KR20100054428A - 인삼 또는 인삼추출물로부터 유산균인 락토바실러스 가세리ｋｃｔｃ 3163 발효에 의한 당항상성 개선용 추출물 및 그의 제조방법 - Google Patents
인삼 또는 인삼추출물로부터 유산균인 락토바실러스 가세리ｋｃｔｃ 3163 발효에 의한 당항상성 개선용 추출물 및 그의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인삼을 특정 유산균으로 발효시켜 제조된 당항상성 개선용 추출물 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 인삼 혹은 인삼 추출물을 유산균인 락토바실러스 가세리 KCTC 3163 (Lactobacillus gasseri KCTC 3163)으로 발효시켜 발효물로부터 포도당 항상성 개선용 성분을 에탄올(주정 포함) 혹은 부탄올로 추출하는 것으로서, (1) 인삼 분말을 증류수에 현탁하는 단계, (2) 인삼을 유산균으로 발효시키는 단계, (3) 발효물을 에탄올(혹은 주정) 혹은 부탄올(1-butanol, n-butanol)로 추출한 후 여과하는 단계 및 (4) 여과액을 감압농축한 후 동결건조하여 추출물을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 당항상성 개선용 추출물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 인삼을 유산균으로 발효시켜 얻은 추출물은 포도당 항상성 유지 혹은 개선 효과가 우수하여 공복혈당장애자, 내당능장애자, 당뇨병 전단계로 진단받은 자, 당뇨병 환자의 치료에 효과가 있다.
인삼, 유산균, 포도당 항상성, 당뇨병, 혈당강하, 인슐린 저항성 개선, 인슐 린 분비 촉진, 췌장 베타세포 사멸 억제, 당흡수 촉진, 글루코키나제 증진
Description
본 발명은 인삼 (혹은 인삼 추출물)을 유산균 (Lactobacillus gasseri KCTC 3163)으로 발효시켜 얻은 포도당 항상성 개선용 발효물에 에탄올 또는 부탄올로 추출하여 얻은 당항상성 개선용 추출물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
인체가 항상 필요로 하는 포도당은 몸 속에서 혈당으로 존재하는 데 공복시에는 간, 근육 및 지방에 저장된 포도당이 다시 혈액으로 방출되고 식사를 하면 약 2-3 시간 동안 위장관에서 흡수된 다량의 포도당이 혈액을 거쳐 간, 근육 및 지방에 저장된다. 이러한 체내 에너지 대사가 자동으로 조절되는 것은 바로 췌장 베타세포에서 분비되는 인슐린의 양을 조절함으로써 이루어지게 된다 (이현철 등. 당뇨병 백과, 가림출판사, 2007년, p.34).
체내에서 혈당(blood glucose)은 80∼120mg/dL으로 항상 일정하게 유지되는데, 이 현상을 포도당 항상성 (glucose homeostasis; 이하 당항상성이라 약칭함)이라고 한다. 인체가 당항상성을 유지하는 과정에는 췌장의 베타(β)세포와 알파(α)세포에서 각각 분비되는 인슐린(insulin)과 글루카곤(glucagon)이 관여한다. 식사 직후에는 혈당이 상승하고 이 때 분비된 인슐린은 간, 근육, 지방세포 등의 말초조직에 포도당을 에너지원으로 사용할 수 있게 공급하고, 또한 간 및 근육에 포도당을 글리코겐 (glycogen)으로 저장시켜 혈당을 정상화시킨다. 공복에는 혈당이 저하되고 이 때 글루카곤이 분비되어 간에서 글리코겐이 포도당으로 분해되어 혈당을 정상화시킨다 (Miyazaki Y, Glass L, Triplitt C, Wajcberg E, Mandarino LJ, DeFronzo RA.2002. Am J Physiol Endocrinol Metab 283, E1135-43). 공복 기간이 길어지면 간의 글리코겐이 고갈되고, 아미노산 등의 당신생합성(gluconeogenesis) 전구체가 간에서 포도당으로 전환되어 혈당을 정상으로 유지시킨다.
당항상성을 유지하는 기능이 저하되면 공복 혈당(fasting glucose)이나 식후 혈당 (postprandial glucose)이 조금씩 오르거나 오른 상태가 되어 있는 내당능장애(耐糖能障碍; glucose intolerance)의 단계로 넘어간다. 내당능장애는 사람에 따라서 수개월간 지속되거나 수년에서 10년 이상 지속되기도 한다. 내당능장애 상태가 모두 당뇨병 단계로 진행되지는 않는다. 그러나 내당능장애 상태에서 당항상성을 유지하는 기능 저하가 계속되면 제2형 당뇨병이 발병한다.
제2형 당뇨병은 혈당이 정상 이상으로 높아진 상태를 나타내는 것으로 간, 근육, 지방세포 등의 말초조직에서 인슐린 작용의 저하와 췌장 베타세포에서의 인 슐린 분비의 균형이 깨어졌을 때 나타나는 질병이다(Miyazaki 등, 2002). 말초조직에서의 인슐린 작용의 감소는 대부분의 조직 세포에서 포도당 이용이 저하하고, 특히 간에서는 혈당이 높음에도 불구하고 글리코겐의 합성은 감소하고 당신생합성을 통한 포도당의 합성은 증가시켜 혈당을 더 상승시키는 역할을 한다(Miyazaki 등, 2002). 결과적으로 인슐린 분비가 충분히 증가하여 인슐린 저항성을 보상할 수 있으면 당뇨병으로 진전되지 않지만, 인슐린 분비가 충분치 못할 때 당뇨병으로 진전된다. 즉 정상 혈당을 유지하기 위해서는 인슐린 저항성과 인슐린 분비능이 조화를 이루어야 하는데, 제2형 당뇨병은 그 조화가 깨어졌을 때 유발되는 질병이다.
인슐린 저항성이란 인슐린의 작용세포들인 간, 근육, 지방세포에서 인슐린의 감수성(반응성)이 낮아져서 혈액 중의 포도당이 작용 세포내로 이동하지 못함으로써 포도당이 대사되지 못하는 현상을 말한다. 인슐린 저항성은 어느 한 조직의 이상에 의하여 발생하는 것이 아니라, 체내의 당항상성 유지에 관여하는 뇌에서 분비되는 β-아드레날린성 화합물(β-adrenergic compounds), 지방조직에서 분비되는 아디포넥틴 (adiponectin) 및 레티놀 결합 단백질 4(retinol binding protein 4; RBP4), 간에서 분비되는 HISS 및 IL-6 등과 같은 신호전달 분자들(signaling molecules)과 같이, 이러한 기관간 네트워크의 균형이 파괴됨으로써 인슐린 저항성이 발병한다는 이론이 우세하다.
췌장의 베타세포(pancreatic β-cells)는 체내의 포도당 항상성을 조절하는데 있어 중추적인 기능을 담당하고 있을 뿐 아니라, 우리 몸의 에너지 대사를 조절하는 가장 중요한 호르몬인 인슐린을 합성 및 저장하며, 필요에 따라 분비하는 역 할을 담당하고 있다. 그러나 인간 수명의 연장, 생활 수준의 향상, 불균형적인 영양분의 과잉 공급, 도시화로 인한 운동량의 감소, 유전적 요인, 환경적 원인 등은 췌장 베타세포의 기능인 인슐린 분비에 이상을 유도하며 심지어 사멸(death)까지 유도한다. 췌장베타세포 기능 이상 및 사멸은 당뇨병의 병인중의 하나이다.
위에서 살펴본 바와 같이 당뇨병은 어느 한 조직(기관)의 이상에 의하여 발병하는 것이 아니라, 체내의 당항상성 유지에 관여하는 조직간 네트워크의 균형이 파괴됨으로써 발병한다. 따라서 당항상성 개선을 위하여는 당항상성 유지에 관여하는 여러 조직에 작용하는 소재를 섭취하는 것이 이상적이다. 또한 당뇨병 환자 치료를 위하여도 작용기전이 서로 보완적인 약제를 병합할 것을 권장한다(이홍규, 제2형 당뇨병 환자 혈당조절 10단계, 청년의사 2007년). 더불어 하나의 조직내에서도 단일 표적으로 인한 부작용 때문에 복합 표적을 권장한다(Agius L, Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism, 21,587-605, 2007).
국제당뇨병연맹 (International Diabetes Federation, IDF)은 2003년 미국의 당뇨병 유병률(prevalence)은 8.0％, 우리나라는 6.4％라고 보고하였다 (International Diabetes Federation, IDF. Diabetes Atlas, 2nd edition, 2003). 그러나 우리나라 국민영양조사(2001, 2005)의 20세 이상 유병률을 적용하면, 우리나라의 유병률도 8.0％에 육박하며, 현재의 증가속도가 유지된다면 2030년이면 OECD 회원국 중에서 가장 높은 수준에 도달할 수도 있다 (당뇨병 기초통계연구 Task Force Team 보고서. Diabetes in Korea 2007. 대한당뇨병학회 2007년).
당뇨병을 예방하거나 치료하기 위하여는 당뇨병의 발병 원인인 균형 잃은 당 항상성 조절 기전을 개선시키는 방법이 효과적이다. 이 방법에 약물 치료가 있을 수 있는데, 당뇨병이 이미 진전된 경우에는 약물 치료가 불가피하지만 당뇨병을 예방하기 위한 목적으로는 약물에 대한 부작용을 감안할 때 바람직한 방법이 아니다. 당뇨 예방을 위하여는 약물보다 효과는 약하지만 부작용없는 건강기능식품이 효과적이다. 그러나 현재 국내에 시판되는 혈당강하용 건강기능식품은 탄수화물 소화 효소 저해 등 식후 혈당의 일시적 저하만을 목표로 하기 때문에 그 제품의 섭취에 의한 혈당강하효과는 일시적이며 근본적인 당뇨병의 병인 해소와는 거리가 있다.
또한 당항상성을 유지하는 상호보완적인 여러 기작을 동시에 만족시키는 복합 기능의 건강기능식품이 단일 기작에 근거한 단일 성분인 의약품에 비하여 당뇨 예방 및 치료에 가장 이상적이지만 이러한 소재는 아직 개발되지 못하였다.
인삼(ginseng)은 식물 분류학상 오가과 인삼속에 속하는 다년생 숙근초로서 지구상에 약 11종이 알려져 있으며, 대표적인 종으로 고려인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 아시아 극동 지역(한국, 북만주, 러시아 일부)에 자생하고 약효가 매우 우수하다. 인삼은 우리나라의 대표적인 생약재로서, 예로부터 약용 및 건강음료로 널리 이용되어 왔다. 인삼은 탄수화물, 아미노산, 지방산, 무기질 등의 영양소와, 인삼의 주된 약리 작용 성분인 인삼사포닌을 비롯하여 항암성분으로 주목되고 있는 폴리아세틸렌 성분, 노화억제 및 항피로효과가 보고된 페놀계 성분 등을 함유하고 있다. 인삼의 주요 효능은 간 보호와 해독, 항피로, 면역증진, 항암 및 항산화작용 등이 있다.
인삼은 제1형 및 제2형 당뇨병 모델 동물에서 당항상성 개선 효과가 있다는 보고가 있다(Kimura et al., J. Pharmacobio-Dyn. 1981, 4, 410-417; Kimura et al., J. Pharmacobio-Dyn. 1981, 4, 402-409; Yokozawa et al., Chem. Pharm. Bull., 1985, 33, 869-872; Kimura et al., Phytotherpy Res. 1999, 13, 484-488 Kimura et al., Phytotherpy Res. 1999, 13, 484-488; Kimura et al., J. Pharmacobio-Dyn. 1981, 4, 907-915; Chung et al., Arch. Pharmacal. Res. 2001, 24, 214-218; Dey et al., Phytomedicine 2003, 10, 600-605). 또한, 인삼은 인체 실험에서도 당항상성 개선 효과가 있다는 보고가 있다(Sievenpiper et al., Diabetes 2003, 52(Suppl.1), A387; Vuksan et al., Diabetes 2003, 52(Suppl. 1), A137).
인삼의 성분으로는 사포닌, 페놀성 성분, 폴리아세칠렌 성분, 알칼로이드 성분, 다당체 등이 알려져 있다. 특히 사포닌 성분은 인삼 특이 성분으로 진세노사이드 (ginsenosides)라 칭하며 30종 이상이 알려져 있으며, 인삼 약효에 있어서 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(박종대, 1997. 고려인삼의 화학성분에 관한 고찰. "고려인삼 연구 20년사" 고려인삼학회 p. 69-112). 진세노사이드는 장내에서 미생물에 의하여 대사되어 흡수되기 때문에 사람마다 장내 균총에 따라 흡수율이 다르며 따라서 효능 발현이 다르다. 최근에는 인삼을 생물학적(장내 미생물이나 유용 균주에 의한 발효)(대한민국 특허공고 10-2002-0077081, 2002.12.5; 10-2002-0046668, 2002.8.7) 혹은 물리적 방법으로 전환시켜서(대한민국 특허공고 2000-058997호, 2000.10.6; 10-1996-017670, 1996.5.23) 흡수율을 증진시켜서 체내 활성을 높히려는 연구가 있다. 장내 세균을 이용하여 인삼 사포닌을 화합물 케이를 중심으로 한 대사체들을 대량 생산할 수 있는 방법 (대한민국 특허공고 10-1996-004217, 1996.2.22), 알파 갈락토시다제를 다이올계 진세노사이드와 반응시켜 진세노사이드 F2 및 화합물 케이(K)를 생산하는 방법이 개시되어 있다 (10-2005-0043187, 2005.5.23).
이에 본 발명자들은 상기와 같이 인삼의 당항상성 개선 작용이 보고된 바 있으나 그 당항상성 개선 활성이 높지 않았기 때문에, 그 활성을 강화시킬 필요가 있다고 판단하였다. 본 발명자들은 인삼 혹은 인삼 추출물을 특정 유산균으로 발효시킴으로써 당항상성 개선 활성이 증가한다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 인삼을 특정 유산균으로 발효시켜 제조된 당항상성 개선용 추출물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 (1) 인삼 분말을 증류수에 현탁하는 단계 (2) 인삼을 유산균 3163으로 발효시키는 단계 (3) 발효물을 에탄올 (주정 포함) 혹은 부탄올(1-butanol, n-butanol)로 추출한 후 여과하는 단계 및 (4) 여과액을 감압농축 및 동결건조하여 추출조성물을 얻는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 당항상성 개선용 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 인삼을 유산균으로 발효시켜 제조된 당항상성 개선용 추출물을 제공한다.
본 발명은 또한 (1) 인삼 분말을 증류수에 현탁하는 단계, (2) 인삼을 유산균 3163으로 발효시키는 단계, (3) 발효물을 에탄올 (혹은 주정) 혹은 부탄올로 추 출한 후 여과하는 단계, (4) 여과액을 감압농축 및 동결건조하여 추출물을 얻는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 당항상성 개선용 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 당항상성 개선용 추출물은 제2형 당뇨병을 가진 포유동물의 간, 근육, 지방세포에서 인슐린 저항성 관련 기능을 개선하고, 췌장 소도에서의 인슐린 분비를 증가시키며, 췌장 베타세포의 사멸을 억제하여, 인삼 자체가 나타내는 효과보다 더욱 증가된 당항상성 개선 효과를 나타낸다.
본 발명은 당항상성 개선용 추출물 및 그의 제조방법을 나타낸다.
본 발명은 당항상성 개선용 인삼발효 추출물 및 그의 제조방법을 나타낸다.
본 발명은 (1) 인삼 분말을 정제수에 현탁하는 단계, (2) 인삼분말 현탁액을 유산균으로 발효시키는 단계, (3) 발효물을 추출용매로 추출한 후 여과하는 단계, (4) 여과액을 감압농축 및 동결건조하여 추출물을 얻는 단계를 포함하는 당항상성 개선용 인삼발효 추출물의 제조방법을 나타낸다.
상기에서 유산균은 Lactobacillus gasseri KCTC 3163을 사용할 수 있다.
상기에서 추출용매는 탄소수가 1 내지 10개인 알코올 용매를 사용할 수 있다.
상기에서 추출용매는 에탄올 또는 부탄올을 사용할 수 있다.
상기에서 인삼은 백삼주근 분말, 백삼미삼 분말, 홍삼 분말 또는 선삼 분말 또는 이들의 추출물 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기에서 추출은 발효물을 60℃∼80℃에서 2∼4시간 동안 탄소수가 1 내지 10개인 알코올 용매로 추출할 수 있다.
상기에서 추출은 발효물을 60℃∼80℃에서 2∼4시간 동안 에탄올 또는 부탄올로 추출할 수 있다.
본 발명은 상기에서 언급한 방법에 의해 얻은 당항상성 개선용 인삼발효 추출물을 포함한다.
본 발명은 상기에서 언급한 방법에 의해 얻은 당항상성 개선용 인삼발효 추출물을 약제학적으로 허용하는 범위에서 의약품으로 사용할 수 있다.
본 발명은 상기에서 언급한 방법에 의해 얻은 당항상성 개선용 인삼발효 추출물을 약제학적으로 허용하는 범위에서 의약품으로 사용하는 방법을 나타낸다.
본 발명은 상기에서 언급한 방법에 의해 얻은 당항상성 개선용 인삼발효 추출물을 식품학적으로 허용하는 범위에서 식품 또는 건강기능식품으로 사용할 수 있다.
본 발명은 상기에서 언급한 방법에 의해 얻은 당항상성 개선용 인삼발효 추출물을 식품학적으로 허용하는 범위에서 식품 또는 건강기능식품으로 사용하는 방법을 나타낸다.
본 발명은 상기에서 언급한 방법에 의해 진세노사이드 함량이 Rh1 5-13％, Comp. K 0-0.5％, Rh2 0-1％인 인삼주근 발효 추출물을 제조할 수 있다.
본 발명은 상기에서 언급한 방법에 의해 진세노사이드 함량이 Rh1 5-13％, Comp. K 0-0.5％, Rh2 0-1％인 인삼주근 발효 추출물을 제조하는 방법을 나타낸다.
본 발명은 상기에서 언급한 방법에 의해 진세노사이드 함량이 Rh1 9-11％, Comp. K 0.1-0.5％, Rh2 0-2.5％인 인삼 미삼 발효 추출물을 제조할 수 있다.
본 발명은 상기에서 언급한 방법에 의해 진세노사이드 함량이 Rh1 9-11％, Comp. K 0.1-0.5％, Rh2 0-2.5％인 인삼 미삼 발효 추출물을 제조하는 방법을 나타낸다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.
본 발명을 상세히 기술하기 전에, 특정 구체예의 변형예들이 행해질 수 있으나 첨부된 특허 청구범위의 범주내에 포함되기 때문에, 본 발명은 이하에 기술된 본 발명의 특정한 예들에 의해 제한되지 않는다. 또한, 사용된 용어는 특정 구체예들을 설명하기 위한 것이지 한정하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 대신에, 본 발명의 범위는 첨부한 특허청구범위에 의해서 확립될 것이다.
본 명세서와 첨부한 특허청구범위에 사용하는 단수 형태들은 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수 형태도 포함하는 것을 알아야 한다. 다르게 정의되지 않는 한, 모든 본 명세서에 사용된 전문 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당업자에게 보편적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
본 발명은 인삼을 유산균으로 발효시켜 제조된 당항상성 개선용 에탄올 혹은 부탄올 추출물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 유산균은 락토바실러스 가세리 (Lactobacullus gasseri) KCTC 3163 (이하 3163이라 칭한다)로서 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다. 상기 KCTC 3163은 본 발명자들의 예비연구에서 50종의 유산균 중 고농도의 인삼 배지에서도 생장이 가능한 한편, 극성이 높은 진세노사이드들인 Rb1, Rb2, Re를 극성이 낮은 성분인 화합물 케이 (Compound K; 이하 C-K로 약칭함) 및 Rh1으로 대사시킬 수 있는 우수 균주로 선발되어 본 발명의 인삼 발효에 사용되었다. 즉 본 발명에서는 단순히 C-K 및 Rh1의 함량 증가만을 목표로 발효 조건을 설정한 것은 아니며, 유산균 발효과정 모니터링의 지표 성분들로서 C-K 및 Rh1을 설정하였다.
본 발명에서는 수삼을 건조하여 백삼을 제조한 후 주근 (main roots; MR)과 미삼 (hairty roots; HR)으로 분리하여 발효시켰다. 그러나 주근과 미삼으로 분리하지 않고 백삼 자체를 발효시키는 방법도 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 또한 백삼을 증숙하여 홍삼 및 선삼으로 가공한 후 KCTC 3163으로 발효시키는 방법도 본 발명의 범위에 들어갈 수 있다. 인삼 분말을 증류수에 현탁하여 KCTC 3163으로 발효시킨 후 에탄올(주정 포함) 혹은 부탄올로 추출한 후 여과하여 감압농축하여 추출조성물을 얻었다. 그 결과, 유산균에 의한 인삼의 발효로 인하여 진세노사이드의 대사가 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 인삼 분말 대신에 인삼 추출물을 KCTC 3163으로 발효시키는 것도 본 발명의 범위에 들어갈 수 있다.
본 발명은 또한 (1) 인삼을 KCTC 3163으로 발효하는 단계, (2) 발효물을 에 탄올이나 부탄올로 추출한 후 여과하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 당항상성 개선용 추출조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 추출조성물은 상기 인삼 분말을 사용한 배지 혹은 인삼 추출물을 사용한 액체 배지에 KCTC 3163을 접종하여 발효시킴으로써 얻어진다. 발효에 의하여 생성된 인삼의 KCTC 3163 발효물로부터 에탄올이나 부탄올로 추출한 후 얻어진 추출물을 여과한다.
본 발명의 당항상성 개선용 추출조성물은 기존의 인삼 발효물에 비하여 진세노사이드 Rh1(프로토파나사트리올; protopanaxatriol)과 Rh2(프로토파나사다이올; protopanaxadiol)를 동시에 많이 함유한다는 특징이 있으며, 이는 기존의 인삼 발효물 특허에서 진일보한 것이다.
본 발명의 당항상성 개선용 추출조성물은 간세포에서 세포내 당이용 대사를 증가시키는데 주요 역할을 하는 글루코키나제(glucokinase; hexokinase IV or D; 이하 GK라 칭한다) 활성을 증가시킨다. 간에서의 당 항상성 유지는 주로 효소에 대한 활성의 조절에 의해 달성된다. 상기 GK는 간의 당 항상성 유지에 중심이 되는 효소로서 포도당을 육-인산화된 포도당(glucose-6-phosphate; G-6-P)으로 인산화시켜 해당(glycolysis)시키거나 글리코겐(glycogen)을 합성시켜서 혈당을 제거한다.
본 발명의 당항상성 개선용 추출조성물은 또한 간세포 및 골격근육세포에서 포도당을 글리코겐으로 전환시키는 데 관여하는 효소인 에이케이티[Akt; Protein Kinase B (PKB)라고도 칭함]의 인산화를 증가시킨다. 즉 인슐린(insulin)은 간세포 및 골격근육 세포 안으로 들어간 포도당을 글리코겐(glycogen) 등으로 저장되게 하는 효소들을 조절하는데 그 효소 중 하나가 에이케이티이며, 에이케이티는 인산화됨으로써 활성화된다. 활성화된 에이케이티는 간 및 근육에서의 글리코겐 신테이즈(glycogen synthase)를 저해하는 글리코겐 신테이즈 카이네이즈-삼[glycogen synthase kinase-3 (GSK-3)]를 인산화시켜서 불활성화시킨다. GSK-3가 불활성화되면 glycogen synthase가 활성화되어서 결국 골격근육세포내 포도당은 글리코겐으로 전환되는 것이 증가된다. 그러나 인슐린 저항성이 유도되면 Akt 및 GSK-3의 인산화가 낮아져서 포도당이 글리코겐으로 저장되지 못한다.
혈당치가 상승하면 췌장 소도의 베타세포로부터 인슐린이 분비되어 혈당을 제거된다. 그러나 여러 병인에 의하여 혈당치가 높은데도 불구하고 적절한 인슐린이 분비되지 못하면 당항상성의 균형이 깨진다. 본 발명의 당항상성 개선용 추출조성물은 흰쥐에서 분리한 췌장 소도(pancreatic islets)에서 인슐린의 분비를 촉진시킨다.
본 발명의 당항상성 개선용 추출조성물은 췌장 베타 세포에서 사이토카인 혹은 유리 지방산으로 유도된 세포사멸을 억제하여, 인삼만을 원료로 하였을 때 보다 훨씬 증가된 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명의 추출조성물은 당항상성을 개선함으로써 인슐린 저항성, 베타세포 이상, 내당능장애(glucose intolerance), 공복혈당장애, 당뇨병 전단계(prediabetes), 당뇨병을 예방 및 치료할 수 있다.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예들이 기술되어질 것이다. 이하의 실시예들은 본 발명을 예증하기 위한 것으로서 본 발명의 범위를 국한시키는 것은 아니다.
<종균의 제조>
본 발명에 사용된 유산균은 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures: KCTC)에서 분양받아 한국식품연구원에서 보관하는 락토바실러스 가세리 케이티씨 3163 (Lactobacillus gasseri KCTC 3163; 이하 3163이라 약칭함)를 사용하였다. 종배양 배지는 tryptic soy broth를 사용하였다.
<인삼 분말의 제조>
인삼은 안성산 5년근을 잘 건조하여 백삼 주근, 백삼 미근(미삼)으로 분리하여 분말을 만들었다. 또는 96∼100℃에서 3∼5시간 동안 쪄서 건조한 후 홍삼 분말로 만들었다. 또는 110∼130℃에서 2∼3시간 쪄서 건조한 후 선삼 분말로 만들었다.
<인삼 증류수 추출물 분말의 제조>
인삼은 안성산 5년근을 잘 건조하여 백삼 주근과 백삼 미근(미삼)으로 분리하여 분말로 만들거나, 또는 96∼100℃에서 3∼5시간 동안 쪄서 건조한 홍삼분말로 만들거나, 또는 110∼130℃에서 2∼3시간 쪄서 건조한 선삼 분말로 만들었다. 이 백삼, 홍삼 및 선삼의 분말을 각각 인삼 1kg당, 1) 물 (증류수 포함) 10리터를 가하여 60℃∼100℃에서 0.5∼10시간 추출하여 동결건조하거나, 혹은 2) 주정 10리터를 가하여 상온∼80℃에서 0.5∼10시간 추출하여 감압건조하여 분말로 제조하였다.
<인삼 에탄올 추출물 분말의 제조>
인삼은 안성산 5년근을 잘 건조하여 백삼 주근과 백삼 미근(미삼)으로 분리하여 분말로 만들거나, 또는 96∼100℃에서 3∼5시간 동안 쪄서 건조한 홍삼분말로 만들거나, 또는 110∼130℃에서 2∼3시간 쪄서 건조한 선삼 분말로 만들었다. 이 백삼, 홍삼 및 선삼의 분말을 각각 인삼 1kg당 에탄올 (주정 포함) 10리터를 가하여 60℃∼80℃에서 0.5∼10시간 추출하고 감압건조후 동결건조하여 분말로 제조하였다.
<실시예 1> 백삼 주근 발효물의 제조
백삼 주근 분말 20g에 증류수 2,000㎖를 가하여 멸균하여 유산균(Lactobacillus gasseri KCTC 3163) 2g을 넣어 37℃에서 3∼10일간 (최적 조건은 7일간) 배양한 후, 발효물을 에탄올(또는 부탄올) 2,000㎖로 60℃∼80℃에서 2∼4시간 혹은 실온에서 18시간 추출하고 여과한다. 이 여과액을 감압농축 및 동결건조하여 추출물을 얻었다.
<실시예 2> 미삼 발효물의 제조
백삼의 미근(미삼) 분말 20g에 증류수 2,000㎖를 가하고 멸균하여 유산균(Lactobacillus gasseri KCTC 3163) 2g을 넣어 37℃에서 3∼10일간 (가장 좋은 조건은 7일간) 배양한 후, 발효물을 에탄올(또는 부탄올) 2,000㎖로 60℃∼80℃에서 2∼4시간 혹은 실온에서 18시간 추출하고 여과한다. 이 여과액을 감압농축 및 동결건조하여 추출물을 얻었다.
<실시예 3> 홍삼 발효물의 제조예
홍삼 분말 20g에 증류수 2,000㎖를 가하고 멸균하여 유산균(Lactobacillus gasseri KCTC 3163) 2g을 넣어 37℃에서 3∼10일간 (가장 좋은 조건은 7일간) 배양한 후, 발효물을 에탄올(또는 부탄올) 2,000㎖로 60℃∼80℃에서 2∼4시간 혹은 실온에서 18시간 추출하고 여과한다. 이 여과액을 감압농축 및 동결건조하여 추출물을 얻었다.
<실시예 4> 선삼 발효물의 제조예
선삼 분말 20g에 증류수 2,000㎖를 가하고 멸균하여 유산균(Lactobacillus gasseri KCTC 3163) 2g을 넣어 37℃에서 3∼10일간 (가장 좋은 조건은 7일간) 배양한 후, 발효물을 에탄올(또는 부탄올) 2,000㎖로 60℃∼80℃에서 2∼4시간 혹은 실온에서 18시간 추출하고 여과한다. 이 여과액을 감압농축 및 동결건조하여 추출물을 얻었다.
<비교예 1-4> 백삼 주근, 백삼미삼, 홍삼, 선삼 추출물의 제조예
백삼 주근, 백삼 미삼, 홍삼 또는 선삼 분말 각 20g에 증류수 2,000㎖를 가하여 멸균한 후 에탄올(혹은 부탄올) 2,000㎖로 60℃∼80℃에서 2∼4시간 혹은 실온에서 18시간 추출하고 여과한다. 이 여과액을 감압농축 및 동결건조하여 추출물을 얻었다.
<적용예 1-4> 백삼 주근, 백삼미삼, 홍삼, 선삼 추출물의 발효물의 제조
상기의 인삼 증류수 추출물 분말의 제조 및 인삼 에탄올 추출물 분말의 제조의 방법으로 제조된 백삼 주근, 백삼 미삼, 홍삼 또는 선삼 추출물 분말 20g에 증류수 2,000㎖를 가하고 멸균하여 유산균(Lactobacillus gasseri KCTC 3163) 2g을 넣어 37℃에서 3-10일간(최적 조건은 7일간) 배양한 후 에탄올 혹은 부탄올로 추출하고 여과한다. 여과액을 감압농축 및 동결건조하여 분말로 하였다.
<적용예 5-8> 백삼 주근, 백삼미삼, 홍삼, 선삼 추출물의 발효물의 제조
인삼은 안성산 5년근을 잘 건조하여 백삼 주근과 백삼 미근(미삼)으로 분리하여 분말로 만들거나, 또는 96∼100℃에서 3∼5시간 동안 쪄서 건조한 홍삼분말로 만들거나, 또는 110∼130℃에서 2∼3시간 쪄서 건조한 선삼 분말로 만들었다. 이 백삼, 홍삼 및 선삼의 분말을 각각 인삼 1kg당 물 (증류수 포함) 10리터를 가하여 60℃∼100℃에서 0.5∼10시간 추출하고 냉각한 후 여기에 바로 유산균 3163 100g을 넣어 37℃에서 3-10일간 (최적 조건은 7일간) 배양한 후 에탄올 혹은 부탄올로 추출하고 여과한다. 여과액을 감압농축 및 동결건조하여 분말로 하였다.
<실험예> 함량분석 실험
상기 실시예 1, 2, 3, 4, 비교예 1-4, 적용예 1-4에 동량의 메탄올(methanol)을 넣고 원심분리하여 상등액을 얻는다. 이 중 100 ml을 감압농축하고 엑스를 각 0.2g씩 취하여 메탄올 100ml씩 3회 추출하였다. 이 추출물을 감압 농축시킨 후에 이에 물 100ml를 넣어 현탁시키고, 에테르 100ml씩으로 3회 추출하고 나머지 물분획을 다시 100ml씩으로 3회 추출하고 감압 농축시켰다. 이어서 MeOH 1ml에 용해시켜 HPLC로 분석하여 표 1과 같은 사포닌 함량 분석결과를 얻었다.
HPLC 분석조건 :영린 에이치피엘씨 시스템: Younglin HPLC system - [Younglin SP930D quaternary pump (Seoul, Korea)와 ELSD (Attech Co., USA) detector]: Column, Develosil ODS-UG-5 Batch #10054 (NOMURA CHEMICAL, Japan); 용매, 증류수-아세토나이트릴 [0-35 min (90:10), 35-30min(5:95)]
그 결과 실시예 1 및 2에 의한 백삼 분말 3163 발효에 의하여 백삼 주근에는 함유되어 있지 않은 Rh1이 발효 백삼 주근에는 각각 5.4％ 함유되었으며, 미삼에는 함유되어 있지 않은 Rh1, C-K가 발효 미삼에는 각각 9.8, 0.2％ 함유되었다.
또한 비교예 1-4에 의한 백삼 엑스의 3163 발효에 의하여 백삼 주근에는 함유되어 있지 않은 Rh1, C-K, Rh2가 발효 백삼 주근에는 각각 11.9, 0.4, 0.7％ 함유되었으며, 미삼에는 함유되어 있지 않은 Rh1, C-K, Rh2가 발효 미삼에는 각각 10.4, 0.4, 2.2％ 함유되었다. 즉 3163 발효에 의하여 백삼에는 함유되지 않은 성분들이 발효 백삼에 생성되었다.
<시험예 1> 간세포에서의 당항상성 관련 기능 평가
간에서의 인슐린 저항성은 혈당치가 높은데도 불구하고 계속 당신생 반응에 의하여 당이 생성되며 혈당치가 간에 의하여 제거되지 못하는 것임. 간에서의 당 항상성의 유지는 주로 효소에 대한 활성의 조절에 의해 달성됨. 글루코키나제 [glucokinase (GK)]는 간의 당 항상성 유지에 중심이 되는 효소임. GK는 포도당을 glucose-6-phosphate (G-6-P)로 인산화시켜 해당작용(glycolysis)시키거나 글리코겐(glycogen)을 합성시켜서 혈당치를 낮춤. Cytokine의 일종인 종양괴사인자 알파[tumor necrosis factor-α(TNF-α)]는 GK 활성을 낮춤. 인삼 발효물이 간에서의 인슐린 저항성 관련 기능에 미치는 영향을 평가하기 위하여 간세포에 TNF-α로 인슐린 저항성을 유발시킨 후 GK 활성에 미치는 영향 및 인슐린 신호전달 단백질 발현 (Akt 및 GSK-3β)의 인산화에 미치는 영향을 검증하였다.
-세포주 : 인간 원발성 간암 세포주(Human hepatocellular carcinomia cell line)인 HepG2 세포
-인슐린 저항성 유도 조건 : 세포가 자라서 세포 배양 용기에 90％ 정도 꽉 차면 종양괴사인자 알파 10ng/mL을 배지에 첨가하고, 24시간 동안 배양한다.
- 추출조성물의 첨가 방법
ㆍ 인슐린 민감성 작용: TNF-α와 동시에 첨가한다.
ㆍ 인슐린 유사 작용: TNF-α로 인슐린 저항성 유도 후 생물전환물로 10분간 반응시킨다.
-GK 활성 측정: 포도당이 GK에 의하여 G-6-P로 전환되어 G-6-P 디하이드로게나아제에 의하여 NAD가 NADH로 환원되는 원리를 이용한다.
-인산화된 Akt 측정 : 웨스턴 블롯팅 이용한다.
-인산화된 GSK-3β 측정 : 웨스턴 블롯팅 이용한다.
그 결과 본 발명의 백삼 주근의 3163 발효물의 에탄올 추출물은 GK의 활성을 증가시켰으며, 백삼 미삼의 3163 발효물의 에탄올 추출물은 GK의 활성을 증가시켰으며, 이를 표2, 표3에 나타내었다.
또한 백삼 주근의 3163 발효물의 부탄올 추출물은 GK의 활성을 증가시켰으며, 백삼 미삼의 3163 발효물의 부탄올 추출물은 GK의 활성을 증가시켰으며, 이를 도8, 도9에 나타내었다. 본 실험계에서 GK 최대 활성의 50％를 나타내는 농도 (EC50)가 백삼 주근은 33.42μg/ml인데 비하여 주근 발효물은 10.58μg/ml이어서 활성이 3배 증가하였다. 백삼 미삼은 20.60μg/ml인데 비하여 미삼 발효물은 11.54μg/ml이어서 활성이 2배 증가하였으며, 이를 표4에 나타내었다.
백삼 주근의 3163 발효물의 부탄올 추출물은 간세포에서 TNF-α 처리에 의하여 낮아진 인산화된 GSK-3β 및 PKB1의 발현을 증가시켰으며, 이를 도10에 나타내었다.
<시험예 2> 골격근세포에서의 당 항상성 관련 기능 평가
- 세포주: C2C12 (마우스 골격근 세포주 : mouse skeletal muscle cell line)
- 분화 및 인슐린 저항성 유도 : 10％ 소 혈청 (fetal bovine serum; FBS) 대신 2％ 말 혈청 (horse serum)으로 교체하여 3일간 분화시킴. 이 기간 동안 인슐린 100nM을 동시에 3일간 처리하거나 혹은 티엔에프-알파 (10ng/mL)를 분화의 마지막 24시간에 처리하면 인슐린 저항성이 유도됨.
- 추출조성물의 첨가 방법
ㆍ 인슐린 민감성 작용: 분화의 마지막 24시간 동안 추출조성물을 첨가한 후 인슐린 자극에 의한 포도당 흡수작용 혹은 인슐린 신호전달 단백질의 인산화 분석한다.
ㆍ 인슐린 유사작용: 2％ 말 혈청으로 3일간 분화시키면서 인슐린 100nM을 동시에 처리하여 인슐린 저항성을 유도시킴. 추출조성물을 10분간 반응시킨 후 포도당 흡수작용 혹은 인슐린 신호전달 단백질의 인산화를 측정한다.
- 포도당 흡수작용
분화가 완료된 세포를 혈청이 없는 DMEM에서 24시간 배양하였다. 배지 제거 후 시료 20-50㎍/㎖를 동일배지에 용해하여 1시간 배양시키고, 37℃ KRP 완충액 [10mM phosphate(pH 7.2), 136mM, NaCl, 4.7mM KCl, 1.25mM CaCl2, 1.25mM MaSO4, 0.05％ BSA]로 2차례 씻은 후 30분간 37℃에서 배양하였다. 완충액을 제거하고 KRP 완충액에 200μM로 녹여진 2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-d-glucose {2-NBDG}를 각 well에 150㎕씩 넣어주고, 37℃에서 1시간 배양하였다. 배양 후 2-NBDG를 제거하고 차가운 KRP 완충액으로 2차례 세척한 후 형광광도계를 이용하여 465nm/535nm에서 형광을 측정하였다.
- 이뮤노블롯팅 (Immunoblotting)
세포의 단백질을 추출하여 p-GSK-3β(Ser 9) 및 p-AKT(P-Ser 472/473)를 분석한다. 그 결과, 본 발명의 백삼 주근의 3163 발효물의 부탄올 추출물은 인삼 추출물을 단독으로 사용한 것에 비하여 포도당 흡수를 증가시켰으며, 이를 표 5에 나타내었다. 또한 백삼 미삼의 3163 발효물의 부탄올 추출물은 인삼 추출물을 단독으로 사용한 것에 비하여 인슐린에 의한 GSK-3β 단백질의 인산화를 증가시켰으며, 이를 도 11에 나타내었다.
<시험예 3> 췌장 소도에서의 인슐린 분비에 미치는 영향
- 포도당에 반응하는 실험계인 흰쥐 췌장 소도의 일차 배양으로 인슐린 분비 효과를 검증한다.
- 췌장 소도의 분리 및 배양
스프래그 돌리 흰쥐 (Sprague-Dawley rats)로부터 췌장 소도의 분리는 콜라게나제 (collagenase)를 총담관에 직접 주입하는 방법을 이용함. 떼어낸 췌장은 피콜 (ficoll) 경사를 이용하여 소도를 분리함. 소도를 크렙스 링거 이탄화 버퍼 (KRB; Krebs-Ringer bicarbonate buffer, pH 7.2)에 담아 37℃, 5％ CO2 배양기에 서 1일간 배양 후 사용한다.
- 인슐린 분비의 검사
24시간 배양한 췌장 소도를 KRB로 2회 수세 후 각 well 당 일정 크기의 것들로 3개씩 옮긴 다음 포도당 농도에 따른 분비능과 배양 시간에 따른 분비능 그리고 생물전환물에 의한 인슐린 분비능을 측정함. 인슐린 농도의 측정은 효소면역방법 (EIA; enzyme immunoassay) 이용한 키트 사용함. 그 결과, 본 발명의 백삼 주근의 3163 발효물의 에탄올 추출물은 인삼 추출물을 단독으로 사용한 것에 비하여 배지 농도 3.3mM에서의 (기저) 인슐린 분비를 증가시켰으며, 배지 농도 16.7mM에서의 인슐린 분비 (포도당 자극)도 인삼 추출물을 단독으로 사용한 것에 비하여 증가시켰으며, 이를 표6, 표7에 나타내었다. 또한 백삼 주근의 KCTC 3163 발효물의 부탄올 추출물은 인삼 추출물을 단독으로 사용한 것에 비하여 기저 인슐린 분비는 증가시켰으나 포도당 자극 인슐린 분비는 감소시켰으며, 이를 표6, 표7에 나타내었다.
또한 백삼 미삼의 3163 발효물의 에탄올 추출물은 인삼 추출물을 단독으로 사용한 것에 비하여 기저 인슐린 분비에는 영향이 없었으나 포도당 자극 인슐린 분비는 증가시켰으며, 이를 표6, 표7에 나타내었다. 즉 백삼 미삼의 KCTC 3163 발효물의 에탄올 추출물은 그 자체만으로는 인슐린 분비를 증가시키지 않았으나 포도당에 의한 인슐린 분비는 증폭시키는 효과를 보였다.
또한 백삼 미삼의 KCTC 3163 발효물의 부탄올 추출물은 인삼 추출물을 단독으로 사용한 것에 비하여 기저 인슐린 분비를 증가시켰으며 포도당 자극 인슐린 분비는 크게 증가시켰으며, 이를 표6, 표7에 나타내었다. 즉 백삼 미삼의 3163 발효 물의 부탄올 추출물은 그 자체만으로는 인슐린 분비를 증가시키지 않았으나 포도당에 의한 인슐린 분비는 증폭시키는 효과를 보였다.
또한 홍삼의 KCTC 3163 발효물의 부탄올 추출물은 홍삼 추출물을 단독으로 사용한 것에 비하여 기저 인슐린 분비를 증가시켰으며, 포도당 자극 인슐린 분비에는 영향주지 않았으며, 이를 도12에 나타내었다. 즉 선삼의 KCTC 3163 발효물의 부탄올 추출물은 그 자체만으로 인슐린 분비를 증가시키는 효과를 보였다.
또한 선삼의 KCTC 3163 발효물의 부탄올 추출물은 선삼 추출물을 단독으로 사용한 것에 비하여 기저 인슐린 분비에는 영향을 주지 않았으나 포도당 자극 인슐린 분비는 증가시켰으며, 이를 도13에 나타내었다. 즉 선삼의 3163 발효물의 부탄올 추출물은 그 자체만으로는 인슐린 분비를 증가시키지 않았으나 포도당에 의한 인슐린 분비는 증폭시키는 효과를 보였다.
<시험예 4> 췌장 베타세포 사멸에 미치는 영향
- 세포주 : MIN6N8 세포주
- 세포사멸 유도 조건
ㆍ 사이토카인에 의한 유도 : 인터페론-γ (IFN-γ10 ng/mL), 종양괴사인자(TNF)-α (10 ng/mL), 인터루이킨-1β (10 ng/mL의 혼합물을 48시간 배지에 첨가함. 본 발명의 조성물을 사이토카인과 동시에 처리한다.
ㆍ 유리지방산에 의한 유도 : 팔미트산 50mM을 50％ 에탄올에 용해하여 0.5mM이 되도록하고, 48시간 후 배지에 첨가함. 본 발명의 조성물을 팔미트산과 동 시에 처리한다.
- 세포사멸 측정
사멸된 세포에서 생성되는 세포질성 히스톤단백질 관련 DNA 절편 (cytoplasmic histone associated-DNA-fragments 모노 및 올리고 뉴클레오솜)을 항히스톤 항체(anti-histone-antibody) 및 항DNA-POD(anti-DNA-POD)로접합하여 ABTS로 발색시키는 photometric enzyme-immunoassay 이용한다.
- 세포독성 측정
3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐-테트라졸리움 브로마이드(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide MTT)를 이용한다.
그 결과, 본 발명의 백삼 미삼의 3163 발효물의 부탄올 추출물은 사이토카인 유도 베타세포 사멸을 미삼 추출물을 단독으로 사용한 것에 비하여 더 억제하는 효과를 보였다 (도 14).
상기 결과를 종합하면, 본 발명의 백삼 주근의 KCTC 3163 발효물의 에탄올 추출물은 간세포 글루코키나제 활성을 증가시키며, 췌장소도에서의 기저 인슐린 분비를 증가시킨다.
백삼 주근의 KCTC 3163 발효물의 부탄올 추출물은 간세포 글루코키나제 활성을 증가시키며, 간세포에서 GSK-3β 및 PKB1의 인산화를 증가시키며, 근육세포에서의 포도당 흡수를 증가시키며, 췌장소도에서의 기저 인슐린 분비를 증가시킨다.
백삼 미삼의 KCTC 3163 발효물의 에탄올 추출물은 간세포 글루코키나제 활성을 증가시키며, 췌장소도에서의 기저 및 포도당 자극 인슐린 분비를 증가시킨다.
백삼 미삼의 KCTC 3163 발효물의 부탄올 추출물은 간세포 글루코키나제 활성을 증가시키며, 근육세포에서 인슐린 자극 GSK-3β의 인산화를 증가시키며, 췌장소도에서의 포도당 자극 인슐린 분비를 증가시키며, 사이토카인 유도 베타세포 사멸을 억제한다.
홍삼의 KCTC 3163 발효물의 부탄올 추출물은 췌장소도에서의 포도당 자극 인슐린 분비를 증가시키며, 선삼의 KCTC 3163 발효물의 부탄올 추출물은 췌장소도에서의 기저 인슐린 분비를 증가시킨다.
상기 결과를 토대로, 본 발명의 당항상성 개선용 조성물은 약제학적 조성물로 사용되는 경우 당항상성 유지을 유지하는 기능을 회복시킬 수 있어서, 공복혈당 장애자, 내당능 장애자, 당뇨병 전단계로 진단받은 자, 당뇨병 환자의 췌장 베타세포 보호제 및 인슐린 저항성 개선제로 사용될 수 있는 효과가 있음을 확인하였다. 또한 인슐린 저항성은 당뇨병 뿐만 아니라 대사성 증후군 환자도 가지는 것으로 일반화되어 있으므로 대사성 증후군 환자의 인슐린 저항성 개선제로도 사용될 수 있을 것이다.
표 1. 인삼의 Lactobacillus gasseri KCTC 3163에 의한 발효가 진세노사이드 함량에 미치는 영향
| 발효방법 |
시료 |
진세노사이드의 함량 (％) | ||||
| Rg1 | Rb1 | Rh1 | Com. K | Rh2 | ||
| 엑스발효1) | 인삼 주근 | 6.9±1.2 | 6.5±0.5 | -3) | - | - |
| 발효인삼주근(3163) | 7.2±0.2 | 2.5 | 11.9±0.6 | 0.4±0.1 | 0.7±0.2 | |
| 엑스발효 | 미삼 | 11.3±0.3 | 12.7 | 5.9±0.3 | - | - |
| 발효미삼 (3163) |
14.4±0.2 | 2.4 | 10.4±0.7 | 0.4±0.1 | 2.2±0.1 | |
| 분말발효2) | 인삼 주근 | 3.1±0.1 | 2.3 | - | - | - |
| 발효인삼주근(3163) | 2.3±0.1 | 0.5 | 5.4±0.2 | - | - | |
| 분말발효 |
미삼 | 5.7±0.4 | 4.5±0.2 | - | - | - |
| 발효미삼 (3163) |
7.5±1.1 | 2.5±0.2 | 9.8±1.1 | 0.2±0.1 | - | |
1)인삼을 증류수나 주정으로 추출한 엑기스를 유산균으로 발효시킴
2)인삼을 바로 유산균으로 발효시킴
3)- 측정할 수 없었음 (not detected).
표 2. 백삼 주근의 KCTC 3163 발효물의 에탄올 추출물 (50μg/mL)이 간세포의 글루코키나제 활성에 미치는 영향
| 시료 | 에탄올 추출물 |
| GK activity (fold of TNF-α-treated group) |
|
| TNF-α-untreated group | 3.618 ± 0.287 |
| TNF-α-treated group | 1.000 ± 0.156 |
| 백삼 주근 | 2.373 ± 0.060 |
| 백삼 주근의 3163 발효물의 에탄올 추출물 | 2.608 ± 0.060 * |
TNF-α-untreated group : 인슐린 저항성을 유도시키지 않은 정상적인 세포
TNF-α-treated group : 인슐린 저항성을 유도시킨 세포
인삼 및 인삼 발효물은 TNF-α에 의하여 인슐린 저항성 유도시킨 세포에 처리함
제시한 값은 평균± 표준편차임(n=3). *P<0.05 (백삼주근과 비교하였을 때)
표 3. 백삼 미삼의 KCTC 3163 발효물의 에탄올 추출물 (50μg/mL)이 간세포의 글루코키나제 활성에 미치는 영향
| 시료 | 에탄올 추출물 |
| GK activity (fold of TNF-α-treated group) |
|
| TNF-α-untreated group | 3.618 ± 0.287 |
| TNF-α-treated group | 1.000 ± 0.156 |
| 미삼 | 1.638 ± 0.087 |
| 미삼의 3163 발효물의 에탄올 추출물 | 1.912 ± 0.536 * |
TNF-α-untreated group : 인슐린 저항성을 유도시키지 않은 정상적인 세포
TNF-α-treated group : 인슐린 저항성을 유도시킨 세포
인삼 및 인삼 발효물은 TNF-α에 의하여 인슐린 저항성 유도시킨 세포에 처리함
제시한 값은 평균± 표준편차임(n=3). *P<0.05(발효시키지 않은 미삼과 비교하였을 때)
표 4. 티엔에프알파를 처리한 간세포(HepG2 cells)에서 락토바실러스 3163에 의한 발효물의 부탄올 추출물이 글루코키나제 EC50 에 미치는 영향
| 구분 | un-fermented | 3163-fermented |
| 백삼 주근 | 33.42 μg/mL | 10.58 μg/mL |
| 백삼 미삼 | 20.60 μg/mL | 11.54 μg/mL |
EC50 (half maximal effective concentration) : 최대 활성의 50％를 나타내는 농도
표 5. 백삼 주근의 3163 발효물의 부탄올 추출물 (20 μg/mL)이 근육세포의 포도당 흡수에 미치는 영향1),2)
| 시료 | 포도당 흡수 정도 |
| 백삼주근 | 1.01 ± 0.10 |
| 백삼주근 3163 발효물의 부탄올 추출물 | 1.67 ± 0.16 |
| Insulin 100nM | 1.20 ± 0.11 |
1)Fold of control =(data-blank) / (control- blank)
blank: glucose-untreatd, control: glucose-treated
2)Values are mean ± SE (n=8)
표 6. 인삼의 3163 발효물의 췌장 소도에서의 기저(basal) 인슐린 분비 효과
| 시료 | 농도(㎍/mL) | 기저 인슐린 분비 (fold of control) | |||
| 백삼 주근 | 백삼 미삼 | ||||
| 에탄올 추출물 |
부탄올 추출물 |
에탄올 추출물 |
부탄올 추출물 |
||
| 대조군 | 1.000 ± 0.103 | ||||
| 원료인삼 |
200 | 6.950 ± 0.269 |
2.700 ± 0.944 |
12.934 ± 4.991 |
2.768 ± 0.905 |
| 100 | 1.587 ± 0.245 |
0.968 ± 0.073 |
2.079 ± 1.243 |
1.007 ± 0.028 |
|
| 3163 발효물 |
200 | 9.437 ± 2.071 |
4.085 ± 0.387 |
11.620 ± 5.490 |
0.618 ± 0.092 |
Values are mean ± SEM (n=3).
표 7. 인삼의 3163 발효물(200μg/ml)의 췌장 소도에서의 포도당 자극(glucose-stimulated) 인슐린 분비에 미치는 영향
| 시료 | 농도(㎍/mL) | 포도당 자극 인슐린 분비 (fold of control) | |||
| 백삼 주근 | 백삼 미삼 | ||||
| 에탄올 추출물 |
부탄올 추출물 |
에탄올 추출물 |
부탄올 추출물 |
||
| 기저 인슐린 분비 | 1.000 ± 0.103 | ||||
| 포도당 자극 인슐린분비 | 8.825 ± 0.729 | ||||
| 원료인삼 | 200 | 14.278 ± 4.798 | 10.019 ± 0.497 |
13.075 ± 4.694 | 17.981 ± 7.024 |
| 100 | 7.176 ± 2.834 |
6.146 ± 3.573 |
8.739 ± 1.209 | 6.764± 3.312 |
|
| 3163 발효물 |
200 | 20.149 ± 4.835 | 2.279 ± 0.397 |
43.615 ± 5.761 | 37.041 ± 14.984 |
Values are mean ± SEM (n=3).
표 8. 백삼 주근 KCTC 3163 발효물의 에탄올 추출물이 사이토카인 유도 베타세포 사멸에 미치는 영향
| 시료 | 농도(㎍/mL) | 저해율 (％) |
| 사이토카인 첨가군 | 0.000±4.98 | |
| 백삼 주근 | 1.0 | 12.36±0.15 |
| 20.0 | 31.40±6.44 | |
| 50.0 | 36.07±5.02 | |
| 3163 발효물의 에탄올 추출물 | 1.0 | 12.77±0.45 |
| 20.0 | 32.05±10.26 | |
| 50.0 | 68.10±12.43 |
표 9. 백삼 주근 KCTC 3163 발효물의 부탄올 추출물이 사이토카인 유도 베타세포 사멸에 미치는 영향
| 시료 | 농도(㎍/mL) | 저해율 (％) |
| 사이토카인 첨가군 | 0.000±8.54 | |
| 백삼 주근 | 1.0 | 32.05±1.21 |
| 20.0 | 28.17±3.84 | |
| 50.0 | 42.58±7.76 | |
| 3163 발효물의 부탄올 추출물 | 1.0 | 24.09±9.77 |
| 20.0 | 38.07±7.65 | |
| 50.0 | 67.69±6.61 |
표 10. 백삼 미삼 KCTC 3163 발효물의 부탄올 추출물이 사이토카인 유도 베 타세포 사멸에 미치는 영향
| 시료 | 농도(㎍/mL) | 저해율 (％) |
| 사이토카인 첨가군 | 0.000±8.54 | |
| 백삼 미삼 |
1.0 | 0.00±9.16 |
| 20.0 | 37.09±4.29 | |
| 50.0 | 56.36±0.72 | |
| 3163 발효물의 부탄올 추출물 |
0.2 | 1.40±32.19 |
| 0.5 | 24.69±13.88 | |
| 1.0 | 33.49±12.22 | |
| 20.0 | 78.68±10.82 | |
| 50.0 | 88.56±0.08 |
표 11. 백삼 미삼 KCTC 3163 발효물의 부탄올 추출물이 팔미틱산 유도 베타세포 사멸에 미치는 영향
| 시료 | 농도(㎍/mL) | 저해율 (％) |
| 팔미틱산 첨가군 | 0.00±1.93 | |
| 인삼 | 1.0 | 43.00±7.19 |
| 20.0 | 49.06±24.30 | |
| 50.0 | 78.39±8.44 | |
| 3163 발효물의 부탄올 추출물 | 1.0 | 69.44±12.81 |
| 20.0 | 97.12±3.67 | |
| 50.0 | 102.79±1.10 |
도 1a 내지 도 1c는 본 발명에 따른 인삼-3163의 발효로부터 에탄올 추출물 혹은 부탄올 추출물을 포함하는 당항상성 개선용 조성물을 제조하는 과정을 순차적으로 도시한 공정도이다(도 1a는 백삼 주근 혹은 미삼의 유산균 3163 발효물의 추출조성물의 제조공정도이고, 도 1b는 홍삼의 유산균 3163 발효물의 추출조성물의 제조공정도이고, 도 1c는 선삼의 유산균 3163 발효물의 추출조성물의 제조공정이다.).
도 2는 백삼 주근의 HPLC 크로마토그램을 도시한 도면이다.
도 3은 백삼 주근의 3163 발효물의 HPLC 크로마토그램을 도시한 도면이다.
도 4는 백삼 미삼의 HPLC 크로마토그램을 도시한 도면이다.
도 5는 백삼 미삼의 3163 발효물의 HPLC 크로마토그램을 도시한 도면이다.
도 6은 홍삼의 HPLC 크로마토그램을 도시한 도면이다.
도 7은 홍삼의 3163 발효물의 HPLC 크로마토그램을 도시한 도면이다.
도 8는 인슐린 저항성이 유도된 HepG2 세포에 백삼 주근-3163 발효물의 부탄올 추출물 첨가에 의한 글루코카이네이즈 활성의 개선 효과를 나타낸 그래프이다. 모든 시료의 농도는 50, 20, 1 μg/mL의 농도로 TNF-α와 함께 24시간 배양함. 1 units/mL glucose-6-phosphate dehydrogenase, 0.5/100mM glucose, 0.5mM NAD, 2.5mM ATP의 농도로 96well에서 1/10의 세포 추출물과 함께 30분 반응시킴. Values are means±SEM, n=3.
도 9는 인슐린 저항성이 유도된 HepG2 세포에 백삼 미삼-3163 발효물의 부탄 올 추출물 첨가에 의한 글루코카이네이즈 활성의 개선 효과를 나타낸 그래프이다. 모든 시료의 농도는 50, 20, 1 μg/mL의 농도로 TNF-α와 함께 24시간 배양함. 1 units/mL glucose-6-phosphate dehydrogenase, 0.5/100mM glucose, 0.5mM NAD, 2.5mM ATP의 농도로 96well에서 1/10의 세포 추출물과 함께 30분 반응시킴. Values are means±SEM, n=3.
도 10은 인슐린 저항성이 유도된 HepG2 세포에 백삼 주근-3163 발효물의 부탄올 추출물 첨가에 의한 GSK-3β 및 PKB1 인산화의 증가 효과를 나타낸 그래프이다. Values are means±SEM, n=3.
도 11은 골격근세포에서 100 nM 인슐린을 3일간 처리하여 인슐린 저항성을 유도하면서 마지막 24시간 동안 백삼 미삼 3163 발효물의 부탄올 추출물 (20μg/mL)을 첨가하였을 때 인슐린 100 nM의 5분간의 자극에 의한 GSK-3β의 인산화 효과를 나타낸 그래프이다. Values are means±SEM, n=3.
도 12는 홍삼의 3163 발효물 (FRG; fermented sun ginseng)의 부탄올 추출물의 흰쥐 췌장 소도에서의 인슐린 분비 효과이다.
도 13은 선삼의 3163 발효물 (FSG; fermented sun ginseng)의 부탄올 추출물의 흰쥐 췌장 소도에서의 인슐린 분비 효과이다.
도 14는 백삼 미삼의 3163 발효물의 부탄올 추출물의 사이토카인 유도 베타세포 사멸 억제효과이다.
Claims (10)
- (1) 인삼 분말을 정제수에 현탁하는 단계, (2) 인삼분말 현탁액을 유산균으로 발효시키는 단계, (3) 발효물을 추출용매로 추출한 후 여과하는 단계, (4) 여과액을 감압농축 및 동결건조하여 추출물을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 당항상성 개선용 인삼발효 추출물의 제조방법
- 제 1항에 있어서, 유산균은 Lactobacillus gasseri KCTC 3163인 것을 특징으로 하는 당항상성 개선용 인삼발효 추출물의 제조방법
- 제 1항에 있어서, 추출용매는 에탄올 또는 부탄올인 것을 특징으로 하는 당항상성 개선용 인삼발효 추출물의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 인삼은 백삼주근 분말, 백삼미삼 분말, 홍삼 분말 또는 선삼 분말 또는 이들의 추출물 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 당항상성 개선용 인삼발효 추출물의 제조방법.
- 제 4항에 있어서, 백삼, 홍삼 및 선삼의 분말의 발효물을 각각 60℃∼80℃에서 2∼4시간 에탄올 또는 부탄올로 추출하는 것을 특징으로 하는 당항상성 개선용 인삼발효 추출물의 제조방법.
- 제 1항 내지 제 5항 중 선택된 어느 한 항의 방법으로 얻은 당항상성 개선용 인삼발효 추출물
- 제 6항의 인삼발효 추출물을 약제학적으로 허용하는 범위에서 의약품으로 사용하는 방법
- 제 6항의 인삼발효 추출물을 식품학적으로 허용하는 범위에서 식품 또는 건강기능식품으로 사용하는 방법
- 진세노사이드 함량이 Rh1 5-13％, Comp. K 0-0.5％, Rh2 0-1％인 인삼주근 발효 추출물의 제조방법
- 진세노사이드 함량이 Rh1 9-11％, Comp. K 0.1-0.5％, Rh2 0-2.5％인 인삼 미삼 발효 추출물의 제조방법
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| KR1020080113359A KR20100054428A (ko) | 2008-11-14 | 2008-11-14 | 인삼 또는 인삼추출물로부터 유산균인 락토바실러스 가세리ｋｃｔｃ 3163 발효에 의한 당항상성 개선용 추출물 및 그의 제조방법 |
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|---|---|---|---|---|
| JP2012001511A (ja) * | 2010-06-18 | 2012-01-05 | Nitto Yakuhin Kogyo Kk | 配糖体分解用組成物 |
| KR101236441B1 (ko) * | 2010-11-17 | 2013-02-22 | (주)풀무원홀딩스 | 인삼 전초를 이용한 인삼 전초 발효물 및 이를 포함하는 발효 음료 |
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| KR20220045303A (ko) | 2020-10-05 | 2022-04-12 | 주식회사 비티씨 | 사포닌에 대해 생물전환능을 갖는 락토바실러스 애시도필러스 bla-9 균주, 이를 이용한 화합물 k의 함량이 증대된 발효 홍삼 추출물의 제조 방법, 이에 따른 발효 홍삼 추출물 및 이를 포함하는 건강기능식품 조성물 |
-
2008
- 2008-11-14 KR KR1020080113359A patent/KR20100054428A/ko not_active Application Discontinuation
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