KR20090089094A - 시노비올린 유전자 또는 단백질의 신규한 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 측두하악관절 질환과 관련된 시노비올린 유전자 또는 단백질의 신규한 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 시노비올린 유전자 및 단백질은 측두하악관절 질환의 발병에 대해 매우 특이적이므로, 바이오 마커의 용도를 갖는다.

측두하악관절, 시노비올린, 활막액, 활막세포

Description

시노비올린 유전자 또는 단백질의 신규한 용도{Novel Use of Synoviolin Gene and Protein}

본 발명은 시노비올린(synoviolin) 유전자 또는 단백질의 신규한 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 측두하악관절 질환과 관련된 시노비올린 유전자 또는 단백질의 신규한 용도에 관한 것이다.

측두하악관절 또는 턱관절((Temporomandibular Joint; TMJ)는 머리뼈와 아래턱이 만나는 부위이며 귀 앞쪽에 위치하고 있는 작은 관절을 말하는데, 이 관절은 아래턱(하악-mandible)이 움직이고 기능할 수 있도록 해주고 몸 가운데에서 가장 빈번하게 움직이는 관절이다. 턱관절은 일명 “볼과 소켓” 관절이라 하고, 그 둥근 끝 또는 “볼”부분은 하악과두(condyle)라 하며 소켓 부분은 관절와(articular fossa)라고 한다. 하악과두와 관절와 사이에는 연골로 이루어진 관절원판(disc)라는 부분은 스트레스를 흡수하는 쿠션역할을 하며 입을 벌리거나 다물 때 하악과두가 쉽게 움직일 수 있도록 한다.

측두하악관절 장애(Temporomandibular joint disorder, TMJD)는 저작근, 측두하악관절 및 그와 관련된 구조물들의 많은 임상적 문제를 포함하는 포괄적인 용 어로 동통, 관절잡음, 개구장애 등의 임상 증상을 나타내는데 일반적으로 관절원판 변위(disk displacement, DD)/내장증(internal derangement, ID) 또는 골관절염(osteoarthritis, OA)이 관련된다. 이 질환은 큰 증상 없이 나타날 수도 있으나 동통 등의 장애를 동반할 수도 있다. 최근의 연구결과를 보면 정신적인 스트레스나 유전적인 요인에 의해 질환의 발병이 촉진될 수도 있다(Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 70(4):406-13(1990)).

관절강에는 점성을 갖는 활막액(synovial fluid, SF)이 소량 존재한다. 활막액막 세포에서 분비되는 활막액은 연골에 영양을 공급하며 관절 표면의 윤활제 역할을 한다. 관절강의 모세 혈관 및 활막액막에 투과성 변화를 줄 수 있는 여러 인자에 의해서 활막액이 고이게 된다. 관절천자로 얻은 활막액 분석(synovial fluid analysis)을 근거로 관절 질환은 원인에 따라 비염증성, 염증성, 감염성 및 외상성으로 분류되는데 염증성의 대표적 관절 질환으로는 결정체 유발성(gout, pseudogout)과 류마티스성 관절 질환이 있다. 비염증성 질환에는 골관절염(osteoarthritis) 및 골연골염(osteochondritis) 등이 있다.

우리 몸의 다른 관절과 마찬가지로 퇴행성 관절질환이라고 하는 관절염 역시 악관절에 나타날 수가 있는데 아플 수도 있으며, 뼈의 손상이 심해질 수도 있다. 이와 같은 관절질환의 대한 최근의 연구결과를 보면 관절질환의 요인을 시노비올린(synoviolin)이라는 단백질에서 찾고 있는데, 이 단백질은 관절질환, 대사질환 및 발생질환을 포함한 모든 질환의 물리 또는 화학적인 인체 대사과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고 있다(1). 인체 대사과정에서 몸의 균형을 유지하려는 항상성을 유지하기 위하여서도 시노비올린의 역할이 중요하다고 알려져 있으며, 인체의 항상성의 불균형이 관절질환을 유도하기도 하며, 이때 시노비올린이 관여한다고 알려져 있다(2).

본 발명에서는 측두하악관절 장애를 가지고 있는 환자의 활막액을 채취하여 유전자 수준과 단백질체학 수준에서 분석해보고자 한다. 측두하악관절 장애 환자의 활막액에서 관절질환과 관련된 새로운 단백질이 존재하는지 알아보고 또한 존재하는 발현 양을 알아봄으로써 악관절 질환과의 상관성도 알아보고자 한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 측두하악관절 질환(Temporomandibular joint disorder; TMJD)의 발병과 관련된 신규한 바이오 마커 또는 치료 타깃을 개발하고자 연구 노력하였고, 결국 시노비올린(synoviolin)이 측두하악관절 질환의 발병과 직접적인 연관이 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 측두하악관절 질환의 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 측두하악관절 질환 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열에 기재된 시노비올린(synoviolin) 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 측두하악관절 질환(Temporomandibular joint disorder; TMJD)의 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열에 기재된 시노비올린 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 측두하악관절 질환의 진단 용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 측두하악관절 질환(Temporomandibular joint disorder; TMJD)의 발병과 관련된 신규한 바이오 마커를 개발하고자 연구 노력하였고, 결국 시노비올린(synoviolin)이 측두하악관절 질환의 발병과 직접적인 연관이 있음을 규명하였다.

본 발명은 시노비올린의 신규한 용도에 관한 것으로서, 측두하악관절 질환과 관련하여 시노비올린의 진단 마커로서의 신규한 용도에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 신규한 용도는 시노비올린이 측두하악관절 질환 환자의 활막액에서 과발현된다는 본 발명자들의 발견에 따른 것이다.

본 발명의 진단키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 서열목록 제1서열에 기재된 시노비올린 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어 “상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화 또는 어닐링 조건 하에서 서열목록 제1서열에 기재된 시노비올린 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 “상보적”은 용어 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 서열목록 제1서열에 기재된 시노비올린 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이다. 바람직하게는, 프로브는 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프로브는 자연 (naturally occurring) dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 시노비올린 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 프로브를 포함하는 측두하악관절 질환의 진단용 키트는 마이크로어레이(microarray) 포맷에 포함되며, 보다 바람직하게는 DNA 또는 cDNA 마이크로어레이이고, 가장 바람직하게는 cDNA 마이크로어레이이다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커 (예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)되고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용되는 것이다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

또한, 본 발명의 측두하악관절 질환의 진단용 키트는 서열목록 제2서열에 기재된 시노비올린 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함시켜 제작될 수도 있다.

본 발명에서 이용되는 시노비올린 단백질에 대한 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 시노비올린 단백질에 대 한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 시노비올린 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis , Thermis flavus , Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 진단용 키트는 측두하악관절 질환의 발병, 발전 및 경감 등을 분석할 수 있다. 따라서 본 명세서에서 키트를 언급하면서 사용되는 용어 “진단”은 질병 유무의 판단뿐만 아니라, 질병의 발병, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함하는 의미를 갖는다.

바람직하게는, 본 발명의 키트는 시노비올린의 과발현에 의하여 발병 및 발전되는 측두하악관절 질환을 진단하는 데 특히 유용하다.

본 발명의 진단용 키트는 측두하악관절 질환의 상태(conditions)를 보다 개선된 효율로 진단할 수 있도록 하며, 더욱이 골관절염과 구별되어 측두하악관절 질환만을 분별적으로 진단할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 측두하악관절 질환 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 시노비올린(synoviolin) 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시노비올린 유전자의 발현량, 시노비올린 단백질의 양 또는 시노비올린 단백질의 활성을 측정하는 단계, 상기 시노비올린 유전자의 발현량, 시노비올린 단백질의 양 또는 시노비올린 단백질의 활성이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료는 측두하악관절 질환 치료 또는 예방용 물질로 판정된다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 시노비올린 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킨다. 바람직하게는, 시노비올린 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포는 측두하악관절 질환-활막세포이다. 본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시료”는 시노비올린 유전자의 발현량, 시노비올린 단백질의 양 또는 시노비올린 단백질의 활성에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이어, 시료가 처리된 세포에서 시노비올린 유전자의 발현량, 시노비올린 단백질의 양 또는 시노비올린 단백질의 활성을 측정한다. 측정 결과, 시노비올린 유전자의 발현량, 시노비올린 단백질의 양 또는 시노비올린 단백질의 활성이 감소-조절(down-regulation)되는 것이 측정되면, 상기 시료는 측두하악관절 질환 치료 또는 예방용 물질로 판정될 수 있다.

시노비올린 유전자의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다.

RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시료를 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, 시노비올린 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 시노비올린 유전자-특이적 프라이머 세트는 서열목록 제3서열 내지 제22서열에 예시되어 있다. 그런 다음, PCR 폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 시노비올린 유전자의 발현량 변화를 측정한다.

시노비올린 단백질의 양의 변화는 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 시노비올린 단백질의 양의 변화는 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme -linked immunosorbent assay ( ELISA ), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 레이블링된 시노비올린 단백질-특이 항체가 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 시료가 처리된 세포로부터 추출물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 시노비올린 단백질-특이 항체와 상기 세포 추출물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지 딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) 및 o-페닐렌디아민(OPD)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

상기 ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

위에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 측두하악관절 질환의 진단용 키트 및 측두하악관절 질환 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 시노비올린 유전자 및 단백질은 측두하악관절 질환의 발병에 대해 매우 특이적이므로 바이오 마커의 용도를 갖는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 실험 방법

실험 재료 및 동물

활막액(synovial fluid)은 분당 서울대 병원 구강내과에 내원한 환자로부터 얻었고, DBA1 마우스는 한국의 샘타코사로부터 구입하였다. 세포를 배양하기 위하여 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), F-12K, 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 항생제, PBS 및 트립신-EDTA는 Gibco사(미합중국)로부터 구입하였고, RNA 추출은 TRI Reagent Kit(Molecular Research Center Inc., 미합중국)를 이용하여 실시하였다. 또한, Bio-Rad사(미합중국)의 폴리아크릴아미드, EDTA 및 SDS-PAGE 전기영동 키트를 이용하였다. 염색시약으로는 쿠마시 브릴리언트 블루 250, 29% 아크릴아미드, 1% 비스아크릴아미드 용액, 0.5 M Tris(pH 6.8), 1.5 M 트리스(pH 8.8), 10% SDS 및 수포화 부탄올 1 x SDS 겔-로딩 완충용액(50 mM 트리스-Cl(pH 6.8), 100 mM 디티오트레이톨, 2% SDS, 0.1% 브로모페놀 블루 및 10% 글리세롤)을 이용하였고, 세척시약으로는 메탄올을 이용하였다. SDS-PAGE 전기영동을 실시하기 위하여 12.5% 폴리아크릴아미드 겔을 이용하고, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 하기 위하여 이용된 컬럼은 C₁₈ 컬럼(Bio-Rad, 미합중국)을 이용하였다. Maldi-Tof(Matrix-assisted laser desorption/ionization Time-of-Flight), Bruker Inc., 독일)을 이용하여 분석하였다.

시노비올린 ( Synoviolin ) RNA 분리

제조사의 제안법에 따라 TRIZOL(Invitrogen사)을 이용하여 활막액으로부터 총 RNA를 분리하고, 이후 과정은 제조사의 프로토콜에 따라 실시하였다. 스펙트로포토메터(Vmax UV/Visible Spectrophotometer, Molecular Devices, 미합중국)를 이용하여 총 RNA의 농도를 측정하였다. M-MuLV 역전사 효소를 이용하여(SuperScript^TM 첫 번째 가닥 합성 키트, Stratagene, 미합중국) 첫 번째 가닥 cDNA을 합성하기 위해서 0.1 ug의 총RNA을 이용하였고, dT 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하였다. 시노비올린 및 GAPDH의 유전자 서열에 근거하여 디자인된 프라이머를 이용하였다(표 1). Taq DNA 중합효소(1 ㎍/㎕)를 이용하고, 상기 과정에서 합성된 시노비올린 cDNA를 주형으로 하여 PCR 반응을 실시하였다. 95℃에서 10분 동안 cDNA을 변성시킨 다음, 94℃ 30초(변성), 56℃ 30초(어닐링) 그리고 58℃ 30초(연장반응)의 온도 사이클로 각 시료에 대하여 25 사이클로 PCR을 실시하였다. PCR 산물은 1.8% 아가로스 겔 상에서 확인하였다.

실시간 RT-PCR의 경우는 SuperScript^TM 첫 번째-가닥 합성 키트 대신에 Stratagene사의 TaqManProve을 이용하여 실시하였다.

서열번호	전방향 프라이머	서열번호	역방향 프라이머
제3서열	5‘-gtgatgggcaaggtgttctt-3'	제4서열	5‘-caagtctctgtgacggcgta-3'
제5서열	5‘-ctatgccctgtggcatttct-3'	제6서열	5‘-aggcattcctttccctgagt-3'
제7서열	5‘-gtgatgggcaaggtgttctt-3'	제8서열	5‘-gaacgttccagaaggtgctc-3'
제9서열	5‘-aggtgttctttgggcaactg-3'	제10서열	5‘-caagtctctgtgacggcgta-3'
제11서열	5‘-actgccgcattgtctctctt-3'	제12서열	5‘-cgaagaggaagtccaggatg-3'
제13서열	5‘-cctgcgtaacatccacacac-3'	제14서열	5‘-tctgagctagggatgctggt-3'
제15서열	5‘-gctggaggcaagctatgaac-3'	제16서열	5‘-aggcattcctttccctgagt-3'
제17서열	5‘-actgccgcattgtctctctt-3'	제18서열	5‘-cacggagtgcagcacatact-3'
제19서열	5‘-attagctcccgttcccaagt-3'	제20서열	5‘-aggcattcctttccctgagt-3'
제21서열	5‘-attagctcccgttcccaagt-3'	제22서열	5‘-agaaatgccacagggcatag-3'
제23서열	5‘-gtcagtggtggacctgacc-3'	제24서열	5‘-aggggtctacatggcaact-3'

SDS - PAGE 전기영동

콤(Comb)을 제거하고 런닝 겔 용액에 15 ㎕의 30% 암모늄 퍼설페이트 및 3 ㎕의 TEMED를 첨가한 후 거품이 나지 않을 정도로 신속히 섞고 피펫을 이용하여 조심스럽게 유리판 사이의 공간에 부었다. 첨가한 겔 mixture의 높이가 미리 표시한 선까지 도달하면 증류수로 포화된 n-부탄올을 조심스럽게 약 500 ㎕정도 가하였다. 겔이 굳으면 상층액인 n-부탄올을 기울여서 버리고 증류수로 수차례 세척하고 필터 페이퍼를 이용하여 완전히 제거하였다. 스택킹 겔 용액에 7 ㎕의 30% 암모늄 퍼설페이트 및 2 ㎕의 TEMED를 첨가한 후 거품이 나지 않을 정도로 신속히 섞고 피펫을 이용하여 조심스럽게 유리판 사이의 공간에 붓고 콤을 설치하였다. 전기영동 기구를 전원에 연결시킨 후 겔의 전기장이 8 V/cm이 되게 전압을 걸었다. 브로모페놀 블루가 리졸빙 겔에 도달하면 15 V/cm으로 전압을 올리고 브로모페놀 블루가 리졸빙 겔의 끝까지 갈 때까지 전기영동을 실시하였다. 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색을 실시하여 단백질 밴드를 확인하였다.

MALDI -TOF( Matrix - assisted laser desorption / ionization - TOF )

단백질을 분석하기 위한 방법 중의 하나로 시료에 대한 미량 정성 및 정량 분석에 적합한 장비가 MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption/ionization-TOF)이다(Betowski et al.,(1987); Mutlib et al.,(1992); Huddleston et al.,(1993); Katayama et al.,(2006)). 이온화된 시료를 질량과 하전량의 비에 따라 분리시키고, 얻어진 질량 스펙트럼을 해석함으로서 분자의 질량 및 구조를 확인할 수 있다. 분석하고자 하는 시료에 PBS를 첨가하여 충분히 세척한 다음 동일한 조건으로 원심분리를 한번 더 실시하였다. 얻어진 세포 펠릿을 호모겐나이즈를 이용하여 세포막을 파쇄하고 균질화 시켰다. SDS 로딩 버퍼를 이용하여 혼합한 다음 12% SDS-PAGE 겔을 이용하여 100 볼트에서 2D 전기영동을 실시하였다. 얻어진 겔 스팟에서 단백질의 증가 및 감소된 스팟을 오려내어 다시 호모겐나이즈를 이용하여 균질화 시킨 다음 C18 컬럼을 이용하여 단백질만을 추출하였다. 그런 다음 LC/MS/MS(Liquid Chromatography/Mass/Mass Spectrometer, ABI/QSTAR LC/MS/MS Spectrometer, USA)을 이용한 펩티드 시퀀싱을 실시하여 아미노산 시퀀스를 얻을 수 있었다.

실험 결과

악관절 질환의 발생으로 말미암아 생성된 활막액을 얻어 유전자와 단백질수준에서의 실험을 진행하였다. 도 1에서 확인할 수 있듯이, 시노비올린 유전자에 대한 발현을 PCR을 이용하여 실험한 결과, 정상군보다 실험군에서 유전자의 발현양이 증가하였음을 알 수 있다. 또한 도 2 및 표 2에서 알 수 있듯이, 실시간-PCR 반응을 통하여, 베타 액틴(β-actin)과 같은 하우스 키핑 유전자에 대한 상대적인 발현양을 확인한 결과, 정상군에 비해 악관절 질환을 가지고 있는 군(실험군)에서 시노비올린 유전자의 발현양이 증가하였음을 알 수 있었다.

한편, 활막액 내의 단백질의 총 양 및 시노비올린에 대한 발현 단백질의 차이를 확인해 보는 실험을 한 결과, 도 3 및 4에서 볼 수 있듯이, 정상군과 악관절 질환을 가진 군(실험군)간의 단백질 차이를 확인할 수 있었다. 또한, 환자의 시료를 가지고 실험을 실시한 결과, 질환을 가진 군과 단백질 차이가 남을 확인할 수 있었다.

또한, 프로테오믹스를 이용한 시노비올린의 분석 실험을 진행하기 위하여 2-DE(2-dimension electrophoresis)을 실시하였다. 우선, 활막액 내에 존재하는 알부민을 제거하는 실험을 실시하였다(도 5). 그 다음 2-DE를 실시하여 시노비올린을 분석하였다(도 6). 또한, 고성능 액체 크로마토그래피를 통하여, 프로테오믹스 실험을 하기 전, 전체 단백질의 양을 패턴을 측정하였다(도 7). LC/MS/MS 실험을 통하여, 정상군(표 3)과 질환을 가진 군(실험군)(표 4)간의 단백질 패턴을 분석한 결과, 시노비올린 이라는 단백질의 아미노산 서열을 확인할 수 있었다(도 8 a 및 b).

상기 실험 결과를 통하여, 본 발명의 시노비올린 유전자 및 단백질은 측두하악관절 질환의 발병에 대해 매우 특이적이므로, 바이오 마커의 용도를 갖는다고 판단된다.

시노비올린	Ct 값	베타 액틴(β-actin)
대조군	26.62	14.99	11.63	0.63	1.55
양성대조군	27.18	14.92	12.26	0.00	1.00
실험군	25.13	14.65	10.47	1.79	3.45

인덱스	질량중심 (Centroid Mass)	하계 (Lower Bound)	상계 (Upper Bound	전하(z)	높이	상대세기	면적
1	2112.21	2028.82	2113.93	0	5963	94.76	2306575.14
2	7565.46	7518.72	7622.69	0	1052	16.72	48426.85
3	7998.87	7993.04	8213.08	0	974	15.48	107758.2
4	13773.47	13346.42	13821.55	0	678	10.77	115790.58
5	14979.40	14493.08	15054.7	0	1681	26.72	525005.37
6	15134.40	15054.7	15272.27	0	1988	31.6	421115.15
7	15304.34	15296.91	15614.57	0	926	14.72	124472.34
8	15878.56	15614.57	15943.51	0	1752	27.85	497103.94
9	15951.11	15943.51	16345.33	0	1511	24.02	548504.7
10	33296.93	32574.06	33743.72	0	905	14.38	108393.03
11	66532.85	65086.08	66576.45	0	1324	21.05	238815.05
12	66695.25	66691.43	68418.71	0	1287	20.45	251312.61

인덱스	질량중심 (Centroid Mass)	하계 (Lower Bound)	상계 (Upper Bound)	전하(z)	높이	상대세기	면적
1	2101.11	2029.23	2101.9	0	2720	89.07	759313.63
2	2580.66	2567.23	2583.28	0	2834	92.82	23945.71
3	3722.33	3692.68	3724.07	0	1504	49.25	47414.75
4	3725.29	3724.07	3743.97	0	1532	50.18	18273.62
5	3822.88	3798.96	3830.24	0	1346	44.08	36418.92
6	13867.60	13214.88	13903.68	0	213	6.98	18941.28
7	14972.57	14844.22	15045.81	0	294	9.62	32945.2
8	15133.49	15045.81	15251	0	392	12.83	55129.95
9	15306.87	15287.95	15580.62	0	264	8.65	15237.99
10	15885.82	15580.62	15942.37	0	334	10.95	49121.17
11	16099.08	16088	16346.48	0	302	9.88	23505.15
12	33322.39	32621.56	33798.75	0	415	13.59	77336.33
13	64090.06	62696.76	64304.61	0	405	13.26	21501.02
14	66575.21	65088.39	66733.7	0	913	29.89	433061.06

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고문헌

1. Cytoplasmic destruction of p53 by the endoplasmic reticulum-resident ubiquitin ligase‘Synoviolin’. The EMBO Journal, 26:113-122(2007).

2. Essential Role of Synoviolin in Embryogenesis. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY , 280(9):7909-7916(2005).

3. Identification of a Crucial Site for Synoviolin Expression. MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, 25(16):7344-7356(2005).

4. Overexpression of Synoviolin in Peripheral Blood and Synoviocytes From Rheumatoid Arthritis Patients and Continued Elevation in Nonresponders to Infliximab Treatment. ARTHRITIS & RHEUMATISM , 54(7):2109-2118(2006).

5. Rheumatoid arthritis as a hyper-endoplasmic reticulum associated degradation disease. Arthritis Research & Therapy , 7:181-186(2005).

6. Synoviolin/Hrd1, an E3 ubiquitin ligase, as a novel pathogenic factor for arthropathy. Genes & Dev , 17:2436-2449(2003).

7. The proinflammatory cytokines IL-1β and TNF-α induce the expression of synoviolin, an E3 ubiquitin ligase, in mouse synovialfibroblasts via the Erk1/2-ETS1 pathway. Arthritis Research & Therapy , 8(6): (2006).

8. Utility of the Framingham risk score to predict the presence of coronary atherosclerosis in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Research & Therapy (2006).

도 1은 PCR 반응을 통하여, 시노비올린 유전자의 발현 정도를 확인한 겔 사진이다. S.M은 사이즈 마커로서 밴드 하단은 100 bp를 나타내고, 100 bp 간격으로 밴드 상단은 1000 bp를 나타낸다. 레인 1 및 5는 대조군, 레인 2 및 6은 양성 대조군 및 레인 3, 4, 7 및 8은 실험군을 나타낸다.

도 2는 실시간-PCR 반응을 통하여, 베타 액틴(β-actin)과 같은 하우스 키핑 유전자에 대한 상대적인 발현양을 보여주는 그래프이다. 계열 1은 대조군, 계열 2는 양성대조군 및 계열 3은 실험군을 나타낸다.

도 3은 정상인 및 악관절 질환을 가지는 환자의 활막액에 대한 단백질 발현 정도를 보여주는 SDS-PAGE 전기영동 사진이다. S.M은 사이즈 마커, 대조군은 정상인 및 실험군은 악관절 질환을 가지는 환자를 나타낸다. 사이즈 마커의 밴드 하단부터 12.5 kDa, 33 kDa, 66 kDa 및 95 kDa를 나타낸다.

도 4는 정상인 및 악관절 질환을 가지는 환자의 활막액에 대한 단백질 발현 정도를 보여주는 SDS-PAGE 전기영동 사진이다.

도 5는 프로테오믹스를 이용한 시노비올린의 분석 실험을 진행하기 위하여 2-DE(2-dimension electrophoresis)을 실시한 결과를 보여주는 사진이다. 좌측 사진은 활막액의 알부민을, 우측 사진은 알부민이 제거된 활막액에 대한 사진이다.

도 6은 프로테오믹스를 이용한 시노비올린의 분석 실험을 진행하기 위하여 2-DE(2-dimension electrophoresis)을 실시한 결과를 보여주는 사진이다. A(대조군)는 정상인의 활막액, B(실험군)는 악관절 질환을 가지는 환자의 활막액에 대한 사진이다.

도 7a-7b는 Maldi-tof를 이용하여, 시료에 대한 단백질의 양의 패턴을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다. 도 7a는 대조군으로 정상인의 활막액, 도 7b는 실험군으로서 악관절 질환을 가지는 환자의 활막액에 대한 결과이다.

도 8a-8b는 LC/MS/MS 실험을 통하여, 정상군(도 8a)과 질환을 가진 군(실험군)(도 8b)간의 단백질 패턴을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.

<110> CHAE, Chang Hun PARK, Jun Woo <120> Novel Use of Synoviolin Gene and Protein <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3374 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (403)..(2253) <400> 1 gccctttctt atgagcatgc ctgtgttggg ttgacagtga gggtaataat gacttgttgg 60 ttgattgtag atatagggct ctcccttgca aggtaattag gctccttaaa ttacctgtaa 120 gattttcttg ccacagcatc cattctggtt aggctggtga tcttctgagt agtgatagat 180 tggttggtgg tgaggtttac aggtgttccc ttctcttact cctggtgttg gctacaatca 240 ggtggcgtct agagcagcat gggacaggtg ggtaagggga gtcttctcat tatgcagaag 300 tgatcaactt aaatctctgt cagatctacc tttatgtagc ccggcagtcg cgcggattga 360 gcgggctcgc ggcgctgggt tcctggtctc cgggccaggg ca atg ttc cgc 411 Met Phe Arg 1 acg gca gtg atg atg gcg gcc agc ctg gcg ctg acc ggg gct gtg gtg 459 Thr Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly Ala Val Val 5 10 15 gct cac gcc tac tac ctc aaa cac cag ttc tac ccc act gtg gtg tac 507 Ala His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr Val Val Tyr 20 25 30 35 ctg acc aag tcc agc ccc agc atg gca gtc ctg tac atc cag gcc ttt 555 Leu Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile Gln Ala Phe 40 45 50 gtc ctt gtc ttc ctt ctg ggc aag gtg atg ggc aag gtg ttc ttt ggg 603 Val Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val Phe Phe Gly 55 60 65 caa ctg agg gca gca gag atg gag cac ctt ctg gaa cgt tcc tgg tac 651 Gln Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg Ser Trp Tyr 70 75 80 gcc gtc aca gag act tgt ctg gcc ttc acc gtt ttt cgg gat gac ttc 699 Ala Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg Asp Asp Phe 85 90 95 agc ccc cgc ttt gtt gca ctc ttc act ctt ctt ctc ttc ctc aaa tgt 747 Ser Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe Leu Lys Cys 100 105 110 115 ttc cac tgg ctg gct gag gac cgt gtg gac ttt atg gaa cgc agc ccc 795 Phe His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu Arg Ser Pro 120 125 130 aac atc tcc tgg ctc ttt cac tgc cgc att gtc tct ctt atg ttc ctc 843 Asn Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu Met Phe Leu 135 140 145 ctg ggc atc ctg gac ttc ctc ttc gtc agc cac gcc tat cac agc atc 891 Leu Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr His Ser Ile 150 155 160 ctg acc cgt ggg gcc tct gtg cag ctg gtg ttt ggc ttt gag tat gcc 939 Leu Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe Glu Tyr Ala 165 170 175 atc ctg atg acg atg gtg ctc acc atc ttc atc aag tat gtg ctg cac 987 Ile Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr Val Leu His 180 185 190 195 tcc gtg gac ctc cag agt gag aac ccc tgg gac aac aag gct gtg tac 1035 Ser Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys Ala Val Tyr 200 205 210 atg ctc tac aca gag ctg ttt aca ggc ttc atc aag gtt ctg ctg tac 1083 Met Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val Leu Leu Tyr 215 220 225 atg gcc ttc atg acc atc atg atc aag gtg cac acc ttc cca ctc ttt 1131 Met Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe Pro Leu Phe 230 235 240 gcc atc cgg ccc atg tac ctg gcc atg aga cag ttc aag aaa gct gtg 1179 Ala Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys Lys Ala Val 245 250 255 aca gat gcc atc atg tct cgc cga gcc atc cgc aac atg aac acc ctg 1227 Thr Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met Asn Thr Leu 260 265 270 275 tat cca gat gcc acc cca gag gag ctc cag gca atg gac aat gtc tgc 1275 Tyr Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp Asn Val Cys 280 285 290 atc atc tgc cga gaa gag atg gtg act ggt gcc aag aga ctg ccc tgc 1323 Ile Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg Leu Pro Cys 295 300 305 aac cac att ttc cat acc agc tgc ctg cgc tcc tgg ttc cag cgg cag 1371 Asn His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe Gln Arg Gln 310 315 320 cag acc tgc ccc acc tgc cgt atg gat gtc ctt cgt gca tcg ctg cca 1419 Gln Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala Ser Leu Pro 325 330 335 gcg cag tca cca cca ccc ccg gag cct gcg gat cag ggg cca ccc cct 1467 Ala Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly Pro Pro Pro 340 345 350 355 gcc ccc cac ccc cca cca ctc ttg cct cag ccc ccc aac ttc ccc cag 1515 Ala Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn Phe Pro Gln 360 365 370 ggc ctc ctg cct cct ttt cct cca ggc atg ttc cca ctg tgg ccc ccc 1563 Gly Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu Trp Pro Pro 375 380 385 atg ggc ccc ttt cca cct gtc ccg cct ccc ccc agc tca gga gag gct 1611 Met Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser Gly Glu Ala 390 395 400 gtg gct cct cca tcc acc agt gca gca gcc ctt tct cgg ccc agt gga 1659 Val Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Ser Gly 405 410 415 gca gct aca acc aca gct gct ggc acc agt gct act gct gct tct gcc 1707 Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ala 420 425 430 435 aca gca tct ggc cca ggc tct ggc tct gcc cca gag gct ggc cct gcc 1755 Thr Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala Gly Pro Ala 440 445 450 cct ggt ttc ccc ttc cct cct ccc tgg atg ggt atg ccc ctg cct cca 1803 Pro Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro Leu Pro Pro 455 460 465 ccc ttt gcc ttc ccc cca atg cct gtg ccc cct gcg ggc ttt gct ggg 1851 Pro Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly Phe Ala Gly 470 475 480 ctg acc cca gag gag cta cga gct ctg gag ggc cat gag cgg cag cac 1899 Leu Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu Arg Gln His 485 490 495 ctg gag gcc cgg ctg cag agc ctg cgt aac atc cac aca ctg ctg gac 1947 Leu Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr Leu Leu Asp 500 505 510 515 gcc gcc atg ctg cag atc aac cag tac ctc acc gtg ctg gcc tcc ttg 1995 Ala Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu Ala Ser Leu 520 525 530 ggg ccc ccc cgg cct gcc act tca gtc aac tcc act gag ggg act gcc 2043 Gly Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu Gly Thr Ala 535 540 545 act aca gtt gtt gct gct gcc tcc tcc acc agc atc cct agc tca gag 2091 Thr Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro Ser Ser Glu 550 555 560 gcc acg acc cca acc cca gga gcc tcc cca cca gcc cct gaa atg gaa 2139 Ala Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro Glu Met Glu 565 570 575 agg cct cca gct cct gag tca gtg ggc aca gag gag atg cct gag gat 2187 Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met Pro Glu Asp 580 585 590 595 gga gag ccc gat gca gca gag ctc cgc cgg cgc cgc ctg cag aag ctg 2235 Gly Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu Gln Lys Leu 600 605 610 gag tct cct gtt gcc cac tgacact gccccagccc agccccagcc tctgctcttt 2290 Glu Ser Pro Val Ala His 615 tgagcagccc tcgctggaac atgtcctgcc accaagtgcc agctccctct ctgtctgcac 2350 cagggagtag tacccccagc tctgagaaag aggcggcatc ccctaggcca agtggaaaga 2410 ggctggggtt cccatttgac tccagtccca ggcagccatg gggatctcgg gtcagttcca 2470 gccttcctct ccaactcttc agccctgtgt tctgctgggg ccatgaaggc agaaggttta 2530 gcctctgaga agccctcttc ttcccccacc cctttccagg agaaggggct gcccctccaa 2590 gccctacttg tatgtgcgga gtcacactgc agtgccgaac agtattagct cccgttccca 2650 agtgtggact ccagaggggc tggaggcaag ctatgaactt gctcgctggc ccacccctaa 2710 gactggtacc catttccttt tcttaccctg atctccccag aagcctcttg tggtggtggc 2770 tgtgccccct atgccctgtg gcatttctgc gtcttactgg caaccacaca actcagggaa 2830 aggaatgcct gggagtgggg gtgcaggcgg gcagcactga gggaccctgc cccgcccctc 2890 cccccaggcc cctttcccct gcagcttctc aagtgagact gacctgtctc acccagcagc 2950 cactgcccag ccgcactcca ggcaagggcc agtgcgcctg ctcctgacca ctgcaatccc 3010 agcgcccaag gaaggccact tctcaactgg cagaacttct gaagtttaga attggaatta 3070 cttccttact agtgtctttt ggcttaaatt ttgtcttttg aagttgaatg cttaatcccg 3130 ggaaagagga acaggagtgc cagactcctg gtctttccag tttagaaaag gctctgtgcc 3190 aaggagggac cacaggagct gggacctgcc tgcccctgtc ctttcccctt ggttttgtgt 3250 tacaagagtt gttggagaca gtttcagatg attatttaat ttgtaaatat tgtacaaatt 3310 ttaatagctt aaattgtata tacagccaaa taaaaacttg cattaacaaa aaaaaaaaaa 3370 aaaa 3374 <210> 2 <211> 617 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Phe Arg Thr Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly 1 5 10 15 Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr 20 25 30 Val Val Tyr Leu Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile 35 40 45 Gln Ala Phe Val Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val 50 55 60 Phe Phe Gly Gln Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg 65 70 75 80 Ser Trp Tyr Ala Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg 85 90 95 Asp Asp Phe Ser Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe 100 105 110 Leu Lys Cys Phe His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu 115 120 125 Arg Ser Pro Asn Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu 130 135 140 Met Phe Leu Leu Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr 145 150 155 160 His Ser Ile Leu Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe 165 170 175 Glu Tyr Ala Ile Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr 180 185 190 Val Leu His Ser Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys 195 200 205 Ala Val Tyr Met Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val 210 215 220 Leu Leu Tyr Met Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe 225 230 235 240 Pro Leu Phe Ala Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys 245 250 255 Lys Ala Val Thr Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met 260 265 270 Asn Thr Leu Tyr Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp 275 280 285 Asn Val Cys Ile Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg 290 295 300 Leu Pro Cys Asn His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe 305 310 315 320 Gln Arg Gln Gln Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala 325 330 335 Ser Leu Pro Ala Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly 340 345 350 Pro Pro Pro Ala Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn 355 360 365 Phe Pro Gln Gly Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu 370 375 380 Trp Pro Pro Met Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser 385 390 395 400 Gly Glu Ala Val Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Ala Leu Ser Arg 405 410 415 Pro Ser Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala 420 425 430 Ala Ser Ala Thr Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala 435 440 445 Gly Pro Ala Pro Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro 450 455 460 Leu Pro Pro Pro Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly 465 470 475 480 Phe Ala Gly Leu Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu 485 490 495 Arg Gln His Leu Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr 500 505 510 Leu Leu Asp Ala Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu 515 520 525 Ala Ser Leu Gly Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu 530 535 540 Gly Thr Ala Thr Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro 545 550 555 560 Ser Ser Glu Ala Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro 565 570 575 Glu Met Glu Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met 580 585 590 Pro Glu Asp Gly Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu 595 600 605 Gln Lys Leu Glu Ser Pro Val Ala His 610 615 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 gtgatgggca aggtgttctt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 caagtctctg tgacggcgta 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 ctatgccctg tggcatttct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 aggcattcct ttccctgagt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 gtgatgggca aggtgttctt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 8 gaacgttcca gaaggtgctc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 9 aggtgttctt tgggcaactg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 10 caagtctctg tgacggcgta 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 11 actgccgcat tgtctctctt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 12 cgaagaggaa gtccaggatg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 13 cctgcgtaac atccacacac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 14 tctgagctag ggatgctggt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 15 gctggaggca agctatgaac 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 16 aggcattcct ttccctgagt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 17 actgccgcat tgtctctctt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 18 cacggagtgc agcacatact 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 19 attagctccc gttcccaagt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 20 aggcattcct ttccctgagt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 21 attagctccc gttcccaagt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 22 agaaatgcca cagggcatag 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 23 gtcagtggtg gacctgacc 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 24 aggggtctac atggcaact 19

Claims (6)

1. 서열목록 제1서열에 기재된 시노비올린(synoviolin) 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 측두하악관절 질환(Temporomandibular joint disorder; TMJD)의 진단용 키트.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 프로브를 포함하는 측두하악관절 질환의 진단용 키트는 마이크로어레이인 것을 특징으로 하는 측두하악관절 질환의 진단용 키트.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용되는 것을 특징으로 하는 측두하악관절 질환의 진단용 키트.
4. 서열목록 제2서열에 기재된 시노비올린 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 측두하악관절 질환의 진단용 키트.
5. 다음의 단계를 포함하는 측두하악관절 질환 치료 또는 예방용 물질의 스크리 닝 방법:

   (a) 시노비올린(synoviolin) 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및

   (b) 상기 시노비올린 유전자의 발현량, 시노비올린 단백질의 양 또는 시노비올린 단백질의 활성을 측정하는 단계, 상기 시노비올린 유전자의 발현량, 시노비올린 단백질의 양 또는 시노비올린 단백질의 활성이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료는 측두하악관절 질환의 치료 또는 예방용 물질로 판정된다.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 시노비올린 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포는 측두하악관절 질환-활막세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

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