CN114317398A - Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用 - Google Patents
Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114317398A CN114317398A CN202011034452.3A CN202011034452A CN114317398A CN 114317398 A CN114317398 A CN 114317398A CN 202011034452 A CN202011034452 A CN 202011034452A CN 114317398 A CN114317398 A CN 114317398A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cells
- gli1
- liver
- epcam
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010016200 Zinc Finger Protein GLI1 Proteins 0.000 title claims abstract description 274
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 title claims abstract description 163
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 68
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 title abstract description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 449
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 claims abstract description 159
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 claims abstract description 156
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims abstract description 150
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 94
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 claims abstract description 72
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims abstract description 58
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 claims abstract description 54
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract description 38
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 21
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 83
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 45
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 claims description 42
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 36
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 30
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 29
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 claims description 26
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 24
- 101000998011 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 claims description 17
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 claims description 17
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 16
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 15
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N DAPT Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)OC(C)(C)C)C=1C=CC=CC=1)C(=O)CC1=CC(F)=CC(F)=C1 DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N 0.000 claims description 14
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 14
- 238000011977 dual antiplatelet therapy Methods 0.000 claims description 14
- 210000003897 hepatic stem cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 claims description 12
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 9
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 8
- 102100022544 Bone morphogenetic protein 7 Human genes 0.000 claims description 7
- 102100028412 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 claims description 7
- 102100035290 Fibroblast growth factor 13 Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 7
- 101000899361 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 7 Proteins 0.000 claims description 7
- 101000917237 Homo sapiens Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 claims description 7
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 claims description 7
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 claims description 6
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims description 5
- ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N Glu-Gly-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N 0.000 claims description 5
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 claims description 5
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 claims description 5
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000868152 Homo sapiens Son of sevenless homolog 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 5
- 239000012574 advanced DMEM Substances 0.000 claims description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 5
- 101000975502 Homo sapiens Keratin, type II cytoskeletal 7 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000692455 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor beta Proteins 0.000 claims description 4
- 102100023974 Keratin, type II cytoskeletal 7 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010051742 Platelet-Derived Growth Factor beta Receptor Proteins 0.000 claims description 4
- 102000018967 Platelet-Derived Growth Factor beta Receptor Human genes 0.000 claims description 4
- 102100026547 Platelet-derived growth factor receptor beta Human genes 0.000 claims description 4
- 101100096242 Mus musculus Sox9 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 abstract description 34
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 20
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 18
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 abstract description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 24
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 22
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 16
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 13
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 10
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 10
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N carbon tetrachloride Substances ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 10
- 231100000012 chronic liver injury Toxicity 0.000 description 10
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 10
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 10
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 10
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical group O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 9
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 9
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 8
- 230000008410 smoothened signaling pathway Effects 0.000 description 8
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 8
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 7
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- KVQOGDQTWWCZFX-UHFFFAOYSA-N 2-[[3-[[2-(dimethylamino)phenyl]methyl]-2-pyridin-4-yl-1,3-diazinan-1-yl]methyl]-N,N-dimethylaniline Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=C1CN1C(C=2C=CN=CC=2)N(CC=2C(=CC=CC=2)N(C)C)CCC1 KVQOGDQTWWCZFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 231100000439 acute liver injury Toxicity 0.000 description 6
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 6
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 101150038994 PDGFRA gene Proteins 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 5
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 5
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000012174 single-cell RNA sequencing Methods 0.000 description 5
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 5
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 210000001631 vena cava inferior Anatomy 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 3
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 description 3
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 3
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 108010088665 Zinc Finger Protein Gli2 Proteins 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009693 chronic damage Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 3
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 3
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 3
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- FOORCIAZMIWALX-ULJHMMPZSA-N (z)-n-(4-benzylpiperazin-1-yl)-1-(3,5-dimethyl-1-phenylpyrazol-4-yl)methanimine Chemical compound CC1=NN(C=2C=CC=CC=2)C(C)=C1\C=N/N(CC1)CCN1CC1=CC=CC=C1 FOORCIAZMIWALX-ULJHMMPZSA-N 0.000 description 2
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 2
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 2
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 2
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 101100204372 Mus musculus Sufu gene Proteins 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 SANT1/2/3/4 Chemical compound 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000002570 interstitial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002032 lab-on-a-chip Methods 0.000 description 2
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- OUBCNLGXQFSTLU-UHFFFAOYSA-N nitisinone Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC(C(F)(F)F)=CC=C1C(=O)C1C(=O)CCCC1=O OUBCNLGXQFSTLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001721 nitisinone Drugs 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000025934 tissue morphogenesis Effects 0.000 description 2
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000002620 vena cava superior Anatomy 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000748236 Australasian lineages Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- QASFUMOKHFSJGL-LAFRSMQTSA-N Cyclopamine Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H](CC2=C3C)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@@]13O[C@@H]2C[C@H](C)CN[C@H]2[C@H]1C QASFUMOKHFSJGL-LAFRSMQTSA-N 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150002615 Foxl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 244000060234 Gmelina philippensis Species 0.000 description 1
- 238000012752 Hepatectomy Methods 0.000 description 1
- 102100022054 Hepatocyte nuclear factor 4-alpha Human genes 0.000 description 1
- 101150068639 Hnf4a gene Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001045740 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 4-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000998020 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 18 Proteins 0.000 description 1
- 101001046960 Homo sapiens Keratin, type II cytoskeletal 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000610551 Homo sapiens Prominin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102100033421 Keratin, type I cytoskeletal 18 Human genes 0.000 description 1
- 102100022905 Keratin, type II cytoskeletal 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150023976 Krt19 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150017554 LGR5 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100503268 Mus musculus Foxl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102100040120 Prominin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 235000011449 Rosa Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150117918 Tacstd2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100027212 Tumor-associated calcium signal transducer 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000013354 cell banking Methods 0.000 description 1
- 230000007348 cell dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011278 co-treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- QASFUMOKHFSJGL-UHFFFAOYSA-N cyclopamine Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C(CC2=C3C)C1C2CCC13OC2CC(C)CNC2C1C QASFUMOKHFSJGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000002782 epithelial mesenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000037219 healthy weight Effects 0.000 description 1
- 210000000514 hepatopancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000004777 loss-of-function mutation Effects 0.000 description 1
- 238000000838 magnetophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- NTGBUUXKGAZMSE-UHFFFAOYSA-N phenyl n-[4-[4-(4-methoxyphenyl)piperazin-1-yl]phenyl]carbamate Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1N1CCN(C=2C=CC(NC(=O)OC=3C=CC=CC=3)=CC=2)CC1 NTGBUUXKGAZMSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000009124 positive feedback regulation Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008458 response to injury Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000007651 self-proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 231100000748 severe hepatic injury Toxicity 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- BPQMGSKTAYIVFO-UHFFFAOYSA-N vismodegib Chemical compound ClC1=CC(S(=O)(=O)C)=CC=C1C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(C=2N=CC=CC=2)=C1 BPQMGSKTAYIVFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004449 vismodegib Drugs 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用。本发明揭示了一种全新分离的细胞群，其为Gli1+细胞群，较佳地其为EpCAM+/Gli1+细胞群。所述细胞具有肝干/祖细胞特性，具有分化/转分化形成肝细胞的功能、肝脏损伤修复作用，以及能够形成肝脏类器官。本发明还提供了分选所述细胞的方法，利用所述细胞来制备肝脏类器官的方法等。本发明为肝损伤修复机理提供了新支持，为肝脏再生的研究和临床应用提供了新途径。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域；更具体地，本发明涉及Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用。
背景技术
肝脏作为机体内最大的实质性器官，也是人体内最大的消化腺，在维持机体新陈代谢过程中处于核心地位，且具有强大的解毒能力和再生能力。当肝脏受到病毒、药物、酒精等致病因素的损伤后，残存肝组织可再生恢复至原有体积和重量，最终达到肝脏组织结构的重建及肝功能的恢复。临床上常见的慢性、持续性的肝脏损伤，对肝脏功能损害表现明显。研究表明，参与肝脏损伤修复过程的细胞种类与肝损伤的程度密切相关。在肝脏受到轻度损伤时，主要由肝实质细胞发生增殖，进行损伤修复。而肝脏受到严重损伤且肝细胞再生发生障碍时，肝细胞坏死增多，无法仅仅依靠肝细胞再生完成修复，往往需要肝非实质性的细胞的参与。在这种情况下，肝组织将启动包括肝干/祖细胞分化、胆管细胞转分化和肝细胞的去分化等在内的过程对受损的肝脏进行修复(图1)。
然而，到目前为止，对受损肝脏如何启动这一过程的分子机制却所知甚少。近年研究显示，肝细胞移植可以作为一种有效的替代治疗手段，帮助部分肝衰竭患者渡过危险期等待肝移植，在部分肝衰竭患者肝细胞移植甚至可以直接取得令人满意的疗效，因而为肝衰竭的治疗提供了一种新的选择。尽管肝细胞在体内具有强大的损伤修复能力，但是在体外成熟肝细胞的长时间培养一直是一个世界性难题，这也对相关肝损伤疾病的临床治疗形成了制约。
因此，肝脏损伤修复过程的分子机制以及在此基础上进行体外肝细胞长期培养和进一步的人工干预肝细胞的增殖仍然是生命科学目前研究的重点之一。
发明内容
本发明的目的在于提供Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用。
在本发明的第一方面，提供细胞或细胞培养物的应用，用于：制备转分化形成肝细胞的组合物，制备进行肝脏损伤修复的组合物，或制备肝脏类器官；其中，所述细胞为Gli1+细胞，且包括以下特征：(i)具有肝干/祖细胞特性，(ii)具有分化/转分化形成肝细胞的功能，(iii)具有肝脏损伤修复作用，和/或(iv)能够形成肝脏类器官。
在一个优选例中，所述的组合物包括培养物。
在另一优选例中，所述细胞为Gli1+和EpCAM+细胞。
在另一优选例中，所述细胞还包括选自下组的特征：具有上皮(样)细胞特征，或表达上皮细胞标志物；具有间充质(样)细胞特征，或表达间充质细胞标志物；能形成类器官且该类器官具有间胆管(样)细胞特征，或表达胆管细胞标志物。
在另一优选例中，所述胆管细胞标志物包括选自下组的标志物：KRT19、SOX9。
在另一优选例中，所述上皮细胞标志物包括选自下组的标志物：EpCAM，KRT7 和KRT19。
在另一优选例中，所述***标记物包括选自下组的标志物：PDGFRα和 PDGFRβ。
在另一优选例中，所述的细胞包括传代的细胞。
在另一优选例中，所述传代的细胞，包括传代1～30代，更具体如2，3，5，8， 10，12，15，18，20，25代。
在本发明的另一方面，提供一种分离的细胞或细胞培养物，所述细胞为Gli1+ 细胞且包括以下特征：(i)具有肝干/祖细胞特性，(ii)具有分化/转分化形成肝细胞的功能，(iii)具有肝脏损伤修复作用，和/或(iv)能够形成肝脏类器官。
在一个优选例中，所述细胞为Gli1+和EpCAM+细胞。
在另一优选例中，所述的细胞还包括选自下组的特征：具有上皮(样)细胞特征，或表达上皮细胞标志物；具有间充质(样)细胞特征，或表达间充质细胞标志物；能形成类器官且该类器官具有间胆管(样)细胞特征，或表达胆管细胞标志物。
在另一优选例中，所述Gli1+细胞通过包括以下的方法分离获得：利用特异性结合或捕获Gli1的结合分子(如抗体)或捕获分子，从肝组织的分离物中将Gli1+细胞分选出。
在另一优选例中，所述Gli1+和EpCAM+细胞通过包括以下的方法分离获得：利用特异性结合或捕获Gli1和EpCAM的结合分子(如抗体)或捕获分子，从肝组织的分离物中将Gli1+和EpCAM+细胞分选出。
在另一优选例中，所述的肝组织的分离物包括：肝脏组织或对组织进行处理后的产物，更具体如细胞悬液。
在本发明的另一方面，提供一种分离或富集细胞或细胞培养物的方法，所述细胞为Gli1+细胞且包括以下特征：(i)具有肝干/祖细胞特性，(ii)具有分化/转分化形成肝细胞的功能，(iii)具有肝脏损伤修复作用，和/或(iv)能够形成肝脏类器官；所述方法包括：利用特异性结合或捕获Gli1的结合分子(如抗体)或捕获分子，从肝组织的分离物中将Gli1+细胞分选出。
在一个优选例中，所述细胞为Gli1+和EpCAM+细胞，所述方法包括：利用特异性结合或捕获Gli1和EpCAM的结合分子(如抗体)或捕获分子，从肝组织的分离物中将Gli1+和EpCAM+细胞分选出。
在另一优选例中，所述分选细胞的方法包括(但不限于)：流式细胞分选法，免疫磁珠分选法，微流控细胞分选法，粘附法。
在本发明的另一方面，提供一种制备肝脏类器官的方法，包括：培养前面任一所述的细胞或细胞培养物，使之生长和分化，从而获得肝脏类器官。
在一个优选例中，所述方法包括：
(1)提供前面任一所述的细胞或细胞培养物，或利用前面任一所述的方法获得细胞或细胞培养物；
(2)将(1)的细胞或细胞培养物进行生长培养；较佳地还进行1～5次(如2，3，4 次)传代；
(3)将(2)获得的培养物进行分化培养，从而获得肝脏类器官。
在另一优选例中，(2)中，进行生长培养的培养基中含有Advance DMEM/F12培养液，其中添加HEPES，GlutaMAX-1，primocin，B27，N-Acetylcysteine， Nicotinamide，A83-01，Y27632，EGF，FGF10，FGF2，R-Spondin，Noggin。
在另一优选例中，(3)中，进行分化培养的培养基中，含有Advance DMEM/F12 培养液，其中添加EGF，DAPT，HEPES，GlutaMAX-1，primocin，B27，Y27632， DAPT，BMP7，HGF，制瘤素M。
在另一优选例中，进行生长培养的培养基中，含有：Advance DMEM/F12培液，以及：10mM HEPES，2nM GlutaMAX-1，500×primocin，1×B27，1.56mM N-Acetylcysteine，10mMNicotinamide，0.5μM A83-01，10μM Y27632，50ng/mL EGF，10ng/mL FGF10，1ng/mL FGF2，R-Spondin(10％)和Noggin(10％)；各含量配方在50％范围内(较佳地40％范围内，更佳地30％范围内，如20％、15％、10％、 5％范围内)可上下浮动。
在另一优选例中，进行分化培养的培养基中，含有：Advance DMEM/F12培液中，以及50ng/mL EGF，10μM DAPT，10mM HEPES，2mM GlutaMAX-1， 500×primocin，1×B27，10μMY27632，10μM DAPT，25ng/mL BMP7，25ng/mL HGF 和20ng/ml制瘤素M；各含量配方在50％范围内(较佳地40％范围内，更佳地30％范围内，如20％、15％、10％、5％范围内)可上下浮动。
在另一优选例中，所述的类器官还包括选自下组的类器官：传代的类器官，连续培养的类器官，经冷冻保存和/或复苏的类器官。
在另一优选例中，所述传代的类器官，包括传代1～30代，更具体如2，3，5， 8，10，12，15，18，20，25代。
在另一优选例中，所述培养包括：三维(3D)培养，或二维(2D)培养；较佳地为三维(3D)培养。
在另一优选例中，所述的方法为体外方法。
在另一优选例中，所述的方法为不以疾病诊断或治疗为直接目的的方法(非诊断性或非治疗性的)。
在本发明的另一方面，提供一种人工建立的肝脏类器官，其由前面任一所述的细胞或细胞培养物经生长和分化获得；或，其由前面任一所述的制备肝脏类器官的方法制备获得。
在本发明的另一方面，提供一种用于分离或富集前面任一所述的细胞或细胞培养物的试剂盒，包括：Gli1结合分子或捕获分子，和EpCAM结合分子或捕获分子。
在本发明的另一方面，提供一种用于制备肝脏类器官的试剂盒，包括：Gli1结合分子或捕获分子，EpCAM结合分子或捕获分子，以及进行类器官培养的试剂。
在本发明的另一方面，提供一种用于制备肝脏类器官的试剂盒，包括：前面任一所述的细胞或细胞培养物，以及进行类器官培养的试剂。
在一个优选例中，所述进行类器官培养的试剂包括：进行生长培养的培养基，其含有：Advance DMEM/F12培养液，其中添加HEPES，GlutaMAX-1，primocin， B27，N-Acetylcysteine，Nicotinamide，A83-01，Y27632，EGF，FGF10，FGF2， R-Spondin，Noggin。
在另一优选例中，所述进行分化培养的培养基，其含有Advance DMEM/F12培养液，其中添加EGF，DAPT，HEPES，GlutaMAX-1，primocin，B27，Y27632， DAPT，BMP7，HGF，制瘤素M。
在本发明的另一方面，提供Gli1的应用，用于筛选肝干/祖细胞，或用于制备筛选肝干/祖细胞的组合物。
在本发明的另一方面，提供Gli1和EpCAM的组合的应用，用于筛选肝干/祖细胞，或用于制备筛选肝干/祖细胞的组合物。
在本发明的另一方面，提供一种筛选促进肝细胞再生或促进肝脏修复的物质(潜在物质)的方法，所述方法包括：
(1)用候选物质处理肝组织的分离物；和
(2)检测所述肝组织的分离物的细胞表面分子特性，若其中Gli1+细胞在统计学上增加(如在整个分离物细胞群体中，Gli1+细胞量占比增加5％以上，10％以上，20％以上，50％以上，80％以上等)，则该候选物质是促进肝细胞再生或促进肝脏修复的物质(潜在物质)。
在另一优选例中，在检测所述分离物的细胞表面分子特性时，还包括检测 EpCAM；若其中Gli1+EpCAM+细胞在统计学上增加(如在整个分离物细胞群体中， Gli1+EpCAM+细胞量占比增加5％以上，10％以上，20％以上，50％以上，80％以上等)，则该候选物质是促进肝细胞再生或促进肝脏修复的物质(潜在物质)。
在另一优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述分离物中；和/或。
在另一优选例中，步骤(2)包括：检测所述分离物中Gli1+细胞或Gli1+EpCAM+ 细胞的量；并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的分离物；若测试组中Gli1+细胞或Gli1+EpCAM+细胞在统计学上增加，则该候选物质是促进肝细胞再生或促进肝脏修复的物质。
在另一优选例中，所述的肝组织的分离物包括：肝脏组织或对组织进行处理后的产物，更具体如细胞悬液。
在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对肝细胞或其中的Gli1 或其编码基因设计的调控分子或其构建体(如基因编辑试剂，过表达载体，用于重组改造(如过表达)的重组的病毒或非病毒构建体等)，化学小分子(如特异性激动剂、增强剂)，相互作用分子等。
在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于促进肝细胞再生或促进肝脏修复有用的物质。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、肝脏损伤修复过程。
图2、Hh信号转导通路模式图。
图3、Gli1在不同肝脏细胞中的表达；
A和B：Alb和HNF4a分别为成熟肝细胞特异性的标志物。qPCR结果发现Alb 和HNF4a主要在肝脏细胞中表达；
C和D：CK19为胆管细胞特异性表达的标志物，EpCAM为胆管细胞及干/祖细胞特异性表达的标志物；qPCR结果发现CK19和EpCAM主要在胆管细胞中表达；
E：qPCR结果发现，Gli1主要在胆管细胞中表达。
图4、Gli1在正常肝脏中主要在胆管周围的细胞中表达并部分与EpCAM、 PDGFRa和a-SMA基因共表达；
A.8-10周龄大Gli1-LacZ小鼠取肝脏做冰冻切片，进行x-gal染色。蓝色为X-gal染色。红色为核固红染色；
B.8-10周龄大Gli1-LacZ小鼠，取肝脏做冰冻切片，分别用β-gal抗体和胆管细胞标记物(KRT1和OPN)、肝细胞标记物(Alb和GS)、免疫细胞标记物(F4/80)、内皮细胞标记物(VE-CAD)抗体进行共染色。红色为不同细胞标记物抗体染色，绿色为β-gal抗体染色；
C.8-10周龄大Gli1-LacZ小鼠，取肝脏做冰冻切片，分别用β-gal抗体和***标记物(PDGFRa和a-SMA)抗体共染色。红色为不同细胞标记物抗体染色，绿色为β-gal抗体染色；
D.8-10周龄大Gli1-LacZ小鼠，取肝脏做冰冻切片，分别用X-gal和肝祖细胞标记物(EpCAM)抗体共染色。绿色为EpCAM抗体染色，蓝色为X-gal染色。
图5、Gli1+细胞主要在胆管周围分布并与EpCAM+祖细胞共定位；
A.Gli1+细胞谱系示踪模式图。Gli1-CreERT2；Ai9小鼠出生6周后注射TM诱导 Cre酶表达，一周后取肝脏做冰冻切片，进行免疫荧光染色；
B.用***标志物(PDGFRa和a-SMA)、肝祖细胞标记物(EpCAM)进行免疫荧光染色，检测Gli1+细胞与***标志物、肝祖细胞标记物的定位，结果发现 Gli1能与***标志物、肝祖细胞标记物部分共定位；
C.用胆管细胞标志物(KRT19和SOX9)进行免疫荧光染色检测Gli1+细胞与胆管细胞的定位，结果发现Gli1+细胞分布在胆管细胞周围，且不能与KRT19和SOX9 共定位；
D.用肝细胞标志物(HNF4a和Alb)、免疫细胞标记物(F4/80)、内皮细胞标记物(VE-CAD)进行免疫荧光染色，结果发现Gli1+细胞不能与肝细胞标志物、免疫细胞标记物和内皮细胞标记物共定位。
图6、肝脏损伤后Gli1阳性细胞增加；
A.8-10周龄大Gli1-LacZ小鼠分别在部分肝脏切除(PH)24h和48h后，取肝脏做冰冻切片，进行x-gal染色；
B.8-10周龄大Gli1-LacZ小鼠，按CCl4:Oil＝1:3的比例进行混合使用CCl4， 2mL/Kg进行腹腔注射，每3天注射1次，共注射28天，对照组只注射等量的Oil，取肝脏做冰冻切片，进行x-gal染色；
C-E.8-10周龄大Gli1-LacZ小鼠分别喂普通饲料和含0.1％DDC，CDE和MCD 的特殊饲料，喂养3-4周后取肝脏做冰冻切片，进行x-gal染色。DDC饲喂2周后汇管区可见小胆管上皮增生，未成熟胆管数量增多，周围聚集有炎症细胞。
图7、Gli1+细胞可转分化形成肝细胞；
A.谱系示踪DDC肝脏损伤小鼠肝脏中Gli1+细胞的属性转换。 Gli1-CreERT2；Ai9小鼠出生6周后注射TM诱导Cre酶表达，TM处理2周后，分组喂普通饲料和含0.1％DDC的特殊饲料，喂养4周后取肝脏做冰冻切片，进行免疫荧光染色；
B.整个包埋的肝组织荧光观察，肝损伤后可观察到tdtomato阳性上皮样细胞存在；
C.肝脏切片，免疫荧光染色可发现tdtomato阳性肝细胞样细胞存在；
D-E.分别用胆管标志物CK19、肝干/祖细胞标志分子EpCAM、肝细胞标志物 HNF4a和tdtomato进行免疫荧光染色。结果发现tdtomato可标记部分肝细胞。
图8、单细胞转录组分析EpCAM和Gli1标记的细胞谱系；
A.从Gli1-CreERt2；Ai9小鼠肝脏中分选EpCAM+/Gli1-、EpCAM-/Gli1+和 EpCAM+/Gli1+细胞群进行单细胞RNA测序；E+G-，EpCAM+/Gli1-；E-G+， EpCAM-/Gli1+；E+G+，EpCAM+/Gli1+；
B和C.分离的527个单细胞t-随机邻接嵌入(tSNE)图；
D.通过scRNA-seq数据绘制的小提琴图显示了EpCAM和tdTomato的表达。 E+G-，EpCAM+/Gli1-；E-G+，EpCAM-/Gli1+；E+G+，EpCAM+/Gli1+；H，肝细胞；
E.基因差异性热图显示scRNA-seq数据的4个不同簇的差异基因；
F.小提琴图显示了从scRNA-seq数据中选择特定的与谱系相关的基因的表达；
G.EpCAM+/Gli1+细胞的GO注释分析；
H.利用GSEA的BioCarta基因集分析在EpCAM+/Gli1+细胞中显著表达的信号通路。
图9、Gli1+细胞3D类器官长期培养体系的建立；
A.Gli1+细胞体外3D类器官培养模式图；
B.Gli1+细胞在基质胶中进行3D培养形成类器官。图示为类器官在培养1天、3天、6天和9天的生长状态。同时结果显示，Gli1+细胞亚群培养产生的肝脏类器官可以稳定的传代。
图10、EpCAM+/Gli1+细胞3D类器官培养；
A.体外3D类器官培养模式图；
B.EpCAM+/Gli1-、EpCAM+/Gli1+、EpCAM-/Gli1+和EpCAM-/Gli1-细胞流式分选；
C.四种细胞类型形成类器官的能力；
D.EpCAM+/Gli1-和EpCAM+/Gli1+形成的类器官在培养0天、2天、4天、6 天、8天和10天的比较。
E.四种细胞类型形成类器官的效率和数量统计；
图11、EpCAM+/Gli1+形成的类器官表达胆管细胞标志物；
A.整个包埋培养的类器官荧光观察；
B.胆管细胞特异性标志物(KRT19、SOX9)、祖细胞标志物(EpCAM)和细胞增殖标志物(Ki67)对类器官进行免疫荧光染色。
图12、EpCAM+/Gli1+形成的类器官可在体外分化成为有功能的肝细胞；
A.qPCR分析了成熟肝细胞标志物(HNF4a和Alb)和胆管细胞标志物(KRT19、EpCAM)在分别存在生长培养基和分化培养基的类器官中的表达情况；
B.肝细胞标志物HNF4a和Alb)对经过分化的类器官进行免疫荧光染色；
C和D.PAS和LDL uptake染色。
图13、EpCAM+/Gli1+细胞在肝脏损伤修复中的生物学功能。
图14、人源肝细胞3D类器官长期培养体系的建立；
A.人肝脏组织块经过机械剪切和胶原酶消化成单细胞后，在基质胶中进行3D 培养形成类器官。图示为类器官在培养1天、3天、6天和9天的生长状态；肝脏类器官可以稳定的长期传代，在经过25代的培养后依然可以稳定增殖；
B-C.培养的类器官可表达胆管细胞的特异性分子(CK19)和肝干/祖细胞标志物(EpCAM)。
图15、Gli抑制剂GANT-61可抑制人源肝脏细胞3D类器官的生长；
A-A”、未做任何处理的人源肝脏细胞3D类器官；
B-D”、用Hh信号通路的抑制剂SANT-1(10nM)、GANT-61(10uM)和激动剂 SAG(100nM)处理培养的人源肝脏细胞3D类器官，在0天，1天，2天分别进行观察，发现只有GANT-61可抑制肝脏细胞3D类器官的生长。
具体实施方式
本发明人致力于肝细胞再生方面的研究，经过深入的研究，揭示了一种全新分离的细胞群，其为Gli1+细胞群，较佳地其为Gli1+和EpCAM+(EpCAM+/Gli1+)细胞群。所述细胞具有肝干/祖细胞特性，具有分化/转分化形成肝细胞的功能，具有肝脏损伤修复作用，以及能够形成肝脏类器官。本发明还提供了分选所述细胞的方法，利用所述细胞来制备肝脏类器官的方法等。本发明为肝损伤修复机理提供新的理论支持，为肝脏再生的研究和临床应用提供了新的途径。
术语
如本发明所用，所述“分离的”是指物质从其原始环境(如天然的机体或自然环境)中分离出来。如活体细胞当存在于体内时是没有分离纯化的，但同样的细胞如从天然状态/原始环境中与同存在的其他物质中分开，则为分离的或纯化的。
如本发明所用，“分离的细胞(培养物)”包括“分离的细胞系(培养物)”。
如本发明所用，“富集”细胞(群)是指增加包含在混合细胞群体中所需目的细胞/目标细胞的含量，通常是指提高“目标细胞”在总细胞中的频率。因此，富集细胞群体指因富集步骤而产生的具有更高频率目标目的细胞的细胞群体。
如本发明所用，除非另外说明，所述的“目的细胞/目标细胞”为本发明中感兴趣的、具有预期功能的细胞；更具体地，所述的“目的细胞/目标细胞”是指Gli1+ 细胞群，或为EpCAM+/Gli1+细胞群。
如本发明所用，所述的“Gli1+(Gli1阳性)”或“EpCAM+(EpCAM阳性)”是指细胞表达Gli1或EpCAM，能被它们的特异性结合分子(如抗体)或捕获分子结合或捕获，并由此分离和富集所述阳性细胞(群)。
如本发明所用，“细胞群”包括富集前和富集后细胞群，当经过富集步骤后，细胞群体可以是富集后的。每种细胞群可直接用于下一步骤，可部分或全部冷冻用于长期或短期贮藏并用于随后的步骤。同时，细胞群体的细胞可单独进行悬浮以得到单细胞悬浮液。
如本发明所用，“标记物”与“标志物”可互换使用。本发明中，非另外说明，所述的“标记物”为感兴趣的、用于确定特定细胞(群)或其特性的分子(如蛋白表面分子)。例如，本发明中，以Gli1为标记物，获得Gli1+细胞；或，以Gli1和EpCAM 为标记物，获得Gli1+和EpCAM+细胞。
新分离的细胞(群)
作为多细胞动物发育过程中最为重要的形态发生素之一，进化上高度保守的Hedgehog(Hh)信号在控制细胞的增殖和分化及胚胎形成、形态发生、组织器官发育等过程中具有重要作用。在哺乳动物机体内，经典的Hh信号转导通路可简明地概括为Hh/Ptch/Smo/Sufu/Gli信号轴。其主要由胞外的Hh配体、细胞膜表面的12次跨膜蛋白受体分子Patched(Ptch)、7次跨膜蛋白Smoothened(Smo)、胞内反向调控因子Sufu蛋白及核转录因子Gli家族蛋白组成(图2)。同时，研究表明在经典的Hh信号转导通路外还存在多种非经典的Hh信号通路。其中主要包括：依赖Hh配体和受体Ptch的功能，但不依赖于Smo的信号转导；不依赖Smo，但依赖Gli的信号转导，等等。在通路中，Gli家族蛋白是位于Hh信号转导通路最末端的关键转录因子，其活性的上调是Hh信号通路激活最重要的标志之一。无论何种原因导致的Hh信号通路激活都将转导至Gli，并最终转化为对Gli活性的调控。Gli家族蛋白成员包括Gli1、 Gli2和Gli3。这3种Gli蛋白均含有高度保守的DNA结合区。Gli1与Gli2、Gli3 在结构上的区别在于Gli1不具有N端抑制区域。虽然这3种蛋白质结构相似，但其功能却有存在较大差异。Gli1主要以转录激活子的形式存在，与Hh信号转导通路存在正反馈调控，对Hh通路信号的放大与维持起重要作用；Gli2和Gli3以直接响应Hh配体的转录因子的形式存在，既有激活功能也有抑制功能，而其中Gli2以激活功能为主，Gli3以抑制功能为主。目前，针对Hh信号通路的几个主要拮抗剂，如Cyclopamine、SANT1/2/3/4、GDC-0449等，主要通过调控Hh信号通路中的Smo 蛋白活性或其上游的信号发挥功能，对Hh通路中Smo下游分子的激活或Hh信号通路抑制因子的功能缺失性突变，则无明显效果；而Gli的抑制剂GANT61则主要通过抑制Gli家族蛋白与DNA的结合，从而发挥对通路的抑制功能。从生物学功能的角度讲，Hh信号转导通路是具有调控细胞增殖、凋亡、迁徙和分化功能的信号通路。目前在肝脏损伤修复过程中的具体生物学功能及分子机制仍然不清楚。
本发明人致力于研究肝脏损伤修复过程中调控的分子机制及生物学功能。以往的研究中，对于转录因子Gli1参与的肝脏损伤修复的分子机制和生物学功能仍知之甚少。而本发明人在研究中发现，Gli1可作为一种肝干/祖细胞的标志基因，并可能通过非经典的Hh信号通路参与肝脏损伤修复过程。同时，本发明人将Gli1+细胞在肝脏损伤修复中的机制及功能作为研究重点，整合利用多种肝脏损伤模型、遗传修饰动物，体细胞示踪和3D类明Gli1+细胞在肝脏损伤修复过程中的生物学功能；同时在此基础上研究Hh信号器官体外培养等技术，以及分子生物学、细胞生物学、信息生物学及化学生物学等方法进行深入研究。通过进行体内谱系示踪，鉴定了 Gli1+细胞在损伤修复过程中的细胞属性转换，明确Gli1+细胞的肝干/祖细胞特性；利用谱系示踪标记技术，分离和富集正常EpCAM+/Gli1+细胞，通过单细胞测序，揭示EpCAM+/Gli1+细胞的干/祖细胞特性；利用3D类器官培养技术，Fah缺失动物模型，结合相应的人源正常及肝脏疾病临床样本，阐通路激动剂和抑制剂对培养的人源类器官的作用。
基于本发明人的新发现，提供了一种分离的细胞(群)或细胞培养物，所述细胞为Gli1+细胞；所述细胞具有以下特征：(i)具有肝干/祖细胞特性，(ii)具有分化/转分化形成肝细胞的功能，(iii)具有肝脏损伤修复作用，和/或(iv)能够形成肝脏类器官。
基于本发明人的新发现，也提供了一种分离的细胞(群)或细胞培养物，所述细胞为EpCAM+/Gli1+细胞；所述细胞具有以下特征：(i)具有肝干/祖细胞特性，(ii) 具有分化/转分化形成肝细胞的功能，(iii)具有肝脏损伤修复作用，和/或(iv)能够形成肝脏类器官。
所述的Gli1为一种来自Gli家族的转录因子，其氨基酸序列可以参见GenBank 登录号2735(人)或GenBank登录号14632(鼠)所示。应理解，本发明也包括Gli1同源物，也即物种来源不同，但是功能相同的此类蛋白。
所述的EpCAM为上皮粘附蛋白，其氨基酸序列可以参见GenBank登录号4072 (人)或GenBank登录号17075(鼠)所示。应理解，本发明也包括Gli1同源物，也即物种来源不同，但是功能相同的此类蛋白。
在本发明的优选方式中，所述的细胞还具有包括选自下组的一种或多种特征：具有上皮(样)细胞特征，或表达上皮细胞标志物；具有间充质(样)细胞特征，或表达间充质细胞标志物；具有间胆管(样)细胞特征，或表达胆管细胞标志物。
在本发明的优选方式中，本发明所述的细胞分离自肝细胞，或为分离自肝肝细胞的传代细胞。
根据本发明人的研究结果，本发明所述的细胞在被从天然环境(如机体)中分离后，可以进行扩繁培养、传代、保存，并且维持其良好的生物活性。因此，本发明的细胞可以实现大规模或产业化的培养和应用。
分离细胞(群)的方法
本发明人发现了一种以Gli1基因或Gli1/EpCAM基因共同标记的祖细胞群，这些细胞在慢性肝病发生后可立即参与肝脏修复过程。Gli1+细胞或EpCAM+/Gli1+细胞用于肝脏修复的遗传证据为肝脏疾病和再生的细胞和分子机制提供了新的见解，将为人类肝脏再生的研究提供帮助。
根据本发明人的新发现，本发明还提供了一种分离或富集细胞或细胞培养物的方法，所述细胞为Gli1+细胞，较佳地其为EpCAM+/Gli1+细胞。所述细胞具有以下特征：(i)具有肝干/祖细胞特性，(ii)具有分化/转分化形成肝细胞的功能，(iii)具有肝脏损伤修复作用，和/或(iv)能够形成肝脏类器官；所述方法包括：提供肝细胞，利用特异性结合Gli1的结合分子(如抗体)或捕获分子，将Gli1+细胞分选出。
本发明所述方法可用于富集(或分离)至少一种目标目的细胞。本发明的方法包括能分开、组合、连续、重复或周期地使用的一系列培养和选择步骤。
因此，分离或富集带有特定的可识别信号(如EpCAM+和/或Gli1+)的细胞的方法是本领域技术人员已知的，多种分离或富集细胞的方法均可用于本发明。本发明的实施例中，提供了具体的细胞分选方法，然而应理解，在本发明已经知道了感兴趣的细胞表面分子之后，进行细胞分选时并不限于实施例中具体所列举的，其它一些方法也是可用的。本领域中常用的一些细胞分选方法包括但不限于如下：
(a)免疫磁珠细胞分选，其是一种通过磁珠从细胞群中分离目的细胞的技术；首先，磁珠通过抗体、生物素或亲和素与目的细胞上特定的细胞表面蛋白结合；接着样本被置于磁场中，经磁珠标记的细胞在磁场的作用下被吸附；未经标记的细胞被保留在上清液中，从而以物理分离的方式分选样本中的目的细胞和非目的细胞；由于其快速且操作简单，免疫磁珠细胞分选是研究人员分离高纯度的特定细胞亚群的常用方法之一。
(b)流式细胞分选，其是一种通过流式细胞仪和荧光探针来分离异质性细胞群的方法；当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内；流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出；在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中；将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离；其尤其适用于单个细胞的分选、基于细胞内标记物的分选、基于细胞表面标志物表达水平的分选、通过多个标记物分离复杂的细胞类型且纯度要求高时的分选。
(c)微流控细胞分选，其通过在微观水平上操控流体来进行单细胞分离，微流控技术经常被构建在微芯片上，通常也被称为“芯片实验室”；当所用样本和试剂的体积很小时，微流控技术具有很大的优势；此外，芯片实验室是便携的，几乎可以在任何地方使用，因此特别适合作为现场诊断的工具。几种不同的微流控细胞分选的方法包括：超声波分选法、双水相***、仿生微流控分选法、亲和性分选法、确定性侧向偏移法、电泳分选法、场流分级、重力与沉降法、磁泳法、微滤法、光分选法。
(d)粘附法，其基于不同类型的细胞独有的粘附能力可从异质细胞群中分离目的细胞；通过选择合适的生长因子和细胞培养板来选择性地促进或抑制细胞的粘附能力，可以从悬浮液中分离被粘附的细胞，这一方法的有效使用还需依托于对本发明中所分离的细胞群的粘附特性的观察。
根据分选方法的不同，可以选择不同类型的可识别信号。例如，通过流式细胞分选方法富集细胞群体以形成包含至少一种目的细胞的富集细胞群体，所采用的可识别信号较佳地为荧光染料，根据荧光染料特定的激发光波长或发射光波长来判读。
用于分离或富集特定细胞的结合分子或捕获分子是本领域人员容易制备或获得的。较为常用的结合分子例如但不限于：抗体，配体，它们可以是游离的或是固定于固相载体上的。
除了分离或富集自肝细胞，本发明的细胞也可以是体外人工培养/规模化培养的细胞。当第一代细胞被从自然环境中人工分离后，可以通过适当的条件来进行大规模的扩繁，这可以运用本领域已知的细胞培养方法。优选地，可以参照本发明实施例中的方法，但本发明不限于这一优选的方法。
此外，本发明也包括一些前体细胞(细胞培养物)，它们在经一定的转化/转分化/人工条件培养后，能够形成如本发明的Gli1+细胞，或形成EpCAM+/Gli1+细胞。
本发明的方法所获得的细胞可冻存、复苏、传代、长时间维持培养。
肝脏类器官及其制备
本发明也提供了一种人工建立的肝脏类器官，其由本发明前面任一所述的细胞或细胞培养物经生长和分化获得；或，其由本发明前面任一所述的制备肝脏类器官的方法制备获得。
本发明的肝脏类器官的培养，包括将前面所述的细胞或细胞培养物进行生长培养和分化培养，从而获得肝脏类器官。更具体地，包括：(1)提供所述的细胞或细胞培养物；(2)将(1)的细胞或细胞培养物进行生长培养；较佳地还进行1～5次(如2，3， 4次)传代；(3)将(2)获得的培养物进行分化培养，从而获得肝脏类器官。
本领域已知的一些生长培养和分化培养的培养基或培养方法可以被运用于本发明中。在本发明的优选方式中，进行生长培养的培养基中含有：Advance DMEM/F12 培养液，其中添加HEPES，GlutaMAX-1，primocin，B27，N-Acetylcysteine， Nicotinamide，A83-01，Y27632，EGF，FGF10，FGF2，R-Spondin，Noggin。本发明人的研究结果中发现，这些组分的添加有利于维持良好的细胞状态，保持良好的活性，有利于类器官的获得。
在本发明的优选方式中，进行分化培养的培养基中，含有Advance DMEM/F12 培养液，其中添加EGF，DAPT，HEPES，GlutaMAX-1，primocin，B27，Y27632， DAPT，BMP7，HGF，制瘤素M。本发明人的研究结果中发现，这些组分的添加有利于细胞的特异性分化，有利于类器官的获得。
本发明中，所述的类器官还包括但不限于：传代的类器官，连续培养的类器官，经冷冻保存和/或复苏的类器官等。所述传代的类器官，可包括传代1～100代，更具体如2，3，5，8，10，12，15，18，20，25，30，35，40，45，50，60，70，80， 90代。
运用本发明的培养方法以及培养基，可以通过二维(2D)或三维(3D)培养体系培养。作为本发明的优选方式，所述的培养为三维(3D)条件下的培养。3D培养是在体外应用组织培养方法使细胞以多细胞集聚体的形式生长称为具有三维结构的形态 (类器官)的培养方法，与2D培养(贴壁)相比，3D培养可以通过模拟三维细胞网络、细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用，从而更加贴近体内组织/器官中相应的生理特征。
本发明的方法所获得的类器官可冻存、复苏、传代、长时间维持培养。
药物筛选
在得知Gli1和EpCAM基因共同标记的细胞的特定性能及其与肝细胞再生/肝脏修复的密切相关性后，可以基于该特征来筛选促进肝细胞再生或促进肝脏修复的物质(潜在物质)。可从所述的物质中找到对于促进肝细胞再生或促进肝脏修复真正有用的药物。
因此，本发明提供一种筛选促进肝细胞再生或促进肝脏修复的物质(潜在物质)的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理肝组织的分离物；和(2)检测所述分离物的细胞表面分子特性，若其中Gli1+细胞在统计学上增加，则该候选物质是促进肝细胞再生或促进肝脏修复的物质(潜在物质)。在更优选的方式中，所述方法还包括检测EpCAM；若其中Gli1+EpCAM+细胞在统计学上增加，则该候选物质是促进肝细胞再生或促进肝脏修复的物质(潜在物质)。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到Gli1+细胞或 Gli1+EpCAM+细胞的量的改变，还可设置对照组(Control)，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的分离物。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验和/或临床实验，以进一步选择和确定对于促进肝细胞再生或促进肝脏修复真正有用的物质。
可将采用本发明所述筛选方法获得的促进肝细胞再生或促进肝脏修复的潜在物质构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中进一步筛选药物。
试剂盒
基于本发明人的新发现，本发明还提供了一种用于分离或富集本发明所述的细胞或细胞培养物的试剂盒，包括：Gli1结合分子或捕获分子，以及EpCAM结合分子或捕获分子。
基于本发明人的新发现，本发明还提供了一种用于制备肝脏类器官的试剂盒，包括：Gli1结合分子或捕获分子，EpCAM结合分子或捕获分子，以及进行类器官培养的试剂。所述的类器官培养试剂可包括但不限于选自下组的试剂：Matrigel胶，生长培养基，分化培养基。
在本发明的优选方式中，所述的试剂盒中还可包括用于水解/分解细胞的试剂，如胶原酶，分解酶；用于细胞悬浮的试剂；用于进行细胞培养的培养基等。
为了便于本领域技术人员应用，本发明所述的试剂盒中，还包括说明如何分离或富集本发明所述的细胞或细胞培养物或如何制备肝脏类器官的使用说明书。例如，可以在使用说明书中记载本发明前述的方法。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社， 2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实验材料与方法
1、动物实验
本实验使用的转基因小鼠和品系如下：Gli1-lacZ(Jackson lab，008211，C57BL/6)， Gli1-CreERt2(Jackson lab，007913，C57BL/6)，B6.Cg-Gt(ROSA) 26Sortm9(CAG -tdTomato)Hze/J(Ai9)(Jackson lab，007909，C57BL/6)，HNF4α-DreERt2、NR1 和Ai66小鼠获自周斌研究员实验室(中国科学院生化与细胞研究所，129x1/SvJ)， Fah-/-rag2-/-Il2rg-/-(FRG)小鼠(获自Xin Wang博士，C57BL/6J和129S6/SvEvTac混合背景)。为了系谱示踪实验Tamoxifen(Sigma，TAM)被用玉米油(Sigma)稀释成浓度为20mg/ml。为了诱导Cre和Dre酶入核，6～8周龄小鼠连续3天按每克体重200ug 的量腹腔注射TAM。所有的谱系示踪实验至少包括5只小鼠。动物实验均按照动物伦理委员会的指导方针进行。动物被饲养于SPF设施中。
2、肝损伤模型构建
小鼠急性和慢性肝脏损伤模型是研究肝脏损伤修复机制及功能的主要模型。本发明人采用2/3肝切除模型(PH)制备急性肝损伤模型。具体如下：麻醉开腹后结扎左右叶根部，切除左右叶；随后结扎中叶，结扎位置约在胆囊往上，离上腔静脉约 2-3mm处，并切除中叶和胆囊；关腹缝合，置于热台上保温直至小鼠苏醒。手术在 SPF级动物房手术室中进行以避免感染。该方法是目前国际公认的小鼠肝部分切除模型。采用CCl4注射和DDC、CDE饲料制备慢性肝损伤模型。CCl4诱导的慢性肝损伤模型的建立：在实验中，按CCl4:Oil＝1:3的比例进行混合使用CCl4，2mL/Kg 进行腹腔注射，每3天注射1次，共注射28天，对照组只注射等量的Oil。基于DDC、 CDE饲料的慢性肝损伤模型的建立：将8周龄大的小鼠分成两组，分别喂普通饲料和含0.1％DDC的特殊饲料，喂养2周后得到DDC慢性损伤小鼠并进行实验。在实验中，分别取不同肝损伤模型小鼠的血液和肝脏标本，同时记录肝重和体重，用于肝脏损伤指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)检测以及H&E 和天狼星红染色，最终确定肝脏损伤模型构建成功。
3、免疫荧光和半乳糖苷酶(LacZ)染色
在无菌条件下取出肝脏用4％多聚甲醛在4℃固定1h，固定后PBS洗涤3次，然后30％蔗糖中4℃脱水过夜，第二天用OCT包埋组织。用冰切机将组织切成10μm 的切片，染色时，将切片室温风干10分钟。将干燥的切片用PBS洗涤，然后用 PBST(0.1％Triton X-100)稀释的1％BSA室温封闭30分钟。用封闭液稀释一抗，4℃孵育过夜；PBST洗三遍，每次10分钟；用封闭液稀释二抗，室温避光孵育60分钟；PBST洗三遍；接下来DAPI染色，去离子水洗两遍；封片，晾干过夜后保存于 -20℃。使用的抗体信息如下表(表1)。
表1、抗体信息
为了对切片进行X-gal染色，首先将切片用Wash buffer(PBS包含2mM MgCl2，0.02％NP-40，0.01％脱氧胆酸钠，pH 7.4)洗涤3次，每次5分钟。接下来用X-gal 染色染色液(Wash buffer包含5mM K3Fe(CN)6，5mM K4Fe(CN)6和1mg/ml X-gal) 避光37℃染色12小时。染色后用PBS洗涤3次，每次5分钟。核固红染核，镜下拍照观察。
4、细胞分离和3D类器官培养
采用下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法进行肝细胞分离：首先将灌注针逆向***下腔静脉后固定，门静脉开放做流出道。接着采用含EGTA的灌注液进行灌注，一段时间后再用含有Ca2+的胶原酶进行充分灌注。灌流结束后，将进行细胞过滤、清洗，随后采用密度梯度离心得到制备好的肝细胞悬液。本发明中，采用胶原酶和分解酶共同处理的方法进行胆管细胞分离：收集6-8周龄Gli1-creERt2；Ai9和 Gli1-lacZ小鼠的肝脏，先将肝脏组织剪成0.5mm3的小块，然后用0.125mg/mL胶原酶和分解酶共同处理，经过离心可获得胆管结构，用体视显微镜挑取形态完好的胆管进行后续实验。在分离得到肝细胞及胆管细胞后，进一步提取肝细胞和胆管细胞 RNA，用qPCR检测Gli1基因的表达水平，或者经过分选获取阳性细胞进行3D类器官培养。
本发明人用EpCAM-APC(eBioscience，Clone G8.8，1:50)抗体通过流式分选EpCAM+和Gli1+(tdTomato+或CUG+)细胞。将分离的阳性细胞与Matrigel胶(BD) 混合，按照Matrigel胶和生长培养液5:3的比例将细胞悬液混合，然后将80μl每个包的量种在24孔悬浮培养板中。生长培养基(EM)的配方如下：Advance DMEM/F12 培液中补加10mM HEPES(Gibco,USA)，2nM GlutaMAX-1(Gibco,USA)， 500×primocin(InvivoGen,USA)，1×B27(Gibco,USA)，1.56mM N-Acetylcysteine (Sigma,Germany)，10mM Nicotinamide(Sigma,Germany)，0.5μM A83-01(Tocris, USA)，10μM Y27632，50ng/mL EGF(Peprotech,USA)，10ng/mL FGF10(Peprotech, USA)，1ng/mL FGF2(Peprotech,USA)，自制R-Spondin(10％)and Noggin(10％)条件性培液。在培养的过程中每3天更换一次培养基，连续培养10天后进行传代，传代步骤如下：先吸去培液，将类器官和Matrigel胶吹打数次后，转移至尖底15ml离心管中，1500rpm离心5分钟，吸去上清加入1ml TrypLE Express，37℃消化8 分钟，然后用移液器反复吹打，直至成单细胞悬液，然后加入1ml含血清的培液中和。1500rpm离心5分钟，将细胞按1:10传代，接着用同样的方法种在24孔板中。为了诱导细胞向肝细胞分化，单细胞来源的类器官传代后，保持在EM中3天，接着更换分化培养基(DM)再培养10天，然后通过免疫荧光、PAS和LDL uptake实验验证细胞的特性和功能。DM培养基配方如下：AdvanceDMEM/F12培液中补加50 ng/mL EGF，10μM DAPT，10mM HEPES(Gibco，USA)，2mM GlutaMAX-1(Gibco， USA)，500×primocin(InvivoGen，USA)，1×B27，10μM Y27632，10μM DAPT(Selleck)，25ng/mL BMP7(Peprotech)，25ng/mL HGF(Peprotech)和20ng/ml制瘤素(Oncostatin)M。
5、实时定量PCR
用TRIzol(Invitrogen)从类器官和分离的细胞中提取总RNA。所有样品的OD260/280比值为>1.8和<2.1。ReverTra Ace qPCR RT master Mix with gDNA Remover kit(Invitrogen)试剂盒将来自类器官和细胞的总RNA(500ng)反转录成cDNA。实时定量PCR采用ABI Fast 7500荧光定量PCR进行，反应体系为25μL，其中SYBR Green(Takara)为12.5μL，模板cDNA为2μL，引物为1μM。反应程序为95℃10min， 94℃15s，60℃30s，72℃30s，40个循环。用GAPDH做内参，每个实验至少重复三次。使用的引物如下：
EpCAM：Fw-TGTGGACATAGCTGATGTGGCTTAC(SEQ ID NO:1)；
Rv-CACCCTCAGGTCCATGCTCTTA(SEQ ID NO:2)；
Krt19：Fw-GTCCTACAGATTGACAATGC(SEQ ID NO:3)；
Rv-CACGCTCTGGATCTGTGACA(SEQ ID NO:4)；
HNF4α：Fw-AGCTCGAGGCTCCGTAGTGTTT(SEQ ID NO:5)；
Rv-GAAAATGTGCAGGTGTTGACCA(SEQ ID NO:6)；
Alb：Fw-GCTGAGACCTTCACCTTCCA(SEQ ID NO:7)；
Rv-TCTTCAGTTGCTCCGCTGTA(SEQ ID NO:8)；
GAPDH：Fw-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG(SEQ ID NO:9)；
Rv-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA(SEQ ID NO:10)。
6、移植实验
FRG小鼠在饮水中添加7.5mg/L 2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰)-1,3环己二酮(NTBC)进行维持饲养。8到12周龄FRG雄性小鼠被用来进行移植实验。移植用类器官细胞在来自三只不同的Gli1-creERt2；ai9小鼠，至少在体外培养2个月。类器官传代后，保持在EM中3天，接着更换分化培养基(DM)再培养10天。然后用TrypLE Express消化成单细胞，将1×106个类器官来源的单细胞悬液注入FRG小鼠脾脏内。小鼠移植后在饮用水中继续给予NTBC药物4天。接下来换正常饮水，每隔1天检测小鼠健康状况和体重。移植后1个月或3个月去小鼠肝脏用于实验。未移植的同窝幼崽作为阴性对照。
7、单细胞建库和测序
本实验使用Smart-seq2方法构建scRNA-seq文库。具体操作步骤如下：96孔板紫外照射后，加入2ul细胞裂解缓冲液(Triton X-100稀释为0.2％(vol/vol)，取190ul 的0.2％Triton X加入10ul RNase inhibitor)，然后加入1ul oligo-dT primer(10uM)和 1uldNTP mix。密封好，4℃保存。FACS打板，4℃700g离心1min，放在冰上。PCR 仪中72℃孵育3分钟进行裂解。接下来，本发明人在oligonucleotide primer(TSO) 存在的情况下，使用SuperScript II reverse transcriptase对单细胞RNA进行逆转录。然后使用Kapa ReadyMix(Kapa Biosystems)对反转录的产物进行预扩增。扩增产物用VAHTS DNA Clean Beads进行纯化，用QIxcel(确认正确的产物大小)和Qubit(确定数量)对产物进行质控。接下来，使用Vazyme的TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina文库构建试剂盒生成单细胞文库。每个单细胞文库用Index引物通过PCR 进行编码。将已编码的单细胞汇集在一起，按80个细胞一组进行测序。
实施例1、Gli1在正常肝脏中的表达分析
肝的再生涉及比较复杂的机制，本发明人在经过广泛的研究和试验后，将研究的重点聚焦在Gli1在肝脏损伤修复中的分子机制及生物学功能。首先，本发明人检测Gli1在正常肝脏中的表达分布，以期为进一步研究提供实验基础。具体的实验步骤和结果如下：
1、Gli1主要在肝脏管腔细胞中表达
肝脏主要由肝细胞和胆管细胞组成。为了研究Gli1在肝脏细胞中的表达分布，本发明人从正常小鼠肝脏组织中分离肝细胞和胆管细胞。采用下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法进行肝细胞分离：首先将灌注针逆向***下腔静脉后固定，门静脉开放做流出道。接着采用含EGTA的灌注液进行灌注，一段时间后再用含有Ca2+的胶原酶进行充分灌注。灌流结束后，将进行细胞过滤、清洗，随后采用密度梯度离心得到制备好的肝细胞悬液。采用胶原酶和分解酶共同处理的方法进行胆管细胞分离：首先将肝脏组织剪成0.5mm3的小块，然后用0.125mg/mL胶原酶和分解酶共同处理，经过离心可获得胆管结构，用体视显微镜挑取形态完好的胆管进行后续实验。在分离得到肝细胞及胆管细胞后，进一步分别提取肝细胞和胆管细胞RNA，用qPCR检测Gli1基因的表达水平。
如图3A～B，Alb和HNF4a分别为成熟肝细胞特异性的标志物，Alb和HNF4a 主要在肝脏细胞中表达；如图3C～D，CK19为胆管细胞特异性表达的标志物， EpCAM为胆管细胞及干/祖细胞特异性表达的标志物，CK19和EpCAM主要在胆管细胞中表达。以上结果说明，分离的细胞特异性比较好。
如图3E，Gli1主要在胆管细胞中表达。
2、Gli1主要在肝脏胆管周围的细胞中表达并部分与EpCAM、PDGFRa和 a-SMA基因共表达
为了更加直观地观察Gli1基因在肝脏中的表达分布，通过使用Gli1-LacZ转基因小鼠，以正常和肝损伤成年小鼠作为研究对象。在无菌条件下取出肝脏，冰冻切片后进行X-gal染色。为排除X-gal染色可能出现假阳性结果，采用β-gal抗体进行免疫荧光染色，重复以上结果，并与各种不同肝脏细胞标志物(包括胆管细胞、肝细胞、***、肝干细胞及肝祖细胞等多种不同类型细胞的标志物)进行免疫荧光共染色，鉴定表达Gli1基因的细胞类型。
结果显示，X-gal染色发现胆管周围存在Gli1+细胞，并且通过免疫荧光染色发现(图4)。
3、体内细胞谱系示踪明确Gli1+细胞的分布
细胞谱系示踪是通过利用各种方式标记机体内的特定细胞，并对包括其后代细胞增殖、分化、迁移等细胞活动进行在体的示踪观察，是检测特定类型细胞在发育、疾病和再生中细胞转分化过程的有效研究方法。基于以上实验结果，为进一步确定表达Gli1基因的细胞类型，使用Gli1-CreERT2小鼠和Cre报告基因Ai9小鼠杂交得到Gli1-CreERT2；Ai9双转基因小鼠，注射tamoxifen(TM)后，取肝脏组织做冰冻切片进行免疫荧光染色，检测小鼠肝脏中Gli1+细胞的tdTomato标记情况，并与各种不同肝脏细胞标志物(包括胆管细胞、肝细胞、***、肝干细胞及肝祖细胞等多种不同类型细胞的标志物)分别进行免疫组化共染色，进一步明确Gli1+细胞在肝脏中的分布。
免疫荧光染色结果显示，Gli1+细胞可被tdTomato标记。实验结果同时表明， Gli1+细胞分布在胆管周围，并可与肝祖细胞标志物EpCAM共定位(图5)。
实施例2、Gli1在肝脏受损伤后的表达分析及谱系示踪Gli1+细胞在肝脏损伤修复中的转分化
1、Gli1在肝脏受损伤后的表达分析
小鼠急性和慢性肝脏损伤模型是研究肝脏损伤修复机制及功能的主要模型。采用2/3肝切除模型(PH)制备急性肝损伤模型。在实验中主要参考Mitchell等在2008 年NatProtoc上发表的方法进行。具体如下：麻醉开腹后结扎左右叶根部，切除左右叶；随后结扎中叶，结扎位置约在胆囊往上，离上腔静脉约2-3mm处，并切除中叶和胆囊；关腹缝合，置于热台上保温直至小鼠苏醒。手术在SPF级动物房手术室中进行以避免感染。该方法是目前国际公认的小鼠肝部分切除模型。采用CCl4注射、 DDC、CDE和MCD饲料制备慢性肝损伤模型。CCl4诱导的慢性肝损伤模型的建立：在实验中，按CCl4:Oil＝1:3的比例进行混合使用CCl4，2mL/Kg进行腹腔注射，每3 天注射1次，共注射28天，对照组只注射等量的Oil。基于DDC、CDE和MCD饲料的慢性肝损伤模型的建立：将8周龄大的小鼠分成两组，分别喂普通饲料和含0.1％ DDC、CDE和MCD的特殊饲料，喂养3-4周后得到慢性损伤小鼠并进行实验。通过以上模型以观察Gli1基因在部分肝脏切除(PH)、CCl4注射、DDC、CDE和MCD 饲料造成的急/慢性肝损伤模型小鼠肝脏中Gli1激活情况。
实验结果显示，Gli1主要在正常肝脏的胆管周围表达，急性肝损伤(PH)不能引起Gli1的明显变化，而慢性肝损伤(CCl4注射、DDC、CDE和MCD模型中)可引起 Gli1水平的显著增加和Gli1+细胞的增加(图6)。
上述实验结果说明，慢性肝损伤修复过程需要调节Gli1表达且需要Gli1+细胞参与。
2、谱系示踪明确Gli1+细胞在肝脏损伤修复中的转分化
基于以上实验结果，为了进一步观察小鼠肝脏中的Gli1+细胞是否可分化为成熟肝细胞。本发明人首先将C57BL/6品系的Gli1-CreERT2小鼠与Ai9小鼠进行杂交，获得了Gli1-CreERT2；Ai9双转基因小鼠。在此基础上，通过注射tamoxifen(TM)，实现肝脏中Gli1+细胞的稳定性遗传标记(即标记上tdTomato)。随后，利用这种Gli1+ 细胞已被遗传标记的Gli1-CreERT2；Ai9小鼠制备了DDC肝脏损伤模型，以用于示踪 Gli1+细胞是否具有向肝细胞转分化和向胆管细胞分化潜能。
结果显示，胆管周围的Gli1+细胞数量增加，且Gli1+细胞可转分化为肝细胞(图7)。以上实验结果说明，Gli1+细胞在肝脏损伤修复过程中具有重要的作用以及Gli1+ 细胞的分化及细胞属性转换的能力。
实施例3、单细胞测序分析Gli1+细胞的特性
以上实验结果证明，Gli1和EpCAM能够共定位，且Gli1+细胞能够在体内转分化形成肝细胞，为了验证EpCAM+和Gli1+细胞是否为同一种细胞，且是否具有肝干/祖细胞特性，分别分离小鼠肝脏中EpCAM-/Gli1+、EpCAM+/Gli1-和 EpCAM+/Gli1+三个细胞亚群用Smart-seq2的方法进行建库，然后进行单细胞测序，并以肝细胞作为对照，从单细胞水平观察不同种类细胞的特性。用单细胞测序共分析了527个细胞(144个EpCAM-/Gli1+细胞，148个EpCAM+/Gli1-细胞，202个 EpCAM+/Gli1+细胞，33个肝细胞)，无监督聚类(Unsupervisedclustering)分析发现这些细胞可以分成四个明显的细胞群，这四个聚类分别被明确识别为 EpCAM+/Gli1-、EpCAM-/Gli1+、EpCAM+/Gli1+和肝细胞，这些细胞表现出不同的生物学特征。结果发现EpCAM主要在EpCAM+/Gli1-细胞和EpCAM+/Gli1+细胞中表达，而tdTomato主要在EpCAM-/Gli1+细胞和EpCAM+/Gli1+细胞中表达。以上结果与流式分选的结果一致，为测序数据的高质量提供了证据。然后，通过聚类分析检测了每个细胞群的前200个基因，并通过小提琴图检测了每个细胞群的代表性差异基因。肝细胞特异性表达肝细胞标记基因，如Alb和CYP7A1。EpCAM+/Gli1- 细胞特异性表达KRT18、KRT7和KRT19，这些是胆细胞的已知标记物。 EpCAM-/Gli1+高表达细胞外基质(ECM)基因(Col1A1，Col1A2，Col3A1和DCN)和关间充质细胞相关标记基因(PDGFRα和PDGFRβ)。有趣的是，结果发现 EpCAM+/Gli1+细胞介于EpCAM+Gli1-和EpCAM-Gli1+细胞之间，共表达 EpCAM+Gli1-和EpCAM-Gli1+细胞特异性的基因。EpCAM+/Gli1+细胞表达了上皮细胞和间充质细胞的标记基因，提示EpCAM+/Gli1+细胞可能是兼性的，具有这两种细胞的功能。为了研究EpCAM+/Gli1+细胞的生物学功能，对EpCAM+/Gli1+细胞中的差异表达的基因进行了GO分析。该分析揭示了几个与组织形态形成、损伤反应和干细胞分化相关的显著富集的生物学过程。通过使用GSEA(gene setenrichment analysis，GSEA)来表征EpCAM+/Gli1+细胞亚群的功能，结果发现EpCAM+/Gli1+ 细胞在组织形态发生、损伤反应和干细胞分化等途径均较其他三种细胞富集。 EpCAM+/Gli1+细胞群共表达上皮细胞标记(EpCAM，KRT7和KRT19)和***标记(PDGFRα和PDGFRβ)支持这群细胞的祖特征，提示EpCAM+/Gli1+细胞是肝损伤后Gli1+肝细胞的来源(图8)。
实施例4、Gli1+细胞的分离和3D类器官培养确定Gli1+细胞的特性
上述实验结果证明，Gli1+细胞可分化/转分化为肝细胞。因此，推测Gli1+细胞有可能是一种肝脏干细胞或祖细胞，从而在肝脏的损伤后的修复过程中具有重要的作用。3D类器官培养是一种最新的细胞体外培养技术，能够很好地模拟细胞在体内的微环境，被广泛应用于干细胞或祖细胞特性的研究。基于此，将进一步利用3D 类器官培养技术确定Gli1+细胞的特性。利用Gli1-CreERT2；Ai9转基因小鼠，TM诱导后，取肝脏分离获取肝脏细胞悬液，通过流式分选将细胞分为Gli1+和Gli1-两种细胞亚群，然后各取5,000个细胞用培养液与Matrigel等比例混合后，进行3D类器官培养，观察Gli1+和Gli1-两种细胞亚群形成类器官的能力。实验结果表明，Gli1+ 细胞能够通过3D培养形成类器官，且形成的类器官可以传代进行连续培养，同时 Gli1+类器官细胞可以进行冷冻保存和复苏。而Gli1-细胞不能通过相同的培养方法形成类器官(图9)。基于此，可以明确Gli1+细胞具有肝干/祖细胞特性。
EpCAM是肝干/祖细胞特异性表达的分子。在成年小鼠中肝脏EpCAM+细胞能够通过3D培养形成类器官，而EpCAM-细胞不能培养形成类器官。结合以上实验发现的结果：Gli1和EpCAM能够共定位以及Gli1+细胞能够体外培养形成类器官，本发明人推测可能存在不同亚群的肝脏祖细胞，且它们在肝脏损伤修复过程中具有重要的作用。在上述分离肝细胞及胆管细胞的基础上，进一步通过流式细胞分选将小鼠肝脏的细胞分为EpCAM+/Gli1-、EpCAM+/Gli1+、EpCAM-/Gli1+和 EpCAM-/Gli1-等多个细胞亚群，并分别进行3D类器官培养，检测各个亚群细胞在体外形成类器官的能力。
实验结果表明，EpCAM+/Gli1-和EpCAM+/Gli1+细胞能够通过3D培养形成类器官，且EpCAM+/Gli1+形成的类器官的效率和同一天的大小明显高于EpCAM+/Gli1-细胞。而EpCAM-/Gli1+和EpCAM-/Gli1-不能通过相同的培养方法形成类器官。另外，EpCAM+Gli1-和EpCAM+Gli1+细胞形成的类器官在形态学上与以前从胆管细胞培养的类器官相似(图10)。
实施例5、EpCAM+/Gli1+形成的类器官表达胆管细胞标志物且可在体外分化成为有功能的肝细胞
1、EpCAM+/Gli1+形成的类器官表达胆管细胞标志物
鉴于EpCAM+Gli1-和EpCAM+Gli1+细胞形成的类器官在形态学上与以前从胆管细胞培养的类器官相似。本发明人意识到EpCAM+Gli1-和EpCAM+Gli1+细胞形成的类器官可能会表达相应的胆管细胞的标志物，通过染色发现EpCAM+Gli1+类器官特异性的表达tdtomato，而EpCAM+Gli1-类器官不表达tdtomato，证明培养的类器官特异性比较好。通过用胆管细胞特异性标志物(KRT19、SOX9)和细胞增殖标志物(Ki67)对类器官进行免疫荧光染色，结果发现两种细胞培养的类器官高表达胆管细胞标志物，且具有高的增殖能力(图11)。
2、EpCAM+/Gli1+形成的类器官可在体外分化成为有功能的肝细胞
为了进一步研究EpCAM+/Gli1+形成的类器官在体外分化能力，将传代后的细胞先用生长培养基培养3天，然后更换为分化培养基再培养10天，首先通过qPCR 分析了成熟肝细胞标志物(HNF4a和Alb)和胆管细胞标志物(KRT19、EpCAM)在分别存在生长培养基和分化培养基的类器官中的表达情况。
结果显示，KRT19、EpCAM主要在存在生长培养基的类器官中表达，而肝细胞特异性标志物(HNF4a和Alb)主要在存在分化培养基的类器官中表达。接下来通过用肝细胞特异性标志物(HNF4a和Alb)对分化后的类器官进行免疫荧光染色。也同样发现在存在分化培养基的类器官中肝细胞特异性标志物高表达。糖原储存(PAS染色) 和LDL摄取是验证成熟肝细胞具有肝功能的重要方法。通过用PAS染色和LDL摄取染色发现分化培养基诱导的类器官具有正常的肝功能(图12)。
这些实验确定，EpCAM+/Gli1+细胞在体外具有形成肝成熟细胞的能力。
实施例6、Gli1+细胞在肝脏损伤修复中的生物学功能
通过以上实验明确了肝脏中Gli1+细胞的肝干/祖细胞特性。然而Gli1在肝脏损伤修复过程中具体的生物学功能仍然不是很清楚。为了探讨在机体内Gli1+细胞是否可以增强肝脏损伤修复以及促进肝细胞再生的能力，将相同数量的体外培养的 EpCAM+/Gli1-和EpCAM+/Gli1+类器官细胞分别移植进入检验肝脏再生能力的模型小鼠(Fah基因敲除小鼠)，分别在不同时间点分析两种细胞在肝脏中增殖的效率，以及对恢复Fah缺陷小鼠的肝脏功能的能力。分别在移植EpCAM+/Gli1-和 EpCAM+/Gli1+类器官细胞1个月和3个月后，用FAH抗体检测肝脏功能恢复的能力。
结果发现，在移植后1个月时可观察到零星的FAH阳性细胞，移植3个月后可以观察到很多的FAH阳性细胞，但是移植EpCAM+/Gli1-和EpCAM+/Gli1+类器官细胞两者没有明显的差异(图13)。
因此，EpCAM+/Gli1+形成的类器官的效率更高，在同一时间点类器官相对大，除此之外，EpCAM+/Gli1-和EpCAM+/Gli1+类器官的其它表型一致。
实施例7、人源肝脏细胞的3D类器官培养和Hh信号通路激动剂和抑制剂对培养的类器官的作用
本发明人的前期工作中，在获取人源肝脏样本的基础上，通过流式细胞术分离EpCAM+细胞，并成功地建立了人源肝脏细胞的3D类器官培养体系。肝脏类器官细胞可以快速地增殖(图14)，并可以进行超过25代的连续培养，同时肝脏类器官细胞可以进行冷冻保存和复苏。
为了确定Hh信号通路对培养的人源肝脏细胞3D类器官的调控作用，本发明人采用Hh信号通路的抑制剂SANT-1(靶向Smo)、GANT-61(靶向Gli)和Smo的激动剂SAG分别处理培养的3D类器官。
结果发现，只有Gli的抑制剂GANT-61能够抑制人源3D类器官的生长(图15)。这一结果一方面暗示以Gli1为代表的非经典Hh通路以及Gli1+细胞在肝脏损伤修复过程中可能发挥更为重要的作用，同时也为利用3D类器官进一步筛选相关小分子先导化合物并对细胞增殖进行人工干预打下了坚实的基础。
总结与讨论
肝脏是最大和最重要的代谢器官之一，在损伤后具有非常高的再生潜力。肝细胞是肝脏生理功能的主要功能细胞类型。因此，新肝细胞的细胞来源一直是肝损伤后再生研究的重点。肝脏的再生能力主要取决于肝细胞和胆管细胞这两种上皮细胞的自我增殖能力。近年来的研究表明，在严重肝损伤中，肝细胞和胆管上皮细胞本身可能互为兼性肝干/祖细胞(LPC)，参与受损肝脏的修复。然而，包括间充质细胞和免疫细胞在内的非上皮细胞在肝再生中的作用仍不完全清楚。当肝细胞和胆管细胞严重受损时，LPC可能通过产生新的肝细胞促进肝再生。毫无疑问，LPC特异性标记的识别将极大地促进肝再生领域的发展。既往研究提示间充质标志物Foxl1可被识别为兼性LPC的标志物，并能在肝损伤后产生肝细胞和胆道细胞。然而，需要强调的是，Foxl1基因在肝损伤之前并不表达，因此不能用于对肝再生过程中产生的细胞进行预标记。另外，多种表面标记物已被用于分离具有肝再生能力的胆管细胞亚群，包括EpCAM、TROP2、CD133、Lgr5、CD44和Thy-1。然而，这些结果是基于单一选择标记或没有完全排除其他非祖细胞群体。在本发明中，本发明人发现了一种新的Gli1+间充质样细胞群，在慢性损伤中有助于形成新的肝细胞。本发明人发现肝脏中的Gli1+细胞是一个异质性群体，其中包括PDGFRa+***和非常小的EpCAM+细胞群。通过scRNA-seq测序，本发明人发现EpCAM+/Gli1+细胞似乎处于双表型状态，共表达上皮标志物和间充质标志物。同时，本发明人的数据也表明，Gli1和EpCAM标记了健康肝脏中存在的一种特殊的细胞群，在体外可扩展为上皮类器官，在体内和体外均可分化为功能性肝细胞。因此，Gli1和EpCAM可以作为筛选肝祖细胞的标志物。基于小鼠研究，本发明人利用培养的EpCAM+人源肝脏类器官为对象，研究Hh通路多种抑制剂及激动剂对人源肝脏类器官的影响，结果显示只有Gli的抑制剂能够抑制人源肝脏类器官的形成、生长及增殖。因此可以明确在培养的人源类器官中存在Gli1的表达，将Gli1和EpCAM共表达的祖细胞群分离出来，在体外进行培养扩增，这将为人类肝脏再生提供新的途径。总之， EpCAM+/Gli1+细胞用于肝脏修复的遗传证据为肝脏疾病和再生的细胞和分子机制提供了新的见解。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心
<120> Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用
<130> 205190
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 1
tgtggacata gctgatgtgg cttac 25
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 2
caccctcagg tccatgctct ta 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 3
gtcctacaga ttgacaatgc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 4
cacgctctgg atctgtgaca 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 5
agctcgaggc tccgtagtgt tt 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 6
gaaaatgtgc aggtgttgac ca 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 7
gctgagacct tcaccttcca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 8
tcttcagttg ctccgctgta 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 9
aggtcggtgt gaacggattt g 21
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 10
tgtagaccat gtagttgagg tca 23
Claims (26)
1.细胞或细胞培养物的应用，用于：制备转分化形成肝细胞的组合物，制备进行肝脏损伤修复的组合物，或制备肝脏类器官；
其中，所述细胞为Gli1+细胞，且包括以下特征：(i)具有肝干/祖细胞特性，(ii)具有分化/转分化形成肝细胞的功能，(iii)具有肝脏损伤修复作用，和/或(iv)能够形成肝脏类器官。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞为Gli1+和EpCAM+细胞。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述细胞还包括选自下组的特征：
具有上皮细胞特征，或表达上皮细胞标志物；
具有间充质细胞特征，或表达间充质细胞标志物；
能形成类器官且该类器官具有间胆管细胞特征，或表达胆管细胞标志物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述胆管细胞标志物包括选自下组的标志物：KRT19、SOX9；
所述上皮细胞标志物包括选自下组的标志物：EpCAM，KRT7和KRT19；或
所述***标记物包括选自下组的标志物：PDGFRα和PDGFRβ。
5.如权利要求1～4任一所述的应用，其特征在于，所述的细胞包括传代的细胞。
6.一种分离的细胞或细胞培养物，所述细胞为Gli1+细胞且包括以下特征：(i)具有肝干/祖细胞特性，(ii)具有分化/转分化形成肝细胞的功能，(iii)具有肝脏损伤修复作用，和/或(iv)能够形成肝脏类器官。
7.如权利要求6所述的细胞或细胞培养物，其特征在于，所述细胞为Gli1+和EpCAM+细胞。
8.如权利要求7所述的细胞或细胞培养物，其特征在于，所述的细胞还包括选自下组的特征：
具有上皮细胞特征，或表达上皮细胞标志物；
具有间充质细胞特征，或表达间充质细胞标志物；
能形成类器官且该类器官具有间胆管细胞特征，或表达胆管细胞标志物。
9.如权利要求6～8任一所述的细胞或细胞培养物，其特征在于，所述Gli1+细胞通过包括以下的方法分离获得：利用特异性结合或捕获Gli1的结合分子或捕获分子，从肝组织的分离物中将Gli1+细胞分选出；或
所述Gli1+和EpCAM+细胞通过包括以下的方法分离获得：利用特异性结合或捕获Gli1和EpCAM的结合分子或捕获分子，从肝组织的分离物中将Gli1+和EpCAM+细胞分选出。
10.一种分离或富集细胞或细胞培养物的方法，所述细胞为Gli1+细胞且包括以下特征：(i)具有肝干/祖细胞特性，(ii)具有分化/转分化形成肝细胞的功能，(iii)具有肝脏损伤修复作用，和/或(iv)能够形成肝脏类器官；所述方法包括：利用特异性结合或捕获Gli1的结合分子或捕获分子，从肝组织的分离物中将Gli1+细胞分选出。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述细胞为Gli1+和EpCAM+细胞，所述方法包括：利用特异性结合或捕获Gli1和EpCAM的结合分子或捕获分子，从肝组织的分离物中将Gli1+和EpCAM+细胞分选出。
12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述分选细胞的方法包括：流式细胞分选法，免疫磁珠分选法，微流控细胞分选法，粘附法。
13.一种制备肝脏类器官的方法，包括：培养权利要求6～9任一所述的细胞或细胞培养物，使之生长和分化，从而获得肝脏类器官。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供权利要求6～9任一所述的细胞或细胞培养物，或利用权利要求1～5任一所述的方法获得细胞或细胞培养物；
(2)将(1)的细胞或细胞培养物进行生长培养；较佳地还进行1～5次传代；
(3)将(2)获得的培养物进行分化培养，从而获得肝脏类器官。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，(2)中，进行生长培养的培养基中含有Advance DMEM/F12培养液，其中添加HEPES，GlutaMAX-1，primocin，B27，N-Acetylcysteine，Nicotinamide，A83-01，Y27632，EGF，FGF10，FGF2，R-Spondin，Noggin；或
(3)中，进行分化培养的培养基中，含有Advance DMEM/F12培养液，其中添加EGF，DAPT，HEPES，GlutaMAX-1，primocin，B27，Y27632，DAPT，BMP7，HGF，制瘤素M。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的类器官还包括选自下组的类器官：传代的类器官，连续培养的类器官，经冷冻保存和/或复苏的类器官。
17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述培养包括：三维培养，或二维培养；较佳地为三维培养。
18.一种人工建立的肝脏类器官，其由权利要求6～9任一所述的细胞或细胞培养物经生长和分化获得；或，其由权利要求13～17任一所述的制备肝脏类器官的方法制备获得。
19.一种用于分离或富集权利要求6～9任一所述的细胞或细胞培养物的试剂盒，包括：Gli1结合分子或捕获分子，和EpCAM结合分子或捕获分子。
20.一种用于制备肝脏类器官的试剂盒，包括：Gli1结合分子或捕获分子，EpCAM结合分子或捕获分子，以及进行类器官培养的试剂；或
包括：权利要求6～9任一所述的细胞或细胞培养物，以及进行类器官培养的试剂。
21.如权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述进行类器官培养的试剂包括：
进行生长培养的培养基，其含有：Advance DMEM/F12培养液，其中添加HEPES，GlutaMAX-1，primocin，B27，N-Acetylcysteine，Nicotinamide，A83-01，Y27632，EGF，FGF10，FGF2，R-Spondin，Noggin；和/或
进行分化培养的培养基，其含有Advance DMEM/F12培养液，其中添加EGF，DAPT，HEPES，GlutaMAX-1，primocin，B27，Y27632，DAPT，BMP7，HGF，制瘤素M。
22.Gli1的应用，用于筛选肝干/祖细胞，或用于制备筛选肝干/祖细胞的组合物。
23.Gli1和EpCAM的组合的应用，用于筛选肝干/祖细胞，或用于制备筛选肝干/祖细胞的组合物。
24.一种筛选促进肝细胞再生或促进肝脏修复的物质的方法，所述方法包括：
(1)用候选物质处理肝组织的分离物；和
(2)检测所述肝组织的分离物的细胞表面分子特性，若其中Gli1+细胞在统计学上增加，则该候选物质是促进肝细胞再生或促进肝脏修复的物质。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，在检测所述分离物的细胞表面分子特性时，还包括检测EpCAM；若其中Gli1+EpCAM+细胞在统计学上增加，则该候选物质是促进肝细胞再生或促进肝脏修复的物质。
26.如权利要求24或25所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述分离物中；和/或，
步骤(2)包括：检测所述分离物中Gli1+细胞或Gli1+EpCAM+细胞的量；并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的分离物；若测试组中Gli1+细胞或Gli1+EpCAM+细胞在统计学上增加，则该候选物质是促进肝细胞再生或促进肝脏修复的物质。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011034452.3A CN114317398B (zh) | 2020-09-27 | 2020-09-27 | Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011034452.3A CN114317398B (zh) | 2020-09-27 | 2020-09-27 | Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114317398A true CN114317398A (zh) | 2022-04-12 |
| CN114317398B CN114317398B (zh) | 2024-03-01 |
Family
ID=81011112
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011034452.3A Active CN114317398B (zh) | 2020-09-27 | 2020-09-27 | Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114317398B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070179091A1 (en) * | 2005-12-27 | 2007-08-02 | Genentech, Inc. | Hedgehog Kinases and Their Use in Modulating Hedgehog Signaling |
| US20080019961A1 (en) * | 2006-02-21 | 2008-01-24 | Regents Of The University Of Michigan | Hedgehog signaling pathway antagonist cancer treatment |
| US20100329986A1 (en) * | 2009-01-06 | 2010-12-30 | Greenbaum Linda E | Adult Hepatic Progenitor Cells and Methods of Use Thereof |
| WO2011038300A1 (en) * | 2009-09-24 | 2011-03-31 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Cancer stem cells, kits, and methods |
| US20160341726A1 (en) * | 2014-02-06 | 2016-11-24 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Uses of gli1 in detecting tissue fibrosis |
| US20170191030A1 (en) * | 2014-05-16 | 2017-07-06 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Improved culture method for organoids |
| US20180028442A1 (en) * | 2016-06-07 | 2018-02-01 | Targagenix, Inc. | Nanoemulsion compositions of taxoid drugs, and methods for the use thereof to target cancer cells and cancer stem cells |
-
2020
- 2020-09-27 CN CN202011034452.3A patent/CN114317398B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070179091A1 (en) * | 2005-12-27 | 2007-08-02 | Genentech, Inc. | Hedgehog Kinases and Their Use in Modulating Hedgehog Signaling |
| US20080019961A1 (en) * | 2006-02-21 | 2008-01-24 | Regents Of The University Of Michigan | Hedgehog signaling pathway antagonist cancer treatment |
| US20100329986A1 (en) * | 2009-01-06 | 2010-12-30 | Greenbaum Linda E | Adult Hepatic Progenitor Cells and Methods of Use Thereof |
| WO2011038300A1 (en) * | 2009-09-24 | 2011-03-31 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Cancer stem cells, kits, and methods |
| US20160341726A1 (en) * | 2014-02-06 | 2016-11-24 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Uses of gli1 in detecting tissue fibrosis |
| US20170191030A1 (en) * | 2014-05-16 | 2017-07-06 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Improved culture method for organoids |
| US20180028442A1 (en) * | 2016-06-07 | 2018-02-01 | Targagenix, Inc. | Nanoemulsion compositions of taxoid drugs, and methods for the use thereof to target cancer cells and cancer stem cells |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| GRZELAK, CA: "The intrahepatic signalling niche of hedgehog is defined by primary cilia positive cells during chronic liver injury", JOURNAL OF HEPATOLOGY, vol. 60, no. 1, 22 January 2014 (2014-01-22), pages 143 - 151, XP028801945, DOI: 10.1016/j.jhep.2013.08.012 * |
| MAYUKO OKABE 等: "Potential hepatic stem cells reside in EpCAM+ cells of normal and injured mouse liver", DEVELOPMENT, vol. 136, no. 11, pages 1951 - 1960 * |
| VIKAS GUPTA等: "Hedgehog Signaling Demarcates a Niche of Fibrogenic Peribiliary Mesenchymal Cells", GASTROENTEROLOGY, vol. 159, no. 2, pages 624 - 638 * |
| 蔡毅东: "多模式肝损伤后Hedgehog信号通路的表达分析", 中国中医药信息杂志, vol. 20, no. 8, 15 August 2013 (2013-08-15), pages 48 - 51 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114317398B (zh) | 2024-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Miserocchi et al. | Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies | |
| EP3158056B1 (en) | Single cell-derived organoids | |
| US20210208131A1 (en) | Immune cell organoid co-cultures | |
| Kamiya et al. | Enrichment and clonal culture of progenitor cells during mouse postnatal liver development in mice | |
| Al-Lamki et al. | Human organ culture: updating the approach to bridge the gap from in vitro to in vivo in inflammation, cancer, and stem cell biology | |
| US9151744B2 (en) | Lung tissue model | |
| Buzhor et al. | Reactivation of NCAM1 defines a subpopulation of human adult kidney epithelial cells with clonogenic and stem/progenitor properties | |
| CN112080472B (zh) | 一种培养专用于生物医药功能研究的人肺癌类器官3d模型的方法 | |
| CN102325871B (zh) | 条件培养基和制备其的方法 | |
| Li et al. | Generation of offspring-producing 3D ovarian organoids derived from female germline stem cells and their application in toxicological detection | |
| AU2010244121B2 (en) | Lung tissue model | |
| CN105121632A (zh) | 由多能干细胞生成肝细胞和胆管细胞的方法 | |
| TWI448554B (zh) | 肝星形細胞前驅體及其分離方法 | |
| KR20220004126A (ko) | 유도 다능성 줄기 세포로부터 생체내에서 기능적이고 환자-특이적인 흉선 조직의 생성 | |
| JP2022535855A (ja) | 肝臓細胞を作製および使用する方法 | |
| EP2265708B1 (en) | Methods for stem cell production and therapy | |
| US10751375B2 (en) | Mitochondrial epigenetic reprogramming and transplant | |
| AU2012262382B2 (en) | Bioartificial proximal tubule systems and methods of use | |
| CN110121555B (zh) | 包含工程化内皮细胞的血脑屏障 | |
| Wang et al. | Development of a cytokine-producing immortalized murine Kupffer cell line | |
| US11834680B2 (en) | Single kidney cell-derived organoids | |
| CN114317398B (zh) | Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用 | |
| WO2024053406A1 (ja) | 小腸上皮様細胞及びその作製方法 | |
| Saber et al. | JAK/STAT3 pathway promotes proliferation of ovarian aggregate-derived stem cells in vitro | |
| TW202417612A (zh) | 非真皮乳突細胞至真皮乳突細胞之轉分化(transdifferentiation) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |