KR20140039257A - 릴랙신을 방출하는 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 링커가 릴랙신의 카르복시-말단을 단백질성 반감기 연장 모이어티와 연결하고 링커가 프로테아제 절단 부위를 포함하는, 릴랙신 융합 단백질을 제공한다. 따라서, 본 발명은 반감기가 연장됨으로써 융합 단백질이 독자적으로 생물학적 활성 릴랙신의 방출을 위한 저장소로서의 역할을 하는 릴랙신 융합 폴리펩티드를 제공한다. 추가로, 본 발명은 상기 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 이를 함유하는 벡터, 릴랙신 융합 폴리펩티드를 발현하는 세포, 제약 조성물, 및 이같은 융합 폴리펩티드의 의학 용도를 제공한다.

Description

릴랙신을 방출하는 융합 단백질 및 이의 용도 {FUSION PROTEINS RELEASING RELAXIN AND USES THEREOF}
본 발명은 링커가 릴랙신(Relaxin)의 카르복시-말단을 단백질성 반감기 연장 모이어티(moiety)와 연결하고 링커가 프로테아제(protease) 절단 부위를 포함하는, 릴랙신 융합 단백질을 제공한다. 따라서, 본 발명은 반감기가 연장됨으로써 융합 단백질이 독자적으로 생물학적 활성 릴랙신의 방출을 위한 저장소로서의 역할을 하는 릴랙신 융합 폴리펩티드를 제공한다. 추가로, 본 발명은 상기 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 이를 함유하는 벡터, 릴랙신 융합 폴리펩티드를 발현하는 세포, 제약 조성물, 및 이같은 융합 폴리펩티드의 의학 용도를 제공한다.
인슐린 슈퍼패밀리의 구성원으로서의 릴랙신 2 (H2 릴랙신, RLN2)는, 유전자 수준에서, N-말단에서 C-말단으로 배열된 전형적인 B - C - A 사슬 프로호르몬(prohormone) 구조를 나타내는 2-사슬 펩티드이다. 인간의 경우 7개의 유전자에 의해 코딩되는, 이러한 슈퍼패밀리의 다른 구성원들은 릴랙신 유전자 RLN1, RLN3, 및 인슐린-유사 펩티드 유전자 INSL3, INSL4, INSL5, 및 INSL6이다. 이러한 패밀리의 구성원들 간의 전체적인 서열 상동성은 낮다; 그럼에도 불구하고, 계통발생학적 분석은 이러한 유전자들이 RLN3 선조 유전자로부터 진화되었음을 가리킨다 (문헌 [Hsu, S. Y. (2003)]; [Wilkinson, T. N. et al. (2005)]). 성숙형 단백질은 분자량이 약 6000 Da이고, 프로호르몬-컨버타제(convertase) 1 (PC1) 및 2 (PC2)에 의해 촉매되는 프로호르몬의 효소성 절단의 생성물이다 (문헌 [Hudson P. et al. (1983)]). 생성된 A- 및 B-사슬은 2개의 분자간 시스테인 다리에 의해 연결된다; A-사슬은 추가적인 분자내 디술피드 결합을 나타낸다.
릴랙신은 다양한 세포 유형 상에서 다중 경로를 통해 다면발현성 효과를 개시시킨다. 이는 LGR7 (류신-풍부 G 단백질-커플링 수용체 7)로 칭해지는 부류 I (로돕신 유사) G-단백질-커플링 수용체 (RXFP1 (릴랙신 패밀리 펩티드 1 수용체)로 또한 명명됨)에 결합함으로써 이의 활성을 부여하고, 이때 LRG8/RXFP2 (릴랙신 패밀리 펩티드 2 수용체)에 대한 친화력은 유의하게 더 낮다 (문헌 [Kong RC et al. (2010)]). 릴랙신 분자 내에서, B-사슬 내의 한 아미노산 모티프 (Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X) (문헌 [Schwabe and Buellesbach (2007)], [Buellesbach and Schwabe (2000)])가 모든 릴랙신 펩티드에서 보존되고, 이러한 펩티드들과 상응하는 수용체의 상호작용에 결정적이다. 릴랙신이 LGR7/RXFP1에 결합하는 것은 아데닐레이트 사이클라제(cyclase)의 활성화 및 제2 메신저 분자인 cAMP의 증가를 유도한다. 이러한 메커니즘을 통해, 릴랙신 2는, 예를 들어 래트 심장에서 심방 나트륨뇨 배설 펩티드의 방출을 매개한다 (문헌 [Toth, M. et al. (1996)]). 래트 심방 근세포에 대한 릴랙신 2의 양성 수축촉진 효과가 또한 제시되었다 (문헌 [Piedras-Renteria, E. S. et al. (1997)]). 릴랙신/LGR7 복합체에 의해 활성화되는 기타 신호 전달 분자는 포스포이노시티드-3 키나제(kinase), 티로신 키나제, 및 포스포디에스테라제(phosphodiesterase)이다 (문헌 [Bartsch, O. et al. (2001)], [Bartsch, O. et al. (2004)]). 이러한 시스템에 의해 활성화되는 추가적인 신호 전달 경로에는 래트 및 기니-피그 심장에서 고리형 GMP 수준의 증가에 이르는 산화질소 (NO) 경로가 포함된다 (문헌 [Bani-Sacchi, T. et al. (1995)]).
릴랙신은 폐, 신장, 뇌 및 심장과 같은 기관에 대한 생물학적 활성을 보유하는 다면발현성 호르몬으로서 작용한다 (문헌 [Dschietzig T. et al. (2006)]). 릴랙신의 강한 항-섬유증 및 혈관확장제 활성이 다양한 동물 질환 모델, 뿐만 아니라 임상 연구에서 이러한 펩티드로 수득된 양성 효과의 가장 현저한 원인이 된다 (문헌 [McGuane J.T. et al. (2005)]). RLN2는 생리학적 조건 하에 심혈관계에서 여러 이로운 효과가 있다. 이는 다양한 병리생리학적 프로세스 동안 손상된 심근을 보호하고 조직 항상성을 유지시킨다. 이는 두드러진 혈관확장 효과를 나타내고, 예를 들어 설치류 관상 동맥 (문헌 [Nistri, S. et al. (2003)]) 및 기타 기관의 혈관상 내에서의 흐름 및 혈관확장에 영향을 미친다. 자발적으로 고혈압인 래트에서, RLN2이 혈압을 저하시켰고, 이는 증가된 NO 생산에 의해 매개되는 효과였다.
릴랙신 2의 심장보호 활성이 기니 피그, 래트 및 피그와 같은 여러 동물 모델에서 평가되었다 (문헌 [Perna A.M. et al. (2005)], [Bani, D. et al. (1998)]). RLN2는 심근 손상, 염증성 세포 침윤 및 이어지는 섬유증을 호전시키고, 이에 의해 중증 심실 기능장애를 완화시킨다 (문헌 [Zhang J. et al. (2005)]).
릴랙신 2는 강한 항-섬유증 활성을 나타낸다. 손상된 조직에서, 섬유모세포 활성화 및 증식은 증가된 콜라겐 생산 및 간질성 섬유증을 야기한다. 심장에서의 섬유증이 생물역학적 과부하에 의해 증가되고, 심실 기능장애, 리모델링 및 부정맥발생에 영향을 미친다. 동물 모델에서, 연속적인 릴랙신 2 주입은 심근병증, 고혈압, 이소프레날린-유도 심장 독성, 당뇨병성 심근병증 및 심근경색에 의해 야기되는 심장 기능장애를 억제하거나 또는 심지어 역전시킨다. 이러한 섬유발생 억제 또는 확립된 섬유증의 역전은 심실 경직을 감소시킬 수 있고, 심장확장 기능을 개선할 수 있다. 명백하게, 릴랙신 2가 비정상적인 콜라겐 축적을 감소시키지만, 이는 건강한 조직에서의 기저 콜라겐 함량에 영향을 미치지 않아서, 치료 용도에 대한 이의 안전성을 강조한다.
결과가 매우 전도유망한 급성 심부전 환자의 치료를 위한 다면발현성 혈관확장제로서 여러 임상 연구에서 릴랙신 2가 테스트되었다. 이러한 연구들에서, 릴랙신 2는 호흡곤란 및 기타 임상 결과의 유리한 경감과 연관되었다 (문헌 [Teerlink J.R. et al. (2009)], [Metra M. et al. (2010)])
릴랙신의 제한된 생체내 반감기로 인해, 환자 치료가 14일 내지 21일마다 반복되어야 하고, 이에 의해 화합물 투여가 적어도 48시간 동안 연속 주입으로서 수행되어야 한다.
추가로, 릴랙신 2는 췌장염, 류머티스성 관절염과 같은 염증-매개 질환, 및 암 (문헌 [Cosen-Binker L.I. et al. (2006)], [Santora K. Et al. (2007)]) 또는 경피증, 폐, 신장 및 간 섬유증 (문헌 [Bennett RG. (2009)])과 같은 질환의 치료에서 또한 유용할 수 있다. 릴랙신 2는 인간 MDA-MB-231 유방암 세포의 이종이식 종양 성장을 감소시킨다 (문헌 [Radestock Y, Hoang-Vu C, Hombach-Klonisch S. (2008)]).
화학적 방법에 의한 릴랙신 2의 합성이 어렵다. B-사슬의 낮은 용해도, 및 A-사슬과 B-사슬 사이에 시스테인 다리를 힘들게, 그리고 특이적으로 도입하는 것이 요구됨으로 인해, 이러한 방법에 의해 수득된 활성 펩티드의 수율이 매우 낮다 (문헌 [Barlos K.K. et al. (2010)]). 별법으로, 릴랙신 2의 재조합 발현이 수행될 수 있다. 번역후 변형 동안의 프리프로(prepro)-펩티드의 효율적인 절단 및 생물학적으로 활성인 성숙형 펩티드의 분비를 허용하기 위해, 관례적으로 발현 숙주 세포가 프로호르몬-컨버타제 1 및/또는 2를 코딩하는 발현 구축물으로 공동-형질감염된다 (문헌 [Park J.I. et al. (2008)]). 그럼에도 불구하고, 이종 세포에서의 프리프로-펩티드의 엔도-단백질분해성(endoproteolytic) 프로세싱 효율이 종종 생리활성(bioactive) 분자의 생산을 유의하게 제한한다 (문헌 [Shaw J.A. et al. (2002)]).
중요하게, 인간에서 정맥 내로 투여된 릴랙신 2의 반감기는 10분 미만이다 (문헌 [Dschietzig T. et al. (2009)]). 그 결과, 임상 시험에서, 릴랙신 2는 48시간에 걸쳐 연속적으로 투여되어야 한다. 따라서, 릴랙신의 생물학적 반감기의 개선 또는 더 길게 작용하는 릴랙신 융합 폴리펩티드가 매우 유리할 수 있다.
생물학적 반감기를 개선하는 것은 화학적 변형, 예컨대 관심 폴리펩티드의 PEG화 또는 HES화, 추가적인 비-천연 N-글리코실화 부위의 도입에 의해, 또는 이러한 폴리펩티드를 다른 분자, 예컨대 항체의 이뮤노글로불린 Fc 단편, 트랜스페린, 알부민, 생체 내에서 더 긴 반감기를 매개하는 다른 분자에 결합하는 결합 분자, 또는 기타 단백질과 유전적으로 융합시킴으로써 각각 수행될 수 있다. 그러나, IgG의 Fc 도메인을 릴랙신 2의 C-말단에 융합시키는 것은 릴랙신 활성과 관련하여 불활성 분자를 유도한다. 놀랍게도, Fc 도메인이 절단되는 경우에, 릴랙신 활성이 회복된다는 것이 발견되었다. 이는 융합 단백질의 불활성에도 불구하고, 릴랙신이 정확하게 폴딩(folding)되지만 Fc 도메인에 의해 활성이 차단되거나, 또는 Fc 도메인의 방출 후 릴랙신이 정확한 폴딩을 회복한다는 것을 암시한다. 항-보체 전구약물을 위한 Fc 융합 폴리펩티드가 문헌 [J Biol Chem. 2003 Sep 19;278(38):36068-76]에 개시되어 있다. 따라서, 본 발명은 릴랙신이 엔도-프로테아제(endo-protease) 절단 부위를 포함하는 링커 폴리펩티드를 통해 단백질성 반감기 연장 모이어티에 연결되어, 릴랙신에 비해 반감기가 개선된 폴리펩티드를 유도하고, 이로부터 활성 릴랙신이 엔도프로테아제의 작용에 의해 방출되는, 릴랙신이 단백질성 반감기 연장 모이어티, 예컨대 IgG의 Fc 도메인에 융합된 릴랙신 융합 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 활성 릴랙신 방출을 위한 전구약물로서의 반감기 연장된 릴랙신 융합 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시양태는 릴랙신, 엔도-프로테아제 절단 부위를 포함하는 링커 펩티드 및 단백질성 반감기 연장 모이어티를 포함하며, 이때 링커 펩티드가 릴랙신을 반감기 연장 모이어티와 연결하는 것인 융합 폴리펩티드이다.
한 실시양태에서, 상기 언급된 릴랙신은 릴랙신 2 또는 릴랙신 3이다. 인간 릴랙신, 예컨대 인간 릴랙신 2 또는 인간 릴랙신 3이 바람직하다.
한 실시양태에서, 상기 언급된 단백질성 반감기 연장 모이어티는 폴리펩티드, 예컨대 IgG의 Fc 도메인, 혈청 알부민, 트랜스페린, 또는 혈청 알부민 결합 단백질 또는 펩티드이다. 인간 또는 인간화 단백질성 반감기 연장 모이어티, 예컨대 인간 IgG의 Fc 도메인 또는 인간 혈청 알부민이 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 상기 언급된 링커는 엔도-프로테아제/엔도-펩티다제(endo-peptidase)에 대한 절단 부위를 포함하며, 이때 엔도-프로테아제/엔도-펩티다제는 세포외 엔도-프로테아제/엔도-펩티다제이다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 상기 언급된 링커는 엔도-프로테아제/엔도-펩티다제에 대한 절단 부위를 포함하며, 이때 엔도-프로테아제/엔도-펩티다제는 인간 엔도-프로테아제/엔도-펩티다제이다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 절단 부위는 혈액에서 활성인 엔도-프로테아제/엔도-펩티다제, 예컨대 혈액 응고 인자 Xa의 것이다. 추가적으로, 혈관 내강을 향하는 활성 부위가 있는 막 결합형 또는 막 신장형 엔도-프로테아제/엔도-펩티다제, 예컨대 MMP12의 절단 부위가 바람직하다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 절단 부위는 이의 활성이 릴랙신 작용이 요망되는 부위에서 강화되거나 특이적인 엔도-프로테아제/엔도-펩티다제의 것이고, 예를 들어 이러한 엔도-프로테아제/엔도-펩티다제는 원하는 릴랙신 활성의 부위, 예컨대 특정 기관 또는 조직에서 특이적으로 발현되고/되거나 활성화된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 절단 부위는 생리학적 프로세스 동안 특정 시점에, 예를 들어 질환 발달의 특정 시점에 발현되고/되거나 활성화되는 엔도-프로테아제/엔도-펩티다제의 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이같은 폴리뉴클레오티드는 융합 폴리펩티드의 분비를 허용하는 신호 펩티드에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이같은 융합 폴리펩티드에 대한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터가 또한 포함된다. 적절한 벡터는, 예를 들어 발현 벡터이다. 본 발명의 추가적인 실시양태는 상기 언급된 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포이다. 본 발명의 숙주 세포는 진핵생물 세포 또는 원핵생물 세포일 수 있다. 진핵생물 세포는 포유동물 세포 또는 효모 또는 곤충 세포일 수 있고, 바람직하게는 포유동물 세포이다. 원핵동물 세포는, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 세포일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 언급된 융합 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 조성물은 정맥내, 복막내, 국소, 흡입 또는 피하 투여용으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 의약으로서의 제약 조성물 또는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 추가적인 실시양태는 심혈관 질환, 췌장염, 염증, 암, 경피증, 폐, 신장 및 간 섬유증의 치료에 있어서 제약 조성물 또는 융합 폴리펩티드의 용도이다.
도 1 릴랙신 융합 폴리펩티드의 구성, 및 프로테아제 절단 부위 (PCS)를 포함하는 링커를 절단하는 엔도-펩티다제/엔도-프로테아제에 의한 혈류에서의 이의 후속 활성화의 개략도. A-사슬, B-사슬 및 C-사슬은 각각의 릴랙신 사슬을 나타낸다. PCS가 있는 링커는 PCS를 포함하는 링커이고, 흑색 선은 릴랙신 내의 분자간 및 분자내 디술피드 결합을 나타낸다. Fc 도메인은 IgG 분자의 Fc 도메인이다.
도 2 CHO-CRE-LGR7 세포주를 사용한 릴랙신-Fc 융합 구축물의 활성 결정. 대조군으로서, h릴랙신 2 (R&D 시스템즈(R&D Systems), 카탈로그 번호 6586-RN-025)가 사용되었다. 데이터는 릴랙신 변이체 및 h릴랙신 2에 의해 유도된 루시퍼라제(luciferase) 발현의 활성을 나타내는 상대 광 단위로서 표현된다. 기호들은 평균을 나타내고, 오차 막대는 S.E.M을 나타낸다.
도 3 a - d CHO-CRE-LGR7 세포주를 사용한 릴랙신-융합 구축물 1 - 4의 활성 결정. 대조군으로서, h릴랙신 2 (R&D 시스템즈, 카탈로그 번호 6586-RN-025)가 사용되었다. 데이터는 릴랙신 변이체 및 h릴랙신 2에 의해 유도된 루시퍼라제 발현의 활성을 나타내는 상대 광 단위로서 표현된다. 기호들은 평균을 나타내고, 오차 막대는 S.E.M을 나타낸다.
정의:
용어 "아미노산 잔기"는 알라닌 (Ala 또는 A), 시스테인 (Cys 또는 C), 아스파르트산 (Asp 또는 D), 글루탐산 (Glu 또는 E), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 글리신 (Gly 또는 G), 히스티딘 (His 또는 H), 이소류신 (Ile 또는 I), 리신 (Lys 또는 K), 류신 (Leu 또는 L), 메티오닌 (Met 또는 M), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 프롤린 (Pro 또는 P), 글루타민 (Gln 또는 Q), 아르기닌 (Arg 또는 R), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 발린 (Val 또는 V), 트립토판 (Trp 또는 W), 및 티로신 (Tyr 또는 Y) 잔기로 이루어진 군 내에 함유된 아미노산 잔기를 지시하도록 의도된다.
용어 "릴랙신의 활성" 또는 "릴랙신 활성"은 자신의 수용체에 결합하는 것 및 따라서 이어지는 제2 메신저인 고리형 AMP의 생성 및/또는 PI3-키나제의 자극을 통해 자극성 G-단백질 Gs를 활성화시키는 릴랙신 또는 이의 변이체의 능력에 의해 정의된다. 릴랙신 또는 이의 변이체는 LGR7에 결합하여, 자극성 G-단백질 Gs의 세포내 활성화에 이르고, 이어서 제2 메신저인 고리형 AMP (cAMP)의 생성을 초래한다. 그러나, cAMP 생성은 시간-의존적인 2상 반응이다. 초기의 짧은 Gs-아데닐레이트 사이클라제-매개 cAMP 반응 후에, 수용체 신호가 억제성 G 단백질 활성화로 전환되고, 이에 의해 PI3-키나제-매개 반응으로 전환된다. (문헌 [Halls M.L., Bathgate R.A., Summers, R.J. (2005)]).
용어 "반감기 연장 모이어티"는 릴랙신 융합 폴리펩티드에 직접적으로 또는 링커를 통해 공유결합으로 연결 ("접합")된 제약상 허용되는 모이어티, 도메인, 또는 "비히클(vehicle)"을 지칭한다. 반감기 연장 모이어티가 약동학 또는 약역학 거동에 양성적으로 영향을 미치는 메커니즘에는 (i) 릴랙신 융합 폴리펩티드의 생체내 단백질분해성 분해 또는 기타 활성-감소 화학적 변형을 방지하거나 완화시키는 것, (ii) 신장 여과를 감소키거나, 수용체-매개 소거를 감소시키거나 또는 생체이용률을 증가시킴으로써 반감기 또는 기타 약동학 성질을 개선하는 것, (iii) 독성을 감소시키는 것, (iv) 용해도를 개선시키는 것, (v) 릴랙신 융합 폴리펩티드의 생물학적 활성 및/또는 표적 선택성을 증가시키는 것이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 반감기 연장 모이어티는 접합되지 않은 형태의 릴랙신 융합 폴리펩티드에 비하여 릴랙신 융합 폴리펩티드의 제작성을 증가시키고/시키거나 면역원성을 감소시키는 면에서 양성 효과가 있을 수 있다. 용어 "반감기 연장 모이어티"에는 비-단백질성 반감기 연장 모이어티, 예컨대 PEG 또는 HES, 및 단백질성 반감기 연장 모이어티, 예컨대 혈청 알부민, 트랜스페린 또는 Fc 도메인이 포함된다.
"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 펩티드 결합을 통해 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 분자 사슬이 이에 포함된다. 이러한 용어는 특정 길이의 사슬을 지칭하지 않는다. 이러한 용어는 폴리펩티드의 번역후 변형, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 또한, 단백질 단편, 유사체, 돌연변이 또는 변이체 단백질, 융합 단백질 등이 폴리펩티드, 펩티드 또는 단백질의 정의에 포함된다. 이러한 용어는 합성되거나 또는 공지된 단백질 조작 기술을 사용하여 재조합적으로 발현될 수 있음에 따라 하나 이상의 아미노산 유사체 또는 비-정규 또는 비천연 아미노산이 포함된 분자를 포함한다. 또한, 본 발명의 융합 단백질은 본원에 기술된 바와 같이 주지된 유기 화학 기술에 의해 유도체화될 수 있다.
용어 "기능성 변이체"는 화학적 구조가 야생형 폴리펩티드와 상이하고 이의 천연 생물학적 활성 중 적어도 일부를 유지하는 변이체 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명에 따른 릴랙신 2 변이체의 경우에, 기능성 변이체는 이의 천연 활성 중 적어도 일부, 예컨대 릴랙신 수용체 LGR7의 활성화를 나타내는 변이체이다. 실험 방법에 개시된 방법에 의해 릴랙신 수용체 LGR7의 활성화를 결정할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 지칭할 때 "단편", "변이체", "유도체", 및 "유사체"라는 용어들은 상응하는 야생형 릴랙신 폴리펩티드의 수용체 활성화 성질 중 적어도 일부를 유지하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드의 단편에는 단백질분해성 단편, 뿐만 아니라 결실 단편이 포함되고, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 인해 아미노산 서열이 변경된 폴리펩티드가 또한 포함된다. 변이체는 천연적으로 발생할 수 있거나, 또는 비-천연적으로 발생할 수 있다. 비-천연 발생 변이체는 당업계에 공지된 돌연변이유발 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존성 또는 비-보존성 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 본원에서 "폴리펩티드 유사체"로 또한 지칭될 수 있다. 본원에서 사용되는 경우에, "폴리펩티드의 유도체"는 관능기의 반응에 의해 하나 이상의 잔기가 화학적으로 유도체화된 대상 폴리펩티드를 지칭한다. 20개의 표준 아미노산의 하나 이상의 천연 발생 아미노산 유도체를 함유하는 펩티드 또한 "유도체"로서 포함된다. , 예를 들어 프롤린이 4-히드록시프롤린으로 치환될 수 있고, 리신이 5-히드록시리신으로 치환될 수 있으며, 히스티딘이 3-메틸히스티딘으로 치환될 수 있고, 세린이 호모세린으로 치환될 수 있고, 리신이 오르니틴으로 치환될 수 있다.
용어 "융합 단백질" 또는 "융합 폴리펩티드"는 이러한 단백질이 1개를 초과하는 모 단백질 또는 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드 성분을 포함한다는 것 및/또는 융합 단백질이 야생형 배향으로 배열되지 않은 하나 이상의 모 단백질 또는 폴리펩티드로부터 유래된 단백질 도메인을 포함한다는 것을 가리킨다. 전형적으로, 융합 단백질은 하나의 단백질로부터의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 상이한 단백질로부터의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 인-프레임(in frame)으로 첨부되고, 임의로는 링커 또는 신장기(stretcher)에 의해 이로부터 분리되어 있는 융합 유전자로부터 발현된다. 그 후, 융합 유전자가 재조합 숙주 세포에 의해 단일 단백질로서 발현될 수 있다.
용어 "뉴클레오티드 서열" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 2개 이상의 뉴클레오티드 분자의 연속적인 신장물을 가리키도록 의도된다. 뉴클레오티드 서열은 게놈, cDNA, RNA, 반합성, 합성 기원, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
용어 "EC 50 " (최대 유효 농도의 절반)은 특정 실험 조건 하에 기준선과 최대값 사이의 중간까지 반응을 유도하는 치료 화합물의 유효 농도를 지칭한다.
소정의 물질과 함께 사용되는 경우에, 용어 "면역원성"은 면역계의 반응을 유도하는 이러한 물질의 능력을 가리키도록 의도된다. 면역 반응은 세포 또는 항체가 매개하는 반응일 수 있다 (예를 들어, 면역원성의 추가적인 정의에 대해서 문헌 [Roitt: Essential Immunology (8th Edition, Black-well)] 참조). 일반적으로, T-세포 증식과 같은 면역 반응의 촉발에서 수반되는 프로세스의 유도가 감소되는 것은 감소된 면역원성의 지표일 것이다. , 예를 들어 생체 내에서 또는 시험관 내에서, 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하여 감소된 면역원성을 결정할 수 있다.
용어 "중합효소 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 미국 특허 번호 US 4,683,195 및 US 4,683,195에 기술된 바와 같은, 시험관 내에서의 원하는 뉴클레오티드 서열의 증폭을 위한 방법을 일반적으로 지칭한다. 일반적으로, PCR 방법은 주형 핵산에 우선적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 프라이머 확장 합성의 반복 사이클을 수반한다.
용어 "벡터"는 뉴클레오티드 서열의 클로닝을 용이하게 하기 위해, 즉 사용가능한 양의 서열을 생산하기 위해, 서열이 코딩하는 유전자 생성물의 발현을 지시하기 위해, 그리고 뉴클레오티드 서열을 숙주 세포의 게놈 내로 통합시키기 위해, 숙주 세포 내에서 복제될 수 있거나 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있고, 따라서 혼화성 숙주 세포 (벡터-숙주 시스템)와 함께 여러 기능을 수행하는데 유용한 플라스미드 또는 기타 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 벡터는 자신이 수행할 기능에 따라 상이한 성분들을 함유할 것이다.
"세포", "숙주 세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 모든 이같은 용어는 세포의 성장 또는 배양으로부터 생성되는 자손을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "기능성 생체내 반감기"는 이의 일반적인 의미로 사용되고, 즉, 폴리펩티드의 생물학적 활성의 50％가 신체/표적 기관에서 여전히 존재하는 시간, 또는 폴리펩티드의 활성이 초기 값의 50％인 시간이다.
기능성 생체내 반감기를 결정하는 것에 대한 별법으로서, "혈청 반감기", 즉 폴리펩티드가 이의 생물학적 기능을 유지하는지 여부와 관계없이 소거되기 전에 폴리펩티드의 50％가 혈장 또는 혈류 내에서 순환하는 시간을 결정할 수 있다. 혈청 반감기의 결정은 기능성 생체내 반감기를 결정하는 것보다 종종 더 용이하고, 혈청 반감기의 규모는 일반적으로 기능성 생체내 반감기의 규모의 양호한 지표이다. 혈청 반감기에 대한 별법적인 용어에는 "혈장 반감기", "순환 반감기", "혈청 소거", "혈장 소거", "말기 반감기" 및 "소거 반감기"가 포함된다. 폴리펩티드는 망상내피계 (RES), 신장, 지라 또는 간 중 하나 이상의 작용에 의해, 조직 인자, SEC 수용체 또는 가타 수용체 매개 제거에 의해, 또는 특이적 또는 비-특이적 단백질분해에 의해 소거된다. 일반적으로, 소거는 크기 (사구체 여과에 대한 차단값에 관련됨), 전하, 부착된 탄수화물 사슬, 및 단백질에 대한 세포 수용체의 존재에 좌우된다. 유지되어야 하는 기능성은 일반적으로 수용체 결합 또는 수용체 활성화로서 결정된다. 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 기능성 생체내 반감기 및 혈청 반감기를 결정할 수 있고, 예를 들어 이는 포유동물에게 적절한 용량의 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 적절하게 투여하는 단계; 혈액 샘플 또는 기타 샘플을 상기 포유동물로부터 일정 간격으로 수집하는 단계; 상기 혈액 샘플 내의 관심 단백질 또는 폴리펩티드의 수준 또는 농도를 결정하는 단계; 및 이렇게 수득된 데이터 (데이터의 플롯)로부터 관심 단백질 또는 폴리펩티드의 수준 또는 농도가 적합한 기준 시점, 예를 들어 정맥내 적용 직후의 초기 농도와 비교하여 50％ 만큼 감소되었을 때까지의 시간을 계산하는 단계를 수반할 수 있다. , 예를 들어 문헌 [Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists] 및 [Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)]와 같은 표준 편람을 참조한다. 문헌 ["Pharmacokinetics", M Gibaldi and D Perron, Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)]을 또한 참조한다.
"글리코실화"는 당 모이어티가 특정 부위에서 폴리펩티드에 부가되는 화학적 변형이다. 폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결이다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티가 부착되는 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 Asn-X-Ser 및 Asn-X-Thr ("N-X-S/T") [식 중, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다]은 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 모이어티가 효소에 의해 부착되는 것에 대한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내의 이러한 트리펩티드 서열 (또는 모티프) 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 N-연결 글리코실화 부위를 생성시킨다. O-연결은 세린 및 트레오닌의 히드록실-기 산소에 탄수화물 모이어티가 부착되는 것을 지칭한다.
"단리"된 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드는 자신을 발현하는 세포의 성분 또는 자신이 분비되는 배지로부터 확인 및 단리된 것이다. 세포의 오염물 성분은 융합 폴리펩티드의 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질이 이에 포함될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 (1), 예를 들어 로우리(Lowry) 방법, UV-Vis 분광법 또는 SDS-모세관 겔 전기영동 (예를 들어 캘리퍼 랩칩(Caliper LabChip) GXII, GX 90 또는 바이오래드 바이오애널라이저(Biorad Bioanalyzer) 장치 상에서의 전기영동)에 의해 결정되는 경우에 융합 폴리펩티드가 95 중량％를 초과하도록, 더 바람직한 실시양태에서는 99 중량％ 초과로, (2) N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하는데 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하는 환원 또는 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의한 균질성으로 정제된다. 그러나, 통상적으로, 단리된 융합 폴리펩티드는 1회 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
개관
본 출원은 반감기가 연장된 릴랙신 융합 단백질을 제공한다. 본 출원은 생물학적 반감기가 유의하게 길어지고 생물학적 활성이 유의하게 감소된, 개선된 릴랙신 융합 단백질을 기술한다. 생체 내에서 활성이고 기능성 릴랙신을 릴랙신 융합 단백질로부터 방출시키는 프로테아제에 대한 절단 부위를 코딩하는 아미노산 신장물에 의해 릴랙신이 반감기 연장 모이어티에 연결된다는 사실로 인해, 이러한 릴랙신 융합 단백질은 약리학적 저장소 효과를 나타낸다.
본 발명의 한 실시양태는 릴랙신이 프로세싱된 A 및 B 사슬을 포함하는 릴랙신 이종이량체 또는 이의 기능성 변이체이고, PCS가 프로테아제 절단 부위 (PCS)를 포함하는 링커 폴리펩티드이며, HEM이 단백질성 반감기 연장 모이어티 (HEM)인, 릴랙신-PCS-HEM을 포함하는 융합 폴리펩티드이다.
본 발명의 추가적인 실시양태는 프로릴랙신(proRelaxin)이 C-사슬을 여전히 함유하는 프로세싱되지 않은 전구형태(proform)의 릴랙신 또는 이의 기능성 변이체이고, PCS가 프로테아제 절단 부위 (PCS)를 포함하는 링커 폴리펩티드이며, HEM이 단백질성 반감기 연장 모이어티 (HEM)인, 프로릴랙신-PCS-HEM을 포함하는 융합 단백질이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 릴랙신이 프로세싱된 A 및 B 사슬을 포함하는 릴랙신 이종이량체 또는 이의 기능성 변이체이고, PCS가 프로테아제 절단 부위 (PCS)를 포함하는 링커 폴리펩티드이며, HEM이 단백질성 반감기 연장 모이어티 (HEM)인, HEM-PCS-릴랙신을 포함하는 융합 단백질이다.
본 발명의 추가적인 실시양태는 프로릴랙신이 C-사슬을 여전히 함유하는 프로세싱되지 않은 전구형태의 릴랙신 또는 이의 기능성 변이체이고, PCS가 프로테아제 절단 부위 (PCS)를 포함하는 링커 폴리펩티드이며, HEM이 단백질성 반감기 연장 모이어티 (HEM)인, HEM-PCS-프로릴랙신을 포함하는 융합 단백질이다.
프로릴랙신은 프로호르몬 컨버타제에 의해 프로세싱되지 않고, 이의 천연 배향의 릴랙신 B 사슬, 릴랙신 C-사슬 및 릴랙신 A-사슬을 포함하는 전구형태의 릴랙신으로서 이해된다.
릴랙신-PCS-HEM 및 프로릴랙신-PCS-HEM이 바람직한 실시양태이다.
릴랙신 도메인:
추가적인 실시양태에서, 릴랙신은 릴랙신 2 A 사슬 폴리펩티드 또는 이의 기능성 변이체를 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 릴랙신은 릴랙신 2 B 사슬 폴리펩티드 또는 이의 기능성 변이체를 포함한다.
추가적인 실시양태에서, 릴랙신은 릴랙신 2 A 사슬 폴리펩티드 또는 이의 기능성 변이체 및 릴랙신 2 B 사슬 폴리펩티드 또는 이의 기능성 변이체를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 릴랙신 A 사슬 폴리펩티드는 인간 최소 릴랙신 2 A 사슬 폴리펩티드 (서열 7) 또는 이의 기능성 변이체를 포함하거나, 또는 인간 릴랙신 2 A 사슬 폴리펩티드 (서열 6) 또는 이의 기능성 변이체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 릴랙신 B 사슬 폴리펩티드는 인간 릴랙신 2 B 사슬 폴리펩티드 (서열 8) 또는 이의 기능성 변이체를 포함한다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 릴랙신 A 사슬은 인간 최소 릴랙신 2 A 사슬 폴리펩티드 (서열 7) 또는 이의 기능성 변이체를 포함하거나, 또는 인간 릴랙신 2 A 사슬 폴리펩티드 (서열 6) 또는 이의 기능성 변이체를 포함하고, 릴랙신 B 사슬 폴리펩티드는 인간 릴랙신 2 B 사슬 폴리펩티드 (서열 8) 또는 이의 기능성 변이체를 포함한다.
추가적인 실시양태에서, 릴랙신은 릴랙신 3 A 사슬 폴리펩티드 또는 이의 기능성 변이체 및/또는 릴랙신 3 B 사슬 폴리펩티드 또는 이의 기능성 변이체를 포함한다.
추가적인 실시양태에서, 릴랙신 A 사슬은 인간 릴랙신 3 A 사슬 폴리펩티드 (서열 9), 인간 최소 릴랙신 3 A 사슬 폴리펩티드 (서열 12), 또는 이의 기능성 변이체를 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 릴랙신 B 사슬 폴리펩티드는 인간 릴랙신 3 B 사슬 폴리펩티드 (서열 11) 또는 이의 기능성 변이체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 릴랙신은 인간 릴랙신 3 A 사슬 폴리펩티드 (서열 10) 또는 이의 기능성 변이체를 포함하고, 인간 릴랙신 3 B 사슬 폴리펩티드 (서열 11) 또는 이의 기능성 변이체를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 릴랙신 A 또는 B 사슬의 기능성 변이체에는 야생형 릴랙신 A 및 B 사슬 각각과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입이 있다. 보존된 모티프 Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X [식 중, X는 나선형 구조를 형성할 수 있는 아미노산을 나타낸다]를 추가로 포함하는 상기 언급된 릴랙신 2 B 변이체가 더 바람직하다.
릴랙신 A 및 B 사슬 변이체는 당업계에 공지되어 있다. 릴랙신의 잘 특성화된 결합 부위 기하학은 당업자에게 릴랙신 A 및 B 사슬 변이체를 디자인하는 지침을 제공하고, 예를 들어 릴랙신 B 사슬의 변형에 대해 문헌 [Buellesbach and Schwabe J Biol Chem. 2000 Nov 10; 275(45):35276-80]을, 릴랙신 A 사슬 및 "최소" 릴랙신 A 사슬의 변형에 대해 문헌 [Hossain et al. J Biol Chem. 2008 Jun 20; 283(25):17287-97]을 참조한다. , 예를 들어 보존된 릴랙신 2 B 모티프 (Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X)에 대해, X는 3개의 규정된 아미노산이 릴랙신 B 사슬의 표면 상에서 수용체 접촉 영역을 형성함에 따라 보존된 모티프 내의 적합한 아미노산 X를 선택하도록 나선형 구조 예를 형성할 수 있는 아미노산을 나타낸다 (문헌 [Buellesbach and Schwabe, (2000)]).
더욱 더 바람직한 실시양태에서, 릴랙신 A 사슬 폴리펩티드는 인간 릴랙신 2 A 사슬 폴리펩티드 (서열 6) 또는 이의 기능성 변이체이고, 릴랙신 B 사슬 폴리펩티드는 인간 릴랙신 2 B 사슬 폴리펩티드 (서열 8) 또는 이의 기능성 변이체이다. 더욱 더 바람직한 실시양태에서, 인간 릴랙신 2 A 사슬 폴리펩티드 (서열 6)의 기능성 변이체는 서열 16과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입이 있는 기능성 변이체이다. 기능성 변이체에 서열 8과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입이 있는 인간 릴랙신 2 B 사슬 폴리펩티드 (서열 8)의 기능성 변이체가 더 바람직하다. 보존된 모티프 Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X를 추가로 포함하는 상기 언급된 인간 릴랙신 2 B 변이체가 더욱 더 바람직하다.
더욱 더 바람직한 실시양태에서, 릴랙신 A 사슬 폴리펩티드는 인간 릴랙신 2 A 사슬 폴리펩티드 (서열 6) 또는 서열 6과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 아미노산 변화가 있는 이의 기능성 변이체이고, 릴랙신 B 사슬 폴리펩티드는 인간 릴랙신 2 B 사슬 폴리펩티드 (서열 8) 또는 서열 18과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 아미노산 변화가 있고 보존된 모티프 Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X를 포함하는 이의 기능성 변이체이다.
기능성 변이체를 수득하는 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 기능성 변이체의 예가 릴랙신 A 사슬에 대해서는 문헌 [Hossain et al J Biol Chem. 2008 Jun 20; 283(25):17287-97] 또는 미국 특허 공개 번호 US2011/0130332에, 릴랙신 B 사슬에 대해서는 문헌 [Schwabe and Buellesbach (2007) Adv Exp Med Biol. 612:14-25] 및 [Buellesbach and Schwabe J Biol Chem. 2000 Nov 10;275(45):35276-80)]에 개시되어 있다.
PCS 링커:
릴랙신을 융합 단백질로부터 방출시키기 위해, 사용된 링커 서열 PCS는 프로테아제/펩티다제에 대한 절단 서열을 포함한다. 프로테아제/펩티다제는 효소의 촉매 기능이 단백질의 펩티드 결합을 가수분해 (파괴)하는 것인 효소들의 군이다. 이들은 단백질분해성 효소 또는 프로테이나제(proteinase)로도 칭해진다. 프로테아제들은 펩티드 결합을 가수분해하는 능력들이 상이하고, 즉 프로테아제들은 인식 및 절단 부위로서 특정 펩티드 서열을 선호할 수 있다. 프로테아제는 6개의 군으로 세분되고, 이때 세린 프로테아제, 예컨대 응고 인자 IIa, VIIa, 및 Xa, 및 메탈로프로테아제(Metalloprotease), 예컨대 매트릭스 메탈로프로테아제 2 및 9가 가장 큰 패밀리를 나타낸다.
프로테아제 기질의 절단 부위 위치는 P1-P1'으로 지정되는데, 이는 절단 부위의 N 말단 부위의 아미노산이 P1으로 규정되고, C 말단 부위가 P1'으로 규정되는 것을 의미한다. 절단된 펩티드 결합의 N-말단 방향의 아미노산은 P2, P3, 및 P4으로 번호가 매겨진다. 절단 부위의 카르복실 측면에서, 유사하게 번호매김이 증분된다 (P1', P2', P3' 등) (문헌 [Schlechter and Berger (1967 & 1968)]).
본 발명의 문맥에서, 프로테아제/펩티다제는 엔도프로테아제/엔도펩티다제이다. 엔도펩티다제 또는 엔도프로테아제는 비-말단 아미노산 (즉, 단백질 내의 아미노산)의 펩티드 결합을 파괴하는 단백질분해성 펩티다제이다. 이의 반대는 엑소펩티다제(exopeptidase)이고, 이는 N- 또는 C-말단 펩티드 결합을 가수분해하며, 따라서 폴리펩티의 N-말단 또는 C-말단 아미노산을 방출시킨다. 이러한 이유로, PCS 링커를 절단하는 엔도펩티다제는 제어된 방식으로 전구약물 융합 단백질로부터 릴랙신을 방출시킬 수 있다.
바람직한 실시양태에서, PCS는 엔도-프로테아제의 PCS이다. 바람직한 실시양태에서, PCS는 세포외 엔도-프로테아제의 PCS이다. 더 바람직한 실시양태에서, 상기 언급된 엔도-프로테아제는 혈액 내에서 또는 릴랙신 작용을 원하는 신체 내의 부위에서 활성이다. 혈액에서 천연적으로 발생하는 엔도-프로테아제, 예컨대 응고 인자 Xa 또는 릴랙신으로 치료가능한 질환의 질환 조직에서 천연적으로 발생하는 엔도-프로테아제, 예컨대 MMP 메탈로프로테아제가 더욱 더 바람직하다. 막에 결합되어 있거나 막에 스패닝(spanning)되어 있지만, 혈관 내강 (따라서 인간 혈액)에 이의 촉매 도메인, 따라서 이의 촉매 활성이 있거나, 또는 조직 내의 간질성 공간에 노출된 엔도-프로테아제, 예컨대 MMP12가 또한 바람직하다. 인간 혈액 및/또는 릴랙신으로 치료가능한 질환의 질환 조직에서 활성인 상기 언급된 엔도-프로테아제가 더욱 더 바람직하다. 릴랙신으로 치료가능한 질환은, 예를 들어 섬유증 질환이다. 따라서, 섬유증 질환의 질환 조직은, 예를 들어 폐, 심장, 간 또는 신장 조직이다. 추가적인 릴랙신으로 치료가능한 질환이 하기에 열거된다. 인간 기원이거나 또는 인간화된 상기 언급된 엔도-프로테아제가 가장 바람직하다.
EC 명명법에 따르면 엔도프로테아제는 EC EC 3.4.21 - EC 3.4.24 군 (국제 생화학 및 분자 생물학 연합(International Union of Biochemistry 및 Molecular Biology)의 명명 위원회(Nomenclature Committee)에 의해 결정됨)에 속한다는 것이 당업자에게 공지되어 있다. 유용한 엔도프로테아제는, 예를 들어 트립신, 트롬빈(Thrombin), Xa 인자, VIIa 인자, MMP2, MMP12 또는 레닌(Renin)이다.
PCS를 절단하는 외인성 엔도-프로테아제가 투여되어 전구약물로부터의 릴랙신 방출에 이를 수 있는 것이 또한 구상된다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 내인성 프로테아제는 프로테아제에 연결된 표적화 모이어티를 통해 릴랙신 활성의 원하는 부위 (예를 들어, 릴랙신으로 치료가능한 질환의 질환 조직)로 표적화된다.
상기 언급된 엔도프로테아제의 발현에 관한 지식은 최신 기술이다. 본 발명의 일부 측면에서, 전구약물로서 릴랙신의 반감기가 더 긴 것뿐만 아니라, 신체의 특정 기관 또는 일부분에서 전구약물로부터 릴랙신이 방출되는 것이 또한 바람직하다. 따라서, 전구약물로부터 릴랙신이 방출되는 부위에 조정(tailoring)되도록 엔도프로테아제가 발현되는 당업계의 정보를 사용할 수 있다.
전구약물로부터 릴랙신이 전신적으로 방출되면, 엔도-프로테아제가 혈액 내에 존재하는 것이 선택될 것이다. 이같은 프로테아제는, 예를 들어 응고 인자 Xa이다.
전구약물로부터 방출된 릴랙신은 반감기가 짧기 때문에, 릴랙신 방출을 특정 기관, 조직 또는 구획, 특히 질환 기관, 조직 또는 구획에 조정하는 것은 릴랙신이 질환 부위에 방출됨에 따라 이의 제약 이점을 추가로 개선한다.
예를 들어, 릴랙신은 직접적인 심근세포에 대한 항-비대 효과 및 심장 섬유모세포에 대한 항-섬유증 활성이 있다 (문헌 [Moore XL. et al. (2007)]; [Wang P. et al. (2009)]). 따라서, 심장 조직에서 주로 발현되는 프로테아제, 예컨대 MMP2 (문헌 [Overall CM. (2004)]) 또는 키마제(Chymase) (문헌 [Matsumoto C. et al. (2009)])가 바람직하다. 섬유증 질환에 영향을 받는 기타 두드러진 기관은 신장 (문헌 [Klein J. et al. (2011)]) 및 폐 ([Coward WR et al. (2010)])이다. 이러한 기관에서, 릴랙신 투여는 강한 항-섬유증 활성을 나타낸다 (문헌 [Bennett RG (2009)]). 따라서, 신장 및/또는 폐에서 주로 발현되는 프로테아제, 예컨대 폐에서의 MMP12 (문헌 [Garbacki N. et al. (2009)]) 또는 신장에서의 레닌 (문헌 [Castrop H. et al. (2010)])으로부터의 링커로서의 프로테아제 절단 부위가 바람직하다.
엔도-프로테아제의 프로테아제 절단 부위가 당업계에 공지되어 있다. 일부 예가 표 1에서 제공된다.
Figure pct00001
프로테아제 절단 부위의 변형이 기질의 상이한 전환에 이를 수 있다는 것이 당업계에 주지되어 있다. 이같은 변형은 인식 서열 내의 하나 이상의 아미노산의 보존성 또는 비-보존성 변화를 포함하고, 기질 전환의 kcat 및/또는 Km에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 릴랙신 융합 단백질 내의 PCS를 변화시키는 것은 릴랙신의 방출 동역학을 추가로 조정하는 기초를 제공한다.
엔도프로테아제의 바람직한 절단 부위가 공지되어 있기 때문에, 엔도프로테아제가 PCS를 특이적으로 절단하지만 릴랙신 또는 반감기 연장 모이어티는 절단하지 않도록 PCS/엔도프로테아제 조합이 선택된다. 또한, 엔도-프로테아제가 릴랙신 또는 반감기 연장 모이어티의 펩티드 결합을 또한 가수분해할지 여부를 결정하는 방법이 당업계에 제공되어 있다다.
바람직한 PCS는 응고 인자 Xa의 절단 부위이고, IleGluGlyArgMetAsp 서열의 PCS가 더욱 바람직하다.
추가적인 실시양태에서, 상기 언급된 융합 폴리펩티드/단백질의 PCS 링커 폴리펩티드는 N-말단 및/또는C-말단에 추가로 신장기 폴리펩티드가 있을 수 있다. 신장기 단위는 PCS에 대한 엔도-프로테아제의 더 양호한 접근을 제공할 수 있고, 따라서 융합 단백질로부터의 릴랙신의 더 양호한 방출을 제공할 수 있다. 소정의 기질에 대한 프로테아제 활성을 결정하는 방법이 당업계에 공지되어 있다.
이같은 신장기는 당업계에 공지되어 있고, 아미노산 1개 내지 약 100개의 길이이거나, 아미노산 1개 내지 약 50개의 길이이거나, 아미노산 1개 내지 약 25개의 길이이거나, 아미노산 1개 내지 약 15개의 길이이거나, 아미노산 1개 내지 10개의 길이이거나, 또는 아미노산 1개 내지 5개의 길이이다.
신장기 서열의 아미노산 조성은 가변적이지만, 낮은 면역원성 잠재력을 나타내는 신장기가 바람직하다. 본 발명의 한 실시양태에서, 신장기 폴리펩티드는 임의의 아미노산으로 구성될 수 있다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 신장기 폴리펩티드는 Gly 및 Ser 잔기를 포함한다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 신장기 펩티드는 글리신-풍부 링커, 예컨대 미국 특허 번호 7,271,149에 개시된 바와 같은 [GGGGS]n 서열을 포함하는 펩티드이고, 이때 n은 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 더욱 바람직하게는 1 내지 5, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 3의 정수이다. 다른 실시양태에서, 미국 특허 번호 5,525,491에 기술된 바와 같은 세린-풍부 신장기 폴리펩티드가 사용된다. 추가적인 바람직한 실시양태는 Gly 및 Ser 잔기를 포함하고 Gly 대 Ser 비가 적어도 3 대 1인 신장기 폴리펩티드이다.
신장기 단위가 PCS와 릴랙신 사이에 도입되는 경우에, 각각의 엔도-프로테아제에 의한 절단 후에, PCS의 P 또는 P' 아미노산 각각에 더하여, 신장기 단위가 릴랙신 상에 남아 있을 것이다. 따라서, 릴랙신 활성을 감소시키지 않을 신장기 단위가 사용된다. 바람직한 실시양태에서, PCS와 반감기 연장 모이어티 사이에 신장기 단위가 삽입된다.
추가적인 실시양태에서, 상기 언급된 융합 폴리펩티드는 활성 릴랙신을 방출한다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 릴랙신 활성은 릴랙신 수용체 LGR7의 활성화이다. 릴랙신 활성을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있거나, 본원에서 제공된다. 더욱더 바람직한 실시양태에서, 본원의 실험 방법에 개시된 방법에 의해 릴랙신 수용체 LGR7의 활성화가 결정된다. 더욱더 바람직한 실시양태에서, 릴랙신 수용체 LGR7 활성화의 결정은 EC50 값을 결정하는 것이다. 더더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 언급된 릴랙신 활성은 최대 활성의 절반을 유도하는 상응하는 야생형 릴랙신의 유효 농도와 비교하여 105배, 104배, 103배, 100배, 75배, 50배, 25배 또는 10배 더 낮다. , 예를 들어 인간 릴랙신 2를 기초로 하는 융합 폴리펩티드에 대한 상응하는 야생형 릴랙신은 인간 릴랙신 2 단백질이다.
단백질성 반감기 연장 모이어티를 통한 반감기 연장:
본 발명의 융합 폴리펩티드의 반감기를 개선하기 위해, 단백질성 반감기 연장 모이어티, 예컨대 이뮤노글로불린의 이뮤노글로불린 Fc 단편, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체 또는 적어도 이의 트랜스페린-결합 부분, 혈청 알부민, 또는 이들의 변이체, 또는 더 긴 반감기를 매개하는 다른 분자에 생체 내에서 결합하는 결합 분자, 예를 들어 혈청 알부민 결합 단백질과의 융합이 구상된다.
"이뮤노글로불린"은 전형적으로는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄가 있는, 디술피드 결합에 의해 함께 유지되는 폴리펩티드 사슬들을 함유하는 분자이다. 각각의 사슬에서, 1개의 도메인 (가변 도메인 Fv)은 분자의 항체 특이성에 좌우되는 가변성 아미노산 서열을 갖는다. 다른 도메인들 (불변 도메인 C)는 동일한 부류의 분자들에게 공통적인 다소 일정한 서열을 갖는다.
본원에서 사용되는 경우에, 이뮤노글로불린의 "Fc" 부분은 면역학 분야에서 이러한 용어에 통상적으로 주어지는 의미를 갖는다. 구체적으로, 이러한 용어는 항체로부터 2개의 항원 결합 영역 (Fab 단편)을 제거함으로써 수득되는 항체 단편을 지칭한다. Fab 단편을 제거하는 한 방식은 이뮤노글로불린을 파파인 프로테아제로 소화시키는 것이다. 따라서, 양쪽 중쇄로부터의 불변 영역의 적합하게 동일한 크기인 단편들로부터 Fc 부분이 형성되고, 이들은 비-공유결합 상호작용 및 임의적인 디술피드 결합을 통해 회합된다. Fc 부분은 힌지(hinge) 영역을 포함할 수 있고, CH2 및 CH3 도메인을 지나 항체의 C-말단까지 확장될 수 있다. 인간 및 마우스 이뮤노글로불린의 대표적인 힌지 영역을 문헌 [Antibody Engineering, A Practical Guide, Borrebaeck, C.A.K., ed., W.H. Freeman and Co., 1992]에서 확인할 수 있다.
이펙터 및 약동학 성질이 상이한 5가지 유형의 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역이 있다: IgG, IgA, IgM, IgD, 및 IgE. IgG는 혈청에서 가장 풍부한 이뮤노글로불린이다. 또한 IgG는 임의의 이뮤노글로불린 중에서 혈청 내의 반감기가 가장 길다 (23일). 다른 이뮤노글로불린과 달리, IgG는 Fc 수용체에 대한 결합에 이어지는 세포내이입 후에 효율적으로 재순환된다. G1, G2, G3, 및 G4의 4가지 IgG 서브부류가 있고, 이들 각각은 효과 또는 기능이 상이하다. 일반적으로 이러한 이펙터 기능들은 Fc 수용체 (FcγR)와의 상호작용을 통해 또는 C1q에 결합하고 보체를 고정하는 것에 의해 매개된다. FcγR에 결합하는 것은 항체 의존적 세포 매개 세포용해에 이를 수 있는 한편, 보체 인자에 결합하는 것은 보체 매개 세포 용해에 이를 수 있다. Fc 부분이 반감기를 연장하는 능력에 대해서만 활용되는 이종성 Fc 융합 단백질을 디자인하는 것에서, 임의의 이펙터 기능을 최소화하는 것이 중요하다. 모든 IgG 서브부류가 Fc 수용체 (CD16, CD32, CD64)에 결합할 수 있고, G1 및 G3가 G2 및 G4보다 더욱 효과적이다. IgG의 Fc 수용체 결합 영역은 CH2 도메인의 힌지 영역 및 카르복시 말단 영역 양쪽 모두에 위치하는 잔기에 의해 형성된다.
원하는 생체내 효과에 따라, 본 발명의 이종성 융합 단백질은 상기 기술된 이소형(isotype) 중 임의의 것을 함유할 수 있거나, 또는 보체 및/또는 Fc 수용체 결합 기능이 변경된 돌연변이된 Fc 영역을 함유할 수 있다. 따라서, 본 발명의 이종성 융합 단백질은 이뮤노글로불린의 전체 Fc 부분, 이뮤노글로불린의 Fc 부분의 단편, 또는 이의 유사체를 함유할 수 있다.
본 발명의 이종성 융합 단백질에 사용된 Fc 영역이 IgG1 또는 IgG2 Fc 영역으로부터 유래되는 것이 바람직하다.
일반적으로, 본 발명의 이종성 융합 단백질에 사용된 Fc 영역은 인간, 래트, 마우스 및 돼지를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 사용된 Fc 영역은 인간 또는 래트로부터 유래된다. 그러나, 융합 단백질이 인간에서 면역원성인 위험을 감소시키기 위해 인간 Fc 영역 및 이의 단편 및 변이체가 가장 바람직하다. "천연 서열 Fc 영역"은 천연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 천연 서열 Fc 영역의 것과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 1개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환이 있다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과의 서열 동일성이 약 80％ 이상일 것이고, 더욱 바람직하게는 서열 동일성이 약 90％ 이상일 것이며, 가장 바람직하게는 서열 동일성이 약 95％ 이상일 것이다.
직접적으로 또는 펩티드 신장기를 통해 상기 기술된 릴랙신 화합물이 알부민 또는 이의 유사체, 단편 또는 유도체에 융합될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 융합 단백질의 일부를 구성하는 알부민 단백질은 임의의 종으로부터 클로닝된 알부민으로부터 유래될 수 있다. 그러나, 융합 단백질이 인간에서 면역원성인 위험을 감소시키기 위해 인간 알부민 및 이의 단편 및 유사체가 바람직하다. 인간 혈청 알부민 (HSA)은 아미노산 585개의 단일한 비-글리코실화 폴리펩티드 사슬로 이루어지고, 분자식의 분자량은 66,500이다. HSA의 아미노산 서열 (서열 3)이, 예를 들어 문헌 [Meloun, et al. (1975)]; [Behrens, et al. (1975)]; [Lawn, et al. (1981)] 및 [Minghetti, et al. (1986)]에 기술되어 있다. 알부민의 다양한 다형성 변이체, 뿐만 아니라 유사체 및 단편이 기술되어 있다 (문헌 [Weitkamp, et al. (1973)] 참조). , 예를 들어 EP0322094 및 EP0399666에 인간 혈청 알부민의 다양한 단편이 개시되어 있다. 본 발명의 이종성 융합 단백질은 단편, 유사체 및 유도체가 포함되는 임의의 알부민 단백질을 포함하는 릴랙신 화합물을 포함하며, 이때 이같은 융합 단백질은 생물학적으로 활성이고 상응하는 야생형 릴랙신 단독보다 혈장 반감기가 더 긴 것으로 이해된다. 따라서, 융합 단백질의 알부민 부분은 혈장 반감기가 천연 인간 알부민의 것과 동일할 필요는 없다. 반감기가 더 길거나 또는 반감기가 천연 인간 알부민 및 관심 릴랙신 화합물의 것의 중간인 단편, 유사체 및 유도체가 공지되어 있거나 또는 생성될 수 있다. 이러한 기술이 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어 WO 93/15199, WO 93/15200, WO 01/77137 및 EP0413622를 참조한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단백질성 반감기 연장 모이어티는 면역원성이 낮거나, 인간형이거나, 또는 인간화된다. 바람직한 실시양태에서, 단백질성 반감기 연장 모이어티는 인간형, 예컨대 인간 트랜스페린 (서열 2), 인간 혈청 알부민 (서열 3), 또는 인간 IgG1 Fc (서열 4)이다.
추가적으로, 생물학적 반감기를 개선하는 기타 단백질, 단백질 도메인 또는 펩티드가 융합 파트너로서 또한 사용될 수 있다.
인간 혈청 알부민에 대한 융합을 통한 반감기 연장이, 예를 들어 WO93/15199에 개시되어 있다. 단백질의 약동학을 개선하기 위한 일반적인 전략으로서의 알부민 결합이, 예를 들어 문헌 [Dennis et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 277, No 38, Issue of September 20, pp. 35035-35043]에 기술되어 있다. 인간 혈청 알부민 결합 단백질에 대한 융합을 통한 반감기 연장이, 예를 들어 US20100104588에 개시되어 있다. 인간 혈청 알부민 또는 IgG-Fc 결합 단백질에 대한 융합을 통한 반감기 연장이, 예를 들어 WO01/45746에 개시되어 있다. 인간 혈청 알부민 결합 펩티드에 대한 융합을 통한 반감기 연장의 추가적인 예가 WO2010/054699에 개시되어 있다.
Fc 도메인에 대한 융합을 통한 반감기 연장이, 예를 들어 WO2001/058957에 개시되어 있다.
생물학적 활성이 관심 단백질의 이의 융합 파트너에 대한 바람직한 배향을 결정한다. 융합 파트너의 C-말단, 뿐만 아니라 N-말단 배향이 포함된다. 또한, 생물학적 반감기 또는 기타 기능의 개선을 위해, 융합 파트너가 인산화, 황산화, 아크릴화, 글리코실화, 탈글리코실화, 메틸화, 파르네실화, 아세틸화, 아미드화 등에 의해 변형될 수 있다.
단백질성 반감기 연장 모이어티의 예는 트랜스페린, 트랜스페린 수용체 또는 적어도 이의 트랜스페린-결합 부분, 혈청 알부민, 혈청 알부민 결합 단백질, 이뮤노글로불린, 및 이뮤노글로불린의 Fc 도메인이다. 인간 단백질성 반감기 연장 모이어티, 예를 들어 인간 트랜스페린, 인간 트랜스페린 수용체 또는 적어도 이의 트랜스페린-결합 부분, 인간 혈청 알부민, 인간 이뮤노글로불린 또는 인간 Fc 도메인이 바람직하다.
추가적인 실시양태에서, 하나 이상의 반감기 연장 모이어티를 포함하는 상기 언급된 융합 폴리펩티드는 상응하는 야생형 릴랙신에 비해 반감기가 연장되고, 이때 반감기 연장은 적어도 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 또는 500배이다. 바람직하게는, 반감기는 혈청 반감기로서 결정되고, 이는, 예를 들어 시판되는 정량 ELISA 검정법 (예를 들어 R&D 시스템즈, 인간 릴랙신-2 퀀티카인(Quantikine) ELISA 키트, 카탈로그 번호 DRL200)을 사용하는 것에 의한, 혈청 또는 전혈 내의 융합 단백질의 검출을 의미한다. 반감기는 바람직하게는 인간 혈액 반감기이다.
클로닝 , 벡터 시스템, 발현, 숙주 및 정제
본 발명은 본 발명의 융합 폴리펩티드 HEM-PCS-프로릴랙신 또는 프로릴랙신-PCS-HEM를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 또한 제공한다. 이러한 벡터 시스템은 숙주 세포에서의 이의 발현을 지시할 수 있는 발현 서열에 작동적으로 연결된다.
적절한 숙주 세포는 박테리아 세포 (예컨대 이. 콜라이), 효모 세포 (예컨대 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)), 진균 세포, 식물 세포, 곤충 세포 및 동물 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 동물 세포에는 HEK293 세포, CHO 세포, COS 세포, BHK 세포, HeLa 세포 및 다양한 1차 포유동물 세포가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. HEK293T 세포와 같은 포유동물 세포의 유도체가 또한 적용가능하다.
본 발명의 DNA 분자
본 발명은 본 발명의 융합 단백질 HEM-PCS-프로릴랙신 또는 프로릴랙신-PCS-HEM을 코딩하는 DNA 분자에 또한 관련된다.
본 발명의 DNA 분자는 본원에 개시된 서열에 한정되지 않고, 이의 변이체를 또한 포함한다. 본 발명에 속하는 DNA 변이체는 혼성화에서의 이의 물리적 성질을 참조로 기술될 수 있다. 당업자는 핵산 혼성화 기술을 사용하여 DNA가 이의 상보물을 확인하는데, 그리고 DNA가 이중 가닥이기 때문에 이의 등가물 또는 상동체를 확인하는데 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 100％ 미만의 상보성으로 혼성화가 일어날 수 있다는 것이 또한 인지될 것이다. 그러나, 조건들의 적합한 선택 하에, 혼성화 기술을 사용하여 DNA 서열들을 특정 프로브에 대한 이들의 구조적 관련성을 기초로 구별할 수 있다. 이같은 조건에 관한 지침을 위해, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 1989, 상기 문헌] 및 [Ausubel et al., 1995 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons)]을 참조한다.
2개의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 구조적 유사성은 2개의 서열이 서로 혼성화할 조건의 "엄격성"의 함수로서 표현될 수 있다. 본원에서 사용되는 경우에, 용어 "엄격성"은 조건이 혼성화에 불리한 정도를 지칭한다. 엄격한 조건은 혼성화에 강하게 불리하고, 이같은 조건 하에서는 구조적으로 가장 관련된 분자들만 서로 혼성화할 것이다. 반대로, 엄격하지 않은 조건은 더 낮은 정도의 구조적 관련성을 나타내는 분자들의 혼성화에 유리하다. 따라서, 혼성화 엄격성은 2개의 핵산 서열의 구조적 관계에 직접적으로 상관된다. 하기의 관계가 혼성화와 관련성을 상관시키는데 유용하다 (식 중, Tm은 핵산 듀플렉스(duplex)의 용융 온도이다):
a. Tm = 69.3 + 0.41(G+C)％
b. 미스매칭(mismatching)된 염기 쌍의 수가 1％ 증가할 때마다 듀플렉스 DNA의 Tm이 1℃만큼 감소된다.
c. (Tm)μ2 - (Tm)μ1 = 18.5 log10μ2/μ1
[식 중, μ1 및 μ2는 2개의 용액의 이온 강도이다].
혼성화 엄격성은 전체적인 DNA 농도, 이온 강도, 온도, 프로브 크기, 및 수소 결합을 파괴하는 작용제의 존재가 포함되는 다수의 인자의 함수이다. 혼성화를 촉진하는 인자에는 높은 DNA 농도, 높은 이온 강도, 낮은 온도, 더 긴 프로브 크기, 및 수소 결합을 파괴하는 작용제의 부재가 포함된다. 전형적으로, 혼성화는 2가지 단계로 수행된다: "결합" 단계 및 "세정" 단계.
먼저, 결합 단계에서, 혼성화에 유리한 조건 하에 프로브가 표적에 결합된다. 일반적으로, 온도를 변경시키는 것에 의해 이러한 단계에서 혼성화가 제어된다. 높은 엄격성의 경우에는, 짧은 (< 20 nt) 올리고뉴클레오티드 프로브가 사용되지 않는 한, 온도가 일반적으로 65℃ 내지 70℃이다. 대표적인 혼성화 용액은 6× SSC, 0.5％ SDS, 5× 덴하르트 용액 및 100 ㎍의 비-특이적 캐리어(carrier) DNA를 포함한다. 문헌 [Ausubel et al., section 2.9, supplement 27 (1994)] 참조. 물론, 다수의 상이하지만 기능적으로 등가인 완충제 조건이 공지되어 있다. 관련성 정도가 더 낮은 경우에는, 더 낮은 온도가 선택될 수 있다. 낮은 엄격성 결합 온도는 약 25℃ 내지 40℃이다. 중등도 엄격성은 약 40℃ 이상 내지 약 65℃ 미만이다. 높은 엄격성은 약 65℃ 이상이다.
다음으로, 과량의 프로브가 세정에 의해 제거된다. 이러한 단계에서 더욱 엄격한 조건이 일반적으로 적용된다. 따라서, 이러한 "세정" 단계가 혼성화를 통해 관련성을 결정하는 것에서 가장 중요하다. 세정 용액은 전형적으로 더 낮은 염 농도를 함유한다. 한 예시적인 중등도 엄격성 용액은 2× SSC 및 0.1％ SDS를 함유한다. 높은 엄격성 세정 용액은 약 0.2× SSC 미만의 등가물 (이온 강도 면에서)을 함유하고, 바람직한 엄격한 용액은 약 0.1× SSC를 함유한다. 다양한 엄격성과 연관된 온도는 "결합"에 대해 상기에서 논의된 바와 동일하다. 또한 전형적으로 세정 용액은 세정 동안 여러 번 교체된다. , 예를 들어 전형적인 높은 엄격성 세정 조건은 30분 동안 55℃에서 2회 및 15분 동안 60℃에서 3회 세정하는 것을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 서열이다.
재조합 DNA 구축물 및 발현
본 발명은 하나 이상의 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 구축물을 추가로 제공한다. 본 발명의 재조합 구축물은 벡터, 예컨대 플라스미드, 파지미드, 파지 또는 바이러스 벡터와 함께 사용되고, 이의 내부로 본 발명의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자가 삽입된다.
본원에서 제공되는 바와 같은 융합 폴리펩티드는 숙주 세포 내에서의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 재조합 발현에 의해 제조된다. 융합 폴리펩티드를 재조합적으로 발현시키기 위해, 융합 폴리펩티드가 숙주 세포 내에서 발현되도록 숙주 세포가 융합 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 단편을 보유하는 재조합 발현 벡터로 형질감염될 수 있다. 표준 재조합 DNA 방법을 사용하여 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제조 및/또는 수득하고, 이러한 핵산을 재조합 발현 벡터 내로 혼입시키고, 벡터를 숙주 세포, 예컨대 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)], [Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)] 및 미국 특허 번호 4,816,397 (보스(Boss) 등)에 기술된 것들 내로 도입할 수 있다.
융합 폴리펩티드를 발현시키기 위해, 표준 재조합 DNA 발현 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)] 참조). , 예를 들어 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있고, 그 후 이를 적절한 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 적절한 숙주 세포는 원핵생물 및 진핵생물 세포이다. 원핵생물 숙주 세포의 예는, 예를 들어 박테리아이고, 진핵생물 숙주 세포의 예는 효모, 곤충 또는 포유동물 세포이다. 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 디자인이 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준, 및 발현이 구성적인지 또는 유도성인지 여부와 같은 인자에 영향을 받는 것으로 이해된다.
박테리아 발현
기능성 프로모터가 있는 작동가능한 판독 상 내에 원하는 단백질을 코딩하는 구조적 DNA 서열을 적절한 번역 개시 및 종결 신호와 함께 삽입함으로써 박테리아에 대한 유용한 발현 벡터가 구축된다. 이러한 벡터는 벡터의 유지를 보증하고 바람직한 경우에는 숙주 내에서의 증폭을 제공하도록 하나 이상의 표현형 선별 마커 및 복제 기원을 포함할 것이다. 형질전환을 위한 적절한 진핵생물 숙주에는 이. 콜라이, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 및 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속에 속하는 다양한 종이 포함된다.
박테리아 벡터는, 예를 들어 박테리오파지, 플라스미드 또는 파지미드를 기초로 할 수 있다. 이러한 벡터들은 주지된 클로닝 벡터 pBR322 (ATCC 37017)의 요소들을 전형적으로 함유하는 시판되는 플라스미드로부터 유래된 선별성 마커 및 박테리아 복제 기원을 함유할 수 있다. 적절한 숙주 균주의 형질전환 및 숙주 세포의 적합한 세포 밀도로의 성장 후에, 선택된 프로모터가 적합한 수단 (예를 들어, 온도 변환 또는 화학적 유도)에 의해 탈억제/유도되고, 추가적인 기간 동안 세포가 배양된다. 세포가 전형적으로 원심분리에 의해 수확되고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴되고, 생성된 미정제 추출물이 추가적인 정제를 위해 유지된다.
박테리아 시스템에서, 발현되는 단백질에 의도되는 용도에 따라 다수의 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. , 예를 들어 다량의 이같은 단백질이 생산되어야 하는 경우, 쉽게 정제되는 높은 수준의 융합 폴리펩티드 생성물의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 본 발명의 융합 폴리펩티드에는 정제된 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물, 및 이. 콜라이, 바실루스 서브틸리스, 살모넬라 타이피무리움 및 슈도모나스, 스트렙토마이세스, 및 스타필로코쿠스 속에 속하는 다양한 종이, 예를 들어 포함되는 원핵생물 숙주, 바람직하게는 이. 콜라이 세포로부터 재조합 기술에 의해 생성된 생성물이 포함된다.
포유동물 발현 및 정제
포유동물 숙주 세포 발현에 대한 바람직한 조절 서열에는 포유동물 세포에서의 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV) (예컨대 CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40 (SV40) (예컨대 SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서가 포함된다. 바이러스 조절 요소 및 이의 서열에 대한 추가적인 설명에 대해, 예를 들어 미국 5,168,062 (스팅스키(Stinski)), 미국 4,510,245 (벨(Bell) 등) 및 미국 4,968,615 (섀프너(Schaffner) 등)을 참조한다. 재조합 발현 벡터는 복제 기원 및 선별성 마커를 또한 포함할 수 있다 (예를 들어, 미국 4,399,216, 4,634,665 및 미국 5,179,017 (악셀(Axel) 등 참조). 적절한 선별성 마커에는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 저항성을 부여하는 유전자가 포함된다. , 예를 들어 디히드로폴레이트 리덕타제(reductase) (DHFR) 유전자는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하고, neo 유전자는 G418에 대한 저항성을 부여한다.
전기천공, 인산칼슘 침전, 및 DEAE-덱스트란, 리포펙션(lipofection) 또는 다가양이온-매개 형질감염과 같은 표준 기술을 사용하여 숙주 세포 내로의 발현 벡터의 형질감염을 수행할 수 있다.
본원에서 제공된 융합 폴리펩티드를 발현시키기 위한 적절한 포유동물 숙주 세포에는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (dhfr- CHO 세포를 포함하고, 문헌 [Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기술되어 있으며, 문헌 [R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에, 예를 들어 기술된 바와 같이 DHFR 선별성 마커와 함께 사용됨), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 일부 실시양태에서, 발현된 단백질이 숙주 세포가 성장된 배양 배지 내로 분비되도록 발현 벡터가 디자인된다. 문헌 [Durocher et al (2002) Nucl.Acids Res. Vol 30 e9]에 의한 프로토콜에 따라 일시적인 형질감염/항체 발현이, 예를 들어 달성될 수 있다. UCOE 시스템 (문헌 [T. Benton et al. (2002) Cytotechnology 38: 43-46])의 프로토콜에 따라 안정적인 형질감염/항체 발현이, 예를 들어 달성될 수 있다.
표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 융합 폴리펩티드가 회수될 수 있다.
황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포-셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하지만 이에 한정되지 않는 주지된 방법에 의해 본 발명의 융합 폴리펩티드를 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제할 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")를 또한 정제에 사용할 수 있다. , 예를 들어 문헌 [Colligan, Current Protocols in Immunology], 또는 [Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)], 예를 들어 이의 챕터 1, 4, 6, 8, 9, 10을 참조하고, 이들 각각은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 융합 폴리펩티드에는 정제 또는 단리된 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물, 및 효모 (예를 들어 피치아(Pichia)), 고급 식물, 곤충 및 포유동물 세포가, 예를 들어 포함되는 진핵생물 숙주, 바람직하게는 포유동물 세포로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물이 포함된다. 재조합 생산 절차에서 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 글리코실화될 수 있거나 또는 글리코실화되지 않을 수 있고, 글리코실화가 바람직하다. 이같은 방법이 다수의 표준 실험 설명서, 예컨대 문헌 [Sambrook, 상기 문헌, 섹션 17.37-17.42]; [Ausubel, 상기 문헌, 챕터 10, 12, 13, 16, 18 및 20]에 기술되어 있다.
치료적 사용
본 발명의 한 실시양태는 심혈관 질환, 신장 질환, 췌장염, 염증, 암, 경피증, 폐, 신장 및 간 섬유증의 치료에서의 본 발명의 제약 조성물 또는 융합 폴리펩티드의 용도이다.
심혈관 질환
본 발명의 문맥에서, 심혈관계의 장애, 또는 심혈관 장애는, 예를 들어 하기의 장애를 의미한다: 고혈압 (높은 혈압), 말초 및 심장 혈관 장애, 관상동맥 심장 질환, 안정형 및 불안정형 협심증, 심근 부전, 지속적인 허혈성 기능장애 ("동면 심근"), 일시적인 허혈후 기능장애 ("기절 심근"), 심부전, 말초 혈류 장애, 급성 관상동맥 증후군, 심부전 및 심근경색.
본 발명의 문맥에서, 심부전이라는 용어는 심부전의 급성 및 만성 징후 양쪽 모두, 뿐만 아니라 더욱 구체적이거나 관련된 유형의 질환, 예컨대 급성 비대상성 심부전, 우심부전, 좌심부전, 전체적 기능상실, 허혈성 심근병증, 확장 심근병증, 선천성 심장 결함, 심장 판막 결함, 심장 판막 결함과 연관된 심부전, 승모판 협착증, 승모판 부전, 대동맥 협착증, 대동맥 부전, 삼첨판 협착증, 삼첨판 부전, 폐동맥 협착증, 폐동맥판 부전, 조합형 심장 판막 결함, 심근 염증 (심근염), 만성 심근염, 급성 심근염, 바이러스성 심근염, 당뇨병성 심부전, 알콜성 심근병증, 심장 축적 장애, 및 이완기 및 수축기 심부전 및 급성기의 심부전 악화를 포함한다.
추가로 본 발명에 따른 화합물은 경색증에 걸린 심근의 면적을 감소시키는데, 그리고 2차 경색증의 예방에 또한 적절하다.
본 발명에 따른 화합물은 혈전색전성 장애, 허혈 후의 재관류 손상, 미세혈관 및 대혈관 병변 (혈관염), 동맥 및 정맥 혈전증, 부종, 허혈, 예컨대 심근경색, 뇌졸중 및 일과성 허혈 발작의 예방 및/또는 치료, 관상 동맥 우회로 수술 (CABG), 1차 경피 경혈관 심장동맥 성형술 (PTCA), 혈전용해 후의 PTCA, 구조용 PTCA, 심장 이식 및 개심 수술과 관련된 심장 보호, 및 이식, 우회로 수술, 카테터 검사 및 기타 수술 절차와 관련된 기관 보호에 또한 적절하다.
기타 적응증 분야는, 예를 들어 만성 폐쇄성 폐 질환 (만성 기관지염, COPD), 천식, 폐 기종, 기관지확장증, 낭성 섬유증 (뮤코비시도시스(mucoviscidosis)) 및 폐 고혈압, 특히 폐동맥 고혈압과 같은 호흡기 장애의 예방 및/또는 치료이다.
신장 질환
본 발명은 신장 질환, 특히 급성 및 만성 신장 질환 및 급성 및 만성 신부전, 뿐만 아니라 급성 및 만성 신장 기능상실 (투석을 요구하는 또는 투석을 요구하지 않는 급성 및 만성 단계의 신장 기능상실 포함), 뿐만 아니라 기저 또는 관련 신장 질환, 예컨대 신장 관류저하, 투석에 의해 유도된 저혈압, 사구체병증, 사구체성 및 세뇨관성 단백뇨, 신성 부종, 1차, 2차, 뿐만 아니라 급성 및 만성 사구체신염, 막성 및 막증식성 사구체신염, 알포트(Alport) 증후군, 사구체경화증, 간질성 세뇨관 질환, 신장병 질환, 예컨대 1차 및 선천성 신장 질환, 신장 염증, 면역학적 신장 질환, 예컨대 신장 이식 거부, 면역 복합체에 의해 유도된 신장 질환, 뿐만 아니라 중독에 의해 유도된 신장병 질환, 당뇨성 및 비-당뇨성 신장 질환, 신우신염, 낭성 신장, 신장경화증, 고혈압성 신장경화증, 콩팥 증후군의 예방 및/또는 치료를 위한 의약으로서의 본 발명의 융합 폴리펩티드의 용도에 관한 것이고, 이들은 크레아티닌 소거 및/또는 수분 배설에서의 비정상적인 감소, 요소, 질소, 칼륨 및/또는 크레아티닌의 혈액 농도의 비정상적인 증가, 신장 효소, 예컨대 글루타밀신테타제(glutamylsynthetase)의 활성, 소변 오스몰농도 및 소변 부피의 변경, 증가된 미세알부민뇨, 거대알부민뇨, 사구체성 및 세동맥성 병변, 세뇨관 확장, 고인산혈증 및/또는 투석 요구를 특징으로 하고, 진단적으로 이와 연관된다.
또한, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 불완전한 신장 절제 후의 신장 암종, 이뇨제 남용 후의 탈수, 악성 고혈압으로의 제어되지 않은 혈압 증가, 요로 폐쇄 및 감염, 아밀로이드증, 뿐만 아니라 사구체 손상과 연관된 전신 질환, 예컨대 홍반성 루푸스, 및 류머티스성 면역학적 전신 질환, 뿐만 아니라 신장 동맥 협착증, 신장 동맥 혈전증, 신장 정맥 혈전증, 진통제에 의해 유도된 신장병 및 신장 세뇨관 산증의 예방 및/또는 치료를 위한 의약으로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 조영제 및 약물에 의해 유도된 급성 및 만성 간질성 신장 질환, 대사 증후군 및 이상지질혈증의 예방 및/또는 치료를 위한 의약으로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 급성 및/또는 만성 신장 질환과 연관된 후유증, 예컨대 폐 부종, 심부전, 요독증, 빈혈, 전해질 장애 (예를 들어 고칼륨혈증, 저나트륨혈증), 뿐만 아니라 뼈 및 탄수화물 대사의 예방 및/또는 치료를 위한 의약으로서의 본 발명의 융합 폴리펩티드의 용도를 포함한다.
폐 질환
추가로, 본 발명에 따른 융합 단백질은 폐 질환, 특히 천식 장애, 폐 동맥 고혈압 (PAH) 및 기타 형태의 폐 고혈압 (PH) (좌심 질환 포함), HIV, 겸상 적혈구 빈혈, 혈전색전증 (CTEPH), 사르코이드증, COPD 또는 폐 섬유증-연관 폐 고혈압, 만성-폐쇄성 폐 질환 (COPD), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 급성 폐 손상 (ALI), 알파-1-항트립신 결핍 (AATD), 폐 섬유증, 폐 기종 (예를 들어, 담배 연기에 의해 유도된 폐 기종) 및 낭성 섬유증 (CF)의 치료 및/또는 예방에 또한 적절하다.
섬유증 장애
본 발명에 따른 융합 단백질은, 예를 들어 폐, 심장, 신장, 골수, 특히 간과 같은 내부 기관의 섬유증 장애, 그리고 또한 피부성 섬유증 및 섬유증 눈 장애의 치료 및/또는 예방에 또한 적절하다. 본 발명의 문맥에서, 섬유증 장애라는 용어에는 특히 하기의 용어들이 포함된다: 간 섬유증, 간 경변, 폐 섬유증, 심내막심근 섬유증, 신장병, 사구체신염, 간질성 신장 섬유증, 당뇨병으로부터 초래된 섬유증 손상, 골수 섬유증 및 유사 섬유증 장애, 경피증, 국소피부경화증, 켈로이드, 비후성 흉터형성 (또한 외과 시술 후의 것), 모반, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체망막병증 및 결합 조직의 장애 (예를 들어 사르코이드증).
암
암은 일군의 세포가 제어되지 않은 성장을 나타내는 질환이다. 일반적으로 암은 상피 세포로부터 유래된 암인 암종 (이러한 군에는 유방, 전립선, 폐 및 결장의 암이 포함되는 다수의 가장 통상적인 암이 포함된다); 결합 조직 또는 중간엽 세포로부터 유래되는 육종; 조혈 세포로부터 유래되는 림프종 및 백혈병; 다능성 세포로부터 유래되는 생식 세포 종양; 및 미성숙 "전구체" 또는 배아 조직으로부터 유래되는 암인 모세포종으로 분류된다.
본 발명은 장애, 특히 상기 언급된 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 의약을 제조하기 위한 본 발명의 융합 단백질의 용도를 또한 제공한다.
본 발명은 유효량의 하나 이상의 본 발명의 융합 단백질을 사용하는, 장애, 특히 상기 언급된 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 관상동맥 심장 질환, 급성 관상동맥 증후군, 심부전, 및 심근경색의 치료 및/또는 예방을 위한 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질을 또한 제공한다.
제약 조성물 및 투여
본 발명은 약리학상 허용되는 비히클 내의 릴랙신 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물을 또한 제공한다. 릴랙신 융합 단백질은 전신성으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 정맥내, 복막내, 동맥내, 비강내, 흡입, 경구, 피하 투여, 국소 주사 또는 수술에 의한 이식물 형태를 포함하지만 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 임의의 적합한 투여 방식을 사용할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 융합 폴리펩티드를 단독으로 또는 하나 이상의 다른 작용제, 예컨대 안정화 화합물과 조합하여 포함할 수 있는 제약 조성물에 또한 관련되고, 이는 염수, 완충 염수, 덱스트로스 및 물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 무균성, 생체적합성 제약 담체 내에서 투여될 수 있다. 이러한 분자들 중 임의의 것이 부형제(들) 또는 제약상 허용되는 담체와 혼합되는 제약 조성물에서 단독으로 다른 작용제, 약물 또는 호르몬과 조합되어 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체는 제약상 불활성이다.
본 발명은 제약 조성물의 투여에 또한 관련된다. 이같은 투여는 경구적으로 또는 비경구적으로 달성된다. 비경구 전달 방법에는 국소, 동맥내, 근육내, 피하, 척수내, 수막강내, 뇌실내, 정맥내, 복막내 또는 비강내 투여가 포함된다. 활성 성분에 더하여, 이러한 제약 조성물은 제약상 사용될 수 있는 제제 내로 활성 화합물이 프로세싱되는 것을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적절한 제약상 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 제형 및 투여를 위한 기술에 대한 추가적인 상세사항을 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.)]의 최신판에서 확인할 수 있다.
경구 투여에 적절한 투여량으로 당업계에 주지된 제약상 허용되는 담체를 사용하여 경구 투여용 제약 조성물을 제형할 수 있다. 이같은 담체는 제약 조성물이 환자가 섭취하기 위한 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형될 수 있게 한다.
비경구 투여용 제약 제형에는 활성 화합물의 수용액이 포함된다. 주사용으로, 본 발명의 제약 조성물이 수용액, 바람직하게는 생리학적으로 상용성인 완충제, 예컨대 행크 용액, 링거 용액 또는 생리학적 완충 염수 내의 수용액에서 제형될 수 있다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 추가적으로, 활성 화합물의 현탁액이 적합한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적절한 친지성 용매 또는 비히클에는 지방유, 예컨대 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜이 포함된다. 임의로, 현탁액은 고도로 농축된 용액의 제조를 허용하도록 적절한 안정화제 또는 화합물의 용해도를 증가시키는 작용제를 또한 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 단독으로, 또는 필요한 경우 다른 활성 화합물과 조합되어 사용될 수 있다. 본 발명은 하나 이상의 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드 및 하나 이상의 추가적인 활성 성분, 특히 상기 언급된 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 것을 포함하는 의약을 또한 제공한다.
조합하기 위한 적절한 활성 성분은, 예를 들어 그리고 바람직하게는 하기와 같다: 지질 대사를 조정하는 활성 성분, 항-당뇨병제, 강압제, 관류-강화 및/또는 항혈전 작용제, 항산화제, 케모카인 수용체 길항제, p38-키나제 억제제, NPY 효능제, 오렉신 효능제, 식욕억제제, PAF-AH 억제제, 소염제 (COX 억제제, LTB4-수용체 길항제), 진통제, 예를 들어 아스피린, 항우울제 및 기타 향정신제.
본 발명은 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드 중 하나 이상과 하나 이상의 지질 대사를 변경시키는 활성 성분, 항당뇨병제, 혈압을 저하시키는 활성 성분 및/또는 항혈전 효과가 있는 작용제의 조합물에 특히 관련된다.
바람직하게는 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드가 하기의 것들 중 하나 이상과 조합될 수 있다:
ㆍ 지질 대사를 조정하는 활성 성분, 예를 들어 그리고 바람직하게는 HMG-CoA 리덕타제 억제제, HMG-CoA 리덕타제 발현 억제제, 스쿠알렌 합성 억제제, ACAT 억제제, LDL 수용체 유도제, 콜레스테롤 흡수 억제제, 중합체성 담즙산 흡착제, 담즙산 재흡수 억제제, MTP 억제제, 리파제(lipase) 억제제, LpL 활성화제, 피브레이트, 니아신, CETP 억제제, PPAR-α, PPAR-γ 및/또는 PPAR-δ 효능제, RXR 조정제, FXR 조정제, LXR 조정제, 갑상선 호르몬 및/또는 갑상선 모방체, ATP 시트레이트 리아제(lyase) 억제제, Lp(a) 길항제, 카나비노이드 수용체 1 길항제, 렙틴 수용체 효능제, 봄베신 수용체 효능제, 히스타민 수용체 효능제 및 항산화제/라디칼 스캐빈저(scavenger)의 군으로부터의 이러한 활성 성분;
ㆍ 문헌 [Rote Liste 2004/II, chapter 12]에서 언급된 항당뇨병제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 술포닐우레아, 비구아니드, 메글리티니드 유도체, 글루코시다제(glucosidase) 억제제, 디펩티딜-펩티다제 IV의 억제제 (DPP-IV 억제제), 옥사디아졸리디논, 티아졸리딘디온, GLP 1 수용체 효능제, 글루카곤 길항제, 인슐린 민감화제, CCK 1 수용체 효능제, 렙틴 수용체 효능제, 글루코스신합성 및/또는 글리코겐분해의 자극에서 수반되는 간 효소의 억제제, 글루코스 흡수 조정제 및 또한 칼륨 채널 개방제, 예컨대 WO 97/26265 및 WO 99/0386에 개시된 것의 군으로부터의 항당뇨병제;
ㆍ 강압 활성 성분, 예를 들어 그리고 바람직하게는 칼슘 길항제, 안지오텐신 AII 길항제, ACE 억제제, 레닌 억제제, 베타-수용체 차단제, 알파-수용체 차단제, 알도스테론 길항제, 광질 코르티코이드 수용체 길항제, ECE 억제제, ACE/NEP 억제제 및 바소펩티다제(vasopeptidase) 억제제의 군으로부터의 강압 활성 성분; 및/또는
ㆍ 항혈전 작용제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 혈소판 응집 억제제 또는 항응고제의 군으로부터의 항혈전 작용제;
ㆍ 이뇨제;
ㆍ 바소프레신 수용체 길항제;
ㆍ 유기 질산염 및 NO 도너(donor);
ㆍ 양성 수축력 활성이 있는 화합물;
ㆍ 고리형 구아노신 모노포스페이트 (cGMP) 및/또는 고리형 아데노신 모노포스페이트 (cAMP)의 분해를 억제하는 화합물, 예를 들어 포스포디에스테라제(phosphodiesterase) (PDE) 1, 2, 3, 4 및/또는 5의 억제제, 특히 PDE 5 억제제, 예컨대 실데나필, 바르데나필 및 타다라필, 및 또한 PDE 3 억제제, 예컨대 밀리논;
ㆍ 나트륨뇨배설 펩티드, 예를 들어 "심방 나트륨뇨배설 펩티드" (ANP, 아나리타이드), "B형 나트륨뇨배설 펩티드" 또는 "뇌 나트륨뇨배설 펩티드" (BNP, 네시리타이드), "C형 나트륨뇨배설 펩티드" (CNP) 및 또한 유로딜라틴;
ㆍ 프로스타사이클린 수용체 (IP 수용체)의 효능제, 예를 들어 일로프로스트, 베라프로스트, 시카프로스트;
ㆍ If (퍼니 채널(funny channel)) 채널의 억제제, 예를 들어 이바브라딘;
ㆍ 칼슘 민감화제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 레보시멘단;
ㆍ 칼륨 보충제;
ㆍ 특히 WO 00/06568, WO 00/06569, WO 02/42301 및 WO 03/095451에 기술된 화합물과 같은, 구아닐레이트 사이클라제(cyclase)의 NO-비의존적이지만 헴(heme)-의존적인 자극제;
ㆍ 특히 WO 01/19355, WO 01/19776, WO 01/19778, WO 01/19780, WO 02/070462 및 WO 02/070510에 기술된 화합물과 같은, 구아닐레이트 사이클라제의 NO- 및 헴-비의존적 활성화제;
ㆍ 인간 호중구 엘라스타제 (HNE)의 억제제, 예를 들어 시벨레스탯 및 DX-890 (렐트란(Reltran));
ㆍ 신호 전달 케스케이드를 억제하는 화합물, 예를 들어 티로신-키나제 억제제, 특히 소라페닙, 이매티닙, 제피티닙 및 에를로티닙; 및/또는
ㆍ 심장의 에너지 대사를 조정하는 화합물, 예를 들어 에토목시르, 디클로로아세테이트, 라놀라진 및 트리메타지딘.
지질 대사를 변형시키는 활성 성분은, 바람직하게는, HMG-CoA 리덕타제 억제제, 스쿠알렌 합성 억제제, ACAT 억제제, 콜레스테롤 흡수 억제제, MTP 억제제, 리파제 억제제, 갑상선 호르몬 및/또는 갑상선 모방체, 니아신 수용체 효능제, CETP 억제제, PPAR-α 효능제, PPAR-γ 효능제, PPAR-δ 효능제, 중합체성 담즙산 흡착제, 담즙산 재흡수 억제제, 항산화제/라디칼 스캐빈저 및 또한 카나비노이드 수용체 1 길항제의 군으로부터의 화합물을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드는 스타틴 부류, 예를 들어 그리고 바람직하게는 로바스타틴, 심바스타틴, 프라바스타틴, 플루바스타틴, 아토르바스타틴, 로수바스타틴 또는 피타바스타틴으로부터의 HMG-CoA 리덕타제 억제제와 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드는 스쿠알렌 합성 억제제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 BMS-188494 또는 TAK-475와 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드는 ACAT 억제제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 아바시미브, 멜리나미드, 팍티미브, 에플루시미브 또는 SMP-797과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 콜레스테롤 흡수 억제제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 에제티미브, 티퀘시드 또는 파마퀘시드와 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 MTP 억제제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 임플리타피드, BMS-201038, R-103757 또는 JTT-130과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 리파제 억제제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 오를리스탯과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 갑상선 호르몬 및/또는 갑상선 모방체, 예를 들어 그리고 바람직하게는 D-티록신 또는 3,5,3'-트리아이오도티로닌 (T3)과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 니아신 수용체의 효능제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 니아신, 아시피목스, 아시프란 또는 라데콜과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 CETP 억제제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 달세트라핍, BAY 60-5521, 아나세트라핍 또는 CETP 백신 (CETi-1)과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 PPAR-γ 효능제, 예를 들어 티아졸리딘디온 부류로부터의 것, 예를 들어 그리고 바람직하게는 피오글리타존 또는 로시글리타존과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 PPAR-δ 효능제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 GW-501516 또는 BAY 68-5042와 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 중합체성 담즙산 흡착제,예를 들어, 그리고 바람직하게는 콜레스티라민, 콜레스티폴, 콜레솔밤, 콜레스타겔(CholestaGel) 또는 콜레스티미드와 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 담즙산 재흡수 억제제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 ASBT (= IBAT) 억제제, 예컨대 AZD-7806, S-8921, AK-105, BARI-1741, SC-435 또는 SC-635와 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 항산화제/라디칼 스캐빈저, 예를 들어 그리고 바람직하게는 프로부콜, AGI-1067, BO-653 또는 AEOL-10150과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 카나비노이드 수용체 1 길항제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 리모나반트 또는 SR-147778과 조합되어 투여된다.
항당뇨병제는, 바람직하게는, 인슐린 및 인슐린 유도체, 및 또한 경구적으로 효과적인 혈당강하 활성 성분을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 여기에서, 인슐린 및 인슐린 유도체에는 동물, 인간 또는 생물공학적 기원의 인슐린 양쪽 모두, 그리고 또한 이들의 혼합물이 포함된다. 경구적으로 효과적인 혈당강하 활성 성분에는 바람직하게는 술포닐우레아, 비구아니드, 메글리티니드 유도체, 글루코시다제 억제제 및 PPAR-감마 효능제가 포함된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 인슐린과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 술포닐우레아, 예를 들어 그리고 바람직하게는 톨부타미드, 글리벤클라미드, 글리메피리드, 글리피지드 또는 글리클라지드와 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 비구아니드, 예를 들어 그리고 바람직하게는 메트포르민과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 메글리티니드 유도체, 예를 들어 그리고 바람직하게는 레파글리니드 또는 나테글리니드와 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 글루코시다제 억제제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 미글리톨 또는 아카르보스와 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 DPP-IV 억제제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 시타글립틴 및 빌다글립틴과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 PPAR-감마 효능제, 예를 들어 티아졸리딘디온 부류로부터의 것, 예를 들어 그리고 바람직하게는 피오글리타존 또는 로시글리타존과 조합되어 투여된다.
강압제는, 바람직하게는, 칼슘 길항제, 안지오텐신 AII 길항제, ACE 억제제, 베타-수용체 차단제, 알파-수용체 차단제 및 이뇨제의 군으로부터의 화합물을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 칼슘 길항제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 니페디핀, 암로디핀, 베라파밀 또는 딜티아젬과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 안지오텐신 AII 길항제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 로사르탄, 발사르탄, 칸데사르탄, 엠부사르탄, 올메사르탄 또는 텔미사르탄과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 ACE 억제제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 에날라프릴, 카프토프릴, 리시노프릴, 라미프릴, 델라프릴, 포시노프릴, 퀴노프릴, 페린도프릴 또는 트란도프릴과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 베타-수용체 차단제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 프로프라놀롤, 아테놀롤, 티몰롤, 핀돌롤, 알프레놀롤, 옥사프레놀롤, 펜부톨롤, 부프라놀롤, 메티프라놀롤, 나돌롤, 메핀돌롤, 카라잘롤, 소탈롤, 메토프롤롤, 베탁솔롤, 셀리프롤롤, 비소프롤롤, 카르테올롤, 에스몰롤, 라베탈롤, 카르베딜롤, 아다프롤롤, 란디올롤, 네비볼롤, 에파놀롤 또는 부신돌롤과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 알파-수용체 차단제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 프라조신과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 이뇨제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 푸로세미드, 부메타니드, 토르세미드, 벤드로플루메티아지드, 클로로티아지드, 히드로클로로티아지드, 히드로플루메티아지드, 메티클로티아지드, 폴리티아지드, 트리클로로메티아지드, 클로로탈리돈, 인다파미드, 메톨라존, 퀸타존, 아세타졸라미드, 디클로로페나미드, 메타졸라미드, 글리세롤, 이소소르비드, 만니톨, 아밀로리드 또는 트리암테렌과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 알도스테론 또는 광질 코르티코이드 수용체 길항제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 스피로노락톤 또는 에플레레논과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 바소프레신 수용체 길항제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 코니밥탄, 톨밥탄, 릭시밥탄 또는 SR-121463과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 유기 질산염 또는 NO 도너, 예를 들어 그리고 바람직하게는 소듐 니트로프루시드, 니트로글리세롤, 이소소르비드 모노니트레이트, 이소소르비드 디니트레이트, 몰시도민 또는 SIN-1과 조합되어, 또는 흡입성 NO와 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 양성 수축력 화합물, 예를 들어 그리고 바람직하게는 심장 글리코시드 (디곡신), 베타-아드레날린성 및 도파민성 효능제, 예컨대 이소프로테레놀, 아드레날린, 노르아드레날린, 도파민 또는 도부타민과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 항교감신경강장제(antisympathotonic), 예컨대 레세르핀 또는 알파-메틸도파와 조합되어, 또는 칼륨 채널 효능제, 예컨대 미녹시딜, 디아족시드, 디히드랄라진 또는 히드랄라진과 조합되어, 또는 산화질소를 방출하는 물질, 예컨대 글리세롤 니트레이트 또는 소듐 니트로프루시드와 조합되어 투여된다.
항혈전제는, 바람직하게는, 혈소판 응집 억제제 또는 항응고제의 군으로부터의 화합물을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 혈소판 응집 억제제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 아스피린, 클로피도그렐, 티클로피딘 또는 디피리다몰과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 트롬빈 억제제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 자이멜라가트란, 멜라가트란, 다비가트란, 비발리루딘 또는 클렉산과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 GPIIb/IIIa 길항제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 티로피반 또는 압식시맙과 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 Xa 인자 억제제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 리바록사반 (BAY 59-7939), DU-176b, 아픽사반, 오타믹사반, 피덱사반, 라작사반, 폰다파리눅스, 이드라파리눅스, PMD-3112, YM-150, KFA-1982, EMD-503982, MCM-17, MLN-1021, DX 9065a, DPC 906, JTV 803, SSR-126512 또는 SSR-128428와 조합되어 투여되고, 단 PCS는 Xa 인자 절단 부위가 아니다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 헤파린 또는 저분자량 (LMW) 헤파린 유도체와 조합되어 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 비타민 K 길항제, 예를 들어 그리고 바람직하게는 쿠마린과 조합되어 투여된다.
본 발명의 문맥에서, 본 발명에 따른 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하고, 또한 HMG-CoA 리덕타제 억제제 (스타틴), 이뇨제, 베타-수용체 차단제, 유기 질산염 및 NO 도너, ACE 억제제, 안지오텐신 AII 길항제, 알도스테론 및 광질 코르티코이드 수용체 길항제, 바소프레신 수용체 길항제, 혈소판 응집 억제제 및 항응고제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 활성 성분을 포함하는 조합물이 특히 바람직하고, 상기 언급된 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 이의 용도가 또한 특히 바람직하다.
본 발명은 일반적으로는 하나 이상의 불활성이고 비독성인 제약상 적절한 보조제와 함께 하나 이상의 본 발명에 따른 융합 단백질을 포함하는 의약을 또한 제공하고, 상기 언급된 목적을 위한 이의 용도도 또한 제공한다.
치료적 유효 용량
본 발명에서 사용하기에 적절한 제약 조성물에는 의도되는 목적, 예를 들어 심부전을 달성하는 유효량으로 활성 성분이 함유된 조성물이 포함된다. 유효 용량의 결정은 충분히 당업자의 능력 내에 속한다.
임의의 화합물에 대해, 치료적 유효 용량이 초기에 시험관내 검정법, 예를 들어 LGR7 수용체 활성화에서, 단리된 관류된 래트 심장에서 생체 외에서, 또는 동물 모델, 일반적으로는 마우스, 토끼, 개 또는 돼지에서 추정될 수 있다. 동물 모델은 원하는 농도 범위 및 투여 경로를 달성하는데 또한 사용된다. 그 후, 이같은 정보를 사용하여 인간에서의 투여에 대한 유용한 용량 및 경로를 결정할 수 있다.
치료적 유효 용량은 증상 또는 용태를 호전시키는 융합 단백질의 양을 지칭한다. 이같은 화합물의 치료 효능 및 독성, 예를 들어 ED50 (집단의 50％에서 치료적으로 효과적인 용량) 및 LD50 (집단의 50％에 대해 치사성인 용량)을 표준 제약 절차에 의해 시험관 내에서 또는 실험 동물에서 결정할 수 있다. 치료 효과와 독성 효과 사이의 용량 비가 치료 지수이고, 이는 ED50/LD50 비로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 제약 조성물이 바람직하다. 시험관내 검정법 및 동물 연구로부터 수득된 데이터가 인간 용도에 대한 투여량 범위를 제형하는데 사용된다. 바람직하게는 이같은 화합물의 투여량은 독성이 없거나 거의 없이 ED50를 포함하는 순환 농도의 범위 내에 속한다. 투여량은 사용된 투여 형태, 환자의 민감도, 및 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 변한다.
일반적인 투여량은 투여 경로에 따라 0.1 내지 100,000 ㎎의 총 용량에서 변할 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 관한 지침이 문헌에서 제공된다. 미국 특허 번호 4,657,760; 5,206,344; 또는 5,225,212 참조. 당업자는 폴리뉴클레오티에 대해 단백질 또는 이의 억제제에 대한 것과 상이한 제형을 사용할 것이다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전달은 특정 세포, 용태, 위치 등에 특이적일 것이다.
하기 실시예에 의해 본 발명이 추가로 기술된다. 실시예는 단지 특정 실시양태를 참조로 본 발명을 설명하기 위해서 제공된다. 이러한 실례들은 본 발명의 특정한 구체적인 측면을 설명하는 한편, 개시된 발명의 제한을 묘사하거나 이의 범주를 제한하지 않는다.
상세하게 달리 기술된 경우를 제외하고, 모든 실시예는 당업자에게 주지되어 있고 당업자에게 일상적인 표준 기술을 사용하여 수행되었다. 하기 실시예의 일상적인 분자 생물학 기술은 표준 실험 설명서, 예컨대 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
추가적인 바람직한 실시양태는 하기의 것들이다:
1. 릴랙신-PCS-HEM 또는 HEM-PCS-릴랙신을 포함하며,
여기서 릴랙신은 릴랙신 A 사슬 폴리펩티드 또는 이의 기능성 변이체, 및 릴랙신 B 사슬 폴리펩티드 또는 이의 기능성 변이체를 포함하고,
PCS는 엔도-프로테아제 절단 부위를 포함하며,
HEM은 단백질성 반감기 연장 모이어티인,
융합 단백질.
2. 프로릴랙신-PCS-HEM 또는 HEM-PCS-프로릴랙신을 포함하며,
여기서 프로릴랙신은 릴랙신 A 사슬 폴리펩티드 또는 이의 기능성 변이체, 릴랙신 C-사슬 폴리펩티드 및 릴랙신 B 사슬 폴리펩티드 또는 이의 기능성 변이체를 포함하고,
PCS는 엔도-프로테아제 절단 부위를 포함하며,
HEM은 단백질성 반감기 연장 모이어티인,
융합 폴리펩티드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, PCS가 세포외 엔도-프로테아제의 절단 부위인 융합 단백질 또는 폴리펩티드.
4. 제3항에 있어서, 엔도-프로테아제가 내인성 엔도-프로테아제인 융합 단백질 또는 폴리펩티드.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 엔도-프로테아제가 심장, 간, 신장 또는 폐에서 발현되는 엔도-프로테아제인 융합 단백질 또는 폴리펩티드.
6. 제3항에 있어서, 엔도-프로테아제가, 이의 촉매 활성이 막의 세포외 측면 상에 있는 막-결합 또는 막-스패닝된 프로테아제인 융합 단백질 또는 폴리펩티드.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도-프로테아제가 표 1에 표시된 엔도프로테아제의 군으로부터 선택되는 것인 융합 단백질 또는 폴리펩티드.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, PCS가 표 1에 표시된 PCS의 군으로부터 선택되는 것인 융합 단백질 또는 폴리펩티드.
9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도-프로테아제가 Xa 인자, 트립신, MMP2, MMP9, MMP12, 레닌, 엘라스타제 및 키마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 융합 단백질 또는 폴리펩티드.
10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도-프로테아제가 인간형인 융합 단백질 또는 폴리펩티드.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, PCS가 IleGluGlyArgMetAsp (FXa 절단 부위), RAKRFASL (MMP9 절단 부위), INARVSTI (트립신 절단 부위), RVGFYESD (키마제 절단 부위) 및 GLRVGFYE (엘라스타제 절단 부위)로 이루어진 서열 군에 포함되는 서열을 갖는 것인 융합 단백질 또는 폴리펩티드.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, PCS의 N-말단 및/또는 C-말단에 신장기 폴리펩티드가 있는 것인 융합 단백질 또는 폴리펩티드.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질성 반감기 연장 모이어티가 이뮤노글로불린 Fc 도메인, 혈청 알부민, 트랜스페린 및 혈청 알부민 결합 단백질로 이루어진 단백질성 반감기 연장 모이어티의 군에 포함되는 것인 융합 폴리펩티드.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질성 반감기 연장 모이어티가 IgG1 Fc 도메인인 융합 폴리펩티드.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질성 반감기 연장 모이어티가 인간형인 융합 폴리펩티드.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 릴랙신 A 사슬이 인간 릴랙신 2 A 사슬이고, 릴랙신 B 사슬이 인간 릴랙신 2 B 사슬인 융합 폴리펩티드.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 폴리펩티드가 프로릴랙신-PCS-HEM인 융합 폴리펩티드.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 폴리펩티드가 릴랙신-PCS-HEM인 융합 단백질.
19. 제2항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 프로릴랙신-PCS-HEM 또는 HEM-PCS-프로릴랙신 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
20. 제19항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
21. 제20항에 따른 벡터 또는 제17항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
22. 프로호르몬 컨버타제 활성을 추가로 포함하는 제21항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 단백질을 단리하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 릴랙신-PCS-HEM 또는 HEM-PCS-릴랙신 단백질을 생산하는 방법.
23. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 릴랙신-PCS-HEM 또는 HEM-PCS-릴랙신 단백질을 포함하는 제약 조성물.
24. 의약으로서의 제23항에 따른 제약 조성물 또는 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 릴랙신-PCS-HEM 또는 HEM-PCS-릴랙신 단백질.
25. 심혈관 질환, 폐 질환, 섬유증 장애 또는 신장 질환의 치료를 위한 의약으로서의 제23항 또는 제24항에 따른 제약 조성물 또는 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 릴랙신-PCS-HEM 또는 HEM-PCS-릴랙신 단백질.
26. 치료적 유효 용량의 제23항 또는 제24항에 따른 제약 조성물 또는 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 릴랙신-PCS-HEM 또는 HEM-PCS-릴랙신 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 질환, 폐 질환, 섬유증 장애 또는 신장 질환을 치료하는 방법.
27. 심혈관 질환이 관상동맥 심장 질환, 급성 관상동맥 증후군, 심부전, 또는 심근경색의 군에 포함되는 것인 제25항 또는 제26항에 따른 치료.
실시예
실험 프로토콜
릴랙신 - Fc 융합 단백질의 구축:
릴랙신 변이체의 cDNA 서열이 화학적 유전자 합성에 의해 생성되었다. 합성된 유전자를 포유동물 발현 벡터 pCEP4 (인비트로젠(Invitrogen), 카탈로그 번호 V044-50) 내로 서브클로닝하였다. 생성된 단백질의 정확한 분비를 위한 신호 리더 서열로서, LDL 수용체-관련 단백질 (LRP, 아미노산 조성 MLTPPLLLLLPLLSALVAA) 또는 CD33 (아미노산 조성 MPLLLLLPLLWAGALA)의 리더 서열을 사용하였다. 합성된 구축물의 서브클로닝을 위해, 제한 효소 HindIII 및 BamH1을 제조사의 설명서에 따라 사용하였다.
혈장 반감기를 개선하기 위해, 인간 IgG1의 Fc 부분을 화학-기반 유전자 합성에 의해 인간 릴랙신 2와 조합하였다. 인간 릴랙신 2의 카르복시-말단 부분 (하기와 같이 배열된 이의 게놈 구성에 따름: B 사슬 - C 사슬 - A 사슬)을 인간 IgG1 Fc 모이어티의 N 말단 끝부분에 융합함으로써, 응고 인자 Xa 절단 부위를 코딩하는 IleGluGlyArgMetAsp 서열의 폴리펩티드로 이루어진 아미노산 6개 길이의 링커 서열에 의해 융합 단백질의 이러한 2개의 부분이 연결되었다.
이러한 프로릴랙신-Fc 융합물의 서열은 하기와 같다 (단백질: 서열 1: 뉴클레오티드 서열: 서열 17):
Figure pct00002
프로-호르몬 컨버타제에 의해 절단되는 C-사슬 서열은 소문자로 표기된다. FXa 절단 부위는 밑줄친 볼드체 문자로 표시된다.
폴리펩티드의 생물학적 반감기를 개선하기 위한 또 다른 선택권은 트랜스페린 (접속 번호 P02787) 또는 알부민 (접속 번호 P02768)과 같은 폴리펩티드와의 융합이다. (문헌 [SR Schmid (2009)]).
또 다른 선택권은 FXa에 대한 것 이외의 다른 프로테아제 절단 부위, 예를 들어 표 1에 열거된 절단 부위를 사용하는 것이다.
MMP9 절단 부위를 나타내는 릴랙신-융합 1 구축물은 서열 13 (폴리펩티드) 및 서열 29의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
키마제 절단 부위를 나타내는 릴랙신-융합 2 구축물은 서열 14 (폴리펩티드) 및 서열 30의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
트립신 절단 부위를 나타내는 릴랙신-융합 3 구축물은 서열 15 (폴리펩티드) 및 서열 31의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
엘라스타제 절단 부위를 나타내는 릴랙신-융합 4 구축물은 서열 16 (폴리펩티드) 및 서열 32의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
릴랙신 Fc 융합 단백질의 발현:
소규모 발현 (2 ㎖ 이하의 배양 부피)을 위해, HEK293 (ATCC, 카탈로그 번호 CRL-1573) 세포를 리포펙타민(Lipofectamine)2000 형질감염 시약 (인비트로젠, 카탈로그 번호 11668-019)을 제조사의 설명서에 따라 사용하여 릴랙신-Fc 융합 구축물을 코딩하는 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 릴랙신의 정확한 프로세싱을 위해, 세포를 인간 프로호르몬 컨버타제 1 (접속 번호 NP_000430.3)을 코딩하는 발현 벡터로 공동-형질감염시켰다. 5％ 이산화탄소, 37℃의 습식 인큐베이터에서 세포를 D-Mem F12 (깁코(Gibco), #31330), 1％ 페니실린-스트렙토마이신 (깁코, #15140) 및 10％ 송아지 태아 혈청 (FCS, 깁코, #11058) 내에서 배양하였다.
형질감염하고 나서 3일 내지 5일 후, 형질감염된 세포의 컨디셔닝 배지를 안정적으로 형질감염된 CHO-CRE-GR7 세포주를 사용하여 활성에 대해 테스트하였다.
대규모 발현 (10 ㎖ 이상의 배양 부피)을 위해, 문헌 [Tom et al., 2007]에 기술된 바와 같이 포유동물 세포에서 구축물을 일시적으로 발현시켰다. 간략하게, 발현 플라스미드를 HEK293-6E 세포 내로 형질감염시키고, 페른바흐-플라스크(Fernbach-Flask) 또는 웨이브-백(Wave-Bag)에서 인큐베이션하였다. F17 배지 (인비트로젠)에서 5일 내지 6일 동안 37℃에서 발현시켰다. 형질감염 후 5 g/ℓ 트립톤 TN1 (오르가노테크니에(Organotechnie)), 1％ 울트라-로우(Ultra-Low) IgG FCS (인비트로젠) 및 0.5 mM 발프로산 (시그마(Sigma))를 보충하였다.
릴랙신 Fc 융합 단백질의 정제:
릴랙신 Fc-융합 구축물을 포유동물 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 원심분리에 의해 제1 상청액을 세포 잔해물로부터 정화하였다. 단백질 A (맵셀렉트 슈어(MabSelect Sure), 지이 헬스케어(GE Healthcare)) 친화력 크로마토그래피에 이어서 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 단백질을 정제하였다. 따라서, 상청액을 PBS pH 7.4 (시그마/알드리치(Aldrich))에서 미리 평형화된 단백질 A 칼럼에 적용하고, 10 칼럼 부피의 PBS pH 7.4 + 500 mM NaCl로 오염물질을 제거하였다. 릴랙신 Fc 융합 구축물을 50 mM 아세트산나트륨 pH 3.5 + 500 mM NaCl로 용출시키고, PBS pH 7.4 내의 슈퍼덱스(Superdex) 200 칼럼 상에서 SEC로 추가로 정제하였다.
발현된 릴랙신 - Fc 융합 단백질의 정량:
분비 및 정제된 재조합 릴랙신 변이체의 정량을 위해, 시판되는 정량 ELISA (R&D 시스템즈, 인간 릴랙신-2 퀀티카인 ELISA 키트, 카탈로그 번호 DRL200)를 제조사의 설명서에 따라 사용하였다.
또한, 일부 구축물에 대해, FC-ELISA를 사용하여 단백질을 정량하였다. Fc ELISA를 위해, 96웰 미량역가 플레이트 (눈크(Nunc), 맥시 소프 블랙(Maxi Sorp black), 카탈로그 번호 460918)를 철야로 4℃에서 5 ㎍/㎖의 농도로 항-Fc 항체 (시그마알드리치(SigmaAldrich), 카탈로그 번호 A2136)로 코팅하였다. PBS 및 0.05％ 트윈(Tween) 20 (시그마알드리치, 카탈로그 번호 63158) 완충제로 이루어진 완충제를 웰 당 50 ㎕로 사용함으로써 플레이트를 1회 세정하였다. 30 ㎕의 차단 완충제 (캔더 바이오사이언스(Candor Bioscience), 카탈로그 번호 113500)를 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 50 ㎕/웰의 PBS/0.05％ 트윈 20 완충제를 사용하여 플레이트를 3회 세정하였다. 샘플을 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 필요하다면, 상기 언급된 차단 완충제를 사용하여 샘플을 희석하여야 한다. 인큐베이션 후, 50 ㎕/웰의 PBS/0.05％ 트윈 20 완충제를 사용하여 플레이트를 3회 세정하였다.
검출하기 위해, 30 ㎕의 10％ 차단 완충제에 1:10000 희석된 항-h-Fc-POD (시그마알드리치, 카탈로그 번호 A0170)를 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 50 ㎕/웰의 PBS/0.05％ 트윈 20 완충제로 플레이트를 3회 세정하였다. 30 ㎕의 BM 블루 기질(Blue Substrate) POD (로슈 디아그노스틱스(Roche Diagnostics), 카탈로그 번호 11484281001)를 첨가하고, 5분 인큐베이션 후, 1 몰농도의 황산 용액을 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 테칸 인피니트(Tecan Infinite) 500 판독기, 흡광 양식, 흡광 450 nm, 방출 690 nm를 사용하여흡광도를 측정하였다.
활성 테스트:
CHO K1 세포 (ATCC, 카탈로그 번호 CCL-61)를 고리형 AMP 반응 요소 (CRE) 루시퍼라제 리포터 유전자 구축물 (바이오믹스 테크놀러지(Biomyx Technology), pHTS-CRE, 카탈로그 번호 P2100)로 일시적으로 형질감염시켜, CHO-CRE-루시퍼라제 세포주가 생성되었다.
이어서, 이러한 세포주를 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1(-) (인비트로젠, 카탈로그 번호 V79520) 내로 염기쌍 2271개 길이의 DNA 단편으로서 클로닝된 인간 LGR7/RXFP1 수용체 (접속 번호 NM_021634.2)로 안정적으로 형질감염시켜, CHO-CRE-LGR7 세포주가 생성되었다. 이러한 세포주를 D-Mem F12 (깁코, #31330), 2 mM 글루타맥스(Glutamax) (깁코, #35050), 100 nM 피루베이트 (깁코, # 11360-070), 20 mM 헤페스(Hepes) (깁코, # 15630), 1％ 페니실린-스트렙토마이신 (깁코, #15140) 및 10％ 송아지 태아 혈청 (FCS, 깁코, #11058)에서 배양하였다.
자극을 위해, 배지를 상이한 농도 (일반적으로, 100 nM 농도에서 시작한 후, 1:2 희석이 이어짐)의 재조합에 의해 발현된 릴랙신-Fc 융합 단백질을 함유하는 OptiMem (깁코, #11058) + 1％ FCS으로 교환하였다. 양성 대조군으로서, 시판되는 재조합에 의해 발현된 인간 릴랙신 2를 사용하였다 (R&D 시스템즈, 카탈로그 번호 6586-RN-025). 이어서, 세포를 6시간 동안 5％ 이산화탄소, 37℃의 습식 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 6시간 후, 루시퍼라제 검정법 시스템 (프로메가(Promega), # E1500)를 사용하여, 그리고 테칸 인피니트 500 판독기, 발광 양식, 1000 밀리세컨드 통합 시간, 측정 시간 30초를 사용하여 세포를 루시퍼라제 활성에 대해 테스트하였다.
상대적 발광 단위를 사용하여, 컴퓨터 프로그램 그래프패드 프리즘(Graph Pad Prism) 버전 5를 사용함으로써 상이한 분자들의 EC50 값을 결정하였다.
릴랙신, 뿐만 아니라 본 발명의 융합 폴리펩티드의 별법적인 활성 테스트를 위해, LGR7 수용체가 내인성으로 발현되는 세포주 (예를 들어 THP1, ATCC 카탈로그 번호 TIB-202) 또는 1차 세포 (예를 들어 셀프로젠 인크.(Celprogen Inc.), 인간 심근세포 세포 배양물, 카탈로그 번호 36044-15)를 사용하였다. 이러한 세포들을 제조사의 설명서에 따라 배양하였다.
릴랙신 또는 릴랙신-Fc 융합 단백질에 의해 유도된 cAMP 생성을 검출하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. , 예를 들어 cAMP ELISA (예를 들어 IBL 인터내셔널 게엠베하(IBL International GmbH), cAMP ELISA, 카탈로그 번호 CM 581001)를 제조사의 설명서에 따라 사용하여 이같은 측정이 수행된다.
릴랙신 또는 릴랙신-Fc 융합 단백질에 의해 유도된 PI3 키나제 활성화를 검출하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. , 예를 들어 PI3-키나제 HTRF 검정법을 제조사의 설명서 (예를 들어 밀리포어(Millipore), PI3-키나제 HTRF 검정법, 카탈로그 번호 33-016)에 따라 사용하여 이같은 측정이 수행된다.
릴랙신 - Fc 융합 단백질의 프로테아제 처리 및 활성 테스트.
릴랙신-융합 단백질을 발현하는 HEK293 세포의 상청액을 하기와 같이 지시된 상응하는 프로테아제와 함께 인큐베이션하였다:
- 릴랙신-Fc를 발현하는 HEK293 세포의 2 ㎖ 상청액을 1 ㎍의 Xa 인자 프로테아제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 카탈로그 번호 P8010)와 함께 6시간 동안 23℃에서 인큐베이션하였다.
- 릴랙신-융합 2를 발현하는 HEK293 세포의 2 ㎖ 상청액을 0.83 ㎍/㎖ 농도의 키마제 (시그마 알드리치, 카탈로그 번호 C8118)와 함께 6시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
- 릴랙신-융합 3을 발현하는 HEK293 세포의 2 ㎖ 상청액을 10 ㎍/㎖ 농도의 트립신 (시그마 알드리치, 카탈로그 번호 T0303)과 함께 6시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
- 릴랙신-융합 4를 발현하는 HEK293 세포의 2 ㎖ 상청액을 5 ㎍/㎖ 농도의 엘라스타제 (시그마 알드리치, 카탈로그 번호 E7885)와 함께 6시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
- 사용 전에, 프로테아제를 APMA (p-아미노페닐머큐릭 아세테이트; 시그마 알드리치, 카탈로그 번호 A-9563)와 함께 인큐베이션하는 것에 의해 MMP9 (R&D 시스템즈, 카탈로그 번호 911-MP)를 활성화시켜야 한다. 이를 위해, MMP9를 검정법 완충제 (50 mM 트리스(Tris), 10 mM CaCl2, 150 mM NaCl2, 0.05％ Brij35, pH 7,5.)에서 100 ㎍/㎖의 농도 (예를 들어, 최종 부피 100 ㎕ 내의 1 ㎍)로 희석하여야 한다. APMA를 1 mM의 최종 농도 (예를 들어, 최종 부피 100 ㎕ 내의 20 ㎕의 5 mM 모액)로 첨가하였다. 이러한 혼합물을 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 활성화된 MMP9를 릴랙신-융합 1을 발현하는 HEK293 세포의 2 ㎖ 상청액에서 0.4 ng/㎖의 최종 농도로 희석하였다. 활성화된 MMP9와 함께 6시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
릴랙신-Fc 융합 단백질을 발현하는 HEK293 세포의 상청액을 상기 기술된 바와 같이 CHO-CRE-LGR7 세포주를 사용함으로써 활성에 대해 테스트하였다. 양성 대조군으로서, 인간 릴랙신 2를 사용하였다.
릴랙신-Fc 융합 단백질에 대해, 활성이 검출되지 않았다. 대조적으로, 릴랙신-Fc 융합 단백질을 함유하는 상청액의 FXa 인큐베이션 후에, CHO-CRE-LGR7 세포주의 유의한 활성화가 관찰되었다. 이러한 활성이 인간 릴랙신 2 양성 대조군에 대해 수득된 활성보다 낮았지만, 이는 PCS를 사용하는 것으로 방출가능한 활성 릴랙신 분자가 생성되었음을 나타낸다.
샘플 내의 가능한 불순물이 잘못된 농도 결정에 이르거나 또는 세포 기반 루시퍼라제 검정법의 정확성에 음성 영향을 미칠 수 있기 때문에, 정제되지 않은 릴랙신-융합 단백질의 사용이 약간 더 낮은 활성을 설명하는 것이 가능하다.
빈 발현 벡터로 형질감염된 HEK293 세포의 상청액을 사용하는 것은 약 3배만큼 활성 검정법에서의 감소에 이르렀다. 절단되고 기능성인 활성 릴랙신 및 불활성 릴랙신-융합 단백질의 혼합물에 이르는 릴랙신-융합 단백질의 불완전한 절단이 또 다른 설명일 수 있다.
실시예 1: 릴랙신 - Fc
생물학적 반감기를 개선하기 위해, 인간 IgG1의 Fc 부분을 화학-기반 유전자 합성에 의해 인간 릴랙신 2와 조합하였다. 인간 릴랙신 2의 카르복시-말단 부분(하기와 같이 배열된 이의 게놈 구성에 따름: B 사슬 - C 사슬 - A 사슬)을 인간 IgG1 Fc 모이어티의 N 말단 끝부분에 융합함으로써, 응고 인자 Xa 절단 부위를 코딩하는 IleGluGlyArgMetAsp 서열의 폴리펩티드로 이루어진 아미노산 6개 길이의 링커 서열에 의해 융합 단백질의 이러한 2개의 부분이 연결되었다. 릴랙신은 구축물을 상기 기술된 바와 같이 프로테아제 FXa와 함께 인큐베이션한 후에만 CHO-CRE-LGR7 세포주를 사용하는 것에 의한 검출가능한 활성을 나타냈다.
실시예 2: 릴랙신 -융합 1
생물학적 반감기를 개선하기 위해, 인간 IgG1의 Fc 부분을 화학-기반 유전자 합성에 의해 인간 릴랙신 2와 조합하였다. 인간 릴랙신 2의 카르복시-말단 부분(하기와 같이 배열된 이의 게놈 구성에 따름: B 사슬 - C 사슬 - A 사슬)을 인간 IgG1 Fc 모이어티의 N 말단 끝부분에 융합함으로써, 프로테아제 MMP9 절단 부위를 코딩하는 ArgAlaLysArgPheAlaSerLeu 서열의 폴리펩티드로 이루어진 아미노산 6개 길이의 링커 서열에 의해 융합 단백질의 이러한 2개의 부분이 연결되었다. 릴랙신은 구축물을 상기 기술된 바와 같이 프로테아제 MMP9와 함께 인큐베이션한 후에만 CHO-CRE-LGR7 세포주를 사용하는 것에 의한 검출가능한 활성을 나타냈다.
실시예 3: 릴랙신 -융합 2
생물학적 반감기를 개선하기 위해, 인간 IgG1의 Fc 부분을 화학-기반 유전자 합성에 의해 인간 릴랙신 2와 조합하였다. 인간 릴랙신 2의 카르복시-말단 부분 (하기와 같이 배열된 이의 게놈 구성에 따름: B 사슬 - C 사슬 - A 사슬)을 인간 IgG1 Fc 모이어티의 N 말단 끝부분에 융합함으로써, 프로테아제 키마제 절단 부위를 코딩하는 ArgValGlyPheTyrGluSerAsp 서열의 폴리펩티드로 이루어진 아미노산 6개 길이의 링커 서열에 의해 융합 단백질의 이러한 2개의 부분이 연결되었다. 릴랙신은 구축물을 상기 기술된 바와 같이 프로테아제 키마제와 함께 인큐베이션한 후에만 CHO-CRE-LGR7 세포주를 사용하는 것에 의한 검출가능한 활성을 나타냈다. 키마제 실험에서 수득된 낮은 신호 값은 첨가된 키마제 프로테아제에 의한 스크리닝 세포주에 의해 발현된 LGR7 수용체의 절단에 기인할 수 있다. 검정법 시스템에서 키마제 활성을 제거하거나 감소시키는 방법이 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 특정 프로테아제 억제제의 사용). 그럼에도 불구하고, 이러한 데이터는 융합 단백질로부터 기능성 릴랙신이 방출될 수 있음을 실연한다.
실시예 4: 릴랙신 -융합 3
생물학적 반감기를 개선하기 위해, 인간 IgG1의 Fc 부분을 화학-기반 유전자 합성에 의해 인간 릴랙신 2와 조합하였다. 인간 릴랙신 2의 카르복시-말단 부분 (하기와 같이 배열된 이의 게놈 구성에 따름: B 사슬 - C 사슬 - A 사슬)을 인간 IgG1 Fc 모이어티의 N 말단 끝부분에 융합함으로써, 프로테아제 트립신 절단 부위를 코딩하는 IleAsnAlaArgValSerThrIle 서열의 폴리펩티드로 이루어진 아미노산 6개 길이의 링커 서열에 의해 융합 단백질의 이러한 2개의 부분이 연결되었다. 릴랙신은 상청액을 상기 기술된 바와 같이 트립신과 함께 인큐베이션한 후에만 유의한 활성을 나타냈다. 인큐베이션되지 않은 상청액이 미미한 활성을 나타냈고, 이는 트립신 이외의 유사한 절단 부위를 인식하는, 세포 배양 상청액 내의 프로테아제 오염물질에 기인할 것이다.
실시예 5: 릴랙신 -융합 4
생물학적 반감기를 개선하기 위해, 인간 IgG1의 Fc 부분을 화학-기반 유전자 합성에 의해 인간 릴랙신 2와 조합하였다. 인간 릴랙신 2의 카르복시-말단 부분 (하기와 같이 배열된 이의 게놈 구성에 따름: B 사슬 - C 사슬 - A 사슬)을 인간 IgG1 Fc 모이어티의 N 말단 끝부분에 융합함으로써, 프로테아제 엘라스타제 절단 부위를 코딩하는 GlyLeuArgValGlyPheTyrGlu 서열의 폴리펩티드로 이루어진 아미노산 6개 길이의 링커 서열에 의해 융합 단백질의 이러한 2개의 부분이 연결되었다. 릴랙신은 상기 기술된 바와 같이 구축물을 프로테아제 엘라스타제와 함께 인큐베이션한 후에만 CHO-CRE-LGR7 세포주를 사용하는 것에 의한 검출가능한 활성을 나타냈다. 인큐베이션되지 않은 상청액이 미미한 활성을 나타냈고, 이는 엘라스타제 이외의 유사한 절단 부위를 인식하는, 세포 배양 상청액 내의 프로테아제 오염물질에 기인할 것이다.
Figure pct00003
인용 문헌:
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SEQUENCE LISTING <110> Bayer Intellectual property GmbH Bayer Intellectual Property GmbH <120> Fusion proteins releasing Relaxin and uses thereof <130> BHC 11 1 034 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 397 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Relaxin-Fxa cleavage site-hum IgG1 Fc <400> 1 Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg 1 5 10 15 Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser Thr Trp Ser Lys Arg Ser Leu 20 25 30 Ser Gln Glu Asp Ala Pro Gln Thr Pro Arg Pro Val Ala Glu Ile Val 35 40 45 Pro Ser Phe Ile Asn Lys Asp Thr Glu Thr Ile Asn Met Met Ser Glu 50 55 60 Phe Val Ala Asn Leu Pro Gln Glu Leu Lys Leu Thr Leu Ser Glu Met 65 70 75 80 Gln Pro Ala Leu Pro Gln Leu Gln Gln His Val Pro Val Leu Lys Asp 85 90 95 Ser Ser Leu Leu Phe Glu Glu Phe Lys Lys Leu Ile Arg Asn Arg Gln 100 105 110 Ser Glu Ala Ala Asp Ser Ser Pro Ser Glu Leu Lys Tyr Leu Gly Leu 115 120 125 Asp Thr His Ser Arg Lys Lys Arg Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn 130 135 140 Lys Cys Cys His Val Gly Cys Thr Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys 145 150 155 160 Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ala Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 165 170 175 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 180 185 190 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 195 200 205 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 210 215 220 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 225 230 235 240 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 245 250 255 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 260 265 270 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 275 280 285 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 290 295 300 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 305 310 315 320 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 325 330 335 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 340 345 350 Ser Phe Phe Leu 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Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 210 215 220 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 225 230 235 240 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 245 250 255 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 260 265 270 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 275 280 285 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 290 295 300 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 305 310 315 320 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 325 330 335 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 340 345 350 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 355 360 365 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 370 375 380 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390 395 <210> 17 <211> 1191 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Relaxin - Fxa cleavage site- hum IgG1 Fc <400> 17 agctggatgg aagaagtgat taaactgtgc ggccgcgaac tggtgcgcgc gcagattgcg 60 atttgcggca tgagcacctg gagcaaacgc agcctgagcc aggaagatgc gccgcagacc 120 ccgcgcccgg tggcggaaat tgtgccgagc tttattaaca aagataccga aaccattaac 180 atgatgagcg aatttgtggc gaacctgccg caggaactga aactgaccct gagcgaaatg 240 cagccggcgc tgccgcagct gcagcagcat gtgccggtgc tgaaagatag cagcctgctg 300 tttgaagaat ttaaaaaact gattcgcaac cgccagagcg aagcggcgga tagcagcccg 360 agcgaactga aatatctggg cctggatacc catagccgca aaaaacgcca gctgtatagc 420 gcgctggcga acaaatgctg ccatgtgggc tgcaccaaac gcagcctggc gcgcttttgc 480 attgaaggcc gcatggatcc gaaagcgtgc gataaaaccc atacctgccc gccgtgcccg 540 gcgccggaac tgctgggcgg cccgagcgtg tttctgtttc cgccgaaacc gaaagatacc 600 ctgatgatta gccgcacccc ggaagtgacc tgcgtggtgg tggatgtgag ccatgaagat 660 ccggaagtga aatttaactg gtatgtggat ggcgtggaag tgcataacgc gaaaaccaaa 720 ccgcgcgaag aacagtataa cagcacctat cgcgtggtga gcgtgctgac cgtgctgcat 780 caggattggc tgaacggcaa agaatataaa tgcaaagtga gcaacaaagc gctgccggcg 840 ccgattgaaa aaaccattag caaagcgaaa ggccagccgc gcgaaccgca ggtgtatacc 900 ctgccgccga gccgcgatga actgaccaaa aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaaa 960 ggcttttatc cgagcgatat tgcggtggaa tgggaaagca acggccagcc ggaaaacaac 1020 tataaaacca ccccgccggt gctggatagc gatggcagct tttttctgta tagcaaactg 1080 accgtggata aaagccgctg gcagcagggc aacgtgttta gctgcagcgt gatgcatgaa 1140 gcgctgcata accattatac ccagaaaagc ctgagcctga gcccgggcaa a 1191 <210> 18 <211> 2037 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 18 gtgccggata aaaccgtgcg ctggtgcgcg gtgagcgaac atgaagcgac caaatgccag 60 agctttcgcg atcatatgaa aagcgtgatt ccgagcgatg gcccgagcgt ggcgtgcgtg 120 aaaaaagcga gctatctgga ttgcattcgc gcgattgcgg cgaacgaagc ggatgcggtg 180 accctggatg cgggcctggt gtatgatgcg tatctggcgc cgaacaacct gaaaccggtg 240 gtggcggaat tttatggcag caaagaagat ccgcagacct tttattatgc ggtggcggtg 300 gtgaaaaaag atagcggctt tcagatgaac cagctgcgcg gcaaaaaaag ctgccatacc 360 ggcctgggcc gcagcgcggg ctggaacatt ccgattggcc tgctgtattg cgatctgccg 420 gaaccgcgca aaccgctgga aaaagcggtg gcgaactttt ttagcggcag ctgcgcgccg 480 tgcgcggatg gcaccgattt tccgcagctg tgccagctgt gcccgggctg cggctgcagc 540 accctgaacc agtattttgg ctatagcggc gcgtttaaat gcctgaaaga tggcgcgggc 600 gatgtggcgt ttgtgaaaca tagcaccatt tttgaaaacc tggcgaacaa agcggatcgc 660 gatcagtatg aactgctgtg cctggataac acccgcaaac cggtggatga atataaagat 720 tgccatctgg cgcaggtgcc gagccatacc gtggtggcgc gcagcatggg cggcaaagaa 780 gatctgattt gggaactgct gaaccaggcg caggaacatt ttggcaaaga taaaagcaaa 840 gaatttcagc tgtttagcag cccgcatggc aaagatctgc tgtttaaaga tagcgcgcat 900 ggctttctga aagtgccgcc gcgcatggat gcgaaaatgt atctgggcta tgaatatgtg 960 accgcgattc gcaacctgcg cgaaggcacc tgcccggaag cgccgaccga tgaatgcaaa 1020 ccggtgaaat ggtgcgcgct gagccatcat gaacgcctga aatgcgatga atggagcgtg 1080 aacagcgtgg gcaaaattga atgcgtgagc gcggaaacca ccgaagattg cattgcgaaa 1140 attatgaacg gcgaagcgga tgcgatgagc ctggatggcg gctttgtgta tattgcgggc 1200 aaatgcggcc tggtgccggt gctggcggaa aactataaca aaagcgataa ctgcgaagat 1260 accccggaag cgggctattt tgcggtggcg gtggtgaaaa aaagcgcgag cgatctgacc 1320 tgggataacc tgaaaggcaa aaaaagctgc cataccgcgg tgggccgcac cgcgggctgg 1380 aacattccga tgggcctgct gtataacaaa attaaccatt gccgctttga tgaatttttt 1440 agcgaaggct gcgcgccggg cagcaaaaaa gatagcagcc tgtgcaaact gtgcatgggc 1500 agcggcctga acctgtgcga accgaacaac aaagaaggct attatggcta taccggcgcg 1560 tttcgctgcc tggtggaaaa aggcgatgtg gcgtttgtga aacatcagac cgtgccgcag 1620 aacaccggcg gcaaaaaccc ggatccgtgg gcgaaaaacc tgaacgaaaa agattatgaa 1680 ctgctgtgcc tggatggcac ccgcaaaccg gtggaagaat atgcgaactg ccatctggcg 1740 cgcgcgccga accatgcggt ggtgacccgc aaagataaag aagcgtgcgt gcataaaatt 1800 ctgcgccagc agcagcatct gtttggcagc aacgtgaccg attgcagcgg caacttttgc 1860 ctgtttcgca gcgaaaccaa agatctgctg tttcgcgatg ataccgtgtg cctggcgaaa 1920 ctgcatgatc gcaacaccta tgaaaaatat ctgggcgaag aatatgtgaa agcggtgggc 1980 aacctgcgca aatgcagcac cagcagcctg ctggaagcgt gcacctttcg ccgcccg 2037 <210> 19 <211> 1755 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 19 gatgcgcata aaagcgaagt ggcgcatcgc tttaaagatc tgggcgaaga aaactttaaa 60 gcgctggtgc tgattgcgtt tgcgcagtat ctgcagcagt gcccgtttga agatcatgtg 120 aaactggtga acgaagtgac cgaatttgcg aaaacctgcg tggcggatga aagcgcggaa 180 aactgcgata aaagcctgca taccctgttt ggcgataaac tgtgcaccgt ggcgaccctg 240 cgcgaaacct atggcgaaat ggcggattgc tgcgcgaaac aggaaccgga acgcaacgaa 300 tgctttctgc agcataaaga tgataacccg aacctgccgc gcctggtgcg cccggaagtg 360 gatgtgatgt gcaccgcgtt tcatgataac gaagaaacct ttctgaaaaa atatctgtat 420 gaaattgcgc gccgccatcc gtatttttat gcgccggaac tgctgttttt tgcgaaacgc 480 tataaagcgg cgtttaccga atgctgccag gcggcggata aagcggcgtg cctgctgccg 540 aaactggatg aactgcgcga tgaaggcaaa gcgagcagcg cgaaacagcg cctgaaatgc 600 gcgagcctgc agaaatttgg cgaacgcgcg tttaaagcgt gggcggtggc gcgcctgagc 660 cagcgctttc cgaaagcgga atttgcggaa gtgagcaaac tggtgaccga tctgaccaaa 720 gtgcataccg aatgctgcca tggcgatctg ctggaatgcg cggatgatcg cgcggatctg 780 gcgaaatata tttgcgaaaa ccaggatagc attagcagca aactgaaaga atgctgcgaa 840 aaaccgctgc tggaaaaaag ccattgcatt gcggaagtgg aaaacgatga aatgccggcg 900 gatctgccga gcctggcggc ggattttgtg gaaagcaaag atgtgtgcaa aaactatgcg 960 gaagcgaaag atgtgtttct gggcatgttt ctgtatgaat atgcgcgccg ccatccggat 1020 tatagcgtgg tgctgctgct gcgcctggcg aaaacctatg aaaccaccct ggaaaaatgc 1080 tgcgcggcgg cggatccgca tgaatgctat gcgaaagtgt ttgatgaatt taaaccgctg 1140 gtggaagaac cgcagaacct gattaaacag aactgcgaac tgtttgaaca gctgggcgaa 1200 tataaatttc agaacgcgct gctggtgcgc tataccaaaa aagtgccgca ggtgagcacc 1260 ccgaccctgg tggaagtgag ccgcaacctg ggcaaagtgg gcagcaaatg ctgcaaacat 1320 ccggaagcga aacgcatgcc gtgcgcggaa gattatctga gcgtggtgct gaaccagctg 1380 tgcgtgctgc atgaaaaaac cccggtgagc gatcgcgtga ccaaatgctg caccgaaagc 1440 ctggtgaacc gccgcccgtg ctttagcgcg ctggaagtgg atgaaaccta tgtgccgaaa 1500 gaatttaacg cggaaacctt tacctttcat gcggatattt gcaccctgag cgaaaaagaa 1560 cgccagatta aaaaacagac cgcgctggtg gaactggtga aacataaacc gaaagcgacc 1620 aaagaacagc tgaaagcggt gatggatgat tttgcggcgt ttgtggaaaa atgctgcaaa 1680 gcggatgata aagaaacctg ctttgcggaa gaaggcaaaa aactggtggc ggcgagccag 1740 gcggcgctgg gcctg 1755 <210> 20 <211> 693 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 20 ccgaaagcgt gcgataaaac ccatacctgc ccgccgtgcc cggcgccgga actgctgggc 60 ggcccgagcg tgtttctgtt tccgccgaaa ccgaaagata ccctgatgat tagccgcacc 120 ccggaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg agccatgaag atccggaagt gaaatttaac 180 tggtatgtgg atggcgtgga agtgcataac gcgaaaacca aaccgcgcga agaacagtat 240 aacagcacct atcgcgtggt gagcgtgctg accgtgctgc atcaggattg gctgaacggc 300 aaagaatata aatgcaaagt gagcaacaaa gcgctgccgg cgccgattga aaaaaccatt 360 agcaaagcga aaggccagcc gcgcgaaccg caggtgtata ccctgccgcc gagccgcgat 420 gaactgacca aaaaccaggt gagcctgacc tgcctggtga aaggctttta tccgagcgat 480 attgcggtgg aatgggaaag caacggccag ccggaaaaca actataaaac caccccgccg 540 gtgctggata gcgatggcag cttttttctg tatagcaaac tgaccgtgga taaaagccgc 600 tggcagcagg gcaacgtgtt tagctgcagc gtgatgcatg aagcgctgca taaccattat 660 acccagaaaa gcctgagcct gagcccgggc aaa 693 <210> 21 <211> 480 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 21 agctggatgg aagaagtgat taaactgtgc ggccgcgaac tggtgcgcgc gcagattgcg 60 atttgcggca tgagcacctg gagcaaacgc agcctgagcc aggaagatgc gccgcagacc 120 ccgcgcccgg tggcggaaat tgtgccgagc tttattaaca aagataccga aaccattaac 180 atgatgagcg aatttgtggc gaacctgccg caggaactga aactgaccct gagcgaaatg 240 cagccggcgc tgccgcagct gcagcagcat gtgccggtgc tgaaagatag cagcctgctg 300 tttgaagaat ttaaaaaact gattcgcaac cgccagagcg aagcggcgga tagcagcccg 360 agcgaactga aatatctggg cctggatacc catagccgca aaaaacgcca gctgtatagc 420 gcgctggcga acaaatgctg ccatgtgggc tgcaccaaac gcagcctggc gcgcttttgc 480 <210> 22 <211> 72 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 22 cagctgtata gcgcgctggc gaacaaatgc tgccatgtgg gctgcaccaa acgcagcctg 60 gcgcgctttt gc 72 <210> 23 <211> 48 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 23 aaatgctgcc atgtgggctg caccaaacgc agcctggcgc gcttttgc 48 <210> 24 <211> 84 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 24 agctggatgg aagaagtgat taaactgtgc ggccgcgaac tggtgcgcgc gcagattgcg 60 atttgcggca tgagcacctg gagc 84 <210> 25 <211> 351 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 25 cgcgcggcgc cgtatggcgt gcgcctgtgc ggccgcgaat ttattcgcgc ggtgattttt 60 acctgcggcg gcagccgctg gcgccgcagc gatattctgg cgcatgaagc gatgggcgat 120 acctttccgg atgcggatgc ggatgaagat agcctggcgg gcgaactgga tgaagcgatg 180 ggcagcagcg aatggctggc gctgaccaaa agcccgcagg cgttttatcg cggccgcccg 240 agctggcagg gcaccccggg cgtgctgcgc ggcagccgcg atgtgctggc gggcctgagc 300 agcagctgct gcaaatgggg ctgcagcaaa agcgaaatta gcagcctgtg c 351 <210> 26 <211> 72 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 26 gatgtgctgg cgggcctgag cagcagctgc tgcaaatggg gctgcagcaa aagcgaaatt 60 agcagcctgt gc 72 <210> 27 <211> 81 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 27 cgcgcggcgc cgtatggcgt gcgcctgtgc ggccgcgaat ttattcgcgc ggtgattttt 60 acctgcggcg gcagccgctg g 81 <210> 28 <211> 45 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 28 tgctgcaaat ggggctgcag caaaagcgaa attagcagcc tgtgc 45 <210> 29 <211> 1197 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Relaxin - MMP9 cleavage site- humFc IgG1 <400> 29 agctggatgg aagaagtgat taaactgtgc ggccgcgaac tggtgcgcgc gcagattgcg 60 atttgcggca tgagcacctg gagcaaacgc agcctgagcc aggaagatgc gccgcagacc 120 ccgcgcccgg tggcggaaat tgtgccgagc tttattaaca aagataccga aaccattaac 180 atgatgagcg aatttgtggc gaacctgccg caggaactga aactgaccct gagcgaaatg 240 cagccggcgc tgccgcagct gcagcagcat gtgccggtgc tgaaagatag cagcctgctg 300 tttgaagaat ttaaaaaact gattcgcaac cgccagagcg aagcggcgga tagcagcccg 360 agcgaactga aatatctggg cctggatacc catagccgca aaaaacgcca gctgtatagc 420 gcgctggcga acaaatgctg ccatgtgggc tgcaccaaac gcagcctggc gcgcttttgc 480 cgcgcgaaac gctttgcgag cctgccgaaa gcgtgcgata aaacccatac ctgcccgccg 540 tgcccggcgc cggaactgct gggcggcccg agcgtgtttc tgtttccgcc gaaaccgaaa 600 gataccctga tgattagccg caccccggaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgagccat 660 gaagatccgg aagtgaaatt taactggtat gtggatggcg tggaagtgca taacgcgaaa 720 accaaaccgc gcgaagaaca gtataacagc acctatcgcg tggtgagcgt gctgaccgtg 780 ctgcatcagg attggctgaa cggcaaagaa tataaatgca aagtgagcaa caaagcgctg 840 ccggcgccga ttgaaaaaac cattagcaaa gcgaaaggcc agccgcgcga accgcaggtg 900 tataccctgc cgccgagccg cgatgaactg accaaaaacc aggtgagcct gacctgcctg 960 gtgaaaggct tttatccgag cgatattgcg gtggaatggg aaagcaacgg ccagccggaa 1020 aacaactata aaaccacccc gccggtgctg gatagcgatg gcagcttttt tctgtatagc 1080 aaactgaccg tggataaaag ccgctggcag cagggcaacg tgtttagctg cagcgtgatg 1140 catgaagcgc tgcataacca ttatacccag aaaagcctga gcctgagccc gggcaaa 1197 <210> 30 <211> 1197 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Relaxin - Chymase cleavage site- humFc IgG1 <400> 30 agctggatgg aagaagtgat taaactgtgc ggccgcgaac tggtgcgcgc gcagattgcg 60 atttgcggca tgagcacctg gagcaaacgc agcctgagcc aggaagatgc gccgcagacc 120 ccgcgcccgg tggcggaaat tgtgccgagc tttattaaca aagataccga aaccattaac 180 atgatgagcg aatttgtggc gaacctgccg caggaactga aactgaccct gagcgaaatg 240 cagccggcgc tgccgcagct gcagcagcat gtgccggtgc tgaaagatag cagcctgctg 300 tttgaagaat ttaaaaaact gattcgcaac cgccagagcg aagcggcgga tagcagcccg 360 agcgaactga aatatctggg cctggatacc catagccgca aaaaacgcca gctgtatagc 420 gcgctggcga acaaatgctg ccatgtgggc tgcaccaaac gcagcctggc gcgcttttgc 480 cgcgtgggct tttatgaaag cgatccgaaa gcgtgcgata aaacccatac ctgcccgccg 540 tgcccggcgc cggaactgct gggcggcccg agcgtgtttc tgtttccgcc gaaaccgaaa 600 gataccctga tgattagccg caccccggaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgagccat 660 gaagatccgg aagtgaaatt taactggtat gtggatggcg tggaagtgca taacgcgaaa 720 accaaaccgc gcgaagaaca gtataacagc acctatcgcg tggtgagcgt gctgaccgtg 780 ctgcatcagg attggctgaa cggcaaagaa tataaatgca aagtgagcaa caaagcgctg 840 ccggcgccga ttgaaaaaac cattagcaaa gcgaaaggcc agccgcgcga accgcaggtg 900 tataccctgc cgccgagccg cgatgaactg accaaaaacc aggtgagcct gacctgcctg 960 gtgaaaggct tttatccgag cgatattgcg gtggaatggg aaagcaacgg ccagccggaa 1020 aacaactata aaaccacccc gccggtgctg gatagcgatg gcagcttttt tctgtatagc 1080 aaactgaccg tggataaaag ccgctggcag cagggcaacg tgtttagctg cagcgtgatg 1140 catgaagcgc tgcataacca ttatacccag aaaagcctga gcctgagccc gggcaaa 1197 <210> 31 <211> 1197 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Relaxin - Trypsin cleavage site- humFc IgG1 <400> 31 agctggatgg aagaagtgat taaactgtgc ggccgcgaac tggtgcgcgc gcagattgcg 60 atttgcggca tgagcacctg gagcaaacgc agcctgagcc aggaagatgc gccgcagacc 120 ccgcgcccgg tggcggaaat tgtgccgagc tttattaaca aagataccga aaccattaac 180 atgatgagcg aatttgtggc gaacctgccg caggaactga aactgaccct gagcgaaatg 240 cagccggcgc tgccgcagct gcagcagcat gtgccggtgc tgaaagatag cagcctgctg 300 tttgaagaat ttaaaaaact gattcgcaac cgccagagcg aagcggcgga tagcagcccg 360 agcgaactga aatatctggg cctggatacc catagccgca aaaaacgcca gctgtatagc 420 gcgctggcga acaaatgctg ccatgtgggc tgcaccaaac gcagcctggc gcgcttttgc 480 attaacgcgc gcgtgagcac cattccgaaa gcgtgcgata aaacccatac ctgcccgccg 540 tgcccggcgc cggaactgct gggcggcccg agcgtgtttc tgtttccgcc gaaaccgaaa 600 gataccctga tgattagccg caccccggaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgagccat 660 gaagatccgg aagtgaaatt taactggtat gtggatggcg tggaagtgca taacgcgaaa 720 accaaaccgc gcgaagaaca gtataacagc acctatcgcg tggtgagcgt gctgaccgtg 780 ctgcatcagg attggctgaa cggcaaagaa tataaatgca aagtgagcaa caaagcgctg 840 ccggcgccga ttgaaaaaac cattagcaaa gcgaaaggcc agccgcgcga accgcaggtg 900 tataccctgc cgccgagccg cgatgaactg accaaaaacc aggtgagcct gacctgcctg 960 gtgaaaggct tttatccgag cgatattgcg gtggaatggg aaagcaacgg ccagccggaa 1020 aacaactata aaaccacccc gccggtgctg gatagcgatg gcagcttttt tctgtatagc 1080 aaactgaccg tggataaaag ccgctggcag cagggcaacg tgtttagctg cagcgtgatg 1140 catgaagcgc tgcataacca ttatacccag aaaagcctga gcctgagccc gggcaaa 1197 <210> 32 <211> 1197 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Relaxin - Elastase cleavage site- humFc IgG1 <400> 32 agctggatgg aagaagtgat taaactgtgc ggccgcgaac tggtgcgcgc gcagattgcg 60 atttgcggca tgagcacctg gagcaaacgc agcctgagcc aggaagatgc gccgcagacc 120 ccgcgcccgg tggcggaaat tgtgccgagc tttattaaca aagataccga aaccattaac 180 atgatgagcg aatttgtggc gaacctgccg caggaactga aactgaccct gagcgaaatg 240 cagccggcgc tgccgcagct gcagcagcat gtgccggtgc tgaaagatag cagcctgctg 300 tttgaagaat ttaaaaaact gattcgcaac cgccagagcg aagcggcgga tagcagcccg 360 agcgaactga aatatctggg cctggatacc catagccgca aaaaacgcca gctgtatagc 420 gcgctggcga acaaatgctg ccatgtgggc tgcaccaaac gcagcctggc gcgcttttgc 480 ggcctgcgcg tgggctttta tgaaccgaaa gcgtgcgata aaacccatac ctgcccgccg 540 tgcccggcgc cggaactgct gggcggcccg agcgtgtttc tgtttccgcc gaaaccgaaa 600 gataccctga tgattagccg caccccggaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgagccat 660 gaagatccgg aagtgaaatt taactggtat gtggatggcg tggaagtgca taacgcgaaa 720 accaaaccgc gcgaagaaca gtataacagc acctatcgcg tggtgagcgt gctgaccgtg 780 ctgcatcagg attggctgaa cggcaaagaa tataaatgca aagtgagcaa caaagcgctg 840 ccggcgccga ttgaaaaaac cattagcaaa gcgaaaggcc agccgcgcga accgcaggtg 900 tataccctgc cgccgagccg cgatgaactg accaaaaacc aggtgagcct gacctgcctg 960 gtgaaaggct tttatccgag cgatattgcg gtggaatggg aaagcaacgg ccagccggaa 1020 aacaactata aaaccacccc gccggtgctg gatagcgatg gcagcttttt tctgtatagc 1080 aaactgaccg tggataaaag ccgctggcag cagggcaacg tgtttagctg cagcgtgatg 1140 catgaagcgc tgcataacca ttatacccag aaaagcctga gcctgagccc gggcaaa 1197

Claims (15)

  1. 릴랙신(Relaxin)-PCS-HEM 또는 HEM-PCS-릴랙신을 포함하며,
    여기서 릴랙신은 릴랙신 A 사슬 폴리펩티드 또는 이의 기능성 변이체, 및 릴랙신 B 사슬 폴리펩티드 또는 이의 기능성 변이체를 포함하고,
    PCS는 엔도-프로테아제(endo-protease) 절단 부위를 포함하며,
    HEM은 단백질성 반감기 연장 모이어티인,
    융합 단백질.
  2. 프로릴랙신(proRelaxin)-PCS-HEM 또는 HEM-PCS-프로릴랙신을 포함하며,
    여기서 프로릴랙신은 릴랙신 A 사슬 폴리펩티드 또는 이의 기능성 변이체, 릴랙신 C-사슬 폴리펩티드 및 릴랙신 B 사슬 폴리펩티드 또는 이의 기능성 변이체를 포함하고,
    PCS는 엔도-프로테아제 절단 부위를 포함하며,
    HEM은 단백질성 반감기 연장 모이어티인,
    융합 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, PCS가 세포외 엔도-프로테아제의 절단 부위인 융합 단백질 또는 폴리펩티드.
  4. 제3항에 있어서, 엔도-프로테아제가 내인성 엔도-프로테아제인 융합 단백질 또는 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질성 반감기 연장 모이어티가 이뮤노글로불린 Fc 도메인, 혈청 알부민, 트랜스페린 및 혈청 알부민 결합 단백질로 이루어진 단백질성 반감기 연장 모이어티의 군에 포함되는 것인 융합 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 릴랙신 A 사슬이 인간 릴랙신 2 A 사슬이고, 릴랙신 B 사슬이 인간 릴랙신 2 B 사슬인 융합 폴리펩티드.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 프로릴랙신-PCS-HEM 또는 HEM-PCS-프로릴랙신 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  9. 제8항에 따른 벡터 또는 제7항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  10. 프로호르몬(prohormone) 컨버타제(convertase) 활성을 추가로 포함하는 제9항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 단백질을 단리하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 릴랙신-PCS-HEM 또는 HEM-PCS-릴랙신 단백질을 생산하는 방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 릴랙신-PCS-HEM 또는 HEM-PCS-릴랙신 단백질을 포함하는 제약 조성물.
  12. 의약으로서의 제11항에 따른 제약 조성물 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 릴랙신-PCS-HEM 또는 HEM-PCS-릴랙신 단백질.
  13. 심혈관 질환, 폐 질환, 섬유증 장애 또는 신장 질환의 치료를 위한 의약으로서의 제11항 또는 제12항에 따른 제약 조성물 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 릴랙신-PCS-HEM 또는 HEM-PCS-릴랙신 단백질.
  14. 치료적 유효 용량의 제11항 또는 제12항에 따른 제약 조성물 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 릴랙신-PCS-HEM 또는 HEM-PCS-릴랙신 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 질환, 폐 질환, 섬유증 장애 또는 신장 질환을 치료하는 방법.
  15. 심혈관 질환이 관상동맥 심장 질환, 급성 관상동맥 증후군, 심부전, 또는 심근경색의 군에 포함되는 것인 제13항 또는 제14항에 따른 치료.
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