해 과량의 환원 등가물을 제거할 것이다. 세포는 20,000 psi에서 균질기(예를 들어, Avestin EmulsiFlex-C3 고압 균질기)를 통해 두 개의 패스에 의해 용해된다. 용해물은 물기 있는 얼음상에 무균 플라스크 내에서 수집된다. 필요한 경우, 용해물은 4℃에서 30분 동안 25,000xg에서 원심분리를 통해 투명해 진다. 상등액은 투명해진 용해물로 유지되었다.
무-세포 반응의 제조 방법
무-세포 반응을 하기 표에 기재된 설정을 사용하여 생물 반응기에서 발생시켰다. 용해물 또는 투명한 용해물이 반응기에서 37℃로 가열되고 용해된 산소 레벨이 평형이 된다. 무-세포 반응은 경로 기질 및 핵심 보조인자의 첨가로 개시하였다.
무세포 반응과정 인자들
온도 37℃
DO 셋트포인트 80%; 컨트롤러 셋팅 P=0.50, Ti=300s
DO 캐스케이드 컨트롤러 캐스케이드 1200rpm; 0-100% → 21-100% O2
pH 셋트포인트 7; 오토리셋 Yi(체크); 콘트롤러 셋팅 P=10, Ti=2400s
통기 10L/h(2.2vvm)
교반 1200rpm(캐스케이드)
펌프 A H2SO4, 5%(1.9N)
펌프 B KOH, 2N
펌프 C 기질
펌프 D 기질
실시예 1 내지 4에 대한 일반적 방법
각각 하나 이상의 하기 효소의 과잉발현을 유도할 수 있는 여러 균주를 제조하였다: ProB, ProA, CarB, CarA, CarC, 및 PutA. proB/A 및 putA 유전자가 E.Coli MG1655 게놈에서 직접 증폭되는 동안, P. carotovorum 의 carB/A/C 유전자를 E.Coli 에서 발현하기 위해 코돈-최적화시켰다. 균주를 37℃에서 미드-로그 상태로 성장하였고, 1-5시간 동안 유도하고, 펠렛화하고, 재현탁하여 10-20X 농축시키고, 세포 균질기를 사용하여 용해시켰다. 용해물을 세포 파편을 제거하기 위해, 원심분리를 통해 투명하게 하고, 단일 용해물 또는 용해물의 혼합물이 필요한 활동을 제공하기 위해 사용되었다. 반응(0.1-1mL)은 에탄올 냉각 전 1-3 시간 동안 37℃로 유지시켰다. 변형된 이산(diacid), CoA 기질, 프롤린 및 기타 보조 인자(ATP, NADPH, 2-케토글루타르산)를 필요시 반응에 첨가시켰다. LCMSMS가 반응 중간체 및 생성물의 분석에 사용되었다.
실시예 1. 치환된 글루타메이트 및 말로닐-CoA 또는 에틸말로닐-CoA로 부터 치환된 카르복시-메틸프롤린 분자의 제조
ProB, ProA, 및 CarB를 발현하는 플라스미드를 함유하는 BL21(DE3) 균주를 높은 세포 밀도로 성장, 용해하고, 세포 파편은 원심분리를 통해 제거하였다. 투명하게 된 용해물(30% 최종 반응 부피, 3.9㎎/㎖ 단백질)을 37℃에서 60분 동안 1.6mM 에틸말로닐-CoA, 3mM ATP, 3mM NADPH, 및 2mM MgCl2 와 함께 다음, 글루타메이트, 4-히드록시-글루타메이트, 또는 4-메틸-글루타메이트의 하나의 5mM로 배양하였다. 기질 없는 반응이 대조군으로서 포함되었다. 에탄올-냉각 반응은 하기 방법을 이용하여 LCMSMS로 분석되었다:
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칼럼 Phenomenex Synergi Polar RP, 250 x 4.6 mm, 4 mm
유동상 A : 수중 10mM 암모늄 아세테이트, pH 6.6
B : 아세토니트릴
유속 75/25 A/B, 등용매, 0.75㎖/분
주입 부피 반응 혼합물의 0.02㎖
검출 MS/MS, 네거티브 모드
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순수한 카르복시메틸 프롤린 및 많은 치환된 카르복시메틸프롤린이, 카르복실기(-44)의 손실을 통해, 네거티브 모드에서 LCMSMS에 의해 확인되었다. 데이터는 도 10에 도시되었다.
기질 MS/MS 트랜지션(네거티브 모드)
글루타메이트 + 말로닐 CoA 172/128
2S,4S 4-메틸 글루타메이트 + 말로닐 CoA 186/142
2S,4R 4-메틸 글루타메이트 + 말로닐 CoA 186/142
4-히드록시 글루타메이트 + 말로닐 CoA 188/144
4-히드록시 글루타메이트 + 에틸 말로닐 CoA 216/172
글루타메이트 + 에틸 말로닐 CoA 200/156
2S,4R 4-메틸 글루타메이트 + 에틸 말로닐 CoA 214/170
2S,3S-3-OH 글루타메이트(트랜스) + 말로닐 CoA 188/144
실시예 2. ProB, ProA, CarB, 및 CarA 활동을 포함하는 용해물 내 치환된 글루타메이트 및 말로닐-CoA로 부터 치환된 카바페남(carbapenam) 제조
실시예 1에 기재된 반응은 4x 농축되고, 60분 동안 37℃에서 10mM 트리스 pH 9 내에서 5μΜ CarA 단백질, 6mM ATP, 2mM의 MgCl2 와 배합되었다. 기질없는 반응이 대조군으로서 포함되었다. 에탄올-냉각 반응이 하기 방법을 이용하여 LCMSMS로 분석되었다:
-----------------------------------------------------------------
칼럼 Phenomenex Synergi Polar RP, 250 x 4.6 mm, 4 mm
유동상 수중 0.1%(v/v) 포름산
아세토니트릴 내 0.1%(v/v) 포름산
유속 75/25 A/B, 등용매, 0.75㎖/분
주입 부피 반응 혼합물의 0.02㎖
검출 MS/MS, 네거티브 모드
-----------------------------------------------------------------
카바페남이, 5원 고리의 탈카르복실화(-44)와 함께 또는 없이 케톤(-42)의 손실을 나타내는 생성물 이온과 함께 154/112(순수 카바페남) 168/82(4-메틸 카바페남), 및 170/84(4-히드록시 카바페남)의 MS/MS 트랜지션에 의해 확인되었다. 데이터는 도 11에 도시되었다.
실시예 3. ProB, ProA, CarB, CarA, 및 CarC 활동을 포함하는 용해물 내 치환된 글루타메이트 및 말로닐-CoA로 부터 치환된 카바페넴의 제조
15mM의 4-메틸-글루타메이트 및 8mM의 말로닐 CoA를 50mM 트리스 pH 8.5 내의 2.5mM NADPH, 10mM ATP 및 6.7mM MgCl2의 존재에서 ProB, ProA, CarB 및 CarA를 발현하는 균주로부터의 무세포 추출물에 첨가시켰다. 반응이 37℃에서 2시간 동안 진행되어 LCMSMS (168/125.9)에 의해 검출된 메틸화 카바페남을 제조하였다. 카바페남 제조 반응은 8mM 알파-케토글루타레이트, 1mM 아스코르베이트, 1mM 황산 암모늄 제 1 철 및 1.6 ㎎/㎖ CarC로 두배 희석되었다. 37℃에서 1시간 후 반응이 에탄올 동일 부피로 냉각되고 스피드 백(vac) 원심분리에 의해 원래의 부피까지 농축시켰다. 남은 메틸화 카바페남의 레벨 및 메틸화 카바페넴의 외관이 LCMSMS에 의해 결정되었다. 메틸화 카바페넴이 166/122(탈카르복실화) 및 184/140(가수분해 및 이어서 탈카르복실화)에서 검출되었다. 데이터는 도 12에 도시되었다.
실시예 4. PutA (E.coli 프롤린 옥시다제) 및 CarB를 함유하는 용해물 내 3-히드록시프롤린 및 말로닐-CoA로부터 치환된 카르복시메틸-프롤린의 제조
CarB의 IPTG-유도성 발현을 가능하게 하는 플라스미드를 운반하는 BL21 (DE3) 균주가 1L LB 에서 0.5<OD<1 로 성장되었고 37℃에서 1시간 동안 유도되었다(0.8mM IPTG). 빈 벡터를 운반하는 BL21(DE3) 균주가 최대 OD ~ 0.4에 도달할 때까지 5L M9 + 10g/L 프롤린 내에서 성장하였다. 세포를 수확하고, 100mL 재현탁 배지(lOOmM 트리스-HCl, pH 8)에서 세척하고 세포 펠렛은 용해물이 발생하기 전에 -80℃에 보관하였다. 펠렛을 lOOmM 트리스-HCl, pH 8에서 재현탁하고 균질화기(15k psi에서 2패스)를 사용하여 용해하였다. 4℃에서 20분 동안 21,000xg 에서 원심분리함으로써 세포 분해물을 제거하였다. 프롤린 내에서 성장한 세포로부터 얻어진 용해물의 다양한 양(PutA 활동의 다양한 레벨을 나타냄)이 세포 과잉발현 CarB로 부터 얻어진 용해물과 결합되었다. 반응은 또한 8 mM MgCl2, 7.5 mM FAD, 4 mM 말로닐-CoA 및 50 mM 시스- 또는 트랜스-3-히드록시-프롤린을 포함하였다. 에탄올-냉각 반응은 실시예 1에 기재된 LCMSMS에 의해 분석되었다. 데이터는 도 14에 도시되었다.
기타 구현예
청구범위에서 "하나(a)", "하나(an)", 및 "그"와 같은 항목은 반대로 지시하지 않는 한 또는 달리 문맥에서 명백히 하지 않는 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다. 한 그룹의 1 이상의 성분 간에 "또는"을 포함하는 청구항 또는 설명은, 반대로 지시하지 않는 한 또는 달리 문맥에서 명백히 하지 않는 한, 만일 하나, 하나 이상, 또는 그룹 성분 모두가 주어진 생성물 또는 과정 내에 존재, 사용, 또는 다른 관련이 있다면, 만족되는 것으로 여겨진다. 본 발명은 그룹의 정확히 하나의 성분이 주어진 생성물 또는 과정 내에 존재, 사용, 또는 다른 관련이 있는 구현예를 포함한다. 본 발명은 그룹 성분의 하나 이상, 또는 모두가 주어진 생성물 또는 과정 내에 존재, 사용, 또는 다른 관련이 있는 구현예를 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 기재된 청구범위의 하나 이상에서 하나 이상의 제한, 성분, 절, 및 설명 용어가 다른 청구항에 도입되는 모든 변형, 조합 및 치환을 포함한다. 예를 들어, 다른 청구항에 종속된 임의의 청구항은 동일한 기본 청구항에 의존하는 임의의 다른 청구항에서 발견되는 하나 이상의 제한을 포함하도록 변형될 수 있다. 성분은 리스트된 대로 표시되며, 예를 들어, 마쿠쉬 그룹 형태에서, 성분들의 각 서브그룹이 또한 개시되며, 임의의 성분(들)이 그룹으로부터 제거될 수 있다. 일반적으로 본 발명, 또는 본 발명의 양태가 특정 성분 및/또는 특징을 포함하고, 본 발명의 특정 구현예 또는 본 발명의 양태가 그러한 성분 및/또는 특징으로 이루어진 또는 필수적으로 이루어진 것으로 언급된다는 것이 이해되어야 한다. 단순성의 목적을 위해, 이러한 구현예들은 본원에서 상기 특정하게 설명하지 않았다. 또한, 용어 "포함하는" 및 "함유하는"은 개방적이고 추가의 성분 또는 단계의 포함을 허용하는 것으로 의도된다는 것이 또한 주의된다. 범위가 지정되는 경우, 엔드 포인트가 포함되어 있다. 달리 지시하지 않거나 문맥 및 본 기술분야의 당업자중 하나의 이해에서 달리 명백히 하지 않으면, 범위로 표현되는 값은, 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 범위의 하한의 십분의 일까지, 본 발명의 다른 구현예에서 기재된 범위내에 임의의 특정값 또는 서브-레인지를 추정할 수 있다.
본 출원은 다양한 발행 특허, 공개된 특허 출원서, 저널 기사, 및 기타 간행물을 언급하며, 이들 모두는 본원에 참고로 통합되어 있다. 만일 통합된 참고문헌 및 예시 설명 간에 충돌이 있으면, 설명이 조정될 것이다. 또한, 종래 기술에 속하는 본 발명의 임의의 특정 구현예는 임의의 1 이상의 청구항으로 부터 명시적으로 배제될 수 있다. 이러한 구현예는 본 기술분야에서 당업자중 하나에게 공지된 것으로 간주되기 때문에 배제가 명시적으로 본원에 기재되지 않은 경우에도, 이들은 배제될 수 있다. 본 발명의 임의의 특정 구현예는 종래 기술의 존재와 관련이 있든 없든, 어떤 이유로, 임의의 청구항에서 배제될 수 있다.
본 기술분야에서 당업자는 본원에 기재된 특정 구현예들에 대한 많은 등가물들을 단지 통상적인 실험을 이용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본원에 기재된 본 구현예의 범위는 상기 설명에 한정되는 것이 아니라, 첨부된 청구 범위에 기재된 대로이다. 본 기술분야에서 당업자는 하기 청구범위에서 정의된 바대로, 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 본 명세서에 대한 다양한 변경 및 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.

Claims (32)

  1. 다음과 같은 것으로부터의 하기 식(I-a)의 화합물 또는 그의 염 또는 호변이체 또는 이들의 조합물을 발생할 수 있는 효소의 그룹을 포함하는 세포 용해물;
    Figure pct00127

    (1) 글루코스 및 글리신 또는 그의 염; 및/또는
    (2) 글루코스 및 선택적으로 하기 식(i)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 또는 그의 염; 및/또는
    Figure pct00128

    (3) 글루코스 및 하기 식(iv)의 프롤린 화합물 또는 그의 염:
    Figure pct00129

    여기서, 이중선
    Figure pct00130
    는 단일 또는 이중 결합을 나타내고;
    R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴 및 선택적으로 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되고;
    R5는 수소, -OR8, -SR8, 및 -N(R8)2;로 이루어진 군에서 선택되고;
    R8의 각각의 경우는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, -C(=O)R8a, -C(=O)OR8a, -C(=O)SR8a, -C(=O)N(R8b)2, -C(=NR8b)R8a, -C(=NR8b)OR8a, -C(=NR8b)SR8a, -C(=NR8b)N(R8b)2, -C(=S)R8a, -C(=S)OR8a, -C(=S)SR8a, -C(=S)N(R8b)2, -C(=O)NR8bSO2R8a, -S(=O)R8a, -SO2R8a, -SO2N(R8a)2, -Si(R8a)3, -P(=O)(R8a)2, -P(=O)(OR8a)2, -P(=O)(R8a)(OR8a), -P(=O)(R8a)( N(R8b)2), -P(=O)(N(R8b)2)2, -P(=O)2R8a, -P(=O)2OR8a, -P(=O)2N(R8b)2, -B(R8a)2, -B(OR8a)2, 및 -BR8a(OR8a)로 이루어진 군에서 선택되고, 여기서 R8는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 산소 원자가 있는 경우 산소 보호기, 및 황 원자가 있는 경우 황 보호기로 이루어진 군에서 선택되거나, 2개의 R8a 기들 또는 R8a 및 R8b 기들은 선택적으로 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성하기 위해 합쳐지고; R8b의 각각의 경우는 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 및 질소 보호기로 이루어진 군에서 선택되거나, 2개의 R8b는 선택적으로 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성하기 위해 합쳐지고; 및
    R7a는 수소이다.
  2. 다음과 같은 단계를 포함하는 하기 식(I-a)의 화합물 또는 그의 염 또는 호변이체 또는 이들의 조합물을 발생하는 방법:
    Figure pct00131

    하나 이상의 효소를 포함하는 제1항에 따른 세포 용해물을 제공하는 단계, 여기서 상기 하나 이상의 효소는 감마-글루타밀 키나제, Glu-5-P 디히드로게나제, 글리콜리시스/아세틸-CoA 생합성 다중효소, 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 베타-산화 다중효소, 크로토닐-CoA 리덕타제, 아세틸-CoA 카르복실라제, 말로닐-CoA 리덕타제, 트레오닌 알도라제, 베타-알라닌 트랜스퍼라제, 프롤린 3-히드록시라제, 프롤린 옥시다제, 카르복시메틸-프로(Pro) 신타제(synthase), 카바페남 신테타제(carbapenam synthetase), 베타-락탐 신테타제, 카바페넴 신타제(carbapenem synthase), 트랜스퍼라제, 옥시게나제, 메틸트랜스퍼라제 및 이들의 이소자임으로 이루어진 군에서 선택되고,
    여기서 하나 이상의 세포 용해물은 다음과 같은 것과 접촉되고:
    (1) 글루코스 및 글리신 또는 그의 염; 및/또는
    (2) 글루코스 및 선택적으로 치환된 하기 식(i)의 글루타메이트 또는 그의 염; 및/또는
    Figure pct00132

    (3) 글루코스 및 하기 식(iv)의 프롤린 화합물 또는 그의 염:
    Figure pct00133

    여기서 이중 선
    Figure pct00134
    은 단일 또는 이중 결합을 나타내고;
    R1, R2, R3 및 R4의 각 경우는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴 및 선택적으로 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되고;
    R5는 수소, -OR8, -SR8, 및 -N(R8)2;로 이루어진 군에서 선택되고;
    R8의 각각의 경우는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, -C(=O)R8a, -C(=O)OR8a, -C(=O)SR8a, -C(=O)N(R8b)2, -C(=NR8b)R8a, -C(=NR8b)OR8a, -C(=NR8b)SR8a, -C(=NR8b)N(R8b)2, -C(=S)R8a, -C(=S)OR8a, -C(=S)SR8a, -C(=S)N(R8b)2, -C(=O)NR8bSO2R8a, -S(=O)R8a, -SO2R8a, -SO2N(R8a)2, -Si(R8a)3, -P(=O)(R8a)2, -P(=O)(OR8a)2, -P(=O)(R8a)(OR8a), -P(=O)(R8a)( N(R8b)2), -P(=O)(N(R8b)2)2, -P(=O)2R8a, -P(=O)2OR8a, -P(=O)2N(R8b)2, -B(R8a)2, -B(OR8a)2, 및 -BR8a(OR8a)로 이루어진 군에서 선택되고, 여기서 R8는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 산소 원자가 있는 경우 산소 보호기, 및 황 원자가 있는 경우 황 보호기로 이루어진 군에서 선택되거나, 2개의 R8a 기들 또는 R8a 및 R8b 기들은 선택적으로 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성하기 위해 합쳐지고; R8b의 각각의 경우는 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 및 질소 보호기로 이루어진 군에서 선택되거나, 2개의 R8b는 선택적으로 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성하기 위해 합쳐지고; 및
    R7a는 수소이다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R1는 수소인 세포 용해물 또는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, R3는 수소 또는 -CH3인 세포 용해물 또는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, R2는 수소, -CH3 또는 -CH2CH3인 세포 용해물 또는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, R4는 수소인 세포 용해물 또는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 감마-글루타밀 키나제, Glu-5-P 디히드로게나제, 글리콜리시스/아세틸-CoA 생합성 다중효소, 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 베타-산화 다중효소, 크로토닐-CoA 리덕타제, 아세틸-CoA 카르복실라제, 말로닐-CoA 리덕타제, 트레오닌 알도라제, 베타-알라닌 트랜스퍼라제, 프롤린 3-히드록시라제, 프롤린 옥시다제 및 이들의 이소자임으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소가 세포 용해 전에 세포 세포질에 존재되는 것인 세포 용해물 또는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 카르복시메틸-프로 신타제(synthase), 카바페남 신테타제(synthetase), 베타-락탐 신테타제, 카바페넴 신타제, 트랜스퍼라제, 옥시게나제, 메틸트랜스퍼라제 및 이들의 이소자임으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소가 세포 용해 전에 주변세포질 공간에서 격리되는 것인 세포 용해물 또는 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포 용해물은 효소의 그룹을 과잉발현하기 위해 조작된 E.coli 유기체의 용해물인 세포 용해물 또는 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 식(iv)의 프롤린 화합물 또는 그의 염은 프롤린 옥시다제와의 접촉시, 식(v)의 피롤 화합물 또는 그의 염으로 효소적으로 전환되고:
    Figure pct00135

    Figure pct00136

    여기서 글루코스 또는 그의 염은 선택적으로 치환된 식(iii)의 CoA 화합물 또는 그의 염으로 효소적으로 전환되는 세포 용해물 또는 방법:
    Figure pct00137

    여기서, -SCoA는 코엔자임 A 모노라디칼이다.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 식(iv)의 프롤린 화합물 또는 그의 염은 프롤린-3-히드록시라제와의 접촉시, 식(iv-a)의 3-히드록실화된 프롤린 화합물 또는 그의 염으로 효소적으로 전환되고:
    Figure pct00138

    Figure pct00139

    식(iv-a)의 3-히드록실화된 프롤린 화합물 또는 그의 염은 프롤린 옥시다제와의 접촉시, 식(v-a)의 3-히드록실화된 피롤 화합물로 효소적으로 전환되는 세포 용해물 또는 방법:
    Figure pct00140
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 글루코스 및 글리신 또는 그의 염은 글리콜리시스/아세틸-CoA 생합성 다중효소, 아세틸-CoA 카르복실라제, 말로닐-CoA 리덕타제, 트레오닌 알도라제, 감마-글루타밀 키나제, 및 Glu-5-P 디히드로게나제 및 이것의 이소자임으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소와 접촉시 식(ii)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드 또는 그의 염으로 효소적으로 전환되고;
    Figure pct00141

    여기서, 글루코스 또는 그의 염은 식(iii)의 선택적으로 치환된 CoA 화합물 또는 그의 염으로 효소적으로 전환되는 세포 용해물 또는 방법:
    Figure pct00142

    여기서, -SCoA는 코엔자임 A 모노라디칼이다.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 선택적으로 치환된 식(i)의 글루타메이트 또는 그의 염은 감마-글루타밀 키나제, 및 Glu-5-P 디히드로게나제와 접촉시 식(ii)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드 또는 그의 염으로 효소적으로 전환되고;
    Figure pct00143

    여기서, 글루코스 또는 그의 염은 식(iii)의 선택적으로 치환된 CoA 화합물 또는 그의 염으로 효소적으로 전환되는 세포 용해물 또는 방법:
    Figure pct00144

    여기서, -SCoA는 코엔자임 A 모노라디칼이다.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 식(i)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 또는 그의 염은 감마-글루타밀 키나제-GP 리덕타제 다중효소 복합물과 접촉시 식(iv)의 프롤린 화합물 또는 그의 염으로 효소적으로 전환되는 세포 용해물 또는 방법:
    Figure pct00145

    Figure pct00146
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포는 글루코스 및 글리신의 조합물, 또는 글루코스, 또는 그의 염, 또는 글루코스 및 식(i)의 선택적으로 치환된 글루타메이트의 조합물, 또는 그의 염을 식(iii)의 선택적으로 치환된 CoA 화합물 또는 그의 염, 및 식(ii)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드 또는 그의 염으로 전환하고;
    Figure pct00147

    여기서, -SCoA는 코엔자임 A 모노라디칼임;
    여기서 식(ii)의 선택적으로 치환된 글루타메이트 세미알데히드 또는 그의 염 및 식(iii)의 선택적으로 치환된 CoA 화합물 또는 그의 염은 카르복시메틸-프로 신타제 또는 그의 이소자임과 접촉시 식(II-a)의 피롤리디닐 화합물 또는 그의 염을 발생하는 세포 용해물 또는 방법:
    Figure pct00148
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포는 글루코스 또는 그의 염 및 식(iv)의 프롤린 화합물 또는 그의 염을 식(iii)의 선택적으로 치환된 CoA 화합물 또는 그의 염, 및 식(v)의 피롤 화합물 또는 그의 염으로 전환하고;
    Figure pct00149

    여기서, -SCoA는 코엔자임 A 모노라디칼임;
    여기서 식(iii)의 선택적으로 치환된 CoA 화합물 또는 그의 염 및 식(v)의 피롤 화합물 또는 그의 염은 카르복시메틸-프로 신타제 또는 그의 이소자임과 접촉시 식(II-a)의 피롤리디닐 화합물 또는 그의 염을 발생하는 세포 용해물 또는 방법:
    Figure pct00150
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 식(II-a)의 피롤리디닐 화합물 또는 그의 염은 카바페남 신테타제, 베타-락탐 신테타제 또는 그의 이소자임과 접촉시 식(III-a)의 베타-락탐 화합물 또는 그의 염을 발생시키는 세포 용해물 또는 방법:
    Figure pct00151
  18. 제17항에 있어서, 식(III-a)의 베타-락탐 화합물 또는 그의 염은 카바페넴 신타제 또는 그의 이소자임과 접촉시 식(I-a)의 화합물 또는 그의 염을 발생시키는 세포 용해물 또는 방법:
    Figure pct00152

    여기서,
    Figure pct00153
    는 이중 결합을 나타낸다.
  19. 제18항에 있어서, R5는 수소인 세포 용해물 또는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 식(I-a)의 화합물 또는 그의 염을 트랜스퍼라제 효소와 식 HSR8 화합물과 접촉하여 식(I-c)의 티올-함유 화합물 또는 그의 염을 제공하는 단계를 더 포함하는 세포 용해물 또는 방법:
    Figure pct00154

    여기서,
    Figure pct00155
    는 이중 결합을 나타내고;
    여기서, R8는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴 및 선택적으로 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택된다;
    Figure pct00156
  21. 제20항에 있어서, R8는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로시클릴인 세포 용해물 또는 방법.
  22. 제21항에 있어서, R8은 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 세포 용해물 또는 방법:
    Figure pct00157

    Figure pct00158

    여기서, X-는 카운터이온이다.
  23. 제18항에 있어서, R5는 -OH인 세포 용해물 또는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 식(I-a)의 화합물 또는 그의 염 또는 그의 호변이체 또는 그의 조합물은 식 R8'-X의 화합물과 접촉되어 식(I-e)의 화합물 또는 그의 염을 제공하는 세포 용해물 또는 방법:
    Figure pct00159

    Figure pct00160

    여기서,
    Figure pct00161
    는 이중 결합을 나타내고;
    X는 이탈기이고, R8'는 -C(=O)R8a, -C(=O)OR8a, -C(=O)SR8a, -C(=O)N(R8b)2, -C(=NR8b)R8a, -C(=NR8b)OR8a, -C(=NR8b)SR8a, -C(=NR8b)N(R8b)2, -C(=S)R8a, -C(=S)OR8a, -C(=S)SR8a, -C(=S)N(R8b)2, -C(=O)NR8bSO2R8a, -S(=O)R8a, -SO2R8a, -SO2N(R8a)2, -Si(R8a)3, -P(=O)(R8a)2, -P(=O)(OR8a)2, -P(=O)(R8a)(OR8a), -P(=O)(R8a)( N(R8b)2), -P(=O)(N(R8b)2)2, -P(=O)2R8a, -P(=O)2OR8a, -P(=O)2N(R8b)2, -B(R8a)2, -B(OR8a)2, 및 -BR8a(OR8a)로 이루어진 군에서 선택되고, 여기서 R8는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 산소 원자가 있는 경우 산소 보호기, 및 황 원자가 있는 경우 황 보호기로 이루어진 군에서 선택되거나, 2개의 R8a 기들 또는 R8a 및 R8b 기들은 선택적으로 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성하기 위해 합쳐지고; R8b의 각각의 경우는 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 및 질소 보호기로 이루어진 군에서 선택되거나, 2개의 R8b는 선택적으로 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성하기 위해 합쳐진다:
  25. 제24항에 있어서, 상기 식(I-e)의 화합물은 식 HS-R8의 화합물과 접촉하여 식(I-c)의 티올-함유 화합물 또는 그의 염을 제공하는 것인 세포 용해물 또는 방법:
    여기서, R8은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알케닐, 선택적으로 치환된 헤테로알키닐, 선택적으로 치환된 카르보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴 및 선택적으로 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택된다:
    Figure pct00162
  26. 제15항 내지 제25항중 어느 하나의 항에 있어서, R2는 -CH2CH3인 세포 용해물 또는 방법.
  27. 제26항에 있어서, R2가 -CH(OH)CH3인 히드록실화된 화합물을 제공하기 위해 상기 화합물을 옥시게나제 효소와 접촉하는 단계를 더 포함하는 세포 용해물 또는 방법.
  28. 제15항 내지 제25항중 어느 하나의 항에 있어서, R1 및 R2는 모두 수소인 세포 용해물 또는 방법.
  29. 제28항에 있어서, R1이 수소이고, R2가 -CH3 또는 -CH2CH3인 화합물을 제공하기 위해 상기 화합물이 메틸트랜스퍼라제와 접촉되는 단계를 더 포함하는 세포 용해물 또는 방법.
  30. 제29항에 있어서, R2가 -CH(OH)CH3인 히드록실화된 화합물을 제공하기 위해 R2가 -CH2CH3인 화합물을 옥시게나제 효소와 접촉하는 단계를 더 포함하는 세포 용해물 또는 방법.
  31. 제2항 내지 제30항중 어느 하나의 항에 따른 방법에 의해 제조된 화합물 또는 그의 염 및 제약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 제약학적 조성물.
  32. 제2항 내지 제30항중 어느 하나의 항에 따른 방법에 의해 제조된 화합물 또는 그의 염, 또는 제31항에 따른 제약학적 조성물의 치료적 유효량을 이것을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 박테리아 감염 치료방법.
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