CN104684883A - 新型乌索酸衍生物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及作为乌索酸前药形式的新型乌索酸衍生物及其制备方法，其中，新型乌索酸衍生物作为乌索酸前药可具有卓越的药物代谢动力学特征，比如稳定性和口服吸收性，并且通过体内转化成乌索酸显示卓越的药学活性。乌索酸衍生物可以是酯形式，其中，乌索酸中的C28羧酸结合某些药学化合物的前药。

Description

新型乌索酸衍生物及其制备方法
技术领域
本发明涉及新型乌索酸衍生物及其制备方法。更具体而言，本发明涉及如下新型乌索酸衍生物及其制备方法，所述新型乌索酸衍生物作为乌索酸前药形式可具有卓越的药物代谢动力学特征，比如稳定性和口服吸收性，并且通过体内转化成乌索酸显示卓越的药学活性。
背景技术
乌索酸是五环三萜酸化合物，其可提取自天然产物，比如迷迭香叶等等。乌索酸被称为源自天然产物的化合物，其被包含于各种植物，比如苹果、尤其是苹果皮、薰衣草、罗勒(basil)、迷迭香、牛至、百里香等。
乌索酸可由下述化学式1表示，并且可由如下化学名表示：3β-羟基-乌索-12-烯-28-酸。乌索酸的分子量为约456.68并且通式为C30H48O3。
化学式1
如上述化学式1所显示，乌索酸的基本结构为五环三萜，并且在C-3位具有羟基基团，在C-12位具有双键，和在C-28位具有羧酸。已知具有上述结构的乌索酸具有非常差的水溶性，并且是光学活性材料，其具有包含10个手性碳的非常复杂的结构。
由于这些特征，乌索酸不可能被化学合成，并且已知这些材料只有通过从包含大量乌索酸的天然产物比如植物等中提取和纯化才能获得。但是，因为天然产物比如植物等中包含的乌索酸的含量不大，通过提取和纯化而获得具有高纯度和高浓度的乌索酸需要非常高的成本。
另一方面，上述乌索酸以功能性化妆品材料而著称。尤其，已经报道了乌索酸能够用于与光老化相关的皮肤改善和炎症治疗。同时，用作功能性化妆品材料的乌索酸一般具有低的纯度并且包含齐墩果酸，其是在C-29位具有氢和在C-30位具有二甲基等的结构异构体。所以，难以将用作化妆品材料的低纯度的乌索酸直接用于药学用途。
然而，已大量报道乌索酸能够应用至各种药学产品。例如，已经报道了乌索酸抑制活细胞中的NF-ΚB激活，以增强抗癌症治疗-化疗的效力(见Int.J.Cancer(2010),127,462～473)。
另外，已经报道了乌索酸显示卓越的治疗和预防肌肉萎缩的效力(见CellMetabolism(2011)13,627～638)。此外，已经报道了乌索酸用于治疗肝纤维化(见J of Hepatology(2011)55,379～387)，并且已知乌索酸具有通过激活PPAR-α而用于治疗高脂血的可能性(见Bioorg Med Chem Lett(2011)21,5876～5880)。
另外，已经进行了对能够更加增强乌索酸的效力或具有新效力的乌索酸衍生物的研究。
例如，EP1889850A1公开了在C-3位具有磷酸酯的乌索酸衍生物，并且US3909089公开了通过将乌索酸C-28位的羧酸与哌嗪结合获得的胺盐形式的衍生物等。另外，US4530934公开了在乌索酸的C-3位具有羧基丙酰氧基基团并且显示作为抗溃疡剂活性的衍生物。此外，US2011/0190388A1公开了在C-3位具有酰氧基基团和在C-28位的羧基基团取代有C5至C8烷基基团的乌索酸衍生物，其中所述乌索酸衍生物用作抗炎剂和抗癌剂。
虽然乌索酸或其衍生物具有如上述的各种药物代谢动力学可用性和效力，但关于包含乌索酸的制剂的研究具有局限性，因为乌索酸具有差的水溶性和非常低的口服吸收性，例如，小于1％并且难以制备高纯度乌索酸。
发明内容
技术问题
本发明致力于提供一种新型乌索酸衍生物及其制备方法，所述新型乌索酸衍生物作为乌索酸前药形式可具有卓越的药物代谢动力学特征，比如稳定性和口服吸收性，并且通过体内转化成乌索酸显示卓越的药学活性。
技术方案
本发明的示例性实施方式提供由下述化学式2表示的乌索酸衍生物：
化学式2
在化学式2中，
R1是氢或乙酰基基团，和
R2是
本发明的另一示例性实施方式提供制备如上述乌索酸衍生物的方法，包括：
通过乙酰化下述化学式1表示的乌索酸，形成下述化学式3表示的化合物；和
用化学式4表示的R2-X酯化下述化学式3表示的化合物：
化学式1
化学式3
化学式4
R2-X
在上述化学式中，
R2是和
X是氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)的卤素自由基。
下文，将对根据本发明具体的示例性实施方式的乌索酸衍生物及其制备方法进行描述。
根据本发明的示例性实施方式，提供化学式2表示的乌索酸衍生物。乌索酸衍生物具有酯结构，其中，在乌索酸的C-28位的羧酸引入预定的官能团R2。这里，R2是源自奥美沙坦前药(奥美沙坦酯(olmesartan medoxomil))的(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧杂戊烯-4-基)甲基；源自头孢替安前药(头孢替安酯(cefotiamhexetil))的1-[[(环己氧基)羰基]氧基]乙基；源自丙戊酸前药(丙戊匹酯(valproatepivoxil))的[(2,2-二甲基丙酰基)氧基]甲基；或源自头孢呋辛前药(头孢呋辛酯(cefuroxime axetil))的1-[(4-甲氧基-丁酰基)氧基]乙基。
已知当将具体的官能团R2引入不溶于水的药物，比如奥美沙坦、头孢替安、丙戊酸、头孢呋辛等时，可增加不溶于水的药物的口服吸收性并且可改善储存的稳定性。但是，迄今为止还不知道将官能团R2引入乌索酸的例子。
作为实验结果，本发明人吃惊地发现上述化学式2表示的乌索酸衍生物可显著改善乌索酸的低口服吸收性(例如，小于1％)和制剂稳定性，所述乌索酸衍生物是酯形式的前药，其是通过将预定的官能团R2引入特定位置、即乌索酸的C-28位的羧酸而获得的。另外，官能团R2可在体内通过特异性酶，例如，脱酯化酶等快速代谢和分解。结果，化学式2表示的乌索酸在体内转化成乌索酸形式，从而可显示乌索酸卓越的独特的药学活性。
所以，通过将已知且市售的前药形式的酯、即从奥美沙坦、头孢替安、丙戊酸或头孢呋辛获得的前药形式的酯应用和引入至乌索酸，化学式2表示的乌索酸衍生物可解决比如乌索酸的低口服吸收性、生物利用率等问题，并且可在体内显示卓越的独特的药学活性，这可大大有助于将乌索酸或其衍生物应用于药物制剂。
另外，可通过下述化学合成从乌索酸获得乌索酸衍生物。所以，更容易纯化乌索酸以便具有高纯度，这可大大有助于乌索酸或其衍生物的药学和工业利用。
另一方面，如上所述，化学式2表示的乌索酸衍生物可具有预定的官能团R2被引入至C-28位的羧酸的结构，和任选地，可具有乙酰基基团被引入至C-3位的羟基基团的结构。在乌索酸衍生物的结构中，官能团R2可通过酶在体内快速分解，并且可转化成乌索酸，从而显示乌索酸卓越的独特的药学活性。
例如，乌索酸衍生物如乌索酸一样可用作抗癌剂和抗癌剂的增强剂(尤其是用于抗癌症治疗的化疗中的增强剂)，或用于治疗或预防肌肉萎缩，或用于治疗肝纤维化或高脂血。
可通过如下方法制备化学式2表示的上述乌索酸衍生物：通过乙酰化上述化学式1表示的乌索酸形成上述化学式3表示的化合物；和用R2-X酯化上述化学式3表示的化合物。另外，制备方法可进一步包括：酯化之后，使酯化的产物脱乙酰化。可通过下述反应方案1显示制备乌索酸衍生物的方法：
反应方案1
参考上述反应方案1，当在制备方法中进行第一乙酰化步骤，乙酰基基团可被引入至化学式1表示的乌索酸的C-3位的羟基基团，以形成化学式3表示的化合物，并且当用R2-X的亲电体化合物酯化化学式3表示的化合物时，R2可被引入至C-28位的羧酸，从而形成酯形式的乌索酸前药，即，化学式2表示的乌索酸衍生物。另一方面，如此形成的乌索酸衍生物具有乙酰基基团被引入至C-3位的羟基基团结构(即，化学式2中的R1是乙酰基基团)，当需要化学式2表示的乌索酸衍生物的R1是氢时，可进一步进行脱乙酰化步骤。
上述制备乌索酸衍生物的方法的各步骤如下。
首先，在第一步骤中，将化学式1表示的乌索酸乙酰化，以将乙酰基基团引入至C-3位的羟基基团，从而形成化学式3表示的化合物。这里，乙酰化反应可在碱，例如，胺碱比如三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶等的存在下进行，并且可将乙酸酐，乙酰氯等用作用于乙酰化的反应材料。在一些情况下，乙酰化反应可在催化剂比如N,N-二甲基氨基吡啶的存在下进行。
另外，在乙酰化反应中，可将基于卤代烷的溶剂比如二氯甲烷、基于环醚的溶剂比如四氢呋喃或二烷、基于酯的溶剂比如乙酸乙酯、基于酰胺的溶剂比如N,N-二甲基甲酰胺、基于酮的溶剂比如丙酮等用作反应溶剂，或可将包含选自所述溶剂中的两种或多种溶剂的混合溶剂用作反应溶剂。其中，可适当使用基于卤代烷的溶剂或基于环醚的溶剂。
另外，乙酰化反应步骤可在约0℃至100℃，或约10℃至30℃的反应温度下进行。
接着，在第二步骤中，用R2-X的亲电体化合物酯化化学式3表示的化合物，以将R2引入至C-28位的羧酸，从而形成化学式2表示的乌索酸衍生物，其中R1是乙酰基基团。在酯化反应步骤中，在将C-28位的羧酸离子化之后，可通过使用亲电体化合物进行亲核取代反应，从而形成化学式2表示的乌索酸衍生物。
所以，酯化反应步骤可在用于离子化C-28位的羧酸的碱的存在下进行，例如，所述碱为碱金属碱比如氢氧化钠或碳酸钠，或碱土金属碱比如氢氧化钾或碳酸钾。可优选地使用碳酸钾。
另外，R2-X的亲电体化合物的具体例子可包括
等，并且通过使用亲电体化合物进行酯化反应，可适当制备化学式2表示的乌索酸衍生物。亲电体化合物的具体例子可由如下化学名表示：4-氯甲基-5-甲基-2-氧代-1,3-二氧杂戊烯、1-氯乙基环己基碳酸酯、1-氯甲基特戊酸酯或1-(乙酰氧基乙基)溴化物。
在亲电体化合物中，4-氯甲基-5-甲基-2-氧代-1,3-二氧杂戊烯或1-氯乙基环己基碳酸酯是具有10个手性碳的光学活性材料，并且可使用其光学异构体，并且优选地，可使用其外消旋体。
另外，基于化学式3表示的化合物，可以约1.0至3.0当量，优选地，约1.2至2.0当量，和更优选地，约1.4至1.6当量使用亲电体化合物。
进一步，在酯化反应步骤中，可将基于腈的溶剂比如乙腈、基于酮的溶剂比如丙酮或甲乙酮、基于酰胺的溶剂比如N,N-二甲基甲酰胺用作反应溶剂，或可将包含选所述溶剂中的两种或多种溶剂的混合溶剂用作反应溶剂。其中，可适当使用基于酮的溶剂或基于酰胺的溶剂。
另外，酯化反应步骤可在约0至100℃，或约10至50℃的反应温度下进行。
在上述制备方法中，可任选地进行脱乙酰化作为第三步骤，因此，可由R1是乙酰基基团的化学式2表示的乌索酸衍生物制备R1是氢的乌索酸衍生物。
在脱乙酰化中，可在醇溶剂比如甲醇等中用酸或碱处理酯化后的产物。更具体而言，可在醇溶剂比如甲醇等中，在使用碱性水溶液比如氢氧化钠水溶液、碳酸钾水溶液或铵水的碱性条件下，脱乙酰化乌索酸衍生物。作为其他可选的方法，可在醇溶剂中，在使用酸比如4-甲苯磺酸等或路易斯酸比如三氟化硼二***等的酸性条件下，脱乙酰化乌索酸衍生物。
另一方面，可在上述酸性条件下，在基于卤代烷的溶剂比如二氯甲烷和基于醇的溶剂比如甲醇的混合溶剂中进行脱乙酰化步骤。
另外，脱乙酰化反应步骤可在约0至100℃，或约10至40℃的反应温度下进行。
发明的有利效果
根据本发明，提供了一种新型乌索酸衍生物，其能够显著增加乌索酸的低口服吸收性和制剂稳定性，并且在体内转化成乌索酸形式，从而显示卓越的独特的药学活性。
所以，乌索酸衍生物可解决比如乌索酸的低口服吸收性、生物利用率等问题，并且在体内显示卓越的独特的药学活性，这可大大有助于乌索酸或其衍生物应用于药物制剂。
具体实施方式
下文，将描述本发明的示例性实施方式以帮助理解本发明。但是，所提供下述示例性实施方式仅仅为了更容易理解本发明。本发明不限于此。
参考例1：制备3β-乙酰氧基-乌索-12-烯-28-酸(化学式3)
在室温下，将7.5g的乌索酸(纯度：98％)添加至50ml的四氢呋喃进行溶解。然后，向其添加6.45g的吡啶和0.2g的N,N-二甲基氨基吡啶，随后冷却至10℃或更低，并且缓慢逐滴向其添加5.9g的乙酸酐。在室温下搅拌混合物12小时并且确认反应结束之后，浓缩反应液体。这里，通过薄膜色谱(乙酸乙酯:正己烷＝1:4rf＝0.4)确认反应结束。通过使用展开溶剂(乙酸乙酯：正己烷＝1:2至2:1)的柱色谱分离和纯化反应浓缩物，制备5.5g的目标化合物。
1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)11.92(1H.s),5.12～5.14(1H,t),2.10～2.12(1H,d,J＝11.0Hz),2.00(3H,s),1.06(3H,s),0.91～0.92(6H,d),0.81～0.86(9H,m),0.76(3H,s)；
IR(cm-1)2924，1734，1686，1459，1367，1245，1027；
HPLC纯度：99.0％或更高(面积比)。
实施例1：制备(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧杂戊烯-4-基)甲基3β-乙酰氧基-乌索-12-烯-28-酸酯
将1.0g的获得自参考例1的化合物溶解在20ml的丙酮中。向其添加0.9g的碳酸钾和0.4g的碘化钾(KI)，并且向其添加0.6g的4-氯甲基-5-甲基-2-氧代-1,3-二氧杂戊烯。将混合物在室温下反应24小时并且浓缩。将10ml的乙酸乙酯添加至浓缩物，分别用10ml的水和盐水冲洗浓缩物，并且用无水硫酸钠干燥。减压过滤之后浓缩以获得残渣，通过柱色谱分离和纯化残渣，从而获得0.7g的目标化合物。
1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)4.76～4.99(2H,dd)5.17(1H,t),2.15～2.17(1H,d,J＝11.0Hz),2.11(3H,s),2.00(3H,s),1.06(3H,s),0.90～0.92(6H,d),0.81～0.86(9H,m),0.76(3H,s)；
IR(cm-1)2924，1819，1732，1447，1371，1244，1129，1010。
实施例2：制备(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧杂戊烯-4-基)甲基3β-羟基-乌索-12-烯-28-酸酯
将0.5g获得自实施例1的化合物溶解在4ml的二氯甲烷和0.7ml的甲醇中，并且向其添加0.68g的4-甲苯磺酸，并且将混合物在室温下反应10天。然后，向其添加10ml的二氯甲烷和10ml的水，萃取，并且用无水硫酸钠干燥，然后过滤。通过使用展开溶剂(乙酸乙酯:正己烷＝1:2至2:1)的柱色谱分离和纯化获得的残渣，制备0.3g的目标化合物。
1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)4.76～4.99(2H,dd)5.16(1H,t),2.96～3.01(1H,m),2.14～2.16(1H,d,J＝11.5Hz),2.11(3H,s),1.04(3H,s),0.90～0.92(3H,d),0.88(3H,s),0.86(3H,s),0.81～0.86(3H,d,J＝11.5Hz),0.75(3H,s),0.56(3H,s)；
IR(cm-1)2918，1822，1686，1720，1455，1383，1219，1186，1044，1029。
实施例3：1-[[(环己氧基)羰基]氧基]乙基3β-乙酰氧基-乌索-12-烯-28-酸酯
将1.0g获得自参考例1的化合物溶解在20ml的丙酮中。向其添加0.9g的碳酸钾和0.4g的碘化钾(KI)，并且向其添加0.65g的1-氯乙基环己基碳酸酯。将混合物在室温下反应24小时并且浓缩。将10ml的乙酸乙酯添加至浓缩物，分别用10ml的水和盐水冲洗浓缩物，并且用无水硫酸钠干燥。减压过滤之后浓缩以获得残渣，通过柱色谱分离和纯化残渣，从而获得0.8g的目标化合物。
1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)5.74～5.87(1H,dd)5.17(1H,t),3.0(1H,m)2.11～2.13(1H,d,J＝11.0Hz),2.00(3H,s),1.45(3H,d),1.06(3H,s),0.90～0.92(6H,d),0.81～0.86(9H,m),0.76(3H,s),1.00～2.20(10H,m)；
IR(cm-1)292517561732，1697，1466，1373，1245，983。
实施例4：1-[[(环己氧基)羰基]氧基]乙基3β-羟基-乌索-12-烯-28-酸酯
将0.7g获得自实施例3的化合物溶解在4ml的二氯甲烷和0.7ml的甲醇中，并且向其添加0.68g的4-甲苯磺酸，并且将混合物在室温下反应10天。然后，向其添加10ml的二氯甲烷和10ml的水，萃取，并且用无水硫酸钠干燥，然后过滤。通过使用展开溶剂(乙酸乙酯:正己烷＝1:2至2:1)的柱色谱分离和纯化获得的残渣，制备0.4g的目标化合物。
1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)5.70～5.85(1H,dd)5.17(1H,t),3.0(1H,m)2.11～2.13(1H,d,J＝11.0Hz),1.45(3H,d),1.06(3H,s),0.90～0.92(3H,d),0.88(3H,s),0.86(3H,s),0.81～0.86(3H,d,),0.75(3H,s),0.56(3H,s),1.00～2.20(10H,m)；
IR(cm-1)2920，1754，1732，1697，1466，1373，1220。
实施例5：[(2,2-二甲基-丙酰基)氧基]甲基3β-乙酰氧基-乌索-12-烯-28-酸酯
将1.0g获得自参考例1的化合物溶解在20ml的丙酮中。向其添加0.9g的碳酸钾和0.4g的碘化钾(KI)，并且向其添加0.55g的1-氯甲基特戊酸酯。将混合物在室温下反应24小时并且浓缩。将10ml的乙酸乙酯添加至浓缩物，分别用10ml的水和盐水冲洗浓缩物，并且用无水硫酸钠干燥。减压过滤之后浓缩以获得残渣，通过柱色谱分离和纯化残渣，从而获得0.7g的目标化合物。
1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)5.63～5.68(2H,dd)5.16(1H,t),2.11～2.13(1H,d,J＝11.0Hz),2.02(3H,s),2.0(3H,s),1.13(9H,m),1.06(3H,s),0.90～0.92(6H,d),0.82(9H,m),0.71(3H,s)；
IR(cm-1)2920，1749，1726，1686，1466，1372，1245，1152。
实施例6：[(2,2-二甲基-丙酰基)氧基]甲基3β-羟基-乌索-12-烯-28-酸酯
将0.5g获得自实施例5的化合物溶解在4ml的二氯甲烷和0.7ml的甲醇中，并且向其添加0.68g的4-甲苯磺酸，并且将混合物在室温下反应10天。然后，向其添加10ml的二氯甲烷和10ml的水，萃取，并且用无水硫酸钠干燥，然后过滤。通过使用展开溶剂(乙酸乙酯:正己烷＝1:2至2:1)的柱色谱分离和纯化获得的残渣，制备0.3g的目标化合物。
1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)5.63～5.68(2H,dd)5.17(1H,t),2.11～2.13(1H,d,J＝11.0Hz),3.0(1H,m)1.13(9H,m),1.04(3H,s),0.90～0.92(3H,d),0.88(3H,s),0.86(3H,s),0.81～0.86(3H,d,),0.75(3H,s),0.56(3H,s)；
IR(cm-1)2920，1749，1726，1686，1466，1372，1219，1180。
实施例7：1-(乙酰氧基)乙基3β-乙酰氧基-乌索-12-烯-28-酸酯
将1.0g获得自参考例1的化合物溶解在20ml的丙酮中。向其添加0.9g的碳酸钾，并且向其添加0.6g的1-(乙酰氧基乙基)溴化物。将混合物在室温下反应24小时并且浓缩。将10ml的乙酸乙酯添加至浓缩物，分别用10ml的水和盐水冲洗浓缩物，并且用无水硫酸钠干燥。减压过滤之后浓缩以获得残渣，通过柱色谱分离和纯化残渣，从而获得0.7g的目标化合物。
1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)5.76～5.87(1H,dd)5.16(1H,t),2.11～2.13(1H,d,J＝11.0Hz),2.03(3H,s),2.0(3H,s),1.48(3H,d),1.13(9H,m),1.06(3H,s),0.90～0.92(6H,d),0.82(9H,m),0.71(3H,s)；
IR(cm-1)2920，1750，1728，1690，1465，1370，1245，1152。
实施例8：1-(乙酰氧基)乙基3β-羟基-乌索-12-烯-28-酸酯
将0.5g获得自实施例7的化合物溶解在4ml的二氯甲烷和0.7ml的甲醇中，并且向其添加0.68g的4-甲苯磺酸，并且将混合物在室温下反应10天。然后，向其添加10ml的二氯甲烷和10ml的水，萃取，并且用无水硫酸钠干燥，然后过滤。通过使用展开溶剂(乙酸乙酯:正己烷＝1:2至2:1)的柱色谱分离和纯化获得的残渣，制备0.3g的目标化合物。
1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)5.75～5.85(1H,dd)5.16(1H,t),3.0(1H,m),2.11～2.13(1H,d,J＝11.0Hz),2.02(3H,s),1.45(3H,d),1.06(3H,s),0.90～0.92(3H,d),0.88(3H,s),0.86(3H,s),0.81～0.86(3H,d,),0.75(3H,s),0.56(3H,s)；
IR(cm-1)2925，1752，1730，1695，1464，1370，1220
实验例：使用实施例的乌索酸和乌索酸衍生物对Sprague Dawley(SD)大鼠进行药物代谢动力学动物试验
-使用实施例的乌索酸衍生物(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧杂戊烯-4-基)甲基3β-羟基-乌索-12-烯-28-酸酯。
A.试验目的
向SD大鼠单次静脉给药乌索酸，并且口服给药实施例2的乌索酸衍生物，然后分时段进行血液采集，分析血液中的试验物质的浓度。因此，测量和比较乌索酸和实施例的乌索酸衍生物的生物利用率。
B.对照物质和试验物质
i)对照物质(静脉给药)：乌索酸(UA)(HPLC纯度为99.0％或更高/面积百分数)
ii)试验物质(口服给药)：实施例2的乌索酸衍生物(HPLC纯度为99.4％或更高/面积百分数)
C.制备试验物质
用0.9％灭菌且密封的生理盐水稀释用于静脉给药的对照物质，以制备为0.5mg/mL。
用0.9％的与对照物质所用的生理盐水相同的生理盐水稀释用于口服给药的试验物质，以制备为25mg/mL，然后稀释以制备为12.5mg/mL。
D.测试材料和方法
[测试***]
(1)物种和品系：无特定病原体(SPF)的SD大鼠
(2)使用的动物的数量和性别：雄性18只
(3)体重范围：约180g±20％之内
(4)开始给药时的体重范围：平均体重(g)±20％之内
(5)动物试验的其他细节参考：食品和药物管理局公告(Food and DrugAdministration Notice)2009-183号(2009年12月22日)优良实验室条例(GoodLaboratory Practice)(GLP)，和优良实验室条例的OECD原则(1997)。
[试验组结构和剂量设置]
(1)试验组结构：
试验组结构显示在下面表1中。
[表1]
组 给药途径 动物数量 性别 数量 剂量(mg/kg) 注射量(mL/kg)
组1 静脉给药 6 雄性 1-6 UA:0.5 1
组2 口服 6 雄性 7-12 实施例2:25 2
组3 口服 6 雄性 13-18 实施例2:50 2
(2)剂量设置
参考下面文献1确定剂量设置。
文献1：Dong Won Jeong，Hye Suk Lee等人，大鼠静脉和口服给药后齐墩果酸的剂量-线性药物代谢动力学(Dose-linear pharmacokinetics ofOleanolic acid after intravenous and oral administration in rats.)Biopharm.DrugDispos.(2007)28:51-57。
[给药和血液采集]
(1)给药途径：参考文献1确定给药途径。
(2)给药次数和给药的持续时间：静脉和单次给药。
(3)注射量计算：基于给药之前最新测量的体重，计算注射量为1.0或2.0mL/kg。
(4)施用方法：对于静脉给药，将待给药的动物放入操作箱，并且用70％酒精棉对尾消毒，然后使用纱布去除酒精成分，使用26G注射针单次快注(bolus)给药物质。对于口服给药，通过颈背皮肤固定法固定动物，使用口服给药的探针(sonde)将物质直接注入胃内。
(5)血液采集
静脉给药：在给药试验物质0、5、15、30、45分钟、以及1、2、4和8小时之后(10次)，采集0.6ml的全血并且储存在用肝素(5IU/mL)处理后的管中，分离血浆并将总量储存在一个管中。
口服给药：在给药试验物质0、5、15、30、45分钟、以及1、2、4、8和12小时之后(9次)，采集0.6ml的全血并且储存在用肝素(5IU/mL)处理后的管中，分离血浆并将总量储存在一个管中。
(6)血浆分离和储存
在血液采集之后，在10,000rpm下对血浆进行5分钟离心分离。将分离的血浆储存在-75±5℃下的深冻冰箱中，直到将其送至实验室。
E.分析方法
1.分析对象
测量大鼠的血浆中的乌索酸的浓度。
2.分析条件
在下面表2显示的下述HPLC/MS/MS条件下分析预处理的血浆样品。
[表2]
3.构建校准曲线
将乌索酸标准物溶解在甲醇中以具有1mg/mL的浓度，保存在冰箱中，然后，用冷冻的空白(blank)血浆稀释溶液，以乌索酸的血浆的浓度为2、5、10、50、100、500和1000ng/mL的方式制备血浆样品。将100ng/ml的内标物质氢***50μL添加至50μL的各标准血浆并且混合。向其添加500μL的甲基-l-叔丁基醚，随后涡流搅拌(vertexing)10mins，并且在13000rpm下离心分离5mins。将450μL的有机层移至干净的聚丙烯管，并且在氮气下完全干燥。将120μL的移动相添加至残渣以便溶解，并且取5μL注入LC-MS/MS。计算乌索酸的峰与内标物质的峰的面积比，以构建校准曲线。
4.处理血浆样品
将各时间从动物采集血液并在-70℃或更低下储存血液而获得的样品在室温下静置溶解，振动后取50μL并且与构建校准曲线相同的方法进行预处理，然后注入LC/MS/MS。
5.计算血液浓度
从获得的色谱图计算乌索酸的峰与内标物质的峰的面积比，并且从先前构建的校准曲线计算血浆中乌索酸的浓度。
F.药物代谢动力学分析程序
使用BA Calc.2007(KFDA)通过非隔室模型分析方法(最佳拟合)进行BACalc.药物代谢动力学分析，计算AUClast、Cmax、Tmax和t1/2。对AUClast和Cmax结果进行生物等效性分析。
G.试验结果：生物利用率
对获得自根据上述方法测量结果的生物利用率数据进行总结并显示在下面表3中。
[表3]
参考表3确认，对大鼠使用实施例2的乌索酸衍生物的药物代谢动力学试验的结果，在25mg/kg剂量下乌索酸衍生物显示卓越的口服吸收性和约2.3％的生物利用率，与现有的乌索酸相比，增加约3至4倍。所以，确定乌索酸衍生物可优选地用作显示卓越的乌索酸效力的口服药物，这与因低口服吸收性而不能用作口服药物的乌索酸不同。
作为参考，文献1公开了齐墩果酸的药物代谢动力学试验结果，所述齐墩果酸是一种异构体，具有与乌索酸类似理化性质，其口服吸收性是约0.7％，所以，通过文献1的结果也可证实实施例2的乌索酸衍生物的卓越的口服吸收性和生物利用率。

Claims (12)

1.一种乌索酸衍生物，其由下述化学式2表示：
在化学式2中，
R1是氢或乙酰基基团，和
R2是
2.根据权利要求1所述的乌索酸衍生物，其中，所述乌索酸衍生物是在体内转化成乌索酸的乌索酸前药。
3.根据权利要求1所述的乌索酸衍生物，其中，所述乌索酸衍生物用作抗癌剂或抗癌剂的增强剂。
4.根据权利要求1所述的乌索酸衍生物，其用于治疗肌肉萎缩。
5.根据权利要求1所述的乌索酸衍生物，其用于治疗肝纤维化。
6.根据权利要求1所述的乌索酸衍生物，其用于治疗高脂血。
7.一种制备权利要求1所述的乌索酸衍生物的方法，所述方法包括：
通过乙酰化下述化学式1表示的乌索酸形成下述化学式3表示的化合物；和
用化学式4表示的R2-X酯化下述化学式3表示的化合物，
R2-X
在上述化学式中，
R2是和
X是氯、溴或碘的卤素自由基。
8.根据权利要求7所述的方法，其进一步包括在所述酯化后脱乙酰化酯化产物的步骤。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，化学式4表示的R2-X是
10.根据权利要求7所述的方法，其中，在乙酰化步骤中，化学式1表示的乌索酸在胺碱的存在下与乙酸酐或乙酰氯反应。
11.根据权利要求7所述的方法，其中，在酯化步骤中，化学式3表示的化合物在碱金属碱或碱土金属碱的存在下与化学式4表示的R2-X反应。
12.根据权利要求8所述的方法，其中，在脱乙酰化步骤中，用酸或碱在醇溶剂中处理酯化产物。
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