JP6417442B2 - ヒト組織因子抗体及びその使用 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１１年３月１５日に出願された米国特許出願第６１／４５２，６７４号
に対する優先権を請求し、この内容は参照することによりその全体として本明細書に組み
込まれる。

（発明の分野）
本発明は、組織因子介在血液凝固を阻害することなく、腫瘍細胞などの血管外組織上に
存在する抗原であるヒト組織因子に結合する、ヒトに適合した抗体にする。本発明はまた
、ヒト組織因子の存在及び受容体機能に関連した、癌などの疾患を治療するための抗体の
使用方法に関する。

凝固因子ＩＩＩ（Ｆ３）、組織トロンボプラスチン、又はＣＤ１４２としても知られる
組織因子（ＴＦ）は、２つのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含む２１９アミノ酸の
細胞外領域と、リン酸化され得る１つのセリン残基を有する短い細胞内ドメインとを有す
る膜貫通糖タンパク質である。ＴＦは、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａの細胞受容体である。

ＴＦは、細胞受容体の形で、正常脳、肺、及び胎盤では高レベル、並びに脾臓、胸腺、
骨格筋、及び肝臓では低レベルの組織特異的分布を呈する。ＴＦはまた、細胞由来微小粒
子中に、及び選択的スプライシング可溶型として見出される。正常組織における発現に加
え、ＴＦは、最も主要な腫瘍型において、及び多くの腫瘍由来の細胞株において過剰発現
されることが報告されている（Ｒｕｆ Ｗ Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．５：１
５８４〜１５８７，２００７；Ｍｉｌｓｏｍら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍ
ｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２９：２００５〜２０１４，２００９）。

損傷に応答した血清タンパク質の凝固は、損傷に対する重要な生理応答である。血液が
、コラーゲン（内因性経路）及び組織因子（外因性経路）を含むタンパク質に暴露される
と、血小板及び血漿タンパクであるフィブリノゲン（凝固因子）への変化を起こす。血管
損傷の後、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は循環を離れ、組織因子保有細胞（間質線維芽細胞
及び白血球）上に発現される組織因子（ＴＦ）と接触し、活性化されたＴＦ−ＦＶＩＩａ
複合体を形成する。ＴＦ−ＦＶＩＩａは、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）及び第Ｘ因子（ＦＸ）を
活性化する。ＦＶＩＩは、ＴＦによってアロステリックに活性化され、かつトロンビン、
ＦＸＩａ、プラスミン、ＦＸＩＩ及びＦＸａによって活性化され得る。ＴＦ−ＦＶＩＩａ
は、ＦＸａと共に三元複合体を形成する。

非血管細胞によって発現される組織因子（ＴＦ）は、血液凝固を活性化することによっ
て止血に重要な役割を担う。ＴＦは、止血と異なるプロセスに更に関与し、その上にＴＦ
が発現される細胞表面の機能に直接関連する。血管及び非血管細胞上の凝固プロテアーゼ
のＴＦ依存性アセンブリは、Ｇタンパク質共役受容体であるプロテアーゼ活性化受容体（
ＰＡＲ）を活性化する。したがって、ＴＦ：ＶＩＩａ複合体は、ＰＡＲ、主にＰＡＲ２を
介して細胞シグナルを誘発し（Ｃａｍｅｒｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９７：５２５５〜５２６０，２０００；Ｒｉｅｗａｌｄ ＆ Ｒｕｆ，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：７７４２〜７７４７，２００１；Ｒ
ｕｆら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ １：１４９５〜４５０３，２００３；Ｃｈ
ｅｎら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ８６：３３４〜４５，２００１）、腫瘍形成、
血管新生、腫瘍進行、及び転移に寄与することができる。

三元複合体ＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａは、ＴＦ：ＶＩＩａ複合体がＦＸに作用すること
によって直接的に、又は、ＦＸをＦＸａに変換することができるＴＦ：ＶＩＩａによるＦ
ＩＸとＦＩＸａの変換後に間接的に形成される。ＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ複合体の形成
は、シグナル伝達を引き起こすか、又はＰＡＲ１〜４などの他の受容体を活性化すること
ができる。ＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ複合体の形成は、インターロイキン−８（ＩＬ−８
）の誘導をもたらし、腫瘍細胞移動を刺激することができる（Ｈｊｏｒｔｏｒら、血液１
０３：３０２９〜３０３７，２００４）。ＰＡＲ１及びＰＡＲ２は共に、腫瘍転移に関与
するが（Ｓｈｉら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２：３９５〜４０２，２００４）、
活性化された二元及び三元複合体（ＴＦ−ＶＩＩａ及びＴＦ−ＶＩＩａ−ＦＸａ）は、同
様に細胞シグナル伝達をもたらすＰＡＲ２の活性化因子である（Ｒａｏ ＆ Ｐｅｎｄｕ
ｒｔｈｉ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２５：４７
〜５６，２００５）。したがって、組織因子の発癌性の役割を、腫瘍の移動、溢血、及び
転移メカニズムに関与することもまた長い間疑われてきた凝血の役割から分離させること
ができるかどうかを決めることは興味深かった。

リガンド結合部位の機能的側面及び免疫学的側面を研究するために、組織因子に対する
、Ｍｏｒｒｉｓｅｙ（１９８８，Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ ５２（３）：２４７〜２６１；
ＵＳ５２２３４２７）及びＭａｇｄｏｌｅｎ（１９９６ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ３７９：
１５７〜１６５）に記載されているもののようなモノクローナル抗体が用いられてきた。
ＴＦ−ＶＩＩａ複合体を形成する又は維持するＴＦの能力を妨げることによって、又はＦ
Ｘを活性化する複合体の能力を阻害することによって、血栓事象を阻害するために、組織
因子に結合することが可能なモノクローナル抗体を用いることができる。組織因子に結合
し、かつ凝固を阻害しない抗体もまた知られている。第ＶＩＩａ因子開始ＴＦシグナル伝
達を阻害するが、凝固を阻害しない、抗体１０Ｈ１０などの抗体もまた記載されており（
Ａｈａｍｅｄら、２００６ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３（
３８）：１３９３２〜１３９３７）、かかる抗体は、かかる活性を有する剤の、固形腫瘍
の治療における役割及び実用性を研究する機会を提供してきた（Ｖｅｒｓｔｅｅｇら、２
００８ Ｂｌｏｏｄ １１１（１）：１９０〜１９９）。Ｒｕｆらは、国際公開特許第２
００７０５６３５２Ａ３号において、患者のうっ血を妨げずに、組織因子シグナル伝達を
阻害するための方法及び組成物を開示している。

癌の進行は多角的プロセスであるので、患者の止血を妨げないと同時に、腫瘍細胞に対
する発癌、転移、血管生成、及び抗アポトーシス機能を阻害することができるＴＦ結合抗
体である治療候補物質が望ましい。

本発明は、マウス抗体１０Ｈ１０の結合エピトープを保持する、ヒトの治療法として使
用される、ヒト適合坑ヒト組織因子特異抗体を提供し、その抗体は、ＦＶＩＩａ結合に関
して組織因子と競合せず、したがって、ＴＦ−ＶＩＩａ複合体の凝固促進活性、アミド分
解活性を実質的に阻害しないが、ＴＦ−ＶＩＩａによって媒介されるシグナル伝達、及び
サイトカインＩＬ−８放出などの下流の発癌作用を阻害する。

ヒトに適合した本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ可変ドメインフレームワークと、１０Ｈ１
０マウス抗体ＣＤＲ配列の配列を参照することによって決定され、かつ配列番号６〜１１
及び２７で表されるＣＤＲ変異体残基との組み合わせで構築される。ヒトフレームワーク
ＦＲ１及びＦＲ２及びＦＲ３と、ＣＤＲ及びＣＤＲ変異体と、ＦＲ４との組み合わせが提
供され、これらの組み合わせは、抗体結合ドメインの、マウス抗体１０Ｈ１０の免疫特異
性とのアセンブリを可能にする。本発明の一実施形態では、配列番号６〜１１で表される
、又は配列番号６、８〜１１、及び２７で表されるグループとしての６つのＣＤＲ配列は
、ヒトＩｇＧ可変ドメインのＣＤＲでない位置と定義され、ヒトＴＦに対する１０Ｈ１０
の結合親和性が保持されるように選択される、ヒト生殖細胞系ＦＲと組み合わされる。一
態様では、ヒトＨＣ可変領域ＦＲは、ＩＭＧＴデータベースによって表わされるＩＧＨＶ
遺伝子ファミリーの１、３、又は５メンバー由来である。一態様では、ヒトＬＣ可変領域
ＦＲは、ヒトＩＧＫＶ遺伝子ファミリーの２又は４メンバー由来である。一実施形態では
、抗体Ｆｖ（ＬＣ可変領域と対をなすＨＣ可変領域）は、配列番号１２〜２１から選択さ
れるＨＣ可変領域と、配列番号２２〜２６から選択されるＬＣ可変ドメインとを含む。

特定の実施形態では、抗体Ｆｖ（ＬＣ可変領域と対をなすＨＣ可変領域）を形成するヒ
トＦＲは、ＩＧＨＶ５と、ＩＧＫＶ２ ＦＲとを含む。本発明の抗体は、配列番号８のＨ
−ＣＤＲ３、配列番号６、及び６２〜８３から選択される配列を有するＨ−ＣＤＲ１、配
列番号７、２７、及び８４〜１０７から選択される配列を有するＨ−ＣＤＲ２、並びに、
任意にＩＧＶＪ４（配列番号６０）又はその変異体から選択されるＨＣ ＦＲ４領域を有
するＨＣ可変ドメインを含む。本発明の抗体は、配列番号９、１０８〜１１６から選択さ
れる配列を有するＬ−ＣＤＲ１、配列番号１０及び１１７〜１２０から選択される配列を
有するＬ−ＣＤＲ２、配列番号１１及び１２１〜１２８から選択される配列を有するＬ−
ＣＤＲ３、並びに、任意にＩＧＫＪ２（配列番号６１）又はその変異体から選択されるＬ
Ｃ ＦＲ４領域を有するＬＣ可変ドメインを有する抗体を更に含む。特定の実施形態では
、ヒトフレームワーク配列は、ＩＧＨＶ５＿ａに由来し、形成された可変ドメインは、配
列番号１９、１２９〜１５５から選択される配列を含む。別の実施形態では、ヒトフレー
ムワーク配列は、ＩＧＫＶ２Ｄ４０＿Ｏ１由来であり、形成された可変ドメインは、配列
番号２３、１５６〜１６３から選択される配列を含む。

本発明の抗体は、ＩＧＨＶ５＿ａフレームワーク由来の、ＣＤＲでない位置と定義され
る結合ドメインを有し、Ｈ−ＣＤＲ３が、配列ＳＧＹＹＧＮＳＧＦＡＹ（配列番号８）を
有し、Ｈ−ＣＤＲ−１位置の配列が、下記式：
Ｈ−ＣＤＲ１ ＧＹＴＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３ＷＩＥ （Ｉ） （配列番号８３）
（式中、Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹから選択され
、Ｘ２は、Ａ、Ｐ、Ｓ、及びＴから選択され、Ｘ３は、Ｆ、Ｈ、及びＹから選択され、又
は配列はＧＦＴＦＩＴＹＷＩＡ（配列番号８１）であってもよい）；及びＨ−ＣＤＲ２位
置の配列が次式によって与えられ：
Ｈ−ＣＤＲ２ ＤＩＸ_１ＰＧＸ_２ＧＸ_３ＴＸ_４ （ＩＩ） （配列番号１
０７）
（式中、Ｘ１はＩ及びＬから選択され、Ｘ２はＳ及びＴから選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｆ
、Ｈ、及びｗから選択され、Ｘ４は、Ｄ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、及びＮから選択され；ただし、Ｈ
−ＣＤＲ２がＤＩＬＰＡＳＳＳＴＮ（配列番号１０５）であるＨ１８９は除く）によって
与えられる、抗体としての一形態で表されることができる。

本発明の抗体は、ＩＧＫＶ２Ｄ４０＿Ｏ１フレームワーク由来の、ＣＤＲでない位置と
定義される結合ドメインを有し、Ｌ−ＣＤＲ−１及び／又はＬＣＤＲ−２、並びにＬ−Ｃ
ＤＲ３の配列が、下記式：
Ｌ−ＣＤＲ１ ＫＳＳＱＳＬＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｑ Ｘ_５ＮＹＬＴ （ＩＩＩ）
（配列番号１１６）
（式中、Ｘ１は、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、及びＹから選択され、Ｘ２は、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｒ
、及びＶから選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され、Ｘ４は
、Ｇ、Ｎ、及びＴから選択され、Ｘ５は、Ｋ、Ｒ、及びＳから選択される）；
Ｌ−ＣＤＲ２ Ｘ_１ＡＳＴＲＸ_２Ｓ （ＩＶ） （配列番号１２０）
（式中、Ｘ１はＨ及びＷから選択され、Ｘ２は、Ｄ、Ｅ、及びＳから選択される）；
Ｌ−ＣＤＲ３ ＱＮＤＸ_１Ｘ_２Ｘ_３ＰＸ_４Ｔ （Ｖ） （配列番号１２８）
（式中、Ｘ１は、Ｄ、Ｆ、及びＬから選択され、Ｘ２は、Ｓ、Ｔ、及びＹから選択され
、Ｘ３は、Ｗ及びＹから選択され、Ｘ４は、Ｌ及びＭから選択される）によって与えられ
る配列を有する、抗体として表わされる。

こうして、抗体重鎖及び軽鎖ＣＤＲ残基は、実質的に１０Ｈ１０のマウスＣＤＲから改
変される。例えば、上述の説明によると、抗体重鎖は、１０Ｈ１０のマウスＣＤＲと、７
０％（ＣＤＲ１で３／１０の残基が変更された場合）及び６０％（ＣＤＲ２で４／１０の
残基が変更された場合）だけ類似し得る（ＣＤＲ ３は変更されない場合）。軽鎖ＣＤＲ
残基は、１０Ｈ１０のマウスＣＤＲと、７１％（５／１７が変更された場合）、（７１％
）（２／７が変更された場合）、又は５５％（４／９が変更された場合）だけ類似する。

本発明は、ヒト組織因子に対する結合で競合し、したがって、マウス１０Ｈ１０抗体と
実質的に同じヒトＴＦ−ＥＣＤ上のエピトープと結合する、ヒトに適合した抗体を更に提
供する。本発明は、ＴＦ発現、及びそのＴＦ発現により生じる局所生物活性が、治療すべ
き疾患に直接又は間接的に関連している疾患を患う被験者を治療するために、かかる抗体
を使用する方法を更に提供する。

本発明は、抗体、並びに抗体の薬学的に許容可能な調製物を調製する方法、調製物を含
む容器、及び、本発明の抗体が被験者を治療するために使用する方法に利用される、その
容器を含むキット、を更に提供する。

１０Ｈ１０ Ｆａｂの共結晶のＸ線回折分析によって、又はヒト適合変異体（Ｍ１５９３ Ｆａｂ）及びヒトＴＦ−ＥＣＤ残基５〜２０８を用いて明らかにされたエピトープを示し、Ｍ１５９３ Ｈ−ＣＤＲ１（Ｔ３１Ｐ）及びＨＣＤＲ−２（Ｓ５７Ｆ）において改変された２つの接触残基が示されている。 ヒト（配列番号１、１〜２１９）、カニクイザル（配列番号２、１〜２２０）、及びマウスＴＦ−ＥＣＤ（配列番号３、１〜２２１）のアミノ酸残基のアライメントであり、マウス抗体ＴＦ８−５Ｇ９（Ｈｕａｎｇら、１９９８ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７５：８７３〜９４）及び１０Ｈ１０が接触する残基位置を示しており、これら残基は、凝固因子ＦＶＩＩ／ＶＩＩａ及びＦＸが接触することで知られている。 ５Ｇ９及び１０Ｈ１０のパラトープ、並びに凝固因子ＦＶＩＩ及びＦＸが接触して示されている領域を有する、ヒトＴＦ−ＥＣＤの三次元映像を示し、残基Ｌ１０４及びＴ１９７のみに１０Ｈ１０及びＦＸの両方が接触している。 マウス抗体１０Ｈ１０の重鎖（上方のアライメント）及び軽鎖（下方のアライメント）可変ドメインのアミノ酸配列（それぞれ配列番号４及び５）、抗体Ｍ５９のヒトフレームワーク適合配列（それぞれ配列番号１９及び２３）、並びに２つの選択された親和性成熟可変ドメイン配列Ｈ１１６（配列番号１３３）及びＨ１７１（配列番号１３９）のアライメントを示す。 アイソタイプ対照Ｂ３７と比較した、ＭＤＢ−ＭＢ−２３１乳癌細胞による０．２４μｇ／ｍＬでの、ＦＶＩＩａ誘発ＩＬ−８放出に対する２７個の親和性成熟ｍＡｂによる相対的阻害百分率を示す。 免疫無防備状態のマウスにＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍細胞を埋め込んだ後の、数日にわたる腫瘍容積のプロットを示し、Ｍ１５９３を投与された群は、定着腫瘍の成長を低減させた。 免疫無防備状態のマウスにＡ４３１ヒト扁平上皮癌細胞を埋め込んだ後の、数日にわたる腫瘍容積のプロットを示し、Ｍ１５９３を投与された群は、定着腫瘍の成長を低減させた。 マウス可変ドメインヒトＩｇＧ１（Ｍ１）、位置２３４及び２３５がアラニン置換されているマウス可変ドメインヒトＩｇＧ４、未修飾ＣＨＯで産生された野生型ＩｇＧ１としてのＭ１５９３、低フコース含有量でグリカンを生成するように選択されたＣＨＯ株で産生されたＭ１５９３−ＬＦ、並びにＳ２３９Ｄ及びＩ３３２ＥにＫａｂａｔ位置置換を有するＭ１５９３−ＤＥに関する、ヒトＰＢＭＣによる標的細胞溶解（ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞）のパーセンテージと、ＭＡｂ濃度とを対比したプロットを示す。

配列リストの説明（１）

配列リストの説明（２）

配列リストの説明（３）

配列リストの説明（４）

配列リストの説明（５）

略語
ＴＦ＝組織因子、ｈｕＴＦ＝ヒト組織因子、ｍｕＴＦ＝マウス組織因子、ｃｙｎｏＴＦ
＝カニクイザル組織因子、ＴＦ−ＦＶＩＩａ＝組織因子−第ＶＩＩａ因子複合体、ＴＦ／
ＦＶＩＩａ＝組織因子−第ＶＩＩａ因子複合体、ＨＣ＝重鎖、ＬＣ＝軽鎖、ｖ−領域＝可
変領域、ＶＨ＝重鎖可変領域、ＶＬ＝軽鎖可変領域、ＣＣＤ＝電荷結合素子、ＣＤＲ＝相
補的決定領域、ＣＨＥＳ＝２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−エタンスルホン酸、ＥＤ
ＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸、ＥＣＤ＝細胞外ドメイン、ＨＥＰＥＳ＝Ｎ−（２−ヒド
ロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸、ＨＥＫ＝ヒト胎児腎臓細胞
、ＭＥＳ＝２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ＰＡＲ＝プロテアーゼ活性化受容
体、ＰＢＭＣ＝末梢血単核細胞、ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水、ＰＤＢ＝プロテインデ
ータバンク、ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール、ＳＤＳ ＰＡＧＥ＝ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＳＥＣ＝サイズ排除クロマトグラフィ、ＭＡｂ
＝モノクローナル抗体、ＦＲ＝抗体のフレームワーク、ＨＦＡ＝ヒトフレームワーク適合
。

定義＆用語の説明
本明細書で使用されるとき、「抗体」は、抗体全体、及びその任意の抗原結合断片又は
短鎖を含む。したがって、抗体は、本発明の抗体の中に組み込むことのできる、重鎖若し
くは軽鎖の少なくとも１つの相補的決定領域（ＣＤＲ）若しくはそのリガンド結合部、重
鎖若しくは軽鎖可変領域、重鎖若しくは軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域若し
くはその任意の部分、又は結合タンパク質の少なくとも一部分などが挙げられるが、これ
らに限定されない、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む任意のタンパク質又は
ペプチド含有分子を含む。用語「抗体」は、抗体、その消化断片、特定部分及び変異体を
更に含むことを意図し、これには抗体模倣薬が挙げられ、あるいは抗体の構造及び／若し
くは機能を模倣する抗体の部分又はその特定断片若しくは一部を含み、単鎖並びに単一ド
メイン抗体及びその断片が挙げられる。機能的断片は、予め選択された標的に対する抗原
結合断片を含む。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例は、（ｉ
）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ、ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａ
ｂ’）２断片、ヒンジ領域にてジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂ断片を含
む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ、ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単腕
（single arm）のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなる
ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６）；並び
に（ｖｉ）単離された相補的決定領域（ＣＤＲ）を含む。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイ
ン、ＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によりコードされているが、これらの領域は組換え方法
を用いて合成リンカーにより連結することができ、合成リンカーは、ＶＬ及びＶＨ領域を
対にして、一価分子を形成する単一タンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる
、例えば、Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３〜４２６、及びＨ
ｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５
８７９〜５８８３を参照のこと）として作製することを可能にする。そのような単鎖抗体
も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることを意図する。これらの抗体断片
は、当業者に既知の従来の技術を使用して得られ、これらの断片はインタクト抗体と同一
の方法で、有用性に関してスクリーニングされる。逆に、ｓｃＦｖコンストラクトのライ
ブラリを使用して抗原結合能力に関してスクリーニングした後、従来の技術を使用して、
ヒト生殖系列遺伝子配列をコードする他のＤＮＡにスプライスしてもよい。そのようなラ
イブラリの１つの例は、「ＨｕＣＡＬ：ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリ」（Ｋｎａ
ｐｐｉｋ，Ａ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０００）２９６（１）：５７〜８６）であ
る。

用語「ＣＤＲ」は、抗原結合に関与する、又はその原因である、抗体の相補的決定領域
又は高頻度可変領域アミノ酸残基を指す。抗体のヒトＩｇＧサブタイプの高頻度可変領域
、即ちＣＤＲは、Ｋａｂａｔら（１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉ
ｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ
Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）に記載されているように、軽鎖可変ドメイン
内の残基２４〜３４（Ｌ−ＣＤＲ１）、５０〜５６（Ｌ−ＣＤＲ２）、及び８９〜９７（
Ｌ−ＣＤＲ３）と、重鎖可変ドメイン内の３１〜３５（Ｈ−ＣＤＲ１）、５０〜６５（Ｈ
−ＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（Ｈ−ＣＤＲ３）とからのアミノ酸残基、並びに／又は
高頻度可変ループ（即ち、（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７ Ｊ．Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７）に記載されているように、軽鎖可変ドメイン内の
残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、及び９１〜９６（Ｌ３）、並びに重鎖可
変ドメイン内の２６〜３２（Ｈ１）、５２〜５６（Ｈ２）、及び９５〜１０１（Ｈ３））
からのアミノ酸残基を含む。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋは、構造的に保存されている高
頻度可変ループを「カノニカル構造」と呼ぶ。フレームワーク又はＦＲ１〜４残基は、高
頻度可変領域以外の、それを一括する可変ドメイン残基である。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅ
ｓｋの付番システムは、小文字表記、例えば３０ａ、３０ｂ、３０ｃ等で表される特定の
残基の拡張を示すことにより、ループ内の残基の数の相違を考慮する。最近では、共通の
付番システムであるｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ）（ＬａＦｒａｎｃら、２０
０５．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：Ｄ５９３〜Ｄ５９７）が開発され、広く採
用されている。

本明細書において、ＣＤＲは、アミノ酸配列と、連番による軽鎖又は重鎖内の位置との
両方の観点において意味される。免疫グロブリン可変ドメインの構造内のＣＤＲの「位置
」が、種間で保存され、ループと呼ばれる構造に存在するとき、構造上の特徴により可変
ドメイン配列を整合する付番システムを使用することにより、ＣＤＲ及びフレームワーク
残基は、容易に同定される。この情報は、１種の免疫グロブリンから、典型的にヒト抗体
からのアクセプターフレームワークの中へのＣＤＲ残基のグラフト化及び置換に使用され
る。

本明細書で使用されるとき、用語「Ｆｃ」、「Ｆｃ含有タンパク質」、又は「Ｆｃ含有
分子」は、少なくとも１つの免疫グロブリンＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する、単量体
、二量体、又はヘテロ二量体タンパク質を意味する。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、タン
パク質／分子（例えば、抗体）の二量体領域の少なくとも一部を形成することができる。
「エピトープ」という用語は、抗体に対する特異的結合が可能なタンパク質決定因子を
意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの化学的に活性な分子表面基で構
成されており、通常、特定の３次元構造特性並びに特定の電荷特性を有する。構造的及び
非構造的エピトープは、後者ではなく前者に対する結合が、変性溶媒の存在下で損失する
という点で区別される。

本明細書で使用されるとき、Ｋ_Ｄは、解離定数、詳細には既定の抗原についての抗体の
解離定数Ｋ_Ｄを意味し、特異的標的に対する抗体の親和性の尺度である。高親和性抗体は
、既定の抗原について、有するＫ_Ｄが１０^−８Ｍ以下、より好ましくは１０^−９Ｍ以下、
更に好ましくは１０^−１０Ｍ以下である。Ｋ_Ｄの逆数は、Ｋ_Ａ、会合定数である。本明細
書で使用されるとき、用語「ｋ_ｄｉｓ」又は「ｋ_２」又は「ｋ_ｄ」は、特定の抗体−抗原
相互作用の解離速度を指すよう意図されている。「Ｋ_Ｄ」は、解離速度（ｋ_２）（「オフ
速度（ｋ_ｏｆｆ）」とも呼ばれる）の結合速度（ｋ_１）（又は「オン速度（ｋ_ｏｎ）」）
に対する比である。よってＫ_Ｄは、ｋ_２／ｋ_１又はｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎに等しく、モル濃度
（Ｍ）として表現される。ここで、Ｋ_Ｄが小さくなるほど、結合は強くなる。よって、Ｋ
_Ｄが１０^−６Ｍ（又は１マイクロＭ）とは、１０^−９Ｍ（又は１ｎＭ）と比べ、弱い結合
を表わす。

本明細書で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組
成物」は、単一分子組成物の抗体分子の調製を意味する。モノクローナル抗体組成物は、
特定エピトープの単一の結合特異性及び親和性を示す。この用語はまた、「組み換え抗体
」及び「組み換えモノクローナル抗体」も含み、（ａ）動物、又は抗体分泌動物細胞と融
合パートナーとの融合により調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体
を発現するよう形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから単離された抗
体、（ｃ）組み換えの、ヒト又は他の種のコンビナトリアル抗体ライブラリから単離され
た抗体、並びに（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライスすること
を含む任意の他の手段により調製、発現、作製又は単離された抗体、などの全ての抗体は
、組み換え手段により調製、発現、作製又は単離される。本明細書で使用されるとき、「
単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に有さない抗体を指す
ことが意図される。しかしながら、ヒトＴＦのエピトープ、アイソフォーム、又は変異体
に特異的に結合する、単離された抗体は、他の関連した抗原、例えば、他の種（例えば、
ＴＦ種ホモログ）由来の抗原に対して、交差反応性を有する場合がある。更に、単離抗体
は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない場合もある。本発明の一実施形
態では、異なる特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組み合わせを、明確
に規定された組成物中で混ぜ合わせる。

本明細書で使用されるとき、「特異的な結合」、「免疫特異的な結合」及び「免疫特異
的に結合する」は、所定の抗原に結合する抗体を指す。通常、抗体の結合における解離定
数（Ｋ_Ｄ）は１０^−７Ｍ以下であり、抗体が所定の抗原と結合する際のＫ_Ｄは、所定の抗
原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、又は他の任意の特定のポリペプチド
）と結合する際のＫ_Ｄと比較して、少なくとも１／２以下である。「抗原を認識する抗体
」及び「抗原に特異的な抗体」という表現は、本明細書において、「抗原に特異的に結合
する抗体」という用語と同義的に使用される。本明細書で使用されるとき、「高度に特異
的な」結合は、特定の標的エピトープに対する抗体の相対的なＫ_Ｄが、他のリガンドに対
する抗体の結合に関するＫ_Ｄの少なくとも１０倍小さいことを意味する。

本明細書で使用されるとき、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードさ
れる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ）を指す。いくつかの抗体クラスは更にサブ
クラスを包含し、そのサブクラスも重鎖定常領域によりコードされ、更に定常領域ドメイ
ン（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）内の特定の残基においてオリ
ゴ糖により装飾され、抗体に生物学的機能が更に付与されている。例えば、ヒト抗体アイ
ソタイプにおいて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、及びわずかながらＩｇＧ２は、マウスＩｇＧ２
ａ抗体と同様、エフェクター機能を呈する。

「エフェクター」機能又は「エフェクターポジティブ（effector positive）」は、抗
体が抗原特異的結合領域から区別されるドメインを含み、そのドメインは、受容体、又は
補体などの他の血液成分と相互作用して、例えばマクロファージの動員、及び抗体の抗原
結合ドメインに結合された細胞の破壊をもたらす事象を引き起こすことができる。抗体は
、エフェクター分子の結合により仲介される数種のエフェクター機能を有する。例えば、
抗体に対する補体のＣ１成分の結合は、補体系を活性化させる。補体の活性化は、オプソ
ニン作用と、細胞の病原体の溶解に重要である。補体の活性化は、炎症性応答を刺激し、
また自己免疫過敏症にも関与し得る。更に、抗体は、Ｆｃ領域を介して細胞に結合し、抗
体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体部位が、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と結合する。ＩｇＧ（
γ受容体）、ＩｇＥ（η受容体）、ＩｇＡ（α受容体）及びＩｇＭ（μ受容体）を含む、
抗体の異なるクラスに特異的な多数のＦｃ受容体が存在する。細胞表面上のＦｃ受容体に
対する抗体の結合は、多数の重要で多様な生物学的応答を誘発し、生物学的応答には、抗
体被覆粒子の貪食及び破壊、免疫複合体の排除、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶
解（抗体依存性細胞介在性細胞傷害、又はＡＤＣＣと称される）、炎症性メディエーター
の放出、胎盤通過、並びに免疫グロブリン産生の制御が含まれる。

用語「組織因子タンパク質」、「組織因子」、及び「ＴＦ」は、以下に記載されるよう
に、天然ヒト組織因子又は組み換え組織因子に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドを指すために用いられる。天然ＴＦは、人類並びに他の動物種、例えば、ウサギ、ラッ
ト、ブタ、非ヒト霊長類、ウマ、マウス、及び羊の組織因子を包含する（例えば、Ｈａｒ
ｔｚｅｌｌら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９：２５６７〜２５７３；
Ａｎｄｒｅｗｓら、（１９９１）Ｇｅｎｅ，９８：２６５〜２６９；及びＴａｋａｙｅｎ
ｉｋら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１８１：
１１４５〜１１５０を参照のこと）。ヒト組織因子のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受
入番号Ｐ１３７２６（配列番号１）、カニクイザル（配列番号２）、及びＵｎｉＰｒｏｔ
受入番号Ｐ２０３５２で示されるマウス（配列番号３）で示される。他の哺乳類組織因子
タンパク質のアミノ酸配列は、一般に知られているか、又は従来技術を通じて取得できる
。

本発明の抗体は、ＴＦシグナル伝達によりもたらされる細胞、組織、又は器官上に発現
したヒトＴＦの機能を阻害することが望ましい場合、また、ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体の形
成によりもたらされるＴＦの凝血原機能を実質的に変化させないことが望ましい場合に、
被験者に投与する又はヒト組織と接触させるのに有用である。そうした用途は、腫瘍、特
に、胸部、前立腺、肺、膵臓、及び卵巣の原発又は二次性固形腫瘍の治療に見出すことが
できる。

本発明はまた、培養液中、生体内原位置、及び生体内などで形成されるのが望ましい環
境において、組換え手段、又は抗体の発現情報の伝達を介して構築及び製造するのが有用
であることが当該技術分野において周知である配列と組み合わされることができる、本発
明の抗体配列をコードする核酸を包含する。本発明の抗体を産生する目的でかかる核酸を
操作する手段は、当業者に周知である。

本発明は、更に、本発明の抗体を単離された形態で投与及び貯蔵するための調製物、例
えば、薬学的に許容可能な又は安定した調製物を提供する。

１．抗体の組成物
特性
本発明は、１０Ｈ１０（Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎら、米国特許第５，２２３，４２７号）と
して知られるヒトＴＦに結合する、凝固を阻害しないマウス抗体は、特定の細胞における
ＴＦのシグナル伝達を抑制することができるという予想外の発見に基づいている（Ａｈｍ
ｅｄら、２００６、先に引用、ＰＣＴ国際公開特許第２００７／０５６３５２Ａ２号）。
したがって、本発明の抗体は、マウス抗体１０Ｈ１０の結合エピトープを保持するもので
あり、このマウス抗体１０Ｈ１０は、ＦＶＩＩａ結合に関して組織因子と競合せず、ＴＦ
−ＶＩＩａ複合体の凝固を促進するアミド分解活性を実質的に阻害し、並びに、ＴＦ−Ｖ
ＩＩａによって媒介されるシグナル伝達、及びサイトカインＩＬ−８の放出などの下流の
発癌作用を阻害する。本発明の抗体は、ＩＭＧＴデータベースに記載されているヒト生殖
細胞系列ＩｇＧ遺伝子に適合し、ヒト血漿中のカルシウムの存在下で凝固を開始させるＴ
Ｆの能力を妨げずに、ヒトＴＦに結合し続ける。

マウス抗体１０Ｈ１０の結合エピトープを保持する抗体は、一般に、抗体のＴＦに結合
する能力、及びヒトＴＦへの結合に関して１０Ｈ１０と競合する能力の評価によって評価
され得、一方でそれと同時に、ヒト血漿の存在下でＴＦを含む試料中に存在する場合、抗
体の不在下でのヒト血漿の同様の試料と比べて、ＴＦが開始する血漿凝固に必要な時間を
実質的に長引かせない。別の意味では、抗体のエピトープは、抗体によって結合されたＴ
Ｆの欠失突然変異誘発、置換変異誘発、制限タンパク質分解後のペプチド断片の同定、並
びにＴＦの一次構造及び抗体結合ドメインの原子構造の近くをマッピングし、それによっ
て抗体とヒトＴＦとの間の三次元結合を定義するための、共結晶化及びＸ線回折法を含む
が、これらに限定されない当該技術分野において既知の技術によって、物理的にマッピン
グされ得る（図１）。

したがって、エピトープは、ＦＶＩＩａ結合部位と重ならないとして定義することがで
きる（図２及び図３）。より詳細には、本発明の抗体によって結合されるエピトープは、
ヒト血漿中のカルシウムの存在下で凝固を開始させるＴＦの能力を妨げずに、ＦＶＩＩに
よって接触されないＴＦのＮドメインの１つ以上の残基（配列番号１で示される成熟鎖の
残基１〜１０４）、例えば残基６５〜７０と接触し、基質結合にとって重要なＣドメイン
のＫ１６５及びＫ１６６と接触しなくてもよい（Ｋｉｒｃｈｏｆｅｒら、２０００ Ｔｈ
ｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔａｔ ８４：１０７２〜８１）。

一実施形態では、抗体の結合速度（ｋ_ａ（１／Ｍ・ｓ））は１×１０^−５より大きい。
別の実施形態では、ＴＦに関する抗体の解離速度（ｋ_ｄ（１／ｓ））は１．０×１０^−５
未満であり、得られるＫ_Ｄは、１×１０^−９Ｍ未満（１ｎＭ未満）である。特定の実施形
態では、抗体は、Ｋ_Ｄが０．５×１０^−９Ｍ未満であるヒト生殖系列遺伝子適応抗体であ
る。一実施形態では、抗体は、表１１に示される重鎖及び軽鎖ペアのドメイン、例えば、
Ｍ１６３９、Ｍ１６４５、Ｍ１６４７、Ｍ１６５２、Ｍ１６４１、Ｍ１６４４、Ｍ１５８
７、Ｍ１６０４、Ｍ１５９３、Ｍ１６０６、Ｍ１５８４、Ｍ１６１１、Ｍ１５９６、Ｍ１
６０１、Ｍ１５８８、Ｍ１５９４、Ｍ１６０７、Ｍ１６１２、Ｍ１５９５、Ｍ１５９９、
Ｍ１５８９、Ｍ１５９２、Ｍ１５８３、及びＭ１６１０から選択される結合ドメインを有
する。

抗体組成物は、配列番号６〜１６６で示されるアミノ酸配列の１つ以上から選択される
結合ドメインのアミノ酸残基の配列を含むとして更に特徴付けることができる。

変化したＦｃ機能を有する抗体変異体
組換え方法によって生産された治療用モノクローナル抗体の使用が広がるにつれて、こ
うした複合体組成物の特徴及び特性が探求されてきた。免疫特異性及び抗原標的化の特徴
は、一般に、ＣＤＲとしても知られる高頻度可変領域のループ末端などの可変ドメイン及
びサブドメインに存在するが、複合体は、ＩｇＧのＦｃ部分などの定常ドメインによって
形成される構造体によって提供される他の受容体及び血清成分と相互作用する。

抗体及び他のＦｃ含有タンパク質は、いくつかのよく知られた生体外アッセイによって
機能性を比較することができる。具体的には、Ｆｃγ受容体のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ
、及びＦｃγＲＩＩＩファミリーのメンバーに対する親和性が対象となる。これらの測定
値は、受容体の組み換え可溶型又は受容体の細胞結合型を使用して形成することができる
。更に、ＦｃＲｎに対する親和性、ＩｇＧの延長された循環半減期に応答可能な受容体は
、組み換え可溶型ＦｃＲｎを使用して、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅによって測定することが
できる。ＡＤＣＣアッセイ及びＣＤＣアッセイ等の細胞ベースの機能性アッセイは、特定
の変異型構造の可能な機能性の結果に関する見識を提供する。一実施形態において、ＡＤ
ＣＣアッセイは、主要なエフェクター細胞であるＮＫ細胞を有するように構成され、それ
によって、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体上で機能的効果を反映させる。過酸化物又は炎症媒介
物放出等の細胞応答を測定できるように、食作用アッセイを使用して、異なる変異型の免
疫エフェクター機能を比較することもできる。インビボモデルも同様に、例えば、抗ＣＤ
３抗体の変異型を使用して、マウスにおけるＴ細胞活性を測定する場合に使用することが
でき、活性は、Ｆｃγ受容体等の特定リガンドを係合するＦｃドメインに依存する。

２．組織因子シグナル阻害抗体の産生
本出願に記載される抗体の特徴及び生物活性を有する抗体は、任意の哺乳類、例えば、
非限定的にヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、霊長類、ヤギ、若しくはそれらの
任意の組み合わせを含むか、又はそれらに由来することができ、単離されたヒト、霊長類
、げっ歯類、哺乳類、キメラ、ヒト又は霊長類適応抗体、免疫グロブリン、開裂生成物、
及び他の特定部分、並びにそれらの変異型を含む。モノクローナル抗体は、ハイブリドー
マ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：
４９５〜４９７）、及びＢ細胞と融合する不死化融合パートナーを用いる関連方法など、
当該技術分野において周知の任意の方法によって調製され得る。本発明で用いる抗体はま
た、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９３（１５）：７８４３〜７８４８１、国際公開特許第９２／０２５５１号
、同第２００４／０５１２６８号、及びＰＣＴ国際特許出願第２００４／１０６３７号に
記載される方法による特異抗体の生成に関して選択される１個のリンパ球から生成する免
疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡｓのクローニング及び発現に基づいた単一リンパ球抗体法
を用いて産生することもできる。

標的結合ドメイン又はサブドメイン、定常ドメイン、並びに本明細書に記載されるＦｃ
ドメインなどの機能的非標的結合ドメインを含む抗体は、当該技術分野において周知のい
くつかの方法によって誘導され得る。一態様では、天然抗体ドメインの配列は、例えば、
Ｖ−ｂａｓｅ（ｔｈｅ ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇから供給される）、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ Ｉｇ ｂｌａｓｔ）、又はｔｈｅ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）より供給されるｔｈｅ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（
ＩＭＧＴ）ｄａｔａｂａｓｅなどの、刊行された又はオンラインの文書又はデータベース
から好都合に得られる。

ヒト抗体
本発明は更に、ヒトＴＦに結合するヒト免疫グロブリン（又は抗体）を提供する。これ
らの抗体はまた、遺伝子操作を受けた又は適応されたとして特徴付けされ得る。免疫グロ
ブリンは、実質的にヒト生殖系列免疫グロブリンからの可変領域（複数可）を有し、抗原
認識に関与することが知られる残基において、指向された変形、例えば、ＫａｂａｔのＣ
ＤＲ又は構造的に画定されるような高頻度可変ループを含む。存在する場合、定常領域（
１つ以上）も、実質的にヒト免疫グロブリンからである。ヒト抗体は、少なくとも約１０
^−６Ｍ（１マイクロＭ）、約１０^−７Ｍ（１００ｎＭ）、１０^−９Ｍ（１ｎＭ）以下のＴ
Ｆに対するＫ_Ｄを示す。親和性の変化に影響を及ぼす、例えば、ＴＦに対するヒト抗体の
親和性を改善する、又はそのＫ_Ｄを減少させるために、ＣＤＲ残基又は他の残基のいずれ
かの置換が行われ得る。

ＴＦに結合するヒト抗体の産生源は、好ましくは、本明細書では、配列番号１２９〜１
６３から選択される配列、配列番号２８〜６１から選択されるＦＲ、及び、ヒトＴＦに結
合することができ、かつ繊維状ファージ粒子上にディスプレイされるヒト由来Ｆａｂのレ
パートリーを用いて、カニクイザルＴＦと交差反応することができるとして特定される、
配列番号６〜１１、２７、６２〜１２８の１つ以上から選択されるＣＤＲを含む可変領域
として提供される配列である。

いずれかのヒト可変ドメインＦＲへのいずれかの非ヒトＣＤＲの置換は、ＣＤＲの由来
となった親可変ＦＲに対する適合から提供されるのと同じ空間的定位を可能とし得ない。
最終ＭＡｂに対合される重鎖及び軽鎖の可変フレームワーク領域は、同一又は異なるヒト
抗体配列に由来し得る。ヒト抗体配列は、天然ヒト抗体の配列であってもよく、ヒト生殖
系列免疫グロブリン配列に由来してもよく、又は数種のヒト抗体及び／若しくは生殖系列
配列のコンセンサス配列であってもよい。

好適なヒト抗体配列は、マウス可変領域のアミノ酸配列と、既知のヒト抗体の配列との
コンピュータ比較により同定される。比較は重鎖と軽鎖とで別々に行われるが、原理はそ
れぞれに関して類似している。

経験的方法に関しては、所望の活性、結合親和性又は特異性をスクリーニングし得る変
異体配列のライブラリを形成することが特に簡便であることが見出されている。そのよう
な変異体のライブラリを形成するための１つのフォーマットは、ファージディスプレイベ
クターである。あるいは、変異体は、可変ドメイン内の標的残基をコードする核酸配列を
多様化させる他の方法を用いて生成することができる。

更なる置換が必要であるか否かを決定する別の方法と、置換されるアミノ酸残基の選択
とは、コンピュータモデリングを用いて達成することができる。免疫グロブリン分子の３
次元画像を生成するコンピュータハードウェア及びソフトウェアは、広く入手可能である
。一般に、分子モデルは、免疫グロブリン鎖又はそのドメインに関する解明された構造か
ら出発して生成される。モデリングされる鎖のアミノ酸配列の、解明された３次元構造の
鎖又はドメインとの類似性が比較され、最大の配列類似性を示す鎖又はドメインが分子モ
デル構成の出発点として選択される。解明された出発構造は、モデリングされている免疫
グロブリン鎖又はドメイン内の実際のアミノ酸と、出発構造内のアミノ酸との間の差異を
許容するよう変更される。次いで、変更された構造は、複合体免疫グロブリンに組み立て
られる。最終的に、モデルは、エネルギーを最小化し、また全部の原子が互いから適切な
距離内に存在し、結合の長さと角度とが化学的に許容し得る限界内にあることを検証する
ことにより精密化される。

コードの縮重により、多様な核酸配列が各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードするで
あろう。所望の核酸配列は、新規の固相ＤＮＡ合成、又は所望のポリヌクレオチドの早期
に調製された変異体のＰＣＲ突然変異誘発により生成され得る。本願に記載される抗体を
コードする全ての核酸は、本発明に明白に含まれる。

本明細書に記載されるように生成されたヒト抗体の可変セグメントは、典型的には、ヒ
ト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部に結合される。抗体は、軽鎖及び重鎖定常領
域の両方を含む。重鎖定常領域は、通常、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、更にＣＨ４
ドメインを含むことがある。

ヒト抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む抗体の任意のクラス
、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む任意のサブクラス（アイソ
タイプ）からの任意のタイプの定常ドメインを含んでもよい。ヒト化抗体が細胞傷害活性
を示すことが所望される場合、定常ドメインは通常、補体結合性定常ドメインであり、ク
ラスは一般にＩｇＧ_１である。かかる細胞傷害活性が望ましくないとき、定常ドメインは
、ＩｇＧ_２クラスであってもよい。ヒト化抗体は、２つ以上のクラス又はアイソタイプか
らの配列を含んでもよい。

場合により定常領域に結合されたヒト化軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸は、発
現ベクター内に挿入される。軽鎖及び重鎖は、同じ又は異なる発現ベクターにクローニン
グされ得る。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペ
プチドの発現を確実にする発現ベクター（１つ以上）内の制御配列に操作可能に結合され
る。そのような制御配列は、シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、及び転写終結
配列を含む（全ての目的に関して引用によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｑｕｅ
ｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９（１９８９
）；国際公開特許第９０／０７８６１号；Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１１４
９（１９９２）を参照のこと）。

抗体若しくはＦｃ又はその成分及びドメインは、そのようなドメイン又は成分のライブ
ラリ、例えば、ファージライブラリから選択することにより得られてもよい。ファージラ
イブラリは、ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリ又は目的とする配列を含むポリヌ
クレオチドのライブラリを挿入することによって、例えば、免疫化動物又はヒトのＢ細胞
から作製することができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏ
ｄａｙ ２１（８）３７１〜８）。抗体ファージライブラリは、１つのファージに重（Ｈ
）及び軽（Ｌ）鎖可変領域対を含み、単鎖Ｆｖ断片又はＦａｂ断片の発現を可能にする（
Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、２０００ ｓｕｐｒａ）。ファージミドライブラリの多様性は
、ライブラリのモノクローナル抗体の免疫特異性を増大及び／又は変化させ、追加の望ま
しいヒトモノクローナル抗体を産生しその後同定するように、操作され得る。例えば、遺
伝子をコードする重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）の免疫グロブリン分子は、組み立てられた免
疫グロブリン分子における新規のＨＬ対を作成するように、無作為に混合（入れ替え）さ
れ得る。更に、遺伝子をコードするＨ鎖及びＬ鎖の一方又は双方は、免疫グロブリンポリ
ペプチドの可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）において変異誘発され、かつその後に望
ましい親和性及び中和能力について篩分けされ得る。抗体ライブラリはまた、１つ以上の
ヒトＦＲ配列を選択し、かつヒト抗体レパートリー由来か又は設計された変異を通じて得
られるＣＤＲカセットの収集物を導入することによって合成的に作製され得る（Ｋｒｅｔ
ｚｓｃｈｍａｒ ａｎｄ ｖｏｎ Ｒｕｄｅｎ ２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉ
ｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５９８〜６０２）。多様性の位置はＣ
ＤＲに限定されず、可変領域のＦＲセグメントも含み得、又は抗体可変領域以外、例えば
ペプチド等を含み得る。

抗体可変領域以外を含み得る標的結合成分又は非標的結合成分の他のライブラリは、リ
ボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、及び細菌ディスプレイである。リボソームデ
ィスプレイは、タンパク質のＲＮＡとの付着を保ちつつ、ｍＲＮＡをそれらの同属タンパ
ク質へと翻訳する方法である。核酸コーディング配列は、ＲＴ−ＰＣＲによって回復され
る（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ９１，９０２２）。酵母ディスプレイは、膜結合α−アグルチニン酵母接
着受容体、ａｇａ１及びａｇａ２（接合型系の一部）の融合タンパク質の構築に基づく（
Ｂｒｏｄｅｒら、１９９７．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：５５３
〜７）。細菌ディスプレイは、細胞膜又は細胞壁に関係している、標的と排出された細菌
タンパク質との融合に基づく（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ２００２ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，７９：４９６〜５０３）。

本発明はまた、本発明の組成物をコードする核酸を、単離したポリヌクレオチドとして
、又は、組成物若しくはその定方向突然変異の原核、真核、若しくは繊維状ファージ発現
、分泌及び／若しくは表示に適合性のベクターを含む発現ベクターの一部分として提供す
る。

３．本発明の抗体の産生方法
本発明の抗体分子が、本明細書に記載される構造及び機能特性に従って特定されたら、
抗体鎖の所望の部分又は抗体鎖全体をコードする核酸配列は、クローン化、コピー、又は
化学的に合成されることができ、かつ常法によって抗体を発現させるために単離及び使用
されることができる。本発明の抗体は、免疫グロブリン分子の精製のための当該技術分野
において周知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、
アフィニティー、及びサイズ排除カラムクロマトグラフィ）、遠心分離、溶解度差によっ
て、又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。更
に、本発明の抗体及びその断片は、精製を容易にするために、本明細書に記載される、さ
もなければ当該技術分野において既知の異種ポリペプチド配列と融合することができる。

宿主細胞選択又は宿主細胞工学
本明細書で説明されるように、組換えＦｃ含有タンパク質又はモノクローナル抗体の発
現のために選択される宿主細胞は、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン内でタンパク質を修飾
するオリゴ糖部分の組成物における変化を含むが、これに限定されず、最終的な組成物に
とって重要な寄与因子である。したがって、本発明の１つの態様は、所望の治療用タンパ
ク質を発現する産生細胞の使用及び／又は開発のために、適切な宿主細胞の選択を含む。

更に、宿主細胞は、哺乳類起源であってもよく、又はＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ
２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３
、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はそれらの任意の誘導
体、不死化細胞、若しくは形質転換細胞から選択されてもよい。

あるいは、別の方法としては、宿主細胞は、ポリペプチドのグリコシル化が不可能であ
る種又は有機体、例えば、原核細胞又は有機体、及び天然又は工学的大腸菌ｓｐｐ、クレ
ブシェラｓｐｐ、又はシュードモナスｓｐｐから選択されてもよい。

４．抗ＴＦ抗体の使用方法
上述された方法のうちのいずれかによって生成される組成物（抗体、抗体変異体、又は
断片）は、ヒトの疾患、又は細胞、組織、器官、体液、若しくは、一般に宿主における特
定の病理を、診断、治療、検出、又は調節するために使用され得る。本明細書において教
示されるように、抗体が元のターゲッティング性を保持した状態で、標的結合後のエフェ
クター機能のより特異的に適した範囲をもたらすための、抗体のＦｃ部分、Ｆｃ融合タン
パク質、又はＦｃ断片の修飾は、特定応用及び治療指標のための抗体の変異体を産生する
。

本明細書によって提供される組成物を用いて治療可能であり得る疾患又は症状としては
、原発固形腫瘍及び転移癌などの癌、細胞腫、腺癌、メラノーマ、リンパ腫、白血病及び
骨髄腫などの液性腫瘍、並びに癌の進行につれて形成される浸潤性腫瘤、軟部組織癌；悪
性腫瘍、骨肉腫、胸腺腫、リンパ肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫、脂肪腫、神経膠芽腫、星
状細胞腫（astrosarcoma）、前立腺、乳腺、卵巣、胃、膵臓、喉頭、食道、精巣、肝臓、
耳下腺、胆道、結腸、直腸、頸、子宮、子宮内膜、甲状腺、肺、腎臓、又は膀胱の癌が挙
げられるが、これらに限定されない。

本発明の抗体が、炎症性サイトカインＩＬ−８などのサイトカインの下流放出に関与す
るＴＦの能力を阻害することによって、組織内の発癌促進環境を低減する限りにおいて、
本発明の抗体は、予防的に、又は腫瘍の増殖及び血管新生を抑制することを目的とする他
の治療と共に用いられ得る。ほとんどの加齢による癌は、再生可能な組織の上皮細胞に由
来する。上皮組織の重要な要素は、細胞外基質、及び線維芽細胞、マクロファージ、及び
内皮細胞などのいくつかの細胞型から成る上皮下部の層である間質である。癌性腫瘍にお
いて、間質は、腫瘍の成長及び進行にとって重要であり、ＴＦは、間質細胞並びに癌性上
皮細胞上に発現され得る。したがって、間質内のＴＦ：ＶＩＩａシグナル伝達によりもた
らされる下流因子の存在は、腫瘍性組織の形成を駆動する発癌突然変異と相乗作用する癌
促進組織環境を作り出す可能性がある。

同様に、ＴＦが脂肪組織で発現されると、肥満症、メタボリックシンドローム、及び糖
尿病などの状態の組織の機能を変更することができる。本発明の抗体は、ＴＦ：ＶＩＩａ
シグナル伝達を阻害することによって、こうした疾患を治療するのに有用であり得る。例
えばＩＬ−８及びＩＬ−６などのＴＦ：ＦＶＩＩａシグナル伝達の下流で生成される因子
のいくつかは、強力な炎症メディエーターである。本発明の抗体の付加的用途は、したが
って、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、及び喘息などであるが、これらに限定されない
炎症性疾患の治療が挙げられる。

本発明の抗体は、ＴＦ：ＶＩＩａシグナル伝達を阻害し、かつ血管新生を促進する下流
効果を低減するので、本発明の抗体は、癌に加えて、血管新生を伴う他の疾病、疾患、及
び／又は病状を治療するのに有用であり得る。こうした疾病、疾患、及び／又は病状とし
ては、良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫瘍、神経線維腫、トラコーマ、及び化膿性肉芽
腫など；動脈硬化斑；眼球血管新生疾患、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑
変性症、角膜移植片拒絶反応、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシス、網膜
芽細胞腫、ブドウ膜炎及び眼の翼状片（異常な血管成長）など；リウマチ性関節炎；乾癬
；創傷治癒遅延；子宮内膜症；脈管形成；肉芽形成；肥厚性瘢痕（ケロイド）；癒着不能
骨折；強皮症；トラコーマ；血管接着：心筋血管新生；冠側副；脳側副；動静脈奇形；虚
血肢血管新生；オースラー・ウェーバー症候群；プラーク血管新生；毛細血管拡張症；血
友病関節症；血管線維腫；線維筋性形成異常；創傷肉芽形成；クローン病；及びアテロー
ム性動脈硬化症が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の抗体がＴＦ：ＶＩＩａシグナル伝達を阻害する限りにおいて、その抗体を用い
て、新生物などであるが、これに限定されない、過剰増殖性の疾病、疾患、及び／又は病
状を治療及び／又は診断することができる。抗体は、直接的又は間接的相互作用を介して
、疾患の拡散を阻害することができる。本発明の抗体によって治療することができる、及
び／又は診断することができる過剰増殖性の疾病、疾患、及び／又は病状の例としては、
高ガンマグロブリン血、リンパ増殖性疾患、キャッスルマン病などの疾病、及び／又は病
状、パラプロテイン血症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、Ｗａｌｄｅｎｓｔ
ｒｏｎマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増加症、並びに器官、組織、又は体液
区画における任意のその他の過剰増殖性疾患などの過剰増殖性の疾病、疾患、及び／又は
病状が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の抗体が治療上使用され得る更なる手段としては、例えば、補体（ＣＤＣ）によ
って又はエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）によって介在されるような抗体の直接的細胞毒性
、又は、例えば免疫複合体としての抗体の間接的細胞毒性が挙げられるが、これらに限定
されない。

本発明は一般論として記述されてきているが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲を
限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。実験的記述では
、特定の試薬及び手順を用いて、タンパク質、又は抗体、又は特定の断片を産生した。抗
体を特性化するために定常的に用いた解析法を以下に記載する。

材料及び方法
タンパク質及び抗体スタンダード
ヒトＴＦの組み換え細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、ＥＬＩＳＡ及びＢｉａｃｏｒｅを基
礎とする直接的な結合アッセイ用に２つの形態で構築し、ＴＦ（配列番号１）の成熟鎖の
アミノ酸１〜２１９を、Ｃ末端Ｈｉｓ６−ｔａｇペプチドを有する哺乳類系で発現させ、
共結晶構造解析に関しては、配列番号１のアミノ酸５〜２１３を、Ｃ末端Ｈｉｓ６−ｔａ
ｇペプチドを有する細菌系で発現させた。タンパク質のアミン残基を標的にするＮＨＳ−
ｅｓｔｅｒ化学分析を用いて、ヒト_{ＴＦ１−２１９}をビオチン化した。凝固アッセイでは
、Ｉｎｎｏｖｉｎ（登録商標）（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｃ．カタログ番号Ｂ４
２１２）（診断用途用の、リン脂質、カルシウム、緩衝液、及び安定剤と混合された凍結
乾燥された組み換えヒト組織因子）を用いた。

カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＴＦ−ＥＣＤ（配列番号２）を、ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）から入手したカニクイザルの精巣組織から単離し
たｃＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてクローン化した。

いくつかの抗体を参照抗体として用いた：ｉ）元のハイブリドーマＴＦ９．１０Ｈ１０
−３．２．２からクローン化した１０Ｈ１０（米国特許第７２２３４２７号）；ｉｉ）ヒ
トＩｇＧ１／Ｋａｐｐａ定常領域に配列番号４及び配列番号５を含む１０Ｈ１０マウス−
ヒトキメラ、Ｍ１と指定；ｉｉｉ）Ｍ５９、１０Ｈ１０の６つのＣＤＲを含み、かつ親和
性成熟のための親抗体としての役割を果たす、ヒトＩｇＧ１及びヒトＫａｐｐａ定常領域
に配列番号１９及び配列番号２３を含むヒトＦＲ適応抗体；ｉｖ）マウスの抗ヒト組織因
子抗体ＴＦ８−５Ｇ９（米国特許第７２２３４２７号）；ｖ）抗体５Ｇ９からヒトＩｇＧ
１／Ｋａｐｐａとしてヒト化した、ＣＮＴＯ ８６０として知られる抗体（米国特許第７
６０５２３５号）、並びにｖｉ）Ｂ３７と呼ばれる無関係な抗原（ＲＳＶ）に結合するア
イソタイプ対照（ヒトＩｇＧ１／ｋａｐｐａ）抗体。

抗体の発現及び精製
常法を用いて、開示される抗体を発現及び生成した。一次スクリーニングでは、これら
分子をコードするＤＮＡを、９６ウェルプレートの中のＨＥＫ ２９３Ｅ細胞の中で一時
的に発現させ、トランスフェクションの後９６時間後に、上清を活性（結合）に関して試
験した。パイロットスケールでの発現及び精製の該当点を特定して選択した。パイロット
スケールでの発現は、７５０ｍＬの量のＨＥＫ ２９３Ｆ細胞又はＣＨＯ−Ｓ中で一時的
に行われた。採取した上清をタンパク質Ａクロマトグラフィで精製し、精製タンパク質を
、それらの親和性及び機能活性について評価した。更に、精製タンパク質を、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、及び相互作用クロマトグラフィ（ＣＩＣ）による生物物理学的
特徴付けに供した。理論的等電点（ｐＩ）を、各変異体についても計算した。パイロット
スケールでの特徴付けから、最終的な有力候補の組をＷＡＶＥ生物反応器にトランスフェ
クトし、タンパク質Ａクロマトグラフィ（chromatorgraphy）で精製した。

Ｆａｂ産生及びモノクローナルＦａｂのＥＬＩＳＡ
ファージパニングラウンドからのグリセロールストックをミニプレップし、ｐＩＸ遺伝
子をＮｈｅＩ／ＳｐｅＩ消化により除去した。再連結の後、ＤＮＡをＴＧ−１細胞に転換
し、ＬＢ／寒天平板培地で一晩増殖させた。次の日、コロニーを採取し、一晩増殖させ、
この培養物を、（ｉ）Ｖ領域のコロニーＰＣＲ及びシークエンシング、並びに（ｉｉ）Ｆ
ａｂ産生の誘発で用いた。Ｆａｂを産生するため、一晩培養物を新しい培地で１０〜１０
０倍に希釈し、３７℃で５〜６時間にわたって増殖させた。Ｆａｂ産生は、ＩＰＴＧを含
有する新鮮培地を加えることによって誘発され、培養物を３０℃にて一晩増殖させた。次
の日、培養物を回転沈降させ、可溶性のＦａｂタンパク質を含有する上清を、ＦａｂのＥ
ＬＩＳで用いた。

ＦａｂのＥＬＩＳＡでは、Ｆａｂは、多クローン性抗Ｆｄ（ＣＨ１）抗体によってプレ
ートの上に捕捉された。適切な洗浄及び阻害の後、ビオチン化ｈＴＦを０．２ｎＭ濃度で
添加した。この濃度は、全プレートに対照として存在する親Ｆａｂを１００％結合と定義
した場合の親の結合百分率として定義された、Ｆａｂ変異体のランク付けを可能にする。
ビオチン化ｈＴＦは、ＨＲＰ共役ストレプトアビジン及びプレートリーダーの化学発光読
取値によって検出された。

ＴＦ−ＥＣＤ結合ＭＡｂベースのＥＬＩＳＡ
化学発光による検出を用いた溶液相直接ＴＦ結合ＥＬＩＳＡを用いて、ヒトフフレーム
ワーク適応ライブラリから最も良く結合するもののランク付けを行った。９６ウェルｂｌ
ａｃｋ ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、炭酸塩−重炭酸塩緩衝液で希釈した１００ｕＬの
４ｕｇ／ｍＬヤギ抗ヒトＩｇＧ ＦＣで、ｐＨ ９．４、４℃にて一晩コーティングした
後、洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０溶液を有するＰＢＳ）で３回洗浄し、３
００μＬの１％ ＢＳＡ／１０ｍＭ ＰＢＳ溶液で１時間にわたって阻害し、その後、先
と同様に洗浄した。試料又は標準物質をアッセイ緩衝液（ＰＢＳ＋０５％ Ｔｗｅｅｎ中
１％ ＢＳＡ）で５０ｎｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬを室温にて１時間にわたり振盪さ
せながらアッセイプレートに添加した。これらプレートを３回洗浄し、１ウェル当たり１
００ｕＬの、Ｈｉｓタグのついたヒト又はカニクイザルＴＦ−ＥＣＤを、アッセイ緩衝液
で希釈して１００ｎｇ／ｍＬで添加し、室温にて２時間インキュベートした。洗浄後、ア
ッセイ緩衝液で１：２０００に希釈したＱｉａｇｅｎペルオキシダーゼ共役ｐｅｎｔａ−
ｈｉｓを１ウェル当たり１００ｕＬで添加し、室温で１時間にわたり振盪させながらイン
キュベートした。ＢＭ ＣｈｅｍｉＬｕｍ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＢＭ Ｃｈｅｍｉｌｕ
ｍ，ＰＯＤ，Ｒｏｃｈｅ）を緩衝液中１：１００の希釈で新たに調製し、最終洗浄後に１
００ｕＬをプレートに添加した。１０分後に、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉ
ｏｎ Ｒｅａｄｅｒ，ＢＭ ＣｈｅｍｉＬｕｍ ｐｒｏｇｒａｍでプレートを読み取る。

ＦＡＣＳによる坑組織因子ｍＡｂのＭＤＡ−ＭＢ−２３１全細胞結合
このアッセイは、乳癌細胞に発現した内在性ヒトＴＦに対する抗体の直接結合を検出す
るために用いられる。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中１％ ＦＢＳ）中の試験ｍＡｂの４点滴
定を２組調製する。滴定を１：４希釈にて１，０００ｎｇ／ｍＬで開始する。親分子であ
るＭ１を陽性対照として用い、坑ＲＳＶ ｍＡｂであるＢ３７を陰性／アイソタイプ対照
として用いる。無染色細胞及び二次抗体である、ＦＡＣＳ緩衝液１：２００中のＣｙ−５
共役ヤギ坑ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を対照として用い、使用直前に調製した。

標準的な組織培養技術を用いて、培養瓶の中の接着ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＰＢＳ
（ｗ／ｏ Ｃａ＋２／Ｍｇ＋２）で１回すすぐ。Ｖｅｒｓｅｎｅで細胞を持ち上げ、細胞
を計数し、１ウェル当たり２００，０００個の細胞をポリスチレン製Ｖ底プレートに播種
する。ＦＡＣＳ解析プロトコル：組織因子結合。Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ−１５Ｒ遠心機の中
の細胞を４５０×ｇにて３分間４℃でペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中２％ Ｆ
ＢＳ）中に再懸濁し、１ウェル当たり２００，０００個の細胞を２００μＬの中に蒔く。
細胞を４５０×ｇにて３分間４℃でペレット化する。上清を捨て、１００μＬ／ウェルの
試験又は対照ｍＡｂを指定されたウェルに添加し、氷上又は４℃で１時間（＋／−１０分
）にわたってインキュベートする。細胞を４５０×ｇにて３分間４℃でペレット化する。
上清を捨て、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄する。２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝
液中に細胞を再懸濁し、細胞を４５０×ｇにて３分間４℃でペレット化する。上清を捨て
、１００μＬ／ウェルの二次抗体を指定されたウェルに添加し（倍散）、氷上で１時間（
＋／−１０分）にわたってインキュベートする。細胞を４５０×ｇにて３分間４℃でペレ
ット化する。上清を捨て、２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中に細胞を再懸濁する前
に（倍散）、ＦＡＣＳ緩衝液中で細胞を２回洗浄する。細胞を４５０×ｇにて３分間４℃
でペレット化する。上清を捨て、１００μＬ／ウェルのＣｙｔｏＦｉｘ緩衝液中に細胞を
再懸濁する。反応をフローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｒａｙ）で解析する。無
染色対照のウェル中の主要な細胞集団をゲーティングし、このゲートを全データセットに
適用することによって、ＦＡＣＳデータ解析にＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いる。デー
タは、適用したゲートに関する赤チャンネルの幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）の表としてエ
クスポートされる。

Ｔｈｅｒｍａｆｌｕｏｒアッセイ
Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ技術は、加熱されたときの分子アンフォールディングの反応速
度測定である。分子が加熱されると、分子が展開するときに、色素（ＡＮＳ）は分子に結
合することができる。色素は分子に結合すると蛍光を発し、この蛍光が経時的に測定され
る。このアッセイでは、抗体の展開は３７℃〜９５℃で測定され、０．５℃毎に検出され
る。アッセイ対照として用いられる既知のＴｍｓを有する２つのｍＡｂ（Ｅｍｍｐ ４Ａ
５、及びＥｍｍｐ ５Ｆ６）と同様に、マウス及びキメラ形態（１０Ｈ１０、Ｍ１、５Ｇ
９、及びＣＮＴＯ８６０）の両方の親分子のＴｍｓも測定した。

ヒトフフレームワーク適応ライブラリ変異体の耐熱性を予測するために、このアッセイ
を用いた。精製抗体をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、２ｕＬの試料を各ウェルに添
加し、１ウェル当たり合計で１ｕｇの試料とする。各試料を２重で加える。ストックＡＮ
Ｓは、ＤＭＳＯ中５００ｍＭである。ストックＡＮＳをＤＭＳＯで１：１２に（４０ｍＭ
まで）希釈し、２０ｕＬの４０ｍＭ ＡＮＳ溶液、２．８ｕＬの１０％ Ｔｗｅｅｎ、及
び１．９８ｍＬのＰＢＳを混合して色素／Ｔｗｅｅｎ溶液を形成し、２ｕＬの色素／Ｔｗ
ｅｅｎ溶液及び２ｕＬの油を加える。プレートを遠心する（４５０ｒｐｍで２分）。Ｔｈ
ｅｒｍｏｆｌｕｏｒ設定：シャッターは手動に設定、勾配温度０．５℃／秒、連続勾配、
温度勾配：５０〜９５℃。高温で１５秒保持を選択、露出時間１０秒／１反復、ゲイン標
準値＝２、「単一ＳＣ画像／プレート」を選択。

相互作用クロマトグラフィ（ＣＩＤ）
種々の抗体と他のヒト抗体との相互作用を判定するために、ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ
Ａｌｄｒｉｃｈ）結合カラムを用いてクロマトグラフィ実験を行った。簡潔に言うと、５
０ｍｇのヒトＩｇＧを、メーカーの説明書に従って、１ｍＬのＮＨＳ−セファロースカラ
ム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させた。結合されなかったＩｇＧを、０．１Ｍ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、０．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄することによって取り除き、非反応ＮＨ
Ｓ群を同じ緩衝液によりブロックした。結合効率は、Ｐｉｅｒｃｅ’ｓ Ｃｏｏｍａｓｓ
ｉｅ Ｐｌｕｓアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、非反応結合
緩衝液及び洗浄液中に残っているタンパク質濃度を測定し、固定化の前のタンパク質の量
から減算することによって決定された。タンパク質を樹脂に添加しなかったこと以外は、
同じプロトコルを用いて対照カラムも調製した。

最初に対照カラムを、ＰＢＳ、ｐＨ７で平衡化した後のＤｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔ
ｅ ３０００ ＨＰＬＣに、０．１ｍＬ／分の流量で通した。非特異的結合部位がブロッ
クされるのを確実にするために、最初に２０Ｌのタンパク質ストック溶液を注入し、続い
て２０Ｌの１０％アセトンを注入して、カラムの完全性をチェックした。

分析されるべき試料を、ＰＢＳ、ｐＨ７で０．１ｍｇ／ｍＬに希釈した。各試料の２０
マイクロリットルを各カラムに注入し、０．１ｍＬ／分で３０分にわたって通した。保持
時間を記録し、各変異体の保持係数（ｋ’）を計算した。
ｋ’の計算は、タンパク質誘導体化カラム（ＩｇＧ結合カラム）での保持時間（ｔＲ）
と、タンパク質が結合していないカラムでの保持時間（ｔ０）の差である。計算は、カラ
ムを標準化するために、両方のカラムでのアセトンの保持時間も考慮に入れる。ｋ’の許
容値は０．３未満である。

溶解性
種々の抗体の室温での溶解性を判定するため、遠心濾過装置を使用して濃度実験を行っ
た。簡潔に言うと、ＰＢＳ中の抗体調製物を、室温にてＶｉｖａｓｐｉｎ−１５（１５ｍ
Ｌ）遠心濾過装置（３０，０００ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ
，Ｇｅｒｍａｎｙ）に加えた。フィルタを、Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ１５−
Ｒ遠心機の中でスインギングバケットローターを使用して、３０００×ｇで２０分間隔で
回転させた。体積が約２ｍＬまで減少したら、上清をＶｉｖａｓｐｉｎ−４（４ｍＬ）濾
過装置（３０，０００ＭＷＣＯ）に移し、２０分間隔で４，０００×ｇで遠心分離した。
体積が５００Ｌまで減少したら、サンプルをＶｉｖａｓｐｉｎ−５００濾過装置に移し、
１５分間Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４２４遠心機で１５，０００×ｇにて遠心分離した。タ
ンパク質濃度が１００ｍｇ／ｍＬ以上に達するまでこれを繰り返した。タンパク質濃度は
、適切な希釈を用い、ＢｉｏＴｅｋ ＳｙｎｅｒｇｙＨＴ（商標）分光光度計上での２８
０ｎｍ及び３１０ｎｍにおける吸光度により決定された。この時点で、遠心分離を停止さ
せ、試料を一晩室温で保持して、平衡に達した。次の朝、試料の沈殿の兆候をチェックし
た。濃度が１００ｍｇ／ｍＬ超であった場合、プロセスを中止した。

第ＶＩＩＡ因子誘発ＩＬ−８阻害アッセイ
このアッセイを用いて、ＴＦ結合抗体が、ＴＦを発現するヒト細胞からのＦＶＩＩａ誘
発ＩＬ−８放出をなくすかどうかを試験した。ＤＭＥＭ及び１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ
：カタログ番号１１９９５及びカタログ番号１６１４０）中で成長するように適合された
ヒト乳腺癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−２６）を、９６ウェルの
細胞培養プレート（Ｎｕｎｃ：カタログ番号１６７００８）に、１ウェル当たり２０００
０個の細胞（１００，０００個の細胞／ｍＬ）の密度で、標準的細胞培養技術を用いて蒔
いた。２μｇ／ｍＬで開始し、ＦＢＳを有さないＤＭＥＭで１：２又は１：４のいずれか
で連続希釈される抗体処理の前に、細胞を２日にわたって回収した。抗体は、ＦＢＳを有
さないＤＭＥＭ中最終濃度５０ｎＭのヒトＦＶＩＩａ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ：カタログ番号ＩＨＦＶＩＩａ、ロット：２８２４）で処理する１時間前に加え
られた。細胞をインキュベータに２４時間入れた。処理の後、上清を収集し、ＩＬ−８の
量を、メーカーのプロトコル（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ：カタログ番号Ｄ８０００Ｃ）に
したがってＥＬＩＳＡによって検出した。簡単に言えば、各処理試料の光学密度（ＯＤ）
を４５０ｎｍ及び５４０ｎｍにて読み取った。アッセイプレートの光学的不完全性を補正
するために、５４０ｎｍにおける読み取り値を用いたが、一方で、メーカーのプロトコル
に従って作製したＩＬ−８標準曲線を用いて処理試料中のＩＬ−８含有量を計算するため
に、４５０ｎｍにおける補正された読み取り値（ＯＤ ４５０マイナスＯＤ ５４０）を
用いた。抗体及びＦＶＩＩａ処理を受けていない細胞を有するウェルを用いて、内因性Ｉ
Ｌ−８レベルを決定する一方で、ＦＶＩＩａのみを受けた細胞を有するウェルを用いて、
「非阻害」ＩＬ−８レベルを決定し、それによって、最小及び最大ＩＬ−８レベルをそれ
ぞれ定義した。ＭＡｂ滴定処理試料を、上で定義された最大及び最小ＩＬ−８レベルに対
して正規化し、阻害百分率で表した。正規化データは、棒グラフで表されるか、又は各Ｍ
ＡｂのＥＣ_５０値を抽出するようにフィットする４パラメータのロジスティック曲線に当
て嵌められるかのいずれかであった。

凝固アッセイ
このアッセイは、カルシウム及び添加された組み換えヒトＴＦ調製物（Ｉｎｎｏｖｉｎ
，Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｃ）の存在下でヒト血漿を使用して、坑ヒトＴＦ抗体
が生体外での凝固を阻害するかどうかを判定するために用いた。坑ヒトＴＦ抗体をＨＢＳ
Ｓ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１７５）で２ｍｇ／ｍＬ抗体まで希釈する。クエン酸
ナトリウムを有するプールされたヒト血漿（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏｍｅｄｉｃ
ａｌ，Ｎｏｖｉ，ＭＩ）を、１０００ｒｐｍにて５分にわたり回転沈降させ、透明な血漿
を新しい管に移す。透明な９６ウェルアッセイプレート（ＮＵＮＣ、カタログ番号４３９
４５４）の各ウェルの中で、２５ｕＬの希釈した抗体を１００ｕＬのヒト血漿に加える。
２２ｍＭのＣａＣＬ２を有するＨＢＳＳで１：５００に希釈した１２５μＬのＩｎｎｏｖ
ｉｎ（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｂ４２１２）を、抗体を有す
る又は有する血漿を収容しているウェルに添加することによって、反応を開始させる。凝
固反応は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２ｅ読み取り機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃ
ｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、反応開始直後及び３０分にわたり３７℃
にて、ＯＤ ４０５で速度論的に監視する。各抗体のＴ１／２ Ｍａｘは、最大光学密度
の５０％に達するまでにかかる時間（秒）として、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏソフトウェア
を用いて決定される。試料の時間（秒）は各プレートの参照に対して正規化されたが、統
計的には、抗体を有さない試料、１０Ｈ１０、及び全て１０Ｈ１０由来でヒトに適合した
変異体の平均時間である１５０秒及び２００秒と記載している試料の間に差はなかった。
（実施例）

実施例１：１０Ｈ１０のシークエンシング
Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｉｎ Ｌａ Ｊｏ
ｌｌａ，ＣＡ（米国特許第５２２３４２７号、Ｍｏｒｒｉｓｅｙら、１９８８ Ｔｈｒｏ
ｍｂ Ｒｅｓ．５２（３）：２４７〜２６１）で産生された１０Ｈ１０として知られるマ
ウス抗体を、ハイブリドーマＴＦ９．１０Ｈ１０−３．２．２によって産生する。１０Ｈ
１０ハイブリドーマクローンからの抗体の配列は、以前に報告されていない。
この配列は、２つの抗体鎖、ＶＨ及びＶＬを、５’ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）（Ｉｎ
Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）、プライマー、並びにマウスＩｇＧ１定常領域及びマウスＫａｐｐａ
定常領域内の配列にそれぞれ相補的な３’コンセンサスプライマーを用いて増殖せる、５
’ＲＡＣＥ法（Ｆｏｃｕｓ ２５（２）：２５〜２７，２００３；Ｍａｒｕｙａｍａ １
９９４ Ｇｅｎｅ １３８，１７１〜１７４）を用いて特定された。配列解析により適し
たＶＬ生成物を生成するために、５’ＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｎｅｓｔｅｄプライマー及び
３’コンセンサスプライマーを用いるＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲ増幅を用いた。

各鎖の可変領域を特定するために、少なくとも１６個のクローンが選択された。挿入の
未知の領域の配列決定のためにプライマーを用いた。配列解析のため、生配列データをＡ
ＢＩ ＤＮＡ ＳｅｑｕｅｎｃｅｒからＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
Ｉｎｆｏｒｍａｘ）にダウンロードした。１つの機能的ＶＨ及び１つの機能的ＶＬを特定
した。ＶＨ及びＶＬ遺伝子は共に、それらの自然シグナル配列、ＦＲ、ＣＤＲ、及びＪセ
グメントを見つけるために更に解析された。

ＶＨのＣＤＲ−１に対応する領域を除き、１０Ｈ１０、ＦＲ及びＣＤＲは順次的に番号
が付けられ、Ｋａｂａｔの定義（Ｋａｂａｔら、５ｔｈ ｅｄｉｔ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅ
ａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，１９９１）に従って
分割された。この領域では、Ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義との組み合わせが
用いられた（Ｒａｇｈｕｎａｔｈａｎ，Ｇ．，ＵＳ２００９／０１１８１２７ Ａ１；Ｃ
ｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６（４）：９０１〜１７
，１９８７）。

クローン化したＶ領域は、ヒトＩｇＧ１／Ｋａｐｐａ定常領域を用いて操作され、ＨＥ
Ｋ２９３又はＣＨＯ細胞株の組み換え発現のために哺乳類発現ベクターにクローニングさ
れ、Ｍ１と指定されるマウス−ヒトキメラ抗体を産生し、これを参照抗体としてアッセイ
開発で用いた。結晶構造解析で用いる１０Ｈ１０Ｆａｂを産生するために、ＨＣ Ｖ領域
もまた、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインのみ、及びＣ末端ヘキサヒスチジンを用いて操作
された。

実施例２：非凝固性組織因子抗体のエピトープマッピング
ヒトＴＦ ＥＣＤと、対応するＦａｂ断片との間の複合体の結晶構造決定により、１０
Ｈ１０のエピトープマッピングを行った。Ｈｉｓタグ付きヒトＴＦ ＥＣＤ（配列番号１
の残基５〜２１３）を大腸菌内で発現させ、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａ
ｌｔｈｃａｒｅ）及びＱ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をそれぞれ用いて
、親和性及びイオン交換クロマトグラフィによって精製した。１０Ｈ１０ ＦａｂのＨｉ
ｓタグ付きキメラバージョン（マウスＶ領域、ヒト定常ドメイン）をＨＥＫ細胞内で発現
させ、親和性（ＴＡＬＯＮカラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びサイズ排除（Ｈｉ
Ｌｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグ
ラフィを用いて精製した。

ＦａｂとヒトＴＦ ＥＣＤを１：１．２のモル比で混合することにより、複合体を調製
した（過剰なＴＦ）。混合物を２０分間室温でインキュベートし、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ
、ｐＨ ７．５、及び０．１Ｍ ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム
（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。主ピークに対応するフラクションをプー
ルし、１０ｍｇ／ｍＬとなるまで濃縮し、結晶化で使用した。複合体は、蒸気拡散法によ
り２０℃で結晶化された。１０Ｈ１０：ＴＦ複合体は、０．１ＭのＣＨＥＳ、ｐＨ ９．
５中１８％のＰＥＧ ８０００を含有する溶液から結晶化された。Ｘ線データ収集のため
に、複合体の１つの結晶を、２０％グリセロールを補充した母液に数秒間浸漬し、３８℃
（１００Ｋ）の窒素流中で急速冷凍した。Ｓａｔｕｒｎ ９４４ ＣＣＤ検出器を装備し
たＲｉｇａｋｕ ＭｉｃｒｏＭａｘＴＭ−００７ＨＦ微小焦点Ｘ線発生装置、及びＸ−ｓ
ｔｒｅａｍ（商標）２０００循環冷却システム（Ｒｉｇａｋｕ）を用いて、Ｘ線回折強度
を測定した。構造は、高分子結晶学のＣＣＰ４プログラムスーツ（CCP4 suite of progra
ms）を用いて、分子置換によって決定された（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕ
ｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎｕｍｂｅｒ ４．１９９４．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓ
ｔ．Ｄ５０，７６０〜７６３）。

ＴＦ ＥＣＤは、免疫グロブリンフォールドを有する２つの位相的に同一のドメインか
ら成る。Ｎ末端ドメインは（ＥＣＤ、配列番号１の）残基１〜１０３に及び、Ｃ末端ドメ
インは残基１０４〜２１０に及ぶ。１０Ｈ１０エピトープは、ＥＣＤの残基Ｋ１４９〜Ｄ
１５０を中心とし、１０Ｈ１０の重鎖及び軽鎖の可変ドメインの間の深いポケットに至る
ことが見出された。１０Ｈ１０とＴＦとの間の接点は広範囲であり、６つのＣＤＲループ
全てが関与する（図１）。

注目すべき発見は、１０Ｈ１０のＴＦエピトープがＦＶＩＩ及びＦＸ結合部位と重なり
合わないことである（図２及び図３）。また、１０Ｈ１０及び５Ｇ９（凝固を阻害する能
力を有する別のマウスヒトＴＦ結合抗体であり、このエピトープは従前公表されている、
Ｈｕａｎｇら、１９９８ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７５：８７３〜９４）のエピトープ
は、部分的に重なり合っており、これら２つの抗体とヒトＴＦとの間の競合的結合を説明
している（図２及び図３）。

ヒトＴＦ ＥＣＤ：１０Ｈ１０接点
１０Ｈ１０は、ＥＣＤのＮ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間の接点でＴＦに結合す
る。ＴＦの凸面は、抗体の凹状ＣＤＲ表面に合致する。複合体形成の際に覆われる総面積
は、相互作用分子のそれぞれの上で１，１００Å２を超える。６つのＣＤＲの全てが、Ｔ
Ｆとの直接接触に関与する（接触は４Å原子間距離と定義される）。合計で、２４個のエ
ピトープ残基及び２５個のパラトープ残基が存在する。ＣＤＲ Ｌ１、Ｈ１、及びＨ３は
、接触の大部分を形成する。１０Ｈ１０：ＴＦ複合体のエピトープ及びパラトープを形成
する残基は、図１に概略的に示されている。

１０Ｈ１０エピトープは、ＴＦ ＥＣＤのＮドメインからの２つのセグメントと、Ｃド
メインからの３つのセグメントとを含む。Ｎドメインからの２つのセグメントは抗体と相
互作用する、つまり、残基６５〜７０はＨ−ＣＤＲ１及びＨ−ＣＤＲ３と相互作用し、残
基１０４はＨ−ＣＤＲ１と相互作用する。Ｃドメインの３つのセグメントは抗体と相互作
用する、つまり、残基１９５及び１９７は、Ｈ−ＣＤＲ１及びＨ−ＣＤＲ２と相互作用し
、残基１７１〜１７４は、Ｌ−ＣＤＲ１及びＬ−ＣＤＲ３と相互作用し、残基１２９〜１
５０は、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ３、Ｈ−ＣＤＲ１及びＨ−ＣＤＲ３と相互作用し、Ｔ
Ｆ残基Ｋ１４９〜Ｄ１５０は、エピトープの中心にあり、ＶＬドメインとＶＨドメインと
の間に形成される深いポケットに達し、それらの主なパートナーはそれぞれ、１０Ｈ１０
のＬＣ可変領域（配列番号５）のＤ９７、及びＨＣ可変領域（配列番号４）のＷ３３であ
る。

Ｂ．抗体特異性
ヒト、カニクイザル（配列番号２）、及びマウスＴＦ ＥＣＤ（配列番号３）のアミノ
酸配列が、図２に整列配置されている。ヒトの配列とカニクイザルＴＦ ＥＣＤの配列の
類似性は高く、これら２つが１０Ｈ１０接触残基において異なるのは、配列番号１の位置
１９７の１つ残基だけであり、この位置はカニクイザル配列ではＲ（Ａｒｇ）である。ヒ
ト配列のＴ１９７は、単一Ｈ−ＣＤＲ２残基によって接触されるので、１０Ｈ１０由来の
抗体の現在の組で見られる高レベルの交差反応性の説明がつく。

ヒト及びマウスＴＦ配列を並べることにより、有意なアミノ酸の相違がエピトープ残基
において生じるので、１０Ｈ１０の種特異性を決定するエピトープ残基は明白であった、
つまり、配列番号１と配列番号３とを対比すると、１０Ｈ１０がヒトＴＦと接触する２４
個の残基のうち、ヒト配列とマウス配列とは、Ｎドメインにおいて位置６８、６９、７０
、及び１０４で異なり、Ｃドメインにおいて位置１３６、１４２、１４５、及び１９７で
異なっている。この相違は、マウスＴＦに対する１０Ｈ１０の低い結合親和性と一致する
。

図２はまた、三元複合体への会合を説明する理論的３Ｄモデル（図３）に基づいた、Ｆ
ＶＩＩ及びＦＸに関するヒトＴＦ上の相互作用部位を示す（Ｎｏｒｌｅｄｇｅら、Ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ ５３：６４０〜６４８，２００３）。抗体５Ｇ９は、ＦＸ結合部位と部分的
に重なっているエピトープにおいてＴＦに結合する。したがって、５Ｇ９はＦＸと競合し
、これにより凝固カスケードの阻害が引き起こされる。１０Ｈ１０は、凝固を阻害しない
が、ＴＦ関連ＰＡＲを介したシグナル伝達を効果的に遮断するという点で、５Ｇ９と異な
る。三元ＴＦ／ＦＶＩＩ／ＦＸ複合体のモデルに基づき、１０Ｈ１０エピトープはＴＦの
自由表面上にあり、残基Ｋ１４９〜Ｄ１５０を中心としていることが予想された。突然変
異誘発によりマッピングされた１０Ｈ１０の結合及びペプチドエピトープマッピングは、
これが事実であるということを初期に証明した。

ＴＦ ＥＣＤと１０Ｈ１０ Ｆａｂとの間の複合体の本発明の結晶構造は、ＦＶＩＩ及
びＦＸがＴＦと又は互いに相互作用するのを妨げることなく、抗体がＴＦに結合できる方
法の空間マッピングを提供する。この構造によって明らかにされるような１０Ｈ１０エピ
トープは、三元複合体に理論的に存在する場合、ＴＦの自由表面を覆う。更に、１０Ｈ１
０エピトープは、凝固阻害ＭＡｂ（５Ｇ９）エピトープと部分的に重なり（Ｈｕａｎｇ
１９９８、上記）、共通の残基はＫ１４９及びＮ１７１である。１０Ｈ１０又は５Ｇ９は
いずれも、ＴＦに対するＦＶＩＩの結合を阻害しない。１０Ｈ１０及びＦＸのエピトープ
もまた重ならないが、現行モデルのＦａｂの定常ドメインとＦＸのプロテアーゼ（球状）
ドメインとの間に立体衝突が生じる。しかしながら、ＦＸの配向は実際にはモデルと異な
り、ＦＸとＴＦとの間の会合は、プロテアーゼドメインにおけるいくらかの柔軟性を可能
にすることに留意されたい。Ｆａｂの可変ドメインと定常ドメインとの間の肘角度にもか
なりの柔軟性があり、これは、１０Ｈ１０が三元複合体に結合する際の衝突を回避できる
ようにし得る。

実施例３：結合ドメインをヒトで用いるために適合させる
治療用タンパク質の有効性は、望ましくない免疫反応によって制限され得る。非ヒトモ
ノクローナル抗体は、ヒトでの免疫応答を誘発することができる、かなりの線形アミノ酸
配列鎖と、局所的な構造コンフォメーションを有し得る。非ヒトＭＡｂの標的結合の免疫
特異性に関与している残基のヒト抗体骨格への移動は、しばしば、標的抗原に対する結合
親和性の大きな損失をもたらす。したがって、ヒトに注入されたときに、親非ヒト分子の
結合及び生物物理学的プロファイルを保持すると同時に、最小免疫原性反応を誘発する抗
体分子を作成するための、しっかりした設計原理を用いることが極めて重要である。

米国特許出願第２００９０１１８１２７Ａ１号において前述されたように、またＦｒａ
ｎｓｓｏｎら、２０１０ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９８：２１４〜２３１で例示された
ように、ヒトＴＦと結合するとマウス抗体１０Ｈ１０の標的効果を示す、本発明の抗体種
を産生するために、結合親和性をヒト化しかつ回復又は強化させるために、２工程プロセ
スを用いた。ヒトフレームワーク適合（ＨＦＡ）と呼ばれる２工程プロセスは、１）ヒト
フレームワーク選択、及び２）親和性成熟工程から成る。

ＨＦＡプロセスにおいて、結合部位残基（ＣＤＲ）は、配列相同性及び構造的考察に基
づいて選択されたヒト生殖系列遺伝子と結合される。抗体のＣＤＲ割り当てのための２つ
の体系は、抗体配列の可変性に基づいているＫａｂａｔの定義、及び抗体の３次元構造の
解析に基づいているＣｈｏｔｈｉａの定義である。６個のＣＤＲの間で、それらが異なる
場合には、一方又は他方の体系が用いられる場合がある。軽鎖ＣＤＲの場合、Ｋａｂａｔ
の定義を使用する。

重鎖ＣＤＲ３の場合、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの両定義は同一である。重鎖ＣＤ
Ｒ１の場合、Ｃｈｏｔｈｉａの定義を使用して開始を定義し、Ｋａｂａｔの定義を使用し
て終結を定義する（パターンは、Ｗの後にＶ、Ｉ、又はＡのような疎水性アミノ酸が続く
ことによって定義される）。ＶＨ−ＣＤＲ２の場合、Ｋａｂａｔの定義を使用した。しか
しながら、ほとんどの抗体構造において、この配列に基づく定義は、ＣＤＲ２に属するよ
うにＦＲ３の一部に割り当てる。即ち、このＣＤＲのより短い変更体（これはこのＣＤＲ
のＣ末端領域について７残基前に終了する）も使用することができ、本明細書ではＫａｂ
ａｔ−７と呼ばれる。

ヒトＦＲ選択
抗原結合部位に含まれないＶ領域内の領域であると定義されるヒトＦＲ領域は、機能的
ヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ及びＩＧＨＪ遺伝子のレパートリーから選択された。ヒト生殖系
列遺伝子配列のレパートリーは、ＩＭＧＴデータベース（Ｌｅｆｒａｎｃ ２００５）を
検索し、「０１」対立遺伝子を一括してコンパイルすることによって得た。このコンパイ
ルから、重複遺伝子（アミノ酸レベルで１００％同一）及び対を成さないシステイン残基
を有する遺伝子はコンパイルから除外された。遺伝子コンパイルの最終更新は、２００７
年１０月１日に行われた。

ＶＨのＨＦＡのヒト配列の最初の選択は、ＦＲ−１〜３、並びにＨ−ＣＤＲ−１及びＨ
−ＣＤＲ−２を含むマウスＶＨ領域の全長に対する、ヒトＶＨ生殖系列遺伝子の配列相同
性に基づいた。次の段階で、選択されたヒト配列は、ＣＤＲの長さ、及びマウスのＣＤＲ
とヒト配列との間の配列類似性の両方を考慮したスコアを用いてランク順序付けされた。
ＢＬＯＳＵＭ ６２置換マトリックスのような標準突然変異マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏ
ｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ １９９２ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ １５；８９（２２）：１０９１５〜９）を、マウス及びヒト配列のＣＤＲのアラ
イメントを採点するために使用し、そして挿入及び／又は欠失がＣＤＲループにある場合
、大きなペナルティを適用する。ヒトＦＲ−４は、ＩＧＨＪ生殖系列遺伝子（Ｌｅｆｒａ
ｎｃ ２００５）とマウス１０Ｈ１０配列、ＩＧＨＪ４（配列番号６０）の配列相同性に
基づいて選択された。

ＶＬのヒトＦＲの選択にも同様の方法を用いた。この場合、ＩＧＨＶ遺伝子で使用され
たのと同じ手順で選択された生殖系列遺伝子ＩＧＶＫは、ＦＲ １〜３及びＬ−ＣＤＲ
１〜３を選択するための遺伝子としての役割を果たした。ヒトＩＧＪ−Ｋ２遺伝子（配列
番号６１）は、全ての変異体のＦＲ４として選択された。

１１個のＶＨ及び７つのＶＬ生殖細胞系列鎖が選択された。選択したＶＨ遺伝子は、主
にＩＧＶＨ−１遺伝子ファミリーから選択され、６個の配列はＩＧＶＨ１からであり、Ｉ
ＧＶＨ１−６９及びＩＧＶＨ１−ｆはより長い及びより短いＨ−ＣＤＲ２と共に用いられ
、２個の配列はＩＧＶＨ３からであり、１個の配列はＩＧＶＨ５遺伝子からであり、長い
及び短いＨ−ＣＤＲ２共に用いられた。ＶＬ遺伝子は、６個がＩＧＶＫ２遺伝子ファミリ
ーのものであり、１個がＩＧＶＫ４遺伝子ファミリーのものであった。

したがって、より長いＨ−ＣＤＲ２（配列番号７）を有するＶＨ変異体Ｈ１５、Ｈ１９
、及びＨ２１は、それぞれ、より短いマウスＣＤＲ−Ｈ２（配列番号２７）を用いたＨ２
２、Ｈ２３、及びＨ２４に対応した。接頭辞「ｓ」は、β鎖領域により少ないマウス残基
及びよい多くのヒト残基を有する試験変異体を意味する。用いたＶ領域表記及び用いた遺
伝子配列は、下記の表２及び３に示されている。

１１本の重鎖及び７つの軽鎖ヒトＦＲ変異体、更にはマウス１０Ｈ１０キメラ鎖を示す
９６のＭＡｂのライブラリを、一次スクリーニング用の上清を提供するために、９６ウェ
ル形式においてＨＥＫ ２９３Ｅ細胞で発現させた。一次スクリーニング用に、９６ウェ
ルプレートのＨＥＫ ２９３Ｅ細胞において一時的に発現する完全ＭＡｂを形成するため
に、標準的な組換え方法を用いて、選択された可変ドメインをコードするＤＮＡを組み換
えた。培養物からの上清液を、トランスフェクションから９６時間後に活性（結合）に関
して試験した。

一次スクリーニングの結果に基づき、１９個の変異体を、ＨＥＫ ２９３−Ｆ細胞にお
けるパイロットスケールでの発現及び精製用に選択した。パイロットスケールでの発現は
、７５０ｍＬの量のＨＥＫ ２９３Ｆ細胞又はＣＨＯ−Ｓ中で一時的に行われた。採取し
た上清をタンパク質Ａクロマトグラフィで精製し、精製タンパク質を、それらの親和性及
び機能活性について評価した。更に、精製タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰ
ＬＣ、及び相互作用クロマトグラフィ（ＣＩＣ）による生物物理学的特徴付けに供した。
理論的等電点（ｐＩ）を、各変異体についても計算した。パイロットスケールでの特徴付
けから、最終的な有力候補の組をＷＡＶＥ生物反応器にトランスフェクトし、タンパク質
Ａクロマトグラフィ（chromatorgraphy）で精製した。

結合性評価
ヒト及びカニクイザルＴＦの両方に対する親キメラ抗体、Ｍ１、及びＨＦＡ変異体の結
合は、化学発光による検出を用いる直接ＥＬＩＳＡ形式として行われた。粗上清中のライ
ブラリ変異体の一次スクリーニングでは、試料又は対照は、消費ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２
９３ ＨＥＫ培地（Ｇｉｂｃｏ）内で５０ｎｇ／ｍＬに正規化され、単一濃度測定で検定
された。本発明のアッセイでは、抗体の濃度は５ｎｇ（０．１ｍＬ使用）であり、ＴＦ
ＥＣＤ及び抗原は、Ｈｉｓ６−ＴＦ−ＥＣＤ_{１−２１９}であり、最終濃度１０ｎｇ／ウェ
ルで用いられた。

全コンビナトリアルライブラリのスクリーニングの結果は、Ｈ１４を除いて他の全ての
ＶＨが、様々な強度でｈＴＦに結合したことを示した。親１０Ｈ１０（Ｈ１３、Ｌ１）、
特に一部のＬ３及びＬ５の組み合わせよりも強い結合シグナルを与えたいくつかのＨＦＡ
変異体が存在する。Ｈ１８及びＨ２１は、ヒト抗原及びＶＨに結合せず、カニクイザル抗
原に対するわずかな結合を示した。ＶＬの中でも、Ｌ６及びＬ８はいずれの抗原にも結合
せず、他のＶＬは検出可能レベルで結合した。Ｈ１４及びＬ８もまた、任意のＶＬと組み
合わされると低発現を示した。表４に示されるように、ＴＦ結合を示したのは、７７個の
抗体（ＶＨ、ＶＬの組み合わせ）のうち５０個であった。

ＥＬＩＳＡを用いたＴＦに対する相対結合親和性に基づき、発現の増強及び精製のため
の１０個の変異体を選択した。ＢＩＡｃｏｒｅにより測定したＫ_Ｄの要約、ＥＬＩＳＡア
ッセイデータ、全細胞結合、５０ｎＭのＦＶＩＩａ及び２ｕｇ／ｍＬのＭＡｂによるＭＤ
Ａ−ＭＢ２３１細胞からのＩＬ−８誘導の阻害、及びＴｈｅｒｍｏｆｌｏｕｒアッセイに
より測定されたＴｍが、表５に示されている。

新規ヒトＭＡｂ変異体のいくつかは、Ｍ１（１０Ｈ１０可変鎖：Ｈ１３及びＬ１を有す
る）よりもＴＦに対して高い親和性を示し、いくつかは低かった。Ｍ６１のＫ_Ｄ（０．２
１ｎＭ）は、マウス親ＭＡｂ（Ｋ_Ｄ＝０．５６ｎＭ）のＫＤより２．５倍低い。表５のデ
ータは、共に同じ生殖系列遺伝子（ＩＧＨＶ５−ａ）から構築された、Ｈ１５を含む４つ
のＭａｂと、Ｈ２２を含む４つのＭａｂとを含む。Ｈ２２、及びより短いＨ−ＣＤＲ２を
有するＭａｂは概ね、対応するＨ１５を有する分子よりも高い結合親和性を示した。新規
変異体の多くはカニクイザルＴＦに結合したが、カニクイザル結合親和性のランクは、ヒ
トＴＦに対する結合のランクと異なった。

マウス１０Ｈ１０ ＭａｂのＴｍは７４．２℃であった。選択された分子のＴｍは、７
５〜８２．２℃のＴｍの範囲であった。このように、ＨＦＡプロセスは、ヒト及び非ヒト
霊長類ＴＦに対する高い結合親和性を有する新規Ｆｄ領域を有する抗体構築物の産生をも
たらし、更に、ヒトドメインを有する安定した完全抗体変異体を産生させた。

新規抗体構築物の追加的特徴付けは、その抗体が、ヒト腫瘍組織由来の細胞（ＭＤＡ−
ＭＢ２３１乳癌由来細胞）の天然ＴＦを認識することができ、また、ＭＤＡ−ＭＢ２３１
からのＩＬ−８の誘導抑制によって測定した場合、ＶＩＩａの存在下でＴＦシグナル伝達
を低減することができることを立証した。

更なる生物物理学的特徴（溶解度及び相互作用クロマトグラフィ）及びアッセイの結果
から、可変領域Ｈ２２及びＬ３から成るＭ５９を、親和性成熟のために選択するよう導か
れた。

実施例４：抗体成熟
Ｆａｂライブラリは、米国特許第６，４７２，１４７号（Ｓｃｒｉｐｐｓ）及び、国際
公開特許第２００９／０８５４６２号として発行された本出願人による同時継続中の出願
に記載されている、ｐＩＸファージディスプレイシステムにおいて、制限酵素部位に若干
の変更を加えて構築された。

ｈＴＦ複合体を形成する１０Ｈ１０の実験的構造に基づいて、ＶＬ及びＶＨの両方の多
様化のため、Ｈ１１６（配列番号１９）及びＬ３（配列番号２３）の対合であるＭ５９で
開始する２つのライブラリを設計した。これらライブラリは、多様化の標的となる位置に
関して異なり、並びに標的位置を多様化するために用いられるアミノ酸が異なっていた。
一方のライブラリは、以前にＴＦと接触していることが示された各ＣＤＲを示す合計で８
つの位置を多様化した。設計する際には、Ｌ１、Ｌ３、Ｈ１、及びＨ２に重点が置かれた
。Ｌ２の接触位置は多様化されず、Ｈ３の位置のほとんども多様化されなかった。Ｃｙｓ
及びＭｅｔなどの不安定な又は反応性のアミノ酸は避けた。

２つ目のライブラリは、結合及び非結合Ｆａｂ結晶構造の溶媒接触性を算定することに
よって決定された抗原結合部位の周囲のアミノ酸を多様化するように設計された。結合す
ると埋もれるが、なおも溶媒分子と接触している残基は、多様化の標的となった。合計で
１２個の残基（Ｖ_Ｌで６及びＶ_Ｈで６）を、この方法を用いて特定し、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａ
ｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｒｐ（Ｗ）
、及びＴｙｒ（Ｙ）を含む８個のアミノ酸の縮小集合で多様化した。結合したライブラリ
のサイズは、８^１２又は１０^１０個の変異体であると予想され、標準的ライブラリ限定ク
ローニング技術を用いてカバーされ得る。

ＣＤＲ接触残基ライブラリでは、位置は、ヌクレオチド二量体（Ｎ−二量体）合成法を
用いて、１５個のアミノ酸（全てＭｅｔ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、及びＧｌｕを除く）
で多様化された。

遅い解離速度（解離速度値の増加）又は早い結合速度（結合速度値の減少）を選択する
か、又はその両方を用いることによって親和性を高めることを目的として、ファージコー
トタンパク質ＩＸにディスプレイされるＦａｂライブラリを、当該技術分野において周知
のパニング法に従って、ビオチン化ｈＴ−ＥＣＤに対してパニングした。パニングは、ヒ
ト及びカニクイザルＴＦの両方を標的抗原として用いた。ファージは、ヘルパーファージ
感染によって生成された。バインダーは、ビーズ／抗原／ファージ複合体を形成するＳＡ
ビーズの添加により回収された。最終洗浄の後、対数増殖期ＴＧ−１大腸菌細胞の感染に
より、ファージをレスキューした。ファージを再度生成し、更なる一連のパニングに供し
た。

ｐＩＸ遺伝子をＮｈｅＩ／ＳｐｅＩ消化によって、選択したクローンから切除し、再連
結の後、ＤＮＡをＴＧ−１細胞に転換し、ＬＢ／寒天平板培地で一晩増殖させた。一晩培
養物は、（ｉ）コロニーＰＣＲ及びＶ−領域のシークエンシング、並びに（ｉｉ）可溶性
Ｆａｂ産生で用いられる。可溶性のＦａｂタンパク質を、多クローン性抗Ｆｄ（ＣＨ１）
抗体によりプレート上に捕捉した。適切な洗浄及び阻害の後、ビオチン化ｈＴＦを０．２
ｎＭ濃度で加え、ビオチン化ｈＴＦを、上記と同様に、ＨＲＰ共役ストレプトアビジン及
び化学発光読取値によって検出した。このｈＴＦ濃度で、親の結合百分率として定義され
る（全てのプレートに対照として存在する親Ｆａｂを１００％結合と定義する）Ｆａｂ変
異体のランク付けが可能である。

この基準により、Ｍ５９ Ｆａｂと比べて１００％以上の高さでヒトＴＦに結合する３
８１ Ｆａｂが選択された。

Ｖ領域（配列番号４又は１９）の位置２７及び３０〜３２に対応する重鎖ＣＤＲ１（配
列番号６）のＹ２、Ｉ５、Ｔ６、及びＹ７に一定の改変を示した、選択したクローンの解
析は、成功であった。接触残基ではないが、位置２７のみが芳香族アミノ酸（Ｔｙｒ及び
Ｐｈｅ）を受容した。１０Ｈ１０ ＦａｂにおけるヒトＴＦ配列番号１（図１）のＫ６８
、Ｔ１０１、Ｙ１０３、及びＬ１０４と直接接触する位置３０〜３２に関し、位置３０は
比較許容性であるが、３１及び３２は制限的であった（表６）。

１０Ｈ１０ ＦａｂのヒトＴＦ配列番号１（図１）のＰ１９４、Ｓ１９５、及びＴ１９
７と直接接触する残基である、配列番号４又は１９の位置Ｌ５２、Ｓ５５、及びＳ５７に
対応するＬ３、Ｓ６、及びＳ８（配列番号７）におけるＬ−ＣＤＲ２の改変では、置換許
容がいくぶん制限された組が存在した。

Ｈ−ＣＤＲ３では、ヒトＴＦ−ＥＤ（配列番号１）のＦ１４７、Ｇ１４８、及びＫ１４
９と直接接触する、配列番号４又は１９のＮ１０４に対応するＮ６位置（配列番号８）は
、制限されていることが明らかであった。

ファージパニング、及び０．２ｎＭのヒトＴＦ−ＥＣＤ１〜２１９を用いる固相捕捉ア
ッセイにおける同等な結合親和性のスクリーニングによって選択されたライブラリ位置の
それぞれで、可能となるアミノ酸改変が表６に示されている。

選択されたクローンのＶＬに関し、エピトープマッピングではヒトＴＦ配列番号１（図
１）のＥ１７４、Ｄ１２９、Ｓ１４２、Ｒ１４４、及びＤ１４５と接触して示される、Ｌ
Ｃ可変領域（配列番号５又は２３）の位置３２、３３、３４及び３６に対応するＬ−ＣＤ
Ｒ１（配列番号９）のＳ９、Ｇ１０、Ｎ１１、及びＫ１３における改変が、比較的許容性
であるとして図７に示されている。Ｌ−ＣＤＲ２に関し、配列番号５又は２３の残基Ｗ１
、位置５６（Ｋａｂａｔ残基番号５０）は接触残基である一方、残基Ｅ６１は、置換に対
する制限された許容性を示した。ヒトＴＦ配列番号１（図１）のＫ１４９、Ｄ１５０、Ｎ
１７１、及びＴ１７２と直接接触する、配列番号５又は２３の残基位置９７〜１００に対
応する軽鎖ＣＤＲ３（配列番号９）では、位置Ｄ９７（Ｋａｂａｔ位置９１）は制限され
た。ヒトＴＦ−ＥＣＤ１〜２１９クローン許容性アミノ酸使用に対する親和性結合に基づ
く選択が、表７にまとめられている。

要約すると、一連の親和性が改善されたＦａｂ変異体は、可変ドメインＨ２２（配列番
号１９）及びＬ３（配列番号２３）に対する、抗原ヒトＴＦとの接触位置にあるアミノ酸
のＣＤＲ位置の直接多様化、それに続くパニング、及び出発配列と比べて同等又はそれ以
上の結合のスクリーニングアッセイにおける親和性を有する種の選択に基づくファージラ
イブラリの構築を通して特定された。

全体的としては、設計されたＨＦＡライブラリから選択されるＶＨ及びＶＬの対に対す
る親和性の穏やかな増加が得られた。しかしながら、接触残基が多様化されたＶＨライブ
ラリから、ストリンジェントなファージパニングの後に親アミノ酸が再度選択された。構
造解析から説明されるように、２つのパラトープ位置だけが有意に改変された。親和性成
熟中にＣＤＲに導入されたこれら２つのアミノ酸置換、Ｔ３１Ｐ及びＳ５７Ｆは、接触残
基に関与する。５倍の親和性改善は、ＴＦのＳ１９５と接触するＦ５７の接点が増加した
ことに起因し得る。ＶＬとＴＦの相互作用は塑性であり、接触残基並びに隣接残基に対す
る多くの改変を可能にするように思われる。

３８１個のＶＨとＶＬの対の中から、４３個を更なる特徴付けのために選択した。選択
した４３個のＭＡｂは、２７個の異なるＶＨ、及び８個のＶＬを示し（重鎖及び軽鎖配列
の対に関しては表８を参照のこと）、３つのサブグループに分類することができる。グル
ープ１は、同じ軽鎖を有する変異体であり（Ｌ３、配列番号２３）、グループ２及びグル
ープ３は、２つの異なる重鎖と対になった８つの軽鎖によって示される（それぞれ、Ｈ１
１６及びＨ１７１、配列番号１３１及び６７）。

Ｍ５９のような同じ軽鎖を有する２７個の抗体のグループのうち（Ｌ３、配列番号２３
）、２７の重鎖は、Ｈ−ＣＤＲ１の３つの位置で異なっており（ＧＹＴＦＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｗ
ＩＥ）（配列番号８３）、ここで、Ｘ１は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、
Ｖ、Ｙから選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｐ、Ｓ、及びＴから選択され、Ｘ３は、Ｆ、Ｈ、及び
Ｙから選択される；（Ｈ−ＣＤＲ１がＧＦＴＦＩＴＹＷＩＡ（配列番号８１）であるＨ１
８９を除く）、Ｈ−ＣＤＲ２は４つの位置で異なっており（ＤＩＸ_１ＰＧＸ_２ＧＸ_３ＴＸ
_４）（配列番号１０７）、ここで、Ｘ１はＩ及びＬから選択され、Ｘ２はＳ及びＴから選
択され、Ｘ３は、Ａ、Ｆ、Ｈ、及びｗから選択され、Ｘ４は、Ｄ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、及びＮか
ら選択される；（Ｈ−ＣＤＲ２がＤＩＬＰＡＳＳＳＴＮ（配列番号１０５）であるＨ１８
９を除く）、一方、Ｈ−ＣＤＲ３及びＦＲは、Ｈ２２配列（配列番号１９）から変更され
ず、ＳＧＹＹＧＮＳＧＦＡＹ（配列番号８）であった。これら２７個のＭＡｂの重鎖の特
有の組成は次の通りである（表９）。

Ｈ１７１（配列番号１３９）は、Ｈ１１６と比べるとＨ−ＣＤＲ１及びＨ−ＣＤＲ２に
更なる改変を含み、Ｉ３１Ａ及びＳ５５Ｔである。

Ｍａｂの２つのグループは、２つの異なるＨＣ、つまり、Ｈ２２（配列番号１９）又は
重鎖Ｈ１７１（配列番号１３９）の一方と対になる８つのＬＣによって表わされる（表１
０）。８つの軽鎖は全て、Ｌ３のＲＦを有し（ＩＧＫＶ２４０＿Ｏ１由来）、並びに、Ｌ
−ＣＤＲ１の５つの位置で配列改変を有し（ＫＳＳＱＳＬＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＱＸ_５ＮＹ
ＬＴ（配列番号１１６）、ここで、Ｘ１は、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、及びＹから選択され、
Ｘ２は、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、及びＶから選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、及び
Ｖから選択され、Ｘ４は、Ｇ、Ｎ、及びＴから選択され、Ｘ５は、Ｋ、Ｒ、及びＳから選
択される）、Ｌ−ＣＤＲ２の２つの位置で改変を有し（Ｘ_１ＡＳＴＲＸ_２Ｓ（配列番号１
２０）、ここで、Ｘ１は、Ｈ及びＷから選択され、Ｘ２は、Ｄ、Ｅ及びＳから選択される
）、またＬ−ＣＤＲ３の４つの位置で改変を有する（ＱＮＤＸ_１Ｘ_２Ｘ_３ＰＸ_４Ｔ（配列
番号１２８）、ここで、Ｘ１は、Ｄ、Ｆ、及びＬから選択され、Ｘ２は、Ｓ、Ｔ、及びＹ
から選択され、Ｘ３は、Ｗ及びＹから選択され、Ｘ４は、Ｌ及びＭから選択される）。８
つのＬＣの組成は表１０に示されている。

これらＭＡｂのいくつかを、更なる特徴付けに供し、生体内異種移植モデルで試験した
（実施例５）。

実施例５：ＭＡＢの特徴付け
単一ＬＣ可変領域（Ｌ３、配列番号２３）及び単一ＨＣ可変領域（Ｈ２２、配列番号１
９）を含み、いくつかのＣＤＲ残基に異なる残基を有する、Ｍ５９に基づく変異体の、ヒ
トフフレームワーク適応及びライブラリ再選択の後、この新規Ｍａｂを、生物物理学的及
び生理活性アッセイに供し、また、異なるパラトープ残基を有する一対（paring）、Ｍ１
５８７を用いて、ＴＦ−ＥＣＤに対する１０Ｈ１０ Ｆａｂの結合に関して初めに特徴付
けされたエピトープ（実施例２）が変わったどうかを再度調べた。

ヒトＴＦ ＥＣＤ：Ｍ１５８７接点
１０Ｈ１０ ＣＤＲ、Ｍ１５８７（Ｌ３及びＨ１１６）に基づいたヒトに適合しかつ親
和性の成熟抗体と、ＴＦ ＥＣＤとの共結晶化を、Ｍ１５８７−Ｆａｂ：ＴＦ複合体が、
１６％のＰＥＧ ３３５０、０．２Ｍの酢酸アンモニウム、０．１Ｍの酢酸ナトリウム、
ｐＨ ４．５を含有する溶液から結晶化されたことを以外は、１０Ｈ１０（実施例３）と
同様の方法で行った。

ヒトＴＦ ＥＣＤの共結晶構造と親和性成熟Ｍ１５８７ Ｆａｂの共結晶構造との比較
は、１０Ｈ１０のヒト適合及び親和性成熟は、図２に示される抗体エピトープのフットプ
リントを変化させず、またＣＤＲのコンフォメーションも変化させなかったことを示す。
３つのアミノ酸置換（Ｔ３１Ｐ、Ｓ５７Ｆ、及びＮ５９Ｔ）は、Ｈ１１６（配列番号１３
３）の残基３１及び５７に接触残基（Ｔ３１Ｐ及びＳ５７Ｆである）を含む、ヒトフレー
ムワーク適合及び親和性成熟（配列番号６及び７は配列番号６３及び８６で置き換えられ
た）の間に、Ｈ−ＣＤＲ１及びＨ−ＣＤＲ２（それそれ、配列番号６及び２７、実施例２
に記載のＣＤＲ定義を使用）に導入された。親和性改善は５倍であり、これは、ＴＦのＳ
１９５と接触するＦ５７の接点が増加したことに起因し得る。たとえＨ−ＣＤＲ１及びＨ
−ＣＤＲ２パラトープ残基に変更がなされたとしても、ＨＦＡ及び親和性成熟中にエピト
ープが保存されることが、ヒトＴＦ ＥＣＤとＭ１５８７ Ｆａｂのとの構造により確認
された。

生物物理学的及び生物学的アッセイの結果
これら抗体の、ＢｉａｃｏｒｅによるＫＤ分析（表１１）、ヒトＴＦによるヒト血漿の
凝固時間（表１２）、及びＦＶＩＩａで刺激されたＭＤ−ＭＢ−２３１細胞からのＩＬ８
放出に関するＥＣ５０（表１３、１４、及び図５）に関する要約データが、以下に示され
ている。

４３個の選択された親和性成熟Ｍａｂに関し、マウス１０Ｈ１０、及びＭＡｂ（Ｍ１）
と、１０Ｈ１０からの非修飾ＣＤＲを有する選択されたヒトフレームワーク適合変異体と
のキメラバージョンのために生成されたデータを含むＫ_Ｄが（Ｍ数は１００未満）、表１
１に示されている。したがって、ヒトフレームワーク選択とＣＤＲ残基置換との組み合わ
せは、Ｋ_Ｄが８０〜９５０ｐＭの範囲であり、解離速度（Ｋｏｆｆ）が２．２×１０−５
秒−１〜２．６×１０−３秒−１の範囲であり、結合速度（Ｋｏｎ）が１０^４Ｍ−１秒−
１〜２．３×１０^５Ｍ−１秒−１の範囲である、ヒト抗体を産生させた。新規Ｍａｂは、
最初のマウス１０Ｈ１０又はキメラ構築物の値と比べて、最大で１０倍も小さい平衡解離
定数（Ｋ_Ｄ）（０．７７ｎＭ〜０．０８ｎＭ）を有し、より速い結合速度（Ｋ_ｏｎ＞１０
^５Ｍ−１秒−１）を有し、又はより遅い解離速度（Ｋｏｆｆ＝１０^５秒−１）を示す。こ
れら特性を用いて、滞留時間又は組織を通過する能力のいずれかが所望される、特定用途
用のＭＡｂを選択する際に利益をもたらすことができる。

凝固
新規Ｍａｂは、カルシウム及び外から加えられたヒトＴＦの存在下で、生体外で測定し
た場合に、ヒト血漿の凝固を阻害せずにヒトＴＦに結合する能力によって特徴付けられる
（表１２）。１７個のＨＦＡ（Ｍ数は１００未満）変異体及び３８個の親和性成熟変異体
（Ｍ１５８３以上）を検定し、Ｔ１／２最大（最大光学密度の５０％に達する時間（秒）
）を報告した。
全て、１０Ｈ１０（表１２）で観察されたのと同様の応答を示し、Ｔ１／２最大の値は
２０５秒未満であり、このことは、１５９±１７（ｎ＝１４）であった抗体のない溶媒対
照群と比較した場合に、これら抗体が凝固時間を長引かせないことを示している。前述し
たヒトＴＦ結合抗体であり（米国特許第７６０５２３５ Ｂ２号）、ＴＦに対するＦＸの
結合を阻害するマウス抗体５Ｇ９由来のＣＮＴＯ８６０は、凝固を長引かせ、同じアッセ
イで１８００秒以内に決して凝固に達しない。実施例４において変化したＣＤＲを有する
と記載された４３個のＭＡｂのうち５個は、２ｍｇ／ｍＬ未満の開始濃度を有したので、
凝固アッセイで試験しなかった。Ｍ１、Ｍ５９、及びＣＮＴＯ８６０の値は、複数回の試
験にわたって平均化された。

シグナル阻害活性
新規ＭＡｂは、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体を介してシグナル伝達を阻害する能力の観点か
らも説明され得る。乳癌細胞のＴＦ／ＶＩＩａ／ＰＡＲ２シグナル伝達は、ＶＥＧＦ２５
、Ｃｙｒ６１、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１、及びＩＬ−８などの血管新生促進
因子の広範なレパートリーを誘導する。ＦＶＩＩａが、ＴＦを発現するヒト乳癌細胞株で
あるＭＤＡ−ＭＢ−２３１？？？において検出可能なＩＬ−８を誘導することは、既に報
告されている（Ａｌｂｒｅｋｔｓｅｎら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ５：１５
８８〜１５９７，２００７）。したがって、このアッセイをバイオアッセイとして用いて
、ＴＦ／ＶＩＩａの誘導によるＩＬ−８の産生を阻害する変異体抗体の能力を評価した。

このアッセイの詳細は本明細書において上記されており、実施例３のＨＦＡ（Ｍ１０〜
Ｍ６８）変異体のうちの１９、及び実施例４のＣＤＲ変異体のうちの２９を試験した結果
を、単一濃度（０．５マイクログラム／ｍＬ）のＴＦにてＩＬ−８産生を阻害する能力に
ついて検証した。組織因子に結合しない坑ＲＳＶ抗体（Ｂ３７）を、陰性対照として用い
た。ＨＦＡ Ｍａｂの多くは、この濃度で、ＩＬ−８誘導を６７％を超えて阻害すること
ができた（表１３）。図５は、１０Ｈ１０のＭＡｂ（それぞれ配列番号６及び７）と比較
した場合の、Ｌ３軽鎖（配列番号２３）を共有し、かつＨ−ＣＤＲ１又はＨ−ＣＤＲ２に
置換を有する２７のＭＡｂによるＩＬ８放出の相対的阻害を示す。更に、これらのうち４
つ（Ｍ１５８４、Ｍ１６１１、ＴＦ７Ｍ１６１２、及びＴＦ７Ｍ１６０７）は、Ｍと共に
十分な滴定ＩＬ−８誘導アッセイに供された。計算された相対ＩＣ５０値は、親和性が改
善した変異体が、１０Ｈ１０のマウス−ヒトキメラであるＭ１と比べてより強力であると
いう知見を支持している（表１４）。実施例４に記載された親和性成熟抗体の他の親和性
成熟群は、同様の結果をもたらした。

実施例６：抗体の抗腫瘍活性
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を有するマウス異種移植モデル
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を、１０％のＦＢＳ及び１％のＬＮＮを有するＤＭ
ＥＭ培地で培養し、トリプシン処理によって対数期に採取し、滅菌無血清ＤＭＥＭ培地に
５×１０^７細胞／ｍＬで再懸濁させた。２０匹の雌ＳＣＩＤベージュ（Ｃ．Ｂ−１７／Ｉ
ｃｒＣｒｌ−ｓｃｉｄ−ｂｇＢＲ）マウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓから入手し、実験に先立って１４日間順応させた。生後約８週目に、マウス
の右腋窩乳腺脂肪体に２．５×１０^６ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を埋め込んだ。腫瘍の
サイズが約１００ｍｍ^３になったとき、マウスを腫瘍サイズによって治療群に階層化した
（Ｎ＝１０／群）。階層化した日に、１０ｍｇ／体重１ｋｇのＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩
衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）又はＭ１５９３による腹腔内投与治療を開始し、週１回投与を
続けて合計６回投与した。腫瘍及び体重を週１回記録した。各群の平均腫瘍容積が１５０
０ｍｍ^３に達した時点で研究を終了した。適用した統計検定は、反復測定二元配置分散分
析（ＰＲＩＺＭ ４．０、ＧｒａｐｈＰａｄ）であった。

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植モデルにおいて、Ｍ１５９３は、２２日目（^＊Ｐ＜０．
０１）に始まり、対照（ＤＰＢＳ処理）群を安楽死させた２９日目（^＊＊Ｐ＜０．００１
）まで続いた腫瘍成長を、有意に阻害した。Ｍ１５９３処理群は、３６日目に安楽死させ
た。Ｍ１５９３は、腫瘍成長を２９日目で約４９％阻害した。ＤＰＢＳ処理対照群と比較
して、Ｍ１５９３処理群における腫瘍成長遅延は約１１日であった（図６）。

Ａ４３１を有するマウス異種移植モデル
Ａ４３１ヒト扁平上皮癌細胞を、１０％のＦＢＳ及び１％のＬＮＮを有するＤＭＥＭ培
地で培養し、トリプシン処理によって対数期に採取し、滅菌ＨＢＳＳに１×１０^７細胞／
ｍＬで再懸濁させた。２０匹の雌ＳＣＩＤベージュ（Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＣｒｌ−ｓｃ
ｉｄ−ｂｇＢＲ）マウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから
入手し、実験に先立って１４日間順応させた。生後約８週目に、マウスの右脇腹に２×１
０^６ Ａ４３１細胞を埋め込んだ。腫瘍のサイズが約１１８ｍｍ^３になったとき、マウス
を腫瘍サイズによって治療群に階層化した（Ｎ＝１０／群）。階層化した日に、１０ｍｇ
／体重１ｋｇのＤＰＢＳ又はＭ１５９３による腹腔内投与治療を開始し、週１回投与を続
けて合計６回投与した。腫瘍及び体重を週２回記録した。各群の平均腫瘍容積が１０００
ｍｍ^３に達した時点で研究を終了した。適用した統計検定は、反復測定二元配置分散分析
（ＰＲＩＺＭ ４．０、ＧｒａｐｈＰａｄ）でった。

Ｍ１５９３は、対照（ＤＰＢＳ処理）群を安楽死させた２２日目（^＊Ｐ＝０．００６７
）における腫瘍成長を、有意に阻害した。ＣＮＴＯ５９２処理群は、３９日目に安楽死さ
せた。ＣＮＴＯ５９２は、腫瘍成長を２２日目で約５４％阻害した。ＤＰＢＳ処理対照群
と比較して、Ｍ１５９３処理群における腫瘍成長遅延は約１７日であった（図７）。

実施例７：変化したＦ_Ｃを有する抗体組成物
天然ヒトＦｃ受容体変異体は、ヒト抗体のＦｃタンパク質に対して実質的に異なる親和
性を有する。更に、臨床研究で、Ｆｃ操作されたｍＡｂで治療された後、強力結合Ｆｃ遺
伝子型を有する患者の奏効率及び生存率が改善したことが立証されている（Ｍｕｓｏｌｉ
ｎｏら２００８ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２６：１７８９〜１７９６（２００８）；
Ｂｉｂｅａｕら２００９ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２７：１１２２〜１１２９）。

ＴＦシグナル伝達の阻害は、細胞応答を減少させ、腫瘍増殖、移動、及び転移性の広が
りをもたらすと予想されるが、ＴＦ抗原が腫瘍細胞上に提示されるという事実は、抗体Ｆ
ｃによるＦｃ受容体結合に関連する機序により、標的細胞の選択的殺傷手段を提供する。
抗体のＦｃドメインの表面特徴は、グリカン組成物、並びに重鎖の一次配列の影響を受け
ることが知られており、それらの一方又は両方による修飾は、Ｆｃ受容体結合を変化させ
ることができる。

Ｍ１５９３として特定されるＭＡｂは、低フコースグリカン修飾ＩｇＧ１として、及び
更にはＩｇＧ１−ＣＨ２ドメイン変異体として産生された（Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅの付
番は、Ｋａｂａｔ ＥＵシステムのものである）。

ＭＡｂ組成物及び製造方法
フコース含有量が少ない抗体（Ｍ１５９３−ＬＦ）は、シグナルペプチドを有する以下
に示されるＭ１５９３（ＩｇＧ１／Ｋａｐｐａ）鎖をコードするベクターを、ＣＨＯ宿主
細胞株からタンパク質の低フコシル化のために選択されたＣＨＯ宿主細胞亜系統中に電気
穿孔することによって産生された。配列番号１６５は、可変ドメイン、残基１〜１１３（
配列番号２３及びＦＲ４、配列番号６１、下線）、及びヒトｋａｐｐａ定常軽鎖ドメイン
を含む完全な軽鎖を示す。可変ドメイン残基１〜１２０（配列番号１３９及びＦＲ４、配
列番号６０を含む、下線）、並びにＫａｂａｔ位置２３９及び３３２（配列番号１６７の
２４２及び３３５）である野生型ヒトＩｇＧアイソタイプ１ ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ
３を含む重鎖は、変異体Ｍ１５９３−ＤＥを産生するために、野生型残基Ｓ及びＤからそ
れぞれ、Ｄ及びＥに変更された。

Ｍ１５９３−軽鎖
（配列表１）

Ｍ１５９３−Ｋａｂａｔ位置Ｓ２３９がＤであり、Ｉ３３２がＥである重鎖
（配列表２）

ＣＨＯ細胞は、宿主細胞株として用いられるべき天然低フコース細胞のプールを単離す
るために、陰性レクチン選択（フコース結合レクチンに対する非結合の選択）及びＦＡＣ
Ｓソートを４回繰り返した後に、サブクローニングすることによって生成された。この細
胞株は、Ｍ１５９３を産生するのに用いたのと同じ宿主細胞由来であったので、その細胞
は、全く同じやり方で培養及び処理された。トランスフェクトされた細胞は、検出用タン
パク質Ｇを用いてメチルセルロース播種によってスクリーニングされ、コロニーを採取し
て９６ウェルプレートに入れた。培養を振盪フラスコに拡大し、力価測定した。上部の親
クローンは、バッチ振盪フラスコ培養でＭ１５９３−ＬＦを最高７０８ｍｇ／Ｌ（標準培
地中）産生した。

フコシル化パーセントを決定し、グリコシル化プロファイルの経時的安定性及び産生プ
ロセスを評価するために、２つのＭ１５９３−ＬＦ産生クローン（Ｃ２４５２Ｂ及びＣ２
４５２Ｄ）にＬＣ−ＭＳ糖ペプチドマッピングを行った（表１５）。試料は、継代１フェ
ドバッチ及び継代１０バッチ培養物から安定性試験中に収集され、精製された。バイオリ
アクター評価からの精製された試料を更に分析した。糖ペプチドマッピングは好ましいグ
リコシル化パターンを示し、Ｃ２４５２Ｂ及びＣ２４５２Ｄのフコシル化の割合は全体的
に低かった。重要なことに、フコシル化パーセントは時間とともに有意に増加せず、これ
は宿主細胞のフコシル化が安定的であることを示唆している。このように、Ｍ１５９３−
ＬＦのフコース含有量は、１０％未満、一般には５％未満、及び一部の調製物では２％未
満である。レクチンを選択しない宿主ＣＨＯ細胞で産生されるＭａｂは、８０％超過がフ
コシル化されるグリカン群を含んだ。

Ｍ１５９３のＦｃ突然変異体（Ｍ１５９３−ＤＥ）では、Ｍ１５９３を発現するプラス
ミドが特定部位の突然変異誘発に供された。

生物活性
３つの抗ヒトＴＦ Ｆｃ変異体（Ｍ１５９３、Ｍ１５９３−ＬＦ、及びＭ１５９３−Ｄ
Ｅ）は、ヒト及びカニクイザルＦｃ受容体の両方に対して親和性である（ＦｃγＲＩ、Ｆ
ｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）。これらアッセイは、本出願人による同時継続中の出
願（米国特許出願第６１／４２６６１９号）に記載される通りに、又はプラズモン共鳴（
Ｂｉａｃｏｒｅ）に基づく結合アッセイ（？）を用いて行われた。

これらアッセイの結果は、両方のＦｃ修飾抗ＴＦ抗体が、未修飾の親ＩｇＧ１ Ｍ１５
９３抗体よりもはるかに緊密に、１８倍（Ｍ１５９３−ＬＦ）及び４０倍（Ｍ１５９３−
ＤＥ）の強さで組み換えヒトＦｃγＩＩＩａ受容体に結合することを実証した（表１６）
。

ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａ結合により刺激される。ＡＤＣＣアッセイを、前述の通
りに行った（Ｓｃａｌｌｏｎら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４：１５２４〜１５３４
２００７）。

改善されたＦｃ受容体結合は、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用い、ヒト乳癌
細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を標的細胞として用いる機能的生体外ＡＤＣＣアッセイに反
映された（図８）。

Claims (6)

1. 単離された抗組織因子抗体であって、
   配列番号２３で示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域と、配列番号１３９で示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域とを含むか、あるいは、配列番号１６５で示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域と、配列番号１６６又は１６７で示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域とを含み、
   ３つの重鎖ＣＤＲ配列であるＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２及びＨ−ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号７６、９８及び８で示されるアミノ酸配列であり、かつ、３つの軽鎖ＣＤＲ配列であるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号９、１０及び１１で示されるアミノ酸配列である、
   前記抗体。
2. 前記抗体が、
   組織因子結合に関してＦＶＩＩａと競合せず、かつ、
   ＴＦ−ＶＩＩａ複合体の凝固促進活性、アミド分解活性を実質的に阻害しないが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からのサイトカインＩＬ−８放出によって測定される、ＴＦ−ＶＩＩａによって媒介されるシグナル伝達を阻害する
   抗組織因子抗体である、請求項１に記載の抗体。
3. 請求項１又は２に記載の抗体を含む、医薬組成物。
4. 下記（ａ）又は（ｂ）の核酸：
   （ａ）配列番号２３で示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域と、配列番号１３９で示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域とをコードするか、あるいは、配列番号１６５で示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域と、配列番号１６６又は１６７で示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域とをコードする、核酸；
   （ｂ）配列番号２３で示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域をコードする核酸と、配列番号１３９で示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域をコードする核酸とを含むか、あるいは、配列番号１６５で示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域をコードする核酸と、配列番号１６６又は１６７で示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域をコードする核酸とを含む、核酸。
5. 請求項４に記載の核酸を含む、ベクター。
6. 請求項５に記載のベクターを含む、宿主細胞。