ES2579231T3 - Vectores de expresión de mamíferos mejorados y usos de los mismos - Google Patents

Vectores de expresión de mamíferos mejorados y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Un vector de expresión que comprende: (a) un origen de replicación OriP del virus de Epstein-Barr (EBV); (b) un origen de replicación de SV40; (b) un sitio de inserción para la inserción de un gen de interés; (d) un promotor EF-1α conectado operablemente al sitio de inserción; y, opcionalmente, que comprende (e) una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena pesada o ligera de un anticuerpo, conectada operablemente al sitio de inserción, en donde el origen de la replicación OriP está unido mediante un factor de iniciación de la replicación EBNA1 que actúa en trans que no está codificado por el vector de expresión.

Description

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incluyen el uso de la región del núcleo de estreptavidina para preparar una molécula tetramérica scFv (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y el uso de un residuo de cisteína, un marcador peptídico y una etiqueta de polihistidina C-terminal para preparar moléculas de scFv bivalentes y biotiniladas (Kipuyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058). Las porciones de anticuerpo, tales como los fragmentos Fc, Fab y F(ab')2, se pueden preparar a partir de anticuerpos completos usando técnicas convencionales, tales como digestión con papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos completos. Por otra parte, los anticuerpos, porciones de anticuerpos y moléculas de inmunoadherencia pueden ser obtenidos usando técnicas de ADN recombinante convencionales.
El término "dominio" se refiere a una estructura de proteína plegada que retiene su estructura terciaria independientemente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de las propiedades funcionales discretas de las proteínas, y en muchos casos se pueden añadir, eliminar o transferir a otras proteínas sin pérdida de la función del resto de la proteína y/o del dominio. Por dominio variable sencillo de anticuerpo se entiende un dominio de polipéptido plegado que comprende secuencias características de dominios variables de anticuerpos. Por lo tanto, incluye dominios completos de anticuerpos variables y los dominios variables modificados, por ejemplo, en el que uno o más bucles han sido reemplazados por secuencias que no son características de dominios variables de anticuerpo, o dominios variables de anticuerpo que han sido truncados o comprenden extensiones N-o C-terminales, así como fragmentos plegados de dominios variables que retienen al menos en parte la actividad de unión y la especificidad del dominio completo.
Los dominios variables de la invención pueden combinarse para formar un grupo de dominios; por ejemplo, se pueden combinar dominios complementarios, de manera que los dominios VL se combinen con los dominios VH. Los dominios no complementarios también pueden combinarse, p. ej., un dominio VH y un segundo dominio VH. Los dominios se pueden combinar de diversas maneras, que implican la conexión de los dominios por medios covalentes
o no covalentes.
Un "dAb" o "anticuerpo de dominio" se refiere a un polipéptido de dominio variable de un solo anticuerpo (VH o VL) que se une específicamente al antígeno. En una realización, el vector de la invención se utiliza para expresar un dAb.
La frase "anticuerpo recombinante" se refiere a anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula anfitriona, anticuerpos aislados de un biblioteca de anticuerpos recombinante, combinatoria, anticuerpos aislados de un animal (p. ej., un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, p. ej., Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implica el corte y empalme de determinadas secuencias de genes de inmunoglobulina (tales como secuencias de genes de inmunoglobulina humanas) con otras secuencias de ADN. Los ejemplos de anticuerpos recombinantes incluyen anticuerpos quiméricos, injertados con CDR y humanizados.
El término "anticuerpo humano" se refiere a anticuerpos que tienen regiones variables y constantes correspondientes a, o derivadas de, secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana como describen, por ejemplo, Kabat et al. (Véase Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., Publicación NIH Núm. 91-3242). Los anticuerpos humanos de la invención, sin embargo, pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas por medio de mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), Por ejemplo en las CDR y en particular, CDR3.
Los anticuerpos humanos recombinantes de la invención tienen regiones variables, y también pueden incluir regiones constantes, derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (véase Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., Publicación NIH Núm.. 91-3242). En ciertas realizaciones, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes son sometidos a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para las secuencias de Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y por lo tanto las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas de y relacionadas con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo. En ciertas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos recombinantes son el resultado de mutagénesis selectiva o retromutación o ambas.
El término "retromutación" se refiere a un proceso en el que algunos o todos de los aminoácidos mutados somáticamente de un anticuerpo humano se remplazan por los correspondientes residuos de la línea germinal a partir de una secuencia de anticuerpo de la línea germinal homóloga. Las secuencias de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano de la invención se alinean por separado con las secuencias de la línea germinal en la base de datos VBASE para identificar las secuencias con la mayor homología. Las diferencias en el anticuerpo humano de la invención se devuelven a la secuencia de línea germinal mutando posiciones de nucleótidos definidas que codifican
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los SEQ ID NO: 3-32.
Una realización de la invención incluye vectores que se pueden utilizar para expresar un anticuerpo completo, es decir, una región variable conectada a la región constante, ya sea para la cadena pesada o ligera. Por lo tanto, el gen de interés puede codificar una región variable de cadena pesada o de cadena ligera de anticuerpo, que puede ser de cualquier tipo de anticuerpo, p. ej., murino, quimérico, humanizado, y humano. Un gen de interés que codifica una región variable de cadena pesada o cadena ligera puede incluir la región variable completa, o, alternativamente, puede codificar solo un fragmento de la cadena pesada o de la cadena ligera, p. ej., la región de la porción de unión a antígeno. En una realización, el gen de interés codifica una región variable de anticuerpo murino o humano. En tal caso, la región constante puede ser emparejada con las especies de la región variable (los SEQ ID NO: 3-8, 27 y 28 codifican las regiones constantes murinas, mientras que los SEQ ID NO: 9-26 y 29-32 codifican las regiones constantes humanas).
En una realización, el vector de la invención incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena pesada del anticuerpo que tiene ciertas características de isotipo y/o alotipo. La región constante de cadena pesada puede ser, por ejemplo, un isotipo gamma (IgG), tal como gamma 1, gamma 2, gamma 3, o gamma 4. En una realización, la región constante gamma 1 de la cadena pesada es un cierto alotipo, incluyendo, pero no limitado a, los alotipos z, a y z, no a. El alotipo z, a, también se conoce como alotipos G1m17 y G1m1, y corresponde a IGHG1 con Lys en la posición 214 (dentro de CH1), Asp en 356 (CH3), y Leu en 358 (CH3) (numeración de acuerdo con el sistema de numeración EU). El alotipo z, no a, también conocido como alotipos G1m17, y nG1m1, corresponde a IGHG1 con Lys en la posición 214 (dentro de CH1), Glu en 356 (CH3), y Met en 358 (CH3) (numeración de acuerdo con el sistema de numeración EU).
En otra realización, la región constante gamma 2 de la cadena pesada (hcG2) es un cierto alotipo, incluyendo, pero no limitado a, n-o n+. El alotipo n+ de hcG2, también conocido como G2m (n) o G2m (23), corresponde a IGHG2 con Thr en la posición 189 en CH1 y Met en la posición 282 (numeración de acuerdo con el sistema de numeración EU). El alotipo n-de hcG2, también conocido como G2m (n-), corresponde a IGHG2 con Pro en la posición 189 en CH1 y Val en la posición 282 (numeración de acuerdo con el sistema de numeración EU). Los detalles adicionales de los alotipos n + y n-son descritos por Hougs et al. (2001) Immunogenetics 52:242 y Brusco et al. (1995) Immunogenetics 42:414.
En otras realizaciones, la región constante de cadena pesada puede ser un isotipo IgM, IgA (IgA1 o IgA2), IgD, o IgE.
En una realización, la región constante de cadena pesada puede tener las siguientes características de isotipo y alotipo humanos: gamma 1, z, a; gamma 1, z, no a; gamma 2, n+; gamma 2, n-; o gamma 4. En una realización, el isotipo/alotipo gamma 1, z, no a puede incluir una mutación en la posición 234 de la región constante de la cadena pesada. En una realización adicional, el isotipo/alotipo gamma 1, z, no a puede incluir mutaciones en la posición 234 y 235 o 234 y 237 de la región constante de cadena pesada. Los ejemplos de tales vectores se proporcionan en las Figuras 8 a 25.
En otro ejemplo, la región constante de la cadena ligera codificada en el vector de la invención puede comprender un isotipo kappa o isotipo lambda.
Las regiones constantes codificadas por el vector de la invención no están limitadas a las humanas, sino que en su lugar pueden incluir regiones constantes murinas o de otras especies. En una realización, el vector de expresión de la invención comprende un ácido nucleico que codifica una región constante de cadena pesada que es o bien un isotipo gamma 1 murino o un isotipo gamma 2a murino, o una región constante de cadena ligera que es un isotipo kappa murino.
Dos vectores de la invención, pHybC y pHybE, son vectores vacíos ya que estos vectores no contienen regiones constantes, y pueden ser utilizados para la clonación de genes de interés. Las descripciones de pHybC y pHybE se proporcionan a continuación, y los mapas de estos vectores se pueden encontrar en las Figuras 1 y 2.
pHybC El vector pHybC (vacío) contiene dos orígenes de replicación virales, de manera que el vector se puede replicar en diferentes líneas celulares. pHybC contiene los siguientes elementos: un origen de replicación de SV40 ( "Ori SV40"), que permite la replicación del plásmido vector en células que expresan la proteína grande del antígeno T de SV40 (p. ej., una célula COS7); un promotor de CMV ("pCMV") conectado operablemente al sitio de inserción para un gen de interés; una secuencia líder tripartita (TPL); un sitio donador de empalme (SD); un elemento potenciador tardío principal de adenovirus (enh MLP); un sitio aceptor de empalme (SA); una región de marco de lectura abierto (ORF) de un gen de interés seguida de una señal de poli A (pA); un elemento bivalente simétrico (DS); un origen de replicación eucariota derivado del virus de Epstein Barr (OriP), que permite la replicación del plásmido vector en células que expresan la proteína EBNA-1 viral (por ejemplo, células HEK-293-6E); una región de repetición (FR); un marcador de resistencia a la ampicilina (AmpR); y un origen de replicación bacteriano (pMB1ori).
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El vector pHybC utiliza el promotor pCMV, uno de los elementos promotores más fuertes disponibles. Un mapa de vector de pHybC (vacío) se describe en la Figura 1. La secuencia de ácido nucleico del vector pHybC se expone en el SEQ ID NO: 1.
pHybE El vector pHybE (vacío) contiene dos orígenes de replicación, de tal manera que el vector se puede replicar en diferentes líneas celulares. pHybE contiene los siguientes elementos: un origen de replicación de SV40 ("Ori SV40"), que permite la replicación del plásmido vector en células que expresan la proteína grande del antígeno T de SV40 (por ejemplo, una célula COS7); un promotor de eucariota EF-1a conectado operablemente al sitio de inserción para un gen de interés; una región de marco de lectura abierto (ORF) de un gen de interés seguida de una señal de poli A (pA); un elemento bivalente simétrico (DS); un origen de replicación eucariótico derivado de un virus de Epstein Barr (OriP); una región de repetición (FR); un marcador de resistencia a la ampicilina (AmpR); y un origen de replicación bacteriano (pMB1ori). Un mapa de vector de pHybE (vacío) se describe en la Figura 2. pHybE se distingue de pHybC en que pHybE contiene un promotor EF-1a conectado operablemente al sitio de inserción para el gen de interés, mientras pHybC contiene un promotor de CMV. La secuencia de ácido nucleico del vector pHybE se expone en el SEQ ID NO: 2.
Los vectores mencionados a continuación se basan en pHybE o en pHybC, y, además, contienen regiones constantes de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina. Al igual que con pHybE y pHybC, los siguientes vectores tienen sitios de clonación que se pueden utilizar para la inserción de un gen de interés, p. ej., una secuencia codificante de una región variable de inmunoglobulina, o una porción de unión a antígeno de la misma. En cada caso, el sitio de clonación para el gen de interés es adyacente a la secuencia codificante de una región constante contenida en el vector. Por lo tanto, los vectores siguientes se pueden utilizar para expresar cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo que contienen una región constante concreta, y una región variable concreta. Al igual que con pHybC y pHybE, cada uno de los vectores de la invención mencionados a continuación contienen orígenes de replicación múltiples, de tal manera que la cadena ligera o pesada del anticuerpo se pueden expresar en diferentes líneas celulares utilizando el mismo vector. Las descripciones de vectores adicionales de la invención se exponen a continuación (véanse también los mapas de vectores proporcionados en las Figuras 8 a 25). Cabe señalar que los vectores pHyb descritos como versión 1 (V1) tienen un sitio Swa I adicional aguas arriba del sitio de restricción Srf I, mientras que los vectores descritos como pHyb versión 2 (V2) no tienen el sitio Swa I adicional.
Vectores de la invención que comprenden regiones constantes murinas
pHybC-mCg2a El vector pHybC-mCg2a está basado en el vector pHybC (por lo tanto contiene todos los elementos descritos anteriormente para pHybC). Este vector también comprende la secuencia codificante de inmunoglobulina murina para la región constante de cadena pesada gamma 2a. Por lo tanto, en una realización, el vector de pHybCmCg2a se puede utilizar para expresar una cadena pesada del anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (o una porción de la misma) y una región constante de cadena pesada gamma 2 murina. Alternativamente, pHybC-mCg2 se puede utilizar para expresar un gen de interés fusionado a una región constante de cadena pesada gamma 2, p. ej, una proteína de fusión de Fc. La Figura 8 muestra un mapa de pHybC-mBR3-mCg2a que comprende la secuencia codificante para el dominio extracelular (ECD) de la proteína BR3 murina como gen de interés. La secuencia de ácido nucleico de pHybC-mBR3-mCg2a se expone en el SEQ ID NO:
27.
pHybE-MCK El vector pHybE-MCK está basado en el vector pHybE (por lo tanto contiene todos los elementos descritos anteriormente para pHybE). pHybE-MCK también comprende la secuencia codificante de inmunoglobulina murina para la región constante de la cadena ligera kappa. Por lo tanto, en una realización, el vector pHybE-MCK se puede utilizar para expresar una cadena ligera de anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina y una región constante de cadena ligera kappa murina. Alternativamente, pHybE-MCK se puede utilizar para expresar un gen de interés fusionado a una región constante de cadena ligera kappa murina. Un mapa de vector de pHybE-MCK V2 se proporciona en la Figura 25. La secuencia de ácido nucleico de pHybE-MCK V1 se expone en el SEQ ID NO: 3 y la secuencia de ácido nucleico de pHybE-MCK V2 se expone en el SEQ ID NO: 4.
pHybE-mCg1 pHybE-mCg1 está basado en el vector pHybE (por lo tanto contiene todos los elementos descritos anteriormente para pHybE). Este vector también comprende la secuencia codificante de inmunoglobulina murina para la región constante de cadena pesada gamma 1. Por lo tanto, en una realización, el vector de pHybE-mCg1 se puede utilizar para expresar una cadena pesada del anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y una región constante de la cadena pesada gamma 1 murina. Alternativamente, pHybEmCg1 se puede utilizar para expresar un gen de interés fusionado a una región constante de la cadena pesada gamma 1 murina, p. ej, una proteína de fusión de Fc. Un mapa de vector de pHybE-mCg1 V2 se proporciona en la Figura 21. La secuencia de ácido nucleico de pHybE-mCg1 V1 se expone en el SEQ ID NO: 5 y la secuencia de ácido nucleico de pHybE-mCg1 V2 se expone en el SEQ ID NO: 6.
pHYbE-mCg2a pHybE-mCg2a está basado en el vector pHybE (por lo tanto contiene todos los elementos descritos anteriormente para pHybE). Este vector también comprende la secuencia codificante de inmunoglobulina murina
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memoria. El grado de identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico afecta a la eficacia y la intensidad de sucesos de hibridación entre tales moléculas. Una secuencia de ácido nucleico parcialmente idéntica inhibirá al menos parcialmente la hibridación de una secuencia completamente idéntica con una molécula diana. La inhibición de la hibridación de la secuencia completamente idéntica puede evaluarse usando análisis de hibridación que son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, transferencia Southern, transferencia Northern, hibridación en solución, o similares, véase Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York; o Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1997)). Tales ensayos pueden realizarse usando grados variables de selectividad, por ejemplo, usando condiciones que varían de baja a alta rigurosidad. Si se emplean condiciones de baja rigurosidad, la ausencia de unión no específica puede evaluarse usando una sonda secundaria que carece incluso de un grado parcial de identidad de secuencia (por ejemplo, una sonda que tiene menos de aproximadamente 30% de identidad de secuencia con la molécula diana), de manera que, en ausencia de eventos de unión no específica, la sonda secundaria no hibridará con la diana.
Cuando se utiliza un sistema de detección basado en la hibridación, se elige una sonda de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana, y a continuación mediante la selección de las condiciones apropiadas la sonda y la secuencia diana "hibridan selectivamente", o se unen, entre sí para formar una molécula híbrida. Una molécula de ácido nucleico que es capaz de hibridarse selectivamente a una secuencia diana en condiciones "moderadamente rigurosas" típicamente hibrida en condiciones que permiten la detección de una secuencia de ácido nucleico diana de al menos aproximadamente 10-14 nucleótidos de longitud que tiene al menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia con la secuencia de la sonda de ácido nucleico seleccionada. Las condiciones de hibridación rigurosas típicamente permiten la detección de secuencias de ácidos nucleicos diana de al menos aproximadamente 10-14 nucleótidos de longitud que tienen una identidad de secuencia de más de aproximadamente 90 a 95% con la secuencia de la sonda de ácido nucleico seleccionada. Las condiciones de hibridación útiles para la hibridación de la sonda/diana, donde la sonda y la diana tienen un grado específico de identidad de secuencia, pueden determinarse como se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editores B. D. Hames y S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington DC.; IRL Press).
Con respecto a las condiciones de rigurosidad para la hibridación, es bien sabido en la técnica que se pueden emplear numerosas condiciones equivalentes para establecer una rigurosidad concreta variando, por ejemplo, los siguientes factores: la longitud y naturaleza de las secuencias de la sonda y diana, la composición de bases de las diversas secuencias, las concentraciones de sales y otros componentes de la solución de hibridación, la presencia o ausencia de agentes de bloqueo o detergentes en las soluciones de hibridación (p. ej., formamida, sulfato de dextrano y polietilenglicol, y dodecilsulfato de sodio), los parámetros de temperatura y de tiempo de la reacción de hibridación, así como, variando las condiciones de lavado. La selección de un conjunto particular de condiciones de hibridación se realiza siguiendo procedimientos convencionales en la técnica (véase, por ejemplo, véase Sambrook, et al., Supra, o Ausubel et al., Supra). Un primer polinucleótido está "derivado de" un segundo polinucleótido si tiene la misma o sustancialmente la misma secuencia de pares de bases que una región del segundo polinucleótido, su ADNc, sus complementos, o si presenta una identidad de secuencia como se ha descrito anteriormente. Un primer polipéptido está "derivado de" un segundo polipéptido si está (i) codificado por un primer polinucleótido derivado de un segundo polinucleótido, o (ii) muestra una identidad de secuencia con los segundos polipéptidos como se ha descrito anteriormente.
La invención también proporciona un kit que contiene uno o más vectores de la invención en un recipiente adecuado tal como un vial. Los vectores de expresión pueden contener al menos un sitio de clonación para la inserción de una secuencia de interés seleccionada, o pueden tener un gen de interés específico ya presente en el vector. El vector puede ser proporcionado en una forma deshidratada o liofilizada, o en una solución acuosa. El kit puede incluir un tampón para reconstituir el polinucleótido deshidratado. Otros reactivos pueden incluirse en el kit, por ejemplo, tampones de reacción, vectores de control positivo y negativo para la comparación. Generalmente, el kit también incluirá instrucciones para el uso de los reactivos en el mismo.
III. Usos de los vectores de la invención La invención incluye métodos para expresar proteínas utilizando los vectores descritos en la presente memoria. Por lo tanto, la invención incluye un método para producir una proteína recombinante que comprende introducir el vector de expresión de la invención en una célula anfitriona de mamífero, cultivar la célula anfitriona de mamífero bajo condiciones adecuadas para expresar la proteína, y recuperar la proteína. Una ventaja del vector de la invención es que proporciona una alta producción de proteína utilizando sistemas de cultivo de células de mamíferos.
Cualquier tipo de célula susceptible de expresión génica a través de un ácido nucleico o vector de expresión de la presente invención se puede utilizar en la presente invención como célula anfitriona. El término "células anfitrionas" se refiere a células que han sido transformadas con un vector construido utilizando técnicas de ADN recombinante.
Los expertos en la técnica puede seleccionar una línea de célula anfitriona concreta que sea la más adecuada para
18
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Tabla 2: Conjunto maestro ilustrativo de vectores pHybE preparados para la expresión de IgG humana y de ratón
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Vectores de cadena pesada Vectores cadena ligera
Humano
pHybE-,hCg1, z ,a pHybE-hCk
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pHybE-,hCg1, z, no a pHybE-hCl
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pHybE-,hCg1, z, no a, (mut 234235) imagen22
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pHybE-,hCg1, z, no a, (mut 234237) imagen24
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pHybE-,hCg2,n+ imagen26
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pHybE-,hCg2,n imagen28
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pHybE-,hCg4 imagen30
Ratón
pHybE-mCg1 pHybE-mCk
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pHybE-mCg2a imagen32
Compendio:
5 Los experimentos anteriores descritos en los Ejemplos 1-4 muestran que los vectores pHyb-C y pHyb-E son funcionales en más de una línea celular a la vez que proporcionar una amplia expresión de proteínas que a menudo supera los niveles de expresión observados con los vectores pBOS y pTT3 originales. Este aumento de expresión fue particularmente pronunciado cuando se utilizó el vector pHyb-E para expresar la proteína de fusión mBR3-Fc de bajo rendimiento en las células HEK-293-6E. Como se muestra mediante estos datos, los vectores pHyb-C y pHyb-E
10 representan un avance significativo en la tecnología de vectores sobre los vectores utilizados previamente.
Tabla 3: Visión de conjunto de vectores de la invención Los vectores pHyb descritos como versión 1 tienen un sitio adicional Swa I aguas arriba del sitio de restricción Srf I. Los pHyb vectores descritos como versión 2, no tienen sitio adicional Swa I.
SEQ ID NO
DESCRIPCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
1
pHybC-vacío
2
pHybE-vacío
3
pJP180 ; pHybE-mCk V1
4
pJP193 ; pHybE-mCk V2
5
pJP176 ; pHybE-V1 mCg1
6
pJP189 ; pHybE-mCg1 V2
7
pJP177 ; pHybE-mCg2a V1
8
pJP190 ; pHybE-mCg2a V2
9
pJP178 ; pHybE-hCk V1
10
pJP191 ; pHybE-hCk V2
11
pJP179 ; pHybE-hCk V1
12
pJP192 ; pHybE-hC1 V2
13
pJP170 ; pHybE-hCg1, z, a V1
14
pJP182 ; pHybE-hCg1, z, a V2
15
pJP171 ; pHybE-hCg1,z,no a V1
16
pJP183 ; pHybE-hCg1,z,no a V2
17
pJP172 ; pHybE-hCg1,z,no a,mut (234,235) V1
18
pJP184 ; pHybE-hCg1,z,no a,mut (234,235) V2
19
pJP173 ; pHybE-hCg1,z,no a,mut (234,237) V1
20
pJP185 ; pHybE-hCg1,z,no a,mut (234,237) V2
24

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    imagen2
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