KR20230067453A - 신규한 재조합 뉴캣슬바이러스벡터 및 이를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents

신규한 재조합 뉴캣슬바이러스벡터 및 이를 포함하는 백신 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20230067453A
KR20230067453A KR1020220030155A KR20220030155A KR20230067453A KR 20230067453 A KR20230067453 A KR 20230067453A KR 1020220030155 A KR1020220030155 A KR 1020220030155A KR 20220030155 A KR20220030155 A KR 20220030155A KR 20230067453 A KR20230067453 A KR 20230067453A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
newcastle disease
disease virus
vaccine composition
virus
vector
Prior art date
Application number
KR1020220030155A
Other languages
English (en)
Inventor
송창선
이지호
조용진
Original Assignee
건국대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 건국대학교 산학협력단 filed Critical 건국대학교 산학협력단
Priority to PCT/KR2022/017533 priority Critical patent/WO2023085760A1/ko
Publication of KR20230067453A publication Critical patent/KR20230067453A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 저병원성 조류인플루엔자의 헤마글루티닌 유전자를 포함하는 재조합 뉴캣슬바이러스 벡터 및 이를 이용한 백신 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 기존의 뉴캣슬바이러스 벡터에 A/Korean native chicken/Korea/N20-132/2020(H9N2) LPAIV의 HA 유전자를 포함함으로써 뉴캣슬병 바이러스와 저병원성 조류인플루엔자에 대한 우수한 예방효과를 얻을 수 있다.

Description

신규한 재조합 뉴캣슬바이러스벡터 및 이를 포함하는 백신 조성물{Novel Recombinant Newcastle Disease Virus and An Vaccine Composition Comprising the Same}
본 발명은 저병원성 조류인플루엔자의 헤마글루티닌 유전자를 포함하는 재조합 뉴캣슬바이러스 벡터 및 이를 이용한 백신 조성물에 관한 것이다
인플루엔자 바이러스는 Orthomyxoviridae에 속하는 RNA 바이러스이며 그 타입에 따라 A형, B형, C형으로 나뉜다. 이 중 A타입은 사람, 돼지, 조류 등에 감염이 가능하며 특히 감염 및 전염성이 높은 야생조류와 가금류는 조류인플루엔자 전파의 주요 요인으로 작용한다. 인플루엔자의 유전자는 여덟 부분(8 segment)으로 나누어져 있으며 이 중 두 구조단백질인 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다제(NA)의 특성에 따라 H1에서 H16까지 16종, N1에서 N9까지 9종의 아형으로 나뉘어진다. 이 두 단백질의 조합을 통해 이론적으로 144개의 아형이 존재할 수 있다.
조류 인플루엔자바이러스(Avian influenza Virus, 이하, "AIV")는 그 병원성에 따라 고병원성 조류인플루엔자 바이러스(Highly Pathogenic Avian Influenza, 이하, "HPAIV")와 저병원성 조류인플루엔자 바이러스(Low Pathogenic Avian Influenza 이하, "LPAIV")로 나뉘어진다.
저병원성 조류인플루엔자 바이러스 중에서 유라시아 유래 H9N2 아형 조류 인플루엔자는 G1, Y439 및 Y280-lineage의 뚜렷한 계통으로 진화했다. 한국에서는 Y439-like 바이러스에서 분화한 Korean-lineage의 H9N2 아형 조류인플루엔자가 1996년부터 국내 가금류에서 문제가 되었다. Korean-lineage H9N2 아형 조류인플루엔자에 대한 백신 개발과 방역 정책을 기반으로 점점 H9N2 아형 조류 인플루엔자의 발생이 감소하는 것으로 보였으나, 2020년에 Y280-lineage H9N2 아형 조류 인플루엔자 발생이 다시금 확인되었다. 최근 발생한 Y280-lineage H9N2 아형 조류인플루엔자는 현재까지 개발된 백신균주로는 예방이 불가능하였고, 다양한 가금류종에서 중증에서 경증의 질병을 유발하였으며, 2차 세균감염이 동반되면 계란 생산량 감소, 이환율 및 사망률 증가를 야기하는 것으로 확인되었다. 또한, Y280-lineage H9N2 아형 조류인플루엔자는 기존 Korean-lineage H9N2 아형 조류인플루엔자와 달리 인체감염도 일으킨 이력이 있기 때문에 공중보건학적인 측면에서도 Y280-lineage H9N2 아형 조류인플루엔자에 대한 백신 개발이 꼭 필요한 실정이다.
현재 국내에선 저병원성인 Y280-lineage H9N2 아형 조류인플루엔자에 대한 백신을 실시하지 않고 살처분 정책을 통해 대응을 하고 있으나 양계 및 오리 농장에 대한 살처분 보상금 및 환경문제, 윤리적 문제가 끊이지 않고 제기되고 있다.
현재 개발된 Y280-lineage H9N2 아형 조류인플루엔자에 대한 백신은 불활화 유성백신이 있다. 불활화 유성백신의 경우 장기 면역 및 교차 보호가 되지 않는다는 문제점이 있다. 본 발명자들은 이러한 문제점을 해결하고자 노력한 결과, 역유전자법을 이용하여 야생오리에서 분리된 K148/08 NDV(KCTC 11570BP)를 사용하여 바이러스 벡터를 제작하고 Y280-lineage H98N2 아형 조류인플루엔자 바이러스의 유전자를 삽입하여 벡터 백신을 제작하고 상기 벡터 백신의 효과가 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 목적은 Y280-lineage H9N2 저병원성 조류인플루엔자의 헤마글루티닌 단백질을 발현하여 저병원성 조류 인플루엔자와 뉴캣슬병 바이러스에 대한 방어능이 있는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터 및 이를 포함하는 재조합 바이러스를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이러스 벡터를 유효성분으로 포함함으로써 체액성 면역반응과 세포성 면역반응을 동시에 유발하는 저병원성 조류인플루엔자 바이러스에 대한 효율적인 백신 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 대상체, 구체적으로는 조류, 보다 구체적으로는 가금류, 가장 구체적으로는 닭에 투여하는 단계를 포함하는 저병원성 조류인플루엔자의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, LPAIV(Low Pathogenic Avian Influenza) H9N2 혈청형의 헤마글루티닌(HA) 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명은 닭 뿐만 아니라 전체 가금류에도 광범위하게 적용가능한 재조합 뉴캣슬병 바이러스 백신을 개발하기 위하여, 역유전자법을 이용하여 야생오리에서 분리된 K148/08 NDV(KCTC 11570BP) 벡터 시스템을 이용하고, LPAIV(Low Pathogenic Avian Influenza) H9N2 혈청형의 헤마글루티닌(HA) 유전자를 삽입하여 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 뿐만 아니라 뉴캣슬병 바이러스에 대해서도 효과적인 방어가 가능한 혁신적인 백신을 개발하고자 하였다.
상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터는 5'에서 3' 방향으로 순차적으로 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 것이며, 상기 뉴캣슬병 바이러스 벡터의 P(phosphoprotein) 유전자와 M(matrix) 유전자 사이에 LPAIV(Low Pathogenic Avian Influenza) H9N2 혈청형의 헤마글루티닌(HA) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자는 삽입 또는 위치하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터가 제공된다.
상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터는 상기 뉴캣슬병 바이러스의 인체 친화적 마커를 제거하기 위하여 상기 P 단백질의 226번째 아미노산이 류신(L)에서 글루타민(Q)으로 치환된 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 헤마글루티닌(HA) 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산 분자가 뉴캣슬병 바이러스 벡터에 삽입된 일 예를 도 1에 나타내었다.
본 발명에 사용가능한 뉴캣슬병 바이러스 벡터는 뉴캣슬병 바이러스 벡터의 5'에서 3'방향으로 순차적으로 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 것일 수 있으며, 또한 상기 NP 단백질의 암호화 유전자의 5'-말단에 연결된 T7 promoter, 리더 서열 및 3' UTR 서열과, 상기 L 단백질의 암호화 유전자의 3'-말단에 5'UTR, 트레일러 서열 및 T7 terminator 서열을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에 사용가능한 뉴캣슬병 바이러스 벡터는 약독화 균주(lentogenic) 벡터일 수 있으며, 보다 구체적으로는 선형의 플라스미드 백터일 수 있으며, 가장 구체적으로는 기탁번호 KCTC 11570BP로 기탁된 NDV K148/08 뉴캣슬병 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명의 바람직한 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터는 하기 도 1에 개시된 플라스미드 벡터일 수 있으며, 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 pK148/Y280-HA 벡터일 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 HA 단백질은 LPAIV(Low Pathogenic Avian Influenza) H9N2 혈청형의 헤마글루티닌(HA) 단백질일 수 있으며, 보다 구체적으로는 A/Korean native chicken/Korea/N20-132/2020(H9N2) LPAIV의 HA 단백질일 수 있다. 상기 HA 단백질은 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질로, 적혈구응집 단백질 또는 혈구응집소라고도 불린다. 상기 HA 단백질의 암호와 유전자는 서열번호 8로 표시되는 것일 수 있다.
상기 헤마글루티닌 단백질의 절단 부위(cleavage site)는 돌연변이된 것일 수 있다. 상기 돌연변이는 삽입, 절단, 결실, 치환, 점 돌연변이, 또는 격자이동 돌연변이된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 도입한 재조합 뉴캣슬병 바이러스를 제공한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스는 A/Korean native chicken/Korea/N20-132/2020(H9N2) LPAIV의 HA 단백질을 발현하는 것일 수 있다.
상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스는 상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터로 형질전환된 동물세포의 상층액을 발육란(embryonated egg)에 접종한 후 요막액(allantoic fluid)으로부터 수득하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 재조합 뉴캣슬병 바이러스를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 재조합 뉴캣슬병 바이러스를 유효성분으로 포함하는 저병원성 조류인플루엔자의 감염증 예방용 조류 면역화용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 조성물은 뉴캣슬병 바이러스와 저병원성 조류인플루엔자 바이러스의 예방용 백신일 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물, 면역화용 조성물은 상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스를 유효성분으로 포함하기 때문에, 그 자체만으로도 우수한 면역원성을 구현할 수 있으나, 그 효과를 더욱 강화하기 위하여 적어도 하나의 수의학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 담체는 상기 백신 조성물을 제형화하기 위해 사용하는 것으로 통상 희석제, 부형제, 안정화제, 방부제 등을 포함할 수 있다.
상기 희석제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유, 땅콩유와 같은 식물성유 등의 비수성 용매나염수(바람직하게는 0.8%의 염수), 완충 매질을 포함한 물(바람직하게는 0.05M의 인산염 완충액) 등의 수성 용매 등을 들 수 있으나, 특별히 여기에 한정되는 것은 아니다.
상기 부형제로는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 나트륨 클로라이드, 무수 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜,물, 에탄올 등을 들 수 있으나, 특별히 여기에 한정되는 것은 아니다.
상기 안정화제로는 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로스, 덱스트란, 글루타메이트, 글루코스 등의 탄수화물이나분유, 혈청 알부민, 카제인 등의 동물성, 식물성 또는 미생물성 단백질 등의 단백질을 들 수 있으나, 특별히 여기에 한정되는 것은 아니다.
상기 방부제로는 티메로살, 메르티올레이트, 젠타마이신, 네오마이신, 니스타틴, 암포테리신 B,테트라사이클린, 페니실린, 스트렙토마이신, 폴리믹신 B 등을 들 수 있으나, 특별히 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 재조합 뉴캣슬병 바이러스는 상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터로부터 제조된 것일 수 있으며, 상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터와 재조합 뉴캣슬병 바이러스는 전술한 바와 같다.
상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스는 LPAIV(Low Pathogenic Avian Influenza) H9N2 혈청형의 헤마글루티닌(HA) 단백질을 발현하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터로부터 제조된 것으로, 조류 및 포유동물에서 뉴캣슬병 바이러스 및 저병원성 조류인플루엔자 바이러스(특히, Y280-lineage H9N2 저병원성 조류인플루엔자)에 대하여 동시 면역능력을 나타내는 장점을 지닌다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 백신 조성물은 생독 백신, 사독 백신, 서브유니트 백신, 벡터 백신, 키메라 백신 및 DNA 백신을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 백신 조성물은 뉴캣슬 바이러스 및 조류 독감을 예방하기 위한 것일 수 있다. 상기 백신 조성물은 조류(예, 닭, 오리) 또는 포유류(예, 사람, 돼지, 개, 고양이, 말, 소, 양, 마우스, 낙타)에 투여하기 위한 것일 수 있다. 상기 예방은 상기 백신 조성물의 투여에 의해 뉴캣슬병 바이러스에 의해 유발되는 질환 뿐만 아니라, 인플루엔자 바이러스에 의해 유발되는 질환(예, 독감, 조류 독감)의 발생을 억제하거나 그의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다.
상기 면역화용 조성물은 저병원성 조류인플루엔자로부터 발현되는 관심의 항원 또는 면역원에 대해 면역 반응을 유발시키는 임의의 조성물을 의미하는 것으로, 예를 들면, 대상에 투여될 후 관심의 표적 면역원 또는 항원에 대해 면역 반응을 유발시킬 수 있는 조성물을 포함한다.
상기 백신 조성물은 관심의 항원에 대하여 방어 면역 반응을 유도하거나 또는 그 항원에 대해 효과적으로 방어하는 조성물을 의미하는 것으로, 예를 들면, 대상에 투여하거나 주사된 후 표적 항원 또는 면역원에 대해 방어 면역 반응을 유발시키거나 또는 뉴캣슬병 바이러스 및 저병원성 조류인플루엔자, 바람직하게는 본 발명에 따른 뉴캣슬병 바이러스와 인플루엔자 바이러스에 의해 유발되는 질환(예, 독감, 조류 독감)에 대해 효과적인 방어를 제공하는 임의의 조성물을 포함한다.
상기 백신 조성물이 투여되는 대상은 조류 또는 포유류에 속하는 동물을 포함하나, 바람직하게는 조(Aves) 강에 속하는 임의의 모든 가내 및 야생 조류를 의미하는 것으로, 신조상목 및 치조상목을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 신조상목은 기러기목, 칼새목, 부세로포메스, 쏙독새목, 도요목, 황새목, 쥐새목, 비둘기목, 파랑새목, 뻐꾸기목, 매목, 갈벌리포메스, 닭목, 아미목, 두루미목, 무소파기포메스, 오피스토코미포메스, 참새목, 다라새목, 홍학목, 딱다구리목, 논병아리목, 바다제비목, 앵무목, 펭귄목, 올빼미목, 벌새목, 비단날개새목, 세가락메추라기목 및 후투티목 등을 포함할 수 있다. 치조상목은 키위새목, 화식조목, 공조목, 레아목, 타조목 및 티니아미포메스 등을 포함하며, 보다 바람직하게는 오리, 닭, 거위, 칠면조, 기니아 파울(guinea fowl) 또는 메추리일 수 있고, 더욱 바람직하게는 닭 또는 오리일 수 있다. 상기 조류 대상은 성숙 조류, 조류 새끼 및 조류 배아/난을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 발육종란내(In Ovo), 비강내, 기관내, 경구, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 직장, 국소, 동맥내, 경피, 흡입, 결막 및 피하로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경로를 통해 투여될 수 있으나, 특별히 여기에 제한되지 않으나, 바람직하게는 비강내, 흡입, 결막, 경구로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경로를 통해 투여되는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 경구일 수 있다.
상기 조성물은 1마리 이상의 개체, 구체적으로 조류 대상에게 동시 접종되는 것일 수 있다. 상기 동시 접종은 분무 또는 점안 접종되는 것일 수 있다. 상기 조성물은 1마리 이상의 개체에 대하여 동시 투여할 수 있다. 상기 동시 접종용 조성물은 분무 접종법, 점안 접종법, 또는 음수 투여법에 의해 투여될 수 있다. 동시 접종용 조성물은 개별 접종용 백신 조성물에 비하여 일회 투여에 의한 백신 투여 개체의 수가 현저히 증가될 수 있다. 상기 백신 조성물은 약 10 마리 이상의 개체에 대하여 동시 투여할 수 있다. 상기 백신 조성물은 약100 마리 이상의 개체에 대하여 동시 투여할 수 있다. 상기 백신 조성물은 약 1,000 마리 이상의 개체에 대하여 동시투여할 수 있다. 상기 백신 조성물은 약 10,000 마리 이상의 개체에 대하여 동시투여할 수 있다. 상기 백신 조성물은 약 50,000마리 이상의 개체에 대하여 동시투여할 수 있다. 상기 백신 조성물은 약 100,000 마리 이상의 개체에 대하여 동시투여할 수 있다. 상술한 접종 방법은 상기 백신 조성물의 효용성 평가에 중요한 요소일 수 있다.
상기 백신 조성물 또는 면역원성 조성물은 상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터 또는 재조합 뉴캣슬병 바이러스를 유효한 양으로 포함할 수 있다. 용어 "유효한 양"은 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 예방 또는 치료의 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다.
상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 백신 조성물은 약 105EID50 내지 1010EID50를 포함한 양으로 투여될 수 있고, 바람직하게는 106EID50 내지 1010EID50를 포함한 양으로 투여될 수 있으며, 보다 바람직하게는 107EID50 내지 1010EID50를 포함한 양으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 107.5EID50 내지 1010EID50를 포함한 양으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 2회 내지 24회, 1주일에 1회 내지 6회, 1개월에 1회 내지 3회, 또는 1년에 1회 내지 12회 투여될 수 있다.
상기 백신 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 뉴캣슬 바이러스 및 조류 독감 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 백신 조성물을 조류 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 조류 대상의 접종 방법 또는 면역화 방법이 제공될 수 있다.
상기 방법을 통해 저병원성 조류인플루엔자, 바람직하게는 본 발명에 따른 뉴캣슬병 방이러스와 인플루엔자 바이러스에 의해 유발되는 질환(예, 독감, 조류 독감)에 대해 효과적인 방어를 제공하여, 뉴캣슬병 바이러스 및 조류 독감을 예방하거나 치료하거나, 면역화할 수 있다.
상기 개체는 조류 또는 포유류(예, 사람, 돼지, 개, 고양이, 말, 소, 양, 마우스, 낙타)에 속하는 동물을 포함하나, 바람직하게는 조(Aves) 강에 속하는 임의의 모든 가내 및 야생 조류를 의미하는 것으로, 신조상목 및 치조상목을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 신조상목은 기러기목, 칼새목, 부세로포메스, 쏙독새목, 도요목, 황새목, 쥐새목, 비둘기목, 파랑새목, 뻐꾸기목, 매목, 갈벌리포메스, 닭목, 아미목, 두루미목, 무소파기포메스, 오피스토코미포메스, 참새목, 다라새목, 홍학목, 딱다구리목, 논병아리목, 바다제비목, 앵무목, 펭귄목, 올빼미목, 벌새목, 비단날개새목, 세가락메추라기목 및 후투티목 등을 포함할 수 있다. 치조상목은 키위새목, 화식조목, 공조목, 레아목, 타조목 및 티니아미포메스 등을 포함하며, 보다 바람직하게는 오리, 닭, 거위, 칠면조, 기니아 파울(guinea fowl) 또는 메추리일 수 있고, 더욱 바람직하게는 닭 또는 오리일 수 있다. 상기 조류 대상은 성숙 조류, 조류 새끼 및 조류 배아/난을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 발육종란내(In Ovo), 비강내, 기관내, 경구, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 직장, 국소, 동맥내, 경피, 흡입, 결막 및 피하로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경로를 통해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조성물은 1마리 이상의 개체, 구체적으로 조류 대상에게 동시 접종되는 것일 수 있다.
상기 조성물의 투여량은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 백신 조성물은 약 105EID50 내지 1010EID50를 포함한 양으로 투여될 수 있고, 바람직하게는 106EID50 내지 1010EID50를 포함한 양으로 투여될 수 있으며, 보다 바람직하게는 107EID50 내지 1010EID50를 포함한 양으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 107.5EID50 내지 1010EID50를 포함한 양으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 2회 내지 24회, 1주일에 1회 내지 6회, 1개월에 1회 내지 3회, 또는 1년에 1회 내지 12회 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 뉴캣슬병 바이러스의 생산방법은 다음과 같다.
상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 숙주 세포주에 접종하고, 상기 숙주 세포주를 배양한 다음, 상기 숙주 세포주의 배양물로부터 재조합 뉴캣슬병 바이러스를 수득할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 바이러스 pK148/Y280-HA는 통상의 바이러스 작출 방법을 통해 회수할 수 있다. HA 단백질 발현을 위한 감염성 클론 cDNA 서열을 제작 완료한 후 3종의 Supporting Plasmid(NP, P, L)를 Hep-2 세포주에 주입하여 배양한 후 재조합 바이러스를 회수하는 절차는 통상적인 방법에 따라 실시하였다. 세포주에 주입방법은 lipofectamine 3,000을 이용한 transfection을 실시하였다. 3~4일 배양 후 재조합 바이러스를 회수하여 8에서 10일령 SPF 유정란 allantoic cavity에 접종하여 바이러스를 배양한 후 allantoic fluid를 회수하여 다시 같은 방법으로 유정란에 blind passage를 최소 2대 이상 배양하여 바이러스 역가를 높이는 작업을 수행하였다. 이후 allantoic fluid로부터 통상의 정제 방법을 통해 정제하여 사용할 수 있다. 재조합 바이러스의 정제는 통상의 정제방법이라면 특별히 제한되지 않으나, 크로마토그래피나 ultrafiltration 방법을 통해 추출을 포함하여 공지된 방법을 통해 정제 가능하다. 크로마토그래피를 이용한 정제 방법은 친화성, 이온 교환, 크기별 배제 그리고 소수성 등의 결합력 차이를 통해 적절한 resin과 buffer의 조합을 통해 바이러스 정제가 가능하다.
본 발명에 따른 백신 조성물 생산방법은 다음과 같다.
SPF 발육란에 rK148/Y280-HA 바이러스를 접종하고, 접종 후 24시간마다 검란을 실시하여 중사란을 확인한다. 접종 72시간 후 접종란을 4 ℃에 냉장한 후 요막강액(Allantoic Fluid)을 채취하여 닭 적혈구 응집반응을 통해 바이러스의 배양을 확인한다. 배양이 확인된 바이러스는 9-11일령 SPF 발육란에 십진 희석 후 접종하여 바이러스 역가(EID50)를 측정한다. 상기 바이러스를 사용하여 생백신으로 사용할 수 있으며, 또는 포르말린을 최종함량 0.05 내지 0.1%(v/v)가 되도록 첨가하고 37 ℃ 온도에서 24시간 교반하여 바이러스를 불활화하여 사독백신으로 사용할 수 있다.
또한, 상기 불활화된 바이러스는 오일 어쥬번트(Seppic ISA70)과 3:7 중량비로 혼합하여 사독백신을 제조할 수 있다.
상기 백신 조성물은 상기 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 더 포함할 수 있으며, 상기 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 당업계에 잘 알려져 있는 것으로, 예를 들면, 살균수, 식염수 용액 또는 인산염 완충액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 백신 조성물을 제조하기 위하여, 상기 재조합 바이러스 벡터 또는 재조합 바이러스는 그 자체로 사용할 수도 있지만, 수의학으로 수용 가능한 매개체 내에 장입할 수 있고, 부형제로서 선택적으로 어쥬번트(adjuvant)를 보충할 수 있다. 본 발명의 특별한 구현양태에서, 조성물은 면역원성 조성물 및 항원보강제를 포함하고, 이들로 필수적으로 구성되고/되거나 구성된다. 본 발명의 항원보강제의 비제한적인 예는 알루미늄 유래 항원보강제, 사포닌, 미네랄 겔, 다가음이온, 플루로닉 폴리올, 사포닌 유도체, 리소레시틴 및 다른 유사한 표면 활성 물질, 글리코시드, 모든 유형의 오일 및 이들의 조합을 포함한다. 본 발명의 특별한 구현양태에서, 조성물은 수-중-유-중-수 에멀젼을 포함할 수 있다.
상기 매개체로는 아데노바이러스, 허피스바이러스, 폭스바이러스 등과 같은 전달매개체를 사용할 수 있으나 이에만 한정되는 것은 아니다. 또한 어쥬번트로서 수산화알루미늄을 사용하거나, 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체, 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 중합체 등을 사용할 수 있고, 백신을 O/W(oil-in-water) 에멀젼 형태로 제형화할 수 있다. 상기 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체는 특히 당 또는 폴리알코올의 폴리알케닐 에테르로 가교결합되어 있다. 이들 화합물은 카보머(carbomer)라는 명칭으로 알려져 있다. 또한, 상기 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 공중합체 중에서 말레산 무수물과 에틸렌의 공중합체로는 선형 또는 예를 들면 디비닐에테르와 가교결합된 EMA(R) 공중합체(Monsanto사)가 사용될 수 있다. 최종 백신 조성물에서의 중합체 농도는 0.01% 내지 1.5%(w/v), 보다 구체적으로는 0.05% 내지 1%(w/v), 바람직하게는 0.1% 내지 0.4%(w/v)일 수 있다.
상기 O/W 에멀젼은 특히 액체 파라핀 경유(유럽 약전 타입); 스쿠알란, 스쿠알렌과 같은 이소프레노이드 오일; 이소부텐 또는 데센의 존재 하에 알켄의 올리고머화로 얻어지는 오일; 선형 알킬기를 함유하는 산 또는 알코올의 에스테르, 특히 식물유, 에틸올레이트, 프로필렌글리콜 디(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴트리(카프릴레이트/카프레이트), 프로필렌글리콜 디올레이트; 분지형 지방산 알코올 또는 산의 에스테르, 특히 이소스테아르산의 에스테르 등을 기본으로 할 수 있다. 에멀젼을 형성하기 위해 상기 오일은 유화제와 혼합하여 사용된다.
바람직한 유화제로는 비이온성 계면활성제, 특히 소르비탄, 만나이드, 글리세롤, 폴리글리세롤 또는 프로필렌글리콜의 에스테르; 및 선택적으로 에톡시화되어 있는 올레산, 이소스테아르산, 리신올레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르, 또는 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체 등을 들 수 있다.
본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 NDV와 함께 A/Korean native chicken/Korea/N20-132/2020(H9N2) LPAIV의 HA 유전자를 포함함으로써 뉴캣슬병 바이러스와 저병원성 조류인플루엔자에 대한 두가지 바이러스에 대한 예방효과를 갖는 2가(divalent) 백신을 제조할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 백신 조성물은 분무 또는 음수 접종 시에도 우수한 예방 효과를 갖는 생백신 개발이 가능하며, 양계 농장에서의 저병원성 조류인플루엔자에 대한 피해 저감하고, 양계 백신 수입을 대체하여 백신접종비용을 절감하며, 생산량을 증대시키는 효과를 갖는다.
도 1은 pK148/Y280-HA 벡터의 개열지도이다.
도 2는 pK148/Y280-HA 벡터의 전체 게놈 분석결과로, HA 유전자 서열 내에 변이가 없는 것을 확인하였다.
도 3은 P 유전자와 M 유전자 사이의 NCR에 Y280-HA 유전자가 삽입된 rK148/Y280-HA의 Y280-HA 단백질 발현 여부를 확인하기 위한 western blot 분석결과이다.
도 4는 K148(a)과 rK148/Y280-HA 바이러스(b)의 증폭능을 분석하여 나타낸 결과 그래프이다.
도 5는 분무 백신으로 처리한 닭(실험군 1 내지 3)(a)과 음수 백신으로 처리한 닭(실험군 7 내지 9)(b)에서의 저병원성 조류인플루엔자인 Y280 H9N2 바이러스에 대한 혈청 HI 항체를 나타낸 결과이다.
도 6은 분무 백신으로 처리한 닭(실험군 4, 5)(a)과 음수 백신으로 처리한 닭(실험군 10 내지 12)(b)에서의 K148 NDV 바이러스에 대한 혈청 HI 항체를 나타낸 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 야생형 H9N2형 계통의 Y280 HA 단백질을 발현하는 바이러스의 의 제조 및 확인
1-1. 사용된 세포 및 바이러스
8%의 Fetal bovine serum과 항생제로 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, CCL-81; ATCC)에서 CEF(Chicken embryo fibroblast)와 Hep-2 세포주를 배양하였다. K148 NDV(newcastle disease virus)(KCTC 11570BP)가 야생 조류 배설물로부터 분리하는 것은 이전 실험에서 설명되었다[대한민국 공개특허공보 제10-2011-0045605호]. T7 역전사효소 공급을 위한 수정된 Vaccinia Ankara T7 재조합 바이러스(MVA-T7)는 Bernard Moss(미국국립보건소; NIH)가 제공해 주었다. MVA-T7 바이러스는 향후 사용을 위해 CEF 세포에서 배양되었다.
본 연구에서 사용된 H9N2형 LPAIV은 한국 재래시장의 감연된 닭으로부터 분리된 분리주 A/Korean native chicken/Korea/N20-132/2020(H9N2)(이하, N20-132로 명명하였다)이며, 이 바이러스는 자체분리 균주로, Genbank accession number: OM780106이다.
1-2. RNA 준비
분리된 K148 NDV(newcastle disease virus) 균주와 N20-132 H9N2 LPAIV는 각각 37 ℃에서 72시간 동안 10일령 SPF(Specific pathogen free) 수정란에 접종되었다. 접종된 종란에서 요막공간액(Allantoic fluid)(또는 요수라고도 한다)을 채취하고 RNeasy 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 수확된 요막공간액에서 바이러스 RNA를 추출하였다. K148 NDV full genome과 H9N2 LPAIV HA 유전자의 cDNA는 SuperScript IV first-Strand system(Thermo Fisher scientific, California)을 사용하여 합성되었다.
1-3. K148 바이러스의 전장 cDNA 클로닝
K148 NDV 바이러스의 cDNA는 인접한 조각들 간에 약 300 bp의 뉴클레오티드가 중첩되어 있는 6개의 절편으로 나뉘었다(도 1). 6개 절편 모두 유전자별 프라이머 6세트를 사용하여 PCR을 통해 증폭하고, RBC TA cloning vector(RBC Bioscience, Taipei, Taiwan)로 cloning 하였다(표 1). 각 절편은 In-Fusionㄾ PCR 복제 키트(Clontech, Mountain View, CA)를 사용하여 pBluescript 벡터에 순차적으로 삽입되었다. pfuUltraTM II fusion HS DNA polymerase(Stratagene, La Jolla, CA)는 각 절편의 증폭 및 벡터 선형화에 사용되었다. 벡터 플라스미드는 각각의fragment의 삽입 이전에 선형화되었다. Supporting Plasmid를 제작하기 위해Nucleoprotein(NP), Polymerase(P) 및 Large polymerase(L) 유전자는 발현 플라스미드에 클로닝(cloning) 되었다. 벡터 선형화 및 각 fragment의 삽입에 사용되는 프라이머는 표 2에 요약하였다. K148 바이러스의 전장 지놈 cDNA 클론(pK148)은 HIT-DH5αcompetent cell에 형질전환되었고, 37 ℃에서 18시간 동안의 배양 이후 PureLink™HiPure plasmid midiprep kit(Thermo Fisher Scientific, California, USA)을 사용하여 플라스미드를 분리 및 정제하였다.
K148 cDNA의 여섯개 절편과 NP, P, L 유전자 증폭에 사용된 프라이머
번호 서열 프라이머
9 5'-ACCAAACAGAGAATCTGTAAGG-3' F1_F
10 5'-TCAGTACCCCCAGTCGG-3' F1_R
11 5'-GTGACCAGATGAGCTTTGC-3' F2_F
12 5'-TTAGCCATTCAGTGCAAGG-3' F2_R
13 5'-GTGCATTGATCATGTCACG-3' F3_F
14 5'-GTCAGTTTGACATTGACCTTG-3' F3_R
15 5'-GATAGAAGAACTTGACACCTC-3' F4_F
16 5'-GAGCCATGCAAACTTGGCTG-3' F4_R
17 5'-ATGGCGRGCTCCGGTCC-3' F5_F
18 5'-AACAGCATTGCATGCATGC-3' F5_R
19 5'-GACTAACCTTCAATACTCAAG-3' F6_F
20 5'-ACCAAACAAAGATTTGGTGAATG-3' F6_R
21 5'-ATGTCTTCTGTATTCGATGAG-3' NP_F
22 5'-TCAGTACCCCCAGTCGG-3' NP_R
23 5'-ATGGCCACCTTYACAGATG-3' P_F
24 5'-TTAGCCATTCAGTGCAAGG-3' P_R
25 5'-ATGGCGRGCTCCGGTCC-3' L_F
26 5'-TTAAGAGTCACAGTTACTRTAATATC-3' L_R
Rescued rK148/Y280-HA 전장 유전체 시퀀싱을 위해 사용된 primer 시퀀스
Primer Primer Sequence Primer name
27 5'- GGCAGAAGGCTTTCTCGAGT -3' 21 R
28 5'- ACTCGAGAAAGCCTTCTGCC -3' 2 F
29 5'- GCAAAAGCCATGACTGCGTA -3' 553 F
30 5'- GCCTCTCTTGAGCTCGCTAA -3' 738 R
31 5'- CAACCAGAAGCCGGGGATG -3' 1,333 F
32 5'- GAAGCAGGCTGGGTTTTGTC -3' 1,516 R
33 5'- GCAACTCTCTGCTGTTGATGC -3' 2,130 F
34 5'- GTCTGTGCCCTGGTTTCCA -3' 2,323 R
35 5'- AGGAAAATCAAGCGCCTTGC -3' 2,945 F
36 5'- TCCCATCAGATTTTATCCGCAG -3' 3,914 R
37 5'- CGTTGGGTTCCAATGCAGTG -3' 4,530 F
38 5'- AGAGATGAGGCGACAGTCGA -3' 4,746 R
39 5'- AAGCGTCCCAAATACCGGAG -3' 5,325 F
40 5'- TCCACTCCCGGGAATCTTCT -3' 5,541 R
41 5'- AGAAGGTCTGGAGCCCATCT -3' 6,312 R
42 5'- CGGACCACAAATCACTTCACC -3' 6,957 F
43 5'- AGGGTTACCGGTGATTAAGCC -3' 7,113 R
44 5'- AGGAAAGCAACAGAAAACTAGACA -3' 7,739 F
45 5'- TGTAGTGGCTCTCATCTGATCT -3' 7,947 R
46 5'- GGCACCTATCCATGACCCAG -3' 8,534 F
47 5'- TGGGTGTAGCAGTAATGGGT -3' 8,728 R
48 5'- GCCCAACACAGTCACACTCA -3' 9,335 F
49 5'- ACAATGCCATCTTTCCAACTCC -3' 9,541 R
50 5'- AACTGCTGGGGTCATCTTGG -3' 10,151 F
51 5'- ATCACCAATTTGTTGGCCGC -3' 10,340 R
52 5'- GAAGAATGCAGGTGTGTGGC -3' 10,956 F
53 5'- CTCAGGTTGGTGACAGGGTC -3' 11,132 R
54 5'- GGGCCTACCTCACTTCTTCG -3' 11,733 F
55 5'- TCATTGTCCATAGCTTCTGGCA -3' 11,920 R
56 5'- CCCGGGGACTACTGCTTTTG -3' 12,537 F
57 5'- AGGACTCTTTGCGTATGTTTCT -3' 12,734 R
58 5'- AGAGCTGCCTCACTTGCAAA -3' 13,339 F
59 5'- TTGAAGATTCCCAGCCGTGG -3' 13,539 R
60 5'- TGAAGTGCTCCTCGACTGTTC -3' 14,145 F
61 5'- TGCAAGTTGGTGTGATCCGT -3' 14,349 R
62 5'- CGATACTTGTTCAGAGGGATAGGG -3' 14,959 F
63 5'- TGTGGTACATGCAGTTCGAGA -3' 15,119 R
64 5'- TATTCACCTCACAGCGGCAG -3' 15,734 F
65 5'- TGTGTCAATGTGGCTAGCGA -3' 15,936 R
66 5'- CCCTGACTCCTTAGGACTCGA -3' 16,437 F
67 5'- TCGAATTCGAGTCCTAAGGAGT -3' 16,463 R
1-4. 야생형 Y280 LPAIV 바이러스의 H9N2 HA 유전자 포함하는 K148 clone의 구축
Y280 LPAIV 바이러스의 H9N2 HA 유전자와 K148 전장 지놈 cDNA clone의 P 유전자와 M 유전자 사이에 있는 NCR(Non-coding region)의 cDNA 조각을 삽입할 수 있도록 pK148을 선형화하였다. 서열번호 8로 표시되는 Y280 HA 유전자와 NCR(Non-coding region)은 PCR에 의해 증폭되어 RBC TA cloning Vector(RBC Bioscience, Taipei, Taiwan)로 복제되었다. Y280 HA 유전자의 발현을 향상시키기 위해 Muta-directTM site-directed Mutagenesis kit(iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 HA 유전자의 상류에 Kozak sequence(ACC)를 삽입하였다. NCR과 HA 유전자의 cDNA는 위에서 설명한 infusion PCR을 통하여 pK148의 P와 M 유전자 사이에 삽입되었고 인체 친화적 마커(marker)를 제거하기 위해 L226Q로 변이시킴으로써, 최종적으로 pK148/Y280-HA clone(서열번호 1)이 제작되었다(도 1 및 도 2). Y280 HA 유전자를 삽입하기 위해 사용된 프라이머는 표 3에 나타내었다. pK148/Y280-HA clone은 37 ℃에서 18시간 동안 HIT-DH5αcompetent cell에서 증폭되어 PureLink™HiPure plasmid midiprep kit를 사용하여 정제되었다.
Primer Sequence Primer name
68 5'-TTAGCCATTCAGTGCAAGGCGC-3' Insertion-up
69 5'-TCACCACTGCAGCTCGCAG-3' Insertion-down
70 5′-cactgaatggctaaTCACCACTGCAGCTC-3′ UTR-HA_F
71 5′-gagctgcagtggtgaTAATTGCAATTTGAG-3′ UTR-HA_R
1-5. 바이러스 rescue 및 증식
두 전장 지놈 cDNA(pK148 또는 pK148/Y280-HA)를 encoding한 두 종류의 플라스미드와 세가지 supporting plasmid(N, P and L)를 Hep-2 세포로 Transfection하였다. T7 transcriptase를 공급하기 위해 6-well plate에 배양된 Hep-2 세포에 MVA-T7 바이러스를 감염시켰다.
pK148 또는 pK148/Y280-HA 8.8ug, pSupport_NP 1ug, pSupport_P 0.1ug, pSupport_L 0.1ug을 혼합하였고 Lipofectamine 3000((Thermo Fisher Scientific, California, USA)을 사용하여 Hep-2 세포로 형질감염하였다. 37 ℃ 인큐베이터에서 1시간 배양한 후 PBS로 3회 세척하였고, Opti-MEM media로 배지를 교체한 후 37 ℃, 5% CO2 조건에서 72시간 배양하였다. 이후 세포를 1회 얼렸다 녹이는 과정을 통해 K148과 rK148/Y280-HA 바이러스를 rescue하였다. 수확한 바이러스는 10일령 SPF 유정란에 접종되어 37℃에서 3일 동안 배양되었다. 배양 3일 후 접종된 종란을 4 ℃에서 1시간 동안 냉장하였고, rescue된 바이러스를 검출하기 위해 Allantoic Fluid를 Hemagglutination Assay(HA)에 사용하였다. HA 양성 시료는 0.45 ㅅm syringe filter(Ministart RC 15, Sartorius Stedim Biotech, Germany)를 통해 필터링한 후 10일령 SPF 유정란에 계대 접종하였다. 계대 후 종란의 Allantoic fluid를 채취 및 소분하였고, 추가 실험을 위해 - 80 ℃에서 저장하였다.
K148 전장 유전자를 인코딩하고 있는 플라스미드에 N20-132의 HA 유전자를 성공적으로 삽입하고(도 1 및 도 2), Transfection한 후, rK148/Y280-HA가 성공적으로 rescue된 것을 혈구응집반응(HA)으로 확인하였다.
또한, rescue된 rK148/Y280-HA 바이러스를 10배 연속 희석하고 10일령 SPF 유정란에 접종한 후, 추가 계대를 3회 진행하여 rK148/Y280-HA의 유전자를 확인하였고, 그 결과 HA 유전자 서열 내에 변이가 없는 것을 확인하였다(도 2).
1-6. 바이러스 정제 및 웨스턴 블롯팅
연속 계대 후 Y280 HA 단백질의 발현과 HA 유전자의 안정성을 조사하기 위해 10일령 SPF 유정란에 4회 계대된 rK148 또는 rK148/Y280-HA를 저원심분리(2000×g, 10분, 4℃)하였다. 이후 상층액을 0.1% 포르말린으로 불활화하였다. 불활화 후 원심분리(30,000×g, 1시간, 4℃)를 하여 상층액은 버리고 펠렛(Pellet)만을 회수하였다. 상기 펠렛을 PBS에 재현탁(resuspension)한 후 20-50% 비연속 Sucrose 구배에 로딩하고 정제를 위해 밀도구배원심분리(150,000 ×g, 1.5시간, 4℃)를 진행하였다. 정제된 샘플의 단백질 농도는 Bradford protein Asaays(Pierce, USA)를 이용해 측정하였다. 고농도(2μg/well) 및 저농도(400ng)의 정제된 샘플을 Western blotting을 사용하여 분석하였다.
정제된 샘플의 Western blot 분석을 위해, Y280 HA 단백질의 발현은 1차 항체로는 N20-132 바이러스에 대한 닭의 항혈청을 사용하였고, 2차 항체로는 HRP-conjugated goat anti-chicken IgY 2차 항체(Invitrogen, California, USA)를 사용하여 검출하였다. NDV(newcastle disease virus)는 Bionote(한국, 수원)에서 제공한 anti-NDV HN mouse IgG 항체와 HRP-conjugated goat anti-mouse IgG antibody(Komabio, Seoul, Republic of Korea)를 통해 확인하였다.
도 3은 P 유전자와 M 유전자 사이의 NCR에 Y280-HA 유전자가 삽입된 rK148/Y280-HA의 Y280-HA 단백질 발현 여부를 확인하기 위한 western blot 분석결과이다. 구체적으로 rK148/Y280-HA로부터 Y280-HA 단백질의 발현을 측정한 것으로, N20-132 바이러스에 대한 닭의 항혈청 및 HRP-conjugated goat anti-chicken IgY 2차 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 사용하였다. 도 3에서 lane 1은 K148 대조 시료이며, lane 2는 rK148/Y280-HA 시료이다.
도 3에 나타난 바와 같이, rK148/Y280-HA는 ~70kDa(HA0 단백질), ~55kDa(HA1 단백질)크기의 밴드가 확인된 바, rK148/Y280-HA는 Y280-HA 단백질을 효율적으로 발현하는 것을 알 수 있다.
1-7. 바이러스 증폭 특성 분석
rescue된 rK148/Y280-HA 바이러스의 안정성 및 증폭 특성을 확인하기 위하여, rescue된 rK148/Y280-HA 바이러스와 K148 NDV를 0.1 mL의 10진 희석 바이러스(101, 102, 103 및 104 EID50)와 함께 10일령 SPF 유정란에 접종하였다. 2가지 바이러스 각각의 10진 희석액을 10일 된 SPF 유정란 3개에 접종하였다. 접종 후 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간에 접종된 알의 allantoic fluid를 채취하여 HAU(Hemagglutination Unit) 단위로 바이러스 역가를 측정하였다.
도 4는 K148(a)과 rK148/Y280-HA 바이러스(b)의 증폭능을 분석하여 나타낸 결과 그래프이다. 바이러스 증식성(Viral growth kinetics)은 10일령 SPF 종란에 4회의 연속 용량(101, 102, 103 및 104 EID50)을 접종하여 수행되었고, 접종 후 12시간마다 혈구응집 단위를 측정하여 분석하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, rK148/Y280-HA 및 K148/08 NDV의 바이러스 성장을 비교하기 위해 4개의 연속 10진 희석액(101-104 EID50)을 10일령의 SPF 발육란에 접종하고 12시간마다 HAU(Hemagglutination Unit)으로 바이러스 역가를 측정하였다. rK148/Y280-HA 바이러스와 K148 바이러스의 최고 역가는 각각 HAU(29.7)과 HAU(211)로 확인된 바, rK148/Y280-HA와 K148/08 NDV의 성장 곡선 간에는 유의적인 차이가 관찰되지 않았다.
1-8. 결과 확인
상술한 실험을 종합하면 K148/08 바이러스의 전장 유전자를 포함하는 플라스미드가 성공적으로 클로닝되었고, Y280 바이러스의 HA 유전자 또한 K148/08 바이러스의 P유전자 및 M유전자 사이에 성공적으로 삽입이 되었다는 것을 확인하였다.
또한, Hep-2 cell에 Transfection 이후 성공적으로 rK148 및 rK148/Y280-HA가 rescue되었고 삽입 유전자인 Y280 바이러스의 HA 유전자가 rescue 이후에도 바이러스 유전자 내에 성공적으로 존재하는 것을 확인하였다(도 1 및 도 2 참조).
또한, rK148/Y280-HA 바이러스에서 HA 단백질이 성공적으로 발현되는 것을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다(도 3 참조).
<실시예 2> K148 NDV 벡터 고병원성 조류인플루엔자 백신의 효능 확인
2-1. 백신 접종 및 챌린지 실험
시중에 판매되는 1일령된 SPF 닭 62마리와 6주령 SPF 닭 59마리를 남덕 SPF(대한민국 이천)에서 구입하였다.
하기 표 4에 설명된 대로 12개 그룹(n = 10 또는 n = 11)으로 나누어 실험을 수행하였다. 백신 접종 그룹은 실험군 1, 2, 4, 5, 7, 8. 10, 11이고, 실험군 1 및 4는 107EID50 용량의 rK148/Y280-HA를 사용하여 스프레이 방법으로 백신 접종하였으며, 실험군 2 및 5는 106.5EID50 용량의 rK148/Y280-HA를 사용하여 스프레이 방법으로 백신 접종하였다. 또한 실험군 7 및 10은 107.5EID50 용량의 rK148/Y280-HA를 사용하여 음수 방법으로 백신 접종하였으며, 실험군 8 및 11은 106.5EID50 용량의 rK148/Y280-HA를 사용하여 음수 방법으로 백신 접종하였다. 스프레이 방법으로 백신 접종한 분무 백신은 50-70μm의 에어로졸 입자를 생성하는 자동 분무 장치(SK-MO-2000, Threeshine Inc, Korea)를 사용하였다. 음수 백신은 마이크로파이펫을 이용하여 해양 용량을 구강을 통해 투여(경구투여)하였다. Mock 백신 접종 그룹(실험군 3, 6, 9, 12)은 양성대조군으로 PBS로 백신 접종하였다. 백신 접종 후, 백신 접종된 닭의 임상 징후를 매일 평가하였다. 혈청학적 분석을 위해 닭에서 혈액 샘플을 수집하여 분석하였다.
백신 접종하고 2주 후, 실험군 4, 5, 6, 10, 11, 12에 105.5EID50 용량의 virulent NDV(Kr005)를 근육을 통해 공격 접종하였다. 백신 접종하고 3주 후 실험군 1, 2, 3, 7, 8, 9에 106EID50 용량의 H9N2 Y280 lineage 바이러스로 비강내 공격 접종하였다. 본 발명의 백신의 방어 효과를 평가하기 위하여 임상 징후 및 사망률을 매일 기록하였다. 공격접종하고 5일 후, 기관 및 Cecal tonsil에서 바이러스 재분리를 위한 안락사 후 부검을 진행하였다.
이 연구에서 수행된 모든 동물 실험은 건국대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee of Konkuk University)의 관찰 및 승인을 받은 후 진행되었다(허가번호: KU21045). 백신접종 실험은 BSL2 시설에서, 공격접종 연구는 건국대학교 ABSL3 시설에서 수행하였다.
백신 및 공격접종실험설계
구분 백신 생백신
용량 (EID50)		 백신 경로 마리수 Chickens Challenge Virus ChallengeDose
실험군 1 rK148/Y280-HA 107.5 Spray 10 1-day-old Chickens H9N2 Y280 lineage 106.0EID50
실험군 2 rK148/Y280-HA 106.5 Spray 11
실험군 3 Mock - - 11
실험군 4 rK148/Y280-HA 107.5 Spray 10 NDV (Kr005) 105.5EID50
실험군 5 rK148/Y280-HA 106.5 Spray 10
실험군 6 Mock - - 10
실험군 7 rK148/Y280-HA 107.5 DWa 9 6-weeks-old
Chickens		 H9N2 Y280 lineage 106.0EID50
실험군 8 rK148/Y280-HA 106.5 DW 10
실험군 9 Mock - 10
실험군 10 rK148/Y280-HA 107.5 DW 10 NDV (Kr005) 105.5EID50
실험군 11 rK148/Y280-HA 106.5 DW 10
실험군 12 Mock - - 10
a DW : 음수를 통한 백신 접종
2-2. 혈청 분석-면역반응
rK148/Y280-HA 백신의 효과를 확인하기 위하여, 상기 백신 접종을 통한 닭에서의 항체 반응은 혈구응집능 억제반응(Hemagglutination inhibition; HI) 시험을 통해 측정하였다.
백신 후 1, 2, 3주에 채취한 혈청 샘플은 보체(complement) 불활화를 위하여 56 ℃에서 30분간 열처리를 하였다. 열처리 이후 각 혈청은 PBS에 2진 희석을 진행하였고 NDV 바이러스 항원 4HA Unit(HAU) 및 H9N2 Y280 항원 8HA Unit(HAU)과 함께 상온에서 40분간 반응하였다. 반응 이후 각각의 시료는 96 well V-bottom plate에서 1% 닭 혈구와 상온에서 40분간 반응하였다. OIE의 표준 프로토콜에 따라 혈구응집 억제능을 관찰하여, 도 5, 도 6, 표 5 및 표 6에 나타내었다.
도 5는 분무 백신으로 처리한 닭(실험군 1 내지 3)(a)과 음수 백신으로 처리한 닭(실험군 7 내지 9)(b)에서의 저병원성 조류인플루엔자인 Y280 H9N2 바이러스에 대한 혈청 HI 항체를 나타낸 결과이다. 구체적으로 백신을 접종한 닭의 혈청 샘플에 대한 혈구응집 억제를 분석한 결과로, 각 군에 rK148/Y280-HA(Spray), rK148/Y280-HA(DW; Drink Water) 및 PBS 백신을 106.5 또는 107.5 EID50 농도로 접종하고 면역화후 매주 혈액 샘플을 수집하고, Y280 H9N2 바이러스에 대한 혈청 혈구응집 억제(HI) 역가를 측정하였다. 4log2보다 낮은 HI 항체 역가를 갖는 닭은 혈청음성으로 간주하였다.
구분 백신경로 Dose (EID50) Seropositive rate(3wpv) Mean HI titer(2wpv)
실험군 1 Spray 107.5 10/10 4.6 ± 0.9
실험군 2 Spray 106.5 9/11 3.1 ± 0.7
실험군 3 Mock - 0/11 0.2 ± 0.4
실험군 7 Drink Water 107.5 9/9 5.2 ± 0.8
실험군 8 Drink Water 106.5 10/10 4.2 ± 0.9
실험군 9 Mock - 1/10 0.8 ± 1.1
도 5 및 표 5에 나타난 바와 같이, 스프레이법으로 접종하여 면역화된 닭(실험군 1 내지 2)의 Y280 H9N2 바이러스에 대한 HI 항체 역가는 백신화 1주차부터 증가하기 시작하여, 평균 24.6 HI titer의 높은 HI 역가를 나타내었다. 음수를 통해 백신 접종하여 면역화된 닭(실험군 7 내지 8)의 HI 역가는 백신화 1주차부터 크게 증가하였다(평균 25.2).
구체적으로, 107.5EID50 용량의 rK148/Y280-HA 백신을 스프레이 법으로 접종하거나 음수를 통해 접종한 실험군 1 및 7의 모든 개체에서 Y280 H9N2에 대한 항체를 형성한 것을 확인하였다. 106.5EID50 용량의 rK148/Y280-HA 백신을 스프레이 법으로 접종한 실험군 2의 11마리 중 9마리가 Y280 H9N2에 대한 혈청 항체 양성률을 나타내었다. 반면, 실험군 8은 모든 개체에서 혈청양성률을 보이는 것을 확인하였다.
백신 후 2주차에서 rK148/Y280-HA 그룹의 모든 닭이 H9N2 Y280 lineage 바이러스에 대해 양성 HI 역가(≥4 log2)를 나타내었다. rK148 또는 PBS로 백신 접종한 닭(실험군 1, 4, 5, 7)는 H5N6 HPAIV에 대한 HI 항체 역가를 나타내지 않았다.
도 6은 분무 백신으로 처리한 닭(실험군 4, 5)(a)과 음수 백신으로 처리한 닭(실험군 10 내지 12)(b)에서의 K148 NDV 바이러스에 대한 혈청 HI 항체를 나타낸 결과이다. 구체적으로 백신을 접종한 닭의 혈청 샘플에 대한 혈구응집 억제를 분석한 결과로, 각 군에 rK148/Y280-HA(Spray), rK148/Y280-HA(DW; Drink Water) 및 PBS 백신을 106.5 또는 107.5 EID50 농도로 접종하고 면역화후 매주 혈액 샘플을 수집하고, K148 NDV 바이러스에 대한 혈청 혈구응집 억제(HI) 역가를 측정하였다. 4log2보다 낮은 HI 항체 역가를 갖는 닭은 혈청음성으로 간주하였다.
구분 백신경로 Dose (EID50) Seropositive rate(2wpv) Mean HI titer(2wpv) 생존율
실험군 4 Spray 107.5 10/10 4.1 ± 1.9 10/10
실험군 5 Spray 106.5 8/10 1.9 ± 1.8 8/10
실험군 6 Mock - 0/10 0.0 ± 0.0 0/10
실험군 10 Drink Water 107.5 10/10 5.6 ± 0.9 10/10
실험군 11 Drink Water 106.5 7/10 2.4 ± 2.1 9/10
실험군 12 Mock - 0/10 0.0 ± 0.0 0/10
도 6 및 표 6에 나타난 바와 같이, 강독형 NDV(K148 NDV)에 대한 면역반응을 HI assay로 확인한 결과, 107.5EID50 용량의 rK148/Y280-HA를 접종한 실험군 4, 10의 모든 개체가 혈청양성으로 확인되었다. 106.5EID50 용량의 rK148/Y280-HA를 접종한 실험군 5 및 11은 일부 개체를 제외한 70~80% 개체에서 혈청양성률을 확인하였다. 음수를 통한 백신 접종 그룹(실험군 10, 11)이 스프레이 법으로 접종한 백신 그룹(실험군 4, 5)보다 높은 HI 항체 역가를 갖는 것을 확인하였다.
106.5EID50 용량에서도 백신효과를 얻을 수 있으나, 106.5EID50 용량을 초과하는 고용량 투여가 바람직하고, 보다 바람직하게는 음수를 통한 백신 접종이 면역효과를 더 높이는데 효과적이라는 것을 확인하였다.
또한, 강독형 NDV에 대한 방어능을 조사하기 위해 실험군 4, 5, 6, 10, 11, 12의 생존율을 측정하였다. 그 결과 106.5EID50 용량을 초과하는 고용량 투여인 경우 투여경로에 상관없이 100% 생존율을 달성하는 것을 확인하였다. 흥미롭게도 106.5EID50 용량의 경우에는 80~90% 이상의 생존율을 갖는 것으로 확인되었으나, 음수를 통해 백신을 접종하는 경우에는 10% 더 높은 생존율을 보이는 것을 확인하였다. 닭 공격접종 실험에서 Mock 백신을 접종한 실험군 6과 12는 모두 폐사하였다. 반면 rK148/Y280-HA 백신을 접종한 실험군 4, 10은 100% 생존율을 나타내었다.
2-3. 항바이러스 활성 검증
바이러스 공격 접종 이후 바이러스의 생산성을 정량하기 위해 공격 접종 이후 5일째 기관(Trachea) 및 맹장편도(Cecal Tonsil)에서 시료를 수집하였다. 상기 기관(Trachea) 및 맹장편도(Cecal Tonsil)의 조직 시료를 1:10 혼합비(w/v)로 PBS에 보관하였다. 상기 조직 시료를 동결 및 해동한 후 바이러스를 방출해내기 위하여 균질화하였다. 각각의 균질화된 조직의 상층액을 3 개의 9-10일령 SPF 유정란에 접종하였다. 72 시간 배양한 후, 요막강 액을 수집하고 HA 반응을 관찰하여 양성율을 파악하여, 표 7에 나타내었다.
구분 백신경로 Dose (EID50) Isolation rate
Cecal tonsil Trachea
실험군 1 Spray 107.5 0/10 1/10
실험군 2 Spray 106.5 1/11 4/11
실험군 3 Mock - 3/11 11/11
실험군 7 Drink Water 107.5 0/9 4/9
실험군 8 Drink Water 106.5 0/10 4/10
실험군 9 Mock - 3/10 10/10
표 7에 나타난 바와 같이, 실험군 1 내지 3, 7 내지 9로부터 기관(Trachea) 및 맹장편도(Cecal Tonsil) 샘플을 5일째 채취한 후, 바이러스 재분리 실험을 통해 Y280-lineage H9N2 아형 조류인플루엔자에 대한 방어능을 확인하였다. PBS 접종 그룹인 실험군 3 및 9의 경우 기관(Trachea)에서 100% 분리율을 보였고, 맹장편도(Cecal Tonsil)에서 27%~30%의 분리율을 확인하였다. 107.5EID50 용량으로 분무 백신 접종한 실험군 1은 한 개체의 기관(Trachea)에서만 바이러스가 분리가 확인되었다. 저용량(106.5EID50)으로 분무 백신 접종한 실험군 2는 한 개체의 맹장편도(Cecal Tonsil)와 네 개체의 기관(Trachea)에서 바이러스 분리가 확인되었다. 즉 고용량(107.5 EID50) 백신 접종의 효과가 유의하게 우수하다는 것을 확인할 수 있다.
또한, 표 7에 나타난 바와 같이, 음수를 통해 백신을 접종한 실험군 7 및 8은 네 개체의 기관(Trachea)에서 바이러스 분리가 확인된 바, 분무 백신 접종은 음수 백신 접종에 비해 기관(Trachea)에서의 방어율이 더 높은 것을 알 수 있다.
2-4. 통계분석
바이러스 배출 및 혈청 HI 항체 역가는 Tukey-Kramer post-hoc test를 이용한One-way 또는 Two-way ANOVA를 통해 진행하였고, 각 실험그룹 간의 유의성을 검토하기위하여 long-rank test를 진행하였다. p값이 ≤0.05 일 경우에 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
상술한 결과를 통해, 닭에 rK148/Y280-HA 백신을 접종한 결과 혈액 내 항체역가가 대조군에 비하여 유의적으로 현저히 높은 것을 확인하였다(도 5).
또한, rK148/Y280-HA 백신을 접종한 닭은 저병원성 조류인플루엔자(Y280-lineage H9N2 아형 조류인플루엔자) 공격접종에도 사망하지 않고, 우수한 생존율을 나타내며, Y280-lineage H9N2 아형 조류인플루엔자에 대한 90~100%의 높은 혈청 항체 양성율을 갖는다는 것을 확인하였다(표 5). 이에 반해 PBS로 백신화한 닭의 경우 대부분 사망하는 것으로 확인되었으며, 10% 미만의 현저히 낮은 혈청 항체 양성율을 갖는 것으로 확인되었다. 이러한 결과를 통해, 본 발명의 재조합 NDV 바이러스 벡터로 제조된 rK148/Y280-HA 백신은 생백신 벡터로도 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
또한, rK148/Y280-HA 백신을 접종한 닭은 virulent NDV(Kr005) 공격접종에도 사망하지 않고, 90%~100%의 높은 생존율을 나타내며, 70 내지 100%의 높은 혈청 항체 양성율을 갖는다는 것을 확인하였다(도 6, 표 6). 이에 반해 PBS로 백신화한 닭의 경우 대부분 사망하는 것으로 확인되었으며, 0%의 현저히 낮은 혈청 항체 양성율을 갖는 것으로 확인되었다. 이러한 결과를 통해, 본 발명의 재조합 NDV 바이러스 벡터로 제조된 rK148/Y280-HA 백신은 저병원성 조류인플루엔자(Y280-lineage H9N2 아형 조류인플루엔자) 뿐만 아니라 강독성의 뉴캣슬병 바이러스(NDV)에 대해서도 백신으로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
또한, rK148/Y280-HA 백신을 접종한 실험군 1, 2, 7, 8은 저병원성 조류인플루엔자 바이러스와 강독성의 뉴캣슬병 바이러스(NDV)의 공격접종 후 바이러스 배출양이 Mock 대조군에 비해 현저히 감소하였음 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 rK148/Y280-HA 백신은 닭과 같은 가금류에서 2020년 발생한 저병원성인 Y280-lineage H9N2 조류인플루엔자뿐만 아니라 뉴캣슬병 바이러스(NDV)에 의한 폐사를 방어함과 동시에 바이러스 배출을 억제할 수 있으며, 분무 뿐만 아니라 음수를 통한 백신 접종으로 닭과 같은 가금류에 유용하게 사용가능함을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> {Novel Recombinant Newcastle Disease Virus and An Vaccine Composition Comprising the Same <130> 10571 <150> KR 1020210153053 <151> 2021-11-09 <160> 71 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21211 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Full sequence of pK148/Y280-HA recombinant vector <400> 1 tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 60 ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 120 tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 180 cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 240 gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 300 ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 360 gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 420 agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacgat tcctggcctt ttgctggcct 480 tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 540 tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 600 gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 660 taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 720 aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 780 atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 840 tacgccaagc tcggaagcgg ccgctaatac gactcactat agggaccaaa cagagaatct 900 gtaaggtacg ataaaaggcg aaggagcaat cgaagtcgta cgggtagaag gtgtgaatct 960 cgagtgcgag cccgaagctc aaactcgaga gagccttctg ccaaaatgtc ttctgtattc 1020 gatgagtacg agcagctcct cgcagctcag actctcccca atggagctct tggcggagga 1080 gagaagggga gtaccttaaa agtagaagtc ccggtgttca ctctcaacag tgacgacccg 1140 gaagatacat ggaattttgc aggattttgt cttcggattg ctgttagcga ggatgccaat 1200 taaccactca ggcacggtgc tctcatatct ctcttatgct cccactctca agtgatgagg 1260 aaccatgttg cccttgcagg gaagcagaat gaggccacac tggctgttct cgagatcgat 1320 ggttttacca acggcgtgcc acagttcaac aacaggagtg gagtgtccga ggagagagca 1380 cagagattta tgatgatagc aggctctctc ccccgggcat gcagcaatgg taccccgttc 1440 gtcacagctg gggctgaaga cgatgcacca gaagacatca ctgataccct ggagaggatt 1500 ctctctatcc aggctcaagt atgggtcacg gtggccaagg ctatgacagc atatgagaca 1560 gcagatgagt cagaaacaag aagaatcaat aagtacatgc agcaaggcag ggtccagaag 1620 aagtacatcc tccatcctgt gtgcaggagt gcaatccaac tcacaatcag acagtctctg 1680 gcagttcgca ttttcctggt cagtgagctt aagagaggcc gtaacacggc aggtgggact 1740 tccacctact acaacttggt aggggatgtc gactcatata ttaggaacac cgggcttact 1800 gcgttcttcc tgacacttaa gtatggaatt aacaccaaga catcagccct tgcgcttagc 1860 agcctttcag gagatatcca aaaaatgaag cagctcatgc gcttgtatcg aatgaaagga 1920 gataatgcgc cgtatatgac attgctcggt gacagtgacc agatgagctt tgcacccgcc 1980 gagtacgcac aactttactc ttttgctatg ggtatggcgt cagtcctaga taaaggaact 2040 ggaaaatacc aatttgccag ggactttatg agcacatcat tctggagact tggagtagag 2100 tacgcccagg ctcaaggaag cagcatcaat gaggatatgg ctgccgagct aaagctaacc 2160 ccagcagcaa ggagaggcct agcagctgct gcccagcgag tgtctgagga gaccagcagc 2220 atagacatgc ccactcaaca agcaggagtc cttactggac tcagtgacgg gggatcccaa 2280 gccccacaag gtggatcaaa cagatcacaa gggcaaccgg acaccgggga tggggagacc 2340 caatttttgg atttgatgag agcggtggca aatagcatga gagaagcgcc aaactccgcg 2400 cagggcaccc cccaatcggg gcctccccca actcctgggc cttcccaaga caatgacacc 2460 gactgggggt actgaccgac aacacccagc tcgcttttat gaaatcatcc caactccccc 2520 gcttgcaccc caccccccag tccgcagtcc cgcgcggcca aacccacaaa cgaacccccc 2580 catctacctc ccctccccca gccccacagc cctacctgcc caaggcaaca caggcacaat 2640 gcaactcact aacaatcaat acagagccaa agaaattaga aaaaagtacg ggtagaaggg 2700 aggcattcag agatcagggc gagtcacccg ggtctctgtt ctcccttctg cctagtggat 2760 tagagtgaag atggccacct ttacagatgc ggaaatcgac gagctatttg aaaccagtgg 2820 aactgtcatt gacagcataa ttacggccca ggggaaacca gtagagactg ttggaaggag 2880 tgcaatccca caaggcaaaa ccaaggcgct gagcgcagca tgggagaagc acgggagcat 2940 ccagccacca gccagccaag acacccccga tcgaccagac aaatcagaca aacaaccgtc 3000 tgtacccgag caaatggctc cacacgacag ctcgccggcc acgtccactg accagctccc 3060 cactcaagct gcggacgaag ccggcgacac acaactcagg accggagcga gcaactcctt 3120 gctgtccatg cttgatgagc tcagcaataa gtcgtccaat gctaaaaagg gcccttggtc 3180 gagcccccag gaagggcatc atcaacgtcc gccgcaacag caggggagcc aaccaagtcg 3240 cggaaacagc caagagagac cgcagaacca ggtcaaggcc gcccctggaa accagggcac 3300 agacgcgaac acagcatatc atggacaatg ggaggagtca caactatcag ctggtgcaac 3360 ccatcatgct ctccgatcag ggcagagcca agacaatact cctgcacctg tggatcatgt 3420 ccagctacct gtcgactttg tgcaagcgat gatgtctatg atggaggcga tatcacagag 3480 ggtaagtaaa gttgactacc agttggacct tgtcctaaaa cagacatctt ccatccccat 3540 gatgcggtct gaaatccagc agctgaaaac atccgttgcg gtcatggaag ccaatttggg 3600 catgatgaag attctggatc ctggttgtgt caatgtttca tctctaagtg atctacgggc 3660 agtcgcccga tcccacccag ttttagtttc tggccccgga gacccatctc cttatgcgac 3720 ccaaggaggt gaaatggcgc ttaataaact ctcgcaaccg gtgcaacatc cctctgagtt 3780 ggttaaacct gccatggcag gcgggcccga cataggagtg gagagagaca ccgtccgtgc 3840 attgatcatg tcacgcccta tgcatccgag ctcctcagct aagctcctga gcaaactgga 3900 tgcagctgga tcgattgaag agatcaggaa aatcaagcgc cttgcactga atggctaacc 3960 gacaacaccc agctcgcttt tatgaaatca tcccaactcc cccgcttgca ccccaccccc 4020 cagtccgcag tcccgcgcgg ccaaacccac aaacgaaccc ccccatctac ctcccctccc 4080 ccagccccac agccctacct gcccaaggca acacaggcac aatgcaactc actaacaatc 4140 aatacagagc caaagaaatt agaaaaaata cgggtagaag ggaggcattc agagatcagg 4200 gcgagtcacc cgggtctctg ttctcccttc tgcctagtgg attagagtga agatggaggc 4260 agtatcacta ataactatac tagtagtggc aacagtaagc aatgcagata agatctgcat 4320 cggctatcaa tcaacaaact ccacggaaac tgtggacaca ctaacagaaa acaatgtccc 4380 tgtaacacat gccaaagaac tgctccacac agagcataat gggatgctgt gtgcaacaag 4440 cttgggacac cctcttattc tagacacctg caccattgaa gggctaattt atggcaatcc 4500 ttcttgtgat ccattgctgg gaggaagaga atggtcctat atcgtcgaga ggccatcagc 4560 cgttaacgga ttatgttatc ccgggaatgt agaaaatcta gaagagctaa gatcactttt 4620 tagttcttct aggtcttatc aaaggatcca gatctttcca gacacaatct ggaatgtgtc 4680 ttacagtggg acaagcaaag catgctcgga ttcattctac agaagcatga gatggttgac 4740 tcaaaagaac aacgcttacc ctacccaaga tgctcaatac acaaataatc aaggaaagaa 4800 cattcttttc atgtggggta taaatcatcc acccactgat gctgcgcaga cnaatctgta 4860 caccagaact gacacnacaa caagtgtggc aacagaggaa atgaataggg tctttnaacc 4920 attgatagga ccnaggcctc ttgtcaacgg tttgatggga agaattaatt attattggtc 4980 ggtattgaaa ccgggccaaa cgctgcggat aaaatctgat gggaatctaa tagctccatg 5040 gtatggacac atcctttcag gagagagcca cggaagaatc ctaaagactg acttaaaaat 5100 gggtagctgc acagtgcagt gtcaaacaga gaaaggtggc ttaaacacaa cattgccctt 5160 ccaaaatgta agtaagtatg catttggaaa ctgctcaaag tacantggcg taaagagtct 5220 caaacttgca gttggtctga ggaatgtgcc ttctagatct agcagaggac tattcggggc 5280 catagcagga tttatagagg gaggttggtc aggactggtt gctggttggt atgggttcca 5340 acattcaaat gaccaagggg ttggtatggc agcagataga gattcaaccc aaaaggcagt 5400 tgataaaata acatccaaag tgaataatat agtcgacaaa atgaacaagc agtatgaaat 5460 cattgatcat gaattcagtg aggtagaaac taggcttaac atgatcaatg ataaggttga 5520 tgatcaaatc caagatatat gggcatataa tgcagaattg ctagtcctgc tcgaaaacca 5580 gaaaacactc gatgaacatg acgctaatgt gaacaatcta tataataaag tgaagagggc 5640 gttgggttcc aatgcagtgg aagatgggag aggatgtttc gagctatacc acaaatgtga 5700 taaccattgc atggagacaa ttcggaatgg gacctacaac aggaggaagt atcaagagga 5760 atcaaaatta gaaagacaga aaatagaggg ggtcaagctg gaatctgaag aaacttacaa 5820 aatcctcacc atttattcga ctgtcgcctc atctcttgtg attgcaatgg ggttcgctgc 5880 ctttttgttc tgggccatgt ccaacgggtc ctgcagatgc aacatttgta tataaatttg 5940 tgagctcaaa ttgcaattat caccactgca gctcgcagcc ggtctccgtt cactcagaat 6000 tacaaggtat ctgcatcggg cccctctttg caaacccaag gtccaataat ccgagcgacg 6060 accccctccc gttacctctg ccccgctgaa tgatcacgca actgtaatta atccagctac 6120 attaaagatt aagaaaaaat acgggtagaa tcggagtgcc ccgattgtgc caagatggac 6180 tcatctagga caatcgggct gtactttgat tctgcccttc cttctagcaa cctgttagca 6240 ttcccgatcg tcctacaaga cacaggggac gggaagaaac aaatcgcccc gcagtacagg 6300 atccagcgcc ttgactcgtg gacagacagc aaagaagact cggtattcat cactacctat 6360 ggattcatct ttcaggttgg gaatgaagaa gccactgtcg gcatgatcaa tgataatccc 6420 aagcgcgagt tactttctgc tgcaatgctc tgcctaggaa gtgtcccaaa tgtcggagat 6480 cttgttgagc tggcaagggc ctgcctcact atggttgtga catgcaagaa gagtgcaacc 6540 aacaccgaga gaatggtctt ctcagtagta caggcacctc aggtgctgca aagctgcagg 6600 gttgtggcaa acaagtactc gtcggtgaat gcagtcaagc acgtgaaagc gccagagaag 6660 atccccggga gcggaacttt agagtacaag gtgaactttg tctctttgac cgtggtgccg 6720 aggaaggatg tctacaaaat accaactgca gcactaaagg tctccggctc gagtctatac 6780 aatcttgcgc tcaatgtcac tattgatgtg gaggtagacc cgaagagccc gttggtcaaa 6840 tctctgtcca agtctgacag tggatactat gctaatctct tcttacatat tgggcttatg 6900 tccaccgtag acaagaaggg gaagaaagtg acatttgaca agctggagag gaagataagg 6960 agacttgacc tatctgttgg gctcagtgac gtgcttggac cttccgtact tgtgaaggcg 7020 aggggcgcaa ggactaagct gctggcacct ttcttctcta gcagtgggac agcctgctat 7080 cccatagcaa atgcctctcc tcaggtggct aagatacttt ggagtcaaac cgcgtgcctg 7140 cggagtgtca aagtgattat ccaagcaggt acccagcgcg ctgtcgcagt gaccgctgac 7200 cacgaggtca cctctactaa gctggaaaag gggcatacca ttgccaaata caatcctttc 7260 aagaaatagg ctgcatctct gagattacac tctgctcatt cccctggatc accatgacac 7320 taaataatga tctgtcttaa ttacttatag ttagttcgcc tgtctatcaa attagaaaaa 7380 acacgggtag aagattctgg atcccggttg gcgcctccaa ggtgcaagat gggctccaga 7440 tcttctacca ggatcccagt acctctgatg ctgactgttc gggtcgcgct ggcactgagt 7500 tgcgtccgtc tgacaagctc ccttgatggc aggcctcttg cagctgcagg gattgtggtg 7560 acaggagaca aagcagtcaa catatacacc tcatcccaga cagggtcaat catagtcaag 7620 ttactcccca atatgcccaa ggacaaagag gcgtgtgcaa aagccccgtt ggaggcgtac 7680 aacaggacat tgactactct gctcaccccc cttggtgatt ctatccgtag gatacaagag 7740 tccgtgacta catctggagg agggaaacag ggacgcctta taggcgctat tatcggtggt 7800 gcggctctcg gggttgcaac cgctgcacag ataacagcag cctcggctct gatacaagcc 7860 aaccaaaatg ctgctaacat cctccggctt aaagagagca ttgctgcaac caatgaggct 7920 gtgcacgagg tcactgacgg attatcacaa ctagccgtgg cagtcgggaa gatgcaacaa 7980 tttgttaatg accagtttaa taaaacagct caggaattgg actgtataaa aattacacag 8040 caggttggtg tagaactcaa tctgtaccta actgaattga ctacagtatt cgggccacaa 8100 atcacttccc ctgccttaac ccagctgact atccaggctc tgtataatct agctggtggg 8160 aatatggatt acttgttgac aaagttaggt gtagggaaca accaactcag ctcattaatt 8220 ggtagcggcc tgatcaccgg caaccctatc ctgtacgact cacagactca gctcctgggt 8280 atacaggtaa ccctaccctc agtcgggaac ctgaataata tgcgtgccac ctacctggaa 8340 actctgtctg taagtacaac caaaggattt gcctcagcac ttgtcccaaa ggtggtgaca 8400 caggtcggtt ccgtgataga agaacttgac acctcatact gtatagagac cgatttagat 8460 ctatattgta caagaatagt gacattccct atgtctcctg gtatttactc ctgtttgagc 8520 ggcaatacat cggcttgtat gtattcgaag actgagggcg cactcactac gccgtacatg 8580 actctcaaag gctcagttat tgccaactgt aagatgacaa catgtagatg tgcagacccc 8640 ccgggtatca tatcgcaaaa ttatggagaa gctgtgtctc taatagatag gcaatcgtgc 8700 aatatcttat ccttggacgg gataactttg aggctcagtg gggaatttga tgcaacttat 8760 caaaagaata tctcaataca agattctcaa gtaatcgtga caggcaatct cgatatctcg 8820 actgagcttg ggaatgttaa caactcgata agtaatgccc tagataagtt agaggaaagc 8880 aacagcaaac tagacaaggt caatgtcaaa ctgaccagca cgtctgccct catcacctac 8940 attgttttaa ctgtcatatc tcttgtttgc ggtatactta gcctggttct agcatgctac 9000 ctgatgtaca agcaaaaggc gcaacagaag accttgttat ggcttgggaa taataccctg 9060 gaccagatga gggccactac gaaaatgtga acgtaaatga gaggtggggg cgtctccaat 9120 agcggtttgt gtgtaaagtc tggcagcctg ttaattagaa gacttaagaa aaaattgccg 9180 gatgtagatg accaaaggat aatatacggg tagaacggtc ggaggggccg cccctcaatc 9240 gggagtcggg cctcacaaca tccgttctac cgcatcacca acagcagtct tcagtcatgg 9300 accgcgcagt tagccaagtt gcgttagaga atgatgagag agaggcaaag aatacatggc 9360 gtttggtatt ccggatcgcg atcctgcttt taacagttgt gaccttagcc atctctgcag 9420 ctgcccttgc atatagtatg gaggctagca cacctagcga ccttataggc ataccgactg 9480 cgatctctaa agcagaggaa aggattacat ctgcactcgg ttccaaccaa gatgtagtag 9540 ataggattta taagcaggtg gccctcgaat ctccattggc attgctaaac accgaatcta 9600 caattatgaa tgcaataacg tctctctctt atcagatcaa tggggccgca aatagcagcg 9660 ggtgtggggc acctattcat gatccggatt atatcggggg aataggtaaa gaacttattg 9720 tggatgatgc tagtgatgtc acatcattct atccctctgc gttccaagaa cacctgaact 9780 ttatcccggc gcctactaca ggatcgggtt gcactcgaat accctcattt gacatgagtg 9840 ctacccacta ctgctatact cacaatgtga tattatctgg ctgcagggat cactcgcact 9900 cacatcagta cttagcactt ggcgtgcttc ggacatctgc aacagggagg gtattctttt 9960 ctactctgcg ttccattaac ctggatgaca cccaaaatcg aaagtcttgc agtgtgagtg 10020 caactccctt aggttgtgat atgctgtgct ccaaggtcac agagactgag gaagaggatt 10080 ataattcagc tatcccaaca tcgatggtac atgggaggtt agggttcgac ggccaatacc 10140 atgagaagga cctagacgtc acaacactat tcggagactg ggtggcgaat tacccaggag 10200 tagggggtgg atcctttatt gacaaccgcg tgtggttccc agtttatgga gggctaaagc 10260 ccaactcgcc tagtgacact gcacaagaag ggaaatatgt aatatataag cgatacaatg 10320 acacatgtcc agatgagcaa gattaccaga tccgaatggc taagtcttcg tataagcctg 10380 ggcggttcgg tgggaaacgc gtgcaacagg ccatcttatc tatcaaagtg tctacatcct 10440 tgggcgagga cccggtgctg actgtaccgc ccaacacagt cacactcatg ggggctgaag 10500 gcagagttct cacagtaggg acatctcatt tcttgtacca acgagggtca tcatacttct 10560 ctcctgcctt attatatcct atgacagtca gcaacaaaac agccactctt catagtcctt 10620 atacattcaa tgccttcact cgaccaggta gtgtcccttg ccaggcttca gcaagatgcc 10680 ctaattcatg tgttaccgga gtctatactg atccatatcc cttagtcttt tataggaacc 10740 ataccttgcg aggagtattc gggacaatgc ttgatgatga acaagcaaga ctcaaccctg 10800 tatctgcagt attcgacagc atatcccgca gtcgcataac ccgggtgagt tcaagcagca 10860 ccaaggcagc gtacacgaca tcaacgtgtt ttaaagttgt caagaccaat aaaacctatt 10920 gtctcagcat tgctgaaata tccaacaccc tcttcgggga attcagaatt gtccctttac 10980 tagttgagat tctcaaggat gatggggtca gagaggccag gtctggccga ttgagtcagc 11040 tgcaagaggg ttggaaagat aacattgtat cacctatctt ttgtgatatt aagaatcaaa 11100 ctgaataccg gcgtgggctc gagtcttacg ctgccagctg gccgtaatca gccagcgcca 11160 atgtgattat attaaatctt gtcgatgatc acttgattaa gaaaaaatgt gagcggtagt 11220 gggatacaag gcaaaacaac tcctggagaa tattacgggt aggacatggc gagctccggt 11280 cccgaaaggg cggagcatca gattatccta ccagagtcac acctgtcttc accattggtc 11340 aagcacaaac tactctatta ctggaaatta actgggctac cgctccctga tgagtgtgac 11400 ttcgaccacc tcattctcag ccgacaatgg aagaaaatac ttgaatcggc ttctcctgac 11460 actgagagaa tgataaaact tggaagggca gtacaccaga ctctcaacca taattccaga 11520 ataaccggag tactacatcc caggtgctta gaggaactgg ctagtattga ggtccctgat 11580 tcaaccaaca agtttcggaa gattgagaag aagatccaaa ttcacaacac aagatacgga 11640 gaactgttca caaggctgtg cacgcatgta gagaggaaat tgttggggtc gtcttggtct 11700 agtaatgtcc cccggtcaga agagttcaac agcatccgca cagatccggc gttctggttt 11760 cactcaaaat ggtccacagc caagtttgca tggctccata taaaacagat ccaaaggcat 11820 ctgatcgtgg cagcgagaac aaggtccgca gctaacaaat tggtgacgct gacccataag 11880 gtaggccaag tctttgttac tcctgagcta gtcattgtga cacatacaga tgagaacaag 11940 ttcacatgtc ttacccagga acttgtgttg atatatgcag atatgatgga gggcagagat 12000 atggtcaaca taatatcatc tacggcggca catctcaaaa gcctatcaga gaaaattgat 12060 gatattctgc ggttagtaga tgccctggca aaagatctgg gcaatcaagt ctacgatgtt 12120 gtagcactta tggagggatt tgcatacggt gccgtccagc tgcttgagcc gtcagggaca 12180 tttgcggggg atttcttcgc attcaacctg caggagctaa aagacacttt gatcggcctc 12240 ctccccaagg atatagcaga gtcagtgact cacgcgatag cgactgtatt ctctggctta 12300 gaacaaaatc aagcagccga gatgttgtgt ctgttgcgtc tgtggggcca cccactactt 12360 gagtcccgta ttgcagcaaa agcagtaagg agccaaatgt gcgcaccaaa aatggtagac 12420 tttgatatga tcctccaggt actgtctttc tttaaaggaa caatcatcaa tgggtacaga 12480 aagaagaatg caggtgtttg gccgcgtgtc aaggtagaca cgatatacgg gaaagtcatt 12540 gggcagctac acgctgattc agcagagatt tcacacgata tcatgttgag agagtataag 12600 agtttatctg cgcttgaatt cgagccatgt atagagtacg accctgtcac taatctgagt 12660 atgttcctaa aagacaaggc gatcgcgcac ccgaaagaca actggctcgc ctcgtttagg 12720 cgaaaccttc tttctgagga ccagaagaaa catgttaagg aggcaacctc gactaaccgc 12780 ctcctaatag agttcttaga gtcaaatgat tttgatccgt ataaggagat ggaatatctg 12840 acgacccttg agtatctaag agatgacaat gtggcagtat catactcact caaagagaag 12900 gaagtgaagg ttaatgggcg gattttcgct aagctgacaa agaaattgag gaactgtcaa 12960 gtgatggcag aagggatctt agctgaccag attgcacctt tctttcaggg gaatggggtc 13020 attcaggata gcatatcttt aaccaagagt atgctagcga tgagtcaact gtctttcaac 13080 agcaacaaga aacgtataac tgactgcaag gaaagagtat cctcaaaccg caatcacgag 13140 cagaaaagca agaatcgtcg gagagttgcc acttttataa cgaccgacct gcaaaagtac 13200 tgtcttaatt ggagatatca gacagtcaaa ttgttcgctc atgccatcaa tcagctgatg 13260 ggcttacctc acttcttcga gtggattcat ctaaggctaa tggatactac aatgttcgta 13320 ggggaccctt tcaatccccc aagtgacccg actgactgtg atctctcaag agtcccgaat 13380 gatgacatat atattgttag tgctagaggg ggtattgagg gattatgtca gaagctatgg 13440 acgatgatct cgattgctgc gatccaactt gctgcagcaa gatcacattg tcgtgtcgcc 13500 tgcatggtac agggtgacaa tcaagtaata gctgtaacga gagaggtaag gtcagatgac 13560 tccccagaga tggtgttaac acaactgcat caagccagtg acaatttctt caaggaattg 13620 attcatgtta atcatctgat tggccataat ttgaaggacc gtgaaactat caggtcagac 13680 acattcttca tatacagcaa acgaatattc aaagatggag caatactcag tcaggtcctc 13740 aaaaattcat ctaaattagt gctagtatca ggcgacctta gtgagaatac cgtaatgtcc 13800 tgtgccaaca ttgcatctac tatagcacgg ctgtgcgaga acgggctccc caaggatttc 13860 tgttattact taaactacct aatgagttgc gtgcagacgt acttcgactc tgagttttcc 13920 atcgccaaca gctcacaccc tgaatttaac cagtcgtgga ttgaagacat ctctttcgtg 13980 cactcatatg tcctgacccc tgcccagtta gggggactga gtaaccttca atactcaagg 14040 ctctatacga gaaacatcgg tgacccggga actactgctt ttgcagaggt caagcgacta 14100 gaggcagtgg ggttactgag tcctagcatt atgactaaca tcttaactag gccgcccgga 14160 aatggagatt gggccagtct gtgcaatgac ccatactctt tcaattttga gactgttgca 14220 agtccaaata ttgtccttaa gaaacataca caaagagtct tatttgaaac ctgttcaaat 14280 cccctattat ctggagtgca tacagaagat aatgaggcag aggaaaaggc attggctgaa 14340 tttttactca atcaagaagt aattcaccca cgagtcgcgc atgctatcat ggaagcaagc 14400 tccgtaggta ggaggaagca gattcaggga cttgttgaca cgacaaatac cgtaatcaag 14460 attgcattga ctagaaggcc acttggcatc aaaaggctga tgcggatagt taactactcg 14520 agcatgcatg caatgctgtt taaagacgat gtcttctcat ccaacagatc caaccaccct 14580 ttagtctctt ctagtatgtg ttctctgacg ctggcagact atgcacggaa tagaagctgg 14640 tcacctttga cggggggtag gaagatacta ggtgtatcta atcctgatac catagaactc 14700 gtggagggtg agatccttag cgtcagtgga gggtgcacaa gatgtgacag cggggatgag 14760 cagttcactt ggttccatct tccgagcaat atagaactga ccgatgacac cagcaagaac 14820 cctccgatga gagtgccgta tcttgggtca aaaactcaag agaggagagc tgcctcgctt 14880 gcgaaaatag ctcatatgtc accacatgta aaagctgctc taagggcatc atctgtgctg 14940 atctgggctt atggagacaa cgaggtaaat tggactgctg ctcttaaaat tgccagatcc 15000 cggtgcaata taaactcaga gtatcttcga ctattgtcac ctttgcctac agctgggaat 15060 ctccaacata gactggatga cggcataact cagatgacat tcacccctgc atccctctac 15120 agggtgtcac cttacatcca catatccaat gattctcaaa ggctattcac tgaggaagga 15180 gtcaaggagg ggaacgtggt ttatcagcaa atcatgctct tgggtttatc tctaatcgaa 15240 tcactcttcc caatgacgac aaccaggaca tatgatgaga tcacattaca cctccacagt 15300 aagtttagct gctgtatcag agaagcacct gttgcagttc ctttcgagct actcgggatg 15360 gcaccagaac taaggacagt gacctcaaat aagtttatgt atgatcctag tcctgtatcg 15420 gagggtgact ttgcgaggct tgacttagct atctttaaga gttatgagct taatttagag 15480 tcatacccca caatagagct aatgaacatt ctttcaatat ctagcgggaa gctgattggc 15540 cagtctgtgg tttcctatga tgaagatacc tccataaaga atgacgccat aatagtgtat 15600 gacaacaccc ggaattggat cagcgaagcc caaaattcag atgtggtccg cttatttgag 15660 tacgcagcac ttgaagtgct cctcgactgt tcttaccagc tttactatct gagagtaaga 15720 ggtctagaca atatcgtgtt atatatgagt gatctataca agaatatgcc aggaattcta 15780 ctttccaaca ttgcagctac aatatctcat cccatcattc attcaagatt acatgcagta 15840 ggcctagtca atcatgacgg gtcacaccaa cttgcagaca cagatttcat agaaatgtct 15900 gcgaagctgt tagtctcttg cactcgacgc gtggtctcag gtttatatgc agggaataag 15960 tatgatctgc tgttcccatc cgtcctagat gataacctga gtgagaagat gctccagctg 16020 atatcccggt tatgctgcct gtacacggtg ctctttgcta caacaaggga gatcccgaaa 16080 ataagaggct tatctgcgga agagaagtgt tcagtactta ctgagtacct actgtcagat 16140 gctgtgaaac cactacttag ttctgagcaa gtgagttcta tcatgtcccc taacatagtc 16200 acattcccag ctaatctata ctacatgtct cggaagagcc ttaatttgat cagagaaaga 16260 gaggacaggg acactatctt ggcactattg ttcccccaag agccattact cgagttcccc 16320 ttagtacaag atattggcgc tcgagtgaaa gatccattta cccgacaacc tgcggcgttt 16380 ttacaggagt tagatttgag cgctccagca aggtatgacg catttacact tagtcaggtt 16440 cattctgaac acatatcacc aagtccggaa gaagactact tagtacgata cctgttcaga 16500 ggaataggaa ctgcgtcctc ctcttggtat aaggcatccc accttctttc tgtacccgag 16560 gtcagatgtg caaggcacgg gaattcctta tacttggcag aaggaagcgg agccatcatg 16620 agtcttctcg aactgcatgt gccgcatgaa actatctatt acaatacgct cttctcaaat 16680 gagatgaacc ctccacagcg acatttcgga ccgaccccaa cacagttcct gaactcggtt 16740 gtttatagga atctacaagc agaggtacca tgcaaggatg gattcgtcca ggagttccgt 16800 ccattatgga gagagaatac agaagaaagc gacctgacat cagacaaagc agtggggtat 16860 atcacatccg cggtgcccta ccggtctgta tcattgctgc attgtgacat tgagattcct 16920 ccaggatcca accaaagctt actggatcaa ctggctacca atcaatctct gattgccatg 16980 cattctgtaa gggaaggcgg ggttgtgatc atcaaagtgt tgtatgcaat gggatattac 17040 ttccatctac tcatgaactt attcactccg tgttccacaa aaggatatat tctttccaat 17100 ggctatgcat gtagagggga tatggaatgt tacctggtat ttgtcatggg ttatctaggt 17160 gggcctacat ttgtacatga ggtagtgagg atggcaaaaa ctttagtgca gcggcacggc 17220 acacttttgt ctaaatcaga tgagatcaca ctgactaggt tattcacctc acagcggcag 17280 cgtgtagcag atatcttatc tagtccttta ccgagactaa taaagttctt gagaaaaaat 17340 atcgatactg cgctgataga ggccggggga cagcctgtcc gtccattctg tgcggagagc 17400 ttggtgagca cattggcgga cataactcag atgacccaga tcattgccag tcacattgac 17460 acagtcattc gatctgtgat ctacatggag gctgagggtg atctcgctga tacagtattc 17520 ttatttaccc cttacaatct ctctacagac ggtaaaaaga gaacatcact taaacagtgc 17580 acacggcaga tcttagaggt cacaatactg ggtcttagag tagagaacct caataaagta 17640 ggtgatgtaa tcagcctagt gcttaaaggt atgatttccc tagaggatct catcccacta 17700 agaacatact tgaaacgtag tactcgccct aagtacttga aggctgtcct aggtatcact 17760 aaactcaaag aaatgtttac agacacatct ttattatact tgactcgtgc tcaacagaaa 17820 ttctacatga aaactatagg caatgcagtt aagggatatt atagtaactg tgactcttaa 17880 agacaatcac atatcaatag attccctttc tagctgattg tacccctgtt gatttaacta 17940 tattatatta gaaaaaagtc gtactctgac ccttcaggac tcgtattcga attcgaataa 18000 atgtcttaga aaaaagttgc acgtaattgt tcttgagtgt agttctgtca ttcaccaaat 18060 ctttgtttgg tggccggcat ggtcccagcc tcctcgctgg cgccggctgg gcaacattcc 18120 gaggggaccg tcccctcggt aatggcgaat gggacgcggc cgatccggct gctaacaaag 18180 cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg 18240 gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggatgcg 18300 gccgatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag 18360 caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa 18420 ggaggaacta tatccggatg gccgccaccg atgggccttg cagcacatcc ccctttcgcc 18480 agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 18540 aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg 18600 cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct 18660 tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta 18720 gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt 18780 tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg 18840 ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat 18900 tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgacctgatt 18960 taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta ggtggcactt 19020 ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 19080 atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 19140 tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 19200 tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 19260 gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 19320 aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 19380 gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 19440 ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 19500 gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 19560 gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg 19620 atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc 19680 ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt 19740 cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct 19800 cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc 19860 gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 19920 cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct 19980 cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt 20040 taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 20100 ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 20160 aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 20220 caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 20280 taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag 20340 gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 20400 cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 20460 taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 20520 agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 20580 ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 20640 gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 20700 acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 20760 acgccagcaa cgcggccttt ttacgattcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 20820 tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg 20880 ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag 20940 agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 21000 acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 21060 tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 21120 ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctcg 21180 gaagcggccg ctaatacgac tcactatagg g 21211 <210> 2 <211> 1095 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rK148/Y280-HA_extraction_M <400> 2 atggactcat ctaggacaat cgggctgtac tttgattctg cccttccttc tagcaacctg 60 ttagcattcc cgatcgtcct acaagacaca ggggacggga agaaacaaat cgccccgcag 120 tacaggatcc agcgccttga ctcgtggaca gacagcaaag aagactcggt attcatcact 180 acctatggat tcatctttca ggttgggaat gaagaagcca ctgtcggcat gatcaatgat 240 aatcccaagc gcgagttact ttctgctgca atgctctgcc taggaagtgt cccaaatgtc 300 ggagatcttg ttgagctggc aagggcctgc ctcactatgg ttgtgacatg caagaagagt 360 gcaaccaaca ccgagagaat ggtcttctca gtagtacagg cacctcaggt gctgcaaagc 420 tgcagggttg tggcaaacaa gtactcgtcg gtgaatgcag tcaagcacgt gaaagcgcca 480 gagaagatcc ccgggagcgg aactttagag tacaaggtga actttgtctc tttgaccgtg 540 gtgccgagga aggatgtcta caaaatacca actgcagcac taaaggtctc cggctcgagt 600 ctatacaatc ttgcgctcaa tgtcactatt gatgtggagg tagacccgaa gagcccgttg 660 gtcaaatctc tgtccaagtc tgacagtgga tactatgcta atctcttctt acatattggg 720 cttatgtcca ccgtagacaa gaaggggaag aaagtgacat ttgacaagct ggagaggaag 780 ataaggagac ttgacctatc tgttgggctc agtgacgtgc ttggaccttc cgtacttgtg 840 aaggcgaggg gcgcaaggac taagctgctg gcacctttct tctctagcag tgggacagcc 900 tgctatccca tagcaaatgc ctctcctcag gtggctaaga tactttggag tcaaaccgcg 960 tgcctgcgga gtgtcaaagt gattatccaa gcaggtaccc agcgcgctgt cgcagtgacc 1020 gctgaccacg aggtcacctc tactaagctg gaaaaggggc ataccattgc caaatacaat 1080 cctttcaaga aatag 1095 <210> 3 <211> 1188 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rK148/Y280-HA_extraction_P <400> 3 atggccacct ttacagatgc ggaaatcgac gagctatttg aaaccagtgg aactgtcatt 60 gacagcataa ttacggccca ggggaaacca gtagagactg ttggaaggag tgcaatccca 120 caaggcaaaa ccaaggcgct gagcgcagca tgggagaagc acgggagcat ccagccacca 180 gccagccaag acacccccga tcgaccagac aaatcagaca aacaaccgtc tgtacccgag 240 caaatggctc cacacgacag ctcgccggcc acgtccactg accagctccc cactcaagct 300 gcggacgaag ccggcgacac acaactcagg accggagcga gcaactcctt gctgtccatg 360 cttgatgagc tcagcaataa gtcgtccaat gctaaaaagg gcccttggtc gagcccccag 420 gaagggcatc atcaacgtcc gccgcaacag caggggagcc aaccaagtcg cggaaacagc 480 caagagagac cgcagaacca ggtcaaggcc gcccctggaa accagggcac agacgcgaac 540 acagcatatc atggacaatg ggaggagtca caactatcag ctggtgcaac ccatcatgct 600 ctccgatcag ggcagagcca agacaatact cctgcacctg tggatcatgt ccagctacct 660 gtcgactttg tgcaagcgat gatgtctatg atggaggcga tatcacagag ggtaagtaaa 720 gttgactacc agttggacct tgtcctaaaa cagacatctt ccatccccat gatgcggtct 780 gaaatccagc agctgaaaac atccgttgcg gtcatggaag ccaatttggg catgatgaag 840 attctggatc ctggttgtgt caatgtttca tctctaagtg atctacgggc agtcgcccga 900 tcccacccag ttttagtttc tggccccgga gacccatctc cttatgcgac ccaaggaggt 960 gaaatggcgc ttaataaact ctcgcaaccg gtgcaacatc cctctgagtt ggttaaacct 1020 gccatggcag gcgggcccga cataggagtg gagagagaca ccgtccgtgc attgatcatg 1080 tcacgcccta tgcatccgag ctcctcagct aagctcctga gcaaactgga tgcagctgga 1140 tcgattgaag agatcaggaa aatcaagcgc cttgcactga atggctaa 1188 <210> 4 <211> 1221 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rK148/Y280-HA_extraction_NP <400> 4 atgaggaacc atgttgccct tgcagggaag cagaatgagg ccacactggc tgttctcgag 60 atcgatggtt ttaccaacgg cgtgccacag ttcaacaaca ggagtggagt gtccgaggag 120 agagcacaga gatttatgat gatagcaggc tctctccccc gggcatgcag caatggtacc 180 ccgttcgtca cagctggggc tgaagacgat gcaccagaag acatcactga taccctggag 240 aggattctct ctatccaggc tcaagtatgg gtcacggtgg ccaaggctat gacagcatat 300 gagacagcag atgagtcaga aacaagaaga atcaataagt acatgcagca aggcagggtc 360 cagaagaagt acatcctcca tcctgtgtgc aggagtgcaa tccaactcac aatcagacag 420 tctctggcag ttcgcatttt cctggtcagt gagcttaaga gaggccgtaa cacggcaggt 480 gggacttcca cctactacaa cttggtaggg gatgtcgact catatattag gaacaccggg 540 cttactgcgt tcttcctgac acttaagtat ggaattaaca ccaagacatc agcccttgcg 600 cttagcagcc tttcaggaga tatccaaaaa atgaagcagc tcatgcgctt gtatcgaatg 660 aaaggagata atgcgccgta tatgacattg ctcggtgaca gtgaccagat gagctttgca 720 cccgccgagt acgcacaact ttactctttt gctatgggta tggcgtcagt cctagataaa 780 ggaactggaa aataccaatt tgccagggac tttatgagca catcattctg gagacttgga 840 gtagagtacg cccaggctca aggaagcagc atcaatgagg atatggctgc cgagctaaag 900 ctaaccccag cagcaaggag aggcctagca gctgctgccc agcgagtgtc tgaggagacc 960 agcagcatag acatgcccac tcaacaagca ggagtcctta ctggactcag tgacggggga 1020 tcccaagccc cacaaggtgg atcaaacaga tcacaagggc aaccggacac cggggatggg 1080 gagacccaat ttttggattt gatgagagcg gtggcaaata gcatgagaga agcgccaaac 1140 tccgcgcagg gcacccccca atcggggcct cccccaactc ctgggccttc ccaagacaat 1200 gacaccgact gggggtactg a 1221 <210> 5 <211> 1662 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rK148/Y280-HA_extraction_F <400> 5 atgggctcca gatcttctac caggatccca gtacctctga tgctgactgt tcgggtcgcg 60 ctggcactga gttgcgtccg tctgacaagc tcccttgatg gcaggcctct tgcagctgca 120 gggattgtgg tgacaggaga caaagcagtc aacatataca cctcatccca gacagggtca 180 atcatagtca agttactccc caatatgccc aaggacaaag aggcgtgtgc aaaagccccg 240 ttggaggcgt acaacaggac attgactact ctgctcaccc cccttggtga ttctatccgt 300 aggatacaag agtccgtgac tacatctgga ggagggaaac agggacgcct tataggcgct 360 attatcggtg gtgcggctct cggggttgca accgctgcac agataacagc agcctcggct 420 ctgatacaag ccaaccaaaa tgctgctaac atcctccggc ttaaagagag cattgctgca 480 accaatgagg ctgtgcacga ggtcactgac ggattatcac aactagccgt ggcagtcggg 540 aagatgcaac aatttgttaa tgaccagttt aataaaacag ctcaggaatt ggactgtata 600 aaaattacac agcaggttgg tgtagaactc aatctgtacc taactgaatt gactacagta 660 ttcgggccac aaatcacttc ccctgcctta acccagctga ctatccaggc tctgtataat 720 ctagctggtg ggaatatgga ttacttgttg acaaagttag gtgtagggaa caaccaactc 780 agctcattaa ttggtagcgg cctgatcacc ggcaacccta tcctgtacga ctcacagact 840 cagctcctgg gtatacaggt aaccctaccc tcagtcggga acctgaataa tatgcgtgcc 900 acctacctgg aaactctgtc tgtaagtaca accaaaggat ttgcctcagc acttgtccca 960 aaggtggtga cacaggtcgg ttccgtgata gaagaacttg acacctcata ctgtatagag 1020 accgatttag atctatattg tacaagaata gtgacattcc ctatgtctcc tggtatttac 1080 tcctgtttga gcggcaatac atcggcttgt atgtattcga agactgaggg cgcactcact 1140 acgccgtaca tgactctcaa aggctcagtt attgccaact gtaagatgac aacatgtaga 1200 tgtgcagacc ccccgggtat catatcgcaa aattatggag aagctgtgtc tctaatagat 1260 aggcaatcgt gcaatatctt atccttggac gggataactt tgaggctcag tggggaattt 1320 gatgcaactt atcaaaagaa tatctcaata caagattctc aagtaatcgt gacaggcaat 1380 ctcgatatct cgactgagct tgggaatgtt aacaactcga taagtaatgc cctagataag 1440 ttagaggaaa gcaacagcaa actagacaag gtcaatgtca aactgaccag cacgtctgcc 1500 ctcatcacct acattgtttt aactgtcata tctcttgttt gcggtatact tagcctggtt 1560 ctagcatgct acctgatgta caagcaaaag gcgcaacaga agaccttgtt atggcttggg 1620 aataataccc tggaccagat gagggccact acgaaaatgt ga 1662 <210> 6 <211> 1851 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rK148/Y280-HA_extraction_HN <400> 6 atggaccgcg cagttagcca agttgcgtta gagaatgatg agagagaggc aaagaataca 60 tggcgtttgg tattccggat cgcgatcctg cttttaacag ttgtgacctt agccatctct 120 gcagctgccc ttgcatatag tatggaggct agcacaccta gcgaccttat aggcataccg 180 actgcgatct ctaaagcaga ggaaaggatt acatctgcac tcggttccaa ccaagatgta 240 gtagatagga tttataagca ggtggccctc gaatctccat tggcattgct aaacaccgaa 300 tctacaatta tgaatgcaat aacgtctctc tcttatcaga tcaatggggc cgcaaatagc 360 agcgggtgtg gggcacctat tcatgatccg gattatatcg ggggaatagg taaagaactt 420 attgtggatg atgctagtga tgtcacatca ttctatccct ctgcgttcca agaacacctg 480 aactttatcc cggcgcctac tacaggatcg ggttgcactc gaataccctc atttgacatg 540 agtgctaccc actactgcta tactcacaat gtgatattat ctggctgcag ggatcactcg 600 cactcacatc agtacttagc acttggcgtg cttcggacat ctgcaacagg gagggtattc 660 ttttctactc tgcgttccat taacctggat gacacccaaa atcgaaagtc ttgcagtgtg 720 agtgcaactc ccttaggttg tgatatgctg tgctccaagg tcacagagac tgaggaagag 780 gattataatt cagctatccc aacatcgatg gtacatggga ggttagggtt cgacggccaa 840 taccatgaga aggacctaga cgtcacaaca ctattcggag actgggtggc gaattaccca 900 ggagtagggg gtggatcctt tattgacaac cgcgtgtggt tcccagttta tggagggcta 960 aagcccaact cgcctagtga cactgcacaa gaagggaaat atgtaatata taagcgatac 1020 aatgacacat gtccagatga gcaagattac cagatccgaa tggctaagtc ttcgtataag 1080 cctgggcggt tcggtgggaa acgcgtgcaa caggccatct tatctatcaa agtgtctaca 1140 tccttgggcg aggacccggt gctgactgta ccgcccaaca cagtcacact catgggggct 1200 gaaggcagag ttctcacagt agggacatct catttcttgt accaacgagg gtcatcatac 1260 ttctctcctg ccttattata tcctatgaca gtcagcaaca aaacagccac tcttcatagt 1320 ccttatacat tcaatgcctt cactcgacca ggtagtgtcc cttgccaggc ttcagcaaga 1380 tgccctaatt catgtgttac cggagtctat actgatccat atcccttagt cttttatagg 1440 aaccatacct tgcgaggagt attcgggaca atgcttgatg atgaacaagc aagactcaac 1500 cctgtatctg cagtattcga cagcatatcc cgcagtcgca taacccgggt gagttcaagc 1560 agcaccaagg cagcgtacac gacatcaacg tgttttaaag ttgtcaagac caataaaacc 1620 tattgtctca gcattgctga aatatccaac accctcttcg gggaattcag aattgtccct 1680 ttactagttg agattctcaa ggatgatggg gtcagagagg ccaggtctgg ccgattgagt 1740 cagctgcaag agggttggaa agataacatt gtatcaccta tcttttgtga tattaagaat 1800 caaactgaat accggcgtgg gctcgagtct tacgctgcca gctggccgta a 1851 <210> 7 <211> 6615 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rK148/Y280-HA_extraction_L <400> 7 atggcgagct ccggtcccga aagggcggag catcagatta tcctaccaga gtcacacctg 60 tcttcaccat tggtcaagca caaactactc tattactgga aattaactgg gctaccgctc 120 cctgatgagt gtgacttcga ccacctcatt ctcagccgac aatggaagaa aatacttgaa 180 tcggcttctc ctgacactga gagaatgata aaacttggaa gggcagtaca ccagactctc 240 aaccataatt ccagaataac cggagtacta catcccaggt gcttagagga actggctagt 300 attgaggtcc ctgattcaac caacaagttt cggaagattg agaagaagat ccaaattcac 360 aacacaagat acggagaact gttcacaagg ctgtgcacgc atgtagagag gaaattgttg 420 gggtcgtctt ggtctagtaa tgtcccccgg tcagaagagt tcaacagcat ccgcacagat 480 ccggcgttct ggtttcactc aaaatggtcc acagccaagt ttgcatggct ccatataaaa 540 cagatccaaa ggcatctgat cgtggcagcg agaacaaggt ccgcagctaa caaattggtg 600 acgctgaccc ataaggtagg ccaagtcttt gttactcctg agctagtcat tgtgacacat 660 acagatgaga acaagttcac atgtcttacc caggaacttg tgttgatata tgcagatatg 720 atggagggca gagatatggt caacataata tcatctacgg cggcacatct caaaagccta 780 tcagagaaaa ttgatgatat tctgcggtta gtagatgccc tggcaaaaga tctgggcaat 840 caagtctacg atgttgtagc acttatggag ggatttgcat acggtgccgt ccagctgctt 900 gagccgtcag ggacatttgc gggggatttc ttcgcattca acctgcagga gctaaaagac 960 actttgatcg gcctcctccc caaggatata gcagagtcag tgactcacgc gatagcgact 1020 gtattctctg gcttagaaca aaatcaagca gccgagatgt tgtgtctgtt gcgtctgtgg 1080 ggccacccac tacttgagtc ccgtattgca gcaaaagcag taaggagcca aatgtgcgca 1140 ccaaaaatgg tagactttga tatgatcctc caggtactgt ctttctttaa aggaacaatc 1200 atcaatgggt acagaaagaa gaatgcaggt gtttggccgc gtgtcaaggt agacacgata 1260 tacgggaaag tcattgggca gctacacgct gattcagcag agatttcaca cgatatcatg 1320 ttgagagagt ataagagttt atctgcgctt gaattcgagc catgtataga gtacgaccct 1380 gtcactaatc tgagtatgtt cctaaaagac aaggcgatcg cgcacccgaa agacaactgg 1440 ctcgcctcgt ttaggcgaaa ccttctttct gaggaccaga agaaacatgt taaggaggca 1500 acctcgacta accgcctcct aatagagttc ttagagtcaa atgattttga tccgtataag 1560 gagatggaat atctgacgac ccttgagtat ctaagagatg acaatgtggc agtatcatac 1620 tcactcaaag agaaggaagt gaaggttaat gggcggattt tcgctaagct gacaaagaaa 1680 ttgaggaact gtcaagtgat ggcagaaggg atcttagctg accagattgc acctttcttt 1740 caggggaatg gggtcattca ggatagcata tctttaacca agagtatgct agcgatgagt 1800 caactgtctt tcaacagcaa caagaaacgt ataactgact gcaaggaaag agtatcctca 1860 aaccgcaatc acgagcagaa aagcaagaat cgtcggagag ttgccacttt tataacgacc 1920 gacctgcaaa agtactgtct taattggaga tatcagacag tcaaattgtt cgctcatgcc 1980 atcaatcagc tgatgggctt acctcacttc ttcgagtgga ttcatctaag gctaatggat 2040 actacaatgt tcgtagggga ccctttcaat cccccaagtg acccgactga ctgtgatctc 2100 tcaagagtcc cgaatgatga catatatatt gttagtgcta gagggggtat tgagggatta 2160 tgtcagaagc tatggacgat gatctcgatt gctgcgatcc aacttgctgc agcaagatca 2220 cattgtcgtg tcgcctgcat ggtacagggt gacaatcaag taatagctgt aacgagagag 2280 gtaaggtcag atgactcccc agagatggtg ttaacacaac tgcatcaagc cagtgacaat 2340 ttcttcaagg aattgattca tgttaatcat ctgattggcc ataatttgaa ggaccgtgaa 2400 actatcaggt cagacacatt cttcatatac agcaaacgaa tattcaaaga tggagcaata 2460 ctcagtcagg tcctcaaaaa ttcatctaaa ttagtgctag tatcaggcga ccttagtgag 2520 aataccgtaa tgtcctgtgc caacattgca tctactatag cacggctgtg cgagaacggg 2580 ctccccaagg atttctgtta ttacttaaac tacctaatga gttgcgtgca gacgtacttc 2640 gactctgagt tttccatcgc caacagctca caccctgaat ttaaccagtc gtggattgaa 2700 gacatctctt tcgtgcactc atatgtcctg acccctgccc agttaggggg actgagtaac 2760 cttcaatact caaggctcta tacgagaaac atcggtgacc cgggaactac tgcttttgca 2820 gaggtcaagc gactagaggc agtggggtta ctgagtccta gcattatgac taacatctta 2880 actaggccgc ccggaaatgg agattgggcc agtctgtgca atgacccata ctctttcaat 2940 tttgagactg ttgcaagtcc aaatattgtc cttaagaaac atacacaaag agtcttattt 3000 gaaacctgtt caaatcccct attatctgga gtgcatacag aagataatga ggcagaggaa 3060 aaggcattgg ctgaattttt actcaatcaa gaagtaattc acccacgagt cgcgcatgct 3120 atcatggaag caagctccgt aggtaggagg aagcagattc agggacttgt tgacacgaca 3180 aataccgtaa tcaagattgc attgactaga aggccacttg gcatcaaaag gctgatgcgg 3240 atagttaact actcgagcat gcatgcaatg ctgtttaaag acgatgtctt ctcatccaac 3300 agatccaacc accctttagt ctcttctagt atgtgttctc tgacgctggc agactatgca 3360 cggaatagaa gctggtcacc tttgacgggg ggtaggaaga tactaggtgt atctaatcct 3420 gataccatag aactcgtgga gggtgagatc cttagcgtca gtggagggtg cacaagatgt 3480 gacagcgggg atgagcagtt cacttggttc catcttccga gcaatataga actgaccgat 3540 gacaccagca agaaccctcc gatgagagtg ccgtatcttg ggtcaaaaac tcaagagagg 3600 agagctgcct cgcttgcgaa aatagctcat atgtcaccac atgtaaaagc tgctctaagg 3660 gcatcatctg tgctgatctg ggcttatgga gacaacgagg taaattggac tgctgctctt 3720 aaaattgcca gatcccggtg caatataaac tcagagtatc ttcgactatt gtcacctttg 3780 cctacagctg ggaatctcca acatagactg gatgacggca taactcagat gacattcacc 3840 cctgcatccc tctacagggt gtcaccttac atccacatat ccaatgattc tcaaaggcta 3900 ttcactgagg aaggagtcaa ggaggggaac gtggtttatc agcaaatcat gctcttgggt 3960 ttatctctaa tcgaatcact cttcccaatg acgacaacca ggacatatga tgagatcaca 4020 ttacacctcc acagtaagtt tagctgctgt atcagagaag cacctgttgc agttcctttc 4080 gagctactcg ggatggcacc agaactaagg acagtgacct caaataagtt tatgtatgat 4140 cctagtcctg tatcggaggg tgactttgcg aggcttgact tagctatctt taagagttat 4200 gagcttaatt tagagtcata ccccacaata gagctaatga acattctttc aatatctagc 4260 gggaagctga ttggccagtc tgtggtttcc tatgatgaag atacctccat aaagaatgac 4320 gccataatag tgtatgacaa cacccggaat tggatcagcg aagcccaaaa ttcagatgtg 4380 gtccgcttat ttgagtacgc agcacttgaa gtgctcctcg actgttctta ccagctttac 4440 tatctgagag taagaggtct agacaatatc gtgttatata tgagtgatct atacaagaat 4500 atgccaggaa ttctactttc caacattgca gctacaatat ctcatcccat cattcattca 4560 agattacatg cagtaggcct agtcaatcat gacgggtcac accaacttgc agacacagat 4620 ttcatagaaa tgtctgcgaa gctgttagtc tcttgcactc gacgcgtggt ctcaggttta 4680 tatgcaggga ataagtatga tctgctgttc ccatccgtcc tagatgataa cctgagtgag 4740 aagatgctcc agctgatatc ccggttatgc tgcctgtaca cggtgctctt tgctacaaca 4800 agggagatcc cgaaaataag aggcttatct gcggaagaga agtgttcagt acttactgag 4860 tacctactgt cagatgctgt gaaaccacta cttagttctg agcaagtgag ttctatcatg 4920 tcccctaaca tagtcacatt cccagctaat ctatactaca tgtctcggaa gagccttaat 4980 ttgatcagag aaagagagga cagggacact atcttggcac tattgttccc ccaagagcca 5040 ttactcgagt tccccttagt acaagatatt ggcgctcgag tgaaagatcc atttacccga 5100 caacctgcgg cgtttttaca ggagttagat ttgagcgctc cagcaaggta tgacgcattt 5160 acacttagtc aggttcattc tgaacacata tcaccaagtc cggaagaaga ctacttagta 5220 cgatacctgt tcagaggaat aggaactgcg tcctcctctt ggtataaggc atcccacctt 5280 ctttctgtac ccgaggtcag atgtgcaagg cacgggaatt ccttatactt ggcagaagga 5340 agcggagcca tcatgagtct tctcgaactg catgtgccgc atgaaactat ctattacaat 5400 acgctcttct caaatgagat gaaccctcca cagcgacatt tcggaccgac cccaacacag 5460 ttcctgaact cggttgttta taggaatcta caagcagagg taccatgcaa ggatggattc 5520 gtccaggagt tccgtccatt atggagagag aatacagaag aaagcgacct gacatcagac 5580 aaagcagtgg ggtatatcac atccgcggtg ccctaccggt ctgtatcatt gctgcattgt 5640 gacattgaga ttcctccagg atccaaccaa agcttactgg atcaactggc taccaatcaa 5700 tctctgattg ccatgcattc tgtaagggaa ggcggggttg tgatcatcaa agtgttgtat 5760 gcaatgggat attacttcca tctactcatg aacttattca ctccgtgttc cacaaaagga 5820 tatattcttt ccaatggcta tgcatgtaga ggggatatgg aatgttacct ggtatttgtc 5880 atgggttatc taggtgggcc tacatttgta catgaggtag tgaggatggc aaaaacttta 5940 gtgcagcggc acggcacact tttgtctaaa tcagatgaga tcacactgac taggttattc 6000 acctcacagc ggcagcgtgt agcagatatc ttatctagtc ctttaccgag actaataaag 6060 ttcttgagaa aaaatatcga tactgcgctg atagaggccg ggggacagcc tgtccgtcca 6120 ttctgtgcgg agagcttggt gagcacattg gcggacataa ctcagatgac ccagatcatt 6180 gccagtcaca ttgacacagt cattcgatct gtgatctaca tggaggctga gggtgatctc 6240 gctgatacag tattcttatt taccccttac aatctctcta cagacggtaa aaagagaaca 6300 tcacttaaac agtgcacacg gcagatctta gaggtcacaa tactgggtct tagagtagag 6360 aacctcaata aagtaggtga tgtaatcagc ctagtgctta aaggtatgat ttccctagag 6420 gatctcatcc cactaagaac atacttgaaa cgtagtactc gccctaagta cttgaaggct 6480 gtcctaggta tcactaaact caaagaaatg tttacagaca catctttatt atacttgact 6540 cgtgctcaac agaaattcta catgaaaact ataggcaatg cagttaaggg atattatagt 6600 aactgtgact cttaa 6615 <210> 8 <211> 1683 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y280_HA <400> 8 atggaggcag tatcactaat aactatacta gtagtggcaa cagtaagcaa tgcagataag 60 atctgcatcg gctatcaatc aacaaactcc acggaaactg tggacacact aacagaaaac 120 aatgtccctg taacacatgc caaagaactg ctccacacag agcataatgg gatgctgtgt 180 gcaacaagct tgggacaccc tcttattcta gacacctgca ccattgaagg gctaatttat 240 ggcaatcctt cttgtgatcc attgctggga ggaagagaat ggtcctatat cgtcgagagg 300 ccatcagccg ttaacggatt atgttatccc gggaatgtag aaaatctaga agagctaaga 360 tcacttttta gttcttctag gtcttatcaa aggatccaga tctttccaga cacaatctgg 420 aatgtgtctt acagtgggac aagcaaagca tgctcggatt cattctacag aagcatgaga 480 tggttgactc aaaagaacaa cgcttaccct acccaagatg ctcaatacac aaataatcaa 540 ggaaagaaca ttcttttcat gtggggtata aatcatccac ccactgatgc tgcgcagaca 600 aatctgtaca ccagaactga cacaacaaca agtgtggcaa cagaggaaat gaatagggtc 660 tttaaaccat tgataggacc aaggcctctt gtcaacggtt tgatgggaag aattaattat 720 tattggtcgg tattgaaacc gggccaaacg ctgcggataa aatctgatgg gaatctaata 780 gctccatggt atggacacat cctttcagga gagagccacg gaagaatcct aaagactgac 840 ttaaaaatgg gtagctgcac agtgcagtgt caaacagaga aaggtggctt aaacacaaca 900 ttgcccttcc aaaatgtaag taagtatgca tttggaaact gctcaaagta cattggcgta 960 aagagtctca aacttgcagt tggtctgagg aatgtgcctt ctagatctag cagaggacta 1020 ttcggggcca tagcaggatt tatagaggga ggttggtcag gactggttgc tggttggtat 1080 gggttccaac attcaaatga ccaaggggtt ggtatggcag cagatagaga ttcaacccaa 1140 aaggcagttg ataaaataac atccaaagtg aataatatag tcgacaaaat gaacaagcag 1200 tatgaaatca ttgatcatga attcagtgag gtagaaacta ggcttaacat gatcaatgat 1260 aaggttgatg atcaaatcca agatatatgg gcatataatg cagaattgct agtcctgctc 1320 gaaaaccaga aaacactcga tgaacatgac gctaatgtga acaatctata taataaagtg 1380 aagagggcgt tgggttccaa tgcagtggaa gatgggagag gatgtttcga gctataccac 1440 aaatgtgata accattgcat ggagacaatt cggaatggga cctacaacag gaggaagtat 1500 caagaggaat caaaattaga aagacagaaa atagaggggg tcaagctgga atctgaagaa 1560 acttacaaaa tcctcaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgat tgcaatgggg 1620 ttcgctgcct ttttgttctg ggccatgtcc aacgggtcct gcagatgcaa catttgtata 1680 taa 1683 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1_F <400> 9 accaaacaga gaatctgtaa gg 22 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1_R <400> 10 tcagtacccc cagtcgg 17 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2_F <400> 11 gtgaccagat gagctttgc 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2_R <400> 12 ttagccattc agtgcaagg 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3_F <400> 13 gtgcattgat catgtcacg 19 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3_R <400> 14 gtcagtttga cattgacctt g 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F4_F <400> 15 gatagaagaa cttgacacct c 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F4_R <400> 16 gagccatgca aacttggctg 20 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F5_F <400> 17 atggcgrgct ccggtcc 17 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F5_R <400> 18 aacagcattg catgcatgc 19 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F6_F <400> 19 gactaacctt caatactcaa g 21 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F6_R <400> 20 accaaacaaa gatttggtga atg 23 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NP_F <400> 21 atgtcttctg tattcgatga g 21 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NP_R <400> 22 tcagtacccc cagtcgg 17 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P_F <400> 23 atggccacct tyacagatg 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P_R <400> 24 ttagccattc agtgcaagg 19 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L_F <400> 25 atggcgrgct ccggtcc 17 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L_R <400> 26 ttaagagtca cagttactrt aatatc 26 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 21 R <400> 27 ggcagaaggc tttctcgagt 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2 F <400> 28 actcgagaaa gccttctgcc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 553 F <400> 29 gcaaaagcca tgactgcgta 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 738 R <400> 30 gcctctcttg agctcgctaa 20 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1,333 F <400> 31 caaccagaag ccggggatg 19 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1,516 R <400> 32 gaagcaggct gggttttgtc 20 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2,130 F <400> 33 gcaactctct gctgttgatg c 21 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2,323 R <400> 34 gtctgtgccc tggtttcca 19 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2,945 F <400> 35 aggaaaatca agcgccttgc 20 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3,914 R <400> 36 tcccatcaga ttttatccgc ag 22 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4,530 F <400> 37 cgttgggttc caatgcagtg 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4,746 R <400> 38 agagatgagg cgacagtcga 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5,325 F <400> 39 aagcgtccca aataccggag 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5,541 R <400> 40 tccactcccg ggaatcttct 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6,312 R <400> 41 agaaggtctg gagcccatct 20 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6,957 F <400> 42 cggaccacaa atcacttcac c 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7,113 R <400> 43 agggttaccg gtgattaagc c 21 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7,739 F <400> 44 aggaaagcaa cagaaaacta gaca 24 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7,947 R <400> 45 tgtagtggct ctcatctgat ct 22 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8,534 F <400> 46 ggcacctatc catgacccag 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8,728 R <400> 47 tgggtgtagc agtaatgggt 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9,335 F <400> 48 gcccaacaca gtcacactca 20 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9,541 R <400> 49 acaatgccat ctttccaact cc 22 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10,151 F <400> 50 aactgctggg gtcatcttgg 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10,340 R <400> 51 atcaccaatt tgttggccgc 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10,956 F <400> 52 gaagaatgca ggtgtgtggc 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11,132 R <400> 53 ctcaggttgg tgacagggtc 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11,733 F <400> 54 gggcctacct cacttcttcg 20 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11,920 R <400> 55 tcattgtcca tagcttctgg ca 22 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12,537 F <400> 56 cccggggact actgcttttg 20 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12,734 R <400> 57 aggactcttt gcgtatgttt ct 22 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 13,339 F <400> 58 agagctgcct cacttgcaaa 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 13,539 R <400> 59 ttgaagattc ccagccgtgg 20 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14,145 F <400> 60 tgaagtgctc ctcgactgtt c 21 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14,349 R <400> 61 tgcaagttgg tgtgatccgt 20 <210> 62 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14,959 F <400> 62 cgatacttgt tcagagggat aggg 24 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 15,119 R <400> 63 tgtggtacat gcagttcgag a 21 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 15,734 F <400> 64 tattcacctc acagcggcag 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 15,936 R <400> 65 tgtgtcaatg tggctagcga 20 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16,437 F <400> 66 ccctgactcc ttaggactcg a 21 <210> 67 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16,463 R <400> 67 tcgaattcga gtcctaagga gt 22 <210> 68 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insertion-up <400> 68 ttagccattc agtgcaaggc gc 22 <210> 69 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insertion-down <400> 69 tcaccactgc agctcgcag 19 <210> 70 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UTR-HA_F <400> 70 cactgaatgg ctaatcacca ctgcagctc 29 <210> 71 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UTR-HA_R <400> 71 gagctgcagt ggtgataatt gcaatttgag 30

Claims (14)

  1. LPAIV(Low Pathogenic Avian Influenza) H9N2 혈청형의 헤마글루티닌(HA) 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 HA 단백질은 A/Korean native chicken/Korea/N20-132/2020(H9N2)(Genbank accession number: OM780106) LPAIV의 HA 단백질인 것을 특징으로 하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 HA 단백질은 서열번호 8로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 HA 단백질은 기탁번호 KCTC 11570BP로 기탁된 NDV K148/08 뉴캣슬병 바이러스의 P(phosphoprotein) 영역과 M(matrix) 영역 사이에 삽입된 것을 특징으로 하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 NDV K148/08 뉴캣슬병 바이러스의 P 단백질의 226번째 아미노산이 류신(L)에서 글루타민(Q)으로 치환된 것을 특징으로 하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 pK148/Y280-HA 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중에서 어느 한 항에 따른 재조합 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 도입한 재조합 뉴캣슬병 바이러스.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 재조합 뉴캣슬병 바이러스는 A/Korean native chicken/Korea/N20-132/2020(H9N2)(Genbank accession number: OM780106) LPAIV의 HA 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 뉴캣슬병 바이러스.
  9. 제7항에 따른 재조합 뉴캣슬병 바이러스를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 뉴캣슬병 바이러스 및 저병원성 조류인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 뉴캣슬병 바이러스 및 Y280-lineage H9N2 저병원성 조류인플루엔자에 대한 백신 조성물인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 생백신, 사독 백신, 서브유닛 백신, 벡터 백신, 키메라 백신 및 DNA 백신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 발육종란내(In Ovo), 비강내, 기관내, 경구, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 직장, 국소, 동맥내, 경피, 흡입, 결막 및 피하로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  14. 제10항에 따른 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 뉴캣슬병 바이러스 및 조류 독감의 예방 방법.
KR1020220030155A 2021-11-09 2022-03-10 신규한 재조합 뉴캣슬바이러스벡터 및 이를 포함하는 백신 조성물 KR20230067453A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2022/017533 WO2023085760A1 (ko) 2021-11-09 2022-11-09 신규한 재조합 뉴캣슬바이러스벡터 및 이를 포함하는 백신 조성물

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210153053 2021-11-09
KR20210153053 2021-11-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230067453A true KR20230067453A (ko) 2023-05-16

Family

ID=86546416

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020220030155A KR20230067453A (ko) 2021-11-09 2022-03-10 신규한 재조합 뉴캣슬바이러스벡터 및 이를 포함하는 백신 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20230067453A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10655146B2 (en) Turkey herpesvirus vectored recombinant containing avian influenza genes
CA2668632C (en) Feline vaccines against avian influenza
KR20220031028A (ko) 아프리카 돼지 열병 백신
DK179920B1 (en) Nucleic acid sequences of a fish virus and its use
CN102021147A (zh) 引起严重急性呼吸道综合征(sars)的新型人病毒及其应用
KR20130008645A (ko) 광견병 바이러스 항원을 함유하는 파라폭스바이러스 벡터
KR20130020963A (ko) 파라폭스바이러스 벡터
Wang et al. Protection of chickens against infectious bronchitis by a recombinant fowlpox virus co-expressing IBV-S1 and chicken IFNγ
KR102154794B1 (ko) 조류 인플루엔자 바이러스 h9n2의 표면항원을 발현하는 뉴캣슬병 바이러스 발현 시스템 및 이를 이용한 조류 백신
EA036116B1 (ru) Пестивирусные вакцины против врожденного тремора
KR102154796B1 (ko) 변이 뉴캣슬병 바이러스 및 상기 바이러스를 이용한 조류 백신
CN112245578A (zh) 一种covid-19病毒预防性疫苗及其制备方法
KR20230067453A (ko) 신규한 재조합 뉴캣슬바이러스벡터 및 이를 포함하는 백신 조성물
CN111718932A (zh) 一种新型的基因编辑动物生物反应器制备方法及应用
US20200276298A1 (en) Paramyxoviridae expression system
CN109943576A (zh) 一种嵌合犬瘟热病毒主要免疫基因的重组狂犬病病毒及其应用
KR102154795B1 (ko) 조류 인플루엔자 바이러스 h5n6의 표면항원을 발현하는 뉴캣슬병 바이러스 발현 시스템 및 이를 이용한 조류 백신
KR101908905B1 (ko) 인플루엔자 바이러스의 h9 및 h5의 다중 아형에 대한 교차 면역반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신
CN111298129B (zh) 二甲双胍介导核酸纳米材料自组装方法及采用该方法制备的纳米制剂和应用
CN100564533C (zh) 一种高效表达病毒基因dsRNA的载体及其应用
US10201604B2 (en) Live attenuated infectious laryngotracheitis virus (ILTV) vaccines and preparation thereof
KR100872840B1 (ko) 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 전체-길이의감염성이 있는 cDNA 클론 및 이의 용도
CN100543132C (zh) 引起严重急性呼吸道综合征(sars)的新型人病毒及其应用
CN113999317B (zh) 激发机体抗非洲猪瘟感染的融合基因及其编码蛋白和应用
CN100352513C (zh) 新城疫粘膜dna疫苗及其构建方法