KR20140042824A - 인공 근위세뇨관 시스템 및 사용 방법 - Google Patents

인공 근위세뇨관 시스템 및 사용 방법 Download PDF

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KR20140042824A
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크리스챤 카자네키
데이비드 씨. 콜터
요한나 샨츠
안케 홉펜자크
얀 한스만
하이케 발레스
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디퍼이 신테스 프로덕츠, 엘엘씨
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Abstract

본 출원은 탈세포화된 생물학적 매트릭스를 제조하고, 생물학적 매트릭스에 포유류 신장-유래된 세포 및 선택적으로 포유류 내피 세포를 접종함으로써 제작된, 생체 인공 근위세뇨관 기구를 개시한다. 그 후, 본 기구는 생물 반응기 배양을 이용하여 성숙되거나 또는 정적 배양되어 신장 세포가 기능성 근위세뇨관 세포로 분화되게 할 수 있다. 본 기구는 근위세뇨관 기능을 수행할 수 있다. 또한 본 출원은 생체 인공 근위세뇨관 기구의 다양한 제조 방법을 개시한다. 또한 본 출원은 예를 들어 세뇨관 세포 수송, 다양한 화합물의 독성 효과 또는 약학 화합물 스크리닝의 시험관 내 연구에 있어서의 생체 인공 근위세뇨관 기구의 사용 방법을 추가로 개시한다.

Description

인공 근위세뇨관 시스템 및 사용 방법{BIOARTIFICIAL PROXIMAL TUBULE SYSTEMS AND METHODS OF USE}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2011년 5월 27일자로 출원된 미국 가출원 제61/490,890호의 이득을 주장하며, 상기 미국 가출원의 내용은 전체적으로 참고로 포함된다.
일반적으로 본 발명은 생물학적 스캐폴드(scaffold) 및 (예를 들어, 포유류 신장-유래된 세포와 같은) 하나 이상의 선구 세포를 포함하는 생체 인공 근위세뇨관 기구에 관한 것인데, 상기 선구 세포는 스캐폴드 상에서 신장 근위세뇨관 세포 단층으로 분화된다. 추가로, 본 발명은 본 기구의 제조 방법 및 생물 반응기에서의 본 기구의 배양 방법에 관한 것이다. 시험관 내에서의 신독성 또는 약학 화합물 스크리닝에 있어서의 본 기구의 사용 방법이 또한 제공된다.
만성 신장 질환(chronic kidney disease; CKD) 및 말기 신부전증(end-stage renal disease; ESRD)은 신장 기능, 주로 사구체 여과 속도의 감소로 정의된다. 이는 신체에 의해 생성되는 독성 대사 노폐물의 배출에 대한 신장의 무능력으로 이어진다. 미국에서, CKD는 점점 더 일반적으로 되고 있으며, 허약한 건강 결과 및 높은 의료비와 관련된다. 미국 국립 신장 재단(The National Kidney Foundation)은 2000만명의 미국인이 CKD를 앓고 있으며, 2000만명 이상의 추가의 사람들이 CKD 발병 위험이 있다고 추정하고 있다. ESRD는 500,000명 초과의 환자에서 발병하며, 이때 CKD를 앓고 있는 위험 집단은 150만명의 환자에 달한다. CKD 및 ESRD의 총 비용은 총 노인 의료 보험료의 거의 30%를 차지하지만, 이들 환자는 전체 노인 의료 보험 인구의 단지 8.1%를 구성한다 (문헌[2008 US Renal Data Service, 2008 Annual Report]). ESRD의 발생률은 지난 10년간 50% 초과로 증가하였으며, CKD를 앓고 있거나 또는 CKD에 대하여 위험한 환자의 수는 꾸준히 증가하고 있다. 따라서, 관심 대상의 화합물의 신독성을 결정할 수 있는 시험관 내 시스템뿐만 아니라, 손상된 신장의 복구를 가능하게 하기 위한 새로운 치료적 옵션에 대한 큰 필요성이 있다.
많은 생체 이물질, 또는 이의 분해로부터 유래되는 분자는 신장의 신장 근위세뇨관 세포에 의해 방광으로 예정된 여과액 내로의 능동 수송에 의해 혈액으로부터 제거된다. 이 중요한 기능을 수행한 결과로서, 신장 근위세뇨관 세포는 흔히 이들 화합물의 독성 효과에 의해 손상된다. 따라서, 동물 시험을 잠재적으로 대체할 수 있는 시험관 내 시스템에서의 잠재적인 치료 화합물의 신독성 시험은 상당한 관심을 얻었다.
신장 근위세뇨관 상피 단층 형성 및 기능을 시험하기 위한 현재의 세포 배양물 기반의 모델은 일차 세포를 이용하거나 또는 예를 들어 MDCK(매딘-다비 개 신장(Madin-Darby Canine Kidney)) 세포, LLC-PK1(루이스 폐암 돼지 신장 1(Lewis lung cancer porcine kidney 1)) 세포, 또는 인간 유두종 바이러스 16 E6/E7 유전자를 이용한 형질도입에 의해 불사화된 인간 신장 세포주인 HK-2 세포와 같은 다양한 공급원으로부터의 확립된 세포주를 사용하여 주로 개발되었다. 이들 세포를 이용한 분석 시스템은 전형적으로 (예를 들어, 트랜스웰(Transwell)(등록상표) 필터와 같은) 다공성 필터를 이용하며, 이는 세포의 첨부(apical side) 및 기저외측부(basolateral side) 상에서의 유체 노출을 허용하여 상피 분화를 촉진한다.
그러나, 이들 세포주의 사용은 몇몇 불리한 점을 갖는다. 이들 세포주들 중 다수는 형질전환되거나 또는 종양으로부터 유래되어, 잠재적으로는 그의 성장, 분화, 및 궁극적으로 기능적 특성이 변경된다. 더욱이, 이들 세포주들 중 다수는 인간-유래되지 않는다. 따라서, 다양한 화합물에 대한 이들 세포의 응답에 있어서 그리고 기능에 있어서 종 특이적 차이가 있을 수 있다. 일차 세포의 사용은 번잡한 것이며, 그 이유는 상기 세포가 전형적으로 신선하게 단리되고 최소로 확장된 후 실험에 사용되기 때문이다. 단리 공정은 원하지 않는 세포 집단의 오염으로 힘든 것일 수 있다. 게다가, 공여체 공급원 재료의 상당한 가변성이 있을 수 있다.
다른 일반적인 쟁점은 일차 세포가 온전한 단층을 형성하는 지속 기간이 제한적이라는 것이며; 이는 시험관 내 연구에 있어서 세포 유용성을 제한한다. 일차 세포는 빈번하게는 과다성장하며, 표면을 벗어나서 3차원 응집체를 형성하며, 이는 접촉 저해를 유지하기 위하여 MEK 저해제와 같은 추가의 인자의 첨가를 필요로 한다 (예를 들어, 미국 특허 공개 제2009/0209019호에 개시된 바와 같음). (예를 들어, 트랜스웰(등록상표) 필터와 같은) 다공성 필터는, 다소 효과적으로, 합성 재료로 만들어지며, 따라서 전형적으로 신장 세뇨관 세포가 생체 내에서 노출되는 당해 하부 매트릭스를 정확하게 대표하는 것은 아니다.
다른 것은 예를 들어 매트리겔(Matrigel)™과 같은 3D 겔 내에서, 고체 표면 (국제특허 공개 WO 2010/064995 A1호 참조) 상에서 일차 세포의 전술한 과다성장을 이용한 3차원 세뇨관 구조의 형성, 또는 동물 유래의 단리된 신장 세뇨관의 배양에 의존하는 대안적인 스크리닝 방법을 기재하였다. 후자는 힘든 단리 기술 및 고려될 필요가 있는 종간 차이로 인하여 문제시된다. 이들 대안의 다른 불리한 점은 배양 배지에 적용된 생체 이물질 화합물의, 신장 세뇨관 관강 내로의 수송만을 평가하는 그의 능력이다. 예를 들어 글루코스 재흡수 또는 알부민 흡수와 같은, 세뇨관의 정상 기능에 대한 이러한 화합물의 영향은 평가될 수 없으며, 그 이유는 표지된 시험 물질을 상기 관강 내로 도입하거나 또는 세뇨관의 관강액의 샘플을 분석용으로 취하는 신뢰성 있는 방법이 없기 때문이다. 게다가, 다양한 생체 내 시나리오 하에서 일어날 수 있는 유동 및 생리학적 동적 조건의 변화의 영향이 평가될 수 없다.
따라서, 신장 근위세뇨관 상피의 정상적인 생리학적 특성을 더 잘 반영하는 생물학적 검정법(bioassay)을 개발하는 것이 당해 분야에서 필요하다. 이는 궁극적으로는 신장 질환의 새로운, 그리고 더욱 효과적인 치료법의 개발을 가능하게 할 것이다.
본 출원은 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드를 갖는 생체 인공 근위세뇨관 기구를 포함하며, 상기 스캐폴드 상에서 (예를 들어, 포유류 (예를 들어, 인간) 신장-유래된 세포와 같은) 전구 세포로부터 신장 근위세뇨관 세포의 단층이 형성된다.
본 발명은 탈세포화된 생물학적 매트릭스를 제조하고, 생물학적 매트릭스에 포유류 신장-유래된 세포 및 선택적으로 포유류 내피 세포를 접종함으로써 제작된, 생체 인공 근위세뇨관 기구를 개시한다. 그 후, 본 기구는 생물 반응기 배양을 이용하여 성숙되거나 또는 정적 배양되어 신장 세포가 기능성 근위세뇨관 세포로 분화되게 할 수 있다. 생성된 기구는 근위세뇨관 기능, 예를 들어 생물학적 막의 어느 한 쪽으로부터 다른 한 쪽으로의 분자의 수송을 수행할 수 있다. 또한 본 발명은 생체 인공 근위세뇨관 기구의 다양한 제조 및 성숙 방법을 개시한다. 또한 본 발명은 세뇨관 세포 수송, 다양한 화합물의 독성 효과 또는 약학 화합물 스크리닝의 시험관 내 연구에 있어서의 생체 인공 근위세뇨관 기구의 사용 방법을 개시한다.
일 실시 형태에서, 생체 인공 근위세뇨관 기구는 신장 세포로 분화가능한 하나 이상의 세포 (예를 들어, 신장 세포로 분화될 수 있는 전구 세포)가 신장 근위세뇨관 세포로 분화되게 하고, 이에 의해, 분화된 세포는 스캐폴드 상에서 상피 단층을 형성하기에 충분한 조건 하에서, 신장 세포로 분화가능한 하나 이상의 세포 (예를 들어, 신장 세포로 분화될 수 있는 전구 세포)가 접종된 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드를 포함한다. 생체 인공 근위세뇨관 기구는 선택적으로 혈관 내피 세포를 추가로 포함할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 생체 인공 근위세뇨관 기구는 적어도 2개의 표면을 갖는 탈세포화된 생물학적 스캐폴드를 포함하며, 여기서, 적어도 하나의 표면은 신장 세포로 분화가능한 하나 이상의 세포 (예를 들어, 신장 세포로 분화될 수 있는 전구 세포)가 신장 근위세뇨관 상피 세포로 분화되게 하고, 이에 의해 상기 세포가 스캐폴드의 표면 상에 세포 단층을 형성하기에 충분한 조건 하에서, 신장 세포로 분화가능한 하나 이상의 세포 (예를 들어, 신장 세포로 분화될 수 있는 전구 세포)가 접종된다.
다른 실시 형태에서, 생체 인공 근위세뇨관 기구는 하나 이상의 표면을 갖는, 포유류 조직으로부터 유래된 탈세포화된 생물학적 스캐폴드 및 스캐폴드의 표면 상의 신장 근위세뇨관 상피 단층을 포함하며, 여기서, 상피 단층은 하나 이상의 포유류 신장-유래된 세포가 신장 근위세뇨관 세포로 분화되게 하고 단층이 형성되게 하기에 충분한 조건 하에서 하나 이상의 포유류 신장-유래된 세포를 상기 표면에 접종함으로써 형성된다. 상기 표면의 접종은 생물 반응기에서 수행될 수 있다. 이러한 생물 반응기는 상부 몸체 요소, 세포 성장을 위한 영역을 갖는 하부 몸체 요소, 및 하나 이상의 연결 장치를 가질 수 있다.
신장 세포로 분화가능한 상기 하나 이상의 세포 (예를 들어, 전구 세포)는 일차 신장 세뇨관 상피 세포들, 신장 세포들 또는 신장 선구 세포들로 분화되는 유도 전능성 줄기 세포들 또는 선구 세포들, 신장으로부터 단리된 줄기 세포들 또는 신장으로부터 단리된 선구 세포들 및 이들의 혼합물들일 수 있다. 일 실시 형태에서, 신장 세포로 분화가능한 상기 하나 이상의 세포는 예를 들어 인간과 같은 포유류 유래의 신장-유래된 세포이다. 이들 신장-유래된 세포는 신장 피질, 신장 수질, 신장 피막하 영역 및 이들의 혼합물로부터 수득될 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 생체 인공 근위세뇨관 기구는 적어도 2개의 표면을 갖는 탈세포화된 생물학적 스캐폴드를 포함하며, 여기서, 적어도 하나의 표면은 하나 이상의 포유류 신장-유래된 세포가 신장 근위세뇨관 세포로 분화되게 하기에 충분한 조건 하에 하나 이상의 포유류 신장-유래된 세포가 접종되고, 상기 세포는 스캐폴드의 표면 상에 상피 단층을 형성한다. 포유류는 인간일 수 있으며, 세포는 신장 피질, 신장 수질 또는 신장 피막하 영역으로부터 수득될 수 있다.
소정의 실시 형태에서, 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 포유류 조직으로부터 유래된다. 스캐폴드는 예를 들어 돼지 조직과 같은 포유류 조직으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드는 포유류의 위, 십이지장, 공장, 회장 또는 결장으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 스캐폴드는 소장 점막하 조직으로부터 유래된다. 다른 실시 형태에서, 탈세포화된 생물학적 매트릭스는 점막 조직 또는 점막하 조직으로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 신장-유래된 세포는 배양 중 자기-재생 및 확장이 가능하고, Oct-4, Pax-2 및 Rex-1 중 하나 이상의 발현에 대하여 양성이며, Sox2, FGF4, hTert 및 Wnt-4 중 하나 이상의 발현에 대하여 음성이다. 다른 실시 형태에서, 신장-유래된 세포는 배양 중 자기-재생 및 확장이 가능하고, Oct-4 및 Pax-2 중 하나 이상의 발현에 대하여 양성이며, Sox2, FGF4, hTert 및 Wnt-4 중 하나 이상의 발현에 대하여 음성이다.
다른 실시 형태에서, 신장-유래된 세포는 배양 중 자기-재생 및 확장이 가능하고, Eya1, Pax-2, WT1, FoxD1, BMP7, BMP2, GDF5, EpoR 또는 Rex-1 중 적어도 하나의 발현에 대하여 양성이며, Sox2, FGF4, hTert 또는 Wnt-4 중 적어도 하나의 발현에 대하여 음성이다. 소정의 실시 형태에서, 신장-유래된 세포는 또한 세포 표면 마커들 HLA I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166, 또는 SSEA-4 중 적어도 하나에 대하여 양성이고, 세포 표면 마커들 HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141, 또는 E-카드헤린 중 적어도 하나에 대하여 음성일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 스캐폴드의 제2 표면에 포유류 혈관 내피 세포를 접종할 수 있다. 예를 들어, 혈관 내피 세포는 내피 세포주, 내피 선구 세포, 일차 내피 세포, 미세혈관 내피 세포 및 이들의 혼합물일 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태는 하나 이상의 전구 세포(즉, 신장 세포로 분화될 수 있는 전구 세포)가 신장 근위세뇨관 상피 세포로 분화되게 하기에 충분한 조건 하에서 하나 이상의 전구 세포(즉, 신장 세포로 분화될 수 있는 전구 세포)가 접종된 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드를 포함하는 생체 인공 근위세뇨관 기구이며, 여기서, 분화된 세포는 스캐폴드 상에 상피 단층을 형성한다. 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 예를 들어 점막 조직 또는 점막하 조직과 같은 포유류 조직 (예를 들어, 돼지 조직)으로부터 유래될 수 있다. 일 실시 형태에서, 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 포유류 소화관으로부터 유래된다. 다른 실시 형태에서, 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 포유류의 위, 십이지장, 공장, 회장 또는 결장으로부터 유래된다 (예를 들어, 수득된다). 상기 하나 이상의 전구 세포는 일차 신장 세뇨관 상피 세포들, 신장 세포들 또는 신장 선구 세포들로 분화되는 유도 전능성 줄기 세포들, 신장 세포들 또는 신장 선구 세포들로 분화되는 선구 세포들, 신장으로부터 단리된 줄기 세포들 또는 신장으로부터 단리된 선구 세포들 및 이들의 혼합물들로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 선구 세포는 인간 신장-유래된 세포이다. 일 실시 형태에서, 인간 신장-유래된 세포들은 배양 중 자기-재생 및 확장이 가능하며, Oct-4, Rex-1, Pax -2, 카드헤린-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox- 17, EpoR, BMP2, BMP7 또는 GDF5 중 적어도 하나의 발현에 대하여 양성이고; Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2, E-카드헤린 또는 GATA-4 중 적어도 하나의 발현에 대하여 음성이다. 선택적으로, 이들 세포는 또한 세포 표면 마커들 HLA-I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166, 또는 SSEA-4 중 적어도 하나에 대하여 양성이며; 세포 표면 마커들 HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, 및 CD141 중 적어도 하나에 대하여 음성이다. 게다가, 세포는 선택적으로 추가로 영양 인자들 FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 또는 VEGF 중 적어도 하나를 분비하며; 영양 인자들 PDGF-bb 또는 IL12p70 중 적어도 하나를 분비하지 않는다.
본 발명의 또 다른 다른 실시 형태는 적어도 2개의 표면을 갖는 탈세포화된 생물학적 스캐폴드를 포함하는 생체 인공 근위세뇨관 기구이며, 여기서, 적어도 하나의 표면은 하나 이상의 전구 세포(즉, 신장 세포로 분화될 수 있는 전구 세포)가 신장 근위세뇨관 상피 세포로 분화되게 하기에 충분한 조건 하에서 하나 이상의 전구 세포(즉, 신장 세포로 분화될 수 있는 전구 세포)로 접종되며, 상기 세포는 스캐폴드의 표면 상에 상피 단층을 형성한다. 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 포유류 조직 (예를 들어, 돼지 조직)으로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 점막 조직 또는 점막하 조직으로부터 유래된다. 대안적으로, 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 포유류 소화관으로부터 유래된다. 다른 실시 형태에서, 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 포유류의 위, 십이지장, 공장, 회장 또는 결장으로부터 유래된다 (예를 들어, 수득된다). 상기 하나 이상의 전구 세포는 일차 신장 세뇨관 상피 세포들, 신장 세포들 또는 신장 선구 세포들로 분화되는 유도 전능성 줄기 세포들, 신장 세포들 또는 신장 선구 세포들로 분화되는 선구 세포들, 신장으로부터 단리된 줄기 세포들 또는 신장으로부터 단리된 선구 세포들 및 이들의 혼합물들로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 선구 세포는 인간 신장-유래된 세포이다. 일 실시 형태에서, 인간 신장-유래된 세포들은 배양 중 자기-재생 및 확장이 가능하며, Oct-4, Rex-1, Pax -2, 카드헤린-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox- 17, EpoR, BMP2, BMP7 또는 GDF5 중 적어도 하나의 발현에 대하여 양성이고; Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2, E-카드헤린 또는 GATA-4 중 적어도 하나의 발현에 대하여 음성이다. 선택적으로, 이들 세포는 또한 세포 표면 마커들 HLA-I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166, 또는 SSEA-4 중 적어도 하나에 대하여 양성이며; 세포 표면 마커들 HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138 및 CD141 중 적어도 하나에 대하여 음성이다. 게다가, 세포는 선택적으로 추가로 영양 인자들 FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 또는 VEGF 중 적어도 하나를 분비하며; 영양 인자들 PDGF-bb 또는 IL12p70 중 적어도 하나를 분비하지 않는다. 다른 실시 형태에서, 스캐폴드의 제2 표면에 포유류 혈관 내피 세포를 접종한다. 이들 혈관 내피 세포는 내피 세포주, 내피 선구 세포, 일차 내피 세포 또는 미세혈관 내피 세포로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시 형태는 근위세뇨관 기구의 사용 방법이다. 따라서, 일 실시 형태는 하나 이상의 전구 세포를 신장 세포들로 분화시키는 방법으로서, 상기 방법은 하나 이상의 전구 세포(즉, 신장 세포로 분화될 수 있는 전구 세포)를 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드에 접종하는 단계 및 상기 전구 세포를 신장 근위세뇨관 상피 세포들로 분화시키기에 충분한 조건들 하에 상기 스캐폴드 상에서 상기 세포들을 배양하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 분화된 세포들은 스캐폴드 상에 상피 단층을 형성한다. 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 2개의 표면을 가질 수 있다. 일 실시 형태에서, 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 포유류 (예를 들어, 돼지) 조직으로부터 유래된다. 따라서, 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 점막 조직 또는 점막하 조직으로부터 유래될 (예를 들어, 수득될) 수 있다. 다른 실시 형태에서, 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 포유류의 위, 십이지장, 공장, 회장 또는 결장으로부터 유래된다. 본 방법은 일차 신장 세뇨관 상피 세포들, 신장 세포들 또는 신장 선구 세포들로 분화되는 유도 전능성 줄기 세포들, 신장 세포들 또는 신장 선구 세포들로 분화되는 선구 세포들, 신장으로부터 단리된 줄기 세포들 또는 신장으로부터 단리된 선구 세포들 및 이들의 혼합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 하나 이상의 전구 세포를 이용할 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 방법에서 이용되는 선구 세포는 인간 신장-유래된 세포이다.
일 실시 형태에서, 본 방법에서 사용되는 인간 신장-유래된 세포는 배양 중 자기-재생 및 확장이 가능하며, Oct-4, Rex-1, Pax-2, 카드헤린-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 또는 GDF5 중 적어도 하나의 발현에 대하여 양성이고; Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2, E-카드헤린 또는 GATA-4 중 적어도 하나의 발현에 대하여 음성이다. 다른 실시 형태에서, 이들 세포는 또한 세포 표면 마커들 HLA-I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166, 또는 SSEA-4 중 적어도 하나에 대하여 양성이며; 세포 표면 마커들 HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138 및 CD141 중 적어도 하나에 대하여 음성이다. 다른 실시 형태에서, 세포는 영양 인자들 FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 또는 VEGF 중 적어도 하나를 분비하며; 영양 인자들 PDGF-bb 또는 IL12p70 중 적어도 하나를 분비하지 않는다.
본 발명의 다른 실시 형태는, 분화를 허용하기에 충분한 조건 하에 신장 세포로 분화가능한 하나 이상의 세포를 신장 근위세뇨관 상피 세포로 분화시키는 방법이며, 이에 의해, 분화된 세포는 상피 단층을 형성하고, 이에 의해 장력이 세포에 적용된다. 본 방법은 세포를 분화시키기 전에 세포를 탈세포화된 스캐폴드 상에 접종하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 방법이 이 단계를 포함할 때, 본 방법을 사용하여 본 발명의 생체 인공 기구를 생성할 수 있다. 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 (예를 들어 돼지 조직과 같은) 포유류 조직, 예를 들어 점막 조직 또는 점막하 조직으로부터 유래될 수 있다. 일 실시 형태에서, 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 포유류 소화관으로부터 유래된다. 다른 실시 형태에서, 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 포유류의 위, 십이지장, 공장, 회장 또는 결장으로부터 유래된다. 신장 세포로 분화가능한 상기 하나 이상의 세포는 일차 신장 세뇨관 상피 세포들, 신장 세포들 또는 신장 선구 세포들로 분화되는 유도 전능성 줄기 세포들 또는 선구 세포들, 신장으로부터 단리된 줄기 세포들 또는 신장으로부터 단리된 선구 세포들 및 이들의 혼합물들로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 신장 세포로 분화가능한 상기 하나 이상의 세포는 (예를 들어 인간 신장-유래된 세포와 같은) 포유류 신장-유래된 세포이다. 포유류 신장-유래된 세포는 신장 피질, 신장 수질, 신장 피막하 영역 및 이들의 혼합물로부터 수득될 수 있다. 일 실시 형태에서, 신장-유래된 세포는 배양 중 자기-재생 및 확장이 가능하고, Oct-4, Pax-2 및 Rex-1 중 하나 이상의 발현에 대하여 양성이며, Sox2, FGF4, hTert 및 Wnt-4 중 하나 이상의 발현에 대하여 음성이다. 다른 실시 형태에서, 신장-유래된 세포는 배양 중 자기-재생 및 확장이 가능하고, Eya1, Pax2, WT1, FoxD1, BMP7, BMP2, GDF5, EpoR 또는 Rex-1 중 적어도 하나의 발현에 대하여 양성이며, Sox2, FGF4, hTert 또는 Wnt-4 중 적어도 하나의 발현에 대하여 음성이다. 또 다른 실시 형태에서, 신장-유래된 세포는 또한 세포 표면 마커들 HLA I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD166, 또는 SSEA-4 중 적어도 하나에 대하여 양성이고, 세포 표면 마커들 HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141, 또는 E-카드헤린 중 적어도 하나에 대하여 음성이다.
전술한 요약 뿐만 아니라 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용도 첨부 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시할 목적으로, 도면은 본 발명의 실시 형태를 보여준다. 그러나, 본 발명은 예시된 정확한 배열, 실시예 및 수단에 한정되지 않음을 이해하여야 한다.
<도 1 내지 도 6>
도 1 내지 도 6은 인간 신장-유래된 세포에 대한 대사 파라미터의 분석 결과를 나타낸다. 도 1a는 인간 신장-유래된 세포 배양물("SW 배양물")에서의 락테이트 방출량을 시간의 함수로 나타낸다. 도 1b는 SW 배양물에서의 글루코스 소비량을 시간의 함수로 나타낸다. 도 2a는 SW 배양물에서의 LDH 방출량을 시간의 함수로 나타낸다. 도 2b는 탈세포화된 소장 점막하 조직(SIS) 상에 접종된 인간 신장-유래된 세포의 세포 배양물("SIS-SW 배양물")에서의 락테이트 방출량을 시간의 함수로 나타낸다. 도 3a는 SIS-SW 배양물에서의 글루코스 소비량을 시간의 함수로 나타낸다. 도 3b는 SIS-SW 배양물에서의 LDH 방출량을 시간의 함수로 나타낸다. 도 4a는 탈세포화된 소장 점막하 조직(SIS) 상에 접종된 인간 신장-유래된 세포로부터 성장시킨 단층 ("SIS-ML 배양물")에서의 락테이트 방출량을 시간의 함수로 나타낸다. 도 4b는 SIS-ML 배양물에서의 글루코스 소비량을 시간의 함수로 나타낸다. 도 5a는 SIS-ML 배양물에서의 LDL 방출량을 시간의 함수로 나타낸다. 도 5b는 ML 배양물에서의 락테이트 방출량을 시간의 함수로 나타낸다. 도 6a는 ML 배양물에서의 글루코스 소비량을 시간의 함수로 나타낸다. 도 6b는 ML 배양물에서의 LDH 방출량을 시간의 함수로 나타낸다. 도 1 내지 도 6에서, n = 3이다.
<도 7 및 도 8>
도 7 및 도 8은 세포외(즉, 탈세포화된) 매트릭스 스캐폴드 상의 인간 신장-유래된 세포(hKDC)의 조직학적 염색을 나타낸다. 인간 신장-유래된 세포를 3가지의 상이한 스캐폴드 구성 상에 2.5 × 103개의 세포/스캐폴드의 농도로 접종하고, 3주 동안 배양하였다. 그 후, 샘플들을 고정하고, 슬라이스들을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 도 7a는 콜라겐 샌드위치(sandwich) 배양물의 조직학적 염색을 나타낸다. 도 7b는 콜라겐-탈세포화된 소장 점막하 조직(SIS) 샌드위치 배양의 조직학적 염색을 나타낸다. 도 8a는 탈세포화된 SIS 단층 배양물의 조직학적 염색을 나타낸다. 도 8b는 콜라겐-코팅된 트랜스웰 배양물의 조직학적 염색을 나타낸다.
<도 9>
도 9는 세포외(탈세포화된) 매트릭스 스캐폴드 상에 접종된 hKDC에 의한 아쿠아포린-1(Aquaporin-1)의 면역조직화학적 검출을 나타낸다. 인간-유래된 신장 세포를 탈세포화된 SIS 스캐폴드 상에 접종하고, 하룻밤 부착시켰다. 샘플들을 3주 동안 배양하고, 그 후 고정하였다. 후속적으로, 3 ㎛ 두께의 슬라이스를 항-인간 아쿠아포린-1 항체 (영국 캠브리지 소재의 아브캄(Abcam))를 이용한 면역조직화학(IHC)에 사용하였다. 화살표는 세포의 첨부 염색 영역을 나타낸다.
<도 10>
도 10은 탈세포화된 스캐폴드 상에 접종된 hKDC의 조직학적 염색을 나타낸다. 인간 신장-유래된 세포를 2가지의 상이한 세포 농도로 탈세포화된 SIS 스캐폴드 상에 접종하고, 3주 동안 배양하고, 그 후 고정하였다. 후속적으로, 3 ㎛ 두께의 슬라이스들을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 도 10a는 1 × 104개의 세포를 접종한 샘플의 H&E 염색을 나타낸다. 도 10b는 5 × 104개의 세포를 접종한 샘플의 H&E 염색을 나타낸다.
<도 11>
도 11은 탈세포화된 스캐폴드 상에 접종된 hKDC의 3주 배양물의 렉틴 염색을 나타낸다. 인간 신장-유래된 세포를 탈세포화된 SIS 스캐폴드 상에 접종하고, 3주 동안 배양하고, 그 후 고정하였다. 후속적으로, 3 ㎛ 두께의 슬라이스들을 로투스 테트라고노불루스(Lotus tetragonobulus) 렉틴 (도 11a) 및 돌리코스 비플로루스(Dolichos biflorus) 애글루티닌 (도 11b)으로 염색하였다. 도 11a에서 화살표 및 선은 양성 염색 영역을 나타낸다.
<도 12>
도 12는 탈세포화된 스캐폴드 상에 접종된 hKDC의 제IV형 콜라겐 염색을 나타낸다. 인간 신장-유래된 세포를 탈세포화된 SIS 스캐폴드 상에 접종하고, 3주 동안 배양하고, 그 후 고정하였다. 후속적으로, 3 ㎛ 두께의 슬라이스들을 항-제IV형 콜라겐 항체로 염색하였다.
<도 13>
도 13은 탈세포화된 스캐폴드 상에 접종된 hKDC의 Pgp-1 염색을 나타낸다. 인간 신장-유래된 세포를 탈세포화된 SIS 스캐폴드 상에 접종하고, 3주 동안 배양하고, 그 후 고정하였다. 후속적으로, 3 ㎛ 두께의 슬라이스들을 항-인간 P-당단백질-1 항체로 염색하였다.
<도 14>
도 14는 탈세포화된 스캐폴드 상에 접종된 hKDC에 의한, 형광 표지된 소 혈청 알부민(BSA-FITC)의 흡수를 나타낸다. 인간 신장-유래된 세포를 탈세포화된 SIS 스캐폴드 상에 접종하고, 2주 동안 배양하고, 그 후 BSA-FITC의 존재 하에 1시간 동안 배양하였다. 후속적으로, 상기 세포를 DAPI(다이아미디노-2-페닐인돌)로 대조염색하고, 영상화하였다.
<도 15>
도 15는 주 반응기 구성요소들을 나타내는 세포 배양용 생물 반응기의 개략도이다.
<도 16>
도 16은 생물 반응기의 하부 몸체 요소의 상세도를 나타낸다.
본 발명의 기구, 기구의 사용 방법 및 다른 태양에 관련된 다양한 용어가 본 명세서 및 특허청구범위 전체에 걸쳐 사용된다. 이러한 용어는 달리 지시되지 않으면 본 기술 분야에서의 그의 일상적인 의미로 주어져야 한다. 다른 구체적으로 정의된 용어는 본 명세서에 제공된 정의와 일치하는 사안으로 해석되어야 한다.
본 발명은 (예를 들어, 신장-유래된 세포와 같은) 신장 세포로 분화될 수 있는 전구 세포 (신장 세포로 분화가능한 세포)가, 분화를 허용하는 조건 하에서 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드 상에 접종될 때, 상기 스캐폴드의 표면 상에 신장 근위세뇨관 상피 단층을 형성한다는 발견에 기초한다.
본 발명은 특정 방법, 시약, 화합물, 조성물 또는 생물학적 시스템에 한정되지 않으며, 이는 물론 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시 형태들을 설명하기 위한 것이며, 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 그 내용이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수형 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"의 언급은 둘 이상의 세포의 조합 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 측정가능한 값, 예를 들어 양, 시간적 지속 등을 말할 때 용어 "약"은 특정된 값으로부터 ± 20% 또는 ± 10%, 더 바람직하게는 ± 5%, 더욱 더 바람직하게는 ± 1%, 그리고 더욱 더 바람직하게는 ± 0.1%의 변화를 포함함을 의미하며, 이와 같이 변화는 개시된 발명을 수행하기에 적절하다.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명을 개시하고 청구함에 있어서, 하기 용어가 사용될 것이다.
"분화"는 특화되지 않은("미결정된") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어 신장 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. "분화된 또는 분화 유도된 세포"는 세포 계통 내에서 더욱 특화된 (결정된(committed)) 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 통상적인 환경 하에서 특정 세포형 또는 세포형의 서브세트로 계속 분화할 것이며, 통상적인 환경 하에서 다른 세포형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. "탈분화(de-differentiation)"는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특화된 (또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포 "계통"은 세포의 유전, 즉, 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포를 발생시킬 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. "계통 특이적 마커"는 관심 대상의 계통의 세포 표현형과 특이적으로 관련되며, 미결정된 세포가 관심 대상의 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.
넓은 의미에서, "선구 세포"는 그 자신보다 더 분화됨에도 불구하고 선구체의 풀(pool)을 보충하는 능력을 유지하는 자손을 생성하는 능력을 갖는 세포이다. 이 정의에 의하면, 줄기 세포 그 자신은 또한, 최종적으로 분화된 세포에 대하여 더 가까운 전구체가 그러하듯이, 선구 세포이다. 본 명세서에 개시된 세포를 말할 때, "선구 세포"의 이러한 넓은 정의가 사용될 수 있다. 분화된 세포는 다능성 세포로부터 유래될 수 있으며, 상기 다능성 세포 그 자신은 다능성 세포로부터 유래되고, 기타 등등이다. 이들 다능성 세포 각각이 줄기 세포로 간주될 수 있지만, 각각이 생성할 수 있는 세포 유형의 범위는 상당히 다양할 수 있다. 일부 분화된 세포는 또한 더욱 큰 발생 잠재력의 세포를 생성하는 능력을 갖는다. 이러한 능력은 천연적인 것일 수 있거나 또는 다양한 인자를 이용한 처리시에 인공적으로 유도될 수 있다. "증식"은 세포수의 증가를 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "신장 선구 세포"는 동등한 잠재력의 딸세포의 생성에 더하여, 하나 이상의 유형의 조직, 예를 들어 신장 조직을 생성할 수 있거나, 또는 지방 세포 또는 조골 세포와 같은 세포를 생성할 수 있는 포유류 (예를 들어, 인간) 신장-유래된 세포이다. "신장 또는 신 선구 세포"는 사실상 성체 또는 태아 신장 조직에서 기원하는 다능성 또는 전능성 세포이다. 이들 세포는 전능성 줄기 세포에 특징적인 특징을 보유하며, 이는 급속한 증식 및 다른 세포 계통으로의 분화 잠재력을 포함하는 것으로 밝혀졌다. "다능성" 신장 선구 세포는 다수의 세포 계통, 예를 들어, 신장 세포 계통, 지방 세포 계통, 또는 조골 세포 계통을 생성할 수 있다. 신장 선구 세포는 초기 발생 유전자 마커, 신장 발생 유전자 마커, 후신 중간엽 유전자 마커, 및 후신 중간엽의 생존을 촉진하는 유전자에 대한 유전자 발현 프로파일을 보여준다. 예를 들어, 신장 선구 세포 (예를 들어, 인간 신장-유래된 세포)는 Oct-4, Pax-2 및 Rex-1을 포함하지만 이에 한정되지 않는 유전자의 발현에 대하여 양성이며 Sox2, FGF4, hTERT 및 Wnt-4를 포함하지만 이에 한정되지 않는 유전자의 발현에 대하여 음성인 유전자 발현 프로파일을 보여준다.
"조직"은 소정의 특수 기능을 함께 수행하는, 유사하게 특화된 세포의 군 또는 층을 말한다. "기관"은 조직의 2개 이상의 인접 층을 말하며, 조직의 이들 층은 마이크로아키텍처(microarchitecture)가 형성되도록 일부 형태의 세포-세포 및/또는 세포-매트릭스 상호작용을 유지한다.
"신장"은 복부 내의 한 쌍의 기관들 중 하나를 말한다. 신장은 혈액으로부터의 노폐물을 (소변으로서) 제거하며, 에리트로포이에틴을 생성하여 적혈구 세포 생성을 자극하며, 혈압 조절에서 그 역할을 한다. 신장은 적당한 수분과 전해질의 균형을 유지하고, 산-염기 농도를 조절하고, 대사 노폐물의 혈액을 여과시키는 기능을 하는데, 상기 대사 노폐물은 그 후에 소변으로서 배출된다.
"일차 배양물"은 조직으로부터 단리된 많은 상이한 세포 유형들의 상호작용을 가능하게 하는 세포들의 혼합된 세포 집단을 말한다. 단어 "일차"는 조직 배양 업계에서의 그의 일반적인 의미를 취한다. "배양 중 자기-재생 및 확장이 가능한"은 세포 배양 중 성장 및 분열하고, 모세포(mother cell)로부터 딸세포까지 영양 인자를 분비하는 것 및 세포 마커에 의해 측정할 경우 사실상 동일한 표현형을 유지하는 포유류 신장-유래된 세포 집단을 말한다. 포유류 신장-유래된 세포 집단의 복제 동안 일부 시점에서, 표현형은 상기 신장-유래된 세포의 더욱 특화된 또는 분화된 상태로 변화될 수 있다.
다양한 용어를 사용하여 배양 중인 세포를 기재한다. 일반적으로 "세포 배양물"은 제어된 조건 하에서 살아있는 유기체로부터 취하여 성장시킨 세포, 예를 들어 "배양 중" 세포를 말한다. "일차 세포 배양물"은 유기체로부터 직접적으로, 그리고 첫 번째 계대 배양 전에 취해진 세포, 조직 또는 기관의 배양물이다. 세포는 세포 성장 및/또는 분열을 용이하게 하는 조건 하에 세포를 성장 배지 내에 넣을 때 배양 중 "확장"되어서 더욱 큰 세포 집단을 생성한다. 세포가 배양 중 확장될 때, 세포 증식 속도는 때때로 세포수의 배가에 필요한 시간의 양으로 측정된다. 이는 "배가 시간"으로 지칭된다.
"세포주"는 일차 세포 배양물의 하나 이상의 계대 배양에 의해 형성되는 세포 집단이다. 계대 배양의 각각의 라운드(round)는 계대로 지칭된다. 세포가 계대 배양될 때, 세포는 "계대된" 것으로 칭해진다. 특정 세포 집단, 또는 세포주는 때때로 그가 계대된 회수로 지칭되거나 또는 특성 확인된다. 예를 들어, 10회 계대된 배양된 세포 집단은 "P10" 배양물로서 지칭될 수 있다. 일차 배양물, 즉 조직으로부터 세포를 단리한 후 첫 번째 배양물을 P0으로 표기한다. 첫 번째 계대 배양 후에, 세포를 이차 배양물로 기재한다(P1 또는 계대 1). 두 번째의 계대 배양 후, 세포는 삼차 배양물(P2 또는 계대 2)이 되며, 기타 등등이다. 당업자라면 계대 기간 동안 많은 집단의 배가가 있을 수 있으며, 따라서 배양물의 집단 배가 수는 일반적으로 계대 수보다 크다는 것을 이해할 것이다. 계대 사이의 기간 동안 세포의 확장(즉, 집단 배가 수)은 접종 밀도, 기재, 배지, 및 계대 사이의 시간을 포함하지만 이에 한정되지 않는 많은 인자에 좌우된다.
일반적으로, "영양 인자"는 세포의 생존, 성장, 증식, 성숙, 분화, 및/또는 유지를 촉진하거나 또는 세포의 활성 증가를 자극하는 물질로 정의된다. 본 명세서에서 "영양 지지체"는 세포의 생존, 성장, 증식, 성숙, 분화 및/또는 유지를 촉진하거나 또는 세포의 활성 증가를 자극하는 능력을 말하기 위하여 사용된다. 본 발명의 포유류 신장-유래된 세포 집단은 성장 인자, 사이토카인 및 분화 인자를 포함하지만 이에 한정되지 않는 영양 인자를 생성한다. 영양 인자는 FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, VEGF, MMP-2 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
"비-면역원성"은 대다수의 치료되는 포유류 대상에 있어서 유해한 면역 응답을 일으키지 않는, 즉, 포유류 대상의 건강을 손상시키거나 또는 치료된 포유류 대상에 있어서 치료적 응답을 간섭하는 면역 응답을 일으키지 않는 세포 또는 세포 집단을 말한다.
"유전자"는 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 말한다. 유전자는 유전자의 발현에 필요한 서열 정보 (예를 들어, 프로모터, 인핸서 등)를 선택적으로 포함한다. 용어 "게놈"은 유기체의 게놈에 관련된다.
"유전자 발현 데이터"는 유전자 발현의 상이한 측면들에 관한 정보를 포함하는 하나 이상의 데이터 세트를 말한다. 상기 데이터 세트는 하기에 관한 정보를 선택적으로 포함한다: 세포 또는 세포-유래된 샘플에서의 표적 전사체의 존재; 표적 전사체의 상대적인 그리고 절대적인 풍부함의 수준; 특정 유전자의 발현을 유도하는 다양한 처리제의 능력; 및 특정 유전자의 발현을 상이한 수준들로 변화시키는 다양한 처리제의 능력.
"유전자 발현 프로파일"은 선택된 발현 조건 (예를 들어, 하나의 시점 또는 몇몇 시점에서 표준 화합물 또는 시험 화합물의 존재 하의 인큐베이션)이 없을 경우(즉, 기저선 또는 대조군) 또는 상기 발현 조건에 응답하는 복수의 유전자의 발현 수준을 나타낸 것을 말한다. 유전자 발현은 대조 세포와 비교하여 시험 세포에서 전사되는 mRNA의 비 등으로서, 각각의 유전자에 대하여 전사되는 mRNA의 절대적인 양으로 표현될 수 있다. 또한 이것은 대상에 있어서 개별 유전자의 발현 및 개별 유전자들의 스위트(suite)들의 발현을 말한다.
"단리된" 또는 "정제된"은 천연 상태로부터 "사람의 손에 의해" 변경된 것을 말하며, 즉, 자연에서 나타나는 무엇이든지, 이것이 그의 원래 환경으로부터 꺼내졌을 때 단리된 것으로 정의되거나, 또는 이들 둘 모두이다. 또한 "단리된"은 오염물질(즉, 세포와 상이한 물질)로부터 분리된 조성물, 예를 들어 포유류 신장-유래된 세포 집단을 정의한다. 일 태양에서, 세포의 집단 또는 조성물은 그가 자연에서 결부될 수 있는 세포 및 물질이 사실상 없다. 포유류 신장-유래된 세포와 관련하여 "단리된" 또는 "정제된" 또는 "사실상 순수한"은, 전체 세포 집단을 구성하는 포유류 신장-유래된 세포와 관련하여, 약 50% 이상, 약 75% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 약 95% 이상 순수한 포유류 신장-유래된 세포의 집단을 말한다. 고쳐 말하면, 어구 "사실상 순수한"은 후속적인 배양 및 증폭 이전에 원래의 비증폭되고 단리된 집단 중에 약 50% 미만, 바람직하게는 약 30% 미만, 바람직하게는 약 20% 미만, 더 바람직하게는 약 10% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 계통 결정된 신장 세포를 함유하는 본 발명의 포유류 신장-유래된 세포의 집단을 말한다. 세포의 집단 또는 조성물의 순도는 본 기술 분야에 잘 알려진 적절한 방법에 의해 평가될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유래된"은 또한 수득됨을 의미할 것이다. 따라서, 예를 들어 인간 신장-유래된 세포는 인간 신장 조직으로부터 단리되고 수득된 세포이다. 상기 용어는 또한 조직으로부터 수득된 (예를 들어, 단리된), 그리고 그 후 후속적으로 배양된 세포를 포함한다.
본 발명은 탈세포화된 생물학적 스캐폴드 및 신장 세포로 분화가능한 세포로부터 형성된 신장 근위세뇨관 세포 상피 단층을 포함하는 근위세뇨관 기구를 개시한다. 본 스캐폴드 및 세포는 함께 다중 성분, 2차원 근위세뇨관 기구를 생성한다. 이러한 신장 근위세뇨관 세포 상피 단층은 기능성 근위세뇨관 세포로 이루어진다.
본 발명의 근위세뇨관 기구는 예를 들어 MEK 저해제와 같은 저해제의 사용 없이 온전한 단층의 형성 및 접촉 저해의 천연적 조절 기작의 기능을 최적으로 촉진한다. 탈세포화된 생물학적 스캐폴드의 사용을 통하여, 본 발명의 근위세뇨관 기구는 또한 유리하게는 전형적으로 신장 세포가 생체 내에서 노출되는 당해 하부 매트릭스를 대표하고/하거나 모방한다. 최적으로, 천연 탈세포화 스캐폴드 상에의 접종은 세포가 분화되어 상피 단층을 형성하게 하는데, 상기 단층은 전통적인 방법을 통하여 생성된 것보다 더 안정하다.
본 발명은 수송 연구, 신장 독성 스크리닝, 또는 치료제의 효과의 스크리닝을 위한 시험관 내 시험 시스템으로서 사용될 수 있는 2차원 근위세뇨관 기구를 개시한다. 일 실시 형태에서, 2차원 생체 인공 신장 근위세뇨관 기구는 탈세포화된 생물학적 스캐폴드에 신장 선구 세포 및 선택적으로 일부의 경우에 또한 미세혈관 내피 세포를 접종하고, 이어서 정적 배양하거나 또는 생물 반응기에서 배양하여 신장 세포가 기능성 근위세뇨관 세포로 분화되게 하고 시험관 내 시험을 위한 조립된 기구를 유지하도록 함으로써 제작된다. 이들 기능성 근위세뇨관 세포는 스캐폴드의 표면 상에 단층을 형성한다.
또한 본 발명은 개시된 생체 인공 근위세뇨관 기구의 구성요소로서의 탈세포화된 생물학적 스캐폴드의 용도를 개시한다. 탈세포화된 생물학적 스캐폴드의 표면들 중 하나 이상에 세포를 접종할 수 있다. 일 실시 형태에서, 탈세포화된 스캐폴드는 임의의 포유류 조직, 바람직하게는 소화관의 부분들, 가장 바람직하게는 위, 십이지장, 공장, 회장 또는 결장으로부터 유래될 수 있다. 일 실시 형태에서, 스캐폴드가 유래되는 조직은 가장 바람직하게는 공장의 일부분이다. 일 실시 형태에서, 탈세포화된 생물학적 스캐폴드는 점막 조직 또는 점막하 조직으로부터 유래된다. 다른 실시 형태에서, 탈세포화된 생물학적 스캐폴드는 포유류 소장 점막하 조직으로부터 유래된다. 탈세포화된 스캐폴드 또는 이의 조각은 스캐폴드 표면의 각각의 면의 접종을 허용하는 기구 내로 고정될 수 있다.
탈세포화된 스캐폴드의 생성에 사용되는 조직 공급원은 인간, 영장류, 소, 양, 돼지, 또는 쥐 조직을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 포유류 조직일 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 조직은 포유류로부터 단리된다. 다른 실시 형태에서, 탈세포화된 스캐폴드는 포유류 세포 배양물로부터 유래된다. 다른 실시 형태에서, 조직 공급원은 돼지 조직이다. 바람직한 실시 형태에서, 스캐폴드는 예를 들어 더욱 어린, 6개월령 미만의 동물 또는 3개월령 미만의 동물과 같은 더욱 어린 동물로부터 단리된 돼지 조직으로부터 유래된다. 더 바람직한 실시 형태에서, 스캐폴드는 중량이 약 10 내지 25 ㎏, 대안적으로 중량이 약 10 내지 20 ㎏, 그리고 대안적으로 중량이 약 15 내지 약 20 ㎏인 더욱 어린 동물로부터 단리된 돼지 조직으로부터 유래된다. 가장 바람직한 실시 형태에서, 스캐폴드는 중량이 약 10 내지 약 15 ㎏인 동물로부터 단리된 돼지 조직으로부터 유래된다.
통상적인 방법을 이용하여 조직의 무세포화(acellularization) (예를 들어 탈세포화)를 수행하는 데 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 단리된 조직의 점막 구조는 단리 동안 보존된다. 바람직한 실시 형태에서, 점막 구조를 후속적으로 부분적으로 또는 완전히 제거하여 세포 부착을 위한 점막하 층을 노출시킨다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 신장 선구 세포는 점막 구조 상에서 배양된다. 더욱 높은 백분율의 신장 선구 세포는 점막 조직과 비교하여 점막하 구조 상에서 배양될 때 상피 형태를 채용하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 다른 실시 형태에서, 신장 선구 세포는 점막하 구조 상에서 최적으로 배양된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "신장 세포로 분화가능한 세포"는 신장 세포로 분화되는 전구 세포, 예를 들어 신장 세포로 분화될 수 있는 임의의 선구체, 전구체 또는 일차 세포를 의미할 것이다. 일 실시 형태에서, 세포는 일차 신장 세뇨관 상피 세포, 신장 세포 또는 신장 선구 세포 (예를 들어, 유도 전능성 줄기 세포)로 분화되는 선구 (예를 들어, 줄기) 세포, 인간 신장-유래된 세포, 신장으로부터 단리된 신장 세포 또는 선구 세포로부터 단리된 줄기 세포, 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 신장 세포 또는 신장 선구 세포로 분화될 수 있는 임의의 선구 (예를 들어, 줄기) 세포가 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어 배아 줄기 세포, iPS 세포, 제대-유래된 세포, 태반-유래된 세포 또는 중간엽 줄기 세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 분화가능한 세포는 포유류 신장-유래된 세포이다. 따라서, 본 발명의 일 실시 형태는 개시된 생체 인공 신장 시스템의 구성요소로서의, (예를 들어 인간 신장과 같은) 포유류 신장으로부터 단리된 포유류 신장-유래된 세포의 용도이다. 콜터(Colter) 등의 미국 특허 공개 제2008/0112939호에 기재된 바와 같이, 선구 세포는 인간 신장 조직으로부터 유래될 수 있으며, 이들 신장-유래된 세포는 세뇨관 구조로 자기-조직될 수 있으며, 질환에 걸린 신장의 치료에 사용될 수 있음이 이전에 입증되었으며, 상기 미국 특허 공개의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
포유류 신장-유래된 세포의 단리, 배양 및 특성 확인에 사용되는 예시적인 기술은 콜터 등의 미국 특허 공개 제2008/0112939호에 기재되어 있다. 미국 특허 공개 제2008/0112939호에 기재된 바와 같이, 인간 신장-유래된 세포는 인간 신장으로부터 단리되며, 기관 이식에 적합하다. 일 실시 형태에서, 혈액 및 잔사는 임의의 적합한 배지 또는 완충제, 예를 들어 인산염 완충 염수를 이용한 세척에 의해 세포의 단리 이전에 신장 조직으로부터 제거된다. 그 후, 예를 들어 인간 신장-유래된 세포와 같은 신장-유래된 세포는 효소적 소화에 의해 포유류 신장 조직으로부터 단리된다. 효소는 세포를 포유류 (예를 들어 인간) 신장 조직으로부터 해리시키는 데 사용된다. 일 실시 형태에서, 디스파아제가 사용될 수 있다. 대안적으로, 중성 프로테아제 (예를 들어 디스파아제), 메탈로프로테아제 (예를 들어, 콜라게나아제) 및 하이알루로니다아제의 조합물을 사용하여 세포를 포유류 (예를 들어, 인간) 신장 조직으로부터 해리시킬 수 있다. 그 후, 단리된 세포는 처음에 젤라틴으로 코팅된 살균 조직 배양 용기로 옮겨진다. 포유류 (예를 들어 인간) 신장-유래된 세포는 예를 들어 REGM™ 신장 상피 성장 배지 (미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 론자(Lonza)), 또는 어드밴스드(Advanced)™ DMEM/F12 (인비트로겐(Invitrogen))와 같은 그러나 이에 한정되지 않는, 세포의 성장을 유지할 수 있는 임의의 배양 배지에서 배양된다.
신장 세포로 분화가능한 세포 (예를 들어, 신장 세포로 분화될 수 있는 전구 세포) 또는 포유류 신장-유래된 세포는 세포 집단일 수 있다. 일 실시 형태에서, 인간 신장-유래된 세포의 집단이 사용된다. 다른 실시 형태에서, 상기 집단은 균질하다. 다른 실시 형태에서, 상기 집단은 사실상 균질하다.
일부 실시 형태에서, 신장-유래된 세포는 신장 피질, 신장 수질 또는 신장 피막하 영역 및 이들의 혼합물로부터 수득될 수 있다.
포유류 (예를 들어 인간) 신장-유래된 세포는 표현형 특성, 예를 들어 형태, 성장 잠재력, 표면 마커 표현형, 초기 발생 유전자 발현, 신장 발생 유전자 발현 및 영양 인자 분비를 특징으로 한다. 표면 마커, 유전자 발현 및 영양 인자 분비 표현형은 배양 중 인간 신장-유래된 세포 집단의 다수의 계대 후 유지된다.
바람직한 실시 형태에서, 단리된 포유류 신장-유래된 세포 (즉 세포 집단)는 배양 중 자기-재생 및 확장이 가능하며, 독특한 발현 프로파일, 예를 들어 하기에 기재된 것들 중 임의의 것을 나타낸다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 인간 신장-유래된 세포는 Oct-4, Rex-1, Pax-2, 카드헤린-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7, 또는 GDF5 중 적어도 하나의 발현에 대하여 양성이다. 또 다른 실시 형태에서, 세포는 Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2 또는 GATA-4 중 적어도 하나의 발현에 대하여 음성이다. 다른 실시 형태에서, 세포는 Oct-4, Rex-1, Pax-2, 카드헤린-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7, 또는 GDF5 중 적어도 하나의 발현에 대하여 양성이며, Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2 또는 GATA-4 중 적어도 하나의 발현에 대하여 음성이다. 다른 실시 형태에서, 세포는 Eya1, WT1, FoxD1, BMP7, BMP2, GDF5, EpoR 또는 Rex-1 중 적어도 하나의 발현에 대하여 양성이다. 또 다른 실시 형태에서, 세포는 Sox2, FGF4, hTert 또는 Wnt-4 중 적어도 하나의 발현에 대하여 음성이다. 다른 실시 형태에서, 세포는 Eya1, WT1, FoxD1, BMP7, BMP2, GDF5, EpoR 또는 Rex-1 중 적어도 하나의 발현에 대하여 양성이며, Sox2, FGF4, hTert 또는 Wnt-4 중 적어도 하나의 발현에 대하여 음성이다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 인간 신장-유래된 세포는 또한 세포 표면 마커들 HLA I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD166, 또는 SSEA-4 중 적어도 하나에 대하여 양성이다. 다른 실시 형태에서, 인간 신장-유래된 세포는 또한 세포 표면 마커들 HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141, 또는 E-카드헤린 중 적어도 하나에 대하여 음성이다. 다른 실시 형태에서, 인간 신장-유래된 세포는 또한 세포 표면 마커들 HLA I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD166, 또는 SSEA-4 중 적어도 하나에 대하여 양성이며, 세포 표면 마커들 HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141, 또는 E-카드헤린 중 적어도 하나에 대하여 음성이다. 일 실시 형태에서, 인간 신장-유래된 세포는 영양 인자들 FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 또는 VEGF 중 적어도 하나를 분비할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 세포는 영양 인자들 PDGFbb 및 IL12p70 중 적어도 하나를 분비하지 않는다.
다른 실시 형태에서, 생체 인공 근위세뇨관 기구에서 사용되는 선구 세포는 인간 신장-유래된 세포이다. 이들 인간 신장-유래된 세포는 배양 중 자기-재생 및 확장이 가능하며, Oct-4, Rex-1, Pax-2, 카드헤린-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7, 또는 GDF5 중 적어도 하나의 발현에 대하여 양성이고; Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2, E-카드헤린 또는 GATA-4 중 적어도 하나의 발현에 대하여 음성이다. 더욱이, 인간 신장-유래된 세포는 또한 세포 표면 마커들 HLA-I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166, 또는 SSEA-4 중 적어도 하나에 대하여 양성이며; 세포 표면 마커들 HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138 및 CD141 중 적어도 하나에 대하여 음성일 수 있다. 게다가, 이들 세포는 선택적으로 영양 인자들 FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 또는 VEGF 중 적어도 하나를 분비하며; 영양 인자들 PDGF-bb 또는 IL12p70 중 적어도 하나를 분비하지 않는다.
또 다른 실시 형태에서, 인간 신장-유래된 세포는 (1) Oct-4, Rex-1, Pax-2, 카드헤린-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 및 GDF5의 발현에 대하여 양성이며 (2) Sox2, FGF4, hTert, SIX2 및 Gata-4 중 적어도 하나의 발현에 대하여 음성이다. 다른 실시 형태에서, 신장-유래된 세포는 (1) Oct-4, Rex-1, Pax-2, 카드헤린-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 및 GDF5의 발현에 대하여 양성이며; (2) Sox2, FGF4, hTert, SIX2 및 Gata-4 중 적어도 하나의 발현에 대하여 음성이며; (3) 세포 표면 마커들 HLA I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD166, 및 SSEA-4에 대하여 양성이며; (4) HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD90, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141, 및 E-카드헤린에 대하여 음성이다.
다른 실시 형태에서, 인간 신장-유래된 세포는 배양 중 자기-재생 및 확장이 가능하며, HLA I 및 CD44의 세포 표면 마커 발현에 대하여 양성이고, Oct-4, Pax-2, 및 WT1의 유전자 발현에 대하여 양성이며, CD133의 세포 표면 마커 발현 및 Wtn-4의 유전자 발현에 대하여 음성이다. 일 실시 형태에서, 인간 신장-유래된 세포는 부가적으로 BMP7, BMP2, GDF4, EpoR 및 Rex-1의 유전자 발현에 대하여 양성이며, Sox2, FGF4 및 hTert의 유전자 발현에 대하여 음성이다.
다른 실시 형태에서, 인간 신장-유래된 세포는 (1) 배양물의 자기-재생 및 확장이 가능하고; (2) HLA-I의 발현과, Oct-4, Rex-1, Pax-2, 카드헤린-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 또는 GDF5 중 적어도 하나의 발현에 대하여 양성이며; (3) CD133의 발현과, SOX2, FGF4, hTertm Wnt-4, SIX2, E-카드헤린 또는 GATA-4 중 적어도 하나의 발현에 대하여 음성이다. 이들 세포는 추가로 (4) 세포 표면 마커들 CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166 또는 SSEA-A 중 적어도 하나에 대하여 양성이며 (5) 세포 표면 마커들 HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141, 및 E-카드헤린 중 적어도 하나에 대하여 음성일 수 있다. 이들 세포는 또한 영양 인자들 FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 또는 VEGF 중 적어도 하나를 분비하며 영양 인자들 PDGFbb 또는 IL12p70 중 적어도 하나의 분비가 결여될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 인간 신장-유래된 세포는 집단이다.
포유류 (예를 들어 인간) 신장-유래된 세포는 처음에 사용한 것과 동일하거나 또는 상이한 유형의 신선한 배지를 함유하는 별도의 배양 용기로 계대되며, 여기서, 세포 집단은 유사 분열에 의해 확장될 수 있다. 그 후, 포유류 (예를 들어 인간) 신장-유래된 세포는 생물학적 매트릭스 내에 접종되며, 신장-유래된 세포가 기능성 근위세뇨관 세포로 분화되도록 배양된다. 본 발명의 세포는 계대 0과 노쇠기 사이의 임의의 시점에 사용될 수 있다. 세포는 바람직하게는 약 3 내지 약 20회, 약 5 내지 약 10회, 약 15 내지 20회, 약 5 내지 약 7회, 그리고 더 바람직하게는 약 3 내지 약 7회 계대된다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 탈세포화된 생물학적 스캐폴드의 2개 이상의 표면에 세포가 접종된다. 일 실시 형태에서, 혈관 내피 세포는 스캐폴드의 일 표면 상에 접종되며, 그 후 다른 하나의 표면에는 포유류 신장-유래된 세포가 접종된다. 그 후, 접종된 스캐폴드는 신장-유래된 세포가 기능성 근위세뇨관 세포로 분화되는 것 및 반대쪽 표면 상에서 혈관 내피 단층이 형성되는 것이 허용되도록 배양된다.
일 실시 형태에서, 스캐폴드의 재생에 사용되는 인간 혈관 내피 세포는 내피 세포주, 골수 또는 전혈 내피 선구 세포, 또는 일차 내피 또는 미세혈관 내피 세포로부터 선택될 수 있다. 사용되는 혈관 내피 세포는 통상적인 방법을 이용하여 단리된다. 바람직한 실시 형태에서, 스캐폴드의 재생에 사용되는 세포는 일차 미세혈관 내피 세포이다. 일 실시 형태에서, 사용되는 혈관 내피 세포는 임의의 포유류 공급원으로부터 단리될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 단리되는 혈관 내피 세포는 인간 기원의 것이다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 혈관 내피 세포는 포유류 (인간) 신장으로부터 단리된 일차 미세혈관 내피 세포이다.
본 발명의 다른 실시 형태는 근위세뇨관 기구 제조용 장치이다.
일 실시 형태에서, 탈세포화된 스캐폴드의 접종은 특별하게 설계된 장치 ("크라운(crown)")를 사용함으로써 달성되며, 상기 장치 내에 탈세포화된 스캐폴드의 한 조각이 삽입되어 그의 에지들이 금속 또는 플라스틱의 두 조각들 사이에 배치되며, 이는 상기 에지들을 효과적으로 밀봉하여 스캐폴드에 의해 분리되는 상부 및 하부 웰을 생성한다. 크라운은 또한 약간의 신축성 및 장력을 탈세포화된 스캐폴드 내로 도입한다. 그 후, 세포는 상부 웰 내에 접종되며 탈세포화된 스캐폴드 상에 침강되게 된다. 크라운은 또한 뒤집어져서 스캐폴드의 다른 하나의 면의 접종을 가능하게 할 수 있거나, 또는 크라운은 해체되고, 스캐폴드는 뒤집어져서 반대쪽 표면의 접종을 위하여 크라운 내로 재조립될 수 있다. 신장 세포는 약 500개의 세포/㎠ 내지 약 350,000개의 세포/㎠, 대안적으로 약 1,000개의 세포/㎠ 내지 약 100,000개의 세포/㎠, 대안적으로 약 750개의 세포/㎠ 내지 약 75,000개의 세포/㎠, 대안적으로 약 10,000개의 세포/㎠ 내지 약 300,000개의 세포/㎠, 대안적으로 약 7,500개의 세포/㎠ 내지 약 200,000개의 세포/㎠, 그리고 바람직하게는 약 5,000개의 세포/㎠ 내지 약 70,000개의 세포/㎠의 범위의 밀도로 스캐폴드 상에 접종될 수 있다.
본 장치를 이용하여 세포-접종된 스캐폴드는 그 후 통상적인 기술을 이용하여 배양되어 신장 세포의 분화 및 연속 상피 단층의 형성을 가능하게 한다. 배양 시간은 1 내지 6주의 배양, 바람직하게는 2 내지 4주의 배양, 가장 바람직하게는 3 내지 4주일 수 있다. 그 후, 생성된 성숙 근위세뇨관 기구는 통상적인 방법을 사용한 신장 수송 연구, 신독성 검사, 또는 치료제의 시험에 사용될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 시험관 내 시험 시스템뿐만 아니라 접종된 스캐폴드 상에서의 세포의 배양도, 스캐폴드를 주문 설계된 생물 반응기 내에 배치하여서 스캐폴드가 두 구획들 사이에 장벽을 생성하게 함으로써 달성된다. 생물 반응기 챔버는 유체 유동이 스캐폴드의 둘 모두의 표면을 가로지를 수 있도록 설계된 유체 유동 시스템에 연결된다. 예를 들어, 기저외측부에서의 내피 세포의 기능성을 지지하기 위하여, 접종되는 세포 유형에 따라 유동 시스템 특성, 예를 들어 유량을 변경시킴으로써, 세포 특이적 유체의 기계적 조건을 스캐폴드의 각각의 면에 대하여 확립할 수 있다. 스캐폴드는 생물 반응기 내에 배치되기 전에 세포로 사전 접종되거나 또는 생물 반응기 내에 배치되고 이어서 생물 반응기 내에서 세포가 접종될 수 있다. 다른 태양에서, 생물 반응기는 생물 반응기 내에 배치된 탈세포화된 제작물에 가해지는 장력을 필요할 경우 변경하여 세포의 접종 및/또는 분화를 용이하게 할 수 있게 하는 방식으로 설계된다.
일 실시 형태에서, 탈세포화된 스캐폴드는 신장 세포, 그리고 선택적으로 내피 세포의 접종에 대하여 설명된 장치를 이용하여 세포가 접종된다. 그 후, 세포-접종된 스캐폴드는 장치로부터 꺼내지고, 배양 또는 평가를 위하여 생물 반응기 챔버로 옮겨지며, 이는 하기 실시예에서 기재된 바와 같다. 세포-접종된 스캐폴드는 먼저 대략 0 내지 4주의 기간 동안 장치 내에서 배양된 후 생물 반응기 챔버로 옮겨질 수 있다. 신장 세포는 스캐폴드 상에 약 500개의 세포/㎠ 내지 약 350,000개의 세포/㎠, 바람직하게는 약 5000개의 세포/㎠ 내지 약 70,000개의 세포/㎠의 범위의 밀도로 접종될 수 있다. 장치 내에서의 인큐베이션 지속 기간을 비롯한 배양 조건은 세포 공급원 및 배양 배지에 따라 달라질 수 있다.
다른 실시 형태에서, 탈세포화된 스캐폴드는 먼저 생물 반응기 챔버 내에 배치되며, 그 후 스캐폴드는 세포 현탁물을 생물 반응기 챔버 내로 관류시키고 탈세포화된 스캐폴드에 세포가 부착될 수 있게 하는 기간 동안 인큐베이션함으로써 접종된다. 이러한 생물 반응기는 상부 몸체 요소 및 스캐폴드 성장용으로 지정된 영역을 갖는 하부 몸체 요소를 포함한다.
본 발명에 사용하기에 적합한 하나의 예시적인 생물 반응기가 도 15에 도시되어 있다. 도 15를 참조하면, 생물 반응기(100)의 구성요소로는 본체 요소들, 즉 상부 몸체 요소(110) 및 하부 몸체 요소(120)와, 2개의 클립들, 즉 전방 클립(130) 및 후방 클립(160)과, 외부 클로져 플랩들(outer closure flaps), 즉 하부 외부 클로져 플랩(140) 및 상부 외부 클로져 플랩(150)과, 연결 장치(170)가 있다. 생물 반응기(100)의 반응기 상부 본체 요소(110) 및 하부 본체 요소(120)는 전방 클립(130) 및 후방 클립(160)에 의해 결합된다. 상부 외부 클로져 플랩(150)은 상부 몸체 요소(110)의 상부에 있다. 하부 외부 클로져 플랩(140)은 하부 몸체 요소(120) 아래에 있다. 도 16은, 탈세포화된 스캐폴드 상에서의 장력을 조정하기 위하여 상부 몸체 요소 내의 프레임을 따라 깊이가 변경될 수 있는 홈(groove; 180)을 나타내는 생물 반응기의 하부 몸체 요소(120)의 도면이다. 하부 몸체 요소(120)는 또한 세포 성장을 위한 영역(190)을 포함한다.
일 실시 형태에서, 비접종된 스캐폴드는 생물 반응기(100)의 상부 몸체 요소(110)와 하부 몸체 요소(120) 사이에 위치될 수 있다 (도 15 참조). 하부 몸체 요소(120) 내에 상응하는 홈 구조가 있는 상태에서 상부 몸체 요소(110)로 밀링되는 원형 프레임 구성은 셀 크라운에 비견되는 스캐폴드의 고정을 가능하게 한다. 장력은 특정하게 설계된 프레임/홈 조합을 이용함으로써 조정될 수 있으며, 이는 홈의 깊이 및 프레임의 브릿지 폭이 상이하다. 프레임이 홈(180) (도 16 참조) 내로 이동할 수 있는 거리는 스캐폴드의 장력을 결정하며, 이때 거리가 더 길수록 장력이 더 높아진다. 스캐폴드 직경 및 스캐폴드 두께와 같은 인자가 고려되어야 한다. 스캐폴드 위치 설정 후, 생물 반응기의 전방 클립(130) 및 후방 클립(160)은 상부 몸체 요소(110)와 하부 몸체 요소(120)를 결합시키며, 이 제작물은 셀 크라운과 같이 취급될 수 있다. 하부 외부 클로져 플랩(140) 및 상부 외부 클로져 플랩은 당해 시스템의 폐쇄를 가능하게 하며, 세포 현탁물은 생물 반응기의 연결 장치(170)를 통하여 스캐폴드의 한 면에 도입될 수 있다. 세포는 세포 성장 영역(190)에서 성장한다. 접종된 세포가 유착할 수 있는 세포 특이적 기간 후, 폐쇄된 생물 반응기는 뒤집어질 수 있으며, 다른 또는 동일한 세포 유형이 스캐폴드의 다른 하나의 면 상에 접종될 수 있다. 일 실시 형태에서, 접종에 사용되는 세포 현탁물은 약 103개의 세포/ml 내지 약 107개의 세포/ml의 범위일 수 있다. 제1 면 상에 접종된 세포의 생존성의 손실을 피하기 위하여, 제1 면의 구획은 배지로 충전될 수 있다. 정적 조건이 필요할 경우, 상기 구획은 세포 배양 배지로 충전될 수 있다. 대안적으로, 다양한 유동 조건 하에서의 배지의 관류는 연결 장치(170)를 사용하여 개시될 수 있다.
스캐폴드에의 세포의 유착 후, 세포는 챔버 구획에 배지를 단순히 범람시키고, 생물 반응기의 연결 장치를 폐쇄함으로써 정적으로 배양될 수 있다. 대안적으로, 유동 시스템의 튜브들을 생물 반응기에 연결하고, 관류를 시작할 수 있다. 그 후, 생물 반응기 챔버 내의 탈세포화된 스캐폴드 상에 접종된 세포를 배양하여 세포의 성장 및 신장 세뇨관 세포의 기능성 단층으로의 분화를 허용한다. 세포의 배양물은 정적 배양물, 또는 더 바람직하게는 선형 유동(linear flow) 또는 맥동 유동(pulsatile flow)과 같은 동적 조건 하에서의 배양물을 포함할 수 있다. 유량, 압력 및 맥동 조건을 모두 변화시켜 세포의 성장 및 기능성 신장 세포로의 분화를 용이하게 할 수 있다. 생물 반응기 내의 배지의 평균 유량은 1 내지 25 ml/min, 대안적으로 약 1 내지 약 10 ml/min, 대안적으로 약 2.5 내지 약 10 m/min, 대안적으로 약 5 내지 20 ml/min의 범위일 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 평균 유량은 약 2.5 내지 15 ml/min의 범위일 수 있다. 배양 기간은 약 1 내지 약 4주, 대안적으로 약 1 내지 약 2주, 대안적으로 약 1 내지 약 3주, 대안적으로 약 2 내지 약 4주의 범위일 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 배양 기간은 바람직하게는 약 2 내지 3주의 범위일 수 있다. 이 시간 동안, 세포 층 완전성(integrity)은 본 기술 분야에 잘 알려진 기술을 사용하여 모니터링될 수 있다. 일 실시 형태에서, 세포 층 완전성은 생물 반응기의 각각의 구획 내에 통합된 전극을 사용하여 상피 횡단 전기 저항(trans-epithelial electrical resistance)을 측정함으로써 또는 예를 들어 이눌린 또는 크레아티닌과 같은 다양한 형광 태그된 분자의 단층을 가로지르는 누출을 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 상이한 세포 배양 배지가 각각의 챔버에서 사용된다. 또 다른 실시 형태에서, 상이한 유량, 압력, 및 맥동 조건이 각각의 챔버에서 이용될 수 있으며, 이는 유동 전단 응력을 통한 세포 특이적 배양을 가능하게 한다. 생물 반응기의 설명은 또한 독일 특허 출원 제102008056037.5-41호 및 유럽 특허 제2 184 344호에서 찾아볼 수 있으며, 이들의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명의 다른 실시 형태는 (예를 들어 포유류 (인간) 신장-유래된 세포와 같은) 신장 세포로 분화가능한 세포를 장력 하에서 이 세포의 분화에 의해 신장 근위세뇨관 세포의 안정한 단층으로 분화시키는 방법이다. 이 방법은 본 발명의 근위세뇨관 기구를 생성하기 위하여 본 발명의 스캐폴드를 사용하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 근위세뇨관 기구는 신장 독성 스크리닝용의 또는 치료제 스크리닝용의 시험관 내 시험 시스템으로서 사용될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 본 기구는 화합물 또는 입자에의 노출 동안 또는 상기 노출 후, 수송과 같은 세뇨관 세포 기능의 모니터링에 사용될 수 있다. 상이한 배지 제형을 각각의 표면 위에서의 유동에 사용할 수 있으며, 이는 하나의 배지 구획으로부터 다른 하나의 구획으로 세포 및 스캐폴드 층을 가로지르는 수송에 대한 연구를 가능하게 한다. 이러한 배지 제형의 하나의 예로는 mvEC가 그 위에 접종된 구획 내에서 내피 세포 배지를 유동시키는 것 및 신장 세뇨관 단층을 포함하는 반대쪽 구획 내에서 사구체 여과액을 모방하는 배지 제형을 유동시키는 것이 있을 것이다.
그 후, 신장 세뇨관 단층의 수송 기능은 당업자에 의해 공지된 표지된 분자 및 표준 기술을 이용하여 평가될 수 있다. 독성 스크리닝은, 영양소를 내피 세포에 제공하고 내피 세포와 접촉하는 혈관 구획 유동 경로에 관심 대상의 화합물 또는 입자를 첨가함으로써 또는 영양소를 신장 세뇨관 세포에 제공하고 신장 세뇨관 세포와 접촉하는 세뇨관 구획 유동 경로에 화합물 또는 입자를 도입함으로써 성취될 수 있으며, 이는 각각 혈액 및 소변에서의 독성 생체 이물질 화합물의 출현을 모방한다. 화합물 또는 입자의 수송은 상기 유동 경로들 중 하나 또는 이들 둘 모두의 유동 경로의 배지의 분석에 의해 모니터링될 수 있다. 게다가, 독성은 관심 대상의 화합물에의 노출 후, 세포 생존성, 형태, 또는 수송 기능에 대한 영향의 분석에 의해 모니터링될 수 있다. 화합물 또는 입자의 독성 또는 치료 효과의 평가에 사용되는 분석법은 상기에 기재된 것에 한정되지 않는다.
치료제는 먼저 생체 인공 기구의 신장-유래된 세포에 상해를 입히고, 그 후 상기 세포를 치료적 시험 입자로 처리함으로써 분석될 수 있다. 상기 상해는 예를 들어 세포를 예를 들어 시스플라틴 또는 스트렙토조토신과 같은 독성 화합물 또는 입자에 노출시키는 것과 같은 물리적 또는 화학적 수단에 의해 도입될 수 있다. 치료적 시험 화합물 또는 입자는, 예를 들어 치료제의 정맥내(IV) 전달 후 세포가 노출되는 농도를 모방하는 농도로, 본 기구의 혈관 구획 유동 경로 내에 첨가함으로써 세포와 접촉되게 할 수 있다. 그 후, 신장 세뇨관 세포 기능의 모니터링은 적용된 치료적 시험 화합물의 유효성의 정도의 결정에 사용될 수 있다.
세뇨관 기능의 모니터링은 신장 세뇨관 세포에 의한 화합물 또는 입자의 흡수, 근위세뇨관 기구의 하나의 배지 구획으로부터 다른 하나의 구획으로의, 상기 세포에 의해 흡수된 화합물 또는 입자의 수송, 흡수 또는 수송에 대한 저해제의 영향, 및 신장 세뇨관 세포의 유전자 또는 단백질의 발현, 형태, 표면 마커 발현, 효소 활성 또는 생존성의 변화를 검출하거나 또는 평가하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 화합물 또는 입자의 독성 또는 치료 효과의 평가에 사용되는 분석법은 상기에 기재된 것에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 생체 인공 근위세뇨관 기구를 포함하는 키트이다. 일 실시 형태에서, 키트는 생체 인공 세뇨관 기구 및 생성물 인서트(insert)를 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 생체 인공 근위세뇨관 기구를 포함하는 조성물이다. 일 실시 형태에서, 조성물은 본 발명의 생체 인공 근위세뇨관 기구 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
추가의 설명 없이, 당업자라면, 전술한 설명 및 하기의 예시적인 실시예를 이용하여 본 발명을 만들어 이용하고 청구된 방법을 실시할 수 있을 것으로 믿어진다. 따라서, 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시 형태들을 특정하게 알려 주며, 어떠한 방식으로든지 본 개시 내용의 나머지를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 부가적으로, 하기 실시예 및 본 명세서의 다른 곳에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 기구 및 방법에서 유용한 신장-유래된 세포("hKDC")는 hKDC의 설명, 단리 및 특성 확인에 관련된, 전체적으로 참고로 포함된 미국 특허 공개 제2008/0112939호의 개시 내용에 따라 단리되고 특성 확인될 수 있다.
실시예
실시예 1: 세포외 매트릭스 스캐폴드 상에서의 hKDC의 접종 및 분화
이 실험은 콜라겐-코팅된 트랜스웰 상에서의 전통적인 배양 뿐만 아니라 세포외(즉, 탈세포화된) 매트릭스 스캐폴드의 다양한 구성 상에서의 인간 신장-유래된 세포("hKDC")의 부착, 성장 및 분화를 시험한다.
계대 4의 hKDC를 3개의 상이한 스캐폴드 구성 상에 그리고 트랜스웰 (미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝(Corning)) 상에 접종하였다. 세포를 REGM™ 신장 상피 성장 배지 (미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 론자)를 이용하여 3주의 기간에 걸쳐 배양하였다. 각각의 스캐폴드 구성을 하기 3가지의 상이한 세포 농도를 이용하여 시험하였다: 2.5 × 103개, 5 × 103개, 및 1×104개의 세포. 시험한 구성은 다음과 같았다: 1) 콜라겐 샌드위치 배양; 2) 콜라겐-SIS 샌드위치 배양; 3) SIS 단층 배양; 및 4) 콜라겐-코팅된 트랜스웰.
콜라겐 샌드위치 배양
hKDC를 24웰 플레이트에서 두 콜라겐 겔 층들 사이에서 배양하였다. 하부 겔은 먼저 냉 겔 중화 용액을 1:2의 비로 콜라겐 (쥐 꼬리 건으로부터 단리된 제1형, 0.1% 아세트산 중 6 mg/ml)과 혼합하고, 그 후 웰당 500 μl의 이 용액을 첨가함으로써 캐스팅하였다(cast). 상기 용액을 37℃ / 5% CO2에서 15분 동안 인큐베이션함으로써 겔화하였다. 그 후, 세포를 웰당 1 ml의 배지 중에 접종하였다. 24시간 후, 커버(cover) 겔을 캐스팅하였다. 배지를 흡인하고, 300 μl의 겔 용액 (상기와 같이 제조함)을 각각의 웰 내에 피펫팅하였다. 상기 용액을 37℃ / 5% CO2에서 15분 동안 인큐베이션함으로써 겔화하였다. 마지막으로, 웰당 1 ml의 배지를 첨가하였다.
소장 점막하 조직(SIS) 단층 배양
스캐폴드를 통상적인 방법을 이용하여 소장 점막하 조직(SIS)의 세그먼트의 탈세포화에 의해 제조하였다. 간략하게는, 돼지 소장의 세그먼트의 점막을 기계적으로 제거하였다. 그 후, 상기 소장 세그먼트를 3.4% 소듐 데옥시콜레이트 중에서 진탕하면서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 탈세포화를 수행하였다. 그 후, 탈세포화된 세그먼트를 PBS로 광범위하게 헹구고, 감마 조사에 의해 살균하였다. 12웰 플레이트를 SIS 단층 배양에 사용하였다. 탈세포화된 SIS를 둥근 금속 프레임 위에서 스패닝하고(spanned), 세포의 접종 전날에 웰당 1 ml의 배지로 덮었다. 스패닝된 SIS 표면은 24웰 플레이트 내의 웰의 표면과 대략적으로 동등하다. 세포를 SIS 상에 접종하기 위하여, 세포 배양 배지를 제거하고, 적당량의 세포를 웰당 1 ml의 배지 중에 접종하였다.
SIS 샌드위치 배양
SIS 스캐폴드를 준비하고, hKDC를 접종하였는데, 이는 상기에 설명된 바와 같았다. 세포를 24시간 동안 부착시킨 후, 커버 겔을 콜라겐 샌드위치 배양 (상기 참조)에서와 같이 세포 위에 캐스팅하였다.
트랜스웰 배양
트랜스웰을 12웰 플레이트 내로 옮기고, 각각 200 μl의 제1형 콜라겐 (0.1% 아세트산 중 100 ㎍/ml)으로 코팅하였다. 상기 코팅 용액을 실온에서 20분 동안 인큐베이션하고, 그 후 흡인하였다. 적당량의 세포를 웰당 1.5 ml의 배지 중에 접종하였다.
다수의 샘플들을 상기 조건들 각각에서 3주 동안 배양하였다. 1주, 2주 및 3주 후, 샘플들을 조직학적 분석을 위하여 꺼냈다. 게다가, 배지 샘플들을 하기의 대사 파라미터에 대하여 란독스 RX 데이토나(RANDOX RX DAYTONA)™ 임상 분석기로 분석하였다: 글루코스 농도, 락테이트 및 락테이트 데하이드로게나아제. 조직학적 분석용으로 취해진 샘플들을 보우인 고정제(Bouin's fixative)로 1시간 동안 고정하였다. 그 후, 상기 샘플들을 물 중에서 4시간 이상 동안 세척하고, 파라핀 내에 매립시켰다. 후속적으로, 3 ㎛ 두께의 슬라이스들을 제조하였다. 슬라이스들을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하여 세포 형태를 평가하였다. 더욱이, 하기 항체를 사용하여 면역조직화학적(IHC) 검사를 수행하여 세포의 분화를 특성 확인하였다: 항-hPAX2, 항-hAQP1, 항-Ki67, 항 hE-카드헤린 및 항-hN-카드헤린 (하기 표 1 참조). 면역조직화학적 검사에 있어서, 3 ㎛의 횡단면들을 탈파라핀화하였다. 표적 검색을 프로테이나아제 K를 이용한 효소 처리에 의해 또는 pH 6의 시트르산 완충제 (다코(Dako), #S2369) 또는 pH9의 트리스(Tris)/EDTA 완충제 (다코, #S2367) 중에서 가열함에 의해 성취하였다. 3% 하이드로겐 퍼옥시다아제를 이용한 차단 단계를 내인성 퍼옥시다아제의 차단을 위하여 포함시켰다. 그 후, 일차 항체를 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 엔비전(ENVISION)™ 검출 시스템 퍼옥시다아제/DAB 토끼/생쥐 (다코, #K5007)를 이용하여 이를 검출하였다. 슬라이스들을 헤마톡실린으로 대조염색하였다.
[표 1]
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대사 파라미터들의 분석에 의한 결과는 hKDC가 잘 접종되었고, 시험한 모든 배양 조건 하에서 증식하였음을 나타냈다 (도 1 내지 도 6 참조). H&E를 이용한 조직학적 염색은, 콜라겐 샌드위치 및 SIS-콜라겐 샌드위치 배양 조건 둘 모두에서 세포는 거의 연속적인 이중 층 또는 다중 층으로 성장하였으며, 이는 튜브 또는 낭포를 닮은 3차원 구조로 진행하였음을 나타냈다. 이와는 대조적으로, SIS 상에서 배양된 세포는 고도로 다면적인 형태를 나타내는 융합성(confluent) 단층을 형성하였는데, 상기 형태는 상피 분화를 나타내는 것이다 (도 7 및 도 8 참조). 이 형태는 사용한 초기 세포 접종 농도와 관계 없이 3주의 배양 후 관찰되었다. 콜라겐-코팅된 PET 막을 갖는 트랜스웰 상에서 배양한 hKDC는 평평한 형태, 다층 형성, 및 비연속 세포 층에 이르게 되는, 표면에서 박리되는 것으로 관찰된 응집체를 나타낸다. 콜라겐-코팅된 PET 막 상의 hKDC의 이러한 관찰된 특성들은 이들이 수송 분석에 부적당해지게 한다. 유사한 다층화가 폴리에스테르 및 폴리카르보네이트 트랜스웰 막에서 또한 관찰되었으며, 이는 이 효과가 실험에서 사용된 특정 막이 아니라 일반적으로 합성 막의 특성임을 나타낸다. 이러한 특성들은 SIS 배양에 있어서는 관찰되지 않았으며, 이는 이러한 스캐폴드가 온전한 단층의 형성 및 접촉 저해의 자연적 조절 기작의 기능을 촉진함을 시사한다.
Ki67 항체를 이용한 면역조직화학 결과는 hKDC가 시험한 스캐폴드 구성들 각각에서 증식하고 있음을 나타낸다. 신장 전사 인자 Pax-2의 발현은 또한 배양 기간 전체에 걸쳐 양성이었다. 데스모좀(desmosome) 및 접착 연접의 구성요소로서의 카드헤린은 세포-세포 접촉에 연루되며, 이의 발현은 세포 분화에 대한 마커이다. 카드헤린은 세포의 분극에 필수적이며, 따라서 이의 기능성에 필수적이다. 신장에서, N-카드헤린은 근위세뇨관 세포에 의해 발현되며, 반면에 E-카드헤린은 원위세뇨관 세포에서 우세하다. IHC 결과는 모든 스캐폴드 구성에서 hKDC에 의한 N-카드헤린에 대한 강한 면역염색을 나타낸다. 이와는 대조적으로, E-카드헤린에 대한 면역염색은, 극도로 약하게 염색된 약간의 영역이 관찰되었지만, 대체로 부재하였다.
아쿠아포린은 세포막을 통한 수분의 수송을 촉매하며, 따라서 신장의 기능성에 매우 중요하다. 아쿠아포린 1은 근위 신장 세포에 의해 발현되며, 반면에 아쿠아포린 2는 원위세뇨관 세포에서 우세하다. 아쿠아포린 1 발현은 2주 및 3주의 배양 후 검출될 수 있으며, 반면에 아쿠아포린 2 발현은 관찰되지 않았다. 영역들에 있어서, 아쿠아포린-1의 염색은 입방 세포의 첨부 상에만 있는 것으로 관찰되었으며 (도 9 참조), 이는 세포의 주로 근위의 분화를 또한 나타내는 것이다. 원위세뇨관 세포에 의해 발현되는 수송자인 소듐 글루코스 동시수송자 1(sodium glucose co-transporter 1; SGLT-1)의 IHC를 또한 분석하였지만, 마커 발현은 샘플들 중 어떠한 것에서도 관찰할 수 없었다.
이 실시예는 hKDC가 근위세뇨관 세포로 분화될 수 있고, 이 분화는 세포가 그 위에 접종되는 기재의 조성에 의존적임을 입증한다. 평면형 천연 세포외(즉, 탈세포화된) 매트릭스는 hKDC 상피 형태 및 분화와 관련하여 표준 트랜스웰 배양 뿐만 아니라 콜라겐, SIS/콜라겐 스캐폴드도 능가하였다. 전형적으로, 형질전환되지 않은 근위세뇨관 세포 (예를 들어 일차 세포)는 일단 융합이 도달되면, 계속하여 성장할 것이며, 이는 트랜스웰과 같은 합성 평면형 표면 상에서의 3차원 응집체의 형성으로 이어진다. 천연 탈세포화 스캐폴드, 예를 들어 SIS 상에의 접종은 세포가 분화되어 상피 단층을 형성하게 하는데, 상기 단층은 전통적인 방법을 통하여 생성된 것보다 더 안정하다.
실시예 2: 탈세포화된 스캐폴드 상에의 hKDC의 세포 접종 농도의 최적화
실시예 1은, 콜라겐을 포함하지 않는 2차원 탈세포화 스캐폴드 상에 접종된 세포가 3주의 배양 후 근위세뇨관 마커를 발현하는 융합성 상피 단층을 형성함을 입증하였다. 하기 실험을 행하여 세포 접종 밀도를 최적화하고, 상기 단층의 형성에 필요한 배양 기간을 감소시키려고 시도하였다.
스캐폴드는 실시예 1에 설명한 바와 같이 소장 점막하 조직(SIS)의 세그먼트들을 탈세포화함으로써 제조하였다. 계대 4의 hKDC를 3가지의 상이한 농도(1 × 104개, 5 × 104개, 및 1 × 105개의 세포/웰)로 SIS 스캐폴드 상에 접종하고, REGM™ 신장 상피 성장 배지 (미국 워커스빌 소재의 론자)를 이용하여 3주 동안 배양하였다. 샘플들을 2주 및 3주 후 조직학적 분석을 위하여 꺼내고, 보우인 고정제로 1시간 동안 고정시켰다. 그 후, 상기 샘플들을 물 중에서 4시간 이상 동안 세척하고, 파라핀 내에 매립시켰다. 후속적으로, 3 ㎛ 두께의 슬라이스들을 제조하였다. 슬라이스들을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하여 세포 형태를 평가하였다. 게다가, 실시예 1에서와 같이 면역조직화학적(IHC) 검사를 수행하여 세포의 분화를 특성 확인하였다. 첫째, 3 ㎛의 횡단면들을 탈파라핀화하였다. 표적 검색을 프로테이나아제 K를 이용한 효소 처리에 의해, 또는 pH 6의 시트르산 완충제 (다코, #S2369) 중에서 가열함에 의해, 또는 pH 9의 트리스/EDTA 완충제 (다코, #S2367) 중에서 가열함에 의해 성취하였다. 3% 하이드로겐 퍼옥시다아제를 이용한 차단 단계를 엔도겐(endogen) 퍼옥시다아제의 차단을 위하여 포함시켰다. 그 후, 일차 항체를 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 엔비전™ 검출 시스템 퍼옥시다아제/DAB 토끼/생쥐 (다코, #K5007)를 이용하여 이를 검출하였다. 슬라이스들을 헤마톡실린으로 대조염색하였다.
렉틴 염색을 수행하여 세포 분화를 추가로 평가하였다. 상기에 설명한 바와 같이, 3 ㎛ 횡단면들을 탈파라핀화하고, 하이드로겐 퍼옥시다아제로 차단시켰다. 그 후, 로투스 테트라고노볼루스 렉틴 (바이오졸(Biozol), #B-1325) 또는 돌리코스 비플로루스 응집소 (바이오졸, #B1035) 중 어느 하나인 바이오티닐화 렉틴들을 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 스트렙타비딘 (바이오제넥스(Biogenex), #LP000-ULE)으로 표지하고, 아미노에틸 카르바졸 색원체(aminoethyl carbazole chromogen; AEC) (바이오제넥스, #HK129-5KE)를 첨가하여 검출하였다. 슬라이스들을 헤마톡실린으로 대조염색하였다.
H&E 염색 결과에 의하면, 2주의 배양 후, 조사한 접종 밀도들 중 어떠한 것도 100% 융합도에 도달하지 못했음이 나타났다. 그러나, 3주의 배양 후, 모든 밀도로 접종한 세포는 거의 융합성인 단층을 형성하였으며, 세포의 1/3 위치보다 아래쪽에 핵이 위치하는 전형적인 입방 상피 형태를 나타내는 영역을 가졌다. 더 높은 밀도로 접종된 세포도 거의 융합성이었지만, 세포의 형태는 덜 균일하였으며, 외관 면에서 상피와 같지 않았다 (도 10 참조).
면역조직화학적 결과를 하기 표 2에 요약한다. 더욱 낮은 접종 밀도의 3주 샘플의 IHC에 의하면 근위세뇨관 마커들 AQP-1 (40-50%) 및 N-카드헤린 (대략 90%)의 발현이 검출되었으며, 반면에 원위 마커들은 발현되지 않거나 (AQP-2 및 SGLT-1) 또는 단지 매우 약하게 발현되었다 (E-카드헤린). 또한, PAX-2 발현이 샘플 전체에 걸쳐 검출되었으며, 밀착 연접 마커인 클라우딘-2(Claudin-2)가 샘플의 몇몇 영역에서 검출되었다. 증식의 마커인 Ki67은 상기 단층이 완전히 융합성인 것은 아닌 영역에서만 검출되었다. 중요하게는, 기저막 단백질인 제IV형 콜라겐의 기저외측 염색이 샘플의 많은 영역에서 관찰되었다. 제IV형 콜라겐의 발현은 세포가 스캐폴드를 리모델링하고 있고 새로운 기저막을 침적시키고 있음을 나타내는 것이었다.
바이오티닐화 렉틴들, 근위세뇨관 세포의 마커인 로투스 테트라고노불루스 렉틴(LTL), 및 원위세뇨관 세포의 마커인 돌리코스 비플로루스 응집소(DBA)를 이용한 더욱 낮은 접종 밀도의 3주 샘플의 염색은 또한 대부분의 상기 세포가 근위세뇨관 세포로 분화됨을 나타냈다. LTL의 발현은 샘플의 많은 영역에서 관찰되었으며, 반면에 DBA의 발현은 희박하고 약하였다 (도 10 참조).
이 실시예는 세포의 분화 정도가 접종 밀도에 의존적임을 입증한다. 그러나, 예기치 않게도, 보통 추정되는 것과는 대조적으로, 더욱 낮은 접종 밀도가 더욱 큰 분화 정도로 이어졌다.
1 × 104개의 세포/웰로 접종된 샘플을 항-인간 제IV형 콜라겐 항체 (다코, #M0785)를 사용하여, 상기에 설명된 바와 같이, 면역조직 화학적 검사에 의해 제IV형 콜라겐의 발현에 대하여 또한 분석하였다. 도 11에 나타낸 결과는 세포의 기저외측 표면 상에서의 제IV형 콜라겐의 양성 염색을 입증하며, 이는 상기 세포가 탈세포화된 천연 스캐폴드 상에서 세포외 매트릭스 성분들을 활발하게 분비하고 있음을 나타내고; 온전한 단층이 트랜스웰과 같은 합성 스캐폴드보다 생리학적으로 더 연관성이 있는 탈세포화된 천연 스캐폴드 상에서 발달할 수 있음을 입증하는 것이다. 또한, 이것은 세포 접종 밀도가 세포 분화 및 단층 형성에 대하여 직접적으로 영향을 줌을 시사한다.
[표 2]
Figure pct00002
실시예 3: p-당단백질-1의 면역조직화학
스캐폴드는 실시예 1에 설명한 바와 같이 소장 점막하 조직(SIS)의 세그먼트들을 탈세포화함으로써 제조하였다. 계대 4의 hKDC를 5 × 104개의 세포/스케폴드로 SIS 스캐폴드 상에 접종하고, REGM™ 신장 상피 성장 배지 (미국 워커스빌 소재의 론자)를 이용하여 3주 동안 배양하였다. 샘플들을 3주 후 조직학적 분석을 위하여 꺼내고, 보우인 고정제로 1시간 동안 고정시켰다. 그 후, 상기 샘플들을 물 중에서 4시간 이상 동안 세척하고, 파라핀 내에 매립시켰다. 후속적으로, 3 ㎛ 두께의 슬라이스들을 제조하였다. 면역조직화학적(IHC) 검사를 수행하여, 근위세뇨관 세포에 의해 발현되는 배출 수송자인 p-당단백질-1 (pgp-1 aka MDR1)의 발현을 확인하였다. 탈파라핀화된 섹션들의 표적 검색을 프로테이나아제 K를 이용한 효소 처리에 의해, pH 6의 시트르산 완충제 (다코, #S2369) 중에서 가열함에 의해, 또는 pH 9의 트리스/EDTA 완충제 (다코, #S2367) 중에서 가열함에 의해 성취하였다. 3% 하이드로겐 퍼옥시다아제를 이용한 차단 단계를 엔도겐 퍼옥시다아제의 차단을 위하여 포함시켰다. 그 후, 일차 항-인간 pgp-1 (바이오제넥스, #AM-391-5M)을 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 엔비전™ 검출 시스템 퍼옥시다아제/DAB 토끼/생쥐 (다코, #K5007)를 이용하여 이를 검출하였다. 슬라이스들을 헤마톡실린으로 대조염색하였다.
결과는 세포 단층의 첨부 막 상에서의 pgp-1에 대하여 양성 염색을 나타냈는데 (도 13 참조), 이는 근위세뇨관 세포의 기능성 마커의 발현을 확인해 주는 것이고, 추가로, 설명된 스캐폴드 및 접종 방법이 hKDC의 기능성 근위세뇨관 세포로의 분화를 가능하게 함을 나타내는 것이었다.
실시예 4: 탈세포화된 스캐폴드 상에 접종된 hKDC에 의한 알부민 흡수
스캐폴드는 실시예 1에 설명한 바와 같이 소장 점막하 조직(SIS)의 세그먼트들을 탈세포화함으로써 제조하였다. 계대 4의 hKDC를 5 × 104개의 세포/스케폴드로 SIS 스캐폴드 상에 접종하고, REGM™신장 상피 성장 배지 (미국 워커스빌 소재의 론자)를 이용하여 3주 동안 배양하였다. 알부민 흡수를 평가하기 위하여, 세포-접종된 샘플들을 먼저 무혈청 배지 (REBM 기본 배지, 미국 워커스빌 소재의 론자) 중에서 1시간 동안 예비 인큐베이션하였다. 그 후, 상기 배지를 200 ㎍/ml의 형광 표지된 소 혈청 알부민(BSA-FITC) (시그마(Sigma), #A9771)을 함유하는 REBM 기본 배지로 교환하고, 30 내지 60분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 샘플들을 PBS로 세척하고, Dapi(다이아미디노-2-페닐인돌)로 대조염색하고, 형광 현미경에서 영상화하였다.
결과는, 세포가 근위세뇨관 세포의 기능인 BSA-FITC의 흡수를 할 수 있음을 나타냈다 (도 14 참조). 이들 결과는 탈세포화된 스캐폴드 상에 접종된 hKDC가 신장 근위세뇨관 분화의 마커를 발현할 뿐만 아니라 근위세뇨관 상피 세포로서도 기능함을 입증하였다.
하기 실시예 5 내지 실시예 9는 본 발명의 스캐폴드의 특성들을 추가로 설명하기 위하여 설계된 가공 실시예이다. 기능 분석, 예를 들어 BSA-FITC 흡수를 이용하여 신장 수송 기능의 회복에 대한 치료 화합물의 유효성 뿐만 아니라 세포 상해 또는 신독성도 평가할 수 있다.
실시예 5: 탈세포화된 스캐폴드 상에 접종된 hKDC에 의한 유기 음이온 수송
이 실시예는 형광 염료, 예를 들어 로다민, 루시퍼 옐로우, 또는 카르복시플루오레세인의 수송을 분석함으로써, 배출 수송자인 pgp-1 뿐만 아니라 유기 음이온 수송자(organic anion transporter; OAT)의 기능도 시험한다. 세포 내로의 수송은 다양한 유기 음이온 수송자(OAT)에 의해 매개된다. pgp-1 수송자가 베라파밀에 의해 저해될 때, 적용된 염료, 예를 들어 로다민은 세포 외부로 수송되는 것이 중단되며, 이는 세포 형광을 증가시킨다.
스캐폴드는 실시예 1에 설명한 바와 같이 소장 점막하 조직(SIS)의 세그먼트들을 탈세포화함으로써 제조할 것이다. 계대 4의 hKDC를 5 × 104개의 세포/스케폴드로 SIS 스캐폴드 상에 접종하고, REGM™ 신장 상피 성장 배지 (미국 워커스빌 소재의 론자)를 이용하여 3주 동안 배양할 것이다. 그 후, 상부 구획 내의 배지를 다양한 농도의 로다민, 루시퍼 옐로우 또는 카르복시플루오레세인 염료를 함유하는 페놀-레드 무함유 배지와 교환할 것이다. 또한 일부 웰을 둘 모두의 구획에서 다양한 농도의 베라파밀과 함께 예비 인큐베이션한 후, 형광 염료를 함유하는 (배지 중에 추가의 베라파밀을 포함하는 그리고 이를 포함하지 않는) 배지를 상기 상부 구획에 첨가할 것이다. 그 후, 웰을 30 내지 120분 동안 인큐베이션할 것이다. 그 후, 샘플들을 PBS로 세척하고, 고정하고, Dapi로 대조염색하고, 형광 현미경에서 영상화할 것이다. 게다가, 배지의 샘플들을 형광 염료의 존재의 정량적 분석을 위하여 취할 것이다.
실시예 6: 유동식 생물 반응기 내의 탈세포화된 스캐폴드 상에의 hKDC (미세혈관 내피 세포를 포함하거나 또는 포함하지 않음)의 접종 및 분화
생물 반응기 시스템을 상기에 설명한 바와 같이 제조할 것이다. 스캐폴드를 생물 반응기(100)의 상부 몸체 요소(110)와 하부 몸체 요소(120) 사이에 위치시키고, 셀 크라운에 비견되는 장력으로 고정시킨다 (도 15 참조). 생물 반응기 내에 위치된 스캐폴드 상의 장력은 변경될 수 있으며, 실험을 행하여 세포의 단층의 형성 및 후속적인 분화에 가장 적절한 장력 범위를 결정할 것이다. 스캐폴드의 한 면에 hKDC를 접종하고, 이어서 적절한 유착 기간이 뒤따를 것이다 (유동 없음). 그 후, 스캐폴드의 다른 한 면에 내피 세포를 접종할 수 있다. 대조군으로서, 세포 유형들 중 단지 하나를 포함하는 생물 반응기가 또한 있을 것이다. 그 후, 적절한 기간의 세포 유착 후 생물 반응기 챔버를 관류시킬 것이다. 유량을 신장 상태로 조정하여 분화 및 상피 단층 형성을 촉진할 것이다. 단층의 형성 및 완전성을 형광 FITC-이눌린의 누출의 측정에 의해서 뿐만 아니라 상피-횡단 전기 저항(trans-epithelial electric resistance; TEER)의 주기적 측정에 의해서도 모니터링할 것이다. 둘 모두의 세포 유형을 사용하는 경우, 유동 조건을 상피 및 내피 세포 단층 둘 모두의 유지에 적절한 것으로 조정할 것이다. TEER 및 이눌린 모니터링에 더하여, 샘플을 1주, 2주 및 3주 후에 고정할 것이다. 상피 형태 및 단층 형성을 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 평가할 것이다.
실시예 7: SIS 스캐폴드 상에 접종하고 유동식 생물 반응기 내에서 배양한 hKDC (미세혈관 내피 세포를 포함하거나 또는 포함하지 않음)에 의한 글루코스의 기능적 수송 및 다른 용질의 재흡수
이 실시예는 세포-접종된 막을 가로지르는 하나의 배지 구획으로부터의 다른 배지 구획으로의 글루코스 및 다른 용질의 능동 수송을 분석함으로써 유동식 생물 반응기 내에서 SIS 스캐폴드 상에 접종될 때 hKDC가 근위세뇨관 상피 세포로 기능적으로 분화하는 것을 입증한다.
SIS 스캐폴드를 실시예 1에 설명한 바와 같이 제조할 것이다. 통상적인 방법에 따라 단리한 미세혈관 내피 세포(mvEC)를 스캐폴드의 한 면 상에 접종할 것이다. 후속적으로 hKDC를 스캐폴드의 다른 한 면 상에 접종할 것이다. 그 후, 스캐폴드를 배지가 스캐폴드들의 각 면을 가로질러서 유동되게 하는 생물 반응기 챔버 내에 넣고, 배양하여 실시예 6에서와 같이 단층 형성을 허용할 것이다. 단층 형성을 실시예 6에서와 같이 TEER 측정 및 FITC-이눌린 누출에 의해 모니터링할 것이다. 이 시점에서, 각각의 배지 구획은 작은 루프로 봉입되는데, 이는 단지 SIS 스캐폴드 상의 온전한 세포 단층에 의해 분리된다. 글루코스 측정을 위하여, 공지된 농도의 글루코스를 함유하는 배지를 예를 들어 플로리드진과 같은 글루코스 수송 저해제를 첨가하고서 또는 이를 첨가하지 않고서 상이한 배지 구획들에서 사용할 것이다. 배지를 대략 48시간의 기간 동안 성숙 세포 단층을 가로질러서 유동시킬 것이며, 이때 배지 샘플은 비색 분석을 통한 글루코스 농도 측정용으로 주기적으로 꺼낼 것이다. 시간에 따른 글루코스 농도의 변화를 조사하기 위하여 두 구획에서 글루코스 농도를 상이하게 하여 다수의 실험을 행할 것이다. 이들 측정으로부터의 결과를 이용하여 시간과 관련된 세포에 의한 소비에 대비한 글루코스 수송의 상대적인 양을 계산할 것이다. 예를 들어 알부민과 같은, 세포에 의해 수송되거나 또는 흡수되어 분해되는 다른 용질을 이용하여 유사한 실험을 행할 수 있다.
실시예 8: 비타민 D 활성화
비타민 D 활성화는 신장의 근위세뇨관 세포의 특정한 기능이다. 따라서, 이 실시예는 불활성 25-OH-D3 전구체를 그의 활성 1,25-(OH)2D3 형태로 전환시키는 25-(OH)D3-12-하이드록실라아제 효소의 활성을 시험함으로써 비타민 D 활성화에 대하여 시험한다.
비타민 D 활성화를 분석하기 위하여, hKDC를 SIS 상에 접종할 것인데, 상기 SIS는 실시예 1에 설명한 바와 같이 제조할 것이다. 계대 4의 hKDC를 5×104개의 세포/스캐폴드로 SIS 스캐폴드 상에 접종하고, REGM™ 신장 상피 성장 배지 (미국 워커스빌 소재의 론자)를 이용하여 3주 동안 배양할 것이다.
배지를 불활성 25-OH-D3 전구체를 함유하는 배지로 교환할 것이다. 대략 15분 내지 2시간의 인큐베이션 시간 후, 배지를 수집하고, HPLC 분석 또는 ELISA에 의해 전구체 및 활성 1,25-(OH)2D3 형태 둘 모두의 양에 대하여 분석할 것이다. 인큐베이션 시간은 인큐베이션 배지 및 인큐베이션 온도에 따라 달라질 수 있다. 상기 전환을 추가로 부갑상선 호르몬의 첨가에 의해 유도하거나, 또는 포스페이트 첨가에 의해 저해할 수 있다.
실시예 9: 신독성 시험 및 약물 발견 응용을 위한 hKDC / SIS 신장 근위세뇨관 시스템
이 실시예에서, hKDC/SIS 신장 근위세뇨관 모델 시스템에 대하여 특정 신독성 물질 (예를 들어, 시스플라틴, 빈블라스틴) 또는 신보호 시약의 영향을 가할 것이다. 이를 행하기 위하여, hKDC를 정적 조건 및/또는 유동 조건 하에서 SIS 상에 접종하고, 성장시켜 근위세뇨관 상피의 단층으로 분화시킬 것이다. 그 후, 다양한 신독성 물질을 hKDC/SIS 시스템에 적용할 것이고, 세포 생존성, 형태 및 근위세뇨관 기능성을 평가할 것이다. 신장 기능 파라미터는 예를 들어 용질 수송, TEER, 이눌린 누출, 알부민 흡수, 비타민 D 합성, 에리트로포이에틴 및 프로스타글란딘 생성을 포함한다. 게다가, hKDC 근위세뇨관 시스템을 다양한 신보호 및 다른 세포보호 시약의 영향을 검출하는 그의 능력에 대하여 시험할 것이다.
실시예 10: 인간 신장-유래된 세포의 단리
정상 인간 신장을 미국 국립 질병 연구 상호교환(National Disease Research Interchange; NDRI, 미국 펜실베이니아주 필라델피아 소재)으로부터 획득하였다. 각각의 신장을 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagles medium) (DMEM-저 글루코스, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐) 또는 인산염 완충 염수 (PBS, 인비트로겐)에서 세척하여 혈액 및 잔사를 제거하였다. 조직을 신장의 외부 피질 영역, 내부 수질 영역, 및 피막하 영역으로부터 절개하였다. 그 후, 상기 조직들을 조직이 미세한 펄프로 다져질 때까지 조직 배양 플레이트에서 기계적으로 해리시켰다. 그 후, 상기 조직을 50 밀리리터 코니칼 튜브로 옮겼다. 그 후, 0.25 단위의 PZ 활성/밀리리터의 콜라게나아제 (NB6, N0002779, 독일 하이델베르크 소재의 세르바 일렉트로포레시스 게엠베하(Serva Electrophoresis GmbH)), 2.5 단위/밀리리터의 디스파아제 (디스파아제 II 165 859, 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 로셰 다이아그노스틱스 코포레이션(Roche Diagnositics Corporation)), 1 단위/밀리리터의 하이알루로니다아제 (비트라아제(Vitrase), 미국 캘리포니아주 어바인 소재의 아이에스티에이 파마슈티칼스(ISTA Pharmaceuticals))를 함유하는 우수 제조 기준(good manufacturing practice; GMP) 효소 혼합물 또는 500 단위/밀리리터의 콜라게나아제 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마), 50 단위/밀리리터의 디스파아제 (인비트로겐) 및 5 단위/밀리리터의 하이알루로니다아제 (시그마)를 함유하는 비-GMP 등급 효소 혼합물에서 상기 조직을 소화시켰다. 또한 신장-유래된 세포를 50 단위/밀리리터의 디스파아제를 이용하여 단리하였다. 상기 효소 혼합물을 신장 상피 성장 배지(REGM) (미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 캄브렉스) 또는 중간엽 줄기 세포 성장 배지(mesenchymal stem cell growth medium; MSCGM) (캄브렉스)와 조합하였다. 상기 조직, 배지 및 소화 효소를 포함하는 코니칼 튜브를 37℃에서 오비탈(orbital) 진탕기에서 225 rpm에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
상기 소화물을 150 × g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 흡인하였다. 생성된 세포 펠렛을 20 밀리리터의 REGM 또는 MSCGM에 재현탁시켰다. 상기 세포 현탁물을 40 마이크로미터의 나일론 BD 팔콘(FALCON) 세포 스트레이너(strainer) (미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 비디 바이오사이언시즈)를 통하여 여과하였다. 상기 여과물을 배지 (총 부피: 50 밀리리터) 중에 재현탁시키고, 150 × g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 흡인하고, 세포 펠렛을 50 밀리리터의 신선한 배양 배지에 재현탁시켰다. 이 과정을 2회 더 반복하였다.
최종 원심분리 후, 상청액을 흡인하고, 세포 펠렛을 5 밀리리터의 신선한 배양 배지에 재현탁시켰다. 생존가능한 세포의 수를 구아바(Guava) 기기 (미국 캘리포니아주 헤이워드 소재의 구아바 테크놀로지즈(Guava Technologies))를 사용하여 결정하였다. 그 후, 세포를 5000개의 세포/㎠의 접종 밀도로 2% 젤라틴 또는 라미닌 코팅된 조직 배양 플라스크에 도말하고, 낮은 산소 (저산소) 또는 정상 (산소 정상 상태) 분위기에서 배양하였다. 표 1은 신장-유래된 세포의 집단의 단리에 사용한 성장 조건 및 공여체 정보를 나타낸다. 신장 세포의 단일-세포 유래된 클론을 수득하기 위하여, 제한 희석 기술을 수행하였다. 전체로서, 세포를 39세, 46세, 21세 및 10세의 4명의 상이한 시신 공여자로부터 24가지의 상이한 조건을 이용하여 단리하였다.
실시예 11: 인간 신장-유래된 세포의 형태
단리한지 7일 후, 신장-유래된 세포 집단을 광학 현미경법으로 평가하고, 세포의 형태적 특성을 관찰하였다. 일관되게, 모든 단리 조건은 상피 형태를 갖는 세포가 생기게 하였다. (표 11-1 참조).
[표 11-1]
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
이 데이터는 신장-유래된 세포가 임의의 연령 또는 성별의 공여체로부터 단리될 수 있으며, 이외에도 다양한 성장 배지 제형 또는 배양 조건을 이용하여 단리될 수 있음을 예시한다. 단리 절차의 용이함 및 일관성은 신장-유래된 세포가 세포-기반 치료법에서 사용하기 위한 세포의 가치있는 공급원임을 나타낸다.
실시예 12: 신장-유래된 세포의 성장 잠재력
신장-유래된 세포를 배양 중 광범위하게 번식시킬 수 있으며, 상기 세포는 짧은 시간 내에 상당한 수의 세포를 생성할 수 있다. 이는 동종 이계 세포 치료법의 개발 기준이다.
신장-유래된 세포를 5,000개의 세포/㎠로 T75 플라스크 상에, REGM 또는 MSCGM 중에 도말하고, 5% 이산화탄소에서 37℃에서 배양하였다. 세포를 2-5일마다 계대하였다. 각각의 계대에서, 세포를 계수하고, 생존성을 구아바 기기 (미국 캘리포니아주 헤이워드 소재의 구아바 테크놀로지즈)를 사용하여 측정하였다. 세포 집단을 노쇠기에 도달할 때까지 수주 동안 계속하여 계대하였다. 세포가 연구 시간 간격 동안 1배 초과의 집단 배가를 성취하지 못할 때 노쇠기를 결정하였다. 그 후, 집단 배가 [ln(최종 세포 수율/도말된 초기 세포수)/ln2]를 계산하였다.
핵형 분석에 있어서, 단리물 22 및 23으로부터의 계대 4 및 계대 10의 신장-유래된 세포를 T25 플라스크 내에 도말하고, 하룻밤 부착시켰다. 그 후, 플라스크를 REGM으로 충전시키고, 핵형 분석을 수행하였다.
표 12-1은 시험한 단리물에 있어서의 성장 데이터의 요약이다. 세포 단리에 사용한 효소, 조직 공급원 또는 공여체 연령과 관련하여 세포 성장 특성에 대한 현저한 영향은 없었다.
핵형 분석을 계대 4 및 계대 10의 단리물 22 및 23에서 수행하였다. 이들 둘 모두는 계대 4 및 계대 10에서 정상 핵형을 보여 주었다.
[표 12-1]
Figure pct00006
평균적으로, 노쇠기에서의 집단 배가 (PD)는 28.5인 반면, 평균 생존성은 97.6%였다.
요약하면, 신장-유래된 세포는 배양 중 강한 성장 잠재력을 갖는다. 이들 데이터를 사용하여 하나의 전체 인간 신장으로부터 생성한 세포의 총수를 개산할 수 있다. 신장 조직 전부를 프로세싱하고, 생성된 세포를 31의 집단 배가를 위하여 배양할 경우, 하나의 전체 인간 신장은 1.89 × 1016개의 전체 세포의 개산치를 생성할 것이다. 따라서, 세포의 1회 치료 용량이 사람당 1 × 108개의 세포라고 간주하면, 단일한 신장으로부터 단리된 신장-유래된 세포는 1억 8,900만명의 환자를 치료하기에 충분할 것이다. 궁극적으로, 이들 세포는 동종 이계-기반의 세포 치료법에서 사용하기 위한 고도로 확장가능한 세포 공급원이다.
실시예 13: hKDC 표면 마커 표현형
유세포 분석법적 분석을 인간 신장-유래된 세포에서 수행하여 표면 마커 표현형을 결정하였다. 실시예 11에서의 단리물들 중 9가지로부터의 세포를 REGM 중에서, T75 플라스크에서, 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 계대 4 및 계대 10까지 확장시켰다. 유착성 세포를 PBS에서 세척하고, 트립엘이 셀렉트(TrypLE Select) (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 깁코(Gibco))를 이용하여 떼어냈다. 세포를 수확하고, 원심분리하고, PBS 중 3% (v/v) FBS에서 2 × 105개의 세포/밀리리터의 농도로 재현탁시켰다. 특이적 항체를 100 마이크로리터의 세포 현탁물에 첨가하고, 상기 혼합물을 암소에서 4℃에서 30-45분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 세척하고, 원심분리하여 여분의 항체를 제거하였다. 세포를 500 마이크로리터의 PBS에 재현탁시키고, 유세포 분석법으로 분석하였다. 유세포 분석법적 분석을 구아바 기기 (미국 캘리포니아주 헤이워드 소재의 구아바 테크놀로지즈)를 이용하여 수행하였다. 표면 마커 표현형의 특성 확인에 사용한 항체를 표 13-1에 나타낸다.
[표 13-1]
Figure pct00007
표 13-2는 모든 표면 마커 표현형 데이터의 요약을 나타낸다. 시험한 모든 단리물은 CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD166, SSEA-4 및 HLA I에 대하여 양성 염색을 나타내고, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141, E-카드헤린 및 HLA II에 대하여 음성 염색을 나타냈다. 게다가, 분석한 모든 단리물을 다수의 세대 동안 (계대 10) 확장시켰으며, 이는 여전히 그의 표면 마커 표현형을 유지하였다.
이들 세포는 HLA I을 발현하지만, HLA II, CD80 또는 CD86은 발현하지 않는다. 이러한 세포 발현 특성은 세포가 숙주 면역계를 회피하는 능력을 반영한다. 이들 데이터는 신장-유래된 세포가 비-면역원성이며, 조직형 분석 또는 면역억제에 대한 필요성 없이 환자에게 투여될 수 있음을 입증한다.
요약하면, 이들 데이터는 다수의 공여체로부터의 신장-유래된 세포가 다양한 조건 하에서 단리될 수 있으며 (표 11-1 참조), 여전히 그의 표면 마커 표현형을 유지할 수 있음을 입증한다. 게다가, 상기 세포는 추정 선구체 마커, 예를 들어 CD24 및 SSEA-4를 발현하지만, 성숙, 계통-결정 마커, 예를 들어 E-카드헤린은 발현하지 않는다. 마지막으로, 신장-유래된 세포는 비-면역원성이며, 따라서 동종 이계 세포 치료법에서 사용하기에 매력적인 세포 공급원이다.
[표 13-2]
Figure pct00008
실시예 14: 신장-유래된 세포의 유전자 발현
RNA를 RNA 추출 키트 (알엔이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit); 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 단리물 1, 2 및 17-23으로부터의 세포로부터 추출하였다. RNA를 50 마이크로리터의 DEPC 처리수로 용출시키고, -80℃에서 보관하였다. RNA를 탁맨(TaqMan) 역전사 시약 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))을 이용하여 랜덤 헥사머를 사용하여 25℃, 10분; 37℃, 60분; 및 95℃, 10분으로 역전사시켰다. 샘플들을 -20℃에서 보관하였다. 표 14-1에 기재된 프라이머들을 사용하여, 선택된 유전자들을 통상적인 PCR(폴리머라아제 연쇄 반응)에 의해 조사하였다. PCR을 RT2 PCR 프라이머 세트들 (미국 메릴랜드주 프레더릭 소재의 수퍼어레이 바이오사이언시즈 코포레이션(SuperArray Biosciences Corp))을 사용하여 cDNA 샘플에서 수행하였다.
[표 14-1]
Figure pct00009
프라이머들을 제조업자의 지시에 따라 1 마이크로리터의 cDNA 및 2X 리액션레디(ReactionReady)™ SYBR 그린(Green) PCR 마스터 믹스(Master Mix) (수퍼어레이 바이오사이언시즈)와 혼합하고, PCR을 에이비아이 프리즘(ABI Prism) 7000 시스템 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈)을 사용하여 수행하였다. 서멀 사이클(thermal cycle) 조건은 처음에 50℃, 2 min 및 95℃, 10 min; 이어서 95℃, 15 sec의 34 사이클 및 60℃, 1 min이었다. GAPDH의 경우, PCR은 제조업자의 지시에 따라 어플라이드 바이오시스템즈로부터의 GAPDH 프라이머 (카탈로그 번호: 402869), 1 마이크로리터의 cDNA 용액 및 1X 암플리탁 골드(AmpliTaq Gold) 범용 믹스 PCR 반응 완충제 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 수행하였다. 최종 PCR 반응물 중 프라이머 농도는 정방향 및 역방향 프라이머 둘 모두의 경우 0.5 마이크로몰랄이었으며, 탁맨 프로브를 첨가하지 않았다. 샘플들을 2% (w/v) 아가로스 겔 상에서 진행시키고, 에티듐 브로마이드 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)로 염색하였다. 영상을 667 유니버셜 트윈팩(Universal Twinpack) 필름 (미국 뉴저지주 사우스 플레인필드 소재의 브이더블유알 인터내셔널(VWR International)) 및 초점-길이 폴라로이드(Polaroid)™ 카메라 (미국 뉴저지주 사우스 플레인필드 소재의 브이더블유알 인터내셔널)를 사용하여 캡쳐(capture)하였다. 분석한 각각의 유전자에 있어서, 최종 PCR 생성물을 겔로부터 잘라내고, 표적 서열을 DNA 서열결정에 의해 확인하였다.
RT-PCR 분석
분석한 모든 세포 단리물은 일정하고 안정한 유전자 발현 프로파일을 나타냈다. RT-PCR 분석을 단리물 1, 2, 및 17-23에서 수행하여 초기 발생 유전자 마커 (Oct-4, Rex-1, Sox2, FGF4, hTert), 신장 발생 유전자 마커 (Pax-2, WT-1, Eya-1, Wnt-4, BMP-7, 카드헤린-11, FoxD1), 후신 중간엽 유전자 마커 (Pax-2, Eya-1, WT-1, Six2, 및 FoxD1), 및 후신 중간엽의 생존을 촉진하는 유전자 (BMP-7)의 발현을 검출하였다. 게다가, 신장 질환 치료에서 치료 가치를 갖거나 또는 신장 복구를 촉진하는 유전자 마커 (Epo, EpoR, BMP-7, BMP-2, GDF5) 뿐만 아니라 다른 발생 유전자, 예를 들어 내배엽 유전자 (HNF3B, CXC-R4, Sox-17, GATA-4)의 발현도 분석하였다.
표 14-2에 나타낸 바와 같이, 모든 단리물은 Oct-4 및 Rex-1에 대하여 양성 발현을 나타내며, Sox2, FGF4, hTERT 및 Wnt-4에 대하여 음성 발현을 나타냈다. 단리물 17-23은 Pax-2, WT1, 카드헤린-11 및 FoxD1에 대하여 양성 발현을 나타냈다. 단리물 22 및 23은 Eya-1, Sox-17 및 CXCR-4에 대하여 양성 발현을 나타내며 GATA-4에 대하여 음성 발현을 나타냈다. 단리물 17-23은 EpoR을 발현하였지만, Epo를 발현하지 않았다. 단리물 17-22는 BMP-2, BMP-7 및 GDF5를 발현하였다. 게다가, 모든 단리물을 다수의 세대로 확장시킬 수 있으며 (계대 10), 이는 여전히 그의 유전자 발현 표현형을 유지할 수 있다.
[표 14-2]
Figure pct00010
요약하면, 신장-유래된 세포는 초기 발생 및 신장 발생에 연루된 유전자를 발현한다. 상기 세포는 후신 중간엽에 대한 마커 및 신장 선구 세포에 대한 마커를 발현한다. 상기 세포는 신장 복구 및 관형성(tubulogenesis)에 연루된 인자 뿐만 아니라 내배엽 마커도 발현한다.
전체로서, 이들 데이터는 신장-유래된 세포가 손상된 신장 조직의 보호 또는 복구를 위한 세포-기반 치료법에 사용될 수 있는 잠정적 신장 선구 세포의 공급원임을 입증한다.
실시예 15: 영양 인자 분비 분석
신장-유래된 세포는 신장을 보호 및 복구하는 영양 인자를 일관되게 생성하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이들 세포는 신장 질환 치료용 치료제로서의 역할을 할 수 있다.
단리물 17-21로부터의 계대 3의 세포를 단리물당 하나의 T75 플라스크 내에 5,000개의 세포/㎠로 접종하였는데, 상기 플라스크 각각은 15 밀리리터의 REGM을 함유하였다. 세포를 37℃에서 5% 이산화탄소에서 배양하였다. 하룻밤 배양 후, 배지를 무혈청 배지 (DMEM-저 글루코스 (깁코), 0.1% (w/v) 소 혈청 알부민 (시그마), 페니실린 (50 단위/밀리리터) 및 스트렙토마이신 (50 마이크로그램/밀리리터) (깁코))로 교환하고, 8시간 동안 추가로 배양하였다. 무혈청 조절 배지를 인큐베이션 마지막에 14,000 × g에서 5분 동안 원심분리함으로써 수집하고, -20℃에서 보관하였다.
세포를 PBS로 세척하고, 4 밀리리터의 트립엘이 셀렉트 (깁코)를 사용하여 떼어내고, 구아바 기기 (미국 캘리포니아주 헤이워드 소재의 구아바 테크놀로지즈)를 이용하여 계수하여 각각의 플라스크 내의 세포의 수를 개산하였다. 그 후, 서치라이트 프로테옴 어레이즈(SearchLight Proteome Arrays; 피어스 바이오테크놀로지 인크.(Pierce Biotechnology Inc))를 사용하여, 샘플들을 하기 영양 인자에 대하여 ELISA로 분석하였다: 메탈로프로테이나아제-1(TIMP-1)의 조직 저해제, 메탈로프로테이나아제-2(TIMP-2)의 조직 저해제, 혈소판-유래된 상피 성장 인자 bb(PDGF-bb), 케라틴 세포 성장 인자(KGF), 간세포 성장 인자(HGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(FGF2), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 헤파린-결합 표피 성장 인자(HB-EGF), 단구 주화성 단백질-1(MCP-1), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-8(IL-8), 형질전환 성장 인자 알파(TGFα), 뇌-유래된 신경영양 인자(BDNF), 기질(stromal)-유래된 인자 1b(SDF1b), 모양체 신경영양 인자(CNTF), 염기성 신경 성장 인자(b-NGF), 뉴로트로핀-3 (NT-3), 성장-관련된 발암 유전자-알파(GRO-α), 인터류킨-1b(IL-1b), 인터류킨-12p40(IL-12p40), 인터류킨-12p70(IL-12p70), 인터류킨-11(IL-11), 인터류킨-15(IL-15), 매트릭스 메탈로프로테이나아제-2(MMP-2), 매트릭스 메탈로프로테이나아제-9(MMP-9), 안지오포이에틴-2(ANG-2) 및 인간 성장 호르몬(HGH).
영양 인자 생성의 분석
27가지의 상이한 성장 인자들 및 사이토카인의 분비를 단리물 17-21에서 분석하였다. 결과를 표 15-1에 요약한다. 모든 단리물은 TIMP-1, TIMP-2, VEGF, 및 MMP-2를 300 피코그램 초과/밀리리터/1×106개의 세포/8시간으로 분비하였다. 상기 단리물들은 50-300 피코그램/밀리리터/1×106개의 세포/8시간의 FGF2 및 HGF와, 1-50 피코그램/밀리리터/1×106개의 세포/8시간의 KGF, PDGF-bb, b-NGF, IL-12p40 및 IL-11을 분비하였다. SDF-1, ANG-2, HGH 및 Il-12p70은 검출되지 않았다.
요약하면, 이 데이터는 신장-유래된 세포가 손상된 신장 조직의 보호 및 복구를 위하여 몇몇 영양 인자를 분비함을 나타낸다. 예를 들어, FGF2, HGF, 및 TGFα가 신장 복구에 연루되었다. 신장-유래된 세포는 상승된 그리고 일관된 수준으로 이들 인자를 분비한다. 따라서, 이들 세포는 신장 질환을 목표로 하는 치료법에서 사용하기에 가치있는 세포 공급원이다.
[표 15-1]
Figure pct00011
실시예 16: 시험관 내에서의 신장-유래된 세포의 관형성
계대 4 및 계대 10의 신장-유래된 세포를 해동시키고, 그 후 66%의 비트로겐(vitrogen) 100 (3 밀리그램/밀리리터) (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 코헤전 테크놀로지즈(Cohesion))을 함유하는 제I형 콜라겐 용액 중 4 × 104개의 세포/밀리리터의 단일 세포 현탁물로 미분화할 수 있다. 현탁물 형태의 세포를 탈세포화된 장막 막 상에 도말할 수 있다. 그 후, 콜라겐/세포 혼합물을 37℃, 5% CO2, 95% 공기에서 30분 동안 인큐베이션하여 콜라겐을 겔화시킬 수 있고, 그 후 배양 배지를 첨가한다. 세포를 7일 동안 3일마다 공급한다. 7일에, 배양물을 다양한 농도의 간세포 성장 인자로 처리하고, 관형성이 관찰될 때까지 추가로 배양한다.
이들 관찰은 신장-유래된 세포가 시험관 내에서 세뇨관 구조로 자기-조직화될 수 있음을 입증한다. 이들 구조는 약물 스크리닝 및 독물학적 분석법의 개발 뿐만 아니라 신장 재건 응용에 있어서도 빌딩 블록으로서의 가치를 갖는다.
실시예 17: 생체 내에서의 신장-유래된 세포의 관형성
3개의 35/65의 PCL/PGA (10 ㎝ 직경 × 2 ㎜ 두께) 필름에 인간 신장-유래된 세포 (10,000개의 세포/㎠)를 접종하고, 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 8일 동안 REGM (캄브렉스) 중에서 배양하였다. 35/65의 PCL/PGA 폼 스캐폴드를 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제6,355,699호에 설명된 방법에 따라 제조하였다. 그 후, 세포/필름 제작물을 필름-캐스팅 디쉬로부터 꺼내고, 3층으로 적층시키고, 35/65의 PCL/PGA 폼 스캐폴드 지지체에 적용하였다. 그 후, 이 제작물을 추가로 24시간 동안 배양하고, 그 후 3 × 3 ㎜ 정사각형 조각으로 절단한 후 이식하였다. 그 후, 임플란트들을 PBS로 세척하고, 수송을 위하여 PBS를 충전시킨 6웰 플레이트로 옮겼다.
SCID 생쥐의 배외측 흉요추 영역(dorsal lateral thoracic-lumbar region) 내에 양방향으로 임플란트들을 피하 이식하였다. 수컷 SCID 생쥐 (폭스 체이스(Fox Chase) SCID CB17SC 주)를 타코닉 인크.(Taconic Inc., 미국 뉴욕주 허드슨 소재)로부터 구매하였으며, 이는 5주령이었다. 2개의 임플란트를 각각의 SCID 생쥐 내에 두었다. 길이가 각각 대략 5 ㎜인 2개의 피부 절개부를 생쥐의 등에 만들었다. 상기 절개부들을, 촉진된 장골릉으로부터 두개쪽으로 약 5 ㎜에 있는 요추 영역 위에 가로로 두었으며, 이때 하나는 정중선의 어느 한 쪽에 두었다. 그 후, 피부를 하부 결합 조직으로부터 분리하여 작은 포켓을 만들고, 임플란트를 절개부로부터 두개쪽으로 약 10 ㎜에 두었다. 피부 절개부를 리플렉스(Reflex) 7 금속 창상용 클립으로 닫았다. 3주 후, 임플란트들을 상기 피하 포켓으로부터 꺼내고, 10% 포르말린에서 고정시키고, 파라핀 왁스에 매립시키고, 박편화하고, 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하고, 광학 현미경 기술을 이용하여 병리학자가 평가하였다.
신장-유래된 세포는 PCL/ PGA 필름의 층들 내에서 세뇨관-유사 구조를 형성하였다. 이들 세뇨관은 특유한 상피 벽 및 명백한 관강을 나타냈다. 신장-유래된 세포는 폼 스캐폴드를 침윤하였으며, 세포외 매트릭스에 침적하였고, 조밀한 조직-유사 구조를 형성하였다. 게다가, 폼 내의 신장-유래된 세포는 혈관신생 및 혈관 네트워크의 형성을 자극하였다.
요약하면, 인간 신장-특이적 세포는 생체 내 미세환경에의 노출 후 세뇨관 구조를 형성하였다. 신장-유래된 세포가 미세환경 신호에 응답하는 능력 및 상기 세포가 세뇨관을 형성하도록 지시하는 능력은 이들 세포의 신장 선구체 성질을 추가로 예시한다. 게다가, 상기 세포는 폼 스캐폴드 내로 이동하여, 혈관 신생을 촉진하는 조직-유사 구조를 형성하였다. 이 데이터는 신장 세뇨관의 재건을 위한 그리고 궁극적으로는 신장 조직 엔지니어링 응용에서 사용하기 위한 세포 빌딩 블록으로서의 신장-유래된 세포의 유용성을 예시한다.
본 발명을 다양한 특정한 재료, 절차 및 실시예를 참고로 하여 본 명세서에서 설명하고 예시하였지만, 본 발명은 이 목적용으로 선택된 재료 및 절차의 특정한 조합에 제한되지 않음이 이해된다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 이러한 상세 사항에 대한 다양한 변화가 암시될 수 있다. 본 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 간주되는 것으로 의도되며, 이때 본 발명의 실제 범주 및 사상은 하기 특허청구범위에 의해 나타난다. 본 출원에서 언급되는 모든 참고 문헌, 특허 및 특허 출원은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

Claims (21)

  1. 생체 인공 근위세뇨관 기구로서, 상기 기구는 하나 이상의 전구 세포를 신장 근위세뇨관 상피 세포들로 분화시키기에 충분한 조건들 하에 상기 전구 세포가 접종된 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드를 포함하며, 상기 분화된 세포들은 상기 스캐폴드 상에 상피 단층을 형성하는, 생체 인공 근위세뇨관 기구.
  2. 생체 인공 근위세뇨관 기구로서, 상기 기구는 2개 이상의 표면들을 갖는 탈세포화된 생물학적 스캐폴드를 포함하며, 적어도 하나의 표면은 하나 이상의 전구 세포를 신장 근위세뇨관 상피 세포들로 분화시키기에 충분한 조건들 하에 상기 전구 세포가 접종되고, 상기 세포들은 상기 스캐폴드의 상기 표면 상에 상피 단층을 형성하는, 생체 인공 근위세뇨관 기구.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 포유류 조직으로부터 유래되는, 생체 인공 근위세뇨관 기구.
  4. 제3항에 있어서, 상기 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 점막 조직 또는 점막하 조직으로부터 유래되는, 생체 인공 근위세뇨관 기구.
  5. 제3항에 있어서, 상기 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 포유류 소화관으로부터 유래되는, 생체 인공 근위세뇨관 기구.
  6. 제5항에 있어서, 상기 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 포유류의 위, 십이지장, 공장, 회장 또는 결장으로부터 유래되는, 생체 인공 근위세뇨관 기구.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 전구 세포는 일차 신장 세뇨관 상피 세포들, 신장 세포들 또는 신장 선구 세포들로 분화되는 유도 전능성 줄기 세포들, 신장 세포들 또는 신장 선구 세포들로 분화되는 선구 세포들, 신장으로부터 단리된 줄기 세포들 또는 신장으로부터 단리된 선구 세포들, 및 이들의 혼합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 생체 인공 근위세뇨관 기구.
  8. 제7항에 있어서, 상기 선구 세포들은 인간 신장-유래된 세포들인, 생체 인공 근위세뇨관 기구.
  9. 제8항에 있어서, 상기 인간 신장-유래된 세포들은 배양 중 자기-재생 및 확장이 가능하며, Oct-4, Rex-1, Pax -2, 카드헤린(Cadherin)-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox- 17, EpoR, BMP2, BMP7 또는 GDF5 중 적어도 하나의 발현에 대하여 양성이고; Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2, E-카드헤린 또는 GATA-4 중 적어도 하나의 발현에 대하여 음성인, 생체 인공 근위세뇨관 기구.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 인간 신장-유래된 세포들은 세포 표면 마커들 HLA-I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166 또는 SSEA-4 중 적어도 하나에 대하여 양성이며; 세포 표면 마커들 HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138 및 CD141 중 적어도 하나에 대하여 음성인, 생체 인공 근위세뇨관 기구.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 신장-유래된 세포들은 영양 인자들 FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 또는 VEGF 중 적어도 하나를 분비하며; 영양 인자들 PDGF-bb 또는 IL12p70 중 적어도 하나를 분비하지 않는, 생체 인공 근위세뇨관 기구.
  12. 제8항에 있어서, 상기 인간 신장-유래된 세포들은 배양 중 자기-재생 및 확장이 가능하며, HLA-I의 발현 및 Oct-4, Rex-1, Pax-2, 카드헤린-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox- 17, EpoR, BMP2, BMP7 또는 GDF5 중 적어도 하나의 발현에 대하여 양성이고; CD 133의 발현 및 Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2, E-카드헤린 또는 GATA-4 중 적어도 하나의 발현에 대하여 음성인, 생체 인공 근위세뇨관 기구.
  13. 하나 이상의 전구 세포를 신장 세포들로 분화시키는 방법으로서, 상기 방법은 하나 이상의 전구 세포를 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드에 접종하는 단계 및 상기 전구 세포를 신장 근위세뇨관 상피 세포들로 분화시키기에 충분한 조건들 하에 상기 스캐폴드 상에서 상기 세포들을 배양하는 단계를 포함하며, 상기 분화된 세포들은 상기 스캐폴드 상에 상피 단층을 형성하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 포유류 조직으로부터 유래되는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 점막 조직 또는 점막하 조직으로부터 유래되는, 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 탈세포화된 생물학적 매트릭스 스캐폴드는 포유류의 위, 십이지장, 공장, 회장 또는 결장으로부터 유래되는, 방법.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 전구 세포는 일차 신장 세뇨관 상피 세포들, 신장 세포들 또는 신장 선구 세포들로 분화되는 유도 전능성 줄기 세포들, 신장 세포들 또는 신장 선구 세포들로 분화되는 선구 세포들, 신장으로부터 단리된 줄기 세포들 또는 신장으로부터 단리된 선구 세포들, 및 이들의 혼합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 선구 세포들은 인간 신장-유래된 세포들인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 인간 신장-유래된 세포들은 배양 중 자기-재생 및 확장이 가능하며, Oct-4, Rex-1, Pax -2, 카드헤린-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox- 17, EpoR, BMP2, BMP7 또는 GDF5 중 적어도 하나의 발현에 대하여 양성이고; Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2, E-카드헤린 또는 GATA-4 중 적어도 하나의 발현에 대하여 음성인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 인간 신장-유래된 세포들은 세포 표면 마커들 HLA-I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD 166 또는 SSEA-4 중 적어도 하나에 대하여 양성이며; 세포 표면 마커들 HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138 및 CD141 중 적어도 하나에 대하여 음성인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 인간 신장-유래된 세포들은 영양 인자들 FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 또는 VEGF 중 적어도 하나를 분비하며; 영양 인자들 PDGF-bb 또는 IL12p70 중 적어도 하나를 분비하지 않는, 방법.
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