KR20140024215A

KR20140024215A - 신규한 우르솔릭산 유도체 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20140024215A
Application number: KR1020130091893A
Authority: KR
Inventors: 윤여홍; 권돈선
Original assignee: 한국콜마주식회사
Priority date: 2012-08-14
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2014-02-28
Also published as: US20150218206A1; US9120839B2; KR101889528B1; WO2014027777A2; CN104684883A; WO2014027777A3

Abstract

본 발명은 우수한 안정성 및 경구 흡수도 등 약동력학적 특성을 가질 수 있는 우르솔릭산의 전구 약물 형태로서, 체내에서 우르솔릭산으로 전환되어 우수한 약학적 활성을 나타낼 수 있는 우르솔릭산 전구 약물 형태의 신규한 우르솔릭산 유도체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 우르솔릭산 유도체는 우르솔릭산의 C28의 카르복실산에 소정 약학적 화합물의 전구 약물이 결합된 에스테르 형태를 가질 수 있다.

Description

신규한 우르솔릭산 유도체 및 이의 제조 방법{NOVEL URSOLIC ACID DERIVATIVES AND PREPARATION METHOD THEREOF}

본 발명은 신규한 우르솔릭산 유도체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 우수한 안정성 및 경구 흡수도 등 약동력학적 특성을 가질 수 있는 우르솔릭산의 전구 약물 형태로서, 체내에서 우르솔릭산으로 전환되어 우수한 약학적 활성을 나타낼 수 있는 우르솔릭산 전구 약물 형태의 신규한 우르솔릭산 유도체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

우르솔릭산은 로즈마리 잎 등의 천연물에서 추출 가능한 펜타시클릭 트리테르펜산(pentacyclic triterpene acid) 화합물이다. 이러한 우르솔릭산은 사과, 특히 껍질, 라벤더(lavender), 바질(basil), 로즈마리(rosemary), 오레가노(olegano) 또는 타임(thyme) 등의 많은 식물에 함유되어 있는 천연물 유래 화합물로 볼 수 있다.

상기 우르솔릭산은 하기 화학식 1의 구조를 가질 수 있으며, 3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic acid의 화학명으로 지칭될 수 있다. 이의 분자량 및 일반식은 약 456.68 및 C₃₀ H₄₈O₃이다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 우르솔릭산은 pentacyclic triterpene의 기본 구조를 가지고 있으며, C-3에 히드록시기, C-12에 이중결합, C-28에 카르복실기가 치환된 구조를 가지고 있다. 이러한 구조를 갖는 우르솔릭산은 물에 매우 난용성인 것으로 알려져 있고, 또, 10개의 부재탄소를 가지고 있는 매우 복잡한 구조의 광학활성 물질로 알려져 있다.

이러한 특성으로 인해, 상기 우르솔릭산은 화학적 합성으로 제조하기가 불가능하며, 단지 이러한 물질이 다량 함유된 식물 등 천연물로부터 추출 및 정제해야만 얻어질 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이러한 식물 등 천연물에도 상기 우르솔릭산이 함유된 함량이 그리 높지는 않으므로, 추출 및 정제를 통해 이러한 우르솔릭산을 고순도 및 고농도로 얻기 위해서는 매우 높은 비용이 요구된다.

한편, 상술한 우르솔릭산은 기능성 화장품 소재로서 알려져 있고, 특히, 광노화로 인한 피부개선이나 염증치료 등에 사용 가능함이 보고된 바 있다. 다만, 화장품 소재로 사용되는 우르솔릭산은 그 순도가 높지 않은 경우가 많고, C-29가 수소이고 C-30이 디메틸인 구조 이성체인 올레아노릭산 (oleanolic acid) 등을 함유하고 있다. 따라서, 상기 화장품 소재로 사용되는 저순도의 우르솔릭산을 의약품 용도에 그대로 적용하기에는 어려움이 있다.

그럼에도 불구하고, 우르솔릭산을 다양한 의약품에 적용할 수 있음이 다수 보고된 바 있다. 예를 들어, Int. J. Cancer (2010), 127, 462~473 에는, 상기 우르솔릭산이 살아있는 세포에서 NF-ΚB 활성화를 저해하므로 항암치료-화학요법의 효능을 증강시킬 수 있음이 보고되었다. 또, Cell Metabolism (2011) 13, 627~638 에는, 우르솔릭산이 근위축증(Muscle atrophy)의 치료 및 예방에 우수한 효능을 나타내는 것으로 보고되었다. 이외에도, 상기 우르솔릭산은 간섬유화(hepato fibrosis)의 치료제 (J of Hepatology (2011) 55, 379~387)로 보고된 바 있고, PPAR-α 를 활성화시킴으로서 고지혈증 치료제로 가능성을 나타냄이 알려진 바 있다 (Bioorg Med Chem Lett (2011) 21, 5876~5880).

또한, 상술한 우르솔릭산의 효능을 더욱 증강시키거나 새로운 효능을 가질 수 있는 우르솔릭산 유도체에 관한 연구도 일부 이루어진 바 있다.

예를 들어, EP1889850A1에는 우르솔릭산의 C-3에 포스페이트를 치환시킨 유도체가 개시되어 있고, US3909089에는 우르솔릭산의 C-28의 카르복실산에 피페라진 등을 결합시킨 아민염 형태의 유도체가 개시되어 있다. 그리고, US4530934에서는, 우르솔릭산의 C-3에 카르복시프로피오닐옥시기를 치환시킨 유도체를 개시하고 있으며, 이러한 유도체가 항궤양 치료제로서 활성을 나타내는 것으로 기재하고 있다. 부가하여, US2011/0190388A1에서는 항염증제 및 항암제로서 사용 가능한 우르솔릭산 유도체로서, C-3에 아실옥시기를 치환시키고, C-28의 카르복실산에 탄소수 5 내지 8의 알킬기를 치환시킨 유도체를 개시하고 있다.

상술한 바와 같은 우르솔릭산 또는 이의 유도체들의 다양한 약학적 유용성 및 효능에도 불구하고, 물에 난용성이고 경구 흡수도가, 예를 들어, 1% 미만으로 매우 낮으며, 고순도 제조가 어려운 우르솔릭산 등의 특성으로 인해, 우르솔릭산을 포함하는 제제에 관한 연구는 한계에 부딪히고 있다.

이에 본 발명은 우수한 안정성 및 경구 흡수도 등 약동력학적 특성을 가질 수 있는 우르솔릭산의 전구 약물 형태로서, 체내에서 우르솔릭산으로 전환되어 우수한 약학적 활성을 나타낼 수 있는 우르솔릭산 전구 약물 형태의 신규한 우르솔릭산 유도체 및 이의 제조 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 하기 화학식 2의 우르솔릭산 유도체를 제공한다:

[화학식 2]

상기 화학식 2에서, R₁은 수소 또는 아세틸기이고, R₂는

,

,

또는

이다.

본 발명은 또한, 화학식 1의 우르솔릭산을 아세틸화하여 화학식 3의 화합물을 형성하는 단계; 및 화학식 3의 화합물을 화학식 4의 R₂-X와 에스테르화 반응시키는 단계를 포함하는 상기 화학식 2의 우르솔릭산 유도체의 제조 방법을 제공한다:

[화학식 1]

[화학식 3]

[화학식 4]

R₂-X

상기 식에서, R₂는

,

,

또는

이고, X는 클로로(Cl), 브로모(Br) 또는 요오드(I)의 할로겐 라디칼이다.

이하 발명의 구체적인 구현예에 따른 우르솔릭산 유도체 및 이의 제조 방법에 대해 설명하기로 한다.

발명의 일 구현예에 따르면, 상기 화학식 2의 우르솔릭산 유도체가 제공된다. 이러한 우르솔릭산 유도체는 우르솔릭산의 C28의 카르복실산에 소정의 작용기 R₂가 도입되어 에스테르 구조를 갖는 것이다. 이때, R₂는 올메사탄의 전구 약물(olmesartan medoxomil)에서 유래한 (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔-4일)메틸기; 세포티암의 전구 약물 (cefotiam hexetil)에서 유래한 1-[[(시클로헥실옥시)카르보닐]옥시]에틸기; 발프로에이트 산의 전구 약물 (valproate pivoxil)에서 유래한 [(2,2-디메틸프로파노일)옥시]메틸기; 또는 세프록심의 전구 약물 (cefuroxime axetil)에서 유래한 1-[(4-메톡시부타노일)옥시]에틸기에 해당하는 것이다.

상기 올메사탄, 세포티암, 발프로에이트산 또는 세프록심 등의 난용성 약물에 이러한 소정의 작용기 R₂를 도입함에 따라, 난용성 약물의 경구 흡수도를 증가시키고 보관상 안정성을 향상시킬 수 있음이 알려진 바 있다. 그러나, 이러한 작용기 R₂를 우르솔릭산에 도입한 예는 알려진 바 없었다.

본 발명자들의 실험 결과, 놀랍게도 이러한 소정의 작용기 R₂를 우르솔릭산의 특정 위치, 즉, C28의 카르복실산에 도입하여 에스테르 형태의 전구 약물, 즉, 상기 화학식 2의 우르솔릭산 유도체로 제공함에 따라, 우르솔릭산의 낮은 경구 흡수도(예를 들어, 1% 미만) 및 제제 안정성을 크게 향상시킬 수 있음이 확인되었다. 또한, 이들 작용기 R₂는 체내에서 특정 효소, 예를 들어, 탈에스테르화 효소 등에 의해 빠르게 대사 및 분해될 수 있다. 그 결과, 상기 화학식 2의 우르솔릭산 유도체는 체내에서 우르솔릭산의 형태로 전환될 수 있으므로, 우르솔릭산 특유의 우수한 약동학적 특성을 나타낼 수 있다.

따라서, 상기 화학식 2의 우르솔릭산 유도체는 올메사탄, 세포티암, 발프로에이트산 또는 세프록심에서 이미 적용하여 상품화하였던, 공지의 전구 약물 형태의 에스테르를 우르솔릭산에 적용하여 도입함으로서 우르솔릭산이 갖는 낮은 경구 흡수도 또는 생체 이용율 등의 문제점을 해결하면서도, 체내에서 우르솔릭산 특유의 우수한 약학적 활성을 향상시킬 수 있으므로, 우르솔릭산 또는 이의 유도체의 약학적 제제에 대한 적용에 크게 기여할 수 있다.

부가하여, 상기 우르솔릭산 유도체는 우르솔릭산으로부터 후술하는 화학적 합성을 통해 얻어질 수 있다. 따라서, 이러한 우르솔릭산 유도체를 고순도로 정제하기가 보다 용이하게 되며, 이는 우르솔릭산 또는 이의 유도체의 약학적, 산업적 이용에 크게 기여할 수 있다.

한편, 상술한 바와 같이, 화학식 2의 우르솔릭산 유도체는 C28의 카르복실산에 소정의 작용기 R₂가 도입된 구조를 갖게 되며, 선택적으로 C3의 히드록시기에 아세틸기가 도입된 구조를 가질 수 있다. 이러한 우르솔릭산 유도체의 구조에서, 상기 R₂의 작용기는 생체 내에서 효소에 의해 빠르게 분해되어 상기 우르솔릭산으로 전환될 수 있으며, 그 결과 우르솔릭산 특유의 우수한 약학적 활성을 나타낼 수 있다.

예를 들어, 상기 우르솔릭산 유도체는 우르솔릭산 자체와 마찬가지로, 항암제, 항암제의 효능 증강제 (특히, 항암 치료를 위한 화학 요법에서의 효능 증강제), 근위측증 치료 또는 예방제, 간섬유화 치료제 또는 고지혈증 치료제 등에 사용될 수 있다.

상술한 화학식 2의 우르솔릭산 유도체는, 상기 화학식 1의 우르솔릭산을 아세틸화하여 상기 화학식 3의 화합물을 형성하는 단계; 및 상기 화학식 3의 화합물을 R₂-X와 에스테르화 반응시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다. 또한, 이러한 제조 방법은 상기 에스테르화 반응 단계 후에, 그 반응 결과물을 탈아세틸화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 우르솔릭산 유도체의 제조 방법은 하기 반응식 1로 표시될 수 있다:

[반응식 1]

상기 반응식 1을 참고하면, 상기 제조 방법에서 첫 번째 아세틸화 단계를 진행함에 따라, 화학식 1의 우르솔릭산의 C3의 히드록시기에 아세틸기가 도입되어 화학식 3의 화합물이 형성될 수 있으며, 이를 R₂-X의 친전자체 화합물과 에스테르화 반응시키면, C28의 카르복실산에 R₂가 도입되어 에스테르 형태의 우르솔릭산 전구 약물, 즉, 화학식 2의 우르솔릭산 유도체가 형성될 수 있다. 단, 이때 형성된 우르솔릭산 유도체는 C3의 히드록시기의 아세틸기가 도입된 형태로 되는데(즉, 화학식 2에서 R₁은 아세틸기), R₁이 수소인 화학식 2의 우르솔릭산 유도체의 제조가 필요할 경우, 탈아세틸화 단계를 추가적으로 진행할 수 있다.

이러한 우르솔릭산 유도체의 제조 방법을 각 단계별로 설명하면 다음과 같다.

먼저, 첫 번째 단계에서는, 화학식 1의 우르솔릭산을 아세틸화하여 C3의 히드록시기에 아세틸기를 도입하며, 이에 따라 화학식 3의 화합물을 형성한다. 이때, 아세틸화 반응은 염기, 예를 들어, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민 또는 피리딘 등의 아민 염기의 존재 하에 진행할 수 있고, 아세틸화를 위한 반응물로는 무수 초산 또는 아세틸클로라이드 등을 사용할 수 있다. 경우에 따라, N,N-디메틸아미노피리딘과 같은 촉매의 존재 하에, 상기 아세틸화 반응을 진행할 수 있다.

또, 상기 아세틸화 단계에서는, 디클로로메탄 등의 할로알칸계 용매, 테트라히드로퓨란 또는 디옥산 등의 시클릭에테르계 용매, 에틸아세테이트 등의 에스테르계 용매, N,N-디메틸포름아미드 등의 아미드계 용매 또는 아세톤 등의 케톤계 용매나, 이들 중에 선택된 2종 이상의 혼합 용매를 반응 용매로 사용할 수 있다. 이중에서도, 할로알칸계 용매 또는 시클릭에테르계 용매를 적절히 사용할 수 있다.

그리고, 상기 아세틸화 단계는, 약 0 내지 100℃, 혹은 약 10 내지 30℃의 반응 온도에서 진행할 수 있다.

다음으로, 두 번째 단계에서는, 상기 화학식 3의 화합물과, R₂-X의 친전자체 화합물을 에스테르화 반응시켜 C28의 카르복실산에 R₂를 도입하며, 이에 따라, R₁이 아세틸기인 화학식 2의 우르솔릭산 유도체를 형성한다. 이러한 에스테르화 반응 단계에서는, 상기 C28의 카르복실산을 이온화한 후, 친전자체 화합물을 이용해 친핵성 치환 반응을 진행함으로서, 상기 화학식 2의 우르솔릭산 유도체를 형성할 수 있다.

따라서, 상기 에스테르화 반응 단계에서는, 상기 C-28의 카르복실산을 이온화하기 위한 염기, 예를 들어, 수산화나트륨 또는 소디움카보네이트 등의 알칼리 금속 염기나, 수산화칼륨 또는 포타슘카보네이트 등의 알칼리 토금속 염기의 존재 하에 상기 반응 단계를 진행할 수 있다. 적절하게는 포타슘카보네이트를 사용할 수 있다.

또한, 상기 R₂-X의 친전자체 화합물의 구체적인 예로는,

,

,

또는

등을 사용할 수 있고, 이러한 친전자체 화합물을 사용해 에스테르화 반응 단계를 진행함으로서 화학식 2의 우르솔릭산 유도체를 적절히 제조할 수 있다. 상기 친전자체 화합물의 구체적인 예들은 4-클로로메틸-5-메틸-2-옥소-1,3-디옥소렌, 1-클로로에틸 시클로헥실 카르보네이트, 1-클로로메틸 피발레이트 또는 1-(아세톡시에틸)브로마이드의 화합물명으로 표시될 수 있다.

이들 친전자체 화합물 중, 상기 4-클로로메틸-5-메틸-2-옥소-1,3-디옥소렌 또는 1-클로로에틸 시클로헥실 카르보네이트는 부재 탄소를 갖는 광학 활성 물질로서, 이들의 광학 이성체를 사용할 수도 있지만, 보다 적절하게는 이들의 라세미체를 사용할 수 있다.

또, 상기 친전자체 화합물은 화학식 3의 화합물에 대해 약 1.0 내지 3.0 당량, 적절하게는 약 1.2 내지 2.0 당량, 더욱 적절하게는 약 1.4 내지 1.6 당량으로 사용될 수 있다.

그리고, 상기 에스테르화 반응 단계에서는, 아세토니트릴 등의 니트릴계 용매,아세톤 또는 메틸에틸케톤 등의 케톤계 용매, 혹은 N,N-디메틸포름아미드 등의 아미드계 용매나, 이들 중에 선택된 2종 이상의 혼합 용매를 반응 용매로 사용할 수 있다. 이중에서도, 케톤계 용매 또는 아미드계 용매를 적절히 사용할 수 있다.

또, 상기 에스테르화 반응 단계는, 약 0 내지 100℃, 혹은 약 10 내지 50℃의 반응 온도에서 진행할 수 있다.

상술한 제조 방법에서는, 선택적으로 탈아세틸화를 세 번째 단계로 진행할 수 있고, 이에 따라, R₁은 아세틸기인 화학식 2의 우르솔릭산 유도체로부터 R₁이 수소인 우르솔릭산 유도체를 제조할 수 있다.

이러한 탈아세틸화 단계에서는, 메탄올 등의 알코올 용매 내에서, 상기 에스테르화 반응 결과물을 산 또는 염기로 처리하여 탈아세틸화를 진행할 수 있다. 보다 구체적으로, 메탄올 등의 알코올 용매 내에서, 수산화나트륨 수용액, 탄산칼륨 수용액 또는 암모니아수 등의 염기성 수용액을 사용하는 염기성 조건 하에서, 상기 우르솔릭산 유도체를 탈아세틸화할 수 있다. 선택 가능한 다른 방법으로서, 상기 알코올 용매 내에서, 4-톨루엔술폰산 등의 산이나, 트리플루오로보란 디에틸에테르 등의 루이스 산을 사용하는 산성 조건 하에서, 상기 우르솔릭산 유도체를 탈아세틸화할 수도 있다.

다만, 적절하게는 디클로로메탄 등의 할로알칸계 용매와, 메탄올 등의 알코올계 용매의 혼합 용매 내에서, 상술한 산성 조건 하에 탈아세틸화 단계를 진행할 수 있다.

그리고, 상기 탈아세틸화 단계는, 약 0 내지 100℃, 혹은 약 10 내지 40℃의 반응 온도에서 진행할 수 있다.

본 발명에 따르면, 우르솔릭산의 낮은 경구 흡수도 및 제제 안정성을 크게 향상시키면서도, 생체 내에서 우르솔릭산의 형태로 전환되어 그 특유의 우수한 약학적 활성을 나타내는 신규한 우르솔릭산 유도체가 제공될 수 있다.

따라서, 이러한 우르솔릭산 유도체는 우르솔릭산이 갖는 낮은 경구 흡수도 또는 생체 이용율 등의 문제점을 해결하면서도, 체내에서 우르솔릭산 특유의 우수한 약학적 활성을 나타낼 수 있으므로, 우르솔릭산 또는 이의 유도체의 약학적 제제에 대한 적용에 크게 기여할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

참고예 1: 3β-아세톡시-우르스-12-엔-28-오익산(화학식 3)의 제조

우르솔릭산(순도 98%) 7.5g을 테트라히드로퓨란 50ml에 실온에서 가하여 용해시켰다. 이어서, 피리딘 6.45g과 N,N-디메틸아미노피리딘 0.2g을 가한 다음 10℃ 이하로 냉각시키고, 무수 초산 5.9g을 30분 동안 서서히 적가하였다. 실온에서 12시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 반응 완료가 확인되면 반응액을 농축하였다. 이때, 반응 완료 여부는 박막크로마토그래피법 (에틸아세테이트: n-헥산= 1:4 rf=0.4)으로 확인하였다. 전개 용매 (에틸아세테이트: n-헥산= 1: 2 에서 2:1 )를 사용한 컬럼크로마토그래피를 통하여 상기 반응 농축액을 분리 및 정제하여 목적 화합물 5.5g을 제조하였다.

¹H-NMR(DMSO-d6, 500MHz) 11.92(1H. s), 5.12~5.14(1H, t), 2.10~2.12(1H, d, J=11.0Hz), 2.00(3H, s), 1.06(3H,s), 0.91~0.92(6H, d), 0.81~0.86(9H, m), 0.76(3H,s);

IR(cm^-1) 2924, 1734, 1686, 1459, 1367, 1245, 1027;

HPLC 순도: 99.0% 이상(면적비).

실시예 1: (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔-4-일) 메틸 3β-아세톡시-우르스-12-엔-28-오에이트의 제조

참고예 1에서 얻어진 화합물 1.0g을 아세톤 20ml에 용해시켰다. 탄산칼륨 0.9g와 포타슘요오드(KI) 0.4g을 가하고, 4-클로로메틸-5-메틸-2-옥소-1,3-디옥소렌 0.6g을 가하였다. 실온에서 24시간 동안 반응시킨 후 농축하였다. 농축물에 에틸아세테이트 10ml를 가하고, 물과 소금물 10ml로 각각 세척한 다음, 무수황산나트륨으로 건조하였다. 감압 여과 후 농축하여 얻어진 잔사를 컬럼크로마토그래피로 분리 및 정제하여 목적 화합물 0.7g을 제조하였다.

¹H-NMR(DMSO-d6, 500MHz) 4.76~4.99(2H, dd) 5.17(1H, t), 2.15~2.17(1H, d, J=11.0Hz), 2.11(3H,s), 2.00(3H, s), 1.06(3H, s), 0.90~0.92(6H, d), 0.81~0.86(9H, m), 0.76(3H,s);

IR(cm^-1) 2924, 1819, 1732, 1447, 1371, 1244, 1129, 1010.

실시예 2: (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔-4-일)메틸 3β-히드록시-우르스-12-엔-28-오에이트

실시예 1에서 얻어진 화합물 0.5g을 디클로로메탄 4ml와 메탄올 0.7ml에 용해시키고, 4-톨루엔술폰산 0.68.g을 가하여 10일 동안 실온에서 반응시켰다. 이후, 디클로로메탄 10ml와 물 10ml를 가하고 추출한 다음, 무수황산나트륨으로 건조하고 여과하였다. 얻어진 잔사를 전개 용매 (에틸아세테이트: n-헥산= 1: 2 에서 2:1)를 사용하여 컬럼크로마토그래피를 통하여 분리 정제하여 목적 화합물 0.3g을 제조하였다.

¹H-NMR(DMSO-d6, 500MHz) 4.76~4.99(2H, dd) 5.16(1H, t), 2.96~3.01(1H,m), 2.14~2.16(1H, d, J=11.5Hz), 2.11(3H,s), 1.04(3H,s), 0.90~0.92(3H, d), 0.88(3H, s), 0.86(3H,s), 0.81~0.86(3H, d, J= 11.5Hz), 0.75(3H, s), 0.56(3H,s);

IR(cm^-1) 2918, 1822, 1686, 1720, 1455, 1383, 1219, 1186, 1044, 1029.

실시예 3: 1-[[(시클로헥실옥시)카르보닐]옥시]에틸 3β-아세톡시-우르스-12-엔-28-오에이트

참고예 1에서 얻어진 화합물 1.0g을 아세톤 20ml에 용해시켰다. 탄산칼륨 0.9g와 포타슘요오드(KI) 0.4g을 가하고, 1-클로로에틸 시클로헥실 카르보네이트 0.65g을 가하였다. 실온에서 24시간 동안 반응시킨 후 농축하였다. 농축물에 에틸아세테이트 10ml를 가하고, 물과 소금물 10ml로 각각 세척한 다음, 무수황산나트륨으로 건조하였다. 감압 여과 후 농축하여 얻어진 잔사를 컬럼크로마토그래피로 분리 및 정제하여 목적 화합물 0.8g을 제조하였다.

¹H-NMR(DMSO-d6, 500MHz) 5.74~5.87(1H, dd) 5.17(1H, t), 3.0(1H, m) 2.11~2.13(1H, d, J=11.0Hz), 2.00(3H,s), 1.45(3H,d), 1.06(3H, s), 0.90~0.92(6H, d), 0.81~0.86(9H, m), 0.76(3H,s), 1.00~2.20(10H, m);

IR(cm^-1) 2925 1756 1732, 1697, 1466, 1373, 1245, 983.

실시예 4: 1-[[(시클로헥실옥시)카르보닐]옥시]에틸 3β-히드록시-우르스-12-엔-28-오에이트

실시예 3에서 얻어진 화합물 0.7g을 디클로로메탄 4ml와 메탄올 0.7ml에 용해시키고, 4-톨루엔술폰산 0.68.g을 가하여 10일 동안 실온에서 반응시켰다. 이후, 디클로로메탄 10ml와 물 10ml를 가하고 추출한 다음, 무수황산나트륨으로 건조하고 여과하였다. 얻어진 잔사를 전개 용매 (에틸아세테이트: n-헥산= 1: 2 에서 2:1)를 사용하여 컬럼크로마토그래피를 통하여 분리 정제하여 목적 화합물 0.4g을 제조하였다.

¹H-NMR(DMSO-d6, 500MHz) 5.70~5.85(1H, dd) 5.17(1H, t), 3.0(1H, m) 2.11~2.13(1H, d, J=11.0Hz), 1.45(3H,d), 1.06(3H,s), 0.90~0.92(3H,d), 0.88(3H,s), 0.86(3H,s), 0.81~0.86(3H, d,), 0.75(3H, s), 0.56(3H,s), 1.00~2.20(10H, m);

IR(cm^-1) 2920, 1754, 1732, 1697, 1466, 1373, 1220.

실시예 5: [(2,2-디메틸-프로판오일)옥시]메틸 3β-아세톡시-우르스-12-엔-28-오에이트

참고예 1에서 얻어진 화합물 1.0g을 아세톤 20ml에 용해시켰다. 탄산칼륨 0.9g와 포타슘요오드(KI) 0.4g을 가하고, 1-클로로메틸 피발레이트 0.55g을 가하였다. 실온에서 24시간 동안 반응시킨 후 농축하였다. 농축물에 에틸아세테이트 10ml를 가하고, 물과 소금물 10ml로 각각 세척한 다음, 무수황산나트륨으로 건조하였다. 감압 여과 후 농축하여 얻어진 잔사를 컬럼크로마토그래피로 분리 및 정제하여 목적 화합물 0.7g을 제조하였다.

¹H-NMR(DMSO-d6, 500MHz) 5.63~5.68(2H, dd) 5.16(1H, t), 2.11~2.13(1H, d, J=11.0Hz), 2.02(3H, s), 2.0(3H,s), 1.13(9H,m), 1.06(3H, s), 0.90~0.92(6H, d), 0.82(9H, m), 0.71(3H, s);

IR(cm^-1) 2920, 1749, 1726, 1686, 1466, 1372, 1245, 1152.

실시예 6: [(2,2-디메틸-프로판오일)옥시]메틸 3β-히드록시-우르스-12-엔-28-오에이트

실시예 5에서 얻어진 화합물 0.5g을 디클로로메탄 4ml와 메탄올 0.7ml에 용해시키고, 4-톨루엔술폰산 0.68.g을 가하여 10일 동안 실온에서 반응시켰다. 이후, 디클로로메탄 10ml와 물 10ml를 가하고 추출한 다음, 무수황산나트륨으로 건조하고 여과하였다. 얻어진 잔사를 전개 용매 (에틸아세테이트: n-헥산= 1: 2 에서 2:1)를 사용하여 컬럼크로마토그래피를 통하여 분리 정제하여 목적 화합물 0.3g을 제조하였다.

¹H-NMR(DMSO-d6, 500MHz) 5.63~5.68(2H, dd) 5.17(1H, t), 2.11~2.13(1H, d, J=11.0Hz), 3.0(1H, m) 1.13(9H,m), 1.04(3H,s), 0.90~0.92(3H, d), 0.88(3H,s), 0.86(3H,s), 0.81~0.86(3H, d,), 0.75(3H, s), 0.56(3H,s);

IR(cm^-1) 2920, 1749, 1726, 1686, 1466, 1372, 1219, 1180.

실시예 7 : 1-(아세톡시) 에틸 3β-아세톡시-우르스-12-엔-28-오에이트

참고예 1에서 얻어진 화합물 1.0g을 아세톤 20ml에 용해시켰다. 탄산칼륨 0.9g을 가하고, 1-(아세톡시에틸)브로마이드 0.6g을 가하였다. 실온에서 24시간 동안 반응시킨 후 농축하였다. 농축물에 에틸아세테이트 10ml를 가하고, 물과 소금물 10ml로 각각 세척한 다음, 무수황산나트륨으로 건조하였다. 감압 여과 후 농축하여 얻어진 잔사를 컬럼크로마토그래피로 분리 및 정제하여 목적 화합물 0.7g을 제조하였다.

¹H-NMR(DMSO-d6, 500MHz) 5.76~5.87(1H, dd) 5.16(1H, t), 2.11~2.13(1H, d, J=11.0Hz), 2.03(3H, s), 2.0(3H,s), 1.48(3H, d), 1.13(9H,m), 1.06(3H, s), 0.90~0.92(6H, d), 0.82(9H, m), 0.71(3H, s);

IR(cm^-1) 2920, 1750, 1728, 1690, 1465, 1370, 1245, 1152.

실시예 8: 1-(아세톡시) 에틸 3β-히드록시-우르스-12-엔-28-오에이트

실시예 7에서 얻어진 화합물 0.5g을 디클로로메탄 4ml와 메탄올 0.7ml에 용해시키고, 4-톨루엔술폰산 0.68.g을 가하여 10일 동안 실온에서 반응시켰다. 이후, 디클로로메탄 10ml와 물 10ml를 가하고 추출한 다음, 무수황산나트륨으로 건조하고 여과하였다. 얻어진 잔사를 전개 용매 (에틸아세테이트: n-헥산= 1: 2 에서 2:1)를 사용하여 컬럼크로마토그래피를 통하여 분리 정제하여 목적 화합물 0.3g을 제조하였다.

¹H-NMR(DMSO-d6, 500MHz) 5.75~5.85(1H, dd) 5.16(1H, t), 3.0(1H, m) ,2.11~2.13(1H, d, J=11.0Hz), 2.02(3H,s), 1.45(3H,d), 1.06(3H,s), 0.90~0.92(3H,d), 0.88(3H,s), 0.86(3H,s), 0.81~0.86(3H, d,), 0.75(3H, s), 0.56(3H,s);

IR(cm^-1) 2925, 1752, 1730, 1695, 1464, 1370, 1220

시험예: 우르솔릭산과, 실시예의 우르솔릭산 유도체를 사용한 SD(Sprague Dawley) 랫트(rat)에 대한 약동력학 동물시험

- 실시예의 우르솔릭산 유도체: (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔-4-일)메틸 3β-히드록시-우르스-12-엔-28-오에이트 사용

가. 시험목적

SD 랫트에 대하여 우르솔릭산을 단회 정맥 투여하였고, 실시예 2의 우르솔릭산 유도체는 경구 투여 후 시간 별로 채혈하여 혈중 시험물질의 농도를 분석하였다. 이를 통해, 우르솔릭산 및 실시예의 우르솔릭산 유도체의 Bioavailability (생체이용률)를 측정 및 비교하였다.

나. 대조물질 및 시험물질

i) 대조물질(정맥 투여): 우르솔릭산(UA) (HPLC 순도 99.0% 이상 / area percentage)

ii) 시험물질(경구투여): 실시예 2의 우르솔릭산 유도체 (HPLC 순도 99.4% 이상 / area percentage)

다. 시험물질의 조제

정맥투여용 대조물질은 멸균 밀봉된 0.9% Saline으로 희석하여 0.5 mg/mL로 조제하였으며,

경구투여용 시험물질은 동일한 0.9% Saline에 희석하여 25 mg/mL로 조제하고, 이를 2배 희석하여 12.5 mg/mL로 조제하였다.

라. 시험재료 및 방법

[시험계 ]

(1) 종 및 계통: 특정병원체 부재(SPF) SD 랫트

(2) 사용 동물수 및 성별 : 수컷 18 마리

(3) 체중범위: 약 180 g ± 20% 이내

(4) 투여개시시 체중범위: 평균체중(g) ± 20% 이내

(5) 기타 동물시험 사항은 식품의약품안전청 고시 제 2009-183호 (2009년12월 22일) '비임상시험관리기준' 및 OECD Principles of Good Laboratory Practice (1997)를 참조하여 수행하였다.

[시험군 구성 및 투여량 설정]

(1) 시험군 구성: 하기 표 1

군	투여경로	동물수	성별	번호	투여량(mg/kg)	투여액량(mL/kg)
G1	정맥	6	M	1 - 6	UA :0.5	1
G2	경구	6	M	7 - 12	실시예2: 25	2
G3	경구	6	M	13 - 18	실시예2: 50	2

(2) 투여량의 설정

하기 논문 1을 참고함:

논문 1: Dong Won Jeong, Hye Suk Lee et al., Dose-linear pharmacokinetics of Oleanolic acid afterintravenous and oral administration in rats. Biopharm. Drug Dispos. (2007) 28:51-57.

[투여 및 채혈]

(1) 투여경로: 상기 논문 1 참고함

(2) 투여횟수 및 투여기간: 정맥 및 단회 투여

(3) 투여액량 산출: 투여 전 가장 최근에 측정한 체중을 근거로 1.0 또는 2.0 mL/kg로 산출하여 투여하였다.

(4) 투여방법: 정맥투여는 투여할 동물을 보정기에 넣은 후, 꼬리를 70% 알코올 솜으로 소독하고, 거즈를 이용하여 알코올 성분을 제거한 후, 26G 주사침을 이용하여 bolus로 투여하였다. 경구투여는 동물을 경배부 피부 고정법으로 고정하고 경구투여용 존데를 이용하여 위 내에 직접 주입하였다.

(5) 채혈

정맥투여: 시험물질 투여 후 0, 5, 15, 30, 45분, 1, 2, 4, 8 시간 (10 회)에 전혈 0.6 mL을 채혈하여 헤파린 (5 IU/mL) 처리된 tube에 담아 혈장을 분리하여 1개의 튜브에 전량 보관하였다.

경구투여: 시험물질 투여 후 0, 15, 30, 45분, 1, 2, 4, 8, 12 시간 (9회)에 전혈 0.6 mL을 채혈하여 헤파린 (5 IU) 처리된 tube에 담아 혈장을 분리하여 1개의 튜브에 전량 보관하였다.

(6) 혈장부리 및 보관

채혈 후 혈액은 10,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 분리한 혈장은 분석기관에 송부할 때까지 -75±5℃ Deep freezer에 보관하였다.

마. 분석방법

1.분석대상

랫트 혈장 중 우르솔릭산의 농도를 측정하였다.

2.분석조건

전처리 된 혈장시료는 하기 표 2의 HPLC/MS/MS 조건에서 수행하였다.

HPLC	Agilent 1200 series LC system
검출기	AB API4000 LC/MS
컬럼	Phenomenex Luna C18 column (50 mm x 2.0 mm, 3 ?)
이동상	10 mM Ammonium acetate : methanol = 10 : 90, v/v
유속	0.3 mL/min
주입량	5 ?
MRM	우르솔릭산 (m/z 455.4>455.2) 히드로클로로티아지드 (m/z 296.0.269.0)

3.검량선의 작성

우르솔릭산 표준품을 methanol에 녹여 1 mg/mL의 농도로 만든 후 냉동 보관시키고, 이 용액을 냉동 보관 하였던 공혈장으로 희석하여 우르솔릭산의 혈장 중 농도가 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000 ng/mL 가 되도록 혈장시료를 만들었다. 각각의 표준혈장 50 ?에 내부표준물질 100 ng/mL 히드로클로로티아지드 50 ?를 가한 후 섞는다. 여기에 메틸-l-tert-부틸 에테르 500? 를 가하여 10분간 vortexing 한 후 13000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 유기층 450 ? 을 깨끗한 폴리프로필렌 튜브에 옮기고 질소 하에서 완전히 건조시켰다. 잔사에 이동상 120 ?를 가하여 녹인 후 이 중 5?를 취하여 LC-MS/MS에 주입하였다. 여기에서 얻은 내부표준물질의 피크 면적에 대한 우르솔릭산 의 피크 면적비를 구하여 검량선을 작성하였다.

4. 혈장시료의 처리

동물개체로부터 각 시간별로 채혈하여 -70 ℃ 이하에 보관하였던 혈장시료를 실온에 방치하여 녹인 후 진탕한 다음 이 혈장 50 ?를 취하여 검량선 작성방법과 동일한 방법으로 전처리한 후 LC/MS/MS에 주입하였다.

5. 혈중농도 계산

얻어진 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 피크 면적에 대한 우르솔릭산의 피크 면적비를 구하여 미리 작성한 검량선으로부터 혈장 중 우르솔릭산 의 농도를 구하였다.

바. 약물동태 분석 프로그램

약물동태 분석은 BA Calc. 2007 (KFDA)을 사용하여, Non-compartment analysis (best fit)에 의해 수행하였고, AUC_last, C_max, T_max 및 t_1/2를 산출하였다. AUC_last및 C_max 결과는 Bioequivalence analysis를 수행하였다.

사. 시험결과: 생체 이용률 (Bioavailability)

상술한 바와 같은 방법으로 측정한 결과 얻은 생체 이용률 데이터를 하기 표 3에 정리하여 나타내었다.

투여경로	투여용량	AUC_last	C_max	Bioavailablity (%)
투여경로	투여용량	AUC_last	C_max	AUC_last	C_max
우르솔릭산의 정맥 투여	0.5	114.33	378.50	-	-
실시예 2의 경구 투여	25	132.22	30.26	2.3	0.2
실시예 2의 경구 투여	50	127.05	29.20	1.1	0.1

상기 표 3을 참고하면, 실시예 2의 우르솔릭산 유도체를 사용해 랫트를 대상으로 약동력학 시험을 수행한 결과, 상기 우르솔릭산 유도체는 25mg/kg에서 경구흡수도 및 생체이용률이 약 2.3%로서 기존의 우르솔릭산 대비 약 3~4배가 향상됨이 확인되었다. 따라서, 상기 우르솔릭산 유도체는 낮은 경구흡수도로 인해 경구용 약물로 사용될 수 없었던 우르솔릭산과는 달리, 우르솔릭산의 우수한 효능을 발현하는 경구용 약물로서 바람직하게 적용될 수 있을 것으로 보인다.

참고로, 상기 논문 1에서, 우르솔릭산과 유사한 물리화학적 성질을 가지는 이성질체인 Oleanolic acid에 대한 약동력학 실험 결과는 경구흡수도가 약 0.7%임을 보여주고 있는 바, 이를 통해서도 실시예 2의 우르솔릭산 유도체의 우수한 경구흡수도 및 생체이용률이 입증될 수 있다.

Claims

하기 화학식 2의 우르솔릭산 유도체:
[화학식 2]

상기 화학식 2에서, R₁은 수소 또는 아세틸기이고, R₂는
,
,
또는
이다.
제 1 항에 있어서, 생체 내에서 우르솔릭산으로 전환되는 우르솔릭산 전구 약물(prodrug)인 우르솔릭산 유도체.
제 1 항에 있어서, 항암제 또는 항암제의 효능 증강제에 사용되는 우르솔릭산 유도체.
제 1 항에 있어서, 근위축증의 치료에 사용되는 우르솔릭산 유도체.
제 1 항에 있어서, 간섬유화 치료에 사용되는 우르솔릭산 유도체.
제 1 항에 있어서, 고지혈증 치료에 사용되는 우르솔릭산 유도체.
화학식 1의 우르솔릭산을 아세틸화하여 화학식 3의 화합물을 형성하는 단계; 및
화학식 3의 화합물을 화학식 4의 R₂-X와 에스테르화 반응시키는 단계를 포함하는 제 1 항의 우르솔릭산 유도체의 제조 방법:
[화학식 1]

[화학식 3]

[화학식 4]
R₂-X
상기 식에서, R₂는
,
,
또는
이고, X는 클로로(Cl), 브로모(Br) 또는 요오드(I)의 할로겐 라디칼이다.
제 7 항에 있어서, 상기 에스테르화 반응 단계 후에, 그 반응 결과물을 탈아세틸화하는 단계를 더 포함하는 우르솔릭산 유도체의 제조 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 화학식 4의 R₂-X는
,
,
또는
인 우르솔릭산 유도체의 제조 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 아세틸화 단계에서는, 아민 염기의 존재 하에, 화학식 1의 우르솔릭산을 무수 초산 또는 아세틸클로라이드와 반응시키는 우르솔릭산 유도체의 제조 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 에스테르화 반응 단계에서는, 알칼리 금속 염기 또는 알칼리 토금속 염기의 존재 하에, 화학식 3의 화합물을 화학식 4의 R₂-X와 반응시키는 우르솔릭산 유도체의 제조 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 탈아세틸화 단계에서는, 알코올 용매 내에서, 상기 에스테르화 반응 결과물을 산 또는 염기로 처리하는 우르솔릭산 유도체의 제조 방법.