KR20100049032A - 당사슬 부가 ｇｌｐ―１ 펩티드 - Google Patents

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가츠나리 데즈카
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Abstract

본 발명은 GLP-1과 비교하여, 혈중 반감기가 길고, 또한 바람직하게는 높은 혈당치 억제활성을 나타내는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 관한 것이다. 본 발명은, (a) GLP-1; (b) GLP-1에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드; 또는, (c) GLP-1의 유연체(類緣體, analogue); 에 있어서, 1개 이상의 아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 관한 것이다.

Description

당사슬 부가 ＧＬＰ―１ 펩티드{GLP-1 peptide having sugar chain attached thereto}
본 발명은 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 관한 것이다.
GLP-1(글루카곤 유사 펩티드-1: glucagon-like peptide-1)은, 당의 호메오스타시스(homeostasis)의 제어에 깊이 관여하는 장 기원의 펩티드이다. GLP-1은, 글루카곤 전구체의 프레프로글루카곤의 조직 특이적인 번역 후 프로세싱에 의해 장의 L 세포에 있어서 합성되고, 식사에 반응하여 순환 중에 방출된다. 이들 펩티드는, 장인슐린축의 주요 메디에이터로서, 특정 수용체에 결합함으로써 작용한다.
GLP-1은, 주로 췌장에 작용하고, β세포에 의한 인슐린 방출을 글루코오스 농도 의존적으로 촉진하는 것이 알려져 있다. 또한, 글루카곤의 분비를 억제하고, 위의 공동화를 지연시켜, 말초의 글루코오스 처리를 높일 가능성이 시사되고 있다.
GLP-1의 투여에 의해 인슐린 비의존형 당뇨병 환자에 있어서 식후의 글루코오스 레벨이 정상화될 수 있는 점에서, GLP-1의 치료제로서의 가능성이 시사되고 있다. 또한, GLP-1은 인슐린 의존형 당뇨병 환자에 있어서 혈당 조절을 개선하는 작용도 갖고 있다. 또한, GLP-1의 인슐린 방출 촉진작용은 혈장 글루코오스 농도에 의존하고 있기 때문에, 낮은 혈장 글루코오스 농도에서는 GLP-1 개재성의 인슐린 방출이 낮아, 심각한 저혈당증을 초래하지 않는 이점이 있다. 따라서, 필요시에 따라, 혈중 GLP-1 양을 조절함으로써, 안전성이 높은 당뇨병 치료가 가능해진다고 생각된다. 그러나, GLP-1의 혈중 반감기는, 2~6분으로 매우 짧아, 그 치료제로서의 가능성이 한정된다는 문제가 있다.
이와 같은 문제를 해결하는 수단으로서, GLP-1을 개변하는 시도가 이루어지고 있다. 예를 들면, 특허문헌 1에는, 1개 이상의 폴리에틸렌글리콜(PEG) 분자에 공액적으로 결합한 GLP-1 화합물을 포함하는 페그화 GLP-1 화합물로서, 각 PEG가 GLP-1 화합물에, Cys 또는 Lys 아미노산에서, 또는 카르복시 말단 아미노산에 결합하고, 페그화 GLP-1 화합물이 1시간 이상의 배출 반감기를 갖는 페그화 GLP-1 화합물이 개시되어 있다.
특허문헌 1에 의하면, 비페그화(unPEGylated) 펩티드에 비해, 반감기가 연장되고, 클리어런스가 지연화된 생물활성 펩티드가 얻어진다. 또한, 이들의 페그화(PEGylated) GLP-1 화합물 및 조성물은, 당뇨병, 비만, 과민성장증후군, 및 혈당을 저하시키는 것, 위 및/또는 장 운동성을 억제하는 것, 및, 위 및/또는 장 내용 배출을 억제하는 것, 또는 식물 섭취를 억제하는 것 등, 건강상태의 치료에 유용한 것이 개시되어 있다(예를 들면, 비특허문헌 1).
그러나, PEG는, 생체 내에서 대사되지 않는 화합물로, 그 때문에 페그화 GLP-1 화합물의 투여를 계속하면, PEG가 생체 내에 축적되어, 생체에 약해를 입힐 위험성이 있다(비특허문헌 1).
또한, GLP-1과 유사한 구조이고, 동일한 활성을 가지며, 또한, 혈중 안정성이 높은 화합물로서, 도마뱀(Heloderma)의 타액으로부터 발견된 엑센딘-4(exendin-4)(비특허문헌 2)가 미국에서 시판되고 있으나, exendin-4는 비인간형 서열로, 장기 투여에 의한 중화항체의 출현이나 그것에 수반하는 약효의 감약이 우려된다(비특허문헌 3~5).
한편, 당사슬은 생체 내에 있어서 다양한 역할을 담당하고 있는 것이 명확해져 있어, 그 연구의 중요성이 인식되면서도, 구조의 복잡함이나 다양성에 의해 연구가 늦어지고 있다. 조성이 일정한 당펩티드를 얻기 위한 방법도 시도되고 있으나(특허문헌 2), 간편함이나 대량생산의 관점에서 충분한 제조방법이라고는 할 수 없고, 또한, 특히 생체 내에 존재하는 긴 당사슬에 관해서는 실용적인 제조방법이라고는 할 수 없다.
특허문헌 1: 일본국 특허공표 제2006-520818호 공보
특허문헌 2: 일본국 특허재공표 제2005-095331호 공보
비특허문헌 1: Toxicological Science, 42, 152-157 (1998).
비특허문헌 2: J Biol Chem. 267, 402-5 (1992)
비특허문헌 3: Vascular Health and RiskManagement 2, 69-77 (2006)
비특허문헌 4: JAMA. 298, 194-206 (2007)
비특허문헌 5: Endocrine Review 28, 187–218 (2007)
본 발명의 과제는, GLP-1에 비해, 혈중 안정성이 증대되어 있고, 더욱 바람직하게는, 높은 혈당치 억제활성을 나타내는, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 제공하는 것이다.
이상의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 이하의 특성을 가질 수 있다.
즉, 본 발명은,
(a) GLP-1;
(b) GLP-1에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드; 또는,
(c) GLP-1의 유연체(類緣體, analogue);
에 있어서, 1개 이상의 아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드일 수 있다.
또한 본 발명은,
(a) GLP-1; 또는,
(b) GLP-1에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드로서, GLP-1 활성을 갖는 펩티드;
에 있어서, 1개 이상의 아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드일 수 있다.
본 발명은,
(a) GLP-1의 C 말단(37번 위치)에 추가적으로, 1 또는 수개의 아미노산이 부가된 펩티드에 있어서, 당해 부가된 아미노산의 하나 이상이, 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드; 또는,
(b) (a)에 의해 정의되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 당사슬 부가 아미노산 이외의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드;
로서, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드일 수 있다.
또한, 본 발명은,
(a) GLP-1의 N 말단(7번 위치)에 추가적으로, 1 또는 수개의 아미노산이 부가된 펩티드에 있어서, 당해 부가된 아미노산의 하나 이상이, 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드; 또는,
(b) (a)에 의해 정의되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 당사슬 부가 아미노산 이외의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드;
로서, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드일 수 있다.
또한, 본 발명은,
(a) GLP-1의 18, 20, 22, 26, 30, 34 및 36번 위치로부터 선택되는 1 이상의 부위의 아미노산을 당사슬 부가 아미노산으로 치환한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드; 또는
(b) (a)에서 정의되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 당사슬 부가 아미노산 이외의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드;
로서, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드일 수 있다.
또한, 본 발명은,
(a) GLP-1;
(b) GLP-1에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드; 또는,
(c) GLP-1의 유연체;
에 있어서, 2개 이상의 아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드일 수 있다.
또한, 본 발명은,
(a) GLP-1; 또는,
(b) GLP-1에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드;
에 있어서, 2개 이상의 아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드일 수 있다.
또한, 본 발명은,
(a) GLP-1; 또는,
(b) GLP-1에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드로서, GLP-1 활성을 갖는 펩티드;
에 있어서, 2개 이상의 아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드일 수 있다.
본 발명에 있어서, 당사슬 부가 아미노산은, 실시태양에 따라서는, 바람직하게는 당사슬 부가 Asn 또는 당사슬 부가 Cys일 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명에 있어서, 당사슬 부가 아미노산에 있어서는, 당사슬과 아미노산이 링커를 매개로 하여 결합하는 것도 가능하고, 링커를 매개로 하지 않고 결합하는 것도 가능하지만, 실시태양에 따라서는, 바람직하게는, 링커를 매개로 하지 않고(직접) 결합하고 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 당사슬은 4개 이상의 당으로 되는 당사슬인 것이 일반적으로는 바람직하다고 할 수 있고, 또한, 실시태양에 따라서는, 5개~11개의 당으로 되는 당사슬인 것이 바람직한 경우가 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 당사슬은, 실시태양에 의해서는, 디시알로 당사슬, 모노시알로 당사슬, 아시알로 당사슬, 디글크낙 당사슬 및 디만노오스 당사슬로 이루어진 군으로부터 선택되는 당사슬인 것이 바람직한 경우가 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명에 있어서, 당사슬은, 실시태양에 따라서는, 이하의 식으로 표시되는 당사슬이 바람직한 경우가 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
Figure pct00001
[식 중, R1 및 R2는 동일 또는 상이하고,
Figure pct00002
를 나타낸다. Ac는 아세틸기를 나타낸다.]
본 발명에 있어서는, 당사슬이 실질적으로 균일한 것이 바람직하고, 또한, 본 발명에 있어서는, 그와 같이 조정할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 개시에 따르면, 90% 이상 균일, 또는, 99% 이상 균일을 실현할 수 있다.
본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, 바람직하게는, GLP-1과 비교하여 증대된 혈중 안정성을 갖는다.
본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, GLP-1과 비교하여 바람직하게는 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상, 더욱 바람직하게는 20배 이상의 OGTT(Oral Glucose Tolerance Test)에 있어서의 혈당치 억제활성을 가질 수 있다.
본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, GLP-1과 비교하여 바람직하게는, 30배 이상, 더욱 바람직하게는 50배 이상의 DPP-IV 내성을 가질 수 있다.
본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 신규한 유효성분으로서 의료용도에 사용할 수 있다. 그와 같은 의료용도로서는, GLP-1 관련 질환의 치료 또는 예방이 포함된다. 그와 같은 질환의 대표예는, 예를 들면, 당뇨병이다.
이상 기술한 본 발명의 특징의 하나 또는 복수를 임의로 조합시킨 것도, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드인 것은 물론이다.
본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, GLP-1과 비교하여, 혈중 안정성이 증대되고, 또한, 본 발명의 일 태양에 있어서, GLP-1과 비교하여, 혈당치 억제활성이 증대되어 있다. 따라서, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, GLP-1과 비교하여, 그 투여량 및 투여횟수를 저감할 수 있다.
또한, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 부가되는 당사슬은, 생체 내에서 용이하게 분해되기 때문에, 그 축적에 의해 생체에 약해를 입히지 않는다.
또한, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 부가되는 당사슬의 일부 또는 전부는, 인간을 포함하는 포유류, 조류 등의 생체 내에 존재하는 당사슬로서, 체내에 투여해도 부작용이나 항원성을 나타내지 않아, 알레르기 반응이나, 항체 생산에 의해 약효를 얻을 수 없게 되는 등의 걱정이 없다.
또한, 지금까지 당사슬, 특히 장쇄(長鎖)의 당사슬에 대해서는, 균일한 구조를 갖는 당사슬을 부가한 펩티드(또는 단백질)를 대량으로, 일정 품질로 얻는 것은 곤란하였으나, 본 발명의 제조방법에 의하면, 당사슬 부가 펩티드인 본 발명의 화합물을 안정적이고 간편하게 대량으로 공급할 수 있어, 의약품의 제조라는 관점에서도, 매우 유용하다.
도 1은 실시예 43에 있어서의 HPLC 차트의 일례로서, 18Asn GLP-1-asialo 및 18Asn GLP-1-disialo의 피크를 나타낸다.
도 2는 실시예 44에 있어서의 HPLC 차트의 일례로서, 22Asn GLP-1-asialo 및 22Asn GLP-1-disialo의 피크를 나타낸다.
도 3은 실시예 45에 있어서의 HPLC 차트의 일례로서, 30Asn GLP-1-asialo 및 30Asn GLP-1-disialo의 피크를 나타낸다.
도 4는 실시예 47에 있어서의 HPLC 차트의 일례로서, 36Asn GLP-1-asialo 및 36Asn GLP-1-disialo의 피크를 나타낸다.
도 5는 시험예 1(혈장 중에 있어서의 안정성 시험)에 있어서의, 실시예 7의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 HPLC에 의한 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 시험예 1(혈장 중에 있어서의 안정성 시험)에 있어서의, 비교예 1의 GLP-1의 HPLC에 의한 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 시험예 2(db/db 마우스에 있어서의 혈당치 저하작용 시험)에 있어서의, 실시예 1~5의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 및 비교예 1의 GLP-1 화합물 투여 후의 혈당치의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 8은 시험예 3(db/db 마우스에 있어서의 혈당치 저하작용 시험)에 있어서의, 실시예 5의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 및 비교예 1의 GLP-1 투여 후의 혈당치의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 9는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 상승 억제작용을 조사하기 위해 실시한 경구 내당능(耐糖能)시험(OGTT)인 시험예 7-1에 있어서의, 실시예의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 및 비교예 1의 GLP-1 첨가 후의 혈당치의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 10은 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 상승 억제작용을 조사하기 위해 실시한 경구 내당능시험(OGTT)인 시험예 7-1에 있어서의, 실시예의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 및 비교예 1의 GLP-1 첨가 후의 혈당치의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 11은 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 상승 억제작용을 조사하기 위해 실시한 경구 내당능시험(OGTT)인 시험예 7-1에 있어서의, 실시예의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 및 비교예 1의 GLP-1 첨가 후의 혈당치의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 12는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 상승 억제작용에 대한 그 펩티드의 당사슬 구조의 영향을 조사하기 위해 실시한 경구 내당능시험(OGTT)인 시험예 7-2에 있어서의, 실시예의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 및 비교예 1의 GLP-1 첨가 후의 혈당치의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 13은 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 상승 억제작용에 대한 그 펩티드의 당사슬 구조의 영향을 조사하기 위해 실시한 경구 내당능시험(OGTT)인 시험예 7-2에 있어서의, 실시예의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 및 비교예 1의 GLP-1 첨가 후의 혈당치의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 14는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 상승 억제작용에 대한 그 펩티드의 당사슬 구조의 영향을 조사하기 위해 실시한 경구 내당능시험(OGTT)인 시험예 7-2에 있어서의, 실시예의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 및 비교예 1의 GLP-1 첨가 후의 혈당치의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 15는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 상승 억제작용에 대한 그 펩티드의 투여량의 영향을 조사하기 위해 실시한 경구 내당능시험(OGTT)인 시험예 7-3에 있어서의, 실시예의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 및 비교예 1의 GLP-1 첨가 후의 혈당치의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 16은 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 상승 억제작용에 대한 그 펩티드의 투여량의 영향을 조사하기 위해 실시한 경구 내당능시험(OGTT)인 시험예 7-3에 있어서의, 실시예의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 및 비교예 1의 GLP-1 첨가 후의 혈당치의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 17은 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 상승 억제작용에 대한 그 펩티드의 투여량의 영향을 조사하기 위해 실시한 경구 내당능시험(OGTT)인 시험예 7-3에 있어서의, 실시예의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 및 비교예 1의 GLP-1 첨가 후의 혈당치의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 18은 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 상승 억제작용에 대한 그 펩티드의 투여량의 영향을 조사하기 위해 실시한 경구 내당능시험(OGTT)인 시험예 7-3에 있어서의, 실시예의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 및 비교예 1의 GLP-1 첨가 후의 혈당치의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 19는 Asn 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 상승 억제작용을 조사하기 위해 실시한 경구 내당능시험(OGTT)인 시험예 7-4에 있어서의, 실시예의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 및 비교예 1의 GLP-1 첨가 후의 혈당치의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 20은 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 상승 억제작용에 대한 그 펩티드의 당사슬 부가수의 영향을 조사하기 위해 실시한 경구 내당능시험(OGTT)인 시험예 7-5에 있어서의, 실시예의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 및 비교예 1의 GLP-1 첨가 후의 혈당치의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 21은 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 상승 억제작용에 대한 그 펩티드의 당사슬 부가수의 영향을 조사하기 위해 실시한 경구 내당능시험(OGTT)인 시험예 7-5에 있어서의, 실시예의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 및 비교예 1의 GLP-1 첨가 후의 혈당치의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 22는 당뇨병 모델 마우스에 있어서의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 저하작용을 조사하기 위해 실시한 시험예 8에 있어서의, 실시예의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 및 비교예 1의 GLP-1 첨가 후의 혈당치의 추이를 나타내는 그래프이다.
본 명세서에 있어서 「GLP-1」이란, 글루카곤 유사 펩티드-1(glucagon-like peptide-1)을 나타내고, GLP-1(7-37)을 가리킨다.
GLP-1(7-37)은, 하기의 아미노산 서열을 갖는다.
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly(서열번호 2)
본 발명에 있어서, 「GLP-1의 유연체」란, GLP-1과 구조상 유사한 펩티드 및/또는 GLP-1과 중복된 구조를 갖는 펩티드, 예를 들면: GLP-1의 아미노산에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드; GLP-1의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 보존적으로 치환된 펩티드; GLP-1 개변체; GLP-1 활성을 갖는 GLP-1의 프래그먼트; GLP-1 활성을 갖는 신장 GLP-1; 및 엑센딘-4 및 그의 유연체를 들 수 있다(Curr. Opin. Investig. Drugs 8, 842-8(2007), J. Pharmacol. Exp. Ther. 307, 490-496 (2003), Diabetes 50, 2530-9(2001) 등).
본 명세서 중에 있어서, 「아미노산」이란, 그 가장 넓은 의미로 사용되어, 천연 아미노산 뿐 아니라 아미노산 변이체 및 유도체와 같은 비천연 아미노산을 포함한다. 당업자라면, 이 넓은 정의를 고려하여, 본 명세서에 있어서의 아미노산으로서, 예를 들면, 천연 단백 원성 L-아미노산; D-아미노산; 아미노산 변이체 및 유도체 등의 화학 수식된 아미노산; 노르류신, β-알라닌, 오르니틴 등의 천연 비단백 원성 아미노산; 및 아미노산의 특징인 당업계에서 공지의 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물 등을 들 수 있는 것을 이해할 수 있다. 비천연 아미노산의 예로서, α-메틸아미노산(α-메틸알라닌 등), D-아미노산, 히스티딘 유사 아미노산(2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 및 α-메틸-히스티딘 등), 측쇄에 여분의 메틸렌을 갖는 아미노산(「호모」아미노산) 및 측쇄 중의 카르복실산 관능기 아미노산이 설폰산기로 치환되는 아미노산(시스테인산 등)을 들 수 있다. GLP-1 활성을 갖는 GLP-1 유연체의 몇 가지는, 비천연 아미노산을 포함하는 것이 알려진다. 바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 화합물에 포함되는 아미노산은, 천연 아미노산만으로 된다.
본 명세서 중에 있어서, 「아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된」인 경우, 치환되거나 하는 아미노산의 개수는, GLP-1 활성을 보유하는 한 특별히 한정되지 않으나, 1~9개, 바람직하게는 1~5개, 보다 바람직하게는 1~3개 정도이거나 또는 전체 길이의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내이다. 치환 또는 부가되는 아미노산은, 천연 아미노산, 비천연 아미노산 또는 아미노산 아날로그일 수 있고, 바람직하게는 천연 아미노산이다.
본 명세서 중에 있어서, 「아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 보존적으로 치환된」이란, 아미노산 치환에 있어서, 원래의 아미노산과 치환되는 아미노산의 친수성 지수 및/또는 소수성 지수가 유사한 치환으로서, 그와 같은 치환 전후에서, GLP-1 활성의 명백한 저하 또는 소실을 발생하지 않는 치환을 말한다.
본 명세서 중에 있어서, 「GLP-1 개변체」란, GLP-1을 천연 또는 인공적으로 개변한 화합물로서, 그와 같은 개변으로서는, 예를 들면, GLP-1의 1 또는 복수의 아미노산 잔기의, 알킬화, 아실화(예를 들면 아세틸화), 아미드화, 카르복실화, 에스테르 형성, 디설피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 인산화, 수산화, 표지성분의 결합 등을 들 수 있다.
본 명세서 중에 있어서, 「GLP-1 활성을 갖는 GLP-1의 프래그먼트」란, GLP-1의 N 말단 및/또는 C 말단으로부터 1개 또는 그 이상의 아미노산의 결실이 발생하고, 또한 GLP-1 활성을 유지한 펩티드이다.
본 명세서 중에 있어서, 「GLP-1 활성을 갖는 신장 GLP-1」이란, GLP-1의 N 말단 및/또는 C 말단으로부터 1개 또는 그 이상의 아미노산의 부가가 발생하고, 또한 GLP-1 활성을 유지한 펩티드이다(예를 들면, Endocrinology, 125, 3109-14 (1989)를 참조).
본 명세서 중에 있어서, 「GLP-1의 C 말단(37번 위치)에 추가적으로, 1 또는 수개의 아미노산이 부가된 펩티드」인 경우, GLP-1의 C 말단에 부가된 아미노산으로부터 순서대로, 38번 위치의 아미노산, 39번 위치의 아미노산···등으로 부르고, 또한, 「GLP-1의 N 말단(7번 위치)에 추가적으로, 1 또는 수개의 아미노산이 부가된 펩티드」인 경우, GLP-1의 N 말단에 부가된 아미노산으로부터 순서대로, 6번 위치 아미노산, 5번 위치 아미노산···등으로 부르는 것으로 한다. 예를 들면, 「GLP-1의 C 말단(37번 위치)에 추가적으로, 1개의 아미노산이 부가된 펩티드」로서, GLP-1의 37번 위치의 Gly에 Asn 또는 Cys가 결합한 펩티드를 들 수 있다.
본 발명의 「당사슬 부가 GLP-1 펩티드」는, 1개 이상의 아미노산이, 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 한다.
본 명세서 중에 있어서, 「당사슬 부가 GLP-1 펩티드」에는, GLP-1의 1개 이상의 아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 펩티드, 상기 GLP-1 유연체에 있어서 1개 이상의 아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 펩티드가 포함되고, 각각, 추가적으로 당사슬 부가 아미노산 이외의 아미노산 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되어 있어도, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 포함된다. 이들 펩티드의 C 말단이 아미드화된 펩티드(예를 들면, His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 GLP-1(7-36) NH2 중 1개 이상의 아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 펩티드)도, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 포함된다. 또한, 이들 펩티드의 염도, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 포함된다.
본 명세서 중에 있어서 염이란 당업자에게 공지의 염으로, 산 부가염 또는 염기 부가염 중 어느 것이어도 된다. 산 부가염을 형성하기 위해 통상 사용되는 산은, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 인산 등의 무기산 및 p-톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 옥살산, p-브로모페닐설폰산, 카르복실산, 숙신산, 구연산, 안식향산, 초산 등의 유기산이다. 염기 부가염으로서는, 수산화암모늄 또는 알칼리 또는 알칼리토류금속 수산화물, 탄산염, 중탄산염 등의 무기 염기로부터 유도된 염을 들 수 있다. 특히, 약학적으로 허용되는 염이 바람직하다.
본 명세서 중에 있어서, 「당사슬 부가 아미노산」이란, 당사슬이 결합한 아미노산으로, 여기서 당사슬과 아미노산이란, 링커를 매개로 하여 결합되어 있어도 된다. 당사슬과 아미노산의 결합부위에 특별히 제한은 없으나, 당사슬의 환원 말단에 아미노산이 결합되어 있는 것이 바람직하다.
당사슬이 결합하는 아미노산의 종류에 특별히 한정은 없고, 천연 아미노산, 비천연 아미노산 중 어느 것을 사용하는 것도 가능하다. 당사슬 부가 아미노산이 생체 내에 당펩티드(당단백질)로서 존재하는 것과 동일 또는 유사한 구조를 갖는다는 관점에서는, 당사슬 부가 아미노산은, N-결합형 당사슬과 같은 당사슬 부가 Asn, O-결합형 당사슬과 같은 당사슬 부가 Ser 및 당사슬 부가 Thr이 바람직하고, 특히 당사슬 부가 Asn이 바람직하다.
또한, 당사슬과 아미노산이 링커를 매개로 하여 결합되어 있는 경우, 링커와의 결합 용이성이라는 관점에서는, 당사슬 부가 아미노산의 아미노산은, 아스파라긴산이나 글루타민산 등의 분자 내에 2개 이상의 카르복실기를 갖는 아미노산, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 트립토판 등의 분자 내에 2 이상의 아미노기를 갖는 아미노산, 세린, 트레오닌, 티로신 등의 분자 내에 수산기를 갖는 아미노산, 시스테인 등의 분자 내에 티올기를 갖는 아미노산, 아스파라긴, 글루타민 등의 분자 내에 아미드기를 갖는 아미노산이 바람직하다. 특히, 반응성의 관점에서는, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민이 바람직하다.
또한, 후술하는 시험예 7-4에 있어서, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 대해서, 당사슬구조, 당사슬 이외의 구조, 당사슬의 부가부위 및 당사슬의 부가수가 동일한 경우에, 당사슬 부가 아미노산이, 당사슬 부가 Asn(링커를 매개로 하지 않음)의 경우와 당사슬 부가 Cys(링커를 매개로 함)의 경우에서, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 상승 억제작용에 커다란 차이는 보이지 않았다.
당사슬과 아미노산이 링커를 매개로 하여 결합되어 있는 경우, 링커로서는, 당해 분야에 있어서 사용되고 있는 것을 널리 사용할 수 있으나, 예를 들면,
Figure pct00003
(식 중, a는 정수이고, 목적으로 하는 링커 기능을 저해하지 않는 한 한정되지 않으나, 바람직하게는 0~4의 정수를 나타낸다.),
Figure pct00004
(여기서 R은, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 탄소고리기, 치환된 탄소고리기, 헤테로고리기 및 치환된 헤테로고리기로 이루어진 군으로부터 선택되는 기로부터 수소원자가 하나 이탈하여 생기는 기이다)
등을 들 수 있다.
당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 당사슬 부가 아미노산에 있어서, 당사슬과 아미노산이 링커를 매개로 하지 않고 결합되어 있는 경우, 당사슬과 아미노산이 링커를 매개로 하여 결합되어 있는 경우와 비교하여, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 항원성은 낮아질 수 있다. 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 당사슬 부가 아미노산에 있어서, 당사슬과 아미노산이 링커를 매개로 하여 결합되어 있는 경우, 당사슬과 아미노산이 링커를 매개로 하지 않고 결합되어 있는 경우와 비교하여, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈중 안정성이 높아질 수 있다.
또한, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, 그 기재(예를 들면, 「아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드」라는 기재)에 의해 전혀 제조방법이 한정되지 않고, 후술하는 A법 및 B법 중 어떤 방법으로 제조한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드여도, 「아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드」에 포함된다. 또한, 예를 들면, 아미노산이 결합되어 있지 않은 당사슬을, 펩티드 상의 아미노산에 직접 또는 링커를 매개로 하여 결합한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 부가한 당사슬에 추가적으로 당 또는 당사슬을 부가함으로써 이미 부가된 당사슬을 신장시킨 당사슬 부가 GLP-1 펩티드, 당사슬 부가 아미노산의 아미노기 및/또는 카르복실기에 1 또는 수개의 아미노산을 결합시키고, 추가적으로 이것을 1 또는 복수의 GLP-1 프래그먼트와 연결시킨 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 등도, 최종적인 구조가 일치하고 있는 한, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 포함된다.
GLP-1의 아미노산을 당사슬 부가 아미노산으로 치환하는 치환 수는, 혈중 안정성이나 혈당치 억제활성 등의 생리활성, 최종적인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 존재하는 아미노산의 개수나 당사슬 부가 전후의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 분자량 등에 의해 적절히 조절하면 된다. 예를 들면, 1~5개 치환하는 것이 바람직하고, 1~3개 치환하는 것이 보다 바람직하다. 간편성의 관점에서는, 1개의 치환으로 목적하는 활성이 얻어지는 것이면, 1개의 치환을 선택하는 것이 바람직할 것이다. 일반적으로, GLP-1의 1개의 아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 당사슬 부가 아미노산 이외의 아미노산의 1개 이상을 추가적으로 당사슬 부가 아미노산으로 치환한 경우, 혈중 안정성은 증대되고, 혈당치 억제활성은 감소한다(단, 혈중 안정성이 증대됨으로써, 감소한 혈당치 억제활성을 보상하는 것이 가능하다).
본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 아미노산을 당사슬 부가 아미노산으로 치환하는 부위는, 혈중 안정성이나 혈당치 억제활성에 의해 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 일 태양에 있어서, GLP-1 아미노산을 당사슬 부가 아미노산으로 치환하는 부위는, 목적하는 활성에 따라 GLP-1의 임의의 부위를 선택할 수 있고, 예를 들면 GLP-1의 8, 9, 12, 18, 19, 20, 22, 26, 30, 34, 36 및 38번 위치(=37번 위치의 아미노산에 당사슬 부가 아미노산을 부가)로부터 선택되는 1 이상의 부위이고, 바람직하게는, 18, 20, 22, 26, 30, 34, 36 및 38번 위치로부터 선택되는 1 이상의 부위이며, 예를 들면, 26, 30, 34 및 36번 위치로부터 선택되는 1 이상의 부위이고, 특히 30 및 36번 위치로부터 선택되는 1 이상의 부위이다.
본 발명의 일 태양에 있어서, 아미노산을 당사슬 부가 아미노산으로 치환하는 부위는, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈중 안정성이라는 관점에서는, GLP-1의 임의의 부위를 선택할 수 있고, 예를 들면 GLP-1의 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 32, 34, 36 및 38번 위치(=37번 위치의 아미노산에 당사슬 부가 아미노산을 부가)로부터 선택되는 1 이상의 부위이고, 바람직하게는 9, 10, 11, 12, 14 및 28번 위치로부터 선택되는 1 이상의 부위이며, 특히 바람직하게는 9, 10, 11 및 12로부터 선택되는 1 이상의 부위이다. 특히 GLP-1의 N 말단에 가까운 부위의 아미노산의 치환도 바람직하다. 특히 GLP-1의 2의 아미노산을 당사슬 부가 아미노산으로 치환하는 부위의 예로서, 예를 들면 GLP-1의 18번 위치와 36번 위치의 치환, 26번 위치와 34번 위치의 치환 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 태양에 있어서, 아미노산을 당사슬 부가 아미노산으로 치환하는 부위는, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 억제작용이라는 관점에서는, 예를 들면 GLP-1의 18, 20, 22, 26, 30, 34, 36 및 38번 위치(=37번 위치의 아미노산에 당사슬 부가 아미노산을 부가)로부터 선택되는 1 이상의 부위이고, 바람직하게는 26, 30, 34 및 36번 위치로부터 선택되는 1 이상의 부위이며, 특히 30 및 36번 위치로부터 선택되는 1 이상의 부위이다. 특히 GLP-1의 2의 아미노산을 당사슬 부가 아미노산으로 치환하는 부위의 예로서, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 억제작용이라는 관점에서, 예를 들면 GLP-1의 18번 위치와 36번 위치의 치환, 26번 위치와 34번 위치의 치환 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 태양에 있어서, 아미노산을 당사슬 부가 아미노산으로 치환하는 부위는, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 GLP-1 활성 중, cAMP 합성능에 관한 관점에서는, 바람직하게는 22, 26, 27, 30, 34, 36 및 38번 위치(=37번 위치의 아미노산에 당사슬 부가 아미노산을 부가)로부터 선택되는 1 이상의 부위이고, 보다 바람직하게는 22, 26, 30, 34, 36 및 38번 위치로부터 선택되는 1 이상의 부위이다.
본 발명의 일 태양에 있어서, 아미노산을 당사슬 부가 아미노산으로 치환하는 부위는, GLP-1의 8, 9 및 12번 위치 이외의 부위로부터 선택되는 1 이상의 부위이다.
본 발명의 일 태양에 있어서, 아미노산을 당사슬 부가 아미노산으로 치환하는 부위는, GLP-1의 7, 10, 13, 15, 19, 21, 28 및 29번 위치 이외의 부위로부터 선택되는 1 이상의 부위, 특히, 7, 10, 15 및 28번 위치 이외의 부위로부터 선택되는 1 이상의 부위이다.
본 발명의 일 태양에 있어서, 아미노산을 당사슬 부가 아미노산으로 치환하는 부위는, GLP-1의 GLP-1 수용체로의 결합부위로부터도 결정할 수 있다.
본 발명의 일 태양에 있어서, 2 이상의 아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환되어 있는 경우에, 아미노산을 당사슬 부가 아미노산으로 치환하는 부위는, 상기의 어느 조합도 채용할 수 있으나 이것에 한정되지 않는다. 예를 들면, 1의 부위가 상기의 바람직한 부위로부터 선택되고, 다른 부위가 GLP-1의 임의의 부위로부터 선택되는 조합; 1의 부위가 상기의 바람직한 부위로부터 선택되고, 다른 부위가 GLP-1의 C 말단(37번 위치)에 추가적으로 부가된 1 또는 수개의 아미노산의 임의의 부위로부터 선택되는 조합 등도 또한, 본 발명의 바람직한 일 태양에 포함된다.
본 발명의 일 태양에 있어서, 당사슬 부가 아미노산 이외의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가는, GLP-1에 있어서의:
8번 위치의 Ala가 Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로의 치환;
9번 위치의 Glu가 Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
11번 위치의 Thr이 Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
12번 위치의 Phe가 Trp 또는 Tyr로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
13번 위치의 Thr이 Ser로 치환;
14번 위치의 Ser이 Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
15번 위치의 Asp가 Glu로 치환;
16번 위치의 Val이 Phe, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
17번 위치의 Ser이 Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
18번 위치의 Ser이 Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
19번 위치의 Tyr이 Phe, Trp, Glu, Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
20번 위치의 Leu가 Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
21번 위치의 Glu가 Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
22번 위치의 Gly가 Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
23번 위치의 Gln이 Asn, Arg, Glu, Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
24번 위치의 Ala가 Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
25번 위치의 Ala가 Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
26번 위치의 Lys가 Arg, Gln, Glu, Asp 또는 His로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
27번 위치의 Glu가 Asp, Ile 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
28번 위치의 Phe가 Trp로 치환;
29번 위치의 Ile가 Leu, Val 또는 Ala로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
30번 위치의 Ala가 Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
31번 위치의 Trp가 Phe, Tyr, Glu, Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
32번 위치의 Leu가 Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
33번 위치의 Val이 Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
34번 위치의 Lys가 Arg, Glu, Asp 또는 His로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
35번 위치의 Gly가 Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
36번 위치의 Arg가 Lys, Glu, Asp 또는 His로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환; 및/또는
37번 위치의 Gly가 Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp 또는 Lys로 이루어진 군 중 어느 하나의 아미노산으로 치환;
인 것이 바람직하지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 태양에 있어서, 당사슬 부가 아미노산 이외의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가가 발생하는 부위는, GLP-1의 7, 10, 13, 15, 19, 21, 28 및 29번 위치 이외의 부위로부터 선택되는 1 이상의 부위, 예를 들면, 7, 10, 15 및 28번 위치 이외의 부위로부터 선택되는 1 이상의 부위인 것이 바람직하다(Structure-Activity Studies of Glucagon-like Peptide-l, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.269, No. 9, Issue of March 4, pp. 6276-6278. 1994).
본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서는, 예를 들면,
[일반식 1]
Figure pct00005
[식 중, Xaa18은 Ser, 당사슬 부가 Cys, 또는 당사슬 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa19은 Tyr, 당사슬 부가 Cys, 또는 당사슬 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa22는 Gly, 당사슬 부가 Cys, 또는 당사슬 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa26는 Lys, 당사슬 부가 Cys, 또는 당사슬 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa36는 Arg, 당사슬 부가 Cys, 또는 당사슬 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa37은 Gly, NH2, Gly-당사슬 부가 Cys 또는 Gly-당사슬 부가 Asn을 나타낸다.
Xaa18이 Ser이고, Xaa19이 Tyr이며, Xaa22가 Gly이고, Xaa26가 Lys이며, 또한 Xaa36가 Arg인 경우, Xaa37은 Gly-당사슬 부가 Cys 또는 Gly-당사슬 부가 Asn을 나타낸다.]
로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 들 수 있다. 본 명세서에 있어서, 일반식 1로 표시되는 펩티드를 서열번호 1로 나타낸다.
구체적으로는, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서는, 예를 들면,
(a1) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 당사슬 부가 Cys를 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 4);
(a2) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 당사슬 부가 Cys를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 5);
(a3) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 당사슬 부가 Cys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 6);
(a4) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa36가 당사슬 부가 Cys를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 7);
(a5) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly-당사슬 부가 Cys를 나타내는 펩티드(서열번호 8);
(a6) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 당사슬 부가 Cys를 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 9);
(a7) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 당사슬 부가 Asn을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 10);
(a8) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 당사슬 부가 Asn을 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 11);
(a9) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 당사슬 부가 Asn을 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 12);
(a10) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa36가 당사슬 부가 Asn을 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 13);
(a11) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내고, Xaa36가 Arg를 나타내며, 또한 Xaa37이 Gly-당사슬 부가 Asn을 나타내는 펩티드(서열번호 14);
(a12) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 당사슬 부가 Asn을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 15);
(a13) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 당사슬 부가 Cys를 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 16);
(a14) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 당사슬 부가 Cys를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 화합물(서열번호 17);
(a15) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 당사슬 부가 Cys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 화합물(서열번호 18);
(a16) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa36가 당사슬 부가 Cys를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 19);
(a17) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 당사슬 부가 Cys를 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 20);
(a18) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 당사슬 부가 Asn을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 21);
(a19) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 당사슬 부가 Asn을 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 22);
(a20) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 당사슬 부가 Asn을 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 23);
(a21) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa36가 당사슬 부가 Asn을 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 24);
(a22) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 당사슬 부가 Asn을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 25);
(a23) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 당사슬 부가 Cys를 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 당사슬 부가 Cys를 나타내고, Xaa26가 Lys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly-당사슬 부가 Cys를 나타내는 펩티드(서열번호 26);
(a24) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 당사슬 부가 Cys를 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 당사슬 부가 Cys를 나타내고, Xaa26가 당사슬 부가 Cys를 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly를 나타내는 펩티드(서열번호 27);
(a25) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 Ser을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 Gly를 나타내고, Xaa26가 당사슬 부가 Asn을 나타내며, Xaa36가 당사슬 부가 Asn을 나타내고, 또한 Xaa37이 Gly-당사슬 부가 Asn을 나타내는 펩티드(서열번호 28);
(a26) 상기 일반식 1에 있어서 Xaa18이 당사슬 부가 Asn을 나타내고, Xaa19이 Tyr을 나타내며, Xaa22가 당사슬 부가 Asn을 나타내고, Xaa26가 당사슬 부가 Asn을 나타내며, Xaa36가 Arg를 나타내고, 또한 Xaa37이 NH2를 나타내는 펩티드(서열번호 29) 등을 들 수 있다.
본 명세서 중에 있어서, 「당사슬」이란, 단위당(단당 및/또는 그의 유도체)이 1개 이상 연결되어 생성된 화합물을 말한다. 단위당이 2개 이상 연결되는 경우, 각각의 단위당끼리 사이는, 글리코시드 결합에 의한 탈수 축합에 의해 결합한다. 이와 같은 당사슬로서는, 예를 들면, 생체 중에 함유되는 단당류 및 다당류(글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스, 크실로오스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 시알산 및 그들의 복합체 및 유도체) 외에, 분해된 다당, 당단백질, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸, 당지질 등의 복합 생체분자로부터 분해 또는 유도된 당사슬 등 광범위한 것을 들 수 있으나 그들에 한정되지 않는다. 당사슬은 직쇄형이어도 되고 분지쇄형이어도 된다.
또한, 본 명세서 중에 있어서, 「당사슬」에는 당사슬의 유도체도 포함되고, 당사슬의 유도체로서는, 예를 들면, 당사슬을 구성하는 당이, 카르복실기를 갖는 당(예를 들면, C-1번 위치가 산화되어 카르복실산으로 된 알돈산(예를 들면, D-글루코오스가 산화된 D-글루콘산), 말단의 C 원자가 카르복실산으로 된 우론산(D-글루코오스가 산화된 D-글루쿠론산), 아미노기 또는 아미노기의 유도체(예를 들면, 아세틸화된 아미노기)를 갖는 당(예를 들면, N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-갈락토사민 등), 아미노기 및 카르복실기를 양쪽 모두 갖는 당(예를 들면, N-아세틸뉴라민산(시알산), N-아세틸무람산 등), 데옥시화된 당(예를 들면, 2-데옥시-D-리보오스), 황산기를 포함하는 황산화당, 인산기를 포함하는 인산화당 등인 당사슬을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 바람직한 당류는, GLP-1에 부가된 경우(당류 부가 아미노산의 형태로 GLP-1의 아미노산으로 치환된 경우)에 혈중 안정성을 증대시키고, 또한, 보다 바람직하게는 혈당치 억제활성을 소실시키지 않는 당사슬이다. 본 발명의 어떤 태양에 있어서, 바람직한 당사슬은, GLP-1에 부가된 경우에(당사슬 부가 아미노산의 형태로 GLP-1의 아미노산으로 치환된 경우) 혈당치 억제활성을 증대시키는 당사슬이다.
본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드가 생체에 투여된다는 관점에서, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서의 당사슬은, 생체 내에서 복합 당질(당펩티드(또는 당단백질), 프로테오글리칸, 당지질 등)로서 존재하는 당사슬이고, 바람직하게는, 생체 내에서 당펩티드(또는 당단백질)로서 펩티드(또는 단백질)에 결합되어 있는 당사슬인 N-결합형 당사슬, O-결합형 당사슬 등이다.
바람직하게는, 본 발명에서 사용하는 당사슬은, N 결합형 당사슬이다. N 결합형 당사슬로서는, 예를 들면, 고만노오스(하이만노오스)형, 복합(콤플렉스)형, 혼성(하이브리드)형을 들 수 있고, 특히 바람직하게는 복합형이 좋다.
본 발명의 일 태양에 있어서, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서의 당사슬은, 4개 이상, 예를 들면 5개 이상, 7개 이상, 특히 9개 이상, 11개 이상의 당으로 되는 당사슬인 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 일 태양에 있어서, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서의 당사슬은, 5~11개, 9~11개 또는 11개의 당으로 되는 당사슬이다.
본 발명의 바람직한 일 태양에 있어서, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서의 당사슬은, 디시알로 당사슬, 모노시알로 당사슬, 아시알로 당사슬, 디글크낙 당사슬 및 디만노오스 당사슬로 이루어진 군으로부터 선택되는 당사슬이고, 보다 바람직하게는, 디시알로 당사슬이다.
본 발명에서 사용하는 바람직한 당사슬로서는, 예를 들면, 하기 일반식
Figure pct00006
[식 중, R1 및 R2는 동일 또는 상이하고,
Figure pct00007
를 나타낸다. Ac는 아세틸기를 나타낸다.]
으로 표시되는 당사슬 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 바람직한 당사슬로서는, 예를 들면, 인간 체내에 있어서, 단백질과 결합한 당단백질로서 존재하는 당사슬(예를 들면, 「FEBS LETTERS Vol.50, No.3, Feb. 1975」에 기재된 당사슬)과, 동일한 구조를 갖는 당사슬(구성당의 종류 및 그들의 결합 양식이 동일한 당사슬) 또는 이의 비환원 말단으로부터 1 또는 복수의 당을 잃은 당사슬인, 하기 표 1~4에 기재된 당사슬을 들 수 있다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
본 발명의 바람직한 일 태양에 있어서, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서의 당사슬의 구조는 균일하다. 본 명세서 중에 있어서, 당사슬의 구조가 균일하다는 것은, 당사슬을 구성하는 각 당의 종류, 결합순서, 및 당 간의 결합양식이 동일한 것을 말하고, 적어도 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 당사슬의 구조가 균일한 것을 말한다. 당사슬이 균일한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, 품질이 일정하고, 특히 의약품의 제조 등의 분야에 있어서 바람직하다.
본 발명에 있어서, 바람직한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, 예를 들면, 후술하는 실시예 1~49에 있어서 제조한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(서열번호 103~151)이다. 즉, 이하의 GLP-1의 서열:
His7-Ala8-Glu9-Gly10-Thr11-Phe12-Thr13-Ser14-Asp15-Val16-Ser17-Ser18-Tyr19-Leu20-Glu21-Gly22-Gln23-Ala24-Ala25-Lys26-Glu27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp31-Leu32-Val33-Lys34-Gly35-Arg36-Gly37(서열번호 2)
에 있어서,
(b1) 18번 위치의 Ser이 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 1)(서열번호 103);
(b2) 22번 위치의 Gly가 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 2)(서열번호 104);
(b3) 26번 위치의 Lys가 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 3)(서열번호 105);
(b4) 36번 위치의 Arg가 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 4)(서열번호 106);
(b5) 37번 위치의 Gly에 디시알로 당사슬 부가 Cys가 부가된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 5)(서열번호 107);
(b6) 37번 위치의 Gly에 아시알로 당사슬 부가 Asn이 부가된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 6)(서열번호 108);
(b7) 19번 위치의 Tyr이 아시알로 당사슬 부가 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 7)(서열번호 109);
(b8) 7번 위치의 His에 디시알로 당사슬 부가 Cys가 부가된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 8)(서열번호 110);
(b9) 8번 위치의 Ala가 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 9)(서열번호 111);
(b10) 9번 위치의 Glu가 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 10)(서열번호 112);
(b11) 10번 위치의 Gly가 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 11)(서열번호 113);
(b12) 11번 위치의 Thr이 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 12)(서열번호 114);
(b13) 12번 위치의 Phe가 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 13)(서열번호115);
(b14) 14번 위치의 Ser이 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 14)(서열번호 116);
(b15) 16번 위치의 Val이 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 15)(서열번호 117);
(b16) 20번 위치의 Leu가 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 16)(서열번호 118);
(b17) 24번 위치의 Ala가 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 17)(서열번호 119);
(b18) 25번 위치의 Ala가 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 18)(서열번호 120);
(b19) 27번 위치의 Glu가 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 19)(서열번호 121);
(b20) 28번 위치의 Phe가 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 20)(서열번호 122);
(b21) 30번 위치의 Ala가 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 21)(서열번호 123);
(b22) 32번 위치의 Leu가 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 22)(서열번호 124);
(b23) 34번 위치의 Lys가 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 23)(서열번호 125);
(b24) 22번 위치의 Gly가 아시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 24)(서열번호 126);
(b25) 26번 위치의 Lys가 아시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 25)(서열번호 127);
(b26) 30번 위치의 Ala가 아시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 26)(서열번호 128);
(b27) 34번 위치의 Lys가 아시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 27)(서열번호 129);
(b28) 36번 위치의 Arg가 아시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 28)(서열번호 130);
(b29) 22번 위치의 Gly가 디글크낙 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 29)(서열번호 131);
(b30) 30번 위치의 Ala가 디글크낙 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 30)(서열번호 132);
(b31) 34번 위치의 Lys가 디글크낙 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 31)(서열번호 133);
(b32) 22번 위치의 Gly가 디만노오스 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 32)(서열번호 134);
(b33) 30번 위치의 Ala가 디만노오스 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 33)(서열번호 135);
(b34) 34번 위치의 Lys가 디만노오스 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 34)(서열번호 136);
(b35) 12번 위치의 Phe가 아시알로 당사슬 부가 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 35)(서열번호 137);
(b36) 18번 위치의 Ser이 아시알로 당사슬 부가 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 36)(서열번호 138);
(b37) 22번 위치의 Gly가 아시알로 당사슬 부가 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 37)(서열번호 139);
(b38) 26번 위치의 Lys가 아시알로 당사슬 부가 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 38)(서열번호 140);
(b39) 27번 위치의 Glu가 아시알로 당사슬 부가 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 39)(서열번호 141);
(b40) 28번 위치의 Phe가 아시알로 당사슬 부가 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 40)(서열번호 142);
(b41) 30번 위치의 Ala가 아시알로 당사슬 부가 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 41)(서열번호 143);
(b42) 36번 위치의 Arg가 아시알로 당사슬 부가 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 42)(서열번호 144);
(b43) 18번 위치의 Ser이 디시알로 당사슬 부가 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 43)(서열번호 145);
(b44) 22번 위치의 Gly가 디시알로 당사슬 부가 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 44)(서열번호 146);
(b45) 30번 위치의 Ala가 디시알로 당사슬 부가 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 45)(서열번호 147);
(b46) 30번 위치의 Ala가 디시알로 당사슬 부가 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 46)(서열번호 148);
(b47) 36번 위치의 Arg가 디시알로 당사슬 부가 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 47)(서열번호 149);
(b48) 26번 위치의 Lys 및 34번 위치의 Lys가 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 48)(서열번호 150);
(b49) 18번 위치의 Ser 및 36번 위치의 Arg가 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(실시예 49)(서열번호151);
이다.
본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, 당업자에게 공지의 펩티드 합성방법에, 당사슬 부가공정을 삽입시킴으로써 제조할 수 있다. 당사슬 부가시에는, 트랜스글루타미나아제로 대표되는, 효소의 역반응을 이용하는 방법도 사용할 수 있으나, 이 경우, 부가하는 당사슬이 대량으로 필요해지고, 최종공정 후의 정제가 번잡해지며, 당사슬의 부가위치 및 부가 가능한 당사슬이 제한되는 등의 문제가 있기 때문에, 어세이용 등의 소량의 합성에는 사용하는 것이 가능하더라도, 의약품 제조 등의 대규모의 제조에는 실용적인 방법이라고 할 수 없는 경우가 있다.
본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 간편한 제조방법이며, 또한, 당사슬의 제조가 균일한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 안정된 제조방법의 구체예로서, 이하, 당사슬 부가 아미노산으로서 당사슬 부가 Asn을 사용하여, 고상(固相) 합성, 액상(液相) 합성 등의 공지의 펩티드 합성방법을 적용함으로써 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 제조하는 방법(A법) 및 GLP-1의 임의의 아미노산을 Cys로 치환한 펩티드를 공지의 펩티드 합성방법에 따라 제조하고, 그 후, Cys에 화학 합성에 의해 당사슬을 부가하여, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 제조하는 방법(B법)을 예시한다. 이들의 제조방법을 참고로, 당업자라면 다양한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 제조하는 것이 가능하여, 얻어지는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 및 그의 제조방법은, 특히 의약품 제조의 분야에 있어서, 매우 유용하다. 또한, 이들의 A법 및 B법은, 조합하여 행하는 것도 가능하다. 어세이 등에 사용하는 소량의 합성이면, 추가적으로, 상기의 방법에, 전이효소에 의한 당사슬 신장반응을 조합시키는 것도 가능하다. 또한, A법에 관해서는, 국제공개번호 WO 2004/005330의 기재를, B법에 관해서는, 국제공개번호 WO 2005/010053의 기재를 참조할 수 있고, 또한, 각각의 방법에 있어서 사용하는 당사슬에 관해서는, 국제공개번호 WO 03/008431, WO 2004/058984, WO 2004/058824, WO 2004/070046, WO 2007/011055 등을 참조할 수 있다. 이들 문헌은, 참조함으로써, 본 명세서에 삽입된다.
당사슬 부가 GLP -1 펩티드를 제조하는 방법(A법)
먼저, (1) 수산기를 갖는 수지(레진)의 수산기와, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산의 카르복실기를 에스테르화 반응시킨다. 이 경우 아미노산의 아미노기 질소를 지용성 보호기로 보호하고 있기 때문에, 아미노산끼리의 자기 축합은 방지되고, 레진의 수산기와 아미노산의 카르복실기가 반응하여 에스테르화가 일어난다.
다음으로 (2) 상기에서 얻어진 에스테르의 지용성 보호기를 이탈하여 유리(遊離) 아미노기를 형성시키고,
(3) 이 유리 아미노기와, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산의 카르복실기와 아미드화 반응시키며,
(4) 상기 지용성 보호기를 이탈하여 유리 아미노기를 형성시키고,
(5) 상기 (3) 및 (4)의 공정을 1회 이상 반복함으로써, 임의의 수의 임의의 아미노산이 연결된, 말단에 레진을 결합하고, 타단에 유리 아미노기를 갖는 펩티드가 얻어진다.
(6) 다음으로, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당사슬 아스파라긴(당사슬 부가 아스파라긴)의 아스파라긴 부분의 카르복실기와 상기 유리 아미노기를 아미드화 반응시키고,
(7) 추가적으로 상기 지용성 보호기를 이탈하여 유리 아미노기를 형성시키며,
(8) 이 유리 아미노기와, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산의 카르복실기와 아미드화 반응시키고,
(9) 상기 (7) 및 (8)의 공정을 1회 이상 반복하여,
(10) 상기 지용성 보호기를 이탈하여 유리 아미노기를 형성시킴으로써, 임의의 수의 임의의 아미노산이 연결된, 말단에 레진을 결합하고, 타단에 유리 아미노기를 가지며, 중간에 당사슬 아스파라긴을 갖는 당펩티드가 얻어진다.
(11) 그리고, 산으로 수지(레진)를 절단함으로써, 당사슬 아스파라긴을 펩티드 사슬의 임의의 위치에 갖는 당펩티드를 제조할 수 있다.
또한, 상기 (6)의 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당사슬 아스파라긴의 아스파라긴 부분의 카르복실기와 상기 유리 아미노기를 아미드화 반응시키는 공정을, 적절히 추가함으로써 적어도 2 이상의 당사슬 아스파라긴을 펩티드 사슬의 임의의 위치에 갖는 당펩티드를 제조할 수 있다. 또한 이때, 상이한 당사슬 아스파라긴을 사용함으로써 2종 이상의 당사슬 아스파라긴을 펩티드 사슬의 임의의 위치에 갖는 당펩티드를 제조하는 것도 가능하다.
또한, 이 당사슬 아스파라긴을 펩티드 사슬의 단부에 도입하는 것도 가능하다.
수산기를 갖는 수지(레진)로서는, 통상, 고상 합성으로 사용하는 수산기를 갖는 수지(레진)이면 되고, 예를 들면, Amino-PEGA 레진(머크사제) Wang 레진(머크사제), HMPA-PEGA 레진(머크사제) 등을 사용할 수 있다.
아미노산으로서는 모든 아미노산을 사용할 수 있고, 예를 들면, 천연 아미노산인, 세린(Ser), 아스파라긴(Asn), 발린(Val), 류신(Leu), 이소류신(Ile), 알라닌(Ala), 티로신(Tyr), 글리신(Gly), 리신(Lys), 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 아스파라긴산(Asp), 글루타민산(Glu), 글루타민(Gln), 트레오닌(Thr), 시스테인(Cys), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 트립토판(Trp), 프롤린(Pro)을 들 수 있다.
지용성 보호기로서는, 예를 들면 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)기, t-부틸옥시카르보닐(Boc)기, 벤질기, 알릴기, 알릴옥시카르보닐기, 아세틸기 등의, 카보네이트계 또는 아미드계의 보호기 등을 들 수 있다. 지용성 보호기를 도입하는데는, 예를 들면 Fmoc기를 도입하는 경우에는 9-플루오레닐메틸-N-숙신이미딜카보네이트와 탄산수소나트륨을 첨가하여 반응을 행함으로써 도입할 수 있다. 반응은 0~50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 1~5시간 정도 행하는 것이 좋다.
지용성 보호기로 보호한 아미노산으로서는, 상기의 아미노산을 상기의 방법으로 제조할 수 있다. 또한, 시판의 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, Fmoc-Ser, Fmoc-Asn, Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Ile, Fmoc-AIa, Fmoc-Tyr, Fmoc-Gly, Fmoc-Lys, Fmoc-Arg, Fmoc-His, Fmoc-Asp, Fmoc-Glu, Fmoc-Gln, Fmoc-Thr, Fmoc-Cys, Fmoc-Met, Fmoc-Phe, Fmoc-Trp, Fmoc-Pro를 들 수 있다.
에스테르화 촉매로서, 예를 들면, 1-메시틸렌설포닐-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT), 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 디이소프로필카르보디이미드(DIPCDI) 등의 공지의 탈수 축합제를 사용할 수 있다. 아미노산과 탈수 축합제의 사용 비율은, 전자 1 중량부에 대해, 후자가 통상 1~10 중량부, 바람직하게는 2~5 중량부이다.
에스테르화 반응은, 예를 들면, 고상 칼럼에 레진을 넣고, 이 레진을 용제로 세정하여, 그 후 아미노산의 용액을 첨가함으로써 행하는 것이 바람직하다. 세정용 용제로서는, 예를 들면 디메틸포름아미드(DMF), 2-프로판올, 염화메틸렌 등을 들 수 있다. 아미노산을 용해하는 용매로서는, 예를 들면 디메틸설폭시드(DMSO), DMF, 염화메틸렌 등을 들 수 있다. 에스테르화 반응은 0~50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 10분~30시간 정도, 바람직하게는 15분~24시간 정도 행하는 것이 좋다.
이때 고상 상의 미반응의 수산기를 무수 초산 등을 사용하여 아세틸화하여 캡핑(capping)하는 것도 바람직하다.
지용성 보호기의 이탈은, 예를 들면 염기로 처리함으로써 행할 수 있다. 염기로서는, 예를 들면 피페리딘, 모르폴린 등을 들 수 있다. 그때, 용매의 존재하 행하는 것이 바람직하다. 용매로서는, 예를 들면 DMSO, DMF, 메탄올 등을 들 수 있다.
유리 아미노기와, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산의 카르복실기와의 아미드화 반응은, 활성화제 및 용매의 존재하 행하는 것이 바람직하다.
활성화제로서는, 예를 들면, 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드·염산염(WSC/HCl), 디페닐포스포릴아지드(DPPA), 카르보닐디이미다졸(CDI), 디에틸시아노포스포네이트(DEPC), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스피롤리디노포스포늄(DIPCI), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(PyBOP), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 히드록시숙신이미드(HOSu), 디메틸아미노피리딘(DMAP), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt), 히드록시프탈이미드(HOPht), 펜타플루오로페놀(Pfp-OH), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스포네이트(HATU), O-벤조트리아졸-1-일-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU), 3,4-디히드로-3-히드로디-4-옥사-1,2,3-벤조트리아진(Dhbt) 등을 들 수 있다.
활성화제의 사용량은, 지용성의 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산에 대해, 1~20 당량, 바람직하게는 1~10 당량, 더욱 바람직하게는 1~5 당량으로 하는 것이 바람직하다.
용매로서는, 예를 들면 DMSO, DMF, 염화메틸렌 등을 들 수 있다. 반응은 0~50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 10~30시간 정도, 바람직하게는 15분~24시간 정도 행하는 것이 좋다. 지용성 보호기의 이탈은, 상기와 동일하게 행할 수 있다.
수지(레진)로부터 펩티드 사슬을 절단하는 데는 산으로 처리하는 것이 바람직하다. 산으로서는, 예를 들면 트리플루오로초산(TFA), 불화수소(HF) 등을 들 수 있다.
상기 (6)의, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당사슬 아스파라긴의 아스파라긴 부분의 카르복실기와 아미드화 반응시키고, (7)의, 상기 지용성 보호기를 이탈하여 유리 아미노기를 형성시키는 공정을, 적절히 추가함으로써, 적어도 2 이상의 당사슬 아스파라긴을 펩티드 사슬의 임의의 위치에 갖는 당펩티드를 제조할 수 있다.
또한 상기 (6)의, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당사슬 아스파라긴의 아스파라긴 부분의 카르복실기와 아미드화 반응시키고, (7)의, 상기 지용성 보호기를 이탈하여 유리 아미노기를 형성시키는 공정을, 최종공정으로 행함으로써, 적어도 1 이상의 당사슬 아스파라긴을 펩티드 사슬에 갖는 당펩티드를 제조할 수 있다.
또한 상기 (6)의 공정 대신에, 또는 (6)의 공정에 더하여, (1) 수산기를 갖는 수지(레진)의 수산기와, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당사슬 아스파라긴의 아스파라긴 부분의 카르복실기를 에스테르화 반응시킴으로써, 단부에 당사슬 아스파라긴을 갖는 당펩티드를 제조할 수 있다.
이와 같이 하여, 당사슬 부가 Asn으로 치환한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 얻을 수 있다.
당사슬 부가 GLP -1 펩티드를 제조하는 방법(B법)
먼저, Cys를 포함하는 펩티드를, 고상 합성법, 액상합성법, 세포에 의한 합성, 천연에 존재하는 것을 분리 추출하는 방법 등에 의해 제조한다.
다음으로, 할로아세타미드화 복합형 당사슬 유도체를 상기에서 얻은 Cys를 포함하는 펩티드와 반응시킴으로써 제조한다. 상기 반응은, 통상 0~80℃, 바람직하게는 10~60℃, 더욱 바람직하게는 15~35℃에서 행하는 것이 좋다. 반응시간은, 바람직하게는, 통상 30분~5시간 정도이다. 반응 종료 후는, 적절히 공지의 방법[예를 들면, 고속액체칼럼크로마토그래피(HPLC)]으로 정제하는 것이 좋다.
할로아세타미드화 복합형 당사슬 유도체는, 예를 들면, 복합형 아스파라긴 결합형 당사슬의 1번 위치의 탄소에 결합하고 있는 수산기를, -NH-(CO)-(CH2)a-CH2X(X는 할로겐원자, a는 정수이고, 목적으로 하는 링커 기능을 저해하지 않는 한 한정되지 않으나, 바람직하게는 0~4의 정수를 나타낸다.)로 치환한 화합물이다.
구체적으로는, 할로아세타미드화 복합형 당사슬 유도체와 Cys 함유 펩티드를 인산 완충액 중, 실온에서 반응시킨다. 반응 종료 후, HPLC로 정제함으로써 당사슬 부가 Cys로 치환한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 얻을 수 있다.
본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, GLP-1 활성을 갖는다.
본 명세서 중에 있어서, 「GLP-1 활성」이란, GLP-1에 대해서 공지의 생리활성의 일부 또는 전부를 말한다. GLP-1은, 혈당치 억제작용 외에, 예를 들면, 췌도(膵島) 작용으로서, cAMP 합성유도에 수반되는 인슐린 분비, 췌도 보호(아포토시스 억제), 췌도 증식, 췌외 작용으로서, 식욕 억제, 소화관운동 억제, 칼시토닌 분비 촉진, 허혈시의 심장보호 작용 등을 갖는 것이 알려진다. 따라서, GLP-1 활성이란, 이들 작용에 관련된 생리활성의 전부 또는 일부를 가리키고, 각각, 당업자에게 공지의 수법을 사용하여 측정할 수 있다.
예를 들면, GLP-1 활성 중, 혈당치 억제활성은, 당뇨병 마우스(db/db 마우스)에 있어서의 혈당치 저하작용의 측정이나, 경구 내당능시험(OGTT: Oral Glucose Tolerance Test)에 있어서의 혈당치 상승 억제작용의 측정 등을 사용하여 측정할 수 있다. 또한, 본 명세서 중에 있어서, 「혈당치 억제」란, 혈당치의 상승을 억제하는 것 및 혈당치를 저하시키는 것의 모든 개념을 포함한다. 특히, 본 명세서 중에 있어서, db/db 마우스에 있어서의 혈당치 억제작용을 「혈당치 저하작용」, OGTT에 있어서의 혈당치 억제작용을 「혈당치 상승 억제작용」이라고 하는 경우가 있다.
OGTT에 의한 혈당치 억제활성은, 마우스에게 강제적으로 당을 마시게 했을 때의 혈당치 상승 억제의 측정에 의해 판단할 수 있다. 예를 들면, 후술하는 시험예 7의 수법을 사용한 경우, 먼저, 피험 화합물을 하룻밤 절식시킨 마우스에 투여하고, 그 30분 후에 글루코오스용액을 경구투여한다. 글루코오스 투여에 의해 마우스 혈당치는 상승하여, 투여 후 약 30분 후에 최대가 되고 서서히 감소한다. 글루코오스 투여 후 30분의 혈당치를 측정하여, GLP-1을 투여한 경우의 혈당치와 비교함으로써, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 억제작용을 측정할 수 있다. 이 30분 후의 혈당치를 GLP-1을 투여한 경우와 비교한 경우, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, 바람직하게는 80% 이하, 보다 바람직하게는 60% 이하, 더욱 바람직하게는 40% 이하, 특히 바람직하게는 20% 이하의 혈당치를 나타낸다. 또한, OGTT에 있어서 동일 정도의 혈당치 상승 억제작용이 확인되었을 때의 투여량을 비교함으로써, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 억제활성의 강도를 판단할 수 있다. 예를 들면, GLP-1을 10 투여한 경우와 어떤 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 1 투여한 경우에서 동일한 혈당치 억제작용이 얻어지는 경우, 그 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 억제활성은, GLP-1의 10배이다. 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, GLP-1과 비교하여, 바람직하게는 5배 이상, 보다 바람직하게는 10배 이상, 더욱 바람직하게는 20배 이상, 특히 바람직하게는 50배 또는 그 이상의 혈당치 억제활성을 갖는다.
db/db 마우스를 사용한 혈당치 억제활성은, 당뇨병 마우스에 피험 화합물을 투여 후의 혈당치의 측정에 의해 판단할 수 있다. 예를 들면 후술하는 시험예 8에 기재된 수법을 사용한 경우, 피험 화합물 투여 후의 혈당치를 경시(經時)로 측정하고, 예를 들면 투여 후 120분의 혈당치가 투여시보다 저하되어 있으면, 혈당치 저하작용을 확인할 수 있다. 또한, 예를 들면 투여 후 300분의 혈당치를 측정함으로써, 혈당치 저하작용의 지속성도 판단할 수 있다. 후술하는 시험예 8의 수법을 사용하여, 투여 후 120분의 혈당치를 GLP-1 투여의 경우와 비교한 경우, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, 바람직하게는 80% 이하, 보다 바람직하게는 70% 이하, 특히 바람직하게는 60% 이하의 혈당치를 나타낸다. 또한, 투여 후 120분의 혈당치를, 투여시의 혈당치와 비교한 경우, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, 바람직하게는 70% 이하, 보다 바람직하게는 60% 이하, 특히 바람직하게는 50% 이하(예를 들면 45% 이하)의 혈당치를 나타낸다. 투여 후 300분의 혈당치를 GLP-1 투여의 경우와 비교한 경우, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, 바람직하게는 70% 이하, 보다 바람직하게는 50% 이하의 혈당치를 나타낸다. 또한, 투여 후 300분의 혈당치를, 투여시의 혈당치와 비교한 경우, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, 바람직하게는 70% 이하, 보다 바람직하게는 50% 이하의 혈당치를 나타낸다.
또한, 혈당치 억제활성이 GLP-1과 비교하여 낮은 경우여도, 혈중 안정성이 증대됨으로써, 이 활성의 낮음을 보상할 수 있다.
예를 들면, GLP-1 활성 중, 인슐린 분비 활성은, 인비트로(in vitro)에서의 cAMP 합성능 시험 등을 사용하여 측정할 수 있다. GLP-1은 GLP-1 수용체와 결합함으로써 세포 내 cAMP 농도를 상승시키고, 인슐린 분비를 촉진시킨다. 따라서, 예를 들면, 마우스 GLP-1 수용체 발현 CHO-K1 세포를 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로 자극하고, 세포 내에서 합성되는 cAMP량을 측정하여, EC50값을 GLP-1과 비교함으로써, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 인슐린 분비 활성을 측정할 수 있다.
본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, GLP-1보다도 증대된 혈중 안정성을 갖는다. 혈중 안정성은 당업자에게 공지의 수법을 사용하여 측정할 수 있고, 예를 들면, 혈장 중에 있어서의 안정성이나, DPP-IV(디펩티딜 펩티다아제 IV)에 대한 내성을 측정하여, 반감기, AUC(약물 혈중 농도-시간 곡선 아래면적) 등을 지표로 판단할 수 있다. 또한, 신장 클리어런스의 증대도 혈중 안정성의 증대에 기여한다.
혈장 중에 있어서의 안정성은, 예를 들면 후술하는 시험예 1과 같은 수법을 사용하여 판단할 수 있다. 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, GLP-1과 비교하여, 혈장 중에 있어서의 안정성이 증대되어 있다.
DPP-IV에 대한 내성은, 예를 들면 후술하는 시험예 4와 같이, DPP-IV 용액 중에 있어서의 반감기의 측정에 의해 판단할 수 있다. 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, GLP-1과 비교하여, DPP-IV에 대한 내성이 증대되어 있어, 예를 들면, 후술하는 시험예 4의 수법을 사용하여 DPP-IV에 대한 내성을 측정한 경우, 그 반감기는, GLP-1과 비교하여 1.2배 이상(예를 들면 2배 이상), 바람직하게는 5배 이상, 보다 바람직하게는 10배 이상, 특히 바람직하게는 20배 이상 증대되어 있다.
또한, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, 바람직하게는 1시간 이상, 보다 바람직하게는 3, 5, 7, 10, 15, 20시간 이상 및 더욱 바람직하게는 24시간 이상의 혈중 반감기를 갖는다.
다음으로, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물에 대해 설명한다.
본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물은, GLP-1 관련 질환의 치료 또는 예방에 유효하다. 전술한 바와 같이, GLP-1에는 각종 작용이 알려져 있어, 이들 작용에 관련된 질환도 다양하다. 예를 들면, GLP-1이, 인슐린 방출을 자극함으로써, 세포에 의한 글루코오스 흡수 및 혈당치의 저하를 일으키는 것이 발견되고 있다. 또한, 위 및/또는 장 운동성을 억제하는 것, 위 및/또는 장내용 배출을 억제하는 것 및 음식물 섭취를 억제하는 것도 발견되고 있다. 따라서, GLP-1 관련 질환에는, 예를 들면, 비인슐린 의존성 당뇨병(NIDDM), 인슐린 의존성 당뇨병, 뇌졸중(Efendic에 의한 WO 00/16797을 참조), 심근경색(Efendic에 의한 WO 98/08531을 참조), 비만(Efendic에 의한 WO 98/19698을 참조), 기능성 소화불량, 과민성장증후군(Efendic에 의한 WO 99/64060을 참조), 췌도 이식이 포함된다. 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물은, 특히 당뇨병의 치료 또는 예방에 유효하고, 보다 특정하자면, 1형 당뇨병의 예방, 2형 당뇨병의 치료에 유효하다.
상기 의약 조성물은, 통상 사용되는 충전제, 증량제, 결합제, 부습제, 붕괴제, 표면 활성제, 활택제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여, 통상의 의약 조성물의 형태로 제제한 것이다.
이와 같은 의약 조성물로서는, 예를 들면, 정제, 환제, 산제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제, 캡슐제, 좌제, 주사제 등을 들 수 있다.
의약 조성물 중에 함유되는 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 양은, 특별히 한정되지 않고 넓은 범위 내에서 적절히 선택할 수 있으나, 통상, 의약 조성물 중에 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 1~70 중량% 함유시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물은, 추가적으로 다른 유효성분을 함유하는 것도 가능하고, 다른 유효성분을 함유하는 의약 조성물과 조합시켜 사용하는 것도 가능하다. 또한, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물은, 추가적으로 상이한 1 이상의 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 것도 가능하고, 상이한 1 이상의 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물과 조합시켜 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 의약 조성물의 투여방법으로서는 특별히 제한은 없고, 각종 제제형태, 환자의 연령, 성별, 질환의 상태, 기타 조건에 따른 방법으로 투여된다. 정제, 환제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제 및 캡슐제인 경우의 투여방법으로서는, 예를 들면, 경구투여를 들 수 있다. 또한, 주사제의 경우에는, 단독으로, 또는 포도당, 아미노산 등의 통상의 보액(補液)과 혼합하여, 정맥 내, 근육 내, 피내, 피하 또는 복강 내에 투여할 수 있다. 좌제의 경우에는, 직장 내에 투여된다.
상기 의약 조성물의 투여량은, 용법, 환자의 연령, 성별, 질환의 정도, 기타 조건에 따라 적절히 선택하면 되고, 통상, 체중 1 ㎏에 대해 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드가 0.1~900 n㏖, 바람직하게는 1~90 n㏖로 되는 투여량이다. 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는 GLP-1에 비해, 혈중 안정성이 매우 높고, 또한, 일 태양에 있어서, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는 GLP-1에 비해, 혈당치 억제활성이 매우 높기 때문에, 투여량을 줄일 수 있다는 이점이 있다.
상기 의약 조성물의 투여횟수는, 용법, 환자의 연령, 성별, 환자의 정도, 기타 조건에 따라 적절히 선택하면 되고, 예를 들면, 3회/1일, 2회/1일, 1회/1일, 더 나아가서는 그 혈중 안정성에 따라, 보다 빈도가 적은 투여횟수(1회/주, 1회/월 등)도 선택할 수 있다. 바람직하게는, 상기 의약 조성물의 투여횟수는, 1회/1일 이하이다. 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는 GLP-1에 비해, 혈중 안정성이 매우 높기 때문에, 투여횟수를 줄일 수 있다는 이점이 있다.
본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 부가된 당사슬은, 체내의 대사계에서 용이하게 분해된다. 또한, 본 발명의 일 태양에 있어서, 그 당사슬은 생체 내에서 당펩티드(또는 당단백질)로서 결합하여 존재하는 구조를 갖는다. 따라서, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 및 그 펩티드를 유효성분으로서 포함하는 의약 조성물은, 생체 내에 투여해도 부작용이나 항원성을 나타내지 않고, 알레르기 반응이나, 항체 생산에 의해 약효가 얻어지지 않게 될 걱정이 적은 등의 이점을 갖는다.
또한, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는 안정적이고 간편하게 대량으로 공급하는 것이 가능하고, 품질이 안정된, 고품질의 의약품의 제공이라는 관점에서도 매우 유용하다.
본 발명은 또한, 본 발명의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는, GLP-1 관련 질환의 치료 또는 예방방법도 제공한다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예를 토대로 구체적으로 설명하지만 전혀 이들에 한정되지 않는다. 또한, 도 7~22 중, 예를 들면, GLP-1의 22번 위치의 아미노산이 디시알로 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드인 「22Cys GLP-1-disialo」를, 필요에 따라 「22Cys-disialoGLP-1」, 「C22」 또는 「C22-disialo」로 기재하는 경우가 있다. 다른 당사슬 및 아미노산 부위에 관해서도 동일하다.
실시예 1 18번 위치 Cys-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 MHCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 30). 또한, Fmoc법의 성질 상, C 말단측으로부터 37→7 방향으로 서열 표기를 하고 있다.
DCM 및 DMF를 사용해서 세정한 후, 31 잔기의 펩티드 5 μ㏖ 상당의 수지를 에펜도르프 튜브로 옮겼다.
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼:SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액: 0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 18번 위치의 세린이 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당사슬(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 3 ㎎
Figure pct00012
과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 1 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 170 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하고, GLP-1의 18번 위치의 Ser이 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(1) (18Cys GLP-1-disialo)를 1 ㎎ 얻었다.
실시예 2~5
아미노산의 축합 순서를 바꾼 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 하여, GLP-1의 22번 위치의 Gly가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(2) (22Cys GLP-1-disialo), GLP-1의 26번 위치의 Lys가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(3) (26Cys GLP-1-disialo), GLP-1의 36번 위치의 Arg가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(4) (36Cys GLP-1-disialo), 및 GLP-1의 37번 위치의 Gly에 추가적으로 당사슬 부가 Cys가 결합한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(5) (38Cys GLP-1-disialo)를 얻었다. 결과를 표 5에 나타낸다.
비교예 1
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(100 μ㏖)을 넣고, DCM, DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB) (0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖), N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖)와 MSNT(0.50 m㏖), N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 NMP(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 MHCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 31).
DCM 및 DMF를 사용해서 세정한 후, 31 잔기의 펩티드 5 μ㏖ 상당의 수지를 에펜도르프 튜브로 옮겼다.
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC(Cadenza column C18 100×10 ㎜ 전개용매A: 0.1% TFA 수용액 B: 0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=95:5➝ 5:95 15분 유속 3.0 ㎖/min)로 정제하여, GLP-1을 얻었다. 결과를 표 5에 나타낸다.
Figure pct00013
실시예 6 38번 위치 Asn-아시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(100 μ㏖)을 넣고, DCM, DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖), N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻고, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖)와 MSNT(0.50 m㏖), N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노산을 보호한 아미노산을 NMP(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 MHCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
(최후의 아미노산은 Boc-His(Trt)-OH를 사용. 축합방법은 Fmoc-His(Trt)-OH와 동일하게 행하였다.)
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt), Boc기로 보호한 아미노산에는 Boc-His(Trt)-OH를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 32).
DCM 및 DMF를 사용해서 세정한 후, 트리플루오로에탄올과 초산의 혼합용액(1:1)을 충분히 수지가 잠길 정도로 첨가하여, 18시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 농축하여, 보호 펩티드 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-Boc를 얻었다(서열번호 33). 31 잔기의 보호 펩티드 2 μ㏖ 상당을 가지형 플라스크로 옮기고, DMF(0.03 ㎖)에 용해시켰다. 별도로 준비한 에펜도르프 튜브에 아시알로 당사슬 아스파라긴(아민 프리체)(4.9 ㎎, 1 μ㏖), PyBOP(1 ㎎, 1.9 μ㏖), HOBt(0.3 ㎎, 2 μ㏖)를 DMF(0.04 ㎖)에 용해시켜서 넣고, 마지막으로 DIPEA(0.00052 ㎖, 3 μ㏖)를 첨가하였다. 이 에펜도르프 튜브 중의 혼합용액을 앞서 준비한 가지형 플라스크에 넣고, 실온에서 2.5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 용액을 농축하고, 얻어진 잔사물에 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 첨가하여 실온에서 교반하였다. 2시간 후, 이 용액을 별도로 준비한 디에틸에테르(150 ㎖)에 첨가하여 정석(晶析)을 행하고, 용액부분을 멤브레인 필터로 제거함으로써 목적으로 하는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 포함하는 잔사가 얻어졌다. 이 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 38번 위치를 당사슬 부가 Asn으로 치환한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(38Asn-GLP-1-asialo)가 얻어졌다.
Figure pct00014
실시예 7 19번 위치 Asn-아시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(100 μ㏖)을 넣고, DCM, DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖), N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻고, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖)와 MSNT(0.50 m㏖), N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 NMP(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 MHCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu의 18 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 34).
DCM 및 DMF를 사용해서 세정한 후, 18 잔기의 펩티드 5 μ㏖ 상당의 수지를 에펜도르프 튜브로 옮겼다.
당사슬 아스파라긴(b)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제)(18 ㎎, 10 μ㏖)
Figure pct00015
과 DEPBT(4.5 ㎎, 15 μ㏖)를 DMF(0.34 ㎖)에 용해시키고, 에펜도르프 튜브에 넣었다. DIPEA(2.6 ㎕, 15 μ㏖)를 첨가하여 실온에서 24시간 교반하였다. DMF와 DCM으로 세정하면, 고상 상에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Asn(Oligosaccharide chain)의 19 잔기 당사슬 펩티드가 얻어졌다(서열번호 35). 그 후, 아미노기가 Fmoc 보호된 아미노산을 HOBt(3.4 ㎎, 0.025 m㏖), DIPCI(3.8 ㎕, 0.025 m㏖), DMF(0.1 ㎖)에 의해 축합시키고, 고상 상에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Asn(Oligosaccharide chain)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기의 당사슬 펩티드를 형성시켰다(서열번호 36).
얻어진 당사슬 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 19번 위치를 당사슬 부가 Asn으로 치환한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(19Asn-GLP-1-asialo)가 얻어졌다.
Figure pct00016
Figure pct00017
실시예 8 6번 위치 Cys - 디시알로 당사슬 부가 GLP -1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 mmol) 및 N-에틸모르폴린(0.25 mmol)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt), Fmoc-Cys(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-Cys(Trt)의 32 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 37).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 6번 위치에 Cys가 부가된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당사슬(a)(오츠가 가가쿠 가부시키가이샤제) 34 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 9.6 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 1 ㎖에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 6번 위치에 당사슬 부가 Cys가 부가된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(6Cys GLP-1-disialo)를 9.9 ㎎ 얻었다.
실시예 9 8번 위치 Cys-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 38).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 8번 위치의 Ala가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당사슬(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 25 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 7.3 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 730 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 8번 위치의 Ala가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(8Cys GLP-1-disialo)를 9.3 ㎎ 얻었다.
실시예 10 9번 위치 Cys-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 39).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 9번 위치의 Glu가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당사슬(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 50 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 16.4 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 1.7 ㎖에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 9번 위치의 Glu가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(9Cys GLP-1-disialo)를 7.3 ㎎ 얻었다.
실시예 11 10번 위치 Cys-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 40).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 10번 위치의 Gly가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당사슬(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 16.8 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 5.6 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 560 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 10번 위치의 Gly가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(10Cys GLP-1-disialo)를 3.0 ㎎ 얻었다.
실시예 12 11번 위치 Cys - 디시알로 당사슬 부가 GLP -1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Cyc(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 41).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 11번 위치의 Thr이 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당사슬(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 41 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 12.8 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 1.3 ㎖에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 11번 위치의 Thr이 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(11Cys GLP-1-disialo)를 11.9 ㎎ 얻었다.
실시예 13 12번 위치 Cys-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cyc(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 42).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 12번 위치의 Phe가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당사슬(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 33 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 9.5 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 1 ㎖에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 12번 위치의 Phe가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(12Cys GLP-1-disialo)를 10.0 ㎎ 얻었다.
실시예 14 14번 위치 Cys-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 43).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 14번 위치의 Ser이 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당사슬(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 32 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 8.8 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 1 ㎖에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 14번 위치의 Ser이 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(14Cys GLP-1-disialo)를 8.4 ㎎ 얻었다.
실시예 15 16번 위치 Cys-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 44).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 16번 위치의 Val이 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당사슬(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 36 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 12 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 1.2 ㎖에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 16번 위치의 Val이 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(16Cys GLP-1-disialo)를 11.2 ㎎ 얻었다.
실시예 16 20번 위치 Cys-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 45).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 20번 위치의 Leu가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당사슬(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 36.9 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 12.3 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 1.5 ㎖에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 20번 위치의 Leu가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(20Cys GLP-1-disialo)를 13.4 ㎎ 얻었다.
실시예 17 24번 위치 Cys-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 46).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 24번 위치의 Ala가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당사슬(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 6.6 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 2.2 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 250 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 24번 위치의 Ala가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(24Cys GLP-1-disialo)를 1.8 ㎎ 얻었다.
실시예 18 25번 위치 Cys-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 47).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 25번 위치의 Ala가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당사슬(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 28 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 8.3 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 830 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 25번 위치의 Ala가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(25Cys GLP-1-disialo)를 5.6 ㎎ 얻었다.
실시예 19 27번 위치 Cys-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 48).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 27번 위치의 Glu가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당사슬(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 34 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 10.8 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 1.1 ㎖에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 27번 위치의 Glu가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(27Cys GLP-1-disialo)를 8.7 ㎎ 얻었다.
실시예 20 28번 위치 Cys-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 49).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 28번 위치의 Phe가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당사슬(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 30.6 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 10.2 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 1.2 ㎖에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 28번 위치의 Phe가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(28Cys GLP-1-disialo)를 10.3 ㎎ 얻었다.
실시예 21 30번 위치 Cys-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 50).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 30번 위치의 Ala가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당사슬(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 21.3 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 7.1 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 0.7 ㎖에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 30번 위치의 Ala가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(30Cys GLP-1-disialo)를 6.6 ㎎ 얻었다.
실시예 22 32번 위치 Cys-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 51).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 32번 위치의 Leu가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당사슬(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 20 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 5.6 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 600 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 32번 위치의 Leu가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(32Cys GLP-1-disialo)를 3.5 ㎎ 얻었다.
실시예 23 34번 위치 Cys-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Cys(Trt)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 52).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 34번 위치의 Lys가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당사슬(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 33 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 10.0 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 1 ㎖에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 34번 위치의 Lys가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(34Cys GLP-1-disialo)를 7.9 ㎎ 얻었다.
실시예 24 22번 위치 Cys-아시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 53).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 22번 위치의 Gly가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 아시알로 당사슬(c)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 15 ㎎
Figure pct00018
과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 3.4 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 340 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 22번 위치의 Gly가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(22Cys GLP-1-asialo)를 0.7 ㎎ 얻었다.
실시예 25 26번 위치 Cys-아시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 54).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 26번 위치의 Lys가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 아시알로 당사슬(c)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 13 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 3.9 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 400 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 26번 위치의 Lys가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(26Cys GLP-1-asialo)를 1.0 ㎎ 얻었다.
실시예 26 30번 위치 Cys-아시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 55).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 30번 위치의 Ala가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 아시알로 당사슬(c)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 9.0 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 4.1 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 410 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 30번 위치의 Ala가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(30Cys GLP-1-asialo)를 2.4 ㎎ 얻었다.
실시예 27 34번 위치 Cys-아시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Cys(Trt)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 56).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 34번 위치의 Lys가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 아시알로 당사슬(c)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 10 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 3.5 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 350 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 34번 위치의 Lys가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(34Cys GLP-1-asialo)를 2.2 ㎎ 얻었다.
실시예 28 36번 위치 Cys-아시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 57).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 36번 위치의 Arg가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 아시알로 당사슬(c)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 3.0 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 0.5 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 100 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 36번 위치의 Arg가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(36Cys GLP-1-asialo)를 0.2 ㎎ 얻었다.
실시예 29 22번 위치 Cys-디글크낙 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 58).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 22번 위치의 Gly가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디글크낙 당사슬(d)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 8.4 ㎎
Figure pct00019
과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 3.4 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 340 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 22번 위치의 Gly가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(22Cys GLP-1-diGlcNAc)를 2.2 ㎎ 얻었다.
실시예 30 30번 위치 Cys-디글크낙 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 59).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 30번 위치의 Ala가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디글크낙 당사슬(d)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 9.3 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 4.1 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 410 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 30번 위치의 Ala가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(30Cys GLP-1-diGlcNAc)를 2.2 ㎎ 얻었다.
실시예 31 34번 위치 Cys-디글크낙 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Cys(Trt)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 60).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 34번 위치의 Lys가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디글크낙 당사슬(d)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 12 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 3.9 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 390 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 34번 위치의 Lys가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(34Cys GLP-1-diGlcNAc)를 1.5 ㎎ 얻었다.
실시예 32 22번 위치 Cys-디만노오스 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 61).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 22번 위치의 Gly가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디만노오스 당사슬(e)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 7.2 ㎎
Figure pct00020
과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 3.4 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 340 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 22번 위치의 Gly가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(22Cys GLP-1-dimannose)를 1.6 ㎎ 얻었다.
실시예 33 30번 위치 Cys-디만노오스 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 62).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 30번 위치의 Ala가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디만노오스 당사슬(e)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 10.2 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 4.1 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 410 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 30번 위치의 Ala가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(30Cys GLP-1-dimannose)를 2.4 ㎎ 얻었다.
실시예 34 34번 위치 Cys-디만노오스 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Cys(Trt)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 63).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 34번 위치의 Lys가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디만노오스 당사슬(e)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 10 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 3.9 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 390 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 34번 위치의 Lys가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(34Cys GLP-1-dimannose)를 1.3 ㎎ 얻었다.
실시예 35 12번 위치 Asn-아시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Ala(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 4시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu)을 사용하고, 고상 수지 상에 Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)의 12 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 64). 이 12 잔기의 펩티드 7.0 μ㏖ 분량을 별도로 준비한 고상 합성용 칼럼에 옮기고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(1 ㎖)을 사용해서 탈보호하여, DMF로 세정 후, 별도로 준비한 원침관에 아시알로 당사슬 아스파라긴(b)(27.7 ㎎, 14.0 μ㏖)과 DEPBT(6.3 ㎎, 21.1 μ㏖)를 DMF/DMSO(4:1 혼합용액, 0.35 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, DIPEA(2.4 ㎕, 14.1 μ㏖)를 첨가하여 실온에서 18시간 교반하였다. DMF와 DCM로 세정하면, 고상 상에 Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asn(Oligosaccharide chain)의 13 잔기당사슬 펩티드가 얻어졌다(서열번호 65).
그 후 Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산과 HOBt(4.7 ㎎, 0.03 m㏖), DIPCI(5.4 ㎕, 0.03 m㏖)를 DMF(0.875 ㎖)에 용해시키고, 15분간 활성화시킨 후, 고상 합성용 칼럼에 넣었다. 실온에서 1시간 교반한 후, Fmoc기를 20분 20% 피페리딘/DMF 용액(1 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, 아미노산을 순차 축합시켰다. Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Boc기로 보호한 아미노산에는 Boc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지 상에 Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asn(Oligosaccharide chain)-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 18 잔기의 당사슬 펩티드를 얻었다(서열번호 66).
DCM 및 DMF를 사용하여 세정한 후, 트리플루오로에탄올과 초산의 혼합용액(1:1)을 충분히 수지가 잠길 정도로 첨가하고, 18시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 농축하여, 보호 당사슬 펩티드 Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asn(Oligosaccharide chain)-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)―NH-Boc를 얻었다(서열번호 67).
18 잔기의 보호 당사슬 펩티드 2.45 μ㏖ 상당을 가지형 플라스크로 옮기고, DMF(0.1 ㎖)에 용해시킨 후, 아르곤 분위기하, -15~-20℃로 냉각하였다. 이것에 벤질티올(8.7 ㎕, 73.6 μ㏖)을 첨가한 후, 별도로 준비한 PyBOP(6.4 ㎎, 12.3 μ㏖)의 DMF 용액(0.231 ㎖)을 첨가하고, 계속해서, DIPEA(2.1 ㎕, 12.3 μ㏖)를 첨가하였다. -15~-20℃에 있어서 2시간 교반한 후, 냉각한 디에틸에테르(150 ㎖)에 첨가하여 펩티드성분을 침전시킨 후, 용액부분을 멤브레인 필터로 제거하였다. 얻어진 잔사를 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 첨가하여 실온에서 교반하였다. 2시간 후, 재차, 이 용액을 별도로 준비한 디에틸에테르(150 ㎖)에 첨가하여 침전시킨 후, 용액부분을 멤브레인 필터로 제거함으로써 목적으로 하는 펩티드 티오에스테르체를 포함하는 잔사가 얻어졌다. 이 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, C 말단이 벤질티오에스테르인 펩티드 PhS-Ala-Gln-Gly-Glu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Asn(Oligosaccharide chain)-Thr-Gly-Glu-Ala-His 2.1 ㎎을 얻었다(서열번호 68).
한편, 고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 4시간 교반한 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Boc기로 보호한 아미노산에는 Boc-Cys(Trt)를 사용하고, 고상 수지 상에, Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Cys(trt)의 13 잔기의 펩티드를 얻었다(서열번호 69). 이것을 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 첨가하여 실온에서 3.5시간 교반하였다. 그 후, 별도로 준비한 디에틸에테르(150 ㎖)에 첨가하여 침전시킨 후, 용액부분을 멤브레인 필터로 제거함으로써 목적으로 하는 펩티드 티오에스테르체를 포함하는 잔사가 얻어졌다. 이 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, 목적으로 하는 펩티드 Gly-Arg-Gly-Lys-Val-Leu-Trp-Ala-Ile-Phe-Glu-Lys-Cys를 얻었다(서열번호 70).
이와 같이 하여 조제한 18 잔기의 C 말단이 벤질티오에스테르펩티드(2.1 ㎎)와 13 잔기의 펩티드(2.6 ㎎)의 2종류를 동일한 원침관에 넣고, pH 6.8의 버퍼용액(0.58 ㎖)(6 M 구아니딘 염산액, 0.2 mM 인산용액으로 조제)에 용해시킨 후, 실온에서 티오페놀(2.9 ㎕)을 첨가하여, 실온에서 반응을 행하였다. 24시간 후, HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, 31 잔기의 당사슬 펩티드 1.5 ㎎을 얻었다.
얻어진 당사슬 펩티드를 원침관에 넣고, pH 7.0의 버퍼용액(35 mMTCEP액, 6 M 구아니딘 염산액, 0.2 mM 인산용액으로 조제)에 용해시켰다. 이 반응용액을 실온에서, 활성화된 레이니니켈을 첨가하고, 26시간 후, 반응 종료를 HPLC로 확인한 후, 반응용액을 멤브레인 필터로 여과하여, 목적으로 하는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 포함하는 여액부분을 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, 목적으로 하는 GLP-1의 12번 위치의 Phe가 아시알로 당사슬 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(12Asn GLP-1-asialo)를 0.8 ㎎ 얻었다.
실시예 36 18번 위치 Asn-아시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(50 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.125 m㏖), TBTU(0.125 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.125 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.25 m㏖), MSNT(0.25 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.175 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.25 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.25 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.25 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu)을 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)의 19 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 71).
아시알로 당사슬 아스파라긴(b)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 198 ㎎(100 μ㏖)과 DEPBT 30.0 ㎎(100 μ㏖)을 NMP/DMSO(2.4/0.6 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣었다. DIPEA 26 ㎕(150 μ㏖)를 첨가하여 실온에서 24시간 교반하였다. DMF와 DCM으로 세정하면, 고상 상에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Asn(Oligosaccharide chain)의 20 잔기 당사슬 펩티드가 얻어졌다(서열번호 72). 그 후, 아미노기가 Fmoc 보호된 아미노산을 HOBt 34 ㎎(0.25 m㏖), DIPCI 38 ㎕(0.25 m㏖), DMF(1 ㎖)에 의해 축합시키고, Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Asn(Oligosaccharide chain)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기의 당사슬 펩티드를 형성시켰다(서열번호 73).
얻어진 당사슬 펩티드를 형성한 수지를, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하고, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 18번 위치의 Ser이 아시알로 당사슬 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(18Asn GLP-1-asialo) 8.2 ㎎이 얻어졌다.
실시예 37 22번 위치 Asn-아시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(50 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.125 m㏖), TBTU(0.125 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.125 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.25 m㏖), MSNT(0.25 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.175 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.25 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.25 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.25 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt)을 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)의 15 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 74).
아시알로 당사슬 아스파라긴(b)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 198 ㎎(100 μ㏖)과 DEPBT 30 ㎎(100 μ㏖)을 NMP/DMSO(2.4/0.6 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣었다. DIPEA(26 ㎕, 150 μ㏖)를 첨가하여 실온에서 24시간 교반하였다. DMF와 DCM으로 세정하면, 고상 상에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Asn(Oligosaccharide chain)의 16 잔기 당사슬 펩티드가 얻어졌다(서열번호 75). 그 후, 아미노기가 Fmoc 보호된 아미노산을 HOBt 34 ㎎(0.25 m㏖), DIPCI 38 ㎕(0.25 m㏖), DMF(1 ㎖)에 의해 축합시키고, Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Asn(Oligosaccharide chain)-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기의 당사슬 펩티드를 형성시켰다(서열번호 76).
얻어진 당사슬 펩티드를 형성한 수지를, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하고, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 22번 위치의 Gly가 아시알로 당사슬 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(22Asn GLP-1-asialo) 12.2 ㎎이 얻어졌다.
실시예 38 26번 위치 Asn-아시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Ala(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 4시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Boc기로 보호한 아미노산에는 Boc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지 상에 Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)(서열번호 77)의 18 잔기 펩티드를 얻었다.
DCM 및 DMF를 사용하여 세정한 후, 트리플루오로에탄올과 초산의 혼합용액(1:1)을 충분히 수지가 잠길 정도로 첨가하고, 18시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 농축하여, 보호 펩티드 Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-NHBoc를 얻었다(서열번호 78).
18 잔기의 보호 펩티드 35 μ㏖ 상당을 가지형 플라스크로 옮기고, DMF(3.7 ㎖)에 용해시킨 후, 아르곤 분위기하, -15~-20℃로 냉각하였다. 이것에 벤질티올(125 ㎕, 1.06 m㏖)을 첨가한 후, 별도로 준비한 PyBOP(94.7 ㎎, 182 μ㏖)의 DMF 용액(1.0 ㎖)을 첨가하고, 계속해서, DIPEA(29.8 ㎕, 175 μ㏖)를 첨가하였다. -15~-20℃에 있어서 2시간 교반한 후, 냉각한 디에틸에테르(150 ㎖)에 첨가하여 펩티드성분을 침전시킨 후, 용액부분을 멤브레인 필터로 제거하였다. 얻어진 잔사를 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 첨가하여 실온에서 교반하였다. 2시간 후, 재차, 이 용액을 별도로 준비한 디에틸에테르(150 ㎖)에 첨가하여 침전시킨 후, 용액부분을 멤브레인 필터로 제거함으로써 목적으로 하는 펩티드 티오에스테르체를 포함하는 잔사가 얻어졌다. 이 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, C 말단이 벤질티오에스테르인 18 잔기의 펩티드 PhS-Ala-Gln-Gly-Glu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Glu-Ala-His를 얻었다(서열번호 79).
한편, 고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 4시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노산을 보호한 아미노산과 HOBt(67.6 ㎎, 0.50 m㏖), DIPCI(77.0 ㎕, 63.1 ㎎, 0.50 m㏖)를 DMF(2 ㎖)에 용해시키고, 15분간 활성화시킨 후, 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 1시간 교반한 후, Fmoc기를 20분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu)를 사용하고, 고상 수지 상에 Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)의 11 잔기의 펩티드를 얻었다(서열번호 80). 이 11 잔기의 펩티드 10 μ㏖ 분량을 별도로 준비한 고상 합성용 칼럼에 옮기고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(1 ㎖)을 사용해서 탈보호하여, DMF로 세정 후, 별도로 준비한 원침관에 아시알로 당사슬 아스파라긴(b)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 40.0 ㎎(20.0 μ㏖)과 DEPBT 9.0 ㎎(30.0 μ㏖)을 DMF/DMSO(4:1 혼합용액, 0.5 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, DIPEA 3.4 ㎕(20 μ㏖)를 첨가하여 실온에서 16시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용하여 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(1 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, Boc-Cys(Trt), HOBt 6.8 ㎎(0.05 m㏖), DIPCI 7.7 ㎕(0.05 m㏖)를 DMF(1 ㎖)에 용해시키고, 15분간 활성화시킨 후, 고상 합성용 칼럼에 넣었다. 실온에서 1시간 교반한 후, 수지를 DCM, DMF를 사용하여 세정함으로써 고상 수지 상에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Asn(Oligosaccharide chain)-Cys(Trt)의 13 잔기의 당사슬 펩티드를 얻었다(서열번호 81). 이것을 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 첨가하여 실온에서 3.5시간 교반하였다. 그 후, 별도로 준비한 디에틸에테르(150 ㎖)에 첨가하여 침전시킨 후, 원심분리조작을 행하여, 목적으로 하는 당사슬 펩티드를 포함하는 침전물과 용액부분을 나누었다. 그 후, 용액부분을 제거한 후, HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, 목적으로 하는 당사슬 펩티드 7.1 ㎎을 얻었다.
이렇게 하여 조제한 18 잔기의 C 말단이 벤질티오에스테르펩티드(1.6 ㎎)와 13 잔기의 당사슬 펩티드(2.5 ㎎) 두 종류를 동일한 원침관에 넣어, pH 6.8의 버퍼용액(0.8 ㎖)(6 M 구아니딘염산액, 0.2 mM 인산용액으로 조제)에 용해시킨 후, 실온에서 티오페놀(8.0 ㎕)을 첨가하여, 실온에서 반응을 행하였다. 24시간 후, 반응 종료를 HPLC로 확인한 후, 반응용액을 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, 목적으로 하는 31 잔기의 당사슬 펩티드 2.0 ㎎을 얻었다.
얻어진 당사슬 펩티드(1.0 ㎎)를 원침관에 넣고, pH 7.0의 버퍼용액(35 mM TCEP액, 6 M 구아니딘염산액, 0.2 mM 인산용액으로 조제)에 용해시켰다. 이 반응용액을 실온에서, 활성화된 레이니니켈을 첨가하고, 18시간 후, 반응 종료를 HPLC로 확인한 후, 반응용액을 멤브레인 필터로 여과하여, 목적으로 하는 당사슬 펩티드를 포함하는 여액부분을 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, 목적으로 하는 GLP-1의 26번 위치의 Lys가 아시알로 당사슬 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(26Asn GLP-1-asialo) 0.2 ㎎을 얻었다.
실시예 39 27번 위치 Asn-아시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Ala(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 4시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Boc기로 보호한 아미노산에는 Boc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지 상에 Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 18 잔기의 펩티드를 얻었다(서열번호 82).
DCM 및 DMF를 사용하여 세정한 후, 트리플루오로에탄올과 초산의 혼합용액(1:1)을 충분히 수지가 잠길 정도로 첨가하고, 18시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 농축하여, 18 잔기의 보호 펩티드 Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-NHBoc를 얻었다(서열번호 83).
18 잔기의 보호 펩티드 35 μ㏖ 상당을 가지형 플라스크로 옮기고, DMF(3.7 ㎖)에 용해시킨 후, 아르곤 분위기하, -15~-20℃로 냉각하였다. 이것에 벤질티올 125 ㎕(1.06 m㏖)를 첨가한 후, 별도로 준비한 PyBOP 94.7 ㎎(182 μ㏖)의 DMF 용액(1.0 ㎖)을 첨가하고, 계속해서, DIPEA 29.8 ㎕(175 μ㏖)를 첨가하였다. -15~-20℃에 있어서 2시간 교반한 후, 냉각한 디에틸에테르(150 ㎖)에 첨가하여 펩티드성분을 침전시킨 후, 용액부분을 멤브레인 필터로 제거하였다. 얻어진 잔사를 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 첨가하여 실온에서 교반하였다. 2시간 후, 재차, 이 용액을 별도로 준비한 디에틸에테르(150 ㎖)에 첨가하여 침전시킨 후, 용액부분을 멤브레인 필터로 제거함으로써 목적으로 하는 펩티드 티오에스테르체를 포함하는 잔사가 얻어졌다. 이 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, C 말단이 벤질티오에스테르인 18 잔기의 펩티드 PhS-Ala-Gln-Gly-Glu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Glu-Ala-His를 얻었다(서열번호 84).
한편, 고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 4시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노산을 보호한 아미노산과 HOBt 67.6 ㎎(0.50 m㏖), DIPCI 77.0 ㎕(63.1 ㎎, 0.50 m㏖)를 DMF(2 ㎖)에 용해시키고, 15분간 활성화시킨 후, 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 1시간 교반한 후, Fmoc기를 20분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe를 사용하고, 고상 수지 상에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe의 10 잔기의 펩티드를 얻었다(서열번호 85). 이 10 잔기의 펩티드 10 μ㏖ 분량을 별도로 준비한 고상 합성용 칼럼에 옮기고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(1 ㎖)을 사용해서 탈보호하여, DMF로 세정 후, 별도로 준비한 원침관에 아시알로 당사슬 아스파라긴(b)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 37.2 ㎎(18.8 μ㏖)과 DEPBT 8.5 ㎎(28.4 μ㏖)을 DMF/DMSO(4:1 혼합용액, 1.0 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, DIPEA 3.2 ㎕(18.8 μ㏖)를 첨가하여 실온에서 16시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용하여 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(1 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 당사슬 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노산을 보호한 아미노산과 HOBt 6.8 ㎎(0.05 m㏖), DIPCI 7.7 ㎕(0.05 m㏖)를 DMF(1 ㎖)에 용해시키고, 15분간 활성화시킨 후, 고상 합성용 칼럼에 넣었다. 실온에서 1시간 교반한 후, Fmoc기를 20분 20% 피페리딘/DMF 용액(1 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, 아미노산을 순차 축합시켰다. Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Lys(Boc), Boc기로 보호한 아미노산에는 Boc-Cys(Trt)를 사용하고, 고상 수지 상에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Asn(Oligosaccharide chain)-Lys(Boc)-Cys(Trt)의 13 잔기의 당사슬 펩티드를 얻었다(서열번호 86). 이것을 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 첨가하여 실온에서 3.5시간 교반하였다. 그 후, 별도로 준비한 디에틸에테르(150 ㎖)에 첨가하여 침전시킨 후, 원심분리조작을 행하여, 목적으로 하는 당사슬 펩티드를 포함하는 침전물과 용액부분을 나누었다. 그 후, 용액부분을 제거한 후, 목적물을 HPLC로 확인한 후, HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, 13 잔기의 당사슬 펩티드 6.1 ㎎을 얻었다.
이렇게 하여 조제한 18 잔기의 C 말단이 벤질티오에스테르펩티드(1.3 ㎎)와 13 잔기의 당사슬 펩티드(2.0 ㎎) 두 종류를 동일한 원침관에 넣어, pH 6.8의 버퍼용액(0.64 ㎖)(6 M 구아니딘염산액, 0.2 mM 인산용액으로 조제)에 용해시킨 후, 실온에서 티오페놀(6.4 ㎕)을 첨가하여, 실온에서 반응을 행하였다. 24시간 후, 반응 종료를 HPLC로 확인한 후, 반응용액을 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, 31 잔기의 당사슬 펩티드 1.0 ㎎을 얻었다.
얻어진 당사슬 펩티드(1.0 ㎎)를 원침관에 넣고, pH 7.0의 버퍼용액(35 mM TCEP액, 6 M 구아니딘염산액, 0.2 mM 인산용액으로 조제)에 용해시켰다. 이 반응용액을 실온에서, 활성화된 레이니니켈을 첨가하고, 18시간 후, 반응 종료를 HPLC로 확인한 후, 반응용액을 멤브레인 필터로 여과하여, 당사슬 펩티드를 포함하는 여액부분을 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, 목적으로 하는 GLP-1의 27번 위치의 Glu가 아시알로 당사슬 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(27Asn GLP-1-asialo) 0.5 ㎎을 얻었다.
실시예 40 28번 위치 Asn-아시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Ala(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 4시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Boc기로 보호한 아미노산에는 Boc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지 상에 Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 18 잔기의 펩티드를 얻었다(서열번호 87).
DCM 및 DMF를 사용하여 세정한 후, 트리플루오로에탄올과 초산의 혼합용액(1:1)을 충분히 수지가 잠길 정도로 첨가하고, 18시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 농축하여, 18 잔기의 보호 펩티드 Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-NHBoc를 얻었다(서열번호 88).
18 잔기의 보호 펩티드 35 μ㏖ 상당을 가지형 플라스크로 옮기고, DMF(3.7 ㎖)에 용해시킨 후, 아르곤 분위기하, -15~-20℃로 냉각하였다. 이것에 벤질티올 125 ㎕(1.06 m㏖)를 첨가한 후, 별도로 준비한 PyBOP 94.7 ㎎(182 μ㏖)의 DMF 용액(1.0 ㎖)을 첨가하고, 계속해서, DIPEA 29.8 ㎕(175 μ㏖)를 첨가하였다. -15~-20℃에 있어서 2시간 교반한 후, 냉각한 디에틸에테르(150 ㎖)에 첨가하여 펩티드성분을 침전시킨 후, 용액부분을 멤브레인 필터로 제거하였다. 얻어진 잔사를 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 첨가하여 실온에서 교반하였다. 2시간 후, 재차, 이 용액을 별도로 준비한 디에틸에테르(150 ㎖)에 첨가하여 침전시킨 후, 용액부분을 멤브레인 필터로 제거함으로써 목적으로 하는 펩티드 티오에스테르체를 포함하는 잔사가 얻어졌다. 이 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, C 말단이 벤질티오에스테르인 18 잔기의 펩티드 PhS-Ala-Gln-Gly-Glu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Glu-Ala-His를 얻었다(서열번호 89).
한편, 고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 4시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노산을 보호한 아미노산과 HOBt 67.6 ㎎(0.50 m㏖), DIPCI 77.0 ㎕(63.1 ㎎, 0.50 m㏖)를 DMF(2 ㎖)에 용해시키고, 15분간 활성화시킨 후, 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 1시간 교반한 후, Fmoc기를 20분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile를 사용하고, 고상 수지 상에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile의 9 잔기의 펩티드를 얻었다(서열번호 90). 이 9 잔기의 펩티드 11 μ㏖ 분량을 별도로 준비한 고상 합성용 칼럼에 옮기고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(1 ㎖)을 사용해서 탈보호하여, DMF로 세정 후, 별도로 준비한 원침관에 아시알로 당사슬 아스파라긴(b)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 82.6 ㎎(41.8 μ㏖)과 DEPBT 18.7 ㎎(62.5 μ㏖)을 DMF/DMSO(4:1 혼합용액, 1.4 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, DIPEA 7.0 ㎕(41.2 μ㏖)를 첨가하여 실온에서 16시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용하여 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(1 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 당사슬 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노산을 보호한 아미노산과 HOBt 6.8 ㎎(0.05 m㏖), DIPCI 7.7 ㎕(0.05 m㏖)를 DMF(1 ㎖)에 용해시키고, 15분간 활성화시킨 후, 고상 합성용 칼럼에 넣었다. 실온에서 1시간 교반한 후, Fmoc기를 20분 20% 피페리딘/DMF 용액(1 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, 아미노산을 순차 축합시켰다. Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Boc기로 보호한 아미노산에는 Boc-Cys(Trt)를 사용하고, 고상 수지 상에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Asn(Oligosaccharide chain)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Cys(Trt)의 13 잔기의 펩티드를 얻었다(서열번호 91). 이것을 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 첨가하여 실온에서 3.5시간 교반하였다. 그 후, 별도로 준비한 디에틸에테르(150 ㎖)에 첨가하여 침전시킨 후, 원심분리조작을 행하여, 목적으로 하는 당사슬 펩티드를 포함하는 침전물과 용액부분을 나누었다. 그 후, 용액부분을 제거한 후, HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, 13 잔기의 당사슬 펩티드 10.1 ㎎을 얻었다.
이렇게 하여 조제한 18 잔기의 C 말단이 벤질티오에스테르펩티드(3.6 ㎎)와 13 잔기의 당사슬 펩티드(5.6 ㎎) 두 종류를 동일한 원침관에 넣어, pH 6.8의 버퍼용액(1.8 ㎖)(6 M 구아니딘염산액, 0.2 mM 인산용액으로 조제)에 용해시킨 후, 실온에서 티오페놀(18 ㎕)을 첨가하여, 실온에서 반응을 행하였다. 24시간 후, 반응 종료를 HPLC로 확인한 후, 반응용액을 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, 31 잔기의 당사슬 펩티드 3.8 ㎎을 얻었다.
얻어진 당사슬 펩티드(1.3 ㎎)를 원침관에 넣고, pH 7.0의 버퍼용액(35 mM TCEP액, 6 M 구아니딘염산액, 0.2 mM 인산용액으로 조제)에 용해시켰다. 이 반응용액을 실온에서, 활성화된 레이니니켈을 첨가하고, 40시간 후, 반응 종료를 HPLC로 확인한 후, 반응용액을 멤브레인 필터로 여과하여, 당사슬 펩티드를 포함하는 여액부분을 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, 목적으로 하는 GLP-1의 28번 위치의 Phe가 아시알로 당사슬 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(28Asn GLP-1-asialo) 0.8 ㎎을 얻었다.
실시예 41 30번 위치 Asn-아시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(50 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.125 m㏖), TBTU(0.125 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.125 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.25 m㏖), MSNT(0.25 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.175 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.25 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.25 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.25 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)의 7 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 92).
아시알로 당사슬 아스파라긴(b)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 198 ㎎(100 μ㏖)과 DEPBT 30.0 ㎎(100 μ㏖)을 NMP/DMSO(2.4/0.6 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣었다. DIPEA 26 ㎕(150 μ㏖)를 첨가하여 실온에서 24시간 교반하였다. DMF와 DCM으로 세정하면, 고상 상에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Asn(Oligosaccharide chain)의 8 잔기 당사슬 펩티드가 얻어졌다(서열번호 93). 그 후, 아미노기가 Fmoc 보호된 아미노산을 HOBt 34 ㎎(0.25 m㏖), DIPCI 38 ㎕(0.25 m㏖), DMF(1 ㎖)에 의해 축합시키고, Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Asn(Oligosaccharide chain)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기의 당사슬 펩티드를 형성시켰다(서열번호 94).
얻어진 당사슬 펩티드를 형성한 수지를, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하고, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 30번 위치의 Ala가 아시알로 당사슬 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(30Asn GLP-1-asialo) 6.4 ㎎이 얻어졌다.
실시예 42 36번 위치 Asn-아시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(50 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.125 m㏖), TBTU(0.125 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.125 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.25 m㏖), MSNT(0.25 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.175 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.25 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.25 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다.
아시알로 당사슬 아스파라긴(b)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 198 ㎎(100 μ㏖)과 DEPBT 30.0 ㎎(100 μ㏖)을 NMP/DMSO(2.4/0.6 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣었다. DIPEA 26 ㎕(150 μ㏖)를 첨가하여 실온에서 24시간 교반하였다. DMF와 DCM으로 세정하면, 고상 상에 Gly-Asn(Oligosaccharide chain)의 2 잔기 당사슬 펩티드가 얻어졌다.
그 후, 아미노기가 Fmoc 보호된 아미노산을 HOBt 34 ㎎(0.25 m㏖), DIPCI 38 ㎕(0.25 m㏖), DMF(1 ㎖)에 의해 축합시켜서, Gly-Asn(Oligosaccharide chain)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기의 당사슬 펩티드를 형성시켰다(서열번호 95).
얻어진 당사슬 펩티드를 형성한 수지를, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하고, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 36번 위치의 Arg가 아시알로 당사슬 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(36Asn GLP-1-asialo) 8.0 ㎎이 얻어졌다.
실시예 43 18번 위치 Asn - 디시알로 당사슬 부가 GLP -1 펩티드의 합성법
실시예 36에서 합성한 18Asn GLP-1-asialo(0.6 ㎎)를 50 mM 카코딜산 완충액(pH=5.0, 200 ㎕)에 용해시킨 후, 소 혈청 알부민(BSA, 1 ㎎)을 첨가하였다. 이것에, CMP-시알산(5 ㎎), 알칼리포스파타아제(Alkaline phosphatase)(1 ㎕)를 첨가하여 균일화하고, 마지막으로, α2,6-Sialyltransferase(JT사제, 10 mU)를 첨가하여 30℃에서 24시간 반응시켰다(HPLC 반응 모니터 조건: 칼럼: SHISEIDO CAPCELPAK C18 UG120, φ4.6×250 ㎜, 전개용매A: 0.1% TFA 수용액, 전개용매B: 0.09% TFA 아세토니트릴/물=90/10, 그라디언트 A/B=60/40→30/60 40분 유속 0.7 ㎖/분). 도 1에 HPLC 차트의 일례를 나타낸다. 도면 중, 앞쪽의 피크가 원료인 18Asn GLP-1-asialo, 뒤쪽의 피크가 18Asn GLP-1-disialo이다. HPLC 동일 조건으로 정제하여, GLP-1의 18번 위치의 Ser이 디시알로 당사슬 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(18Asn GLP-1-disialo)가 0.3 ㎎ 얻어졌다.
실시예 44 22번 위치 Asn-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
실시예 37에서 합성한 22Asn GLP-1-asialo(1.3 ㎎)를 50 mM 카코딜산 완충액(pH=5.0, 200 ㎕)에 용해시킨 후, 소 혈청 알부민(BSA, 1 ㎎)을 얻었다. 이것에, CMP-시알산(5 ㎎), 알칼리포스파타아제(1 ㎕)를 첨가하여 균일화하고, 마지막으로, α2,6-Sialyltransferase(JT사제, 10 mU)를 첨가하여 30℃에서 24시간 반응시켰다(HPLC 반응 모니터 조건: 칼럼: SHISEIDO CAPCELPAK C18 UG120, φ4.6×250 ㎜, 전개용매A: 0.1% TFA 수용액, 전개용매B: 0.09% TFA 아세토니트릴/물=90/10, 그라디언트 A/B=60/40→30/60 40분 유속 0.7 ㎖/분). 도 2에 HPLC 차트의 일례를 나타낸다. 도면 중, 앞쪽의 피크가 원료인 22Asn GLP-1-asialo, 뒤쪽의 피크가 22Asn GLP-1-disialo이다. HPLC 동일 조건으로 정제하여, GLP-1의 22번 위치의 Gly가 디시알로 당사슬 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(22Asn GLP-1-disialo)가 1.3 ㎎ 얻어졌다.
실시예 45 30번 위치 Asn-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
실시예 41에서 합성한 30Asn GLP-1-asialo(0.9 ㎎)를 50 mM 카코딜산 완충액(pH=5.0, 200 ㎕)에 용해시킨 후, 소 혈청 알부민(BSA, 1 ㎎)을 얻었다. 이것에, CMP-시알산(5 ㎎), 알칼리포스파타아제(1 ㎕)를 첨가하여 균일화하고, 마지막으로, α2,6-Sialyltransferase(JT사제, 10 mU)를 첨가하여 30℃에서 24시간 반응시켰다(HPLC 반응 모니터 조건: 칼럼: SHISEIDO CAPCELPAK C18 UG120, φ4.6×250 ㎜, 전개용매A: 0.1% TFA 수용액, 전개용매B: 0.09% TFA 아세토니트릴/물=90/10, 그라디언트 A/B=60/40→30/60 40분 유속 0.7 ㎖/분). 도 3에 HPLC 차트의 일례를 나타낸다. 도면 중, 앞쪽의 피크가 원료인 30Asn GLP-1-asialo, 뒤쪽의 피크가 30Asn GLP-1-disialo이다. HPLC 동일 조건으로 정제하여, GLP-1의 30번 위치의 Ala가 디시알로 당사슬 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(30Asn GLP-1-disialo)가 0.6 ㎎ 얻어졌다.
실시예 46 30번 위치 Asn-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Ala(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 4시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산 (0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Boc기로 보호한 아미노산에는 Boc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지 상에 Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 18 잔기의 펩티드를 얻었다(서열번호 96).
DCM 및 DMF를 사용하여 세정한 후, 트리플루오로에탄올과 초산의 혼합용액(1:1)을 충분히 수지가 잠길 정도로 첨가하고, 18시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 농축하여, 보호 펩티드 Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-NHBoc를 얻었다(서열번호 97).
18 잔기의 보호 펩티드 35 μ㏖ 상당을 가지형 플라스크로 옮기고, DMF(3.7 ㎖)에 용해시킨 후, 아르곤 분위기하, -15~-20℃로 냉각하였다. 이것에 벤질티올 125 ㎕(1.06 m㏖)를 첨가한 후, 별도로 준비한 PyBOP 94.7 ㎎(182 μ㏖)의 DMF 용액(1.0 ㎖)을 첨가하고, 계속해서, DIPEA 29.8 ㎕(175 μ㏖)를 첨가하였다. -15~-20℃에 있어서 2시간 교반한 후, 냉각한 디에틸에테르(150 ㎖)에 첨가하여 펩티드성분을 침전시킨 후, 용액부분을 멤브레인 필터로 제거하였다. 얻어진 잔사를 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 첨가하여 실온에서 교반하였다. 2시간 후, 재차, 이 용액을 별도로 준비한 디에틸에테르(150 ㎖)에 첨가하여 침전시킨 후, 용액부분을 멤브레인 필터로 제거함으로써 목적으로 하는 펩티드 티오에스테르체를 포함하는 잔사가 얻어졌다. 이 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, C 말단이 벤질티오에스테르인 18 잔기의 펩티드 PhS-Ala-Gln-Gly-Glu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Glu-Ala-His를 얻었다(서열번호 98).
Figure pct00021
한편, 고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 4시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노산을 보호한 아미노산과 HOBt 67.6 ㎎(0.50 m㏖), DIPCI 77.0 ㎕(63.1 ㎎, 0.50 m㏖)를 DMF(2 ㎖)에 용해시키고, 15분간 활성화시킨 후, 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 1시간 교반한 후, Fmoc기를 20분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)의 7 잔기의 펩티드를 얻었다(서열번호 99). 이 7 잔기의 펩티드 34.6 μ㏖ 분량을 별도로 준비한 고상 합성용 칼럼에 옮기고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하여, DMF로 세정 후, 별도로 준비한 원침관에 당사슬 아스파라긴(f)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 132.7 ㎎(48.4 μ㏖)과 DEPBT 31.2 ㎎(104.3 μ㏖)을 DMF/DMSO(1:4 혼합용액, 0.6 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, DIPEA 18.1 ㎕(103.8 μ㏖)를 첨가하여 실온에서 18시간 교반하였다.
Figure pct00022
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용하여 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(1 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 당사슬 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노산을 보호한 아미노산과 HOBt 33.8 ㎎(0.25 m㏖), DIPCI 38.5 ㎕(31.5 ㎎, 0.25 m㏖)를 DMF(1 ㎖)에 용해시키고, 15분간 활성화시킨 후, 고상 합성용 칼럼에 넣었다. 실온에서 1시간 교반한 후, Fmoc기를 20분 20% 피페리딘/DMF 용액(1 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, 아미노산을 순차 축합시켰다. Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Boc기로 보호한 아미노산에는 Boc-Cys(Trt)를 사용하고, 고상 수지 상에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Asn(Oligosaccharide chain)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Cys(trt)의 13 잔기의 당사슬 펩티드를 얻었다(서열번호 100). 이것을 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 첨가하여 실온에서 3.5시간 교반하였다. 그 후, 별도로 준비한 디에틸에테르(150 ㎖)에 첨가하여 침전시킨 후, 원심분리조작을 행하여, 당사슬 펩티드를 포함하는 침전물과 용액부분을 나누었다. 그 후, 용액부분을 제거한 후, 얻어진 침전물을 pH 6.8의 50 mM 디티오트레이톨용액 버퍼(50 mM 디티오트레이톨용액, 6 M 구아니딘염산액, 0.2 mM 인산용액으로 조제)에 용해시켜, 하룻밤 반응시켰다. 목적물을 HPLC로 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, 13 잔기의 당사슬 펩티드 18.2 ㎎을 얻었다.
Figure pct00023
이렇게 하여 조제한 18 잔기의 C 말단이 벤질티오에스테르펩티드(9.3 ㎎)와 13 잔기의 당사슬 펩티드(18.2 ㎎) 두 종류를 동일한 원침관에 넣어, pH 6.8의 버퍼용액(0.15 ㎖)(6 M 구아니딘염산액, 0.2 mM 인산용액으로 조제)에 용해시킨 후, 실온에서 티오페놀(15.4 ㎕)을 첨가하여, 37℃에서 반응을 행하였다. 24시간 후, 반응용액을 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, 31 잔기의 당사슬 펩티드 9.2 ㎎을 얻었다.
얻어진 당사슬 펩티드(9.2 ㎎)를 원침관에 넣고, pH 7.0의 버퍼용액(35 mM TCEP액, 6 M 구아니딘염산액, 0.2 mM 인산용액으로 조제)에 용해시켰다. 이 반응용액을 실온에서, 활성화된 레이니니켈을 첨가하고, 72시간 후, 반응 종료를 HPLC로 확인한 후, 반응용액을 멤브레인 필터로 여과하여, 목적으로 하는 당사슬 펩티드를 포함하는 여액부분을 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제하여, 31 잔기의 당사슬 펩티드 1.3 ㎎을 얻었다.
Figure pct00025
이렇게 해서 얻어진 31 잔기의 당사슬 펩티드 1.3 ㎎을 에펜도르프 튜브에 넣고, 증류수(25 ㎕)로 용해시킨 후, 실온에서 100 mM 수산화나트륨수용액(25 ㎕)을 첨가하였다. 30분 후, HPLC로 목적물의 생성을 확인한 후, 0℃로 냉각하고, 50 mM 초산수용액(50 ㎕)을 첨가하여 중화조작을 행하고, 그 후, HPLC[칼럼: Vydac column(C18, 5 ㎛), φ4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 7.0 ㎖/min, ;B액 25→45%(15 min)→60%(10 min)→95%(10 min), linear gradient]로 정제를 행하여, 목적으로 하는 GLP-1의 30번 위치의 Ala가 디시알로 당사슬 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(30Asn GLP-1-disialo) 0.3 ㎎을 얻었다.
Figure pct00026
실시예 47 36번 위치 Asn-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
실시예 42에서 합성한 36 Asn GLP-1-asialo(0.8 ㎎)를 50 mM 카코딜산 완충액(pH=5.0, 200 ㎕)에 용해시킨 후, 소 혈청 알부민(BSA, 1 ㎎)을 첨가하였다. 이것에, CMP-시알산(5 ㎎), 알칼리포스파타아제(1 ㎕)를 첨가하여 균일화하고, 마지막으로, α2,6-Sialyltransferase(JT사제, 10 mU)를 첨가하여 30℃에서 24시간 반응시켰다(HPLC 반응 모니터 조건: 칼럼: SHISEIDO CAPCELPAK C18 UG120, φ4.6×250 ㎜, 전개용매A: 0.1% TFA 수용액, 전개용매B: 0.09% TFA 아세토니트릴/물=90/10, 그라디언트 A/B=60/40→30/60 40분 유속 0.7 ㎖/분). 도 4에 HPLC 차트의 일례를 나타낸다. 도면 중, 앞쪽의 피크가 원료인 36 Asn GLP-1-asialo, 뒤쪽의 피크가 36Asn GLP-1-disialo이다. HPLC 동일 조건으로 정제하여, GLP-1의 36번 위치의 Arg가 디시알로 당사슬 Asn으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(36Asn GLP-1-disialo)가 0.6 ㎎ 얻어졌다.
실시예 48 26번 위치-34번 위치 Cys-디시알로 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지 상에 Gly-Arg(Pbf)-Gly-Cys(Trt)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기의 펩티드를 얻었다(서열번호 101).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 26번 위치 및 34번 위치의 Lys가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당사슬(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 10.5 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 2.1 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 210 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 26 및 34번 위치의 Lys가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(26-34Cys GLP-1-disialo)를 0.1 ㎎ 얻었다.
실시예 49 18번 위치-36번 위치 Cys-디시알로 당사슬 부가 GLP-1의 합성법
고상 합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(100 μ㏖)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.25 m㏖), TBTU(0.25 m㏖) 및 N-에틸모르폴린(0.25 m㏖)을 DMF(2 ㎖)에 용해시켜서 칼럼에 넣고, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, HMPB-PEGA resin을 얻어, 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.
Fmoc-Gly(0.50 m㏖), MSNT(0.50 m㏖) 및 N-메틸이미다졸(0.375 m㏖)을 DCM(2 ㎖)에 용해시키고, 고상 합성용 칼럼에 넣어, 25℃에서 3시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 사용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산을 N-메틸피롤리돈(NMP)(1 ㎖)에 용해시키고, 0.45 M HCTU·HOBT/NMP(0.4 m㏖)를 첨가한 후에, 고상 합성용 칼럼에 첨가하고, 계속해서 0.9 M DIPEA/NMP(0.8 m㏖)를 고상 합성용 칼럼에 첨가하였다. 실온에서 20분간 교반한 후, 수지를 DCM 및 DMF를 사용해서 세정하고, Fmoc기를 15분 20% 피페리딘/DMF 용액(2 ㎖)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하고, Fmoc기로 보호한 아미노산(0.5 m㏖)을 사용하여 아미노산을 순차 축합시켰다.
Fmoc기로 보호한 아미노산에는 Fmoc-Gly, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Trp(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ala, Fmoc-His(Trt)를 사용하고, 고상 수지에 Gly-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)의 31 잔기 펩티드를 얻었다(서열번호 102).
얻어진 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 칼럼에 취하고, 트리플루오로초산:물:TIPS(=95:2.5:2.5)를 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하여, 3시간 실온에서 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ20×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 8.0 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 18번 위치의 Ser 및 36번 위치의 Arg가 Cys로 치환된 펩티드가 얻어졌다.
브로모아세틸화한 디시알로 당사슬(a)(오츠카 가가쿠 가부시키가이샤제) 10.5 ㎎과 상기에서 합성한 펩티드 사슬 2.1 ㎎을 100 mM 인산 완충액 pH 7.5, 210 ㎕에 녹이고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후, 그 상태로 HPLC[칼럼: SHISEIDO UG-120(C18, 5 ㎛), φ4.6×250 ㎜, 그라디언트:A액:0.1% TFA 수용액, B액:0.09% TFA/10% 물/90% AN 0.7 ㎖/min, ;B액 35→60% 20 min linear gradient]로 정제하여, GLP-1의 18번 위치의 Ser 및 36번 위치의 Arg가 당사슬 부가 Cys로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(18-36Cys GLP-1-disialo)를 0.8 ㎎ 얻었다.
이하의 표 7은, 실시예 8~49에서 얻어진 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 MS 스펙트럼 데이터이다. 표 중, [M+H]+는 MALDI-TOF mass이고, [M+3H]3+ 및 [M+4H]4+는, EMI-MS로 측정한 결과를 나타낸다.
Figure pct00027
시험예 1 (혈장 중에 있어서의 안정성)
실시예 7 또는 비교예 1에서 제조한 펩티드 0.1 ㎎을 에펜도르프 튜브에 넣고, 전량 0.114 ㎖가 되도록 PBS(0.08 ㎖, 전체량의 70%) 및 혈장(0.034 ㎖, 전체량의 30%)를 순차적으로 넣어, 37℃에서 반응시켰다.
혈장을 반응용기에 첨가한 시간을 0분으로 하고, 10, 30, 60, 180, 360, 720 및 1440분에, 반응용액으로부터 0.01 ㎖를 취출(取出)함으로써 샘플링을 행하였다.
샘플링한 반응용액을, 사전에 에펜도르프 튜브에 준비한 10% 트리플루오로초산용액 0.02 ㎖와 혼화시킨 후, 원심분리를 행하여, 그 혼화용액의 상징분(上澄分)으로부터 0.025 ㎖를 HPLC로 인젝션하여, 반응용액의 조성을 분석하였다(반응 모니터링 조건: SHISEIDO CAPCELLPAK C18, UG120, 250×4.6 ㎜, 전개용매A: 0.1% TFA 수용액, B: 0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10, 그라디언트 A:B=95:5→5:95 15분 유속 0.7 ㎖/min). 결과를 도 5(실시예 7) 및 도 6(비교예 1)에 나타낸다.
도 5에 있어서, 13.3분 부근에, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 피크가 확인된다. 도 5에 나타내어지는 바와 같이, 혈장 첨가 후 24시간(1440분) 후까지, 실시예 7의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, 그 대부분이 잔존해 있었다.
한편, 도 6에 있어서, 16~16.5분간의 피크는, 분해되어 있지 않은 GLP-1을 나타내고, 17.5~18분간의 피크는, 7번 위치 및 8번 위치의 His-Ala가 이탈된 GLP-1 프래그먼트(9-36)를 나타낸다. 도 6에 나타내어지는 바와 같이, 당사슬이 부가되어 있지 않은 비교예 1의 GLP-1은, 혈장 첨가 후 180분까지 그 대부분이 분해되었다.
시험예 2 (db/db 마우스에 있어서의 혈장값 저하작용 1)
실시예 1~5 또는 비교예 1에서 제조한 펩티드를, 8주령의 수컷, 2형 당뇨병 모델 마우스(BKS.Cg-+ Leprdb/Leprdb/Jcl*)에 전량 8 ㎖/㎏ body waight(샘플농도 9 n㏖/㎏ body waight)가 되도록, 투여 샘플과 동일한 것을 모델 마우스 3마리 각각에 복강 내 투여하였다. 즉, 그 펩티드의 PBS 용액(9 n㏖/10 ㎖)을, BKS.Cg-+ Leprdb/+ Leprdb/Jcl 마우스(8주령, 수컷)에 10 ㎖/㎏의 투여량으로 복강 내 투여하였다. 투여 후, 0, 30, 60, 90, 120, 180분 후에 안저(眼底) 채혈법에 의해 0.03 ㎖ 채혈을 행하여, 얻어진 혈액을 전량 0.3 ㎖가 되도록 PBS로 희석하고, 그 용액을 원심분리조작하여 혈장성분과 혈구성분으로 분리하였다. 그 후, 혈장성분만을 별도로 준비한 에펜도르프 튜브로 옮기고, 냉장보존하였다. 혈장 중의 글루코오스 농도를, 흡광광도계를 이용한 글루코오스 CII-테스트와코를 사용하여 측정하였다. 통계학적 처리를 행하여 결과를 얻었다. 결과를 도 7에 나타낸다.
도 7에 나타내어지는 바와 같이, 당사슬이 부가되어 있지 않은 비교예 1의 GLP-1은, 혈당치를 거의 저하시키지 않았다. 이것에 대해, 실시예 1~5의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, 모두 혈당치를 유의하게 저하시키고, 또한 그 효과는, 120분 후에도 지속되었다.
시험예 3 ( db / db 마우스에 있어서의 혈당치 저하작용 2)
실시예 5 또는 비교예 1에서 제조한 펩티드를, 8주령의 수컷, 2형 당뇨병 모델 마우스(BKS.Cg-+ Leprdb/Leprdb/Jcl*)에 전량 8 ㎖/㎏ body waight(샘플농도(body waight):0.9 n㏖/㎏, 9 n㏖/㎏, 90 nm㏖/㎏, 900 n㏖/㎏)가 되도록, 투여 샘플과 동일한 것을 모델 마우스 3마리 각각에 복강 내 투여하였다. 즉, 그 펩티드의 PBS 용액(각각 0.9 n㏖/10 ㎖, 9 n㏖/10 ㎖, 90 n㏖/10 ㎖, 900 n㏖/10 ㎖)을, BKS.Cg-+ Leprdb/+ Leprdb/Jcl 마우스(8주령, 수컷)에 10 ㎖/㎏의 투여량으로 복강 내 투여하였다. 샘플 투여의 0, 30, 60, 90 및 120분 후에 안저 채혈법에 의해 0.03 ㎖ 채혈을 행하여, 얻어진 혈액을 전량 0.3 ㎖가 되도록 PBS로 희석하고, 그 용액을 원심분리조작하여 혈장성분과 혈구성분으로 분리하였다. 그 후, 혈장성분만을 별도로 준비한 에펜도르프 튜브로 옮겨 냉장보존하였다. 혈장 중의 글루코오스 농도를, 흡광광도계를 이용한 글루코오스 CII-테스트와코를 사용하여 측정하였다. 통계학적 처리를 행하여 결과를 얻었다. 결과를 도 8에 나타낸다.
도 8의 결과로부터, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드가, GLP-1의 투여량을 900 n㏖/㎏으로 했을 때에 비해 1/100의 투여량으로도 우수한 혈당치 저하작용을 나타내는 것을 알 수 있다.
시험예 4 (디펩티딜 펩티다아제 IV(DPP-IV)에 대한 내성시험 1)
0.5 ㎖의 에펜도르프 튜브 중에 실시예 1~5, 13~23, 25, 27, 31, 34, 36, 48 또는 49에서 제조한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 또는 비교예 1에서 제조한 GLP-1 17.7 n㏖과 DPP-IV(Dipeptidyl Peptidase IV from porcine kidney, SIGMA사제) 2.2 mU를 첨가하고, 각각 100 mM 인산나트륨 완충액으로 전량 100 ㎕가 되도록 조제하여, 37℃에서 반응시켰다. 반응액 10 ㎕를, 사전에 별도의 에펜도르프 튜브에 준비한 10% 트리플루오로초산 15 ㎕와 혼화시키고, HPLC로 20 ㎕ 인젝션하여, 원료의 소실을 모니터하였다(HPLC 조건: 칼럼: SHISEIDO CAPCELLPAK C18, UG120, φ4.6×250 ㎜, 전개용매A: 0.1% TFA 수용액, 전개용매B: 0.09% TFA 아세토니트릴/물=90/10, 그라디언트 A/B=65/30→30/60 20분 유속 0.7 ㎖/분).
DPP-IV에 대한 내성의 지표가 되는 반감기(t1/2)를, 당사슬이 부가되어 있지 않은 비교예 1의 GLP-1의 반감기(t1/2)를 기준(=1)으로 하여, 각 실시예의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 대해 평가한 값을 표 8에 나타낸다.
Figure pct00028
각 실시예의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, 비교예 1의 GLP-1의 DPP-IV 내성의 1.2배~128배의 DPP-IV 내성을 나타내었다. 18, 36번 위치(Cys-디시알로) 당사슬 부가 GLP-1 펩티드가 최대의 내성을 나타내고, 다음으로 12번 위치(Cys-디시알로), 26, 34번 위치(Cys-디시알로), 28번 위치(Cys-디시알로), 14번 위치(Cys-디시알로), 26번 위치(Cys-디시알로), 26번 위치(Cys-아시알로), 32번 위치(Cys-디시알로), 25번 위치(Cys-디시알로), 22번 위치(Cys-디시알로), 24번 위치(Cys-디시알로), 34번 위치(Cys-디시알로), 20번 위치(Cys-디시알로), 30번 위치(Cys-디시알로), 27번 위치(Cys-디시알로), 34번 위치(Cys-아시알로), 34번 위치(Cys-디글크낙), 38번 위치(Cys-디시알로), 36번 위치(Cys-디시알로), 34번 위치(Cys-디만노오스), 18번 위치(Cys-디시알로), 18번 위치(Asn-아시알로), 16번 위치(Cys-디시알로)의 순서로 큰 DPP-IV 내성을 나타내었다.
실시예 3, 23 및 48 또는 실시예 1, 4 및 49의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 DPP-IV 내성의 비교로부터, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 2개 이상의 당사슬 부가를 행함으로써, 1개의 당사슬 부가를 행한 경우에 비해, DPP-IV 내성 증대에 대해, 상승(相乘)효과가 생기는 것이 나타내어졌다.
당사슬구조에 관해서는, 디시알로 당사슬＞아시알로 당사슬＞디글크낙 당사슬＞디만노오스 당사슬의 순서로, 부가된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드가 높은 DPP-IV 내성을 나타내었다.
시험예 5 (디펩티딜 펩티다아제 IV(DPP-IV)에 대한 내성시험 2)
0.5 ㎖의 에펜도르프 튜브 중에 실시예 10~13 중 어느 하나에서 제조한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 17.7 n㏖과 DPP-IV(Dipeptidyl Peptidase IV from porcine kidney, SIGMA사제) 22 mU를 첨가하고, 100 mM 인산나트륨 완충액으로 전량 100 ㎕가 되도록 조제하여, 37℃에서 반응시켰다. 반응액 10 ㎕를, 사전에 별도의 에펜도르프 튜브에 준비한 10% 트리플루오로초산 15 ㎕와 혼화시키고, HPLC로 20 ㎕ 인젝션하여, 원료의 소실을 모니터하였다(HPLC 조건: 칼럼: SHISEIDO CAPCELLPAK C18, UG120, φ4.6×250 ㎜, 전개용매A: 0.1% TFA 수용액, 전개용매B: 0.09% TFA 아세토니트릴/물=90/10, 그라디언트 A/B=65/30→30/60 20분 유속 0.7 ㎖/분).
DPP-IV에 대한 내성의 지표가 되는 반감기(t1/2)를 실시예 13의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 반감기(t1/2)를 기준(=1)으로 하여, 실시예 10~12의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 대해 평가한 값을 표 9에 나타낸다.
Figure pct00029
시험예 4에 있어서, 실시예 13의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, 당사슬이 부가되어 있지 않은 비교예 1의 GLP-1과 비교하여, 약 34배의 DPP-IV 내성을 나타내었다. 이 실시예 13의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(12번 위치(Cys-디시알로)와 비교하여, 실시예 10~12의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는, 1.1배~17.2배의 DPP-IV 내성을 나타내었다. 9번 위치(Cys-디시알로)가 최대의 내성을 나타내고, 다음으로 10번 위치(Cys-디시알로), 11번 위치(Cys-디시알로), 12번 위치(Cys-디시알로)와, GLP-1의 N 말단에 가까운 부위의 순서로 증대된 DPP-IV 내성을 나타내었다. 또한, DPP-IV에 대한 반응부위는 GLP-1의 N 말단에 존재하는 것이 알려져 있는 부위에 당사슬을 부가한 것일수록, 높은 DPP-IV 내성을 나타내었다.
시험예 6 (cAMP 합성능시험)
1. 마우스 GLP-1 수용체 발현 벡터의 구축
마우스 GLP-1 수용체 cDNA의 5' 말단과 3' 말단에 결합하는 마우스 GLP-1 수용체 센스 프라이머(5'-GTTGCTAGCGCCACCATGGCCAGCACCCCAAGCCT-3')(서열번호 152) 및 마우스 GLP-1 수용체 안티센스 프라이머(5'-CCTGAATTCTCAGCTGTAGGAACTCTGGCAG-3')(서열번호 153)를 각각 합성하고, cDNA(Clone ID:40046534, Open Biosystems사)를 주형으로 하여 ExTaq polymerase(TaKaRa사)를 사용하여 PCR을 행하였다. 즉, 템플레이트 cDNA(10 ng/μL) 1 μL, 2.5 mM dNTPs 4 μL, 프라이머 혼합액(각 50 μM) 1 μL, ×10 Ex Taq polymerase Buffer 5 μL, Ex Taq polymerase 0.25 μL 및 멸균수 38.75 μL로 되는 합계 50 μL의 반응액을 사용하여, 94℃ 1분; 94℃ 45초, 55℃ 1분, 72℃ 2분(35 사이클); 72℃ 10분으로 반응시켰다. PCR 반응 산물은 1% 아가로오스겔 전기영동 후, cDNA 단편을 Wizard SV Gel and PCR Clean-up System(Promega사)을 사용하여 정제하고, 추가적으로 제한효소(EcoRI 및 NheI)처리를 행하여, 마우스 GLP-1 수용체 cDNA를 얻었다.
마우스 GLP-1 수용체 고발현세포의 효율적 취득을 위해, 발현벡터로서 pIRES-gfp 벡터를 사용하였다. 본 벡터는 pIRESpuro2(Clontech사)의 제한효소처리(Sal I, BamHI)에 의해 얻어진 IRES 유전자를 포함하는 DNA 단편을 벡터 pEGFP-N1(Clontech사)에 삽입함으로써 제작하였다.
마우스 GLP-1 수용체 cDNA 단편을 pIRES-gfp에 삽입함으로써 마우스 GLP-1 수용체 발현 벡터 mGLP-1R/pIRES-gfp를 얻었다. 얻어진 벡터는 ABI3100-Avant(Applied Biosystems사)를 사용하여 DNA 염기서열의 확인을 행하였다.
2. 마우스 GLP-1 수용체 발현 CHO-K1 세포의 제작
얻어진 mGLP-1R /pIRES-gfp는, FuGENE(등록상표)(Roche사)을 사용하여, 취급설명서에 따라 CHO-K1 세포(ATCC 카탈로그 번호 CCL-61)에 유전자 도입하였다. 유전자 도입된 CHO-K1 세포는 10% FCS(Hyclone사), 페니실린-스트렙토마이신(SIGMA사) 함유 RPMI 1640 배지(와코순약사)에서 배양하고, 추가적으로 G418(와코순약공업주식회사) 1.0 ㎎/㎖를 첨가하여 약제 선택을 행하였다. 약제 내성을 획득한 세포는 셀소터(EPICS ALTRA, Beckman Coulter사)를 사용하여 GFP 발현량을 지표로 소팅을 행하였다. 소팅 후의 세포는 한계 희석을 행하여, GFP 고발현세포, 즉 마우스 GLP-1 수용체를 고발현하는 세포를 얻었다. 얻어진 세포를 마우스 GLP-1 수용체 발현 CHO-K1 세포로서 하기 실험에 사용하였다.
3. 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 아고니스트 작용(cAMP 합성능) 해석
상기 2에서 제작한 마우스 GLP-1 수용체 발현 CHO-K1 세포를 사용하여, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 아고니스트 작용을 cAMP 합성능을 지표로 평가하였다.
마우스 GLP-1 수용체 발현 CHO-K1 세포를 10% FCS 함유 RPMI 1640 배지에 5 ×105개/㎖의 농도가 되도록 현탁하였다. 세포 현탁액은 100 μL씩 바닥이 평평한 96웰 플레이트(Falcon사)에 파종하여, 37℃, 5% CO2에서 16시간 배양하였다. 배양상청을 버리고, 2.5 mM 글루코오스 함유 Krebs Ringer bicarbonate Buffer로 용해한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 100 μL/웰씩 첨가하고, 37℃에서 30분 배양하여, 신속하게 배양상청을 버렸다. 마우스 GLP-1 수용체 발현 CHO-K1 세포 내에서 합성된 cAMP량은 cAMP ELISA 키트(GE 헬스케어 바이오사이언스사 또는 Cayman사)를 사용해서 측정하여, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 마우스 GLP-1 수용체에 대한 아고니스트 작용의 지표로 하였다.
GLP-1은 GLP-1 수용체와 결합함으로써 세포 내 cAMP 농도를 상승시키고, 인슐린 분비를 촉진시킨다. 이에 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 활성을, cAMP 합성능을 지표로 평가하였다. 마우스 GLP-1 수용체 발현 CHO-K1 세포를 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로 자극하고, 세포 내에서 합성되는 cAMP량을 측정하였다. 당사슬이 부가되어 있지 않은 비교예 1의 GLP-1의 EC50값을 1로 했을 경우의 실시예 1~5, 8~23, 25, 27의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 상대활성을, 표 10에 나타낸다.
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당사슬이 부가되어 있지 않은 비교예 1의 GLP-1과 동등 이상의 활성을 나타내는 실시예의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서 22Cys GLP-1-disialo, 26Cys GLP-1-asialo, 30Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-asialo, 36Cys GLP-1-disialo, 38Cys GLP-1-disialo가 발견되었다. 22, 26, 30, 34, 36, 38번 위치(=37번 위치의 아미노산에 당사슬 부가 아미노산을 부가)의 아미노산이 당사슬 부가에 적합한 위치라고 생각되었다.
시험예 7 경구 내당능시험(OGTT: Oral Glucose Tolerance Test)
실시예 1~5, 9, 10, 13, 16, 21, 23~27, 29~34, 38, 45, 48 또는 49에서 제조한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 또는 비교예 1에서 제조한 GLP-1의 PBS 용액을, 하룻밤 절식시킨 C57BL/6JJcl 마우스(10주령, 수컷)에 10 ㎖/㎏의 투여량으로 복강 내에 투여하였다. 30분 후에 글루코오스용액을 1 ㎎/g의 투여량으로 경구투여하였다. 글루코오스 투여 전, 글루코오스 투여 30분 후, 60분 후, 120분 후에 안와(眼窩) 채혈을 행하고, 아큐체크 아비바(로슈 다이어그노스틱스사)를 사용하여 혈당치를 측정하였다.
시험예 7-1 (각종 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 OGTT)
하룻밤 절식시킨 상기 마우스에 글루코오스용액을 경구투여 후, 경시적으로 채혈하여 혈당치를 측정하였다. 글루코오스 투여에 의해 마우스 혈당치는 상승하여, 투여 후 30분에 최대가 되고, 그 후 서서히 감소한다. 글루코오스 투여 30분 전에, 각 실시예에서 제조한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(8Cys GLP-1-disialo, 9Cys GLP-1-disialo, 12Cys GLP-1-disialo, 18Cys GLP-1-disialo, 20Cys GLP-1-disialo, 22Cys GLP-1-disialo, 26Cys GLP-1-disialo, 26Cys GLP-1-asialo, 30Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-asialo, 36Cys GLP-1-disialo, 38Cys GLP-1-disialo) 또는 비교예 1에서 제조한 GLP-1을 각각 9 n㏖/㎏의 투여량으로 복강 내에 투여하여 혈당치 상승 억제작용을 비교하였다. 결과를 도 9~11에 나타낸다.
당사슬이 부가되어 있지 않은 비교예 1의 GLP-1은 혈중 안정성이 낮고, 투여 후, 신속하게 분해되기 때문에, 혈당치 상승 억제작용은 작다.
이에 대해, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드인 18Cys GLP-1-disialo, 20Cys GLP-1-disialo, 22Cys GLP-1-disialo, 26Cys GLP-1-disialo, 26Cys GLP-1-asialo, 30Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-asialo, 36Cys GLP-1-disialo, 38Cys GLP-1-disialo는 강한 혈당치 상승 억제작용을 나타내었다.
시험예 7-2 (당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 OGTT에 있어서의 당사슬구조의 영향)
11당(디시알로 당사슬), 9당(아시알로 당사슬), 7당(디글크낙 당사슬) 또는 5당(디만노오스 당사슬)을 부가한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(22Cys GLP-1-disialo, 22Cys GLP-1-asialo, 22Cys GLP-1-diGlcNAc, 22Cys GLP-1-dimannose, 30Cys GLP-1-disialo, 30Cys GLP-1-asialo, 30Cys GLP-1-diGlcNAc, 30Cys GLP-1-dimannose, 34Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-asialo, 34Cys GLP-1-diGlcNAc, 34Cys GLP-1-dimannose) 또는 비교예 1에서 제조한 GLP-1을 각각 9 n㏖/㎏의 투여량으로 복강 내에 투여하고, 당사슬구조-활성 상관을 마우스 OGTT로 검토하였다. 결과를 도 12~14에 나타낸다.
22번 위치, 30번 위치, 34번 위치 중 어느 부가부위에 있어서도, 가장 높은 혈당치 상승 억제작용을 나타낸 것은 가장 큰 11당(디시알로 당사슬)을 부가한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드였다. 혈당치 상승 억제활성은, 11당≥9당≥7당≥5당의 순서로 높았다.
시험예 7-3 (당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 OGTT에 있어서의 투여량의 영향)
고활성 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 순위 정하기를 목적으로, 26Cys GLP-1-disialo, 30Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-disialo, 36Cys GLP-1-disialo에 대해 투여량을 각각 1/10(0.9 n㏖/㎏) 또는 1/100(0.09 n㏖/㎏)로 한 마우스 OGTT를 실시하였다. 결과를 도 15~18에 나타낸다. 도 15~18 중, GLP-1에 대해서는 시험예 7-2에서 얻은, 9 nmol/㎏의 투여량에서의 OGTT의 결과를 나타낸다.
26Cys GLP-1-disialo, 30Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-disialo, 36Cys GLP-1-disialo 중 어느 당사슬 부가 GLP-1 펩티드도 투여량 의존적인 혈당치 상승 억제활성을 나타내었다. 0.9 n㏖/㎏의 투여량으로 혈당치 상승을 가장 강하게 억제한 것은 30Cys GLP-1-disialo 및 36Cys GLP-1-disialo로, 거의 완전히 혈당치 상승을 억제하고 있었다.
또한, 투여량 0.09 n㏖/㎏의 36Cys GLP-1-disialo의 혈당치 상승 억제활성은, 투여량 9 n㏖/㎏의 GLP-1의 활성과 동등하다는 점에서, 36Cys GLP-1-disialo의 활성은 GLP-1에 비해 약 100배 증대된 것으로 생각되었다. 마찬가지로, 투여량 0.09 n㏖/㎏의 30Cys GLP-1-disialo의 혈당치 상승 억제활성은 동 투여량의 36Cys GLP-1-disialo의 활성보다도 약하다는 점에서, 30Cys GLP-1-disialo의 활성은 GLP-1의 10배~100배 이하인 것으로 생각되었다. 투여량 0.9 n㏖/㎏에 있어서의 26Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-disialo의 약효는 동 투여량의 30Cys GLP-1-disialo, 36Cys GLP-1-disialo의 혈당 상승 억제활성의 1/2 정도였던 점에서 26Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-disialo의 활성은 GLP-1의 5배~50배 정도인 것으로 생각되었다. 상기 OGTT에 있어서 높은 활성을 나타낸 당사슬 부가부위는 30번 위치 및 36번 위치였다.
시험예 7-4 (Asn 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 OGTT)
GLP-1의 22번 위치 또는 30번 위치의 아미노산을, 당사슬 부가 Asn(천연 결합형 당사슬) 또는 당사슬 부가 Cys로 치환한, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 대해서, 투여량 0.9 n㏖/㎏에 있어서의 활성을 마우스 OGTT로 비교하였다. 결과를 도 19에 나타낸다. 도 19 중, GLP-1에 대해서는, 시험예 7-2에서 얻은, 9 n㏖/㎏의 투여량에서의 OGTT의 결과를 나타낸다.
22번 위치에 9당(아시알로 당사슬)을 부가한 경우, 30번 위치에 11당(디시알로 당사슬)을 부가한 경우 모두, 당사슬 부가 Asn과 당사슬 부가 Cys 사이에서 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 상승 억제작용에 차이는 없고, 어느 당사슬 부가 아미노산을 부가한 경우에도 당사슬 부가 GLP-1 펩티드는 활성을 나타내었다.
실시예 7-5 (당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 OGTT에 있어서의, 당사슬 부가 수의 영향)
2개의 당사슬을 부가한 실시예 48 및 49의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 상승 억제작용에 대해, 마우스 OGTT를 사용하여 평가하였다. 투여량 9 n㏖/㎏에 있어서의 26, 34Cys GLP-1-disialo 및 18, 36Cys GLP-1-disialo의 OGTT의 결과를 도 20에 나타낸다. 도 20 중, GLP-1에 대해서는, 시험예 7-2에서 얻은, 9 n㏖/㎏의 투여량에서의 OGTT의 결과를 나타낸다.
투여량 9 n㏖/㎏의 18, 36Cys GLP-1-disialo의 작용은, 도 5, 14에 있어서의 36Cys GLP-1-disialo와 거의 동등하였다. 투여량 9 n㏖/㎏의 26, 34Cys GLP-1-disialo의 혈당치 상승 억제활성은, 동 투여량의 GLP-1과 비교하여, 약간 개선되어 있었다.
다음으로 18, 36Cys GLP-1-disialo에 대해, 투여량을 1/10(0.9 n㏖/㎏)로 하여 OGTT를 행하였다. 마찬가지로, 투여량 9 n㏖/㎏의 GLP-1에 대해서 OGTT를 행하고, 18, 36Cys GLP-1-disialo와 비교하였다. 결과를 도 21에 나타낸다.
투여량 0.9 n㏖/㎏의 18, 36Cys GLP-1-disialo의 혈당치 저하작용은 투여량 9 n㏖/㎏의 GLP-1과 거의 동등하였다. 18, 36Cys GLP-1-disialo의 혈당치 상승 억제활성은 GLP-1에 비해 10배 정도 증대되어 있는 것으로 생각되었다.
시험예 8 (당뇨병 모델 마우스에 있어서의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 혈당치 저하작용)
실시예 2, 3, 4, 21 또는 23에서 제조한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 또는 비교예 1에서 제조한 GLP-1의 PBS 용액(9 n㏖/10 ㎖)을, BKS.Cg-+ Leprdb/+Leprdb/Jcl 마우스(10주령, 수컷)에 10 ㎖/㎏의 투여량으로 복강 내에 투여하였다. 화합물 투여 전, 30분 후, 60분 후, 120분, 180분, 300분 후에 안와 채혈을 행하고, 아큐체크 아비바(로슈 다이어그노스틱스사)를 사용하여 혈당치를 측정하였다.
당뇨병 모델 마우스인, db/db(BKS.Cg-+ Leprdb/+ Leprdb/Jcl) 마우스는 섭식억제/에너지대사 항진 호르몬인 렙틴의 수용체에 변이가 생긴 마우스로, 비만, 고혈당 등의 증상을 발증한다.
마우스 OGTT(시험예 7)에서 혈당치 상승 억제활성을 나타낸 당사슬 부가 GLP-1 펩티드 중, 22Cys GLP-1-disialo, 26Cys GLP-1-disialo, 30Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-disialo, 36Cys GLP-1-disialo를 db/db 마우스에 9 n㏖/㎏의 투여량으로 복강 내에 투여하고, 경시적으로 혈당치를 측정함으로써, 혈당치 저하작용을, 당사슬이 부가되어 있지 않은 비교예 1의 GLP-1과 비교하였다. 결과를 도 22에 나타낸다.
GLP-1의 혈중 안정성은 낮아, 투여 후, 신속하게 분해된다. 이 때문에 혈당치 저하작용은 작아 PBS 투여 마우스의 혈당치와 거의 다르지 않다.
이에 대해, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드(26Cys GLP-1-disialo, 30Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-disialo, 36Cys GLP-1-disialo)는 강한 혈당치 저하작용을 나타내고, 마우스 OGTT에 있어서 혈당치 상승 억제활성을 나타낸 것은 db/db 마우스에서도 혈당치 저하작용을 나타내었다(120분에 있어서의 혈당치 저하작용: 26Cys GLP-1-disialo, 30Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-disialo, 36Cys GLP-1-disialo≥22Cys GLP-1-disialo).
26Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-disialo를 투여한 경우의 혈당치는 그 후 서서히 상승하여, 경시적으로 혈당치 저하작용이 약간 약해졌다. 30Cys GLP-1-disialo, 36Cys GLP-1-disialo를 투여한 경우의 혈당치는 300분까지 낮은 레벨을 유지하고 있었다(300분에 있어서의 혈당치 저하작용: 30Cys GLP-1-disialo, 36Cys GLP-1-disialo≥22Cys GLP-1-disialo, 26Cys GLP-1-disialo, 34Cys GLP-1-disialo).
서열표 프리텍스트
서열번호 1은 일반식(1)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 2는 GLP-1(7-37)이다.
서열번호 3은 GLP-1(7-36) NH2이다.
서열번호 4는 (a1)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 5는 (a2)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 6은 (a3)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 7은 (a4)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 8은 (a5)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 9는 (a6)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 10은 (a7)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 11은 (a8)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 12는 (a9)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 13은 (a10)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 14는 (a11)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 15는 (a12)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 16은 (a13)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 17은 (a14)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 18은 (a15)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 19는 (a16)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 20은 (a17)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 21은 (a18)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 22는 (a19)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 23은 (a20)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 24는 (a21)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 25는 (a22)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 26은 (a23)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 27은 (a24)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 28은 (a25)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 29는 (a26)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 30은 실시예 1에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 31은 비교예 1에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 32는 실시예 6에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 33은 실시예 6에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 34는 실시예 7에 있어서 합성된 보호기를 갖는 18 잔기 펩티드이다.
서열번호 35는 실시예 7에 있어서 합성된 보호기를 갖는 19 잔기 당사슬 부가 펩티드이다.
서열번호 36은 실시예 7에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 당사슬 부가 펩티드이다.
서열번호 37은 실시예 8에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 38은 실시예 9에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 39는 실시예 10에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 40은 실시예 11에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 41은 실시예 12에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 42는 실시예 13에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 43은 실시예 14에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 44는 실시예 15에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 45는 실시예 16에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 46은 실시예 17에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 47은 실시예 18에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 48은 실시예 19에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 49는 실시예 20에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 50은 실시예 21에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 51은 실시예 22에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 52는 실시예 23에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 53은 실시예 24에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 54는 실시예 25에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 55는 실시예 26에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 56은 실시예 27에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 57은 실시예 28에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 58은 실시예 29에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 59는 실시예 30에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 60은 실시예 31에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 61은 실시예 32에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 62는 실시예 33에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 63은 실시예 34에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 64는 실시예 35에 있어서 합성된 보호기를 갖는 12 잔기 펩티드이다.
서열번호 65는 실시예 35에 있어서 합성된 보호기를 갖는 13 잔기 당사슬 부가 펩티드이다.
서열번호 66은 실시예 35에 있어서 합성된 보호기를 갖는 18 잔기 당사슬 부가 펩티드이다.
서열번호 67은 실시예 35에 있어서 합성된 보호기를 갖는 18 잔기 당사슬 부가 펩티드이다.
서열번호 68은 실시예 35에 있어서 합성된 이탈기를 갖는 18 잔기 당사슬 부가 펩티드이다.
서열번호 69는 실시예 35에 있어서 합성된 보호기를 갖는 13 잔기 펩티드이다.
서열번호 70은 실시예 35에 있어서 합성된 13 잔기 펩티드이다.
서열번호 71은 실시예 36에 있어서 합성된 보호기를 갖는 19 잔기 펩티드이다.
서열번호 72는 실시예 36에 있어서 합성된 보호기를 갖는 20 잔기 당사슬 부가 펩티드이다.
서열번호 73은 실시예 36에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 당사슬 부가 펩티드이다.
서열번호 74는 실시예 37에 있어서 합성된 보호기를 갖는 15 잔기 펩티드이다.
서열번호 75는 실시예 37에 있어서 합성된 보호기를 갖는 16 잔기 당사슬 부가 펩티드이다.
서열번호 76은 실시예 37에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 당사슬 부가 펩티드이다.
서열번호 77은 실시예 38에 있어서 합성된 보호기를 갖는 18 잔기 펩티드이다.
서열번호 78은 실시예 38에 있어서 합성된 보호기를 갖는 18 잔기 펩티드이다.
서열번호 79는 실시예 38에 있어서 합성된 이탈기를 갖는 18 잔기 펩티드이다.
서열번호 80은 실시예 38에 있어서 합성된 보호기를 갖는 11 잔기 펩티드이다.
서열번호 81은 실시예 38에 있어서 합성된 보호기를 갖는 13 잔기 당사슬 부가 펩티드이다.
서열번호 82는 실시예 39에 있어서 합성된 보호기를 갖는 18 잔기 펩티드이다.
서열번호 83은 실시예 39에 있어서 합성된 보호기를 갖는 18 잔기 펩티드이다.
서열번호 84는 실시예 39에 있어서 합성된 이탈기를 갖는 18 잔기 펩티드이다.
서열번호 85는 실시예 39에 있어서 합성된 보호기를 갖는 10 잔기 펩티드이다.
서열번호 86은 실시예 39에 있어서 합성된 보호기를 갖는 13 잔기 당사슬 부가 펩티드이다.
서열번호 87은 실시예 40에 있어서 합성된 보호기를 갖는 18 잔기 펩티드이다.
서열번호 88은 실시예 40에 있어서 합성된 보호기를 갖는 18 잔기 펩티드이다.
서열번호 89는 실시예 40에 있어서 합성된 이탈기를 갖는 18 잔기 펩티드이다.
서열번호 90은 실시예 40에 있어서 합성된 보호기를 갖는 9 잔기 펩티드이다.
서열번호 91은 실시예 40에 있어서 합성된 보호기를 갖는 13 잔기 당사슬 부가 펩티드이다.
서열번호 92는 실시예 41에 있어서 합성된 보호기를 갖는 7 잔기 펩티드이다.
서열번호 93은 실시예 41에 있어서 합성된 보호기를 갖는 8 잔기 당사슬 부가 펩티드이다.
서열번호 94는 실시예 41에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 당사슬 부가 펩티드이다.
서열번호 95는 실시예 42에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 당사슬 부가 펩티드이다.
서열번호 96은 실시예 46에 있어서 합성된 보호기를 갖는 18 잔기 펩티드이다.
서열번호 97은 실시예 46에 있어서 합성된 보호기를 갖는 18 잔기 펩티드이다.
서열번호 98은 실시예 46에 있어서 합성된 이탈기를 갖는 18 잔기 펩티드이다.
서열번호 99는 실시예 46에 있어서 합성된 보호기를 갖는 7 잔기 펩티드이다.
서열번호 100은 실시예 46에 있어서 합성된 보호기를 갖는 13 잔기 당사슬 부가 펩티드이다.
서열번호 101은 실시예 48에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 102는 실시예 49에 있어서 합성된 보호기를 갖는 31 잔기 펩티드이다.
서열번호 103은 (b1)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 104는 (b2)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 105는 (b3)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 106은 (b4)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 107은 (b5)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 108은 (b6)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 109는 (b7)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 110은 (b8)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 111은 (b9)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 112는 (b10)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 113은 (b11)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 114는 (b12)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 115는 (b13)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 116은 (b14)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 117은 (b15)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 118은 (b16)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 119는 (b17)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 120은 (b18)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 121은 (b19)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 122는 (b20)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 123은 (b21)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 124는 (b22)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 125는 (b23)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 126은 (b24)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 127은 (b25)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 128은 (b26)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 129는 (b27)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 130은 (b28)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 131은 (b29)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 132는 (b30)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 133은 (b31)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 134는 (b32)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 135는 (b33)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 136은 (b34)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 137은 (b35)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 138은 (b36)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 139는 (b37)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 140은 (b38)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 141은 (b39)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 142는 (b40)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 143은 (b41)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 144는 (b42)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 145는 (b43)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 146은 (b44)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 147은 (b45)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 148은 (b46)로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 149는 (b47)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 150은 (b48)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 151은 (b49)으로 표시되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드이다.
서열번호 152는 시험예 6에 있어서 합성된 45 잔기의 마우스 GLP-1 수용체 센스 프라이머이다.
서열번호 153은 시험예 6에 있어서 합성된 41 잔기의 마우스 GLP-1 수용체 안티센스 프라이머이다.
산업상 이용가능성
본 발명은 GLP-1과 비교하여, 혈중 안정성이 증대되고, 바람직하게는, 혈당치 억제활성이 증대된, 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 제공한다. 본 발명은 특히 의약품의 분야에 있어서 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> Otsuka Chemical Co., Ltd. and Yokohama City University <120> glycosylated GLP-1 peptide <130> W001192 <150> JP 2007-160951 <151> 2007-06-19 <160> 153 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> glycosylated GLP-1 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa18: Ser, glycosylated Cys or glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa19: Tyr, glycosylated Cys or glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa22: Gly, glycosylated Cys or glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa26: Lys, glycosylated Cys or glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa36: Arg, glycosylated Cys or glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa37: Gly, -NH2, Gly-glycosylated Cys or Gly-glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> When Xaa18 is Ser, Xaa19 is Tyr, Xaa22 is Gly, Xaa26 is Lys and Xaa36 is Arg, Xaa37 is Gly-glycosylated Cys or Gly-glycosylated Asn. <400> 1 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Xaa Xaa Leu Glu Xaa 1 5 10 15 Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Xaa Xaa 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> human <220> <223> GLP-1(7-37)OH <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> GLP-1(7-36)NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 3 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a1) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <400> 4 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 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Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a9) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <400> 12 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Asn Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a10) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <400> 13 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Asn Gly 20 25 30 <210> 14 <211> 32 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a11) <220> <221> CARBOHYD <222> (32)..(32) <223> <400> 14 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Asn 20 25 30 <210> 15 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid 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CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> <400> 18 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 19 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a16) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 19 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys 20 25 30 <210> 20 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a17) <220> <221> CARBOHYD <222> (13)..(13) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 20 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Cys Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 21 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a18) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 21 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Asn Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 22 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a19) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 22 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asn 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 23 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a20) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 23 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Asn Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 24 <211> 30 <212> 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Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Cys 20 25 30 <210> 27 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a24) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <400> 27 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Cys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 28 <211> 32 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a25) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (32)..(32) <223> <400> 28 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Asn Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Asn Gly Asn 20 25 30 <210> 29 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (a26) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 29 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Asn Tyr Leu Glu Asn 1 5 10 15 Gln Ala Ala Asn Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 30 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 1) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 30 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 31 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Comparative Example 1) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having a blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having a blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having a blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having a blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having a blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having a blocking group Pbf <400> 31 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 32 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 6) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having a blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having a blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having a blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having a blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having a blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having a blocking group Pbf <400> 32 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 33 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Exapmle 6) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking groups Trt and Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having a blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having a blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having a blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having a blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having a blocking group Pbf <400> 33 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 34 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 7) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Glu having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Gln having a blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Lys having a blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Glu having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Trp having a blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Lys having a blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Arg having a blocking group Pbf <400> 34 Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly 1 5 10 15 Arg Gly <210> 35 <211> 19 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 7) <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Gln having a blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Lys having a blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Glu having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Trp having a blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Lys having a blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Arg having a blocking group Pbf <400> 35 Asn Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Gly <210> 36 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having a blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having a blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having a blocking group tBu <220> <221> CARBOHYD <222> (13)..(13) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having a blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having a blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having a blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having a blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having a blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having a blocking group Pbf <400> 36 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Asn Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 37 <211> 32 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 8) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 37 Cys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 1 5 10 15 Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 38 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 9) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 38 His Cys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 39 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 10) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 39 His Ala Cys Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 40 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 11) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 40 His Ala Glu Cys Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 41 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 12) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 41 His Ala Glu Gly Cys Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 42 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 13) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group 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blocking groups (Example 19) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 48 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Cys Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 49 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 20) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 49 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Cys Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly 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MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 50 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 51 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 22) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 51 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Cys Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 52 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 23) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 52 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 53 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 24) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> 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having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) 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<223> amino acid sequence having blocking groups (Example 28) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Cys having blocking group Trt <400> 57 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 58 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 29) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 58 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu 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blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 59 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 60 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 31) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 60 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 61 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 32) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 61 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 62 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 33) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 62 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 63 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 34) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 63 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 64 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 35) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Gln having blocking group Trt <400> 64 Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala 1 5 10 <210> 65 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 35) <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Gln having blocking group Trt <400> 65 Asn Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala 1 5 10 <210> 66 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 35) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> CARBOHYD <222> (6)..(6) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <400> 66 His Ala Glu Gly Thr Asn Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala <210> 67 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 35) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt and Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> CARBOHYD <222> (6)..(6) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <400> 67 His Ala Glu Gly Thr Asn Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala <210> 68 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having leaving groups (Example 35) <220> <221> CARBOHYD <222> (6)..(6) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Ala having leaving group PhS <400> 68 His Ala Glu Gly Thr Asn Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala <210> 69 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 35) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 69 Cys Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 1 5 10 <210> 70 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence (Example 35) <400> 70 Cys Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 1 5 10 <210> 71 <211> 19 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 36) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 71 Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Gly <210> 72 <211> 20 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 36) <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 72 Asn Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val 1 5 10 15 Lys Gly Arg Gly <210> 73 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 36) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 73 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Asn Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 37) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 74 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 1 5 10 15 <210> 75 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 37) <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 75 Asn Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 1 5 10 15 <210> 76 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 37) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 76 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asn 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 77 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 38) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> 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82 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 39) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <400> 82 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala <210> 83 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 39) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt and Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) 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blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> CARBOHYD <222> (3)..(3) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 86 Cys Lys Asn Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 1 5 10 <210> 87 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 40) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> 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having blocking groups (Example 40) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 90 Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 1 5 <210> 91 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 40) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> CARBOHYD <222> (4)..(4) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 91 Cys 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amino acid sequence having blocking groups (Example 41) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> 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MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <400> 95 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Asn Gly 20 25 30 <210> 96 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 46) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <400> 96 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala <210> 97 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 46) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt and Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <400> 97 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala <210> 98 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having leaving groups (Example 46) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Ala having leaving group PhS <400> 98 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala <210> 99 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 46) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 99 Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 1 5 <210> 100 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 46) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> CARBOHYD <222> (6)..(6) <223> Asn glycosylated by dibenzyl disialo oligosaccharide chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 100 Cys Lys Glu Phe Ile Asn Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 1 5 10 <210> 101 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 48) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 101 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 102 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 49) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Cys having blocking group Trt <400> 102 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 103 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b1) (Example 1) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 103 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 104 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b2) (Example 2) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 104 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 105 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b3) (Example 3) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 105 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 106 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b4) (Example 4) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 106 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 107 <211> 32 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b5) (Example 5) <220> <221> CARBOHYD <222> (32)..(32) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 107 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Cys 20 25 30 <210> 108 <211> 32 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b6) (Example 6) <220> <221> CARBOHYD <222> (32)..(32) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <400> 108 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Asn 20 25 30 <210> 109 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b7) (Example 7) <220> <221> CARBOHYD <222> (13)..(13) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <400> 109 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Asn Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 110 <211> 32 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b8) (Example 8) <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 110 Cys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 1 5 10 15 Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 111 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b9) (Example 9) <220> <221> CARBOHYD <222> (2)..(2) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 111 His Cys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 112 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b10) (Example 10) <220> <221> CARBOHYD <222> (3)..(3) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 112 His Ala Cys Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 113 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b11) (Example 11) <220> <221> CARBOHYD <222> (4)..(4) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 113 His Ala Glu Cys Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 114 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b12) (Example 12) <220> <221> CARBOHYD <222> (5)..(5) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 114 His Ala Glu Gly Cys Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 115 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b13) (Example 13) <220> <221> CARBOHYD <222> (6)..(6) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 115 His Ala Glu Gly Thr Cys Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 116 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b14) (Example 14) <220> <221> CARBOHYD <222> (8)..(8) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 116 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Cys Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 117 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b15) (Example 15) <220> <221> CARBOHYD <222> (10)..(10) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 117 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Cys Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 118 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b16) (Example 16) <220> <221> CARBOHYD <222> (14)..(14) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 118 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Cys Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 119 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b17) (Example 17) <220> <221> CARBOHYD <222> (18)..(18) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 119 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Cys Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 120 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b18) (Example 18) <220> <221> CARBOHYD <222> (19)..(19) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 120 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Cys Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 121 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b19) (Example 19) <220> <221> CARBOHYD <222> (21)..(21) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 121 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Cys Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 122 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b20) (Example 20) <220> <221> CARBOHYD <222> (22)..(22) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 122 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Cys Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 123 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b21) (Example 21) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 123 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 124 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b22) (Example 22) <220> <221> CARBOHYD <222> (26)..(26) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 124 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Cys Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 125 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b23) (Example 23) <220> 125 <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 125 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 126 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b24) (Example 24) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> Cys glycosylated by asialo oligosaccharide chain <400> 126 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 127 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b25) (Example 25) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> Cys glycosylated by asialo oligosaccharide chain <400> 127 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 128 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b26) (Example 26) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> Cys glycosylated by asialo oligosaccharide chain <400> 128 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 129 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b27) (Example 27) <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> Cys glycosylated by asialo oligosaccharide chain <400> 129 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 130 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b28) (Example 28) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Cys glycosylated by asialo oligosaccharide chain <400> 130 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 131 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b29) (Example 29) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> Cys glycosylated by diGlcNAc oligosaccharide chain <400> 131 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 132 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b30) (Example 30) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> Cys glycosylated by diGlcNAc oligosaccharide chain <400> 132 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 133 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b31) (Example 31) <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> Cys glycosyalated by diGlcNAc oligosaccharide chain <400> 133 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 134 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b32) (Example 32) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> Cys glycosylated by dimannose oligosaccharide chain <400> 134 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 135 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b33) (Example 33) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> Cys glycosylated by dimannose oligosaccharide chain <400> 135 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 136 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b34) (Example 34) <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> Cys glycosylated by dimannose oligosaccharide chain <400> 136 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 137 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b35) (Example 35) <220> <221> CARBOHYD <222> (6)..(6) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <400> 137 His Ala Glu Gly Thr Asn Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 138 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b36) (Example 36) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <400> 138 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Asn Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 139 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b37) (Example 37) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <400> 139 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asn 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 140 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b38) (Example 38) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <400> 140 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Asn Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 141 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b39) (Example 39) <220> <221> CARBOHYD <222> (21)..(21) <223> Asn glycosylatedby asialo oligosaccharide chain <400> 141 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Asn Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 142 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b40) (Example 40) <220> <221> CARBOHYD <222> (22)..(22) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <400> 142 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Asn Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 143 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b41) (Example 41) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <400> 143 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Asn Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 144 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b42) (Example 42) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Asn glycosylated by asialo oligosaccharide chain <400> 144 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Asn Gly 20 25 30 <210> 145 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b43) (Example 43) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> Asn glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 145 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Asn Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 146 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b44) (Example 44) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> Asn glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 146 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asn 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 147 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b45) (Example 45) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> Asn glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 147 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Asn Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 148 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b46) (Example 46) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> Asn glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 148 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Asn Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 149 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b47 (Example 47) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Asn glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 149 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Asn Gly 20 25 30 <210> 150 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b48) (Example 48) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 150 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 151 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of (b49) (Example 49) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide chain <400> 151 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly 20 25 30 <210> 152 <211> 45 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sense primer for mouse GLP-1 receptor <400> 152 GTTGCTAGCG CCACCATGGC CAGCACCCCA AGCCT 45 <210> 153 <211> 41 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense primer for mouse GLP-1 receptor <400> 153 CCTGAATTCT CAGCTGTAGG AACTCTGGCA G 41

Claims (61)

  1. (a) GLP-1;
    (b) GLP-1에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드; 또는,
    (c) GLP-1의 유연체(類緣體);
    에 있어서, 1개 이상의 아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  2. (a) GLP-1; 또는,
    (b) GLP-1에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드;
    에 있어서, 1개 이상의 아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  3. (a) GLP-1; 또는,
    (b) GLP-1에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드로서, GLP-1 활성을 갖는 펩티드;
    에 있어서, 1개 이상의 아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬 부가 아미노산이 당사슬 부가 Asn 또는 당사슬 부가 Cys인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬 부가 아미노산이 당사슬 부가 Asn인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬 부가 아미노산이 당사슬 부가 Cys인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬 부가 아미노산에 있어서, 당사슬과 아미노산이 링커를 매개로 하지 않고 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬이 4개 이상의 당으로 되는 당사슬인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬이 5~11개의 당으로 되는 당사슬인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬이, 디시알로 당사슬, 모노시알로 당사슬, 아시알로 당사슬, 디글크낙 당사슬 및 디만노오스 당사슬로 이루어진 군으로부터 선택되는 당사슬인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬이,
    Figure pct00031

    [식 중, R1 및 R2는 동일 또는 상이하고,
    Figure pct00032

    를 나타낸다. Ac는 아세틸기를 나타낸다.]
    으로 표시되는 당사슬인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬이 실질적으로 균일한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  13. (a) GLP-1의 C 말단(37번 위치)에 추가적으로, 1 또는 수개의 아미노산이 부가된 펩티드에 있어서, 당해 부가된 아미노산의 하나 이상이, 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드; 또는,
    (b) (a)에 의해 정의되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 당사슬 부가 아미노산 이외의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드;
    로서, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  14. (a) GLP-1의 C 말단(37번 위치)에 추가적으로, 1개의 아미노산이 부가된 펩티드에 있어서, 당해 부가된 아미노산이, 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드; 또는,
    (b) (a)에 의해 정의되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 당사슬 부가 아미노산 이외의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드;
    로서, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  15. (a) GLP-1의 N 말단(7번 위치)에 추가적으로, 1 또는 수개의 아미노산이 부가된 펩티드에 있어서, 당해 부가된 아미노산의 하나 이상이, 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드; 또는,
    (b) (a)에 의해 정의되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 당사슬 부가 아미노산 이외의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드;
    로서, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  16. (a) GLP-1의 N 말단(7번 위치)에 추가적으로, 1개의 아미노산이 부가된 펩티드에 있어서, 당해 부가된 아미노산이, 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드; 또는,
    (b) (a)에 의해 정의되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 당사슬 부가 아미노산 이외의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드;
    로서, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  17. (a) GLP-1의 18, 20, 22, 26, 30, 34 및 36번 위치로부터 선택되는 1 이상의 부위의 아미노산을 당사슬 부가 아미노산으로 치환한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드; 또는
    (b) (a)에서 정의되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 당사슬 부가 아미노산 이외의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드;
    로서, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬 부가 아미노산이, 당사슬 부가 Asn 또는 당사슬 부가 Cys인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬 부가 아미노산에 있어서, 당사슬과 아미노산이 링커를 매개로 하지 않고 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  20. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬이 4개 이상의 당으로 되는 당사슬인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  21. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬이, 디시알로 당사슬, 모노시알로 당사슬, 아시알로 당사슬, 디글크낙 당사슬 및 디만노오스 당사슬로 이루어진 군으로부터 선택되는 당사슬인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  22. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬이,
    Figure pct00033

    [식 중, R1 및 R2는 동일 또는 상이하고,
    Figure pct00034

    를 나타낸다. Ac는 아세틸기를 나타낸다.]
    으로 표시되는 당사슬인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  23. 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬이 99% 이상 균일한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  24. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서,
    상기 당사슬 부가 아미노산이 당사슬 부가 Asn이고,
    상기 당사슬 부가 아미노산에 있어서, 당사슬과 아미노산이 링커를 매개로 하지 않고 결합되어 있으며,
    상기 당사슬이 4개 이상의 당으로 되는 당사슬이고,
    상기 당사슬이 디시알로 당사슬, 모노시알로 당사슬, 아시알로 당사슬, 디글크낙 당사슬 및 디만노오스 당사슬로 이루어진 군으로부터 선택되는 당사슬이며,
    상기 당사슬이 실질적으로 균일한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, GLP-1과 비교하여 증대된 혈중 안정성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, GLP-1과 비교하여 10배 이상의 OGTT(Oral Glucose Tolerance Test)에 있어서의 혈당치 억제활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  27. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, GLP-1과 비교하여 30배 이상의 DPP-IV 내성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 유효성분으로서 포함하는 의약조성물.
  29. 제28항의 의약조성물로서, 상기 당사슬이 90% 이상 균일한 의약조성물.
  30. 제28항의 의약조성물로서 GLP-1 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약조성물.
  31. 제28항의 의약조성물로서 GLP-1 관련 질환이 당뇨병인 의약조성물.
  32. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는 GLP-1 관련 질환의 치료 또는 예방방법.
  33. (a) GLP-1;
    (b) GLP-1에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드; 또는,
    (c) GLP-1의 유연체;
    에 있어서, 2개 이상의 아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  34. (a) GLP-1; 또는,
    (b) GLP-1에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드;
    에 있어서, 2개 이상의 아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  35. (a) GLP-1; 또는,
    (b) GLP-1에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드로서, GLP-1 활성을 갖는 펩티드;
    에 있어서, 2개 이상의 아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬 부가 아미노산이 당사슬 부가 Asn 및/또는 당사슬 부가 Cys인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  37. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬 부가 아미노산이 모두 당사슬 부가 Asn인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  38. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬 부가 아미노산이 모두 당사슬 부가 Cys인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  39. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬 부가 아미노산에 있어서, 당사슬과 아미노산이 링커를 매개로 하지 않고 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  40. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬이 모두 4개 이상의 당으로 되는 당사슬인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  41. 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬이 모두 5~11개의 당으로 되는 당사슬인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  42. 제33항 내지 제41항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬이 모두 독립적으로, 디시알로 당사슬, 모노시알로 당사슬, 아시알로 당사슬, 디글크낙 당사슬 및 디만노오스 당사슬로 이루어진 군으로부터 선택되는 당사슬인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  43. 제33항 내지 제41항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬이 모두 독립적으로,
    Figure pct00035

    [식 중, R1 및 R2는 동일 또는 상이하고,
    Figure pct00036

    를 나타낸다. Ac는 아세틸기를 나타낸다.]
    으로 표시되는 당사슬인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  44. 제33항 내지 제43항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬이 실질적으로 균일한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  45. (a) GLP-1에 있어서, 2 이상의 아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 하나 이상의 치환부위가, 18, 20, 22, 26, 30, 34 또는 36번 위치인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드; 또는,
    (b) (a)에서 정의되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 당사슬 부가 아미노산 이외의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드;
    로서, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  46. (a) GLP-1에 있어서, 2 이상의 아미노산이 당사슬 부가 아미노산으로 치환된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 어느 치환부위도 18, 20, 22, 26, 30, 34 또는 36번 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드; 또는,
    (b) (a)에서 정의되는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드에 있어서, 당사슬 부가 아미노산 이외의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 당사슬 부가 GLP-1 펩티드;
    로서, GLP-1 활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  47. 제45항 또는 제46항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬 부가 아미노산이 당사슬 부가 Asn 및/또는 당사슬 부가 Cys인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬 부가 아미노산에 있어서, 당사슬과 아미노산이 링커를 매개로 하지 않고 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  49. 제45항 내지 제48항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬이 모두 4개 이상의 당으로 되는 당사슬인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬이 모두 독립적으로, 디시알로 당사슬, 모노시알로 당사슬, 아시알로 당사슬, 디글크낙 당사슬 및 디만노오스 당사슬로 이루어진 군으로부터 선택되는 당사슬인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  51. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬이 모두 독립적으로,
    Figure pct00037

    [식 중, R1 및 R2는 동일 또는 상이하고,
    Figure pct00038

    를 나타낸다. Ac는 아세틸기를 나타낸다.]
    으로 표시되는 당사슬인 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  52. 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, 상기 당사슬이 99% 이상 균일한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  53. 제45항 또는 제46항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서,
    상기 당사슬 부가 아미노산이 당사슬 부가 Asn이고,
    상기 당사슬 부가 아미노산에 있어서, 당사슬과 아미노산이 링커를 매개로 하지 않고 결합되어 있으며,
    상기 당사슬이 4개 이상의 당으로 되는 당사슬이고,
    상기 당사슬이 모두 독립적으로, 디시알로 당사슬, 모노시알로 당사슬, 아시알로 당사슬, 디글크낙 당사슬 및 디만노오스 당사슬로 이루어진 군으로부터 선택되는 당사슬이며,
    상기 당사슬이 실질적으로 균일한 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  54. 제33항 내지 제53항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, GLP-1과 비교하여 증대된 혈중 안정성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  55. 제33항 내지 제53항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, GLP-1과 비교하여 10배 이상의 OGTT(Oral Glucose Tolerance Test)에 있어서의 혈당치 억제활성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  56. 제33항 내지 제53항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드로서, GLP-1과 비교하여 30배 이상의 DPP-IV 내성을 갖는 당사슬 부가 GLP-1 펩티드.
  57. 제33항 내지 제56항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드를 유효성분으로서 포함하는 의약조성물.
  58. 제57항의 의약조성물로서, 상기 당사슬이 90% 이상 균일한 의약조성물.
  59. 제57항의 의약조성물로서 GLP-1 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약조성물.
  60. 제57항의 의약조성물로서 GLP-1 관련 질환이 당뇨병인 의약조성물.
  61. 제33항 내지 제57항 중 어느 한 항의 당사슬 부가 GLP-1 펩티드의 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는 GLP-1 관련 질환의 치료 또는 예방방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140059829A (ko) * 2011-09-04 2014-05-16 가부시키가이샤 도우사 고가쿠 겐큐쇼 당쇄 부가 폴리펩티드 및 당해 폴리펩티드를 포함하는 의약 조성물

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2008264750C1 (en) * 2007-06-19 2013-01-10 Glytech, Inc. GLP-1 peptide having sugar chain attached thereto
AU2009261441B2 (en) * 2008-06-17 2013-01-10 Glytech, Inc. Oligosaccharide chain added glp-1 peptide
US20120264684A1 (en) * 2009-10-30 2012-10-18 Yasuhiro Kajihara Glycosylated Form of Antigenic GLP-1 Analogue
US9234023B2 (en) * 2010-06-24 2016-01-12 Biousian Biosystems, Inc. Glucagon-like peptide-1 glycopeptides
EP2657244B8 (en) * 2010-12-22 2016-08-31 Ajinomoto Co., Inc. Glycoside compounds as glp-1 secretion promoting agents
CN102718858B (zh) * 2011-03-29 2014-07-02 天津药物研究院 胰高血糖素样肽-1类似物单体、二聚体及其制备方法与应用
CN102321170B (zh) * 2011-09-14 2013-11-13 深圳翰宇药业股份有限公司 利拉鲁肽变构体及其缀合物
US10358470B2 (en) 2011-10-01 2019-07-23 Glytech, Inc. Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same
KR102227918B1 (ko) * 2012-11-22 2021-03-15 가부시키가이샤 도우사 고가쿠 겐큐쇼 당쇄 부가 링커, 당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 함유하는 화합물 또는 그의 염, 및 이들의 제조 방법
WO2014084110A1 (ja) * 2012-11-30 2014-06-05 株式会社糖鎖工学研究所 糖鎖付加リンカー、糖鎖付加リンカーと生理活性物質とを含む化合物またはその塩、及びそれらの製造方法
DK2982686T3 (en) * 2013-03-29 2018-10-08 Glytech Inc POLYPEPTIDE WITH SIALYLED SUGAR CHAIN CONNECTED
PE20171154A1 (es) 2014-12-30 2017-08-16 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Derivados de glucagon con estabilidad mejorada
MX2017016845A (es) 2015-06-30 2018-08-01 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Derivado de glucagón y una composición que comprende un conjugado de acción prolongada del mismo.
CN108699125B (zh) 2015-12-31 2022-10-28 韩美药品株式会社 胰高血糖素/glp-1/gip受体三重激动剂
UA126662C2 (uk) 2016-06-29 2023-01-11 Ханмі Фарм. Ко., Лтд. Похідна глюкагону, її кон'югат, композиція, яка її містить, та її терапевтичне застосування
CA3147770A1 (en) * 2019-08-13 2021-02-18 Jae Ha Ryu Exenatide analog and use thereof
EP4104849A4 (en) * 2020-01-13 2024-03-27 Hanmi Pharm. Co., Ltd. THERAPEUTIC USE OF A LONG-ACTING CONJUGATE OF A TRIPLE AGONIST WITH ACTIVITY RELATED TO GLUCAGON AND GLP-1 AND GIP RECEPTORS AGAINST LUNG DISEASE
CN115463208B (zh) * 2021-10-09 2023-05-30 上海海赜生物科技有限公司 一种口服降糖组合物

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7943763B2 (en) * 2002-07-05 2011-05-17 Otsuka Chemical Holdings Co., Ltd. Process for preparing glycopeptides having asparagine-linked oligosaccharides, and the glycopeptides
US7772188B2 (en) * 2003-01-28 2010-08-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
SI1605897T1 (sl) 2003-03-19 2012-11-30 Lilly Co Eli Polietilen glikol povezane GLP spojine
CN1802386B (zh) * 2003-06-12 2010-12-15 伊莱利利公司 Glp-1类似物融合蛋白质
KR100731875B1 (ko) * 2003-07-28 2007-06-25 오츠카 가가쿠 가부시키가이샤 아미노화 복합형 당사슬 유도체 및 그의 제조방법
JP2005095331A (ja) 2003-09-24 2005-04-14 Ihara Suisan Kk 魚皮真皮コラーゲンを含有する発泡体シートおよびその用途
WO2006010143A2 (en) * 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
JPWO2007063907A1 (ja) 2005-11-30 2009-05-07 塩野義製薬株式会社 ペプチド糖鎖付加体およびそれを有効成分とする医薬
AU2008264750C1 (en) * 2007-06-19 2013-01-10 Glytech, Inc. GLP-1 peptide having sugar chain attached thereto

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140059829A (ko) * 2011-09-04 2014-05-16 가부시키가이샤 도우사 고가쿠 겐큐쇼 당쇄 부가 폴리펩티드 및 당해 폴리펩티드를 포함하는 의약 조성물

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