BR112013030567B1 - dispositivos de túbulo proximal bioartificial e método in vitro para gerar um dispositivo de túbulo proximal bioartificial por diferenciação de uma ou mais células precursoras em células renais - Google Patents

Abstract

DISPOSITIVOS DE TÚBULO PROXIMAL BIOARTIFICIAL E MÉTODO PARA DIFERENCIAR UMA OU MAIS CÉLULA S PRECURSORAS EM CÉLULAS RENAIS. A invenção do presente pedido de patente apresenta um dispositivo de túbulo proximal bioartificial, construído ao preparar uma matriz biológica descelularizada, semear a matriz biológica com células derivadas de rins de mamífero e, opcionalmente, células endoteliais de mamífero. O dispositivo pode, então, ser cultivado estaticamente ou maturado com o uso de cultura de biorreator para permitir a diferenciação das células de rins em células de túbulo proximal em ação. O dispositivo é capaz de realizar funções de túbulo proximal. O pedido também descreve vários métodos de produção dos dispositivos de túbulo proximal. O pedido descreve, ainda, métodos de uso de dispositivos de túbulo proximal bioartificiais para, por exemplo, estudos in vitro de transporte de célula de túbulo, efeitos de toxicidade de vários compostos ou a triagem de composto farmacêutico.

Description

DISPOSITIVOS DE TÚBULO PROXIMAL BIOARTIFICIAL E MÉTODO IN VITRO PARA GERAR UM DISPOSITIVO DE TÚBULO PROXIMAL BIOARTIFICIAL POR DIFERENCIAÇÃO DE UMA OU MAIS CÉLULAS PRECURSORAS EM CÉLULAS RENAIS REFERÊNCIA REMISSIVA AOS PEDIDOS DE DEPÓSITO CORRELATOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório U.S. n° 61/490.890, depositado em 27 de maio de 2011, cujo conteúdo está incorporado a título de referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A invenção refere-se em geral a um dispositivo de túbulo proximal bioartificial que compreende um arcabouço biológico e uma ou mais células progenitoras (como, por exemplo, células derivadas de rim de mamífero) que são diferenciadas em uma monocamada de célula de túbulo proximal renal no arcabouço. A invenção se refere adicionalmente aos métodos de preparação e cultura do dispositivo em um biorreator. Também são fornecidos métodos para o uso do dispositivo para nefrotoxicidade ou triagem de composto farmacêutico in vitro.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] A doença renal crônica (CKD) e a doença renal de estágio final (ESRD) são definidas por um declínio em função renal, principalmente, a taxa de filtração glomerular. Isso resulta em uma incapacidade dos rins em excretar dejetos metabólicos tóxicos produzidos pelo corpo. Nos Estados Unidos, a CKD está se tornando crescentemente comum e está associada a resultados de estado de saúde insatisfatório e custos médicos altos. A National Kidney Foundation estima que 20 milhões de americanos tenham CKD e pelo menos 20 milhões de outras pessoas estejam em risco de desenvolver CKD. A ESRD afeta mais de 500.000 pacientes com uma população em risco de ter CKD alcançando 1,5 milhão de pacientes. Os custos totais para CKD e ESRD contabilizam quase 30% do total de custos Medicare, entretanto, esses pacientes constituem apenas 8,1% do total de população Medicare (2008 US Renal Data Service, 2008 Annual Report). A incidência de ESRD aumentou mais de 50% nos últimos 10 anos e o número de pacientes com ou em risco de CKD está crescendo de forma constante. Consequentemente, há uma grande necessidade por novas opções terapêuticas para permitir o reparo de rins danificados, bem como para sistemas in vitro que possam determinar a nefrotoxicidade de compostos de interesse.

[0004] Muitos xenobióticos ou moléculas derivadas de sua degradação, são removidos do sangue através do transporte ativo para o filtrado desejado para a bexiga por células de túbulo proximal renal dos rins. Como uma consequência da execução dessa função importante, as células de túbulo proximal renal são com frequência danificadas pelo efeito tóxico desses compostos. Dessa forma, o teste de nefrotoxicidade de compostos terapêuticos potenciais em um sistema in vitro que poderia substituir potencialmente o teste animal tem ganhado interesse significativo.

[0005] Os modelos à base de cultura celular atuais para testar função e formação de monocamada epitelial de túbulo proximal renal utilizam células primárias ou foram principalmente desenvolvidos com o uso de linhagens celulares estabelecidas de várias fontes, como, por exemplo, MDCK (Rins Caninos Madin-Darby), LLC-PK1 (rins porcinos com câncer pulmonar de Lewis 1) ou células HK-2, que são uma linhagem celular de rim humano imortalizada através da transdução com genes 16 E6/E7 de vírus papiloma humano. Os sistemas de ensaio que usam essas células tipicamente fazem uso de filtros porosos (como, por exemplo, filtros TRANSWELL®), que permitem a exposição de fluido tanto no lado apical quanto no lado basolateral das células, o que promove a diferenciação epitelial.

[0006] Entretanto, o uso dessas linhagens celulares tem várias desvantagens. Muitas dessas linhagens celulares são transformadas ou derivadas de um tumor, o que altera potencialmente seu crescimento, sua diferenciação e, por fim, suas características funcionais. Ademais, muitas dessas linhagens celulares não são derivadas de humano. Portanto, pode haver diferenças específicas de espécie em função e em respostas dessas células a vários compostos. O uso de células primárias é pouco prático, posto que as células são tipicamente recentemente isoladas e minimamente expandidas antes de serem usadas para experimentos. O processo de isolamento pode ser difícil com a contaminação de populações de célula indesejadas. Além disso, pode haver variabilidade significativa do material fonte de doador.

[0007] Um outro problema comum é a duração limitada na qual as células primárias irão formar uma monocamada intacta; isso limita a utilidade das células para estudos in vitro. As células primárias frequentemente crescem em excesso, puxam a superfície e formam agregados tridimensionais, requerem que fatores adicionais sejam adicionados, como inibidores de MEK (proteína quinase quinase ativadora de mitógeno) para manter a inibição de contato (como apresentado, por exemplo, no pedido de publicação U.S. 2009/0209019). Os filtros porosos (como, por exemplo, filtros TRANSWELL®), embora um tanto quanto eficazes, são produzidos a partir de materiais sintéticos e, portanto, não representam precisamente a matriz subjacente à qual as células de túbulo renal são tipicamente expostas in vivo.

[0008] Foram descritos outros métodos alternativos para triagem que dependem da formação de estruturas de túbulo tridimensionais que levam vantagem em comparação com o crescimento excessivo supracitado de células primárias em superfícies sólidas (consulte WO 2010/064995 A1), dentro de géis 3D como, por exemplo, MATRIGEL™ ou a cultura de túbulos renais isolados de animais. O último é problemático devido à técnica de isolamento complicada e às diferenças de espécie que precisam ser consideradas. Uma outra desvantagem dessas alternativas é sua capacidade de apenas avaliar o transporte de compostos xenobióticos, que são aplicados aos meios de cultura, no lúmen dos túbulos renais. O efeito de tais compostos sobre as funções normais dos túbulos, como, por exemplo, reabsorção de glicose ou absorção de albumina, não pode ser avaliada, posto que não há maneira confiável de introduzir substâncias de teste marcadas no lúmen ou tomar amostras do fluido luminal dos túbulos para ensaio. Além disso, os efeitos de alterações em condições dinâmicas de fluxo e fisiológicas que podem ocorrer sob vários cenários in vivo não podem ser avaliados.

[0009] Portanto, existe uma necessidade no campo por desenvolver um bioensaio que melhor reflete a fisiologia normal de epitélio de túbulo proximal renal. Isso permitirá por fim o desenvolvimento terapias novas e mais eficazes para doença renal.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00010] Este pedido abrange dispositivos de túbulo proximal bioartificiais que têm um arcabouço de matriz biológica descelularizada no qual uma monocamada de células de túbulo proximal renal é formado a partir de células precursoras (como, por exemplo, de mamífero (por exemplo, humana) células derivadas de rins).

[00011] A presente invenção descreve um dispositivo de túbulo proximal bioartificial, construído através da preparação de uma matriz biológica descelularizada, da semeadura da matriz biológica com células derivadas de rim de mamífero e opcionalmente células endoteliais de mamífero. O dispositivo pode, então, ser cultivado estaticamente ou maturado com o uso de cultura de biorreator para permitir a diferenciação das células renais no funcionamento das células de túbulo proximal. O dispositivo resultante é capaz de executar funções de túbulo proximal, por exemplo, o transporte de moléculas do lado da membrana biológica para o outro. A presente invenção também descreve vários métodos de produção e maturação dos dispositivos de túbulo proximal bioartificiais. A presente invenção também descreve métodos para o uso dos dispositivos de túbulo proximal bioartificiais para estudos in vitro de transporte de célula de túbulo, efeitos de toxicidade de vários compostos ou triagem de composto farmacêutico.

[00012] Em uma modalidade, o dispositivo de túbulo proximal bioartificial compreende um arcabouço de matriz biológica descelularizada semeado com uma ou mais células diferenciáveis em células renais (por exemplo, uma célula precursora que pode ser diferenciada em células renais) sob condições suficientes para permitir a diferenciação dessas células em células de túbulo proximal renal através do que as células diferenciadas formam uma monocamada epitelial no arcabouço. O dispositivo de túbulo proximal bioartificial pode, opcionalmente, compreender ainda células endoteliais vasculares.

[00013] Em outra modalidade, o dispositivo de túbulo proximal bioartificial compreende um arcabouço biológico descelularizado que tem pelo menos duas superfícies em que pelo menos uma superfície é semeada com uma ou mais células diferenciáveis em células renais (por exemplo, uma célula precursora que pode ser diferenciada em uma célula renal) sob condições suficientes para permitir a diferenciação das células em células epiteliais de túbulo proximal renal, através do que as células formam uma monocamada celular na superfície do arcabouço.

[00014] Em uma modalidade alternativa, o dispositivo proximal bioartificial compreende um arcabouço biológico descelularizado derivado de tecido de mamífero que tem uma ou mais superfícies e uma monocamada epitelial de túbulo proximal renal em uma superfície do arcabouço, em que a monocamada epitelial é formada através da semeadura da superfície com uma ou mais células derivadas de rim de mamífero sob condições suficientes para permitir a diferenciação das células derivadas de rins em células de túbulo proximal renal e a formação da monocamada. A semeadura da superfície pode ser executada em um biorreator. Tal biorreator pode ter um elemento de corpo superior, um elemento de corpo inferior com uma área para crescimento de célula e um ou mais conectores.

[00015] As uma ou mais células diferenciáveis em células renais (por exemplo, célula precursora) podem ser células epiteliais de túbulo renal primárias, células-tronco pluripotentes induzíveis ou células progenitoras diferenciada em células renais ou células progenitoras renais, células-tronco isoladas dos rins ou células progenitoras isoladas dos rins e misturas das mesmas. Em uma modalidade, as uma ou mais células diferenciáveis em células renais são células derivadas de rins de um mamífero como, por exemplo, um ser humano. Essas células derivadas de rins podem ser obtidas junto ao córtex dos rins, medula dos rins, região subcapsular dos rins e misturas dos mesmos.

[00016] Ainda em uma outra modalidade, o dispositivo de túbulo proximal bioartificial compreende um arcabouço biológico descelularizado que tem pelo menos duas superfícies em que pelo menos uma superfície é semeada com uma ou mais células derivadas de rim de mamífero sob condições suficientes para permitir a diferenciação das células derivadas de rins em células de túbulo proximal renal, em que as células formam uma monocamada epitelial sobre a superfície do arcabouço. O mamífero pode ser um ser humano e as células podem ser obtidas junto ao córtex dos rins, medula dos rins ou região subcapsular dos rins.

[00017] Em certas modalidades, o arcabouço de matriz biológica descelularizada é derivado de tecido de mamífero. O arcabouço pode ser derivado de tecido de mamífero como, por exemplo, tecido porcino. Por exemplo, o arcabouço pode ser derivado do estômago, duodeno, jejuno, íleo ou cólon de um mamífero. Em uma modalidade da invenção, o arcabouço é derivado da submucosa do intestino delgado. Em uma outra modalidade, a matriz biológica descelularizada pode ser derivada de tecido mucoso ou submucoso.

[00018] Em uma modalidade da invenção, as células derivadas de rins têm a capacidade de autorrenovação e expansão em cultura, positivas para a expressão de um ou mais dentre Oct-4, Pax-2 e Rex-1 e negativas para a expressão de um ou mais dentre Sox2, FGF4, hTert e Wnt-4. Em uma outra modalidade, as células derivadas de rins têm a capacidade de autorrenovação e expansão em cultura, positivas para a expressão de um ou mais dentre Oct-4 e Pax-2 e negativas para a expressão de um ou mais dentre Sox2, FGF4, hTert e Wnt-4.

[00019] Em uma outra modalidade, as células derivadas de rins têm a capacidade de autorrenovação e expansão em cultura, positivas para a expressão de pelo menos um dentre Eya1, Pax-2, WT1, FoxD1, BMP7, BMP2, GDF5, EpoR ou Rex-1 e negativas para a expressão de pelo menos um dentre Sox2, FGF4, hTert ou Wnt-4. Em certas modalidades, as células derivadas de rins também podem ser positivas para pelo menos um dentre os marcadores de superfície celular HLA I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166, ou SSEA-4 e negativas para pelo menos um dentre os marcadores de superfície celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141 ou E-caderina.

[00020] Em algumas modalidades, uma segunda superfície do arcabouço pode ser semeada com células endoteliais vasculares de mamífero. Por exemplo, as células endoteliais vasculares podem ser linhagens celulares endoteliais, células progenitoras endoteliais, células endoteliais primárias, células endoteliais microvasculares e misturas das mesmas.

[00021] Uma modalidade alternativa da invenção é um dispositivo de túbulo proximal bioartificial que compreende um arcabouço de matriz biológica descelularizada semeado com uma ou mais células precursoras (isto é, células precursoras que podem diferenciar em células renais) sob condições suficientes para permitir a diferenciação da célula precursora em células epiteliais de túbulo proximal renal, em que as células diferenciadas formam uma monocamada epitelial no arcabouço. O arcabouço de matriz biológica descelularizada pode ser derivado de tecido de mamífero (por exemplo, tecido porcino) como, por exemplo, tecido mucoso ou submucoso. Em uma modalidade, o arcabouço de matriz biológica descelularizada é derivado de uma canal alimentar de mamífero. Em uma outra modalidade, o arcabouço de matriz biológica descelularizada é derivado (por exemplo, obtida) do estômago, duodeno, jejuno, íleo ou cólon de um mamífero. As uma ou mais células precursoras são selecionadas do grupo que consiste em células epiteliais de túbulo renal primárias, células-tronco pluripotentes induzíveis diferenciada em células renais ou células progenitoras renais, células progenitoras diferenciadas em células renais ou células progenitoras renais, células-tronco isoladas dos rins ou células progenitoras isoladas dos rins e misturas das mesmas. Em uma modalidade, as células progenitoras são células derivadas de rim humano. Em uma modalidade, as células derivadas de rim humano têm a capacidade de autorrenovação e expansão em cultura e são positivas para a expressão de pelo menos uma dentre Oct-4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 ou GDF5; e negativas para a expressão de pelo menos uma dentre Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2, E-caderina ou GATA-4. Opcionalmente, essas células também são positivas para pelo menos um dentre os marcadores de superfície celular HLA-I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166 ou SSEA-4; e negativas para pelo menos um dentre os marcadores de superfície celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138 e CD141. Além disso, as células opcionalmente secretam ainda pelo menos um dos fatores tróficos FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 ou VEGF; e não secretam pelo menos um dentre os fatores tróficos PDGF-bb ou IL12p70.

[00022] Ainda uma outra modalidade alternativa da invenção é um dispositivo de túbulo proximal bioartificial que compreende um arcabouço biológico descelularizado que tem pelo menos duas superfícies em que pelo menos uma superfície é semeada com uma ou mais células precursoras (isto é, células precursoras que podem ser diferenciadas em células renais) sob condições suficientes para permitir a diferenciação das células em células epiteliais de túbulo proximal renal, em que as células formam uma monocamada epitelial na superfície do arcabouço. O arcabouço de matriz biológica descelularizada é derivado de tecido de mamífero (por exemplo, tecido porcino). Em uma modalidade, o arcabouço de matriz biológica descelularizada é derivado de tecido mucoso ou submucoso. Alternativamente, o arcabouço de matriz biológica descelularizada é derivado de um canal alimentar de mamífero. Em uma outra modalidade, o arcabouço de matriz biológica descelularizada é derivado (por exemplo, obtida) do estômago, duodeno, jejuno, íleo ou cólon de um mamífero. As uma ou mais células precursoras são selecionadas do grupo que consiste em células epiteliais de túbulo renal primárias, células-tronco pluripotentes induzíveis diferenciada em células renais ou células progenitoras renais, células progenitoras diferenciadas em células renais ou células progenitoras renais, células-tronco isoladas dos rins ou células progenitoras isoladas dos rins e misturas das mesmas. Em uma modalidade, as células progenitoras são células derivadas de rim humano. Em uma modalidade, as células derivadas de rim humano têm a capacidade de autorrenovação e expansão em cultura e são positivas para a expressão de pelo menos uma dentre Oct-4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 ou GDF5; e negativas para a expressão de pelo menos uma dentre Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2, E-caderina ou GATA-4. Opcionalmente, essas células também são positivas para pelo menos um dentre os marcadores de superfície celular HLA-I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166 ou SSEA-4; e negativas para pelo menos um dentre os marcadores de superfície celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138 e CD141. Além disso, as células opcionalmente secretam ainda pelo menos um dos fatores tróficos FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 ou VEGF; e não secretam pelo menos um dentre os fatores tróficos PDGF-bb ou IL12p70. Em uma outra modalidade, a segunda superfície do arcabouço é semeada com células endoteliais vasculares de mamífero. Essas células endoteliais vasculares podem ser selecionadas a partir de linhagens celulares endoteliais, células progenitoras endoteliais, células endoteliais primárias ou células endoteliais microvasculares.

[00023] Ainda uma outra modalidade da invenção é um método para o uso dos dispositivos de túbulo proximal. Consequentemente, uma modalidade é um método de diferenciação de uma ou mais células precursoras em células renais que compreende semear um arcabouço de matriz biológica descelularizada (isto é, células precursoras que podem ser diferenciadas em células renais) com uma ou mais células precursoras e cultivar as células no arcabouço sob condições suficientes para permitir a diferenciação da célula precursora em células epiteliais de túbulo proximal renal, em que as células diferenciadas formam uma monocamada epitelial no arcabouço. O arcabouço de matriz biológica descelularizada pode ter duas superfícies. Em uma modalidade, o arcabouço de matriz biológica descelularizada é derivado de tecido de mamífero (por exemplo, porcino). Consequentemente, o arcabouço de matriz biológica descelularizada pode ser derivado (por exemplo, obtida) de tecido mucoso ou submucoso. Em uma outra modalidade, o arcabouço de matriz biológica descelularizada é derivado do estômago, duodeno, jejuno, íleo ou cólon de um mamífero. Os métodos podem usar as uma ou mais células precursoras são selecionadas do grupo que consiste em células epiteliais de túbulo renal primárias, células-tronco pluripotentes induzíveis diferenciada em células renais ou células progenitoras renais, células progenitoras diferenciadas em células renais ou células progenitoras renais, células-tronco isoladas dos rins ou células progenitoras isoladas dos rins e misturas das mesmas. Em uma modalidade, as células progenitoras utilizadas nos métodos são células derivadas de rim humano.

[00024] Em uma modalidade, as células derivadas de rim humano usadas nos métodos têm a capacidade de autorrenovação e expansão em cultura e são positivas para a expressão de pelo menos uma dentre Oct-4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 ou GDF5; e negativas para a expressão de pelo menos uma dentre Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2, E-caderina ou GATA-4. Em outra modalidade, essas células também são positivas para pelo menos um dentre os marcadores de superfície celular HLA-I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166 ou SSEA-4; e negativas para pelo menos um dentre os marcadores de superfície celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138 e CD141. Em uma outra modalidade, as células secretam pelo menos um dos fatores tróficos FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 ou VEGF; e não secretam pelo menos um dentre os fatores tróficos PDGF-bb ou IL12p70.

[00025] Uma outra modalidade da invenção é um método de diferenciação de uma ou mais células diferenciáveis em células renais em células epiteliais de túbulo proximal renal sob condições suficientes para permitir a diferenciação, através do que as células diferenciadas formam uma monocamada epitelial e através do que a tensão é aplicada às células. O método pode compreender, adicionalmente, a etapa de semear as células em um arcabouço descelularizado antes da diferenciação das células. Quando o método compreende essa etapa, o método pode ser usado para produzir um dispositivo bioartificial da invenção. O arcabouço de matriz biológica descelularizada pode ser derivado de tecido de mamífero (como, por exemplo, porcino) como tecido mucoso ou submucoso. Em uma modalidade, o arcabouço de matriz biológica descelularizada é derivado de um canal alimentar de mamífero. Em uma outra modalidade, o arcabouço de matriz biológica descelularizada é derivado do estômago, duodeno, jejuno, íleo ou cólon de um mamífero. As uma ou mais células diferenciáveis em células renais são selecionadas do grupo que consiste em células epiteliais de túbulo renal primárias, células-tronco pluripotentes induzíveis ou células progenitoras diferenciadas em células renais ou células progenitoras renais, células-tronco isoladas dos rins ou células progenitoras isoladas dos rins e misturas das mesmas. Em uma modalidade, as uma ou mais células diferenciáveis em células renais são células derivadas de rim de mamífero (como, por exemplo, células derivadas de rim humano). As células derivadas de rins de mamífero podem ser obtidas junto ao córtex dos rins, medula dos rins, região subcapsular dos rins e misturas dos mesmos. Em uma modalidade da invenção, as células derivadas de rins têm a capacidade de autorrenovação e expansão em cultura, positivas para a expressão de um ou mais dentre Oct-4, Pax-2 e Rex-1 e negativas para a expressão de um ou mais dentre Sox2, FGF4, hTert e Wnt-4. Em uma modalidade alternativa, as células derivadas de rins têm a capacidade de autorrenovação e expansão em cultura, positivas para a expressão de pelo menos um dentre Eya1, Pax2, WT1, FoxD1, BMP7, BMP2, GDF5, EpoR ou Rex-1 e negativas para a expressão de pelo menos um dentre Sox2, FGF4, hTert ou Wnt-4. Ainda em uma outra modalidade, as células derivadas de rins são também positivas para pelo menos um dentre os marcadores de superfície celular HLA I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD166 ou SSEA-4 e negativas para pelo menos um dentre os marcadores de superfície celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141 ou E-caderina.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00026] O sumário anteriormente mencionado, bem como a seguinte descrição detalhada da invenção, serão mais bem compreendidos quando lidos em conjunto com as figuras anexas. Com o propósito de ilustrar a invenção, as figuras demonstram as modalidades da presente invenção. Deve-se compreender, no entanto, que a invenção não se limita às disposições, aos exemplos e às instrumentalidades precisas mostradas.

[00027] As Figuras 1 a 6 mostram os resultados da análise de parâmetros metabólicos para células derivadas de rim humano. A Figura 1A mostra a liberação de lactato em culturas celulares derivadas de rim humano ("culturas SW") como uma função de tempo. A Figura 1B mostra o consumo de glicose em culturas SW como uma função de tempo. A Figura 2A mostra a liberação de LDH em culturas SW como uma função de tempo. A Figura 2B mostra a liberação de lactato em culturas celulares de células derivadas de rim humano semeadas em submucosa de intestino delgado descelularizada (SIS) ("culturas SIS-SW") como função de tempo. A Figura 3A mostra o consumo de glicose em culturas SIS-SW como uma função de tempo. A Figura 3B mostra a liberação de LDH em culturas SIS-SW como uma função de tempo. A Figura 4A mostra a liberação de lactato em monocamadas desenvolvidas a partir de células derivadas de rim humano que foram semeadas em submucosa de intestino delgado descelularizada (SIS) ("culturas SIS-ML") como uma função de tempo. A Figura 4B mostra o consumo de glicose em culturas SIS-ML como uma função de tempo. A Figura 5A mostra a liberação de LDL em culturas SIS-ML como uma função de tempo. A Figura 5B mostra a liberação de lactato em culturas ML como uma função de tempo. A Figura 6A mostra o consumo de glicose em culturas ML como uma função de tempo. A Figura 6B mostra a liberação de LDH em culturas ML como uma função de tempo. Nas Figuras 1 a 6, n = 3.

[00028] A Figura 7 e a Figura 8 mostram coloração histológica de células derivadas de rim humano (hKDCs) em arcabouços de matriz extracelular (isto é, descelularizados). As células derivadas de rim humano foram semeadas sobre três diferentes configurações de arcabouço a uma concentração de 2,5 x 103 células/arcabouço e cultivadas por três semanas. As amostras foram, então, fixadas e as fatias foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E). A Figura 7A mostra a coloração histológica da cultura em sanduíche de colágeno. A Figura 7B mostra a coloração histológica da cultura em sanduíche de submucosa de intestino delgado descelularizada (SIS) de colágeno. A Figura 8A mostra a coloração histológica da cultura de monocamada de SIS descelularizada. A Figura 8B mostra a coloração histológica da cultura transcavidade revestida com colágeno.

[00029] A Figura 9 mostra a detecção imuno-histoquímica de Aquaporin-1 por hKDCs semeados em arcabouços de matriz extracelular (descelularizados). As células renais derivadas de humano foram semeadas sobre arcabouços SIS descelularizados e permitiu-se a fixação de um dia para o outro. As amostras foram cultivadas por três semanas, então, fixadas. Subsequentemente, as fatias com 3 µm de espessura foram usadas para imuno-histoquímica (IHC) com um anticorpo Aquaporin-1 anti-humano (Abcam, Cambridge, Reino Unido). As setas indicam áreas de coloração apical das células.

[00030] A Figura 10 mostra a coloração histológica de hKDCs semeadas em arcabouços descelularizados. As células derivadas de rim humano foram semeadas sobre arcabouços de SIS descelularizados em duas concentrações de célula diferentes e cultivadas por três semanas, então, fixadas. Subsequentemente, as fatias de 3 µm de espessura foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E). A Figura 10A mostra a coloração H&E de uma amostra semeada com 1 x 104 células. A Figura 10B mostra a coloração H&E de uma amostra semeada com 5 x 104 células.

[00031] A Figura 11 mostra a coloração de lectina de culturas de três semanas de f hKDC semeada em arcabouços descelularizados. As células derivadas de rim humano foram semeadas sobre os arcabouços de SIS descelularizados e cultivadas por três semanas, então, fixadas. Subsequentemente, as fatias com 3 µm de espessura foram marcadas com lectina de Lotus tetragonobulus (Figura 11A) e aglutinina de Dolichos biflorus (Figura 11B). As setas e as linhas na Figura 11A indicam áreas de coloração positiva.

[00032] A Figura 12 mostra a coloração de colágeno IV de hKDC semeada em arcabouços descelularizados. As células derivadas de rim humano foram semeadas sobre os arcabouços de SIS descelularizados, cultivadas por três semanas e, então, fixadas. Subsequentemente, as fatias com 3 µm de espessura foram marcadas com anticorpo anti-colágeno IV.

[00033] A Figura 13 mostra a coloração de Pgp-1 de hKDC semeada em arcabouços descelularizados. As células derivadas de rim humano foram semeadas sobre os arcabouços de SIS descelularizados e cultivadas por três semanas, então, fixadas. Subsequentemente, as fatias com 3 µm de espessura foram marcadas com anticorpo de P-glicoproteína-1 anti-humano.

[00034] A Figura 14 mostra a absorção de albumina sérica bovina marcada fluorescentemente (BSA-FITC) por hKDC semeada em arcabouços descelularizados. As células derivadas de rim humano foram semeadas sobre arcabouços de SIS descelularizados, cultivadas por duas semanas e, então, cultivadas na presença de BSA-FITC por 1 hora. Subsequentemente, as células foram contracoradas com DAPI (diamidino-2-fenil indol) e imageadas.

[00035] A Figura 15 é uma vista esquemática de um biorreator para cultivo celular que mostra os componentes de reator principais.

[00036] A Figura 16 mostra uma vista detalhada do elemento de corpo inferior do biorreator.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00037] Vários termos relacionados ao dispositivo, aos métodos de uso do dispositivo e outros aspectos da invenção são usados por todo o relatório descritivo e as reivindicações. Tais termos devem ser dados em seu significado comum na técnica exceto onde indicado em contrário. Outros termos especificamente definidos devem ser interpretados em uma matéria consistente com a definição aqui fornecida.

[00038] Esta invenção tem por base a descoberta de que as células precursoras que podem ser diferenciadas em células renais (células diferenciáveis em células renais) (como, por exemplo, células derivadas de rins), quando semeadas em um arcabouço de matriz biológica descelularizada sob condições que permitem a diferenciação, formam uma monocamada epitelial de túbulo proximal renal na superfície do arcabouço.

[00039] Deve ficar entendido que esta invenção não se limita a métodos, reagentes, compostos, composições ou sistemas biológicos específicos, que podem, obviamente, variar. Entende-se que a terminologia usada aqui tem o propósito de apenas descrever somente modalidades particulares e não pretende ser limitadora. Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "uma", "um" e "o(a)" incluem referências no plural solvo se o conteúdo determinar claramente de outro modo. Dessa forma, por exemplo, a referência a "uma célula" inclui uma combinação de duas ou mais células e similares.

[00040] Conforme usado na presente invenção, o termo "cerca de" quando se refere a um valor mensurável como uma quantidade, uma duração temporal e similares, se destina a abranger variações de ± 20% ou ± 10%, com mais preferência, ± 5%, com mais preferência ainda ± 1% e ainda com mais preferência ± 0,1% do valor especificado, conforme tais variações são adequadas para executar os métodos apresentados.

[00041] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado, conforme comumente compreendido pelo versado na técnica a qual a invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática para teste da presente invenção, os materiais e métodos preferenciais são descritos na presente invenção. Na descrição e na reivindicação da presente invenção, a terminologia a seguir será usada.

[00042] "Diferenciação" é o processo através do qual uma célula não especializada ("não comprometida") ou menos especializada adquire as características de uma célula especializada, como uma célula renal, por exemplo. Uma "célula diferenciada ou induzida por diferenciação" é uma que adotou uma posição mais especializada ("comprometida") dentro da linhagem de uma célula. O termo "comprometida," quando aplicado ao processo de diferenciação, se refere a uma célula que prosseguiu na rota de diferenciação para um ponto em que, sob circunstâncias normais, irá continuar a diferenciar em um tipo de célula específico ou subconjunto de tipos celulares e não pode, sob circunstâncias normais, ser diferenciada em um tipo de célula diferente ou inverter para um tipo de célula menos diferenciado. "Desdiferenciação" se refere ao processo pelo qual uma célula inverte para uma posição menos especializada (ou comprometida) dentro da linhagem de uma célula. Conforme usado na presente invenção, a "linhagem" de uma célula define a herança da célula, isto é, de quais células a mesma vem e quais células a mesma pode dar origem. A linhagem de uma célula a coloca dentro de um esquema hereditário de desenvolvimento e diferenciação. Um "marcador específico de linhagem" se refere a uma característica especificamente associada ao fenótipo de células de uma linhagem de interesse e pode ser usado para avaliar a diferenciação de uma célula não comprometida para a linhagem de interesse.

[00043] Em um sentido amplo, uma "célula progenitora" é uma célula que tem a capacidade de criar progênies que são mais propriamente diferenciadas e ainda retém a capacidade de restaurar o agrupamento de progenitores. Por essa definição, as próprias célulastronco também são células progenitoras, como são os precursores mais imediatos para células terminalmente diferenciadas. Quando se refere às células apresentadas na presente invenção, essa definição ampla de "célula progenitora" pode ser usada. Uma célula diferenciada pode ser derivada de uma célula multipotente que propriamente é derivada de uma célula multipotente e assim por diante. Embora casa uma dessas células multipotentes possa ser considerada célulastronco, a faixa de tipos de célula pode originar uma variação considerável. Algumas células diferenciadas também têm a capacidade de gerar células de maior potencial de desenvolvimento. Tal capacidade pode ser natural ou pode ser induzida artificialmente mediante o tratamento com vários fatores. "Proliferação" indica um aumento em número de célula.

[00044] As "células progenitoras de rins" conforme usado na presente invenção são células derivadas de rins de mamífero (por exemplo, ser humano) que podem dar origem a células, como adipócitos ou osteoblastos ou podem dar origem a um ou mais tipos de tecido, por exemplo, tecido renal, além de produzir células filhas de potencial equivalente. Uma "célula progenitora renal ou dos rins" é uma célula multipotente ou pluripotente que se origina substancialmente de tecidos dos rins adulto ou fetal. Concluiu-se que essas células possuem recursos característicos de células-tronco pluripotentes, incluindo proliferação rápida e potencial para diferenciação em outras linhagens celulares. As células progenitoras de rins "multipotentes" podem dar origem a múltiplas linhagens celulares, por exemplo, linhagens de célula renal, linhagens de adipócito ou linhagens de osteoblasto. As células progenitoras dos rins demonstram um perfil de expressão gênica para marcadores gênicos de desenvolvimento prévio, marcadores gênicos de desenvolvimento renal, marcadores gênicos mesenquimais metanófricos e genes que promovem a sobrevivência de mesênquima metanófrico. Por exemplo, as células progenitoras dos rins (por exemplo, células derivadas de rim humano) demonstram um perfil de expressão gênica que é positivo para a expressão de genes incluindo, mas não se limitando a, Oct-4, Pax-2 e Rex-1 e negativo para a expressão de genes incluindo, mas não se limitando a, Sox2, FGF4, hTERT e Wnt-4.

[00045] "Tecido" se refere a um grupo ou camada de célula similarmente especializadas, que juntas executam certas funções especiais. "Órgão" se refere a duas ou mais camadas adjacentes de tecido, cujas camadas de tecido mantêm alguma forma de interação célula-célula e/ou célula-matriz para formar uma microarquitetura.

[00046] "Rim" se refere a um dentre um par de órgãos no abdômen. Os rins removem o resíduo do sangue (como urina), produzem eritropoietina para estimular produção de eritrócito e desempenham um papel em regulação de pressão sanguínea. Os rins funcionam para manter o equilíbrio apropriado de água e eletrólito, regular a concentração ácido-base e filtrar o sangue de resíduos metabólicos, que são, então, excretados como urina.

[00047] "Cultura primária" se refere a uma população celular misturada de células que permite a interação de muitos tipos de célula diferentes isolados de um tecido. A palavra "primária" tem seu significado usual na técnica de cultura de tecido. "Capacidade de autorrenovação e expansão em cultura" se refere a populações de célula derivadas de rins de mamífero que crescem e se dividem em cultura celular e mantêm substancialmente o mesmo fenótipo conforme medido por marcadores de célula e secreção de fatores tróficos da célula mãe para a célula filha. Em algum ponto durante a replicação da população de célula derivada de rim de mamífero, o fenótipo pode mudar para um estado mais especializado ou diferenciado da célula derivada de rim.

[00048] Vários termos são usados para descrever as células em cultura. "Cultura celular" se refere geralmente a células retiradas de um organismo vivo e desenvolvidas sob condições controladas, por exemplo, "em cultura". Uma "cultura celular primária" é uma cultura de células, tecidos ou órgãos retirados diretamente de organismos antes da primeira subcultura. As células são "expandidas" em cultura quando são colocadas em um meio de crescimento sob condições que facilitam o crescimento e/ou a divisão celular, resultando em uma população maior das células. Quando as células são expandidas na cultura, a taxa de proliferação celular é, às vezes, medida pela quantidade de tempo necessária para que dobre o número de células. Isso é chamado de "tempo de duplicação".

[00049] Uma "linhagem celular" é uma população de células formada por um ou mais subcultivos de uma cultura celular primária. Cada ciclo de subcultivo é chamado de uma passagem. Quando as células são subcultivadas, as mesmas são denominadas como "submetidas à passagem". Uma população específica de células, ou uma linhagem celular, é algumas vezes chamadas de ou caracterizada pelo número de vezes que foi submetida à passagem. Por exemplo, uma população celular cultivada que foi passada dez vezes pode ser chamada de cultura "P10". A cultura primária, isto é, a primeira cultura após o isolamento de células do tecido, é designada P0. Após a primeira subcultura, as células são descritas como uma cultura secundária (P1 ou passagem 1). Após a segunda subcultura, as células se tornam uma cultural terciária (P2 ou passagem 2), etc. Será compreendido por aquele versado na técnica que pode haver muitas duplicações de populações durante o período de passagem; portanto, o número de duplicações de população de uma cultura é usualmente maior que o número de passagem. A expansão de células (isto é, o número de duplicações de população) durante o período entre a passagem depende de muitos fatores, incluindo, mas não se limitando a, densidade de semeadura, substrato, meio e tempo entre a passagem.

[00050] Em geral, um "fator trófico" é definida como uma substância que promove a sobrevivência, o crescimento, a proliferação, a maturação, a diferenciação e/ou a manutenção de uma célula ou estimula a atividade aumentada de uma célula. "Suporte trófico" é usado na presente invenção para se referir à capacidade de promover a sobrevivência, o crescimento, a proliferação, a maturação, a diferenciação e/ou a manutenção de uma célula ou até estimular a atividade aumentada de uma célula. A população de célula derivada de rim de mamífero da presente invenção produz fatores tróficos, incluindo, mas não se limitando a, fatores de crescimento, citoquinas e fatores de diferenciação. Os fatores tróficos incluem, mas não se limitam a, FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, VEGF, MMP-2 ou uma combinação dos mesmos.

[00051] "Não imunogênico" se refere a células ou uma população de células que não provoca uma resposta imunológica com efeito prejudicial na maioria os indivíduos mamíferos tratados, que é uma resposta imunológica que compromete a saúde do mamífero ou que interfere em uma resposta terapêutica no indivíduo mamífero tratado.

[00052] "Gene" se refere a uma sequência de ácido nucleico que codifica um produto gênico. O gene compreende opcionalmente informação de sequência necessária para a expressão do gene (por exemplo, promotores, intensificadores, etc.). O termo "genômico" refere-se ao genoma de um organismo.

[00053] "Dados de expressão gênica" se refere a um ou mais conjuntos de dados que contêm informações referentes a diferentes aspectos de expressão gênica. O conjunto de dados inclui opcionalmente informações referentes a: presença de transcritos alvo em célula ou amostras derivadas de célula; os níveis de abundância relativos e absolutos de transcritos-alvo; a capacidade de várias tratamentos para induzir a expressão de genes específicos; e a capacidade de vários tratamentos para alterar a expressão de genes específicos para níveis diferentes.

[00054] "Perfil de expressão gênica" se refere a uma representação do nível de expressão de uma pluralidade de genes sem (isto é, linha de base ou controle) ou em resposta a, uma condição de expressão selecionada (por exemplo, incubação da presença de um composto padrão ou composto de teste em um ou vários momentos). A expressão gênica pode ser expressa em termos de uma quantidade absoluta de mRNA transcrito para cada gene, como uma razão de mRNA transcrito em uma célula de teste em comparação com uma célula de controle e similares. Isso também se refere à expressão de um gene individual e de conjuntos de genes individuais em um indivíduo.

[00055] "Isolado" ou "purificado" se refere a algo alterado "manualmente pelo ser humano" do estado natural, isto é, algo que ocorra na natureza é definido como isolado quando foi removido de seu ambiente original ou ambos. "Isolado" também define uma composição, por exemplo, uma população de célula derivada de rim de mamífero, que é separada de contaminantes (isto é, substâncias que diferem da célula). Em um aspecto, uma população ou composição de células é substancialmente isenta de células e materiais aos quais a mesma pode estar associada por natureza. "Isolado", "purificado" ou "substancialmente puro", em relação a células derivadas de rim de mamífero, se refere a uma população de células derivadas de rim de mamífero que é pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, de preferência pelo menos cerca de 85%, com mais preferência pelo menos cerca de 90% e com a máxima preferência pelo menos cerca de 95% pura, em relação a células derivadas de rim de mamífero que constituem uma população de células total. Novamente, o termo "substancialmente pura" se refere a uma população de células derivadas de rim de mamífero da presente invenção que contêm menos que cerca de 50%, de preferência, menos que cerca de 30%, de preferência menos que cerca de 20%, com mais preferência menos que cerca de 10%, com a máxima preferência menos que cerca de 5%, das células renais de linhagem comprometida na população isolada e não amplificada original antes do cultivo e da amplificação subsequentes. A pureza de uma população ou composição de células pode ser avaliada por métodos apropriados que são bem conhecidos na técnica.

[00056] Conforme usado na presente invenção, o termo "derivado" também deve significar obtido. Dessa forma, por exemplo, as células derivadas de rim humano são células que foram isoladas e obtidas junto ao tecido de rim humano. O termo também abrange células que foram obtidas (por exemplo, isoladas) de um tecido e, então, subsequentemente cultivadas.

[00057] A invenção apresenta um dispositivo de túbulo proximal que compreende um arcabouço biológico descelularizado e uma monocamada epitelial de célula de túbulo proximal renal formada a partir de células que são diferenciáveis em células renais. O arcabouço e as células criam juntos um dispositivo de túbulo proximal bidimensional multicomponente. Essa monocamada epitelial de célula de túbulo proximal renal compreende o funcionamento das células de túbulo proximal.

[00058] Os dispositivos de túbulo proximal da invenção promovem idealmente o funcionamento de mecanismos regulatórios naturais de inibição de contato e a formação de uma monocamada intacta sem o uso de inibidores como, por exemplo, por exemplo, inibidores de MEK. Através do uso do arcabouço biológico descelularizado, os dispositivos de túbulo proximal da invenção também representam e/ou imitam vantajosamente a matriz subjacente às quais as células renais são tipicamente expostas in vivo. Idealmente, a semeadura em um arcabouço descelularizado natural permite que as células seja diferenciadas e formem monocamadas epiteliais, que são mais estáveis que as produzidas através de métodos tradicionais.

[00059] A presente invenção descreve um dispositivo de túbulo proximal bidimensional que pode ser usado como um sistema de teste in vitro para estudos de transporte, triagem de toxicidade renal ou para a triagem dos efeitos de agentes terapêuticos. Em uma modalidade, o dispositivo de túbulo proximal renal bioartificial bidimensional é construído através da semeadura de um arcabouço biológico descelularizado com células progenitoras dos rins e, opcionalmente, em alguns casos, também as células endoteliais microvasculares, seguidas de cultura estática ou cultura em um biorreator para permitir a diferenciação das células renais no funcionamento de células de túbulo proximal e manter o dispositivo montado para teste in vitro. Essas células de túbulo proximal em funcionamento formam uma monocamada na superfície do arcabouço.

[00060] A presente invenção também descreve o uso de arcabouços biológicos descelularizados como um componente do dispositivo de túbulo proximal bioartificial descrito. Uma ou mais das superfícies do arcabouço biológico descelularizado podem ser semeadas com células. Em uma modalidade, o arcabouço descelularizado pode ser derivado de qualquer tecido de mamífero, de preferência, porções do tubo digestivo, com a máxima preferência, estômago, duodeno, jejuno, íleo ou cólon. Em uma modalidade, o tecido do qual o arcabouço é derivado é, com a máxima preferência, uma porção do jejuno. Em uma modalidade, o arcabouço biológico descelularizado é derivado de tecido mucoso ou submucoso. Em uma outra modalidade, o arcabouço biológico descelularizado é derivado de submucosa de intestino delgado de mamífero. Os arcabouços descelularizados, ou partes dos mesmos, podem ser presos em dispositivos que permitem a semeadura de cada lado da superfície do arcabouço.

[00061] O tecido fonte usado para criar os arcabouços descelularizados podem ser qualquer tecido de mamífero, incluindo, mas não se limitando a tecido humano, de primata, bovino, de ovelha, porcino ou de rato. Em uma modalidade da invenção, o tecido é isolado do mamífero. Em uma outra modalidade, os arcabouços descelularizados são derivados de culturas celulares de mamífero. Ainda em outra modalidade, o tecido fonte é tecido porcino. Em modalidades preferenciais, os arcabouços são derivados de tecidos porcinos isolados de animais mais jovens, como, por exemplo, animais mais jovens menores que 6 meses de idade ou animais menores que 3 meses de idade. Em modalidades mais preferenciais, os arcabouços são derivados de tecidos porcinos isolados de animais mais jovens de cerca de 10 a 25 kg em peso, alternativamente de cerca de 10 a 20 kg em peso e, alternativamente, de cerca de 15 a cerca de 20 kg em peso. Em uma modalidade da máxima preferência, os arcabouços são derivados de tecidos porcinos isolados de animais de cerca de 10 a cerca de 15 kg em peso.

[00062] Os métodos convencionais podem ser usados para executar a acelularização (por exemplo, descelularização) do tecido. Em uma modalidade, as estruturas de mucosa do tecido isolado são conservadas durante o isolamento. Em uma modalidade preferencial, as estruturas de mucosa são subsequentemente parcial ou completamente removidas para expor a camada submucosa para fixação de célula. Em uma modalidade da invenção, as células progenitoras dos rins são cultivadas em estruturas de mucosa. Foi observado que um percentual superior de células progenitoras dos rins adota uma morfologia epitelial quando cultivadas nas subestruturas de mucosa em comparação com as estruturas de mucosa. Consequentemente, em uma modalidade alternativa, as células progenitoras dos rins são idealmente cultivadas em estruturas de submucosa.

[00063] Conforme usado na presente invenção, o termo "células diferenciáveis em células renais" deve significar uma célula precursora que é diferenciada em células renais, por exemplo, qualquer célula progenitora, precursora ou primária que pode ser diferenciada em uma célula renal. Em uma modalidade, as células podem ser selecionadas a partir de células epiteliais de túbulo renal primárias, células progenitoras (por exemplo, tronco) diferenciadas em células renais ou células progenitoras renais (como, por exemplo, célula-tronco pluripotente induzível), células derivadas de rim humano, célulastronco isoladas dos rins ou células progenitoras isoladas dos rins e misturas dos mesmos. Quaisquer células progenitoras (por exemplo, tronco) que podem ser diferenciadas em células renais ou células progenitoras renais podem ser usadas incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, células-tronco embrionárias, células IPS, células de derivação umbilical, células derivadas de placenta ou células-tronco mesenquimais.

[00064] Em uma modalidade da invenção, as células diferenciáveis são células derivadas de rim de mamífero. Consequentemente, uma modalidade da invenção é o uso de células derivadas de rim de mamífero, isoladas dos rins de mamífero (como, por exemplo, um rim humano), como um componente do sistema renal bioartificial descrito.
Foi anteriormente demonstrado, conforme descrito no pedido de publicação U.S. 2008/0112939 de Colter et al., cuja descrição está aqui incorporada a título de referência em sua totalidade, que as células progenitoras podem ser derivadas de tecido de rim humano e que essas células derivadas de rins podem se autorganizar em estrutura de túbulo e podem ser usadas para tratar um rim adoecido.

[00065] As técnicas exemplificadoras usadas para isolar, cultivar e caracterizar as células derivadas de rim de mamífero são descritas no pedido de publicação U.S. 2008/0112939 de Colter et al. Conforme descrito no pedido de publicação U.S. 2008/0112939, as células derivadas de rim humano são isoladas de um rim humano e são adequadas para transplante de órgão. Em uma modalidade, o sangue e os detritos são removidos do tecido renal antes do isolamento das células através da lavagem com qualquer meio ou tampão adequado como solução salina tamponada com fosfato. As células derivadas de rins como, por exemplo, células derivadas de rim humano, são, então, isoladas de tecido renal de mamífero por digestão enzimática. As enzimas são usadas para dissociar células do tecido renal de mamífero (por exemplo, humano). Em uma modalidade, a dispase pode ser usada. Alternativamente, as combinações de uma protease neutra (por exemplo, dispase), metaloprotease (por exemplo, colagenase) e hialuronidase pode ser usadas para dissociar células do tecido renal de mamífero (por exemplo, humano). As células isoladas são, então, transferidas para vasos estéreis de cultura de tecido que são inicialmente revestidos com gelatina. As células derivadas de rins de mamífero (por exemplo, humano) são cultivadas em qualquer meio de cultura capaz de sustentar o crescimento das células como, por exemplo, mas não se limitando a, meio de crescimento epitelial renal REGM™ (Lonza, Walkersville, MD, EUA) ou ADVANCED™ DMEM/F12 (Invitrogen).

[00066] As células diferenciáveis em células renais (por exemplo, células precursoras que podem ser diferenciadas em células renais) ou células derivadas de rim de mamífero podem ser uma população de células. Em uma modalidade, uma população de células derivadas de rim humano é usada. Em uma outra modalidade, a população é homogênea. Em uma outra modalidade, a população é substancialmente homogênea.

[00067] Em algumas modalidades, as células derivadas de rins podem ser obtidas junto ao córtex dos rins, à medula dos rins ou à região subcapsular dos rins e misturas das mesmas.

[00068] As células derivadas de rins de mamífero (por exemplo, humano) são caracterizadas por características fenotípicas, por exemplo, morfologia, potencial de crescimento, fenótipo de marcador de superfície, expressão gênica de desenvolvimento precoce, expressão gênica de desenvolvimento renal e secreção de fator trófico. O marcador de superfície, a expressão gênica e o fenótipo de secreção de fator trófico são retidos após múltiplas passagens da população de célula derivada de rim humano em cultura.

[00069] Em modalidades preferenciais, as células derivadas de rim de mamífero isoladas (isto é, as populações de célula) têm a capacidade de autorrenovação e expansão em cultura e exibem um perfil de expressão exclusivo, como qualquer um daqueles descritos a seguir.

[00070] Em uma outra modalidade da invenção, as células derivadas de rim humano são positivas para a expressão de pelo menos um dentre Oct-4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 ou GDF5. Ainda em uma outra modalidade, as células são negativas para a expressão de pelo menos um dentre Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2 ou GATA-4. Em uma modalidade alternativa, as células são positivas para a expressão de pelo menos um dentre Oct-4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 ou GDF5 e negativas para a expressão de pelo menos um dentre Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2 ou GATA-4. Em uma modalidade alternativa, a célula é positiva para a expressão de pelo menos um dentre Eya1, WT1, FoxD1, BMP7, BMP2, GDF5, EpoR ou Rex-1. Em ainda uma outra modalidade alternativa, as células são negativas para a expressão de pelo menos um dentre Sox2, FGF4, hTert ou Wnt-4. Em uma modalidade alternativa, as células são positivas para a expressão de pelo menos um dentre Eya1, WT1, FoxD1, BMP7, BMP2, GDF5, EpoR ou Rex-1 e negativas para a expressão de pelo menos um dentre Sox2, FGF4, hTert ou Wnt-4. Em uma modalidade da invenção, as células derivadas de rim humano são também positivas para pelo menos um dos marcadores de superfície celular HLA I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD166 ou SSEA-4. Em uma outra modalidade, as células derivadas de rim humano são também negativas para pelo menos um dos marcadores de superfície celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141 ou E-caderina. Em uma modalidade alternativa, as células derivadas de rim humano são também positivas para pelo menos um dentre os marcadores de superfície celular HLA I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD166 ou SSEA-4 e negativas para pelo menos um dentre os marcadores de superfície celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141 ou E-caderina. Em uma modalidade, as células derivadas de rim humano podem secretar pelo menos um dos fatores tróficos FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 ou VEGF. Em uma modalidade preferencial, as células não secretam pelo menos um dos fatores tróficos PDGFbb e IL12p70.

[00071] Em uma modalidade alternativa, as células progenitoras usadas com o dispositivo de túbulo proximal bioartificial são células derivadas de rim humano. Essas células derivadas de rim humano têm a capacidade de autorrenovação e expansão em cultura e são positivas para a expressão de pelo menos uma dentre Oct-4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 ou GDF5; e negativas para a expressão de pelo menos uma dentre Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2, E-caderina ou GATA-4. Adicionalmente, as células derivadas de rim humano podem também ser positivas para pelo menos um dos marcadores de superfície celular HLA-I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166 ou SSEA-4; e negativas para pelo menos um dentre os marcadores de superfície celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138 e CD141. Além disso, essas células opcionalmente secretam pelo menos um dos fatores tróficos FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 ou VEGF; e não secretam pelo menos um dentre os fatores tróficos PDGF-bb ou IL12p70.

[00072] Ainda em uma outra modalidade, as células derivadas de rim humano são (1) positivas para a expressão de Oct-4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 e GDF5 e (2) negativas para a expressão de pelo menos um dentre Sox2, FGF4, hTert, SIX2 e Gata-4. Em uma modalidade alternativa, as células derivadas de rins são (1) positivas para a expressão de Oct-4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 e GDF5; (2) negativas para a expressão de pelo menos um dentre Sox2, FGF4, hTert, SIX2 e Gata-4; (3) positivas para os marcadores de superfície celular HLA I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD166 e SSEA-4; e (4) negativas para HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD90, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141 e E-caderina.

[00073] Em uma outra modalidade, as células derivadas de rim humano têm a capacidade de autorrenovação e expansão em cultura, são positivas para a expressão de marcador de superfície celular HLA I e CD44, positivas para a expressão gênica de Oct-4, Pax-2 e WT1, negativas para a expressão de marcador de superfície celular de CD133 e a expressão gênica de Wtn-4. Em uma modalidade, as células derivadas de rim humano são adicionalmente positivas para a expressão gênica de BMP7, BMP2, GDF4, EpoR e Rex-1 e negativas para a expressão gênica de Sox2, FGF4 e hTert.

[00074] Em uma modalidade alternativa, as células derivadas de rim humano são: (1) capazes de autorrenovar e expandir em cultura; (2) positivas para a expressão de HLA-I e pelo menos um dentre Oct4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 ou GDF5; e (3) negativas para a expressão de CD133 e pelo menos um dentre SOX2, FGF4, hTertm Wnt-4, SIX2, E-caderina ou GATA-4. Essas células podem ser adicionalmente (4) positivas para pelo menos um dentre os marcadores de superfície celular CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166 ou SSEA-A e (5) negativas para pelo menos um dentre os marcadores de superfície celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141 e Ecaderina. Essas células também podem secretar pelo menos um dentre os fatores tróficos FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 ou VEGF e carecem de secreção de pelo menos um dentre os fatores tróficos PDGFbb ou IL12p70. Em uma modalidade alternativa, as células derivadas de rim humano são uma população.

[00075] As células derivadas de rins de mamífero (por exemplo, humanas) são passadas para um vaso de cultura separado que contém meio fresco do mesmo tipo ou de um tipo diferente do usado inicialmente, onde a população de células pode ser mitoticamente expandida. As células derivadas de rins de mamífero (por exemplo, humano) são, então, semeadas na matriz biológica e cultivadas para permitir a diferenciação das células derivadas de rins em células de túbulo proximal em funcionamento. As células da invenção podem ser usadas a qualquer ponto entre a passagem zero e a senescência. As células são de preferência passadas entre cerca de 3 e cerca de 20 vezes, entre cerca de 5 e cerca de 10 vezes, entre cerca de 15 e 20 vezes, entre cerca de 5 e cerca de 7 vezes e com mais preferência entre cerca de 3 e cerca de 7 vezes.

[00076] Em uma modalidade da invenção, duas ou mais superfícies do arcabouço biológico descelularizado são semeadas com células. Em uma modalidade, as células endoteliais vasculares são semeadas em uma superfície do arcabouço e a outra superfície é, então, semeada com células derivadas de rim de mamífero. O arcabouço semeado é, então, cultivado para permitir a diferenciação das células derivadas de rins em células de túbulo proximal em funcionamento e a formação de uma monocamada endotelial vascular na superfície oposta.

[00077] Em uma modalidade, as células endoteliais vasculares humanas usadas para a repopulação do arcabouço podem ser selecionadas a partir de linhagens celulares endoteliais, células progenitoras endoteliais de medula óssea ou sangue total ou células endoteliais primárias ou células endoteliais microvasculares. As células endoteliais vasculares usadas são isoladas com o uso de métodos convencionais. Em uma modalidade preferencial, as células usadas para a repopulação do arcabouço são células endoteliais microvasculares primárias. Em uma modalidade, as células endoteliais vasculares usadas podem ser isoladas de qualquer fonte de mamífero. Em uma modalidade preferencial, as células endoteliais vasculares isoladas são de origem humana. Em uma modalidade preferencial alternativa, as células endoteliais vasculares são células endoteliais microvasculares primárias isoladas de um rim de mamífero (humano).

[00078] Uma outra modalidade da invenção é um aparelho para a produção dos dispositivos de túbulo proximal.

[00079] Em uma modalidade, a semeadura dos arcabouços descelularizados é realizada através do uso de um aparelho especificamente projetado ("coroa") no qual uma parte do arcabouço descelularizado é inserida para que suas bordas sejam colocadas entre duas partes de metal ou plástico, vedando efetivamente as bordas para criar uma cavidade superior e uma cavidade inferior separadas pelo arcabouço. A coroa também introduz algum estiramento e alguma tensão no arcabouço descelularizado. As células são, então, semeadas na cavidade superior e permite-se o assentamento sobre o arcabouço descelularizado. A coroa pode também ser dobrada para permitir a semeadura do outro lado do arcabouço ou a coroa pode ser desmontada, o arcabouço virado e remontado na coroa para semeadura da superfície oposta. As células renais podem ser semeadas sobre os arcabouços a uma densidade na faixa de cerca de 500 células/cm2 a cerca de 350.000 células/cm2, alternativamente de cerca de 1.000 células/cm2 a cerca de 100.000 células/cm2, alternativamente de cerca de 750 células/cm2 a cerca de 75.000 células/cm2, alternativamente de cerca de 10.000 células/cm2 a cerca de 300.000 células/cm2, alternativamente de cerca de 7.500 células/cm2 a cerca de 200.000 células/cm2 e de preferência de cerca de 5.000 células/cm2 a cerca de 70.000 células/cm2.

[00080] O arcabouço semeado com célula com o aparelho é, então, cultivado com o uso de técnicas convencionais para permitir a diferenciação das células renais e a formação de uma monocamada epitelial contínua. O tempo de cultura pode ser de 1 a 6 semanas de cultura, de preferência, 2 a 4 semanas de cultura, com máxima preferência 3 a 4 semanas. O dispositivo de túbulo proximal maduro resultante pode, então, ser usado para estudos de transporte renal, teste de nefrotoxicidade ou teste de agentes terapêuticos com o uso de métodos convencionais.

[00081] Em uma outra modalidade, a cultura de células no arcabouço semeado, bem como o sistema de teste in vitro, é alcançada através da colocação dos arcabouços em um biorreator projetado padrão de modo que o arcabouço crie uma barreira entre dois compartimentos. A câmara de biorreator está conectada a um sistema de fluxo de fluido projetado para permitir o fluxo de fluido por todas as superfícies do arcabouço. Através da alteração das características de sistema de fluxo, como taxas de fluxo, as condições mecânicas de fluido específicas de célula podem ser estabelecidas para cada lado do arcabouço, dependendo do tipo de célula semeada, por exemplo, para sustentar a funcionalidade de células endoteliais no lado basolateral. Os arcabouços podem ser pré-semeados com células antes da colocação no biorreator ou colocados no biorreator seguido da semeadura de células dentro do biorreator. Em um outro aspecto, o biorreator é projetado de tal maneira que a tensão aplicada ao construto descelularizado colocado dentro do biorreator possa ser alterada conforme necessário para facilitar a semeadura e/ou a diferenciação de células.

[00082] Em uma modalidade, o arcabouço descelularizado é semeado com células com o uso do aparelho descrito para semeadura de células renais e, opcionalmente, células endoteliais. Os arcabouços semeados com célula são, então, removidos do aparelho e transferidos para a câmara de biorreator para cultura ou avaliações, conforme descrito abaixo nos exemplos. Os arcabouços semeados com célula podem ser primeiro cultivados dentro do aparelho durante um período de aproximadamente 0 a 4 semanas antes da transferência para a câmara de biorreator. As células renais podem ser semeadas sobre os arcabouços a uma densidade na faixa de cerca de 500 células/cm2 a cerca de 350.000 células/cm2, de preferência cerca de 5.000 células/cm2 a cerca de 70.000 células/cm2. As condições de cultura, incluindo a duração de incubação no aparelho, podem variar dependendo da fonte da célula e do meio de cultura.

[00083] Em uma outra modalidade, os arcabouços descelularizados são primeiro colocados dentro de uma câmara de biorreator e, então, os arcabouços são semeados através da perfusão de uma suspensão de células na câmara de biorreator e da incubação durante um período de tempo para permitir a fixação celular ao arcabouço descelularizado. Tal biorreator compreende um elemento de corpo superior e um elemento de corpo inferior que têm uma área projetada para crescimento de arcabouço.

[00084] Um biorreator exemplificador adequado para uso na presente invenção é mostrado na Figura 15. Em referência à Figura 15, os componentes do biorreator 100 são os elementos do corpo principal, o elemento de corpo superior 110 e o elemento de corpo inferior 120, duas presilhas, presilha frontal 130 e presilha posterior 160, abas de fechamento externo, aba de fechamento externo inferior 140 e aba de fechamento externo superior 150 e os conectores 170. O elemento de corpo superior do reator principal 110 e o elemento de corpo inferior 120 do biorreator 100 são mantidos juntos pela presilha frontal 130 e pela presilha posterior 160. A aba de fechamento externo superior 150 está no topo do elemento de corpo superior 110. A aba de fechamento externo inferior 140 está abaixo do elemento de corpo inferior 120. A Figura 16 é uma vista do elemento de corpo inferior 120 do biorreator que mostra o sulco 180 cuja profundidade pode ser alterada junto com um quadro no elemento de corpo superior para ajustar a tensão no arcabouço descelularizado. O elemento de corpo inferior 120 também contém a área para crescimento celular 190.

[00085] Em uma modalidade, o arcabouço não semeado pode ser posicionado entre o elemento de corpo superior 110 e o elemento de corpo inferior 120 do biorreator 100 (consulte a Figura 15). Uma construção de quadro circular, que é moída formando o elemento de corpo superior 110 com uma estrutura de sulco correspondente no elemento de corpo inferior 120, permite a fixação do arcabouço comparável com as coroas celulares. A tensão pode ser ajustada através do uso de combinações de quadro/sulco especificamente projetadas, que diferem em profundidade do sulco e da largura de ponte do quadro. A distância na qual o quadro pode ser movido no sulco 180 (consulte a Figura 16) determina a tensão do arcabouço, com uma distância mais longa levando a uma tensão mais alta. Os fatores como diâmetro de arcabouço e espessura de arcabouço precisam ser considerados Após o posicionamento do arcabouço, a presilha frontal 130 e a presilha posterior 160 do biorreator mantêm o elemento de corpo superior 110 e o elemento de corpo inferior 120 juntos e o construir pode ser manipulado como uma coroa celular. A aba de fechamento externo inferior 140 e a aba de fechamento externo superior permitem o fechamento do sistema e uma suspensão de células pode ser introduzida em um lado do arcabouço através dos conectores 170 do biorreator. As células crescem na área de crescimento celular 190. Após um período de tempo específico de célula, no qual as células semeadas podem aderir, o biorreator fechado pode ser dobrado e um segundo tipo de célula ou o mesmo tipo de célula pode ser semeado no outro lado do arcabouço. Em uma modalidade, as suspensões de célula usadas para a semeadura podem estar na faixa de cerca de 103 células/ml a cerca de 107 células/ml. A fim de evitar uma perda de viabilidade das células semeadas no primeiro lado, o compartimento do primeiro lado pode ser preenchido com meios. Se condições estáticas forem necessárias, o compartimento pode ser preenchido com meios de cultura celular. Alternativamente, a perfusão de meios sob várias condições de fluxo pode ser iniciada com o uso dos conectores 170.

[00086] Após a adesão das células ao arcabouço, as células podem ser cultivadas estaticamente através da simples inundação dos compartimentos de câmara com os meios e do fechamento dos conectores do biorreator. Alternativamente, os tubos de um sistema de fluxo são conectados ao biorreator e a perfusão pode ser iniciada. As células semeadas sobre os arcabouços descelularizados dentro das câmaras de biorreator são, então, cultivadas para permitir o crescimento e a diferenciação das células em uma monocamada funcional de células tubulares renais. A cultura das células pode incluir cultura estática ou com mais preferência cultura sob condições dinâmicas como fluxo linear ou fluxo pulsátil. As taxas de fluxo, pressão e condições pulsáteis podem todas ser variadas para facilitar o crescimento e a diferenciação das células em células renais funcionais. A taxa de fluxo média dos meios dentro do biorreator pode estar na faixa de 1 a 25 ml/min, alternativamente de cerca de 1 a cerca de 10 ml/min, alternativamente de cerca de 2,5 a cerca de 10 m/min, alternativamente de cerca de 5 a 20 ml/min. Em uma modalidade preferencial, a taxa de fluxo média pode estar na faixa de cerca de 2,5 a 15 ml/min. O período de cultura pode estar na faixa de cerca de 1 a cerca de 4 semanas, alternativamente de cerca de 1 a cerca de 2 semanas, alternativamente de cerca de 1 a cerca de 3 semanas, alternativamente de cerca de 2 a cerca de 4 semanas. Em uma modalidade preferencial, o período de cultura pode estar na faixa de preferência de cerca de 2 a 3 semanas. Durante esse tempo, a integridade de camada de célula pode ser monitorada com o uso de técnicas bem conhecidas na técnica. Em uma modalidade, a integridade de camada celular pode ser monitorada ao medir a resistência transepitelial elétrica com o uso de eletrodos integrados em cada compartimento do biorreator ao medir o vazamento através da monocamada de várias molécula etiquetadas de modo fluorescente, como, por exemplo, inulina ou creatinina. Em outra modalidade, meios de cultura celular diferentes são usados em cada câmara. Em ainda outra modalidade, taxas de fluxo, pressão e condições pulsáteis diferentes podem ser usadas em cada câmara para permitir a cultura específica de célula através de tensão de cisalhamento de índices de fluxo. Uma descrição do biorreator também pode ser encontrada no pedido de patente n° DE 102008056037.5-41 e no documento EP 2.184.344, cujas descrições estão aqui incorporadas a título de referência em suas totalidades.

[00087] Outra modalidade da invenção é um método para diferenciar as células diferenciáveis em células renais (como, por exemplo, aquelas derivadas de rins mamíferos (humanos)) em uma monocamada estável de células de túbulo proximal renais ao diferenciar as células sob tensão. Esse método pode compreender, ainda, o uso dos arcabouços da invenção para produzir dispositivos de túbulo proximal da invenção.

[00088] Os dispositivos de túbulo proximal da invenção podem ser usados como sistemas de teste in vitro para triagem de toxicidade renal ou para a triagem de agentes terapêuticos. Em outra modalidade, os dispositivos podem ser usados para monitorar função celular de túbulo, como transporte, durante ou após a exposição a um composto ou partícula. Formulações de meios diferentes podem ser usadas par ao fluxo sobre cada superfície, permitindo que se estude o transporte através das camadas de célula e arcabouço de um compartimento de meio para o outro. Um exemplo de tais formulações de mídia seria fluir um meio celular endotelial no compartimento que tinha mvECs cultivados sobre o mesmo e fluir uma formulação de meios que imita o filtrato glomerular no compartimento oposto que contém a monocamada tubular renal.

[00089] As funções de transporte da monocamada tubular renal podem, então, ser avaliadas com o uso de técnicas padrão e moléculas etiquetadas conhecidas por aqueles versados na técnica. A triagem de toxicidade pode ser alcançada ao adicionar compostos ou partículas de interesse ou à trajetória de fluxo do compartimento vascular que fornece nutrientes a e entra em contato com as células endoteliais ou ao introduzir compostos ou partículas à trajetória de fluxo de compartimento de túbulo que fornece nutrientes a e entra em contato com as células tubulares renais, imitando a aparência de compostos xenobióticos tóxicos no sangue e urina, respectivamente. O transporte de compostos ou partículas pode ser monitorado ao testar o meio de uma ou ambas as trajetórias de fluxo. Ademais, a toxicidade pode ser monitorada ao testar a viabilidade de célula, morfologia ou efeito sobre funções de transporte após a exposição a compostos de interesse. Ensaios usados para a avaliação de toxicidade ou efeitos terapêuticos de compostos ou partículas não se limitam àqueles descritos acima.

[00090] Alvos terapêuticos podem ser testados ao, primeiramente, lesionar as células derivadas de rins do dispositivo bioartificial, então, tratar as células com a partícula terapêutica de teste. A lesão pode ser introduzida por meios físico ou químico, como, por exemplo, expor as células a compostos tóxicos ou partículas, como, por exemplo, cisplatina ou estreptozotocina. Compostos de teste terapêutico ou partículas podem ser colocados em contato com as células por adição na trajetória de fluxo de compartimento vascular do dispositivo, por exemplo, em uma concentração que imitaria as concentrações às quais as células seriam expostas após a aplicação intravenosa (IV) do agente terapêutico. O monitoramento de função celular tubular renal pode, então, ser usado para determinar o grau de efetividade dos compostos terapêuticos de teste aplicados.

[00091] O monitoramento da função tubular inclui, mas sem limitação, detectar ou avaliar a absorção de um composto ou partícula por células tubulares renais, o transporte de um composto ou partícula absorvida pelas células a partir de um compartimento de meios dos dispositivos de túbulo proximal para o outro, o efeito de inibidores na absorção ou transporte e mudanças na expressão de gene ou proteína de célula de túbulo renal, morfologia, expressão de marcador de superfície, atividade enzimática ou sobrevivência. Ensaios usados para a avaliação de toxicidade ou efeitos terapêuticos de compostos ou partículas não se limitam àqueles descritos acima.

[00092] Outra modalidade da invenção são kits que compreendem dispositivos de túbulo proximal bioartificiais da invenção. Em uma modalidade, o kit compreende o dispositivo de túbulo bioartificial e um inserto de produto.

[00093] Uma modalidade alternativa da invenção é uma composição que compreende os dispositivos de túbulo proximal bioartificiais da invenção. Em uma modalidade, a composição compreende um dispositivo de túbulo proximal bioartificial da invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00094] Sem descrição adicional, acredita-se que um indivíduo com habilidade comum na técnica pode, com o uso da descrição precedente e os exemplos ilustrativos a seguir, fazer e utilizar a presente invenção e praticar os métodos reivindicados. Os exemplos de trabalho a seguir apontam especificamente, portanto, as modalidades preferenciais da presente invenção e não devem ser interpretados como limitadores de nenhuma forma do restante da descrição. Adicionalmente, conforme usado nos exemplos a seguir e em outras partes do relatório descritivo, as células derivadas de rins ("hKDC") úteis nos dispositivos e métodos da invenção podem ser isoladas e caracterizadas de acordo com a descrição da publicação de patente U.S. n° 2008/0112939, que está incorporada a título de referência em sua totalidade, já que se refere à descrição, isolamento e caracterização de hKDC.

Exemplos Exemplo 1: Semeadura e a diferenciação de hKDC em arcabouços de matriz extracelular

[00095] Esse experimento testa a fixação, crescimento e diferenciação de células derivadas de rim humano ("hKDC") em várias configurações de arcabouços de matriz extracelular (ou seja, descelularizado), assim como a cultura tradicional em Tranwells revestidos de colágeno.

[00096] hKDC na passagem 4 foram semeados em três configurações de arcabouço diferentes e em Transwells (Corning, Corning NY). As células foram cultivadas por um período de tempo de três semanas com REGM™ renal epithelial growth medium (Lonza, Walkersville MD). Cada configuração de arcabouço foi testada com três configurações de célula diferentes: 2,5 x 103, 5 x 103 e 1x104 células. As configurações testadas foram: 1) cultura de sanduíche de colágeno; 2) cultura de sanduíche de colágeno-SIS; 3) cultura de monocamada de SIS; e 4) Transwells revestidos com colágeno.

Culturas de sanduíche de colágeno

[00097] hKDC foram cultivadas entre duas camadas de colágeno em placas de 24 cavidades. Os géis de fundo foram derramados ao, primeiramente, misturar uma solução de neutralização de gel fria com colágeno (tipo 1 isolada de tendões de cauda de rato, 6 mg/ml em 0,1 % de ácido acético) em uma razão de 1:2 e, então, adicionar 500 µl dessa solução por cavidade. A solução foi gelificada por incubação a 37 °C / 5% de CO2 por 15 minutos. Posteriormente, as células foram semeadas em 1 ml de meio por cavidade. Após 24 horas, os géis de cobertura foram derramados. O meio foi aspirado e 300 µl de solução de gel (preparada como acima) foram pipetados em cada cavidade. A solução foi gelificada por incubação por 15 minutos a 37 °C / 5% de CO2. Finalmente, 1 ml de meio foi adicionado por cavidade.

Culturas de monocamada de submucosa de intestino delgado (SIS)

[00098] Arcabouços foram preparados ao descelularizar segmentos da submucosa de intestino delgado (SIS) com o uso de métodos convencionais. Brevemente, a mucosa de segmentos de intestino delgado porcino foi removida mecanicamente. Posteriormente, a descelularização foi realizada ao incubar os segmentos intestinais em 3,4% de desoxicolato de sódio por 1 hora a 4 graus Celsius com agitação. Os segmentos descelularizados foram, então, enxaguados extensivamente com PBS e esterilizados por irradiação gama. Placas de 12 cavidades foram usadas para as culturas de monocamada de SIS. A SIS descelularizada foi espalhada sobre estruturas metálicas redondas e coberta com 1 ml de meio por cavidade no dia anterior à semeadura das células. A superfície de SIS espalhada é aproximadamente equivalente à superfície de uma cavidade em uma placa de 24 cavidades. Para semear as células sobre a SIS, o meio de cultura celular foi removido e a quantidade adequada de células foi semeada em 1 ml de meio por cavidade.

Culturas de sanduíche de SIS

[00099] Arcabouços de SIS foram preparados e semeados com hKDCs, conforme descrito acima. Após permitir que as células se fixem por 24 horas, um gel de cobertura foi derramado sobre as células como nas culturas de sanduíche de colágeno (consulte acima).

Culturas de Transwell

[000100] Transwells foram transferidos para placas de 12 cavidades e revestidos, cada um com 200 µl de colágeno tipo 1 (100 µg/ml em 0,1% de ácido acético). A solução de revestimento foi incubada por 20 minutos à temperatura ambiente e, então, aspirada. A quantidade adequada de células foi semeada em 1,5 ml de meio por cavidade.

[000101] Múltiplas amostras foram cultivadas por três semanas em cada uma das condições acima. As amostras foram removidas para análise histológica após uma, duas e três semanas. Ademais, amostras de meios foram analisadas com um analisador clínico RANDOX RX DAYTONA™ para seguir os parâmetros metabólicos: concentração de glicose, lactato e lactato desidrogenase. As amostras obtidas para análise histológica foram fixadas com fixador de Bouin por 1 hora. Então foram lavadas em água por pelo menos 4 horas e embebidas em parafina. Subsequentemente, fatias de 3 µm de espessura foram preparadas. As fatias foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E) para avaliar morfologia celular. Ademais, imuno-histoquímica (IHC) foi realizada para caracterizar a diferenciação das células com o uso dos anticorpos a seguir: Anti-hPAX2, Anti-hAQP1, Anti-Ki67, Anti hE-caderina e Anti-hN-caderina (consulte a Tabela 1 abaixo). Para a imuno-histoquímica, 3 µm de seções transversais foram desparafinizadas. A remoção alvo foi obtida ou por tratamento enzimático com proteinase K ou por aquecimento em tampão de citrato com pH 6 (Dako, #S2369) ou tampão Tris/EDTA com pH 9 (Dako, #S2367). Uma etapa de bloqueio com 3% de hidrogênio peroxidase foi incluída para bloquear peroxidases endógenas. Anticorpos primários foram, então, incubados por 1 hora seguidos por sua detecção com o Sistema de Detecção de Peroxidase/DAB de coelho/camundongo (Dako, #K5007)ENVISION™. As fatias foram contra-coradas com hematoxilina.

[000102] Os resultados da análise de parâmetros metabólicos indicaram que hKDCs cultivaram bem e proliferaram sob todas as condições de cultura testadas (consulte as Figuras 1 a 6). A coloração histológica com H&E mostrou que em ambas as condições de cultura de sanduíche de colágeno e de sanduíche de SIS-colágeno as células cresceram em camadas quase contínuas duplas ou múltiplas, que progrediram para estruturas tridimensionais similares a tubos ou cistos. Ao contrário, as células cultivadas em SIS formaram uma monocamada confluente que exibiu uma morfologia altamente prismática que é indicativa de uma diferenciação epitelial (consulte as Figuras 7 e 8). Essa morfologia foi observada após três semanas de cultura, independentemente da concentração de semeadura de célula inicial usada. hKDC cultivada em Transwells com membranas revestidas por PET mostram uma morfologia plana, formação de múltiplas camadas e aglomerados que foram observados para o descolamento da superfície, que leva a uma camada celular nãocontínua. Essas propriedades observadas da hKDC em membranas PET revestidas por colágeno tornam as mesmas inadequadas para ensaios de transporte. A formação de múltiplas camadas similares também foi observada com membranas de Transwell de poliéster e policarbonato, indicando que esse efeito é uma propriedade de membranas sintéticas, em geral, não as membranas específicas usadas no experimento. Essas propriedades não foram observadas para a cultura de SIS, o que implica que esse arcabouço promove o funcionamento de mecanismos reguladores naturais de inibição de contato e a formação de uma monocamada intacta.

[000103] Os resultados de imuno-histoquímica com o uso de anticorpos Ki67 indicaram que as hKDCs estão proliferando em cada uma das configurações de arcabouço testadas. A expressão do fator de transcrição de rins Pax-2 também foi positiva através do período de cultura. Caderinas como constituintes de desmossomas e junções de aderenos são envolvidas em contatos de célula-célula e sua expressão é um marcador de diferenciação celular. São essenciais para a polarização de células e, portanto, para sua funcionalidade. Nos rins, N-caderina é expressa por células de túbulo proximal, enquanto E-caderina é prevalente em células de túbulo distal. Os resultados de IHC mostram imunocoloração forte para N-caderina pelas hKDCs em configurações de arcabouço total. Em contraste, a imunomarcação para E-caderina estava amplamente ausente, embora houvesse algumas áreas de marcação extremamente fraco observadas.

[000104] Aquaporinas catalisam o transporte de água através da membrana celular e são, portanto, muito importantes para a funcionalidade dos rins. Aquaporina 1 é expressa por células de rins proximais, enquanto Aquaporina 2 é predominante em células de túbulo distais. A expressão de aquaporina 1 poderia ser detectada após 2 e 3 semana de cultura, enquanto a expressão de aquaporina 2 não foi observada. Em áreas, a marcação de aquaporina-1 foi observado como o único lado do ápice das células cúbicas (consulte a Figura 9) novamente, indicando uma diferenciação principalmente proximal das células. IHC do cotransportador 1 de glicose de sódio (SGLT-1), que é um transportador expresso por células de túbulo distais, também foi testado, mas nenhuma expressão de marcador poderia ser observada em qualquer uma das amostras.

[000105] Esse exemplo demonstra que hKDCs são capazes de diferenciar em células de túbulo proximais, e que essa diferenciação é dependente da composição do substrato sobre o qual as células são cultivadas. Uma matriz extracelular natural plana (isto é, descelularizada) teve um desempenho superior a arcabouços de colágeno, SIS/colágeno, assim como uma cultura de Transwell padrão em relação à diferenciação e morfologia epitelial de hKDC. Células de túbulo proximais não transformadas (como células primárias) continuarão, tipicamente, a crescer uma vez que a confluência é alcançada, resultando na formação de agregados tridimensionais em superfícies planas sintéticas, como Transwells. A semeadura em um arcabouço descelularizado natural, como SIS, permite que as células diferenciem e formem monocamadas epiteliais que são mais estáveis que aquelas produzidas através de métodos tradicionais.

Exemplo 2: Otimização da concentração de semeadura de célula de hKDC em arcabouços descelularizados

[000106] O Exemplo 1 demonstrou que células semeadas sobre arcabouços descelularizados bidimensionais sem colágeno formaram uma monocamada epitelial confluente que expressa marcadores de túbulo proximais após três semanas de cultura. Os experimentos a seguir foram conduzidos para otimizar a densidade de semeadura de célula e tentar reduzir o período de cultura necessário para a formação da monocamada.

[000107] Os arcabouços foram preparados ao descelularizar segmentos de submucosa de intestino delgado (SIS), conforme descrito no Exemplo 1. hKDC na passagem 4 foram semeadas nos aracabouços de SIS em três concentrações diferentes (1 x 104, 5 x 104 e 1 x 105 células/cavidade) e cultivadas por três semanas com meio de crescimento epitelial renal REGM™ (Lonza, Walkersville). As amostras foram removidas para a análise histológica após duas e três semanas e foram fixadas com o fixador de Bouin por 1 hora. Depois disso, foram lavadas em água por pelo menos 4 horas e embebidas em parafina. Subsequentemente, fatias de 3 µm de espessura foram preparadas. As fatias foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E) para avaliar morfologia celular. Ademais, a imuno-histoquímica (IHC) foi realizada, como no Exemplo 1, para caracterizar a diferenciação das células. Primeiro, seções transversais de 3 µm foram desparafinizadas. A remoção de alvo foi alcançada por tratamento enzimático com proteinase K, ao aquecer em tampão de citrato de pH 6 (Dako, #S2369) ou ao aquecer em tampão de Tris/EDTA de pH 9 (Dako, #S2367). Uma etapa de bloqueio com 3 % de hidrogênio peroxidase foi incluída para bloquear peroxidases endógenas. Anticorpos primários foram, então, incubados por 1 hora seguidos por sua detecção com o Sistema de Detecção de Peroxidase/DAB de coelho/camundongo (Dako, #K5007) ENVISION™. As fatias foram contra-coradas com hematoxilina.

[000108] A marcação para lectina foi realizado para avaliar adicionalmente a diferenciação celular. Conforme descrito acima, 3 µm de seções transversais foram desparafinizados e bloqueados com hidrogênio peroxidase. Lectinas biotiniladas, ou a lectina Lotus tetragonobolus (Biozol, #B-1325) ou a aglutinina Dolichos biflorus (Biozol, #B1035), foram, então, incubadas por 1 hora, seguidas por conjugadas com estreptavidina (Biogenex, #LP000-ULE) e detecção por adição de cromogênio de amino etila carbazol (AEC) (Biogenex, #HK129-5KE). As fatias foram contra-coradas com hematoxilina.

[000109] Os resultados da coloração H&E indicaram que, após duas semanas de cultura, nenhuma das densidades de semeadura examinadas havia alcançado 100% de confluência. Entretanto, após três semanas de cultura, as células semeadas em toda as densidades haviam formado uma monocamada praticamente confluente e tinha áreas que desenvolveram uma morfologia epitelial cúbica típica com núcleos localizados no terço interior da célula. As células semeadas na densidade mais alta também eram quase confluentes, mas a morfologia das células era menos uniforme e não epitelial em aparência (consulte a Figura 10).

[000110] Resultados de imuno-histoquímica são resumidos na Tabela 2 abaixo. A IHC das amostras de três semanas de densidade de semeadura inferior detectou a expressão de marcadores de túbulos proximais AQP-1 (40 a 50 %) e N-caderina (~90 %), enquanto os marcadores distais não foram expressos (AQP-2 e SGLT-1) ou foram expressos apenas de modo fraco (E-caderina). Ademais, a expressão de PAX-2 foi detectada através da amostra e claudina-2 um marcador de junção justa foi detectada em diversas regiões das amostras. Ki67, um marcador de proliferação, foi apenas detectados em áreas em que a monocamada não estava completamente confluente. É de importância que a marcação basolateral de colágeno IV, uma proteína da membrana basal, foi observado em muitas áreas das amostras. A expressão de colágeno IV indicou que as células estavam remodelando o arcabouço e depositando uma nova membrana basal.

[000111] A marcação das amostras de três semanas de densidade de semeadura inferior com as lectinas biotiniladas lectina de Lotus tetragonobulus (LTL), um marcador de células de túbulo proximal, e aglutinina de Dolichos biflorus (DBA), um marcador de célula de túbulo distal, também indicaram que a porção principal das células diferenciaram em células de túbulo proximais. A expressão de LTL foi observada em muitas áreas das amostras, enquanto a expressão de DBA era feita em períodos irregulares e fraca (consulte a Figura 10).

[000112] Esse exemplo demonstra que o grau de diferenciação das células é independente da densidade de semeadura. Entretanto, inesperadamente, em contraste com o que seria presumido normalmente, uma densidade de semeadura inferior resultou em um grau maior de diferenciação.

[000113] A amostra semeada a 1 x 104 células/cavidade também foi analisada para a expressão de colágeno tipo IV por imunohistoquímica, conforme descrito acima, com o uso de anticorpo de colágeno IV anti-humano (Dako, #M0785). Os resultados, mostrados na Figura 11, demonstram a marcação positiva para colágeno IV na superfície basolateral das células, indicando que as células estavam secretando ativamente componentes de matriz extracelular no arcabouço natural descelularizado; demonstrando que monocamadas intactas podem ser desenvolvidas em arcabouços naturais descelularizados, que são mais fisiologicamente relevantes que arcabouços sintéticos, como Transwells. Adicionalmente, sugere que a densidade de semeadura de célula tem um efeito direto na diferenciação celular e formação de monocamada.

Exemplo 3: Imuno-histoquímica de p-glicoproteína-1

[000114] Arcabouços foram preparados ao descelularizar segmentos de submucosa de intestino delgado (SIS), conforme descrito no Exemplo 1. hKDC na passagem 4 foram semeadas sobre os arcabouços de SIS a 5 x 104 células/arcabouço e cultivadas por três semanas com meio de crescimento epitelial renal REGM™ (Lonza, Walkersville). As amostras foram removidas para a análise histológica após três semanas e fixadas com fixador de Bouin por 1 hora. Posteriormente, foram lavadas em água por pelo menos 4 horas e embebidas em parafina. Subsequentemente, fatias de 3 µm de espessura foram preparadas. Imuno-histoquímica (IHC) foi realizada para confirmar a expressão de p-glicoproteína-1 (pgp-1, também conhecido como MDR1), que é um transportador de efluxo expresso por células de túbulo proximal. A remoção alvo de seções desparafinizadas foi alcançada por tratamento enzimático com proteinase K, ao aquecer no tampão de citrato de pH 6 (Dako, #S2369) ou ao aquecer em tampão de Tris/EDTA de pH 9 (Dako, #S2367). Uma etapa de bloqueio com 3% de hidrogênio peroxidase foi incluída para bloquear peroxidases endógenas. Pgp-1 anti-humano primário (Biogenex, #AM-391-5M) foi, então, incubado por 1 hora seguido por sua detecção com o Sistema de Detecção de Peroxidase/DAB de coelho/camundongo (Dako, #K5007) ENVISION™. As fatias foram contra-coradas com hematoxilina.

[000115] Os resultados mostraram a marcação positiva para pgp-1 na membrana apical da monocamada celular (consulte a Figura 13), confirmando a expressão de um marcador funcional de células de túbulo proximal, indicando, ainda, que o arcabouço e os métodos de semeadura descritos permitem a diferenciação de hKDCs em células de túbulo proximal em funcionamento.

Exemplo 4: Absorção de albumina por hKDCs semeadas em arcabouços descelularizados

[000116] Os arcabouços foram preparados por segmentos de descelularização de submucosa de intestino delgado (SIS), conforme descrito no Exemplo 1. hKDC na passagem 4 foram semeados sobre os arcabouços de SIS a 5 x 104 células/arcabouço e cultivados por três semanas com meio de crescimento epitelial renal REGM™ (Lonza, Walkersville). Para avaliar a absorção de albumina, as amostras semeadas com células foram primeiramente pré-incubadas em meio livre de soro (meio basal REBM, Lonza, Walkersville) por 1 hora. Os meios foram, então, trocados por meio basal REBM que contém 200 µg/ml de albumina de soro bovino marcado fluorescentemente (BSA-FITC) (Sigma, #A9771) e incubados por 30 a 60 minutos. As amostras foram, então, lavadas com PBS, contra-coradas com DAPI (diamidino2-fenil indol) e imageadas em um microscópio fluorescente.

[000117] Os resultados mostraram que as células são capazes de absorver BSA-FITC (consulte a Figura 14), uma função de células de túbulo proximal. Esses resultados demonstraram que hKDCs semeadas sobre arcabouços descelularizados não apenas expressam marcadores de diferenciação de túbulo proximal renal, mas também funcionam como células epiteliais de túbulo proximal.

[000118] Os Exemplos 5 a 9 que seguem são Exemplos profiláticos projetados para elucidas adicionalmente as propriedades para os arcabouços da invenção. Ensaios funcionais, como absorção de BSA-FITC, podem ser usados para avaliar lesões celulares ou nefrotoxicidade, assim como a efetividade de compostos terapêuticos na restauração de funções de transporte renal.

Exemplo 5: Transporte de ânion orgânico por hKDCs semeadas em arcabouços descelularizados

[000119] Esse exemplo testa a função de transportadores de ânion orgânicos, assim como pgp-1, um transportador de efluxo, ao avaliar o transporte de corantes fluorescentes, como rodamina, lúcifer amarelo ou carboxifluoresceína. O transporte para a célula é mediado por vários transportadores de ânion orgânico (OATs). Quando o transportador pgp-1 é inibido por verapamil, o corante aplicado, como rodamina, para de ser transportado para fora da célula, resultando em um aumento na fluorescência celular.

[000120] Os arcabouços serão preparados ao descelularizar segmentos de submucosa de intestino delgado (SIS), conforme descrito no Exemplo 1. hKDC na passagem 4 será semeado sobre os arcabouços de SIS a 5 x 104 células/arcabouço e cultivado por três semanas com meio de crescimento epitelial renal REGM™ (Lonza, Walkersville). O meio no compartimento de topo será, então, trocado por meio livre de vermelho de fenol que contém várias concentrações de rodamina, lúcifer amarelo ou corante de carboxiflouresceína. Algumas cavidades também serão pré-incubadas com várias concentrações de verapamila em ambos os compartimentos anteriormente à adição dos meios que contêm o corante fluorescente (com e sem verapamila adicional no meio) ao compartimento de topo. As cavidades serão, então, incubadas por 30 a 120 minutos. As amostras serão, então, lavadas com PBS, fixadas, contra-coradas com DAPI e imageadas em um microscópio fluorescente. Ademais, as amostras do meio serão tomadas para análise quantitativa da presença de corante fluorescente.

Exemplo 6: Semeadura e diferenciação de hKDCs (com ou sem células endoteliais microvasculares) em arcabouços descelularizados em um biorreator de fluxo.

[000121] O sistema de biorreator foi preparado conforme descrito acima. O arcabouço está posicionado entre o elemento de corpo superior 110 e elemento de corpo inferior 120 do biorreator 100 e fixado com uma tensão comparável às coroas de célula (consulte a Figura 15). A tensão no arcabouço posicionado no biorreator pode ser alterada e experimentos serão conduzidos para determinar as faixas de tensão mais apropriadas para a formação de um monocamada de células e diferenciação subsequente. Um lado do arcabouço será semeado com hKDCs seguido por um período de aderência apropriado (sem fluxo). O outro lado do arcabouço pode, então, ser semeado com células endoteliais. Como um controle, também haverá biorreatores com apenas um dos tipos celulares. As câmaras do biorreator serão, então, perfusadas após um período apropriado de adesão celular. A taxa de fluxo será ajustada para condições renais para promover a diferenciação e formação de monocamada epitelial. A formação e integridade de monocamada será monitorada por medição periódica de resistência elétrica transepitelial (TEER), assim como pela medição do vazamento de FITC-inulina fluorescente. Em casos em que ambos os tipos de células são usados, as condições de fluxo serão ajustadas àquelas apropriadas para a manutenção de ambas as monocamadas de célula epitelial e endotelial. Além de TEER e monitoramento de inulina, as amostras serão fixadas após 1, 2 e 3 semanas. A morfologia epitelial e a formação de monocamada serão avaliadas por coloração com hematoxilina e eosina.

Exemplo 7: Transporte funcional de glicose e a reabsorção de outros solutos por hKDCs (com ou sem células endoteliais microvasculares) semeados em arcabouços de SIS e cultivados em um biorreator de fluxo

[000122] Esse exemplo demonstra a diferenciação funcional de hKDCs nas células epiteliais de túbulo proximal quando semeadas em arcabouços de SIS em um biorreator de fluxo ao analisar o transporte ativo de glicose e outros solutos a partir de um compartimento para meios através da membrana semeada com célula para outro compartimento de meios.

[000123] Arcabouços de SIS serão preparados conforme descrito no Exemplo 1. Células endoteliais microvasculares (mvEC), isoladas seguindo métodos convencionais, serão semeadas sobre um lado do arcabouço. hKDCs serão subsequentemente semeadas sobre o outro lado dos arcabouços. Os arcabouços serão, então, colocados em câmaras de biorreator, que permitem que os meios fluam através de cada lado dos arcabouços, e cultivados para permitir a formação de monocamada, como no Exemplo 6. A formação de monocamada será monitorada por medição de TEER e vazamento de FITC-inulina, como no Exemplo 6. Nesse ponto, cada compartimento de meios é encerrado em um pequeno laço, que é separado apenas pelas monocamadas de célula intactas no arcabouço de SIS. Para medições de glicose, os meios que contêm concentrações conhecidas de glicose serão usados nos diferentes compartimentos de meios com ou sem a adição de um inibidor de transporte de glicose, como, por exemplo, floridzina. Será permitido que os meios fluam através das monocamadas de célula madura por um período de aproximadamente 48 horas, sendo que amostras de meios são periodicamente removidas para medições de concentração de glicose através de um ensaio colorimétrico. Múltiplos experimentos serão conduzidos com concentrações de glicose diferentes nos dois compartimentos para examinar a mudança em concentrações de glicose com o tempo. Os resultados dessas medições serão usadas pra calcular a quantidade relativa de transporte de glicose em função do consumo pelas células em relação ao tempo. Experimentos similares podem ser conduzidos com outros solutos que são ou transportados ou absorvidos e degradados pelas células, como, por exemplo, albumina.

Exemplo 8: Ativação de vitamina D

[000124] A ativação de vitamina D é uma função específica de células de túbulo proximais dos rins. Consequentemente, esses exemplo testa a ativação de vitamina D ao testar a atividade de enzima 25-(OH)D3-12-hidrolase que converte o precursor de 25-OH-D3 inativo em sua forma ativa 1,25-(OH)2D3.

[000125] Para testar a ativação de vitamina D, hKDC será semeada em SIS, que será preparada conforme descrita no Exemplo 1. hKDC na passagem 4 será semeada sobre arcabouços de SIS a 5x104 células/arcabouço e cultivadas por três semanas com meio de crescimento epitelial renal REGM™ (Lonza, Walkersville).

[000126] O meio será trocado para um meio que contém o precursor inativo 25-OH-D3. Após um tempo de incubação de aproximadamente 15 minutos a 2 horas, o meio será coletado e analisado para a quantidade de ambos o precursor e a forma ativa 1,25-(OH)2D3 por análise por HPLC ou ELSIA. O tempo de incubação pode ser variado dependendo do meio de incubação e temperatura de incubação. A conversão pode ser adicionalmente induzida pela adição de hormônio da paratiroide ou inibida pela adição de fosfato.

Exemplo 9: Sistema de túbulo proximal renal de hKDC/SIS para teste de nefrotoxicidade e aplicações de descoberta de fármaco

[000127] Nesse exemplo, os efeitos de substâncias nefrotóxicas específicas (por exemplo, cisplatina, vinblastina) ou reagentes renoprotetores serão aplicados no sistema de modelo de túbulo proximal renal hKDC/SIS. Para isso, hKDCs serão semeadas sobre SIS, sob condições de fluxo estáticas e/ou fluxo e permite-se que crescem e diferenciam em uma monocamada de epitélio de túbulo proximal. Então, várias substâncias serão aplicadas ao sistema de hKDC/SIS e viabilidade celular, morfologia e funcionalidade de túbulo proximal serão avaliadas. Parâmetros funcionais renais incluem, por exemplo, transporte de soluto, TEER, vazamento de inulina, absorção de albumina, síntese de vitamina D, produção de eritropoietina e prostaglandina. Ademais, o sistema de túbulo proximal de hKDC terá sua habilidade de detectar os efeitos de vários reagentes renoprotetores e outros reatentes citoprotetores testada.

Exemplo 10: Isolamento de células derivadas de rim humano

[000128] Rim humano normais foram obtidos junto ao Intercâmbio de Pesquisa de Doenças Nacional (National Disease Research Interchange - NDRI, Philadelphia, PA). Cada rim foi lavado em meio Eagles modificado de Dulbecco (DMEM com baixo teor de glicose, Invitrogen, Carlsbad, CA) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS, Invitrogen) para remover sangue e resíduos. O tecido foi dissecado da região de córtex externa, região medular interna e região subcapsular dos rins. Os tecidos foram, então, mecanicamente dissociados em placas para cultura de tecidos, até que estivessem fragmentados em uma polpa fina. O tecido foi, então, transferido para um tubo cônico de 50 mililitros. O tecido foi, então, digerido ou em misturas de enzima de boa prática de fabricação (GMP) que contém 0,25 unidades de atividade de PZ/mililitro de colagenase (NB6, N0002779, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemanha), 2,5 unidades/mililitro de dispase (Dispase II 165 859, Roche Diagnositics Corporation, Indianapolis, IN), 1 unidade/mililitro de hialuronidase (Vitrase, ISTA Pharmaceuticals, Irvine, Ca) ou misturas de enzima de grau não GMP que contêm 500 unidades/mililitro de colagenase (Sigma, St Louis, MO), 50 unidades/mililitro de dispase (Invitrogen) e 5 unidades/mililitro de hialuronidase (Sigma). Células derivadas de rins também foram isoladas com 50 unidades/mililitro de dispase. A mistura de enzima foi combinada ou com meio de crescimento epitelial renal (REGM) (Cambrex, Walkersville, MD) ou meio de crescimento de células-tronco mesenquimais (MSCGM) (Cambrex). Os tubos cônicos que contêm o tecido, meio e enzimas de digestão foram incubados a 37°C em um agitador orbital a 225 rpm por 1 hora.

[000129] A digestão foi centrifugada a 150 x g por 5 minutos e o sobrenadante foi aspirado. O pélete de célula resultante foi ressuspenso em 20 mililitros de REGM ou MSCGM. A suspensão de célula foi filtrada através de um filtro de células de náilon de 40 mícrons BD FALCON (BD Biosciences, San Jose, CA). O filtrato foi ressuspenso no meio (volume total de 50 mililitros) e centrifugado a 150 x g por 5 minutos. O sobrenadante foi aspirado e o pélete de célula foi ressuspenso em 50 mililitros de meio de cultura fresco. Esse processo foi repetido mais duas vezes.

[000130] Após a centrifugação final, o supernatante foi aspirado e o pélete de célula foi ressuspenso em 5 mililitros de meio de cultura fresco. O número de células viáveis foi determinado com o uso de um instrumento Guava (Guava Technologies, Hayward, CA). As células foram, então, plaqueadas a uma densidade de semeadura de 5.000 células/cm2 sobre frascos de cultura de tecido revestido com 2% de gelatina ou laminina e cultivadas ou em uma atmosfera com baixo teor de oxigênio (hipóxia) ou uma atmosfera normal (normoxia). A Tabela 1 mostra as informações de doador e condições de crescimento usadas para isolar populações de células derivadas de rins. Para obter clones derivados de célula única de células de rins, técnicas de limitação de diluição foram realizadas. No total, as células foram isoladas com o uso de vinte e quatro condições diferentes, de quatro doadores cadavéricos diferentes de idades 39, 46, 21 e 10.

Exemplo 11: Morfologia de células derivadas de rim humano

[000131] Sete dias após o isolamento, populações celulares derivadas de rins foram avaliadas por microscopia de luz e as características morfológicas das células foram observadas. Consistentemente, todas as condições de isolamento originaram células com morfologia epitelial. (Consulte a Tabela 11-1).

[000132] Esses dados ilustram que células derivadas de rins podem ser isoladas de um doador de qualquer idade ou gênero, assim como isoladas com o uso de várias formulações de meio de crescimento ou condições de cultura. A facilidade e consist}ência do procedimento de isolamento mostra que células derivadas de rins são uma fonte valiosa de células para uso em terapias à base de célula.

Exemplo 12: Potencial de crescimento de células derivadas de rins

[000133] Células derivadas de rins podem ser propagadas extensivamente em cultura e são capazes de gerar números significativos de células em um tempo curto. Isso é um critério para o desenvolvimento de terapias celulares alogênicas.

[000134] Células derivadas de rins foram plaqueadas a 5.000 células/cm2 em frascos T75 em REGM ou MSCGM e cultivadas a 37 °C em 5% de dióxido de carbono. As células foram subcultivadas a cada 2 a 5 dias. Em cada passagem, as células foram contadas e a viabilidade foi medida com o uso de um instrumento Guava (Guava Technologies, Hayward, CA). As populações celulares foram continuamente subcultivadas por diversas semanas até que a senescência fosse alcançada. A senescência foi determinada quando células falharam em alcançar mais que uma duplicação de população durante o intervalo de tempo do estudo. Duplicações de população [ln(rendimento de célula final/número inicial de células plaqueadas)/ln2] foram, então, calculadas.

[000135] Para a análise de cariótipo, células derivadas de rins da passagem 4 e passagem 10, dos isolamentos 22 e 23, foram plaqueadas em frascos T25 e permitiu-se que se fixassem de um dia para o outro. Os frascos foram, então, preenchidos com REGM e a análise de carótipo foi realizada.

[000136] A Tabela 12-1 é um sumário dos dados de crescimento para isolamentos testados. Não houve efeito notável nas características de crescimento celular em relação à idade de doador, fonte de tecido ou enzimas usadas para isolar as células.

[000137] A análise de cariótipo foi realizada nos isolamentos 22 e 23 tanto na passagem 4 quanto na passagem 10. Ambas demonstraram um cariótipo normal na passagem 4 e na passagem 10.

[000138] Em média, duplicações de população (PD) na senescência foram de 28,5, enquanto a viabilidade média foi de 97,6%.

[000139] Resumindo, células derivadas de rins têm um potencial de crescimento robusto em cultura. Esses dados podem ser usados para estimar o número total de células geradas a partir de um rim humano inteiro. Se todo o tecido de rins for processado e as células resultantes forem cultivadas para 31 duplicações de população, um rim humano inteiro renderia um total estimado de 1,89 x1016 células. Portanto, considerando que uma dose terapêutica de células é 1 x 108 células por pessoa, células derivadas de rins, isoladas de um único rim, serão suficientes para tratar 189 milhões de pacientes. Por fim, essas células são uma fonte altamente expansível de células para uso em terapias de célula à base de alogene.

Exemplo 13: Fenótipo de marcador de superfície de hKDC

[000140] A análise citométrica de fluxo foi realizada em células derivadas de rim humano para determinar o fenótipo marcador de superfície. As células de 9 dos isolamentos no Exemplo 11 foram expandidas para a passagem 4 e passagem 10 em REGM em frascos T75 a 37°C e 5% de dióxido de carbono. Células aderentes foram lavadas em PBS e descoladas com TrypLE Select (Gibco, Grand Island, NY). As células foram colhidas, centrifugadas e ressuspensas em 3% (v/v) de FBS em PBS a uma concentração de 2 x 105 células/mililitro. O anticorpo específico foi adicionado a 100 microlitros de suspensão celular e a mistura foi incubada no escuro por 30 a 45 minutos a 4°C. Após a incubação, as células foram lavadas com STF e centrifugadas para remover o excesso de anticorpo. As células foram ressuspensas em 500 microlitros de PBS e analisadas por citometria de fluxo. A análise por citometria de fluxo foi realizada com um instrumento Guava (Guava Technologies, Hayward, CA). Os anticorpos usados para caracterizar o fenótipo de marcador de superfície são mostrados na Tabela 13-1.
Tabela 13-1: Anticorpos usados na caracterização de célula do fenótipo de marcador de superfície de células derivadas dos rins.

[000141] A Tabela 13-2 mostra um sumário de todos os dados de fenótipo de marcador de superfície. Todos os isolamentos testados mostraram marcação positiva para CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD166, SSEA-4 e HLA I e marcação negativa para CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141, E-caderina e HLA II. Além disso, todos os isolamentos analisados foram expandidos para múltiplas gerações (passagem 10) e ainda retiveram o fenótipo de marcador de superfície.

[000142] Essas células expressam HLA I, mas não expressam HLA II, CD80 ou CD86. Essas características refletem a habilidade da célula de evadir um sistema imunológico do hospedeiro. Esses dados demonstram que células derivadas de rins são não imunogênicas e podem ser administradas a um paciente sem a necessidade de tipagem de tecido ou imunossupressão.

[000143] Resumindo, esses dados demonstram que células derivadas de rins de múltiplos doadores podem ser isoladas sob várias condições (consulte a Tabela 11-1) e ainda manterem seu fenótipo de marcador de superfície. Ademais, expressam marcadores de progenitor putativo, como CD24 e SSEA-4, ainda que não expressem marcadores maduros, de linhagem comprometida, como E-caderina. Finalmente, células derivadas de rins são não imunogênicas e, portanto, são uma fonte atraente de células para uso em terapias de célula alogênicas.
Tabela 13-2: Resumo da análise de marcador de superfície. Não determinado (ND). Marcação positiva (+). Marcação negativa (-).

Exemplo 14: Expressão de gene de célula derivada de rins

[000144] RNA foi extraído de células dos isolamentos 1, 2 e 17-23 com o uso de um kit de extração de RNA (RNeasy Mini Kit; Qiagen, Valencia, CA). RNA foi eluído com 50 microlitros de água tratada com DEPC e armazenado a –80°C. RNA foi revertido transcrito com o uso de hexâmeros aleatórios com os reagentes de transcrição reversa TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA) a 25°C por 10 minutos, 37°C por 60 minutos e 95°C por 10 minutos. As amostras foram armazenadas a -20°C. Com o uso dos iniciadores descritos na Tabela 14-1, genes selecionados foram investigados por PCR convencional (reação em cadeia de polimerase). PCR foi realizada em amostras de cDNA com o uso de conjuntos de inciadores PCR RT2 (SuperArray Biosciences Corp, Frederick MD).

[000145] Iniciadores foram misturados com 1 microlitro de cDNA e 2X ReactionReady™ SYBR Green PCR Master Mix (SuperArray Biosciences), de acordo com as instruções do fabricante e PCR foi realizada com o uso de um sistema ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Condições de ciclo térmicas eram inicialmente 50°C por 2 minutos e 95°C por 10 minutos seguidos por 34 ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto. Para GAPDH, PCR foi realizada com o uso de iniciadores GAPDH da Applied Biosystems (n° de catálogo: 402869) 1 microlitro de solução de cDNA e tampão de reação PCR de mistura universal 1× AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA), de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de primer na reação de PCR final foi de 0,5 micromolar para ambos o iniciador direto e reverso e a sonda TaqMan não foi adicionada. As amostras foram testadas em gel de agarose a 2% (p/v) e coradas com brometo de etídio (Sigma, St. Louis, MO, EUA). Imagens foram capturadas com o uso de um filme 667 Universal Twinpack (VWR International, South Plainfield, NJ) e uma câmera Polaroid™ de distância focal (VWR International, South Plainfield, NJ). Para cada gene analisado, o produto de PCR final foi excisado do gel e a sequência alvo foi confirmada por sequenciamento de DNA.

Análise de RT-PCR

[000146] Todos os isolados de célula analisados mostraram um perfil de expressão genética constante e estável. A análise de RT-PCR foi realizada nos isolamentos 1, 2 e 17-23 para detectar a expressão do marcador genético de desenvolvimento precoce (Oct-4, Rex-1, Sox2, FGF4, hTert), marcadores genéticos de desenvolvimento de rins (Pax-2, WT-1, Eya-1, Wnt-4, BMP-7, caderina-11, FoxD1), marcadores genéticos mesenquimais metanéfricos (Pax-2, Eya-1, WT-1, Six2 e FoxD1) e genes que promovem a sobrevivência de mesênquima metanéfrico (BMP-7). Ademais, a expressão de outros genes de desenvolvimento, como genes endodérmicos (HNF3B, CXC-R4, Sox-17, GATA-4), assim como marcadores de gene que promovem o reparo renal ou têm valor terapêutico no tratamento de doença dos rins (Epo, EpoR, BMP-7, BMP-2, GDF5), foi analisada.

[000147] Conforme mostrado na Tabela 14-2, todos os isolamentos mostraram a expressão positiva para Oct-4 e Rex-1 e expressão negativa para Sox2, FGF4, hTERT e Wnt-4. Os isolamentos 17-23 mostraram a expressão positiva para Pax-2, WT1, caderina-11 e FoxD1. Os isolamentos 22 e 23 mostraram a expressão positiva para Eya-1, Sox-17 e CXCR-4 e a expressão negativa para GATA-4. Os isolamentos 17-23 expressaram EpoR, mas não expressaram Epo. Os isolamentos 17-22 expressaram BMP-2, BMP-7 e GDF5. Ademais, todos os isolamentos podem ser expandidos em múltiplas gerações (passagem 10) e ainda assim reter seu fenótipo de expressão genética.

[000148] Tabela 14-2: Resumo de análise de expressão de gene. Expressão positiva (+). Expressão negativa (-). Não determinado (ND). Genes que funcionam durante o desenvolvimento precoce (Desenvolvimento precoce). Genes que funcionam durante o desenvolvimento dos rins (Desenvolvimento dos rins). Marcadores mesênquimas metanéfricos (Met). Marcadores de linhagem endodérmica (Endoderma). Genes envolvidos na sobrevivência dos rins (renoprotetores). Genes envolvidos na sobrevivência mesênquima metanéfrica (Survival).

[000149] Resumindo, células derivadas de rins expressam genes envolvidos no desenvolvimento precoce e desenvolvimento dos rins.
As mesmas expressam marcadores para mesênquima metanéfrico e marcadores para células progenitoras renais. As mesmas expressam marcadores endodérmicos assim como fatores envolvidos no reparo renal e tubulogênese.

[000150] No total, esses dados demonstram que células derivadas de rins são uma fonte de células progenitoras renais putativas que podem ser usadas para terapias à base de célula para proteger ou reparar tecido dos rins lesionados.

Exemplo 15: Análise de secreção de fator trófico

[000151] Constatou-se que células derivadas de rins produzem consistentemente fatores tróficos que protegem e reparam os rins. Portanto, essas células podem servir como um agente terapêutico para tratar doença dos rins.

[000152] Células da passagem 3, dos isolamentos 17 a 21, foram semeadas a 5.000 células/cm2 em um frasco T75/isolamento, sendo que cada um contém 15 milímetros de REGM. As células foram cultivadas a 37°C em 5% de dióxido de carbono. Após a cultura de um dia para o outro, o meio foi modificado para um meio sem soro (DMEM-baixo teor de glicose (Gibco), 0,1% (peso por volume) de albumina de soro bovino (Sigma), penicilina (50 unidades/mililitro) e estreptomicina (50 microgramas/mililitro) (Gibco)) e adicionalmente cultivado por 8 horas. Meio condicionado, sem soro, foi coletado no final da incubação por centrifugação a 14.000 x g por 5 minutos e armazenado a –20°C.

[000153] As células foram lavadas com PBS, descoladas com o uso de 4 mililitros de TrypLE Select (Gibco) e contadas com um instrumento Guava (Guava Technologies, Hayward, CA) para estimar o número de células em cada frasco. Com uso de Searchlight Proteome Arrays (Pierce Biotechnology Inc), as amostras foram, então, testadas por ELISA para os seguintes fatores tróficos: inibidor de tecido de metaloproteinase-1 (TIMP-1), inibidor de tecido de metaloproteinase-2 (TIMP-2), fator de crescimento epitelial derivado de plaqueta bb (PDGF-bb), fator de crescimento de queratinócito (KGF), fator de crescimento de hepatócito (HGF), fator de crescimento de fibroblasto básico (FGF2), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento epidérmico de ligação a heparina (HB-EGF), proteína-1 quimiotática de monócito (MCP-1), interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8), fator de crescimento de transformação alfa (TGFα), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator derivado de estroma 1b (SDF1b), fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator de crescimento de nervo básico (b-NGF), neurotrofina-3 (NT-3), oncogene-alfa relacionado a crescimento (GRO-α), interleucina-1b (IL-1b), interleucina-12p40 (IL-12p40), interleucina-12p70 (IL-12p70), interleucina-11 (IL-11), interleucina-15 (IL-15), matriz metaloproteinase-2 (MMP-2), matriz metaloproteinase-9 (MMP-9), angiopoietina-2 (ANG-2) e hormônio do crescimento do ser humano (HGH).

Análise de produção de fator trófico

[000154] A secreção de vinte e sete fatores de crescimento e citoquinas foi analisada nos isolamentos 17 a 21. Os resultados são resumidos na Tabela 15-1. Todos os isolamentos secretaram TIMP-1, TIMP-2, VEGF e MMP-2 em mais que 300 picogramas/mililitro/1x106 células/8 horas. Os mesmos secretaram 50 a 300 picogramas/mililitro/1x106 células/8 horas de FGF2 e HGF e 1 a 50 picogramas/mililitro/1x106 células/8 horas de KGF, PDGF-bb, b-NGF, IL-12p40 e IL-11. SDF-1, ANG-2, HGH e Il-12p70 não foram detectados.

[000155] Resumindo, esses dados mostram que células derivadas de rins secretam diversos fatores tróficos para proteger e reparar tecido de rins lesionado. Por exemplo, FGF2, HGF e TGFα foram envolvidos no reparo renal. Células derivadas de rins secretam esses fatores em níveis consistentes e elevados. Portanto, essas células são uma fonte valiosa de células para uso em terapias que alvejam doenças dos rins.

[000156] Tabela 15-1: Análise de ensaio ELISA multiplexado SearchLight da produção de fator trófico de células derivadas de rins. O isolamento "Meios apenas" é uma amostra de controle em meios sem soro apenas sem condicionamento. As unidades em dados mostrados são picogramas/mililitro/1x106 células/8 horas. Os resultados mostrados são a média de medidas duplicadas

Exemplo 16: Tubulogênese de célula derivada de rins in Vitro

[000157] Células derivadas de rins podem ser descongeladas na passagem 4 e passagem 10 e, então, trituradas em uma suspensão de célula única a 4 x 104 células/mililitro em uma solução de colágeno tipo I que contém 66% de vitrogene 100 (3 miligramas/millilitro (Cohesion Technologies, Palo Alto, CA). As células na suspensão podem ser plaqueadas sobre uma membrana de omento descelularizada. A mistura de colágeno/célula pode, então, ser incubada por 30 minutos a 37°C, 5% de CO2, 95% de ar para permitir que o colágeno gelifique e, então, o meio de cultura é adicionado. As células são alimentadas a cada 3 dias por 7 dias. No dia 7, as culturas são tratadas com concentrações variadas de fator de crescimento de hepatócito e adicionalmente cultivadas até que a tubulogênese seja observada.

[000158] Essas observações demonstram que células derivadas de rins podem se auto-organizar em estruturas de túbulo in vitro. Essas estruturas têm um valor como blocos de construção para aplicações de reconstrução de rins, assim como para desenvolver ensaios de triagem de medicamentos e toxicologia.

Exemplo 17: Tubulogênese de célula derivada de rins in vivo

[000159] Três filmes 35/65 PCL/PGA (10 cm de diâmetro x 2 mm de espessura) foram semeados com células derivadas de rim humano (10.000 células/cm2) e cultivadas em REGM (Cambrex) a 37°C e 5% de dióxido de carbono por 8 dias. O arcabouço de espuma 35/65 PCL/PGA foi preparado de acordo com os métodos descritos na patente US n° 6.355.699, aqui incorporada a título de referência em sua totalidade. Os construtos de célula/filme foram, então, removidos do prato de fundição de filme, empilhados em três camadas e aplicados a um suporte de arcabouço de espuma 35/65 PCL/PGA. Esse construto foi, então, cultivado por mais 24 horas, então, cortado em partes quadradas de 3 x 3 mm anteriormente à implantação. Os implantes foram, então, lavados com PBS e transferidos para uma placa de 6 cavidades preenchida com PBS para transporte.

[000160] Os implantes foram implantados subcutaneamente bilateralmente na região torácica-lombar lateral dorsal de camundongos SCID. Camundongos SCID macho (cepa Fox Chase SCID CB17SC) foram obtidos junto à Taconic Inc., (Hudson, NY) e tinham 5 semanas de idade. Dois implantes foram colocados em cada camundongo SCID. Duas incisões de pele, cada uma com aproximadamente 5 mm de comprimento, foram feitas no dorso dos camundongos. As incisões foram colocadas transversalmente sobre a área lombar cerca de 5 mm cranial em relação ao crista ilíaca palpada, com um em cada lado da linha média. A pele foi, então, separada do tecido conectivo subjacente para formar um pequeno bolso e o implante foi colocado cerca de 10 mm cranial em relação à incisão. As incisões na pele foram fechadas com grampos de ferimento de metal Reflex 7. Após 3 semanas, os implantes foram removidos do bolso subcutâneo, fixado em 10% de formalina, embebidos em cera de parafina, seccionados, corados com hematoxilina e eosina (H&E) e avaliados por um patologista com o uso de técnicas de microscopia de luz.

[000161] Células derivadas de rins formaram estruturas similares a túbulo nas camadas de filme de PCL/ PGA. Esses túbulos mostraram uma parede epitelial distinta e um lúmen límpido. Células derivadas de rins infiltraram o arcabouço de espuma, depositaram a matriz extracelular e formaram uma estrutura similar a tecido densa. Ademais, células derivadas de rins na espuma estimularam angiogênese e a formação de redes vasculares.

[000162] Resumindo, células específicas de rim humano formaram estruturas de túbulo após a exposição a um microambiente in vivo. A habilidade de células derivadas de rins de responderem a sinais microambientais e instruírem as células a formarem túbulos ilustra, ainda, a natureza progenitora renal dessas células. Ademais, as células migraram para os arcabouços de espuma, formando uma estrutura similar a tecido que promoveu a angiogênese. Esses dados ilustram a utilidade de células derivadas de rins como blocos de construção celular para reconstruir túbulos de rins e, finalmente, para uso em aplicações de engenharia de tecido de rins.

[000163] Embora a invenção tenha sido descrita e ilustrada no presente documento com referência a vários materiais, procedimentos e exemplos específicos, compreende-se que a invenção não é restrita às combinações particulares de material e procedimentos selecionados para esse fim. Diversas variações de tais detalhes podem ser implicadas, conforme será constatado por indivíduos versados na técnica. Pretende-se que o relatório descritivo e exemplos sejam considerados como exemplificadores, apenas, sendo que o verdadeiro escopo e essência da invenção são indicados pelas reivindicações a seguir. Todas as referências, patentes e pedidos de patentes referidos nesse pedido de patente estão aqui incorporados a título de referência em suas totalidades.

Claims (17)

1. Dispositivo de túbulo proximal bioartificial, caracterizado pelo fato de que compreende um arcabouço de matriz biológica descelularizado semeado com uma ou mais células derivadas de rim humano sob condições suficientes para permitir a diferenciação das células derivadas de rim humano em células epiteliais de túbulo proximal renal, em que as células diferenciadas formam uma monocamada epitelial no arcabouço, em que a matriz biológica extracelular é derivada de tecido mucoso de mamífero, tecido submucoso de mamífero ou canal alimentar de mamífero, em que as células são diferenciadas sem o uso de um inibidor de proteína quinase quinase ativadora de mitógeno (MEK), e/ou em que as células mantêm inibição por contato.
2. Dispositivo de túbulo proximal bioartificial, caracterizado pelo fato de que compreende um arcabouço biológico descelularizado que tem pelo menos duas superfícies em que pelo menos uma superfície é semeada com uma ou mais células derivadas de rim humano sob condições suficientes para permitir a diferenciação das células derivadas de rim humano em células epiteliais de túbulo proximal, em que as células formam uma monocamada epitelial na superfície do arcabouço, em que a matriz biológica extracelular é derivada de tecido mucoso de mamífero, tecido submucoso de mamífero ou canal alimentar de mamífero, em que as células são diferenciadas sem o uso de um inibidor de proteína quinase quinase ativadora de mitógeno (MEK), e/ou em que as células mantêm inibição por contato.
3. Dispositivo de túbulo proximal bioartificial, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o arcabouço de matriz biológica descelularizado é derivado de tecido mucoso de mamífero.
4. Dispositivo de túbulo proximal bioartificial, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o arcabouço de matriz biológica descelularizado é derivado de tecido submucoso de mamífero.
5. Dispositivo de túbulo proximal bioartificial, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o arcabouço de matriz biológica descelularizado é derivado de um canal alimentar de mamífero.
6. Dispositivo de túbulo proximal bioartificial, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o arcabouço de matriz biológica descelularizado é derivado do estômago, duodeno, jejuno, íleo ou cólon de um mamífero.
7. Dispositivo de túbulo proximal bioartificial, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as células derivadas de rim humano são capazes de autorrenovação e expansão em cultura e são positivas para a expressão de pelo menos um dentre Oct-4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 ou GDF5; e negativas para a expressão de pelo menos um dentre Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2, E-caderina ou GATA-4.
8. Dispositivo de túbulo proximal bioartificial, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as células derivadas de rim humano são positivas para pelo menos um dentre os marcadores de superfície celular HLA-I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166 ou SSEA-4; e negativas para pelo menos um dentre os marcadores de superfície celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138 e CD141.
9. Dispositivo de túbulo proximal bioartificial, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que as células derivadas de rim humano secretam pelo menos um dentre os fatores tróficos FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 ou VEGF; e não secretam pelo menos um dos fatores tróficos PDGF-bb ou IL12p70.
10. Dispositivo de túbulo proximal bioartificial, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as células derivadas de rim humano são capazes de autorrenovação e expansão em cultura e positivas para a expressão de HLA-I e pelo menos um dentre Oct-4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 ou GDF5; e negativas para a expressão de CD 133 e pelo menos um dentre Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2, E-caderina ou GATA-4.
11. Método in vitro para gerar um dispositivo de túbulo proximal bioartificial por diferenciação de uma ou mais células precursoras em células renais, caracterizado pelo fato de que compreende semear um arcabouço de matriz biológica descelularizado com uma ou mais células derivadas de rim humano e cultivar as células no arcabouço sob condições suficiente para permitir a diferenciação das células derivadas de rim humano em células epiteliais de túbulo proximal renal, em que a matriz biológica extracelular é derivada de tecido mucoso de mamífero, tecido submucoso de mamífero ou canal alimentar de mamífero, em que as células são diferenciadas sem o uso de um inibidor de proteína quinase quinase ativadora de mitógeno (MEK), e/ou em que as células mantêm inibição por contato.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o arcabouço de matriz biológica descelularizado é derivado do tecido mucoso de mamífero.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o arcabouço de matriz biológica descelularizado é derivado de tecido submucoso de mamífero.
14. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o arcabouço de matriz biológica descelularizado é derivado do estômago, duodeno, jejuno, íleo ou cólon de um mamífero.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que as células derivadas de rim humano são capazes de autorrenovação e expansão em cultura e são positivas para a expressão de pelo menos um dentre Oct-4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 ou GDF5; e negativas para a expressão de pelo menos um dentre Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2, E-caderina ou GATA-4.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que as células derivadas de rim humano são positivas para pelo menos um dentre os marcadores de superfície celular HLA-I, CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD 166 ou SSEA-4; e negativas para pelo menos um dentre os marcadores de superfície celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138 e CD141.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que as células derivadas de rim humano secretam pelo menos um dentre os fatores tróficos FGF2, HGF, TGFα, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 ou VEGF; e não secretam pelo menos um dos fatores tróficos PDGF-bb ou IL12p70.

Images