KR20110020904A - 피라졸 화합물 436 - Google Patents

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KR20110020904A
KR20110020904A KR1020117000437A KR20117000437A KR20110020904A KR 20110020904 A KR20110020904 A KR 20110020904A KR 1020117000437 A KR1020117000437 A KR 1020117000437A KR 20117000437 A KR20117000437 A KR 20117000437A KR 20110020904 A KR20110020904 A KR 20110020904A
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데이빗 부타르
마리-엘레나 테오클리투
앤드류 피터 토마스
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아스트라제네카 아베
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Abstract

신규한 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 이의 제조 방법, 이를 함유하는 약학 조성물 및 치료를 위한 이의 용도가 제공된다.

Description

피라졸 화합물 436{PYRAZOLE COMPOUNDS 436}
본 발명은 피라졸 화합물, 이의 제조 방법, 이를 함유하는 약학 조성물, 약학 조성물의 제조 방법 및 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.
단백질 키나제는 각종 세포 기능을 조절하는 한 종류의 단백질(효소)이다. 이는 단백질 기질 상의 특정 아미노산을 인산화시켜 기질 단백질의 구조 변경을 초래함으로써 이루어진다. 구조 변화는 기질 활성, 또는 다른 결합 파트너와의 상호작용 능력을 조절한다. 단백질 키나제의 효소 활성이란 키나제가 인산염 기를 기질에 부가하는 속도를 말한다. 이것은, 예를 들어 시간에 따라 생성물로 전환되는 기질의 양을 측정함으로써 결정할 수 있다. 기질의 인산화는 단백질 키나제의 활성 부위에서 일어난다.
티로신 키나제는 단백질 기질 상에서 아데노신 트리포스페이트(ATP)의 티로신 잔기로의 말단 인산염 전달을 촉진하는 단백질 키나제의 부분집합이다. 이들 키나제는 세포 증식, 분화 및 이동을 유도하는 성장 인자 신호 전달 보급에 중요한 역할을 한다.
섬유아세포 성장 인자(FGF)는, 발생 및 혈관형성 과정에서의 형태발생과 같은, 여러 생리학적 프로세스의 중요한 매개인자로서 인식되어 왔다. 현재 25개 이상의 FGF 패밀리 구성원이 알려져 있다. 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR) 패밀리는, 각각 세포외 리간드 결합 도메인, 단일 막관통 도메인 및 세포내 세포질 단백질 티로신 키나제 도메인으로 구성되는 4개의 구성원으로 이루어져 있다. FGF로 자극시, FGFR은 이량체화 및 인산전달반응을 진행하여, 수용체가 활성화된다. 수용체 활성화는 세포 성장, 세포 대사 및 세포 생존과 같은 다양한 프로세스의 조절에 관여하는 특정 하류 신호전달 파트너의 소집 및 활성화에 충분하다(문헌[Eswarakumar, V.P. et. al., Cytokine & Growth Factor Reviews 2005, 16, p139-149]에서 리뷰). 따라서, FGF 및 FGFR은 종양형성의 개시 및/또는 촉진 가능성을 가진다.
이제는 FGF 신호전달을 인간암에 직접 연관짓는 상당한 증거가 있다. 방광, 신세포 및 전립선(특히)과 같은 다양한 범위의 종양 유형에서 각종 FGF의 상승 발현이 보고된 바 있다. FGF는 또한 강력한 혈관형성 인자로서 개시되어 있다. 내피세포에서의 FGFR 발현도 또한 보고되어 있다. 각종 FGFR의 활성화 돌연변이가 방광암 및 다발성 골수종(특히)과 관련이 있으며, 특히 전립선암 및 방광암에서 수용체 발현이 또한 문헌에 개시되었다(문헌[Grose, R. et. al., Cytokine & Growth Factor Reviews 2005, 16, p179-186 및 Kwabi-Addo, B. et. al., Endocrine-Related Cancer 2004, 11, p709-724] 참조). 이러한 이유로, 특히, FGFR 및/또는 FGF 신호전달을 표적으로 하는 요법이 종양 세포에 직접적으로 그리고 종양 혈관형성에 영향을 줄 수 있기 때문에, FGF 신호전달 시스템은 유인성 치료 표적이다.
FGFR로서의 FGF 신호전달 및/또는 FGFR을 표적으로 하는 요법에서 용도를 찾을 수 있는 피라졸 아미드는 2007년 12월 20일에 제출된 PCT 출원 PCT/GB2007/004917호에 개시되어 있다. 특히, 개시된 일부 피라졸 아미드를 라세미 혼합물로서 제조하였다. 일부 에난티오머의 경우, 유리할 수 있는 하나 이상의 생물학적 및/또는 생리학적 성질이 다를 수 있다는 것을 발견하였다.
본 발명에 따르면, 하기 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다:
Figure pct00001
Figure pct00002
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 하기 화학식 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다:
Figure pct00003
본 발명의 화합물의 적절한 약학적으로 허용되는 염은, 예를 들어 충분히 염기성인 본 발명의 화합물의 산 부가염, 예를 들어 무기산 또는 유기산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 트리플루오로아세트산, 구연산 또는 말레산과의 산 부가염이다. 또한, 충분히 산성인 본 발명의 화합물의 적절한 약학적으로 허용되는 염은 알칼리 금속염, 예컨대 나트륨 또는 칼륨 염, 알칼리토 금속염, 예컨대 칼슘 또는 마그네슘 염, 암모늄염 또는 생리학적으로 허용되는 양이온을 제공하는 유기 염기와의 염, 예를 들어 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 피페리딘, 모르폴린 또는 트리스(2-히드록시에틸)아민과의 염이다.
본 발명은 또한 FGFR 억제 활성을 보유하는 하기 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물의 임의의 모든 호변이성체 형태에 관한 것이다. 예를 들어, 화학식 (IA)의 화합물은 화학식 (Ia)의 화합물의 호변이성체이다.
Figure pct00004
Figure pct00005
예를 들어, 화학식 (IB)의 화합물은 화학식 (Ib)의 화합물의 호변이성체이다.
Figure pct00006
화학식 (Ia) 및 (Ib)의 특정 화합물은 용매화된 형태뿐 아니라, 비용매화된 형태, 예를 들어 수화된 형태로 존재할 수 있음을 또한 이해해야 한다. 본 발명은 또한 FGFR 억제 활성을 보유하는 모든 용매화된 형태를 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명의 추가의 측면에서, 본 발명의 특정 화합물은 실시예들 중의 임의의 한 화합물 또는 이의 임의의 한 화합물의 약학적으로 허용되는 염이다.
본 발명은 또한 하기 화학식 (IIa) 또는 (IIb)의 화합물을 하기 화학식 (III)의 화합물과 반응시켜 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물을 형성하는 단계를 포함하고, 경우에 따라 하기 중 하나 이상을 실시하는 단계:
· 얻어진 화합물을 본 발명의 화합물로 전환시키는 것,
· 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 형성하는 것
을 포함하는 본원에 개시된 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 제조 방법을 제공한다.
Figure pct00007
또는
Figure pct00008
상기 식에서, Z는 이탈기(예, 할로겐, 예컨대 염소, -CN, -N3, -OH 또는 -OR, -OC(O)R, -OCR(NRaRb)2 또는 -OC(=NR)NRaRb 기이고, 이 때 R은 임의 치환된 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 알카릴이고, 각 Ra, Rb는 독립적으로 수소 또는 임의 치환된 알킬, 아릴 또는 알카릴임)를 나타낸다.
Figure pct00009
상기 식에서, Q는 수소 또는 보호기(예, t-Bu 또는 BOC 기 또는 문헌['Protective Groups in Organic Synthesis', 2nd edition, T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Wiley-Interscience (1991)]에 개시된 바와 같음)이다.
화학식 (IIa) 또는 (IIb)의 적절한 화합물은 카르복실산 또는 카르복실산의 반응성 유도체를 포함한다. 카르복실산 또는 카르복실산의 반응성 유도체는 아실 할라이드, 예컨대 산과 무기산 클로라이드, 예컨대 티오닐 클로라이드의 반응으로 형성한 아실 클로라이드; 혼합 무수물, 예컨대 산과 클로로포르메이트, 예컨대 이소부틸 클로로포르메이트의 반응으로 형성된 무수물; 활성 에스테르, 예컨대 카르복실산과 펜타플루오로페놀 등의 페놀, 펜타플루오로페놀 트리플루오로아세테이트 등의 에스테르, 또는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올 또는 N-히드록시벤조트리아졸 등의 알콜의 반응으로 형성된 에스테르; 아실 아지드, 예를 들어 산과 아지드, 예컨대 디페닐포스포릴 아지드의 반응으로 형성된 아지드; 아실 시아니드, 예를 들어 산과 시아니드, 예컨대 디에틸포스포릴 시아니드의 반응으로 형성된 시아니드; 또는 산과 카르보디이미드, 예컨대 디시클로헥실카르보디이미드, 또는 우로늄 화합물, 예컨대 2-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(V)의 반응의 생성물을 포함한다.
이 반응은 통상적으로 적절한 비활성 용매 또는 희석제, 예를 들어 할로겐화된 용매, 예컨대 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 또는 사염화탄소, 알콜 또는 에스테르, 예컨대 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 에틸 아세테이트, 에테르, 예컨대 테트라히드로푸란 또는 1,4-디옥산, 방향족 용매, 예컨대 톨루엔의 존재 하에 실시할 수 있다. 이 반응은 또한 양극성 비양성자성 용매, 예컨대 N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리딘-2-온 또는 디메틸설폭시드의 존재 하에 실시할 수 있다. 이 반응은, 실시되는 반응과 이탈기 Z의 성질에 따라서, 예를 들어 -20℃ 내지 100℃, 바람직하게는 0℃ 내지 상온의 온도 범위에서 편리하게 실시한다.
이 반응은 통상적으로 염기의 존재하에 실시할 수 있다. 적절한 염기는 실시되는 반응과 이탈기 Z의 성질에 따라서, 유기 아민 염기, 예컨대 피리딘, 2,6-루티딘, N,N-디이소프로필아민, 콜리딘, 4-디메틸아미노피리딘, 트리에틸아민, 모르폴린, N-메틸모르폴린 또는 디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔, 알칼리 또는 알칼리토 금속 탄산염 또는 수산화물, 예컨대 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산칼슘, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨, 알칼리 금속 아미드, 예컨대 나트륨 헥사메틸디실라지드(NaHMDS), 또는 알칼리 금속 수소화물, 예컨대 수소화나트륨을 포함한다.
또한 이 반응은, 실시되는 반응과 이탈기 Z의 성질에 따라서, 루이스산, 예컨대 트리메틸암모늄의 존재 하에 실시할 수 있다.
화학식 (IIa), (IIb) 또는 (III)의 화합물은 시판되거나, 문헌에 공지되어 있거나, 또는 공지의 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
Z가 할로겐 또는 -OR인 화학식 (II)의 화합물은 문헌에 공지된 방법에 의해, Z가 -OH인 화학식 (II)의 화합물로부터 제조할 수 있다. 예를 들어, 카르복실산으로부터 산 클로라이드 또는 에스테르의 제조를 위해 공지된 방법을 이용할 수 있다.
Z가 -OR인 화학식 (II)의 화합물은, 2-메틸피페라진을 4-플루오로벤조에이트 에스테르와 반응시켜 4-(3-메틸피페라지닐)벤조에이트의 에스테르를 형성한 다음, N-메틸화하여 제조할 수 있다.
화학식 (III)의 화합물은 하기 화학식 (IV)의 화합물을 화학식 (V)의 히드라진과 반응시켜 제조할 수 있다.
[화학식 IV]
Figure pct00010
[화학식 V]
Figure pct00011
반응은 에탄올과 같은 용매 중에서 60 내지 80℃의 온도 범위에서 편리하게 실시할 수 있다.
화학식 (IV) 및 (V)의 화합물은 시판되거나, 문헌에 공지되어 있거나, 또는 당업계에 공지된 표준 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서 출발 반응물 또는 중간체 화합물의 히드록실 또는 아미노기와 같은 일부 작용기를 보호기로 보호해야 할 수도 있음을 당업자는 알 것이다. 따라서, 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물의 제조는 각종 단계에서 하나 이상의 보호기의 첨가 및 제거를 포함할 수 있다.
보호기의 보호 및 탈보호는 문헌['Protective Groups in Organic Chemistry', edited by J.W.F. McOmie, Plenum Press (1973) 및 'Protective Groups in Organic Synthesis', 2nd edition, T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Wiley-Interscience (1991)]에 개시되어 있다.
상기 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물을 약학적으로 허용되는 염, 예컨대 산 부가염, 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트, 아세테이트, 푸마레이트, 말레에이트, 타르타레이트, 시트레이트, 옥살레이트, 메탄설포네이트 또는 p-톨루엔설포네이트, 또는 알칼리 금속염, 예컨대 나트륨 또는 칼륨 염으로 전환시킬 수 있다.
호변이성체 및 이의 혼합물의 용도는 또한 본 발명의 일측면을 형성한다.
화학식 (Ib)의 화합물은 하나 이상의 결정형으로 존재할 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 화학식 (Ib)의 화합물은 A형이라고 하는 결정형으로 존재한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 화학식 (Ib)의 화합물이 결정형으로 존재하는 본원에 정의된 바와 같은 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 실질적으로 결정형 A형의 화학식 (Ib)의 화합물을 포함하는 본원에 정의된 바와 같은 약학 조성물이 제공된다.
실질적으로 결정형 A형이란 95% 이상이 A형으로 존재하는 것을 의미한다. 특히, A형이 96% 이상 존재한다. 특히, A형이 97% 이상 존재한다. 특히, A형이 98% 이상 존재한다. 특히, A형이 99% 이상 존재한다. 특히, A형이 99.5% 이상 존재한다. 특히, A형이 99.8% 이상 존재한다.
일 구체예에서, 2-쎄타(λ=1.5418Å)에서 피크 5.288, 17.935, 18.011, 20.513 및 20.753을 포함하는 XRD 패턴을 가지는 화학식 (Ib)의 화합물의 결정형이 제공된다.
추가의 구체예에서, 2-쎄타(λ=1.5418Å)에서 5.288, 17.935, 18.011, 18.766, 19.628, 19.667, 20.513, 20.753 및 23.892를 포함하는 XRD 패턴을 가지는 화학식 (Ib)의 화합물의 결정형이 제공된다.
추가의 구체예에서, 2-쎄타(λ=1.5418Å)에서 5.288, 17.761, 17.935, 18.011, 18.766, 19.094, 19.628, 19.667, 20.513, 20.753, 22.264 및 23.892를 포함하는 XRD 패턴을 가지는 화학식 (Ib)의 화합물의 결정형이 제공된다.
추가의 구체예에서, 2-쎄타(λ=1.5418Å)에서 5.288, 10.483, 11.388, 11.912, 14.086, 15.671, 16.322, 17.761, 17.935, 18.011, 18.766, 19.094, 19.628, 19.667, 20.513, 20.753, 21.765, 22.264, 22.766, 22.793 및 23.892를 포함하는 XRD 패턴을 가지는 화학식 (Ib)의 화합물의 결정형이 제공된다.
추가의 구체예에서, 2-쎄타(λ=1.5418Å)에서 3.642, 4.357, 5.288, 7.226, 9.062, 9.482, 10.483, 11.388, 11.85, 11.912, 13.078, 14.086, 14.559, 15.671, 16.156, 16.179, 16.322, 17.761, 17.935, 18.011, 18.766, 19.094, 19.628, 19.667, 20.513, 20.753, 21.765, 22.264, 22.766, 22.793, 23.892, 26.257 및 36.269를 포함하는 XRD 패턴을 가지는 화학식 (Ib)의 화합물의 결정형이 제공된다.
당업자는 본원에 제시된 회절 패턴 데이타가 절대적인 것으로 해석되지 않음을 이해할 것이다(추가의 정보를 위해서는 문헌[Jenkins, R & Snyder, R.L. 'Introduction to X-Ray Powder Diffractometry' John Wiley & Sons, 1996] 참조). 따라서, 결정형은 본원에 개시된 X-선 분말 회절 패턴과 동일한 X-선 분말 회절 패턴을 제공하는 결정에 한정되는 것은 아님을 이해해야 한다. 본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 실질적으로 동일한 X-선 분말 회절 패턴을 제공하는 임의의 결정을 포함한다. X-선 분말 회절 분야의 당업자는 X-선 분말 회절 패턴의 실질적 유사성을 판단할 수 있고, 차이가 각종 인자, 예를 들어 측정 조건(예, 장비, 샘플 제조 또는 사용된 기기)으로부터 생긴 측정 오차; 측정 조건 및 샘플 제조로부터 생긴 강도 편차; 결정의 크기 또는 비일원화 종횡비의 편차로 생긴 피크의 상대적 강도 편차; 및 회절계에서 샘플이 위치하는 정확한 높이, 회절계의 제로 검정과 샘플의 표면 평탄도에 의해 영향을 받을 수 있는 반사 위치의 결과일 수 있음을 이해할 것이다.
화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물은 약제, 특히 FGFR 활성의 조절제 또는 억제제로서 활성을 가지며, 증식성 및 과증식성 질환/병태의 치료에 사용될 수 있고, 이의 예로는 하기의 암들을 포함한다:
(1) 방광암, 뇌암, 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위암, 자궁경부암, 대장암, 갑상선암 및 피부암을 포함하는 암;
(2) 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종 및 버킷 림프종을 포함하는, 림프계의 혈액 종양;
(3) 급성 및 만성 골수구성 백혈병 및 전골수구성 백혈병을 포함하는 골수계의 혈액 종양;
(4) 섬유육종 및 횡문근육종을 포함하는, 간엽 기원 종양; 및
(5) 흑색종, 정상피종, 기형암종, 신경아세포종 및 신경교종을 포함하는 다른 종양.
일 구체예에서, 본 발명의 화합물은 방광, 유방 및 전립선의 종양 및 다발성 골수종의 치료에 유용하다.
따라서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 요법에 의해 인체 또는 동물체의 치료 방법에 사용하기 위한 하기 정의된 바와 같은 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.
본 명세서에 있어서, 용어 "치료"는 특별히 반대의 지시가 없는한 "예방"도 포함한다. 용어 "치료적" 및 "치료적으로"도 이에 따라 해석되어야 한다.
본 발명은 또한 암 치료가 필요한 환자에게 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
본 발명자들은 본 발명에 정의된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 효과적인 항암제로서, 이 성질은 FGFR 활성의 조절 또는 억제로부터 생기는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 화합물은 FGFR에 의해 단독으로 또는 부분적으로 매개되는 질병 또는 의학 증상의 치료에 유용할 것으로 기대된다. 즉, 이 화합물을, 그러한 치료가 필요한 온혈 동물에서 FGFR 억제 효과를 생성하는데 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 화합물은 FGFR의 억제를 특징으로 하는 암 치료 방법을 제공한다. 즉, 이 화합물을, FGFR 억제에 의해 단독으로 또는 부분적으로 매개되는 항암 효과를 생성하는데 사용할 수 있다.
FGFR의 활성화 돌연변이가 비제한적인 예로서 유방암, 방광암, 전립선암 및 다발성 골수종을 포함하는 여러 인간 암에서 관찰되기 때문에, 본 발명의 상기 화합물은 광범위한 항암성을 보유할 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 화합물은 이들 암에 대한 항암 활성을 보유할 것으로 예상된다. 또한, 본 발명의 화합물은 간, 신장, 방광, 전립선, 유방 및 췌장과 같은 조직에서 암종 및 육종과 같은 고형 종양, 림프구성 악성종양 및 백혈병에 대해 활성을 보유할 것으로 예상된다. 일 구체예에서, 본 발명의 화합물은, 예를 들어 피부, 결장, 갑상선, 폐 및 난소의 원발성 및 재발성 고형 종양의 성장을 유리하게 지연시킬 것으로 예상된다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은, 예를 들어 방광, 전립선, 유방의 일부 종양 및 다발성 골수종을 포함하는 FGFR과 관련된 종양, 특히 그 성장 및 확산을 위해 FGFR에 유의적으로 의존하는 종양의 성장을 억제할 것으로 예상된다.
따라서, 본 발명의 이 측면에 따르면, 의약으로서 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 인간과 같은 온혈 동물에서 FGFR 억제 효과의 생성에 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도가 제공된다.
본 발명의 이 측면에 따르면, 인간과 같은 온혈 동물에서 항암 효과의 생성에 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도가 제공된다.
본 발명의 추가의 특징에 따르면, 흑색종, 유두상 갑상선 종양, 담관암종, 결장암, 난소암, 폐암, 백혈병, 림프구 악성종양, 다발성 골수종, 간, 신장, 방광, 전립선, 유방 및 췌장의 암종 및 육종, 피부, 결장, 갑상선, 폐 및 난소의 원발성 및 재발성 고형 종양의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도가 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 인간과 같은 온혈 동물에서 FGFR 억제 효과의 생성에 있어서 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도가 제공된다.
본 발명의 이 측면에 따르면, 인간과 같은 온혈 동물에서 항암 효과의 생성에 있어서 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도가 제공된다.
본 발명의 추가의 특징에 따르면, 흑색종, 유두상 갑상선 종양, 담관암종, 결장암, 난소암, 폐암, 백혈병, 림프구 악성종양, 다발성 골수종, 간, 신장, 방광, 전립선, 유방 및 췌장의 암종 및 육종, 피부, 결장, 갑상선, 폐 및 난소의 원발성 및 재발성 고형 종양의 치료에 있어서 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도가 제공된다.
본 발명의 이 측면의 추가의 특징에 따르면, FGFR 억제 효과 생성의 치료가 필요한 인간과 같은 온혈 동물에서 FGFR 억제 효과를 생성하는 방법으로서, 상기 동물에게 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 이 측면의 추가의 특징에 따르면, 항암 치료가 필요한 인간과 같은 온혈 동물에서 항암 효과를 생성하는 방법으로서, 상기 동물에게 상기 정의된 바와 같은 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 생성 방법이 제공된다.
본 발명의 이 측면의 추가의 특징에 따르면, 흑색종, 유두상 갑상선 종양, 담관암종, 결장암, 난소암, 폐암, 백혈병, 림프구 악성종양, 다발성 골수종, 간, 신장, 방광, 전립선, 유방 및 췌장의 암종 및 육종, 피부, 결장, 갑상선, 폐 및 난소의 원발성 및 재발성 고형 종양을, 이의 치료를 필요로 하는 인간과 같은 온혈 동물에서 치료하는 방법으로서, 상기 동물에게 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에서, 인간과 같은 온혈 동물에서 FGFR 억제 효과의 생성에 사용하기 위한, 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에서, 인간과 같은 온혈 동물에서 항암 효과의 생성에 사용하기 위한, 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에서, 흑색종, 유두상 갑상선 종양, 담관암종, 결장암, 난소암, 폐암, 백혈병, 림프구 악성종양, 다발성 골수종, 간, 신장, 방광, 전립선, 유방 및 췌장의 암종 및 육종, 피부, 결장, 갑상선, 폐 및 난소의 원발성 및 재발성 고형 종양의 치료에 사용하기 위한, 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 및 이의 약학적으로 허용되는 염은 그 자체로 사용될 수 있으나, 일반적으로 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 염(활성 성분)이 약학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체와 함께 존재하는 약학 조성물의 형태로 투여된다. 투여 방식에 따라서, 약학 조성물은 총 조성물의 중량을 기준으로, 활성 성분을 0.01 내지 90 중량%, 0.05 내지 80 중량%, 0.10 내지 70 중량%, 심지어 0.10 내지 50 중량% 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을, 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을, 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 혼합하는 단계를 포함하는 본 발명의 약학 조성물의 제조 방법을 제공한다.
약학 조성물은, 예컨대 크림, 용액, 현탁액, 헵타플루오로알칸 에어로졸 및 건조 분말 조제물의 형태로 국소(예컨대, 피부에, 또는 폐 및/또는 기도로) 투여되거나; 또는 예를 들어 정제, 캡슐, 시럽, 분말 또는 과립의 형태로 경구 투여에 의해; 또는 용액 또는 현탁액의 형태로 비경구 투여에 의해; 또는 피하 투여에 의해; 또는 좌약의 형태의 직장 투여에 의해; 또는 경피 투여에 의해 전신 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된, 통상적인 약학 부형제를 사용한 통상적인 절차로 얻을 수 있다. 따라서, 경구용 조성물은 예를 들어 하나 이상의 착색제, 감미제, 착향제 및/또는 보존제를 포함할 수 있다.
정제 조제물을 위한 적절한 약학적으로 허용되는 부형제는, 예를 들어 락토스, 탄산나트륨, 인산칼슘 또는 탄산칼슘과 같은 비활성 희석제, 옥수수 전분 또는 알긴산과 같은 과립화제 및 붕해제; 전분과 같은 결합제; 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 활석과 같은 윤활제; 에틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트와 같은 보존제, 및 아스코르브산과 같은 항산화제를 포함한다. 정제 제형은 위장관 내의 활성 성분의 붕해 및 후속 흡수를 변형시키거나, 또는 안정성 및/또는 외관을 개선시키기 위해서 비코팅 또는 코팅할 수 있으며, 어느 경우에나 당업자에게 공지된 통상의 코팅제 및 절차를 사용할 수 있다.
경구 사용을 위한 조성물은, 활성 성분을 예를 들어 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린 등의 비활성 고체 희석제와 혼합한 경질 젤라틴 캡슐 형태로, 또는 활성 성분을 땅콩유, 액상 파라핀 또는 올리브유와 같은 오일 또는 물과 혼합한 연질 젤라틴 캡슐로서 사용할 수 있다.
수성 현탁액은 일반적으로 하나 이상의 현탁제, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 검 트라가칸스 및 검 아카시아; 분산제 또는 습윤제, 예컨대 레시틴 또는 알킬렌 옥시드와 지방산의 축합물(예, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 또는 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방 알콜의 축합물, 예컨대 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 또는 헥시톨 및 지방산으로부터 유도된 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레이트, 또는 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예를 들어 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레이트와 함께, 미분 형태로 활성 성분을 함유한다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제(예컨대 에틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트), 항산화제(예컨대 아스코르브산), 착색제, 착향제 및/또는 감미제(예컨대 수크로스, 사카린 또는 아스파탐)를 포함할 수 있다.
유성 현탁액은 활성 성분을 식물성유(예, 아라키스유, 올리브유, 참깨유 또는 코코넛유) 또는 미네랄유(예컨대 액상 파라핀)에 현탁시켜 제제화할 수 있다. 유성 현탁액은 또한 밀납, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜과 같은 증점제를 포함할 수 있다. 상기 개시된 바와 같은 감미제, 및 착향제를 첨가하여 입맛에 맞는 경구 제제를 제공할 수 있다. 아스코르브산과 같은 항산화제를 첨가하여 이들 조성물을 보존할 수 있다.
물을 첨가하여 수성 현탁액을 제조하기에 적합한 분산성 분말 및 과립은 일반적으로 분산제 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 이상의 보존제와 함께 활성 성분을 포함한다. 적절한 분산제 또는 습윤제와 현탁제로는 상기 이미 언급한 것을 예로 들 수 있다. 감미제, 착향제 및 착색제와 같은 추가의 부형제가 또한 존재할 수 있다.
또한 본 발명의 약학 조성물은 수중유 에멀션 형태로 존재할 수 있다. 유상은 올리브유 또는 아라키스유와 같은 식물성유, 또는 예를 들어 액상 파라핀과 같은 미네랄유, 또는 이들 중 임의의 것의 혼합물일 수 있다. 적절한 유화제는, 예를 들어 자연 발생 검, 예컨대 검 아카시아 또는 검 트라가칸스, 자연 발생 포스파티드, 예컨대 대두, 레시틴, 지방산과 헥시톨 무수물로부터 유도된 에스테르 또는 부분 에스테르(예를 들어, 소르비탄 모노올레이트) 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트와 같은 상기 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물일 수 있다. 에멸션은 또한 감미제, 착향제 및 보존제를 포함할 수 있다.
시럽 및 엘릭시르는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 아스파탐 또는 수크로스와 같은 감미제와 함께 제제화할 수 있으며, 완화제(demulcent), 보존제, 착향제 및/또는 착색제를 또한 포함할 수 있다.
약학 조성물은 또한 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 형태로 존재할 수 있으며, 상기 언급한 하나 이상의 적절한 분산제 또는 습윤제와 현탁제를 사용하여 공지된 절차에 따라서 제제화할 수 있다. 멸균 주사용 제제는 비경구적으로 허용되는 비독성 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사성 용액 또는 현탁액, 예를 들어 1,3-부탄디올 중의 용액일 수 있다.
좌약 제제는, 보통의 온도에서는 고체이지만 직장 온도에는 액체여서, 직장에서 용해되어 약물을 방출하는 적절한 비자극성 부형제와 활성 성분을 혼합하여 제조할 수 있다. 적절한 부형제는, 예를 들어 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
크림, 연과, 겔 및 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액과 같은 국소 제제는, 일반적으로 당업계에 공지된 통상의 절차를 이용하여 활성 성분을 국소적으로 허용되는 통상의 비히클 또는 희석제와 제제화하여 얻을 수 있다.
통기 투여용 조성물은 평균 직경이, 예를 들어 30 μ 또는 휠씬 작은 입자를 포함하는 미분 분말 형태로 존재할 수 있으며, 분말 자체는 활성 성분을 단독으로 포함하거나, 또는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 예컨대 락토스로 희석시켜 포함할 수 있다. 그 다음 통기용 분말을, 기존의 제제인 나트륨 크로모글리케이트의 통기을 위해 사용되는 것과 같은, 흡입 장치(turbo-inhaler)와 함께 사용하기 위해 통상적으로 활성 성분을, 예를 들어 1 내지 50 mg 함유하는 캡슐 중에 보유한다.
흡입 투여용 조성물은 미분 고체 또는 액적을 함유하는 에어로졸로서, 활성 성분을 분배시키도록 되어 있는 통상의 가압 에어로졸의 형태로 존재할 수 있다. 휘발성 플루오르화 탄화수소 또는 탄화수소와 같은 통상의 에어로졸 추진체를 사용할 수 있으며, 에어로졸 장치는 통상적으로 활성 성분의 계량된 양을 분배시키도록 되어 있다.
제제에 대한 추가의 정보를 위해서는 문헌[Comprehensive Medicinal Chemistry(Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board) 5권 25.2장, Pergamon Press 1990]을 참조한다.
본 발명의 화합물의 치료 목적을 위한 용량 크기는 기존의 잘 알려진 의약 원리에 따라서, 병태의 특성 및 경중, 동물 또는 환자의 연령 및 성별 및 투여 경로에 따라서 자연적으로 달라질 것이다.
일반적으로, 예를 들어 체중 1 kg당 활성 성분 0.1 mg 내지 1000 mg 범위의 일일 용량을, 필요에 따라 분할 용량으로, 제공받도록 본 발명의 화합물을 투여한다. 그러나, 일일 용량은 치료할 숙주, 특정 투여 경로, 및 치료할 질병의 경중에 따라서 불가피하게 달라질 것이다. 따라서, 최적 용량은 어떤 특정 환자를 치료하는 전문의가 결정할 수 있다. 일반적으로, 비경구 경로를 이용하는 경우에 낮은 용량이 투여된다. 따라서, 예를 들어 정맥내 투여의 경우, 예를 들어 체중 1 kg당 활성 성분 0.1 mg 내지 30 mg 범위의 용량이 일반적으로 사용된다. 유사하게, 흡입 투여의 경우, 예를 들어 체중 1 kg당 활성 성분 0.1 mg 내지 25 mg 범위의 용량이 일반적으로 사용된다. 그러나, 경구 투여가 바람직하다. 예를 들어, 인간에게 경구 투여하기 위한 제제는 일반적으로 예컨대 활성 성분을 0.1 mg 내지 2 g 포함한다.
투여 경로 및 용법에 대한 추가의 정보에 대해서는 문헌[Comprehensive Medicinal Chemistry(Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board) 5권 25.3장, Pergamon Press 1990]을 참조한다.
이하 개시된 항암 치료를 단독 요법으로서 적용하거나, 또는 본 발명의 화합물 이외에 통상적인 수술 또는 방사선요법 또는 화학요법을 포함할 수 있다. 상기 화학요법은 다음 카테고리의 하기 항암제 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
(i) 의학 종양학에 사용되는 다른 항증식성/항신생물성 약물 및 이의 조합물, 예컨대 알킬화제(예, 시스 플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 시클로포스파미드, 질소 머스타드, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 테모졸아미드 및 니트로소우레아); 대사길항물질(예, 젬시타빈 및 항엽산제, 예컨대 플루오로피리미딘, 예컨대 5-플루오로우라실 및 테가푸르, 랄티트렉세드, 메토트렉세이트, 시토신 아라비노시드 및 히드록시우레아); 항종양 항생제(예, 안트라사이클린, 예컨대 아드리아마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신-C, 닥티노마이신 및 미트라마이신); 항유사분열제(예, 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈 및 탁소이드, 예컨대 탁솔 및 탁소테레, 및 폴로키나제 억제제); 및 토포이소머라제 억제제(예, 에피포도필로톡신, 예컨대 에토포시드 및 테니포시드, 암사크린, 토포테칸 및 캄포테신);
(ii) 세포증식 억제제, 예컨대 항에스트로겐(예, 타목시펜, 풀베스트란트, 토레미펜, 랄록시펜, 드롤록시펜 및 요오독시펜), 항안드로겐(예, 비칼루타마이드, 플루타마이드, 닐루타마이드 및 시프로테론 아세테이트), LHRH 길항제 또는 LHRH 작동제(예, 고세렐린, 루프로렐린 및 부세렐린), 프로게스토겐(예, 메게스토롤 아세테이트), 아로마타제 억제제(예, 아나스트로졸, 레트로졸, 보라졸 및 엑세메스탄) 및
5*-리덕타제의 억제제, 예컨대 피나스테라이드;
(iii) 항침윤제(예, c-Src 키나제 패밀리 억제제, 예컨대 4-(6-클로로-2,3-메틸렌디옥시아닐리노)-7-[2-(4-메틸피페라진-1-일)에톡시]-5-테트라하이드로피란-4-일옥시퀴나졸린(AZD0530; 국제 특허 출원 WO 01/94341) 및 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-{6-[4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일]-2-메틸피리미딘-4-일아미노}티아졸-5-카르복사미드(다사티닙, BMS-354825; J. Med. Chem., 2004, 47, 6658-6661, 및 메탈로프로테인아제 억제제, 예컨대 마리마스타트 및 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체 기능의 억제제 또는 헤파라나제에 대한 항체);
(iv) 성장 인자 기능의 억제제: 예를 들어, 상기 억제제는 성장 인자 항체 및 성장 인자 수용체 항체를 포함함(예, 항-erbB2 항체 트라스트즈맙[HerceptinTM], 항-EGFR 항체 파니투무맙, 항-erbB1 항체 세툭시맙[Erbitux, C225] 및 문헌[Stern et al. Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol. 54, pp11-29]에 개시된 임의의 성장 인자 또는 성장 인자 수용체 항체); 상기 억제제는 또한 티로신 키나제 억제제, 예를 들어 표피세포 성장 인자 패밀리의 억제제(예, EGFR 패밀리 티로신 키나제 억제제, 예컨대 N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린-4-아민(제피티닙, ZD1839), N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민(에를로티닙 OSI 774) 및 6-아크릴아미도-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-(3-모르폴리노프로폭시)-퀴나졸린-4-아민(CI 1033), erbB2 티로신 키나제 억제제, 예컨대 라파티닙, 간세포 성장 인자 패밀리의 억제제, 혈소판 유래 성장 인자 패밀리의 억제제, 예컨대 이마티닙, 세린/트레오닌 키나제의 억제제(예, Ras/Raf 신호전달 억제제, 예컨대 파르네실 전이효소 억제제, 예컨대 소라페닙(BAY 43-9006)), MEK 및/또는 AKT 키나제를 통한 세포 신호전달의 억제제, 간세포 성장 인자 패밀리의 억제제, c-kit 억제제, abl 억제제, IGF 수용체(인슐린 유사 성장 인자) 키나제 억제제; 오로라 키나제 억제제(예를 들어, AZD1152, PH739358, VX-680, MLN8054, R763, MP235, MP529, VX-528 및 AX39459), 및 사이클린 의존성 키나제 억제제, 예컨대 CDK2 및/또는 CDK4 억제제를 포함함;
(v) 항신생혈관형성제, 예컨대 혈관 내피세포 성장 인자의 효과를 억제하는 제제[예, 항-혈관 내피 세포 성장 인자 항체 베바시주맙(AvastinTM), 및 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제, 예컨대 4-(4-브로모-2-플루오로아닐린)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린(ZD6474; WO 01/32651의 실시예 2), 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피롤리딘-1-일프로폭시)퀴나졸린(AZD2171; WO 00/47212의 실시예 240), 바탈라닙(PTK787; WO 98/35985), 및 SU11248(수니티닙; WO 01/60814), 국제 특허 출원 WO97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 및 WO 98/13354에 개시된 바와 같은 화합물 및 다른 기전에 의해 작용하는 화합물(예, 리노마이드, 인테그린 avb3 기능의 억제제 및 안지오스타틴)];
(vi) 혈관 손상제, 예컨대 콤브레타스타틴 A4; 및 국제 특허 출원 WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 및 WO 02/08213에 개시된 화합물;
(vii) 안티센스 요법, 예를 들어 ISIS 2503, 항-ras 안티센스와 같은, 상기 제시한 표적에 대한 안티센스 요법
(viii) 유전자 치료법, 예를 들어 비정상 p53 또는 비정상 BRCA1 또는 BRCA2와 같은 비정상 유전자를 치환하기 위한 방법, GDEPT(유전자 유도 효소 프로드러그 요법) 방법, 예컨대 시토신 데아미나제, 티미딘 키나제 또는 박테리아성 니트로리덕타제 효소를 이용하는 방법 및 다제 내성 유전자 요법과 같은 화학요법 또는 방사선요법에 대한 환자의 내성을 증가시키는 방법을 포함하는 유전자 치료법; 및
(ix) 면역치료법, 예를 들어 환자 종양 세포의 면역원성을 증가시키기 위한 생체외 및 생체내 방법, 예컨대 인터루킨 2, 인터루킨 4 또는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자와 같은 사이토카인을 사용한 형질감염, T-세포 아네르기를 감소시키는 방법, 사이토카인 형질감염 수지상 세포와 같은 형질감염된 면역 세포를 사용하는 방법, 사이토카인 형질감염 종양 세포주를 사용하는 방법 및 항-이디오타입 항체를 사용하는 방법을 포함하는 면역치료법.
실시예
이하, 하기 예시적인 실시예를 참조하여 본 발명을 추가로 설명하며, 달리 언급된 바 없다면 이하와 같다:
(i) 온도는 섭씨(℃)로 제시하고; 조작은 실온 또는 상온, 즉 18∼25℃ 범위의 온도에서 실시하였으며;
(ii) 유기 용액을 무수 황산마그네슘으로 건조시켰고; 용매의 증발은 감압(600∼4000 파스칼; 4.5∼30 mmHg) 하에 최대 60℃의 수조 온도에서 회전식 증발기를 사용하여 실시하였으며;
(iii) 크로마토그래피는 실리카 겔 상에서의 플래쉬 크로마토그래피를 의미하며; 박막 크로마토그래피(TLC)는 실리카겔 플레이트 상에서 실시하였으며;
(iv) 일반적으로, 반응 과정은 TLC로 추적하였고 반응 시간은 단지 예로서 나타낸 것이며;
(v) 최종 생성물은 충분한 양성자 핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼 및/또는 질량 스펙트럼 데이타를 가지며;
(v) 수율은 단지 예로서 제시된 것이며, 반드시 부단한 공정 개발에 의해서 얻을 수 있는 것은 아니며; 더 많은 물질이 필요하다면 제조를 반복하였고;
(vi) NMR 데이터는 제공될 경우 주요 진단 양성자에 대한 델타값의 형태로서, 달리 언급하지 않는 한 DMSO-d6에서 300 MHz에서 측정시, 내부 표준물로서 테트라메틸실란(TMS)에 대한 ppm으로 주어지며;
(viii) 화학 기호는 통상적인 의미를 가지며; SI 단위 및 기호가 사용되고;
(ix) 용매비는 부피:부피(v/v) 관계로 제시되며;
(x) 질량 스펙트럼(MS) 데이타는 LC/MS 시스템에서 생성하였으며, 여기서 HPLC 부품은 일반적으로 Agilent 1100 또는 Waters Alliance HT (2790 & 2795) 장비를 포함하며, 산성 용리제(예를 들어, 50:50 물:아세토니트릴(v/v) 혼합물 중 1% 포름산 5%를 포함하는 0-95% 물/아세토니트릴의 구배를 이용하거나; 또는 아세토니트릴 대신에 메탄올을 포함하는 등가의 용매계를 사용) 또는 염기성 용리제(예를 들어, 아세토니트릴 혼합물 중 0.1% 880 암모니아 5%를 포함하는 0-95% 물/아세토니트릴의 구배를 이용)로 용리시켜 Phemonenex Gemini C18 5 ㎛, 50 x 2 mm 컬럼(또는 유사한 컬럼)에서 작동시켰으며; MS 부품은 일반적으로 Waters ZQ 분광기를 포함한다. 정전 분무(ESI) 양성 및 음성 베이스 피크 강도에 대한 크로마토그램, 및 220-300 nm의 UV 총 흡수 크로마토그램을 형성하였으며, m/z에 대한 값을 제시하였으며; 일반적으로 모질량을 나타내는 이온만을 보고하고, 달리 언급된 바 없다면 인용된 값은 양이온 모드에 대해서는 (M+H)+이고 음이온 모드에 대해서는 (M-H)-이며;
(xi) 분취용 HPLC는, 용리제로서 감소하는 극성 혼합물, 예를 들어 아세토니트릴과 물(1% 아세트산 또는 1% 수성 수산화암모늄(d=0.88))의 감소하는 극성 혼합물을 사용하여, C18 역상 실리카, 예를 들어 Waters 'Xterra' 분취용 역상 컬럼(5 마이크론 실리카, 19 mm 직경, 100 mm 길이)에서 실시하였으며;
(xii) 하기의 약어가 사용되었다:
THF 테트라히드로푸란;
DMF N,N-디메틸포름아미드;
EtOAc 에틸 아세테이트;
DCM 디클로로메탄; 및
DMSO 디메틸설폭시드
DIPEA N,N-디이소프로필에틸아민
(N-에틸-N-프로판-2-일-프로판-2-아민으로도 알려져 있음)
PBS 인산염 완충 염수
HEPES N-[2-히드록시에틸]피페라진-N'-[2-에탄설폰산]
DTT 디티오트레이톨
ATP 아데노신 트리포스페이트
BSA 소 혈청 알부민
DMEM 듈베코 변형 이글 배지
MOPS 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산
(xiii) 화합물은 IUPAC 명명 규약을 이용하는 전유물 명명 소프트웨어: Openeye Lexichem version 1.4를 사용하여 명명하며;
(xiv) 달리 특정된 바 없다면, 출발 물질은 시판되는 것이다.
실시예 1(a) (S)-N-(3-(3,5-디메톡시펜에틸)-1H-피라졸-5-일)-4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)벤즈아미드의 제조
Figure pct00012
트리메틸알루미늄(톨루엔 중 2M, 1.93 ml, 3.87 mmol)을 25℃에서 톨루엔(10 ml) 중 3-(3,5-디메톡시펜에틸)-1H-피라졸-5-아민(382 mg, 1.55 mmol) 및 (S)-메틸 4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)벤조에이트(384 mg, 1.55 mmol)의 현탁액에 적하하였다. 얻어진 용액을 18 시간 동안 60℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 메탄올(50 ml)에 붓고 2M 염산으로 산성화하였다. SCX 컬럼을 사용하여, 이온 교환 크로마토그래피로 미정제 생성물을 정제하였다. 7M 메탄올성 암모니아를 사용하여 컬럼으로부터 목적하는 생성물을 용리시키고 증발 건조시켜 순수하지 않은 생성물을 얻었다. 미정제 생성물은 1% 수성 암모니아 및 아세토니트릴의 감소하는 극성 혼합물을 용리제로서 사용하여 분취용 HPLC(Waters XTerra C18 컬럼, 5 μ 실리카, 30 mm 직경, 100 mm 길이)로 정제하였다. 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 증발 건조시켜 (S)-N-(3-(3,5-디메톡시펜에틸)-1H-피라졸-5-일)-4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)벤즈아미드(387 mg, 54%)를 백색 고체로서 얻었다.
Figure pct00013

(S)-메틸 4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)벤조에이트
Figure pct00014
나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드(2.25 g, 10.6 mmol)를, 25℃에서 메탄올(21 ml) 중 (S)-메틸 4-(3-메틸피페라진-1-일)벤조에이트(0.99 g, 4.24 mmol), 포름알데히드(37% 수용액 6.32 ml, 84.9 mmol) 및 아세트산(0.49 ml, 8.49 mmol)에 첨가하였다. 얻어진 용액을 18 시간 동안 질소 하에서 상온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 수성 NaHCO3 용액으로 염기화하고 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 EtOAc(200 ml)로 희석한 후, 포화 수성 NaHCO3 용액(200 ml)으로 세척하였다. 수성액을 EtOAc(2 x 75 ml)로 추가 추출하고, 합한 유기물을 물(200 ml) 및 포화 염수(200 ml)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4상에서 건조하고 여과하고 증발시켜 미정제 생성물을 얻었다. EtOAc/이소헥산(0:100에서부터 극성 증가시켜 100:0으로)으로 용리시킨, 플래쉬 실리카 크로마토그래피로 미정제 생성물을 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 (S)-메틸 4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)벤조에이트(0.538 g, 51%)를 백색 고체로서 얻었다.
Figure pct00015
(S)-메틸 4-(3-메틸피페라진-1-일)벤조에이트
Figure pct00016
메틸 4-플루오로벤조에이트(1.00 ml, 7.73 mmol)를 25℃에서 DMA(31 ml) 중 (S)-(+)-2-메틸피페라진(1.55 g, 15.5 mmol)에 첨가하였다. 얻어진 용액을 3일 동안 120℃에서 질소 하에서 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고 EtOAc (100 ml)로 희석한 후, 포화 NaHCO3 수용액(200 ml)으로 세척하였다. 수성액을 EtOAc(2 x 100 ml)로 추가 추출하고, 합한 유기물을 물(200 ml) 및 포화 염수(200 ml)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4상에서 건조하고 여과하고 증발시켜 목적하는 (S)-메틸 4-(3-메틸피페라진-1-일)벤조에이트(0.995 g, 55%)를 갈색 오일로서 얻었으며, 이는 정치시 결정화되었다. 이를, 추가의 정제 없이 직접 사용하였다.
Figure pct00017
3-(3,5-디메톡시펜에틸)-1H-피라졸-5-아민
Figure pct00018
사용된 출발 물질은 다음과 같이 제조하였다:
아세토니트릴(2.29 ml, 43.61 mmol, 1.2eq)을 무수 톨루엔(70 ml) 중 수소화나트륨(미네랄유 중 분산액 1.75g, 43.61 mmol, 1.2eq)의 슬러리에 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반하였다. 톨루엔(60 ml) 중 에틸 3-(3,5-디메톡시페닐)프로파노에이트(8.66g, 36.34 mmol, 1eq)를 첨가하고 반응물을 18 시간 동안 환류시켰다. 냉각한 후에, 반응 혼합물을 물로 켄칭하고, 용매를 감압하에 증발시켰다. 잔류물을 2 M HCl(50 ml) 중에 용해시켰다. 산성 용액을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 물, 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조하였다. 여과 후에, 용매를 감압 하에 증발시켜 미정제 생성물을 황색 오일로서 얻었다. 이 오일을 실리카 컬럼 크로마토그래피(DCM으로 용리)로 정제하고 목적하는 분획을 합하고 증발시켜 크림색 고체(3.76g, 44% 수율)를 얻었다.
에탄올(55 ml) 중 크림색 고체(3.72g, 15.96 mmol, 1eq)에 하이드라진 수화물(852 ㎕, 17.56 mmol, 1.1eq)을 첨가하였다. 냉각시키기 전에 반응물을 24시간 동안 환류시켰다. 감압 하에 증발시킨 후에, 잔류물을 DCM으로 추출하였다. 유기층을 물, 염수로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조하여, 여과하고, 감압 하에 증발시켜 3-(3,5-디메톡시펜에틸)-1H-피라졸-5-아민을 연황색 고체(두 단계에 걸쳐 3.76g. 42%)로서 얻었다.
Figure pct00019
실시예 1(b)(i) (R)-N-(3-(3,5-디메톡시펜에틸)-1H-피라졸-5-일)-4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)벤즈아미드의 제조
Figure pct00020
트리메틸알루미늄(톨루엔 중 2M, 2.44 ml, 4.88 mmol)을 25℃에서 톨루엔(10 ml) 중 3-(3,5-디메톡시펜에틸)-1H-피라졸-5-아민(483mg, 1.95 mmol) 및 (R)-메틸 4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)벤조에이트(485 mg, 1.95 mmol)의 현탁액에 적하하였다. 얻어진 용액을 18 시간 동안 60℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 메탄올(50 ml)에 붓고 2M 염산으로 산성화하였다. SCX 컬럼을 사용하여, 이온 교환 크로마토그래피로 미정제 생성물을 정제하였다. 7M 메탄올성 암모니아를 사용하여 컬럼으로부터 목적하는 생성물을 용리시키고 증발 건조시켜 순수하지 않은 생성물을 얻었다. 미정제 생성물은 1% 수성 암모니아 및 아세토니트릴의 감소하는 극성 혼합물을 용리제로서 사용하여 분취용 HPLC(Waters XTerra C18 컬럼, 5 μ 실리카, 30 mm 직경, 100 mm 길이)로 정제하였다. 목적하는 화합물을 함유하는 분획을 증발 건조시켜 (R)-N-(3-(3,5-디메톡시펜에틸)-1H-피라졸-5-일)-4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)벤즈아미드(561 mg, 62%)를 백색 고체로서 얻었다.
Figure pct00021
(R)-메틸 4-(3,4-디메틸피페라진-1- 일 )벤조에이트
Figure pct00022
나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드(1.62 g, 7.63 mmol)를, 25℃에서 메탄올(15 ml) 중 (R)-메틸 4-(3-메틸피페라진-1-일)벤조에이트(0.715g, 3.05 mmol), 포름알데히드(37% 수용액 4.54 ml, 61 mmol) 및 아세트산 (0.35 ml, 6.10 mmol)에 첨가하였다. 얻어진 용액을 18 시간 동안 질소 하에서 상온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 수용액으로 염기화하고 감압 하에 농축하였다. 반응 혼합물을 EtOAc(200 ml)로 희석한 후, 포화 수성 NaHCO3 용액(200 ml)으로 세척하였다. 수성액을 EtOAc(2 x 75 ml)로 추가 추출하고, 합한 유기물을 물(200 ml) 및 포화 염수(200 ml)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4상에서 건조하고 여과하고 증발시켜 미정제 생성물을 얻었다. EtOAc/이소헥산(30:100에서부터 극성 증가시켜 100:0으로)으로 용리시킨, 플래쉬 실리카 크로마토그래피로 미정제 생성물을 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 (R)-메틸 4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)벤조에이트 (0.600g, 79%)를 크림색 고체로서 얻었다.
Figure pct00023
(R)-메틸 4-(3-메틸피페라진-1-일)벤조에이트
Figure pct00024
메틸 4-플루오로벤조에이트(0.62 ml, 4.79 mmol)를 25℃에서 DMA(19 ml) 중 (R)-(-)-2-메틸피페라진(0.96g, 9.58 mmol)에 첨가하였다. 얻어진 용액을 50 시간 동안 120℃에서 질소 하에서 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고 EtOAc(100 ml)로 희석한 후, 포화 NaHCO3 수용액(200 ml)으로 세척하였다. 수성액을 EtOAc(2 x 100 ml)로 추가 추출하고, 합한 유기물을 물(200 ml) 및 포화 염수(200 ml)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4상에서 건조하고 여과하고 증발시켜 (R)-메틸 4-(3-메틸피페라진-1-일)벤조에이트(0.721 g, 64%)를 갈색 고체로서 얻었다. 이를, 추가의 정제 없이 직접 사용하였다.
Figure pct00025
실시예 1(b)(ii) (R)-N-(3-(3,5-디메톡시펜에틸)-1H-피라졸-5-일)-4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)벤즈아미드의 대안적인 제조
Figure pct00026
2-메틸테트라히드로푸란(3500 ml) 중 5-(3,5-디메톡시펜에틸)-1H-피라졸-3-아민(159 g, 0.643 mol, 1eq) 및 (R)-메틸 4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)벤조에이트 (191 g, 0.772 mol, 1.2 eq)의 용액을, 딘-스타크(Dean-Stark) 장치를 사용하여 가열 환류시켰다. 용매 약 300 ml를 제거하고 용액을 70℃로 냉각시켰다. 톨루엔(25%, 1.7M, 908 ml, 1.544 mol, 2.4eq) 중 칼륨 tert-펜톡시드 용액을 30분 동안 첨가하였다. 생성된 현탁액을 가열 환류시키고 총 1.5 L 용매를 딘-스타크 조건 하에 75분 동안 제거하였다. 현탁액을 40℃로 냉각시켰으며 LC로 완전한 전환을 확인하였다.
물 (20 ml) 및 2M 염산(380 ml, 0.76 mol)을 조심스럽게 첨가하였다(40℃에서 50℃로 발열반응). 거무스름한 용액이 형성되었으며 이를 이소프로필 아세테이트(1500 ml)로 희석하였다. 수성층을 분리하고, 유기층을 물(500 ml) 및 염수(500 ml)로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘상에서 건조하고 45℃의 진공에서 증발시켜 거무스름한 검을 얻었다. 이소프로필 아세테이트(960 ml)를 첨가하고 혼합물을 60분 동안 55℃에서 회전시켰다. 검이 서서히 용해되고 백색 고체가 침전되었다. 슬러리를 0℃로 냉각하고 120분 동안 교반하였다. 생성물을 여과로 수집하고, 저온 이소프로필 아세테이트(2 x 400 ml)로 세척하고, 120분 동안 50℃에서 건조하였다. 생성물을 백색 고체(231 g, 78%)로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3)은 실시예 1(b)(i)의 데이타와 일치하였다. LC: 99.5% 순도.
(R)-메틸 4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)벤조에이트
(R)-메틸 4-(3-메틸피페라진-1-일)벤조에이트(218 g, 0.93 mol, 1 eq)를 메탄올(2200 ml, 10 vols) 및 아세트산(111.7 g, 1.86 mol, 2 eq)에 용해시켰다. 37% 포름알데히드 수용액(880 ml, 11.74 mol, 12.6 eq)을 첨가하고 고체를 침전시켰다. 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드(493 g, 2.33 mol, 2.5 eq)를 1 시간 동안 분할하여 첨가하면서 혼합물을 교반하였다. 온도를 30℃ 이하로 유지하였다. 생성되는 용액을 질소 하에 밤새 교반하였다.
메탄올을 45℃에서 진공 하에 제거하였으며, 잔류물을 탄산수소나트륨 포화 용액(5000 ml)에 조심스럽게 부었다. 혼합물을 15분 동안 질소류하에서 교반하고 고체를 침전시켰다. 생성물을 이소프로필 아세테이트(2000 ml 및 1500 ml)로 추출하였다. 합한 유기 층을 탄산수소나트륨 포화 용액(1000 ml)으로 세척하고 황산마그네슘 상에서 건조하였다. 이소프로필 아세테이트 용액을 진공에서 농축하였으며, 부피가 작아지면서 생성물이 결정화하기 시작하였다. 생성물을 여과로 수집하고, 제2의 수확물(196 g, 85%)을 얻었다. 1H NMR (CDCl3)은 실시예 1(b)(i)의 데이타와 일치하였다. LC: 99.5% 순도.
(R)-메틸 4-(3-메틸피페라진-1-일)벤조에이트
DMSO (1200 ml, 6 vols) 중 (R)-2-메틸피페라진(203 g, 2.03 mol, 1.59 eq) 현탁액을 37℃에서 교반하였다. 탄산칼륨(383 g, 2.77 mol, 2.16 eq)을 첨가하고 DMSO (200 ml, 1 vol) 중 메틸 4-플루오로벤조에이트(198 g, 1.28 mol, 1 eq) 용액을 20분 동안 첨가하면서 현탁액을 교반하였다. 반응 혼합물을 24 시간 동안 95℃에서 교반하였다. IPC 결과 메틸-4-플루오로벤조에이트 중 1% 미만이 남았음을 확인하였다.
반응 혼합물을 40℃로 냉각하고, 에틸 아세테이트(1600 ml)로 희석하였으며, 물(5000 ml)에 서서히 부었다. 혼합물을 15분 동안 교반하고 층을 분리시켰다. 수성층을 에틸 아세테이트(1600 ml)로 추출하였다. 합한 유기층을 물(1200 ml) 및 염수(1200 ml)로 세척하였다. 용매를 진공 하에 제거하여 백색 고체 233 g(78%)을 얻었다. 1H NMR (CDCl3)은 실시예 1(b)(i)의 데이타와 일치하였다. LC: 98.4% 순도.
XRD - A형
Bruker D4 X-선 회절계(X-선 파장 1.5418 Å Cu원, 전압 40 kV, 필라멘트 방출 40 mA)를 사용하여 분말 X-선 회절 패턴을 기록하였다. 샘플을 0.00570°단계 및 단계 시간 계수당 0.03초를 이용하여 2-40° 2θ로부터 샘플을 스캐닝화였다.
피크는 다음과 같이 관찰되었다:
Figure pct00027
Figure pct00028
A형에 대한 XRD 패턴은 도 1에 도시되어 있다.
효소 분석
FGFR1 키나제 분석 - 캘리퍼 에코 투약법
FGFR1 활성의 억제를 측정하기 위해서, 캘리퍼 방법을 사용하여 키나제 분석을 실시하였다.
키나제 활성 분석은 Greiner 384-웰 소량 부피 플레이트에서 웰당 총 반응 부피를 12 ㎕로 하여 실시하였다. 각 웰에서의 FGFR1 활성 키나제의 최종 농도는 7.2 nM이었다. 각 분석에 대한 기질은 형광 태그를 포함하는 맞춤 펩티드(13 아미노산 길이, KKSRGDYMTMQIG, 첫번째 K는 형광 태그임)였다.
Labcyte Echo 550 어코스틱 분주 장치를 사용하여 분석 플레이트에 직접 화합물을 분배하였다. 각 웰에 화합물을 함유하는 DMSO 120 nl를 넣어 정지액을 첨가하기 전에 분석 화합물의 최종 농도를 30 μM 내지 30 pM이 되도록 하였다. 각 플레이트는 화합물 외에 최대 및 최소 대조군 웰을 보유하며, 최대 웰은 120 nl DMSO를 포함하고 최소 웰은 120 nl의 10 mM 스타우로스포린(LC Laboratories, MA 01801, USA 카탈로그 번호 S-9300)을 포함하였다. 효소(7.2 nM [최종]) 및 기질(3.6 μM[최종])을, 반응 완충액[50 mM MOPS(시그마, 카탈로그 번호 M1254) - pH 6.5, 0.004% 트리톤(시그마, 카탈로그 번호 X-100), 2.4 mM DTT, 12 mM MgCl2, 408 μM ATP 포함] 중에서, 별도로 화합물 플레이트에 첨가하여 반응 혼합물 중의 최종 DMSO 농도 1%를 얻었다.
실온에서 분석 플레이트를 1.5 시간 동안 항온처리한 다음, 완충액[100mM HEPES - pH7.5, 0.033% Brij-35 (시그마 카탈로그 B4184), 0.22% 캘리퍼 코팅 시약 #3 (캘리퍼 라이프 사이언스 카탈로그 번호 760050), 88mM EDTA, 5% DMSO 포함]을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이어서, 반응이 정지된 분석 플레이트를, Caliper LabChip® LC3000(형광 표지된 펩티드와 FGFR1 키나제- 이 펩티드의 인산화 형태 사이의 이동성을 측정하기 위해서 마이크로유체를 사용함)을 사용하여 판독하였다.
이 분석에서, 화합물을 일정 농도 범위에서 테스트하였다. 미처리된 대조군 웰 및 100% 억제 대조군 웰과 함께, 각 농도에 대한 평균 데이타값을 이용하여 농도에 대한 억제 플롯을 유도하였다. 이 데이타로부터, IC50 값 또는 정해진 농도에서의 억제율(%) 값을 측정할 수 있다.
본원에서 표시된 바와 같은 1 μM에서의 억제율(%)은 실험적으로 형성된 곡선 피트를 기초로 계산된 값이다. 1 μM 농도에서의 화합물의 효과는, 핏팅된 곡선 플롯으로부터 억제율(%)로 계산하였다. IC50은 분석 상황에서 FGFR1 키나제 활성이 50% 억제되는 화합물의 농도이다. 이 값은 표준 곡선 핏팅 소프트웨어 패키지 OriginTM을 이용하여 계산한다. 1회 이상 화합물을 시험하는 경우, IC50 값은 기하 평균으로 정할 수 있다.
실시예 1a - IC50 0.00074 μM
실시예 1b - IC50 0.0011 μM, 0.00064 μM, 0.00076 μM.
FGFR4 키나제 분석 - 캘리퍼
FGFR4 활성의 억제를 측정하기 위해서, 캘리퍼 방법을 사용하여 키나제 분석을 실시하였다. FGFR4 효소를 사용하였다(8 μM, 카탈로그 번호 PR4380B, 인비트로젠). 키나제 활성 분석은 Greiner 384-웰 소량 부피 플레이트에서 웰당 총 반응 부피를 12 ㎕로 하여 실시하였다. 각 반응 웰에서의 FGFR4 활성 키나제의 최종 농도는 25 nM이었다. 각 분석에 대한 기질은 형광 태그를 포함하는 맞춤 펩티드(13 아미노산 길이, 5FAM-EEPLYWSFPAKKK-CONH2)이며, 이의 서열은 FGFR4 키나제에 대해 특이적이었다.
화합물을 5%(v/v) DMSO에서 연속 희석한 다음, 분석 플레이트에 첨가하였다. 효소(25 nM [최종]) 및 기질(1.5 μM[최종])을, 반응 완충액[100mM HEPES - pH 7.5, 0.004% Triton, 1mM DTT (최종), 10mM MnCl2 (최종), 30 μM ATP(최종) 포함] 중에서, 별도로 화합물 플레이트에 첨가하여 반응 혼합물 중의 최종 DMSO 농도 0.8%를 얻었다.
실온에서 분석 플레이트를 2 시간 동안 항온처리한 다음, 완충액(100mM HEPES - pH7.5, 0.033% Brij-35, 0.22% 캘리퍼 코팅 시약 #3, 40mM EDTA, 5% DMSO 포함), 88mM EDTA, 5% DMSO 포함]을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이어서, 반응이 정지된 분석 플레이트를, Caliper LabChipTM LC3000(형광 표지된 펩티드와 FGFR4 키나제- 이 펩티드의 인산화 형태 사이의 이동성을 측정하기 위해서 마이크로유체를 사용함)을 사용하여 판독하였다.
이 분석에서, 화합물을 일정 농도 범위에서 테스트하였다. 미처리된 대조군 웰 및 100% 억제 대조군 웰과 함께, 각 농도에 대한 평균 데이타값을 이용하여 농도에 대한 억제 플롯을 유도하였다. 이 데이타로부터, IC50 값 또는 정해진 농도에서의 억제율(%) 값을 측정할 수 있다.
실시예 1b - IC50 0.022 μM, 0.016 μM, 0.016 μM.
세포 분석
세포 FGFR1 ( ECHO ) - (포스포-특이적 1차 항체 및 형광성 2차 항체를 사용하여 측정되는) 에코( ECHO ) 방법을 이용하여 일시적으로 발현된 FGFR1 IIIc 인산화의 세포계 억제
이 분석은 ArrayScan 기법을 사용하여 검출되는 고정 세포의 항체 염색으로 일시적으로 발현된 FGFR1 인산화의 억제제를 검출하도록 고안된다.
Cos-1 세포를, DMEM(Gibco BRL, 41966)와 3% 태아 소 혈청(FCS), 1% L-글루타민(Gibco BRL, 25030)에서 80%의 컨플루언시로 일반적으로 계대배양하였다. 분석을 위해서 Cos-1 세포를, 세포 형질감염에 대해 90-95% 컨플루언스로 수거하였다. 각 96웰 플레이트에 대해, 24 ㎕ 리포펙타민 2000을 809 ㎕ OptiMEM에 첨가하고 5 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 각 96 웰 플레이트에 대해, 20 ㎍ 3 FLAG 태그된 FGFR1/ pcDNA3.1(인하우스 클론15, MSD 4793)을 OptiMEM으로 총 부피 833 ㎕로 희석하였다. 동 부피의 DNA 및 리포펙타민 2000을 합하고(DNA:지질 = 1:1.2 비율), 20 분 동안 실온에서 항온처리하였다.
수거한 Cos-1 세포를, 쿨터 계수기를 사용하여 계수하고 1% FCS/DMEM으로 2.5 x 105 세포/ml로 추가 희석하였다. 각 96웰에 대해 8.33 ml 세포가 필요하였다. 복합 형질감염 용액을 세포 용액에 첨가하고, 96웰 플레이트(Costar, 3904)에서 DMEM과 1% 태아 소 혈청, 1% L-글루타민 중에 2.5x105 세포/웰로 접종하고 가습 항온기에서 밤새(24 시간) 37℃(+5% CO2)에서 항온처리하였다.
다음 날, 건조 중량 샘플로부터 얻은 화합물을 100% DMSO에 용해시켜 10 mM 농도를 얻었다. 화합물 40 ㎕를, (양성 대조군(100% DMSO), 음성 대조군(10 μM) 및 기준 화합물(250nM)을 포함하는) 384 Labcyte 플레이트(랩사이트 카탈로그 번호 P-05525)의 각 사분면의 웰에 분배하였다. 이 후 384 Labcyte 플레이트를 Hydra로 옮겨 남은 사분면의 웰에 화합물을 1:100으로 희석하였다. 플레이트를 ECHO 550으로 옮기기 전에 Quadra를 사용하여 배지 70 ㎕를 분석 플레이트로부터 흡인하였다. 384 Labcyte 화합물 플레이트를 또한 ECHO 550으로 옮겼다. ECHO 550에서 분석 플레이트로의 화합물 전달은 농도 범위 1) 10 μM, 2) 3 μM, 3) 1 μM, 4) 0.3 μM, 5) 0.1 μM, 6) 0.01에서 실시하였다.
플레이트를 가볍게 두드려서 화합물과 세포 배지를 혼합하고, 1 시간 동안 5% CO2 하에 37℃에서 항온처리되게 하였다.
진공 흡인으로 웰로부터 배지를 제거하고; 100% 메탄올 50 ㎕를 각 웰에 첨가하여 세포를 고정하고 20분 동안 실온에서 항온처리하였다. 그 다음 고정액을 제거하고 실온에서 20분 동안 50 ㎕/웰 0.1% 트리톤/PBS/A를 첨가하여 세포로 침투시키기 전에 200 ㎕ 인산염 완충 염수(PBS/A)로 웰을 1회 세척하였다. 그 다음 침투액을 제거하고 각 웰에 40 ㎕ 1/1000 1차 항체 용액(셀 시그널링 테크놀로지스 #CS3476; 10% FCS + 0.1% 트윈20을 포함하는 PBS/A로 희석된 마우스 항-포스포 FGFR1)을 첨가하기 전에 200 ㎕/웰 PBS/A로 세포를 1회 이상 세척하였다. 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후에, 항체 용액을 제거하고 200 ㎕/웰 PBS/A에서 웰을 1회 세척하였다. 그 다음 40 ㎕ 1/500 2차 항체(A11005; 염소 항-마우스 594) 용액 및 1/10000 훽스트(10% FCS + 0.1% 트윈 20을 포함하는 PBS/A 중에서 함께 희석됨)를 첨가하고, 1시간 동안 실온의 암실에서 플레이트를 항온처리하였다. 마지막으로, 플레이트를 200 ㎕/웰 PBS/A로 1회 세척하여, 플레이트를 밀봉하기 전에 웰에 최종 세척물을 남겨두었다. 플레이트를 Arrayscan(셀로믹스)에서 판독하였다. 플레이트 내의 비투약(최대) 및 기준 화합물(최소)로부터 얻은 채널 2(594 nm) 값을 사용하여 0% 내지 100% 화합물 억제에 대한 경계를 설정하였다. 이들 값에 대해 화합물 데이타를 정규화하여 인산화된 FGFR1의 50% 억제를 제공하는 시험 화합물의 희석 범위를 결정하였다.
실시예 1b - IC50 <0.01 μM, 0.0011 μM, 0.0022 μM, 0.0048 μM.
세포 FGFR2 ( ECHO ) 분석
ECHO 기법을 사용한 구성적으로 발현되는 FGFR2 인산화의 세포계 억제(포스포-특이적 1차 및 형광성 2차 항체를 이용한 측정).
이 분석은, ArrayScan 기법을 사용하여 검출되는 고정 세포의 항체 염색으로 구성적으로 발현된 FGFR2 인산화의 억제제를 검출하는데 이용할 수 있다. SUM52-PE 세포를, RPMI 1640(Gibco BRL, 31870)과 10% 태아 소 혈청(FCS), 1% L-글루타민(Gibco BRL, 25030)에서 70%의 컨플루언시로 일반적으로 계대배양하였다. 수거한 SUM52-PE 세포를, 쿨터 계수기를 사용하여 계수하고 1% FCS/RPMI 1640로 1.5 x 105 세포/ml로 추가 희석하였다. 각 96웰 플레이트에 대해 10 ml 세포가 필요하였다. 100 ㎕의 세포 현탁액을 96웰 플레이트(Costar, 3904)의 각 웰에 첨가하고, 가습 항온기에서 밤새(24 시간) 37℃(+5% CO2)에서 항온처리하였다. 다음 날, 건조 중량 샘플로부터 얻은 화합물을 100% DMSO에 용해시켜 100 μM 농도를 얻었다. 화합물 용액 40 ㎕를, (양성 대조군(100% DMSO), 음성 대조군(10 μM) 및 기준 화합물(250 nM) - 1-tert-부틸-3-[2-{[3-(디에틸아미노)프로필]아미노}-6-(3,5-디메톡시페닐)-피리도[2,3-d]피리미딘-7-일]우레아 - PD173074- 시판되는 FGFR 억제제를 포함하는) 384 Labcyte 플레이트(랩사이트 카탈로그 번호 P-05525)의 각 사분면의 웰에 분배하였다. 이 후 384 Labcyte 플레이트를 Hydra로 옮겨 남은 사분면의 웰에 화합물을 1:100으로 희석하였다. 플레이트를 ECHO 550으로 옮기기 전에 Quadra를 사용하여 배지 70 ㎕를 분석 플레이트로부터 흡인하였다. 384 Labcyte 화합물 플레이트를 또한 ECHO 550으로 옮겼다. ECHO 550에서 분석 플레이트로의 화합물 전달은 농도 범위 (1) 100 nM, (2) 33.3 nM, (3) 11.1 nM, (4) 3.70 nM, (5) 1.23 nM, (6) 0.41 nM에서 실시하였다. 플레이트를 가볍게 두드려서 화합물과 세포 배지를 혼합하고, 1 시간 동안 5% CO2 하에 37℃에서 항온처리하였다. 진공 흡인으로 웰로부터 배지를 제거하고; 100% 메탄올 50 ㎕를 각 웰에 첨가하여 세포를 고정하고 20분 동안 실온에서 항온처리하였다. 그 다음 고정액을 제거하고 실온에서 20분 동안 50 ㎕/웰 0.1% 트리톤/PBS/A를 첨가하여 세포로 침투시키기 전에 200 ㎕ 인산염 완충 염수(PBS/A)로 웰을 1회 세척하였다. 그 다음 침투액을 제거하고 각 웰에 40 ㎕ 1/1000 1차 항체 용액(셀 시그널링 테크놀로지스 #CS3476; 10% FCS + 0.1% 트윈20을 포함하는 PBS/A로 희석된 마우스 항-포스포 FGFR)을 첨가하기 전에 200 ㎕/웰 PBS/A로 세포를 1회 이상 세척하였다. 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후에, 항체 용액을 제거하고 200 ㎕/웰 PBS/A로 웰을 1회 세척하였다. 그 다음 40 ㎕ 1/500 2차 항체(A11005; 염소 항-마우스 594) 용액 및 1/10000 훽스트(10% FCS + 0.1% 트윈 20을 포함하는 PBS/A 중에서 함께 희석됨)를 첨가하고, 1시간 동안 실온의 암실에서 플레이트를 항온처리하였다. 마지막으로, 플레이트를 200 ㎕/웰 PBS/A로 1회 세척하여, 플레이트를 밀봉하기 전에 웰에 최종 세척물을 남겨두었다. 플레이트를 Arrayscan(셀로믹스)에서 판독하였다. 플레이트 내의 비투약(최대) 및 기준 화합물(최소) 웰로부터 얻은 채널 2(594 nm) 값을 사용하여 0% 내지 100% 화합물 억제에 대한 경계를 설정하였다.
세포 FGFR3 ( ECHO ) 분석
ECHO 기법을 사용한 일시적으로 발현되는 FGFR3 IIIc 인산화의 세포계 억제(포스포-특이적 1차 및 형광성 2차 항체를 이용한 측정).
이 분석은, ArrayScan 기법을 사용하여 검출되는 고정 세포의 항체 염색으로 일시적으로 발현된 FGFR3 인산화의 억제제를 검출하는데 이용할 수 있다. Cos-1 세포를, DMEM(Gibco BRL, 41966)와 3% 태아 소 혈청(FCS), 1% L-글루타민(Gibco BRL, 25030)에서 80%의 컨플루언시로 일반적으로 계대배양하였다. 분석을 위해서 Cos-1 세포를, 세포 형질감염에 대해 90-95% 컨플루언스로 수거하였다. 각 96웰 플레이트에 대해, 24 ㎕ 리포펙타민 2000을 809 ㎕ OptiMEM에 첨가하고 5 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 각 96 웰 플레이트에 대해, 20 ㎍ 3 FLAG 태그된 FGFR3/pcDNA3.2 전길이 FGFR3을 OptiMEM으로 총 부피 833 ㎕로 희석하였다. 동 부피의 DNA 및 리포펙타민 2000을 합하고(DNA:지질 = 1:1.2 비율), 20 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 수거한 Cos-1 세포를, 쿨터 계수기를 사용하여 계수하고 1% FCS/DMEM로 2.5 x 105 세포/ml로 추가 희석하였다. 각 96웰에 대해 8.33 ml 세포가 필요하였다. 복합 형질감염 용액을 세포 용액에 첨가하고, 96웰 플레이트(Costar, 3904)에서 DMEM과 1% 태아 소 혈청, 1% L-글루타민 중에 2.1x104 세포/웰로 세포를 접종하고 가습 항온기에서 밤새(24 시간) 37℃(+5% CO2)에서 항온처리하였다. 다음 날, 건조 중량 샘플로부터 얻은 화합물을 100% DMSO에 용해시켜 10 mM 농도를 얻었다. 화합물 용액 40 ㎕를, (양성 대조군(100% DMSO), 음성 대조군(10 μM) 및 기준 화합물(250nM) - 1-tert-부틸-3-[2-{[3-(디에틸아미노)프로필]아미노}-6-(3,5-디메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘-7-일]우레아 - PD173074- 시판되는 FGFR 억제제를 포함하는) 384 Labcyte 플레이트(랩사이트 카탈로그 번호 P-05525)의 각 사분면의 웰에 분배하였다. 이 후 384 Labcyte 플레이트를 Hydra로 옮겨 남은 사분면의 웰에 화합물을 1:100으로 희석하였다. 플레이트를 ECHO 550으로 옮기기 전에 Quadra를 사용하여 배지 70 ㎕를 분석 플레이트로부터 흡인하였다. 384 Labcyte 화합물을 또한 ECHO 550으로 옮겼다. ECHO 550에서 분석 플레이트로의 화합물 전달은 농도 범위 (1) 10 μM, (2) 3 μM, (3) 1 μM, (4) 0.3 μM, (5) 0.1 μM 및 (6) 0.01 μM에서 실시하였다. 플레이트를 가볍게 두드려서 화합물과 세포 배지를 혼합하고, 1 시간 동안 5% CO2 하에 37℃에서 항온처리하였다.
진공 흡인으로 웰로부터 배지를 제거하고; 100% 메탄올 50 ㎕를 각 웰에 첨가하여 세포를 고정하고 20분 동안 실온에서 항온처리하였다. 그 다음 고정액을 제거하고 실온에서 20분 동안 50 ㎕/웰 0.1% 트리톤/PBS/A를 첨가하여 세포로 침투시키기 전에 200 ㎕ 인산염 완충 염수(PBS/A)로 웰을 1회 세척하였다. 그 다음 침투액을 제거하고 각 웰에 40 ㎕ 1/1000 1차 항체 용액(셀 시그널링 테크놀로지스 #CS3476; 10% FCS + 0.1% 트윈20을 포함하는 PBS/A로 희석된 마우스 항-포스포 FGFR1)을 첨가하기 전에 200 ㎕/웰 PBS/A로 세포를 1회 이상 세척하였다. 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후에, 항체 용액을 제거하고 200 ㎕/웰 PBS/A로 웰을 1회 세척하였다. 그 다음 40 ㎕ 1/500 2차 항체(A11005; 염소 항-마우스 594) 용액 및 1/10000 훽스트(10% FCS + 0.1% 트윈 20을 포함하는 PBS/A 중에서 함께 희석됨)를 첨가하고, 1시간 동안 실온의 암실에서 플레이트를 항온처리하였다. 마지막으로, 플레이트를 200 ㎕/웰 PBS/A로 1회 세척하여, 플레이트를 밀봉하기 전에 웰에 최종 세척물을 남겨두었다. 플레이트를 Arrayscan(셀로믹스)에서 판독하였다. 플레이트 내의 비투약(최대) 및 기준 화합물(최소) 웰로부터 얻은 채널 2(594 nm) 값을 사용하여 0% 내지 100% 화합물 억제에 대한 경계를 설정하였다. 이들 값에 대해 화합물 데이타를 정규화하여 인산화된 FGFR3의 50% 억제를 제공하는 시험 화합물의 희석 범위를 결정하였다.
세포 FGFR4 ( ECHO ) 분석
ECHO 기법을 사용한 일시적으로 발현되는 FGFR4 인산화의 세포계 억제(포스포-특이적 1차 및 형광성 2차 항체를 이용한 측정).
이 분석은 ArrayScan 기법을 사용하여 검출되는 고정 세포의 항체 염색으로 일시적으로 발현된 FGFR4 인산화의 억제제를 검출하도록 고안된다. Cos-1 세포를, DMEM(Gibco BRL, 41966)와 3% 태아 소 혈청(FCS), 1% L-글루타민(Gibco BRL, 25030)에서 80%의 컨플루언시로 일반적으로 계대배양하였다. 분석을 위해서 Cos-1 세포를, 세포 형질감염에 대해 90-95% 컨플루언스로 수거하였다. 각 96웰 플레이트에 대해, 24 ㎕ 리포펙타민 2000을 809 ㎕ OptiMEM에 첨가하고 5 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 각 96 웰 플레이트에 대해, 20 ㎍ 3' FLAG 태그된 FGFR4/pcDNA3.1(MSD 6273)을 OptiMEM으로 총 부피 833 ㎕로 희석하였다. 동 부피의 DNA 및 리포펙타민 2000을 합하고(DNA:지질 = 1:1.2 비율), 20 분 동안 실온에서 항온처리하였다.
수거한 Cos-1 세포를, 쿨터 계수기를 사용하여 계수하고 1% FCS/DMEM로 1.2 x 105 세포/ml로 추가 희석하였다. 각 96웰에 대해 8.33 ml 세포가 필요하였다. 복합 형질감염 용액을 세포 용액에 첨가하고, 96웰 플레이트(Biocoat # 6640)에서 DMEM과 1% 태아 소 혈청, 1% L-글루타민 중에 1.0x104 세포/웰로 세포를 접종하고 가습 항온기에서 밤새(24 시간) 37℃(+5% CO2)에서 항온처리하였다.
다음 날, 건조 중량 샘플로부터 얻은 화합물을 100% DMSO에 용해시켜 10 mM 농도를 얻었다. 화합물 용액 40 ㎕를, (양성 대조군(100% DMSO), 음성 대조군(10 μM) 및 기준 화합물(250 nM)을 포함하는) 384 Labcyte 플레이트(랩사이트 카탈로그 번호 P-05525)의 각 사분의 웰에 분배하였다. 이 후 384 Labcyte 플레이트를 Hydra로 옮겨 남은 사분면의 웰에 화합물을 1:100으로 희석하였다. 플레이트를 ECHO 550으로 옮기기 전에 Quadra를 사용하여 배지 70 ㎕를 분석 플레이트로부터 흡인하였다. 384 Labcyte 화합물을 또한 ECHO 550으로 옮겼다. ECHO 550에서 분석 플레이트로의 화합물 전달은 농도 범위 (1) 10 μM, (2) 3 μM, (3) 1 μM, (4) 0.5 μM, (5) 0.1 μM, (6) 0.03 μM (7) 0.01 μM, (8) 0.001 μM에서 실시하였다.
플레이트를 가볍게 두드려서 화합물과 세포 배지를 혼합하고, 1 시간 동안 5% CO2 하에 37℃에서 항온처리하였다.
진공 흡인으로 웰로부터 배지를 제거하고; 100% 메탄올 50 ㎕를 각 웰에 첨가하여 세포를 고정하고 20분 동안 실온에서 항온처리하였다. 그 다음 고정액을 제거하고 실온에서 20분 동안 50 ㎕/웰 0.1% 트리톤/PBS/A를 첨가하여 세포로 침투시키기 전에 200 ㎕ 인산염 완충 염수(PBS/A)로 웰을 1회 세척하였다. 그 다음 침투액을 제거하고 각 웰에 40 ㎕ 1/1000 1차 항체 용액(셀 시그널링 테크놀로지스 #CS3476; 10% FCS + 0.1% 트윈20을 포함하는 PBS/A로 희석된 마우스 항-포스포 FGFR 1)을 첨가하기 전에 100 ㎕/웰 PBS/A로 세포를 4회 이상 세척하였다.
실온에서 1시간 동안 항온처리한 후에, 항체 용액을 제거하고 100 ㎕/웰 PBS/A로 웰을 4회 세척하였다. 그 다음 40 ㎕ 1/500 2차 항체(A11005; 염소 항-마우스 594) 용액 및 1/10000 훽스트(10% FCS + 0.1% 트윈 20을 포함하는 PBS/A 중에서 희석됨)를 첨가하고, 1시간 동안 실온의 암실에서 플레이트를 항온처리하였다. 마지막으로, 플레이트를 100 ㎕/웰 PBS/A로 4회 세척한 다음, PBS/A 200 ㎕/웰을 플레이트를 밀봉하기 전에 웰에 첨가하였다. 플레이트를 Arrayscan(셀로믹스)에서 판독하였다. 플레이트 내의 비투약(최대) 및 기준 화합물(최소) 웰로부터 얻은 채널 2(594 nm) 값을 사용하여 0% 내지 100% 화합물 억제에 대한 경계를 설정하였다. 이들 값에 대해 화합물 데이타를 정규화하여 인산화된 FGFR4의 50% 억제를 제공하는 시험 화합물의 희석 범위를 결정하였다.
실시예 1b - IC50 0.029 μM, 0.033 μM, 0.045 μM, 0.028 μM.
시토크롬 P450 억제 분석
5가지 인간 시토크롬 P450(CYP) 이소폼(1A2, 2C9, 2C19, 3A4 및 2D6)에 대한 시험 화합물의 억제능(IC50)은, Crespi의 문헌[Crespi and Stresser, J Pharmacol Toxicol Methods 2000, 44: 325:31]에 기재된 방법을 변형한 자동화 형광 종점 시험관내 분석을 이용하여 평가하였다. 각각 인간 CYP 이소폼을 발현하는 효모 세포주로부터 제조한 마이크로솜 준세포 분획을 이 분석에서의 효소 공급원으로서 사용하였다. 5가지 주요 인간 CYP의 활성은 NADPH의 존재 하에 다수의 쿠마린 기질의 형광 대사물질로의 생체전환으로부터 측정하였다. 이들 CYP의 억제는 형성되는 형광 대사물질의 양을 감소시켰다. 다양한 농도의 시험 화합물의 존재 하에 관찰되는 형광도와 부재하에 관찰되는 형광도를 비교하여 IC50 값을 계산할 수 있었다. 분석의 반응속도론을 최적화하기 위해 초기 실험을 실시하였으며, 이들은 표 1에 제시되어 있다. 각 CYP와 이의 각각의 기질을 포함하는 스톡액을 인산염 완충액 pH 7.4에서 제조하였으며(표 1 참조), 178 ㎕를 흑색 고체, 편평한 바닥의 300 ㎕의 96웰 미량역가 플레이트(Corning Costar)의 웰에 첨가하였다. 시험 화합물을 DMSO/아세토니트릴에서 연속 희석하고 반응에 첨가하여(2 ㎕) 0.1, 0.3, 1, 3 및 10 μM의 최종 농도를 얻었다. 5분 동안 37℃에서 사전항온처리한 후에, NADPH(20 ㎕, 표 1에 제시된 농도)를 첨가하여 반응을 시작하였다. 각 항온배양시 최종 용매 함량은 <= 2%였다(시험 화합물로부터 1% 및 기질로부터 최대 1%). 각 실험에 적절한 용매 대조군 및 기질 블랭크를 포함시켜 시험 화합물로 인한 임의의 고유의 형광을 확인하고 대조군 활성을 평가하였다. 또한, 공지된 각 CYP의 억제제를 양성 대조군으로 포함시켰다(억제제 농도 및 예상되는 IC50 범위에 대해서는 표 3 참조). 정해진 시점(표 1 참조)에서 용매(아세토니트릴:0.5M Tris 완충액 80:20 v/v) 100 ㎕를 켄칭시켜 반응을 정지시켰다. 적절한 여기 및 방출 파장에서 형광계(Spectrafluor Plus)로 플레이트를 판독하였으며(표 2에 제시됨), 대조군에 대해 보정한 활성(%)을 시험 화합물 농도에 대해 플롯하였다. 이후, 각 CYP에 대한 IC50(대사 활성의 50% 억제를 유발하는데 필요한 시험 화합물의 농도)을, 상기 플롯의 기울기로부터 결정하였다.
[표 1]
분석 시약의 농도 및 분석 조건
Figure pct00029
[표 2]
형광성 대사산물을 검출하기 위해 Spectrafluor Plus 형광계에 의해 사용되는 여기 및 방출 파장. CEC 및 HFC는 울트라파인 케미칼스로부터 입수하였고; CHC는 몰리큘라 프로브로부터 입수하였으며; MFC, MAMC, HAMC 및 BFC는 젠테스트 코포레이션으로부터 입수하였다.
Figure pct00030
[표 3]
5종의 인간 CYP 이소폼 각각에 대한 최적화된 실험 조건 및 공지된 억제제. 플루복사민은 토크리스 쿡슨 리미티드로부터 입수하였고; 설파페나졸 및 퀴니딘은 시그마로부터 입수하였으며; 오메프라졸은 아스트라제네카로부터 입수하였고; 케토코나졸은 울트라파인 케미칼스로부터 입수하였다.
Figure pct00031
결과
Figure pct00032
결론: 본 발명의 에난티오머 화합물은 양호한 FGFR 억제를 나타내면서, 또한 시토크롬 P450 억제에 있어서 차이를 나타낸다. 가능한 약물:약물 상호작용을 개선하기 위해서는 시토크롬 P450의 억제가 낮은 것이 바람직하다.
물성 테스트 및 방법
단백질 결합
평형 투석으로 단백질 결합을 결정한다. 20 μM 농도의 화합물을 18 시간 동안 37℃의 온도에서 10% 혈장에 대해 투석한다. 질량 스펙트럼 피크 확인과 결합된 일반 HPLC-UV 방법을 이용하여 생성 샘플을 분석한다. 보고된 KI 값은 제1의 겉보기 회합 상수[단백질리간드]/[단백질][리간드])이며, 모든 농도는 몰/리터로 측정된다(J. Med. Chem., 2006, 49(23), 6672-6682).
액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석과 병행되는 평형 분석에 의해 고처리량 스크리닝에서 단백질 결합을 측정할 수 있다(Wan, H. and Rehngren, M., J. Chromatogr. A 2006, 1102, 125-134).
실시예 1a: 0.91% 유리 (래트)
실시예 1b: 0.62% 유리 (래트)
실시예 1a: 3.72% 유리 (인간)
실시예 1b: 2.79% 유리 (인간)
결론: 단백질 결합 감소는 유리 약물(비결합)이 더 많음을 나타낸다. 이는, 표적 부위에서의 작용에 이용가능한 약물이 더 많을 수 있기 때문에 유리할 수 있다.
제거율:
0.927 mg/kg (2 umol/kg)의 래트 투여량을 위해, 1 umol/ml로 20% DMA:80% 소렌슨(sorensens) 완충액 pH5에서 화합물을 제제화하였다. 각 제제를 4마리의 수컷 래트(250-300 g)에게 투약하고(2 ml/kg), 먹이에 자유롭게 접근할 수 있게 하였다. 꼬리 정맥을 통해서 2마리의 래트로부터 5분 및 20분과, 1시간 및 4시간에, 다른 2 마리의 래트로부터 10분 및 40분과 2시간 및 6시간째에 채혈하였다. 최종 샘플은 첫번째 쌍의 래트로부터는 12시간째에, 두번째 쌍의 래트로부터는 24시간째에 취하였다. 분석 전에 물로 혈액 샘플을 1:1로 희석하였다.
0.927 mg/kg(2 umol/kg)의 개 투여량을 위해, 2 umol/ml로 10% DMSO:90% 히드록실-프로필-β-시클로덱스트린(25%w/v)의 소렌슨 완충액 pH5에서 화합물을 제제화하였다. 각 제제를 수캐 및 암캐(8-15 kg)에게 투약하고(1 ml/kg), 밤새 단식시켰다. 투약 후 5, 10, 20 및 40분과 1, 2, 4, 6, 12 및 24시간째에 경정맥을 통해서 채혈하였다. 분석 전에 물로 혈액 샘플을 1:1로 희석하였다.
블랭크 매트릭스(1:1 혈액:물)를 스파이킹하여 농도 범위(0.001 umol/L 내지 10 umol/L)를 포괄하는 10개의 검정 표준물 한 세트를 준비하였다. 샘플 및 표준물을, 고상 추출 플레이트를 사용하여 추출하고, 질소 하에서 배출시키고 메탄올:물(20:80)에서 재구성하였다. LS-MSMS를 이용하여 샘플을 분석하고, 얻어진 결과를 이용하여 각 화합물에 대해 0시부터 무한대까지의 곡선하 면적[AUC0-inf(ug.hr/ml)], 제거율[Cl(ml/분/kg)] 및 정상 상태 부피 분포[Vss (L/kg)]를 측정하였다.
수컷 래트에 대한 데이타
Figure pct00033
수캐에 대한 데이타
Figure pct00034
암캐에 대한 데이타
Figure pct00035
결론: 제어율 감소는 약물이 더 오래 유지됨을 나타낸다. 이는, 더욱 소량의 약물로부터 효능에 필요한 약물 노출 시간을 실현하고 유지할 수 있기 때문에 유리할 수 있다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00036
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (Ib)의 화합물인 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00037
  3. 의약으로서 사용하기 위한, 제2항의 화학식 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  4. 치료용 의약의 제조에 있어서의, 제2항의 화학식 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도.
  5. 흑색종, 유두상 갑상선 종양, 담관암종, 결장암, 난소암, 폐암, 백혈병, 림프구 악성종양, 다발성 골수종, 간, 신장, 방광, 전립선, 유방 및 췌장의 암종 및 육종과, 피부, 결장, 갑상선, 폐 및 난소의 원발성 및 재발성 고형 종양의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 본원에 정의된 바와 같은 제2항의 화학식 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도.
  6. FGFR 억제 효과 생성 치료가 필요한 인간과 같은 온혈 동물에서 FGFR 억제 효과를 생성하는 방법으로서, 상기 동물에게 제2항의 화학식 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 생성 방법.
  7. 항암 효과 생성 치료가 필요한 인간과 같은 온혈 동물에서 항암 효과를 생성하는 방법으로서, 상기 동물에게 제2항의 화학식 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 생성 방법.
  8. 본원에 정의된 바와 같은 제2항의 화학식 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을, 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물.
  9. 흑색종, 유두상 갑상선 종양, 담관암종, 결장암, 난소암, 폐암, 백혈병, 림프구 악성종양, 다발성 골수종, 간, 신장, 방광, 전립선, 유방 및 췌장의 암종 및 육종과, 피부, 결장, 갑상선, 폐 및 난소의 원발성 및 재발성 고형 종양을, 이의 치료를 필요로 하는 인간과 같은 온혈 동물에서 치료하는 방법으로서, 상기 동물에게 본원에 정의된 바와 같은 제2항의 화학식 (Ib)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 화학식 (Ib)의 화합물이 결정형으로 존재하는 약학 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 화학식 (Ib)의 화합물이 A형이라고 하는 결정형으로 존재하는 약학 조성물.
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