KR20140019375A - 인간 조직 인자 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 조직 인자 (응고 인자 F3) 신호전달을 방지할 수 있지만 조직 인자에 대한 인자 VII의 결합 또는 FX의 결합을 간섭하지 않는 그리고 응고 시간을 연장시키지 않는 인간화 형태의 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 결부된 세포가 조직 인자를 발현하고 조직 인자 신호전달이 일어나는, 종양 진행과 같은 병태의 치료에서 유용하다.

Description

인간 조직 인자 항체 및 이의 용도{HUMAN TISSUE FACTOR ANTIBODY AND USES THEREOF}
선출원
본 출원은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된, 2011년 3월 15일자로 출원된 미국 특허 출원 제61/452,674호의 우선권을 주장한다.
본 발명은 종양 세포를 비롯한 가외 혈관 조직 상에 존재하는 항원인 인간 조직 인자(tissue factor; TF)에 결합하는 인간 적응형 항체(human adapted antibody)에 관한 것이며, 이 항체는 조직 인자 매개된 혈액 응고를 저해하지 않는다. 또한 본 발명은 인간 조직 인자의 존재 및 수용체 기능과 결부된 암과 같은 병태를 치료하기 위한 본 항체의 사용 방법에 관한 것이다.
응고 인자 III (F3), 조직 트롬보플라스틴, 또는 CD142로도 공지된 조직 인자(TF)는 하나의 세린 잔기가 포스포릴화될 수 있는, 짧은 세포내 도메인 및 2개의 피브로넥틴 타입 III 도메인을 포함하는 219개 아미노산의 세포외 도메인을 갖는 막관통 당단백질이다. TF는 FVII/FVIIa의 세포 수용체이다.
TF는 정상적인 뇌, 폐 및 태반에서 높은 수준으로, 그리고 비장, 흉선, 골격근 및 간에서 낮은 수준으로, 세포 수용체의 형태로 조직 특이적 분포를 나타낸다. 이것은 또한 세포 유래된 미세입자에서 그리고 대안적으로는 스플라이싱된(spliced) 용해성 형태로서 발견된다. 정상 조직에서의 발현에 더하여, TF는 대부분의 주요 종양 유형에서 그리고 종양 유래된 많은 세포주에서 과다발현되는 것으로 보고되었다 (문헌[Ruf W J Thromb Haemost. 5:1584 -1587, 2007]; 문헌[Milsom et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29: 2005-2014, 2009]).
상해에 응답하는 혈청 단백질의 응고는 상해에 대한 중요한 생리적 응답이다. 콜라겐 (내인성 경로) 및 조직 인자 (외인성 경로)를 비롯한 단백질에의 혈액의 노출은 응혈 인자인 혈장 단백질 피브리노겐 및 혈소판으로의 변화를 개시한다. 혈관에의 손상 후에, 인자 VII(FVII)은 순환계를 떠나서 조직 인자 보유 세포(간질 섬유아세포 및 백혈구) 상에서 발현되는 조직 인자(TF)와 접촉하여 활성화 TF-FVIIa 복합체를 형성하게 된다. TF-FVIIa는 인자 IX(FIX) 및 인자 X(FX)를 활성화시킨다. FVII은 알로스테릭하게(allosterically) TF에 의해 활성화되며 트롬빈, FXIa, 플라스민, FXII 및 FXa에 의해 활성화된다. TF-FVIIa는 FXa와 삼원 복합체를 형성한다.
비혈관 세포에 의한 조직 인자(TF)의 발현은 혈액 응고의 활성화에 의해 지혈에서 중요한 역할을 한다. TF는 추가로 지혈과는 별개인 과정과 결부되며, 그가 발현되는 세포의 표면에서 기능과 직접적으로 관련된다. 혈관 및 비혈관 세포 상에서의 응고 프로테아제들의 TF-의존성 조립은 G-단백질 커플링된 수용체인 프로테아제 활성화 수용체(protease activated receptor; PAR)를 활성화시킨다. 따라서, TF:VIIa 복합체는 PAR, 일차적으로 PAR2를 통하여 세포 신호전달을 유도할 수 있으며 (문헌[Camerer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5255-5260, 2000]; 문헌[Riewald & Ruf, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:7742-7747, 2001]; 문헌[Ruf et al, J Thromb Haemost 1: 1495-4503, 2003]; 문헌[Chen et al., Thromb Haemost 86: 334-45, 2001]), 이는 종양 형성, 혈관 신생, 종양 진행, 및 전이에 기여하게 된다.
삼원 복합체 TF/FVIIa/FXa는 TF:VIIa 복합체에 의해 직접적으로 형성되어 FX에 작용하거나 또는 FX를 FXa로 절단할 수 있는 FIXa로의 FIX의 TF:VIIa 절단 후 간접적으로 형성된다. TF/FVIIa/FXa 복합체 형성은 신호전달로 이어지거나 또는 다른 수용체, 예를 들어 PAR1 - 4를 활성화시킬 수 있다. TF/FVIIa/FXa 복합체 형성은 인터류킨-8(IL-8)의 유도에 이르게 되며, 이는 종양 세포 이동을 촉진할 수 있다 (문헌[Hjortor et al., Blood 103:3029-3037, 2004]). PAR1 및 PAR2 둘 모두는 종양 전이에 연루되어 있지만 (문헌[Shi et al., Mol Cancer Res. 2:395-402, 2004]), 활성화된 이원 및 삼원 복합체, TF-VIIa 및 TF-VIIa-FXa는 PAR2의 활성화 인자(activator)인데, PAR2는 또한 세포 신호전달에 이르게 된다 (문헌[Rao & Pendurthi, Arterioscler. Thromb.Vasc. Biol. 25:47-56, 2005]). 따라서, 조직 인자의 발암 역할(oncogenic role)이 응혈 촉진 역할(procoagulant role)에서 분리될 수 있는지를 결정하는 것은 관심있는 것이었는데, 상기 응혈 촉진 역할은 또한 오랫 동안 종양 이동, 혈관외 유출, 및 전이 기작에 연루된 것으로 생각되어 왔다.
조직 인자에 대한 단클론 항체, 예를 들어 모리세이(Morrisey) (문헌[1988, Thromb Res 52(3): 247-261]; 미국 특허 제5223427호) 및 매그돌런(Magdolen) (문헌[1996 Biol Chem 379: 157-165])에 의해 기재된 것을 사용하여 리간드 결합 부위들의 기능적 측면 및 면역학적 측면을 탐구하였다. 조직 인자에 결합할 수 있는 단클론 항체는, TF가 TF-VIIa 복합체를 형성하거나 또는 유지하는 능력을 간섭함으로써 또는 상기 복합체가 FX를 활성화시키는 능력을 차단함으로써 혈전성 사건(thrombotic event)을 차단하는 데 사용될 수 있다. 조직 인자에 결합하고 응고를 차단하지 않는 항체가 또한 공지되어 있다. 인자 VIIa 개시되는 TF 신호전달을 차단하는 항체 (그러나 응고 차단 항체는 아님), 예를 들어 항체 10H10이 또한 개시되었으며 (문헌[Ahamed et al. 2006 Proc Natl Acad Sci USA 103 (38): 13932-13937]), 이러한 항체는 고형 종양의 치료에 있어서 이러한 활성을 갖는 에이전트(agent)의 역할 및 유용성을 연구할 기회를 제공하였다 (문헌[Versteeg, et al 2008 Blood 111(1): 190-199]). 루프(Ruf) 등의 국제특허 공개 WO2007056352A3호에는 환자에 있어서 헤모스타티스(hemostatis)를 간섭하지 않고서 조직 인자 신호전달을 저해하는 방법 및 조성물이 개시되어 있다.
암 진행은 다면적 과정이기 때문에, 환자에 있어서 지혈을 간섭하지 않으면서 종양 세포에서의 발암 기능, 전이 기능, 혈관 신생 기능 및 항-아폽토시스 기능(anti-apoptotic function)의 차단이 가능한 TF 결합 항체인 치료적 후보가 바람직할 것이다.
본 발명은 쥐과 항체 10H10의 결합 에피토프를 보유하는, 인간 치료제로서 사용하기 위한 인간 적응형 항-인간 조직 인자 특이적 항체를 제공하는데, 이 항체는 FVIIa 결합에 대하여 조직 인자와 경쟁하지 않고, 따라서 TF-VIIa 복합체의 응혈 촉진, 아미드 분해(amidolytic) 활성을 사실상 차단하지 않지만, 이는 TF-VIIa 매개 신호전달 및 하류 발암 효과, 예를 들어 사이토카인 IL-8 방출을 차단한다.
본 발명의 인간 적응형 항체는 CDR 변이 잔기들과 조합된 인간 IgG 가변 도메인 프레임워크로 제작되며, 이는 10H10 쥐과 항체 CDR 서열들의 서열을 참조함으로써 결정되는 바와 같고 서열 번호 6-11 및 27로 나타낸 바와 같다. 인간 프레임워크 FR1 및 FR2 및 FR3이 CDR 및 CDR 변이체와, FR4와 조합된 것이 제공되며, 이는 쥐과 항체 10H10의 면역특이성을 갖는 항체 결합 도메인들의 조립을 허용한다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 서열 번호 6-11로 나타낸 6개의 CDR 서열 또는 서열 번호 6, 8-11, 및 27로 나타낸 군으로서의 6개의 CDR 서열은, 인간 IgG 가변 도메인의 비-CDR 위치로서 정의되며 인간 TF에 대한 10H10의 결합 친화도가 유지되도록 선택되는 인간 생식 세포 계열(germline) FR과 조합된다. 일 태양에서, 인간 중쇄(heavy chain; HC) 가변 영역 FR들은 IMGT 데이터베이스가 나타내는 바와 같이 IGHV 유전자 패밀리 1, 3 또는 5의 구성원으로부터 유래된다. 일 태양에서, 인간 LC 가변 영역 FR들은 인간 IGKV 유전자 패밀리 2 또는 4의 구성원으로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 항체 Fv (HC 가변 영역이 LC 가변 영역과 쌍을 형성한 것)는 서열 번호 12-21의 서열로부터 선택되는 HC 가변 영역 및 서열 번호 22-26의 서열로부터 선택되는 LC 가변 도메인을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 항체 Fv (HC 가변 영역이 LC 가변 영역과 쌍을 형성한 것)를 형성하는 인간 FR은 IGHV5 및 IGKV2 FR을 포함한다. 본 발명의 항체는 서열 번호 8의 H-CDR3; 서열 번호 6 및 62-83의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 H-CDR1; 서열 번호 7, 27 및 84-107의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 H-CDR2; 및 선택적으로 IGVJ4 로부터 선택되는 HC FR4 영역 (서열 번호 60)을 갖는 HC 가변 도메인 또는 이의 변이체를 포함한다. 본 발명의 항체는 서열 번호 9, 108-116의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 L-CDR1; 서열 번호 10 및 117-120의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 L-CDR2; 및 서열 번호 11 및 121-128의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 L-CDR3; 및 선택적으로 IGKJ2 로부터 선택되는 LC FR4 영역 (서열 번호 61)을 갖는 LC 가변 도메인 또는 이의 변이체를 갖는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시 형태에서, 인간 프레임워크 서열은 IGHV5_a로부터 유래되며, 생성된 가변 도메인은 서열 번호 19, 129-155의 서열로부터 선택되는 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 인간 프레임워크 서열은 IGKV2D40_O1로부터 유래되며, 생성된 가변 도메인은 서열 번호 23, 156-163의 서열로부터 선택되는 서열을 포함한다.
본 발명의 항체는 일 형태에서 비-CDR 위치로 정의되는, IGHV5_a 프레임워크들로부터 유래된 결합 도메인, 서열 SGYYGNSGFAY (서열 번호 8)를 H-CDR3을 갖는 항체로서 나타낼 수 있으며, H-CDR-1 위치들에서의 서열은 하기 화학식 I:
H-CDR1
[화학식 I]
GYTFX1X2X3WIE (서열 번호 83)
(여기서, X1은 A, D, G, I, L, N, P, R, S, T, V 및 Y로부터 선택되며; X2는 A, P, S 및 T로부터 선택되고, X3은 F, H 및 Y로부터 선택되거나; 또는 상기 서열은 GFTFITYWIA (서열 번호 81)임)로 주어지고; H-CDR2 위치에서의 서열은 하기 화학식 II로 주어진다:
H-CDR2
[화학식 II]
DIX1PGX2GX3TX4 (서열 번호 107)
(여기서, X1은 I 및 L로부터 선택되며, X2는 S 및 T로부터 선택되고, X3은 A, F, H 및 w로부터 선택되며, X4는 D, H, I, L 및 N으로부터 선택되고; H189에서 H-CDR2가 DILPASSSTN (서열 번호 105)인 경우는 제외됨).
본 발명의 항체는 비-CDR 위치들로 정의되는, IGKV2D40_O1 프레임워크들로부터 유래된 결합 도메인을 갖는 항체로 나타내어지며, 여기서, L-CDR-1 및/또는 LCDR-2 , 및 L-CDR3에서의 서열들은 하기 화학식들로 주어지는 서열들을 갖는다:
L-CDR1
[화학식 III]
KSSQSLLX1X2X3 X4Q X5NYLT (서열 번호 116)
(여기서, X1은 F, P, S, T, W 및 Y로부터 선택되며; X2는 F, S, T, R 및 V로부터 선택되고; X3은 A, G, P, S, W, Y 및 V로부터 선택되며; X4는 G, N 및 T로부터 선택되고; X5는 K, R 및 S로부터 선택됨);
L-CDR2
[화학식 IV]
X1ASTRX2S (서열 번호 120)
(여기서, X1은 H 및 W로부터 선택되며; X2는 D, E 및 S로부터 선택됨);
L-CDR3
[화학식 V]
QNDX1X2X3PX4T (서열 번호 128)
(여기서, X1은 D, F 및 L로부터 선택되며; X2는 S, T 및 Y로부터 선택되고; X3은 W 및 Y로부터 선택되며; X4는 L 및 M으로부터 선택됨).
따라서, 항체 중쇄 및 경쇄 CDR 잔기들은 10H10의 쥐과 CDR들로부터 사실상 변형된다. 예를 들어, 상기에 기술된 설명에 따르면, 항체 중쇄는 10H10의 쥐과 CDR들 (CDR3이 변화되지 않음)과 단지 70%(CDR1에서 10개의 잔기 중 3개가 변경됨), 및 60% (CDR2에서 10개의 잔기 중 4개가 변경됨) 유사할 수 있다. 경쇄 CDR 잔기들은 10H10의 쥐과 CDR들과 단지 71% (17개 중 5개 변화됨), 71% (7개 중 2개가 변화됨), 또는 55% (9개 중 4개가 변화됨) 유사하다.
추가로 본 발명은 인간 조직 인자에의 결합에 대하여 경쟁하며 따라서 쥐과 10H10 항체와 사실상 동일한, 인간 TF-ECD 상의 에피토프에 결합하는 인간 적응형 항체를 제공한다. 추가로 본 발명은 TF-발현 및 TF-발현에서 생기는 국소적 생물활성이 치료될 병태에 직접적으로 또는 간접적으로 관련된 병태를 앓고 있는 인간 대상을 치료하기 위한 이러한 항체의 사용 방법을 제공한다.
본 발명은 항체의 제조 방법뿐만 아니라 항체의 약학적으로 허용가능한 제제, 이 제제를 포함하는 용기, 및 이 용기를 포함하는 키트 (여기서, 본 발명의 항체는 인간 대상을 치료하기 위한 사용 방법에 이용가능하게 됨)를 추가로 제공한다.
<도 1>
도 1은 10H10 Fab의 또는 인간 적응형 변이체 (M1593 Fab) 및 인간 TF-ECD 잔기 5-208을 포함하는 공결정의 X선 회절 분석으로 나타내어진 에피토프를 나타내며, 여기서 M1593 H-CDR1 (T31P) 및 HCDR-2 (S57F)에서 변화된 2개의 접촉 잔기를 나타낸다.
<도 2>
도 2는 인간 (서열 번호 1, 1-219), 사이노(cyno) (서열 번호 2, 1-220), 및 생쥐 TF-ECD (서열 번호 3, 1-221)의 아미노산 잔기들의 정렬이며, 이는 쥐과 항체 TF8-5G9 (문헌[Huang et al. 1998 J Mol Biol 275:873-94]) 및 10H10이 접촉하는 잔기 위치들 및 응고 인자 FVII/VIIa 및 FX와 접촉하는 것으로 공지된 잔기들을 나타낸다.
<도 3>
도 3은 응고 인자 FVII 및 FX 뿐만 아니라 5G9 및 10H10의 파라토프가 접촉하는, 나타낸 영역들을 갖는 인간 TF-ECD의 3차원 투영도를 나타내며, 여기서, 단지 잔기 L104 및 T197이 10H10 및 FX 둘 모두에 의해 접촉된다.
<도 4>
도 4는 쥐과 항체 10H10의 중쇄 (상부 정렬) 가변 도메인 및 경쇄 (하부 정렬) 가변 도메인의 아미노산 서열 (각각 서열 번호 4 및 5), 항체 M59의 인간 프레임워크 적응형 서열들 (각각 서열 번호 19 및 23) 및 2개의 선택된 친화성의 성숙형 가변 도메인 서열들 H116 (서열 번호 133) 및 H171 (서열 번호 139)의 정렬을 나타낸다.
<도 5>
도 5는, 아이소타입 대조군 B37과 비교하여, MDB-MB-231 유방암 세포에 의한, FVIIa-유도된 IL-8이 0.24 ug/ml로 방출되는 것에 대한 27가지의 친화성 성숙형 mAb에 의한 상대적인 저해율 (%)을 나타낸다.
<도 6>
도 6은 면역손상된 생쥐에 있어서 MDA-MB231 종양 세포의 이식 후 일수에 걸친 종양 부피의 선도를 나타내며, 여기서, M1593이 투약된 군은 확립된 종양의 성장을 감소시켰다.
<도 7>
도 7은 면역손상된 생쥐에 있어서 A431 인간 편평 종양 세포의 이식 후 일수에 걸친 종양 부피의 선도를 나타내며, 여기서, M1593이 투약된 군은 확립된 종양의 성장을 감소시켰다.
<도 8>
도 8은 쥐과 가변 도메인-인간 IgG1 (M1), 위치 234 및 235에 알라닌 치환을 갖는 쥐과 가변 도메인-인간 IgG4, 비변형 CHO에서 생성된 야생형 IgG1로서의 M1593, 푸코스 함량이 낮은 글리칸의 생성용으로 선택된 CHO 주에서 생성된 M1593-LF로서의 M1593, 및 S239D 및 I332E에서 카밧(Kabat) 위치 치환을 갖는 M1593-DE에 있어서 MAb의 농도에 대한 인간 PBMC에 의한 표적 세포 용해율 (MDA-MB231 세포) (%)의 선도를 나타낸다.
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약어
TF = 조직 인자, huTF = 인간 조직 인자, muTF = 쥐과 조직 인자, 사이노TF = 사이노몰구스 조직 인자, TF-FVIIa = 조직 인자-인자 VIIa 복합체, TF/FVIIa = 조직 인자-인자 VIIa 복합체, HC = 중쇄, LC = 경쇄, v-영역 = 가변 영역, VH = 중쇄 가변 영역, VL = 경쇄 가변 영역, CCD = 전하 결합 장치(Charge-coupled device), CDR = 상보성 결정 영역(Complementarity determining region), CHES = 2-(N-사이클로헥실아미노)-에탄설폰산, EDTA = 에틸렌다이아민테트라아세트산, ECD = 세포외 도메인(Extracellular domain), HEPES = N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-2-에탄설폰산, HEK = 인간 배아 신장 세포, MES = 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산, PAR = 프로테아제 활성화 수용체, PBMC = 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell), PBS = 인산염 완충 염수(Phosphate buffered saline), PDB = 단백질 데이터 은행(Protein Data Bank), PEG = 폴리에틸렌 글리콜, SDS PAGE = 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis), SEC = 크기 배제 크로마토그래피(Size exclusion chromatography), MAb = 단클론 항체, FR = 항체 중 프레임워크, HFA = 인간 프레임워크 적응.
정의 및 용어의 설명
본 명세서에서 사용되는 "항체"는 전 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편 또는 단쇄를 포함한다. 따라서, 항체는 면역글로불린 분자의 적어도 일부분, 예컨대 비제한적으로 중쇄 또는 경쇄의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 이의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크(FR) 영역 또는 이의 임의의 부분 또는 본 발명의 항체 내로 혼입될 수 있는 결합 단백질의 적어도 일부분을 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 용어 "항체"는 추가로 항체, 이의 분해 단편, 특정 부분 및 변이체를 포함하고자 하며 이는 항체 모방체(mimetic)를 포함하거나 단쇄 항체 및 단일 도메인 항체 및 이의 단편을 포함하는, 항체 또는 이의 특정 단편 또는 부분의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체의 부분을 포함한다. 기능성 단편은 사전선택된 표적에 대한 항원-결합 단편을 포함한다. 용어 항체의 "항원 결합 부분"에 포함되는 결합 단편의 예에는 (i) Fab 단편, 즉, VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 즉, 힌지(hinge) 영역에서 다이설파이드 가교에 의해 결합된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일의 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(문헌[Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 더욱이, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH는 별개의 유전자들에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 이용하여 이들이 단일 단백질 사슬로서 만들어지게 할 수 있는 합성 링커에 의해 결합될 수 있으며, 여기서 VL 및 VH 영역은 쌍을 형성하여 1가 분자(단쇄 Fv(scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌[Bird et al. (1988) Science 242:423-426], 및 문헌[Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883] 참조)를 형성한다. 또한, 이러한 단쇄 항체는 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 얻어지며, 이 단편은 온전한(intact) 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대하여 스크리닝된다. 역으로, scFv 제작물의 라이브러리를 사용하여 항원 결합 능력에 대하여 스크리닝한 다음, 통상의 기술을 사용하여 인간 생식 세포 계열 유전자 서열을 코딩하는 다른 DNA로 스플라이싱할 수 있다. 이러한 하나의 라이브러리의 일례로는 "HuCAL: 인간 조합 항체 라이브러리"(문헌[Knappik, A. et al. J Mol Biol (2000) 296(1):57-86])가 있다.
용어 "CDR"은 항원-결합에 참여하거나 이의 원인이 되는 항체의 상보성 결정 영역 또는 초가변 영역 아미노산 잔기를 지칭한다. 항체의 인간 IgG 아형의 초가변 영역 또는 CDR은 카밧 등(문헌[1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.])에 의해 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (L-CDR1), 50-56 (L-CDR2) 및 89-97 (L-CDR3), 및 중쇄 가변 도메인 내의 31-35 (H-CDR1), 50-65 (H-CDR2) 및 95-102 (H-CDR3)로부터의 아미노산 잔기 및/또는 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)]에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 내의 초가변 루프로부터의 잔기, 즉, 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 중쇄 가변 도메인 내의 26-32 (H1), 52-56 (H2), 및 95-101 (H3)을 포함한다. 초티아(Chothia) 및 레스크(Lesk)는 구조적으로 보존된 초가변 루프를 "정규 구조(canonical structure)"로 지칭한다. 프레임워크 또는 FR1-4 잔기는 초가변 영역들 이외의 그리고 초가변 영역들을 괄호로 묶는 가변 도메인 잔기이다. 초티아 및 레스크의 넘버링 시스템은 소문자 표기, 예를 들어 30a, 30b, 30c 등으로 나타낸 특정 잔기에서의 확장을 보여줌으로써 루프 내의 잔기의 개수의 차이를 고려한다. 더욱 최근에는, 보편적인 넘버링 시스템, 인터내셔널 이뮤노지네틱스 인포메이션 시스템(international ImMunoGeneTics information system)(등록 상표)(IMGT)이 개발되어 널리 채용되었다 (문헌[LaFranc, et al. 2005. Nucl Acids Res. 33:D593-D597).
본 명세서에서, CDR은 순차적인 넘버링에 의한 경쇄 또는 중쇄 내의 위치 및 아미노산 서열 둘 모두의 면으로 나타낸다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 내의 CDR의 "위치"가 종들 간에 보존되고 루프로 지칭되는 구조에 존재함에 따라, 구조 특징에 따라 가변 도메인 서열을 정렬하는 넘버링 시스템을 사용함으로써 CDR 및 프레임워크 잔기가 용이하게 확인된다. 이러한 정보는 하나의 종의 면역글로불린으로부터의 CDR 잔기를, 전형적으로 인간 항체로부터의 수용 프레임워크 내로 그래프팅(grafting) 또는 대체하는데 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "Fc", "Fc-함유 단백질" 또는 "Fc-함유 분자"는 적어도 면역글로불린 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 단량체형, 이량체형 또는 헤테로이량체형 단백질을 말한다. CH2 및 CH3 도메인은 단백질/분자(예를 들어, 항체)의 이량체 영역의 적어도 일부분을 형성할 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 의미한다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹화(grouping)로 이루어지며, 통상 특이적인 3차원 구조적 특징뿐 아니라 특이적 전하 특징을 갖는다. 입체형태 및 비입체형태 에피토프는 전자에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에서 소실되나 후자는 그렇지 않다는 점에서 구별된다.
본 명세서에서 사용되는 KD는 해리 상수, 구체적으로, 소정의 항원에 대한 항체 KD를 지칭하며, 이는 특정 표적에 대한 항체의 친화성의 척도이다. 고 친화성 항체는 KD가 소정의 항원에 대하여 10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 10-9 M 이하, 더욱 더 바람직하게는 10-10 M 이하이다. KD의 역수는 회합 상수인 KA이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "kdis" 또는 "k2" 또는 "kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하고자 한다. "KD"는 "온-속도(on-rate)(kon)" 또는 회합 속도(k1)에 대한 "오프-속도(off-rate)(koff)"로도 지칭되는 해리 속도(k2)의 비이다. 따라서, KD는 k2/k1 또는 koff / kon과 동일하며, 몰 농도(M)로 표현된다. 이것은 KD가 작을수록 결합이 더 강해진다는 것을 따른다. 따라서 10-6M(또는 1 mM)의 KD는 10-9 M(또는 1 nM)과 비교하여 약한 결합을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단클론 항체" 또는 "단클론 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 단클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 또한, 모든 항체가 재조합 수단, 예컨대 (a) 동물로부터 단리되는 항체 또는 항체 분비 동물 세포와 융합 파트너의 융합에 의해 제조되는 하이브리도마(hybridoma), (b) 예를 들어, 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 인간 또는 다른 종 항체 조합 라이브러리로부터 단리된 항체 및 (d) 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 항체에 의해 제조되거나 발현되거나, 생성되거나, 단리됨에 따라, 상기 용어는 "재조합 항체" 및 "재조합 단클론 항체"를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 사실상 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 그러나, 인간 TF의 에피토프, 아이소형(isoform) 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 예를 들어, 다른 종으로부터의 다른 관련 항원(예를 들어, TF 종 동족체)에 대한 교차 반응성을 가질 수 있다. 게다가, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 사실상 없을 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 상이한 특이성을 갖는 "단리된" 단클론 항체의 조합은 잘 정의되어 있는 조성물에서 조합된다.
본 명세서에서 사용되는 "특이적인 결합", "면역특이적 결합" 및 "면역특이적으로 결합한다"는 소정의 항원에 대한 항체 결합을 말한다. 전형적으로, 항체는 10-7 M 이하의 해리 상수(KD)로 결합하며, 소정의 항원 이외의 비특이적인 항원(예를 들어, BSA, 카세인, 또는 임의의 다른 특정 폴리펩티드)으로의 결합에 대한 그의 KD보다 적어도 2배 더 작은 KD로 소정의 항원에 결합한다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 "고도로 특이적인" 결합은 특정 표적 에피토프에 대한 항체의 상대적 KD가 다른 리간드에 대한 항체의 결합에 대한 KD보다 적어도 10배 더 작은 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "아이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예를 들어, IgM 또는 IgG)를 지칭한다. 일부 항체 클래스는 중쇄 불변 영역에 의해 또한 코딩되며 불변 영역 도메인 내의 특정 잔기에서 올리고당류에 의해 추가로 장식되는 하위 클래스를 추가로 포함하는데 (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4), 이는 생물학적 기능을 항체에 추가로 부여한다. 예를 들어, 인간 항체 아이소타입에 있어서 IgG1, IgG3 및 더 적은 정도로 IgG2는 쥐과 IgG2a 항체가 그러한 바와 같이 이펙터 기능을 나타낸다.
"이펙터" 기능 또는 "이펙터 양성"은 항체가 수용체 또는 기타 혈액 구성성분, 예컨대 보체와 상호작용하여 예를 들어 대식세포의 동원과 항체의 항원 결합 도메인에 의해 결합되는 세포의 파괴로 이어지는 사건을 야기할 수 있는, 항원 특이적 결합 도메인과 별개의 도메인을 포함하는 것을 의미한다. 항체는 이펙터 분자의 결합에 의해 매개되는 몇몇 이펙터 기능을 가진다. 예를 들어, 보체의 C1 성분의 항체에의 결합은 보체 시스템을 활성화시킨다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화(opsonisation) 및 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 염증 응답을 촉진하며 또한 자가면역 과민성에 연루될 수 있다. 추가로, 항체는 Fc 영역을 통해 세포에 결합하며, 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 부위가 세포 상의 Fc 수용체(FcR)에 결합한다. IgG (감마 수용체), IgE (에타 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)을 비롯한 상이한 항체 클래스에 대해 특이적인 많은 Fc 수용체가 있다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에의 항체의 결합은, 항체-코팅된 입자의 포식(engulfment) 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 킬러 세포(killer cell)에 의한 항체-코팅 표적 세포의 용해(항체-의존성 세포-매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), 또는 ADCC로 불림), 염증 매개체의 분비, 태반 이동 및 면역글로불린 생성의 조절을 비롯한 많은 중요하고 다양한 생물학적 반응을 촉발시킨다.
용어 "조직 인자 단백질", "조직 인자" 및 "TF"는 천연 발생 인간 조직 인자 또는 재조합 조직 인자에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭하기 위하여 사용되며, 이는 하기에 기재된 바와 같다. 천연 발생 TF는 인간 종과, 다른 동물 종, 예를 들어 토끼, 쥐, 돼지, 인간외 영장류, 말, 쥐과, 및 양 조직 인자를 포함한다 (예를 들어 문헌[Hartzell et al., (1989) Mol. Cell. Biol., 9:2567-2573]; 문헌[Andrews et al., (1991) Gene, 98:265-269]; 및 문헌[Takayenik et al., (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm., 181:1145-1150] 참조). 인간 조직 인자의 아미노산 서열은 UniProt 레코드(record) P13726(서열 번호 1), 사이노몰구스 원숭이(서열 번호 2)에 의해, 그리고 UniProt P20352(서열 번호 3)에 의해 쥐과에 의해 주어진다. 다른 포유류 조직 인자 단백질의 아미노산 서열은 일반적으로 공지되어 있거나 또는 통상적인 기술을 통하여 획득가능하다.
본 발명의 항체는 인간 대상에게 투여하기에 유용하거나 또는 인간 조직과 접촉시키기에 유용하며(여기서, TF 신호전달에서 생기는, 세포, 조직 또는 기간 상에서 발현되는 인간 TF 기능의 차단이 요구됨), 또한 TF:FVIIa 복합체의 형성에서 생기는 TF의 응혈 촉진 기능을 사실상 변경하지 않는 것이 요구된다. 이러한 용도는 종양, 특히 유방, 전립선, 폐, 췌장, 및 난소의 원발성 또는 이차 고형 종양의 치료에서 발견될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 항체 서열을 코딩하는 핵산을 포함하며, 이는 항체가 배양에서, 원위치에서 그리고 생체 내에서와 같이 형성되는 것이 요구되는 환경에서 항체의 발현을 위한 정보의 이전 또는 재조합적 수단을 통한 제작 및 제조에서 유용한 것으로 본 기술 분야에 공지된 서열과 조합될 수 있다. 본 발명의 항체를 생성하려는 의도로 이러한 핵산을 작동시키는 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다.
추가로 본 발명은 단리된 형태의 본 발명의 항체의 투여 및 보관을 위한 약학적으로 허용가능하거나 또는 안정한 제제와 같은 제제를 제공한다.
1. 항체의 조성물
특성
본 발명은 10H10 (에드깅턴(Edgington) 등의 미국 특허 제5,223,427호)으로 공지된, 인간 TF에 결합하는 비응고성 차단 쥐과 항체가 소정의 세포에서 TF의 신호전달을 무효화할 수 있다는 예기치 못한 발견에 기초한다 (문헌[Ahmed , et al. 2006, 상기에 인용됨), 국제특허 공개 WO2007/056352A2호). 따라서, 본 발명의 항체는 쥐과 항체 10H10의 결합 에피토프를 보유하는 것이며, 이 항체는 FVIIa 결합에 대하여 조직 인자와 경쟁하지 않고, TF-VIIa 복합체의 응혈 촉진, 아미드 분해 활성을 사실상 차단하지 않으며, TF-VIIa 매개 신호전달 및 하류 발암 효과, 예를 들어 사이토카인 IL-8 방출을 차단한다. 본 발명의 항체는 IMGT 데이터베이스에서 나타낸 바와 같이 인간 생식 세포 계열 IgG 유전자에 적응되며, TF가 인간 혈장에서 칼슘의 존재 하에 응고를 개시하는 능력을 간섭하지 않으면서 인간 TF에의 결합성을 유지한다.
일반적으로, 쥐과 항체 10H10의 결합 에피토프를 보유하는 항체는, 인간 혈장의 존재 하에 TF를 포함하는 샘플에 존재할 때 이 항체의 부재 하에서의 인간 혈장의 유사 샘플과 비교하여 혈장의 TF 개시되는 응고에 필요한 시간을 사실상 연장시키지 않음과 동시에, 이 항체가 TF에 결합하여 인간 TF에의 결합에 대하여 10H10과 경쟁하는 능력을 평가함으로써 평가될 수 있다. 다른 의미에서, 본 항체의 에피토프는 결실 돌연변이 유발, 치환 돌연변이 유발, 항체가 결합한 TF의 제한된 단백질 분해 후 펩티드 단편 확인, 및 공결정화 및 X선 회절 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 본 기술 분야에 공지된 기술을 이용하여 물리적으로 지도화하여 항체 결합 도메인 및 TF의 일차 구조의 원자 구조의 부근을 지도화하고 이럼으로써 항체와 인간 TF 사이의 3차원적 회합을 규정할 수 있다 (도 1).
따라서, 에피토프는 FVIIa 결합 부위와 중첩되지 않는 것으로 정의될 수 있다 (도 2 및 3). 더 구체적으로, 본 발명의 항체가 결합하는 에피토프는 TF가 인간 혈장에서 칼슘의 존재 하에 응고를 개시하는 능력을 간섭하지 않으면서, FVII가 접촉하지 않는 TF의 N-도메인 (서열 번호 1로 나타낸 성숙 사슬의 잔기 1-104) 내의 하나 이상의 잔기, 예를 들어 잔기 65 - 70과 접촉하고, 기질 결합에 중요한 C-말단 내의 잔기 K165 및 K166과 접촉하지 않을 수 있다 (문헌[Kirchofer et al. 2000 Thromb Haemostat 84: 1072-81]).
일 실시 형태에서, 항체의 온-속도(1/Mㅇs 단위의 ka)는 1 × 10-5 초과이다. 다른 실시 형태에서, TF에 대한 항체의 오프-속도(1/s 단위의 kd)는 1.0 × 10-5 미만이며, 생성된 KD는 1 × 10-9 M 미만(1 nM 미만)이다. 특정 실시 형태에서, 항체는 KD가 0.5 × 10-9 M 미만인 인간 생식 세포 계열 유전자 적응형 항체이다. 일 실시 형태에서, 항체는 M1639, M1645, M1647, M1652, M1641, M1644, M1587, M1604, M1593, M1606, M1584, M1611, M1596, M1601, M1588, M1594, M1607, M1612, M1595, M1599, M1589, M1592, M1583 및 M1610과 같은, 표 11에 나타낸 중쇄 및 경쇄 쌍의 것으로부터 선택되는 결합 도메인을 갖는다.
본 항체 조성물은 서열 번호 6 - 166으로 주어지는 아미노산 서열들 중 하나 이상으로부터 선택되는 결합 도메인 내의 아미노산 잔기들의 서열을 포함하는 것으로 추가로 특성화될 수 있다.
Fc 기능이 변경된 항체 변이체
재조합적 방법에 의해 생성된 치료적 단클론 항체의 사용이 확장됨에 따라, 이들 복합 조성물의 특징 및 특성이 탐구되고 있다. 면역특이적인 그리고 항원을 표적화하는 특징부는 일반적으로 가변 도메인 및 하위 도메인(subdomain), 예를 들어 CDR로도 공지된 초가변 영역의 루프 말단 내에 있는 반면, 복합체는 IgG의 Fc 부분과 같이 불변 도메인에 의해 형성되는 구조에 의해 제공되는 혈청 성분들 및 다른 수용체와 상호작용한다.
항체 및 다른 Fc-함유 단백질은 몇몇의 잘 알려진 시험관 내 분석법에 의해 기능성에 대하여 비교될 수 있다. 특히, Fcγ 수용체의 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 패밀리의 구성원에 대한 친화성이 관심있다. 이들 측정은 재조합 용해성 형태의 수용체 또는 세포-회합된 형태의 수용체를 이용하여 행해질 수 있다. 게다가, IgG의 장기간 순환 반감기에 책임이 있는 수용체인 FcRn에 대한 친화성이 예를 들어 재조합 용해성 FcRn을 이용하여 비아코어(BIAcore)에 의해 측정될 수 있다. 세포 기반의 기능 분석법, 예를 들어 ADCC 분석법 및 CDC 분석법은 특정한 변이체 구조의 가능한 기능적 결과로의 통찰을 제공한다. 일 실시 형태에서, ADCC 분석법은 NK 세포가 일차 이펙터 세포가 되도록 구성되며, 이럼으로써 FcγRIIIA 수용체에 대한 기능적 영향을 반영하게 된다. 또한 식작용 분석법을 이용하여 상이한 변이체들의 면역 이펙터 기능을 비교할 수 있으며, 이는 세포 반응, 예를 들어 수퍼옥사이드(superoxide) 또는 염증 매개자 방출을 측정하는 분석법이 그러할 수 있는 바와 같다. 예를 들어, 생쥐에서 T 세포 활성화, 즉, 특정 리간드를 참여시키는 Fc 도메인, 예를 들어, Fcγ 수용체에 의존적인 활성을 측정하기 위하여 항-CD3 항체의 변이체를 사용하는 경우에서와 같이, 생체 내 모델이 또한 사용될 수 있다.
2. 조직 인자 신호-차단 항체의 생성
본 출원에 기재된 항체의 특징 및 생물학적 활성을 갖는 항체는 임의의 포유류, 예를 들어, 그에 한정되는 것은 아니지만 인간, 생쥐, 토끼, 쥐, 설치류, 영장류, 염소, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나 또는 그로부터 유래될 수 있으며, 이는 단리된 인간, 영장류, 설치류, 포유류, 키메라, 인간- 또는 영장류-적응형 항체, 면역글로불린, 이들의 절단 생성물 및 기타 특정 부분 및 변이체를 포함한다. 단클론 항체는 하이브리도마 기술 (문헌[Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497]) 및 B 세포에 융합된 불멸화 융합 파트너들을 이용한 관련 방법과 같은 본 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 항체는 또한 예를 들어 문헌[Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-78481]; 국제특허 공개 WO92/02551호; 국제특허 공개 WO2004/051268호 및 국제특허 공개 WO2004/106377호에 기재된 방법에 의해 특정 항체를 생성하기 위한 것으로 선택된 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNA를 클로닝하고 발현시킴으로써 단일 림프구 항체 방법을 이용하여 생성될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 표적 결합 도메인 또는 하위 도메인, 불변 도메인 및 기능성 표적 비결합 도메인, 예를 들어 Fc-도메인을 포함하는 항체는 본 기술 분야에 잘 알려진 몇몇 방법으로 유래될 수 있다. 일 태양에서, 천연 발생 항체 도메인의 서열은 편리하게는 공개된 또는 온라인 상의 문헌 또는 데이터베이스, 예를 들어 V-베이스(base) (MRC 단백질 공학 센터(MRC Centre for Protein Engineering)에 의해 제공됨), 미국 국립 생물 정보 센터(National Center for Biologics Information; NCBI Ig 블라스트(blast)), 또는 인터내셔널 이뮤노제네틱스 인포메이션 시스템(International Immunogenetics Information System)(등록상표)에 의해 제공되는 이뮤노진 틱스(ImMunoGeneTics; IMGT) 데이터베이스로부터 획득된다.
인간 항체
본 발명은 인간 TF에 결합하는 인간 면역글로불린(또는 항체)을 추가로 제공한다. 또한, 이들 항체는 엔지니어링되거나 적응된 것을 특징으로 할 수 있다. 면역글로불린은 사실상 인간 생식 세포 계열 면역글로불린으로부터의 가변 영역(들)을 가지며, 항원 인식에 참여하는 것으로 공지되어 있는 잔기, 예를 들어, 구조적으로 정의된 바와 같은 초가변 루프 또는 카밧의 CDR 내의 지시된 변이를 포함한다. 불변 영역(들)은 또한, 존재하는 경우 사실상 인간 면역글로불린으로부터의 것이다. 인간 항체는 적어도 약 10-6 M(1 마이크로M), 약 10-7 M(100 nM), 10-9 M(1 nM) 이하의 TM에 대한 KD를 나타낸다. 친화성의 변화에 영향을 주기 위하여, 예를 들어, TF에 대한 인간 항체의 친화성을 향상시키거나 KD를 감소시키기 위하여, CDR 잔기 또는 다른 잔기 중 어느 하나에서의 치환이 이루어질 수 있다.
TF에 결합하는 인간 항체의 생성을 위한 공급원은 바람직하게는 서열 번호 129-163의 서열로부터 선택되는 서열을 포함하는 가변 영역들, 서열 번호 28-61의 서열로부터 선택되는 FR, 및 CDR들로서 본 명세서에 제공되는 서열이며, 여기서, CDR들은, 사상 파지 입자 상에 디스플레이된 인간 유래의 Fab의 레퍼토리를 사용하여 사이노몰구스 원숭이 TF와 교차 반응하고 인간 TF에 결합할 수 있는 것으로 확인된 서열 번호 6-11, 27, 62-128의 서열 중 하나 이상으로부터 선택된다.
비인간 CDR들 중 임의의 것의 임의의 인간 가변 도메인 FR로의 치환은 상기 CDR이 기원하는 모 가변 FR에 대하여 입체형태에 의해 제공되는 동일한 공간 배향을 허용하지 않을 수 있다. 최종 MAb에서 쌍을 형성하는 중쇄 및 경쇄 가변 프레임워크 영역은 동일하거나 상이한 인간 항체 서열로부터 유래될 수 있다. 인간 항체 서열은 천연 발생 인간 항체의 서열이거나, 인간 생식 세포 계열 면역글로불린 서열로부터 유래되거나 몇몇 인간 항체의 콘센서스(consensus) 서열 및/또는 생식 세포 계열 서열일 수 있다.
적합한 인간 항체 서열은 생쥐 가변 영역의 아미노산 서열과 공지되어 있는 인간 항체의 서열의 컴퓨터 비교에 의해 확인된다. 비교는 중쇄 및 경쇄에 대하여 따로 수행하나, 원리는 각각에 대하여 유사하다.
실험 방법에 관해서는, 목적하는 활성, 결합 친화성 또는 특이성에 대하여 스크리닝될 수 있는 변이체 서열의 라이브러리를 생성하는 것이 특히 편리한 것으로 밝혀졌다. 이러한 변이체의 라이브러리의 생성을 위한 하나의 형식은 파지 디스플레이 벡터이다. 대안적으로, 변이체는 가변 도메인 내의 표적화된 잔기를 코딩하는 핵산 서열을 다양하게 하기 위한 다른 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
추가의 치환이 필요한지를 결정하는 방법, 및 치환을 위한 아미노산 잔기의 선택은 컴퓨터 모델링을 사용하여 달성될 수 있다. 면역글로불린 분자의 3차원 이미지를 생성하기 위한 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어는 광범위하게 이용할 수 있다. 일반적으로, 면역글로불린 사슬 또는 이의 도메인에 대하여 밝혀져 있는 구조로부터 시작하여 분자 모델을 생성한다. 모델링될 사슬을 아미노산 서열 유사성에 대하여 밝혀져 있는 3차원 구조의 사슬 또는 도메인과 비교하며, 가장 큰 서열 유사성을 보이는 사슬 또는 도메인은 분자 모델의 구축을 위한 출발점으로 선택한다. 밝혀져 있는 출발 구조를 변형시켜, 모델링될 면역글로불린 사슬 또는 도메인에서의 실제 아미노산과 출발 구조에서의 아미노산 간의 차이를 허용한다. 이어서, 변형된 구조를 복합 면역글로불린으로 조립한다. 마지막으로, 모델은 에너지 최소화에 의해, 그리고 모든 원자가 서로 적절한 거리 내에 존재하며, 결합 길이 및 결합 각이 화학적으로 허용되는 한계 내에 있는 것을 입증함으로써 정교화시킨다.
코드의 축퇴성(degeneracy) 때문에, 다양한 핵산 서열이 각 면역글로불린 아미노산 서열을 코딩할 것이다. 원하는 핵산 서열은 드 노보(de novo) 고체상 DNA 합성에 의해 또는 원하는 폴리뉴클레오티드의 조기에 제조된 변이체의 PCR 돌연변이 유발에 의해 생성될 수 있다. 본 출원에 기재된 항체를 코딩하는 모든 핵산은 분명히 본 발명에 포함된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 인간 항체의 가변 절편은 전형적으로 인간 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부분에 결합된다. 본 항체는 경쇄 불변 영역 및 중쇄 불변 영역 둘 모두를 포함할 것이다. 중쇄 불변 영역은 일반적으로 CH1, 힌지, CH2, CH3을 포함하며, 가끔 CH4 도메인을 포함한다.
인간 항체는 임의의 클래스의 항체로부터의 임의의 유형의 불변 도메인을 포함할 수 있으며, 이는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE와, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 하위 클래스(subclass)(아이소타입)를 포함한다. 인간화 항체가 세포독성 활성을 나타내기를 원할 때, 불변 도메인은 일반적으로 보체-고정(complement-fixing) 불변 도메인이며 그 클래스는 전형적으로 IgG1이다. 그러한 세포독성 활성이 바람직하지 않을 때에는, 불변 도메인은 IgG2 클래스의 것일 수 있다. 인간화 항체는 한 가지 초과의 클래스 또는 아이소타입으로부터의 서열을 포함할 수 있다.
선택적으로 불변 영역에 결합되는, 인간화 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산을 발현 벡터 내로 삽입한다. 경쇄 및 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터 내에 클로닝될 수 있다. 면역글로불린 사슬을 코딩하는 DNA 절편은 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현 벡터(들) 내의 조절 서열에 작동가능하게 결합된다. 그러한 조절 서열은 시그널 서열, 프로모터, 인핸서, 및 전사 종결 서열을 포함한다 (실제로 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029 (1989)]; WO 90/07861호; 문헌[Co et al., J. Immunol. 148, 1149 (1992)] 참조).
항체 또는 Fc 또는 이의 구성요소 및 도메인이 또한 이러한 도메인 또는 구성요소의 라이브러리, 예를 들어 파지 라이브러리로부터의 선발에 의해 얻어질 수 있다. 파지 라이브러리는 면역화된 동물 또는 인간의 B-세포 유래의 것과 같은 관심대상의 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리 또는 랜덤 올리고뉴클레오티드의 라이브러리를 삽입함으로써 생성될 수 있다 (문헌[Hoogenboom, et al. 2000, Immunol. Today 21(8) 371-8]). 항체 파지 라이브러리는 하나의 파지 내에 중쇄(H) 및 경쇄(L) 가변 영역 쌍을 함유하는데, 이는 단쇄 Fv 단편 또는 Fab 단편의 발현을 허용한다 (문헌[Hoogenboom, et al. 2000, 상기 문헌]). 파지미드 라이브러리의 다양성은 추가의 바람직한 인간 단클론 항체를 생성하고 후속적으로 확인하기 위하여 라이브러리의 단클론 항체의 면역특이성을 증가시키고/시키거나 변경하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 중쇄(H) 및 경쇄(L) 면역글로불린 분자 코딩 유전자는 어셈블링된 면역글로불린 분자에서 새로운 HL 쌍을 생성하도록 랜덤하게 혼합될(셔플링될) 수 있다. 부가적으로, 어느 하나의 또는 둘 모두의 H 및 L 사슬 코딩 유전자는 면역글로불린 폴리펩티드의 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR)에서 돌연변이되고, 후속적으로 바람직한 친화성 및 중화 능력에 대하여 스크리닝될 수 있다. 또한 항체 라이브러리는 하나 이상의 인간 FR 서열을 선발하고, 인간 항체 레퍼토리로부터 유래된 또는 설계된 변이를 통하여 유래된 CDR 카세트의 콜렉션(collection)을 도입함으로써 합성에 의해 생성될 수 있다 (문헌[Kretzschmar and von Ruden 2000, Current Opinion in Biotechnology, 13:598-602]). 다양성의 위치는 CDR에 한정되지 않지만, 가변 영역의 FR 절편을 또한 포함할 수 있거나, 또는 펩티드와 같은 항체 가변 영역 이외의 것을 포함할 수도 있다.
항체 가변 영역 이외의 것을 포함할 수도 있는 표적 결합 또는 표적 비결합 성분의 다른 라이브러리로는 리보좀 디스플레이, 효모 디스플레이 및 박테리아 디스플레이가 있다. 리보좀 디스플레이는 단백질이 RNA에 계속하여 부착되게 하면서 mRNA를 그의 동계 단백질로 번역하는 방법이다. 핵산 코딩 서열은 RT-PCR에 의해 회복된다 (문헌[Mattheakis, L.C. et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9022]). 효모 디스플레이는 교배형 시스템의 일부인 막-회합된 알파-응집소 효모 부착 수용체, aga1 및 aga2의 융합 단백질의 제작을 기반으로 한다 (문헌[Broder, et al. 1997. Nature Biotechnology, 15:553-7]). 박테리아 디스플레이는 세포막 또는 세포벽과 회합된 엑스포트된(exported) 박테리아 단백질에의 표적의 융합을 기반으로 한다 (문헌[Chen and Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng, 79:496-503]).
또한 본 발명은 본 발명의 조성물을 코딩하는 핵산을 조성물 또는 이의 유도된 돌연변이원의 원핵, 진핵 또는 사상 파지 발현, 분비 및/또는 디스플레이와 상용성인 벡터를 포함하는 발현 벡터의 부분으로서 또는 단리된 폴리뉴클레오티드로서 제공한다.
3. 본 발명의 항체의 제조 방법
일단 본 발명의 항체 분자가 본 명세서에 기재된 구조적 특징 및 기능적 특징에 따라 확인되었으면, 전체 항체 사슬의 원하는 일부들 또는 전체 항체 사슬을 코딩하는 핵산 서열이 클로닝되거나, 복제되거나 또는 화학적으로 합성될 수 있으며, 일상적인 방법에 의해 항체를 발현하도록 단리되어 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 면역글로불린 분자의 정제를 위한 본 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화성 및 크기화 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해성에 의해, 또는 단백질을 정제하기 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 게다가, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 정제를 용이하게 하기 위하여, 본 명세서에 기재된 또는 달리 본 기술 분야에 공지된 이종성 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있다.
숙주 세포 선발 또는 숙주 세포 조작
본 명세서에 기재된 바와 같이, 재조합 Fc-함유 단백질 또는 단클론 항체의 발현용으로 선택된 숙주 세포는 제한 없이 면역글로불린 CH2 도메인에서 단백질을 장식하는 올리고당 모이어티의 조성에서의 변이를 비롯하여 최종 조성에의 중요한 기여자이다. 따라서, 본 발명의 일 태양은 원하는 치료적 단백질을 발현하는 생산 세포의 사용 및/또는 개발에 적절한 숙주 세포의 선발을 포함한다.
또한, 숙주 세포는 포유류 기원의 것일 수 있거나, 또는 COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종, 림프종, 효모, 곤충 또는 식물 세포, 또는 이들의 임의의 유도체, 불멸화 또는 형질전환 세포로부터 선택될 수 있다.
대안적으로, 숙주 세포는 천연 또는 엔지니어링된 이. 콜라이(E. coli) 종, 클레브시엘라(Klebsiella) 종, 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 종과 같은 또는 이들의, 폴리펩티드를 글리코실화할 수 없는 종 또는 유기체, 예를 들어 원핵 세포 또는 유기체로부터 선택될 수 있다.
4. 항- TF 항체의 사용 방법
임의의 상기에 기재된 방법에 의해 생성된 조성물 (항체, 항체 변이체 또는 단편)은 세포, 조직, 기관, 유체, 또는 일반적으로 숙주에서 인간 질환 또는 특정 병상을 진단, 치료, 검출 또는 조정하기 위하여 사용될 수 있다. 본 명세서에 교시된 바와 같이, 표적 결합 후 더욱 특정하게 적합한 범위의 이펙터 기능을 제공하지만 항체는 원래의 표적화 특성을 유지하는, Fc 단편, Fc-융합 단백질 또는 항체의 Fc 부분의 변형은 특정한 응용 및 치료적 징후를 위한 항체의 변이체를 생성할 것이다.
본 발명에 의해 제공되는 조성물을 이용한 치료에 따를 수 있는 질환 또는 병상은 암을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 상기 암은 원발성 고형 종양 및 전이; 암종, 선암종, 흑색종, 액성 종양, 예를 들어 림프종, 백혈병 및 골수종 및 암이 진행됨에 따라 형성되는 침습성 덩어리; 연조직 암; 육종, 골육종, 흉선종, 림프육종, 섬유육종, 평활근육종, 지방종, 교모세포종, 성상세포육종(astrosarcoma), 전립선암, 유방암, 난소암, 위암, 췌장암, 후두암, 식도암, 고환암, 간암, 이하선암, 담도암, 결장암, 직장암, 자궁 경부암, 자궁암, 자궁 내막암, 갑상선암, 폐암, 신장암 또는 방광암을 포함한다.
TF가 사이토카인, 예를 들어 염증성 사이토카인, IL-8의 하류 방출에 참여하는 능력을 차단함으로써 본 발명의 항체가 조직에서 암유발(pro-oncogenic) 환경을 감소시키는 한, 본 발명의 항체는 종양 증식 및 혈관 신생을 억제하도록 지시된 다른 치료와 함께 또는 예방적으로 사용될 수 있다. 대부분의 연령-관련된 암은 재생가능한 조직의 상피 세포로부터 유래된다. 상피 세포의 중요한 요소는 섬유아세포, 대식 세포 및 내피 세포를 포함하는 몇몇 세포 유형 및 세포외 매트릭스로 구성된 상피하 층, 간질이다. 암성 종양에 있어서, 간질은 종양의 성장 및 진행에 결정적이며, TF는 암성 상피 세포 뿐만 아니라 간질 세포 상에서도 발현될 수 있다. 따라서, 간질에서 TF:VIIa 신호전달에서 생기는 하류 인자들의 존재는 암유발 조직 환경을 생성할 수 있는데, 이는 발암 돌연변이와 상승 작용을 하여 신생 조직(neoplastic tissue)이 형성되게 한다.
이와 유사하게, TF가 지방 조직에서 발현될 때, 이것은 비만, 대사 증후군 및 당뇨병과 같은 병태에 있어서 조직의 기능을 변경시킬 수 있다. 본 발명의 항체는 TF:VIIa 신호전달을 차단함으로써 이들 병태의 치료에서 유용할 수 있다. IL-8 및 IL-6을 비롯하여 TF:FVIIa 신호전달의 하류에서 생성되는 인자들 중 일부는 염증의 강력한 매개자이다. 따라서, 본 발명의 항체의 추가의 용도는 류마티스 관절염, 염증성 장질환 및 천식과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 염증성 병태의 치료를 포함한다.
본 발명의 항체는 TF:VIIa 신호전달을 저해하고 혈관 신생을 촉진하는 하류의 효과를 감소시키기 때문에, 본 발명의 항체는 암에 더하여, 혈관 신생을 포함하는 다른 질환, 장애 및/또는 병태의 치료에 유용할 수 있다. 이들 질환, 장애 및/또는 병태는 양성 종양, 예를 들어 혈관종, 청신경종, 신경섬유종, 트라코마(trachoma) 및 화농성 육아종; 죽상 판(artheroscleric plaque); 혈관 신생 안과 질환, 예를 들어 당뇨성 망막병증, 미숙아 망막병증, 황반 변성, 각막 이식 거부, 신생 혈관 녹내장, 수정체 후방 섬유 증식증, 조홍, 망막아종, 포도막염 및 눈의 익상편(Pterygia; 비정상적 혈관 성장); 류마티스 관절염; 건선; 창상 치유 지연; 자궁 내막증; 맥관 형성; 육아(granulation); 비후성 반흔(켈로이드); 골절 불유합; 피부 경화증; 트라코마; 혈관 유착; 심근 혈관 신생; 관상동맥 측부순환(coronary collateral); 뇌 측부순환(cerebral collateral); 동정맥 기형; 허혈성 사지 혈관 신생; 오슬러-웨버 증후군(Osler-Webber Syndrome); 플라크 신혈관 형성; 모세 혈관 확장; 혈우병 관절; 혈관섬유종; 섬유근성 이형성증; 창상 육아; 크론병(Crohn's disease); 및 아테롬성 동맥 경화증을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체가 TF:VIIa 신호전달을 저해하는 한, 본 항체는 신생물을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 과증식성 질환, 장애 및/또는 병태를 치료 및/또는 진단하는 데 사용될 수 있다. 본 항체는 직접적인 또는 간접적인 상호작용을 통하여 상기 장애의 확산을 저해할 수 있다. 본 발명의 항체에 의해 치료되고/되거나 진단될 수 있는 과증식성 질환, 장애 및/또는 병태의 예에는 고감마글로불린혈증, 림프증식성 질환, 캐슬만씨병(Castleman's disease)과 같은 장애, 및/또는 병태들, 이상단백혈증, 자반증, 사르코이드증, 세자리 증후군(Sezary Syndrome), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstron's Macroglobulinemia), 고세병(Gaucher's Disease), 조직구증, 및 기관, 조직 또는 체액 구획에서의 임의의 다른 과증식성 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않는 과증식성 질환, 장애 및/또는 병태를 포함한다.
본 발명의 항체를 치료적으로 사용할 수 있는 추가의 방법은 예를 들어 이펙터 세포에 의한 (ADCC) 또는 보체에 의해 매개되는 (CDC) 항체의 직접 세포독성 또는 예를 들어 면역콘쥬게이트(immunoconjugate)로서의 항체의 간접 세포독성을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명을 일반적인 개념으로 개시하였지만, 본 발명의 실시 형태는 특허청구범위의 범주를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 되는 하기 실시예에서 추가로 개시될 것이다. 실험 설명에서, 소정의 시약 및 절차를 사용하여 단백질 또는 항체 또는 특정 단편을 생성하였다. 항체를 특성화하는 데 일상적으로 사용되는 분석 방법을 하기에 설명한다.
재료 및 방법
단백질 및 항체 표준물
인간 TF의 재조합 세포외 도메인(ECD)을 2가지 형태로 제작하였으며, 즉 ELISA 및 비아코어-기반의 직접적 결합 분석법의 경우, C-말단 His6-태그 펩티드를 포함하는 TF의 성숙 사슬 (서열 번호 1)의 아미노산 1-219를 포유류 시스템에서 발현시켰고; 공결정법 연구의 경우, C-말단 His6-태그 펩티드를 포함하는 서열 번호 1의 아미노산 5-213을 박테리아 시스템에서 발현시켰다. 인간 TF1-219를 상기 단백질 상의 아민 잔기들을 표적화하여 NHS-에스테르 화학을 이용하여 바이오티닐화하였다. 응고 분석의 경우, 진단용의, 인지질, 칼슘, 완충제 및 안정제와 조합된 동결건조된 재조합 인간 조직 인자인 이노빈(Innovin)(등록상표) (데이드 베링 인크.(Dade Behring Inc.) 카탈로그 번호:B4212)을 이용하였다.
사이노몰구스 원숭이(사이노) TF-ECD (서열 번호 2)를 PCR을 사용하여, 바이오체인 인스티튜트(BioChain Institute; 미국 캘리포니아주 헤이워드 소재)로부터 획득한 사이노몰구스 고환 조직으로부터 단리한 cDNA로부터 클로닝하였다.
하기의 몇몇 항체를 기준 항체로 사용하였다: i) 원 하이브리도마 TF9.10H10-3.2.2 (미국 특허 제7223427호)로부터 클로닝된 10H10; ii) M1로 표기되는, 인간 IgG1/카파 불변 영역을 포함하는, 서열 번호 4 및 서열 번호 5의 서열을 포함하는 10H10 생쥐-인간 키메라; iii) 10H10의 6개의 CDR을 포함하며 친화력 성숙을 위한 모 항체로서의 역할을 하는 인간 FR 적응형 항체로서, 인간 IgG1 및 인간 카파 불변 영역을 포함하는 서열 번호 19 및 서열 번호 23의 서열을 포함하는 M59; iv) 쥐과 항-인간 조직 인자 항체 TF8-5G9 (미국 특허 제7223427호); v) 인간 IgG1/카파로서, CNTO 860으로서 공지된 인간화된 형태의 항체 5G9 (미국 특허 제7605235호); 및 vi) B37로 칭해지는, 관계없는 항원(RSV)에 결합하는 아이소타입 대조 (인간 IgG1/카파) 항체.
항체의 발현 및 정제
일상적인 절차를 이용하여 개시된 항체들을 발현시키고 정제하였다. 일차 스크리닝에 있어서, 이들 분자를 코딩하는 DNA를 96웰 플레이트에서 HEK 293E 세포에서 일시적으로 발현시키고, 트랜스펙션시킨지 96시간 후에 상청액을 활성 (결합)에 대하여 검사하였다. 히트(Hit)들을 확인하고, 파일럿 규모(pilot-scale)의 발현 및 정제용으로 선택하였다. 파일럿 규모 발현을 HEK 293F 세포 또는 CHO-S에서 750 ml의 부피로 일시적으로 행하였다. 수확한 상청액들을 단백질 A 크로마토그래피를 통하여 정제하고, 정제된 단백질들을 그의 친화성 및 기능적 활성에 대하여 평가하였다. 게다가, 정제된 단백질들은 SDS-PAGE, SE-HPLC, 및 교차 상호작용 크로마토그래피(cross-interaction chromatography; CIC)에 의해 생물물리학적으로 특성화하였다. 이론적 등전점(pI)을 각각의 변이체에 대하여 또한 계산하였다. 파일럿 규모의 특성화로부터, 최종 선두 후보들의 세트를 WAVE 생물반응기에서 트랜스펙션시키고, 단백질 A 크로마토그래피를 통하여 정제하였다.
Fab의 생성 및 단클론 Fab의 ELISA
파지 패닝 라운드(phage panning round)로부터의 글리세롤 스톡을 미니프렙하고(miniprepped), pIX 유전자를 NheI/SpeI 절단에 의해 잘라냈다. 재라이게이션 후, 상기 DNA로 TG-1 세포를 형질전환시키고, LB/한천 플레이트에서 하룻밤 성장시켰다. 다음 날, 콜로니를 골라내고, 하룻밤 성장시키고, 상기 배양물을 (i) 콜로니 PCR 및 V-영역의 서열결정, 및 (ii) Fab 생성의 유도에 사용하였다. Fab 생성에 있어서, 상기 하룻밤 배양물을 새로운 배지에서 10-100배 희석시키고, 37℃에서 5-6시간 동안 성장시켰다. Fab 생성은 IPTG를 함유하는 신선 배지의 첨가에 의해 유도하였으며, 상기 배양물을 30℃에서 하룻밤 성장시켰다. 다음 날, 상기 배양물을 스핀다운시키고(spun down), 용해성 Fab 단백질을 함유하는 상청액을 Fab의 ELISA에 사용하였다.
Fab의 ELISA에 있어서, Fab를 다클론 항-Fd(CH1) 항체에 의해 플레이트 상에 포획하였다. 적절한 세척 및 차단 후, 바이오티닐화 hTF를 0.2 nM의 농도로 첨가하였다. 이 농도는 모 Fab의 결합성의 퍼센트로서 정의되는 Fab 변이체들의 순위 매김을 가능하게 하며, 여기서, 모든 플레이트에서 대조군으로서 존재하는 모 Fab는 100% 결합으로서 정의된다. 바이오티닐화 hTF를 HRP-콘쥬게이션된 스트렙타비딘에 의해 검출하고, 플레이트 판독기에서 화학발광을 판독하였다.
TF-ECD 결합 Mab-기반 ELISA
화학발광 검출을 이용한 용액상 직접적 TF 결합 ELISA를 사용하여 인간 프레임워크 적응형 라이브러리로부터 최고 결합자들을 순위 매김하였다. pH 9.4의 탄산염-중탄산염 완충제에 희석시킨 4 ug/ml의 염소 항 인간 IgG FC 100 uL를 이용하여 4℃에서 하룻밤 96웰 블랙 맥시소르프(black maxisorp) 플레이트를 코팅하고, 그 후 세척 완충제 (0.05% 트윈(Tween)-20 용액을 포함하는 PBS)로 3회 세척하고, 300 μl의 1% BSA/10 mM PBS 용액으로 1시간 동안 차단시키고, 이어서 이전과 같이 세척하였다. 샘플들 또는 표준물들을 분석 완충제(PBS 중 1% BSA + 05% 트윈)에서 50 ng/ml로 희석시키고, 100 ul를 실온에서 1시간 동안 진탕시키면서 분석 플레이트에 첨가하였다. 상기 플레이트들을 3회 세척하고, 웰당, His 태그를 포함하는 인간 또는 사이노몰로구스 TF-ECD 100 ul를 분석 완충제에 희석시킨 100 ng/ml로 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 웰당, 분석 완충제에서 1:2000으로 희석시킨, 퀴아젠(Qiagen) 퍼오시다아제 콘쥬게이션된 펜타-his 100 ul를 첨가하고, 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 비엠 케미룸 기질(BM ChemiLum Substrate) (비엠 케미룸(BM Chemilum), POD, 로슈(Roche))를 완충제 중에 1:100으로 희석시켜 신선하게 제조하고, 최종 세척 후 100 ul를 상기 플레이트에 첨가하였다. 10분 후, 플레이트들을 퍼킨 엘머 인비전 리더(Perkin Elmer Envision Reader), 비엠 케미룸 프로그램에서 판독한다.
FACS에 의한 항-조직 인자 mAb의 MDA-MB-231 전 세포 결합
유방암 세포에서 발현된 내인성 인간 TF에 대한 항체의 직접적 결합을 탐지하기 위하여 이 분석법을 이용한다. FACS 완충제 (PBS 중 1% FBS) 중 시험 mAb들의 4점 적정물들을 이중으로 제조한다. 1:4의 희석물들을 이용하여 1,000 ng/ml에서 적정을 시작한다. 모 분자인 M1을 양성 대조군으로 사용하는 반면, 항-RSV mAb인 B37을 음성/아이소타입 대조군으로 사용한다. 염색되지 않은 세포 및 이차 항체, Cy-5 콘쥬게이션된 염소 항-인간 IgG Fc 항체 (FACS 완충제 중의 것, 1:200)를 대조군으로 사용하며, 사용 직전에 제조한다.
표준 조직 배양 기술을 이용하여, 배양 플라스크 내의 유착 MDA-MB-231 세포를 PBS (Ca+2/Mg+2를 포함하지 않음)로 1회 헹군다. 세포를 베르센(Versene)으로 들어올리고, 세포를 계수하고, 폴리스티렌 V자형 바닥 플레이트 내에 웰당 200,000개의 세포를 접종한다. FACS 분석 프로토콜: 조직 인자 결합. 4℃에서 450xg에서 3분 동안 알레그라(Allegra) X-15R 원심분리기에서 세포를 펠렛화하고, FACS 완충제 (PBS 중 2% FBS)에 재현탁시키고, 웰당 200,000개의 세포를 200 uL로 플레이팅한다. 4℃에서 450xg에서 3분 동안 세포를 펠렛화한다. 상청액을 버리고, 100 uL/웰의 시험 또는 대조 mAb를 표기된 웰에 첨가하고, 얼음 상에서 또는 4℃에서 1시간 (+/- 10분) 동안 인큐베이션한다. 4℃에서 450xg에서 3분 동안 세포를 펠렛화한다. 상청액을 버리고, 세포를 FACS 완충제에서 1회 세척한다. 세포를 200 uL/웰의 FACS 완충제에 재현탁시키고, 4℃에서 450xg에서 3분 동안 세포를 펠렛화한다. 상청액을 버리고, 100 uL/웰의 이차 항체를 표기된 웰에 첨가하고 (함께 혼합함(triterate)), 얼음 상에서 1시간 (+/- 10분) 동안 인큐베이션한다. 4℃에서 450xg에서 3분 동안 세포를 펠렛화한다. 상청액을 버리고, 세포를 FACS 완충제에서 2회 세척한 후 세포를 200 uL/웰의 FACS 완충제 중에 재현탁시킨다 (함께 혼합함). 4℃에서 450xg에서 3분 동안 세포를 펠렛화한다. 상청액을 버리고, 세포를 100 uL/웰의 사이토픽스(CytoFix) 완충제 중에 재현탁시킨다. 반응물을 유세포 분석법(flow cytometry) (비디 팩스어레이(BD FACSArray))으로 분석한다. 염색되지 않은 대조 웰 내에 주요 세포 집단을 게이팅(gating)하고 상기 게이트를 전 데이터 세트에 적용함으로써 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 FACS 데이터 분석에 사용한다. 상기 데이터는 적용된 게이트를 위한 레드 채널(red channel)에서 기하 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity; MFI)의 표로서 엑스포트한다.
서모플루오르(Thermofluor) 분석법
서모플루오르 기술은 분자가 가열될 때의 분자의 언폴딩(unfolding)의 반응 속도 측정(kinetic measurement)이다. 당해 분자가 가열될 때, 염료 (ANS)는 상기 분자가 언폴딩될 때 상기 분자에 결합할 수 있다. 염료는 이것이 분자에 결합할 때 형광을 낼 것이며, 이 형광을 시간이 지남에 따라 측정한다. 이 분석법에서, 항체의 언폴딩을 37-95℃에서 측정하였으며, 0.5℃마다 탐지하였다. 분석 대조군으로 사용할, Tm이 공지된 2가지의 mAb(Emmp 4A5, 및 Emmp 5F6)와 함께, 쥐과 및 키메라 형태 둘 모두에서 (10H10, M1, 5G9 및 CNTO860에서) 모 분자의 Tm을 또한 측정하였다.
이 분석을 이용하여 인간 프레임워크 적응형 라이브러리 변이체의 열안정성을 예측하였다. 정제된 항체를 PBS에서 0.5 mg/mL로 희석시키고, 웰당 샘플이 총 1 ug이 되도록 2 ul의 샘플을 각각의 웰에 첨가한다. 각각의 샘플을 이중으로 첨가한다. 스톡 ANS는 DMSO 중 500 mM로 존재한다. 스톡 ANS를 DMSO 내에 1:12로 (40 mM이 되도록) 희석시키며; 20 ul의 40 mM ANS 용액, 2.8 ul의 10% 트윈 및 1.98 mL의 PBS를 합함으로써 염료/트윈 용액을 만들고; 2 uL의 염료/트윈 용액 및 2 ul의 오일을 첨가한다. 플레이트들을 원심분리한다 (450 rpm에서 2분). 서모플루오르 설정: 셔터를 매뉴얼대로 설정, 온도를 0.5C /sec로 증가, 연속적으로 증가, 온도 증가 범위: 50-95℃. 고온에서 15초간 유지를 선택, 노출 시간: 10s / 1회 반복(rep.), 게인 노멀(Gain normal) = 2, "단일 SC 이미지/플레이트"를 선택.
교차 상호작용 크로마토그래피(CID)
다양한 항체들과 다른 인간 항체들의 상호작용을 결정하기 위하여, 인간 IgG (시그마 알드리치(Sigma Aldrich))가 커플링된 컬럼을 이용하여 크로마토그래피 실험을 수행하였다. 간략하게는, 50 mg의 인간 IgG를 제조업자의 지시에 따라 1 ml의 NHS-세파로스(Sepharose) 컬럼 (지이 헬스케어(GE Healthcare))에 커플링시켰다. 커플링되지 않은 IgG는 0.1 M 트리스, pH8, 0.5 M NaCl을 이용하여 세척함으로써 제거하였으며, 미반응 NHS 기를 동일 완충제로 차단시켰다. 피어스(Pierce)의 쿠마시 플러스 분석 키트(Coomassie Plus Assay Kit; 서모 피어스(Thermo Pierce))를 사용하여 미반응 커플링 완충제 및 세척물 중에 남아 있는 단백질의 농도를 측정하고, 이를 고정화 전의 단백질의 양으로부터 차감함으로써 상기 커플링의 효율을 결정하였다. 단지 단백질을 수지에 첨가하지 않은 동일 프로토콜을 이용하여 대조 컬럼을 또한 준비하였다.
먼저 대조 컬럼을, 0.1 ml/분의 유량으로, pH 7의 PBS로 평형화한 후 다이오넥스 얼티메이트(Dionex UltiMate) 3000 HPLC에서 동작(run)시켰다. 먼저 20 l의 스톡 단백질 용액을 주입하여 비특이적 결합 부위들의 차단을 보장하고, 이어서 20 l의 10% 아세톤을 주입하여 컬럼의 완전성(integrity)을 체크하였다.
분석할 샘플들을 pH 7의 PBS에서 0.1 mg/ml로 희석시켰다. 20 마이크로리터의 각각의 샘플을 각각의 컬럼 상에 주입하고, 0.1 ml/분으로 30분 동안 동작시켰다. 각각의 변이체에 대하여 체류 시간을 기록하고, 체류 인자(retention factor; k')를 계산하였다.
k'의 계산은 단백질 유래된 컬럼 (IgG 커플링된 컬럼) 상에서의 체류 시간, tR과 단백질이 커플링되지 않은 컬럼 상에서의 체류 시간, t0 사이의 차이이다. 또한 상기 계산은 컬럼을 표준화하기 위하여 상기 둘 모두의 컬럼 상에서의 아세톤의 체류 시간을 고려한다. k'의 허용가능한 값은 0.3 미만이다.
용해도
실온에서 다양한 항체들의 용해도를 결정하기 위하여, 원심식 필터 장치를 이용하여 농축 실험들을 수행하였다. 간략하게는, PBS 중 항체 제제들을 실온에서 비바스핀(Vivaspin)-15 (15 ml) 원심식 필터 장치 (30,000 MWCO, 독일 괴팅겐 소재의 사르토리우스(Sartorius))에 첨가하였다. 상기 필터들은 스윙 버킷 로터(swinging bucket rotor)를 사용하여 베크만 알레그라(Beckman Allegra) X15-R 원심분리기에서 20분 간격으로 3000 × g로 회전하였다. 일단 부피가 약 2 ml로 감소되면, 상청액을 비바스핀-4 (4 ml) 필터 장치(30,000 MWCO)로 옮기고, 4,000 × g에서 20분 간격으로 원심분리시켰다. 일단 부피가 500 l로 감소되었으면, 샘플을 비바스핀-500 필터 장치로 옮기고, 에펜도르프(Eppendorf) 5424 원심분리기에서 15,000 × g로 15분 동안 원심분리시켰다. 단백질 농도가 100 mg/ml 이상에 도달할 때까지 이를 반복하였다. 적절한 희석물을 이용한 바이오테크 시너지HT(BioTek SynergyHT)TM 분광 광도계에서의 280 nm 및 310 nm에서의 흡광도에 의해 단백질 농도를 결정하였다. 이 때에, 원심분리를 중단하고, 샘플을 실온에서 하룻밤 두어, 평형에 도달하게 하였다. 다음날 아침에, 샘플을 침전 징후에 대하여 점검하였다. 농도가 100 mg/ml보다 크면, 이 과정을 중단하였다.
인자 VIIA-유도된 IL-8의 저해의 분석
이 분석법을 이용하여 TF-결합 항체들이 TF를 발현하는 인간 세포로부터의 FVIIa-유도된 IL-8의 방출을 중화시키는지의 여부를 시험하였다. 인간 유방 선암종 세포(MDA-MB-231) (ATCC: HTB-26)를 DMEM 및 10% FBS (깁코(Gibco): 카탈로그 번호 11995 및 카탈로그 번호 16140)에서 성장하도록 적응시킨 것을, 표준 세포 배양 기술을 이용하여 96웰 세포 배양 플레이트 (넝크(Nunc): 카탈로그 번호 167008)에 웰당 20000개의 세포 (100,000개의 세포/mL)의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 2일 동안 회복시킨 후, 항체 처리를 2 ug/mL에서 시작하고 FBS를 포함하지 않는 DMEM에서 1:2 또는 1:4 중 어느 하나로 연속 희석시켰다. FBS를 포함하지 않는 DMEM 중에 50 nM의 최종 농도로 인간 FVIIa (이노베이티브 리서치(Innovative Research): 카탈로그 번호 IHFVIIa, 로트:2824)로 처리하기 1시간 전에 항체를 첨가하였다. 세포를 인큐베이터 내에 24시간 동안 두었다. 처리 후, 상청액을 수집하고, IL-8의 양을 제조업자의 프로토콜에 따라 ELISA (알앤디 시스템즈(R&D Systems: 카탈로그 번호 D8000C)에 의해 검출하였다. 간략하게는, 각각의 처리 샘플의 광학 밀도(optical density; OD)를 450 nm 및 540 nm에서 판독하였다. 540 nm에서의 판독치를 이용하여 분석 플레이트에서의 광학 결함에 대하여 보정한 반면, 보정된 450 nm에서의 판독치 (OD 450 - OD 540)를 이용하여 처리 샘플 중 IL-8의 함량을 계산하였는데, 이는 제조업자의 프로토콜에 따라 작성한 IL-8 표준 곡선을 이용하였다. 항체 및 FVIIa 처리를 받지 않은 세포를 포함하는 웰을 이용하여 내인성 IL-8의 수준을 정의한 반면, 단지 FVIIa를 받은 세포를 포함하는 웰을 이용하여 "무저해(no inhibition)" IL-8 수준을 정의하고, 이럼으로써 각각 최소 및 최대 IL-8 수준을 정의하였다. MAb 적정 처리 샘플들을 상기에 정의된 최대 및 최소 IL-8 수준에 대하여 정규화하고, 저해율 (%)로 표현하였다. 정규화된 데이터를 막대 그래프로 나타내거나 또는 4개 파라미터 로지스틱 커브 피팅(four-parameter logistic curve fit)으로 피팅시켜 각각의 MAb의 EC50 값을 추출하였다.
응고 분석
첨가된 재조합 인간 TF 제제 (이노빈(Innovin), 데이드 베링 인크.) 및 칼슘의 존재 하의 인간 혈장을 이용하여, 이 분석법을 이용하여 항-인간 TF 항체가 시험관 내에서 응고를 차단하는지의 여부를 결정하였다. 항-인간 TF 항체를 HBSS (깁코, 카탈로그 번호 14175)에서 2 mg/ml의 항체가 되도록 희석시켰다. 시트르산나트륨을 포함하는 풀링된 인간 혈장 (미국 미시간주 노비 소재의 조지 킹 바이오메디칼(George King Biomedical))을 1000 rpm에서 5분 동안 스핀 다운시키고, 투명 혈장을 새로운 튜브로 옮긴다. 투명 96웰 분석 플레이트 (넝크, 카탈로그 번호 439454)의 각각의 웰에서, 25 ul의 희석된 항체를 100 ul의 인간 혈장에 첨가한다. 22 mM의 CaCl2를 포함하는 HBSS 내에 1:500으로 희석시킨 125 μl의 이노빈 (데이드 베링 인크., 카탈로그 번호 B4212)을 항체를 포함하거나 또는 포함하지 않는 혈장을 함유하는 각각의 웰에 첨가함으로써 반응을 개시한다. 스펙트라맥스(SpectraMax) M2e 판독기 (미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 몰레큘러 디바이시즈(Molecular Devices))를 이용하여 37℃에서 30분 동안, 그리고 반응 개시 직후에 응고 반응을 OD 405에서 동역학적으로 모니터링하였다. 소프트맥스 프로 소프트웨어(Softmax Pro Software)를 사용하여 각각의 항체에 대하여 T½ Max를 최대 광학 밀도의 50%에 도달하는 데 걸리는 초 단위의 시간으로 결정한다. 샘플들에 있어서 초 단위의 시간을 각각의 플레이트 상의 기준에 대하여 정규화하였지만, 샘플들 사이에서 통계적으로 차이는 전혀 없었으며, 이는 항체를 포함하지 않는 샘플, 10H10, 및 10H10 유래된 변이체 및 인간 적응형 변이체 전부에 있어서의 평균 시간인 150초 및 200초로 열거된다.
실시예 1: 10H10의 서열결정
미국 캘리포니아주 라졸라 소재의 더 스크립스 리서치 인스티튜트(The Scripps Research Institute)에서 생성한, 10H10으로 공지된 쥐과 항체 (미국 특허 제5223427호, 문헌[Morrisey et al. 1988 Thromb Res. 52(3): 247-261])를 하이브리도마 TF9.10H10-3.2.2에 의해 생성한다. 10H10 하이브리도마 클론 유래의 항체의 서열은 이전에 보고되어 있지 않았었다.
서열들을 5'RACE법 (문헌[Focus 25 (2):25-27, 2003]; 문헌[Maruyama 1994 Gene 138, 171-174])을 이용하여 확인하였으며, 여기서, 2가지의 항체 사슬, VH 및 VL을 5' 진레이서(GeneRacer)™ (인비트로겐(InVitrogen)), 프라이머 및 3' 콘센서스 프라이머 (각각 생쥐 IgG1 불변 영역 및 생쥐 카파 불변 영역 내의 서열에 대하여 상보성임)를 이용하여 증폭시켰다. 5' 진레이서 네스티드(Nested) 프라이머 및 3' 콘센서스 프라이머를 이용한 네스티드 PCR 증폭을 이용하여 서열 분석에 더욱 적합한 VL 생성물을 생성하였다.
16개 이상의 클론을 선발하여 각각의 사슬의 가변 영역을 확인하였다. 프라이머들을 이용하여 인서트들의 공지되지 않은 영역을 서열결정하였다. 서열 분석을 위하여 미가공(raw) 서열 데이터를 ABI DNA 시퀀서(Sequencer)로부터 벡터(Vector) NTI (인비트로겐 인포맥스(Invitrogen Informax))로 다운로드하였다. 하나의 기능성 VH 및 하나의 기능성 VL을 확인하였다. VH 유전자 및 VL 유전자 둘 모두를 추가로 분석하여 이들의 천연 시그널 서열, FR, CDR, 및 J-절편을 찾아냈다.
VH의 CDR-1에 상응하는 영역은 제외하고서, 카밧 정의에 따라 10H10의 FR들 및 CDR들을 순차적으로 넘버링하여 절편화하였다 (문헌[Kabat et al., 5th edit. Public Health Service, NIH, Washington, DC, 1991]). 이 영역에 있어서, 카밧 및 초티아의 정의의 조합을 이용하였다 (라구나탄, 지.(Raghunathan, G.)의 미국 특허 공개 제2009/ 0118127 A1호; 문헌[Chothia and Lesk, J Mol Biol 196(4): 901-17, 1987]).
[표 1]
Figure pct00016
클로닝된 V 영역들을 인간 IgG1 / 카파 불변 영역들을 이용하여 엔지니어링하고, HEK293 또는 CHO 세포주에서의 재조합적 발현을 위하여 포유류 발현 벡터 내에 클로닝하여 M1로 표기되는 생쥐-인간 키메라 항체를 생성하였으며, 이를 분석법 개발에서 기준 항체로서 사용하였다. 또한, 결정 구조 분석에 사용된 10H10Fab를 생성하기 위하여 HC V-영역을 단지 인간 IgG1 CH1 도메인과, C-말단 헥사히스티딘을 이용하여 엔지니어링하였다.
실시예 2: 비-항응고 조직 인자 항체의 에피토프의 지도화
인간 TF ECD와, 상응하는 Fab 단편 사이의 복합체의 결정 구조 결정에 의해 10H10의 에피토프의 지도화를 수행하였다. His-태그 인간 TF ECD (서열 번호 1의 잔기 5-213)를 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 발현시키고, 각각 HisTrap HP 컬럼 (지이 헬스케어) 및 Q HP 컬럼 (지이 헬스케어)을 사용하여 친화성 및 이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 10H10 Fab의 His-태그 키메라 버전 (생쥐 V 영역, 인간 불변 도메인)을 HEK 세포에서 발현시키고, 친화성 (탈론(TALON) 컬럼, 지이 헬스케어) 및 크기 배제 (하이로드 수퍼덱스(HiLoad Superdex) 200 컬럼, 지이 헬스케어) 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.
복합체는 Fab를 인간 TF ECD와 1:1.2의 몰비로 (과량의 TF) 혼합함으로써 제조하였다. 상기 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션하고, pH 7.5의 20 mM HEPES, 및 0.1 M NaCl로 평형화한 수퍼덱스 200 컬럼 (지이 헬스케어) 상에 로딩하였다. 주 피크에 상응하는 분획들을 풀링하고, 10 mg/mL로 농축시키고, 결정화에 사용하였다. 상기 복합체를 20℃에서 증기 확산법에 의해 결정화하였다. 10H10:TF 복합체를 pH 9.5의 0.1 M CHES 중 18% PEG 8000을 함유하는 용액으로부터 결정화하였다. X선 데이터 수집에 있어서, 상기 복합체의 하나의 결정을 20% 글리세롤로 보충된 모액 중에 수초 동안 침지시켰으며, 38℃(100 K)에서 질소 스트림에서 순간 냉동시켰다. 엑스-스트림(X-stream)™ 2000 극저온 냉각 시스템(리가쿠(Rigaku)) 및 새턴(Saturn) 944 CCD 검출기를 갖춘 리가쿠 마이크로맥스(MicroMax)TM-007HF 미소초점 X선 발생기를 사용하여 X선 회절 강도를 측정하였다. 거대분자 결정법을 위한 CCP4 프로그램 스위트(suite of program)를 이용하여 분자 대체에 의해 구조를 결정하였다 (문헌[Collaborative Computational Project, Number 4. 1994. Acta Cryst. D50, 760-763]).
TF ECD는 면역글로불린 폴드를 갖는 2개의 토폴로지(topology) 측면에서 동일한 도메인으로 이루어진다. (ECD의, 서열 번호 1의) N-말단 도메인은 잔기 1-103에 걸쳐 있으며, C-말단 도메인은 잔기 104-210에 걸쳐 있다. 10H10 에피토프는 ECD의 잔기 K149-D150에 중심을 두고 있는 것으로 밝혀졌으며, 이는 10H10의 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인 사이의 심부 포켓에 도달한다. 10H10과 TF 사이의 경계면은 광범위하며, 모든 6개의 CDR 루프를 포함한다 (도 1).
주목할 만한 발견은 10H10의 TF 에피토프가 FVII 및 FX 결합 부위와 중첩되지 않는다는 것이다 (도 2 및 3). 또한, 10H10 및 5G9의 에피토프 (응고를 차단하는 능력을 갖는 다른 쥐과 인간-TF 결합 항체 및 이의 에피토프는 이전에 문헌[Huang et al. 1998 J Mol Biol 275:873-94]에 공개됨)는 부분적으로 중첩되며, 이는 인간 TF에 대한 이들 두 항체 사이의 경쟁적 결합을 설명한다 (도 2 및 3).
인간 TF ECD:10H10 경계면
10H10은 ECD의 N-말단 도메인과 C-말단 도메인 사이의 경계면에서 TF에 결합한다. TF의 볼록한 표면은 상기 항체의 오목한 CDR 표면에 피팅된다. 복합체 형성시에 묻히는 총 면적은 각각의 상호작용 분자 상에서 1,100 Å2 초과이다. 모든 6개의 CDR은 TF와의 직접적 접촉 (4-Å의 원자간 거리로서 정의되는 접촉)에 연루되어 있다. 통틀어, 24개의 에피토프 잔기 및 25개의 파라토프 잔기가 있다. CDR인 L1, H1 및 H3이 대다수의 접촉을 형성한다. 10H10:TF 복합체의 에피토프 및 파라토프를 형성하는 잔기들이 도 1에 개략적으로 예시되어 있다.
10H10 에피토프는 TF ECD의 C-도메인으로부터의 3개의 절편 및 N-도메인으로부터의 2개의 절편을 포함한다. N-도메인으로부터의 2개의 절편은 상기 항체와 상호작용하며, 즉 잔기 65-70은 H-CDR1 및 H-CDR3과 상호작용하고, 잔기 104는 H-CDR1과 상호작용한다. 상기 C-도메인 내의 3개의 절편은 항체와 상호작용하며, 즉 잔기 195 및 197은 H-CDR1 및 H-CDR2와 상호작용하고, 잔기 171-174는 L-CDR1 및 L-CDR3과 상호작용하며, 잔기 129-150은 L-CDR1, L-CDR3, H-CDR1 및 H-CDR3과 상호작용하고; TF 잔기 K149-D150은 에피토프의 중심에 있으며; 이는 VL 도메인과 VH 도메인 사이에 형성된 심부 포켓에 도달하는데, 여기서, 이들의 일차 파트너는 각각 10H10의 LC 가변 영역 (서열 번호 5)의 D97 및 HC 가변 영역 (서열 번호 4)의 W33이다.
B. 항체 특이성
인간, 사이노몰구스 (사이노) 원숭이 (서열 번호 2) 및 생쥐 TF ECD (서열 번호 3)의 아미노산 서열이 도 2에 정렬되어 있다. 인간 TF ECD 서열과 사이노몰구스 TF ECD 서열 사이에는 높은 유사성이 있으며, 이들 둘은 10H10 접촉 잔기 내에서 단지 하나의 잔기, 즉 서열 번호 1의 위치 197이 상이한데, 이는 사이노 서열에서 R(Arg)이다. 상기 인간 서열에서의 T197은 단일한 H-CDR2 잔기와 접촉하기 때문에, 10H10 유래된 항체의 본 세트에 대하여 보이는 높은 수준의 교차 반응성이 설명가능하다.
인간 및 생쥐 TF 서열의 정렬에 의하면, 10H10의 종 특이성을 결정하는 에피토프 잔기가 명백하였으며, 그 이유는 유의한 아미노산 차이가 에피토프 잔기들에서 나타나기 때문이고, 즉 인간 TF에 있어서 10H10이 접촉하는 24개의 잔기 중, 인간 및 생쥐 서열은 서열 번호 3의 서열과 대비하여 서열 번호 1의 N-도메인 내의 위치 68, 69, 70, 및 104와, C-도메인 내의 위치 136, 142, 145 및 197에서 상이하기 때문이다. 이 차이는 생쥐 TF에 대한 10H10의 결합 친화성의 감소와 일치한다.
또한 도 2는 이론적인 3D 모델 (도 3)을 기초로 한 FVII 및 FX에 대한 인간 TF 상의 상호작용 부위를 나타내는데, 상기 모델은 삼원 복합체로의 그의 회합을 설명한다 (문헌[Norledge et al., Proteins 53:640-648, 2003]). 항체 5G9는 FX 결합 부위와 부분적으로 중첩되는 에피토프에서 TF에 결합한다. 따라서, 5G9는 FX와 경쟁하며, 이는 응고 캐스케이드(cascade)의 차단을 야기한다. 10H10은, 이것이 응고를 차단하지 않는 한편 이것이 TF-회합된 PAR을 통하여 신호전달을 효과적으로 차단한다는 점에서 5G9와 상이하다. 삼원 TF/FVII/FX 복합체의 모델에 기초하면, 10H10 에피토프는 TF의 자유 표면 상에 그리고 잔기 K149-D150 주위를 중심으로 하여 존재할 것으로 예상되었다. 펩티드 에피토프 지도화 및 돌연변이 유발에 의해 지도화된 10H10의 결합은 이것이 그러하다는 초기 증거를 제공하였다.
TF ECD와 10H10 Fab 사이의 복합체의 본 결정 구조는, FVII 및 FX가 TF와 상호작용하는 것 또는 FVII 및 FX가 서로 상호작용하는 것을 방지하지 않고서 상기 항체가 TF에 결합할 수 있는 방식의 공간적 지도화(spatial mapping)를 제공한다. 상기 구조에 의해 나타나는 10H10 에피토프는 TF의 자유 표면을 덮으며, 그 이유는 이것이 이론적으로 삼원 복합체에 존재하기 때문이다. 또한, 10H10 에피토프는 응고 차단 MAb, 5G9의 에피토프에 부분적으로 중첩되며 (상기의 문헌[Huang 1998]), 공통 잔기는 K149 및 N171이다. 10H10 또는 5G9 어느 것도 TF에의 FVII 결합을 차단하지 않는다. FX 및 10H10의 에피토프도 중첩되지 않지만, 현재의 모델에서 FX의 프로테아제 (구형) 도메인과 Fab의 불변 도메인 사이에는 입체적 충돌이 일어난다. 그러나, FX의 배향은 사실은 상기 모델과 상이할 수 있으며, FX와 TF 사이의 회합은 프로테아제 도메인에서의 약간의 유연성을 허용할 수 있음을 주목해야 한다. 또한, 상기 삼원 복합체에의 10H10의 결합시에 충돌이 회피되게 할 수 있는, Fab의 가변 도메인과 불변 도메인 사이의 엘보우 각(elbow angle)에서의 상당한 유연성이 또한 존재한다.
실시예 3: 인간에서 사용하기 위한 결합 도메인의 적응
치료 단백질의 효능은 원하지 않는 면역 반응에 의해 제한될 수 있다. 비-인간 단클론 항체는 선형 아미노산 서열들의 상당한 스트레치들 및 인간에 있어서 면역 응답을 유발할 수 있는 국소적 구조적 입체형태를 가질 수 있다. 인간 항체 스캐폴드에 대한 비-인간 MAb의 표적 결합의 면역특이성의 원인이 되는 잔기들의 이전은 대개 표적 항원에 대한 결합 친화성의 상당한 손실로 이어진다. 따라서, 인간 내에 주입될 때 비-인간 모 분자의 결합 프로파일 및 생물물리학적 프로파일을 유지하면서 최소 면역 반응을 유발하는 항체 분자를 생성하기 위한 타당한 디자인 원리를 사용하는 것이 고도로 가치가 있다.
미국 특허 공개 제20090118127A1호에 이미 기재되고 문헌[Fransson et al. 2010 J Mol Biol 398:214-231]에 예시된 바와 같이, 본 발명의 항체 종이 생성되도록 인간화하고 복구하거나 또는 결합 친화성을 향상시키기 위하여 2단계 공정을 이용하였는데, 본 발명의 항체 종은 인간 TF와 맞물릴 때 쥐과 항체 10H10의 표적 효과를 나타낸다. 인간 프레임워크 적응(human framework adaption; HFA)으로 칭해지는 상기 2단계 공정은 1) 인간 프레임워크 선택 및 2) 친화성 성숙 단계로 이루어진다.
HFA 공정에서, 결합 부위 잔기 (CDR)는 서열 유사성 및 구조적 고려 사항을 기초로 하여 선택된 인간 생식 세포 계열 유전자와 조합시킨다. 항체에 있어서의 CDR 할당의 두 시스템으로는 상체 서열 가변성을 기초로 한 카밧 정의와, 항체의 3차원 구조의 분석을 기초로 한 초티아 정의가 있다. 6개의 CDR 중, 하나의 시스템 또는 다른 시스템이 사용될 수 있으며, 여기서 이들이 분기된다. 경쇄 CDR의 경우에, 카밧 정의를 사용한다.
중쇄 CDR3의 경우, 카밧 정의 및 초티아 정의 둘 모두는 동일하다. 중쇄 CDR1의 경우, 초티아 정의를 이용하여 출발부를 정의하고, 카밧 정의를 말단부로 이용하였다 (W, 이어서 소수성 아미노산, 예를 들어 V, I 또는 A로 정의된 패턴). VH-CDR2의 경우에, 카밧 정의를 이용하였다. 그러나, 대부분의 항체 구조에서, 이러한 서열-기반 정의는 FR3의 일부분을 CDR2에 속하는 것으로 할당한다. 따라서, 이 CDR의 C-말단 영역 상에서 7개의 잔기만큼 더 일찍 끝나는 더 짧은 버전의 이 CDR을 또한 사용할 수 있었으며, 이는 본 명세서에서 카밧-7로 칭하였다.
인간 FR의 선택
항원 결합 부위 내에 포함되지 않는 V 영역들 내의 영역으로서 정의되는 인간 FR을 기능성 인간 생식 세포 계열 IGHV 및 IGHJ 유전자의 레퍼토리로부터 선택하였다. 인간 생식 세포 계열 유전자 서열의 레퍼토리는 IMGT 데이터베이스 (문헌[Lefranc 2005])를 검색하고 모든 "01" 대립유전자를 컴파일링(compiling)함으로써 얻었다. 이 컴필레이션(compilation)으로부터, 중복 유전자(redundant gene) (아미노산 수준에서 100% 동일함) 및 쌍을 형성하지 않은 시스테인 잔기들을 갖는 유전자를 컴필레이션으로부터 제거하였다. 유전자 컴필레이션의 최종 업데이트를 2007년 10월 1일자로 행하였다.
VH의 HFA에 대한 인간 서열의 처음 선택은 H-CDR-1 및 H-CDR-2 뿐만 아니라 FR-1 내지 3도 포함하는 전장의 생쥐 VH 영역에 대한 인간 VH 생식 세포 계열 유전자의 서열 유사성을 기초로 하였다. 다음 단계에서, 선택된 인간 서열들은 CDR의 길이와, 생쥐 CDR 서열과 인간 CDR 서열 사이의 서열 유사성 둘 모두를 고려하는 스코어를 이용하여 순위를 매겼다. 표준 돌연변이 매트릭스, 예를 들어 BLOSUM 62 치환 매트릭스 (문헌[Henikoff and Henikoff 1992 Proc Natl Acad Sci U S A 15;89(22):10915-9])를 생쥐 CDR 서열 및 인간 CDR 서열의 정렬의 스코어링에 사용하였으며, CDR 루프 내에 삽입 및/또는 결실이 있을 경우 큰 페널티를 적용하였다. 인간 FR-4는 IGHJ 생식 세포 계열 유전자 (문헌[Lefranc 2005])와 생쥐 10H10 서열, IGHJ4 (서열 번호 60)의 서열 유사성을 기초로 하여 선택하였다.
유사한 절차를 VL을 위한 인간 FR의 선택에 사용하였다. 이 경우, IGHV 유전자에 대하여 사용한 것과 동일한 절차를 이용하여 선택한 생식 세포 계열 유전자인 IGVK가 FR 1-3 및 L-CDR 1 - 3의 선택에 있어서의 유전자로서의 역할을 하였다. 모든 변이체에 있어서 인간 IGJ-K2 유전자 (서열 번호 61)를 FR4로 선택하였다.
11개의 VH 생식 세포 계열 사슬 및 7개의 VL 생식 세포 계열 사슬을 선택하였다. 선택한 VH 유전자는 주로 IGVH-1 유전자 패밀리로부터의 것이었으며, 즉 6개의 서열은 IGVH1로부터의 것이고 (이때 IGVH1-69 및 IGVH1-f를 더 긴 그리고 더 짧은 H-CDR2에서 사용함), 2개는 IGVH3으로부터의 것이고, 하나는 IGVH5 유전자로부터의 것이었다 (긴 H-CDR2 및 짧은 H-CDR2 둘 모두에서 사용함). VL 유전자는 IGVK2 유전자 패밀리 중 6가지 및 IGVK4 유전자 패밀리 중 1가지를 나타냈다.
따라서, 더욱 긴 H-CDR2 (서열 번호 7)를 갖는 VH 변이체 H15, H19 및 H21은 각각 H22, H23 및 H24에 상응하며, 여기서, 더욱 짧은 생쥐 CDR-H2 (서열 번호 27)를 사용하였다. 접두어 "s"는 베타 가닥 영역 내에 더 많은 인간 잔기 및 더 적은 생쥐 잔기를 갖는 시험 변이체를 나타낸다. 사용한 V-영역 표기 및 사용한 유전자 서열을 하기 표 2 및 표 3에 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00017
[표 3]
Figure pct00018
11가지의 중쇄 및 7가지의 경쇄 인간 FR 변이체 + 쥐과 10H10의 키메라 사슬을 나타내는 96가지의 Mab의 라이브러리를 96웰 포맷에서 HEK 293E 세포에서 발현시켜 일차 스크린을 위한 상청액을 제공하였다. 일차 스크리닝에 있어서, 표준 재조합 방법을 이용하여, 선택된 가변 도메인을 코딩하는 DNA를 재조합하여 완전 MAb를 형성하였으며, 상기 MAb를 96웰 플레이트에서 HEK 293E 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 상기 배양물로부터의 상청액을 트랜스펙션한지 96시간 후 활성(결합)에 대하여 시험하였다.
19가지의 변이체를, 일차 스크린의 결과를 기초로 한 정제 및 HEK 293-F 세포에서의 파일럿 규모 발현용으로 선발하였다. 파일럿 규모 발현을 HEK 293F 세포 또는 CHO-S에서 750 ml의 부피로 일시적으로 행하였다. 수확한 상청액들을 단백질 A 크로마토그래피를 통하여 정제하고, 정제된 단백질들을 그의 친화성 및 기능적 활성에 대하여 평가하였다. 게다가, 정제된 단백질들은 SDS-PAGE, SE-HPLC, 및 교차 상호작용 크로마토그래피에 의해 생물물리학적으로 특성화하였다. 이론적 등전점(pI)을 각각의 변이체에 대하여 또한 계산하였다. 파일럿 규모의 특성화로부터, 최종 선두 후보들의 세트를 WAVE 생물반응기에서 트랜스펙션시키고, 단백질 A 크로마토그래피를 통하여 정제하였다.
결합성 평가
모 키메라 항체, M1, 및 HFA 변이체의 인간 TF 및 사이노 TF 둘 모두에의 결합을 화학발광 검출을 이용하여 직접적 ELISA 포맷으로 수행하였다. 조 상청액에서의 라이브러리 변이체의 일차 스크리닝에 있어서, 샘플 또는 대조군을 사용 프리스타일(FreeStyle) 293 HEK 배지 (깁코)에서 50 ng/ml에 대하여 정규화하고, 단일 농도 결정으로 분석하였다. 본 분석에서, 항체의 농도는 5 ng (0.1 ml 사용)이었으며, TF ECD 및 항원은 10 ng/웰의 최종 농도로 사용한 His6-TF-ECD1-219였다.
전체 조합 라이브러리의 스크리닝 결과는, H14를 제외하고는 모든 다른 VH가 다양한 강도로 hTF에 결합함을 보여주었다. 모 10H10보다 더 높은 결합 시그널을 제공한 몇몇 HFA 변이체 (H13, L1), 특히 일부 L3과 L5의 조합이 있다. H18 및 H21은 인간 항원과, 다른 VH에 결합하지 않으며, 사이노 항원에 대해서는 사소한 결합성을 나타냈다. VL들 중에서, L6 및 L8은 어느 항원에도 결합하지 않은 반면, 다른 것들은 검출가능한 수준으로 결합하였다. H14 및 L8은 또한 임의의 VL과 조합될 때 낮은 발현을 생성하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 77가지의 항체 (VH, VL 조합) 중 50가지가 TF 결합을 보여 주었다.
[표 4]
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
ELISA를 사용한 TF에 대한 상대적인 결합 친화성을 기초로 하여, 10가지의 변이체를 발현 및 정제의 스케일업(scale up)용으로 선발하였다. 비아코어에 의해 측정한 KD, ELISA 분석 데이터, 전 세포 결합, 2 ug/ml Mab에 의한 50 nM FVIIa에 의한 MDA-MB231 세포로부터의 IL-8 유도의 저해, 및 서모플루오르 분석에 의해 측정한 Tm의 요약을 표 5에 나타낸다.
[표 5]
Figure pct00023
새로운 인간 MAb 변이체들 중 몇몇은 TF에 대하여 M1 (10H10 가변 사슬, 즉 H13 및 L1을 가짐)보다 더 높은 친화성을 나타냈으며, 일부는 더 낮았다. M61에 있어서의 KD (0.21 nM)는 쥐과 모 MAb (KD = 0.56 nM)의 것보다 2.5배 더 낮았다. 표 5의 데이터는 H15를 포함하는 4가지의 Mab 및 H22를 포함하는 4가지를 포함하는데, 이들 둘 모두는 동일한 생식 세포 계열 유전자 (IGHV5-a)로부터 제작한다. H22를 포함하는 것, 및 더 짧은 H-CDR2는 일반적으로 H15를 포함하는 상응하는 분자보다 더 높은 결합 친화성을 나타냈다. 새로운 변이체들 중 다수가 사이노 TF에 결합하는 한편, 사이노 결합 친화성의 순위는 인간 TF에의 결합에 대한 것과 상이하였다.
생쥐 10H10 MAb의 Tm은 74.2℃였다. 선택된 분자의 Tm은 75 내지 82.2℃의 Tm의 범위였다. 따라서, HFA 과정은 인간 및 비인간 영장류 TF에 대한 결합 친화성이 증가된 새로운 Fd 영역을 갖는 항체 제작물의 생성으로 이어졌으며, 또한 인간 도메인을 갖는 안정한 완전 항체 변이체를 생성하였다.
새로운 항체 제작물의 추가의 특성화에 의하면, 본 항체는 인간 종양 조직에서 기원하는 세포(MDA-MB231 유방암 유래 세포) 상의 천연 TF를 인식할 수 있으며, MDA-MB231로부터의 IL-8의 유도의 억제에 의해 측정되는 바와 같이 VIIa의 존재 하에서 TF 신호전달을 감소시켰음이 입증되었다.
추가의 생물물리학적 특성화 (용해도 및 교차 상호작용 크로마토그래피) 및 분석 결과에 의해 친화성 성숙을 위하여 가변 영역 H22 및 L3으로 이루어진 M59를 선발하였다.
실시예 4: 항체 성숙
Fab 라이브러리는, 제한 효소 부위를 약간 변형시킨, 미국 특허 제6,472,147호 (스크립스(Scripps)) 및 국제특허 공개 WO2009/085462호로 공개된 본 출원인의 공계류 중인 출원에 기재된 pIX 파지 디스플레이 시스템에서 제작하였다.
hTF와의 복합체 형태의 10H10의 실험적 구조를 기초로 하여, H116 (서열 번호 19) 및 L3 (서열 번호 23)이 쌍을 형성한 M59에서 시작하여 2가지의 라이브러리를 디자인하였으며, 이는 VL 및 VH 둘 모두의 다양화를 위한 것이었다. 상기 라이브러리들은 표적화 위치들을 다양화하는 데 사용되는 아미노산에서 뿐만 아니라 다양화를 위하여 표적화된 위치 면에서도 상이하였다. 하나의 라이브러리에서는, 이전에는 TF와 접촉하는 것으로 나타난, 각각의 CDR을 나타내는 위치들 중 총 8개의 위치를 다양화하였다. 상기 디자인에서, L1, L3, H1 및 H2가 강조되었다. L2와 접촉하는 위치들도 다양화하지 않았고 H3 내의 대부분의 위치도 다양화하지 않았다. 불안정한 아미노산 또는 반응성 아미노산, 예를 들어 Cys 및 Met를 회피하였다.
결합된 그리고 비결합된 Fab 결정 구조의 용매 접근성을 컴퓨터로 계산함으로써 결정된 항원 결합 부위의 주변부에서 아미노산이 다양화되도록 제2 세트의 라이브러리를 디자인하였다. 결합시에 묻히지만 용매 분자와 또한 접촉하는 잔기들을 다양화에 대하여 표적화하였다. 총 12개의 잔기 (VL 내의 6개 및 VH 내의 6개)를 이 방법을 이용하여 확인하였으며, 이들은 하기를 포함하는 감소된 8개 아미노산 세트로 다양화되었다: Arg(R ), Asn(N), Asp(D), Gly(G), His(H), Ser(S), Trp(W), 및 Tyr(Y). 조합된 라이브러리의 크기는 812 또는 1010가지의 변이체로 개산되었으며, 이는 표준 라이브러리 제한효소 클로닝 기술을 이용하여 커버될 수 있다.
CDR 접촉 잔기 라이브러리에 있어서, 뉴클레오티드 이량체 (N-이량체) 합성 접근법을 이용하여 15개의 아미노산 (Met, Cys, Lys, Gln, 및 Glu를 제외한 모든 것)을 이용하여 위치들을 다양화하였다.
파지 코트 단백질 IX 상에서 디스플레이된 Fab 라이브러리를 본 기술 분야에 공지된 패닝 방법에 따라 바이오티닐화 hT-ECD에 대하여 패닝하거나, 더욱 느린 오프-속도 (오프-속도 값의 증가) 또는 더욱 빠른 온-속도 (온-속도 값의 감소)를 선택함으로써 친화성이 증가되게 하거나 또는 이들 둘 모두를 사용하였다. 패닝에서는 인간 TF 및 사이노 TF 둘 모두를 표적 항원으로서 사용하였다. 파지를 헬퍼 파지 감염에 의해 생성하였다. 바인더를 SA-비드의 첨가에 의해 회수하여 비드/항원/파지 복합체를 형성하였다. 최종 세척 후, 파지를 기하급수적으로 성장 중인 TG-1 에스케리키아 콜라이 세포의 감염에 의해 레스큐하였다(rescued). 파지를 다시 생성하고, 추가의 라운드의 패닝을 가하였다.
pIX 유전자를 선발된 클론으로부터 NheI/SpeI 절단에 의해 잘라내고, 재라이게이션 후, DNA로 TG-1 세포를 형질전환시키고, LB/한천 플레이트에서 하룻밤 성장시켰다. 하룻밤 배양물을 (i) 콜로니 PCR 및 V-영역의 서열결정, 및 (ii) 용해성 Fab 생성에 사용하였다. 용해성 Fab 단백질을 다클론 항-Fd(CH1) 항체에 의해 플레이트 상에 포획하였다. 적절한 세척 및 차단 후, 바이오티닐화 hTF를 0.2 nM 농도로 첨가하고, 바이오티닐화 hTF를 HRP-콘쥬게이션된 스트렙타비딘에 의해 검출하고, 화학발광을 이전과 같이 판독하였다. hTF의 이 농도에서, 모 Fab의 결합성의 퍼센트로서 정의되는 Fab 변이체들의 순위 매김이 가능하며, 여기서, 모든 플레이트에서 대조군으로서 존재하는 모 Fab는 100% 결합으로서 정의된다.
이 기준에 의해, M59 Fab에 비하여 100% 이상으로 인간 TF에 결합하는 381가지의 Fab를 선발하였다.
선발된 클론들의 분석에 의하면, V-영역 (서열 번호 4 또는 19)의 위치 27 및 30-32에 상응하는 중쇄 CDR1 (서열 번호 6)의 Y2, I5, T6 및 Y7에서의 소정의 변화는 성공적인 것으로 나타났다. 접촉 잔기가 아니기는 하지만, 위치 27만이 방향족 아미노산 (Tyr 및 Phe)을 허용하였다. 10H10 Fab (도 1)에 있어서 인간 TF (서열 번호 1)의 K68, T101, Y103 및 L104와 직접적으로 접촉하는 위치 30-32에 있어서, 위치 30은 상대적으로 허용성이었지만, 31 및 32는 제한되었다 (표 6).
10H10 Fab (도 1)에 있어서 인간 TF (서열 번호 1)의 P194, S195, 및 T197과 직접적으로 접촉하는 잔기들인, 서열 번호 4 또는 19의 위치 L52, S55 및 S57에 상응하는 L3, S6 및 S8 (서열 번호 7)에 있어서의 L-CDR2 변화에 있어서, 다소 제한된 치환 세트가 허용되었다.
H-CDR3에서, 인간 TF-ED (서열 번호 1)의 F147, G148 및 K149와 직접적으로 접촉하는, 서열 번호 4 또는 19의 N104에 상응하는 N6 위치 (서열 번호 8)는 제한되는 것으로 나타났다.
0.2 nM 인간 TF-ECD1-219를 사용한 고체상 포획 분석에서 비견되는 결합 친화성에 대한 파지 패닝 및 스크리닝에 의해 선택된 라이브러리 위치들 각각에서의 허용되는 아미노산 변화를 표 6에 나타낸다.
[표 6]
Figure pct00024
선발된 클론에서의 VL에 있어서, 인간 TF (서열 번호 1) (도 1)의 E174, D129, S142, R144 및 D145에 접촉하는 것으로 에피토프 지도화에 의해 밝혀진 LC 가변 영역 (서열 번호 5 또는 23)의 위치 32, 33, 34 및 36에 상응하는 L-CDR1 (서열 번호 9)의 S9, G10, N11 및 K13의 변화는 표 7에서 상대적으로 허용되는 것으로 나타낸다. L-CDR2에 있어서, 서열 번호 5 또는 23의 위치 56, 잔기 W1 (카밧 잔기 번호 50)이 접촉 잔기인 반면, 잔기 E61은 치환에 대하여 제한된 내성을 나타냈다. 인간 TF (서열 번호 1) (도 1)의 K149, D150, N171 및 T172와 직접적으로 접촉하는 서열 번호 5 또는 23의 잔기 위치 97-100에 상응하는 경쇄 CDR3 (서열 번호 9)에 있어서, 위치 D97 (카밧 위치 91)이 제한되었다. 인간 TF-ECD1-219 클론 (허용 아미노산 사용)에 대한 친화성 결합을 기초로 한 선발이 표 7에 요약되어 있다.
[표 7]
Figure pct00025
요약하면, 친화성 향상된 일련의 Fab 변이체들을, 가변 도메인 H22 (서열 번호 19) 및 L3 (서열 번호 23)에 있어서 항원 인간 TF와의 접촉 위치 내의 CDR 아미노산 위치의 유도된 다양성을 기초로 한 파지 라이브러리의 제작을 통하여 확인하였으며, 이어서 출발 서열에 비하여 비견되는 또는 더욱 우수한 결합성의 스크리닝 분석에서 친화성을 갖는 종을 패닝하고 선발하였다.
종합적으로, 디자인된 HFA 라이브러리로부터 선발된 VH 및 VL 쌍에 있어서 친화성의 중간 정도의 증가를 얻었다. 그러나, 엄격한 파지 패닝 후 접촉 잔기들이 다양화된 VH 라이브러리로부터 모 아미노산을 재선발하였다. 단지 2개의 파라토프 위치가 유의하게 변화되었으며, 이는 구조 분석에 의해 설명되는 바와 같았다. 친화성 성숙 동안 CDR 내에 도입된 이들 두 아미노산 대체, T31P 및 S57F는 접촉 잔기를 포함한다. 5배 친화성 향상은 TF의 S195와 접촉하는 F57의 증가된 경계면에 기인할 수 있다. VL과 TF의 상호작용은 가식적인 것으로 보이며, 이는 이웃 잔기 뿐만 아니라 접촉 잔기에 대하여 많은 변화를 허용하게 된다.
381가지의 VH와 VL의 쌍 중, 43가지를 추가의 특성화용으로 선택하였다. 선택된 43가지의 MAb는 27가지의 상이한 VH 및 8가지의 VL을 나타냈으며 (중쇄 서열과 경쇄 서열의 쌍에 대해서는 표 8을 참조), 3가지의 하위 군으로 분류할 수 있었는데, 즉 1군은 동일한 경쇄 (L3, 서열 번호 23)를 가지며, 2군 및 3군은 8가지의 경쇄가 2가지의 상이한 중쇄 (H116 및 H171, 각각 서열 번호 131 및 67)와 쌍을 형성한 것으로 나타내어진다.
[표 8]
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
M59로서 동일 경쇄 (L3, 서열 번호 23)를 갖는 27가지의 항체의 군 중, 27가지의 중쇄는 H-CDR1 (GYTFX1X2X3WIE (서열 번호 83); 여기서, X1은 A, D, G, I, L, N, P, R, S, T, V, Y로부터 선택되며, X2는 A, P, S, 및 T로부터 선택되고, X3은 F, H 및 Y로부터 선택되며, H189에서 H-CDR1이 GFTFITYWIA (서열 번호 81)인 경우는 제외됨)됨)에서 3개의 위치에서 상이하며; H-CDR2 (DIX1PGX2GX3TX4 (서열 번호 107); 여기서, X1은 I 및 L로부터 선택되며, X2는 S 및 T로부터 선택되고, X3은 A, F, H 및 w로부터 선택되며, X4는 D, H, I, L 및 N으로부터 선택되고; H189에서 H-CDR2가 DILPASSSTN (서열 번호 105)인 경우는 제외됨)에서 4개의 위치에서 상이한 반면, H-CDR3 및 FR들은 H22 서열 (서열 번호 19)로부터 변경되지 않았고 SGYYGNSGFAY (서열 번호 8)이다. 이들 27가지의 Mab에 있어서의 중쇄의 독특한 조성이 하기에 주어져 있다 (표 9).
[표 9]
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
H171 (서열 번호 139)은 H116과 비교하여 H-CDR1 및 H-CDR2 내에 추가의 변화를 포함하며, 이는 I31A 및 S55T이다.
Mab의 두 군은 8가지의 LC (표 10)가 2가지의 상이한 HC, 즉 H22 (서열 번호 19) 또는 중쇄 H171 (서열 번호 139) 중 하나와 쌍을 형성한 것으로 나타낸다. 8가지의 경쇄 전부는 L3 (IGKV240_O1로부터 유래됨)의 FR을 가지며, L-CDR1 (KSSQSLLX1X2X3X4QX5NYLT (서열 번호 116) (여기서, X1은 F, P, S, T, W 및 Y로부터 선택되며; X2는 F, S, T, R 및 V로부터 선택되고; X3은 A, G, P, S, W, Y 및 V로부터 선택되며; X4는 G, N 및 T로부터 선택되고; X5는 K, R 및 S로부터 선택됨)에서 5개의 위치에서, L-CDR 2 (X1ASTRX2S (서열 번호 120) (여기서, X1은 H 및 W로부터 선택되며; X2는 D, E 및 S로부터 선택됨)에서 2개의 위치에서 그리고 L-CDR3 (QNDX1X2X3PX4T (서열 번호 128) (여기서, X1은 D, F 및 L로부터 선택되며; X2는 S, T 및 Y로부터 선택되고; X3은 W 및 Y로부터 선택되고; X4는 L 및 M으로부터 선택됨)에서 4개의 위치에서 서열 변화를 갖는다. 8가지의 LC의 조성을 표 10에 나타낸다.
[표 10]
Figure pct00033
Figure pct00034
이들 Mab 중 일부를 추가로 특성화하고, 생체 내 이종 이식 모델에서 시험하였다 (실시예 5).
실시예 5: Mab의 특성화
일부 CDR 잔기에 있어서 변경된 잔기를 갖는, 단일 LC 가변 영역 (L3, 서열 번호 23) 및 단일 HC 가변 영역 (H22, 서열 번호 19)을 포함하는 M59를 기반으로 한 변이체들의 라이브러리의 인간 프레임워크 적응 및 재선발 후, 신규한 Mab는 생물물리학적 분석 및 생물활성 분석을 가하였으며, 파라토프 잔기들이 변경된 하나의 쌍, M1587을 사용하여, 원래 TF-ECD에의 10H10 Fab 결합에 대하여 특성화된 에피토프 (실시예 2)가 변경되었는지를 재조사하였다.
인간 TF ECD: M1587 경계면
16% PEG 3350, 0.2 M 아세트산암모늄, 0.1 M 아세트산나트륨을 함유하는 용액 (pH 4.5)으로부터 M1587-Fab:TF 복합체를 결정화한 것을 제외하고는 10H10 (실시예 3)에 대한 것과 동일한 방식으로, 10H10 CDR을 기반으로 하는 인간 적응된 그리고 친화성 성숙된 항체, M1587 (L3 및 H116)과 TF ECD의 공결정화를 수행하였다.
인간 TF ECD와 친화성 성숙형 M1587 Fab의 공결정 구조의 비교는, 인간 적응된 그리고 친화성 성숙된 10H10은 도 2에 나타낸 바와 같이 항체 에피토프 풋프린트(footprint)를 변화시키지도 않았고, CDR의 입체형태도 변경되지 않았음을 나타낸다. 인간 프레임워크 적응 및 친화성 성숙 동안 3개의 아미노산 대체 (T31P, S57F, 및 N59T)를 H-CDR1 및 H-CDR2 (각각 서열 번호 6 및 27, 실시예 2에서 설명한 CDR 정의를 이용) 내에 도입하였으며 (서열 번호 6 및 7의 서열을 서열 번호 63 및 86의 서열로 대체함), 이는 H116 (서열 번호 133)의 잔기 31 및 57에서의 접촉 잔기를 포함하는데, 이들은 T31P 및 S57F이다. TF의 S195와 접촉하는 F57의 증가된 경계면에 기인할 수 있는 5배의 친화성 향상이 있었다. M1587 Fab를 포함하는 인간 TF ECD의 구조는, H-CDR1 및 H-CDR2 파라토프 잔기에서 변화가 이루어졌음에도 불구하고, HFA 및 친화성 성숙 동안 에피토프의 보존을 확인해 주었다.
생물물리학적 및 생물학적 분석의 결과
이들 항체에 대한 요약 데이터를, 비아코어에 의한 KD 분석 (표 11), 인간 TF에 의한 인간 혈장의 응고 시간 (표 12), 및 FVIIa에 의해 촉진되는, MD-MB-231 세포로부터의 IL-8 방출에 대한 EC50 (표 13, 14, 및 도 5)에 대하여 하기에 나타낸다.
43가지의 선발된 친화성 성숙형 Mab에 대한 KD를, 10H10으로부터의 비변형 CDR (M의 수: 100 미만)을 갖는 선택된 인간 프레임워크 적응형 변이체를 포함하는 MAb의 키메라 버전 (M1) 및 쥐과 10H10에 대하여 생성한 데이터를 포함하여 표 11에 나타낸다. 따라서, 인간 프레임워크 선택 및 CDR 잔기 치환의 조합은 KD가 80 내지 950 pM의 범위인 인간 항체를 생성하였으며, 이때 오프-속도(Koff)는 2.2×10-5 sec-1 내지 2.6×10-3 sec-1이었고 ; 온-속도 (Kon)는 104 M-1sec-1 내지 2.3×105 M-1sec-1의 범위였다. 원래의 쥐과 10H10 또는 키메라 제작물에 있어서의 값을 비교하면, 신규한 Mab는 평형 해리 상수(KD)가 0.77 nM로부터 0.08 nM로 최대 10배 더 낮으며; 더욱 빠른 온-속도(Kon >105 M-1sec-1)를 디스플레이하거나 또는 더욱 느린 오프-속도(Koff = 105 sec-1)를 갖는다. 이들 특성은 체류 시간 또는 조직에 침투하는 능력 중 어느 하나가 요구되는 특정 응용을 위하여 MAb를 선발함에 있어서 유리하도록 이용할 수 있다.
[표 11]
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
응고
칼슘 및 외부에서 첨가된 인간 TF의 존재 하에 시험관 내에서 측정할 때 인간 혈장의 응고를 차단하지 않고서 인간 TF에 결합하는 능력에 의해 신규한 Mab를 특성화한다 (표 12). 17가지의 HFA (M의 수: 100 미만) 변이체 및 38가지의 친화성 성숙형 변이체 (M1583 이상)를 분석하였으며, T½ Max (최대 광학 밀도의 50%에 도달하는 초 단위의 시간)를 기록하였다.
이들 전부는 10H10 (표 12)에서 관찰된 것과 유사한 응답을 보여 주며, 이때 T½ Max 값은 205초 미만인데, 이는 이들 항체가 159 ± 17 (n=14)이었던, 항체를 포함하지 않는 비히클 대조군과 비교할 때 응고 시간을 연장시키지 않음을 나타내는 것이다. TF에의 FX의 결합을 차단하는 쥐과 항체 5G9로부터 유래되고 이전에 기재된 (미국 특허 제7605235 B2호) 인간 TF 결합 항체인 CNTO860은 동일한 분석에서 응혈을 지연시키며, 1800초 이내에는 결코 응고에 도달하지 않는다. 변경된 CDR을 갖는 것으로 실시예 4에 기재된 43가지의 MAb 중 5가지는 응고 분석에서 시험하지 않았으며, 그 이유는 이들이 2 mg/ml 미만의 출발 농도를 갖기 때문이다. M1, M59 및 CNTO860의 값들을 다수의 시험에 걸쳐 평균하였다.
[표 12]
Figure pct00039
시그널 차단 활성
신규한 MAb들을 TF/FVIIa 복합체를 통하여 신호전달을 차단하는 그들의 능력 면에서 또한 설명할 수 있다. 유방암 세포의 TF/VIIa/PAR2 신호전달은 넓은 레퍼토리의 혈관 신생 촉진(proangiogenic) 인자, 예를 들어 VEGF25, Cyr61, VEGF-C, CTGF, CXCL1, 및 IL-8을 유도한다. FVIIa는 TF를 발현하는 인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231???에서 검출가능한 IL-8을 유도함이 이전에 보고되었다 (문헌[Albrektsen et al., J Thromb Haemost 5: 1588-1597, 2007]). 따라서, 이 분석법을 생물학적 분석법으로 이용하여 변이체형 항체가 IL-8 생성의 TF/VIIa 유도를 저해하는 능력을 평가하였다.
이 분석에 대한 상세 사항은 본 명세서에 상기에 주어져 있으며, 실시예 3의 HFA (M10 - M68) 변이체들 중 19가지 및 실시예 4의 CDR 변이체들 중 29가지의 시험 결과는 TF의 단일 농도 (0.5 마이크로그램/ml)에서 IL-8 생성을 저해하는 능력에 대하여 시험한 것이었다. 조직 인자에 결합하지 않는 항-RSV 항체 (B37)를 음성 대조군으로 사용하였다. 이 농도에서, 많은 HFA Mab가 67% 초과만큼 IL-8 유도를 차단할 수 있었다 (표 13). 도 5는 10H10의 것들 (각각 서열 번호 6 및 7)과 비교하여 H-CDR1 또는 H-CDR2에서 치환을 가지며 L3 경쇄 (서열 번호 23)를 공유하는 MAb들 중 27가지에 의한 IL8-방출의 상대적인 저해를 나타낸다. 게다가, 이들 중 4가지, 즉 M1584, M1611, TF7M1612 및 TF7M1607은 M과 함께 전체 적정식(full titration) IL-8 유도 분석에 두었다. 계산된 상대적인 IC50 값들은 친화성 개선된 변이체들이 10H10의 생쥐-인간 키메라인 M1과 비교하여 더욱 효능이 강하다는 관찰을 추가로 지지한다 (표 14). 실시예 4에서 설명한 친화성 성숙형 항체들의 다른 친화성 성숙 군은 유사한 결과를 생성하였다.
[표 13]
Figure pct00040
Figure pct00041
[표 14]
Figure pct00042
실시예 6: 항체의 항종양 활성
MDA-MB-231을 포함하는 생쥐 이종 이식 모델
MDA-MB-231 인간 유방암 세포를, 10% FBS 및 1% LNN을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하고, 트립신 처리에 의해 로그기에서 수확하고, 살균 무혈청 DMEM 배지에서 5 × 107개의 세포/mL로 재현탁하였다. 20마리의 암컷 SCID 베이지(Beige) (C.B-17/IcrCrl-scid-bgBR) 생쥐를 찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories)로부터 획득하고, 14일 동안 순응시킨 후 실험하였다. 대략 8주령에서, 생쥐는 우측 겨드랑이 유선 지방 패드 내에 2.5×106개의 MDA-MB-231 세포를 이식하였다. 종양의 크기가 대략 100 ㎣가 되었을 때, 생쥐를 종양 크기에 의해 처리군으로 계층화하였다 (군당 N=10). 체중 1 kg당 10 mg의 M1593 또는 둘베코 인산염 완충 염수(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline; DPBS)를 이용한 복강내 처리를 계층화한 날에 시작하였으며, 총 6회의 투약 동안 매주 1회 계속하였다. 종양 및 체중을 매주 1회 기록하였다. 각각의 군의 평균 종양 부피가 1500 ㎣에 도달했을 때 연구를 종료하였다. 적용한 통계적 검정법은 이원 변량 반복 측정 분석(two-way repeated measure) ANOVA (프리즘(PRIZM) 4.0, 그래프패드(GraphPad))였다.
MDA-MB-231 이종 이식 모델에서, M1593은 22일에 시작하여 (* P < 0.01) 그리고 29일까지 계속하여 (** P < 0.001) 종양 성장을 유의하게 저해하였는데, 29일의 시점에서 대조군(DPBS 처리군)을 안락사시켰다. M1593 처리군을 36일에 안락사시켰다. M1593은 29일에 종양 성장을 대략 49%만큼 저해하였다. DPBS 처리 대조군에 비하여, M1593 처리군에서 대략 11일의 종양 성장 지연이 있었다 (도 6).
A431을 포함하는 생쥐 이종 이식 모델
A431 인간 편평 세포 암종 세포를 10% FBS 및 1% LNN을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하고, 트립신 처리에 의해 로그기에서 수확하고, 살균 HBSS에서 1 × 107개의 세포/mL로 재현탁하였다. 20마리의 암컷 SCID 베이지 (C.B-17/IcrCrl-scid-bgBR) 생쥐를 찰스 리버 래보러토리즈로부터 획득하고, 14일 동안 순응시킨 후 실험하였다. 대략 8주령에서, 생쥐는 우측 옆구리 내에 2 × 106개의 A431 세포를 이식하였다. 종양의 크기가 대략 118 ㎣가 되었을 때, 생쥐를 종양 크기에 의해 처리군으로 계층화하였다 (군당 N=10). 체중 1 kg당 10 mg의 M1593 또는 DPBS를 이용한 복강내 처리를 계층화한 날에 시작하였으며, 총 6회의 투약 동안 매주 1회 계속하였다. 종양 및 체중을 매주 2회 기록하였다. 각각의 군의 평균 종양 부피가 1000 ㎣에 도달했을 때 연구를 종료하였다. 적용한 통계적 검정법은 이원 변량 반복 측정 분석 ANOVA (프리즘 4.0, 그래프패드)였다.
M1593은 22일에 종양 성장을 유의하게 저해하였으며 (*P = 0.0067), 이 시점에서 대조군 (DPBS 처리군)을 안락사시켰다. CNTO592 처리군을 39일에 안락사시켰다. CNTO592는 22일에 종양 성장을 대략 54%만큼 저해하였다. DPBS 처리 대조군에 비하여, M1593 처리군에서 대략 17일의 종양 성장 지연이 있었다 (도 7).
실시예 7: F C 가 변경된 항체 조성물
천연 발생 인간 Fc 수용체 변이체는 인간 항체의 Fc-부분에 대하여 사실상 상이한 친화성을 갖는다. 게다가, 임상 연구에 의하면, Fc-엔지니어링된 mAb를 이용한 처리 후 단단히 결합하는 Fc의 유전자형을 갖는 환자에 있어서 개선된 응답 속도 및 생존성이 입증되었다 (문헌[Musolino et al 2008 J Clin Oncol 26:1789-1796 (2008)]; 문헌[Bibeau et al 2009 J Clin Oncol 27:1122-1129]).
TF 신호전달의 저해는 종양 증식, 이동 및 전이성 확산에 이르게 되는 세포 응답을 감소시킬 것으로 예상되지만, TF 항원이 종양 세포 상에서 디스플레이된다는 사실은 항체 Fc에 의한 Fc-수용체 맞물림에 관련된 기작에 의한 표적 세포의 선택적 사멸 수단을 제공한다. 항체의 Fc-도메인의 표면 특징은 중쇄의 일차 서열 뿐만 아니라 글리칸 조성에 의해서도 영향을 받는 것으로 공지되어 있으며, 이들 중 하나 또는 이들 둘 모두의 변형은 Fc-수용체 결합을 변경시킬 수 있다.
M1593으로 확인된 MAb는 저 푸코스 글리칸-변형 IgG1로서 그리고 또한 IgG1-CH2 도메인 변이체로서 생성되었다(S239D, I332E; 여기서, 넘버링은 카밧 EU 시스템의 것임).
MAb 조성물 및 제조 방법
저 푸코스 함량을 갖는 항체 (M1593-LF)는 시그널 펩티드를 포함하는 하기에 나타낸 M1593 (IgG1/카파) 사슬을 코딩하는 벡터를, 단백질의 낮은 푸코실화에 대하여 CHO 숙주 세포주로부터 선택된 CHO 숙주 세포 하위 주 내로 전기천공시킴으로써 생성하였다. 서열 번호 165의 서열은 가변 도메인, 잔기 1 - 113 (서열 번호 23 + FR4, 서열 번호 61, 밑줄이 그어짐) 및 인간 카파 불변 경쇄 도메인을 포함하는 전 경쇄를 나타낸다. 중쇄는 야생형 인간 IgG 아이소타입1 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 가변 도메인 잔기 1 - 120 (이는 서열 번호 139의 서열 및 FR4 (서열 번호 60)를 포함함, 밑줄이 그어짐)을 포함하며, 여기서 카밧 위치 239 및 332 (이는 서열 번호 167의 242 및 335임)는 야생형 잔기 S 및 D로부터 각각 D 및 E로 변형되어 변이체 M1593-DE를 형성한다.
M1593-경쇄
Figure pct00043
M1593 - 카밧 위치 S239가 D이며, I332가 E인 중쇄
Figure pct00044
4라운드의 렉틴 음성 선발 (푸코스 결합 렉틴에 대한 비결합의 선발) 후 서브클로닝하고 FACS 분류하여 천연 발생 저 푸코스 세포의 풀을 단리하여 이를 숙주 세포주로 사용함으로써 CHO 세포를 생성하였다. 이 주는 M1593의 생성에 사용한 것과 동일한 숙주 세포로부터 유래되었으며, 따라서 상기 세포를 정확하게 동일한 방식으로 배양하고 취급한다. 트랜스펙션된 세포는 검출을 위하여 단백질 G를 이용하여 메틸셀룰로오스 플레이팅에 의해 스크리닝하고, 콜로니를 골라 96웰 플레이트 내에 넣었다. 배양물을 적정을 위하여 진탕 플라스크로 확장시켰다. 배치식 진탕 플라스크 배양에서, 최고 모 클론들은 (표준 배지에서) M1593-LF를 최대 708 mg/L까지 생성하였다.
LC-MS 글리코페비드 지도화를 2가지의 M1593-LF 생성 클론(C2452B 및 C2452D)에서 수행하여 푸코실화 퍼센트를 결정하고, 시간이 지남에 따른 글리코실화 프로파일의 안정성 및 생성 공정을 평가하였다 (표 15 ). 계대 1의 유가식 배양물 및 계대 10의 배치식 배양물로부터의 안정성 연구 동안 샘플들을 수집하고, 정제하였다. 생물반응기 평가에 의해 정제 샘플들을 또한 분석하였다. 글리코펩티드 지도화에 의하면, C2452B 및 C2452D로부터의 총 푸코실화 퍼센트가 낮은 유리한 글리코실화 패턴이 나타났다. 중요하게는, 푸코실화 퍼센트는 시간이 지남에 따라 유의하게 증가하는 것은 아니었으며, 이는 숙주 세포 푸코실화가 안정함을 시사한다. 따라서, M1593-LF에 있어서의 푸코스 함량은 10% 미만이며, 일반적으로 5% 미만이고, 일부 제제에 있어서 2% 미만이다. 렉틴 비선발 숙주 CHO 세포에서 생성된 Mab는 80% 초과가 푸코실화된 글리칸 기를 포함하였다.
[표 15]
Figure pct00045
M1593의 돌연변이 Fc 변이체 (M1593-DE)에 있어서, M1593을 발현하는 플라스미드에 부위 지정 돌연변이 유발을 가하였다.
생물학적 활성
인간 및 사이노몰구스 Fc 수용체 (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa)에 대한 3가지의 항-인간 TF Fc 변이체 (M1593, M1593-LF, 및 M1593-DE)의 친화성. 본 출원인의 공계류 중인 출원 (미국 특허 출원 제61/426619호)에 기재된 바와 같이 또는 플라스몬 공명 (비아코어) 기반의 결합 분석법 (?)의 사용에 의해 이들 분석을 수행하였다.
이들 분석의 결과는 둘 모두의 Fc 변형된 항-TF 항체가 비변형된 모 IgG1 M1593 항체와 비교하여 재조합 인간 FcγIIIa 수용체에 18배만큼 (M1593-LF) 그리고 40배만큼 (M1593-DE) 더욱 더 단단하게 결합함을 보여 주었다 (표 16).
[표 16]
Figure pct00046
ADCC는 FcγRIIIa 맞물림에 의해 촉진된다. ADCC 분석법을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (문헌[Scallon et al., Mol Immunol 44:1524-1534 2007]).
개선된 Fc 수용체 결합성은 인간 PBMC를 이펙터 세포로서 그리고 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231을 표적 세포로서 사용하여 기능적 시험관 내 ADCC 분석에서 반영되었다 (도 8).
SEQUENCE LISTING <110> Janssen Biotech, Inc. Almagro, Juan Carlos Anderson, Glenn Mark Chi, Ellen Martinez, Christian Raghunathan,Gopalan Swanson, Ronald Teplyakov, Alexey Tse, Kam-Fai Wu, Sheng-Jiun Zhou, Hong Mimi <120> Human Tissue Factor Antibody and Uses Thereof <130> CEN5309WOPCT <140> Unknown <141> Herewith <150> 61/452,674 <151> 2011-03-15 <160> 167 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 263 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser 1 5 10 15 Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln 20 25 30 Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys 35 40 45 Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val 50 55 60 Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala 65 70 75 80 Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn 85 90 95 Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr 100 105 110 Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu 115 120 125 Asp Glu 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domain frameworks <400> 26 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr 100 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Asp Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn 1 5 10 <210> 28 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser 20 25 <210> 29 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 30 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 31 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 32 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser 20 25 <210> 33 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 34 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 35 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 36 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val Ser 1 5 10 <210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 38 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 39 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 40 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 41 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 42 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 43 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 44 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr 20 25 30 <210> 45 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser 1 5 10 15 Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr 20 25 30 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg 35 <210> 46 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser 1 5 10 15 Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 20 25 30 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 35 <210> 47 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Tyr Ala Glu Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser 1 5 10 15 Thr Asp Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 20 25 30 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr 35 <210> 48 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 20 <210> 49 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 50 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 51 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 52 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Gln Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 57 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 58 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 59 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 62 Gly Tyr Thr Phe Asp Ala His Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 63 Gly Tyr Thr Phe Ile Pro Tyr Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 64 Gly Tyr Thr Phe Leu Pro Tyr Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 65 Gly Tyr Thr Phe Arg Pro Tyr Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 66 Gly Tyr Thr Phe Asn Pro Tyr Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 67 Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 68 Gly Tyr Thr Phe Thr Pro Tyr Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 69 Gly Tyr Thr Phe Ser Ser His Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 70 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 70 Gly Tyr Thr Phe Ser Pro Phe Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 71 Gly Tyr Thr Phe Pro Pro Tyr Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 72 Gly Tyr Thr Phe Tyr Pro Tyr Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 73 Gly Tyr Thr Phe Pro Thr Tyr Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 74 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 74 Gly Tyr Thr Phe Ser Pro His Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 75 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 75 Gly Tyr Thr Phe Gly Thr Tyr Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 76 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 76 Gly Tyr Thr Phe Ala Pro Tyr Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 77 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 77 Gly Tyr Thr Phe Val Thr Tyr Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 78 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 78 Gly Tyr Thr Phe Gly Pro Phe Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 79 Gly Tyr Thr Phe Ile Pro His Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 80 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 80 Gly Tyr Thr Phe Gly Pro His Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 81 Gly Phe Thr Phe Ile Thr Tyr Trp Ile Ala 1 5 10 <210> 82 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 82 Gly Tyr Thr Phe Gly Pro Tyr Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 83 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <220> <221> MUTAGEN <222> (5)..(5) <223> Xaa is selected from A, D, G, I, L, N, P, R, S, T, V, and Y <220> <221> MUTAGEN <222> (6)..(6) <223> Xaa is selected from A, P, S, and T <220> <221> MUTAGEN <222> (7)..(7) <223> Xaa is selected from F, H, and Y <400> 83 Gly Tyr Thr Phe Xaa Xaa Xaa Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 84 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 84 Asp Ile Leu Pro Gly Ser Gly Phe Thr Asp 1 5 10 <210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 85 Asp Ile Ile Pro Gly Thr Gly Tyr Thr Thr 1 5 10 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 86 Asp Ile Leu Pro Gly Ser Gly Phe Thr Thr 1 5 10 <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 87 Asp Ile Ile Pro Gly Thr Gly Phe Thr Asn 1 5 10 <210> 88 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 88 Asp Ile Leu Pro Gly Ser Gly Tyr Thr Thr 1 5 10 <210> 89 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 89 Asp Ile Leu Pro Gly Thr Gly Tyr Thr Leu 1 5 10 <210> 90 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 90 Asp Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ala Thr His 1 5 10 <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 91 Asp Ile Leu Pro Gly Ser Gly Phe Thr His 1 5 10 <210> 92 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 92 Asp Ile Leu Pro Gly Thr Gly Tyr Thr Trp 1 5 10 <210> 93 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 93 Asp Ile Ile Pro Gly Thr Gly Tyr Thr Asn 1 5 10 <210> 94 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 94 Asp Ile Leu Pro Gly Thr Gly Phe Thr Asn 1 5 10 <210> 95 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 95 Asp Ile Ile Pro Gly Thr Gly Trp Thr Asn 1 5 10 <210> 96 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 96 Asp Ile Leu Pro Gly Ser Gly Tyr Thr Ile 1 5 10 <210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 97 Asp Ile Leu Pro Gly Thr Gly His Thr Thr 1 5 10 <210> 98 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 98 Asp Ile Leu Pro Gly Thr Gly Phe Thr Thr 1 5 10 <210> 99 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 99 Asp Ile Leu Pro Gly Thr Gly Tyr Thr Val 1 5 10 <210> 100 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 100 Asp Ile Ile Pro Gly Ser Gly Trp Thr Asn 1 5 10 <210> 101 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 101 Asp Ile Leu Pro Gly Ser Gly Tyr Thr Asn 1 5 10 <210> 102 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 102 Asp Ile Leu Pro Gly Ser Gly Trp Thr Asn 1 5 10 <210> 103 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 103 Asp Ile Leu Pro Gly Ser Gly His Thr Thr 1 5 10 <210> 104 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 104 Asp Ile Leu Pro Gly Thr Gly Tyr Thr Asn 1 5 10 <210> 105 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 105 Asp Ile Leu Pro Ala Ser Ser Ser Thr Asn 1 5 10 <210> 106 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 106 Asp Ile Leu Pro Gly Ser Gly His Thr Ile 1 5 10 <210> 107 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <220> <221> MUTAGEN <222> (3)..(3) <223> Xaa is selected from I and L <220> <221> MUTAGEN <222> (6)..(6) <223> Xaa is selected from S and T <220> <221> MUTAGEN <222> (8)..(8) <223> Xaa is selected from A, F, H, and W <220> <221> MUTAGEN <222> (10)..(10) <223> Xaa is selected from D, H, I, L, and N <400> 107 Asp Ile Xaa Pro Gly Xaa Gly Xaa Thr Xaa 1 5 10 <210> 108 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 108 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Trp Phe Val Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 109 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 109 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Val Tyr Gly Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 110 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 110 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Phe Arg Pro Thr Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 111 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 111 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 112 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 112 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 113 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 113 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Pro Ser Trp Asn Gln Ser Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 114 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 114 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Phe Ser Ala Asn Gln Arg Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 115 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 115 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Thr Ser Tyr Asn Gln Arg Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 116 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <220> <221> MUTAGEN <222> (8)..(8) <223> Xaa is selected from F, P, S, T, W, and Y <220> <221> MUTAGEN <222> (9)..(9) <223> Xaa is selected from F, S, T, R, and V <220> <221> MUTAGEN <222> (10)..(10) <223> Xaa is selected from A, G, P, S, W, Y, and V <220> <221> MUTAGEN <222> (11)..(11) <223> Xaa is selected from G, N, and T <220> <221> MUTAGEN <222> (13)..(13) <223> Xaa is selected from K, R, and S <400> 116 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 117 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 117 His Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 118 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 118 Trp Ala Ser Thr Arg Ser Ser 1 5 <210> 119 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 119 Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser 1 5 <210> 120 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(1) <223> Xaa is selected from H and W <220> <221> MUTAGEN <222> (6)..(6) <223> Xaa is selected from D, E, and S <400> 120 Xaa Ala Ser Thr Arg Xaa Ser 1 5 <210> 121 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 121 Gln Asn Asp Phe Ser Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 122 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 122 Gln Asn Asp Asp Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 123 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 123 Gln Asn Asp Asp Tyr Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 124 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 124 Gln Asn Asp Asp Thr Tyr Pro Met Thr 1 5 <210> 125 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 125 Gln Asn Asp Phe Thr Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 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Artificial Sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 143 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ala Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asn Ser Gly Phe Ala Tyr 100 105 <210> 144 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 144 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Pro Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Leu 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frameworks <400> 149 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Leu Pro Gly Thr Gly His Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asn Ser Gly Phe Ala Tyr 100 105 <210> 150 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 150 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Pro His 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Leu Pro Gly Ser Gly Trp Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp 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Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Pro Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Leu Pro Gly Ser Gly His Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asn Ser Gly Phe Ala Tyr 100 105 <210> 153 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 153 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Pro Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Ile Pro Gly Thr Gly Tyr Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asn Ser Gly Phe Ala Tyr 100 105 <210> 154 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 154 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Pro Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Leu Pro Gly Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asn Ser Gly Phe Ala Tyr 100 105 <210> 155 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 155 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Pro Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Leu Pro Gly Thr Gly Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asn Ser Gly Phe Ala Tyr 100 105 <210> 156 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 156 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Leu Pro Gly Ser Gly Phe Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Lys Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asn Ser Gly Phe Ala Tyr 100 105 <210> 157 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 157 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Trp Phe 20 25 30 Val Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Asp Ser Tyr Pro Leu Thr 100 <210> 158 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 158 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Ser Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Asp Thr Tyr Pro Met Thr 100 <210> 159 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 159 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Pro Ser 20 25 30 Trp Asn Gln Ser Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Phe Thr Tyr Pro Leu Thr 100 <210> 160 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 160 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Phe Ser 20 25 30 Ala Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Asp Thr Tyr Pro Leu Thr 100 <210> 161 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 161 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Thr Ser 20 25 30 Tyr Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Leu Thr Tyr Pro Leu Thr 100 <210> 162 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 162 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Val 20 25 30 Tyr Gly Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Phe Ser Trp Pro Leu Thr 100 <210> 163 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 163 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Phe Arg 20 25 30 Pro Thr Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Asp Ser Tyr Pro Leu Thr 100 <210> 164 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 164 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Asp Tyr Trp Pro Leu Thr 100 <210> 165 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 165 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 166 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 166 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Pro Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Leu Pro Gly Thr Gly Phe Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asn Ser Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 167 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine CDR or mutagens thereof in Human IgG variable domain frameworks <400> 167 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Pro Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Leu Pro Gly Thr Gly Phe Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asn Ser Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450

Claims (31)

  1. 인간 조직 인자에의 결합에 대하여 쥐과 항체 10H10과 경쟁하는 단리된 항체로서, 항체 결합 도메인은 인간 프레임워크(framework; FR) 영역에 맞추어지며, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3의 구조를 갖고, 상기 FR의 아미노산 서열들은 인간 생식 세포 계열(germline) 유전자 서열들에 의해 코딩되는 아미노산 서열들로부터 비변경되며, 상기 생식 세포 계열은 IMGT 데이터베이스에서 인식되고, 상기 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR) 서열들은 서열 번호 6-11 및 27로 나타낸 상기 쥐과 10H10 CDR에 대하여 50% 이상의 서열 동일성을 지닌 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 조직 인자 결합에 대하여 FVIIa와 경쟁하지 않으며, TF-VIIa 복합체의 응혈 촉진, 아미드 분해(amidolytic) 활성을 사실상 차단하지 않지만 MDA-MB-231 세포로부터의 사이토카인 IL-8 방출에 의해 측정할 때 TF-VIIa 매개 신호전달(signaling)은 차단하는 단리된 항체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 CDR 서열들 중 하나 이상은 서열 번호 6-11 및 27의 서열로부터 선택되는 항체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 3개의 경쇄 CDR 서열, L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3은 각각 서열 번호 9-11로 나타내어지는 항체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 3개의 중쇄 CDR 서열, H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3은 각각 서열 번호 6-8로 또는 각각 서열 번호 6, 27 및 8로 나타내어지는 항체.
  6. 제3항에 있어서, L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3은 각각 서열 번호 9-11로 나타내어지며, 상기 3개의 중쇄 CDR 서열, H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3은 각각 서열 번호 6-8로 또는 각각 서열 번호 6, 27 및 8로 나타내어지는 항체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 인간 중쇄(heavy chain; HC) 가변 영역 프레임워크들은 IMGT 데이터베이스가 나타내는 바와 같이 IGHV 패밀리 1, 3 또는 5의 구성원으로부터 유래되는 항체.
  8. 제7항에 있어서, 서열 번호 12-21의 서열로부터 선택되는 HC 가변 영역을 포함하는 항체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 인간 경쇄(light chain; LC) 가변 영역 프레임워크들은 인간 IGKV 패밀리 2 또는 4의 구성원으로부터 유래되는 항체.
  10. 제9항에 있어서, 서열 번호 22-26의 서열로부터 선택되는 LC 가변 영역을 포함하는 항체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 인간 HC 가변 영역 프레임워크들은 IGHV5 및 IGKV2로부터 선택되는 인간 생식 세포 계열 유전자 패밀리로부터 유래되는 항체.
  12. 제1항에 있어서, 서열 번호 12-21의 서열로부터 선택되는 HC 가변 영역 및 서열 번호 22-26의 서열로부터 선택되는 인간 LC 가변 영역을 포함하는 항체.
  13. 제1항에 있어서, 서열 번호 8의 H-CDR3; 서열 번호 6, 62-83의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 H-CDR1; 서열 번호 7, 27 및 84-107의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 H-CDR2; 및 선택적으로 IGVJ4 로부터 선택되는 HC FR4 영역 (서열 번호 60)을 갖는 HC 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 항체.
  14. 제1항에 있어서, 서열 번호 9, 108-116의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 L-CDR1; 서열 번호 10 및 117-120의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 L-CDR2; 및 서열 번호 11 및 121-128의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 L-CDR3; 및 선택적으로 IGKJ2 로부터 선택되는 LC FR4 영역 (서열 번호 61)을 갖는 LC 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 항체.
  15. 제1항에 있어서, 서열 번호 8의 H-CDR3; 서열 번호 6, 62-83의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 H-CDR1; 서열 번호 7, 27 및 84-107의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 H-CDR2; 및 선택적으로 IGVJ4 로부터 선택되는 HC FR4 영역 (서열 번호 60)을 갖는 HC 가변 영역 또는 이의 변이체, 및 서열 번호 9, 108-116의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 L-CDR1; 서열 번호 10 및 117-120의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 L-CDR2; 및 서열 번호 11 및 121-128의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 L-CDR3; 및 선택적으로 IGKJ2 로부터 선택되는 LC FR4 영역 (서열 번호 61)을 갖는 LC 가변 도메인 또는 이의 변이체를 포함하는 항체.
  16. 제1항에 있어서, 상기 HC 인간 프레임워크 서열들은 IGHV5_a로부터 유래되며, 상기 HC 가변 영역은 서열 번호 19, 129-155의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 항체.
  17. 제1항에 있어서, 상기 LC 인간 FR 서열들은 IGKV2D40_O1로부터 유래되며, 상기 LC 가변 영역은 서열 번호 23, 157-164의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 항체.
  18. 제1항에 있어서, 상기 HC 인간 프레임워크 서열들은 IGHV5_a로부터 유래되며, 상기 HC 가변 영역은 서열 번호 19, 129-155의 서열로부터 선택되는 서열을 갖고, 상기 LC 인간 FR 서열들은 IGKV2D40_O1로부터 유래되며, 상기 LC 가변 도메인은 서열 번호 23, 157-164의 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 항체.
  19. 제1항에 있어서, 비-CDR 위치로 정의되는, IGHV5_a 프레임워크들로부터 유래된 결합 도메인, 서열 SGYYGNSGFAY (서열 번호 8)를 갖는 H-CDR3을 가지며, H-CDR-1 및/또는 H-CDR-2 위치의 서열은 하기 화학식들로 주어지는 항체:
    H-CDR1
    [화학식 I]
    GYTFX1X2X3WIE (서열 번호 83)
    (여기서, X1은 A, D, G, I, L, N, P, R, S, T, V 및 Y로부터 선택되며; X2는 A, P, S 및 T로부터 선택되고, X3은 F, H 및 Y로부터 선택되거나; 또는 상기 서열은 GFTFITYWIA (서열 번호 81)일 수 있음); 및
    H-CDR2
    [화학식 II]
    DIX1PGX2GX3TX4 (서열 번호 107)
    (여기서, X1은 I 및 L로부터 선택되며, X2는 S 및 T로부터 선택되고, X3은 A, F, H 및 w로부터 선택되며, X4는 D, H, I, L 및 N으로부터 선택되거나; 또는 H-CDR2는 DILPASSSTN (서열 번호 105)임).
  20. 제1항에 있어서, 상기 비-CDR 위치들이 IGKV2D40_O1 프레임워크들로부터 유래되며, L-CDR-1 및/또는 LCDR-2 및 L-CDR3에서의 서열들은 하기 화학식들로 주어지는 서열들을 갖는 결합 도메인을 갖는 항체:
    L-CDR1
    [화학식 III]
    KSSQSLLX1X2X3 X4Q X5NYLT (서열 번호 116)
    (여기서, X1은 F, P, S, T, W 및 Y로부터 선택되며; X2는 F, S, T, R 및 V로부터 선택되고; X3은 A, G, P, S, W, Y 및 V로부터 선택되며; X4는 G, N 및 T로부터 선택되고; X5는 K, R 및 S로부터 선택됨);
    L-CDR2
    [화학식 IV]
    X1ASTRX2S (서열 번호 120)
    (여기서, X1은 H 및 W로부터 선택되며; X2는 D, E 및 S로부터 선택됨);
    L-CDR3
    [화학식 V]
    QNDX1X2X3PX4T (서열 번호 128)
    (여기서, X1은 D, F 및 L로부터 선택되며; X2는 S, T 및 Y로부터 선택되고; X3은 W 및 Y로부터 선택되고; X4는 L 및 M으로부터 선택됨).
  21. TF-발현 및 TF-발현으로 생기는 국소적 생물활성이 치료될 병태와 직접적으로 또는 간접적으로 관련되는 병태를 앓고 있는 인간 대상을 치료하는 방법으로서, 제1항, 제3항, 제19항 또는 제20항에 따른 항체를 이러한 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법
  22. 제21항에 있어서, 상기 병태는 암인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 암은 원발성 고형 종양, 전이; 암종, 선암종, 흑색종, 액성 종양, 림프종, 백혈병, 골수종, 연조직 암, 육종, 골육종, 흉선종, 림프육종, 섬유육종, 평활근육종, 지방종, 교모세포종, 성상세포육종 (astrosarcoma), 전립선암, 유방암, 난소암, 위암, 췌장암, 후두암, 식도암, 고환암, 간암, 이하선암, 담도암, 결장암, 직장암, 자궁 경부암, 자궁암, 자궁 내막암, 갑상선암, 폐암, 신장암 또는 방광암으로부터 선택되는 방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 병태는 양성 종양, 혈관종, 청신경종, 신경섬유종, 트라코마(trachoma) 및 화농성 육아종; 죽상 판(artheroscleric plaque); 혈관 신생 안과 질환, 당뇨성 망막병증, 미숙아 망막병증, 황반 변성, 각막 이식 거부, 신생 혈관 녹내장, 수정체 후방 섬유 증식증, 조홍, 망막아종, 포도막염 및 눈의 익상편(Pterygia; 비정상적 혈관 성장); 류마티스 관절염; 건선; 창상 치유 지연; 자궁 내막증; 맥관 형성; 육아(granulation); 비후성 반흔(켈로이드); 골절 불유합; 피부 경화증; 트라코마; 혈관 유착; 심근 혈관 신생; 관상동맥 측부순환(coronary collateral); 뇌 측부순환(cerebral collateral); 동정맥 기형; 허혈성 사지 혈관 신생; 오슬러-웨버 증후군(Osler-Webber Syndrome); 플라크 신혈관 형성; 모세 혈관 확장; 혈우병 관절; 혈관섬유종; 섬유근성 이형성증; 창상 육아; 크론병(Crohn's disease); 및 아테롬성 동맥 경화증으로부터 선택되는 방법.
  25. 약학적으로 허용가능한 제제 중에 제1항, 제3항, 제19항 또는 제20항의 항체를 포함하는, 대상의 치료에 유용한 약학 조성물.
  26. 안정된 형태의 제1항, 제3항, 제19항 또는 제20항에 따른 항체 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  27. 제1항, 제3항, 제19항 또는 제20항에 따른 항체의 항체 결합 도메인들 중 하나 이상을 코딩하는 단리된 핵산.
  28. 제27항의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  29. 제28항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  30. 제1항, 제3항, 제19항 또는 제20항에 있어서, IgG1 또는 IgG4 아이소타입(isotype)을 갖는 단리된 항체 또는 단편.
  31. 제30항에 있어서, 상기 Fc 영역은 카밧(Kabat) 위치 239 및 332 (이들은 서열 번호 167의 242 및 335임)가 상기 Fc 영역에서 야생형 잔기 S 및 D로부터 D 및 E 돌연변이로 변경된 인간 IgG1 아이소타입을 포함하는 단리된 항체 또는 단편.
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