JP5635912B2 - 改善された哺乳動物発現ベクター及びその使用 - Google Patents
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Description
本願は、2008年1月15日提出の米国特許仮出願第61/021282号及び2008年10月10日提出の米国特許仮出願第61/104546号(これらのそれぞれの内容は、それらの全体において本明細書により組み込まれる。)に対する優先権を主張する。
本発明がより容易に理解され得るように、本明細書中である一定の用語を最初に定義する。
本発明は、哺乳動物宿主細胞でタンパク質を発現させるためのエピソームベクターを提供する。本発明のベクターは、複製起点のいずれかに対するトランス作用複製開始因子を含有する何らかの細胞株においてベクターを使用できるようにする、2つのエピソーム複製起点の含有に基づく。本ベクターが、複製起点に結合する複製開始因子も含有し得る一方、好ましい実施形態において、トランス作用複製因子は宿主細胞により提供される。さらに、ある実施形態において、本発明のベクターは、本ベクターが関心のある遺伝子に操作可能に連結される重又は軽鎖定常領域を含有するので、抗体及びFc融合タンパク質の産生のための効率的で有効な手段を提供する。本発明のベクターの例は図1、2及び8から25に記載する。さらに、典型的ベクターの配列は配列番号1から32で提供する。図1及び2(及び対応する配列番号1及び2)は、「オープン」ベクター、即ち、抗体重又は軽鎖定常領域及び関心のある遺伝子を含有しない本発明のベクターを記載する。図8−25は、関心のある遺伝子をクローニングするための部位とともに様々なマウス又はヒト定常領域も含む本発明のベクターのマップを提供する。
pHybCベクター(空)は、様々な細胞株中でこのベクターが複製され得るように、2個のウイルス複製起点を含有する。pHybCは、次のエレメントを含有する:SV40のラージT抗原タンパク質を発現する細胞(例えばCOS7細胞)でベクタープラスミド複製を可能にする、SV40複製起点(「SV40 Ori」);関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結される、CMVプロモーター(「pCMV」);3成分(tripartite)リーダー配列(TPL);スプライスドナー部位(SD);アデノウイルス主要後期エンハンサーエレメント(enhMLP);スプライス受容部位(SA);関心のある遺伝子に対するオープン・リーディング・フレーム(ORF)領域とそれに続くポリAシグナル(pA);二重対称エレメント(DS);ウイルスEBNA−1タンパク質を発現する細胞(例えばHEK−293−6E細胞)でのベクタープラスミドの複製を可能にする、エプスタインバーウイルス由来真核性複製起点(OriP);反復領域(FR);アンピシリン耐性マーカー(AmpR);及び細菌複製起点(pMB1ori)。pHybCベクターは、入手可能な最強プロモーターエレメントの1つであるpCMVプロモーターを使用する。pHybC(空)のベクターマップは図1に記載する。pHybCベクターの核酸配列は配列番号1で示す。
pHybEベクター(空)は、異なる細胞株中でこのベクターが複製され得るように、2つの複製起点を含有する。pHybEは、次のエレメントを含有する:SV40のラージT抗原タンパク質を発現する細胞(例えばCOS7細胞)でのベクタープラスミド複製を可能にする、SV40複製起点(「SV40 Ori」);関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結される、EF−1α真核性プロモーター;関心のある遺伝子に対するオープン・リーディング・フレーム(ORF)領域と、それに続くポリAシグナル(pA);二重対称(dyad symmetry)エレメント(DS);エプスタインバーウイルス由来真核複製起点(OriP);反復領域(FR);アンピシリン耐性マーカー(AmpR);及び細菌複製起点(pMB1ori)。pHybE(空)のベクターマップは図2に記載する。pHybEは、pHybEが関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結されるEF−1αプロモーターを含有し、一方pHybCがCMVプロモーターを含有するという点で、pHybCとは区別される。pHybEベクターの核酸配列は配列番号2で示す。
pHybC−mCg2a
ベクターpHybC−mCg2aは、pHybCベクターに基づく(従ってpHybCに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ2a重鎖定常領域に対するマウス免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybC−mCg2aベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域(又はその一部)及びマウスγ2重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybC−mCg2は、γ2重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。図8は、関心のある遺伝子としてマウスBR3タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)に対するコード配列を含むpHybC−mBR3−mCg2のマップを示す。pHybC−mBR3−mCg2aの核酸配列は配列番号27で示す。
ベクターpHybE−mCkは、pHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。pHybE−mCkは、κ軽鎖定常領域に対するマウス免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−mCkベクターは、免疫グロブリン軽鎖可変領域及びマウスκ軽鎖定常領域を含む抗体軽鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−mCkは、マウスκ軽鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る。pHybE−mCk V2のベクターマップは図25で与える。pHybE−mCk V1の核酸配列ば配列番号3で示し、pHybE−mCk V2の核酸配列は配列番号4で示す。
pHybE−mCg1は、pHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ1重鎖定常領域に対するマウス免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−mCg1ベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域及びマウスγ1重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−mCg1は、マウスγ1重鎖定常領域に融合される関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−mCg1 V2のベクターマップは図21で与える。pHybE−mCg1 V1の核酸配列は配列番号5で示し、pHybE−mCg1 V2の核酸配列は配列番号6で示す。
pHybE−mCg2aはpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ2a重鎖定常領域に対するマウス免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−mCg2aベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域及びマウスγ2重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−mCg2aは、γ2重鎖定常領域に融合される関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−mCg2a V2のベクターマップは図22で与える。pHybE−mCg2a V1の核酸配列は配列番号7として示し、pHybE−mCg2a V2の核酸配列は配列番号8で示す。pHybE−mCg2がどのように使用され得るかというある実施形態の例として、図9は、pHybE−mBR3−mCg2aのマップを示す。図9に記載のベクターは、マウスBR3タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)に対するコード配列を含有する。pHybE−mBR3−mCg2aの核酸配列は配列番号28で示す。
pHybC−E7−hCk
pHybC−E7−hCkは、pHybCベクターに基づく(従ってpHybCに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、κ軽鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。さらに、pHybC−E7−hCkは、アダリムマブの軽鎖可変領域のコード配列を含有する(「E7」とも呼ばれる。)。pHybC−E7−hCkのベクターマップは図10で与え、pHybC−E7−hCkの核酸配列は配列番号29で示す。
pHybC−D2−hCg1,z,aは、pHybCベクターに基づく(従って、pHybCに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ1,z,a重鎖定常領域に対するコード配列も含む。さらに、pHybC−D2−hCg1,z,aは、アダリムマブの重鎖可変領域のコード配列を含有する(「D2」とも呼ばれる。)。pHybC−D2−hCg1,z,aのベクターマップは図11で与える。pHybC−D2−hCg1,z,aの核酸配列は配列番号30で示す。
pHybE−hCkはpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、κ軽鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、例えば、pHybE−hCkベクターは、免疫グロブリン可変軽鎖領域及びヒトκ軽鎖定常領域を含む抗体軽鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCkは、κ軽鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る。pHybE−hCk V2のベクターマップは図23で与える。pHybE−hCk V1の核酸配列は配列番号9で示し、pHybE−hCk V2の核酸配列は配列番号10で示す。pHybE−E7−hCkのベクターマップもまた図13で与える。上述のpHybE−hCkベクターのエレメント全てに加えて、pHybE−E7−hCkは、アダリムマブの軽鎖可変領域のコード配列を含有する(「E7」とも呼ばれる。)。pHybE−E7−hCkの核酸配列は配列番号32で示す。
pHybE−hClはpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、λ軽鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hClベクターは、免疫グロブリン可変軽鎖領域及びヒトλ軽鎖定常領域を含む抗体軽鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hClは、λ軽鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る。pHybE−hCl V2のベクターマップは図24で与える。pHybE−hCl V1の核酸配列は配列番号11で示し、pHybE−hCl V2の核酸配列は配列番号12で示す。
pHybE−hCg1,z,aは、pHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ1,z,a重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg1,z,aベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ1,z,a重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg1,z,aは、γ1,z,a重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg1,z,aのベクターマップは図14で与える。pHybE−hCg1,z,a V1の核酸配列は配列番号13で示し、pHybE−hCg1,z,a V2の核酸配列は配列番号14で示す。pHybE−D2−hCg1,z,aに対するベクターマップは図12で与える。上述のpHybE−hCg1,z,aのエレメントに加えて、pHybE−D2−hCg1,z,aは、アダリムマブの重鎖可変領域(「D2」とも呼ばれる。)のコード配列を含有する。pHybE−D2−hCg1,z,aの核酸配列は配列番号31で示す。
pHybE−hCg1,z,non−aはpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ1,z,non−a重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg1,z,non−aベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ1,z,non−a重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg1,z,non−aは、γ1,z,non−a重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg1,z,non−a V2のベクターマップは図15で与える。pHybE−hCg1,z,non−a V1の核酸配列は配列番号15で示し、pHybE−hCg1,z,non−a V2の核酸配列は配列番号16で示す。
pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,235)はpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ1,z,non−a,mut(234,235)重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,235)ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ1,z,non−a,mut(234,235)重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,235)は、γ1,z,non−a,mut(234,235)重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,235)V2のベクターマップは図16で与える。pHybE−hcG1,z,non−a,mut(234,235)V1の核酸配列は配列番号17で示し、pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,235)V2の核酸配列は配列番号18で示す。
pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,237)はpHybEベクターに基づく。(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ1,z,non−a,mut(234,237)重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,237)ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ1,z,non−a,mut(234,237)重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,237)は、γ1,z,non−a,mut(234,237)重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,237)V2のベクターマップは図17で与える。pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,237)V1の核酸配列は配列番号19で示し、pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,237)V2の核酸配列は配列番号20で示す。
pHybE−hCg2,n−はpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまたγ2,n−重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg2,n−ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ2,n−重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg2,n−は、γ2,n−重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg2,n−V2のベクターマップは図19で与える。pHybE−hCg2,n−V1の核酸配列は配列番号21で示し、pHybE−hCg2,n−V2の核酸配列は配列番号22で示す。
pHybE−hCg2,n+はpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ2,n+重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg2,n+ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ2,n+重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg2,n+は、γ2,n+重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg2,n+のベクターマップは図18で与える。pHybE−hCg2,n+V1の核酸配列は配列番号23で示し、pHybE−hCg2,n+V2の核酸配列は配列番号24で示す。
pHybE−hCg4はpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ4重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg4ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ4重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg4は、γ4重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg4のベクターマップは図20で与える。pHybE−hCg4 V1の核酸配列は配列番号25で示し、pHybE−hCg4 V2の核酸配列は列番号26で示す。
本発明は、本明細書中に記載のベクターを用いてタンパク質を発現させる方法を含む。従って、本発明は、本発明の発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入し、タンパク質を発現させるために適切な条件下でその哺乳動物宿主細胞を培養し、タンパク質を回収することを含む、組み換えタンパク質を産生させる方法を含む。本発明のベクターの長所は、それが、哺乳動物細胞培養系を用いて高いタンパク質産生をもたらすことである。
次の実施例は、様々な哺乳動物宿主細胞、例えば、COS7及びHEK−293−6E細胞に対して個別のベクター構築を不要にするための革新的な解決法を説明する。次の実施例はまた、抗体の完全な軽又は重鎖の発現における又はFc融合タンパク質の発現における使用のための、抗体の定常領域をコードする核酸を含有するベクターも提供する。
図1及び2は、それぞれが2つの複製起点を含有する新しいベクターのマップを与える。図1及び2は、ベクターの「空」のものに相当し、即ち、関心のある遺伝子又は抗体定常領域の核酸を含有しない(下記実施例4で詳述)。pHybCは、関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結されるCMVプロモーターを含有し、一方、pHybEはEF−1αプロモーターを含有する。
2つの複製起点の付加によるベクターサイズの上昇がそのベクターによるタンパク質産生に影響を与えたか否か判定するために、それぞれが1つの複製起点のみを含有した対照ベクターpBOS及びpTT3と、上記のpHyb−E及びpHyb−Cベクターを比較した。pBOS、pTT3、pHyb−C及びpHyb−Eからの発現を比較するために、マウスBAFF受容体−ヒトFc融合タンパク質コンストラクト(mBR3−Fc)を4つのベクター骨格にサブクローニングし、エンドフリーDNA prepキットにより平行して調製した。
本実験で使用される293の一時的遺伝子移入手順は、Durocherら(2002);Nucleic Acids Research 30(2):E9及びPhamら(2005);Biotechnology Bioengineering 90(3):332−44で公開されている方法の変法であった。遺伝子移入において使用された試薬には次のものが含まれる。
次のような標準的電気穿孔条件を用いて、1コンストラクトあたり2枚のCOS7 150mmプレートを遺伝子移入した。COS7遺伝子移入実験に対して、DMEM+10%FBS+1xグルタミン中でCOS細胞を培養した。電気穿孔法に対して、1本のコンフルエントのT−150フラスコからの細胞を使用した。この細胞をトリプシン処理し、血清を不活性化するために、培地+血清中で沈降させた。次に細胞を1xPBS中で洗浄した。
ELISA及び/又はPorosAを用いて、遺伝子移入から5日後(COS7細胞の場合)又は7日後(293−6E細胞の場合)に、培地上清中のmBR3−Fc融合タンパク質濃度を試験した。
対照及び実験的遺伝子移入からのタンパク質発現レベルを示すデータを図3(COS細胞)及び図4(HEK−293細胞)で示す。図3のデータは、pHybC及びpHybEが両者とも、COS細胞中で融合タンパク質を産生することにおいて有効であり、両ベクターとも対照ベクターpTT3よりも高いレベルで発現したことを示す。図4で与えられるデータは、pHyb−Eにより遺伝子移入されたHEK細胞からの発現レベルがその他の3種類のベクターで見られる発現を超え、一方でpHyb−Cタンパク質産生レベルは対照と同等であったことを示す。従って、pHyb−C及びpHyb−Eは両者とも、それ以上とは言わないまでも、対照ベクター、pTT3及びpBOSと同程度に、mBr3−Fc融合タンパク質を発現することができる。
4つのベクター骨格に、TNFα(アダリムマブ)/D2E7に対するヒトIgG1/κモノクローナル抗体をサブクローニングし、エンドフリーDNA prepキットにより平行して調製した。
新しいpHyb−Eベクター骨格を用いた抗体産生のために使用し得るベクターの作製を促進するために、12種類の様々な重及び軽鎖ベクターのパネルを作製した(表2及び3で概要を与える。)。ヒト及びマウスIgG発現の両方を可能にする12種類のマスター鋳型pHybEベクターを構築した。
実施例1−4で述べられる先行する実験は、複数の細胞株でpHyb−C及びpHyb−Eベクターが機能的であり、同時に、元のpBOS及びpTT3ベクターで見られる発現レベルを超えることが多い、十分なタンパク質発現を提供することを示す。HEK−293−6E細胞中で収率の低いmBR3−Fc融合タンパク質を発現させるためにpHyb−Eベクターを使用した場合、この発現増大は特に顕著である。このデータにより示されるように、pHyb−C及びpHyb−Eベクターは、ベクター技術において、以前に使用されたベクターを上回る顕著な長所を示す。
当業者は、通常の実験のみを用いて、本明細書中に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの同等物を認識し、解明することができる。かかる同等物は、次の特許請求の範囲により包含されるものとする。
本願を通して引用され得る、引用される参照物全ての内容(参考文献、特許、特許出願及びウェブサイトを含む。)は、参照物がそこで引用されるように、あらゆる目的に対してそれらの全体において、本明細書により、参照により明確に組み込まれる。本発明の実施は、別段の断りがない限り、当技術分野で周知である、免疫学、分子生物学、細胞生物学及び薬物製造及び送達の従来技術を使用する。これらの技術には、以下に限定されないが、次の刊行物で記載される技術が含まれる。
Claims (37)
- (a)エプスタイン−バーウイルス(EBV)由来のOriP複製起点と;
(b)SV40複製起点と;
(c)関心のある遺伝子を挿入するための挿入部位と;
(d)挿入部位に操作可能に連結されるEF−1αプロモーターとを含み、
任意選択的に
(e)挿入部位に操作可能に連結される、抗体の重鎖又は軽鎖定常領域をコードする核酸配列を含む発現ベクターであって、
前記OriP複製起点に、前記発現ベクターによってコードされていないトランス作用EBMA1複製開始因子が結合する、発現ベクター。 - 関心のある遺伝子が抗体の重鎖又は軽鎖可変領域である請求項1に記載の発現ベクター。
- 抗体の重鎖又は軽鎖可変領域が、マウス、ヒト化、キメラ及びヒトからなる群から選択される請求項2に記載の発現ベクター。
- 抗体重鎖可変領域が、アダリムマブ、ABT−325及びABT−874からなる群から選択される抗体の重鎖可変領域である請求項2に記載の発現ベクター。
- 抗体軽鎖可変領域が、アダリムマブ、ABT−325及びABT−874からなる群から選択される抗体の軽鎖可変領域である請求項2に記載の発現ベクター。
- 抗体重鎖定常領域がマウス又はヒトである請求項1から請求項5のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 抗体重鎖定常領域が、γ1,z,a;γ1,z,non−a;γ2,n+;γ2,n−;及びγ4からなる群から選択される請求項1から5のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- γ1,z,non−a抗体重鎖定常領域が、重鎖定常領域の位置234(EU付番システム)にアラニン置換をさらに含む請求項7に記載の発現ベクター。
- 抗体重鎖定常領域の位置235又は237(EU付番システム)のいずれかにアラニン置換をさらに含む請求項8に記載の発現ベクター。
- 抗体軽鎖定常領域がヒトκアイソタイプ又はヒトλアイソタイプのいずれかである請求項1から請求項5のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 抗体重鎖定常領域が、マウスγ1アイソタイプ又はマウスγ2aアイソタイプのいずれかである請求項1から請求項5のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 抗体軽鎖定常領域がマウスκアイソタイプである請求項1から請求項5のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 抗体重鎖定常領域がFcドメインである請求項1に記載の発現ベクター。
- 重鎖又は軽鎖抗体可変領域が挿入部位に対して5’である請求項2から請求項5及び請求項13のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 選択可能マーカーをさらに含む請求項1から請求項5及び請求項13のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 選択可能マーカーがアンピシリン耐性遺伝子である請求項15に記載の発現ベクター。
- EF−1αプロモーターがヒトである請求項1に記載の発現ベクター。
- EF−1αプロモーターが、配列番号2のヌクレオチド76から1267と少なくとも90%同一である核酸配列を含む請求項1から請求項5及び請求項13のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- EF−1αプロモーターが、配列番号2のヌクレオチド76から1267と少なくとも95%同一である核酸配列を含む請求項1から請求項5及び請求項13のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- EF−1αプロモーターが、配列番号2のヌクレオチド76から1267を含む請求項1から請求項5及び請求項13のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- OriP複製起点が、配列番号1のヌクレオチドの1795から3545を含む請求項1から請求項5及び請求項13のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- OriP複製起点が、配列番号1のヌクレオチドの1795から3545と少なくとも90%同一である核酸配列を含む請求項1から請求項5及び請求項13のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- OriP複製起点が、配列番号1のヌクレオチドの1795から3545と少なくとも95%同一である核酸配列を含む請求項1から請求項5及び請求項13のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- SV40複製起点が、配列番号1のヌクレオチド5834から6140と少なくとも90%同一である核酸配列を含む請求項1から請求項5及び請求項13のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- SV40複製起点が、配列番号1のヌクレオチド5834から6140と少なくとも95%同一である核酸配列を含む請求項1から請求項5及び請求項13のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- SV40複製起点が配列番号1のヌクレオチド5834から6140を含む請求項1から請求項5及び請求項13のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、31及び32からなる群から選択される配列と少なくとも90%同一である核酸配列を含む発現ベクター。
- 配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、31及び32からなる群から選択される配列と少なくとも95%同一である核酸配列を含む発現ベクター。
- 配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、31及び32からなる群から選択される核酸配列を含む発現ベクター。
- 図2、9及び12から25のいずれか1つに記載の発現ベクター。
- シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む請求項1から請求項5、請求項13及び請求項27から請求項30のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 請求項1から請求項5、請求項13及び請求項27から請求項30のいずれか一項に記載のベクターを含むキット。
- 請求項1から請求項5、請求項13及び請求項27から請求項30のいずれか一項に記載のベクターを含む哺乳動物宿主細胞。
- COS細胞又はヒト胚腎臓(HEK)細胞である請求項33に記載の哺乳動物宿主細胞。
- COS7細胞である請求項34に記載の哺乳動物宿主細胞。
- HEK−293−6E細胞である請求項34に記載の哺乳動物宿主細胞。
- 請求項1から請求項5、請求項13及び請求項27から請求項30のいずれか一項に記載の発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入することと、タンパク質を発現させるために適切な条件下で哺乳動物宿主細胞を培養することと、タンパク質を回収することとを含む、組み換えタンパク質を産生させる方法。
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