CN107254472A - 人表皮生长因子hEGF基因优化序列及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人表皮生长因子hEGF基因优化序列及其制备方法和应用，所述优化序列如SEQIDNO.1所示。本发明通过改变EGF基因的cDNA结构，同义密码子置换核苷酸序列中个别基因的碱基，选择了一种密码子偏好性最优的合成EGF优化序列，构建原核表达载体pET‑30a‑hEGF使其在大肠杆菌宿主中能够得到高水平的表达。对EGF产业化生产及其应用具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人表皮生长因子hEGF基因优化序列及其制备方法和应用。
背景技术
EGF是继神经生长因子之后发现的第二个生长因子，1959年由Chone首先从小鼠领下腺中分离出来，因为能够促进小鼠门齿的萌出及眼睑睁开，最初被称为“齿睑因子”。随后发现这种多肽能够促进表皮生长，又将其命名为表皮生长因子(即小鼠表皮生长因子，mEGF)121。1975年Gergoyr从人尿中提取出一种具有抑制胃酸分泌的物质称为尿抑胃素(urogastrone)，后来证实尿抑胃素即人EGF(hEGF)。
hEGF含有53个氨基酸残基，分子量为6200Da，沉降系数1.255，等电点pH4.7，含3个链内二硫键，是多肤生长因子中最小的一个。相对于其它多肤类物质，EGF对酸和热均较稳定，是已知的最稳定的蛋白多肽之一。hEGF系一单链多肤，圆二色谱研究表明，hEGF没有α螺旋，β片层结构占22％。在整个hEGF分子中，主要折叠为两个结构域：1-32氨基酸残基区域为N- 端结构域，33-53氨基酸残基区域为C-端结构域。其中22-32残基区和33-53残基区直接参与EGF 与其受体的结合，前者起信号转导作用，后者起稳定作用。
hEGF能促进烧伤、创伤及外科伤的愈合，在烧伤、创伤、皮肤和角膜移植、外伤性皮肤溃疡等治疗中有重要作用。EGF也是某些化妆品的添加剂，具有较大的市场价值。目前利用原核***表达重组hEGF(rhEGF)的主要弊端是表达量较低，生物活性不高，真核表达周期长，操作繁琐，成本高等缺点很难规模化生产。
发明内容
解决的技术问题：本发明的目的是解决现有原核***表达重组hEGF(rhEGF)表达量较低、生物活性不高、操作繁琐、成本高的技术问题，提供一种人表皮生长因子hEGF基因优化序列及其制备方法和应用。
技术方案：人表皮生长因子hEGF基因优化序列，如SEQIDNO.1所示。
上述人表皮生长因子hEGF基因优化序列的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，在基因数据库中获取人表皮生长因子hEGF基因；
步骤2，基因优化：对人表皮生长因子hEGF基因的编码区进行大肠杆菌密码子偏爱性的基因优化得到优化序列，优化序列编码的氨基酸与人表皮生长因子hEGF基因编码形成的氨基酸序列一致；
步骤3，添加酶切位点：在优化序列的5’端添加一种内切酶的酶切位点，在优化序列的3’端添加另一种内切酶酶切位点，得到合成序列；
步骤4，基因合成：对得到的合成序列进行全基因合成。
进一步地，在步骤3中，优化序列的5’端添加NdeI酶切位点，优化序列的3’端添加XhoI酶切位点。
含有上述人表皮生长因子hEGF基因优化序列的质粒。
进一步地，所述质粒为pET-30a质粒。
进一步地，上述人表皮生长因子hEGF基因优化序列***到pET-30a质粒的Nde I酶切位点和Xho I酶切位点之间。
含有上述人表皮生长因子hEGF基因优化序列的原核生物。
进一步地，所述原核生物为大肠杆菌。
上述人表皮生长因子hEGF基因优化序列表达得到的人表皮生长因子hEGF在制备护肤品中的应用。
有益效果：利用本发明的人表皮生长因子hEGF基因优化序列可实现原核细菌宿主工程菌 EGF蛋白的高表达，并且具有较高的生物学活性：1、其表达量约占总蛋白的30％左右，以包涵体的形式表达，复性成功的前体下包涵体处理相对较容易；2、通过纯化后，得到纯度在95％左右的EGF小肽，并且依据中国药典2010版中的重组人表皮生长因子生物学活性测定方法，检测了生物学活性，活性大于药典标准1×105UI。
附图说明
图1为实施例1中人表皮生长因子hEGF优化基因扩增琼脂糖凝胶电泳图；
图2为实施例2中人表皮生长因子hEGF蛋白表达鉴定SDS-PAGE电泳图；
图3为实施例2中人表皮生长因子hEGF蛋白纯化SDS-PAGE电泳图；
图4为实施例3中人表皮生长因子hEGF蛋白MTT法活性检测吸光值统计图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1
人表皮生长因子hEGF的基因优化方法
登录GeneBank，查找人表皮生长因子hEGF活性肽的基因序列，其核酸长度为159bp， hEGF为真核生物多肽序列，考虑到后续研发在原核中进行表达，因此将上述hEGF真核多肽序列的编码密码子与大肠杆菌偏好性密码子进行比较分析。根据密码子的兼并性和不改变 hEGF活性肽氨基酸排列顺序不变的情况下，参照生物软件Vector NTI Suitor 7.0对hEGF核酸序列进行分析，对已知的hEGF进行基因改造优化，主要是将hEGF原基因序列中大肠杆菌稀有的密码子改成偏好的密码子，以提高目的基因在大肠杆菌的高水平表达。并进行转基因验证，最终得到hEGF基因的优化序列如SEQIDNO.1所示。
将人hEGF基因优化序列N端和C端分别加上NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点。送上海生工公司进行全基因合成，PCR扩增基因后(如图1所示，基因片段大小正确)并连入原核表达载体pET-30a(军事医学科学院馈赠)的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到重组的原核表达质粒pET-30a-hEGF。
实施例2
2.1表达菌株的获得
将实施例1中的得到的原核表达载体pET-30a-hEGF通过热激法转入大肠杆菌BL21(DE3)(购自于天根生物公司)中，LB平板培养基中加入卡那霉素50ug/mL进行筛选，挑选单克隆进行测序确认鉴定。
2.2人表皮生长因子hEGF基因优化序列的诱导表达
将重组阳性单克隆菌落接种到含有浓度为50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃， 220rpm振荡培养过夜，按照1％的比例将过夜培养的菌液接种到含有50ug/mL卡那霉素的新鲜的液体培养基中，37℃，220rpm培养至菌液浓度OD600约为0.9，立即加入诱导剂IPTG 至0.5Mm，将诱导组和对照组继续培养3h，12000rpm，离心10min收集菌体。
2.3人表皮生长因子hEGF提取与鉴定
将离心收集的菌体，按照每克菌体湿重加入10mL的PBS缓冲液重选菌体，充分混匀，用终浓度为1mg/mL的溶菌酶溶液4℃过夜消化菌体。处理后的菌体于冰上超声破碎，超声 5s,间隔5s，总用15min，然后4℃，12000rpm离心30min。取包涵体沉淀，用1％的Triton-x-100 洗涤3遍，得到粗纯后的包涵体进一步纯化。对未诱导包涵体和诱导后包涵体进行SDA-PAGE 分析，结果如图2所示：M为标准蛋白分子1、未诱导包涵体组份；2、诱导后包涵体组份。根据分子量大小可知诱导后多出来的蛋白条带就是hEGF蛋白。
采用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化人表皮生长因子hEGF，先用5倍柱床体积平衡液缓冲液(8M尿素，100mM NaH2PO4，100mM Tris-Hcl pH＝8)平衡层析柱，将上述hEGF样品按照1mL/min的流速上柱。当样品全部过完介质后，加入清洗缓冲液(8M尿素，100mM NaH2PO4，100mM Tris-Hcl pH＝6.3)，进行非特异结合杂质的清洗，最后加入洗脱缓冲液(8M 尿素，100mM NaH2PO4，100mM Tris-Hcl pH＝4.5)进行洗脱，收集洗脱目的蛋白，将洗脱后的目的蛋白以含0.1mol/L的GSH和0.1mol/L的GSSG洗脱缓冲液(100mM NaH2PO4，100mM Tris-HclpH＝8.0)在4℃条件下以1：20的体积进行透析，2h换一次透析液，5次后，用洗脱缓冲液(100mM NaH2PO4，100mM Tris-Hcl pH＝8.0)透析，全过程无沉淀产生。透析后样品的SDS-PAGE鉴定蛋白纯度在95％以上。对诱导后未处理的包涵体、诱导后粗纯的包涵体和诱导后纯化的包涵体进行SDA-PAGE分析，结果如图3所示：M为标准蛋白分子1、诱导后未处理的包涵体混合物，2、诱导后，包涵体洗涤粗纯的结果，3、诱导后粗纯完的样品上柱纯化后结果，由结果可知最终纯化后其本上除出了所有杂蛋白。
实施例3
人表皮生长因子hEGF生物学活性验证
将购买的Balb/c 3T3细胞(购自ATCC公司)传至3-4代，计数后，然后铺96孔板，每孔1×105个细胞。在96孔板DMEM完全培养基中(10％的血清)培养24小时后，加入维持培养基(0.4％的血清)中继续培养24小时。
hEGF(终浓度为20ng/mL)，分别加对照组NC和EGF标准品(终浓度为20ng/mL)小肽刺激小鼠胚胎成纤维细胞Balb/c 3T3细胞72小时后，通过MTT法检测hEGF促进细胞增殖作用。酶标仪在450nm波长下检测吸光度，吸光度值与细胞增殖活性成正比。计算出比活性为6.1×107IU。结果见表1与图4，hEGF处理组增殖效果明显优于对照组，与标准样品相当。
表1hEGF细胞活性MTT法检测结果统计
*表示EGF处理组与对照组比较，具有显著性差异。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏迈健生物科技发展股份有限公司
<120> 人表皮生长因子hEGF基因优化序列及其制备方法和应用
<130> 20170615
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aacagcgact ctgaatgccc actgtcccac gatggttact gcctgcatga tggtgtgtgc 60
atgtatattg aagctctgga caagtatgca tgcaattgtg ttgtaggcta catcggcgag 120
cgttgtcaat accgtgacct gaaatggtgg gaactgcgc 159
Claims (9)
1.人表皮生长因子hEGF基因优化序列，其特征在于：所述序列如SEQIDNO.1所示。
2.权利要求1所述的人表皮生长因子hEGF基因优化序列的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，在基因数据库中获取人表皮生长因子hEGF基因；
步骤2，基因优化：对人表皮生长因子hEGF基因的编码区进行大肠杆菌密码子偏爱性的基因优化得到优化序列，优化序列编码的氨基酸与人表皮生长因子hEGF基因编码形成的氨基酸序列一致；
步骤3，添加酶切位点：在优化序列的5’端添加一种内切酶的酶切位点，在优化序列的3’端添加另一种内切酶酶切位点，得到合成序列；
步骤4，基因合成：对得到的合成序列进行全基因合成。
3.根据权利要求2所述的人表皮生长因子hEGF基因优化序列的制备方法，其特征在于：在步骤3中，优化序列的5’端添加NdeI酶切位点，优化序列的3’端添加XhoI酶切位点。
4.含有权利要求1所述的人表皮生长因子hEGF基因优化序列的质粒。
5.根据权利要求4所述的含有权利要求1所述的人表皮生长因子hEGF基因优化序列的质粒，其特征在于：所述质粒为 pET-30a质粒 。
6.根据权利要求5所述的含有权利要求1所述的人表皮生长因子hEGF基因优化序列的质粒，其特征在于：权利要求1所述的人表皮生长因子hEGF基因优化序列***到pET-30a质粒的 Nde I 酶切位点和 Xho I 酶切位点之间。
7.含有权利要求1所述的人表皮生长因子hEGF基因优化序列的原核生物。
8.根据权利要求7所述的含有权利要求1所述的人表皮生长因子hEGF基因优化序列的原核生物，其特征在于：所述原核生物为大肠杆菌。
9.权利要求1所述的人表皮生长因子hEGF基因优化序列表达得到的人表皮生长因子hEGF在制备护肤品中的应用。
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