KR20110128333A - 항체 제제 - Google Patents

Abstract

치료 유효량의 항체 (임의로, 사전 동결건조를 거치지 않은 것), 약 4.5 내지 약 6.5의 범위의 pH를 유지하는 완충제 및 임의의 계면활성제를 포함하는 제제가 상기 제제에 대한 용도와 함께 기재되어 있다.

Description

항체 제제 {ANTIBODY FORMULATION}

관련 출원

본 출원은 2009년 3월 6일 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/158,331 (그 명세서 전문이 본원에 포함됨)을 우선권 주장하며 그의 이점을 청구한다.

발명의 분야

본 발명은 항체를 포함하는 제제에 관한 것이다.

지난 수년간, 생명공학의 진보는 재조합 DNA 기술을 이용하여 제약 용도를 위한 다양한 단백질을 생산하는 것을 가능하게 하였다. 단백질은 통상의 유기 및 무기 약물보다 더 크고 보다 복잡하기 때문에 (예를 들어, 복잡한 3차원 구조 이외에도 다수의 관능기를 가짐), 이러한 단백질의 제제에는 특수한 문제들이 있다. 단백질의 생물학적 활성을 유지하기 위해, 제제는 적어도 단백질 아미노산의 핵심 서열의 무손상의 입체형태적 완전성을 보존해야 하며, 동시에 단백질의 여러 관능기를 분해로부터 보호하여야 한다. 단백질에 대한 분해 경로는 화학적 불안정성 (예를 들어, 신규 화학 개체를 생성하는, 결합 형성 또는 절단에 의한 단백질의 변형을 수반하는 임의의 과정) 또는 물리적 불안정성 (예를 들어, 단백질의 보다 고차원적인 구조에서의 변화)을 수반할 수 있다. 화학적 불안정성은 탈아미드화, 라세미화, 가수분해, 산화, 베타 제거 또는 디술피드 교환으로부터 초래될 수 있다. 물리적 불안정성은, 예를 들어 변성, 응집, 침전 또는 흡착으로부터 초래될 수 있다. 3가지의 가장 일반적인 단백질 분해 경로는 단백질 응집, 탈아미드화 및 산화이다. 문헌 [Cleland et al. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993)].

제약 용도를 위해 사용되는 단백질에는 항체가 포함된다. 요법을 위해 유용한 항체의 예에는 산화된 LDL에 결합하는 항체가 있다. 당업계에는 치료 용도에 적합한, 항체 (예컨대, 항-oxLDL 항체)를 포함하는 안정한 수성 제약 제제에 대한 요구가 존재한다.

본 발명은 치료 유효량의 항체, 약 4.5 내지 약 6.5 범위의 pH를 유지하는 완충제 및 임의로 계면활성제를 포함하는 제제를 제공한다. 특정 실시양태에서, 제제는 12개월 이상 동안 약 2 내지 8℃의 온도에 안정하다. 전형적으로, 이로써, 예를 들어 제약 용도로 사용하기 위한 수성 제제가 생성된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 제제는 안정한 수성 제제이다. 특정 실시양태에서, 제제는 안정한 수성 제약 제제이다.

본 발명은 적어도 부분적으로, 모노클로날 항체, 특히 응집되기 쉬운 전장 항체를 제제화하는 데 특히 유용한 완충제로서 히스티딘 및 아르기닌의 조합물 (pH 4.5 내지 6.5)을 확인하는 것에 관한 것이다. 제제는 내부 항체 생성물의 분해를 지연시킨다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 히스티딘 및 아르기닌 완충제는 히스티딘-아세테이트 및 아르기닌-아세테이트 완충제 (pH 5.0 내지 6.0)이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 히스티딘 및 아르기닌 완충제는 히스티딘-숙시네이트 및 아르기닌-숙시네이트 완충제 (pH 4.5 내지 6.5)이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 제제는 멸균된다.

본원에서 완충제의 제제는 4.5 내지 6.5의 pH, 예를 들어 5.0 내지 6.0 의 pH, 5.25 내지 5.75의 pH 또는 5.3 내지 5.6의 pH를 갖는다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 제제는 5.5 또는 약 5.5의 pH를 갖는다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 제제는 5.6 또는 약 5.6의 pH를 갖는다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 모노클로날 항체를 히스티딘-아세테이트 및 아르기닌-아세테이트 완충제 (pH 4.5 내지 6.5) 중에 포함하는 제제에 관한 것이다. 추가 실시양태에서, 이는, 예를 들어 안정한 제약 제제이다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 모노클로날 항체를 히스티딘-숙시네이트 및 아르기닌-숙시네이트 완충제 (pH 4.5 내지 6.5) 중에 포함하는 제제에 관한 것이다. 추가 실시양태에서, 이는, 예를 들어 안정한 제약 제제이다.

특정 실시양태에서, 완충제 중 히스티딘 아세테이트 또는 히스티딘 숙시네이트 농도는 약 5 mM 내지 약 100 mM이다. 특정 실시양태에서, 히스티딘 아세테이트 또는 히스티딘 숙시네이트 농도는 약 20 mM이다. 특정 실시양태에서, 완충제 중 아르기닌 아세테이트 또는 아르기닌 숙시네이트 농도는 약 50 mM 내지 약 500 mM이다. 특정 실시양태에서, 아르기닌 아세테이트 또는 아르기닌 숙시네이트 농도는 약 150 mM이다.

본원에서 제제는 임의로 계면활성제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20)이다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 농도는 0.0001% 내지 약 1.0%이다. 특정 실시양태에서, 계면활성제 농도는 약 0.01% 내지 약 0.1%이다. 한 실시양태에서, 계면활성제 농도는 0.02%이다. 제제는 임의로 메티오닌을 (예를 들어, 약 5 mg/ml 또는 5 mg/ml의 농도로) 포함할 수 있다. 제제는 임의로 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA, EGTA 등을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제 중 EDTA 농도는 1 mM EDTA이다.

제제에서 항체 농도는 전형적으로 약 10 mg/ml 내지 약 250 mg/ml이다. 특정 실시양태에서, 항체 농도는 약 100 mg/ml 내지 250 mg/ml이다. 특정 실시양태에서, 항체 농도는 약 150 mg/ml 내지 약 200 mg/ml이다. 특정 실시양태에서, 항체 농도는 약 25 mg/ml 내지 약 200 mg/ml이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 약 10 mg/mL 내지 약 250 mg/mL 양의, 탈아미드화되거나 응집되기 쉬운 전장 IgG1 항체; (b) pH 4.5 내지 6.5의 히스티딘-아세테이트 및 아르기닌-아세테이트 완충제; 및 (c) 약 0.01% 내지 약 0.1% 양의 폴리소르베이트 20을 포함하는 제약 제제에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 약 10 mg/ml 내지 약 250 mg/mL 양의 응집되기 쉬운 전장 IgG1 항체; (b) pH 4.5 내지 6.5의 히스티딘-숙시네이트 및 아르기닌-숙시네이트 완충제; 및 (c) 약 0.01% 내지 약 0.1% 양의 폴리소르베이트 20을 포함하는 제약 제제에 관한 것이다.

특정 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 전장 항체 (예를 들어, IgG1, IgG4 등)이다. 특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 항체 단편 (예를 들어, 항원 결합 영역을 포함함)이다. 예를 들어, 항체 단편은 Fab 또는 F(ab')₂ 단편이다. 특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 인간화 항체이다. 특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 응집되기 쉽다. 특정 실시양태에서, 항체는 사전 동결건조를 거치지 않는다.

특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 ox-LDL에 결합한다. 추가 측면에서, 본 발명은 pH 약 4.5 내지 약 6.5의 히스티딘 및 아르기닌 완충제 중 ox-LDL에 결합된 항체, 및 계면활성제를 포함하는 제약 제제에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, oxLDL 항체는 도 2의 각각의 서열 3 및 4의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 아미노산 서열, 및 임의로 도 2의 각각의 서열 6 및 7의 불변 영역 (H 및 L)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-oxLDL 항체는 도 1 (서열 1 및 2)의 핵산에 의해 코딩된 VH 및 VL을 포함한다.

본 발명은 또한 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/mL 양의 ox-LDL 항체, 히스티딘-아세테이트 및 아르기닌-아세테이트 완충제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 제약 제제 (여기서, 제제의 pH는 약 4.5 내지 약 6.5임)에 관한 것이다.

본 발명은 또한 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/mL 양의 ox-LDL 항체, 히스티딘-숙시네이트 및 아르기닌-숙시네이트 완충제, 및 폴리소르베이트 20을 포함하는 제약 제제 (여기서, 제제의 pH는 약 4.5 내지 약 6.5임)에 관한 것이다.

본 발명은 또한 치료 유효량의 항체, 약 4.5 내지 약 6.5 범위의 pH를 유지하는 완충제, 및 임의로 계면활성제를 포함하는 안정한 수성 제약 제제가 담긴 용기를 포함하는 제조품에 관한 것이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 완충제는 히스티딘-아세테이트 및 아르기닌-아세테이트 완충제 (pH 5.0 내지 6.0)이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 완충제는 히스티딘-숙시네이트 및 아르기닌-숙시네이트 완충제 (pH 5.0 내지 6.0)이다. 특정 실시양태에서, 완충제의 pH는 5.5이다. 특정 실시양태에서, 완충제의 pH는 5.6이다. 본 발명은 또한 내부에 제제를 포함하는, 임의로 냉동된 형태의, 주사기로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알, 또는 탱크 (예를 들어, 스테인레스 스틸 탱크)에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 바이알 또는 탱크는 약 2 내지 8℃에서 보관된다. 특정 실시양태에서, 바이알은 3 cc, 20 cc 또는 50 cc 바이알이다.

또한, 본 발명은 (a) 모노클로날 항체 제제의 제조; 및 (b) 제제 중 모노클로날 항체의 물리적 안정성, 화학적 안정성 또는 생물학적 활성의 평가를 포함하는, 제약 제제의 제조 방법을 제공한다.

추가 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 항체, 약 4.5 내지 약 6.5 범위의 pH를 유지하는 완충제, 및 임의로 계면활성제를 조합하여 수성 제약 제제 내의 항체를 안정화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 완충제는 히스티딘-아세테이트 및 아르기닌-아세테이트 완충제 (pH 4.5 내지 6.5)이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 완충제는 히스티딘-숙시네이트 및 아르기닌-숙시네이트 완충제 (pH 4.5 내지 6.5)이다.

본 발명은 또한 히스티딘-아세테이트 및 아르기닌 아세테이트 완충제 (pH 4.5 내지 6.5) 중에서 항체를 제제화하는 것을 포함하는, 치료용 모노클로날 항체의 응집을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 히스티딘-숙시네이트 및 아르기닌 숙시네이트 완충제 (pH 4.5 내지 6.5) 중에서 항체를 제제화하는 것을 포함하는, 치료용 모노클로날 항체의 응집을 감소시키는 방법을 제공한다.

본원의 제제 및 방법의 특정 실시양태에서, 제제는 안정하다. 한 실시양태에서, 제제는 12개월 이상 동안 약 25℃에서 보관시 안정하다. 한 실시양태에서, 제제는 12개월 이상 동안 약 5℃에서 보관시 안정하다. 한 실시양태에서, 제제는 12개월 이상 동안 약 -20℃에서 보관시 안정하다. 한 실시양태에서, 제제는 24개월 이상 동안 약 5℃에서 보관시 안정하다. 한 실시양태에서, 제제는 24개월 이상 동안 약 -20℃에서 보관시 안정하다.

본원의 제제 및 방법의 특정 실시양태에서, 제제는 정맥내 (IV), 피하 (SQ) 또는 근육내 (IM) 투여를 위한 것이다. 한 예에서, 제제는 IV 투여를 위한 것이고, 항체 농도는 약 10 mg/ml 내지 약 250 mg/ml이다. 또 다른 예에서, 제제는 SQ 투여를 위한 것이고, 항체 농도는 약 80 mg/ml 내지 약 250 mg/ml이다.

본 발명은 또한 대상체에게 질환 또는 장애를 치료하는 데 효과적인 양의 제제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.

추가 측면에서, 본 발명은 제제 내의 항체를 사용한 치료를 필요로 하는 장애를 앓는 포유동물에게 치료 유효량의 본원에 개시된 수성 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물의 치료 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 아테롬성동맥경화증을 치료하는 데 효과적인 양의 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 아테롬성동맥경화증을 치료하는 방법을 제공한다. 항체가 ox-LDL에 결합하는 경우, 치료할 장애의 예에는 아테롬성동맥경화증이 포함된다.

본 발명의 이러한 측면 및 추가 측면은 당업자에게 명백할 것이다.

도 1에는 항-oxLDL 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 코딩하는 핵산 서열이 도시되어 있다.
도 2에는 항-oxLDL 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 아미노산 서열, 및 불변 영역 H 및 L이 도시되어 있다.
도 3에는 실시예 1의 pH 연구에서 icIEF에 의한, pH의 기능으로서의 항-oxLDL 항체의 전하 변이체가 도시되어 있다. 플롯은 T0에서의 데이터 (◆) 및 40℃에서 4 주 동안 인큐베이션한 후의 데이터 (□)를 보여준다.
도 4에는 40℃에서 pH의 기능으로서의 항-oxLDL 항체의 크기 변이체가 도시되어 있다. 플롯은 T0 (◆), 1주 (□), 2 주 (▲) 및 4 주 (○)에서의 데이터를 보여준다 (pH 연구).
도 5에는 40℃에서 4주 동안 인큐베이션한 항-oxLDL 항체의 주요 피크 비율(%)을 보여주는 CE-SDS UV (비-환원) 데이터가 도시되어 있다 (부형제 연구).
도 6에는 40℃에서 4주 동안 인큐베이션한 항-oxLDL 항체 샘플을 보여주는 ELISA 결합 데이터가 도시되어 있다.
도 7A 및 B에는, (A) 다양한 농도에서의 항-oxLDL 항체의 응집체 비율(%) (SEC 이용) 및 (B) 다양한 농도에서의 항-oxLDL 항체의 산성 피크 비율(%) (icIEF 이용)이 도시되어 있다.
도 8에는 다양한 산화제를 사용한 항-oxLDL 항체의 응집체 비율 (%) (SEC를 이용)이 도시되어 있다.

I. 정의

본 발명을 상세히 설명하기에 앞서, 본 발명이 특정 조성물 또는 생물학적 시스템에 제한되는 것이 아니며, 물론 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어가 단지 특정 실시양태를 기재하려는 목적을 위한 것일 뿐, 제한하려는 의도를 갖지 않는다는 것 또한 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같은 단수 형태는 내용상 달리 명백히 지시되지 않는 한 복수 대상물을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "분자"에 대한 언급은 임의로 2개 이상의 상기 분자의 조합 등을 포함한다.

용어 "제약 제제"는, 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하며 제제가 투여될 대상체에게 허용될 수 없게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제제는 멸균된다. "제약상 허용되는" 부형제 (비히클, 첨가제)는 사용된 활성 성분의 유효 용량을 제공하기 위해 대상 포유동물에 합리적으로 투여될 수 있는 것이다.

"멸균" 제제는 무균성이거나, 또는 모든 살아있는 미생물 및 그의 포자가 없거나, 실질적으로 없다.

본원에서, "냉동" 제제는 0℃ 미만의 온도에 있는 것이다. 일반적으로, 냉동 제제는 냉동-건조되지 않거나, 또는 사전 동결건조 또는 후속 동결건조를 거치지 않는다. 특정 실시양태에서, 냉동 제제는 보관을 위한 (스테인레스 스틸 탱크에서) 냉동 약물 물질, 또는 냉동 약물 생성물 (최종 바이알 형태)을 포함한다.

"안정한" 제제는 보관시에 내부의 단백질이 본질적으로 그의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 유지하는 제제이다. 바람직하게는, 제제는 본질적으로 보관시에 그의 물리적 및 화학적 안정성, 뿐만 아니라 생물학적 활성을 유지한다. 보관 기간은 일반적으로 제제의 의도된 저장기간을 기초로 하여 선택된다. 단백질 안정성을 측정하는 다양한 분석 기술들이 당업계에서 이용가능하고, 예를 들어 문헌 [Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)] 및 [Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)]에서 검토된다. 선택된 기간동안 선택된 온도에서 안정성이 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 약 40℃에서 적어도 약 2 내지 4 주 동안 안정하고/거나, 약 5℃에서 적어도 3 개월 동안 안정하고/거나, 약 5℃에서 적어도 6 개월 동안 안정하고/거나, 약 5℃에서 적어도 12 개월 동안 안정하고/거나, 약 -20℃에서 적어도 3 개월 또는 적어도 1년 동안 안정하다. 특정 실시양태에서, 제제는 약 25℃에서 적어도 6 개월 동안 안정하고/거나 약 25℃에서 12 개월 동안 안정하고/거나 약 5℃에서 6 개월 동안 안정하고/거나 약 5℃에서 12 개월 동안 안정하고/거나 약 -20℃에서 적어도 6 개월 동안 안정하고/거나 약 -20℃에서 적어도 12 개월 동안 안정하고/거나 5℃ 또는 -20℃에서 적어도 2 년 동안 안정하다. 특정 실시양태에서, 제제는 제제의 냉동 (예컨대, -70℃로) 및 해동 후에, 예를 들어 냉동 및 해동의 1, 2 또는 3회 반복 후에 안정하다. 안정성은 각종 다양한 방식으로, 예를 들어 응집 형성의 평가 (예컨대, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여, 탁도 측정에 의해, 및/또는 육안 검사에 의해)로; 양이온 교환 크로마토그래피, 이미지 모세관 등전점 포커싱 (icIEF) 또는 모세관 구역 전기영동을 이용한 전하 이종성 평가에 의해; 아미노-말단 또는 카르복시-말단 서열 분석; 질량 분광측정 분석; 환원된 항체와 무손상 항체를 비교하기 위한 SDS-PAGE 분석; 펩티드 맵 (예를 들어, 트립신 또는 LYS-C) 분석; 항체의 생물학적 활성 또는 항원 결합 기능 평가 등에 의해 정량적으로 및/또는 정성적으로 평가될 수 있다. 불안정성에는 응집, 탈아미드화 (예컨대, Asn 탈아미드화), 산화(예컨대, Met 산화), 이성질체화 (예컨대, Asp 이성질체화), 클리핑/가수분해/단편화 (예컨대, 힌지 영역 단편화), 숙신이미드 형성, 쌍 비형성된 시스테인(들), N-말단 연장, C-말단 프로세싱, 글리코실화 차이 등 중 임의의 하나 이상이 관련될 수 있다.

제약 제제에서 단백질은, 색상 및/또는 투명도의 육안 검사시, 또는 UV 광 산란 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정시에 응집, 침전 및/또는 변성의 징후가 없거나 거의 없는 경우에 "그의 물리적 안정성을 유지한다".

제약 제제에서 단백질은, 주어진 시간에서의 화학적 안정성이, 단백질이 하기 정의된 바와 같은 그의 생물학적 활성을 계속 유지하는 것으로 간주되도록 하는 경우에 "그의 화학적 안정성을 유지한다". 화학적 안정성은 화학적으로 변경된 단백질의 형태를 검출 및 정량화하여 평가할 수 있다. 화학적 변경은, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피, SDS-PAGE 및/또는 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화/비행 시간형 질량 분광측정법 (MALDI/TOF MS)을 이용하여 평가할 수 있는 크기 변형 (예를 들어, 클리핑)을 포함할 수 있다. 다른 유형의 화학적 변경에는, 예를 들어 이온-교환 크로마토그래피 또는 icIEF로 평가할 수 있는 전하 변경 (예를 들어, 탈아미드화의 결과로서 발생함)이 포함된다.

제약 제제에서 항체는, 주어진 시간에서의 항체의 생물학적 활성이, 예를 들어 항원 결합 검정으로 제약 제제의 제조 시점에 측정하였을 때 나타난 생물학적 활성의 약 10% 이내 (검정의 오차 이내)에 포함되는 경우에 "그의 생물학적 활성을 유지한다". 항체에 대한 다른 "생물학적 활성" 검정이 하기 본원에 상세히 설명된다.

본원에서, 모노클로날 항체의 "생물학적 활성"은 항원에 결합하는 항체의 능력을 지칭한다. 여기에는 항원에 대한 항체 결합이 추가로 포함될 수 있으며, 이는 시험관내 또는 생체 내에서 측정될 수 있는 측정가능한 생물학적 반응을 일으킨다. 이러한 활성은 길항작용 또는 효능작용일 수 있다.

본원에서 "탈아미드화" 모노클로날 항체는 하나 이상의 그의 아스파라긴 잔기가, 예를 들어 아스파르트산 또는 이소-아스파르트산으로 유도체화된 것이다.

"탈아미드화되기 쉬운" 항체는 탈아미드화되려는 경향이 있음이 밝혀진 하나 이상의 잔기를 포함하는 것이다.

"응집되기 쉬운" 항체는, 특히 냉동 및/또는 교반시에 다른 항체 분자(들)과 응집되는 것으로 밝혀진 것이다.

"단편화되기 쉬운" 항체는, 예를 들어 그의 힌지 영역에서 2개 이상의 단편으로 절단되는 것으로 밝혀진 것이다.

"탈아미드화, 응집 또는 단편화의 감소"는 다양한 pH 또는 다양한 완충제에서의 제제화된 모노클로날 항체에 대한 탈아미드화, 응집 또는 단편화의 양의 방지 또는 감소를 의도로 한다.

제제화되는 항체는 바람직하게는 본질적으로 순수하고, 바람직하게는 본질적으로 균질하다 (즉, 오염 단백질 등이 없음). "본질적으로 순수한" 항체는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 90 중량% 이상, 바람직하게는 약 95 중량% 이상의 항체를 포함하는 조성물을 의미한다. "본질적으로 균질한" 항체는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 99 중량% 이상의 항체를 포함하는 조성물을 의미한다.

"등장성"은 관심 대상 제제가 본질적으로 인간 혈액과 동일한 삼투압을 가짐을 의미한다. 등장성 제제는 일반적으로 약 250 내지 350 mOsm의 삼투압을 가질 것이다. 예를 들어, 증기압 또는 빙냉 유형 삼투압계를 사용하여 등장성을 측정할 수 있다.

본원에 사용된, "완충제"는 그의 산-염기 접합체 성분의 작용에 의해 pH 변화에 영향을 받지 않는 완충 용액을 지칭한다. 본 발명의 완충제는 약 4.5 내지 약 7.0, 또는 약 4.5 내지 약 6.5, 또는 약 5.0 내지 약 6.0 범위의 pH를 갖거나, 또는 약 5.5의 pH를 갖거나, 5.5의 pH를 갖거나, 약 5.6의 pH를 갖거나, 또는 5.6의 pH를 갖는다. 상기 범위로 pH를 제어할 완충제의 예에는 아세테이트, 숙시네이트, 숙시네이트, 글루코네이트, 히스티딘, 시트레이트, 글리실글리신 및 다른 유기 산 완충제가 포함된다.

"히스티딘 완충제"는 히스티딘 이온을 포함하는 완충제이다. 히스티딘 완충제의 예에는 히스티딘 클로라이드, 히스티딘 아세테이트, 히스티딘 포스페이트, 히스티딘 술페이트, 히스티딘 숙시네이트 등이 포함된다. 한 실시양태에서, 본원의 실시예에서 확인된 히스티딘 완충제는 히스티딘 아세테이트인 것으로 밝혀졌다. 한 실시양태에서, 히스티딘 아세테이트 완충제는 아세트산 (액체)으로 L-히스티딘 (유리 염기, 고체)을 적정함으로써 제조된다. 특정 실시양태에서, 히스티딘 완충제 또는 히스티딘-아세테이트 완충제는 pH 4.5 내지 6.5이다. 한 실시양태에서, 완충제는 pH 5.5를 갖는다. 한 실시양태에서, 본원의 실시예에서 확인된 히스티딘 완충제는 히스티딘 숙시네이트인 것으로 밝혀졌다. 한 실시양태에서, 히스티딘-숙시네이트 완충제는 pH 4.5 내지 6.5이다. 한 실시양태에서 완충제는 pH 5.5를 갖는다. 한 실시양태에서, 완충제는 5.6의 pH를 갖는다.

"히스티딘 아르기닌 완충제"는 히스티딘 이온 및 아르기닌 이온을 포함하는 완충제이다. 히스티딘 완충제의 예에는 히스티딘 클로라이드-아르기닌 클로라이드, 히스티딘 아세테이트-아르기닌 아세테이트, 히스티딘 포스페이트-아르기닌 포스페이트, 히스티딘 술페이트-아르기닌 술페이트, 히스티딘 숙시네이트-아르긴 숙시네이트 등이 포함된다. 한 실시양태에서, 본원의 실시예에서 확인된 히스티딘-아르기닌 완충제는 히스티딘 아세테이트-아르기닌 아세테이트인 것으로 밝혀졌다. 한 실시양태에서, 히스티딘 아세테이트 완충제는 아세트산 (액체)으로 L-히스티딘 (유리 염기, 고체)을 적정함으로써, 그리고 아세트산 (액체)으로 L-아르기닌 (유리 염기, 고체)을 적정함으로써 제조된다. 한 실시양태에서, 히스티딘-아르기닌 완충제는 pH 4.5 내지 6.5이다. 한 실시양태에서, 완충제는 5.5의 pH를 갖는다. 한 실시양태에서, 본원의 실시예에서 확인된 히스티딘-아르기닌 완충제는 히스티딘 숙시네이트-아르기닌 숙시네이트인 것으로 밝혀졌다. 한 실시양태에서, 히스티딘 숙시네이트-아르기닌 숙시네이트 완충제는 pH 4.5 내지 6.5이다. 한 실시양태에서, 완충제는 5.5의 pH를 갖는다. 한 실시양태에서, 완충제는 5.6의 pH를 갖는다.

본원에서, "계면활성제"는 표면-활성제, 바람직하게는 비이온성 계면활성제를 지칭한다. 본원에서의 계면활성제의 예에는 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80); 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188); 트리톤; 나트륨 도데실 술페이트 (SDS); 나트륨 라우렐 술페이트; 나트륨 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-술포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸- 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 나트륨 메틸 코코일- 또는 이나트륨 메틸 올레일-타우레이트; 및 모나쿠아트(MONAQUAT)™ 시리즈 (모나 인더스트리즈, 인크 (Mona Industries, Inc.), 뉴저지주 패터슨); 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예를 들어, 플루로닉스(Pluronics), PF68 등) 등이 포함된다. 한 실시양태에서, 본원의 계면활성제는 폴리소르베이트 20이다.

약학적 관점에서, 본 발명의 문맥상, 항체의 "치료 유효량"은 치료를 위해 항체가 효과적인 장애의 예방 또는 치료에 효과적인 양을 지칭한다. "장애"는 항체로의 처리로부터 이익을 얻게될 임의의 상태이다. 여기에는 만성 및 급성 장애 또는 질환 (포유동물이 당해 장애에 걸리기 쉬운 병리 상태 포함)이 포함된다.

"보존제"는, 예를 들어 박테리아 작용을 본질적으로 감소시켜 다용도 제제의 생산을 용이하게 하기 위하여 제제에 임의로 포함될 수 있는 화합물이다. 가능한 보존제의 예에는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬기들이 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드들의 혼합물) 및 벤즈에토늄 클로라이드가 포함된다. 또 다른 유형의 보존제에는 방향족 알콜 예컨대 페놀, 부틸 및 벤질 알콜, 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥사놀, 3-펜타놀, 및 m-크레졸이 포함된다. 한 실시양태에서, 본원에서의 보존제는 벤질 알콜이다.

"폴리올"은 다중 수산기를 갖는 물질이고, 여기에는 당 (환원당 및 비환원당), 당 알코올 및 당 산이 포함된다. 폴리올은 제제에 임의로 포함될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서의 폴리올은 약 600 kD 미만 (예를 들어, 약 120 내지 약 400 kD 범위)의 분자량을 갖는다. "환원당"은 금속 이온을 환원시키거나 또는 단백질 내의 리신 및 다른 아미노 기와 공유적으로 반응할 수 있는 헤미아세탈 기를 함유하는 것이고, "비환원당"은 환원당의 이러한 특성을 갖지 않는 것이다. 환원당의 예에는 프룩토스, 만노스, 말토스, 락토스, 아라비노스, 크실로스, 리보스, 람노스, 갈락토스 및 글루코스가 있다. 비환원당에는 수크로스, 트레할로스, 소르보스, 멜레지토스 및 라피노스가 포함된다. 만니톨, 크실리톨, 에리트리톨, 트레이톨, 소르비톨 및 글리세롤은 당 알콜의 예이다. 당 산과 관련하여, 여기에는 L-글루코네이트 및 그의 금속 염이 포함된다. 제제가 냉동-해동에 안정한 것이 바람직한 경우, 폴리올은, 바람직하게는 그가 제제 중의 항체를 불안정화시키도록 냉동 온도 (예를 들어, -20℃)에서 결정화되지 않는 것이다. 특정 실시양태에서, 비환원당, 예컨대 수크로스 및 트레할로스가 폴리올의 예이며, 여기서 트레할로스의 용액 안정성 때문에 트레할로스가 수크로스보다 바람직하다.

본원에 사용된 항-OxLDL 항체는 LDL의 단백질 항원 (예를 들어, ApoB-100)에 결합하는 항체이다. 예를 들어, IEI-E3, LDO-D4, KTT-B8 및 2-DO3 (예를 들어, WO2004/030607에서의) 참조. ApoB-100은 인간 혈청 내의 콜레스테롤의 주요 캐리어인 LDL의 단백질 성분이다. LDL의 산화는 아테롬형성 입자로의 전환에서 중요한 단계이며, 산화적 변형은 가장 이른 가시적인 아테롬성동맥경화성 병변인 지방 선조(fatty streaks)의 초기 형성을 유도한다.

항-oxLDL 항체의 예에는 산화된 LDL에 대항하여 지정된 완전 인간 모노클로날 IgG1 항체인 2-DO3이 있다. 항체 2DO3의 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 도 1에 제시되어 있으며, 각각 서열 1 및 서열 2로 지정하였다. 항체 2DO3의 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 아미노산 서열은 도 2에 제시되어 있으며, 각각 서열 3 및 서열 4로 지정하였다. 불변 영역 H 및 L은 도 2에서와 같이 각각 서열 6 및 7로 지정하였다. 2-DO3은 또한 적어도 WO2004/030607의 도 3에 제시되어 있는 VH 및 VL 서열 (또는 US20040202653의 서열 27 및 28), 및 WO2007/025781의 표 2에 수록된 항체의 CDR 서열을 갖는 항체를 지칭한다.

항-oxLDL 항체의 생물학적 활성은 ox-LDL에 결합하고, 임의로, 예를 들어 플라크 형성을 억제하고 아테롬성동맥경화성 병변의 발병을 방지할 것이다 (예를 들어, 문헌 [Schiopu et al., 2004]; WO 2004/030607; US 6,716,410의 동물 모델에 기재된 바와 같음). 다른 활성에는 처리 수주 후 대동맥에서 기존의 확립된 아테롬성동맥경화성 플라크의 퇴행을 활성적으로 유도하는 것이 포함된다 (예를 들어, WO2007/025781).

아테롬성동맥경화증은 흡연, 고혈압, 당뇨병, 고콜레스테롤혈증, 상승된 혈장 저-밀도 지단백질 (LDL) 및 트리글리세리드, 고피브리노겐혈증 및 고혈당증을 비롯한 생화학적 위험 인자가 존재하는 대상체에서 우선적으로 발병하는 다인성 질환이다. 아테롬성동맥경화증은 대형 및 중간-크기 동맥의 최내부 층 (혈관내막)의 비후를 유발하는 만성 질환이다. 이는 혈류를 감소시키고, 영향을 받은 혈관에 의해 공급받는 기관에서 허혈 및 조직 파괴를 야기할 수 있다. 아테롬성동맥경화성 병변은 인간에서 수십년에 걸쳐 발병하고 있으며, 이는 합병증, 예컨대 관상동맥 질환, 뇌허혈 질환 및 혈전색전성 질환, 및 심근경색 및 뇌경색을 유발한다.

아테롬성동맥경화증은 급성 심근경색, 졸중 및 말초 동맥 질환을 비롯한 심혈관 질환의 주요 원인이다. 상기 질환은 혈관의 세포외 기질 내의 지단백질, 주로 LDL의 축적에 의해 개시된다. 이러한 LDL 입자는 응집되고, 산화적 변형을 겪는다. 산화된 LDL은 독성이고, 혈관 손상을 유발한다. 여러 관점에서, 아테롬성동맥경화증은 염증 및 섬유증을 비롯한 이러한 손상에 대한 반응을 나타낸다.

"치료"는 치유적 치료, 및 예방적 또는 방지적 조치를 둘 다 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상에는 이미 장애가 있는 대상, 뿐만 아니라 장애가 예방되어야 하는 대상이 포함된다.

치료 목적의 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등을 비롯한, 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.

용어 "항체"는 본원에서 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 항체 단편을 포함한다.

"단리된" 항체는 천연 환경 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 항체이다. 이것의 천연 환경의 오염물 성분은 항체의 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 여기에는 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질이 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 (1) 예를 들어 로우리(Lowry) 방법으로 측정시에 95 중량% 초과의 항체로, 일부 실시양태에서는 99 중량% 초과로, (2) 예를 들어 스피닝 컵 서열분석기를 이용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 예를 들어 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비-환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균질한 것으로 나타날 정도로 정제된다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하는데, 이는 항체 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계를 통해 제조될 것이다.

"천연 항체"는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 디술피드 공유 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 연결부의 수는 상이한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 달라진다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 쇄내 디술피드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VH)을 갖고, 그 뒤에는 수많은 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VL) 및 다른쪽 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성한다고 여겨진다.

용어 "불변 도메인"은 항원 결합 부위를 함유하는 이뮤노글로불린의 다른 부분인 가변 도메인에 비해 보다 보존된 아미노산 서열을 갖는 이뮤노글로불린 분자의 일부를 지칭한다. 불변 도메인은 중쇄의 C_H1, C_H2 및 C_H3 도메인 (집합적으로, CH) 및 경쇄의 CHL (또는 CL) 도메인을 함유한다.

항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로서 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로서 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이고, 항원-결합 부위를 함유한다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분들이 항체들 사이에서 광범위한 서열 상이성을 나타낸다는 사실을 지칭하고, 각 특정 항체의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에서 사용된다. 그러나, 가변성이 항체 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 이것은 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 초가변 영역 (HVR)이라 불리는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 주로 베타-시트 배위를 취하며 3개의 HVR에 의해 연결되어 있는 4개의 FR 영역을 포함하는데, 이것은 베타-시트 구조를 연결하고, 일부 경우에는 상기 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄에서의 HVR들은 FR 영역에 의해 서로 매우 근접하게 위치하며, 다른 쇄로부터의 HVR과 함께 항체의 항원-결합 부위 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데는 직접 관여하지 않지만, 항체 의존적 세포 독성에서의 항체 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.

임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)라고 불리는 2개의 분명하게 구분되는 유형 중 하나로 배정될 수 있다.

본원에 사용된 용어 IgG "이소형" 또는 "하위클래스"는 그의 불변 영역의 화학적 및 항원성 특징으로 정의되는 임의의 하위클래스의 이뮤노글로불린을 의도한다.

중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (이뮤노글로불린)는 다양한 클래스로 배정될 수 있다. 5가지 주요 클래스의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이중 몇 가지는 하위클래스 (이소형), 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 불린다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 입체형상은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Abbas et al. Cellular and Mol . Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)]에 일반적으로 기재되어 있다. 항체는 항체 및 1종 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성되는, 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.

용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "온전한 항체"는 본원에서 구별없이 사용되며, 하기 정의된 바와 같은 항체 단편이 아니라 실질적으로 무손상인 형태의 항체를 지칭한다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.

본원의 목적상, "네이키드(naked) 항체"는 세포독성 잔기 또는 방사선표지와 접합되지 않은 항체이다.

"항체 단편"은 바람직하게는 항원 결합 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.

항체를 파파인으로 소화시키면 "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편 (각각 단일 항원-결합 부위를 가짐) 및 나머지 "Fc" 단편 (이러한 명칭은 쉽게 결정화되는 능력을 반영함)이 생성된다. 펩신 처리하면, 2개의 항원-결합 부위를 갖고 항원과 여전히 가교 결합할 수 있는 F(ab')₂ 단편이 생성된다.

"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 2-쇄 Fv 종은 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 비공유적으로 회합된 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv (scFv) 종에서, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결될 수 있다. 이러한 형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 HVR은 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면의 항원-결합 부위를 규정한다. 전체적으로, 6개의 HVR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 HVR 만을 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화성이 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.

Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 또한 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)에 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 원래 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 갖는, Fab' 단편들의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.

"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재하는, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315]을 참조한다.

용어 "디아바디"는 동일 폴리펩티드 쇄 내에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) (VH-VL)을 포함하는, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭한다. 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍 형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들어 EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 더욱 상세하게 기재되어 있다. 트리아바디(triabody) 및 테트라바디(tetrabody) 역시 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 이 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 별개 항체의 혼합물이 아닌 것으로서의 항체의 특징을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 이러한 모노클로날 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 표적 결합 폴리펩티드 서열은 복수개의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 과정에 의해 수득하였다. 예를 들어, 선택 과정은 복수개의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 독특한 클론을 선택하는 것일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은 예를 들어 표적에 대한 친화성 개선, 표적 결합 서열의 인간화, 세포 배양물 중 그의 생성 개선, 생체내에서의 그의 면역원성 감소, 다중특이적 항체의 생성 등을 위해 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 본 발명의 모노클로날 항체임을 이해해야 한다. 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지정된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지정된다. 모노클로날 항체 제제는 그의 특이성에 이외에도 전형적으로 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않았다는 점에서 유리하다.

수식어구 "모노클로날"은 항체의 특징을 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것으로 나타내며, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생성이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 예를 들어, 하이브리도마 방법 (예를 들어, [Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)]; [Hongo et al., Hybridoma, 14(3):253-260 (1995)]; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지-디스플레이 기술 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)] 참조), 및 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조)을 비롯한 다양한 기술에 의해 제조할 수 있다.

구체적으로, 본원에서의 모노클로날 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄 (들)의 나머지 부분이 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 이러한 항체의 단편을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)] 참조). 키메라 항체는, 항체의 항원 결합 영역이 예를 들어 마카쿠 원숭이를 관심 대상의 항원으로 면역화하여 생성된 항체로부터 유래된 것인 프리매티지드(PRIMATIZED)® 항체를 포함한다.

비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 수용자의 HVR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및/또는 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 HVR의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 FR 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체한다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 추가로 개선되도록 이루어질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 그것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 그것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은, 예를 들어 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)])을 참조한다. 또한, 예를 들어 문헌 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]; 및 미국 특허 번호 6,982,321 및 7,087,409를 참조한다.

"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체 제조 기술 중 임의의 것을 이용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 제외된다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 비롯한 당업계에 공지된 각종 기술을 사용하여 생성할 수 있다. 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. 또한, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]에 기재된 방법도 인간 모노클로날 항체의 제조에 이용가능하다. 또한, 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)]을 참조한다. 인간 항체는, 항원 접종에 반응하여 이러한 항체를 생성하도록 변형되었으나 내인성 유전자좌는 무력화시킨 트랜스제닉 동물, 예를 들어 면역화된 제노마우스(xenomice)에게 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다 (예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술에 관한 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 참조). 또한, 예를 들어 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]도 참조한다.

"종-의존적 항체"는 제1 포유동물 종으로부터의 항원에 대한 결합 친화도가 제2 포유동물 종으로부터의 상기 항원의 상동체에 대한 결합 친화도보다 더 강력한 항체이다. 통상적으로, 종-의존성 항체는 인간 항원에 "특이적으로 결합" (즉, 결합 친화도 (Kd) 값이 약 1x10-7 M 이하, 바람직하게는 약 1x10-8 M 이하, 바람직하게는 약 1x10-9 M 이하)하지만, 제2의 비-인간 포유동물 종으로부터의 상기 항원의 상동체에 대한 결합 친화도는 인간 항원에 대한 결합 친화도보다 적어도 약 50배 또는 적어도 약 500배 또는 적어도 약 1000배 더 약하다. 종-의존적 항체는 상기 정의된 바와 같은 임의의 다양한 유형의 항체일 수 있으나, 바람직하게는 인간화 또는 인간 항체이다.

용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"가 본원에서 사용되는 경우, 이것은 서열에서 초가변이고/거나 구조적으로 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH 내에 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR 중에서 가장 높은 다양성을 나타내고, 특히 H3은 항체에 정밀한 특이성을 부여하는데 특유의 역할을 수행한다고 여겨진다. 예를 들어, 문헌 [Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000)]; [Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]을 참조한다. 실제로, 중쇄만으로 이루어진 자연 발생 카멜리드(camelid) 항체는 경쇄의 부재하에 기능적이고 안정하다. 예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)]; [Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)]을 참조한다.

많은 HVR 설명이 사용되고 있고 본원에 포함된다. 카바트(Kabat) 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성을 기초로 하며, 가장 흔히 사용된다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]). 코티아(Chothia)는 대신에 구조적 루프의 위치를 표시한다 (문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). AbM HVR은 카바트 HVR과 코티아 구조 루프 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR은 이용가능한 복합 결정 구조의 분석을 기초로 한다. 이들 각각의 HVR로부터의 잔기를 하기 나타낸다.

HVR은 다음과 같이 "확장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 상기 정의에 대해 상기 문헌 [Kabat et al.]에 따라 넘버링된다.

"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 HVR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

용어 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 이들의 변형은 상기 문헌 [Kabat et al.]에서 항체 캄필레이션(compilation)의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 이것으로의 삽입에 상응하는 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 후에 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따른 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 후에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카바트 넘버링 서열과 정렬함으로써 주어진 항체에 대하여 결정할 수 있다.

카바트 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인 내의 잔기 (대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 지칭할 때 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 지수"는 일반적으로 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭할 때 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 보고된 EU 지수). "카바트에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.

표현 "선형 항체"는 문헌 [Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062)]에 기재된 항체를 지칭한다. 간략하게 설명하면, 이들 항체는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 병렬식 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "라이브러리"는 복수 개의 항체 또는 항체 단편 서열 (예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드), 또는 이들 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하는데, 이 서열은 본 발명의 방법에 따라서 이들 서열 내로 도입되는 변이체 아미노산의 조합에 있어서 상이하다.

"파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지 (예를 들어 섬유상 파지) 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 대형 라이브러리를 표적 항원과 고 친화도로 결합하는 서열에 대해 신속하고 효율적으로 분류할 수 있다는 점에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 갖는 폴리펩티드를 찾기 위해서 수백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 이용되어 왔다. 다가 파지 디스플레이 방법은 필라멘트형 파지의 유전자 III 또는 유전자 VIII과의 융합을 통하여 소형 무작위 펩티드 및 소형 단백질을 디스플레이하기 위해 사용되어 왔다. 문헌 [Wells and Lowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:355-362] 및 여기에 인용된 참고문헌을 참조한다. 1가 파지 디스플레이에서는, 단백질 또는 펩티드 라이브러리를 유전자 III 또는 그의 일부와 융합시키고, 야생형 유전자 III 단백질의 존재하에 저수준으로 발현시켜 파지 입자가 상기 융합 단백질의 1개 카피를 디스플레이하거나 전혀 디스플레이하지 않도록 한다. 화합력 효과는 다가 파지에 비해 감소되기 때문에 분류는 내재적 리간드 친화도를 기준으로 하고 DNA 조작을 단순화시키는 파지미드 벡터를 사용한다. 문헌 [Lowman and Wells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology 3:205-0216].

"파지미드"는 박테리아 복제 기점, 예를 들어 ColE1, 및 박테리오파지의 유전자간 영역의 카피를 갖는 플라스미드 벡터이다. 파지미드는 필라멘트형 박테리오파지 및 람다형 박테리오파지를 비롯한 임의의 공지된 박테리오파지에서 사용될 수 있다. 이러한 플라스미드는 또한 일반적으로 항생제 내성에 대한 선택 마커를 함유할 것이다. 이들 벡터 내로 클로닝된 DNA 절편은 플라스미드로서 증식될 수 있다. 이들 벡터를 보유하는 세포에 파지 입자의 생성에 필요한 모든 유전자가 제공되는 경우, 플라스미드의 복제 방식이 롤링 서클(rolling circle) 복제로 변화되어 플라스미드 DNA 및 패키지 파지 입자의 1개 가닥 카피를 생성시킨다. 파지미드는 감염성 또는 비-감염성 파지 입자를 형성할 수 있다. 상기 용어는, 유전자 융합체로서 이종 폴리펩티드 유전자에 연결된 파지 외피 단백질 유전자 또는 그의 단편을 함유하여 상기 이종 폴리펩티드가 파지 입자의 표면상에 디스플레이 되도록 하는 파지미드를 포함한다.

II. 본 발명을 수행하는 방식

본원에서 본 발명은 항체를 포함하는 제제에 관한 것이다. 제제 내의 항체는 항체의 생성을 위하여 당업계에서 이용가능한 기술, 하기 섹션에 보다 상세히 기재되어 있는 예시적인 방법을 이용하여 제조된다. 전형적으로, 제제는 안정한 수성 제제이다. 특정 실시양태에서, 이는 제약 제제이다.

항체는 관심 대상의 항원에 대해 지정된다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고, 질환 또는 장애를 앓는 포유동물에게 항체를 투여하는 것은 이러한 포유동물에서 치료학적 이점을 유도할 수 있다. 그러나, 비-폴리펩티드 항원에 대항하여 지정된 항체 또한 고려된다.

항원이 폴리펩티드인 경우, 이는 막횡단 분자 (예를 들어, 수용체) 또는 리간드 예컨대 성장 인자일 수 있다. 예시적인 항원에는 분자, 예컨대 ox-LDL; ox-ApoB100; 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상샘 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1-안티트립신; 인슐린 A-쇄: 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 난포 자극호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 VIIIC 인자, IX 인자, 조직 인자 및 폰 빌레브란트 인자; 항-응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제, 예컨대 유로키나제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (정상적으로 발현 및 분비된 T-세포 활성화에 대한 조절); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러리안-억제 물질; 릴랙신 A-쇄; 릴랙신 B-쇄; 프로릴랙신; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); VEGFR 수용체, 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 향신경성 인자, 예컨대 골-유래 향신경성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타 (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5 포함); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도성 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터루킨 (IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10: 수퍼옥시드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 가속화 인자; 바이러스 항원, 예를 들어 AIDS 외피의 일부분; 운송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기 열거된 폴리펩티드들 중 임의의 것의 단편이 포함된다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명에 포함된 항체에 대한 분자 표적에는 ox-LDL이 포함된다. 한 실시양태에서, 본원에서의 항체는 인간 ox-LDL에 결합하는 것이다. 한 실시양태에서, 본원에서의 항체는 인간 ox-ApoB100에 결합하는 것이다.

A. 제제의 제조

관심 대상의 항체의 제조 후 (예를 들어, 본원에 개시된 바와 같이 제제화될 수 있는 항체를 생산하기 위한 기술은 하기 상세히 설명되어 있고, 당업계에 공지되어 있음), 이를 포함하는 제약 제제를 제조한다. 특정 실시양태에서, 제제화될 항체는 사전 동결건조를 거치지 않았고, 본원의 관심 대상의 제제는 수성 제제이다. 특정 실시양태에서, 항체는 전장 항체이다. 한 실시양태에서, 제제 내의 항체는 항체 단편, 예컨대 F(ab')₂이고, 이러한 경우 전장 항체에 대해 발생할 수 없는 문제 (예컨대, Fab에 대한 항체의 클리핑)를 처리할 필요가 있을 수 있다. 제제 중에 존재하는 항체의 치료 유효량은, 예를 들어 바람직한 용량 부피 및 투여 방식을 고려하여 결정된다. 약 0.1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL, 또는 약 10 mg/mL 내지 약 200 mg/mL 또는 약 50 mg/mL 내지 약 175 mg/mL가 제제 중 예시적인 항체 농도이다.

항체를 포함하는 수성 제제는 pH-완충 용액 중에서 제조된다. 본 발명의 완충제는 약 4.5 내지 약 6.5 범위의 pH를 갖는다. 특정 실시양태에서 pH는 5.0 내지 6.0의 pH 범위, 또는 pH 5.25 내지 5.75 범위, 또는 pH 5.3 내지 5.6 범위에 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 제제는 5.5 또는 약 5.5의 pH를 갖는다. 상기 범위 내로 pH를 제어할 완충제의 예에는 아세테이트 (예를 들어, 히스티딘 아세테이트, 아르기닌 아세테이트, 아세트산나트륨), 숙시네이트 (예컨대, 히스티딘 숙시네이트, 아르기닌 숙시네이트, 나트륨 숙시네이트), 글루코네이트, 시트레이트 및 다른 유기 산 완충제, 및 그의 조합이 포함된다. 완충제 농도는, 예를 들어 완충제와 제제의 바람직한 등장성에 따라 약 1 mM 내지 약 600 mM일 수 있다. 특정 실시양태에서, 히스티딘은 약 5 mM 내지 100 mM의 농도로 함유되고, 아르기닌은 50 mM 내지 500 mM의 농도로 함유된다. 한 실시양태에서, 완충제는 히스티딘 아세테이트 (약 20 mM) - 아르기닌 아세테이트 (약 150 mM) (pH 5.5)이다. 특정 실시양태에서, 완충제는 히스티딘 숙시네이트 (약 20 mM) - 아르기닌 숙시네이트 (약 150 mM) (pH 5.5)이다.

계면활성제가 항체 제제에 임의로 첨가될 수 있다. 예시적인 계면활성제에는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20, 80 등) 또는 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188을)가 포함된다. 계면활성제는 제제화된 항체의 응집을 감소시키고/거나 제제에서 미립자의 형성을 최소화시키고/거나 흡착을 감소시키는 양으로 첨가된다. 예를 들어, 계면활성제는 약 0.001% 내지 약 0.5%, 바람직하게는 약 0.005% 내지 약 0.2%, 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 0.1%의 양으로 제제 중에 존재할 수 있다. 한 실시양태에서, 제제는 계면활성제를 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 제제는 상기-확인된 작용제 (예를 들어, 항체, 완충제 및/또는 계면활성제)를 함유하고, 본질적으로 하나 이상의 보존제, 예컨대 벤질 알콜, 페놀, m-크레졸, 클로로부탄올 및 벤제토늄 Cl을 함유하지 않는다. 한 실시양태에서, 제제는 보존제를 함유하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 보존제는, 특히 제제가 다중투여 제제인 경우에 제제 내에 포함될 수 있다. 보존제의 농도는 약 0.1% 내지 약 2%, 바람직하게는 약 0.5% 내지 약 1% 범위일 수 있다. 하나 이상의 다른 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제, 예컨대 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있는 것들이 제제 내에 포함될 수 있으나, 단 이들은 제제의 바람직한 특성에 유해한 영향을 미치지 않는다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에 비독성이고, 여기에는 추가적 완충제; 공용매; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 생분해성 중합체, 예컨대 폴리에스테르; 및/또는 염-형성 반대이온이 포함된다.

본원에서 킬레이터의 다양한 설명이 대개 EDTA에 중점을 두고 있지만, 다른 금속 이온 킬레이터 또한 본 발명에 포함된다는 것을 인지할 것이다. 금속 이온 킬레이터는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 여기에는 아미노폴리카르복실레이트, EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산), EGTA (에틸렌 글리콜-비스(베타-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산), NTA (니트릴로트리아세트산), EDDS (에틸렌 디아민 디숙시네이트), PDTA (1,3-프로필렌디아민테트라아세트산), DTPA (디에틸렌트리아민펜타아세트산), ADA (베타-알라닌디아세트산), MGCA (메틸글리신디아세트산) 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 추가로, 본원에서의 일부 실시양태는 포스포네이트/포스폰산 킬레이터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제제는 메티오닌을 포함한다.

본원에서의 제제는 또한 치료될 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 단백질, 바람직하게는 다른 단백질에 유해한 영향을 미치지 않는 보완적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 예를 들어, 항체가 항-oxLDL 항체인 경우, 이는 또 다른 작용제 (예를 들어, 3-히드록시-3-메틸글루타릴-조효소 A (HMG-CoA) 리덕타제의 억제제, 예컨대 스타틴)와 조합될 수 있다. 항-oxLDL 항체와 조합될 수 있는 분자의 예에는, 예를 들어 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 프로바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 단백질은 적합하게는 조합물 내에 의도된 목적에 효과적인 양으로 존재한다. 전형적으로, 스타틴은 경구 투여를 위해 제제화된다.

생체내 투여에 사용하고자 하는 제제는 멸균되어야 한다. 이는 제제의 제조 이전 또는 이후에 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.

B. 제제의 투여

제제는 공지된 방법, 예를 들어 볼루스로서 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의한 정맥내 투여, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액막내, 경막내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의해, 항체로의 처리를 필요로 하는 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여된다. 한 실시양태에서, 제제는 정맥내 투여에 의해 포유동물에게 투여된다. 이러한 목적을 위하여, 제제는 예를 들어 주사기를 이용하여 또는 IV 라인을 통해 주사될 수 있다. 한 실시양태에서, 제제는 포유동물에게 피하 투여에 의해 투여된다.

항체의 적절한 투여량 ("치료 유효량")은, 예를 들어 치료되는 상태, 상태의 중증도 및 경과, 항체가 치료 또는 예방 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 사용되는 항체의 유형, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 항체는 적합하게는 환자에게 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐서 투여되고, 환자에게 진단 이후 임의의 시점에 투여될 수 있다. 항체는 단독 치료로서, 또는 당해 상태의 치료에 유용한 다른 약물 또는 요법과 함께 투여될 수 있다.

일반적으로 제안되는 바와 같이, 투여되는 항체의 치료 유효량은 1회 투여이든 그 초과 횟수 투여이든 약 0.1 내지 약 50 mg/kg(모체 체중) 범위일 것이며, 사용되는 항체의 전형적 범위는 약 0.3 내지 약 20 mg/kg 또는 약 0.3 내지 약 15 mg/kg 또는 약 0.3 내지 약 25 mg/kg 또는 약 0.3 또는 약 30 mg/kg이고, 예를 들어 매일, 또는 예를 들어 매주, 또는 예를 들어 격달로 투여된다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 상기 요법의 진행은 통상의 기술에 의해 용이하게 모니터링된다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 제제의 투여는 항-oxLDL 항체 제제이다. 동맥벽에 침착되는 대부분의 콜레스테롤은 LDL로부터 유래한다. LDL은 인간 혈청에서의 콜레스테롤의 주요 캐리어이고, LDL의 산화는 아테롬형성 입자로의 그의 전환에서의 필수 단계이다. 아테롬성동맥경화증의 모든 단계를 특성화하는 염증 과정의 활성화 및 조절은 LDL의 산화 형태에 대한 면역 반응과 서로 관련될 수 있다. 아테롬성동맥경화증은 급성 MI, 졸중 및 말초 동맥 질환의 주요 원인이다. 항-oxLDL 항체의 경우, 아테롬성동맥경화증을 치료하기 위하여 치료 유효량의 항체를 투여할 수 있다. 예를 들어, 항-oxLDL 항체는 위험성이 큰 환자에서 심혈관 사건의 2차 예방을 위해 사용될 수 있고/거나 아테롬성동맥경화증의 치명적 위험을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 동맥벽 내의 아테롬형성 침전물의 직접적인 결과가 되는 이러한 심혈관 사건에는 급성 심근경색 (MI), 졸중 및 말초 동맥 질환이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 항-oxLDL 항체는 또한 다른 활성에 대해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-oxLDL 항체는 플라크 형성을 억제하고 아테롬성동맥경화성 병변의 발병을 방지하고 (예를 들어, 동물 모델에 있어서 문헌 [Schiopu et al., 2004]; WO 2004/030607; US 6,716,410에 기재된 바와 같음), 처리 수주 후 대동맥에서 기존의 확립된 아테롬성동맥경화성 플라크의 퇴행을 활성적으로 유도하는 것으로 나타났다 (예를 들어, WO2007/025781).

C. 항체 제조

(i) 항원 제조

가용성 항원 또는 그의 단편 (다른 분자에 임의로 접합됨)이 항체를 생성하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 막횡단 분자, 예컨대 수용체의 경우에는, 그의 단편 (예를 들어, 수용체의 세포외 도메인)이 면역원으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 막횡단 분자를 발현하는 세포가 면역원으로 사용될 수 있다. 이같은 세포는 자연 공급원 (예를 들어, 암 세포주)으로부터 유래될 수 있거나, 또는 막횡단 분자를 발현하도록 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다. 항체의 제조에 유용한 기타 항원 및 그의 형태가 당업자에게 명백할 것이다.

(ii) 특정 항체-기반 방법

폴리클로날 항체는 관련 항원 및 아주반트의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 바람직하게 생성된다. 이관능성 또는 유도체화 작용제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂, 또는 R¹N=C=NR (여기서, R 및 R¹은 상이한 알킬기임)을 사용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.

예를 들어 단백질 또는 접합체 100 ㎍ 또는 5 ㎍ (각각, 토끼 또는 마우스의 경우)을 3 부피의 프로인트 완전 아주반트와 합하고, 상기 용액을 여러 부위에 피내 주사함으로써, 동물을 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화한다. 1개월 후, 프로인트 완전 아주반트 내의 펩티드 또는 접합체를 원래 양의 1/5 내지 1/10로 여러 부위에 피하 주사하여 동물을 부스팅한다. 7 내지 14일 후, 동물에서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 검정한다. 역가가 정체기(plateau)에 도달할 때까지 동물을 부스팅한다. 바람직하게는, 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교 시약을 통해 접합된 동일한 항원의 접합체로 동물을 부스팅한다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양물에서 단백질 융합체로서 제조될 수도 있다. 또한, 백반과 같은 응집제를 적합하게 사용하여 면역 반응을 증진시킨다.

본 발명의 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재되고, 예를 들어 문헌 [Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)], [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)], 및 인간-인간 하이브리도마에 관한 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)]에 추가로 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 추가의 방법에는, 예를 들어 하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 천연 IgM 항체의 생성에 관한 미국 특허 번호 7,189,826에 기재된 방법이 포함된다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마 기술)은 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)] 및 [Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.

다양한 기타 하이브리도마 기술에 대해서는, 예를 들어 US 2006/258841; US 2006/183887 (완전 인간 항체), US 2006/059575; US 2005/287149; US 2005/100546; US 2005/026229; 및 미국 특허 번호 7,078,492 및 7,153,507을 참조한다. 하이브리도마 방법을 사용하여 모노클로날 항체를 생산하는 예시적인 프로토콜은 다음과 같이 설명된다. 한 실시양태에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터를 면역화시킴으로써, 면역화를 위해 사용되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편, 및 보조제, 예컨대 모노포스포릴 지질 A (MPL)/트레할로스 디크리노미콜레이트 (TDM) (리비 이뮤노켐 리서치, 인크.(Ribi Immunochem. Research, Inc.), 몬타나주 해밀턴)의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 항체를 유도한다. 본 발명의 폴리펩티드 (예를 들어, 항원) 또는 그의 단편은 그 일부가 본원에서 추가로 기재되는 재조합 방법과 같은 당업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 면역화된 동물로부터의 혈청을 항-항원 항체에 대해 검정하고, 부스터 면역화를 임의로 투여한다. 항-항원 항체를 생산하는 동물로부터 림프구를 단리한다. 별법으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다.

이어서, 림프구를 하이브리도마 세포를 형성하는데 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합시킨다. 예를 들어, 문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]을 참조한다. 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생산을 지지하고, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 골수종 세포가 사용될 수 있다. 예시적인 골수종 세포주에는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 (솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center; 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수가능), 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; 미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 입수가능)로부터 유도된 것이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주 역시 인간 모노클로날 항체 생성과 관련하여 기재된 바 있다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).

이와 같이 제조한 하이브리도마 세포는 적합한 배양 배지, 예를 들어 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 없는 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다. 바람직하게는, 예를 들어 문헌 [Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006)]에 기재된 바와 같이, 태아 소 혈청과 같은 동물-유래 혈청의 사용을 감소시키기 위해서 무-혈청 하이브리도마 세포 배양 방법을 이용한다.

문헌 [Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005)]에는 하이브리도마 세포 배양의 생산성을 개선하기 위한 도구로서 올리고펩티드가 기재되어 있다. 특히, 표준 배양 배지를 특정 아미노산 (알라닌, 세린, 아스파라긴, 프롤린)이나 단백질 가수분해물 분획으로 풍부화시키면, 3 내지 6개의 아미노산 잔기로 구성된 합성 올리고펩티드에 의해서 아폽토시스가 유의하게 억제될 수 있다. 펩티드는 밀리몰 또는 더 높은 농도로 존재한다.

하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 본 발명의 항체에 결합하는 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정할 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사성면역검정 (RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)으로 측정할 수 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]을 참조한다.

목적하는 특이성, 친화성 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후에, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 문헌 [Goding]을 참조한다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물 생체내에서 복수 종양으로서 성장시킬 수 있다. 서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 통상적인 이뮤노글로불린 정제 절차, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다. 하이브리도마 세포로부터 단백질을 단리하는 하나의 절차가 US 2005/176122 및 미국 특허 번호 6,919,436에 기재되어 있다. 상기 방법은 결합 과정에서 최소한의 염, 예컨대 친액성 염의 사용을 포함하고, 바람직하게는 또한 용리 과정에서 소량의 유기 용매의 사용을 포함한다.

(iii) 특정 라이브러리 스크리닝 방법

본 발명의 항체는 조합 라이브러리를 사용하여 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체를 스크리닝함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특징을 갖는 항체에 대하여 상기 라이브러리를 스크리닝하는 각종 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 일반적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 관심 대상의 항체를 생성하는 하나의 방법은 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93]에 기재된 바와 같은 파지 항체 라이브러리를 사용하는 것을 통한다.

원칙적으로, 파지 외피 단백질에 융합된 항체 가변 영역 (Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 합성 항체 클론이 선택된다. 원하는 항원에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 이같은 파지 라이브러리가 패닝된다. 목적하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론이 항원에 흡착되고, 따라서 라이브러리 내의 비-결합 클론으로부터 분리된다. 이어서, 결합 클론이 항원으로부터 용리되고, 항원 흡착/용리의 추가적인 사이클에 의해 추가로 풍부화될 수 있다. 본 발명의 임의의 항체는 관심 대상의 파지 클론을 선택하는데 적합한 항원 스크리닝 절차를 설계한 후, 관심 대상의 파지 클론으로부터 Fv 서열 및 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에 기재된 적합한 불변 영역 (Fc) 서열을 사용하여 전장 항체 클론을 구축함으로써 얻을 수 있다.

특정 실시양태에서, 항체의 항원-결합 도메인은 약 110개 아미노산의 2개의 가변 (V) 영역 (경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) (둘 다 3개의 초가변 루프 (HVR) 또는 상보성-결정 영역 (CDR)을 제시)로부터 각각 하나씩)으로부터 형성된다. 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이, VH 및 VL이 짧은 가요성 펩티드를 통해 공유적으로 연결된 단일쇄 Fv (scFv) 단편으로서, 또는 이들이 불변 도메인에 각각 융합되어 비-공유적으로 상호작용하는 Fab 단편으로서, 가변 도메인이 파지 상에 기능적으로 디스플레이될 수 있다. 본원에서 사용되는 scFv 코딩 파지 클론 및 Fab 코딩 파지 클론은 통칭하여 "Fv 파지 클론" 또는 "Fv 클론"으로 지칭한다.

VH 및 VL 유전자의 레퍼토리가 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별도로 클로닝되어 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합될 수 있고, 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 클론에 대해 조사할 수 있다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화성 항체를 제공한다. 별법으로, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자가 항원 및 또한 자가 항원에 대한 인간 항체의 단일 공급원을 제공하도록 나이브(naive) 레퍼토리를 클로닝할 수 있다. 마지막으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다.

특정 실시양태에서, 소수 외피 단백질 pIII에의 융합에 의해 항체 단편을 디스플레이하기 위해 필라멘트형 파지가 사용된다. 항체 단편은, 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 바와 같이, 가요성 폴리펩티드 스페이서에 의해 동일한 폴리펩티드 쇄 상에서 VH 및 VL 도메인이 연결된 단일쇄 Fv 단편으로서, 또는 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)]에 기재된 바와 같이, 하나의 쇄는 pIII에 융합되고 다른 하나는 박테리아 숙주 세포 주변세포질로 분비되고, 여기서 일부 야생형 외피 단백질을 대체함으로써 Fab-외피 단백질 구조의 어셈블리가 파지 표면 상에 디스플레이되게 되는 Fab 단편으로서 디스플레이될 수 있다.

일반적으로, 항체 유전자 단편을 코딩하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수거된 면역 세포로부터 수득하였다. 항-항원 클론에 유리하게 편향된 라이브러리가 요망되는 경우, 대상을 항체 반응을 생성하도록 항체로 면역화시키고, 비장 세포 및/또는 순환 B 세포, 다른 말초혈 림프구 (PBL)를 라이브러리 구축을 위해 회수한다. 한 실시양태에서, 항-항원 클론에 유리하게 편향된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는 항원 면역화가 항원에 대한 인간 항체를 생산하는 B 세포를 유도하도록 기능적 인간 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 갖는 (또한 기능적 내인성 항체 생산 시스템이 결핍된) 트랜스제닉 마우스에서 항-항원 항체 반응을 일으킴으로써 얻어진다. 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스의 생성은 하기에서 기술된다.

항-항원 반응성 세포 집단에 대한 추가의 풍부화물은, 예를 들어 항원 친화성 크로마토그래피 또는 플루오로크롬-표지된 항원에 대한 세포의 흡착 후 유동-활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하는 세포 분리에 의해, 항원-특이적 막 결합 항체를 발현하는 B 세포를 단리하는 적합한 스크리닝 절차를 이용하여 얻을 수 있다.

별법으로, 비면역화 공여자로부터의 비장 세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBL을 사용함으로써, 가능한 항체 레퍼토리의 보다 우수한 예시를 제공하고, 또한 항원이 항원성이 아닌 임의의 동물 (인간 또는 비-인간) 종을 사용한 항체 라이브러리의 구축을 허용한다. 시험관내 항체 유전자 구축물이 혼입된 라이브러리에 대해, 재배열되지 않은 항체 유전자 절편을 코딩하는 핵산을 제공하기 위해 대상체로부터 줄기 세포를 수거하였다. 관심 대상의 면역 세포는 다양한 동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼목, 이리, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 및 조류 종 등으로부터 얻을 수 있다.

항체 가변 유전자 절편 (VH 및 VL 절편 포함)을 코딩하는 핵산을 관심 대상의 세포로부터 회수하고, 증폭시킨다. 재배열된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우, 림프구로부터의 게놈 DNA 또는 mRNA의 단리에 이어서 문헌 [Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)]에 기재된 바와 같은 재배열된 VH 및 VL 유전자의 5' 및 3' 말단을 매칭시키는 프라이머로의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행함으로써 원하는 DNA가 수득될 수 있고, 이에 의해 발현을 위한 다양한 V 유전자 레퍼토리가 제조된다. 문헌 [Orlandi et al., (1989)] 및 [Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)]에 기재된 바와 같이, 성숙형 V-도메인을 코딩하는 엑손의 5' 말단에서의 역방향 프라이머 및 J-절편을 기초로 하는 정방향 프라이머로, V 유전자가 cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭될 수 있다. 그러나, cDNA로부터의 증폭을 위해, 역방향 프라이머가 또한 문헌 [Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991)]에 기재된 바와 같이 리더(leader) 엑손을 기초로 할 수 있고, 정방향 프라이머가 문헌 [Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)]에 기재된 바와 같이 불변 영역을 기초로 할 수 있다. 상보성을 최대화하기 위해, 문헌 [Orlandi et al., (1989)] 또는 [Sastry et al., (1989)]에 기재된 바와 같이 프라이머 내에 축퇴성을 혼입시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 라이브러리 다양성은 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]의 방법에 설명된 바와 같이 또는 문헌 [Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)]의 방법에 설명된 바와 같이, 면역 세포 핵산 샘플 내에 존재하는 모든 이용가능한 VH 및 VL 배열을 증폭시키기 위해 각각의 V-유전자 패밀리에 표적화된 PCR 프라이머를 사용함으로써 라이브러리 다양성이 최대화된다. 증폭된 DNA를 발현 벡터 내로 클로닝하기 위해, 희귀 제한 부위가 문헌 [Orlandi et al. (1989)]에 기재된 바와 같이 한 말단에서 태그로서, 또는 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 태그가 부착된 프라이머를 사용하는 추가의 PCR 증폭에 의해 PCR 프라이머 내에 도입될 수 있다.

합성적으로 재배열된 V 유전자의 레퍼토리가 시험관내에서 V 유전자 절편으로부터 유래될 수 있다. 대부분의 인간 VH-유전자 절편이 클로닝 및 서열분석되어 있고 (문헌 [Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)]에 보고됨), 맵핑되어 있으며 (문헌 [Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993)]에 보고됨); 이러한 클로닝된 절편들 (H1 및 H2 루프의 모든 주요 형태 포함)은 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 코딩하는 PCR 프라이머로 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성시키는데 사용될 수 있다. 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)]에 기재된 바와 같이 모든 서열 다양성이 단일 길이의 긴 H3 루프에 초점이 맞춰진 VH 레퍼토리가 또한 제조될 수 있다. 인간 Vκ 및 Vλ 절편이 클로닝 및 서열분석되어 있고 (문헌 [Williams and Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)]에 보고됨), 합성 경쇄 레퍼토리를 제조하는데 사용될 수 있다. 광범위한 VH 및 VL 폴드, 및 L3 및 H3 길이를 기초로 하는 합성 V 유전자 레퍼토리는 상당한 구조적 다양성의 항체를 코딩할 것이다. V-유전자 코딩 DNA의 증폭에 이어서, 배선 V-유전자 절편이 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]의 방법에 따라 시험관내에서 재배열될 수 있다.

항체 단편의 레퍼토리는 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 서로 다양한 방식으로 조합하여 구축할 수 있다. 각각의 레퍼토리는 상이한 벡터 내에 생성될 수 있고, 벡터는 예를 들어 문헌 [Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993)]에 기재된 바와 같이 시험관내에서, 또는 조합 감염, 예를 들어 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)]에 기재된 loxP 시스템에 의해 생체내에서 재조합될 수 있다. 생체내 재조합 접근법은 이. 콜라이(E. coli) 형질전환 효율로 인한 라이브러리 크기의 한계를 극복하기 위해 Fab 절편의 2쇄 속성을 이용한다. 나이브 VH 및 VL 레퍼토리를 하나는 파지미드에서, 다른 하나는 파지 벡터에서 별도로 클로닝한다. 이어서, 2개의 라이브러리를 파지미드-함유 박테리아의 파지 감염에 의해 조합하여 각각의 세포가 상이한 조합을 함유하도록 하고, 라이브러리 크기는 존재하는 세포의 개수로만 한정된다 (약 10¹² 클론). 두 벡터는 VH 및 VL 유전자가 단일 레플리콘에서 재조합되어 파지 비리온 내에 공동패키징되도록 하는 생체내 재조합 신호를 함유한다. 이러한 거대 라이브러리는 양호한 친화성 (K_d ^-1가 약 10^-8 M)를 갖는 다양한 항체를 대량으로 제공한다.

별법으로, 레퍼토리를 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 동일한 벡터 내에서 순차적으로 클로닝할 수 있거나, 또는 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 함께 어셈블리한 다음 클로닝할 수 있다. VH 및 VL DNA를 가요성 펩티드 스페이서를 코딩하는 DNA로 연결시켜 단일쇄 Fv (scFv) 레퍼토리를 형성시키는데 PCR 어셈블리가 또한 사용될 수 있다. 또 다른 기술에서, 문헌 [Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)]에 기재된 바와 같이, VH 및 VL 유전자를 림프구 내에서 PCR에 의해 조합시킨 후, 연결된 유전자들의 레퍼토리를 클로닝하는데 "세포내 PCR 어셈블리"가 사용된다.

나이브 라이브러리 (천연 또는 합성)에 의해 생산된 항체는 친화성이 중등도일 수 있지만 (K_d ^-1이 약 10⁶ 내지 10⁷ M^-1), 상기 문헌 [Winter et al., (1994)]에 기재된 바와 같이 제2 라이브러리의 구축 및 이로부터의 재선택에 의해 시험관 내에서 친화성 성숙이 또한 모방될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)]의 방법 또는 [Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992)]의 방법에서 에러 경향이 있는(error-prone) 폴리머라제 (문헌 [Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)]에 보고됨)를 사용함으로써 시험관 내에서 무작위로 돌연변이가 도입될 수 있다. 추가적으로, 예를 들어 관심 대상의 CDR에 스패닝된 무작위 서열을 보유하는 프라이머로의 PCR을 사용하여, 선택된 개별적인 Fv 클론에서 하나 이상의 CDR을 무작위로 돌연변이시키고, 친화성이 더 높은 클론을 스크리닝함으로써 친화성 성숙이 수행될 수 있다. WO 9607754 (1996년 3월 14일 공개)에 이뮤노글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이유발을 유도하여 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성시키는 방법이 기재되어 있다. 또 다른 효과적인 접근법은, 면역화되지 않은 공여자로부터 수득한 자연 발생 V 도메인 변이체의 레퍼토리를 갖는 파지 디스플레이에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 재조합하고, 문헌 [Marks et al., Biotechnol., 10:779-783 (1992)]에 기재된 바와 같이 수 회의 쇄 재셔플링으로 보다 높은 친화성에 대해 스크리닝하는 것이다. 상기 기술을 통해 친화성이 약 10^-9 M 이하인 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다.

라이브러리의 스크리닝은 당업계에 공지된 다양한 기술로 달성할 수 있다. 예를 들어, 항원은 흡착 플레이트의 웰을 코팅하기 위해 사용하거나, 흡착 플레이트에 고정된 숙주 세포 상에 발현시키거나, 세포 분류에서 사용하거나, 스트렙타비딘-코팅된 비드로 포획하기 위해 비오틴에 접합하거나, 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하기 위한 임의의 다른 방법에서 사용할 수 있다.

파지 라이브러리 샘플을 파지 입자의 적어도 일부를 흡착제와 결합시키는데 적합한 조건하에 고정된 항원과 접촉시킨다. 통상적으로, pH, 이온 강도, 온도 등을 비롯한 조건은 생리학적 조건을 모방하도록 선택된다. 고체상에 결합된 파지를 세척한 후, 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 설명된 바와 같이 산에 의해, 또는 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 설명된 바와 같이 알칼리에 의해, 또는 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]의 항원 경쟁 방법과 유사한 절차로 항원 경쟁에 의해 용리시킨다. 단일 라운드의 선택으로 파지가 20 내지 1,000 배 풍부화될 수 있다. 또한, 풍부화된 파지가 박테리아 배양에서 성장되어, 추가적인 선택 라운드에 적용될 수 있다.

선택 효율은 세척 동안의 해리 동역학, 및 단일 파지 상의 다중 항체 단편들이 동시에 항원과 맞물릴 수 있는지의 여부를 비롯한 다수의 요인에 따라 달라진다. 신속한 해리 동역학 (및 약한 결합 친화성)의 항체는 단시간 세정, 다가 파지 디스플레이 및 고체상 내의 항원의 높은 코팅 밀도를 사용함으로써 유지될 수 있다. 높은 밀도는 다가 상호작용을 통해 파지를 안정화시킬 뿐만 아니라, 해리된 파지의 재결합을 장려한다. 느린 해리 동역학 (및 양호한 결합 친화성)의 항체의 선택은 문헌 [Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990)] 및 WO 92/09690에 기재된 바와 같은 1가 파지 디스플레이 및 장시간 세척, 및 문헌 [Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같은 항원의 낮은 코팅 밀도를 사용함으로써 촉진될 수 있다.

항원에 대한 상이한 친화성, 심지어 근소하게 상이한 친화성을 갖는 파지 항체 사이로부터 선택할 수도 있다. 그러나, 선택된 항체의 무작위 돌연변이 (예를 들어, 일부 친화성 성숙 기술에서 수행된 바와 같음)는 항원에 가장 강하게 결합하고, 몇몇은 보다 고친화성을 갖는 많은 돌연변이체를 초래하는 경향이 있다. 항원을 제한하여, 희귀 고친화성 파지를 경쟁시킬 수 있다. 보다 고친화성의 돌연변이체를 모두 보유하기 위해, 파지를 과량의 비오티닐화된 항원과 함께 인큐베이션시킬 수 있지만, 비오티닐화된 항원은 항원에 대한 표적 몰 친화성 상수보다 더 낮은 몰농도의 농도로 사용된다. 이어서, 고친화성-결합 파지가 스트렙타비딘이 코팅된 상자성 비드에 의해 포획될 수 있다. 이같은 "평형 포획"은 친화성이 더 낮은 과량의 파지로부터 친화성이 2배 정도 더 높은 돌연변이체 클론의 단리를 허용하는 감도로 항체가 이들의 결합 친화성에 따라 선택되도록 한다. 고체 상에 결합된 파지를 세척하는데 사용된 조건이 해리 동역학을 기초로 식별하도록 또한 조작될 수 있다.

항-항원 클론은 활성을 기초로 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 자연적으로 항원을 발현하는 살아있는 세포에 결합하거나, 또는 다른 세포 구조에 부착된 항원 또는 유리 부유 항원에 결합하는 항-항원 항체를 제공한다. 이러한 항-항원 항체에 상응하는 Fv 클론은 (1) 상기 기재된 파지 라이브러리로부터 항-항원 클론을 단리하고, 임의로 파지 클론의 단리된 집단을 적합한 박테리아 숙주에서 집단을 성장시킴으로써 증폭시키고; (2) 각각 차단 및 비-차단 활성이 요망되는 항원 및 제2 단백질을 선택하고; (3) 항-항원 파지 클론을 고정된 항원에 흡착시키고; (4) 과량의 제2 단백질을 사용하여 제2 단백질의 결합 결정자와 오버랩되고/거나 이를 공유하는 항원-결합 결정자를 인식하는 임의의 바람직하지 않은 클론을 용리시키고; (5) 단계 (4) 이후에 흡착되어 남아있는 클론을 용리시킴으로써 선택할 수 있다. 임의로, 본원에 기재된 선택 절차를 1회 이상 반복함으로써 원하는 차단/비-차단 특성을 갖는 클론을 추가로 풍부화시킬 수 있다.

본 발명의 하이브리도마-유래 모노클로날 항체 또는 파지 디스플레이 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 하이브리도마 또는 파지 DNA 주형으로부터 관심 대상의 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 서열분석된다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣은 후, 이를 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 원하는 모노클로날 항체의 합성물을 수득할 수 있다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 고찰 논문에는 문헌 [Skerra et al ., Curr . Opinion in Immunol ., 5: 256 (1993)] 및 [Pluckthun, Immunol . Revs, 130: 151 (1992)]이 포함된다.

본 발명의 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 코딩하는 공지의 DNA 서열 (예를 들어, 적절한 DNA 서열은 상기 문헌 [Kabat et al.]으로부터 얻을 수 있음)과 조합되어, 전장 또는 부분 길이 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 클론을 형성할 수 있다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함하여 임의의 이소형 불변 영역이 이러한 목적에 사용될 수 있으며, 이같은 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있음이 이해될 것이다. 하나의 동물 (예를 들어, 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유래된 후, 다른 동물종의 불변 영역 DNA에 융합되어 "하이브리드" 전장 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성하는 Fv 클론은 본원에 기재된 "키메라" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 특정 실시양태에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론은 인간 불변 영역 DNA에 융합되어 전장 또는 부분 길이의 인간 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성한다.

본 발명의 하이브리도마로부터 유래된 항-항원 항체를 코딩하는 DNA는 또한 예를 들어 하이브리도마 클론에서 유래된 상동성 뮤린 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환함으로써 (예를 들어, 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]의 방법에서와 같이) 변형될 수도 있다. 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 전부 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유적으로 연결시켜 하이브리도마 또는 Fv 클론-유래 항체 또는 단편을 코딩하는 DNA를 추가로 변형시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 Fv 클론 또는 하이브리도마 클론-유래된 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.

(iv) 인간화 항체 및 인간 항체

비-인간 항체를 인간화하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있을 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "도입" 잔기라 지칭되고, 전형적으로는 "도입" 가변 도메인으로부터의 것이다. 인간화는 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열 대신 사용함으로써 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 (문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)], [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)], [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)])에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.

인간화 항체의 제조에 사용되는 인간 가변 도메인 경쇄 및 중쇄 둘 다의 선택은 항원성 감소에 매우 중요하다. 소위 "최적 맞춤(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지의 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 (FR)로서 수용된다 (문헌 [Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)], [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 이용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:4285 (1992)]; [Presta et al., J. Immnol., 151:2623 (1993)]).

추가로, 항체가 항원에 대해 높은 친화도를 보유하고 기타 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화하는 것이 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 한 실시양태의 방법에 따라, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이를 조사하면 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 이뮤노글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용자 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 원하는 항체 특징, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화성 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 항원 결합에 대한 영향에는 초가변 영역 잔기가 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.

본 발명의 인간 항체는 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 상기 기재한 바와 같은 공지된 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합함으로써 구축할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있다. 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 예를 들어 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]; 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)]에 기재되어 있다.

면역화시에 내인성 이뮤노글로불린의 생성 없이 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생성하는 것이 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (J_H) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전히 억제된다는 것이 기재되어 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이같은 배선 돌연변이 마우스에게 전달하면, 항원 접종 시 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)], [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)], [Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)] 및 [Duchosal et al. Nature 355:258 (1992)]을 참조한다.

유전자 셔플링은 또한 비-인간, 예를 들어 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 사용될 수 있고, 이때 인간 항체는 출발 비-인간 항체와 유사한 친화성 및 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅(imprinting)"이라고도 지칭되는 이러한 방법에 따라, 본원에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역이 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어 비-인간 쇄/인간 쇄 scFv 또는 Fab 키메라 집단을 생성시킨다. 항원에 의한 선택 결과로서, 인간 쇄가 1차 파지 디스플레이 클론에서 상응하는 비-인간 쇄의 제거시에 파괴된 항원 결합 부위를 복원한, 비-인간 쇄/인간 쇄 키메라 scFv 또는 Fab가 단리되고, 즉 에피토프가 인간 쇄 파트너의 선택을 좌우 (임프린팅)한다. 나머지 비-인간 쇄를 대체하기 위해 상기 과정을 반복하는 경우에 인간 항체가 얻어진다 (1993년 4월 1일자로 공개된 PCT WO 93/06213 참조). CDR 이식에 의한 비-인간 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 이러한 기술은 비-인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기가 없는 완전 인간 항체를 제공한다.

(v) 항체 단편

항체 단편은 통상의 수단, 예컨대 효소 소화에 의해, 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 특정 상황에서는, 온전한 항체가 아닌 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 크기가 작을수록 제거가 신속해지고, 특정 조직에 대한 접근을 개선시킬 수 있다. 특정 항체 단편의 검토를 위해서는 문헌 [Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9:129-134]을 참조한다.

항체 단편 생성을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화를 통해 유래되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)]; 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이러한 단편들이 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두가 이. 콜라이에서 발현되어 분비될 수 있고, 이에 의해 다량의 이들 단편을 쉽게 생성할 수 있다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또 다른 접근법에 따라, F(ab')₂ 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는, 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')₂ 단편이 미국 특허 번호 5,869,046에 기재되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 또 다른 기술들이 당업자에게 명백할 것이다. 특정 실시양태에서, 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. Fv 및 scFv는 불변 영역이 결여된 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이고; 따라서 생체내 사용 동안 비특이적 결합의 감소에 적합할 수 있다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카르복시 말단에 이펙터 단백질의 융합체를 생성시키도록 구축될 수 있다. 상기 문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck]을 참조한다. 예를 들어, 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 번호 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체는 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.

(vi) 다중특이적 항체

다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖고, 이때 에피토프들은 일반적으로 상이한 항원들로부터의 것이다. 이같은 분자들은 일반적으로는 2개의 상이한 에피토프에만 결합할 것이지만 (즉, 이중특이적 항체, BsAb), 추가적인 특이성이 있는 항체, 예컨대 삼중특이적 항체가 본원에서 사용되는 경우 이러한 표현에 포함된다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')₂ 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.

이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 통상적인 생성법은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동 발현을 기초로 하며, 여기서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마(quadroma))는 10종의 상이한 항체 분자들의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 이 중에서 오직 1종만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 상기 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고 생성 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.

다른 접근법에 따라, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 바람직하게는, 융합은 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인에 의한다. 융합체 중 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체 및 원하는 경우에는 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동형질감염시킨다. 이것은 구축에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비율이 최적의 수율을 제공하는 실시양태에서 상기 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 적어도 2종의 폴리펩티드 쇄의 발현으로 높은 수율이 수득되는 경우, 또는 비율이 특별한 유의성을 갖지 않는 경우, 2종 또는 모든 3종의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 1개의 발현 벡터에 삽입할 수 있다.

이러한 접근법의 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암 내의 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른쪽 아암 내의 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방법을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 추가의 세부사항에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.

WO96/27011에 기재된 또 다른 방법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 경계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 하나의 계면은 항체 불변 도메인의 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동(cavity)"이 제2 항체 분자의 계면에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치않는 최종-생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.

이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포의 원치않는 세포로의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980) 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089)를 위해 제안된 바 있다. 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 이종접합체 항체가 제조될 수 있다. 적합한 가교제가 당업계에 널리 공지되어 있고, 수많은 가교 기술과 함께 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키는 기술이 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]은 무손상 항체를 단백질 가수분해적으로 절단하여 F(ab')₂ 단편을 생성하는 절차를 기재한다. 이러한 단편을 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원시켜, 인접한 디티올들을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 그 후 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 그 후 Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생산된 이중특이적 항체를 효소의 선택적 고정을 위한 작용제로서 사용할 수 있다.

최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, 이. 콜라이로부터의 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]은 완전 인간화 이중특이적 항체 F(ab')₂ 분자의 생성을 기재한다. 각각의 Fab' 단편을 이. 콜라이로부터 따로 분비시키고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관내 지정 화학 커플링 반응을 실시하였다.

재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기재되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산되었다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합에 의해 연결되었다. 항체 동종이량체가 힌지 영역에서 환원되어 단량체가 형성된 후, 다시 산화되어 항체 이종이량체가 형성되었다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에 또한 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디 (diabody)" 기술은 이중특이적 항체 단편 제조를 위한 대안적 메카니즘을 제공하였다. 상기 단편은 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍 형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인이 또 다른 단편의 상보적인 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이루게 되어, 2개의 항원-결합 부위가 형성된다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol, 152:5368 (1994)]을 참조한다.

2가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Tuft et al . J. Immunol . 147: 60 (1991)].

(vii) 단일-도메인 항체

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 단일-도메인 항체이다. 단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 왈탐; 예를 들어, 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조). 한 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부로 이루어진다.

(viii) 항체 변이체

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변경을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 원하는 특징을 갖는 최종 구축물이 생성되도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다. 아미노산 변경은 서열이 제조되는 시점에 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.

(ix) 항체 유도체

본 발명의 항체는 당업계에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가적인 비단백질성 잔기를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체의 유도체화에 적합한 잔기는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비제한적 예에는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성으로 인해 제조에 유리할 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착되는 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 1개 초과의 중합체가 부착될 경우에 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 비롯한 (이에 제한되지는 않음) 고려사항을 기초로 결정될 수 있다.

(x) 벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법

항체는 재조합 방법을 사용하여 생성할 수도 있다. 예를 들어, 항-항원 항체를 재조합 생성하기 위해, 이러한 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열 분석할 수 있다. 다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.

(a) 신호 서열 성분

본 발명의 항체는 직접적으로 뿐만 아니라 이종 폴리펩티드, 바람직하게는 신호 서열, 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 기타 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생성될 수 있다. 바람직하게 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식 및 프로세싱 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단)되는 것이다. 천연 항체 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우에는, 신호 서열을 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열-안정성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열로 대체시킨다. 효모 분비의 경우에는, 천연 신호 서열을 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α-인자 리더 포함), 또는 산-포스파타제 리더, C. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 WO 90/13646에 기재된 신호로 치환시킬 수 있다. 포유동물 세포 발현시에는, 포유동물 신호 서열, 뿐만 아니라 바이러스성 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다.

(b) 복제 기점

발현 벡터 및 클로닝 벡터는 둘 다 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제될 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서는 상기 서열이 숙주 염색체 DNA와 상관없이 벡터를 복제할 수 있는 것이고, 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하며, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에서는 필요하지 않다 (전형적으로, SV40 기점은 단지 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있음).

(c) 선택 유전자 성분

발현 및 클로닝 벡터는 선택 마커라고도 불리는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 얻을 수 없는 중요 영양분을 공급하는 단백질을 코딩하고, 예를 들어 바실루스의 경우에는 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자이다.

선택 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포들은 약물 내성 부여 단백질을 생성하고, 따라서 선택 계획에서 생존한다. 이러한 우성 선택의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 사용한다.

포유동물 세포에 대해 적합한 선택 마커의 또 다른 예에는 항체-코딩 핵산을 선택하는 데 반응을 일으키는 세포의 확인을 가능하게 하는 것들, 예컨대 DHFR, 글루타민 신테타제 (GS), 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이 포함된다.

예를 들어, DHFR 유전자로 형질전환시킨 세포는 형질전환체를 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인한다. 이들 조건 하에서, DHFR 유전자를 임의의 다른 공동 형질전환된 핵산과 함께 증폭시킨다. 내인성 DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예컨대 ATCC CRL-9096)를 사용할 수 있다.

별법으로, GS 유전자로 형질전환시킨 세포는 형질전환체를 GS의 억제제인 L-메티오닌 술폭시민 (Msx)을 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인한다. 이들 조건 하에서, GS 유전자를 임의의 다른 공동 형질전환시킨 핵산과 함께 증폭시킨다. GS 선택/증폭 시스템을 상기 기재된 DHFR 선택/증폭 시스템과 조합하여 이용할 수 있다.

별법으로, 관심 대상의 항체, 야생형 DHFR 유전자 및 또 다른 선택 마커, 예컨대 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환되거나 공동-형질전환된 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선택 마커에 대한 선택제, 예컨대 아미노글리코시드계 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신 또는 G418을 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선택될 수 있다. 미국 특허 번호 4,965,199를 참조한다.

효모에 사용하기 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (문헌 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)]). trp1 유전자는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다. 문헌 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. 이후, 효모 숙주 세포 게놈 내 trp1 병변의 존재는 트립토판 부재하에서 성장시켜 형질전환을 검출하는데 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.

또한, 1.6 ㎛ 원형 플라스미드 pKD1로부터 유래된 벡터는 클루이베로미세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 별법으로, 재조합 송아지 키모신의 대량 생산용 발현 시스템이 K. 락티스(K. lactis)에 대해 보고되어 있다. 문헌 [Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)]. 클루이베로미세스의 산업적 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다중 카피 발현 벡터도 개시된 바 있다. 문헌 [Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)].

(d) 프로모터 성분

발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주에 사용하기 적합한 프로모터에는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터가 포함된다. 그러나, 다른 공지의 박테리아 프로모터도 적합하다. 세균성 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한, 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.

프로모터 서열은 진핵생물에 대해 공지되어 있다. 실질적으로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 출발점으로부터 70 내지 80개 염기 상류에 존재하는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역 (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)이다. 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 대부분의 진핵세포 유전자의 3' 말단에 존재한다. 모든 이러한 서열들이 진핵 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.

효모 숙주를 이용한 경우에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예에는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 글리콜분해 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 포함된다.

성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련이 있는 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 또한, 효모 인핸서도 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.

포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 항체 전사는, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 원숭이 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스 게놈으로부터 수득한 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터, 및 열-쇼크 프로모터에 의해 제어될 수 있는데, 단 이들 프로모터는 숙주 세포 시스템과 상용가능하여야 한다.

SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스성 복제 기점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 극초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로 편리하게 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현시키기 위한 시스템이 미국 특허 번호 4,419,446에 개시되어 있다. 이러한 시스템의 변형은 미국 특허 번호 4,601,978에 기재되어 있다. 또한, 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 조절 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대해서는 문헌 [Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982)]을 참조한다. 별법으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복체를 프로모터로 사용할 수 있다.

(e) 인핸서 요소 성분

고등 진핵생물에 의해 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA를 전사하는 것은 종종, 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 현재, 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터의 많은 인핸서 서열이 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로는 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예에는 복제 기점의 하류 쪽 (bp 100-270)의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소에 대한 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 항체 코딩 서열에 대한 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.

(f) 전사 종결 성분

진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터 역시 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 통상적으로 이용가능하다. 이들 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 유용한 전사 종결 성분 중 하나는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO 94/11026 및 여기에 개시된 발현 벡터를 참조한다.

(g) 숙주 세포의 선택 및 형질전환

본원에서의 벡터 내의 DNA의 클로닝 또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 상기 기재된 원핵생물, 효모, 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물에는 유박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리키아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실루스(Bacilli), 예를 들어 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토미세스(Streptomyces)가 포함된다. 한 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주, 예컨대 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하다. 이러한 예들은 제한적이기보다는 예시적이다.

전장 항체, 항체 융합 단백질, 및 항체 단편은 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우, 예를 들어 치료용 항체를 그 자체만으로도 종양 세포 파괴에 있어서 효과적인 것으로 나타나는 세포독성제 (예를 들어, 독소)와 접합시킨 경우에 박테리아에서 생성시킬 수 있다. 전장 항체는 순환 반감기가 더 길다. 이. 콜라이 내에서의 생성은 보다 신속하고 보다 비용 효율적이다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 발현 및 분비 최적화를 위한 번역 개시 영역 (TIR) 및 신호 서열을 설명하고 있는 U.S. 5,648,237 (Carter et. al.), U.S. 5,789,199 (Joly et. al.), 및 U.S. 5,840,523 (Simmons et. al.)을 참조한다. 또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기재되어 있는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254]을 참조한다. 발현 후, 항체를 이. 콜라이 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 단리시킬 수 있고, 예를 들어 이소형에 따라서 단백질 A 또는 G 칼럼을 통하여 정제할 수 있다. 최종 정제는 예를 들어 CHO 세포 내에서 발현된 항체를 정제하는 방법과 유사하게 수행될 수 있다.

원핵생물에 더하여, 진핵 미생물 예컨대 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터에 대한 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 또는 통상적인 빵 효모가 가장 흔하게 사용된다. 그러나, 예컨대 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 숙주, 예컨대 K. 락티스, K. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), K. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), K. 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), K. 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), K. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), K. 써모톨레란스(K. thermotolerans) 및 K. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈와니오미세스(Schwanniomyces), 예컨대 슈와니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실륨(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 A. 니둘란스(A. nidulans) 및 A. 니게르(A. niger)와 같은 수많은 다른 속, 종 및 균주가 본원에서 통상적으로 이용가능하고 본원에서 유용하다. 치료용 단백질을 생성하기 위하여 효모 및 사상 진균을 사용하는 것에 관한 논의를 고찰하기 위해서는, 예를 들어 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)]을 참조한다.

글리코실화 경로를 "인간화"시킴으로써, 부분적으로 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 지닌 항체를 생성시키는 특정의 진균 및 효모 균주를 선택할 수 있다. 예를 들어 문헌 [Li et al., Nat . Biotech . 24:210-215 (2006)] (피키아 파스토리스에서의 글리코실화 경로의 인간화 기재); 및 상기 문헌 [Gerngross et al.]을 참조한다.

글리코실화된 항체를 발현하기에 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 유기체 (척추 동물 및 무척추 동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (쐐기벌레), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (과실파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용성 곤충 숙주 세포가 확인된 바 있다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체, 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용가능하고, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따라 본원에서의 바이러스로서 사용될 수 있다.

목화, 옥수수, 감자, 대두, 피튜니아, 토마토, 좀개구리밥 (렘나세아에(Lemnaceae)), 알팔파 (M. 트룬카튤라(M. truncatula)), 및 담배의 식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하는 플랜티보디스(PLANTIBODIES)™ 기술을 기재함)를 참조한다.

척추동물 세포를 숙주로서 사용할 수 있고, 척추동물 세포를 배양하여 증식시키는 것이 (조직 배양) 통상적인 과정이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 (sertoli) 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (베로-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 세포주 (Hep G2)이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주에는 DHFR-CHO 세포를 비롯한 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 및 NS0 및 Sp2/0와 같은 골수종 세포주가 포함된다. 항체 생성에 적합한 특정의 포유동물 숙주 세포주에 관한 고찰을 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 255-268]을 참조한다.

숙주 세포를 상기 기재된 항체 생산을 위한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형시킨 통상의 영양 배지에서 배양시킨다.

(h) 숙주 세포의 배양

본 발명의 항체를 생산하는데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 시판 배지, 예컨대 햄 F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM) (시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) (DMEM) (시그마)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:225 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기재된 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지에는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 젠타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 등가의 에너지원이 보충될 수 있다. 또한, 임의의 다른 필요한 보충물을 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함시킬 수도 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 이용된 것이고, 당업자에게 명백할 것이다.

(xi) 항체의 정제

재조합 기술을 이용하는 경우, 항체는 세포 내에서 또는 주변세포질 공간 내에서 생성될 수 있거나, 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생성되는 경우, 제1 단계로서 입자형 잔해인 숙주 세포 또는 용해된 단편을 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거하였다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 이. 콜라이의 주변세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하는 절차가 기재되어 있다. 간략하게 설명하면, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 잔해는 원심분리로 제거할 수 있다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 일반적으로는 우선 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 농축시킨다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF를 임의의 이전 단계에 포함시킬 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 저해하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.

세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있는데, 친화성 크로마토그래피가 전형적으로 바람직한 정제 단계 중의 하나이다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A가 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기반으로 하는 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다 (문헌 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (문헌 [Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)]). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 공극이 제어된 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 프로세싱 시간을 가능하게 한다. 항체가 C_H3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 (제이. 티. 베이커(J. T. Baker), 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 회수할 항체에 따라, 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온-교환 칼럼에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스™에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어, 폴리아스파르트산 칼럼)에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전이 이용될 수도 있다.

일반적으로, 조사, 시험 및 임상에 사용하기 위한 항체를 제조하는 각종 방법론이 당업계에 널리 확립되고 있고, 이는 상기 기재된 방법론과 일치하고/거나 관심 대상의 특정 항체에 대해 당업자에게 인지되는 바와 같다.

D. 생물학적 활성 항체의 선택

상기 기재된 바와 같이 생산된 항체를 하나 이상의 "생물학적 활성" 검정에 적용시켜, 치료 관점에서 유익한 특성을 갖는 항체를 선택할 수 있다. 항체는 발생된 항원에 대한 그의 결합 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예에 나타낸 바와 같은 항-oxLDL 항체, 항체의 항원 결합 특성은 MDA-ApoB100에 대한 결합 능력을 검출하는 검정으로 평가할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체의 항원 결합 특성은 소 펩티드 IEIGLEGKGFEPTLEALFGK (서열 5)에 대한 결합 능력을 검출하는 검정으로 평가할 수 있다. 항-oxLDL 항체는 또한 동물 모델에서 플라크 형성을 억제하고 아테롬성동맥경화성 병변의 발병을 예방하는 것에 대해 스크리닝될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Schiopu et al., 2004]; WO 2004/030607; US 6,716,410). 다른 활성에는 처리 수주 후 대동맥에서 기존의 확립된 아테롬성동맥경화성 플라크의 퇴행을 활성적으로 유도하는 것이 포함된다 (예를 들어, WO2007/025781).

또 다른 실시양태에서, 항체의 친화도는, 예를 들어 포화 결합, ELISA 및/또는 경쟁 검정 (예를 들어, RIA의)에 의해 측정될 수 있다.

또한, 상기 항체를 대상으로 하여 다른 생물학적 활성 분석을 수행하여, 예를 들어 그의 치료제로서의 효과를 평가할 수 있다. 이러한 분석은 당업계에 공지되어 있고, 표적 항원 및 항체의 의도된 용도에 따라 달라진다.

관심 대상의 항체 상의 특정 에피토프에 결합하는 항체 (예를 들어, 실시예의 항-oxLDL 항체가 oxLDL에 결합하는 것을 차단하는 것)를 스크리닝하기 위해, 문헌 [Antibodies , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 통상의 교차-차단 검정을 수행할 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 문헌 [Champe et al., J. Biol . Chem . 270:1388-1394 (1995)]에 기재된 바와 같은 에피토프 맵핑을 수행하여 항체가 관심 대상의 에피토프에 결합하는지 여부를 측정할 수 있다.

E. 제조품

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 제제가 담긴 용기를 포함하는 제조품이 제공되며, 임의로 그의 사용 지침서가 제공한다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알 또는 주사기가 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 예시적인 용기는 3-20 cc 단일 용도 유리 바이알이다. 대안적으로, 다중투여 제제를 위해, 용기는 3-100 cc 유리 바이알일 수 있다. 용기는 제제를 보유하며, 용기 상의 또는 용기에 부속된 라벨에 사용에 대한 지시를 나타낼 수 있다. 제조품은 상업적 및 사용자 입장에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 지침서가 있는 포장삽입물을 추가로 포함할 수 있다.

하기 실시예를 참조하여 보다 충분하게 본 발명을 이해할 수 있을 것이다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 모든 문헌 및 특허 인용은 본원에 참조로 포함된다.

본 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 여겨진다. 본원에 제시되고 기재된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재로부터 당업자에게 명백할 것이고, 이는 첨부된 청구범위의 범주에 속할 것이다. 본원에서 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위하여 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

실시예

본원에서 기재하는 실시예 및 실시양태는 단지 설명을 위한 것으로, 그러한 관점에서 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이며, 이는 본 출원의 취지 및 범위와 첨부하는 특허청구범위의 범주 내에 포함됨을 이해한다.

실시예 1 :안정한 항-oxLDL 항체 액체 제제, pH 연구

이들 실시예에는 약 10 mg/mL 내지 200 mg/mL 범위의 단백질 농도로 항-oxLDL 항체 (도 2에 나타낸 아미노산 서열을 가짐)를 포함하는 안정한 액체 제제의 개발 및 안정성 시험이 기재되어 있다. 항체를, 인간 ApoB-100으로부터 유래한 산화된 펩티드에 대항하여 지정된 n-코더(CoDeR)®로 불리는 재조합 항체 단편 라이브러리로부터 개발하였다 (예를 들어, WO02/080954). 항-oxLDL 항체의 안정성 (예를 들어, 응집체 제제, 전하 변이체 등)을 히스티딘, 아르기닌, 아세테이트, 염화나트륨 등으로 이루어진 다양한 액체 (pH 4.5 내지 6.5범위) 제제로 조사하였다. 항-oxLDL 항체의 안정성을, (농도 및 탁도에 대하여) UV를 비롯한 여러 검정에 의해, 크기 변이체 분석에 대하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해, 전하 변이체 분석에 대하여 이미지 모세관 등전점 포커싱 (icIEF)에 의해, 그리고 결합에 의해 모니터링하였다. 안정성 시험 6 개월 후, 본 발명자들의 결과는 항-oxLDL 항체가 pH 4.5 내지 pH 6.5 사이의 아르기닌-함유 완충제에서 안정함을 나타냈다.

항-oxLDL 항체를, 슬라이드-a-리저(Slide-a-Lyzer) 카세트를 이용하는 투석에 의해 다양한 완충제 내로 제제화하여 표 1에 수록된 최종 농도를 달성하였다. 0.22 ㎛ 스테리플립(Sterifilp) 필터 유닛을 이용하여 각각의 제제를 멸균 여과하고, 오토클레이브 바이알에 무균적으로 충전하고, 마개로 막고, 알루미늄 플립-탑 실로 밀봉하였다. 샘플을 -20℃, 2-8℃, 25℃, 30℃, 40℃에 두고, 대조군 바이알을 -70℃에 두고, 안정성 연구를 선택 온도에서 6-개월까지 수행하였다.

방법

pH: 200 ㎕ 부피의 각각의 샘플을 주위 온도에서 1.5 ml 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에 넣고, 그의 pH를 로스(Ross) 세미-마이크로 전극을 갖춘 써모 오리온(Thermo Orion) pH 미터를 이용하여 측정하였다. pH 미터는 써모 오리온 표준 완충제 (pH 4.0, 5.0 및 7.0)를 사용하여 보정하였다.

육안 검사: 샘플을 주위 온도에서 백색 및 흑색 배경의 형광 광하에서 색상, 외관 및 투명도 (CAC)에 대해 시각적으로 분석하였다.

탁도: 제제 샘플의 탁도를 스펙트라맥스(SpectraMax) M2^e 플레이트 판독기를 이용하여 360 nm 및 450 nm의 흡광도에 의해 측정하였다. 희석하지 않는 샘플 100 ㎕를 96-웰 마이크로 플레이트에 로딩하고, 탁도를 물 블랭크에 대하여 측정하였다. 다양한 단백질 농도의 제제를 비교하기 위해, 360 nm 및 450 nm에서의 흡광도를 단백질 농도로 나누어, 존재하는 단백질의 양에 의해 단독으로 유발된 임의의 효과에 대해 정규화하였다.

삼투질농도: 삼투압계를 50 mOsm/kg 및 850 mOsm/kg 보정 용액을 사용하는 사용자의 매뉴얼에 따라 보정하였다. 보정은 제제의 구동 전에 클리니트롤(Clinitrol) 290 기준 용액을 구동함으로써 검증하였다.

단백질 농도 - 용적 측정: 모든 제제에 대한 농도를 밀리-Q(Milli-Q) 물을 사용하여 샘플을 0.5 mg/ml로 희석시킨 후 2벌로 측정하였다. 희석된 샘플을 96-웰 플레이트 (BD 바이오사이언스)로 옮기고, 흡광도 스펙트럼을 스펙트라맥스 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스 M2^e)를 이용하여 판독하였다. 판독치에서 탈이온수에 대한 값을 빼고 평균내었다. 하기 식에 따라 단백질 농도를 계산하였다.

항-oxLDL 항체의 측정된 흡광 계수 (ε)는 1.62 (mg/mL)^-1cm^{- 1}였다.

점도: 점도는 피지카(Physica) MCR 300 모듈러 콤팩트 레오미터(Physica MCR 300 Modular Compact Rheometer) (안톤 파르(Anton Paar))를 이용하여 측정하였다. 샘플 75 ㎕를 주위 온도에서 25 mm 원뿔-및-평판 레오미터 (1°각도; CP 25-1) 사이에 로딩하였다. 측정치는 1000 sec^-1의 일정한 전단 속도에서 구하였다.

활성: 항-oxLDL 항체의 생물학적 활성을 ELISA에서 ox-LDL에 대한 그의 결합 능력을 측정하여 결정하였다. ELISA-결합 검정으로 말론디알데히드 (MDA) 산화된 LDL 펩티드에 대한 항-oxLDL 항체의 결합 능력을 결정하였다.

크기 배제-고성능 액체 크로마토그래피 (SEC): 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 응집체 및 단편을 정량화하였다. 이 검정은 TSK G3000 SWXL™, 7.8X300 mm 칼럼을 이용하였고, 25℃에서 HP 1100™ HPLC 시스템 상에서 구동하였다. 이동상을 사용하여 샘플을 2 mg/ml로 희석하였고, 주입 부피는 25 ㎕였다. 이동상은 0.2 M K₂HPO₄, 0.25 M KCl (pH 6.2)이었고, 단백질을 30분 동안 0.5 mL/분의 일정한 유속으로 용리하였다. 용리액 흡광도를 280 nm에서 모니터링하였다. 적분은 HP 켐스테이션(CHEMSTATIONM)™ 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.

이미지 모세관 등전점 포커싱 (icIEF): icIEF를 이용하여 40℃에 보관된 안정성 샘플 및 기준 샘플을 검정함으로써, 항-oxLDL 항체 안정성 샘플의 전하 (산성 및 염기성) 변이체를 정량화하였다. 이 기술은 프린스(Prince) 오토샘플러 장치를 갖춘 FAST IEF 분석기에서 플루오로카본 코팅된 모세관을 이용한다.

이온-교환 크로마토그래피 (IEC): 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 전하 변이체에서의 변화를 측정하였다. 이 검정은 HP 1100™ HPLC 시스템 상에서 디오넥스 프로팩(DIONEX PROPAC) WCX-10™ 칼럼을 이용하였다. 샘플을 50 mM HEPES를 함유하는 이동상 A (pH 7.5)를 사용하여 2 mg/ml로 희석하였다. 이어서, 희석된 샘플 25 ㎕를 주위 온도 (40℃)에서 유지시킨 칼럼에 로딩하였다. 50 mM HEPES, 100 mM 황산나트륨을 함유하는 이동상 B (pH 7.5)를 이용하여 피크를 용리하였다. 용리액을 280 nm에서 모니터링하였다. 데이터를 HP 켐스테이션® 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

결과 및 논의

이러한 제제 pH 연구에서, 항-oxLDL 항체의 안정성에 대한 단백질 농도, 이온 강도 및 용액 pH의 효과를 조사하였다. SEC, IEC, icIEF 및 탁도 검정을 이용하여 항-oxLDL 항체의 안정성을 실시간으로 모니터링하였고, 보관 조건을 가속화하였다. 단백질 농도, 삼투질농도, 점도, 결합 및 CE-SDS 검정을 선택된 시점에 수행하였다. 이 연구에서 pH 4.5 내지 pH 6.5의 pH 범위에 걸쳐 아르기닌-기재 제제 내의 다양한 농도의 항-oxLDL 항체의 안정성 (예를 들어, 응집체 형성, 전하 변이체 등)을 조사하였다. L-아르기닌을 사용하여 높은 이온 강도 완충제를 제제화하였다. 삼투질농도, pH, 단백질 농도 및 점도를 측정하여 하기 나타내었다 (표 2).

모든 제제를 -20℃ 또는 -70℃에서의 3회의 냉동 사이클에 적용시킨 후, 이어서 주위 온도에서 냉각시켰다. SEC에서, 냉동이 표 1에 수록된 제제에 대해 -70℃ 및 -20℃에서 항-oxLDL 항체의 물리적 특성을 유의하게 바꾸지 않는 것으로 확인되었다 (표 2 참조).

40℃에서의 모든 제제의 결합 활성: oxLDL에 대한 샘플의 결합 활성을 ELISA-결합 검정으로 측정하였다. 검정에서, 40℃에서 4주 동안 인큐베이션한 후에 시험된 모든 제제가 대조군 샘플 (@ T0)의 약 20%로 떨어지는 것으로 나타났다 (표 3).

pH의 효과: 크기, 전하 변이체 및 탁도 검정을 이용하여 시간이 지남에 따른 다양한 온도에서의 항-oxLDL 항체의 안정성을 모니터링하였다. SEC를 이용하여 생성된 응집체, 단량체 및 단편의 양을 측정하고, 동시에 IEC를 이용하여 안정성 연구 중에 생성된 산성, 주요 및 염기성 변이체를 측정하였다 (도 3). 이용된 IEC 방법은 시험된 모든 항-oxLDL 항체 제제에 대한 안정성 제시 검정이 아니었고, 이에 따라 후속으로 본 발명자들은 상이한 메카니즘에 의해 전하를 분리하는 icIEF를 이용하였다. pH 4.5 용액에서, 항-oxLDL 항체는 보다 염기성 변이체를 형성한 반면, pH 6.5에서 보다 산성 변이체를 형성하였다 (도 3).

이들 결과는, 40℃에서 항-oxLDL 항체가 pH 6.5에서 쉽게 응집되고 pH 4.5에서 쉽게 단편화된다는 것을 보여주는 SEC 연구 (도 4)로 보완된다. SEC 및 IcIEF 데이터는 둘 다 40℃에서 항-oxLDL 항체가 시험된 pH 4.5 및 pH 6.5 샘플과 비교하여 pH 5.5에서 보다 안정함을 시사한다.

샘플의 탁도는 360 nm 및 450 nm 파장에서 측정하였고, 단백질 농도에 대해 정규화하였다. 정규화된 샘플 탁도는 30℃ 및 40℃에서 시간이 흐름에 따라 약간 증가된 것으로 관찰되었으나; 침전은 관찰되지 않았다.

부형제 및 이온 강도의 효과: 항-oxLDL 항체의 안정성에 대한 다양한 부형제의 효과를 조사하였다. 조사된 부형제의 목록에는 염화나트륨, 아세트산나트륨, 히스티딘 아세테이트 및 아르기닌 아세테이트가 포함된다. 본 발명자들의 결과는, 염화나트륨을 함유하는 제제가 다른 모든 제제보다 신속하게 응집되었음을 보여주었다.

항-oxLDL 항체 농도의 효과: 단백질 농도는 크기 및 전하 변이체 검정에 의해 제안된 바와 같은 항-oxLDL 항체의 안정성에 대한 강한 효과를 갖지 않았다. 응집은 99 mg/ml 내지 189 mg/ml의 농도에 약간 의존적인 것으로 나타났으며, 여기서 농도가 높을수록 다소 많은 응집을 가졌다. SEC를 이용하여 생성된 응집체, 단량체 및 단편의 양을 측정하고, 동시에 icIEF를 이용하여 안정성 연구 중에 생성된 산성, 주요 및 염기성 변이체를 측정하였다.

항-oxLDL 항체의 안정성을 다양한 완충제 조건에서 평가하였다. 제제 스크리닝 연구로부터 얻은 데이터는 항-oxLDL 항체가 pH 4.5 내지 pH 6.5 사이의 히스티딘 아세테이트 및 아르기닌 아세테이트 완충제에서 보다 안정함을 보여주었다.

실시예 2: 안정한 항-oxLDL 항체 액체 제제, 부형제 연구

항-oxLDL 항체의 안정성을 다양한 액체 (히스티딘 아세테이트, 히스티딘 술페이트, 히스티딘 숙시네이트, 히스티딘 시트레이트 및 PBS) 제제 (표 A)에서 평가하였다. 3cc 유리 바이알 내의 각각의 제제 1 밀리리터를 -70, -20, 5, 25, 30 및 40℃에서 6 개월까지의 기간 동안 보관하였고, 안정성을 1, 2, 4, 6, 8, 12 및 24 주에 평가하였다. 항-oxLDL 항체의 안정성을, (농도 및 탁도에 대하여) UV를 비롯한 여러 검정에 의해, 크기 변이체 분석에 대하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해, 전하 변이체 분석에 대하여 이미지 모세관 등전점 포커싱 (icIEF)에 의해, 크기 분포에 대하여 CE-SDS에 의해, 그리고 활성에 대하여 결합에 의해 모니터링하였다. 안정성 시험 6 개월 후, 본 발명자들의 결과는 항-oxLDL 항체가 20mM 히스티딘 아세테이트, 150mM 아르기닌 아세테이트, 0.02% 폴리소르베이트 20 (pH 5.5)에서 안정함을 나타내었다.

샘플 제조: 항-oxLDL 항체를, 슬라이드-a-리저 카세트를 이용하는 투석에 의해 다양한 완충제 내로 제제화하고, 이어서 아미콘 울트라(Amicon Ultra)-15 원심분리 장치를 이용하여 단백질 농도가 표적 농도에 도달하도록 하였다. 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 메티오닌 및 EDTA를 첨가하여 표 A에 수록된 최종 농도를 달성하였다. 0.22 ㎛ 스테리플립 필터 유닛을 이용하여 각각의 제제를 멸균 여과하고, 오토클레이브 바이알에 무균적으로 충전하고, 마개로 막고, 알루미늄 플립-탑 실로 밀봉하였다. 하기 제제의 모든 샘플을 액체로서 유지하였다. 샘플을 -20℃, 2-8℃, 25℃, 30℃, 40℃에 두고, 대조군 바이알을 -70℃에 두고, 안정성 연구를 선택 온도에서 6-개월까지 수행하였다.

<표 A>

방법

pH: 각각의 샘플 200 ㎕를 주위 온도에 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 넣고, 그의 pH를 로스 세미-마이크로 전극을 갖춘 써모 오리온 pH 미터를 이용하여 측정하였다. pH 미터는 써모 오리온 표준 완충제 (pH 4.0, 5.0 및 7.0)를 사용하여 보정하였다.

육안 검사: 샘플을 주위 온도에서 백색 및 흑색 배경의 형광 광하에서 색상, 외관 및 투명도 (CAC)에 대해 시각적으로 분석하였다.

탁도: 제제 샘플의 탁도를 스펙트라맥스 M2^e 플레이트 판독기를 이용하여 360 nm 및 450 nm의 흡광도에 의해 측정하였다. 희석하지 않는 샘플 100 ㎕ 및 물 (블랭크용)을 96-웰 마이크로 플레이트에 로딩하고, 탁도를 측정하였다. 다양한 단백질 농도의 제제를 비교하기 위해, 360 nm 및 450 nm에서의 흡광도를 단백질 농도로 나누어, 존재하는 단백질의 양에 의해 단독으로 유발된 임의의 효과에 대해 정규화하였다.

삼투질농도: 삼투압계를 50 mOsm/kg 및 850 mOsm/kg 보정 용액을 사용하는 사용자의 매뉴얼에 따라 보정하였다. 보정은 제제 샘플의 구동 전에 클리니트롤 290 기준 용액을 구동함으로써 검증하였다.

단백질 농도 - 용적 측정: 모든 제제에 대한 농도를 밀리-Q 물을 사용하여 샘플을 0.5 mg/ml로 희석시킨 후 2벌로 측정하였다. 희석된 샘플을 96-웰 플레이트 (BD 바이오사이언스, cat# 353261)로 옮기고, 농도를 스펙트라맥스 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스 M2^e)를 이용하여 판독하였다. 판독치에서 탈이온수에 대한 값을 빼고 평균내었다. 하기 식에 따라 단백질 농도를 계산하였다.

항-oxLDL 항체의 측정된 흡광 계수 (ε)는 1.62 (mg/mL)^-1cm^{- 1}였다.

점도: 점도는 피지카 MCR 300 모듈러 콤팩트 레오미터 (안톤 파르)를 이용하여 측정하였다. 샘플 75 ㎕를 주위 온도에서 25 mm 원뿔-및-평판 레오미터 (1°각도; CP 25-1) 사이에 로딩하였다. 측정치는 1000 sec^-1의 일정한 전단 속도에서 구하였다.

결합 검정: 40℃에서 보관된 4-주 안정성 샘플을 밀리-Q 수를 사용하여 0.5 mg/mL로 희석하고, ELISA로 oxLDL 결합에 대해 시험하였다. 열 분해 과정을 거치지 않은 샘플을 검정 대조군으로 사용하였다.

CE-SDS UV (비-환원): CE-SDS UV 비-환원 방법을 이용하여 40℃에서 보관된 4-주 안정성 샘플 및 기준 샘플을 검정함으로써 항-oxLDL 항체 안정성 샘플의 크기 분포를 평가하였다.

크기 배제-고성능 액체 크로마토그래피 (SEC): 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 응집체 및 단편을 정량화하였다. 이 검정은 TSK G3000 SWXL™, 7.8X300 mm 칼럼을 이용하였고, HP 1100™ HPLC 시스템 상에서 구동하였다. 이동상을 사용하여 샘플을 2 mg/mL로 희석하였고, 주입 부피는 25 ㎕였다. 이동상은 0.2 M K₂HPO₄, 0.25 M KCl (pH 6.2)이었고, 단백질을 30분 동안 0.5 mL/분의 일정한 유속으로 용리하였다. 용리액 흡광도를 280 nm에서 모니터링하였다. 적분은 HP 켐스테이션™ 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.

이미지 모세관 등전점 포커싱 (icIEF): icIEF를 이용하여 40℃에 보관된 안정성 샘플 및 기준 샘플을 검정함으로써, 항-oxLDL 항체 안정성 샘플의 전하 (산성 및 염기성) 변이체를 정량화하였다. 이 기술은 프린스 오토샘플러 장치를 갖춘 FAST IEF 분석기에서 플루오로카본 코팅된 모세관을 이용한다.

결과 및 논의

이러한 제제 부형제 연구에서, 항-oxLDL 항체의 안정성에 대한 다양한 완충제 반대이온, 계면활성제 및 항-산화제의 효과를 조사하였다. SEC, icIEF 및 탁도 검정을 이용하여 항-oxLDL 항체의 안정성을 연구 전반에 걸쳐 모니터링하였다. 단백질 농도, 삼투질농도, 점도, 효능 및 CE-SDS 검정을, 선택된 안성정 샘플 및 선택된 시점에 대해 수행하였다. 상기 pH 연구 결과를 근거로 pH 5.5 부근의 20 mM 농도의 완충제를 선택하였다. 모든 액체 제제의 pH를 완충제 교환 후에 측정하였다 (표 A). 삼투질농도, pH, 단백질 농도 및 점도를 측정하여 하기 나타내었다 (표 B). 육안 검사 검정 결과, 모든 샘플의 색상이 연황색으로 명백하게 보이는 것으로 나타났다.

<표 B>

-20℃ 및 -70℃에 보관된 제제의 세트를 1주 기간에 걸쳐 3회의 냉동-해동 사이클에 적용시켰다. 샘플을 -20℃ 및 -70℃에서 각각 냉동시키고, 이어서 주위 온도에서 해동시켰다. 냉동-해동 사이클이 적용된 샘플의 물리적 특성을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 평가하였다. SEC 검정에서, 냉동-해동이 시험된 샘플의 응집체 또는 단편의 비율(%)에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.

360 nm 및 450 nm 파장에서 측정된 샘플의 탁도는, 5℃에서 보관된 대부분의 제제에 대하여 시간의 흐름에 따른 탁도에 있어서 유의한 변화 없었음을 보여주었다. 제제 샘플에 대한 탁도는 온도 (25℃, 30℃ 및 40℃) 및 시간에 따라 다소 증가하였다.

CE-SDS UV는 항체 제제 내의 단백질 공유결합 응집체, 단편 및 단량체, 예컨대 유리 경쇄 또는 중쇄의 분명한 분자량의 추정에 사용된 정량적 검정이다. CE-SDS 검정은 40℃에서 4-주 동안 보관된 안정성 샘플을 사용하여 비-환원 조건하에 구동하였다. 결과는 시험된 모든 샘플에 대한 주요 피크의 비율(%)이 허용되는 검정 범위 내에 있음을 보여주었다 (도 5).

샘플의 결합 활성은 ELISA-결합 검정을 이용하여 측정하였다. ELISA-결합 검정으로, 말론디알데히드 (MDA) 산화된 LDL 펩티드에 대한 항-oxLDL 항체의 결합 능력을 측정하였다. 검정 결과는 40℃에서 4-주의 인큐베이션 후에 시험된 모든 제제가 +/- 25%의 허용되는 검정 범위내에 있음을 보여주었다 (도 6).

항-oxLDL 항체 농도의 효과: 항-oxLDL 항체의 안정성에 대한 농도의 효과를 조사하기 위하여, 20 mM 히스티딘 아세테이트, 150 mM 아르기닌 아세테이트, 0.02% PS20 (pH 5.5) 중에서 제제화하여 40℃에서 4주까지 보관한 3가지 상이한 농도 (25 mg/mL (1), 50 mg/mL (2) 및 150 mg/mL (3))를 검정하였다. 결과는 25 mg/mL 및 50 mg/mL 제제에 대하여 유의한 시간 및 온도 의존성 응집체 형성이 없었던 반면, 150 mg/mL 제제 샘플에 대하여 응집체 형성의 증가가 있었음을 보여주었다. icIEF 검정 결과는 연구된 3가지 농도 모두에 대하여 산성 변이체의 온도 및 시간 의존성 증가가 있었음을 보여주었다 (도 7A 및 B).

부형제의 효과: 항-oxLDL 항체의 안정성에 대한 다양한 부형제의 효과를 조사하였다. 연구된 부형제의 목록에는 포스페이트-완충-염수 (PBS), 히스티딘-히드로클로라이드 및 아르기닌에 대한 반대이온 (아세테이트, 술페이트, 숙시네이트 및 시트레이트)이 포함된다. 결과는 그의 반대이온에 상관없이 아르기닌 함유 제제에 대하여 응집체, 단편, 산성 및 염기성 변이체의 유의한 변화가 없었음을 보여주었다. PBS의 존재 하에, 연구된 모든 온도에서 시간의 흐름에 따른 응집, 단편화 및 산성 변이체의 유의한 증가가 있었다.

계면활성제: 계면활성제는 교반-유도된 응집에 대하여, 뿐만 아니라 단백질의 흡착 유도 손실에 대하여 보호를 제공한다. 항-oxLDL 항체의 안정성에 대한 비-이온성 계면활성제의 효과는 폴리소르베이트 20 (0.02% 및 0.2%) 및 폴리소르베이트 80 (0.05%)의 사용에 의해 완화되었다. 결과는 0.02% 폴리소르베이트 20이 단백질의 안정을 유지하기에 충분하는 것을 보여주었다. 0.2%로 폴리소르베이트 농도를 증가시키거나, 또는 분자량이 더 큰 계면활성제인 폴리소르베이트 80을 사용하는 것은 항-oxLDL 항체에 대해 어떠한 안정성 이점도 제공하지 않았다 (도 8).

항-산화제: 메티오닌 (5 mg/mL) 및 EDTA (1 mM)를 각각 제제 9 및 11에서 항산화제로서 사용하였다. EDTA는 금속 이온을 킬레이트화하여 금속-유도된 산화를 방지하는 반면, 메티오닌은 산화 종을 제거하는 능력을 갖는다. SEC 검정으로부터의 결과는 EDTA 및 메티오닌이 2 내지 8℃에서 항-oxLDL 항체의 안정성을 단지 약간 개선하였음을 보여주었다 (도 8).

항-oxLDL 항체의 안정성을 다양한 완충제 조건에서 평가하였다. 제제 스크리닝 연구로부터 얻은 데이터는, 항-oxLDL 항체가 20 mM 히스티딘 아세테이트, 150 mM 아르기닌 아세테이트, 0.02% 폴리소르베이트 20 (pH 5.5 부근) 중 150 mg/mL 단백질 농도에서 안정함을 보여주었다.

SEQUENCE LISTING <110> Esue, Osi <120> ANTIBODY FORMULATION <130> P4266R1 <141> 2010-03-05 <150> US 61/158,331 <151> 2009-03-06 <160> 9 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 1 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc 50 cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aacgcctgga 100 tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaagt 150 attagtgttg gtggacatag gacatattat gcagattccg tgaagggccg 200 gtccaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga 250 acagcctgag agccgaggac actgccgtgt attactgtgc acggatacgg 300 gtgggtccgt ccggcggggc ctttgactac tggggccagg gtacactggt 350 caccgtgagc tca 363 <210> 2 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 2 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag 50 ggtcaccatc tcctgctctg gaagcaacac caacattggg aagaactatg 100 tatcttggta tcagcagctc ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat 150 gctaatagca atcggccctc aggggtccct gaccgattct ctggctccaa 200 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Claims (28)

1. 치료 유효량의 항체를 pH 4.5 내지 6.5의 히스티딘-아르기닌 완충제 중에 포함하는 제제.
2. 제1항에 있어서, 완충제가 pH 5.0 내지 6.0의 히스티딘 아세테이트-아르기닌 아세테이트 완충제이거나, 또는 완충제가 pH 5.0 내지 6.0의 히스티딘 숙시네이트-아르기닌 숙시네이트 완충제인 제제.
3. 제2항에 있어서, 완충제 중 히스티딘 아세테이트 또는 히스티딘 숙시네이트 농도가 약 5 mM 내지 약 100 mM인 제제.
4. 제2항에 있어서, 히스티딘 아세테이트 또는 히스티딘 숙시네이트 농도가 약 20 mM인 제제.
5. 제2항에 있어서, 완충제 중 아르기닌 아세테이트 또는 아르기닌 숙시네이트 농도가 약 50 mM 내지 약 500 mM인 제제.
6. 제2항에 있어서, 아르기닌 아세테이트 또는 아르기닌 숙시네이트 농도가 약 150 mM인 제제.
7. 제1항에 있어서, 계면활성제를 추가로 포함하는 제제.
8. 제7항에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트인 제제.
9. 제8항에 있어서, 폴리소르베이트가 폴리소르베이트 20인 제제.
10. 제9항에 있어서, 계면활성제 농도가 0.0001% 내지 약 1.0%인 제제.
11. 제10항에 있어서, 계면활성제 농도가 약 0.01% 내지 약 0.1%인 제제.
12. 제11항에 있어서, 계면활성제 농도가 0.02%인 제제.
13. 제1항에 있어서, 항체 농도가 약 10 mg/ml 내지 약 250 mg/ml인 제제.
14. 제1항에 있어서, 항체 농도가 약 100 mg/ml 내지 250 mg/ml인 제제.
15. 제1항에 있어서, 항체 농도가 약 150 mg/ml 내지 약 200 mg/ml인 제제.
16. 제1항에 있어서, 항체 농도가 약 25 mg/ml 내지 약 200 mg/ml인 제제.
17. 제1항에 있어서, 항체가 사전 동결건조를 거치지 않는 것인 제제.
18. 제1항에 있어서, 메티오닌을 추가로 포함하는 제제.
19. 제18항에 있어서, 메티오닌 농도가 5 mg/ml인 제제.
20. 제1항에 있어서, EDTA를 추가로 포함하는 제제.
21. 제20항에 있어서, EDTA 농도가 1 mM EDTA인 제제.
22. 제7항에 있어서, 완충제가 pH 5.5의 20 mM 히스티딘 아세테이트 및 150 mM 아르기닌 아세테이트이고, 계면활성제가 약 0.01 내지 약 0.1% v/v 양의 폴리소르베이트이고, 여기서 제제가 12개월 이상 동안 약 2 내지 약 8℃의 온도에서 안정하거나, 또는 완충제가 pH 5.5의 20 mM 히스티딘 숙시네이트 및 150 mM 아르기닌 숙시네이트이고, 계면활성제가 약 0.01 내지 약 0.1% v/v 양의 폴리소르베이트이고, 여기서 제제가 12개월 이상 동안 약 2 내지 약 8℃의 온도에서 안정한 것인 제제.
23. 제1항에 있어서, 제약 제제인 제제.
24. 제1항에 있어서, 12개월 이상 동안 약 25℃에서 보관시에 안정하거나, 12개월 이상 동안 약 5℃에서 보관시에 안정하거나, 또는 12개월 이상 동안 약 -20℃에서 보관시에 안정한 제제.
25. 치료 유효량의 항체, pH 약 5.0 내지 약 6.0의 히스티딘 아세테이트-아르기닌 아세테이트 완충제 및 계면활성제를 포함하는 수성 제약 제제가 담긴 용기, 또는 치료 유효량의 항체, pH 약 5.0 내지 약 6.0의 히스티딘 숙시네이트-아르기닌 숙시네이트 완충제 및 계면활성제를 포함하는 수성 제약 제제가 담긴 용기를 포함하는 제조품.
26. 치료 유효량의 항체, pH 약 5.0 내지 약 6.0의 히스티딘 아세테이트-아르기닌 아세테이트 완충제 및 계면활성제를 조합하거나, 또는 치료 유효량의 항체, pH 약 5.0 내지 약 6.0의 히스티딘 숙시네이트-아르기닌 숙시네이트 완충제 및 계면활성제를 조합함으로써 수성 제약 제제 중에서 항체를 안정화시키는 방법.
27. (a) 약 10 mg/mL 내지 약 250 mg/mL 양의, 탈아미드화되거나 응집되기 쉬운 전장 IgG1 항체; (b) pH 5.0 내지 6.0의 히스티딘 아세테이트-아르기닌 아세테이트 완충제; 및 (c) 약 0.01% 내지 약 0.1% 양의 폴리소르베이트 20을 포함하는 제약 제제.
28. (a) 약 10 mg/mL 내지 약 250 mg/mL 양의, 탈아미드화되거나 응집되기 쉬운 전장 IgG1 항체; (b) pH 5.0 내지 6.0의 히스티딘 숙시네이트-아르기닌 숙시네이트 완충제; 및 (c) 약 0.01% 내지 약 0.1% 양의 폴리소르베이트 20을 포함하는 제약 제제.

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