KR20050044507A - 장기 기능의 확장 - Google Patents

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KR20050044507A
KR20050044507A KR1020047007513A KR20047007513A KR20050044507A KR 20050044507 A KR20050044507 A KR 20050044507A KR 1020047007513 A KR1020047007513 A KR 1020047007513A KR 20047007513 A KR20047007513 A KR 20047007513A KR 20050044507 A KR20050044507 A KR 20050044507A
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안토니 아탈라
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칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션
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Abstract

본 발명은 조직-특이적 또는 비분화 세포를 매트릭스 재료(예를 들어, 웨이퍼, 스폰지, 하이드로젤)에 접종함으로서 생성된 소규모의 매트릭스 이식을 사용한 조직 기능을 확장하는 방법 및 조성물을 제공한다. 접종된 매트릭스 조성물은 이때 이식될 수 있고 생체내 장기을 확장하는 조직으로 발달될 것이다. 이식된 매트릭스의 접종된 세포의 계속된 성장 및 분화는 조직의 초기 혈관계를 형성하게 된다. 초기 혈관계는 이때 성숙된 혈관계로 발달되고, 또한 추가로 배양된 세포 군락의 성장 및 발달을 지지할 수 있다. 접종된 매트릭스 시스템은 생체내 다양한 상이한 세포 및 조직으로 유도하는데 사용될 수 있다.

Description

장기 기능의 확장 {AUGMENTATION OF ORGAN FUNCTION}
발명의 배경
본 발명의 기술적 분야는 배양된 세포 군락의 이식에 의한 장기 기능의 확장이다. 전형적으로, 어떤 장기 기능의 상당한 비율이 상실되어야 환자가 완전한 장기 부전을 겪을 수 있다. 예를 들어, 신장 기능이 90 내지 95 퍼센트 만큼 많이 상실되어야 신부전이 자명하게 될 수 있다. 이것은 빠른 자기-소생의 굉장한 능력을 증명한다(참조 문헌[Cuppage et al., (1969) Lab.Invest. 21:449-459; Humes et al.,(1989) J.Clin.Invest. 84:1757-1761; and Witzgall et al.(1994) J.Clin.Invest. 93:2175-2188]). 이러한 재생 능력때문에 신장이 수일 또는 수주일내에 정상 기능을 회복하게 한다.
정상 신장의 기능 및 능력의 파괴는 감염, 순환 장애(쇼크), 혈관계 막힘, 사구체신염, 소변 흐름의 방해, 쇼크와 관련된 신부전, 패혈증, 수술후 합병증, 또는 약물, 특히 항생제과 같은 기작의 과다에 기인한다. 이러한 이유의 대부분은 감소된 신장 기능 용량으로 이끈다.
일부의 이러한 병의 치료는 전형적으로 투석을 수반하는데, 이는 혈관계 또는 이식으로부터의 노폐물 및 화합물을 제거한다. 투석은 대부분의 환자에게 상당한 불편을 초래한다. 통상 치료 요법은 환자가 투석기에 붙어있는 동안의 장기간을 수반한다. 투석과정은 또한 일주일 동안 여러번 반복된다. 많은 경우에, 환자는 부작용을 경험하는데, 예를들어, 환자의 신체상 유체에서 빠른 변화와 관련한 근육경련 및 저혈압이 있다.
신장이식에서 주요한 위험은 알맞은 조직적합성 일치의 경우에 조차 신장 거부반응이 있다. 사이클로스포린 및 FK506과 같은 면역억제제가 통상 거부반응을 방지하기 위해 환자에게 주입된다. 그러나, 면역억제제는 적합한 면역억제 및 독성 사이에서 좁은 치료 범위를 가진다. 연장된 면역억제제는 면역계를 약화할 수 있고, 감염 전개의 위협으로 이끌 수 있다. 일부 예에서, 면역억제 조차도 신장 거부반응을 방지하기 충분하지 않다.
이러한 문제점들을 피하기 위한 시도로, 환자 자신의 신장 세포가 시험관에서 배양되는 다양한 방법이 보고되었다. 예를 들어, Humes에서 발행된 미국 특허 제 5,429,938호는 배양한 신장 세포를 사용한 세뇨관을 재구성하는 방법을 기술하였다. 재구성된 세뇨관은 환자에게 이식될 수 있다.
노톤(Naughton)등은 스트로마 세포가 중합체 지지 시스템(참조: 미국 특허 제 5,863,531)에 놓인 것 및 유조직세포가 스트로마 매트릭스에서 배양된 3차원 조직 배양 시스템을 개시하였다. 바칸티(Vacanti)등은 또한 생분해성 중합체로 제조된 3차원 매트릭스에서 세포 배양 방법을 개시하였다. 상기 방법은 지지구조를 전체 장기의 요망되는 형태로 모양을 만드는 것에 의존하고 이런 인공 장기이 대체물로서 체강에 이식될 수 있다. 그러나, 장기의 단지 일부가 손상되었기 때문에 전체 장기를 대체할 필요가 없는 많은 상황이 있다.
따라서, 성장 또는 전체 장기의 대체를 필요로 하지 않는 방법으로 장기 기능을 확장하는 보다 좋은 방법과 조성물에 대한 필요가 존재한다. 천연 장기의 구조를 의태하는 보다 작고, 단순한 구조를 사용할 필요가 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 조직-특이적 또는 비분화된 세포를 매트릭스 재료(예를 들어, 웨이퍼, 스폰지, 하이드로젤)에 접종함으로써 생성된 소규모 매트릭스 임플란트를 사용하여 장기 기능을 확장하는 방법 및 조성물을 제공한다. 접종한 매트릭스 조성물은 이때 상기 세포가 구조를 확장한 신형태(neomorphic) 장기로 발달할 수 있는 조직층을 생성하도록 성장시킨 3차원 생체매트릭스를 형성시키도록 배양될 수 있다. 한번 이식되면, 3차원 생체매트릭스가 장기의 하나 또는 그 이상의 표적 지점에서 발달하고 증식하여 그 지점에서 장기 기능을 확장한다.
본 발명은 부분적으로 접종된 소형-매트릭스는 추가적인 세포 군락의 활발한 증식을 지지하는 발견에 기초한다. 이는 부분적으로 새로운 세포의 활발한 증식의 연장된 기간을 허용하는 매트릭스 구조의 증가된 표면적에 기인할 수 있다. 연장된 증식은 세포가 구조를 확장하는 신형태 장기로 발달하게 하고, 그 구조 자체가 유닛을 확장하는 장기로 발달할 수 있거나, 구조를 확장하는 장기로 발달하는 다른 세포 군락의 성장 및 발달에 대한 지지체를 제공할 수 있다. 추가적으로, 매트릭스는 생체내 조건을 의태하는 공간적인 분배를 가능하게 하고, 그래서 세포의 성숙 및 이동에 도움이 되는 미세환경의 형성을 가능하게 한다. 이는 세포 상호작용이 일어날 수 있도록 정확한 공간적인 거리를 제공한다. 이런 매트릭스의 존재하에서 세포의 성장은 단백질, 당단백질, 글라이코스아미노글리칸 및 세포 매트릭스를 첨가함으로써 추가적으로 증가될 수 있다.
본 발명의 한 관점에서, 인공 장기 구조물은 매트릭스 재료를 배양된 세포의 하나 이상의 군락으로 관류시켜서, 상기 세포가 매트릭스 재료에 부착되어 장기 기능을 확장시켜 예를 들어 심장, 신장, 간장, 췌장, 비장, 방광, 수뇨관 또는 요도와 같은 장기를 확장할 수 있는 조직층을 생성하도록 형성된 3차원 생체매트릭스를 포함하는 장기의 기능을 확장하기 위해 개시되었다.
상기 구조물은 세포를 소형-매트릭스 재료, 예를 들어 탈세포화된 조직, 하이드로젤 또는 합성 또는 천연 중합체에 세포를 접종함으로써 형성될 수 있다. 바람직하게, 상기 매트릭스는 "소형-매트릭스"로, 약 50 밀리미터 미만의 최대 크기이다. 바람직한 한 구체예에서, 매트릭스는 5:1 초과의 최대 크기 대 두께의 비율을 가진 실질적으로 평평한 구조이다.
본 발명의 또 다른 관점에서, 확장된 장기 구조는 신장 세포의 군락으로 매트릭스 재료를 관류시켜서 상기 신장 세포가 매트릭스에 부착되고 네프론 구조 또는 네프론의 일부 구조로 분화되는 조직층을 생성하여, 신장 기능을 확장하도록 형성된 3차원 생체매트릭스를 포함하는 신장 기능 확장 구조이다.
본 발명의 또 다른 관점에서, 매트릭스는 초기에 내피 세포의 군락으로 관류되어서, 상기 내피 세포가 매트릭스 재료에 부착되어 혈관계를 포함하는 내피 조직층을 생성하며, 그 후에 세포의 제 2 군락으로 접종하고, 상기 제 2 세포 군락이 혈관계를 포함하는 내피 조직층에 부착되고 분화되어 장기 기능을 확장한다.
한 관점에서, 본 발명은 전체 장기를 교체하거나, 전체 장기를 재구성하는 것 없이 장기 기능을 확장시키도록 이끌어 진다. 예를 들어, 신장 기능을 확장하기 위하여, 작은 생체검사로 신장을 취할 수 있고 신장 세포가 이때 시험관에서 팽창된다. 손상된 세포를 제거하여 세포를 분류한 후에, 정상 세포가 매트릭스(예를 들어, EGA 웨이퍼, 스폰지, 하이드로젤)에서 배양될 수 있다. 매트릭스는 이때 상기 세포가 신형태 장기 구조로 분화될 수 있는 신장 조직층을 생성할 때까지 배양되어 생체매트릭스를 생성한다. 생체매트릭스는 이때 신장내에 요망되는 위치든지, 요도 근처의 요망되는 위치(예를 들어, 수뇨관 또는 방광에 가까운 위치)중 한 곳으로 환자에게 이식된다.
모든 신장세포 타입이 분리될 수 있고, 예를 들어 근세뇨관, 사구체, 말단세관 및 수집관이 있다. 상기 세포는 별개 또는 함께 접종될 수 있다. 상기 세포가 함께 접종될 때, 세포의 상이한 타입을 순차적으로 매트릭스에 접종하는 것이 바람직할 수 있고, 또한 다른 예에서, 다양한 세포 타입이 함께 접종될 수 있다. 세포 혼합물은 이식된 후 수 주일이 지나서 신장 조직으로 재생성된다. 본 발명의 한 구체예에서, 신장 세포는 중합체 재료, 예를 들어 에틸 글리콜 아세테이트(EGA) 또는 탈세포화된 조직의 웨이퍼에 놓인다. 웨이퍼가 국부 영역으로 이식하기에 적합한 어떤 형태로 놓일 수 있는데, 예를 들어 감길 수 있고 평평할 수 있다. 한 구체예에서, 웨이퍼가 장기, 예를 들면 신장의 한 지점에 놓일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 많은 웨이퍼가 장기의 다른 지점에 놓일 수 있다. 바람직한 한 예에서, 매트릭스가 보다 이식의 용이함을 위해 소형화된다. 많은 응용예에서, 소형-매트릭스는 최대 크기가 50 밀리미터 이하, 바람직하게 25 밀리미터 이하, 및 매우 바람직하게 10 밀리미터 이하의 크기를 가지는 것이 바람직하다. 예를 들어, 중합 웨이퍼는 약 2-5 mm, 바람직하게 약 2-3 mm의 크기를 가질 수 있다. 웨이퍼는 바람직하게 웨이퍼에서 세포간 및 상기 환경에서 세포간에 일어나는 혈관분포를 허용하기에 충분하도록 얇다. 한 구체예에서, 매트릭스는 성장인자, 예를 들어 VEGF로 처리될 수 있다.
시험관에서 성장하는 동안, 세포는 발달하고 매트릭스 재료를 덮는 조직층을 생성한다. 조직층은 구조가 확장된 신형태 장기 및 추가적으로 배양된 세포 군락의 성장 및 발달을 지지한다. 한 구체예에서, 상기 조직층은 신장 세포로부터 유래할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 조직층은 발달하여 초기 혈관계를 생산하는 내피 세포로부터 유래할 수 있다. 이러한 초기 혈관계는 계속해서 성장하고 발달하여, 추가적으로 다른 실질(parenchyma) 세포의 성장을 지지한다.
한 구체예에서, 확장 표적은 심장, 신장, 간장, 췌장, 비장, 방광, 수뇨관 및 요도로 구성된 군으로부터 선택된 장기이다. 또 다른 구체예에서, 확장 표적은 심장, 신장, 간장, 췌장, 비장, 방광, 수뇨관 및 요도로 구성된 군으로부터 선택된 장기의 일부이다. 바람직한 구체예에서, 표적 장기는 신장이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 세포의 군락을 매트릭스 재료에 접종하여 형성된 생체매트릭스를 이식하여서, 상기 세포가 매트릭스에 부착하고 초기 혈관계를 포함하고, 신형태 장기 구조로 분화할 수 있는 원형-조직을 생성하도록 생체 매트릭스를 이식하고; 장기 질환의 조절에 대해 피검자를 모니터링하는 것을 포함하는 매트릭스에 부착하는 장기 질환을 가진 피검자를 치료하는 방법을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포의 군락을 매트릭스 재료에 접종하여서, 상기 세포가 매트릭스에 부착하여 초기 혈관계를 포함하고 신형태 장기 구조로 분화할 수 있는 조직을 생성하도록 형성된 매트릭스를 포함하는 인공 장기 구조물을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 조직-특이성 또는 비분화 세포를 매트릭스 재료, 예를 들어 웨이퍼, 스폰지, 하이드로젤과 같은 곳에 접종하여 상기 세포가 부착되고 상기 세포가 조직 구조를 생산할 때까지 매트릭스 내부 또는 표면에서 세포를 배양하고, 생체내 장기 확장을 위한 표적 지점에 접종 매트릭스를 이식하는 것을 포함하는 인공 신장 구조물을 재구성하는 방법을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포의 군락을 매트릭스에 접종하여서 상기 세포가 매트릭스에 부착되어서 신형태 신장 구조로 분화될 수 있는 초기 혈관계를 포함하는 조직을 생성하도록 형성된 매트릭스; 및 신장 질환에 조절을 위한 피검자의 모니터링을 포함하는 신장 질환을 가진 피검자를 치료하는 방법을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포의 군락을 매트릭스 재료에 접종하여서 상기 세포가 매트릭스에 부착되어 신형태 장기 구조로 분화할 수 있는 초기 혈관계를 포함하는 원형-조직을 생성하도록 형성된 매트릭스를 포함하는 인공 신장 구조물을 특징으로 한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 생체매트릭스를 사용한 신장의 확장을 보여주는 골격도이다.
상세한 설명
본 발명의 실행은 달리 언급된 바가 없다면, 당해 기술 내에서 미생물학, 분자생물학 및 재조합 DNA 기술의 전통적인 방법을 이용한다. 그와 같은 기술은 다음 문헌에 충분히 설명된다.[참조: 예를 들어 Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Current Edition); DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I & II(D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis(N. Gait, ed. Current Edition); Nucleic Acid Hybridization(B.Hames & S.Higgins, eds., Current Edition); Transcription and Translation(B.Hames & S.Higgins, eds., Current Edition); CRC Handbook of Parvoviruses, Vol.I & II(P.Tijessen, ed.); Fundamental Virology, 2nd Edition, Vol. I & II (B.N. Fields and D. M. Knipe, eds.)]. 본 발명은 또한 조직 공학 문헌에서 언급하는 기술들을 사용한다(참조: 예를 들어 문헌[Principles of Tissue Engineering by Lanza et al (Current Edition)]). 본 발명은 보다 쉽게 이해되도록, 특정 용어는 처음으로 정의된다:
본원에서 사용된 "장기 기능을 확장시키다" 또는 "장기의 기능을 확장시키다"의 어구는 최적의 능력 미만으로 작동하는 장기의 기능을 증가, 강화, 향상시키는 것을 의미한다. 상기 용어는 장기가 해당 피검자를 위해 생리학적으로 수용될 수 있는 능력으로 작동하도록 기능이 획득됨을 의미하는데 사용된다. 예를 들어 유아로부터의 장기, 예를 들어, 신장 또는 심장에 대한 생리학적으로 수용할 수 있는 능력은 성인 또는 노환자의 생리학적으로 수용할 수 있는 능력과 다를 것이다. 전체 장기, 또는 장기의 일부가 확장될 수 있다. 바람직하게 상기 확장에 의해 장기가 천연의 장기와 같이 동일한 생리학적 반응을 가지게 된다. 바람직한 구체예에서, 본래 능력의 10% 이상으로 기능을 할 때 장기가 능력면에서 확장된다.
"3차원 생체매트릭스" 또는 "확장 구조물" 또는 "신형태 장기 확장 구조"는 본원에서 사용되는 바와 같이 세포로 관류되고 상기 세포가 조직층을 형성할 때까지 배양되는 소형-매트릭스를 의미한다. 조직층은 단일층 또는 다중층일 수 있다. 조직-특이성 세포는 확장을 필요로 하는 특정 장기로부터 유래된 세포, 예를 들어, 장기 확장을 위한 신장으로부터 유래된 세포, 및 심장 확장을 위한 심장으로부터 유래된 세포를 의미한다. 3차원 생체매트릭스에서 상기 세포는 "유사-조직" 조직학을 형성하고 조직 유사 구조를 재생하고 결과적으로 실제 장기 또는 장기의 일부로 발달할 수 있는 복잡한 다중층 구조를 가진 초기 기관체(organoid)로 발달한다. 3차원 생체매트릭스는 인공 장기 또는 장기의 일부로서 천연 장기의 "기능적 동등물", 즉 천연 장기와 같이 동일 또는 유사한 방법으로 행동하는 것을 말하고, 예를 들어 인공 신장은 생체 신장과 동일한 기능적 특성을 가진다. 예를 들어 신장 확장 구조물은 네프론 구조 또는 네프론 구조의 일부로 발달할 수 있는 조직의 층을 가진 것일 수 있다. 신장 확장에 대해서, 조직-특이성 세포는 원세관 세포, 근세관세포, 사구체 세포, 보우만 주머니 세포 및 헨레 세포의 고리로 구성된 군으로부터 선택된 세포의 분리된 군락일 수 있다. 대안적으로, 조직 특이적 세포는 원세관, 근세관세포, 사구체 세포, 보우만 주머니 세포 및 헨레 세포의 고리를 포함하는 세포의 혼합된 군락일 수 있다. 특정 질병 또는 질환을 다루는 다양한 3차원 생체매트릭스가 제조될 수 있다. 예를 들어, 3차원 생체매트릭스는 매트릭스 재료를 관류하는데 사용한 사구체 세포의 동질성 군락을 사용하여 사구체와 관련한 질환을 개선할수 있도록 특이하게 제조될 수 있다. 대안적으로 3차원 생체매트릭스는 신장세포의 혼합된 군락을 사용하여 제조된 일반적인 구조물일 수 있다.
3차원 생체매트릭스가 장기에서 표적 지점의 숙주 조직에 접촉될 때, 표적 지점내에서 성장 및 증식할 수 있고 그 지점에서 장기의 결여된 활성을 보충하거나 확장시킬 수 있다. 확장 구조는 장기의 한 지점에 추가될 수 있다. 대안적으로, 복수의 확장 구조는 제조되어 장기의 여러 지점에 첨가될 수 있다.
본원에서 사용된 "신장 세포" 어구는 신장의 어떤 영역으로부터 유래된 세포, 예를 들어 원세관 세포, 근세관세포, 사구체 세포, 보우만 주머니 세포 또는 헨레 세포의 고리의 세포를 말한다. 상기 용어는 신장으로부터의 모든 세포를 포함하는 세포의 혼합물을 의미하는데 사용될 수 있다. 또한 상기 용어는 네프론의 영역, 예를 들어 단지 사구체 세포의 단일한 군락으로부터의 세포의 분리된 부-군락을 의미하는데 사용된다. 신장으로부터의 세포는 피검자로부터 생검을 하여 얻을 수 있다. 세포 분류 기술은 질병에 걸린 세포로부터 건강한 세포를 분리하는데 사용될 수 있다. 세포 분류 기술은 또한 세포의 부-군락을 분리하는데 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 "네프론 구조"의 용어는 노폐물 및 혈액으로부터 과다물질을 제거하여 오줌을 생성하는 신장의 전체적인 기능적 단위을 말한다. 각 신장에서 약 100만 네프론 각각이 1.2-2.2 인치의 세관(30-55 mm)이다. 한쪽 끝에서 닫히고, 팽창하여, "보우만 주머니"라 부르는 2중벽의 컵같은 구조로 접혀서, "사구체"라 불리는 모세혈관 덩어리를 둘러싼다. 혈액으로부터 강제로 사구체의 모세혈관 벽을 통해 보우만 주머니로 흐르는 유체가 인접한 신장 세관으로 흐르고, 그 곳에서 물과 영양성분이 선택적으로 유체로부터 다시 혈액으로 재흡수되고, 이온 예를 들어 나트륨 및 칼륨이온이 헨레 고리 및 근세관에서 균형을 이룬다. 최종 농축 생산물은 오줌으로 집합관에 모인다.
본원에서 사용된 "네프론 구조의 일부"라는 용어는 네프론의 어떤 구역을 말한다. 예를 들어, 세포군락은 분류되어 사구체 세포만의 분리된 군락을 생산할 수 있다. 이러한 사구체 세포의 분리된 군락은 소형-매트릭스 재료에 접종하는데 사용되고 사구체로 분화하는 사구체 조직층을 가진 3차원 소형-생체매트릭스 생산하도록 배양될 수 있다. 동일한 방법학은 예를 들어 원세관영역과 같이 네프론의 일부로 분화될, 네프론의 다른 영역으로부터 유래된 특정 세포로 된 3차원 소형-생체매트릭스를 제조하는데 응용될 수 있다. 네프론의 특정 영역과 관련된 다른 신장 질환은 세관 세포와 관련된 병변를 포함한다.
본원에서 사용된 "표적 지점"은 확장을 필요로 하는 장기에서 영역을 말한다. 표적 지점은 장기에서 단일한 영역 또는 장기에서 여러 영역일 수 있다. 전체 장기 또는 장기의 일부가 확장될 수 있다. 바람직하게 상기 확장에 의해 장기가 정상 장기와 같이 동일한 생리학적 반응을 가지게 된다. 전체의 장기는 전체 장기를 따라, 예를 들어 신장의 전체 종단면을 따라 적합한 거리에 복수의 생체매트릭스를 놓음으로써 확장될 수 있다. 대안적으로, 장기의 일부는 장기의 하나의 표적 지점, 예를 들어 신장의 윗부분에 하나 이상의 생체매트릭스를 놓음으로써 확장될 수 있다.
본원에서 사용된 "부착" 또는 "부착하다"의 용어는 매트릭스에 직접 고착된 세포 또는 세포 자체가 다른 세포에 부착된 세포를 말한다.
본원에서 사용된 "소형-매트릭스 재료"의 어구는 세포가 부착하도록 하는 지지 골격을 말한다. 바람직하게, "소형-매트릭스"는 약 50 mm미만의 최대 크기를 가진다. 바람직한 구체예에서, 매트릭스는 최대 크기대 두께의 비율이 5:1 초과인 실질적으로 평평한 구조를 갖는다. 소형-매트릭스 재료는 세포가 그 재료에 또는 그 내부에 부착되도록 하고(또는 세포가 그것에 또는 그 내부에 부착되도록 개질될 수 있음); 세포가 하나 이상의 단일층 또는 하나 이상의 조직층으로 성장시키도록 하는 임의의 재료 및/또는 모양으로 구성된다. 세포의 배양된 군락은 이때 매트릭스에서 또는 매트릭스 내에서 성장된다. 한 구체예에서, 매트릭스 재료는 세포-세포 상호작용에 필요한 요망되는 틈간의 거리를 제공하는 중합체 매트릭스이다. 또 다른 구체예에서, 매트릭스 재료는 전형적으로 불용성 또는 물에 잘 녹지 않는 가교된 중합체 망으로 구성된 하이드로젤이나, 과다한 물의 존재하에서 평형 크기로 팽창할 수 있다. 조절 약물 전달과 같은 영역에서 하이드로젤의 유일한 특성 및 잠재적인 응용예 때문에, 다양한 타입의 하이드로젤이 합성되고 특성화될 수 있다.
소형-매트릭스 재료의 크기는 또한 확장되는 장기의 영역에 따라 다양하다. 상기 크기는 전형적으로 전체 장기보다 작다. 바람직하게, 매트릭스의 부피는 약 1 mm3 내지 장기의 크기의 범위일 수 있다. 매우 바람직하게, 부피의 크기는 약 0.01mm3 내지 약 30mm3, 보다 바람직하게, 0.1 mm3 내지 약 20mm3 , 보다 바람직하게 약 1mm3, 2mm3, 3mm3, 4mm3, 5mm3, 6mm3, 7mm3, 8mm3, 9mm3 및 10mm3의 부피이다. 길거나 평평한 매트릭스는 바람직하게 많은 응용예가 있다. 바람직하게, 매트릭스의 가장 큰 크기의 길이는 0.2mm 초과이고 100mm 미만, 보다 바람직하게 약 0.50 mm 내지 약 30mm의 범위이다. 바람직한 구체예에서, 소형-매트릭스의 모양은 실질적으로 평평하고 최대 크기대 두께의 비율이 5:1 초과, 보다 바람직하게 10:1초과이다.
소형-매트릭스 재료의 모양과 크기는 확장될 장기 및 소형-생체매트릭스를 제조하는데 사용되는 소형-매트릭스의 타입에 기초하여 결정된다. 예를 들어, 중합체 매트릭스가 신장 확장에 사용된다면, 중합체 매트릭스의 크기는 중합체 매트릭스의 너비 및 길이에 따라 다양할 수 있고, 예를 들어, 크기는 약 너비 1mm X 길이 1mm X 높이 1 mm 내지 약 너비 10mm X 길이 20mm X 높이 1 mm이다. 당업자는 중합체 매트릭스의 크기 및 치수는 확장되는 실제 장기 뿐만 아니라, 확장되는 장기의 영역에 기초하여 판단될 것이다.
대안적으로, 매트릭스 재료가 신장을 확장하는데 사용하는 하이드로젤이라면, 이때 하이드로젤의 부피는 신장에서 확장된 영역의 크기에 기초로 판단할 수 있다. 예를 들어, 약 1mm3, 2mm3, 3mm3, 4mm3, 5mm3, 6mm3, 7mm3, 8mm3, 9mm3 및 10mm3의 부피로 세포의 군락이 배양된다. 하이드로젤는 장기에서 하나 이상의 표적 지점으로 주입될 수 있다. 한 구체예에서, 하이드로젤의 부피는 장기 및 확장된 장기의 영역에 기초하여 바뀔 수 있다. 예를 들어, 장기가 심장이고 심장에서 경색의 영역이 확장된다면, 하이드로젤의 부피는 경색의 크기보다 작은 부피 내지 경색의 실제 크기의 부피의 범위일 수 있다.
본원에서 사용된 "생체구조"의 용어는 장기의 일부로부터 세포 및 조직의 전체 내용물을 제거함으로써 탈세포화된 장기의 일부를 말한다.
본원에서 사용된 "탈세포화된" 또는 "탈세포화"의 용어는 세포 및 조직의 내용물이 제거되고 완전한 탈세포적 인프라-구조가 남겨진 생체구조(예를 들어, 장기 또는 장기의 일부)를 말한다. 신장과 같은 장기는 다양한 특수 조직으로 구성된다. 장기 또는 실질의 특수 조직 구조는 장기와 관련된 특이한 기능을 제공한다. 장기의 지지 섬유망은 스트로마이다. 대부분 장기는 특수 조직을 지지하는 비특수 결합 조직으로 구성된 스트로마 골격을 가진다. 탈세포화의 과정은 특수 조직을 제거하고, 결합 조직의 복잡한 3차원망으로 남겨놓는다. 탈세포화 구조는 상이한 세포 군락이 주입된 매트릭스 재료를 제공한다. 탈세포와된 생체구조는 강체이거나, 반강체일 수 있고 모양을 바꿀 수 있는 능력을 가진다. 본 발명에 유용한 탈세포화된 실시예는, 다음에 한정되지는 않지만, 심장, 신장, 간장, 췌장, 비장, 방광, 수뇨관 및 요도를 포함한다.
본원에서 사용된 "3차원 스케폴드"의 어구는 천연 생체구조, 예를 들어 장기가 탈세포화되었을 때 형성된 나머지 인프라-구조를 말한다. 이 복잡한, 3차원 스케폴드는 세포가 이곳에 부착되고 자라도록 하는 지지 골격을 제공한다. 배양된 세포의 군락은 이때 3차원 스케폴드에서 자랄 수 있고, 이 스케폴드가 세포-세포 상호작용에 필요한 정확한 세포간 거리를 제공한다. 이는 천연의 생체내 장기를 닮은 재구성된 장기를 제공한다. 이 3차원 스케폴드는 성숙한 혈관계로 발달될 수 있는 초기 혈관계를 포함하는 내피 조직층을 제공하도록 성장 및 발달하는 배양된 내피 세포의 군락으로 관류된다. 내피 조직층 및 초기 혈관계는 또한 하나 이상의 추가적인 배양 세포 군락의 성장 및 발달을 지지할 수 있다.
본원에서 사용된 "초기 혈관계"의 용어는 조직 구조에 혈액을 공급할 수 있는 혈관을 포함하는 관계의 발달 초기 단계를 말한다
본원에서 사용된 "피검자"의 용어는 면역 반응을 일으킬 수 있는 살아있는 임의 유기체를 말한다. 피검자라는 용어는, 그러나 하게에 한정하지 않고, 인간, 침팬치 및 다른 유인원 및 원숭이종과 같은 비인간 영장류; 소, 양, 돼지, 염소 및 말과 같은 가축; 개 및 고양이 같은 가내 포유동물; 마우스, 래트 및 기니아피그 및 유사종과 같은 설치류를 포함하는 실험용 동물을 포함한다. 상기 용어는 특정 연령 또는 성별을 말하지 않는다. 이와 같이, 태아 뿐만 아니라, 성인 및 신생아는 남성이든지 여성이든지, 이를 모두 포함된다.
I. 세포의 분리 및 배양
세포는 많은 원천, 예를 들어, 생검 또는 부검, 목적하는 장기 세포로 분화되도록 프로그램된 줄기세포 군락, 비면역원성, 이형 세포 및 동형 세포를 부여하도록 캡슐화된 이형유래 세포군락으로부터 분리될 수 있다. 또한 발명의 범위내에 조직 형성을 개선하는 성장인자와 같은 인자로 세포 군락을 트랜스펙션시키는 것을 포함하는 방법이 있다.
분리된 세포는 바람직하게 동형, 자가조직 세포로 피검자로부터 생검에 의해 얻어진다. 예를 들어, 신장은 또한 피검자의 기능장애 신장으로부터 얻거나 시험관에서 배양된다. 생검은 생검침 또는 절차를 빠르고 단순하게 하는 신속 작용 바늘을 사용하여 얻을 수 있다. 생검에 대한 영역은 소량의 리도케인을 피하로 주입하여 국부 마취처리할 수 있다. 장기의 작은 생검 중심, 예를 들어, 문헌에 기술된 바와 같이 신장은 이때 팽창하고 시험관에서 배양된다. 문헌[Atala, et al., (1992) J.Urol.148,658-62; Atala, et al.(19930 J.ural. 150:608-12]. 친척 또는 같은 종의 다른 제공자로부터 세포가 또한 적당한 면역억제로 사용될 수 있다.
세포의 분리 및 배양 방법은 문헌[Fauza et al.(1998) J.Ped.Surg.33, 7-12 및 Frshney,, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, 2d Ed., A.R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch.9, pp.107-126]에서 논의되고 본원에서 참고문헌으로 통합되어 있다. 세포는 당해 기술에서 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 분리될 수 있다. 예를 들어, 조직 또는 장기는 기계적으로 분리시킬 수 있고/있거나 분해 효소 및/또는 이웃 세포간에 연결을 다소의 세포 파괴없이 조직을 개개의 세포의 현탁으로 분산시키는 것이 가능하도록 약화시키는 킬레이트 제제를 처리로 처리할 수 있다. 효소적 해리는 조직을 잘게 썰고 그 조직을 많은 분해효소중 하나 또는 조합으로 처리하는 것이 수반된다. 이것은, 이에 한정하는 것은 아니지만, 트립신, 키모트립신, 콜라겐나아제, 엘라스타아제 및/또는 히알루고니다아제, DNA분해효소, 프로나아제 및 드시파아제를 포함한다. 또한, 기계적 파괴가 사용될수 있고 이는 많은 방법을 수반하는데, 이에 한정하지 않지만, 장기의 표면을 긁기, 그린더, 블랜더, 씨브, 호모제나이저, 세포 압력 또는 인소니케이터의 사용을 포함한다. 세포 분쇄의 기술의 검토는 참고문헌을 참조하라. 문헌[Freshney. (1987), Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2d Ed., A.R.Liss, Inc., New York, Ch.9, pp.107-126].
바람직한 세포 타입은, 이에 한정하지 않지만, 신장세포, 내피세포, 심장세포, 간장세포, 췌장세포, 비장세포, 요로상피 세포, 간엽세포, 평활근 또는 골격근 세포, 근육세포(근줄기 세포), 섬유모세포, 연골세포, 지방세포, 피브로미오블래스트, 및 유연 및 피부 세포를 포함하는 외배엽세포, 헤포토사이트, 섬세포, 내장에 존재하는 세포, 및 다른 실질 세포, 조골세포 및 뼈 또는 연골을 형성하는 다른 세포를 포함한다. 어떤 경우에, 신경세포를 포함하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 신장세포는 분리될 수 있다. 모든 발달 단계, 예를 들어, 태아, 신생아, 청소년 내지 성인과 같은 단계의 신장 세포가 사용될 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 내피 세포가 분리되었다.
조직이 개개의 세포로 현탁되기만 하면, 현탁액은 부군락으로 분별될 수 있고 이로부터 세포 성분요소가 얻어질 수 있다. 이는 또한 세포 분리의 표준 기술을 사용하는 것이 수반될 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니지만, 특정 세포타입의 클로닝 및 선택, 원치 않는 세포의 선택적 파괴(음성 선택), 혼합된 군락에서 분화된 세포의 뭉침을 기초로 한 분리, 동-해 과정, 혼합된 군락에서 세포의 분화된 접착 성질, 여과, 전통적인 띠 원심분리, 원심적 유출(카운터스트리밍의 원심분리), 단위 중력 분리, 향류 분배, 전기영동 및 형광 활성 세포 분류를 포함한다. 클론 선택 및 세포 분리 기술의 검토에 대해서는 문헌을 참고하라. 문헌[Freshney,(1987) Culuture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2d Ed., A.R.Liss, Inc., New York, Ch. 11 및 12, pp. 137-168]. 예를 들어, 신장 세포는 형광-활성 세포 분류로 농축될 수 있다. 또한, 신장 세포의 상이한 영역은 다른 부-군락으로 분류될 수 있다. 예를 들어, 사구체 세포, 보우만 주머니 세포, 원세관 세포, 근세관 세포, 헨레 세포의 고리 및 수집관 세포의 분리된 부-군락이 있다.
세포 분획은 또한 병든 세포로부터 건강한 세포를 분류하는데 바람직한데, 예를 들어, 제공자가 암 또는 종양의 전이가 있는 질병을 가진 때이다. 세포군락은 정상 비암세포와 악성 종양 또는 다른 종양 세포을 분리하는데 분류될 수 있다. 정상 비암세포는, 하나 또는 그 이상의 분류 기술로 분리되어 장기 확장에 사용될 수 있다.
분리된 세포는 시험관에서 배양되어 매트릭스 재료를 코팅할 수 있을 정도의 세포의 숫자를 증가시킬 수 있다. 동형 세포의 사용 및 보다 바람직하게 자가조직 세포는 조직 거부반응을 방지하는데 바람직하다. 그러나, 면역반응이 인공 장기를 이식한 후에 피검자에게 일어난다면 그 피검자는 면역 억제제 예를 들어, 사이클로스포린 또는 FK506로 치료하여 거부반응의 가능성을 줄일 수 있다. 어떤 구체예에서, 키메릭 세포 또는 트랜스제닉 동물은 매트릭스 재료로 코팅될 수 있다. 대안적으로 줄기 세포가 사용될 수 있다.
줄기 세포도 또한 본 발명의 구조를 확장한 신형태 장기를 제조하는데 사용될 수 있다. 줄기 세포는 인간 제공자, 예를 들면, 다능성 조혈 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 성인 신체 줄기 세포 및 그 유사물로부터 유래한다. 줄기 세포는 폴리펩타이드, 재조합 인간 성장 및 성숙 촉진 인자의 조합의 존재에서 배양될 수 있는데, 예를 들면, 사이토카인, 림포카인, 콜로니 자극 인자, 유사 분열 물질, 성장 인자 및 성숙 인자는 목적하는 세포 타입, 즉 신장 세포 또는 심장 세포로 분화하기 위한 것이다. 성인 골수 줄기 세포(BMSCs)로부터 신장 및 간세포로 줄기 세포 분화에 대한 방법은 문헌[Frobes et al.(2002) Gene Ther 9:625-30]에 의한 실시예로 기술된다. 배아 줄기 세포의 심장, 즉 심방유사, 심실유사, 관결절유사, 퍼킨제 유사 세포와 같은 모든 특수한 세포 타입을 나타내는 심장 근육세포와 같은 세포로 시험관에서 분화에 대한 프로토콜이 정립되어져 왔다(참조: 예를 들어, Boheler et al.(2002) Circ Res 91:189-201). 후엽 중간엽으로부터 다능성 줄기 세포는 3개 이상의 명확한 세포 타입을 만드는데, 사구체, 원표피 및 근표피세포로 예를 들어 단일 네프론 조각으로 분화된다.(참조: 예를 들어, Herzlinger et al.(1992) Development 114:565-72).
장기 세포는 예를 들어 신장세포는 특정 유전자로 트랜스팩션한 후에, 매트릭스 재료를 코팅할 수 있다. 신형태 장기 확장 구조는 숙주의 장기 생존 또는 확장된 장기에 필요한 유전 정보를 보유할 수 있다.
분리된 세포는 정상 또는 유전적으로 조작되어 추가의 또는 정상 기능을 제공할 수 있다. 예를 들어, 세포는 장기에서 표적 지점에서 질병의 프로그램을 감소시키는 화합물을 트랜스팩션시킬 수 있다. 세포는 숙주에서 면역반응을 감소시키거나 제거하도록 유전자 조작될 수 있다. 예를 들어, 세포 표면 항원, 즉 클래스 I 및 클래스 II 조직적합 항원이 억제될 수 있다. 이것이 이식된 세포가 숙주에 의해 거부반응의 가능성을 줄이도록 할 수 있다. 추가적으로, 트랜스팩션은 또한 유전자 전달로 사용될 수 있다. 세포 유전자 조작하는 방법은 레트로바이러스 벡터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 당해 기술에서 당업자에게 공지된 방법이 사용될 수 있다. 이것은 전달되어 세포에서 핵산 분자를 발현시키는 발현 벡터을 사용하는 것을 포함한다.(참조:문헌[Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)]).
매트릭스에서 성장한 세포는 유전적으로 조작되어 장기 이식에 유익한 유전자 산물, 예를 들어, 항-염증 인자 즉 항-GM-CSF, 항-TNF, 항-IL-1 및 항-IL-2를 생산한다. 대안적으로, 내피세포는 유전적으로 조작되어 염증을 촉진하는 정상 유전자 산물, 예를 들어 GM-CSF,TNF,IL-1,IL-2의 발현을 "낙 아웃"하거나, 거부반응의 위험을 낮추기 위하여 MHC의 발현을 "낙 아웃"할 수 있다. 추가적으로, 상기 세포는 조직 이식의 결과를 돕거나 개선하기 위하여 피검자의 유전자 활성의 수준을 조절하는 유전자 치료에 사용되도록 유전적으로 조작될 수 있다.
레트로바이러스 벡터, 폴리에틸렌 클리콜, 또는 당해 기술에서 당업자에게 공지된 방법으로 세포의 유전자 조작하는 방법이 사용될 수 있다. 이것은 전달되어 세포에서 핵산 분자를 발현하는 발현 벡터를 사용하는 것을 포함한다.(참조: 문헌[Geoddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, Sna Diego, CA(1990)]).
벡터 DNA는 전통적인 트랜스포메이션 또는 트랜스펙션 기술을 통해서 원핵세포 또는 진핵세포로 도입된다. 숙주 세포에 트랜스포메이션 또는 트랜스펙션하는 적합한 방법은 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press(1989) 및 다른 실험 교재]에서 발견될 수 있다. 접종된 세포는 상기 세포를 트랜스포메이션 또는 트랜스펙션하는 흥미있는 유전자를 함유하는 재조합 DNA 구조물을 사용하여 조작될 수 있다. 접종된 매트릭스는 활성 유전자 산물을 발현하는 트랜스펙션된 세포를 포함하는 것으로, 상기 산물이 결여된 개인에게 이식될 수 있다. 예를 들어, 다양한 타입의 혈관, 비뇨생식, 도관, 탈장, 위장의 질병 또는 신장의 질병의 증상을 예방하거나 개선하는 유전자가 비발현되거나 질병조건하에서 낮게 발현될 수 있다. 유전자 활성의 수준은 존재하는 유전자 산물의 수준을 증가 또는 매트릭스 재료 및 조직, 예를 들어, 내피 조직층 또는 신장 조직층을 포함하는 생체매트릭스에 존재하는 활성 유전자 산물의 수준을 증가시키는 것 중에 한가지에 의해 증가될 수 있다. 생체매트릭스 배양물은 활성 표적 유전자 산물을 발현할 수 있고 다음에 그 산물이 결핍된 환자에게 이식될 수 있다.
그와 같은 유전적으로 조작된 세포를 함유하는 생체매트릭스 배양물은 이때 질병의 증상을 개선하려고 고려된 피검자에게 이때 이식될 수 있다. 유전자 발현은 비유도성(즉 상시 발현성) 또는 유도성 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 유전자 발현의 수준 및 조절 유전자 타입은 각자의 환자에 따른 치료 모델에 의존하여 조절될 수 있다.
II. 매트릭스 재료
본 발명의 방법 및 조성물은 세포가 놓여지고 세포가 성장 및 고착하는 기질로서 매트릭스 재료를 사용되도록 고안된다. 배양에서, 확장의 표적이 되는 특정 장기에 대해 생체내에서 발견되는 세포의 미세환경을 재창조하는 것이 중요하다. 유사하거나 생체내 장기와 동일한 인프라-구조를 유지하는 것은 세포-세포 상호작용, 발달 및 세포 군락의 분화에 대한 최적의 미세환경을 만드는 것이다. 세포 및 조직층이 성장한 후에 생체내에서 사용되는 정도는 확장된 장기의 타입에 따라 다양할 수 있다.
본 발명은 생체내 이들의 대응물와 상동인 성인 조직의 성분요소를 형성하는 시험관에서 추가적으로 배양된 세포의 성숙, 발달 및 분화를 지지하는 매트릭스 재료를 사용하여 장기 기능을 확장하는 방법을 제공한다. 상기 매트릭스는 최적의 세포-세포 상호작용을 하게하여, 그로인해 세포의 표현형 및 조직 미세환경이 보다 자연스럽게 형성되도록 한다. 상기 매트릭스는 또한 세포가 계속해서 활발하게 성장하고, 증식하며, 분화하여 추가의 배양된 세포군락의 성장, 증식 및 분화를 또한 지지할 수 있는 신형태 장기 확장 구조를 생산한다.
매트릭스 재료에서 성장한 세포는 본 발명에 따라서 다중층으로 성장할 수 있고, 생체 내에서 발견되는 생리학적 조건을 닮은 세포 구조를 형성한다. 상기 매트릭스는 세포의 상이한 타입의 증식 및 많은 상이한 조직의 형성을 지지할 수 있다. 실시예는, 이에 한정하지는 않지만, 위장 및 비뇨생식관의 조직뿐만 아니라, 신장, 심장, 피부, 간장, 췌장, 부신 및 신경 조직 및 순환계를 포함한다.
본 발명의 접종된 매트릭스는 다양한 응용예에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 매트릭스는 피검자에게 이식될 수 있다. 본 발명에 따른 이식은 존재하는 조직을 대체 또는 확장하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 천연 신장을 확장시킴으로써 신장 장애를 가진 피검자를 치료하는 것이다. 매트릭스 임플랜트의 이식후에 피검자는 신장 장애의 개선에 대해 모니터될 수 있다.
또한 본 발명의 범위내에서 단일 군락으로부터 조직층을 생성하기 위하여 배양된 세포의 한 군락으로 신형태 장기 확장 구조를 사용한 장기 확장의 조성물 및 방법이다. 대안적으로, 신형태 장기 확장 구조는 두개 상이한 세포군락, 예를 들어, 평활근 세포 군락 및 세포상피 세포 군락으로부터 유래된 다중층을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서 신형태 장기 확장 구조는 초기 혈관계를 가진 내피층 및 실질 세포로 유래된 하나 이상의 다른 조직층을 포함한다.
한번 매트릭스 재료에 관류되면, 내피 세포는 중합매트릭스에서 증식 및 발달하여 내피 조직층을 형성한다. 시험관에서 배양하는 동안, 내피 세포는 발달 및 분화하여 성숙된 혈관계로 발달할 수 있는 초기 혈관계를 형성하고 또한 추가적으로 발달할 수 있고 또한 매트릭스 재료로 관류된 실질 세포의 성장을 지지할 수 있다. 중요하게, 중합체 매트릭스가 배양 배지가 내피 조직층 및 실질 세포에 미치도록 하는 인프라-구조를 가지기 때문에, 상이한 세포 군락은 계속해서 성장하고, 분할하고, 기능적으로 활성이 있게 된다. 실질세포는 생체내에서 상동 구조와 닮은 형태를 가진 신형태 장기구조로 증식 및 분화한다. 내피세포 및 실질 세포가 성장한 후에 생체내에서 사용되는 정도는 확장된 장기의 타입에 따라 다양하다. 확장될 수 있는 장기는 이에 한정되지는 않지만, 심장, 신장, 간장, 췌장, 비장, 방광, 수뇨관 및 요도를 포함한다.
(i) 중합체 매트릭스
바람직한 구체예에서, 매트릭스 재료는 중합체 매트릭스이다. 적합한 중합체의 예는 이에 한정하지는 않지만, 콜라겐, 폴리(알파 에스테르), 예를 들어, 폴리(아세트산), 폴리(글리코릭 산), 폴리올소이스테르 및 폴리무수물 및 이들의 코폴리머, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스, 셀룰로식 에스테를, 플루오르화 폴리에틸렌, 페놀릭, 폴리-4-메틸펜텐, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드, 폴리아미드이미드, 폴리아크릴레이트, 폴리벤조사졸, 폴리카보네이트, 폴리시아노아릴에테르, 폴리에스테르카보네이트, 폴리에테르, 폴리에테르에테르케톤, 폴리에테르이미드, 폴리에테르케톤, 폴리에테르설폰, 폴리에텔렌, 폴리플루오로오레핀, 폴리이미드, 폴리오레핀, 폴리옥사디아졸, 폴리페닐렌옥사이드, 폴리페닐렌, 설파이드, 폴리프로필렌, 플리스렌, 폴리설파이드, 폴리설폰, 폴리테트라플루오로데틸렌, 폴리티오에테르, 폴리트리아졸, 폴리유레탄, 폴리비닐리덴, 플루오라이드, 재생된 셀룰로오스, 유리아-포름알데히드, 또는 코폴리머 또는 이러한 재료들의 물리적 혼합을 포함한다.
중합체, 예를 들어 폴리클리코릭 산은 장기 확장 구조를 생산하는데 적합한 생체호환 구조이다. 생체호환 중합체는 용매 주형, 압축 모델링, 필라멘트 드로잉, 메싱, 리칭, 위빙 및 코팅과 같은 방법을 사용하여 모양이 만들어질 수 있다.
용매 주형에서, 적당한 용매, 예를 들어 염화 메틸렌에서 하나 또는 이상의 중합체 용액이 프랜칭 패턴 리리프 구조와 같은 주형이다. 용매 증발후에, 얇은 필름이 얻어진다.
압축 모델링에서, 중합체는 단위 평방 인치당 30,000 파운드까지 압력으로 압축된다. 필라멘트 드로잉은 주조된 중합체로부터 드로잉을 포함하고 메싱은 섬유를 촉감있는 재료로 압출함으로써 메쉬를 형성하는 것을 포함한다.
리칭에서, 두개의 재료를 함유하는 용액이 장기의 최종 형태에 가까운 형태로 관류된다. 다음에 용매가 성분요소중 하나를 용해시키는데 사용되어, 공극형성을 가져온다.(참조:본원의 참고문헌에 통합된 미코스(Mikos)의 미국 제 5,514378호)
핵 형성에서, 장기의 형태에서 얇은 필름은 방사선에 손상된 재료의 자취를 만드는 방사성 분열 산물에 노출된다. 다음에, 폴리카보네이트 용지가 산 또는 염기로 에칭되고, 방사선-손상 받은 재료의 자취를 공극으로 바꾼다. 마지막으로, 레이저는 많은 재료를 통해서 일정한 공극 크기를 가진 장기 구조를 형성하도록 개개의 구멍을 만들고 태우는데 사용될 수 있다.
중합체 매트릭스는 배지로부터 영양분이 놓여진 세포군락에 미치게 하는 제어된 공극 구조를 가지도록 가공되어질 수 있으나, 배양된 세포가 공극을 통해 이동되지 않도록 가공될 수 있다. 시험관에서 세포의 부착 및 생존은 전자 현미경 촬영, 조직학, 및 방사선 동위원소로 정량분석을 사용하여 측정될 수 있다.
중합체 매트릭스는 임의의 목적하는 형태로 모양을 가져서 임의의 전체 시스템, 기하학 또는 공간 한정을 만족시킬 수 있다. 종합 매트릭스는 상이한 크기의 환자의 장기에 맞는 상이한 크기로 형성될 수 있다. 중합체 매트릭스는 또한 환자, 예를 들어 장애인으로 상이한 복강 공간을 가지고 그 공간에 맞도록 적용되어 재구성된 장기 또는 장기의 일부가 필요한 환자의 특별한 필요를 용이하도록 형성될 수 있다.
다른 구체예에서, 중합체 매트릭스는 신체에서 라미나 구조, 예를 들어 요도, 정관, 자궁관, 눈물관의 치료에 사용된다. 그런 응용예에서 중합 기질은 빈관으로 형성될 수 있다.
본 발명의 신형태 장기 확장 구조는, 장기를 확장하는 기능으로, 평평하고, 관모양이거나, 복잡한 기하구조일 수 있다. 장기의 형태는 의도된 사용에 의해 결정될 수 있다. 인공 장기는 병든 또는 손상된 장기의 일부를 수선, 확장 대체하도록 이식될 수 있다. 평평한 쉬트 또는 웨이퍼가 사용될 수 있다. 평평한 쉬트는 목적하는 형태 및 장기의 표적 지점, 예를 들어, 실린더 또는 튜브로 롤링된 것내에 맞는 기하구조를 형성할 수 있다. 관 이식은, 예를 들어, 식도, 기관, 내장관, 자궁관과 같은 관 장기의 횡단면을 대체하도록 사용될 수 있다. 이러한 장기는 바깥 면 및 관면을 가진 기본적인 관형태를 가진다.
중합체 매트릭스는 기계적인 성질을 바꾸기 위하여, 재료, 예를 들어 액체화된 코폴리머(폴리-DL-락타이드 코-글리코라이드 50:50 80 mg/ml 메틸렌 클로라이드)로 침투시킬 수 있다. 이는 목적하는 기계적인 성질이 이루어질 때까지 한층 또는 다중층을 코팅함으로써 수행될 수 있다. 중합체 매트릭스의 크기는 필요한 장기 확장의 정도에 기초하여 판단된다. 예를 들어, 매트릭스는 약 길이 1mm X 너비 1mm X 깊이 1mm의 크기일 수 있다. 형태 및 매트릭스의 크기는 확장된 장기의 영역에 따른다.
한 구체예에서, 확장된 장기가 신장인 경우, 매트릭스가 약 1cm X 1 cm의 크기 및 약 1 mm 미만의 두께를 가진 평평한 조각일 수 있다. 바람직하게, 매트릭스의 최대 치수 길이는 0.2 mm초과 및 100mm 미만이고, 보다 바람직하게 약 0.5mm 내지 30mm의 범위이다. 바람직한 구체예에서, 소형-매트릭스의 형태는 실질적으로 평평하고 이의 최대 크기 대 두께의 비율은 5:1 초과, 보다 바람직하게 10:1이다.
또 다른 구체예에서, 중합체 매트릭스는 세포가 접종되어 보다 큰 부피의 장기 조직을 제공한 후에 튜브로 로울링될 수 있다. 중합체 매트릭스의 크기 및 모양은 디스크, 웨이퍼, 로울링된 웨이퍼, 사각형, 직사각형, 및 그 유사물일 수 있다. 중합체 매트릭스의 형태는 확장된 영역에 기초하여 판단되고 장기가 확장된다. 중합체 매트릭스의 크기 및 모양은 생산된 신형태 장기 확장 구조가 이의 최대 크기 대 두께의 비율이 5:1 초과, 보다 바람직하게 10:1 초과를 갖도록 선택된다.
한 구체예에서, 확장 장기 구조는 다중층, 예를 들어, 방광을 포함하는 장기를 확장하는데 사용될 수 있다. 이는 첫번째 동질의 세포 군란, 예를 들어, 신장 세포의 현탁으로 중합체 매트릭스의 한 쪽을 코팅하여 조직층을 형성한 중합체 매트릭스의 한 면을 사용하여 수행될 수 있다. 첫번째 균질한 세포 현탁은 세포가 발달 및 증식하여 단일층을 생산하고 단일층의 세포가 중합체 매트릭스에 부착될때 까지 배양 배지에서 인큐베이션된다. 단일층이 한번 형성되면, 첫번째 균질한 세포 현탁이 첫번째 단일층위에 놓여지고, 상기 세포가 발달 및 증식하여 첫번째 단일층 위에 세포의 두번째 단일층을 생산하여, 이중층을 형성하게 될 때까지 배양된다. 상기 과정은 첫번째 균질한 세포군락의 다중층을 포함하는 폴리레이어가 생길 때까지 반복된다. 폴리레이어는 배양되어 장기 확장 구조로 분화되도록 형태적 및 기능적 특성을 가진 조직층을 생성한다.
또 다른 구체예에서, 중합체 매트릭스의 양쪽은 균질한 세포 군락의 폴리레이어를 제조하는데 사용된다. 이는 균질한 세포 군락, 예를 들어 신장 세포를 현탁하여 중합체 매트릭스의 한 쪽을 코팅하고 단일층으로 발달할 때까지 세포를 배양하여 수행된다 중합체 매트릭스의 반대쪽에서 상기 과정을 반복한다. 상기 과정은 균질한 세포군락의 다중층을 포함하는 폴리레이어가 매트릭스의 양쪽에 생길 때까지중합체 매트릭스의 양쪽에서 반복된다. 양쪽에 폴리레이어를 포함하는 중합체 매트릭스가 배양되어 장기 확장 구조로 분화되도록 형태적 및 기능적 특성을 가진 조직층을 생성한다. 그러나 또 다른 구체예에서, 중합체 매트릭스의 양쪽은 상이한 세포 군락의 폴리레이어를 제조하는데 사용될 수 있다. 이는 첫번째 균질한 세포 군락, 예를 들어 내피 세포를 현탁하여 중합체 매트릭스의 한쪽에 코팅하고 단일층으로 발달할 때까지 세포를 배양한다. 상이한 균질한 세포군락, 예를들어 신장 세포로 중합체 매트릭스의 반대쪽에서 상기 과정을 반복한다.
한 구체예에서, 확장된 장기가 신장이다. 상기 장기 확장 구조는 신장 세포, 또는 매트릭스 재료에 접종된 원세관 세포, 근세관 세포 또는 사구체 세포의 분리된 군락를 사용하여 제조된다. 신장은 종축으로 외과적으로 개방할 수 있고, 신형태 장기 확장 구조는 신장에서 하나 이상의 표적 지점에 놓여진다. 또 다른 구체예에서, 복수의 신형태 장기 확장 구조가 제조될 수 있고 신장내 다중 표적 지점에 추가될 수 있다. 추가되는 신형태 장기 확장 구조의 수는 신장에 손상의 정도에 따른다. 예를 들어, 신장의 위쪽 반의 반이 손상되었다면, 이때 웨이퍼 형태로 약 1 내지 약 10개의 확장 구조가 신장의 위쪽 반을 따라 동일하게 위치될 수 있다. 이식될 확장 구조의 수 또한 이를 제조하는데 사용되는 웨이퍼의 크기에 따른다. 웨이퍼가 큰 크기, 예를 들어 1cm X 1cm 1cm를 갖는다면, 이때 웨이퍼의 더 적은 수가 신장의 위쪽 반을 확장하는데 필요하다. 대안적으로, 웨이퍼가 작다면, 예를 들어 1mm X 1mm X 1mm, 이때는 신장의 동일한 위쪽 반을 확장하기 위해서 많이 필요할 것이다.
(ii) 하이드로젤
한 구체예에서, 매트릭스 재료는 전형적으로 불용성 또는 물에 잘 녹지 않는 가교화된 중합체 망으로 구성된 하이드로젤이나, 과량 물의 존재하에서 평형 크기로 팽창할 수 있다. 예를 들어, 세포가 하이드로젤에 놓일 수 있고 하이드로젤이 장기내 목적하는 위치에 주입될 수 있다. 한 구체예에서, 세포가 콜라겐으로만 주입될 수 있다. 또 다른 구체예에서 세포가 콜라제 및 다른 하이드로젤으로 주입될 수 있다. 하이드로젤 조성물은, 한정없이, 예를 들어, 폴리(에스테르), 폴리(히드록시 산), 폴리(락토니스), 폴리(아미드), 폴리(에스테르-아미드), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(올소-에스테르), 폴리(탄산염), 폴리(포스파진), 폴리(티오에스테르), 다당류 및 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 추가적으로, 조성물은 또한, 예를 들어, 폴리(알파-히드록시)산 및 폴리(베타-히드록시)산을 포함하는 폴리(히드록시)산을 포함할 수 있다. 폴리(히드록시)산과 같이, 예를 들어, 폴리락틱 산, 폴리글리코릭 산, 폴리카프로익 산, 폴리부티릭 산, 폴리발레릭 산, 및 코폴리머 및 그의 혼합물을 포함한다. 하이드로젤 및 제어된 약물 전달과 같은 영역에서 이의 잠재적인 응용예의 독특한 특성때문에, 다양한 타입의 하이드로젤이 합성되고 특성화되었다. 대부분의 이런 작업은 가벼운 가교화, 균질한 동종중합체 및 코폴리머에 집중이 된다.
벌크 중합화, 예를 들어, 추가된 용매의 부재에서 단량체가 균질한 하이드로젤을 제조하는 중합화는 매우 경화된 유리질의 투명한 중합체 매트릭스를 생산한다. 유리질 매트릭스가 물에 침적되었을 때, 팽창하여 부드럽고 가요성이 있게 된다. 공극의 하이드로젤은 통상 용액 중합화 기술에 의해 제조되고, 이 기술은 적합한 용매에서 단량체를 중합화하는데 필요하다. 합성된 하이드로젤의 본성은, 빽빽한 젤 또는 느슨한 중합체 망이든지간에, 단량체의 타입, 단량체 혼합물에서 희석제의 양, 가교제의 양에 따른다. 단량체 혼합물에서 희석제(통상 물)의 양이 증가함에따라, 공극크기는 또한 마이크로 범위까지 증가할 수 있다. 10-100nm 및 100 nm- 10㎛ 범위에서 효과적인 공극크기를 가진 하이드로젤은 각각 "미세공극" 및 "거대공극" 하이드로젤이다. 하이드로젤의 미세공극 및 거대공극 구조는 비하이드로젤 공극 재료, 예를 들어 공극 폴리우레탄 거품의 구조와는 다를 수 있다. 플라스틱 거품 영역에서, 미세 및 거대 공극은 각각 50㎛ 미만의 공극 및 100-300㎛ 범위에서 공극을 가진 것으로 나타난다. 이러 차이에 대한 이유중 하나가 10㎛보다 큰 공극을 가진 하이드로젤이 드문 반면에, 100-300 ㎛ 범위에 공극을 가진 공극 플라스틱이 매우 흔하다.
미세공극 및 거대공극 하이드로젤은 종종 중합체 "스폰지"라고 불린다. 단량체, 예를 들어 히드록시에틸 메타아크릴레이트 (HEMA)는, 물중에 45 %(w/w) 또는 보다 높은 초기 단량체 농도로 중합되었을 때 히드로겔은 균질한 하이드로젤보다 높은 공극을 가지고 생산된다. 본 발명의 매트릭스 재료는 전통적인 거품 또는 스폰지 재료 및 소위"하이드로젤 스폰지" 둘 모두를 포함한다. 하이드로젤의 추가적 기술에 대해서는, 미국 특허 제 5,451,613호(스미스 등으로 발행됨)을 참조하라.
(iii) 생체구조의 탈세포화된 부분
그러나 또 다른 구체예에서, 신형태 장기 확장 구조는 천연 탈세포화된 장기의 부분을 사용하여 제조될 수 있다. 생체구조, 또는 장기의 일부는 장기로부터 전체 세포 및 조직의 내용물을 제거함으로써 탈세포화될 수 있다. 탈세포화 공정은 연속적인 추출의 시리즈를 포함한다. 상기 추출 공정의 주요한 특징은 생체구조의 복잡한 인프라-구조를 방해하거나 파괴할 수 있는 가혹한 추출은 기피된다. 첫번째 단계는 세포 부스러기의 제거 및 세포막의 용해를 포함한다. 이 다음에 핵 세포질 성분요소 및 핵 성분 요소의 용해가 수행된다.
바람직하게, 생체구조, 예를 들어, 장기의 일부가 온화한 기계적인 파괴 방법을 사용하여 장기의 부분을 둘러싸 세포만 및 세포 부스러기를 제거함으로써 탈세포화된다. 온화한 기계적 파괴 방법은 세포막을 파괴하는데 충분해야 한다. 그러나, 탈세포화의 공정은 생체구조의 복잡한 인프라-구조의 손상 또는 장애를 피해야만 한다. 온화한 기계적인 파괴 방법은 장기 일부의 표면을 긁고, 장기 일부를 휘젓거나, 적합한 부피의 유체, 예를 들어, 증류수로 장기를 교반하는것을 포함한다. 한 바람직한 구체예에서, 온화한 기계적인 파괴 방법은 세포막이 파괴되고 세포 부스러기가 장기로부터 제거될 때까지 증류수의 적합한 부피로 장기 일부를 교반하는 것을 포함한다.
세포막이 제거된 후에, 생체구조의 핵 및 세포질 성분요소가 제거되었다. 이는 인프라-구조를 파괴하지 않고 세포 및 핵 성분요소를 용해함으로써 수행된다. 핵 성분요소를 용해시키기 위하여, 비이온계 세제 또는 계면활성제가 사용될 수 있다. 비이온계 세제 또는 계면활성제는 예는, 이에 한정되지는 않지만, 트리톤 시르즈, 필라델피아, 파,의 롬 및 하스에서 제조한것으로, 많은 공급업자로부터 상업적으로 구입가능한, 티리톤 X-100, 트리톤 N-101, 트리톤 X-114, 트리톤 X-405, 트리톤 X-705 및 트리톤 DF-16; 트윈 시리즈, 예를 들어 모노로리트(트윈 20), 모노팔미테이트(트윈 40), 모노올레산염(트윈 80) 및 폴리옥스에틸렌-23-로릴 에테르(Brij.35), 폴리옥시에틸렌 에테르 W-1(폴리옥시), 및 그 유사물, 나트륨 콜레이트, 데옥시콜레이트, CHAPS, 사포닌, n-데실 β-D-글루코푸라노사이드, n-헵틸 β-D 글루코피라노사이드, n-옥틸 α-D-글루코피라노사이드 및 노니데트 P-40을 포함한다.
당해 기술에서 당업자가 선행하는 분류에 속하는 화합물의 기술 및 공급자는 상업적으로 얻을 수 있고 다음 문헌에서 발견되는 것이 평가될 것이다. 문헌 ["Chemical Classification, Emulsifiers and Detergents", McCutcheon's,Emelsifiers and Detergents, 1986, North American and International Editions, McCutcheon Division, MC Publishing Co., Glen Rock, N.J., U.S.A. and Judith Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry, Calbiochem.R., Hoechst Celanese Corp., 1987]. 한 바람직한 구체예에서, 비이온계 계면활성제는 트리톤 시리즈, 바람직하게, 트리톤 X-100이다.
비이온계 세제의 농도는 탈세포화된 생체구조의 타입에 따라 변경될 수 있다. 예를 들어, 섬세한 조직, 예를 들어, 혈관에 대해서, 세제의 농도는 감소되어야 한다. 바람직한 비이온계 세제의 농도범위는 약 0.001 내지 약 20.% (w/v), 보다 바람직하게는 약 0.05 내지 약 1.0%(w/v), 보다 더욱 바락직하게 약 0.1%(w/v) 내지 약 0.8%(w/v)이다. 이러한 범위의 바람직한 농도는 약 0.001 내지 0.2%(w/v)이고 약 0.05 내지 0.1 %(w/v)의 농도가 특히 바람직하다.
세포골격 성분요소는 빽빽한 세포질 필라멘트망, 세포간 복합체 및 꼭대기 미세세포 구조를 구성된 것을 포함하는 것으로서, 알칼리성 용액, 예를 들어, 수산화 암모늄을 사용하여 용해될 수 있다. 암모늄 염 또는 이들의 유도체로 구성된 다른 알칼리성 용액이 또한 세포골격 성분요소를 용해하는데 사용될 수 있다. 다른 적합한 암모늄 용액의 예는 황화 암모늄, 암모늄 아세테이트 및 수산화 암모늄을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 수산화 암모늄이 사용된다.
알칼리성 용액, 예를 들어, 수산화 암모늄의 농도는 탈세포화된 생체구조의 타입에 따라 변경될 수 있다. 예를 들어, 섬세한 조직, 예를 들어 혈관에 대해서 세제의 농도는 감소될 수 있다. 바람직한 농도 범위는 약 0.001 내지 2.0%(w/v)일 수 있다. 보다 바람직하게 약 0.005 내지 약 0.1%(w/v), 더욱 보다 바람직하게 약 0.01%(w.v) 내지 약 0.08%(w/v)일 수 있다.
탈세포화, 리포필화된 구조는 사용에 필요할 때까지 적합한 온도에서 저장될 수 있다. 사용전에, 탈세포화된 구조는 적합한 아이소토닉 완충제 또는 세포 배양 배지에서 평형화될 수 있다. 적합한 완충제는, 이에 한정하지는 않지만, 포스페이트 버퍼 살린(PBS), 살린, MOPS, HERES, Hank's Balanced Salt Solution, 및 그 유사물을 포함한다. 적합한 세포 배양 배지는 이에 한정하지는 않지만, RPMI1640, Fisher's, Iscove's, McCoy's Dulbecco's 배지 및 그 유사물을 포함한다.
III 세포 부착
어떤 구체예에서, 세포의 매트릭스 재료로 부착은 매트릭스 재료를 화합물, 예를 들어, 기저막 구성요소, 한천, 아가로스, 젤라틴, 아리비아 고무, 타입 I, II, III, IV 및 V 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 글리코사미노글리칸, 여기에서의 혼합물 및 세포배양의 기술에서 당업자에게 공지된 다른 친수성 및 펩타이드 부착 재료로 코팅하여 증가된다. 매트릭스 재료를 코팅한 바람직한 재료는 콜라겐이다.
다른 구체예에서, 매트릭스 재료는 인자 또는 약물로 처리된 후 이식되고, 전 또는 후에 매트릭스 재료가 배양된 세포로 코팅되어, 이식 후에 새로운 조직의 형성을 촉진한다. 약물을 포함하는 인자는 매트릭스 재료로 통합되거나 매트릭스 재료와 연결되어 공급될 수 있다. 그와 같은 인자는 일반적으로 재건 또는 확장된 조직 또는 장기에 따라 선택될 수 있고, 이는 적당한 신규한 조직이 이식된 장기 또는 조직(뼈 치료를 촉진하는데 사용하는 그와 같은 첨가물의 예: 문헌[Kirker-Head, (1995) Vet.Sur. 24:408-19])에서 형성되는지를 확인하기 위함이다. 예를 들어, 매트릭스 재료가 혈관을 확장하는데 사용될 때, 관 내피 성장 인자(VEGF)가 신규한 관조직의 형성을 촉진하는데 이용될 수 있다.(참조: 갤로 등으로 발행된 미국 특허 제 5,654,273 호). 다른 유용한 첨가물은 항생물질과 같은 항박테리아 제제를 포함한다.
IV. 내피 조직층의 구축
한 측면에서, 본 발명은 중합체 매트릭스 재료위 또는 내부에 또는 탈세포화된 장기의 일부에 관류된 내피 세포의 배양된 군락을 사용하는 것에 관한 것으로, 내피 세포는 성장 및 발달하여 초기 혈관계를 생산한다. 내피세포는 장기, 예를 들어, 피부, 간장, 및 췌장으로부터 유래할 수 있고, 이들은 생검(적당한 곳) 또는 부검에 의해 얻어질수 있다. 내피세포는 또한 적당한 시체 장기로부터 얻어질 수 있다. 내피세포는 목적하는 세포 농도까지 이들을 시험관에서 배양하여 팽창된 후에 매트릭스 재료로 주입될 수 있다.
내피세포는 적당한 장기 또는 세포원으로 역할을 하는 장기 또는 조직의 일부를 해체함으로써 쉽게 분리할 수 있다. 이는 당해 분야에서 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 조직 또는 장기는 기계적으로 해체 및/또는 소화 효소로 및/또는 이웃 세포간에 연결을 약화시켜 조직이 다소의 세포 파괴없이 개개의 세포의 현탁으로 관류시키는 것이 가능하게 하는 킬레이팅 제제로 처리될 수 있다. 효소적 해리는 조직을 썰고 썬 조직을 임의의 많은 소화효소 홀로 또는 조합으로 처리함으로서 수반될 수 있다. 이는 이에 한정하지는 않지만, 트립신, 키모트립신, 콜라겐나아제, 에라스타아제 및/또는 히알루론다이제, DNA 분해효소, 프로나아제 및 디스파아제를 포함한다. 기계적인 파괴는 이에 한정하지는 않지만, 그린더, 블랜더, 씨브, 호모제나이저, 세포 압력 또는 인소니케이터의 사용을 포함하는 많은 방법이 또한 수반될 수 있다(참조: 문헌[Freshney. (1987), Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2d Ed., A.R.Liss, Inc., New York, Ch.9, pp.107-126]).
조직을 개개의 세포의 현탁으로 만든후에, 현탁은 내피세포가 얻어질 수 있는 부군락으로 분획화될 수 있다. 이는 또한 세포 분리의 표준 기술을 사용하는 것이 수반될 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니지만, 특정 세포타입의 클로닝 및 선택, 원치않는 세포의 선택적 파괴(네거티브 시렉션), 혼합된 군락에서 분화된 세포의 뭉침을 기초로한 분리, 동-해 과정, 혼합된 군락에서 세포의 분화된 접착 성질, 여과, 전통적인 띠 원심분리, 원심적 유출(반대흐림의 원심분리), 단위 중력 분리, 향류 분배, 전기영동 및 형광 활성 세포 분류을 포함한다(참조: 문헌[Freshney,(1987) Culuture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2d Ed., A.R.Liss, Inc., New York, Ch. 11 및 12, pp. 137-168]).
매트릭스 재료, 예를 들어, 중합체 매트릭스에서 세포의 성장은, 매트릭스 재료를 단백질(예를 들어, 콜라겐, 탄력 섬유, 망섬유), 당단백질, 글리코사미노글리칸(예를 들어, 황화 헤파란, 콘드로이틴-4-설파이트, 콘드로이틴-6-설파이트, 덜마탄 설파이트, 케라틴 설파이트, 등), 세포 매트릭스, 및/또는 다른 재료로 추가 또는 코팅하여 증가될 수 있다.
내피세포의 관류후에, 매트릭스 재료는 적당한 영양 배지로 인큐베이션되어야만 한다. 많은 상업적인 구입가능한 배지는 예를 들어, RPMI1640, Fisher's, Iscove's, McCoy's Dulbecco's 배지 및 그 유사물이 사용하기에 적합할 수 있다. 배양 배지는 또한 주기적으로 사용 배지를 제거, 방출된 세포의 제거 및 신선한 배지를 추가하여 교체해 주어야만 한다. 초기 혈관계를 포함하는 내피 조직층이 발달한 후에 피조직층을 실질세포로 관류시키는 단계까지 내피세포를 성장시키는 것이 중요하다.
V. 실질세포의 매트릭스 재료 내피층의 관류
내피조직층이 성장의 적당한 정도에 미치고 발달하여 초기 혈관계를 생산하기만 하면, 배양세포, 예를 들어 실질 세포의 추가적인 군락이 내피조직층으로 관류될 수 있다. 내피조직층에 관류된 실질 세포는 상기 세포가 내피 조직층에 고착하도록 인큐베이션될 수 있다. 실질세포는 상기 세포가 천연 조직과 유사한 형태 및 구조와 닮을 때까지 성장 및 발달하도록 배양 배지의 시험관에서 배양될 수 있다. 내피조직층에서 실질 세포의 성장으로 실질 세포가 적당한 신형태 장기 확장 구조로 분화하게 된다.
대안적으로, 실질 세포를 관류후에, 매트릭스는 이전에 시험관에서 실질세포의 배양을 하지않고 생체내에서 이식될 수 있다. 관류를 위해 선택된 실질 세포는 확장된 장기에 따른다. 예를 들어, 신장의 확장은 배양된 내피 세포를 매트릭스 재료에 이식하는것을 포함하는데, 상기 세포는 초기 혈관계를 포함하는 내피조직층으로 발달하기까지 배양된다. 내피조직은 이때 배양된 신장 세포로 관류되고 신장 세포가 네프론 조직을 형성하도록 분화되기 시작할 때까지 시험관에서 배양된다.
실질 세포는 상기에서 기술된 바와 같이 표준 기술을 사용하여 목적하는 조직을 해체함으로써 제조된 세포 현탁물로부터 얻어질 수 있다. 상기 세포는 이때 목적하는 농도로 시험관에서 배양될 수 있다. 목적하는 농도를 이룬 후에, 배양된 세포는 매트릭스 재료에 내피조직층으로 관류하는데 사용될 수 있다. 상기 세포는 증식, 성숙 및 분화하여 내피 조직층이 될 것이다. 실질 세포의 선택은 확장된 장기에 따르는데, 예를 들어, 신장을 확장했을 때, 매트릭스 재료, 예를 들어, 중합체 매트릭스 및 내피 조직층이 배양된 신장세포로 관류된다. 간장을 확장하는 때, 중합체 매트릭스 및 내피조직층은 배양된 간세포로 관류된다. 췌장을 확장할 때, 중합체 매트릭스 및 내피 조직층은 배양된 췌장 내분비 세포로 관류된다. 심장을 확장할 때, 중합체 매트릭스 및 내피 조직층이 배양된 심장 세포로 관류된다. 다양한 조직으로부터 실질 세포를 얻기 위해 사용될 수 있는 방법의 검토는 다음 문헌을 참조하라: 문헌[Freshney. (1987), Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2d Ed., A.R.Liss, Inc., New York, Ch.20, pp.257-288]. 세포는 생체내 천연 조직의 형태를 닮은 구조를 초가하는 신형태 장기를 생산하도록 분화할 때까지 배양된다.
성장 인자 및 조절 인자는 배지에 첨가되어 배양에서 증식, 세포 성숙 및 분화를 높이고, 변화시키고, 조절한다. 배양에서 세포의 성장 및 활성은 다양한 성장인자, 예를 들어, 인슐린, 성장 호르몬, 소마토메딘, 콜로니 자극 인자, 적혈구 생성인자, 표피 성장 인자, 간 적혈구조혈인자(헤파토포이에틴) 및 간-세포 성장 인자에 의해 영향받을 수 있다. 증식 및/또는 분화를 조절하는 다른 인자는 프로스타글란딘, 인터루킨 및 천연적으로-발생하는 칼론을 포함한다.
VI. 3차원 생체 매트릭스의 제조
한 측면에서, 본 발명은 3차원 생체매트릭스 또는 구조/구조물을 확장하는 장기를 제조하는 것에 관한 것이다. 한 구체예에서, 장기 확장 구조는 장기의 기능을 파괴하는 특정 질병 또는 장애를 고치도록 제조된다. 예를 들어, 장기 확장 구조는 확장되어, 비정상 사구체 기능과 관련된 사구체병증을 개선하도록 제조된 특정 확장 구조일 수 있다.[예를 들어, 사구체병증, 즉 손상된 사구체 여과{예를 들어 급성 네프리틱 증상, 빠르게 진전되는 사구체 신염(RPGN), 사구체 경화증, 네프로틱 증상, 유린 침전(간뇨증, 단백뇨증)의 무증후 비정상 및 만성 사구체신염}와 관련된 주요한 사구체 신염 또는 시스템 질병{예를 들어, 당뇨 신장병증 및 면역학적 매개된 다중 시스템 질병}과 관련한 2차적 사구체신염]. 장기 확장 구조는 조직층에서 성장한 사구체 세포의 분리된 군락 및 이때 사구체 경화를 다루도록 이식된 구조물을 사용하여 제조될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 장기 확장 구조는 확장할 세관 세포의 분리된 군락을 사용하여 제조될 수 있는데, 그에 의해서, 세관 장애, 예를 들어 근세관 장애, 부신 세관 산성증을 개선할 수 있다. 이것은 본 발명의 방법 및 조성물이 네프론의 특정 영역과 관련된 특정 장애 및 병변에 사용되도록 한다. 근세관 장애는 고염소혈증, 아미노산뇨증, 당뇨증, 인산뇨증, 요산뇨증, 또는 중탄산염뇨증으로 이끄는 비선택적 재흡수 장애를 명백히 한다. 부신 세관 산성증(RTA)는 여과된 탄산수소의 재흡수, 수소의 배출 또는 양쪽의 결함으로 인한 결과이다. 부신 세관 산성증은 특징적으로 고염소혈증 및 정상 사구체 기능과 관련되어 있다. RTA는 원 RTA(RTA-1), 근 RTA(RTA-2) 및 과칼륨성 RTA(RTA-4)로 분류될 수 있다. 마지막 것은 많은 과칼륨 상태에서 보여지는 것으로 결함은 칼륨의 증가된 세포 저장의 직접적인 결과로서 충분한 암모늄을 배출하는 세관의 무능력으로 특징지워진다.
또 다른 구체예에서, 장기 확장 구조는 확장된 장기로부터 분리된 세포의 혼합물을 사용하여 제조된 일반적인 확장 구조이다. 예를 들어, 신형태 장기 확장 구조는 원세관 세포, 근세관 세포, 헨레 세포의 고리 및 사구체 세포의 혼합물을 포함하는 신장 세포로 접종된다.
또 다른 구체예에서, 확장 구조는 심장 기능을 확장하는데 사용될 수 있다. 이 실시예에서, 신형태 장기 확장 구조는 매트릭스 재료에 심근 세포의 군락을 접종함으로써 제조될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 확장 구조는 방광 기능을 확장하는데 사용될 수 있다. 이 실시예에서, 확장 구조는 매트릭스 재료에 요도관 세포의 분리된 군락 또는 평활근 및 요도관 세포의 혼합물을 포함하는 세포의 군락을 접종함으로써 제조될 수 있다.
생체매트릭스는 배양된 하나 이상의 군락으로 관류되고, 인큐베이션되는 매트릭스 재료를 포함하는 것으로, 단일층을 형성할 때까지 상기 관류된 세포 및 폴리레이어를 형성할 때까지 배양된 세포를 추가적으로 배양하는 것이 세포의 다중 단일층을 형성하여, 결국 조직층, 예를 들어, 신장 조직층 또는 초기 혈관계를 가진 내피층을 형성한다.
조직층의 지지된 활발한 증식은 생체내 장기의 동등한 실질 조직을 닮은 조직층으로 이끈다. 이는 부분적으로 폴리레이어를 생산하는 방법에 기인한다. 폴리레이어는 각 층의 세포가 활발하게 증식할 때까지 매트릭스에서 일정 시간에 첫번째 균질한 세포 군락 한층을 배양하여 생산된다. 폴리레이어는 상기 세포가 발달 및 증식하여 생체내 장기의 동등한 실질 조직의 구조 및 형태를 닮을 때까지 인큐베이션된다.
본 발명의 방법에 의해 발달된 폴리레이어는 그래서 균질한 세포 군락의 장기 증식을 지지하기에 필요한 단백질, 성장인자 및 조절 인자를 생산한다. 첫번째 폴리레이어가 만들어진 후에, 이것이 두번째 폴리레이어를 생산하는 표면을 제공한다. 두번째 폴리레이어는 첫번째 균질한 세포 군락과 다른 두번째 균질한 세포 군락을 포함한다. 두번째 폴리레이어는 각 층의 세포가 활발하게 증식하여 세포의 폴리레이어, 결국 조직층을 생성할 때까지 일정 시간에 두번째 균질한 세포 군락 한층을 배양하여 발달된다.
이 조직층은 시험관내 추가의 인큐베이션 또는 생체내 인큐베이션으로 장기 확장 구조로 분화할 수 있다. 조직층에서 세포의 성장은 인자 예를 들어, 영양소, 성장인자, 사이토카인, 세포외 매트릭스 성분요소, 분화 유도물, 배출 산물, 면역조절자, 세포망 또는 신경 섬유 단백질의 성장을 증대시키거나 허용하는 생물학적-활성 화합물, 당단백질 및 글리코아미노글리칸을 첨가하여 추가적으로 증대시킬 수 있다.
한 구체예에서, 생체 매트릭스를 만드는데 사용하는 매트릭스 재료는 중합체 매트릭스이다. 장기 확장 구조로 분화를 허용하는 형태학 및 조직학을 가진 조직층이 생산될 때까지, 조직층은 중합체 매트릭스의 한면 또는 중합체 매트릭스의 양면으로 제조될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 중합체 매트릭스는 배양된 세포군이 혼합되는 하이드로젤이다. 상기 세포는 장기 확장 구조로 분화할 수 있는 조직층을 형성할 때까지 하이드로젤에서 인큐베이션된다.
VII 3차원 생체매트릭스의 이식
3차원 생체매트릭스 또는 장기 확장 구조는 표준 외과적 과정을 사용하여 확장을 필요로 하는 장기에 이식될 수 있다. 이러한 외과적 과정은 확장된 장기에 따라 다양할 수 있다. 신장 이식에 대해서는, 3차원 생체매트릭스 시리즈를 신장의 무혈관 면 또는 장기의 최소 혈관 영역을 따라 형성된 단면에 이식되는 것이 바람직할 수 있다. 다른 응용예에서, 본 발명의 구조물은 덜 공격적인 과정, 예를 들어, 삽입관, 침, 트로카 또는 케테터-타입 기구에의해 도입될 수 있다.
VIII 사용
본 발명의 방법 및 조성물은 다양한 장기에서 장기 기능을 확장하는데 사용될 수 있다.
(i) 신장
한 구체예에서, 본 발명은 신장 기능을 확장하는데 방법 및 조성물에 관한 것이다. 실제적으로 모든 신장병은 신장기능 상실을 초래하기 때문에, 대부분 경우에 치료의 주요한 초점은 신장 기능을 유지하는 것이다. 피검자는 전형적으로 필요이상의 신장 기능력을 가져서, 대부분 신장병은 인식할 만한 문제 또는 증상을 초래한 후에야 비로소 신장 기능의 90 %가 상실한다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 약 2% 이상의 기능, 바람직하게 약 5% 기능, 보다 바람직하게 약 10% 기능, 보다 더욱 바람직하게 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90% 기능을 하는 신장의 기능을 확장하는데 사용된다. 본 발명의 방법 및 조성물은 급성 및 만성 신장 장애 모두의 증상을 개선하는 데 사용될 수 있다. 확장될 수 있는 신장병은 이에 한정하지는 않지만, 예를 들어, 사구체병증, 즉 손상된 사구체 여과(예를 들어 급성 네프리틱 증상, 빠르게 진전되는 사구체 신염(RPGN), 사구체 경화증, 네프로틱 증상, 유린 침전(간뇨증, 단백뇨증)의 무증후 비정상 및 만성 사구체신염)와 관련된 사구체 신염, 또는 시스템 질병(예를 들어, 당뇨 신장병증 및 면역학적 매개된 다중 시스템 질병)과 관련한 2차적 사구체신염을 포함한다. 이것이 본 발명의 방법 및 조성물이 네프론의 특정 영역에 관련한 특수 장애 및 병변에 사용되도록 한다. 근세관 장애는 고염소혈증, 아미노산뇨증, 당뇨증, 인산뇨증, 요산뇨증, 또는 중탄산염뇨증으로 이끄는 비선택적 재흡수 장애를 명백히 한다. 부신 세관 산성증(RTA)는 여과된 탄산수소의 재흡수, 수소의 배출 또는 양쪽의 결함으로 인한 결과이다. 부신 세관 산성증은 특징적으로 고염소혈증 및 정상 사구체 기능과 관련되어 있다. RTA는 원 RTA(RTA-1), 근 RTA(RTA-2) 및 과칼륨성 RTA(RTA-4)로 분류될 수 있다. 마지막 것은 많은 과칼륨 상태에서 보여지는 것으로 결함은 칼륨의 증가된 세포 저장의 직접적인 결과로서 충분한 암모늄을 배출하는 세관의 무능력으로 특징지워진다.
(ii) 심장병
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 심장병 또는 장애를 가진 피검자의 심장 기능을 확장하는데 사용될 수 있다. 심장 기능상실은 미국에서 이환율 및 사망률의 주요한 원인중 하나이다. 심장 기능장애는 혈액을 펌프하는 심장의 능력을 줄이는 조건에 기인할 수 있다. 매우 자주, 심장 기능장애는 감소된 심장의 혈류에서 기인하여 심근의 감소된 수축때문이다. 심장 판막에 상해, 비타민 결핍, 및 주요한 심근 질병을 포함하는, 많은 다른 요소가 심장 기능장애의 결과를 가져온다(참조: 문헌[Guyton(1982)Human Physiology and Mechanisms of Disease, Third Edition, W.B. Saunders Co., Philadelphia, Pa, p.205]). 심장 기능장애는 주로 심근 균열 결절과 관련하여 명백하다(문헌[Manual of Medical Therapeutics(1989) Twnenty-Sixth Edition, Little, Brown & Co., Boston (W.C. Dunagan and M.I. Ridner, eds.),pp 106-09]).
인간의 심장 기능장애는 심장 출력을 줄이는 감소된 심근 수축성으로 시작한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 심장 기능을 확장하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 신형태 확장의 장기를 제조함으로써 손상되거나 경색된 심장의 영역 또는 허혈의 영역을 확장한다.
심장 질병은 협심증에 한정하지는 않지만, 심근 균열 결절 및 만성 허혈 심장병을 포함한다.
(iii) 비뇨 생식 장애
또 다른 실시예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 비뇨 생식 장기 질병 또는 장애를 가진 피검자에게서 비뇨 생식 장기 기능을 확장하는데 사용될 수 있다. 비뇨 생식 장애의 예는 이에 한정하지는 않지만, 방광, 수뇨관 및 요도에 관련된 것을 포함한다.
(iv) 비장 장애
비장은 면역계의 일부로서 위장 옆에 위치한 작은 장기로, 감염에 대한 신체를 보호하는 것을 돕고 혈액을 여과한다. 비장을 제거한 환자는 어떤 타입의 감염에 보다 큰 감수성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 비장 장애를 개선 또는 제어하는데 사용할 수 있는데, 예를 들어, 질병 또는 장애를 제어하는 제제를 발현하는것을 재조합한 세포를 사용하여 개질시킨다. 비장 장애의 예는, 이에 한정하지는 않지만, 원인불명의 자색반, 펠트 신드롬(Felty's syndrome), 호킨스 병(Hodgkin's disease), 및 면역반응-매개된 비장의 파괴를 포함한다.
본 발명이 사용되는 다른 구체예는 여기에서 개시된 발명의 상세한 설명의 고려 및 본 발명의 실행으로부터 당해 기술에서 당업자에게 자명할 것이다. 모든 미국 특허 및 다른 문헌은 어떤 이유에도 참고문헌에 특이하게 통합되어 여기에서 기술된다.
실시예 1: 신장 세포의 분리
작은 신장, 예를 들어 1주일된 C7 검은 마우스로부터, 탈캡슐화, 절개, 잘게 자르고 헤피스 15mM , pH 7.4 및 인슐린 0.5 ㎍/ml, 콜라겐 분해효소 1.0 mg/ml 및 디스파아제 0.5 mg/ml, 바실러스 폴리미살(Bacillus polymyxal(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN))로부터의 중성 단백질 분해 효소를 함유하는 Dulbecco's Modified Eagles's Medium(DMEM;Sigma, St.Louis, MO)으로 현탁했다.
큰 신장, 예를 들어 돼지 신장을 추출 3시간내에 부재 칼슘하 이글스 최소 필수 배지로 10분 동안 37℃에서 동맥으로 관류시켰다. 상기 신장을 염화 마그네슘 1.5 mM 및 염화칼슘 1.5mM으로 보충된 동일한 완충제에서 콜라겐 분해효소 0.5 mg/ml로 관류시켰다. 상기 신장을 이때 탈캡슐화, 절개, 잘게 자르고, 헤피스 15mM , pH 7.4 및 인슐린 0.5 ㎍/ml, 콜라겐 분해효소 1.0 mg/ml 및 디스파아제 0.5 mg/ml, 바실러스 폴리미살(Bacillus polymyxal(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN))로부터의 중성 단백질 분해 효소를 함유하는 Dulbecco's Modified Eagles's Medium(DMEM;Sigma, St.Louis, MO)으로 현탁했다.
신장 세포 현탁물을, 크거나 작은 신장중 하나로부터 온화하게 37℃에서 30분간 물중탕에서 교반했다. 상기 세포 및 조각을 5분 동안 50g로 원심분리하여 회수하였다. 펠렛을 단백질 분해를 중단하기 위해서 소 태아 혈청 10%(Biowhittaker, Walkersville, Maryland)를 함유하는 DMEM으로 재현탁하고, 현탁액을 80 메쉬 나이론 스크린으로 통과시켜서 큰 조각을 제거하였다. 상기 세포는 원심분리로 회수하고 부재칼슘하 Dulbecco's Modified Eagles's Medium으로 2번 세척하였다.
실시예 2: 신장 세포의 시험관에서 배양
(i) 래트(rat) 꼬리 콜라겐의 분리
힘줄을 래트 꼬리로부터 벗기고 50ml 튜브에 탈이온화한 물중에 아세트산 0.12 M으로 4℃에서 밤새 16시간 동안 저장하였다.
투석백을 균일한 구멍 크기를 확실히 하기 위하여 예비처리하고 중금속을 제거하였다. 간단히 투석백을 중탄산 나트륨 2%의 용액 및 0.05 % EDTA의 용액으로 침지시키고 10분간 끓였다. 증류수로 반복하여 세척하여 중탄산 나트륨 및 0.05% EDTA를 제거하였다.
래트 코리를 포함하는 아세트산 용액 0.12 M을 처리된 투석백에 놓고 아세트산을 제거하기 위하여 2 내지 3 일동안 투석하였다. 투석 용액을 매 3시간 내지 4시간마다 교체해 주었다.
(ii) 조직 배양 플레이트에 코팅
75 cm2의 배양 플라스크를 보충 배지 약 2ml의 총 부피로 콜라겐(Vitrogen 또는 래트 꼬리 콜라겐) 약 30 ㎍/ml, 인간 섬유결합소 10 ㎍/ml(Sigma, St. Louis,MO) 및 약 10 ㎍/ml 소 혈청 알부민(Sigma, St. Louis, MO)을 함유하는 용액으로 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션하여 코팅하였다.
(iii) 세포 배양
소화되어 단일하게 현탁된 신장 세포를 개질된 콜라겐 매트릭스에 약 1X106 세포/ml의 농도로 플레이팅하고 약 37℃에 이산화탄소 5%에서 소 태아 혈청 약 10%, 소 인슐린 약 5 ㎍/ml, 트랜스페린 약 10 ㎍/ml, 셀레나이트 나트륨 약 10 ㎍/ml, 히드로코르티손 약 0.5 μM, 프로스타그란딘 E2 약 10 ng/ml, 페니실린 G 100 unit/ml, 스트렙토마이신(Sigma, St.Louis, MO) 약 100 ㎍/ml로 보충된 DMEM에서 성장시켰다.
컨플루언스 단일층을 칼슘이온 부재 인산 완충제 살린(PBS)(KH2PO4 약 1.51 mM, NaCl 약 155.17 mM, Na2HPO.7H2O 약 2.8 mM)에서 약 0.05% 트립신, 약 0.53 mM EDTA(Gibco BRL, Grand Island, NY)으로 처리하여 2차 배양하였다. 상기 세포를 액체 배지에서 동결 및 저장을 위해서 약 10% DMSO인 배양 배지로 현탁하여 첫 계대로부터 임의 시간에 배양할 수 있다.
실시예 3: 내피 세포의 분리 및 배양
내피 세포를 절개된 정맥으로부터 분리하였다. 이전의 헤파린/파파베린 수용액을(헤파린 100 unit(최종 농도 4㎍/ml)을 함유하는 한크 균형잡힌 염 용액(HBSS) 25ml중의 묽은 염산 파파베린 3mg)을 사용하여 내피 세포 보전을 개선하였다. 근접 실크 루프를 정맥주위에 놓고 타이로 매었다. 작은 베노토미를 타이에 접하여 만들고 정맥 케뉼라의 끝을 삽입하여 2번째 타이로 그 자리에서 매었다. 두번째 베노토미를 근접한 타이 너머에 만들고 정맥을 온화하게 20% 소 태아 혈청 , ECGF(100mg/ml), L-글루타민, 헤파린(Sigma, 17.5 ㎍/ml) 및 항생물질-항항진균제로 보충한 배지 199/헤파린 용액 배지 199(M-199)로 세척하고 혈액 및 혈액 응고를 제거하였다. 콜라겐 분해 효소 용액(M-199 98ml, FBS 1ml, PSF 1ml으로 15-30분 동안 37℃에서 용해시킨 0.2% 워팅톤 타입 I 콜라겐 분해 효소로 여과로 살균함) 대략 1ml을 절개한 정맥을 통해서 세척하였다. 콜라겐 분해효소 용액을 사용하여 정맥을 온화하게 팽창시키고 팽창된 정맥을 한크 균형잡힌 염 용액(HBSS)를 함유하는 50ml 튜브에 놓았다. 콜라겐 용액 및 팽창된 정맥을 함유하는 튜브를 37℃에서 12분 동안 배양하고 정맥의 내부층을 소화하였다. 소화후에, 내피 세포를 함유하는 정맥의 내용물을 살균한 15ml 튜브로 제거하였다. 내피세포 현탁물을 10분간 125g로 원심분리하였다. 내피 세포를 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신(DMEM/FBS 10%)를 가진 Dulbecco's Modified Eagles's Media로 재현탁하고 디프코젤라틴 1%로 코팅한 24-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 내피 세포를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
밤새 인큐베이션 후에, 세포를 HBSS로 세척하고 신선한 DMEM/FBS 10% 1ml으로 놓았다. 배지를 일주일에 3번 교체하였다. 배양이 컨플루언스에 다다를때(3-7일 후에), 컨플루언스 단일층을 세포가 분산될 때까지 3-5분동안 약 0.05% 트립신, 약 0.53 mM EDTA로 처리하여 2차 배양을 하였다. 상기 분산된 세포를 0.1% 디프코젤라틴 으로 코팅한 배양 접시에 1:4 - 1:6 분할비로 플레이팅하였다. 내피 세포를 충분한 세포양이 이루어질 때까지 팽창시켰다. 세포를 트립신 처리하고 수집하고 세척하고 접종을 위해 수를 셌다.
실시예 4: 요로상피 및 평활근 세포의 분리 및 배양
수확한 세포를 본원에서 참고문헌에 특별히 통합된, 전에 발행된 프로토콜에 따라 배양되었다.(Atala et al., (1993) J.Urol. 150:608, Cilento et al.,(1994) J.Urol. 152:655, Fauza et al., (1998)J.Ped. Surg, 33, 7-12)
a) 요로상피 세포군락 배양
방광 표본을 얻고 배양을 위해 제조하였다. 세포의 손상을 최소화하기 위해서, 표본을 전기소작으로 절단하기보다 날카롭게 잘라냈다. 장막 표면을 봉합으로 표시하여 어떤 불명료도 없는 것을 확인하도록 어떤 면이 요로상피 표면인지를 나타내었다.
표본을 살균한 기구로 세포 배양 후드의 라미나에서 가공하였다. 배양 보충물로서 케라티노사이트-SFM(GIBCO BRL(Cat.No 17005), 소 뇌하수체 추출물(Cat.No 13028, 25 mg/500ml 배지), 및 재조합 표피 성장 인자(Cat.No. 13029, 2.5 ㎍/500ml 배지)을 가진 배양 배지를 제조하였다. 4℃에서 10ml 배양 배지를 2개 10cm 세포 배양 접시의 각각에 놓고 세번째 접시에 3.5ml를 놓았다. 표본을 첫번째 접시에 놓고 온화하게 앞뒤로 교반함으로써 표본으로부터 혈액을 제거하였다. 공정을 2번째 접시에서 반복하고 마지막으로 표본을 3번째 접시로 이동시켰다. 요로상피 표면을 자르는 것 없이 표본에 No.10 스칼펠 블레이드로 온화하게 긁었다. 상기 요로 상피 세포를 배지로 분산하는 작은 혼탁한 재료로서 볼 수 있었다. 요로상피 세포/배지 현탁을 흡입하고 각 웰당 전체 1 내지 1.5ml를 가지는 각 웰에 대략 0.5 내지 1ml의 배지을 가진 24-웰 배양 배지 플레이트의 6개 웰에 접종하였다. 세포를 5% 이산화탄소, 37℃에서 인큐베이션했다.
다음날(수확후 첫째날), 배지를 6개 웰로부터 흡입하고 신선한 배지를 적용하였다. 상기 세포를 4분동안 1000rpm에서 원심분리하고 상등액을 제거하였다. 상기 세포를 24-웰 플레이트에서 37℃로 가온한 3 내지 4.5ml 배지로 재현탁하였다.
배양 배지를 제거하고 PBS/EDTA(37℃,pH 7.2, 0.53mM EDTA(각각 PBS 500ml에서 0.5M EDTA 0.53ml,pH8.0))을 각 24-웰 플레이트 웰에 첨가하거나, 10ml를 각 10cm 접시에 첨가하였다. 2개의 10cm 접시에서 이때 상기 세포를 계대하였다. 여기서이후에 상기 세포를 80 내지 90% 컨플루언스가 될때마다 세포가 100% 컨플루언스가 되는것을 허용하지 않고 계대하였다.
세포를 위상차 현미경하에서 관찰하였다. 세포-세포 연결을 대부분의 세포를 위해 분리시키고(대략 5 내지 15분), PBS/EDTA를 제거하고 300㎕ 트립신/EDTA(37℃, GIBCO BRL, Cat.No.25300-054)을 각각 24-웰 플레이트 웰에 첨가하거나 각 10cm 접시에 7ml을 첨가하였다. 플레이트/접시를 주기적으로 교반하였다. 상기 세포의 80 내지 90%를 플레이트로부터 떨어뜨리고 부유되기 시작할 때(대략 3 내지 10분), 트립신의 작용을 콩 트립신 저해제(GIBCO BRL,Cat.No 17075-029, PBS 20ml에 저해제 294 mg)30㎕를 각 24-웰 플레이트 웰 또는 700㎕를 각 10cm 접시에 첨가함으로써 EDTA의 작용을 정지시켜 저해하였다. 배양 배지 0.5ml을 각 24-웰 플레이트 웰에 첨가하거나 배양 배지 3ml을 각 10cm 접시에 첨가하였다. PBS/EDTA 및 트립신/EDTA 인큐베이션을 실온에서 수행하였으나, 플레이트가 37℃에서 인큐베이션된다면 보다 효과적이다.
상기 세포를 4분 동안 1000 rpm 에서 원심분리하여 수확하고 상등액을 제거하였다. 상기 세포를 배양 배지 5ml으로 재현탁하고 세포의 수를 헤마토사이토미터를 사용하여 측정하였다. 세포 생존율을 표준 트립판 블루 염색 테스트로 측정하였다. 100mm 배양 플레이트에 대한 최적 접종 농도를 대략 1X106 세포/플레이트로 하였다. 목적하는 세포수를 접시에 분취하고 배지의 부피를 총 대략 10ml/플레이트로 첨가하였다.
b) 방광 평활근 세포의 배양
위에서 기술한 바와 같이 방광 표본으로부터 요로상피 세포층을 제거한 후에 잔여 근육을 2-3mm 근육 조각으로 절개하였다. 각 근육 조각을 100 mm 세포 배양 접시에 고르게 배분하였다. 근육 조각을 건조하고 접시에 고착되도록 하였다(대략 10분). 10% FCS를 가진 Dulbecco's Modified Eagles's Media의 20ml을 건조된 근육 조각에 첨가하였다. 근육 조각을 5% 이산화탄소 37℃에서 방해없이 5일동안 인큐베이션시켰다. 배양 배지를 6번째 날에 교체하고 임의의 비고착 조각을 제거하였다. 모든 근육조각이 제거된 후에 잔여 조각을 총 10일동안 배양하였다. 접시에 고착한 근육 조각으로부터 세포가 세포의 작은 섬이 나타날 때까지 인큐베이션시켰다. 상기 세포를 트립신 처리하고 세포수를 세고 T75 배양 플라스크로 접종하였다.
상기 세포를 3일마다 세포의 농도에 따라 배지를 공급하고 80-90 % 컨플루언스가 될 때까지 계대하였다.
실시예 5: 심장 세포의 분리 및 배양
이 실시예는 심장 세포를 배양하는 한 방법을 기술한다. 심장세포, 예를 들어 심방 조직을 포유동물로부터 얻을 수 있었다. 심방 조직을, 예를 들어 심장-폐 두름 수술을 요구하는 과정을 겪은 심장혈관 외과 환자로부터 수확된 우심방부속기관으로부터 얻을 수 있다. 상기 부속기관을 제거하고 세척을 위해 냉-살린 슬러쉬에 놓았다. 세포 수확에 포함되는 결합 조직의 양을 줄이는 스칼펠을 사용하여, 거친 심장 외막 덮개를 제거할 수 있었다. 남은 심방 근육을 잘라서 작은(0.5-1.0 mm3)조각으로 하고 칼슘 또는 망간 부재(Whittaker,Walkerville,Mass)의 찬 한크 균형잡힌 염 용액(HBSS)에 놓았다. 자른 심방 조직을 1.43 mg/ml의 농도에서 콜라겐 용액(Worthington, Freehold,N.J.) 0.14%로 소화할 수 있었다. 상기 조각을 상기 용액 35ml에 놓고 한시간 동안 125 RPM에서 37℃의 교반기에서 소화할 수 있었다. 상등액을 심방조직에서 제거하고 37℃에서 10분 동안 3500 RPM으로 원심분리할 수 있었다. 상등액을 회전시키고 한시간동안 소화를 계속하는 동안, 또 다른 콜라겐 분해 효소 용액 35ml을 자른 조직에 놓을수 있었다. 상등 콜라겐 분해 효소 용액을 제거하고 3번째 소화에 사용을 위해 저장할 수 있었다. 세포 펠렛을 30% 염소 신생아 혈청(Whittaker)및 0.1% 항생물질 용액- 페니실린 G 10,000 unit/cc, 스트렙토마이신 10,000 ㎍/cc 및 25 ㎍/cc 앰포테리신 B(Gibco, Grand Island, N.Y.)을 함유하는 Earle's Salts(Whittaker)를 가진 Eagles's Minimal Essential Medium(EMEM)의 2ml으로 재현탁할 수 있었다. 이 과정은 추가의 소화를 위해 계속될 수 있었다.
다양한 소화를 풀링(pool)하고 세포 농도를 헤마토사이토미터를 사용하여 확인하고 EMEM으로 1X105 세포/ml로 조정할 수 있었다. 상기 세포를 35 mm 젤라틴 코팅한 접시(Corning, Corning, N.Y.)에 플레이팅하고 5% 이산화탄소 대기에서 37℃로 인큐베이션할 수 있었다. 배지를 매 3일마다 성장하는 첫번째 2주동안에 교체하고 그이후에 매 5일 내지 7일마다 교체할 수 있었다. 배양을 접종하여 컨플루언스에 접근할 때, 배양액을 트립신으로 처리하고 EMEM중의 60mm 젤라틴 코팅된 접시(Corning)으로 이동할 수 있다. 세포가 컨플루언스에 접근할 때, 상기 세포를 트립신 처리하고 MCDB 107(Sigma, saint Louis, Mo.)중의 T-75 플라스크(Corning)으로 이동시킬 수 있었다.
MCDB 107 에서 성장한 세포의 부분을 4개 방 젤라틴 코팅된 슬라이드 배양 플레이트(Lab Tek, Naperville, Ill.)에 플레이팅할 수 있었다. 대조군 세포를 소 태아 혈청 20%, L-글루타민 1%, 인슐린 5 mg/ml의 0.1%-트랜스페린 5 mg/ml-셀레니어스산(Collaborative Research Inc.) 5㎍/ml, 헤파린 0.6ml(M199에 0.015%), 항생물질-항진균제 용액(Gibco Laboratories: 페니실린 G 나트륨 10,000 unit/ml, 황화 스트렙토마이신 100,000 mcg/ml 및 앰포테리신 B 25 mcg/ml), 및 Biotechnology Research Inst., Rockville, Md로부터 내피 세포 성장 보충제(ECGS) 300 ㎍/ml를 가진 M199에서 성장할 수 있는 인간 탯줄 내피세포 및 인간 피부 섬유모세포 배양(Beaumont Research institute, Royal Oak, Mich.)일 수 있었다. 대조군 배양 및 수확된 세포를 접종하여 컨플루언스에 접근할 때, 상기 세포를 HBSS로 세척하고 10분 동안 포르말린 10%로 세척할 수 있었다. 방을 제거하고 플레이트에 남은 세포를 평활근 알파-엑틴(Lipshaw, Detroit, Mich.), 가로무늬근 특정 미오신(Sigma, St.Louis, Mo.), 미오글로빈(Dako, Carpinteria, Calif), 팩터 VIII(Lipshaw, Detroit, Mich.)및 심방나트륨이뇨인자 펩타이드(Research and Diagnostic Antibodies, Berkeley, Calif.)에 대해 면역과산화 효소로 염색할 수 있었다. 상기 플레이트를 이때 광학 현미경을 사용하여 조사할 수 있었다.
MCDB 107에서 성장한 세포의 부분을 젤라틴 코팅된 96-웰 플레이트에(Corning) 플레이팅할 수 있었다. 상기 세포을 접종하여 컨플루언스에 접근했을 때 HBSS로 세척하고 pH 7.4, 글루타알데히드 2.5% 및 카코디에이드 완충제 0.2M(Polysciences, Inc., Warrington, Pa)로 고정하고, 오스미움 테트로사이드(Polysciences, Inc.) 1%로 이후-고정하고, 에폰 LX-112 레진(Ladd's Research, Burlington, Va.)으로 묻고, 납 구연산 0.03%(Eastman Lodak, Rochester, N.Y.) 및 에틸 알콜 50%중의 우라닐 아세테이트(Pelco Co., Tustin, Calif.)로 염색하고, 그리고 나서 투과 전자현미경하에서 관찰할 수 있었다.
실시예 6: 탈세포화된 장기 또는 장기의 일부의 제조
다음의 방법은 복잡한 3차원 장기 또는 조직의 인프라-구조를 파괴없이 장기 또는 조직의 전체 세포 내용물을 제거하는 방법을 기술한다. 신장을 조직 제거의 표준 기술을 사용하여 C7 검은 마우스로부터 외과적으로 제거하였다. 신장을 분리된 신장을 덮는 증류수의 적합한 부피를 함유하는 플라스크에 놓았다. 자석 교판 플레이트 및 자석 교반기를 사용하여 4℃에서 24-48시간 동안 적합한 속도로 증류수에서 분리된 신장을 회전시켰다. 이런 과정은 세포 부스러기 및 분리된 신장을 둘러싼 세포막을 제거한다.
이러한 첫번째 제거 단계후에, 증류수를 트리톤 X-100 0.5%을 함유하는 수산화 암모늄 용액 0.05%로 대체하였다. 신장을 자석 교판 플레이트 및 자석 교반기를 사용하여 4℃에 72시간동안 이 용액에서 회전시켰다. 이 알칼리성 용액이 분리된 신장의 핵 및 세포질 구성요소를 용해시켰다. 세제 트리톤 X-100을 사용하여 신장의 핵 구성요소를 제거하고, 수산화 암모늄 용액을 사용하여 분리된 신장의 세포막 및 세포질 단백질을 분해시켰다.
분리된 신장을 이때 자석 교반 플레이트 및 자석 교반기를 사용하여 4℃에서 24-48시간 동안 증류수로 세척하였다. 이런 세척 단계후에, 분리된 것으로부터 세포 구성요소의 제거를 신장의 작은 조각의 조직학적 분석으로 확인하였다. 만약 필요하다면, 분리된 신장의 전체 세포 내용물을 제거할 때까지 트리톤 X-100을 함유하는 수산화 암모늄 용액으로 분리된 신장을 다시 처리하였다. 용해된 구성요소의 제거후에, 분리된 신장의 모양에서 콜라겐 3차원 골격을 생산하였다.
이런 탈세포화된 신장을 자석 교반 플레이트 및 자석 교반기를 사용하여 4℃에서 밤새 탈세포화된 신장을 회전시켜서 1X 인산 완충 용액으로 평형화시켰다. 평형후에, 탈세포화된 신장을 진공하에서 밤새 동결건조하였다. 동결건조된 신장을 산화 에틸렌 기체를 사용하여 72시간 동안 살균시켰다. 살균후에, 탈세포화된 신장을 즉시 사용하거나, 필요할 때까지 4℃ 또는 실온에서 저장하든지 하였다. 저장된 장기를 4℃에서 밤새 조직 배양 배지에서 평형화한 후에 배양된 세포로 접종하였다.
실시예 7: 신장 확장 장기 구조의 제조
이 실시예는 장기, 예를 들어 신장의 한곳 이상의 영역으로 이식하는 웨이퍼를 제조하는 것을 기술한다. 신장 실질에 위치시키기 위하여 신장 조직 매트릭스(웨이퍼)의 크기 및 구성을 측정하였다. 예를 들어, 약 1mm두께 매트릭스는 길이 및 너비에서 약 2cm이다. 단일 현탁된 신장 세포를 10x106 세포/cm3의 농도에서 신장 조직 매트릭스에 접종하였다. 상기 세포를 37℃에서 약 2시간동안 매트릭스 벽에 부착하도록 하였다. 상기 매트릭스를 반대쪽으로 뒤집고 단일 현탁된 신장 세포를 신장 조직 매트릭스에 접종하였다. 상기 세포를 37℃에서 약 2시간동안 매트릭스 벽에 부착하도록 하였다. 인큐베이션이 완료된 후에 배양 배지를 천천히 플라스크에 추가하여 전체 신장 매트릭스를 덮었다. 상기 매트릭스내에 상기 세포를 방해하지 않도록 주의를 기하였다. 상기 매트릭스를 이산화탄소 인큐베이터에서 37℃로 인큐베이션하였다. 배양 배지를 생산된 젖산의 수준에 따라 매일 또는 보다 자주 교체하였다. 첫 접종후 4일째에 균일한 세포 분배 및 성장을 이루기 위하여 세포-매트릭스 시스템을 추가 3일 동안 회전하는 생물반응기 시스템에 놓았다.
실시예 8: 신장 확장 장기 구조의 이식
신장 확장 장기 웨이퍼를 장기, 예를 들어 신장의 하나 또는 이상의 영역에 놓았다. 수용자 신장의 표면을 노출시켰다. 신장 혈관을 혈액 누출을 최소화하기 위하여 혈관 클램프로 일시적으로 크램핑하였다. 신장 실질 세포에 접근하기 위하여 신장 캡슐에 절개를 하였다. 상기 캡슐을 실질 세포로부터 주의깊게 밀어내야만 한다. 신장 조직 매트릭스의 크기 및 모양에서 유사한 신장 실질 조직을 제거동안에 수집 시스템을 파괴없이 제거하였다. 세포를 접종한 신장 조직 매트릭스를 신장 실질 세포에 놓고 신장 캡슐을 이식한 신장 조직 매트릭스에 봉합하였다. 혈관 클램프를 재순환을 위해 제거하였다. 수분 동안 이식에 대한 온화한 압력으로 지혈을 하였다. 지혈후에, 상처를 봉합하였다. 이식 다음에, 신장 확장 장기 구조에서 세포의 성장 및 발달을 조사하였다. 이식 1주후에 신장 생체매트릭스의 사진은 세포의 생존 및 X 100 확대(사진에서 보이지 않음) 카르보시아닌, 친유성 붉은 형광 추적기로 포지티브 테스트를 보여준다. 이식 4주후에, 관 및 사구체 유사 구조의 형성을 보여준다(H&E x200, 사진에는 보이지 않음). 상기 관 구조의 발달은 이식 8주후에 계속되었다.

Claims (10)

  1. 매트릭스 재료를 배양된 세포의 하나 이상의 군락으로 관류시켜서 상기 세포가 매트릭스 재료에 부착하여 장기 기능을 확장할 수 있는 조직층을 생성하도록 형성된 3차원 생체매트릭스를 포함하는 장기의 기능을 확장하기 위한 인공 장기 구조물.
  2. 제 1항에 있어서, 구조물이 세포를 소형-매트릭스 재료상에 관류시켜서 형성됨을 특징으로 하는 구조물.
  3. 제 1항에 있어서, 구조물이 심장, 신장, 간장, 췌장, 비장, 방광, 수뇨관 및 요도로 구성된 군으로부터 선택된 장기를 확장하도록 선택됨을 특징으로 하는 구조물.
  4. 제 1항에 있어서, 매트릭스 재료가 탈세포화된 조직임을 특징으로 하는 구조물.
  5. 제 1항에 있어서, 매트릭스 재료가 하이드로젤임을 특징으로 하는 구조물.
  6. 제 1항에 있어서, 매트릭스 재료가 중합체임을 특징으로 하는 구조물.
  7. 제 2항에 있어서, 매트릭스의 최대 크기가 50 밀리미터 미만임을 특징으로 하는 구조물.
  8. 제 1항에 있어서, 매트릭스가 최대 크기 대 두께의 비율이 5:1 초과인 실질적으로 평평한 구조임을 특징으로 하는 구조물.
  9. 제 1항에 있어서, 구조물이, 매트릭스 재료를 신장 세포의 군락으로 관류시켜 상기 신장 세포가 매트릭스에 부착하여 네프론 구조 또는 네프론 구조의 일부로 분화하는 조직층을 생성함으로써 신장 기능을 확장하도록 형성된 3차원 생체매트릭스를 포함하는 신장 기능 확장 구조물임을 특징으로 하는 구조물.
  10. 제 1항에 있어서, 매트릭스가 초기에 내피 세포의 군락으로 관류되어서 상기 내피 세포가 매트릭스에 부착하여 혈관계를 포함하는 내피 조직층을 생성하고, 그 후에 세포의 제 2 군락이 접종되어서 상기 제 2 세포 군락이 혈관계를 포함하는 내피 조직층에 부착하고 분화하여 장기 기능을 확장함을 특징으로 하는 구조물.
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