TW201317259A

TW201317259A - 釋放鬆弛素（ｒｅｌａｘｉｎ）之融合蛋白及其用途

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Publication number: TW201317259A
Application number: TW101124347A
Authority: TW
Inventors: 奧里奇霍普茲; 安卓亞斯威爾曼
Original assignee: 拜耳智慧財產有限公司
Priority date: 2011-07-08
Filing date: 2012-07-06
Publication date: 2013-05-01
Also published as: MX2014000316A; IL229753A0; JP2014529293A; WO2013007563A1; EP2729494A1; CN103649116A; BR112014000474A2; CA2840944A1; AU2012283235A1; US20140148390A1; AR087070A1; RU2014104302A; KR20140039257A

Abstract

本發明提供鬆弛素融合蛋白，其中一連接子將鬆弛素之羧基端與一延長半衰期之蛋白部分相連結，且該連接子包括一蛋白酶切割位點。因此，本發明提供具有半衰期延長之鬆弛素融合多肽，藉此該融合蛋白本身充作用以釋放具有生物活性之鬆弛素的貯庫。此外，本發明提供編碼前述融合多肽之核酸序列、含有該核酸序列之載體、表現該鬆弛素融合多肽之細胞、此等融合多肽的醫藥組成物以及醫藥用途。

Description

釋放鬆弛素(RELAXIN)之融合蛋白及其用途

本發明提供鬆弛素融合蛋白，其中一連接子將鬆弛素之羧基端與一延長半衰期之蛋白部分相連結，且該連接子包括一蛋白酶切割位點。因此，本發明提供具有半衰期延長之鬆弛素融合多肽，藉此該融合蛋白本身作為用以釋放具有生物活性之鬆弛素的貯庫(depot)。此外，本發明提供編碼前述融合多肽之核酸序列、含有該核酸序列之載體、表現該鬆弛素融合多肽之細胞、此等融合多肽的醫藥組成物以及醫藥用途。

鬆弛素2(H2 relaxin,RLN2)為胰島素超家族的一個成員，其為一個雙鏈肽，在遺傳層面上表現由N-端至C-端排列之典型B-C-A鏈前激素結構。這個超家族在人類中由7個基因所編碼的其他成員為鬆弛素基因RLN1、RLN3及類胰島素肽基因INSL3、INSL4、INSL5及INSL6。成員之間的整體序列同源性低；然而，種系分析顯示，這些基因是由RLN3源始基因(ancestral gene)演化而來(Hsu,S.Y.(2003)；Wilkinson,T.N.et al.(2005))。成熟蛋白具有約6000 Da的分子量，而且是原激素經原激素轉變酶1(PC1)與原激素轉變酶2(PC2)催化之酵素切割產物(Hudson P.et al.(1983))。所形成的A鏈與B鏈是藉由2個分子間半胱胺酸橋連結在一起；A鏈另外表現一個分子內雙硫鍵。

鬆弛素透過多重路徑對各種細胞類型起動多效性效應。其藉由結合至被稱為LGR7(富含白胺酸的G蛋白偶和受體7)(亦被稱為RXFP1(鬆弛素家族肽1受體))的第1型G蛋白偶和受體(類視紫質)賦予其活性，並且對LRG8/RXFP2(鬆弛素家族肽2受體)具有明顯較低的親和力(Kong RC et al.(2010))。在鬆弛素分子中，B鏈中的一個胺基酸模式(Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X)在所有鬆弛素肽中是高度保守的(Schwabe and Büllesbach(2007),Büllesbach and Schwabe(2000))，且對於此等肽與對應受體間的交互作用至關重要。鬆弛素結合至LGR7/RXFP1會使得腺苷酸環化酶活化以及增加第二傳訊分子cAMP。經由這個機制，例如鬆弛素2在大鼠心臟中媒介心房利鈉肽的釋放(Toth,M.et al.(1996))。鬆弛素2亦顯示對大鼠心房肌細胞的正向促心肌收縮作用(Piedras-Renteria,E.S.et al.(1997))。其他受到鬆弛素/LGR7複合物所活化的訊號轉導分子為磷脂肌醇-3激酶、酪胺酸激酶與磷酸二酯酶(Bartsch,O.et al.(2001),Bartsch,O.et al.(2004))。其他受到這個系統所活化的訊號轉導路徑包括會在大鼠與天竺鼠心臟中使得環狀GMP濃度增加的一氧化氮(NO)路徑(Bani-Sacchi,T.et al.(1995))。

鬆弛素對於諸如肺臟、腎臟、腦以及心臟的器官充當具有生物活性的多效性激素(Dschietzig T.et al.(2006))。鬆弛素的一個強烈抗纖維化活性以及血管舒張活性尤其是以此肽在各種動物疾病模型以及臨床研究中所得之正向效應的原因(McGuane J.T.et al.(2005))。於病理條件下，RLN2在心血管系統中具有多重有益效應。其在各種病理生理過程中維持組織恆定並保護受損傷的心肌。其表現出顯著的血管舒張效應，例如在囓齒動物冠狀動脈(Nistri,S.et al.(2003))以及其他器官的血管床中影響血流以及血管舒張。在自發性高血壓大鼠中，RLN2降低血壓，是由NO生成增加所調節的一種效應。

已在不同動物模型(諸如天竺鼠、大鼠與豬)中評估鬆弛素2的心臟保護活性(Perna A.M.et al.(2005),Bani,D.et al.(1998))。RLN2改善心肌損傷、發炎性細胞浸潤以及之後的纖維化，從而減輕嚴重的心室功能不全(Zhang J.et al.(2005))。

鬆弛素2表現出強烈的抗纖維化活性。在受損傷的組織中，纖維母細胞活化與增生會致使膠原蛋白生成增加與間質纖維化。心臟內的纖維化會隨著生物力學過載而增加，並且影響心室功能不全、重組與心律失常形成。在動物模型中，持續輸注鬆弛素2會抑制或甚至逆轉由心肌病變、高血壓、異丙基腎上腺素引起之心毒性、糖尿病心肌病變與心肌梗塞所致的心臟功能不全。抑制纖維生成或逆轉已形成的纖維化可以降低心室僵硬並增進舒張功能。值得注意的是，儘管鬆弛素2會降低異常的膠原蛋白累積，但其不會影響健康組織中的基本膠原蛋白含量，凸顯出鬆弛素2在治療用途上的安全性。

已在數個臨床研究中測試鬆弛素2作為多效性血管舒張劑對於治療罹患急性心臟衰竭的患者有非常好的結果。在這些研究中，鬆弛素2與有利緩解呼吸困難以及其他臨床結果相關(Teerlink J.R.et al.(2009),Metra M.et al.(2010))。

因為鬆弛素的活體內半衰期不長，必須每14至21天重複治療患者，因此化合物投藥必須連續輸注進行至少48小時。

此外，鬆弛素2亦可用於治療諸如胰臟炎、發炎相關疾病(如類風溼性關節炎)與癌症(Cosen-Binker L.I.et al.(2006)Santora K.et al.(2007))或硬皮病、肺臟纖維化、腎臟纖維化與肝臟纖維化(Bennett RG.(2009))。鬆弛素2降低人類MDA-MB-231乳癌細胞的異體移植腫瘤生長(Radestock Y,Hoang-Vu C,Hombach-Klonisch S.(2008))。

藉由化學方法合成鬆弛素2有困難。因為B鏈的溶解度低且需要費力、特地將半胱胺酸橋引入至A鏈與B鏈之間，透過這些方法而得到的活性肽產率相當低(Barlos K.K.et al.(2010))。另外，可以進行鬆弛素2的重組表現。為能在轉譯後修飾的期間有效切割前原肽以及分泌成熟與生物活性肽，按慣例以編碼原激素-轉變酶1及/或2之表現建構物來共轉染表現宿主細胞(Park J.I.et al.(2008))。然而，在異源性細胞中，前原肽的內切蛋白分解處理效率通常會明顯限制生物活性分子的生產(Shaw J.A.et al.(2002))。

重要的是，經靜脈內投藥的鬆弛素2在人類體內的半衰期低於10分鐘(Dschietzig T.et al.(2009))。因此，在臨床試驗中，鬆弛素2必須在48小時內持續投藥。故，增進鬆弛素或長效鬆弛素融合多肽的生物半衰期可能有極大益處。

增進生物半衰期可藉由化學修飾(諸如感興趣多肽的乙二醇化(PEGylation)或羥基化(HESylation)、引入額外非天然N-糖基化位點)，或藉由將此多肽分別與其他分子(諸如抗體的免疫球蛋白Fc片段、轉鐵蛋白、白蛋白、在活體內結合至其他媒介更長半衰期之分子的結合模式或其他蛋白)遺傳融合來進行。但是，IgG的Fc域融合至鬆弛素2的C端會導致就鬆弛素活性而言為不活化的分子。出乎意外地，發現到當Fc域被切除時，重新獲得鬆弛素活性。這意味著儘管融合蛋白不活化，鬆弛素仍正確折疊，但其活性被Fc域阻斷，或鬆弛素在釋放Fc域之後重新獲得正確折疊。用於抗補體前藥的Fc融合多肽揭示於J Biol Chem.2003 Sep 19；278(38)；36068-76。因此，本發明提供鬆弛素融合多肽，其中鬆弛素融合至延長半衰期的蛋白部分(諸如IgG的Fc域)，其中鬆弛素經由一連接子多肽連結至該延長半衰期的蛋白部分，該連接子多肽含有一個內切蛋白酶切割位點，產生一個相較於鬆弛素增進半衰期的多肽，透過內切蛋白酶的作用由該多肽釋放出活性鬆弛素。

本發明涉及半衰期延長之鬆弛素融合多肽作為釋放活性鬆弛素的前藥。

本發明的一個具體例是一種融合多肽，其包含鬆弛素、一包含內切蛋白酶切割位點的連接子肽，以及一延長半衰期的蛋白部分，其中該連接子肽連結鬆弛素以及該延長半衰期的部分。

在一個具體例中，前述鬆弛素為鬆弛素2或鬆弛素3。較佳為人類鬆弛素，諸如人類鬆弛素2或人類鬆弛素3。

在一個具體例中，前述延長半衰期之蛋白部分為一多肽，諸如IgG的Fc域、血清白蛋白、轉鐵蛋白或血清白蛋白結合蛋白或肽。較佳為人類或人類化延長半衰期之蛋白部分，諸如人類IgG的Fc域或人類血清白蛋白。

在一個較佳具體例中，前述連接子包含一針對內切蛋白酶/內切肽酶的切割位點，其中該內切蛋白酶/內切肽酶為細胞外內切蛋白酶/內切肽酶。在一個更佳具體例中，前述連接子含有一用於內切蛋白酶/內切肽酶的切割位點，其中該內切蛋白酶/內切肽酶為人類內切蛋白酶/內切肽酶。在一個更佳具體例中，該切割位點來自在血液中具活性的內切蛋白酶/內切肽酶，諸如凝血因數Xa。另外，膜連結或膜伸出型內切蛋白酶/內切肽酶的切割位點較佳，其具有針對血管腔的活性位點，諸如MMP12。於另一個較佳具體例中，該切割位點來自內切蛋白酶/內切肽酶，其活性在鬆弛素所要作用之位點處被增濃或具有專一性，例如在所要鬆弛素活性位點(例如特定器官或組織)處被專一表現及/或活化的內切蛋白酶/內切肽酶。在另一個較佳具體例中，該切割位點來自內切蛋白酶/內切肽酶，其在生理過程期間於特定時間點被表現及/或活化，例如在疾病發展的特定時間點。

在另一態樣中，本發明提供一種編碼前述融合多肽的多核苷酸。此一多核苷酸可進一步包含容許該融合多肽分泌之訊號肽的編碼序列。亦包括含有關於此等融合多肽之多核苷酸的載體。適當的載體為(例如)表現載體。本發明的又一個具體例為一種含有編碼前述融合多肽之一多核苷酸、一載體或表現載體的宿主細胞。本發明之宿主細胞可為真核細胞或原核細胞。真核細胞可為哺乳動物細胞或酵母菌或昆蟲細胞，較佳為哺乳動物細胞。原核細胞可為(例如)大腸桿菌細胞。

在另一個具體例中，本發明提供含有前述融合多肽的醫藥組成物。該醫藥組成物可調配成適用於靜脈內、腹膜內、局部、吸入或皮下投藥。

本發明的另一個具體例提供一種作為藥物的醫藥組成物或融合多肽。又一個具體例為醫藥組成物或融合多肽在治療心血管疾病、胰臟炎、發炎、癌症、硬皮病、肺臟纖維化、腎臟纖維化及腎臟纖維化中的用途。

發明詳細說明 定義：

術語「胺基酸殘基」欲指包含在由丙胺酸(Ala或A)、半胱胺酸(Cys或C)、天冬胺酸(Asp或D)、麩胺酸(Glu或E)、***酸(Phe或F)、甘胺酸(Gly或G)、組胺酸(His或H)、異白胺酸(Ile或I)、離胺酸(Lys或K)、白胺酸(Leu或L)、甲硫胺酸(Met或M)、天冬醯胺酸(Asn或N)、脯胺酸(Pro或P)、麩醯胺酸(Gln或Q)、精胺酸(Arg或R)、絲胺酸(Ser或S)、蘇胺酸(Thr或T)、纈胺酸(Val或V)、色胺酸(Trp或W)及酪胺酸(Tyr或Y)殘基所構成之群組中的胺基酸殘基。

術語「鬆弛素之活性」或「鬆弛素活性」定義為鬆弛素或其變體透過結合至其受體活化刺激性G蛋白Gs並因而產生第二傳訊者環狀AMP，及/或刺激PI3-激酶的能力。鬆弛素或其變體結合至LGR7會致使刺激性G蛋白Gs的細胞內活化，使得之後產生第二傳訊者環狀AMP(cAMP)。但是，cAMP生成是一種時間依賴性雙相反應。在起初短暫的Gs-腺苷酸環化酶-媒介之cAMP反應之後，受體訊號切換成抑制性G蛋白活化並藉此切換成PI3-激酶媒介之反應(Halls M.L.,Bathgate R.A.,Summers,R.J.(2005))。

術語「延長半衰期之部分」意指直接或經由連接子而被共價連結(「接合」)至鬆弛素融合多肽的醫藥上可接受的部分、結構域或「媒劑」。延長半衰期之部分因為包括(但不限於)下列之機制而正向地影響藥動學或藥效學行為：(i)預防或減輕鬆弛素融合多肽之活體內蛋白分解作用或其他活性減少化學修飾、(ii)藉由降低腎臟過濾、降低受體媒介之廓清或增加生物可利用性而增進半衰期或其他藥動學特性、(iii)降低毒性、(iv)增進溶解度、(v)增加鬆弛素融合多肽之生物活性及/或標的選擇性。此外，與鬆弛素融合多肽之未接合形式相較之下，延長半衰期之部分對於增進鬆弛素融合多肽之可製造性，及/或降低鬆弛素融合多肽之免疫原性具有正向影響。術語「延長半衰期之部分」包括延長半衰期之非蛋白部分，諸如PEG或HES，以及延長半衰期之蛋白部分，諸如血清白蛋白、轉鐵蛋白或Fc域。

「多肽」、「肽」及「蛋白」在本文中可交替地使用並包括具有兩個或更多個胺基酸透過肽鍵而連接的分子鏈。該等術語並非意指特定長度的鏈。該等術語包括多肽的轉譯後修飾，例如糖基化、乙醯基化、磷酸化及類似者。此外，蛋白片段、類似物、經突變或變體蛋白、融合蛋白及類似物包括在多肽、肽或蛋白的定義中。該等術語亦包括含有一或多個可被合成或使用已知蛋白工程技術重組表現之胺基酸類似物或非正統或非天然胺基酸的分子。另外，本發明融合蛋白可如本文所述藉由已知有機化學技術而取得。

術語「功能性變體」意指一種變體多肽，其就化學結構來說有別於野生型多肽並保有至少一些天然生物活性。在依據本發明之鬆弛素2變體的情況下，功能性變體是一種表現至少一些其天然活性(諸如活化鬆弛素受體LGR7)的變體。活化鬆弛素受體LGR7可藉由實驗方法中所揭示的方法來測定。

當意指本發明之多肽時，術語「片段」、「變體」、「衍生物」及「類似物」包括任何保有至少一些對應野生型鬆弛素多肽之受體活化特性的多肽。本發明多肽之片段可包括蛋白分解片段，與刪除片段，以及具有因為胺基酸置換、刪除或***所致的胺基酸序列改變的多肽。變體可能是天然的或非天然的。非天然的變體可使用技藝中熟知的致突變技術來製造。變體多肽可包含保守或非保守胺基酸置換、刪除或添加。變體多肽在本文中亦可意指為「多肽類似物」。如本文所用，多肽的「衍生物」意指一個具有一或多個藉由官能基反應而在化學上獲得之殘基的主體多肽。亦包括為「衍生物」者為那些含有一或多個20個標準胺基酸之天然胺基酸衍生物的肽。舉例而言，脯胺酸可置換為4-羥基脯胺酸；離胺酸可置換為5-羥基離胺酸；組胺酸可置換為3-甲基組胺酸；絲胺酸可置換為高絲胺酸；而離胺酸可置換為鳥胺酸。

術語「融合蛋白」或「融合多肽」意指蛋白包括衍生自超過一種母體蛋白或多肽的多肽組分及/或融合蛋白包括衍生自一或多個母體蛋白或多肽的蛋白結構域，其等並非以其野生型位向排列。通常，融合蛋白是由融合基因表現，其中編碼來自蛋白之多肽序列的核苷酸序列在框架內附屬於編碼來自不同蛋白之多肽序列的核苷酸序列，並視情況被一個連接子分開來或由其延伸。接著融合基因可由重組宿主細胞表現為單一蛋白。

術語「核苷酸序列」或「多核苷酸」欲表示兩個或多個核苷酸分子的連續延伸段。核苷酸序列可以是基因體、cDNA、RNA、半合成、合成來源，或其任何組合。

術語「EC₅₀」(半最大有效濃度)意指在特定實驗條件下引起在基線與最大值之間一半反應的治療化合物有效濃度。

術語「免疫原性」是與特定物質結合使用，欲表示該物質引起免疫系統反應的能力。免疫反應可以是細胞或抗體媒介的反應(更多免疫原性的定義參見，例如Roitt：Essential Immunology(8th Edition,Black-well))。通常，涉及觸發免疫反應(諸如T細胞增生)之誘發過程減低表示免疫原性減低。免疫原性減低可以使用任何技藝中已知的適當方法(例如活體內或活體外)來測定。

術語「聚合酶鏈反應」或「PCR」通常意指一種在活體外擴增所要核苷酸序列的方法，例如在美國專利第4,683,195號以及US 4,683,195號中所述。一般而言，PCR方法涉及使用能夠優先與模版核酸雜交的寡核苷酸引子來進行引子延伸合成的重複循環。

術語「載體」意指質體或其他核苷酸序列，其能夠在宿主細胞內複製或併入宿主細胞基因體中，且因而與可相容宿主細胞接合(載體-宿主系統)用於執行不同作用：增進核苷酸序列的選殖，亦即生產可用數量的序列、指揮由該序列所編碼之基因產物表現以及將核苷酸序列併入宿主細胞的基因體。該載體視其將執行的作用而含有不同組分。

「細胞」、「宿主細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」在本文中可交替使用且所有此等術語應理解為包括由細胞生長或培養而來的後代。

術語「功能性活體內半衰期」是以其一般含意來使用，亦即身體/目標器官中仍存在50%生物活性之多肽的時間，或多肽活性為初始值之50%的時間。

測定功能性活體內半衰期以外，可測定「血清半衰期」，亦即在被清除前，50%的多肽循環於血漿或血流中的時間，與多肽是否保有其生物功能無關。測定血清半衰期通常要比測定功能性活體內半衰期容易，且血清半衰期的量度通常是功能性活體內半衰期的一個良好指標。血清半衰期的替代術語包括「血漿半衰期」、「循環半衰期」、「血清廓清」、「血漿廓清」、「末期半衰期」及「廓清半衰期」。多肽是透過網狀內皮系統(RES)、腎臟、脾臟或肝臟；藉由組織因數、SEC受體或其他受體媒介減低，或藉由專一性或非專一性蛋白分解的一或多者作用而被廓清。通常，廓清端視蛋白的大小(相對於腎小球過濾的臨界值)、電荷、附接的醣鏈與存在細胞受體而定。要保留的功能通常是測定為受體結合或受體活化。功能性活體內半衰期及血清半衰期可藉由任何技藝中已知的適當方法來測定，且可例如通常涉及下列步驟：將適當劑量的感興趣蛋白或多肽適當地投與給哺乳動物；以規律間隔從該哺乳動物收集血液樣品或其他樣品；測定感興趣蛋白或多肽在該血液樣品中的水準或濃度；以及從由此得到的數據(圖)計算直到感興趣蛋白或多肽水準或濃度相較於適當參考時間點(例如i.v.施用不久之後的起始濃度)已降低達50%的時間。例如參考標準指南，諸如Kenneth,A et al：Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists and in Peters et al,Pharmacokinete analysis：A Practical Approach(1996)。亦參考"Pharmacokinetics",M Gibaldi and D Perron,published by Marcel Dekker,2nd Rev.edition(1982)。

「糖基化」為化學修飾，其中糖部分在特定位元元點被添加至多肽。多肽的糖基化通常為N連結或O連結。N連結意指醣部分附接至天冬醯胺酸殘基的側鏈。三肽序列Asn-X-Ser以及Asn-X-Thr(「N-X-S/T」)(其中X為脯胺酸以外的任一種胺基酸)是醣部分酵素附接至天冬醯胺酸側鏈的辨識序列。因此，這些三肽序列(或模式)在多肽中的存在與否產生可能的N連結糖基化位點。O-連結意指醣部分附接至絲胺酸與蘇胺酸的羥基基團氧。

「經單離」多肽或融合多肽是已被鑑定且自表現其的細胞組分及/或其所分泌的培養基中分離出來者。細胞的污染組分為幹擾融合多肽之診斷或治療用途的物質，且可能包括酵素、激素及其他蛋白或非蛋白溶質。在較佳具體例中，融合多肽經純化(1)成超過95重量%的融合多肽，當(例如)藉由勞氏法、UV-Vis光譜或藉由SDS-毛細凝膠電泳(例如透過Caliper LabChip GXII、GX90或Biorad Bioanalyzer device)測定時，且在更佳的具體例中超過99重量%、(2)至足以獲得N-端或內部胺基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)至依據SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用考馬斯藍或(較佳)銀染色的均質性。然而，經單離融合多肽通常是藉由至少一種純化步驟製備。

綜述

本申請案提供一種具有持久半衰期的鬆弛素融合蛋白。本申請案描述具有明顯延長的生物半衰期及明顯減低之生物活性的鬆弛素融合蛋白。由於鬆弛素藉由編碼在活體內具活性之蛋白酶切割位點之胺基酸段連結至延長半衰期之部分，並自鬆弛素融合蛋白釋放出功能性鬆弛素，此鬆弛素融合蛋白表現出藥理學貯庫效應。

本發明的一個具體例為一種包含鬆弛素-PCS-HEM的融合蛋白，其中鬆弛素為含有經處理A鏈與B鏈或其功能性變體之鬆弛素異二聚體，PCS為一種含有蛋白酶切割位點(PCS)的連接子多肽，而HEM為延長半衰期的蛋白部分(HEM)。

本發明的又一具體例為一種包含原鬆弛素-PCS-HEM的融合多肽，其中原鬆弛素為仍含有C鏈或其功能性變體之鬆弛素的未經處理原形式，PCS為一種含有蛋白酶切割位點(PCS)的連接子多肽，而HEM為延長半衰期的蛋白部分(HEM)。

本發明的另一個具體例為一種包含HEM-PCS-鬆弛素的融合蛋白，其中鬆弛素為含有經處理A鏈與B鏈或其功能性變體之鬆弛素異二聚體，PCS為一種含有蛋白酶切割位點(PCS)的連接子多肽，而HEM為延長半衰期的蛋白部分(HEM)。

本發明的又一個具體例為一種包含HEM-PCS-原鬆弛素的融合蛋白，其中原鬆弛素為仍含有C鏈或其功能性變體之鬆弛素的未經處理原形式，PCS為一種含有蛋白酶切割位點(PCS)的連接子多肽，而HEM為延長半衰期的蛋白部分(HEM)。

應理解，原鬆弛素是鬆弛素的一種原形式，其未經原激素轉變酶處理並包含呈其天然位向之鬆弛素B鏈、鬆弛素C鏈及鬆弛素A鏈。

鬆弛素-PCS-HEM及原鬆弛素-PCS-HEM為較佳具體例。

鬆弛素結構域：

在又一個具體例中，鬆弛素含有鬆弛素2 A鏈多肽或其功能性變體。在又一個具體例中，鬆弛素含有鬆弛素2 B鏈多肽或其功能性變體。

在又一個具體例中，鬆弛素含有鬆弛素2 A鏈多肽或其功能性變體，以及鬆弛素2 B鏈多肽或其功能性變體。

在一個較佳具體例中，鬆弛素A鏈多肽含有人類最小鬆弛素2 A鏈多肽(SEQ ID NO：7)或其功能性變體，或含有人類鬆弛素2 A鏈多肽(SEQ ID NO：6)或其功能性變體。在一個較佳具體例中，鬆弛素B鏈多肽含有人類鬆弛素2 B鏈多肽(SEQ ID NO：8)或其功能性變體。

在一個更佳具體例中，鬆弛素A鏈含有人類最小鬆弛素2 A鏈多肽(SEQ ID NO：7)或其功能性變體，或含有人類鬆弛素2 A鏈多肽(SEQ ID NO：6)或其功能性變體，且鬆弛素B鏈多肽含有人類鬆弛素2 B鏈多肽(SEQ ID NO：8)或其功能性變體。

在又一個具體例中，鬆弛素含有鬆弛素3 A鏈多肽或其功能性變體及/或鬆弛素3 B鏈多肽或其功能性變體。

在又一個具體例中，鬆弛素A鏈含有人類鬆弛素3 A鏈多肽(SEQ ID NO：9)、人類最小鬆弛素3 A鏈多肽(SEQ ID NO：12)或其功能性變體。在又一個具體例中，鬆弛素B鏈多肽含有人類鬆弛素3 B鏈多肽(SEQ ID NO：11)或其功能性變體。在一個較佳具體例中，鬆弛素含有人類鬆弛素3 A鏈多肽(SEQ ID NO：10)或其功能性變體且含有人類鬆弛素3 B鏈多肽(SEQ ID NO：11)或其功能性變體。

在一個較佳具體例中，與野生型鬆弛素A鏈與B鏈相較之下，鬆弛素A鏈或B鏈的功能性變體分別具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸置換、***及/或刪除。前述鬆弛素2B變體更佳地含有保守模式Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X，其中X表示能夠形成螺旋結構的胺基酸。

鬆弛素A鏈及B鏈變體在技藝中為已知的。鬆弛素之經充分鑑別的結合位點幾何學提供熟習技藝者設計鬆弛素A鏈與B鏈變體的指導，參見例如Büllesbach and Schwabe J Biol Chem.2000 Nov 10；275(45)：35276-80(鬆弛素B鏈的變體)與Hossain et al.J Biol Chem.2008 Jun 20；283(25)：17287-97(鬆弛素A鏈的變體與「最小」鬆弛素A鏈)。例如，關於保守型鬆弛素2 B模式(Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X)，X表示能夠形成螺旋結構實例的胺基酸以保守模式選擇適當胺基酸X作為三個限定胺基酸而在鬆弛素B鏈表面形成受體接觸區(Büllesbach and Schwabe,(2000))。

在一個更佳的具體例中，鬆弛素A鏈多肽為人類鬆弛素2 A鏈多肽(SEQ ID NO：6)或其功能性變體，而鬆弛素B鏈多肽為人類鬆弛素2 B鏈多肽(SEQ ID NO：8)或其功能性變體。在一個更佳的具體例中，與SEQ ID NO：16相較之下，人類鬆弛素2 A鏈多肽或其功能性變體(SEQ ID NO：6)是具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸置換、刪除及/或***的功能性變體。與 SEQ ID NO：8相較之下，人類鬆弛素2 B鏈多肽的功能性變體(SEQ ID NO：8)其中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸置換、刪除及/或***更佳。前述人類鬆弛素2 B變體進一步含有保守型模式Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X更佳。

在一個又更佳的具體例中，鬆弛素A鏈多肽為人類鬆弛素2 A鏈多肽(SEQ ID NO：6)或其相較於SEQ ID NO：6具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸置換之功能性變體，而鬆弛素B鏈多肽為人類鬆弛素2 B鏈多肽(SEQ ID NO：8)或其相較於SEQ ID NO：18具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸置換且具有保守型模式Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X之功能性變體。

熟習技藝者知道如何獲得功能性變體。功能性變體的實例揭示於Hossain et al J Biol Chem.2008 Jun 20；283(25)：17287-97或美國專利公開案第US2011/0130332號(鬆弛素A鏈)以及Schwabe and Büllesbach(2007)Adv Exp Med Biol.612：14-25和Büllesbach and Schwabe J Biol Chem.2000 Nov 10；275(45)：35276-80)(鬆弛素B鏈)。

PCS連接子：

為從融合蛋白釋放出鬆弛素，所採用的連接子序列PCS含有蛋白酶/肽酶的切割序列。蛋白酶/肽酶是一群其催化功能會水解(分解)蛋白肽鍵的酵素。它們又被稱為蛋白分解酵素或蛋白酶。蛋白酶因為其水解肽鍵的能力而有所不同，亦即蛋白酶對於作為辨識與切割位點的特定肽序列具有偏好。蛋白酶為區分為6群，而絲胺酸蛋白酶(諸如凝血因數IIa、VIIa及Xa)與金屬蛋白酶(諸如基質金屬蛋白酶2與9)代表最大的家族。

蛋白酶受質的切割位點位置被稱為P1-P1’，意指切割位點N端側的胺基酸被定義為P1，而C端側被定義為P1’。呈經切割肽鍵N端方向的胺基酸被編號為P2、P3及P4。切割位元元點羧基側以類似的方式遞增編號(P1’、P2’、P3’等)(Schlechter and Berger(1967 and 1968))。

在本發明上下文中，蛋白酶/肽酶是一種內切蛋白酶/內切肽酶。內切肽酶或內切蛋白酶是破壞非末端胺基酸之肽鍵(亦即，在蛋白內)的蛋白分解肽酶。與其相反的是外切肽酶，其分解N端或C端肽鍵且因而釋放出多肽的N端或C端胺基酸。有鑑於此，切割PCS連接子的內切肽酶可以受到控制的方式由前藥融合蛋白釋放出鬆弛素。

在一個較佳的具體例中，PCS為內切蛋白酶的PCS。在一個較佳的具體例中，PCS為細胞外內切蛋白酶的PCS。在又較佳的具體例中，前述內切蛋白酶在血液中或在鬆弛素所要作用之體內位置處具有活性。又更佳的是，內切蛋白酶天然存在於血液中，諸如凝血因數Xa或在可藉由鬆弛素治療之疾病的罹病組織中，諸如MMP金屬蛋白酶。亦較佳的是，內切蛋白酶為膜連結或跨膜但具有催化結構域而在血管腔中具有催化活性(因此在人類血液中)或暴露於組織中的間質空間，諸如MMP12。又更佳的是，前述內切蛋白酶在人類血液及/或可藉由鬆弛素治療之疾病的罹病組織中具有活性。可藉由鬆弛素治療的疾病為(例如)纖維化疾病。因此，纖維化疾病的罹病組織為(例如)肺臟、心臟、肝臟或腎臟組織。更多可藉由鬆弛素治療的疾病列表於下。最佳的是，前述內切蛋白酶來自人類或經人類化。

依據EC命名法，習於技藝者知曉內切蛋白酶屬於群組EC EC 3.4.21-EC 3.4.24(由國際生化與分子生物協會的命名委員會所訂)。可使用的內切蛋白酶為(例如)胰蛋白酶、凝血酶、因數Xa、因數VIIa、MMP2、MMP12或腎素。

亦預期可投與會切割PCS的外源性內切蛋白酶，使得鬆弛素由前藥釋放。在一個較佳具體例中，此內源性蛋白酶透過連結至蛋白酶的靶定部分而靶定至鬆弛素活性的所要位置(例如可藉由鬆弛素治療之疾病的罹病組織)。

關於表現前述內切蛋白酶的知識為目前技藝狀態。在本發明的一些態樣中，較佳的是不僅具有半衰期較長的鬆弛素作為前藥，還有鬆弛素在特定器官或身體部分處從前藥被釋放。因此，吾人可使用本技藝中表現內切蛋白酶而使得鬆弛素自前藥量身訂做釋放至位點的資訊。

為使鬆弛素從前藥全身性地釋放，吾人應選擇存在於血液中的內切蛋白酶。此一蛋白酶為(例如)凝血因數Xa。

由於從其前藥釋放的鬆弛素具有短的半衰期，量身訂做的鬆弛素釋放至特定器官、組織或間室，特別是罹病器官、組織或間室，當鬆弛素在罹病位點處被釋放時進一步增進其醫藥效益。

例如，鬆弛素對於心肌具有直接抗肥厚效應且對心臟纖維母細胞具有抗纖維化活性(Moore XL.Et al.(2007)；Wang P.et al.(2009))。因此，蛋白酶較佳地優先在心臟組織表現，諸如MMP2(Overall CM.(2004))或凝乳酶(Matsumoto C.et al.(2009))。其他受纖維化疾病影響的重要器官為腎臟(Klein J.et al.(2011))與肺臟(Coward WR et al.(2010))。在這些器官中，投與鬆弛素表現出強烈的抗纖維化活性(Bennett RG(2009))。因此，作為連接子的蛋白酶切割位點較佳來自主要在腎臟及/或肺臟中表現的蛋白酶，諸如肺臟中的MMP12(Garbacki N.et al.(2009))或腎臟中的腎素(Castrop H.et al.(2010))。

內切蛋白酶的蛋白酶切割位點為技藝中已知的。表1中提供一些實例。

技藝中已知蛋白酶切割位點的變化可能導致受質的轉換有所不同。此等變化包括辨識序列內的一或多個胺基酸的保守性或非保守性置換，且可能影響受質轉換的kcat及/或Km。因此，改變鬆弛素融合蛋白中的PCS提供進一步量身訂做鬆弛素之釋放動力學的基礎。

由於內切蛋白酶的較佳切割位點為已知，選定PCS/內切蛋白酶組合以使得內切蛋白酶專一地切割PCS但不會切割鬆弛素或延長半衰期的部分。此外，在技藝中提供決定一內切蛋白酶是否也會分解鬆弛素或延長半衰期之部分的肽鍵的方法。

較佳的PCS為凝血因數Xa的切割位點，更佳的PCS具有序列IleGluGlyArgMetAsp。

在又一個具體例中，前述融合多肽/蛋白的PCS連接子多肽可在N端及/或C端處進一步具有一延伸多肽。延伸單元可使得內切蛋白酶更好接近PCS，因而使鬆弛素更適當地從融合蛋白釋放。測定蛋白酶對於特定受質的活性的方法為技藝中已知。

此等延伸段為技藝中已知，且為1至約100個胺基酸長，1至約50個胺基酸長，1至約25個胺基酸長，1至約15個胺基酸長，1至10個胺基酸長或1至5個胺基酸長。

延伸段序列的胺基酸組成是可變的，儘管表現低免疫原性可能性的延伸段較佳。在本發明的一個具體例中，延伸段多肽可由任何胺基酸所構成。

在一個更佳的具體例中，延伸段多肽含有Gly以及Ser殘基。在又一個更佳的具體例中，延伸段肽為富含甘胺酸的連接子，諸如美國專利第7,271,149號中所揭示之含有序列[GGGGS]_n的肽，n為1至20的整數，較佳地介於1至10，更佳地介於1至5而又更佳地介於1至3。在其他具體例中，使用富含絲胺酸的延伸段多肽，如美國專利第5,525,491號中所述。一個又更佳的具體例為含有Gly以及Ser殘基且具有Gly對Ser比例為至少3比1的延伸段多肽。

若一個延伸單元被引入PCS與鬆弛素之間，則該延伸單元在受到個別內切蛋白酶切割之後仍應維持在鬆弛素上，分別除了PCS的P或P’胺基酸以外。因此，使用不會減低鬆弛素活性的延伸單元。在一個較佳具體例中，延伸單元被***PCS與延長半衰期之部分之間。

在又一個具體例中，前述融合多肽釋放具有活性的鬆弛素。在又一個較佳具體例中，鬆弛素活性是鬆弛素受體LGR7的活化。用於測定鬆弛素活性的方法為該技藝中已知或在本文中提供。在又一個較佳具體例中，鬆弛素受體LGR7的活化是由本文實驗方法中所揭示的方法測定。在又一個較佳具體例中，測定鬆弛素受體LGR7的活化是測定EC₅₀數值。在又一個較佳具體例中，前述鬆弛素活性比對應野生型鬆弛素有效引起半最大活性的濃度低10⁵倍、10⁴倍、10³倍、100倍、75倍、50倍、25倍或10倍。例如，基於人類鬆弛素2，用於融合多肽的對應野生型鬆弛素為人類鬆弛素2蛋白。

經由延長半衰期之蛋白部分延長半衰期：

為增進本發明融合多肽的半衰期，預期與延長半衰期之蛋白部分融合，諸如免疫球蛋白的免疫球蛋白Fc片段、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或其至少轉鐵蛋白結合部分、血清白蛋白或其變體或在活體內結合至其他媒介較長半衰期之分子的結合模式，例如血清白蛋白結合蛋白。

「免疫球蛋白」為含有藉由雙硫鍵保持在一起之多肽鏈的分子，通常具有兩個輕鏈以及兩個重鏈。在各鏈中，一個結構域(可變域Fv)具有一個視分子之抗體專一性而定的可變胺基酸序列。其他結構域(恆定域C)具有與同型分子相同的恆定序列。

如本文所用，免疫球蛋白的「Fc」部分具有與免疫學領域中一般所給予的意思。具體而言，此術語意指藉由自抗體移除兩個抗原結合區(Fab片段)而獲得的抗體片段。一個移除Fab片段的方法是使用木瓜酶蛋白酶分解免疫球蛋白。因此，Fc部分是由與恆定區的片段約大小相當之兩個重鏈所形成，其透過非共價交互作用以及視情況存在的雙硫鍵締合。Fc部分可包括樞紐區並延伸通過CH2與CH3域到達抗體C端。人類與小鼠免疫球蛋白的代表性樞紐區可以在Antibody Engineering,A Practical Guide,Borrebaeck,C.A.K.,ed.,W.H.Freeman and Co.,1992中找到。

有五種類型的人類免疫球蛋白Fc區，其具有不同效應子與藥動學特性：IgG、IgA、IgM、IgD與IgE。IgG是血清中最大量的免疫球蛋白。IgG在血清的任何免疫球蛋白中也具有最長的半衰期(23天)。不同於其他的免疫球蛋白，IgG在胞吞作用接著結合至Fc受體後有效地再循環。有四種IgG亞型，G1、G2、G3與G4，其各自具有不同的效用或功能。這些效應子功能通常是透過與Fc受體(FcγR)交互作用或藉由結合Clq並固定補體而被媒介。結合至FcγR可致使抗體依賴性細胞媒介胞溶作用，而結合至補體因數可致使補體媒介細胞溶解。在設計異源性Fc融合蛋白(其中Fc部分以其延長半衰期的能力單獨使用)時，將任何效應子功能減至最低至關重要。所有IgG亞型能夠結合至Fc受體(CD16、CD32、CD64)，其中G1及G3比G2及G4更為有效。IgG的Fc受體結合區是由位在樞紐與CH2域之羧基端區的殘基所形成。

視所要的活體內效應而定，本發明異源性融合蛋白可含有上面所述的任一同型或可含有突變的Fc區，其中補體及/或Fc受體結合功能已經過改變。因此，本發明異源性融合蛋白可含有免疫球蛋白的完整Fc部分、免疫球蛋白的Fc部分之片段或其類似物。

用於本發明異源性融合蛋白的Fc區較佳是衍生自IgG1或IgG2 Fc區。

一般而言，用於本發明異源性融合蛋白的Fc區可衍生自任何物種，包括(但不限於)人類、大鼠、小鼠及豬。較佳地，用於本發明的Fc區是衍生自人類或大鼠。但是，最佳為人類Fc區及其片段與變體，以減低融合蛋白在人類體中的免疫原性風險。「天然序列Fc區」包含與自然界中之Fc區的胺基酸序列相同的胺基酸序列。「變體Fc區」包含憑藉至少一個胺基酸修飾而與天然序列Fc區之胺基酸序列有所差異的胺基酸序列。相較於天然序列Fc區或母體多肽之Fc區，變體Fc區較佳地具有至少一個胺基酸置換，例如在天然序列Fc區或母體多肽之Fc區有約一個至約十個胺基酸置換，且較佳地約一個至約五個胺基酸置換。本文的變體Fc區較佳與天然序列Fc區及/或母體多肽之Fc區具有至少約80%序列同一性，且最佳地與其有至少約90%序列同一性，更佳地與其有至少約95%序列同一性。

上述鬆弛素化合物可直接或經由肽延伸段融合至白蛋白或其類似物、片段或衍生物。構成本發明融合蛋白部分之白蛋白蛋白通常可衍生自任何物種選殖而來的白蛋白。但是，人類白蛋白及其片段與類似物較佳會降低融合蛋白在人類體內的免疫原性風險。人類血清白蛋白(HSA)是由單獨非糖基化多肽鏈(具有585個胺基酸與分子式分子量為66,500)所構成。HSA的胺基酸序列(SEQ ID NO：3)已描述於例如Meloun,et al.(1975)；Behrens,et al.(1975)；Lawn,et al.(1981)and Minghetti,et al.(1986)中。白蛋白的各種多型性變體以及類似物與片段已被描述(參見Weitkamp,et al.(1973))。例如，在 EP0322094與EP0399666中揭示各種人類白蛋白片段。應理解，本發明異源性融合蛋白包括鬆弛素化合物，其具有包括片段、類似物與衍生物的任一種白蛋白蛋白，其中此融合蛋白具有生物活性且相較於單獨對應野生型鬆弛素具有較長的血漿半衰期。因此，融合蛋白的白蛋白部分無須具有與天然人類白蛋白相同的血漿半衰期。具有較長半衰期，或具有居於天然人類白蛋白與感興趣鬆弛素化合物之間的半衰期的片段、類似物及衍生物為已知或可被生成。該等技術為本技藝中已知，參見例如WO 93/15199、WO 93/15200、WO 01/77137及EP0413622。

在本發明的一個具體例中，延長半衰期的蛋白部分具有低免疫原性，其為人類的或經人類化。在一個較佳具體例中，延長半衰期的蛋白部分為人類的，諸如人類轉鐵蛋白(SEQ ID NO：2)、人類血清白蛋白(SEQ ID NO：3)或人類IgG1 Fc(SEQ ID NO：4)。

此外，亦可使用其他增進生物半衰期的蛋白、蛋白結構域或肽作為融合夥伴。

經由融合至人類血清白蛋白而延長半衰期揭示於例如WO93/15199中。以白蛋白結合作為通用策略以增進蛋白藥動學揭示於例如Dennis et al.,The Journal of Biological Chemistry,Vol.277,No 38,Issue of September 20,pp.35035-35043中。經由融合至人類血清白蛋白結合蛋白而延長半衰期揭示於例如 US20100104588中。經由融合至人類血清白蛋白或IgG-Fc結合蛋白而延長半衰期揭示於例如WO01/45746中。經由融合至人類血清白蛋白結合肽而延長半衰期的又一實例揭示於WO2010/054699中。經由融合至Fc域而延長半衰期揭示於例如WO2001/058957中。

生物活性決定了感興趣蛋白相對於其融和夥伴的較佳位向。亦包括融合夥伴的C端以及N端位向。此外，為增進生物半衰期或其他功能，融合夥伴可藉由磷酸化、硫酸化、丙烯化、糖基化、去糖基化、甲基化、法尼基化、乙醯化、醯胺化或其他方式被修飾。

延長半衰期之蛋白部分的實例為轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或其至少轉鐵蛋白結合部分、血清白蛋白、血清白蛋白結合蛋白、免疫球蛋白及免疫球蛋白的Fc域。較佳為人類延長半衰期之蛋白部分，例如人類轉鐵蛋白、人類轉鐵蛋白受體或其至少轉鐵蛋白結合部分、人類血清白蛋白、人類免疫球蛋白或人類Fc域。

在又一個具體例中，包含至少一個延長半衰期的部分之前述融合多肽相較於對應野生型鬆弛素的半衰期延長，其中半衰期延長為至少5、10、20、50、100或500倍。較佳地，半衰期是測定為血清半衰期，表示融合蛋白在血清或全血中的偵測值，例如藉由使用商業上可取得的定量ELISA分析(例如R&D Systems,Human Relaxin-2 Quantikine ELISA kit,catalogue number DRL20)。半衰期較佳為人類血液半衰期。

選殖、載體系統、表現、宿主及純化

本發明亦提供一種載體，其含有編碼本發明融合多肽HEM-PCS-原鬆弛素或原鬆弛素-PCS-HEM的經單離核酸分子。此載體系統操作地連結至能夠引導其在宿主細胞中表現的表現序列。適當的宿主細胞可選自由細菌細胞(諸如大腸桿菌)、酵母菌細胞(諸如釀酒酵母)、真菌細胞、植物細胞、昆蟲細胞及動物細胞所構成之群組。動物細胞包括(但不限於)HEK293細胞、CHO細胞、COS細胞、BHK細胞、HeLa細胞及各種初代哺乳動物細胞。諸如HEK293T細胞的哺乳動物細胞衍生物亦可適用。

本發明的DNA分子

本發明亦有關於編碼本發明融合蛋白HEM-PCS-原鬆弛素或原鬆弛素-PCS-HEM的DNA分子。

本發明的DNA分子不限於本文揭示的序列，亦包括其變體。本發明中的DNA變體可參照其於雜交時的物理性質而說明。習於技藝者將認知到，使用核酸雜交技術，DNA可用於鑑別其互補股(因為DNA為雙股)，其等效物或同源物。亦應認知到，雜交可在低於100%互補性的情況下發生。但是，假若選擇適當條件，雜交技術可基於DNA序列與特定探針的結構相關性而用於區別DNA序列。關於此等條件的指南，參見Sambrook et al.,1989上文及Ausubel et al.,1995(Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G., Smith,J.A.,& Struhl,K.eds.(1995).Current Protocols in Molecular Biology.New York：John Wiley and Sons)。

兩個多核苷酸序列之間的結構相似性可表示為「嚴苛性」條件的函數，兩個序列在該條件下彼此雜交。如本文所用，術語「嚴苛性」意指不利於雜交的條件程度。嚴苛條件強烈不利於雜交，且僅有在結構上最為相關的分子可在此等條件下彼此雜交。相反地，非嚴苛條件有利於表現出結構相關性程度較低之分子雜交。因此，雜交嚴苛性與兩個核酸序列的結構相關性直接關連。下列關係用於校正雜交與相關性(其中T_m為核酸雙股的熔融溫度)：

a. T_m=69.3+0.41(G+C)%

b.雙股DNA的T_m隨著每增加1%失配鹼基數目而降低1℃。

c. (T_m)_μ2-(T_m)_μ1=18.5 log₁₀μ2/μ1

其中μ1與μ2為兩種溶液的離子強度。

雜交嚴苛性為許多因素的函數，包括總DNA濃度、離子強度、溫度、探針大小及破壞氫鍵結之試劑的存在。增進雜交的因素包括高DNA濃度、高離子強度、低溫、較長的探針大小及不存在破壞氫鍵結之試劑。雜交通常以兩個階段進行：「結合」階段與「洗滌」階段。

首先，在結合階段中，探針於有利雜交的條件下結合至標的。通常在這個階段藉由改變溫度來控制嚴苛性。關於高嚴苛性，溫度通常介於65℃與70℃，除非使用短的(<20 nt)寡核苷酸探針。代表性雜交溶液包含6X SSC、0.5% SDS、5X Denhardt's溶液與100 μg非專一性載體DNA。參見Ausubel et al.,section 2.9,supplement 27(1994)。當然，許多不同但功能上相同的緩衝條件為已知的。若相關性程度較低，可選擇較低的溫度。低嚴苛性結合溫度介於約25℃與40℃。中等嚴苛性介於至少約40℃至低於約65℃。高嚴苛性為至少約65℃。

其次，藉由洗滌移除過量的探針。在此階段通常使用更為嚴苛的條件。因此，此「洗滌」階段在經由雜交測定相關性方面更為重要。洗滌溶液通常含有較低的鹽濃度。一個例示性介質嚴苛性溶液含有2X SSC及0.1% SDS。高嚴苛性洗滌溶液含有等價(就離子強度方面)的低於約0.2X SSC，其中較佳的嚴苛性溶液含有約0.1X SSC。與不同嚴苛性相關的溫度與上面針對「結合」所論者相同。洗滌溶液通常亦在洗滌期間置換數次。例如，高嚴苛性洗滌條件通常含有在55℃下洗滌30分鐘2次，以及在60℃下15分鐘3次。

本發明的一個具體例為編碼本發明融合多肽的經單離核酸序列。

重組DNA建構物與表現

本發明更提供重組DNA建構物，其含有一或多個本發明核苷酸序列。本發明重組建構物可與載體(諸如質體、噬菌粒、噬菌體或病毒載體)一起使用，編碼本發明融合多肽的DNA分子被***其中。

本文所提供的融合多肽可藉由在宿主細胞中重組表現編碼融合多肽之核酸序列來製備。為了以重組方式表現融合多肽，可使用帶有編碼融合多肽之DNA片段的重組表現載體轉染宿主細胞，以在宿主細胞中表現該融合多肽。使用標準重組DNA方法學製備及/或獲得編碼融合多肽的核酸、將此等核酸併入重組表現載體並將該等載體引入宿主細胞，諸如彼等描述於Sambrook,Fritsch and Maniatis(eds.),Molecular Cloning；A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989),Ausubel,F.M.et al.(eds.)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,(1989)and in U.S.Pat.No.4,816,397 by Boss et al中。

為了表現融合多肽，可使用標準重組DNA表現方法(參見，例如Goeddel；Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990))。例如，編碼所要多肽的DNA可被***表現載體中，其接而被轉染至適當宿主細胞中。適當的宿主細胞為原核及真核細胞。原核宿主細胞的實例為(例如)細菌，真核宿主細胞的實例為酵母菌、昆蟲或哺乳動物細胞。應理解表現載體的設計(包括調節序列的選定)受到諸如所選宿主細胞、所要蛋白的表現程度及表現為組成性或誘導性的因素所影響。

細菌表現

供細菌使用的常見表現載體是藉由將編碼所要蛋白的結構DNA序列與適當轉譯起始與終止訊號以可操作閱讀位向***一個功能性起動子。載體含有一或多個表現型可篩選標記以及複製原點以確保載體的維持，且若需要的話在宿主中提供擴增。用於轉形的適當原核宿主包括大腸桿菌、枯草桿菌、沙門氏桿菌及假單孢菌、放線菌和葡萄球菌的各種物種。

細菌載體可以是(例如)以噬菌體、質體或噬菌粒為基礎。此等載體可含有可篩選標記以及衍生自商業上可取得之質體的複製原點(通常含有已知選殖載體pBR322(ATCC 37017)的要素)。在適當宿主菌株轉形以及宿主菌株生長至適當細胞密度之後，藉由適當的方式(例如溫度切換或化學誘導)去抑制/誘導篩選的起動子並培養細胞又一段時間。通常藉由離心收取細胞、藉由物理或化學方式破壞並且保留所形成的粗萃取物以供進一步純化。

在細菌系統中，可依據所要用途針對待表現蛋白有利地選定一些表現載體。例如，當有大量此等蛋白待生產時，指引表現易於純化之高量融合多肽產物的載體將會是所要的。本發明融合多肽包括經純化的產物、化學合成步驟的產物以及藉由重組技術由原核宿主(包括，例如大腸桿菌、枯草桿菌、沙門氏桿菌及假單孢菌、放線菌和葡萄球菌的各種物種，較佳為大腸桿菌細胞)生產的產物。

哺乳動物表現及純化

關於哺乳動物宿主細胞表現的較佳調節序列包括在哺乳動物細胞中指引高量蛋白表現的病毒要素，諸如衍生自巨大細胞病毒(CMV)的啟動子及/或增強子(諸如CMV啟動子/增強子)、猴病毒40(SV40)的啟動子及/或增強子(諸如SV40啟動子/增強子)、腺病毒的啟動子及/或增強子(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))以及多瘤病毒的啟動子及/或增強子。更多關於病毒調節要素及其序列的說明參見(例如)Stinski的U.S.5,168,062、Bell et al.的U.S.4,510,245以及Schaffner et al.的U.S.4,968,615。重組表現載體亦可包括複製原點及可篩選標記(參見，例如Axel et al.的U.S.4,399,216、4,634,665與U.S.5,179,017)。適當的可篩選標記包括賦予給已引入載體的宿主細胞對藥物(諸如G418、潮黴素或甲胺蝶呤)之抗性的基因。例如，二氫葉酸還原酶(DHFR)基因賦予對甲胺蝶呤之抗性，而neo基因賦予對G418之抗性。

將表現載體轉染至宿主細胞中可使用標準技術來進行，諸如電穿孔、磷酸鈣沉澱以及DEAE-聚葡萄糖、脂質體轉染或聚陽離子媒介的轉染。

用於表現本文提供之融合多肽的適當哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括dhfr-CHO細胞，描述於Urlaub and Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 77：4216-4220，與DHFR可篩選標記一起使用，例如描述於R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。在一些具體例中，設計表現載體以使得被表現的蛋白分泌至宿主細胞所生長的培養基中。短暫轉染/表現抗體可(例如)遵照Durocher et al(2002)Nucl.Acids Res.Vol 30 e9的程式而達到。穩定轉染/表現抗體可(例如)遵照UCOE系統(T.Benton et al.(2002)Cytotechnology 38：43-46)的程式而達到。

融合多肽可使用標準蛋白純化方法由培養基回收。

本發明融合多肽可藉由已知方法而被回收並由重組細胞培養物中純化，已知方法包括(但不限於)硫酸銨或乙醇沉澱、酸萃取、蛋白A層析法、蛋白G層析法、陰離子或陽離子交換層析法、磷酸-纖維素層析法、疏水***互作用層析法、親和力層析法、氫氧磷灰石層析法及植物凝集素層析法。亦可採用高效液相層析法(「HPLC」)。參見，例如Colligan,Current Protocols in Immunology,or Current Protocols in Protein Science,John Wiley & Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，各自以全文引用的方式併入本文中。

本發明融合多肽包括經純化或經單離的產物、化學合成步驟的產物，以及藉由重組技術由真核宿主(例如酵母菌(例如畢赤酵母菌)、高等植物、昆蟲及哺乳動物，較佳由哺乳動物細胞)製造的產物。視重組生產程式中所用的宿主而定，本發明融合多肽可經糖基化或可以是未糖基化，其中糖基化較佳。此等方法描述於許多標準實驗室手冊中，諸如Sambrook，上文，第17.37-17.42節；Ausubel，上文，第10、12、13、16、18及20章。

治療用途

本發明的一個具體例是醫藥組成物或本發明融合多肽在治療心血管疾病、腎臟疾病、胰臟炎、發炎、癌症、硬皮病、肺臟纖維化、腎臟纖維化及肝臟纖維化的用途。

心血管疾病

在本發明上下文中，心血管系統的病症或心血管病症意指例如下列病症：高血壓(高血壓)、周邊及心臟血管病症、冠狀心臟病、穩定型與不穩定型心絞痛、心肌功能不全、持續型缺血性功能不全(昏迷性心肌)、暫時型缺血後功能不全(「僵硬型心肌」)、心臟衰竭、周邊血流紊亂、急性冠狀動脈症候群、心臟衰竭與心肌梗塞。

在本發明上下文中，術語心臟衰竭包括急性與慢性心臟衰竭的表徵，以及更具體而言或相關類型的疾病，諸如急性代償性心臟衰竭、右心衰竭、左心衰竭、整體衰竭、缺血性心肌病變、擴張性心肌病變、先天性心臟缺損、心臟瓣膜缺損、與心臟瓣膜缺損相關的心臟衰竭、二尖瓣狹窄、三尖瓣缺損、肺狹窄、肺動脈瓣缺損、複合型心臟瓣膜缺損、心肌發炎(心肌炎)、慢性心肌炎、急性心肌炎、病毒性心肌炎、糖尿病心臟衰竭、酒精性心肌病變、心臟蓄積病及舒張期心臟衰竭與收縮期心臟衰竭和惡化心臟衰竭的急性期。

依據本發明的化合物亦可進一步適於減少受梗塞所影響之心肌區域，且用於預防繼發性梗塞。

依據本發明的化合物亦進一步適用於預防及/或治療血栓性栓塞症、缺血後再灌注損傷、微血管及大血管損傷(脈管炎)、動脈與靜脈栓塞、水腫、缺血(諸如心肌梗塞)、中風與暫時性缺血，用於與冠狀動脈繞道手術(CABG)、經皮冠狀動脈氣球擴張術(PTCA)、血栓溶解後PTCA、急救PTCA、心臟移植與開心手術組合的心臟保護，以及用於與移植、繞道手術、導管檢查與其他外科手術程式組合的器官保護。

適應症的其他區域包括(例如)預防及/或治療呼吸病症，諸如(例如)慢性阻塞性肺病(慢性氣管炎，COPD)、氣喘、肺氣腫、支氣管擴張術、囊性纖維變性(黏液黏稠病)及肺高壓，具體而言肺動脈高壓。

腎臟疾病

本發明有關於本發明融合多肽作為藥物供預防及/或治療腎臟疾病的用途，特別是用於急性與慢性腎臟疾病及急性與慢性腎臟功能不全，以及急性與慢性腎衰竭，包括急性與慢性階段的腎臟衰竭，具有或不具有透析之需要，以及潛在或相關腎臟疾病，諸如腎臟過低灌流、透析引起的低血壓、腎小球病變、腎小球與腎管蛋白尿、腎水腫、血尿、原發性、次發性及急性與慢性腎小球腎炎、膜狀與膜狀增生性腎小球腎炎、奧爾波症候群、腎小球硬化、間質性腎小管病、腎病性疾病，諸如原發性與先天性腎臟疾病、腎臟發炎、免疫性腎臟疾病(像是腎臟移植排斥、免疫複合物引起的腎臟疾病以及中毒引起的腎病性疾病)、糖尿病與非糖尿病腎病、腎盂腎炎、囊腫性腎臟、腎硬化、、高血壓性腎硬化、腎病症候群，其特徵在於且在診斷上與肌酸酐廓清及/或水排除異常降低、尿素、氮、鉀及/或肌酸酐的血液濃度異常增加、腎臟酵素(諸如麩胺醯基合成酶)活性改變、尿液滲透壓與尿液體積、微白蛋白尿增加、大量白蛋白尿、腎小球與小動脈損傷、腎小管擴張、高磷酸鹽血症及/或需要透析。

此外，本發明融合多肽可用作為預防及/或治療腎癌、不完全切除腎臟之後、過度使用利尿劑後脫水、血壓不受控制上升伴隨惡性高血壓、尿道阻塞與感染、類澱粉症，以及與腎小管損傷有關全身性疾病(諸如紅斑狼瘡)與風濕性免疫性全身性疾病，及腎動脈狹窄、腎動脈栓塞、腎靜脈栓塞、止痛劑引起腎病變及腎小管酸血症的藥物。

此外，本發明融合多肽可用作為預防及/或治療顯影劑引起以及藥物引起的急性與慢性間質性腎臟疾病、代謝症候群與血脂異常的藥物。

此外，本發明包括本發明融合多肽作為藥物預防及/或治療與急性及/或慢性腎病相關後遺症(諸如肺水腫、心臟衰竭、尿毒血症、貧血、電解質失衡(例如高血鉀症、低血鈉症)與骨及醣代謝)的用途。

肺臟疾病

另外，本發明融合蛋白亦適於治療及/或預防肺部疾病，特別是以下肺臟疾病：氣喘病症、肺動脈高壓(PAH)及其他形式的肺高壓(PH)，包括左心病、HIV、鐮刀血球貧血症、血栓性栓塞症(CTEPH)、類肉瘤病、COPD或肺臟纖維化相關肺高壓、慢性-阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、急性肺損傷(ALI)、α-1-抗胰蛋白酶缺乏(AATD)、肺臟纖維化、肺水腫(例如吸菸引起的肺水腫)與囊性纖維變性(CF)。

纖維化病症

依據本發明之融合蛋白進一步適用於治療及/或預防內部器官的纖維化病症，諸如(例如)肺臟、心臟、腎臟、骨髓，及具體而言肝臟纖維化，還有皮膚纖維化與纖維化眼病。在本發明上下文中，術語纖維化病症包括具體而言下列術語：肝臟纖維化、肝硬化、肺臟纖維化、心肌內纖維化(endomyocardial fibrosis)、腎病變、腎小球腎炎、間質性腎臟纖維化、糖尿病引起的纖維化損傷、骨髓纖維化與類似的纖維化病症、硬皮病、硬斑病(morphea)、瘢痕、肥厚疤痕(亦在外科手術之後)、痣、糖尿病腎病變、增生性玻璃體視網膜病變與結締組織病症(例如類肉瘤病)。

癌症

癌症是一種一群細胞表現出生長不受控制的疾病。癌症通常是依據癌症是衍生自下列細胞的癌來分類：上皮細胞(此類包括最為常見的一些癌症，包括乳癌、***癌、肺炎與結腸癌)；肉瘤，其衍生自結締組織或間葉細胞；淋巴瘤與白血病，其衍生自造血細胞；生殖系細胞腫瘤，其衍生自多能細胞；以及胚細胞瘤，其為衍生自不成熟「前驅」或胚胎組織的癌症。

本發明進一步提供本發明融合蛋白用於製備供治療及/或預防病症，特別是上述病症之藥物的用途。

本發明進一步提供使用有效量之本發明的至少一種融合蛋白治療及/或預防病症，特別是上述病症之藥物的方法。

本發明進一步提供一種用於在治療及/或預防冠狀心臟病、急性冠心病、心臟衰竭及心肌梗塞之方法中的本發明融合蛋白。

醫藥組成物及投藥

本發明亦提供醫藥組成物，其包含於醫藥上可接受媒劑中之鬆弛素融合蛋白。鬆弛素融合蛋白可全身或局部投藥。可使用本技藝中已知的任一種適宜投藥模式，包括(但不限於)靜脈內、腹膜內、動脈內、鼻內、藉由吸入、經口、皮下投藥，藉由局部注射或呈手術植入物形式。

本發明亦關於可含有本發明融合多肽單獨或與至少一種其他藥劑組合的醫藥組成物，該至少一或多種其他藥劑為諸如穩定化合物，其可在任何無菌、生物相容性醫藥載劑(包括，但不限於食鹽水、緩衝食鹽水、右旋糖與水)中投與。此等分子的任一者可單獨投與，或與其他藥劑、藥物或激素組合成醫藥組成物形式(其中與賦形劑或醫藥可接受載劑混合)投與給患者。在本發明的一個具體例中，醫藥可接受載劑為醫藥上惰性的。

本發明亦關於投與醫藥組成物。此等投與是經口或非經腸而達致。非經腸投遞的方法包括局部、動脈內、肌肉內、皮下、髓內、鞘內、室內、靜脈內、腹膜內或鼻內投與。除了活性成分以外，此等醫藥組成物可含有適宜的醫藥可接受載劑，其含有賦形劑與有助於將活性化合物加工成製劑以在醫藥上使用的輔助劑。更多關於調配與投與的技術細節可在Remington's Pharmaceutical Sciences(Ed.Maack Publishing Co,Easton,Pa.)的最新版本中查到。

用於經口投與的醫藥組成物可使用本技藝中已知的醫藥可接受載體以適於經口投與的劑量調配。此等載劑能夠使醫藥組成物調配成錠劑、丸劑、糖衣錠、囊劑、液體、凝膠、糖漿、漿劑、懸浮液及類似物以供患者攝入。

用於非經腸投與的醫藥調配物包括活性化合物的水溶液。就注射而言，本發明之醫藥組成物可調配呈水溶液，較佳在生理可相容緩衝液中，例如漢克氏溶液、林格氏溶液或生理緩衝食鹽水。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏性的物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨醇及葡萄聚糖。此外，活性化合物的懸浮液可製備成適當的油性注射懸浮液。適當的親脂性溶劑或媒劑包括脂肪酸，諸如芝麻油，或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三甘油酯，或脂質體。此外，懸浮液亦可含有適當的穩定劑或增加化合物溶解度的物質，以容許製備高濃度溶液。

依據本發明之融合蛋白可單獨使用，或若需要的話與其他活性化合物組合。本發明進一步提供含有至少一種依據本發明之融合多肽及一或多種其他活性成分的藥物，具體而言用於治療及/或預防上述病症。

藉由實例或偏好的方式，供用於組合的適宜活性成分為：調節脂質代謝的活性成分、抗糖尿病劑、降血壓劑、灌注增強及/或抗栓塞劑、抗氧化劑、趨化激素受體拮抗劑、p38激酶抑制劑、NPY促效劑、食慾素促效劑、厭食劑、PAF-AH抑制劑、抗炎性劑(COX抑制劑、LTB₄-受體拮抗劑)、止痛劑(例如阿斯匹靈)、抗憂鬱劑及其他精神藥物。

具體而言，本發明有關於至少一種依據本發明之融合多肽與至少一種脂質代謝改變活性成分、抗糖尿病劑、降血壓活性成分及/或具有抗栓塞效用之藥劑的組合。

依據本發明之融合多肽較佳可與下列一或多者組合：●脂質代謝調節活性物質，藉由實例或偏好的方式為來自以下群組：HMG-CoA還原酶抑制劑、HMG-CoA 還原酶表現的抑制劑、鯊烯合成抑制劑、ACAT抑制劑、LDL受體誘導劑、膽固醇吸收抑制劑、聚合膽酸吸收劑、膽酸再吸收抑制劑、MTP抑制劑、脂肪酶抑制劑、LpL活化劑、纖維酸(fibrates)、菸鹼酸、CETP抑制劑、PPAR-α、PPAR-γ及/或PPAR-δ促效劑、RXR調節劑、FXR調節劑、LXR調節劑、甲狀腺激素及/或甲狀腺擬似物、ATP檸檬酸解離酶抑制劑、Lp(a)拮抗劑、***素受體1拮抗劑、瘦素受體促效劑、鈴蟾素受體促效劑、組胺酸受體促效劑及抗氧化劑/自由基清除基；●Rote Liste 2004/II，第12章中所述的抗糖尿病劑，且亦藉由實例或偏好的方式為彼等來自以下群組：磺醯脲、雙胍、美格列奈衍生物、葡萄糖苷酶抑制劑、二肽基-肽酶IV的抑制劑(DPP-IV抑制劑)、噁唑烷酮、噻唑烷二酮、GLP 1受體促效劑、升糖素拮抗劑、胰島素敏化劑、CCK 1受體促效劑、瘦素受體促效劑、涉及刺激糖質新生及/或肝糖分解的肝臟酵素抑制劑、葡萄糖攝取的調節劑還有鉀離子通道開啟劑，諸如(例如)WO 97/26265與WO 99/03861中所揭示者；●降血壓活性成分，藉由實例或偏好的方式為彼等來自以下群組：鈣拮抗劑、血管收縮素AII拮抗劑、ACE抑制劑、腎素抑制劑、β-受體阻斷劑、α-受體阻斷劑、醛固酮拮抗劑、礦物性皮質激素受體拮抗劑、ECE抑制劑、ACE/NEP抑制劑及血管肽酶抑制劑；及/或●抗栓塞劑，藉由實例或偏好的方式為來自以下群組：血小板凝劑抑制劑或抗凝血劑；●利尿劑；●血管加壓素受體拮抗劑；●有機硝酸鹽及NO供體；●具有正向促心肌收縮活性的化合物；●抑制環狀鳥苷酸(cGMP)及/或環狀腺苷酸(cAMP)分解的化合物，諸如(例如)磷酸二酯酶(PDE)1、2、3、4及/或5的抑制劑，具體而言PDE 5抑制劑，諸如西地那非、伐地那非及他達那非，還有PDE 3抑制劑，諸如米力農；●利鈉肽，諸如(例如)「心房利鈉肽」(ANP，阿那立肽)、「B-型利鈉肽」或「腦利鈉肽」(BNP，奈西立肽)、「C-型利鈉肽」(CNP)以及尿舒張素；●前列環素受體(IP受體)的促效劑，諸如藉由實例為伊洛前列素、貝前列素、西卡前列素；●If(方尼通道(funny channel))通道的抑制劑，諸如藉由實例為伊伐佈雷定；●鈣敏化劑，諸如藉由實例及偏好的方式為左西孟旦；●鉀補充劑；●鳥苷酸環化酶的NO-獨立性，但為血色素-依賴性刺激劑，諸如具體為WO 00/06568、WO 00/06569、WO 02/42301及WO 03/095451中所述的化合物； ●鳥苷酸環化酶的NO-及血色素-獨立性活化劑，諸如具體為WO 01/19355、WO 01/19776、WO 01/19778、WO 01/19780、WO 02/070462及WO 02/070510中所述的化合物；●人類嗜中性球彈性蛋白酶(HNE)的抑制劑，諸如(例如)西維來司及DX-890(Reltran)；●抑制訊號轉導級聯的化合物，諸如(例如)酪胺酸激酶抑制劑，具體而言索拉菲尼、伊馬替尼、吉非替尼及埃洛替尼；及/或●調節心臟能量代謝的化合物，諸如(例如)乙莫克舍、二氯乙酸、雷諾嗪及曲美他嗪。

脂質代謝調節活性物質應理解為表示，較佳來自以下群組：HMG-CoA還原酶抑制劑、鯊烯合成抑制劑、ACAT抑制劑、膽固醇吸收抑制劑、MTP抑制劑、脂肪酶抑制劑、甲狀腺激素及/或甲狀腺擬似物、菸鹼酸受體促效劑、CETP抑制劑、PPAR-α促效劑、PPAR-γ促效劑、PPAR-δ促效劑、聚合膽酸吸收劑、膽酸再吸收抑制劑、抗氧化劑/自由基清除基及***素受體1拮抗劑。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明的融合多肽與HMG-CoA還原酶抑制劑組合一起投與，HMG-CoA還原酶抑制劑是來自史塔丁類型，諸如藉由實例以及偏好的方式為洛伐司他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿伐他汀、瑞舒伐他汀或匹伐他汀。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合多肽與鯊烯合成抑制劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為BMS-188494或TAK-475。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合多肽與ACAT抑制劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為阿伐麥布、美林那胺、帕替麥布、依魯麥布或SMP-797。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合多肽與膽固醇吸收抑制劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為依折麥布、替奎安或帕馬苷。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合多肽與MTP抑制劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為英普他派、BMS-201038、R-103757或JTT-130。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白與脂肪酶抑制劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為奧利斯他。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白與甲狀腺激素及/或甲狀腺擬似物一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為D-甲狀腺素或3,5,3'-三碘甲狀腺素(T3)。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白與菸鹼酸受體的促效劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為菸鹼酸、阿西莫司、阿昔呋喃或酒石酸煙醇(radecol)。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白與CETP抑制劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為達塞曲匹、BAY 60-5521、安塞曲匹或CETP疫苗(CETi-1)。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白與PPAR-γ促效劑一起投與，例如來自噻唑烷二酮的類型，諸如藉由實例以及偏好的方式為吡格列酮或羅格列酮。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白與PPAR-δ促效劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為GW-501516或BAY 68-5042。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白與聚合膽酸吸收劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為考來烯胺、考來替泊、考來維侖、考來膠或考來替蘭。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白與膽酸再吸收抑制劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為ASBT(=IBAT)抑制劑，諸如(例如)AZD-7806、S-8921、AK-105、BARI-1741、SC-435或SC-635。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白與抗氧化劑/自由基清除劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為普羅布考、AGI-1067、BO-653或AEOL-10150。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白與***素受體1拮抗劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為麻黃素或SR-147778。

抗糖尿病劑應理解為較佳表示胰島素及胰島素衍生物，以及口服有效降血糖活性成分。在此，胰島素與胰島素衍生物包括動物、人類或生物技術來源的胰島素，以及其混合物。口服有效降血糖活性成分較佳包括磺醯脲、雙胍、美格列奈衍生物、葡萄糖苷酶抑制劑及PPAR-γ促效劑。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白可與胰島素一起投與。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白與磺醯脲一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為甲苯磺丁尿素、格力本、馬爾胰、克吡噻或葛立克拉。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白與雙肽一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為甲福明。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白與美格列奈衍生物一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為瑞格列奈或那格列奈。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白與葡萄糖苷酶抑制劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為米格列醇或阿卡波糖。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白與DPP-IV抑制劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為西他列汀及維他列汀。

降血壓劑較佳應理解為表示來自鈣拮抗劑、血管收縮素AII拮抗劑、ACE抑制劑、β-受體阻斷劑、α-受體阻斷劑及利尿劑的化合物。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白是與鈣拮抗劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為硝苯地平、氨氯地平、維拉帕米或迪太贊。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白是與血管收縮素AII拮抗劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為氯沙坦、纈沙坦、坎地沙坦、恩布沙坦、奧美沙坦酯或替米沙坦。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白是與ACE抑制劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為依那普利、卡托普利、賴諾普利、雷米普利、地拉普利、福辛普利、喹那普利、培哚普利或泉多普利。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白是與β-受體阻斷劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為普萘洛爾、阿替洛爾、噻嗎洛爾、吲哚洛爾、阿普洛爾、氧烯洛爾、噴布洛爾、布拉洛爾、美替洛爾、納多洛爾、甲吲洛爾、卡拉洛爾、索他洛爾、美托洛爾、倍他洛爾、塞利洛爾、比索洛爾、卡替洛爾、艾司洛爾、拉貝洛爾、卡菲蒂羅、阿達洛爾、蘭地洛爾、奈必洛爾、依泮洛爾或布新洛爾。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白是與α-受體阻斷劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為呱唑嗪。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白是與利尿劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為呋塞米、布美他尼、托拉塞米、苄氟甲噻嗪、***、氫***、氫氟噻嗪、甲***、多噻嗪、三***、氯噻酮、吲達帕胺、美托拉宗、喹噻酮、乙醯唑胺、二氯苯磺胺、甲醋唑胺、甘油、異山梨醇、甘露醇、阿米洛利或氨喋啶。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白是與醛固酮或礦物性皮質激素受體拮抗劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為螺內酯或依普利酮。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白是與血管加壓素受體拮抗劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為考尼伐坦、托伐普坦、利伐普坦或 SR-121463。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白是與有機硝酸鹽及NO供體一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為硝普鈉、***油、硝酸異山梨酯、二硝酸異山梨酯、嗎多明或SIN-1，或與吸入性NO組合。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白是與正向促心肌收縮化合物一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為強心苷(長葉毛地黃苷)、β-腎上腺及多巴胺促效劑，諸如異丙基腎上腺素、腎上腺素、正腎上腺素、，多巴胺或丁酚多巴胺。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白是與抗交感神經強直劑一起投與，諸如利血平、可樂定或α-甲基多巴，或與鉀通道促效劑組合，諸如敏諾西代、二氮嗪、雙肼苯噠嗪或肼苯酞嗪，或與釋放一氧化氮的物質組合，諸如***油或硝普鈉。

抗栓塞劑應理解為較佳表示來自血小板凝集抑制劑或抗凝血劑之群組的化合物。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白是與血小板凝集抑制劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為阿斯匹靈、氯吡格雷、噻氯匹定或得利達蒙。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白是與凝血酶抑制劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為希美加群、美拉加群、達比加群、比瓦爾丁或克立生。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白是與GPIIb/IIIa拮抗劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為替羅非班或阿昔單抗。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白是與因數Xa抑制劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為利伐沙班(BAY 59-7939)、DU-176b、阿呱沙班、奧米沙班、非地沙班、雷紮沙班、磺達肝癸、艾卓肝素、PMD-3112、YM-150、KFA-1982、EMD-503982、MCM-17、MLN-1021、DX 9065a、DPC 906、JTV 803、SSR-126512或SSR-128428，前提為PCS不為因數Xa切割位點。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白是與肝素或低分子量(LMW)肝素衍生物一起投與。

在本發明的一個較佳具體例中，依據本發明之融合蛋白是與維生素K拮抗劑一起投與，諸如藉由實例以及偏好的方式為香豆素。

在本發明上下文中，尤佳為含有至少一種依據本發明之融合蛋白以及至少一種選自由以下組成之群組之其他活性成分的組合：HMG-CoA還原酶抑制劑(史塔丁)、利尿劑、β-受體阻斷劑、有機硝酸鹽及NO供體、ACE抑制劑、血管收縮素AII拮抗劑、醛固酮及礦物性皮質激素受體拮抗劑、血管加壓素受體拮抗劑、血小板凝集抑制劑及抗凝血劑，及其用於治療及/或預防上述病症的用途。

本發明進一步提供包含至少一種依據本發明之融合蛋白，通常與一或多種惰性無毒之醫藥上適宜輔助劑的藥物，及其於上述目的之用途。

治療有效劑量

適用於本發明的醫藥組成物包括組合物，其中含有數量足以達到所要目的(例如心臟衰竭)之活性成分。測定有效劑量係落在熟習本技藝者的能力範疇內。

關於任何化合物，治療有效劑量可以最初在活體外分析(例如LGR7受體活化)、離體於單離的經灌注大鼠心臟或在動物模型(通常為小鼠、兔、狗或豬)中估算。動物模型亦可用於達到所要濃度範圍及投藥路徑。此資訊接而可用於決定在人類中的有效劑量以及投藥路徑。

治療有效劑量意指改善症狀或病況的融合蛋白數量。此等化合物的治療效力與毒性可藉由標準醫藥程式在活體外或實驗動物體內測定，例如ED50(在50%群體中有效治療的劑量)以及LD50(50%群體致死的劑量)。治療效用與毒性效用間的劑量比為治療指標，且其可表示為比例ED50/LD50。表現出高治療指標的醫藥組成物較佳。由活體外分析以及動物研究所得到的數據被用於調配供人類使用之劑量範圍。此等化合物的劑量較佳落在循環濃度範圍內，其包括具有少許或沒有毒性的ED50。劑量在此範圍內視採用的劑量、患者的敏感性以及投藥路徑而改變。

正常劑量數量可在0.1致100,000毫克總劑量改變，端視投藥路徑而定。文獻中提供特定劑量與投遞方法的指南。參見美國專利第4,657,760號；第5,206,344號或第5,225,212號。習於技藝者會針對多核苷酸採用不同於蛋白或其抑制劑的調配物。相同地，投遞多核苷酸或多肽對特定細胞、條件、位置等是特定的。

本發明將進一步藉下列實施例說明。僅為參照特定具體例說明本發明而提供實施例。此等例示儘管說明本發明的某些特定態樣，但非描述所揭發明的限制因素或限制本發明的範疇。

除非另有詳細說明，否則所有實施例是使用該技藝中已知且慣用的標準技術來進行。下列實施例的慣用分子生物技術可以如標準實驗室手冊(諸如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd Ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)中所述般進行。

1.一種包含鬆弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-鬆弛素之融合蛋白，其中：鬆弛素包含鬆弛素A鏈多肽或其功能性變體，以及鬆弛素B鏈多肽或其功能性變體，PCS包含內切蛋白酶切割位點，以及 HEM為延長半衰期之蛋白部分。

2.一種包含原鬆弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-原鬆弛素之融合多肽，其中：原鬆弛素包含鬆弛素A鏈多肽或其功能性變體，鬆弛素C鏈多肽以及鬆弛素B鏈多肽或其功能性變體，PCS包含內切蛋白酶切割位點，以及HEM為延長半衰期之蛋白部分。

3.如第1或2項之融合蛋白或多肽，其中該PCS為細胞外內切蛋白酶的切割位點。

4.如第3項之融合蛋白或多肽，其中該內切蛋白酶為內源性內切蛋白酶。

5.如第3或4項之融合蛋白或多肽，其中該內切蛋白酶為心臟、肝臟、腎臟或肺臟所表現的內切蛋白酶。

6.如第3項之融合蛋白或多肽，其中該內切蛋白酶為膜連結或跨膜蛋白酶，其在膜的細胞外側具有催化活性。

7.如第1至6項中任一項之融合蛋白或多肽，其中該內切蛋白酶是選自於表1所示內切蛋白酶之群組。

8.如第1至6項中任一項之融合蛋白或多肽，其中該PCS是選自於表1所示PCS之群組。

9.如第3至8項中任一項之融合蛋白或多肽，其中該內切蛋白酶是選自於由因數Xa、胰蛋白酶、MMP2、MMP9、MMP12、腎素、彈性蛋白酶及凝乳酶所構成之群組。

10.如第3至9項中任一項之融合蛋白或多肽，其中該內切蛋白酶為人類的。

11.如第1至10項中任一項之融合蛋白或多肽，其中該PCS具有由下列序列所構成之群組的序列：IleGluGlyArgMetAsp(FXa切割位點)、RAKRFASL(MMP9切割位點)、INARVSTI(胰蛋白酶切割位點)、RVGFYESD(凝乳酶切割位點)及GLRVGFYE(彈性蛋白酶切割位點)。

12.如第1至11項中任一項之融合蛋白或多肽，其中該PCS在N端及/或在C端具有延伸段多肽。

13.如前項中任一項之融合多肽，其中該延長半衰期之蛋白部分包含於由下列所構成之群組中的延長半衰期之蛋白部分：免疫球蛋白Fc域、血清白蛋白、轉鐵蛋白及血清白蛋白結合蛋白。

14.如前項中任一項之融合多肽，其中該延長半衰期之蛋白部分為IgG1 Fc域。

15.如前項中任一項之融合多肽，其中該延長半衰期之蛋白部分為人類的。

16.如前項中任一項之融合多肽，其中該鬆弛素A鏈為人類鬆弛素2 A鏈，而鬆弛素B鏈為人類鬆弛素2 B鏈。

17.如前項中任一項之融合多肽，其中該融合多肽為原鬆弛素-PCS-HEM。

18.如前項中任一項之融合蛋白，其中該融合多肽為鬆弛素-PCS-HEM。

19.一種編碼如第2至18項中任一項之原鬆弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-原鬆弛素融合多肽的多核苷酸。

20.一種包含如第19項之多核苷酸的載體。

21.一種包含如第20項之載體或如第17項之多核苷酸的宿主細胞。

22.一種生產如第1至18項中任一項之鬆弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-鬆弛素蛋白之方法，其包含培育如第21項之進一步含有原激素轉變酶活性的宿主細胞，以及分離該蛋白的步驟。

23.一種包含如第1至18項中任一項之鬆弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-鬆弛素蛋白的醫藥組成物。

24.一種如第23項之醫藥組成物或如第1至18項中任一項之鬆弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-鬆弛素蛋白，其係作為藥物。

25.一種如第23或24項之醫藥組成物或如第1 至18項中任一項之鬆弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-鬆弛素蛋白，其係做為用於治療心血管疾病、肺臟疾病、纖維化病症或腎臟疾病的藥物。

26.一種治療心血管疾病、肺臟疾病、纖維化病症或腎臟疾病的方法，其包含投與治療有效劑量之如第23或24項之醫藥組成物或如第1至18項中任一項之鬆弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-鬆弛素蛋白。

27.一種如第25或26項之治療法，其中該心血管疾病是包含於由下列所構成之群組中：冠狀心臟病、急性冠心病、心臟衰竭或心肌梗塞。

實施例 實驗步驟 建構鬆弛素-Fc融合蛋白：

藉由化學基因合成產生鬆弛素變體的cDNA序列。經合成序列被次選殖至哺乳動物表現載體pCEP4(Invitrogen，目錄編號V044-50)。關於作為正確分泌所得蛋白之訊號前導序列，使用LDL受體相關蛋白(LRP，胺基酸組成為MLTPPLLLLLPLLSALVAA)或CD33(胺基酸組成為mplllllpllwagala)的前導序列。關於次選殖合成建構物，依據製造商的操作指南使用限制酵素HindIII以及BamH1。

為了增進血漿半衰期，藉由以化學為基礎的基因合成將人類IgG1的Fc部分與人類鬆弛素2組合在一起。人類鬆弛素2的羧基端部分(依據其基因體體制排列如下：B鏈-C鏈-A鏈)被融合至人類IgG1 Fc部分的N末端，從而使得融合蛋白的兩個部份可以藉由6個胺基酸長的連接子序列連結在一起，該連接子序列是由編碼凝血因數Xa切割位點之具有序列IleGluGlyArgMetAsp的多肽所構成。

原鬆弛素-Fc融合物具有下列序列(蛋白：SEQ ID O：1；核苷酸序列：SEQ ID O：17)：

由原激素轉變酶切去的C-鏈序列以小寫字母表示。FXa切割位點以粗體、無底線字母表示。

另一個增進多肽之生物半衰期的選擇方案為與像是轉鐵蛋白(存取編號P02787)或白蛋白(存取編號P02768)的多肽融合在一起(SR Schmid(2009))。

另一個選擇方案為使用FXa以外的其他蛋白酶切割位點，例如列於表1中的切割位點。

表現MMP9切割位點之建構物鬆弛素-融合物1具有SEQ ID NO：13(多肽)以及核苷酸序列SEQ ID NO.29。

表現凝乳酶切割位點之建構物鬆弛素-融合物2具有SEQ ID NO：14(多肽)以及核苷酸序列SEQ ID NO.30。

表現胰蛋白酶切割位點之建構物鬆弛素-融合物3具有SEQ ID NO：15(多肽)以及核苷酸序列SEQ ID NO.31。

表現彈性蛋白酶切割位點之建構物鬆弛素-融合物4具有SEQ ID NO：16(多肽)以及核苷酸序列SEQ ID NO.32。

表現鬆弛素Fc融合蛋白：

關於小規模表現(至多2毫升培養體積)，依據製造商的操作指南使用Lipofectamine2000轉染試劑(Invitrogen，目錄編號11668-019)以編碼鬆弛素-Fc融合建構物之表現質體暫時轉染HEK293(ATCC，目錄編號CRL-1573)細胞。關於鬆弛素的正確加工，將細胞共轉染編碼人類原激素轉變酶1(存取編號NP_000430.3)的表現載體。在5%二氧化碳、37℃的濕化培養箱中，以D-Mem F12(Gibco,#31330)、1%盤尼西林-鏈黴素(Gibco,#15140)以及10%胎牛血清(FCS,Gibco,#11058)培養細胞。

轉染之後3至5天，使用經穩定轉染之CHO-CRE-GR7細胞株測試經轉染細胞的條件培養基的活性。

關於大規模表現(10毫升培養體積或更多)，如Tom et al.,2007中所述在哺乳動物細胞中暫時表現該等建構物。簡言之，將表現質體轉染至HEK293-6E細胞中並培育在馮巴赫瓶(Fernbach-Flask)或編織袋中。在37℃ 下於F17培養基(Invitrogen)中表現5至6天。在轉染之後補充5 g/l胰蛋白腖TN1(Organotechnie)、1%超低IgG FCS(Invitrogen)及0.5 mM丙戊酸(Sigma)。

純化鬆弛素Fc融合蛋白：

由哺乳動物細胞培養物上清液純化鬆弛素Fc-融合建構物。首先藉由離心使得上清液自細胞殘餘物移除。藉由蛋白A(MabSelect Sure,GE Healthcare)親和力層析法接而尺寸排除層析法(SEC)純化蛋白。因此，將上清液施用至預先以PBS pH 7.4平衡的蛋白A管柱，以10倍管柱體積的PBS pH 7.4+500 mM NaCl移除汙染物。以50 mM乙酸鈉pH 3.5+500 mM NaCl沖提鬆弛素Fc融合建構物，並藉由SEC在Superdex 200管柱上以PBS pH 7.4進一步純化。

定量經表現之鬆弛素-Fc融合蛋白：

關於經分泌以及經純化重組鬆弛素變體的定量，依據製造商的操作指南使用商業上可取得的定量ELISA(R&D Systems，Human Relaxin-2 Quantikine ELISA Kit，目錄編號DRL200)。

除了一些建構物以外，藉由使用FC-ELISA定量蛋白。關於Fc ELISA，在4℃下將96孔微量滴定盤(Nunc,Maxi Sorp black，目錄編號460918)以濃度為每毫升5 μg之抗Fc抗體(SigmaAldrich，目錄編號A2136)塗覆過夜。藉由使用每孔50微升緩衝液(具有PBS以及0.05% Tween 20緩衝劑(SigmaAldrich，目錄編號63158))洗滌盤1次。添加30微升阻斷緩衝液(Candor Bioscience，目錄編號113500)並在37℃下將盤培育1小時。使用每孔50微升PBS/0.05% Tween 20緩衝液洗滌該等盤3次。添加樣品並在37℃下將盤培育1小時。若需要的話，必須藉由使用上述阻斷緩衝液稀釋樣品。培育之後，使用每孔50微升PBS/0.05% Tween 20緩衝液洗滌該等盤3次。

關於偵測，添加30微升之以10%阻斷緩衝液稀釋成1：10000之抗-h-Fc-POD(SigmaAldrich，目錄編號A0170)並在37℃下將盤培育1小時。培育之後，使用每孔50微升PBS/0.05% Tween 20緩衝液洗滌該等盤3次。添加30微升BM Blue Substrate POD(Roche Diagnostics，目錄編號11484281001)並在培育5分鐘之後藉由添加1莫耳硫酸溶液中止反應。使用Tecan Infinite 500讀取儀、吸光度模式、激發450 nm、發射690 nm來測定吸收。

活性測試：

以環狀AMP反應性要素(CRE)螢光酶報導子基因建構物(Biomyx Technology,pHTS-CRE，目錄編號P2100)穩定轉染CHO K1細胞(ATCC，目錄編號CCL-61)而產生CHO-CRE-螢光酶細胞株。

接著以人類LGR7/RXFP1報導子(存取編號NM_021634.2)穩定轉染此細胞株，以2271鹼基對長的DNA片段選殖至哺乳動物表現載體 pcDNA3.1(-)(Invitrogen，目錄編號V79520)中，產生CHO-CRE-LGR7細胞株。將此細胞株培育在D-Mem F12(Gibco,#31330)、2 mM Glutamax(Gibco,#35050)、100 nM丙酮酸(Gibco,# 11360-070)、20 mM Hepes(Gibco,# 15630)、1%盤尼西林-鏈黴素(Gibco,#15140)及10%胎牛血清(FCS,Gibco,#11058)中。

關於刺激，將培養基置換成含有不同濃度(通常始於濃度100 nM，接而為1：2稀釋度)重組表現鬆弛素-Fc融合蛋白之OptiMem(Gibco,#11058)+1%FCS。作為陽性對照組，使用商業上可取得的重組表現人類鬆弛素2(R&D Systems，目錄編號6586-RN-025)。接著，在5%二氧化碳、37℃的濕化培養箱中培育細胞6小時。6小時之後，使用Luciferase Assay System(Promega,# E1500)以及Tecan Infinite 500讀取儀、螢光模式、1000微秒積分時間、測量時間30秒來測試細胞的螢光酶活性。

藉由使用電腦程式Graph Pad Prism第5版，使用相對螢光單位來測定不同分子的EC50數值。關於鬆弛素以及本發明融合多肽的替代性活性測試，使用具有內源性表現LGR7受體的細胞株(例如THP1，ATCC目錄編號TIB-202)或初代細胞(例如Celprogen Inc.，人類心肌細胞培養物，目錄編號36044-15)。此等細胞是依據製造商的操作指南來進行培育。

偵測鬆弛素或鬆弛素-Fc融合蛋白誘導cAMP生成的方法為本技藝中已知的。例如，此等測量是使用cAMP ELISA(例如IBL International GmbH，cAMP ELISA，目錄編號CM 581001)根據製造商的操作指南來進行。偵測鬆弛素或鬆弛素-Fc融合蛋白誘導PI3激酶活化的方法為本技藝中已知的。例如，此等測量是使用PI3-kinase HTRF Assay根據製造商的操作指南(例如Millipore，PI3-kinase HTRF Assay，目錄編號33-016)來進行。

鬆弛素-Fc融合蛋白的蛋白酶處理以及活性測試

將表現鬆弛素-Fc融合蛋白的HEK293細胞的上清液與下面所指出的對應蛋白酶一起培育：

- 在23℃下將表現鬆弛素-Fc的HEK293細胞的2 ml上清液與1 μg因數Xa蛋白酶(New England Biolabs，目錄編號P8010)一起培育6小時。

- 於37℃下，以濃度為0.83 μg/ml的凝乳酶(Sigma Aldrich，目錄編號C8118)來培育表現鬆弛素-融合物2的HEK293細胞的2 ml上清液6小時。

- 於37℃下，以濃度為10 μg/ml的胰蛋白酶(Sigma Aldrich，目錄編號T0303)來培育表現鬆弛素-融合物3的HEK293細胞的2 ml上清液6小時。

- 於37℃下，以濃度為5 μg/ml的彈性蛋白酶(Sigma Aldrich，目錄編號E7885)來培育表現鬆弛素-融合物4的HEK293細胞的2 ml上清液6 小時。

- 在使用之前，必須藉由將蛋白酶與APMA(乙酸對-胺基苯汞；Sigma Aldrich，目錄編號A-9563)一起培育來活化MMP9(R&D Systems，目錄編號911-MP)。就此，必須以分析緩衝液(Assay Buffer)(50mM Tris、10mM CaCl2、150mM NaCl2、0,05% Brij35，pH 7,5.)將MMP9稀釋至100 μg/ml的濃度(例如，1 μg在100 μl最終體積中)。添加APMA至最終濃度為1 mM(例如，20 μl之5 mM原液於100 μl最終體積中)。在37℃下培育此混合物24小時。之後，以表現鬆弛素-融合物1的HEK293細胞的2 ml上清液將經活化MMP9稀釋至最終濃度為0.4 ng/ml。在37℃下與經活化MMP9一起培育6小時。

針對活性係藉由使用如上所述CHO-CRE-LGR7細胞株來測試表現鬆弛素-Fc融合蛋白的HEK293細胞的上清液。使用人類鬆弛素2作為陽性對照組。

關於鬆弛素-Fc融合蛋白，未偵測到活性。相反地，在含有鬆弛素-Fc融合蛋白之上清液的FXa培育之後，觀察到CHO-CRE-LGR7細胞株的明顯活化。儘管此活性比人類鬆弛素2陽性對照組所得之活性還低，但其顯示使用PCS會生成可釋放之具活性鬆弛素分子。

使用未經純化之鬆弛素-融合蛋白是活性略低的一個可能解釋，因為樣品中的雜質可能會不正確地測得濃度或可能對以細胞為基礎的螢光酶分析準確性有負面影響。

使用經空表現載體轉染之HEK293細胞的上清液使得活性分析降低約3倍的商。另一個解釋為鬆弛素-融合蛋白的不完全切割會產生被切除與具功能活性鬆弛素及不活化鬆弛素-融合蛋白的混合物。

實施例1：鬆弛素-Fc

為增進生物半衰期，藉由以化學為基礎的基因合成將人類IgG1之Fc部分與人類鬆弛素2組合在一起。人類鬆弛素2的羧基端部分(依據其基因體體制排列如下：B鏈-C鏈-A鏈)被融合至人類IgG1 Fc部分的N末端，從而使得融合蛋白的兩個部份可以藉由6個胺基酸長的連接子序列連結在一起，該連接子序列是由編碼凝血因數Xa切割位點之具有序列IleGluGlyArgMetAsp的多肽所構成。藉由使用CHO-CRE-LGR7細胞株在與具有如上所述蛋白酶FXa之建構物一起培育之後，鬆弛素僅顯示可偵測到的活性。

實施例2：鬆弛素-融合物1

為增進生物半衰期，藉由以化學為基礎的基因合成將人類IgG1之Fc部分與人類鬆弛素2組合在一起。人類鬆弛素2的羧基端部分(依據其基因體體制排列如下：B鏈-C鏈-A鏈)被融合至人類IgG1 Fc部分的N末端，從而使得融合蛋白的兩個部份可以藉由6個胺基酸長的連接子序列連結在一起，該連接子序列是由編碼蛋白酶MMP9切割位點之具有序列ArgAlaLysArgPheAlaSerLeu的多肽所構成。藉由使用CHO-CRE-LGR7細胞株在與具有如上所述蛋白酶MMP9之建構物一起培育之後，鬆弛素僅顯示可偵測到的活性。

實施例3：鬆弛素-融合物2

為增進生物半衰期，藉由以化學為基礎的基因合成將人類IgG1之Fc部分與人類鬆弛素2組合在一起。人類鬆弛素2的羧基端部分(依據其基因體體制排列如下：B鏈-C鏈-A鏈)被融合至人類IgG1 Fc部分的N末端，從而使得融合蛋白的兩個部份可以藉由6個胺基酸長的連接子序列連結在一起，該連接子序列是由編碼蛋白酶凝乳酶切割位點之具有序列ArgValGlyPheTyrGluSerAsp的多肽所構成。藉由使用CHO-CRE-LGR7細胞株在與具有如上所述蛋白酶凝乳酶之建構物一起培育之後，鬆弛素僅顯示可偵測到的活性。由凝乳酶實驗中所得之低訊號值可能是因為篩選細胞株因為添加凝乳酶蛋白酶而使表現之LGR7受體被切割。習於本技藝者知曉如何在分析系統中移除或降低凝乳酶活性(例如使用特定蛋白酶抑制劑)。但是，此等數據證實功能性鬆弛素可從融合蛋白被釋放。

實施例4：鬆弛素-融合物3

為增進生物半衰期，藉由以化學為基礎的基因合成將人類IgG1之Fc部分與人類鬆弛素2組合在一起。人類鬆弛素2的羧基端部分(依據其基因體體制排列如下：B鏈-C鏈-A鏈)被融合至人類IgG1 Fc部分的N末端，從而使得融合蛋白的兩個部份可以藉由6個胺基酸長的連接子序列連結在一起，該連接子序列是由編碼蛋白酶胰蛋白酶切割位點之具有序列IleAsnAlaArgValSerThrIle的多肽所構成。在與具有如上所述胰蛋白酶之上清液一起培育之後，鬆弛素僅顯示明顯活性。未經培育的上清液顯示少許活性，可能是因為細胞培養物上清液中的蛋白酶汙染，其辨識胰蛋白酶以外的相似切割位點。

實施例5：鬆弛素-融合物4

為增進生物半衰期，藉由以化學為基礎的基因合成將人類IgG1之Fc部分與人類鬆弛素2組合在一起。人類鬆弛素2的羧基端部分(依據其基因體體制排列如下：B鏈-C鏈-A鏈)被融合至人類IgG1 Fc部分的N末端，從而使得融合蛋白的兩個部份可以藉由6個胺基酸長的連接子序列連結在一起，該連接子序列是由編碼蛋白酶彈性蛋白酶切割位點之具有序列GlyLeuArgValGlyPheTyrGlu的多肽所構成。藉由使用CHO-CRE-LGR7細胞株在與具有如上所述蛋白酶彈性蛋白酶之建構物一起培育之後，鬆弛素僅顯示可偵測到的活性。未經培育的上清液顯示少許活性，可能是因為細胞培養物上清液中的蛋白酶汙染，其辨識彈性蛋白酶以外的相似切割位點。

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EP0322094

EP0399666

EP0413622

U.S. 4,399,216, 4,634,665

Bell et al的U.S. 4,510,245

Schaffner et al.的U.S. 4,968,615

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WO 00/06568

WO 01/19355

WO 01/19778

WO 01/77137

WO 02/070462

WO 02/42301

WO 93/15199

WO 93/15200

WO 97/26265

WO01/45746

WO2001/058957

WO2010/054699

WO93/1519

第1圖為鬆弛素融合多肽的結構及其之後在血流中透過內切肽酶/內切蛋白酶切割含有蛋白酶切割位點(PCS)之連接子而活化的示意圖。A鏈、B鏈及C鏈表示個別鬆弛素鏈。具有PCS的連接子為含有PCS的連接子，而黑線表示鬆弛素中的細胞間雙硫鍵與細胞內雙硫鍵。Fc域為IgG分子的Fc域。

第2圖為使用CHO-CRE-LGR7細胞株之鬆弛素-Fc融合建構物的活性測定圖。h鬆弛素2(R&D Systems，目錄編號6586-RN-025)用為對照組。數據以相對光單位表示，呈現鬆弛素變體及h鬆弛素2誘發螢光酶表現的活性。符號表示平均值，誤差槓表示S.E.M.。

第3a至3d圖為使用CHO-CRE-LGR7細胞株之鬆弛素-融合建構物1-4的活性測定圖。h鬆弛素2(R&D Systems，目錄編號6586-RN-025)用為對照組。數據以相對光單位表示，呈現鬆弛素變體及h鬆弛素2誘發螢光酶表現的活性。符號表示平均值，誤差槓表示S.E.M.。

<110> Baver Intellectual property GmbH Bayer Intellectual Property GmbH

<120> 釋放鬆弛素之融合蛋白及其用途

<130> BHC 11 1 034

<160> 32

<170> Patent In version 3.5

<210> 1

<211> 397

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素-Fxa切割位點-hum IgG1 Fc

<400> 1

<210> 2

<211> 679

<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 2

<210> 3

<211> 585

<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 3

<210> 4

<211> 231

<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 4

<210> 5

<211> 160

<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 5

<210> 6

<211> 24

<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 6

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 7

<210> 8

<211> 28

<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 8

<210> 9

<211> 117

<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 9

<210> 10

<211> 24

<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 10

<210> 11

<211> 27

<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 11

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 智慧人

<400> 12

<210> 13

<211> 399

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素-MMP9切割位點-humFc IgG1

<400> 13

<210> 14

<211> 399

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素-凝乳酶切割位點-humFc IgG1

<400> 14

<210> 15

<211> 399

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素-胰蛋白酶切割位點-humFc IgG1

<400> 15

<210> 16

<211> 399

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素-彈性蛋白酶切割位點-humFc IgG1

<400> 16

<210> 17

<211> 1191

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素-Fxa切割位點-hum IgG1 Fc

<400> 17

<210> 18

<211> 2037

<212> DNA

<213> 智慧人

<400> 18

<210> 19

<211> 1755

<212> DNA

<213> 智慧人

<400> 19

<210> 20

<211> 693

<212> DNA

<213> 智慧人

<400> 20

<210> 21

<211> 480

<212> DNA

<213> 智慧人

<400> 21

<210> 22

<211> 72

<212> DNA

<213> 智慧人

<400> 22

<210> 23

<211> 48

<212> DNA

<213> 智慧人

<400> 23

<210> 24

<211> 84

<212> DNA

<213> 智慧人

<400> 24

<210> 25

<211> 351

<212> DNA

<213> 智慧人

<400> 25

<210> 26

<211> 72

<212> DNA

<213> 智慧人

<400> 26

<210> 27

<211> 81

<212> DNA

<213> 智慧人

<400> 27

<210> 28

<211> 45

<212> DNA

<213> 智慧人

<400> 28

<210> 29

<211> 1197

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素-MMP9切割位點-humFc IgG1

<400> 29

<210> 30

<211> 1197

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素-凝乳酶切割位點-humFc IgG1

<400> 30

<210> 31

<211> 1197

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素-胰蛋白酶切割位點-humFc IgG1

<400> 31

<210> 32

<211> 1197

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬆弛素-彈性蛋白酶切割位點-humFc IgG1

<400> 32

Claims

一種包含鬆弛素(Relaxin)-PCS-HEM或HEM-PCS-鬆弛素之融合蛋白，其中：鬆弛素包含鬆弛素A鏈多肽或其功能性變體，以及鬆弛素B鏈多肽或其功能性變體，PCS包含內切蛋白酶切割位點，以及HEM為延長半衰期之蛋白部分。
一種包含原鬆弛素(proRelaxin)-PCS-HEM或HEM-PCS-原鬆弛素之融合多肽，其中：原鬆弛素包含鬆弛素A鏈多肽或其功能性變體，鬆弛素C鏈多肽以及鬆弛素B鏈多肽或其功能性變體，PCS包含內切蛋白酶切割位點，以及HEM為延長半衰期之蛋白部分。
如申請專利範圍第1或2項之融合蛋白或多肽，其中該PCS為細胞外內切蛋白酶的切割位點。
如申請專利範圍第3項之融合蛋白或多肽，其中該內切蛋白酶為內源性內切蛋白酶。
如前述申請專利範圍中任一項之融合多肽，其中該延長半衰期之蛋白部分包含於由下列構成之群組中的延長半衰期之蛋白部分：免疫球蛋白Fc域、血清白蛋白、轉鐵蛋白及血清白蛋白結合蛋白。
如前述申請專利範圍中任一項之融合多肽，其中該鬆弛素A鏈為人類鬆弛素2 A鏈，而鬆弛素B鏈為人類鬆弛素2 B鏈。
一種編碼如申請專利範圍第2至6項中任一項之原鬆弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-原鬆弛素融合多肽的多核苷酸。
一種包含如申請專利範圍第7項之多核苷酸的載體。
一種包含如申請專利範圍第8項之載體或如申請專利範圍第7項之多核苷酸的宿主細胞。
一種生產如申請專利範圍第1至6項中任一項之鬆弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-鬆弛素蛋白之方法，其包含培育如申請專利範圍第9項之進一步含有原激素轉變酶活性的宿主細胞，以及分離該蛋白的步驟。
一種包含如申請專利範圍第1至6項中任一項之鬆弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-鬆弛素蛋白的醫藥組成物。
如申請專利範圍第11項之醫藥組成物或如申請專利範圍第1至6項中任一項之鬆弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-鬆弛素蛋白，其係作為藥物。
如申請專利範圍第11或12項之醫藥組成物或如申請專利範圍第1至15項中任一項之鬆弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-鬆弛素蛋白，其係作為用於治療心血管疾病、肺臟疾病、纖維化病症或腎臟疾病的藥物。
一種治療心血管疾病、肺臟疾病、纖維化病症或腎臟疾病的方法，其包含投與治療有效劑量之如申請專利範圍第11及12項之醫藥組成物或如申請專利範圍第1至6項中任一項之鬆弛素-PCS-HEM或HEM-PCS-鬆弛素蛋白。
一種如申請專利範圍第13或14項之治療方法，其中該心血管疾病是包含於下列之群組中：冠狀心臟病、急性冠心病、心臟衰竭或心肌梗塞。