TW202409074A - 鬆弛素或類似物的融合蛋白及其醫藥用途 - Google Patents
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Abstract
本揭露關於鬆弛素或類似物的融合蛋白及其醫藥用途。具體而言，本揭露關於一種包含鬆弛素或其類似物與血清白蛋白結合結構域的融合蛋白，及其用於治療疾病(例如，心衰)的醫藥用途。以及，本揭露關於一種血清白蛋白結合分子，所述結合分子包含能結合血清白蛋白的免疫球蛋白單一可變結構域(如VHH)，具有良好的血漿穩定性，可用於延長藥物的血漿半衰期。
Description
本揭露要求2022年5月7日提交的中國專利申請(申請號CN202210491720.7)的優先權。
本揭露屬於生物醫藥領域，具體的，關於一種包含鬆弛素或其類似物與血清白蛋白結合結構域的融合蛋白，及其用於治療疾病(例如，心衰)的醫藥用途。以及，關於一種血清白蛋白結合分子，該結合分子包含能結合血清白蛋白的免疫球蛋白單一可變結構域(如VHH)，具有良好的血漿穩定性，可用於延長藥物的血漿半衰期。
鬆弛素(relaxin)作為孕期重要的激素於1926年由Frederick Hisaw首次發現，它是一種多肽類激素，屬於胰島素超家族。鬆弛素在人類中包含7個多肽成員，包括鬆弛素1(RLN-1或H1)，鬆弛素2(RLN-2或H2)，鬆弛素3(RLN-3或H3)。這些鬆弛素在一級序列上同源性低，卻具有相似的三級結構。其中鬆弛素2是人體循環中主要的鬆弛素，由RLN2
基因編碼。鬆弛素以前體激素(A、B鏈之間藉由C肽進行線性連接)形式表達，在體內經過內切酶水解去除C肽，釋放成熟的鬆弛素。天然成熟的鬆弛素2含有A、B兩條多肽鏈，他們藉由兩個鏈間二硫鍵進行共價鏈接形成異二聚體，A鏈內部還有一對二硫鍵(Schwabe,et al.Science.1977,197,914-915)。
鬆弛素2是一種多效性激素，其信號傳導主要藉由受體RXFP1(又稱LGR7)實現，RXFP1是一種G蛋白偶聯受體(GPCR)，它富含亮胺酸重複單元，RXFP2(又稱LGR8)與鬆弛素2也有結合。鬆弛素2和受體結合可激活多種級聯信號，包括激活cAMP和磷酸肌醇3-激酶通路，激活一氧化氮信號通路等。鬆弛素2與受體結合還可以抑制Smad2/3的磷酸化，從而抑制細胞外基質，膠原蛋白的生成。研究表明鬆弛素2具有促進血管舒張、抗炎、降低血管阻力和增加動脈順應性、促進血管生成和重塑、調節細胞外基質、抗纖維化等生理作用、對心衰竭和心肌纖維化發揮有益的作用(Chiara Sassoli,et al.Current Molecular Medicine 2022,22,196-208)。
鬆弛素2的半衰期(t1/2)很短，天然鬆弛素2在體內的半衰期(t1/2)只有幾分鐘，這為鬆弛素作為治療藥物帶來挑戰。已經上市的天然重組鬆弛素2(serelaxin)在臨床上需要藉由連續靜脈輸注治療，這造成患者不便，也表現出效力短暫。研究者對鬆弛素2進行改造以提高其半衰期(t1/2)，例如藉由化學偶聯的方式引入PEG、脂肪酸鏈等，或者藉由重組的方法融合半衰期延長的蛋白，多肽或者Fc等。
白蛋白是血漿中含量最為豐富的一種蛋白，占血漿蛋白的40-60%。白蛋白可以結合許多內源和外源性配體，是體內天然的“多功能載體”。白蛋白和免疫球蛋白G(IgG)相似，在體內的保留時間比較久，有報導白蛋白在人體內的半衰期大約有19-21天(Berson,S.A.et al,J.Clin.Invest.1953,32,746-768)，這主要是因為：白蛋白分子量為66.5KD，而且其分子流體力學半徑超過了腎小球過濾的閾值3.5-6nm(Lin,J.H.Curr.Drug Metab.2009,10,661-691)；白蛋白可以和FcRn結合，並且這種結合具有pH依賴性的特點，內吞進入內涵體後，在內涵體酸性pH下(pH5.5或者6.0)兩者結合比較強，從而保護了白蛋白免於溶酶體的降解，而隨著FcRn轉運到細胞表面，在中性的生理pH條件下，白蛋白從FcRn上解離，從而實現再循環，這一原理類似於IgG的再循環，而且白蛋白和IgG分別跟FcRn上兩個獨立的位點結合，互不影響。
本揭露提供了新結構的結合血清白蛋白的單域抗體，其能夠顯著提高藥物活性成分的體內半衰期。例如，當本揭露的結合血清白蛋白的單域抗體與作為活性成分的鬆弛素或其類似物融合為融合蛋白後，能夠顯著提高鬆弛素或其類似物的體內半衰期。本揭露提供的融合蛋白活性高，穩定性高，便於生產，具有優異的臨床應用潛力。
本揭露提供了一種血清白蛋白結合分子，其包含特異性結合血清白蛋白的免疫球蛋白單一可變結構域，具有良好的血漿穩定性，可用於延長藥物的血漿半衰期。
血清白蛋白結合分子
本揭露提供血清白蛋白結合分子。
一些實施方案中，血清白蛋白結合分子包含免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含如下1)-5)任一項所述的CDR1、CDR2和CDR3：
1)如SEQ ID NO：6、18-27任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3；
2)如SEQ ID NO：7所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3；
3)分別如SEQ ID NO：8、9和10所示的CDR1、CDR2和CDR3；
4)分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的CDR1、CDR2和CDR3；
5)CDR1為X1SCX2G(SEQ ID NO：64)，其中，X1為T或N，X2為M或L；
CDR2為X3IYX4VGGSTFYX5X6SVKG(SEQ ID NO：58)，其中，X3為S或T，X4為T或M，X5為T或A，X6為N或D；
CDR3為GSPARCX7X8RDPTTFX9Y(SEQ ID NO：59)，其中，X7為R或L，X8為L或R，X9為D或N；
其中，上述X1至X9中的一個或多個可以為其可選胺基酸的保守胺基酸突變。
上述CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的，例如，該CDR是根據Kabat編號系統定義的。
一些實施方案中，血清白蛋白結合分子包含免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含上述1)-5)中CDR1、CDR2、CDR3中的任意一個或任意幾個(例如，2或3)的組合。
一些實施方案中，血清白蛋白結合分子包含免疫球蛋白單一可變結構域，其包含的CDR1與前述任一CDR1相比，具有0、1、2、3、4或5個胺基酸突變；和/或，該免疫球蛋白單一可變結構域包含的CDR2與前述任一CDR2相比，具有0、1、2、3、4或5個胺基酸突變；和/或，該免疫球蛋白單一可變結構域包含的CDR3與前述任一CDR3相比，具有0、1、2、3、4或5個胺基酸突變。一些具體的實施方案中，CDR1、CDR2和/或CDR3中的胺基酸突變為保守性取代。
一些實施方案中，前述免疫球蛋白單一可變結構域為駱駝源的。
一些實施方案中，前述免疫球蛋白單一可變結構域為經過以下任一項改造的：人源化、親合力成熟、去除T細胞表位、降低抗體脫醯胺、降低抗體聚集、降低抗體異構化、或其組合。
一些實施方案中，前述人源化的免疫球蛋白單一可變結構域中的框架區源自人重鏈可變區種系基因IGHV3-23或IGVH3-66。
一些具體實施方案中，前述人源化的免疫球蛋白單一可變結構域在以下位置中的至少一處包含胺基酸突變：第20、23、27、29、30、37、44、45、47、49、74、78、83和84位(基於EU編號系統的位置)；
例如，包含選自以下的至少一種胺基酸突變：20V、23V、27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G、49A、74A、78V、83Q或84P；
例如，包含選自如下任一的胺基酸突變組合：
F27N、F29Y、S30L、V37F、G44E、L45R、W47G；
L20V、F27N、F29Y、S30L、V37F、G44E、L45R、W47G；
A23V、F27N、F29Y、S30L、V37F、G44E、L45R、W47G；
F27N、F29Y、S30L、V37F、G44E、L45R、W47G、S74A；
F27N、F29Y、S30L、V37F、G44E、L45R、W47G、L78V；
F27N、F29Y、S30L、V37F、G44E、L45R、W47G、S49A；
F27N、F29Y、S30L、V37F、G44E、L45R、W47G、R83Q、A84P；
F27N、F29Y、S30L、V37F、G44E、L45R、W47G、A84P；
S30L、V37F、G44E、L45R、W47G、A84P；或
S30L、V37F、G44E、L45R、W47G。
一些實施方案中，本揭露提供的血清白蛋白結合分子包含免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含或為SEQ ID NO：6或7任一或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列。一些實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域是駱駝源的。
一些實施方案中，本揭露提供的血清白蛋白結合分子包含免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含或為SEQ ID NO：18-27任一所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列。一些實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域是人源化的。
本揭露中，“至少90%(序列)同一性”涵蓋至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%(序列)同一性；“至少80%(序列)同一性”
涵蓋至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%(序列)同一性、以及前述任意兩個數值之間的範圍，包括整數和小數。
一些實施方案中，前述本揭露提供的血清白蛋白結合分子中的免疫球蛋白單一可變結構域包含三個互補決定區CDR1、CDR2和CDR3和四個FR，按照以下順序從胺基末端到羧基末端排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
一些實施方案中，前述本揭露提供的血清白蛋白結合分子是結合血清白蛋白的抗體或其抗原結合片段，或包含該抗體或其抗原結合片段的綴合物、融合蛋白。
一些實施方案中，前述抗體為駱駝抗體、嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體。
一些實施方案中，前述抗原結合片段為sdAb或雙特異性抗體、多特異性抗體。
一些實施方案中，前述免疫球蛋白單一可變結構域是VHH。
一些實施方案中，前述免疫球蛋白單一可變結構域是人源化的VHH。
一些實施方案中，前述免疫球蛋白單一可變結構域是經親和力成熟的VHH。
一些實施方案中，提供血清白蛋白結合分子，其包含一個或多個(例如2、3、4、5、6、7、8個)前述免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域可以是相同或不同的，任意兩個免疫球蛋白單一可變結構域之間可以直接連接或藉由連接子連接。
在一些實施方案中，提供血清白蛋白結合分子，其與前述本揭露的免疫球蛋白單一可變結構域結合或競爭結合相同的表位。
在一些實施方案中，提供血清白蛋白結合分子，其阻斷前述本揭露的免疫球蛋白單一可變結構域與血清白蛋白的結合。
在一些實施方案中，提供血清白蛋白結合分子，其與血清白蛋白的結合被前述本揭露的免疫球蛋白單一可變結構域阻斷。
一些實施方案中，前述本揭露提供的血清白蛋白結合分子還包含免疫球蛋白的Fc區，例如選自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc區；或者組胺酸標簽，例如(His)6標簽或(His)8標簽。
可用於本揭露的Fc區可以來自不同亞型的免疫球蛋白，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM。在一些實施方案中，Fc區包括恆定區的鉸鏈區或部分鉸鏈區、CH2區和CH3區。
一些實施方案中，前述免疫球蛋白單一可變結構域與Fc區或組胺酸標簽之間可以由連接子連接。該連接子可以是長度為1-20個或更多個胺基酸、無二級以上結構的非功能性胺基酸序列。例如，該連接子是柔性連接子，例如G4S(SEQ ID NO：67)、GS、GAP、(G4S)2(SEQ ID NO：68)、(G4S)3(SEQ ID NO：69)、(G4S)4(SEQ ID NO：70)、(G4S)5(SEQ ID
NO：71)、ASGS、G3S或其組合。在一些實施方案中，連接子是GGGGSGGGS(SEQ ID NO：72)。
一些實施方案中，本揭露提供的血清白蛋白結合分子包含或為SEQ ID NO：15或16所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，前述血清白蛋白結合分子中的免疫球蛋白單一可變結構域是特異性結合血清白蛋白的，該血清白蛋白可以是齧齒類動物血清白蛋白(例如小鼠血清白蛋白(mSA))，或靈長類動物血清白蛋白(例如獼猴血清白蛋白(cySA)、人血清白蛋白(HSA))。一些具體實施方案中，該血清白蛋白是HSA。
一些替代方案中，本揭露的血清白蛋白結合分子可以包含前述任一的完整的免疫球蛋白單一可變結構域；也可以包含前述任一的免疫球蛋白單一可變結構域的功能部分或其變體，例如CDR3、CDR3-FR4、CDR2-FR3-CDR3、CDR2-FR3-CDR3-FR4、FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4、CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3。
在一些實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域的功能部分的變體可以是保留了CDR3、CDR3-FR4、CDR2-FR3-CDR3、CDR2-FR3-CDR3-FR4、FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4、CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4、或FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3的血清白蛋白結合功能且與之具有至少80%、至少90%序列同源性的多肽，例如可以是保留了CDR3的血清白蛋白結合功能並與之具有一定序列同源性的多肽，例如與上述任一CDR3具有至少80%、至少90%序列同源性的多肽。
一些實施方案中，本揭露提供的血清白蛋白結合分子中，該免疫球蛋白單一可變結構域可以作為用於延長半衰期的載體與任意其他大分子或小分子化合物共價或非共價連接。
一些實施方案中，本揭露的血清白蛋白結合分子包含一種或更多種治療劑或診斷劑，其中該治療劑或診斷劑與該免疫球蛋白單一可變結構域共價或非共價連接。
一些實施方案中，該治療劑或診斷劑選自治療性或診斷性蛋白質、核酸和小分子化合物。
一些實施方案中，本揭露提供的血清白蛋白結合分子或其中的免疫球蛋白單一可變結構域以
1×10-7M，例如
2×10-8M、
1×10-8M，
9×10-9M、
8×10-9M、
7×10-9M、
6×10-9M、
5×10-9M、
4×10-9M、
3×10-9M、
2×10-9M、或
1×10-9M，或
9×10-10M、
8×10-10M、
7×10-10M、
6×10-10M、
5×10-10M、
4×10-10M、
3×10-10M、
2×10-10M、
1×10-10M的KD值結合血清白蛋白，例如人血清白蛋白。
一些實施方案中，本揭露提供的血清白蛋白結合分子對人血清白蛋白的親和力KD值為10nM-100nM，例如10nM-50nM。該KD值的檢測方法是本領域常用的，例如為本揭露實施例4中所提供的。
一些實施方案中，本揭露提供的血清白蛋白結合分子具有選自以下的至少一項的活性：
(a)以
1×10-7M，例如，
1×10-8M的KD值結合HSA；
(b)體內和/或體外未檢測到阻斷血清白蛋白與FcRn的結合，該血清白蛋白例如為HSA，該FcRn例如為人FcRn；
(c)當包含治療劑或診斷劑時，延長該治療劑或診斷劑的血漿半衰期。
一些實施方案中，本揭露提供的血清白蛋白結合分子保留了單域抗體(例如VHH)的有利特性，並在個體循環中具有延長的壽命。因此，這樣的分子能夠在受試者的血清中循環數天，從而減少了治療的頻率、給受試者帶來的不便並降低了治療成本。
一些實施方案中，本揭露的血清白蛋白結合分子的半衰期可以由分子中存在的特異性結合血清蛋白的單一可變結構域的數目來控制。
一些實施方案中，本揭露的血清白蛋白結合分子在體內和/或體外促進血清白蛋白與FcRn的結合。
融合蛋白
本揭露提供融合蛋白，其包含血清白蛋白結合結構域和鬆弛素或其類似物，該血清白蛋白結合結構域包含至少一個免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域為前述本揭露的任一免疫球蛋白單一可變結構域。
一些實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域包含如下1)-5)任一項所述的CDR1、CDR2和CDR3：
1)如SEQ ID NO：6、18-27任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3；
2)如SEQ ID NO：7所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3；
3)如SEQ ID NO：8、9和10所示的CDR1、CDR2和CDR3；
4)如SEQ ID NO：11、12和13所示的CDR1、CDR2和CDR3；
5)CDR1為X1SCX2G(SEQ ID NO：64)，其中，X1為T或N，X2為M或L；
CDR2為X3IYX4VGGSTFYX5X6SVKG(SEQ ID NO：58)，其中，X3為S或T，X4為T或M，X5為T或A，X6為N或D；
CDR3為GSPARCX7X8RDPTTFX9Y(SEQ ID NO：59)，其中，X7為R或L，X8為L或R，X9為D或N；
其中，上述X1至X9中的一個或多個可以為其可選胺基酸的保守胺基酸突變。
上述CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的，例如，該CDR是根據Kabat編號系統定義的。
一些實施方案中，前述免疫球蛋白單一可變結構域經過以下任一項改造的：駱駝源，或人源化、親合力成熟、去除T細胞表位、降低抗體脫醯胺、降低抗體聚集和/或降低抗體異構化、或其組合。
一些實施方案中，該人源化的免疫球蛋白單一可變結構域中的框架區源自人重鏈可變區種系基因IGHV3-23或IGVH3-66。
一些具體實施方案中，該人源化的免疫球蛋白單一可變結構域在以下位置中的至少一處包含胺基酸突變：第20、23、27、29、30、37、44、45、47、49、74、78、83和84位(基於EU編號系統的位置)；
例如，包含選自以下的至少一種胺基酸突變：20V、23V、27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G、49A、74A、78V、83Q或84P；
例如，包含選自如下任一的胺基酸突變組合：
F27N、F29Y、S30L、V37F、G44E、L45R、W47G；
L20V、F27N、F29Y、S30L、V37F、G44E、L45R、W47G；
A23V、F27N、F29Y、S30L、V37F、G44E、L45R、W47G；
F27N、F29Y、S30L、V37F、G44E、L45R、W47G、S74A；
F27N、F29Y、S30L、V37F、G44E、L45R、W47G、L78V；
F27N、F29Y、S30L、V37F、G44E、L45R、W47G、S49A；
F27N、F29Y、S30L、V37F、G44E、L45R、W47G、R83Q、A84P；
F27N、F29Y、S30L、V37F、G44E、L45R、W47G、A84P；
S30L、V37F、G44E、L45R、W47G、A84P；或
S30L、V37F、G44E、L45R、W47G。
一些實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域包含或為SEQ ID NO：6、18-27任一所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域包含或為SEQ ID NO：7所示或與之具有至少80%、至少90%序列同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域是VHH，例如駱駝源、人源化的VHH。
一些實施方案中，融合蛋白中的鬆弛素或其類似物包含A鏈和B鏈。
一些實施方案中，A鏈具有SEQ ID NO：31、50、52、54、56任一所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：31、50、52、54、56任一具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，或較之SEQ ID NO：31、50、
52、54、56任一具有一個或多個胺基酸添加、缺失、***或置換的胺基酸序列，例如A鏈可以是SEQ ID NO：31或50在N端缺失1、2、3或4個胺基酸，或添加1、2、3、4個胺基酸。
一些實施方案中，B鏈具有SEQ ID NO：32、51、53、55、57任一所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：32、51、53、55、57任一具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，或較之SEQ ID NO：32、51、53、55、57任一具有一個或多個胺基酸添加、缺失、***或置換的胺基酸序列，例如B鏈可以是SEQ ID NO：51在N端缺失1個胺基酸。
一些實施方案中，該鬆弛素或其類似物的A鏈和B鏈是上述的任意組合。
一些實施方案中，該鬆弛素或其類似物包含如下1)-7)中任一項的A鏈和B鏈組合：
1)SEQ ID NO：31所示的A鏈和SEQ ID NO：32所示的B鏈；
2)SEQ ID NO：50所示的A鏈和SEQ ID NO：51所示的B鏈；
3)SEQ ID NO：52所示的A鏈和SEQ ID NO：53所示的B鏈；
4)SEQ ID NO：54所示的A鏈和SEQ ID NO：55所示的B鏈；
5)SEQ ID NO：31所示的A鏈和SEQ ID NO：53所示的B鏈；
6)SEQ ID NO：52所示的A鏈和SEQ ID NO：32所示的B鏈；
7)SEQ ID NO：56所示的A鏈和SEQ ID NO：57所示的B鏈。
>人RLN2 A鏈
QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO：31)
>人RLN2 B鏈(delB1)
SWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS(SEQ ID NO：32)
>人RLN1 A鏈
PYVALFEKCCLIGCTKRSLAKYC(SEQ ID NO：50)
>人RLN1 B鏈
VAAKWKDDVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS(SEQ ID NO：51)
>人RLN2 A鏈(delA1-4)
ALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO：52)
>人RLN2 B鏈
DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS(SEQ ID NO：53)
>人RLN3 A鏈
DVLAGLSSSCCKWGCSKSEISSLC(SEQ ID NO：54)
>人RLN3 B鏈
RAAPYGVRLCGREFIRAVIFTCGGSRW(SEQ ID NO：55)
>人RLN2 A鏈(Z10LYS)
X10LYSALANKCCHVGCTKRSLARFC，其中，X10為Q或D
(SEQ ID NO：56)
>人RLN2 B鏈(E突變為D)
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS(SEQ ID NO：57)。
一些實施方案中，該融合蛋白包含1個前述免疫球蛋白單一可變域和1個前述鬆弛素或其類似物。一些實施方案中，該融合蛋白包含1個前述免疫球蛋白單一可變域和2個前述鬆弛素或其類似物。一些實施方案中，該融合蛋白包含2個前述免疫球蛋白單一可變域和1個前述鬆弛
素或其類似物。一些實施方案中，該融合蛋白包含2個前述免疫球蛋白單一可變域和2個前述鬆弛素或其類似物。
一些實施方案中，該融合蛋白包含如式(I)至式(IV)任一所示或任意組合的多肽：
B-L1-A-L2-VHH 式(I)
A-L1-B-L2-VHH 式(II)
VHH-L2-B-L1-A 式(III)
VHH-L1-A-L1-B 式(III)
其中，A是前述任一的鬆弛素A鏈，B是前述任一的鬆弛素B鏈，L1和L2是連接子，可以各自獨立地存在或不存在。
一些實施方案中，L1包含選自(GGGGQ)n(SEQ ID NO：73)、(GGGQ)n、(GGGGS)n、(PGPQ)n和(PGPA)n的胺基酸序列，該n選自1-10的整數，例如3、4、5、6、7、8。
一些實施方案中，L1包含SEQ ID NO：33-35任一所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，L2包含(GXSY)Z的胺基酸序列，該X、Y、Z獨立的選自1-10的整數，例如L2是(GGGGS)z，該Z選自1-10的整數，例如3、4、5、6、7、8。
一些實施方案中，L2包含SEQ ID NO：49所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，L2包含選自KR、KRKPTGYGSRKKR(SEQ ID NO：65)、KRKPTGYGSRKR(SEQ ID NO：66)、KRGGGPRR(SEQ ID
NO：60)、KRGGGPKR(SEQ ID NO：61)、KRKPTGYGSKR(SEQ ID NO：62)、KRSLKR(SEQ ID NO：63)任一或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，該融合蛋白是單鏈蛋白。
一些實施方案中，該融合蛋白是多聚體，例如二聚體蛋白。
以下給出示例性的實施方案：
融合蛋白，包含血清白蛋白結合結構域和鬆弛素或其類似物，該血清白蛋白結合結構域包含免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含如SEQ ID NO：8、9和10所示的CDR1、CDR2和CDR3，或如SEQ ID NO：11、12和13所示的CDR1、CDR2和CDR3；該鬆弛素或其類似物包含如SEQ ID NO：31、32所示的A鏈和B鏈，或如SEQ ID NO：50、51所示的A鏈和B鏈，或如SEQ ID NO：52、53所示的A鏈和B鏈，或如SEQ ID NO：54、55所示的A鏈和B鏈，或如SEQ ID NO：31、53所示的A鏈和B鏈，或如SEQ ID NO：52、32所示的A鏈和B鏈，或如SEQ ID NO：56、57所示的A鏈和B鏈。
融合蛋白，包含血清白蛋白結合結構域和鬆弛素或其類似物，該血清白蛋白結合結構域包含免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含如SEQ ID NO：6、18-27任一所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，或如SEQ ID NO：7所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；該鬆弛素或其類似物包含如SEQ ID NO：31、32所示的A鏈和B鏈，或如SEQ ID NO：50、51所示的A鏈和B鏈，或如SEQ ID NO：52、53所示的A鏈和B鏈，或如SEQ ID NO：
54、55所示的A鏈和B鏈，或如SEQ ID NO：31、53所示的A鏈和B鏈，或如SEQ ID NO：52、32所示的A鏈和B鏈，或如SEQ ID NO：56、57所示的A鏈和B鏈。
一些實施方案中，提供融合蛋白，包含如SEQ ID NO：36-43任一所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，本揭露的融合蛋白對RXFP1受體的結合親和力與天然人鬆弛素2(SEQ ID NO：31和53)的結合親和力相當。另一些實施方案中，本揭露的融合蛋白對RXFP1受體的結合親和力小於與天然人鬆弛素2(SEQ ID NO：31和53)的結合親和力。另一些實施方案中，本揭露的融合蛋白對RXFP1受體的結合親和力大於與天然人鬆弛素2(SEQ ID NO：31和53)的結合親和力。
一些實施方案中，本揭露的融合蛋白較之天然人鬆弛素2(SEQ ID NO：31和53)顯著增長，例如具有體內血清白蛋白相當的體內半衰期(t1/2)，不同種屬中從十幾個小時到十幾天。
一些實施方案中，本揭露的融合蛋白以
1×10-7M，例如，
1×10-8M的KD值結合HSA。
一些實施方案中，本揭露的融合蛋白在體內和/或體外不阻斷血清白蛋白與FcRn的結合。
本揭露的融合蛋白涵蓋其藥學上可接受的鹽。
多核苷酸和載體
一些實施方案中，提供多核苷酸，其編碼本揭露的血清白蛋白結合分子。
一些實施方案中，提供多核苷酸，其編碼本揭露的融合蛋白。
該多核苷酸可為RNA、DNA或cDNA。根據本揭露的一些實施方案，本揭露的多核苷酸是分離的多核苷酸。
本揭露的多核苷酸也可呈載體形式，可存在於載體中和/或可為載體的一部分，該載體例如質粒、黏端質粒、YAC或病毒載體。載體可尤其為表達載體，即可提供血清白蛋白結合分子體外和/或體內(即在適合宿主細胞、宿主有機體和/或表達系統中)表達的載體。該表達載體通常包含至少一種本揭露的多核苷酸，其可操作地連接至一個或多個適合的表達調控元件(例如啟動子、增強子、終止子等)。針對在特定宿主中的表達對該元件及其序列進行選擇為所屬技術領域具有通常知識者的常識。對本揭露的血清白蛋白結合分子的表達有用或必需的調控元件及其他元件例如為啟動子、增強子、終止子、整合因子、選擇標記物、前導序列、報告基因。
本揭露的多核苷酸可基於本揭露的多肽的胺基酸序列的信息藉由已知的方式(例如藉由自動DNA合成和/或重組DNA技術)製備或獲得，和/或可從適合的天然來源加以分離。
宿主細胞
一些實施方案中，提供宿主細胞，其表達或能夠表達一種或多種本揭露的血清白蛋白結合分子、和/或含有本揭露的多核苷酸或載體的重組宿主細胞。
一些實施方案中，宿主細胞為細菌細胞、真菌細胞或哺乳動物細胞。
細菌細胞例如包括革蘭氏陰性細菌菌株(例如大腸桿菌(Escherichia coli)菌株、變形桿菌屬(Proteus)菌株及假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株)及革蘭氏陽性細菌菌株(例如芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株、鏈黴菌屬(Streptomyces)菌株、葡萄球菌屬(Stophylococcus)菌株及乳球菌屬(Lactococcus)菌株)的細胞。
真菌細胞例如包括木黴屬(Trichoderma)、脈孢菌屬(Neurospora)及麴菌屬(Aspergillus)的物種的細胞；或者包括酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、畢赤酵母屬(Pichia)(例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)及嗜甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica))及漢森酵母屬(Hansenula)的物種的細胞。
示例性地，哺乳動物細胞例如包括例如HEK293細胞、CHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞等。
本揭露也可使用兩栖類細胞、昆蟲細胞、植物細胞及本領域中用於表達異源蛋白的任何其他細胞。
本揭露的細胞不能發育成完成的植株或動物個體。
生產或製備方法
本揭露提供製備本揭露的血清白蛋白結合分子或融合蛋白的方法，其包括：
- 在允許表達本揭露的血清白蛋白結合分子或融合蛋白的條件下培養本揭露的宿主細胞；及
- 從培養物回收由該宿主細胞表達的血清白蛋白結合分子或融合蛋白；及
- 視需要地，包括進一步純化和/或修飾本揭露的血清白蛋白結合分子或融合蛋白。
本揭露的血清白蛋白結合分子或融合蛋白可在如上所述細胞中以細胞內方式(例如在細胞質中、在周質中或在包涵體中)產生，接著從宿主細胞分離且視需要進一步純化；或其可以細胞外方式(例如在培養宿主細胞的培養基中)產生，接著自培養基分離且視需要進一步純化。
用於重組產生多肽或蛋白的方法及試劑，例如特定適合表達載體、轉化或轉染方法、選擇標記物、誘導蛋白表達的方法、培養條件等在本領域中是已知的。類似地，適用於製造本揭露的結合分子或抗體等目的蛋白的分離及純化技術為所屬技術領域具有通常知識者所公知。生產和純化抗體的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南(5-8章和15章)。本揭露工程化的抗體也可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染細胞。哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端。藉由表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的株。陽性的株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩，離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
然而，本揭露的血清白蛋白結合分子或融合蛋白也可以藉由本領域已知的其它產生蛋白質的方法獲得，例如化學合成，包括固相或液相合成。
組成物
一些實施方案中，該組成物為醫藥組成物，其含有預防或治療有效量的如上所述的本揭露的血清白蛋白結合分子或融合蛋白，和/或編碼該血清白蛋白結合分子或融合蛋白的多核苷酸，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。
一些具體實施方案中，該醫藥組成物單位劑量中可含有0.01至99重量%的血清白蛋白結合分子或融合蛋白。另一些具體實施方案中，醫藥組成物單位劑量中含血清白蛋白結合分子或融合蛋白的量為0.1-2000mg；一些具體實施方案中為1-1000mg。
試劑盒和檢測
本揭露提供試劑盒或產品，其包含前述本揭露任意的血清白蛋白結合分子和/或編碼本揭露血清白蛋白結合分子的核酸分子。
本揭露提供檢測血清白蛋白的組成物，該組成物包含本揭露的血清白蛋白結合分子。本揭露還提供用於體內或體外檢測血清白蛋白的方法、系統或裝置，其包括使用本揭露的血清白蛋白結合分子。
一些實施方案中，體外檢測方法、系統或裝置可能例如包括(1)使樣品與本揭露的血清白蛋白結合分子接觸；(2)檢測在本揭露的血清白蛋白結合分子和樣品之間形成的複合物；和/或(3)使參比樣品(例如，對照樣品)與抗體接觸；和(4)藉由與參比樣品比較，確定抗體和樣品之間複合物
形成的程度。如與對照樣品或受試者中相比，樣品或受試者中複合物形成的變化(例如，統計學上的顯著變化)表示樣品中存在血清白蛋白。
另一些實施方案中，體內檢測方法、系統或裝置可以包括：(1)向受試者施用本揭露的血清白蛋白結合分子；和(2)檢測在本揭露的血清白蛋白結合分子和受試者之間複合物的形成。檢測可以包括確定形成複合物的位置或時間。結合血清白蛋白結合分子的抗體可以直接或間接地用可檢測物質標記以促進所結合的或未結合的抗體的檢測。合適的可檢測物質包括多種酶、輔基、螢光物質、發光物質和放射性物質。可以藉由測量與血清白蛋白結合分子結合或不結合的抗體或使其可視化，檢測在本揭露的血清白蛋白結合分子和血清白蛋白之間的複合物形成。可以使用常規檢測測定法，例如，酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)或組織免疫組織化學。一些實施方案中，藉由競爭免疫測定法分析樣品中血清白蛋白的存在，該競爭免疫測定法使用以可檢測物質標記的標準物和未標記的本揭露的血清白蛋白結合分子。檢測或測定的活體樣品可以是組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿液、糞便、組織液或培養液。
一些實施方案中，出於檢測目的，本揭露的血清白蛋白結合分子可以用螢光團或發色團標記。
治療、預防疾病的方法和製藥用途
本揭露提供了一種延長治療劑或診斷劑血漿半衰期的方法，其包括將本揭露的血清白蛋白結合分子或其免疫球蛋白單一可變結構域與該治療劑或診斷劑共價或非共價連接。用於連接的方法是本領域已知的，
或者可以是任何將來的方法，例如，可以藉由化學偶聯將其融合、在DNA水平上融合、在mRNA水平上融合或在蛋白質水平上融合等。
一些實施方案中，該治療或診斷性分子可以是治療靶標、診斷靶標。靶標可以是治療或診斷用途的任意蛋白質、肽、核酸、寡核酸、糖、多糖、糖蛋白。實例包括但不限於受體、受體配體、病毒外殼蛋白、免疫系統蛋白、激素、酶、抗原、細胞信號蛋白或其片段。
一些實施方案中，與本揭露的血清白蛋白結合分子或其免疫球蛋白單一可變結構域連接的治療劑或診斷劑的血漿半衰期與連接前相比提高了至少1.5倍，較佳至少2倍，例如至少5倍，例如至少10倍或大於20倍；例如，與連接前相比，增加的血漿半衰期可以大於1小時，較佳大於2小時，更佳大於6小時，例如大於12小時，或甚至大於24、48或72小時。
本揭露提供治療和/或預防疾病的方法，其包括向有需要的受試者施用治療和/或預防有效量的本揭露的血清白蛋白結合分子或融合蛋白。
本揭露還提供了血清白蛋白結合分子或融合蛋白用於治療和/或預防疾病的方法中，方法包括向有需要的受試者施用治療和/或預防有效量的本揭露的血清白蛋白結合分子或融合蛋白。
本揭露還提供了血清白蛋白結合分子在製備用於治療和/或預防疾病的藥物中的用途。
一些實施方案中，該疾病為纖維化疾病或心血管疾病。
一些具體實施方案中，該心血管疾病為心衰竭(心衰)、心肌肥厚。
圖1A至圖1C為血清白蛋白結合分子的ELISA結合實驗結果。
圖1A為抗HSA抗體與人血清白蛋白(HSA)的ELISA結合實驗結果。
圖1B為抗HSA抗體與猴血清白蛋白(CySA)結合的ELISA結合實驗結果。
圖1C為抗HSA抗體與小鼠血清白蛋白(mSA)結合的ELISA結合實驗結果。
圖2A和圖2B為抗HSA抗體對FcRn和HSA結合影響的實驗結果。
圖3為抗HSA抗體小鼠藥物代謝動力學研究中靜脈給藥後血漿中的藥時曲線。
圖4A至圖4B為抗HSA抗體小鼠藥物代謝動力學研究結果。
圖4A為採用非房室模型計算抗HSA抗體在血漿中的T1/2參數比較結果。
圖4B為Cl_obs(mL/(min*kg))參數比較結果。
圖5為本揭露融合蛋白(式(III))的結構示意圖。
圖6A為THP1細胞在無HSA條件下檢測融合蛋白體外活性結果。
圖6B為THP1細胞在體系含有1% HSA條件下檢測融合蛋白體外活性結果。
圖7A為融合蛋白在小鼠模型中的血漿藥時曲線。
圖7B為融合蛋白在大鼠模型中的血漿藥時曲線。
圖8為融合蛋白對小鼠心肌肥厚的作用實驗中，小鼠ISO心肌肥厚模型的心重/脛骨長比。
定義
為了更容易理解本揭露，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本揭露中的它處另有明確定義，否則本揭露使用的所有其它技術和科學術語都具有本揭露所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。
本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
“抗體”或“免疫球蛋白”無論是指重鏈抗體，還是指常規的由兩條重鏈和兩條輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈抗體，均用作一般術語以包括全長抗體、其單個的鏈以及其所有部分、結構域或片段(包括但不限於抗原結合結構域或片段，例如VHH結構域或VH/VL結構域)。
“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗體序列”、“單一可變結構域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的術語中)一般應理解為既包括相關胺基酸序列，又包括編碼該序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本揭露需要進一步限定的解釋。
多肽或蛋白的“結構域”是指折疊蛋白結構，其能夠獨立於蛋白的其餘部分維持其三級結構。一般而言，結構域負責蛋白的單個功能性質，且在許多情況下可添加、移除或轉移至其它蛋白而不損失蛋白的其餘部分和/或結構域的功能。
“免疫球蛋白結構域”是指抗體鏈的球形區域。
“免疫球蛋白可變結構域”是指基本上由“框架區1”(FR1)、“框架區2”(FR2)、“框架區3”(FR3)、及“框架區4”(FR4)，以及“互補決定區1”(CDR1)、“互補決定區2”(CDR2)、及“互補決定區3”(CDR3)組成的結構域。因此，可變結構域的一般結構(或序列)可如下表示為：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。可變結構域因具有抗原結合位點而賦予其對抗原的特異性。
“抗體框架(FR)”，是指可變結構域的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。
“免疫球蛋白單一可變結構域”通常用於指可以在不與其他可變結構域相互作用的情況下(例如在沒有如常規四鏈單株抗體的VH和VL結構域之間所需要的VH/VL相互作用的情況下)，形成功能性抗原結合位點的免疫球蛋白可變結構域(其可以是重鏈或輕鏈結構域，包括VH、VHH或VL結構域)。“免疫球蛋白單一可變結構域”的實例包括奈米抗體(包括
VHH、人源化VHH和/或駱駝化VH，例如駱駝化人VH)、IgNAR、結構域、作為VH結構域或衍生自VH結構域的(單結構域)抗體(諸如dAbsTM)和作為VL結構域或衍生自VL結構域的(單結構域)抗體(諸如dAbsTM)。基於和/或衍生自重鏈可變結構域(諸如VH或VHH結構域)的免疫球蛋白單一可變結構域通常是較佳的。免疫球蛋白單一可變結構域的一個具體實例為如下文定義的“VHH結構域”(或簡稱為“VHH”)。
“VHH結構域”，亦稱為重鏈單域抗體、VHH、VHH結構域、VHH抗體片段、VHH抗體、奈米抗體，是稱為“重鏈抗體”(即“缺乏輕鏈的抗體”)的抗原結合免疫球蛋白的可變結構域(Hamers-Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R.：“Naturally occurring antibodies devoid of light chains”；Nature363，446-448(1993))。使用術語“VHH結構域”以將該可變結構域與存在於常規四肽鏈結構抗體中的VH以及VL進行區分。VHH結構域特異性結合表位而無需其他抗原結合結構域(對於常規四肽鏈結構抗體中的VH或VL結構域，表位由VL結構域與VH結構域一起識別)。VHH結構域為由單一免疫球蛋白結構域形成的小型穩定及高效的抗原識別單元。術語“重鏈單域抗體”、“VHH結構域”、“VHH”、“VHH結構域”、“VHH抗體片段”、“VHH抗體”、“Nanobody®”以及“Nanobody®結構域”(“Nanobody”為Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商標)可互換使用。“VHH結構域”包括但不限於經駱駝科動物產生的天然抗體，也可以是駱駝科動物產生的抗體後再經人源化的，也可以是經噬菌體展示技術篩選獲得的。VHH結構域中的胺基酸殘基的總數將通常在110至120範圍內，
常常介於112與115之間。然而應注意較小及較長序列也可適於本揭露所述的目的。獲得結合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已揭露於以下文獻中：R.van der Linden et al.，Journal of Immunological Methods，240(2000)185-195；Li et al.，J Biol Chem.，287(2012)13713-13721；Deffar et al.，African Journal of Biotechnology Vol.8(12)，pp.2645-2652，17June，2009和WO94/04678。
如本領域中對於VH結構域及VHH結構域所公知的，各CDR中的胺基酸殘基的總數可能不同，且可能不對應於由Kabat編號指示的胺基酸殘基的總數(即根據Kabat編號的一個或多個位置可能在實際序列中未被佔據，或實際序列可能含有多於Kabat編號所允許數目的胺基酸殘基)。這意味著一般而言，根據Kabat的編號可能對應或可能不對應於實際序列中胺基酸殘基的實際編號。其它的編號系統或編碼規則包括Chothia、IMGT、AbM。
“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將非人CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量非人蛋白成分，從而誘導的強烈的免疫應答反應。為避免在免疫原性下降的同時引起活性的下降，可對該全人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。“人源化”的例子包括可將源自駱駝科的VHH結構域藉由以人常規四肽鏈結構抗體VH結構域中相應位置處存在的一個或多個胺基酸殘基置換原始VHH序列的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基而“人源化”人源化VHH結構域可含有一個或多個完全人框架區序列，且在一些具體實施方案中，可含
IGHV3的人框架區序列。人源化方法例如蛋白表面胺基酸人源化(resurfacing)及抗體人源化通用框架移植法(CDR grafting to a universal framework)，即將CDR“移植”於其它“支架”(包括但不限於人支架或非免疫球蛋白支架)上。適於該CDR移植的支架及技術在本領域中是已知的。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在VBase人種系序列數據庫，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。本揭露的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。此外，為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。
所屬技術領域具有通常知識者可以使用許多已知的編號方案中的任一種方案來確定抗體CDR的胺基酸序列邊界，已知的編號方案包括以下文獻中所述的編號方案：Kabat等人，見上文(“Kabat”編號方案)；Al-Lazikani等人，1997,J.Mol.Biol.,273：927-948(“Chothia”編號方案)；MacCallum等人，1996,J.Mol.Biol.262：732-745(“Contact”編號方案)；Lefran等人，Dev.Comp.Immunol.,2003,27：55-77(“IMGT”編號方案)和Honegge和Plückthun,J.Mol.Biol.,2001,309：657-70(“AHo”編號方案)；其各自均藉由引用整體併入。
“表位”或可互換使用的術語“抗原決定簇”指抗體所結合的抗原上的任何抗原決定簇。抗原決定簇通常包含分子的化學活性表面基團，例如胺基酸或糖側鏈，並且通常具有特定的三維結構特徵和/或特定的電荷特徵。例如，表位通常以獨特的空間構象包括至少3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14或15個連續或非連續的胺基酸，其可以是“線性”表位或“構象”表位。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris,Ed.(1996)。在線性表位中，抗原與相互作用分子(例如抗體)之間的所有相互作用的點沿著抗原的一級胺基酸序列線性存在。在構象表位中，相互作用的點跨越彼此分開的胺基酸殘基而存在。可使用本領域中熟知的許多表位定位技術鑑別給定抗原的表位。參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris,Ed.(1996)。舉例而言，線性表位可藉由例如以下方法來確定：在固體支持物上同時合成大量肽，其中這些肽對應於蛋白質分子的各部分，且使這些肽在仍然與支持物連接的情況下與抗體反應。這些技術在本領域中為已知的且描述於例如美國專利第4,708,871號；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002；Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23：709-715中。構象表位也可藉由諸如藉由例如x射線結晶學及二維核磁共振確定胺基酸的空間構形加以鑑別。可使用所屬技術領域具有通常知識者已知的常規技術，就與相同表位的結合競爭性篩選抗體。例如，可進行競爭和交叉競爭研究，以獲得彼此競爭或交叉競爭與抗原結合的抗體。基於它們的交叉競爭來獲得結合相同表位的抗體的高通量方法描述於國際專利申請WO03/48731中。因此，可使用所屬技術領域具有通常知識者已知的常規技術，獲得與本揭露的抗體分子競爭結合血清白蛋白上的相同表位的抗體及其抗原結合片段。
一般而言，術語“特異性”是指特定抗原結合分子或抗原結合蛋白(例如本揭露的血清白蛋白結合分子)可結合的不同類型抗原或表位的
數目。可基於抗原結合蛋白的親和力(affinity)和/或親合力(avidity)確定其特異性。由抗原與抗原結合蛋白的解離平衡常數(KD)所表示的親和力，是表位與抗原結合蛋白上抗原結合位點之間結合強度的量度：KD值越小，表位與抗原結合蛋白之間的結合強度越強(或者，親和力也可表示為結合常數(Ka)，其為1/KD)。如所屬技術領域具有通常知識者將瞭解，取決於具體感興趣的抗原，可以以已知方式測定親和力。親合力為抗原結合蛋白(例如免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單一可變結構域或含有其的多肽)與相關抗原之間結合強度的量度。親合力與以下兩者有關：與其抗原結合蛋白上的抗原結合位點之間的親和力，以及存在於抗原結合蛋白上的相關結合位點的數目。
“血清白蛋白結合結構域”意指任何能夠特異性結合血清白蛋白或其表位的多肽。“血清白蛋白結合分子”意指任何能夠特異性結合血清白蛋白或其表位的分子，包括但不限於蛋白、多肽。血清白蛋白結合分子可以包括針對血清白蛋白或其表位的如本揭露定義的抗體或其抗原結合片段，或包含該抗體、其抗原結合片段的綴合物、融合蛋白。抗原結合片段例如為sdAb或雙特異性抗體、多特異性抗體。本揭露的血清白蛋白結合分子可以包含至少一個(例如，2、3、4或更多個)結合血清白蛋白的免疫球蛋白單一可變結構域(如VHH)。本揭露的血清白蛋白結合分子除免疫球蛋白單一可變結構域外也可包含連接子和/或具有效應分子功能的部分，該效應分子包括但不限於診斷劑或治療劑，例如，抗腫瘤劑、免疫調節劑、發色團、螢光團、化學發光化合物、酶、金屬離子以及其任何組合。
“親和力成熟”的血清白蛋白抗體(如VHH)，在一個或多個CDR中具有一個或多個變化，該變化導致對血清白蛋白的親和力相比於其親本抗血清白蛋白抗體有所增加。親和力成熟的抗血清白蛋白抗體可藉由例如由以下所述的本領域中已知的方法來製備：Marks等人，1992,Biotechnology 10：779-783或Barbas等人，1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA 91：3809-3813.；Shier等人，1995,Gene 169：147-155；Yelton等人，1995,Immunol.155：1994-2004；Jackson等人，1995,J.Immunol.154(7)：3310-9；及Hawkins等人，1992,J.MoI.Biol.226(3)：889896；KS Johnson及RE Hawkins，“Affinity maturation of antibodies using phage display”，Oxford University Press 1996。
“回復突變”是指將人抗體來源的FR區胺基酸殘基突變成原始來源抗體對應位置的胺基酸殘基，通常是為了避人源化抗體引起的免疫原性下降的同時，引起的活性下降，對該人源化抗體可變區可進行最少反向突變，以保持抗體的活性。
通常，本揭露的血清白蛋白結合分子將以如於Biacore或KinExA或Fortibio測定中測量的較佳10-7至10-10莫耳/升(M)、更佳10-8至10-10莫耳/升、甚至更佳10-9至10-10或更低的解離常數(KD)，和/或以至少10-7M、較佳至少10-8M、更佳至少10-9M，更佳至少10-10M的結合常數(Ka)結合所要結合的抗原(即血清白蛋白)。任何大於10-4M的KD值一般都視為指示非特異性結合。抗原結合蛋白對抗原或表位的特異性結合可以以已知的任何適合方式來測定，包括例如本揭露所述的表面電漿共振術
(SPR)測定、Scatchard測定和/或競爭性結合測定(例如放射免疫測定(RIA)、酶免疫測定(ELISA)及夾心式競爭性測定。
術語“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。
本揭露中“同源性”、“同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源；如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源，那麼兩個序列為95%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
“保守胺基酸突變”或“保守(胺基酸)取代”是指將蛋白或多肽的某個或多個胺基酸殘基進行保守胺基酸替換，替換前的胺基酸殘基與替換後的胺基酸殘基的化學結構類似，且提換對蛋白或多肽的功能、活性或其他生物性質影響較小或基本上無影響。該保守胺基酸替換在本領域中是公知的，例如保守胺基酸替換較佳是以下組(i)-(v)內的一個胺基酸被同一組內的另一胺基酸殘基所取代：
(i)較小脂族非極性或弱極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；
(ii)極性帶負電殘基及其(不帶電)醯胺：Asp、Asn、Glu及Gln；
(iii)極性帶正電殘基：His、Arg及Lys；(iv)較大脂族非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及
(v)芳族殘基：Phe、Tyr及Trp。
特別佳地保守胺基酸取代如下：Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；Val被Ile或Leu取代。
“核酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”在本揭露可互換使用，指的是單鏈或雙鏈的任何DNA分子或RNA分子以及在單鏈的情況下，它的互補序列的分子，較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至該編碼序列。
術語“載體”是指能夠運輸與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本揭露中的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。
本揭露使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮傳代數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。
“宿主細胞”包括各個細胞或細胞培養物，其可為或已是用於摻入核酸***片段的載體的受體。宿主細胞包括單個宿主細胞的子代，並且由於天然、偶然或有意的突變，子代可不一定與原始親本細胞完全相同(在形態學或基因組DNA互補體中)。宿主細胞包括用本揭露的核酸在體內轉染和/或轉化的細胞。“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本揭露所述融合蛋白、血清白蛋白結合分子、多核苷酸與其他組分的混合物，該其他組分例如生理學/藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
“給予”、“施用”和“處理”當應用於動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”、“施用”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細
胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”、“施用”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑(如本揭露的融合蛋白)，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床有測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本揭露的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。“和/或”應視為特定揭示兩種指定特徵或組分中的每一者具有或不具有另一者。因此，諸如本揭露中“A和/或B”的詞組中所用的術語“和/或”包括“A及B”、“A或B”、“A”(單獨)及“B”(單獨)。除非上下文另外清楚要求，否則在整個說
明書和申請專利範圍中，應將詞語“包含”、“具有”、“包括”等理解為具有包含意義，而不是排他性或窮舉性意義；也即，“包括但不僅限於”的意義。
本揭露的“受試者”、“患者”意指哺乳動物，尤其靈長類動物，尤其是人。
本揭露的序數詞“第一”、“第二”、“L1”、“L2”等，不意圖對數量、水平、等級、順序構成限制，目的僅在於區別不同的元素、步驟、技術特徵。
實施例
以下結合實施例進一步描述本揭露，但這些實施例並非限制著本揭露的範圍。本揭露實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1. 血清白蛋白抗原及檢測用蛋白的製備
1.人血清白蛋白的設計與表達：
以人血清白蛋白(HSA)為模板，設計缺失部分C-末端胺基酸的檢測用蛋白的胺基酸序列。
人血清白蛋白全長胺基酸序列：
(註：斜體下劃線部分為信號肽；斜體加粗部分為前肽)。
白蛋白與FcRn結合區分佈在白蛋白分子的第三結構域，根據分子模擬結構設計了缺失C-末端第三結構域部分胺基酸的白蛋白分子(同時在C-末端融合了Avi-his標簽)：
(註：斜體為Avi-his標簽)。
2.猴血清白蛋白全長胺基酸序列：
(註：斜體下劃線部分為信號肽；斜體加粗部分為前肽)。
3.小鼠(mouse)血清白蛋白全長胺基酸序列：
(註：斜體下劃線部分為信號肽；斜體加粗部分為前肽)。
4.大鼠(Rat)血清白蛋白全長胺基酸序列：
(註：斜體下劃線部分為信號肽；斜體加粗部分為前肽)。
實施例2. 特異性結合人血清白蛋白(HSA)的抗體篩選
1.駱駝免疫
使用商品化的人血裡提取的血清白蛋白(Sigma,Cat No.126658)免疫內蒙古天然雙峰駝。取免疫前的駱駝血清5mL並分離血清。將弗氏完全或不完全佐劑與抗原按體積1：1混合後，對駱駝進行皮下多點免疫(免疫劑量為100μg蛋白/隻/每次)。每兩週進行一次加強免疫，免疫四次後測定效價。用5μg/mL人血清白蛋白(HSA)包被平板(Costar,Cat.No,9018)，100μL/孔，4℃放置過夜。第二天使用PBST(0.05% Tween20)洗滌三次，300μL/孔，之後加入4%的脫脂奶粉進行封閉，37℃，2h。洗滌後加入梯度稀釋的免疫駱駝的血清，37℃，1h進行孵育。陰性對照為同樣梯度稀釋的免疫前血清和空白PBS溶液。孵育結束後用PBST洗滌三遍，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗駱駝Fc的多抗(Thermo,Cat No.A16060，1：5000稀釋)，37℃孵育1小時。再次洗滌後加入TMB顯色液進行顯色，用1M硫酸進行終止，使用SpectraMax M5酶標儀在OD450nm波長下讀
取吸收值。1：51200倍稀釋後檢測到效價。效價合格，採集駱駝外周血進行建庫。
2.噬菌體文庫建立
取100-200mL駱駝外周血，使用Ficoll方法分離外周血淋巴細胞(PBMC)，細胞計數為1.2×108個，加入Trizol試劑重新懸浮(1×107個細胞/mL Trizol)，以裂解細胞，冰上放置5min；13000rpm離心3min，取上清，丟棄沉澱；加入1/5體積的氯仿，劇烈震盪30-60s，冰浴靜置2min；13000rpm離心10min，吸取上層水相層至新的1.5mL管中；加入等體積的異丙醇，混勻，-20℃靜置30min；13000rpm離心10min，去掉上清，保留沉澱；加入預冷的75%乙醇洗滌沉澱，室溫放置5-10min；加入RNA酶去除的去離子水600μL，複溶，得到RNA，逆轉錄得到cDNA，進行噬菌體文庫的構建。
3.噬菌體文庫的篩選
缺失C-末端第三結構域部分胺基酸的HSA蛋白(又稱截短的HSA，序列如SEQ ID NO：2所示)在HEK293細胞進行表達並純化，使用此蛋白進行噬菌體文庫的篩選。藉由篩選來獲得與HSA具有親和力的抗體。
用10μg上述截短的HSA-avi-生物素蛋白結合1mg Dynabeads M-280鏈黴親和素(Invitrogen，Cat No.11206D)，室溫放置一小時後，使用1×PBS洗滌3次，用2%脫脂奶室溫封閉2小時，加入駱駝重鏈單域抗體噬菌展示文庫，在室溫下作用1小時。用PBST(0.05% Tween-20)溶液洗9遍，去除不結合的噬菌體。用1mg/mL的胰蛋白酶將與截短的
HSA特異性結合的噬菌體沖提，並侵染處於對數期生長的大腸桿菌TG1，產生並純化噬菌體用於下一輪篩選。相同篩選過程重複1-2輪後，陽性的株序列被富集。
4.噬菌體ELISA鑑定
從最後一輪篩選得到的株中挑取單株菌落包裝成噬菌體單鏈抗體，用於噬菌體ELISA測試。ELISA板上分別過夜包被2μg/mL的人、猴、小鼠血清白蛋白(HSA、CySA、mSA)，4%的脫脂牛奶37℃封閉1小時以後，加入使用2%脫脂牛奶進行封閉的噬菌體上清，常溫下作用1小時，PBST(0.05% Tween 20)洗滌3次，加入抗M13 HRP檢測。將ELISA結合測試中與三種白蛋白OD450值都大於0.5的株進行測序，得到50個特異性序列。將僅同時與人和猴血清白蛋白呈現高OD450值的部分抗體進行測序，得到另外7個新的特異性序列。噬菌體篩選獲得57個新的特異性序列。
實施例3. 抗體哺乳動物細胞表達載體的構建
將實施例2藉由噬菌體庫篩選得到的57個特異性序列進行歸類整理，對其中的19個序列進行了選殖，對這19個抗HSA抗體的噬菌體上清ELISA結合進行測試，其中#7和#9株的OD450值如表1所示。
>#7aHSA
>#9aHSA
以上序列SEQ ID NO：6、7中，順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，下劃線分別為CDR1、CDR2、CDR3序列。本揭露提供的抗HSA抗體按照Kabat編碼的CDR序列總結如表2。
因此，我們提供如下抗HSA抗體的CDR：
CDR1為X1SCX2G，其中，X1為T或N，X2為M或L；
CDR2為X3IYX4VGGSTFYX5X6SVKG(SEQ ID NO：58)，其中，X3為S或T，X4為T或M，X5為T或A，X6為N或D；
CDR3為GSPARCX7X8RDPTTFX9Y(SEQ ID NO：59)，其中，X7為R或L，X8為L或R，X9為D或N。
將VHH序列融合人IgG1-Fc(CH2-CH3)，並構建到PTT5表達載體中，所連接的人IgG1-Fc的序列如下所示：
>人IgG1-Fc
以下是VHH序列融合人Fc(CH2-CH3)段的全序列，單下劃線是人IgG1-Fc(CH2-CH3)段序列(SEQ ID NO：14所示)，雙下劃線為連接子序列。全序列如下：
>#7aHSA-IgG1Fc：
>#9aHSA-IgG1Fc：
實施例4. 抗HSA抗體的表達、篩選與檢測
將融合了人IgG1-Fc的#7aHSA和#9a抗HSA抗體分別在HEK293細胞進行瞬時表達和ProteinA親和純化。之後藉由ELISA結合實驗、Biacore蛋白相互作用實驗進行檢測。
藉由ELISA結合實驗檢測#7aHSA和#9a抗HSA抗體對於人、猴和小鼠血清白蛋白的體外結合能力，測試用抗原為人血清白蛋白(Sigma，Cat No.126658)，猴血清白蛋白(Abcam，Cat No.ab184894)和小鼠血清白蛋白(Abcam，Cat No.ab183228)。其中：陰性對照為PBS，陽性對照使用融合了人IgG1-Fc的ALB8(可變區序列來自Ablynx專利公開WO 2008/028977 A2中的ALB8的序列)，序列如下：
>ALB8-IgG1-Fc
(註：單下劃線為IgG1的Fc區，雙下劃線為連接子區)。
用pH 7.4的PBS緩衝液將人、猴、小鼠白蛋白稀釋至1μg/mL，以100μL/孔的體積加入96孔酶標板(Corning，Cat No.9018)，於4℃放置過夜16-20小時。棄去液體後，用PBST(pH7.4，0.05% Tween-20)緩衝液洗板三次後，加入用PBS緩衝液稀釋的2%脫脂奶粉封閉液(300μL/孔)，37℃孵育1小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板3次後，加入初始濃度為2μg/mL的抗HSA抗體，用PBS緩衝液進行三倍比稀釋11個梯度，置於25℃孵育1小時。孵育結束後，棄去板中的反應液，用PBST洗板3次，每孔加入100μLHRP標記的山羊抗人IgGFc的二抗(Jackson immu，109-035-190)(1：5000稀釋)，25℃孵育1小時。用PBST洗板3次後，加入100μL TMB顯色受質進行顯色，使用1M硫酸終止反應，用SpectraMax M5酶標儀在OD450nm處讀取吸收值，使用GraphPad prism對吸收值和抗體濃度用4參數擬合作圖，結果如圖1A至圖1C所示；計算抗體對抗原的結合EC50值，結果如表3所示。
此外，還藉由Biacore T200(GE Healthcare)儀器測定融合了人IgG1Fc的抗HSA抗體與人、猴、小鼠白蛋白(HSA、CySA、mSA)的親和力常數。首先將protein A使用胺基偶聯試劑盒(GE，Cat.BR-1000-50)共價偶聯到CM5 S series芯片(GE，Cat.29-1049-88)上，抗HSA抗體藉由親和捕獲至偶聯了protein A的芯片上，然後於芯片表面流過不同濃度的人、猴、小鼠白蛋白，利用Biacore儀器實時檢測反應信號從而獲得結合解離曲線，藉由BIAevaluation version 4.1，GE軟體以Langmuir 1：1結合模型進行擬合，獲得親和力常數。實驗使用緩衝液為HBS-EP溶液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA,0.05% P20，pH 7.4，GE，Cat.# BR-1006-69)。每個循環結束後使用PH1.5甘胺酸-鹽酸(GE，Cat.# BR-1003-54)對芯片進行再生。親和力結果如表4所示。
實施例5. 抗HSA抗體的人源化改造
藉由對選定的特異性抗HSA抗體分子#7aHSA進行三維結構同源建模，結合與V-base人種系序列數據庫，IMGT人類抗體重鏈可變區種系基因數據庫進行比對的結果，挑選與篩選出來的抗體同源性高的重鏈可變區種系基因IGHV3-23作為模板，將駱駝來源單域抗體的CDR移植到相應的人源模板中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。對移植後的單域抗體再次進行三維結構模擬並分析。將FR區中影響CDR區結構形態的特定位點進行回復突變。改造後的抗體具有更高的穩定性。其中胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並註釋。其中#7_Hu-9和#7_Hu-10的FR中更多的保留了人種系序列，使其具有更低的免疫原性突變。
回復突變位點和突變方式設計如表5。
獲得的人源化具體序列如下，CDR區用下劃線表示，編碼規則為Kabat編碼：
>#7_Hu_1
>#7_Hu_2
>#7_Hu_3
>#7_Hu_4
>#7_Hu_5
>#7_Hu_6
>#7_Hu_7
>#7_Hu_8
>#7_Hu_9
>#7_Hu_10
使用實施例5中的方法構建人源化抗HSA抗體與hIgG1的Fc(CH2-CH3)段融合蛋白或者是融合了6His標簽的蛋白，單下劃線是hIgG1-Fc(CH2-CH3)段序列(SEQ ID NO：14所示)，斜體是6His標簽序列，雙下劃線為連接子序列。蛋白序列如下(以#7_hu_1-hIgG1Fc和#7_hu_10-6His為例，其他人源化抗HSA抗體也一樣)。對於抗體編號規則，#7_hu_10-6His即是#7_Hu_10(SEQ ID NO：26)的C末端融合“
HHHHHH”，其他抗體也是一樣。
>#7_hu_1-hIgG1Fc：
>#7_Hu_10-6His
>ALB8-6his
將質粒瞬時轉染HEK293細胞，細胞培養5天後收集表達上清，4000rpm離心15分鐘以去除細胞，收穫上清並使用0.45μM的濾器進行過濾，再使用Protein A管柱或則鎳管柱等本領域常規方法進行純化，分離獲得。經檢測，獲得本揭露的抗HSA抗體。
實施例6. 人源化抗HSA抗體與人、猴、小鼠血清白蛋白的親和力測定
藉由Biacore T200(GE Healthcare)儀器測定融合了6His標簽的人源化抗HSA抗體與人、猴、小鼠白蛋白的親和力常數。首先使用胺基偶聯試劑盒(GE，Cat.BR-1000-50)和His捕獲試劑盒(GE，Cat.28-9950-
56)根據試劑盒說明書對CM5 S series芯片(GE，Cat.29-1049-88)進行胺基偶聯，表面響應值達到約10000RU，乙醇胺封閉後待用；融合了6His標簽的人源化抗HSA抗體藉由親和捕獲至抗his的芯片上，然後於芯片表面流過不同濃度的人、猴、小鼠白蛋白，利用Biacore儀器實時檢測反應信號從而獲得結合解離曲線，藉由BIAevaluation version 4.1，GE軟體以Langmuir 1：1結合模型進行擬合，獲得親和力常數。實驗使用緩衝液為HBS-EP溶液(10mM HEPES，150mM NaCl,3mM EDTA,0.05% P20，pH 7.4，GE，Cat.# BR-1006-69)。每個循環結束後使用PH1.5甘胺酸-鹽酸(GE，Cat.# BR-1003-54)對芯片進行再生。部分人源化抗體的親和力結果如表6所示。結果顯示，本揭露篩選獲得的抗體與HSA的親和力與陽性對照相當或略好。
使用HEK293E細胞瞬時表達抗HSA抗體7_Hu_10-6his，鎳管柱親和純化後藉由Biacore T200(GE Healthcare)儀器測定其與人、猴、小鼠、大鼠、狗，兔白蛋白的親和力常數。首先使用胺基偶聯試劑盒(GE，Cat.BR-1000-50)和His捕獲試劑盒(GE，Cat.28-9950-56)根據試劑盒說明書對CM5 S series芯片(GE，Cat.29-1049-88)進行胺基偶聯，表面響應值達到約10000RU，乙醇胺封閉後待用；融合了6His標簽的人源化抗HSA抗體藉由親和捕獲至抗his的芯片上，然後於芯片表面流過不同濃度的人、猴、小鼠、大鼠、狗，兔白蛋白，利用Biacore儀器實時檢測反應信號從而獲得結合解離曲線，藉由BIAevaluation version 4.1，GE軟體以Langmuir 1：1結合模型進行擬合，獲得親和力常數。實驗使用緩衝液為HBS-EP溶液(10mM HEPES，150mM NaCl,3mM EDTA,0.05% P20，pH 7.4，GE，Cat.# BR-1006-69)。每個循環結束後使用PH1.5甘胺酸-鹽酸(GE，Cat.# BR-1003-54)對芯片進行再生。親和力結果如表7所示。
實施例7. 抗HSA抗體在穩定表達hFcRn的細胞中對FcRn和生物素-HSA結合的影響
抗HSA抗體對HSA與FcRn結合的阻斷效果藉由抗體對穩定表達hFcRn突變體的HEK293細胞(293-hFcRn-mut細胞)表面結合隨機生物素化HSA的螢光量變化的方式進行檢測。本實驗使用穩定表達hFcRn突變體(L320A，L321A)的HEK293細胞，該hFcRn突變體可較好地定位並維持在細胞膜表面。將表達hFcRn突變體的細胞和不同濃度的抗HSA抗體以及Biotin-HSA共同孵育，隨後加入SA-FITC二抗孵育，以二抗螢光信號(MFI)的減弱程度作為衡量抗HSA抗體對於生物素-HSA與FcRn結合阻斷作用的強弱。具體實驗方法如下：
將293-hFcRn-mut細胞用pH 5.5 PBS清洗兩次後，在U型孔96孔板中每孔加入5×105個細胞。離心並去上清後，每孔加入90μL以PBS(pH5.5)稀釋的抗HSA抗體以及10μL生物素-HSA(終濃度為250μg/mL)，在冰上共同孵育40分鐘。以200μL PBS(pH5.5)清洗兩次後，每孔加入100μL以PBS(pH5.5)稀釋的鏈黴親和素-FITC二抗(eBioscience，Cat No.11-4317-87)，稀釋比例1：200，在冰上孵育40分鐘。以200μL PBS(pH5.5)清洗兩次後，每孔加入200μL PBS(pH5.5)，用流式細胞儀(BD Biosciences,BD Accuri C6)與FL1通道測量螢光值，並使用Flowjo軟體對數據進行分析，用Prism6軟體對分析結果進行繪製。部分抗體的抑制作用測試結果見圖2A和圖2B。
結果分析：根據螢光信號值(MFI)判斷抗HSA抗體與HSA的結合是否阻斷HSA與FcRn的結合，如果螢光信號降低說明阻斷結合。
如圖2A所示，我們以生物素-HSA+FcRn穩轉細胞+SA-FITC組(不阻斷組)作為基線；生物素-HSA+HSA+FcRn穩轉細胞+SA-FITC組(HSA自競爭組)做陽性對照；Nc為同種型對照抗體。結果顯示，本揭露的抗HSA抗體#7_Hu_6-6his和#7_Hu_7-6his不會阻斷HSA與FcRn的結合。
如圖2B所示，#7_Hu_10-6his和#7_Hu_10不會阻斷HSA與FcRn的結合(1mg/mL濃度下檢測)。
這說明，本揭露的抗HSA抗體不會影響FcRn與HSA的PH依賴性的結合，可以很好的維持FcRn介導的血清白蛋白再循環機制。
實施例8. 抗HSA抗體在小鼠中的藥物代謝動力學
對本揭露抗HSA抗體(#7_Hu_6-6his；#7_Hu_7-6his；#7_Hu_10-6his)、陽性對照抗體(ALB8-6his)和同種型對照抗體(Isotype，非HSA結合的VHH分子)在CD-1雄性小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)中進行了藥物代謝動力學特徵研究。每組三隻小鼠，在第0天按照4mg/kg的劑量藉由尾靜脈注射給藥，在給藥前，給藥後5分鐘、1小時、7小時、24小時、48小時、72小時、96小時、120小時、144小時採集血樣，使用EDTA抗凝並離心製備血漿，用於並進行藥物代謝動力學測定。
PK測定：使用5μg/mL抗his的抗體(Thermo,MAI-21315-1mg)包被，以100μL/孔的體積加入96孔酶標板(Corning,Cat No.9018)，於4℃放置過夜16-20小時。棄去液體後，用PBST(pH7.4，0.05% Tween-20)緩衝液洗板三次後，加入Casin Blocker(Thermo,37528)封閉液(300μL/
孔)，37℃孵育箱孵育2小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板3次後，加入使用稀釋液(含有1%CD1小鼠血漿的Casin Blocker)進行適當稀釋的不同時間點的小鼠血漿，37℃孵育1.5個小時。孵育結束後，棄去板中的反應液，用PBST洗板3次，每孔加入100μL HRP標記的兔抗駱駝Cocktail VHH的二抗(Genescript,A02016，無BSA)(1：5000稀釋)，37℃孵育1小時。用PBST洗板3次後，加入100μL TMB顯色受質進行顯色，使用1M硫酸終止反應，用SpectraMax M5酶標儀在OD450nm處讀取吸收值。血漿樣品中的VHH抗體濃度根據標準曲線進行計算，結果如圖3所示。將計算出的濃度使用PK solver進行半衰期的計算，結果如圖4和表8所示。
結果顯示，本揭露的各抗HSA抗體#7_Hu_6-6his、#7_Hu_7-6his、#7_Hu_10-6his具有類似的pK曲線，半衰期在小鼠血清白蛋白的半
衰期範圍內，且優於陽性對照ALB8-6his抗體，清除率也低於ALB8-6his抗體。
實施例9. 融合蛋白的設計和製備
鬆弛素A鏈與B鏈藉由連接子連接形成單鏈鬆弛素分子，同時為提高半衰期，將單鏈鬆弛素分子與抗HSA的單域抗體進一步融合形成融合蛋白，結構示意圖如圖5。
>人RLN2 A鏈
QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO：31)
>人RLN2 B鏈(delB1)
SWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS(SEQ ID NO：32)
>連接子a
GGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQ(SEQ ID NO：33)
>連接子b
PGPAPGPAPGPAPGPAPGPAPGPAPGPAPGPA(SEQ ID NO：34)
>連接子c
PGPQPGPQPGPQPGPQPGPQPGPQPGPQPGPQ(SEQ ID NO：35)
>連接子d
GGGSGGSGGG(SEQ ID NO：49)
>0051
>0052
>0053
>0062
>0063
>0064
>0065
>0066
其中，斜體為抗HSA單域抗體；單下劃線為連接子1；雙下劃線為連接子2；粗體為鬆弛素2的B鏈；粗斜體為鬆弛素2的A鏈。連接子1可選連接子a、b、c，其中，a為柔性連接子，b、c為剛性連接子。
本實施例的陽性對照0054序列來自WO2021022139A1實施例7。
>0054
1.融合蛋白的製備：
對編碼融合蛋白(SEQ ID NO：36-44)的DNA序列進行密碼子優化，合成並選殖進pTT5表達載體，表達質粒瞬時轉染expiCHO(ThermoFisher,Cat No.A29127)細胞，使用ExpiFectamine CHO Transfection Kit(ThermoFisher,Cat No.A29133)，按試劑盒說明書進行轉
染。採用說明書中“High protocol”，轉染後第二天將細胞放置於32℃搖床懸浮震盪培養(5% CO2，110rpm，75%濕度)。轉染後第10-12天，收取細胞培養液上清，4000rpm離心20分鐘，取上清並使用0.45uM的濾器過濾使用。
2.融合蛋白的純化：
(1)A3親和層析捕獲融合蛋白：將表達融合蛋白的細胞培養上清進行高速離心收取上清，0.22um濾膜過濾。A3(JSR Life Sciences,Cat No.BP-AMS-A3-0100)親和管柱利用5倍管柱體積的0.1M NaOH(Sigma,Cat No.71687)再生，然後用5倍管柱體積的1×PBS(pH7.4)(Sangon Biotech(Shanghai)co.,Ltd.：Cat No.E607016-0500)清洗平衡。將過濾後上清低流速進行上樣，以便與親和管柱結合，控制流速使保留時間約1min或更長時間，結合完畢後分別利用5倍管柱體積的1×PBS(pH7.4)、5倍管柱體積的1×PBS(pH 7.4)0.8M NaCl(Vetec,Cat No.V900058)和5倍管柱體積的1×PBS(pH7.4)沖洗層析管柱至紫外吸收回落至基線水平。利用0.1M Glycine(pH3.0)(Sigma,Cat No.410225)緩衝液進行樣品沖提，根據紫外檢測收集沖提峰，沖提產物利用1M Tris-HCl(pH7.5)(Vetec,Cat No.V900483)快速調節pH至7-8，暫存。對於沖提產物，可以利用所屬技術領域具有通常知識者熟知的方法進行溶液置換，如利用超濾管進行超濾濃縮，及溶液置換至所需的緩衝體系，或者利用分子排阻(如G-25脫鹽)替換成所需的緩衝體系。
(2)疏水層析精純融合蛋白：首先，用緩衝液20mM Tris pH 7.5(Vetec,Cat No.V900483)1M Na2SO4(Sigma,Cat No.239313)按等體
積稀釋樣品，Phenyl 650M(Toyopearl,Cat No.0014478)疏水層析管柱用5倍管柱體積的0.5M NaOH(Sigma,Cat No.71687)再生，然後用10倍管柱體積的20mM Tris pH 7.5(Vetec,Cat No.V900483)0.5M Na2SO4(Sigma,Cat No.239313)清洗平衡。將稀釋後的樣品低流速進行上樣，以便與疏水管柱結合，控制流速使保留時間約2min或更長時間，結合完畢後利用5倍管柱體積的20mM Tris pH 7.5(Vetec,Cat No.V900483)0.5M Na2SO4(Sigma,Cat No.239313)沖洗層析管柱至紫外吸收回落至基線水平。用沖提緩衝液20mM Tris pH 7.5(Vetec,Cat No.V900483)進行0-100%的梯度沖提；根據SEC-HPLC(Column：TSKgel G3000SWXL,5μm,Cat No.008541)純度，檢測收集沖提峰。經兩步純化後融合蛋白產量如表9。對於沖提產物可以利用所屬技術領域具有通常知識者熟知的方法進行溶液置換，如利用超濾管進行超濾濃縮及溶液置換至所需的緩衝體系，或者利用分子排阻(如G-25脫鹽)替換成所需的緩衝體系。
兩步純化後，獲得了完整的高純度融合蛋白，並且本揭露的0051和0053分子在expiCHO中瞬時轉染的產量是相同條件下陽性對照分子0054的2倍。
實施例10. 融合蛋白與不同種屬血清白蛋白的親和力測定
利用Biacore T200(GE Healthcare)儀器測定0051與人、猴、大鼠、小鼠、犬、豬、兔和牛血清白蛋白的親和力。陽性對照為0054。使用人白蛋白HSA(Sigma,Cat No.126658)，猴白蛋白(Abcam,Cat No.ab184894)，大鼠白蛋白(Abcam,Cat No.ab198656)，小鼠白蛋白(Abcam,Cat No.ab183228)，兔白蛋白(Abcam,Cat No.ab188055)和牛白蛋白(Sigma,Cat No.B2064)進行實驗。
1.使用抗VHH抗體偶聯芯片進行親和力測定
使用胺基偶聯試劑盒(GE,Cat No.BR-1000-50)對S系列CM5傳感芯片(GE,Cat No.29-1049-88)進行抗VHH抗體(MonoRabTM Rabbit Anti-Camelid VHH Cocktail,Genescript,Cat No.A02014)的偶聯。使用10mM醋酸鈉pH4.5(GE,Cat No.BR-1003-50)將抗體稀釋到10μg/mL。CM5芯片經EDC/NHS活化後，流經稀釋好的抗VHH抗體，使表面響應值達到約5000RU，再用乙醇胺封閉後待用。
各種屬的白蛋白使用1XHBS-EP(10mM HEPES,pH 7.4,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05% Surfactant P20)進行系列梯度稀釋。使用偶聯好的抗VHH抗體芯片對待測融合蛋白分子進行捕獲，響應值30RU左右，然後於芯片表面流經不同濃度的血清白蛋白3分鐘，流速50μL/min，解離時間1-10分鐘(白蛋白種屬不同解離時間不同)，每個循環
結束後使用10mM甘胺酸-鹽酸PH1.5(GE,Cat No.BR-1003-54)對芯片進行再生。利用Biacore T200(GE)實時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線，得到的數據選擇合適的濃度點使用BIAevaluation version 4.1軟體以Langmuir 1：1結合模型進行擬合，得出親和力數值，結果見表10。
本揭露設計的不同的融合蛋白與人、猴、大鼠和牛血清白蛋白的親和力與陽性對照分子0054相當(數據未顯示)，表10示例性給出HSA和大鼠白蛋白結合結果。
2.使用白蛋白偶聯芯片進行親和力測定
使用胺基偶聯試劑盒(GE,Cat No.BR-1000-50)對S系列CM5傳感芯片(GE,Cat.29-1049-88)進行不同種屬血清白蛋白的偶聯。各種屬白蛋白稀釋到2μg/mL。CM5芯片經EDC/NHS活化後，流經稀釋好的白蛋白，使表面響應值達到約200(180至230)RU，之後再用乙醇胺封閉。空白對照通道同樣需要進行EDC/NHS活化和乙醇胺封閉。
0051和0054分子使用1XHBS-EP(10mM HEPES,pH 7.4,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05% Surfactant P20)進行一系列梯度稀釋：2000，666.66，222.22，74.074，24.69，8.23，2.74，0.91，0.305nM。0051和0054不同濃度的樣品分別流經白蛋白偶聯通道和空白通道3分鐘，流速50μL/min，解離時間4分鐘，每個循環結束後使用10mM甘胺酸-鹽酸PH1.5(GE,Cat.# BR-1003-54)對芯片進行再生。利用Biacore T200(GE)實時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線，得到的數據選擇合適的濃度點使用BIAevaluation version 4.1軟體以Langmuir 1：1結合模型進行擬合，得出親和力數值。
0051分子與人、猴、大鼠白蛋白的親和力與陽性對照分子0054相當，與小鼠和犬白蛋白的親和力弱於陽性對照分子0054(數據未顯示)。表11示例性給出HSA、大鼠、小鼠結果。
實施例11. 融合蛋白體外細胞生物活性
1、融合蛋白在THP-1細胞中的生物活性
THP-1是人外周血單核細胞(Procell,Cat No.CL-0233)，內源性表達的RXFP1受體，鬆弛素與THP-1細胞上的受體結合，誘導THP-1細胞產生cAMP。因此，本實例藉由檢測cAMP的產生量來測定融合蛋白的體外活性。本實施例使用均相時間分辨螢光(HTRF)cAMP-Gs Dynamic試劑盒(Cisbio,Cat No.62AM4PEB)並基於製造商的方案測定cAMP水平。0054、800814(源自WO2015067113A1)和0060(WO2021255127A1，RELAX0023)用於陽性對照。
>800814的A鏈
DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(SEQ ID NO：45)
>800814的B鏈
DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWS(SEQ ID NO：46)
>0060的A鏈
>0060的B鏈
實驗方法如下：細胞THP-1在37℃、5%CO2條件下培養，培養基為RPMI1640+0.05mM b-巰基乙醇+10%FBS+1%青黴素-鏈黴素雙抗。實驗當天，對數生長期的THP-1細胞經過離心收集後，重新懸浮在無血清培養基中，調整細胞密度為4×106個細胞/mL，並以每孔50μL的體積(20,000個細胞/孔)轉移至96孔測定板(Cisbio,Cat No.66PL96025)。將
待測融合蛋白樣品和作為陽性對照的0054、0060、800814在單獨的U底96孔板中使用試劑盒中的Stimulation Buffer 1進行10倍倍比系列稀釋，並以每孔5μL的體積轉移至含有THP-1細胞的96孔測定板中，在37℃、5% CO2條件下培養30分鐘，未添加待測樣品的細胞作為參考對照。使用試劑盒中的Lysis & Detection Buffer 1稀釋cAMP-d2(受體螢光基團)和anti-cAMP-cryptat(供體螢光基團)，將cAMP-d2以每孔5μL的體積添加到96孔測定板中除空白對照孔外的所有孔中，之後將anti-cAMP-cyptat添加到所有孔中，避光室溫孵育1小時。然後在Tecan(Infinite 200 PRO)上使用620nm和665nm波長進行讀數，用665nm處螢光強度/620nm處螢光強度X10,000的比率表示信號強度，使用Graphpad Prism進行非線性擬合繪製cAMP濃度曲線，得到待測樣品及對照誘導THP-1細胞產生cAMP的EC50值(nM)。結果見表12，圖6A和圖6B。
結果顯示，本揭露的各融合蛋白體外活性與陽性對照分子0054相當。
2、融合蛋白在過表達RXFP受體的CHO-K1細胞中生物活性
(1)瞬時轉染RXFP1和RXFP2受體的CHO-K1細胞的製備
使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher,Cat No.11668019)對CHO-K1細胞(CCTCC,Cat No.GDC0018)進行瞬時轉染，提前將CHO-K1細胞以6×105細胞/孔的濃度重新懸浮於6孔板中，在37℃、5% CO2條件下培養12小時後移去原培養基，加入1.5mL的無血清Ham's F-12K(Kaighn's)培養基(Gibco,Cat No.21127030)。對於每孔細胞：取兩支試管，試管1將3μg相應質粒DNA(人、狗、食蟹猴、大鼠、小鼠RXFP1受體或人RXFP2受體DNA質粒)溶於250μL Opti-MEM I減血清培養基中(Gibco,Cat No.31985070)，試管2將3μL的Lipofectamine 2000試劑溶於250μLOpti-MEM I減血清培養基中，室溫孵育5分鐘後將試管1中試劑加入到試管2中，輕柔混勻，室溫孵育20分鐘，逐滴加入到6孔板中(500μL/孔)，轉染6小時後換成完全培養基，繼續培養24小時，進行後續實驗。
(2)融合蛋白對其受體的體外激活作用
本實施例使用均相時間分辨螢光(HTRF)cAMP-Gs Dynamic試劑盒(Cisbio,Cat No.62AM4PEB)並基於製造商的方案測定cAMP水平。具體方法如下：
實驗當天，將轉染了人、狗、食蟹猴、大鼠或小鼠RXFP1受體的CHO-K1細胞經過離心收集後，重新懸浮在無血清培養基中，調整細胞密度為4×106細胞/mL，並以每孔50μL的體積(20,000個細胞/孔)轉移至96孔測定板(Cisbio,Cat No.66PL96025)。將待測樣品0051和作為陽性對照的0054、0060、800814在單獨的U底96孔板中使用試劑盒中的Stimulation Buffer 1進行10倍倍比系列稀釋，並以每孔5μL的體積轉移至含有THP1細胞的96孔測定板中，在37℃、5% CO2條件下培養30分鐘，未添加待測樣品的細胞作為參考對照。使用試劑盒中的Lysis & Detection Buffer 1稀釋cAMP-d2(受體螢光基團)和anti-cAMP-cryptat(供體螢光基團)，將cAMP-d2以每孔5μL的體積添加到96孔測定板中除空白對照孔外的所有孔中，之後將anti-cAMP-cyptat添加到所有孔中，避光室溫孵育1小時。然後在Tecan(Infinite 200 PRO)上使用620nm和665nm波長進行讀數，用665nm處螢光強度/620nm處螢光強度×10,000的比率表示信號強度，使用Graphpad Prism進行非線性擬合繪製cAMP濃度曲線，得到融合蛋白及對照誘導CHO-K1受體過表達細胞產生cAMP的EC50值(μM)。結果見表13和圖6B。
結果顯示，0051分子體外活性與對照分子0054和0060相當。
實施例12. 融合蛋白在大鼠中的藥物代謝動力學
雄性SD大鼠，4-6週齡，體重在200-250g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。飼養期間自由攝食飲水，12/12小時光/暗週期調節，溫度16-26℃，相對濕度40-70%。動物到達設施後，適應性餵養不小於7天。實驗開始前一天，對實驗動物進行編號，隨機分組，一共四組，每組3隻。實驗當天，四組實驗動物分別靜脈注射或者皮下注射受試藥物0051和0054。給藥劑量為4mg/kg，注射體積均為5mL/kg。
靜脈注射給藥方式於給藥前及給藥後0.5、1、3、6、24、48、72、96、120、168、192和240小時各時間點採血。皮下注射給藥方式於給藥前及給藥後3、6、24、48、72、96、120、168、192和240小時各時間點採血。每隻動物取全血0.03mL，EDTA-K2抗凝，取血後立即4500rpm離心5min，取上清於EP管中，-20℃保存，實驗結束後轉到-80℃保存。
血漿中0051和0054藥物濃度使用ELISA方法進行檢測：使用0.4μg/mL Anti-Relaxin 2/RLN2抗體(Abcam,Cat No.EPR21832-15)進行包被，以100μL/孔的體積加入96孔酶標板(Corning,Cat No.9018)，於4℃放置過夜16-20小時。棄去液體後，用PBST(pH7.4，0.05% Tween-20)緩衝液洗板三次後，加入4%牛血清白蛋白溶液(300μL/孔)，室溫下孵育1小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板3次後，加入使用稀釋液：含有1%大鼠血漿的Casin Blocker(Thermo,Cat No.37528)進行適當稀釋的不同時間點的大鼠血漿，37℃孵育1個小時。孵育結束後，棄去板中的反應液，用PBST洗板3次，每孔加入100μL HRP標記的兔抗駱駝Cocktail VHH的二抗(Genescript,Cat No.A02016，無BSA)(1：5000稀釋)，37℃孵育1小時。用PBST洗板3次後，加入100μL TMB(Sigma,Cat No.T0440)顯色受質進行顯色，使用1M硫酸終止反應，用SpectraMax M5酶標儀在OD450nm處讀取吸收值。
數據結果使用Graphpad Prism軟體分析，血漿樣品中的0051和0054分子濃度根據標準曲線進行計算，大鼠結果如圖7A所示。將計算出的濃度使用PK solver進行半衰期的計算，結果如表14所示。此外，我們以類似方法檢測了小鼠藥物代謝動力學，結果顯示，如圖7B，0051分子的AUC暴露量和t1/2與陽性對照分子0054相當。
大鼠的PK結果顯示，IV給藥後，0054的AUC大約為0051的2倍，2個分子的t1/2差異不大，SC給藥後0051的生物利用度高於0054。與0054分子相比，0051的表觀分佈容積(Vdss)更大，表明分子有更好的組織細胞屏障透過性；此外，0051有更長的表觀滯留時間(MRT)，預計分子體內發揮藥效作用的時間更長；此外皮下注射SC給藥後，0051的生物利用度(Bioavailability%)明顯高於0054。因此0051有更優的藥動學性質。
實施例13. 融合蛋白對小鼠心肌肥厚的作用
藉由皮下植入微型滲透壓泵(Alzet 1002)輸注異丙腎上腺素(ISO,Sigma,Cat.# I5627)製備C57BL/6J小鼠(Charles River Laboratories)心肌肥厚模型，將ISO溶於含有0.002%抗壞血酸鈉(Sigma,Cat.# 11140)的PBS緩衝液(Servicebio,Cat.# G4202)中，使其濃度為146mg/mL(根據小鼠平均體重25.8g計算)，輸注濃度為15mg/kg/d，連續輸注14天製備病理模型，第14天將滲透壓泵取出，模型對照組1進行安樂死並取材，其餘小鼠隨機分組，開始皮下注射融合蛋白或對照分子，給藥劑量和分組如表15。
在研究結束時，動物禁食6小時後測量小鼠體重，並對小鼠進行安樂死，測量心臟重量和脛骨長度。藉由心臟重量和脛骨長度的比值判斷心肌肥厚的情況。如圖8和表16。
以上計量數據以均數±標準差(mean±SD)表示，兩組比較採用Student t test檢驗，*p<0.05、**p<0.01 vs模型對照2組；#p<0.05 vs空白對照組。
小鼠輸注ISO可顯著引起心肌肥厚，給予本揭露的融合蛋白治療可以逆轉ISO引起的心肌肥厚至基線水平，所需劑量顯著低於對照0060。
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Claims (26)
- 一種融合蛋白，其包含血清白蛋白結合結構域和鬆弛素或其類似物，該血清白蛋白結合結構域包含免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含選自1)-3)任一項的CDR1、CDR2和CDR3：1)如SEQ ID NO：6、18-27任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，2)如SEQ ID NO：7所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，3)分別如SEQ ID NO：64、58、59所示胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，其中，該CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的；較佳地，該CDR1、CDR2和CDR3分別如SEQ ID NO：8、9和10所示，或如SEQ ID NO：11、12和13所示。
- 如請求項1所述的融合蛋白，其中該免疫球蛋白單一可變結構域經選自以下任一項改造的：駱駝源或人源化、親合力成熟、去除T細胞表位、降低抗體脫醯胺、降低抗體聚集、降低抗體異構化、或其組合；較佳地，該人源化改造的人種系基因的框架區模板來源於IGHV3-23。
- 如請求項1或2所述的融合蛋白，其中該免疫球蛋白單一可變結構域在以下位置中的至少一處包含胺基酸突變：第20、23、27、29、30、37、44、45、47、49、74、78、83和84位；該位置基於EU編號系統；較佳地，包含選自以下的至少一種胺基酸突變：20V、23V、27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G、49A、74A、78V、83Q或84P；更佳地，包含選自如下任一的胺基酸突變組合：27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G；20V、27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G；23V、27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G；27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G、74A；27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G、78V；27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G、49A；27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G、83Q、84P；27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G、84P；30L、37F、44E、45R、47G、84P；或30L、37F、44E、45R、47G。
- 如請求項1至3中任一項所述的融合蛋白，其中該免疫球蛋白單一可變結構域：包含SEQ ID NO：6、18-27任一所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：7所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
- 如請求項1至4中任一項所述的融合蛋白，其中該免疫球蛋白單一可變結構域為VHH。
- 如請求項1至5中任一項所述的融合蛋白，其中該鬆弛素或其類似物包含A鏈和B鏈，該A鏈具有SEQ ID NO：31、50、52、54、56任一該或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，該B鏈具有SEQ ID NO：32、51、53、55、57任一所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；較佳地，該A鏈和B鏈選自如下1)-7)的任一組合：1)SEQ ID NO：31所示的A鏈和SEQ ID NO：32所示的B鏈；2)SEQ ID NO：50所示的A鏈和SEQ ID NO：51所示的B鏈；3)SEQ ID NO：52所示的A鏈和SEQ ID NO：53所示的B鏈；4)SEQ ID NO：54所示的A鏈和SEQ ID NO：55所示的B鏈；5)SEQ ID NO：31所示的A鏈和SEQ ID NO：53所示的B鏈；6)SEQ ID NO：52所示的A鏈和SEQ ID NO：32所示的B鏈；7)SEQ ID NO：56所示的A鏈和SEQ ID NO：57所示的B鏈。
- 如請求項6所述的融合蛋白，其包含如式(I)至式(IV)任一所示或任意組合的多肽：B-L1-A-L2-VHH 式(I)A-L1-B-L2-VHH 式(II)VHH-L2-B-L1-A 式(III)VHH-L1-A-L1-B 式(III)其中，A是鬆弛素或其類似物的A鏈，B是鬆弛素或其類似物的B鏈，L1和L2是連接子，L1和L2各自獨立地存在或不存在。
- 如請求項7所述的融合蛋白，其中，L1包含選自(GGGGQ)n、(GGGQ)n、(PGPQ)n、(PGPA)n、(GXSY)Z所示的胺基酸序列，該n選自1-10的整數，該X、Y、Z獨立的選自1-10的整數；L2包含選自(GXSY)Z、KR、SEQ ID NO：60-63、65-66任一所示的胺基酸序列，該X、Y、Z獨立的選自1-10的整數；較佳地，L1包含SEQ ID NO：33-35任一所示的胺基酸序列；較佳地，L2包含SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至8中任一項所述的融合蛋白，其包含SEQ ID NO：36-43任一所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
- 如請求項1至9中任一項所述的融合蛋白，其為單鏈蛋白、二聚體或多聚體蛋白。
- 一種血清白蛋白結合分子，其包含免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含選自1)-3)任一項的CDR1、CDR2和CDR3：1)如SEQ ID NO：6、18-27任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，2)如SEQ ID NO：7所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，3)分別如SEQ ID NO：64、58、59所示胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，其中，該CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的；較佳地，該CDR1、CDR2和CDR3分別如SEQ ID NO：8、9和10所示，或如SEQ ID NO：11、12和13所示。
- 如請求項11所述的血清白蛋白結合分子，其中該免疫球蛋白單一可變結構域經選自以下任一項改造的：駱駝源或人源化、親合力成熟、去除T細胞表位、降低抗體脫醯胺、降低抗體聚集、降低抗體異構化、或其組合；較佳地，該人源化改造的人種系基因的框架區模板來源於IGHV3-23。
- 如請求項11或12所述的血清白蛋白結合分子，其中該免疫球蛋白單一可變結構域在以下位置中的至少一處包含胺基酸突變：第20、23、27、29、30、37、44、45、47、49、74、78、83和84位；該位置基於EU編號系統；較佳地，包含選自以下的至少一種胺基酸突變：20V、23V、27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G、49A、74A、78V、83Q或84P；更佳地，包含選自如下任一的胺基酸突變組合：27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G；20V、27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G；23V、27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G；27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G、74A；27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G、78V；27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G、49A；27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G、83Q、84P；27N、29Y、30L、37F、44E、45R、47G、84P；30L、37F、44E、45R、47G、84P；或30L、37F、44E、45R、47G。
- 如請求項11至13中任一項所述的血清白蛋白結合分子，其中該免疫球蛋白單一可變結構域：包含SEQ ID NO：6、18-27任一所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：7所示或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
- 如請求項11至14中任一項所述的血清白蛋白結合分子，其中該免疫球蛋白單一可變結構域為VHH。
- 如請求項11至15中任一項所述的血清白蛋白結合分子，其還包含人免疫球蛋白Fc區或組胺酸標簽；較佳地，該Fc區是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區。
- 如請求項11至16中任一項所述的血清白蛋白結合分子，其還包含一種或多種治療劑或診斷劑，較佳地，該治療劑或診斷劑與該免疫球蛋白單一可變結構域共價連接或融合；較佳地，該治療劑或診斷劑選自以下任一項：治療性或診斷性蛋白、多肽、核酸、小分子化合物。
- 如請求項11至17中任一項所述的血清白蛋白結合分子，其具有選自以下的至少一項的活性：(a)以1×10-7M，較佳
1×10-8M的KD值結合人血清白蛋白；
(b)未檢測到阻斷血清白蛋白與FcRn的結合；(c)當包含治療劑或診斷劑時，延長所述治療劑或診斷劑的血漿半衰期。 - 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至10中任一項所述的融合蛋白，或如請求項11至18中任一項所述的血清白蛋白結合分子。
- 一種載體，其包含或表達如請求項19所述的多核苷酸。
- 一種宿主細胞，其包含或表達如請求項20所述的載體。
- 一種生產或製備如請求項1至10中任一項所述的融合蛋白或如請求項11至18中任一項所述的血清白蛋白結合分子的方法，包括步驟：培養如請求項22所述的宿主細胞；回收該融合蛋白或血清白蛋白結合分子，以及視需要地，純化和/或修飾該融合蛋白或血清白蛋白結合分子。
- 一種延長治療劑或診斷劑血漿半衰期的方法，其包括：將如請求項11至18中任一項中所述的血清白蛋白結合分子所定義的免疫球蛋白單一可變結構域與該治療劑或診斷劑連接或融合。
- 一種醫藥組成物，其包含：如請求項1至10中任一項所述的融合蛋白、如請求項11至18中任一項所述的血清白蛋白結合分子、如請求項19所述的多核苷酸或如請求項20所述的載體；較佳地，該醫藥組成物進一步包含一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。
- 一種如請求項1至10中任一項所述的融合蛋白用於製備治療、預防疾病的藥物中的用途；較佳地，該疾病為纖維化疾病或心血管疾病；更佳地，該心血管疾病為心臟衰竭或心肌肥厚。
- 一種如請求項11至18中任一項所述的血清白蛋白結合分子在製備用於診斷、治療、預防疾病的藥物中的用途。
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