KR102202120B1 - 알츠하이머 질환의 진단 또는 치료를 위한 Ｕｂｅ２ｈ의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알츠하이머병의 진단 또는 치료를 위한 Ube2h의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 Ube2h 유전자를 함유하는 알츠하이머 질환 진단 마커용 조성물, Ube2h 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는 알츠하이머 질환 진단용 조성물, Ube2h의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 알츠하이머 질환의 발병을 예측 또는 진단하기 위한 정보 제공방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 알츠하이머 질환의 마커 유전자인 Ube2h는 정상군에 비해 알츠하이머가 유발된 개체의 혈액 또는 혈장에서 특이적으로 발현양이 증가되어 있으며, 상기 유전자의 발현을 억제할 경우, 알츠하이머 질환의 원인물질로 알려진 타우 단백질의 억제를 통해 알츠하이머 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있으므로 본 발명에서 발굴한 Ube2h 유전자는 알츠하이머 질환의 진단 및 치료를 위한 타겟으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

알츠하이머 질환의 진단 또는 치료를 위한 Ｕｂｅ２ｈ의 용도{Use of Ube2h for Diagnosis or Treatment of Alzheimer's Disease}

본 발명은 알츠하이머 질환의 진단 또는 치료를 위한 Ube2h의 신규한 용도에 관한 것이다.

퇴행성 뇌질환은 나이가 들어감에 따라 발생하는 퇴행성 질환 중에서도 뇌에서 발생하는 질환을 뜻하며, 주요증상과 침범되는 뇌부위를 고려해 구분할 수 있는데, 대표적으로 알츠하이머 질환(Alzheimer’s disease)이나 파킨슨 질환 등이 포함된다.

특히 알츠하이머 질환은 치매를 유발하는 가장 흔한 질환의 하나이며, 사고력과 기억력을 포함하는 인지능력 손상을 초래하는 것으로 알려져 있으며, 아직까지 정확한 알츠하이머 질환의 발병기작은 알려져 있지 않으며, 현재까지 베타 아밀로이드(beta-amyloid) 단백질이 과도하게 만들어져 뇌 안에 침착되면서 뇌 세포에 유해한 영향을 주는 것이 일반적인 기전으로 알려져 있다.

이러한 알츠하이머 질환의 치료를 위해, 아세틸콜린에스테라아제 저해제 (Acetylcholinesterase (AChE) inhibitors) 또는 NMDA (N-Methyl-D-aspartate) 수용체 길항제 등의 약물이 사용되고 있으나, 이들 약물의 대부분은 초기단계 알츠하이머 질환 환자에 대해 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

또한 알츠하이머 질환의 진단을 위해, 임상조사 (clinical exam) 및 뇌이미징 (brain imaging) 등과 같은 방법이 이용되고 있으나, 이와 같은 진단방법으로 초기단계의 알츠하이머병을 진단하는 것은 매우 어려운 일이다.

특히 알츠하이머 질환을 가진 사람들의 뇌에 대한 분석을 통하여 아밀로이드-β 펩티드(Amyloid-β peptide)의 세포 외 응집체의 존재, 미세소관 (Microtubule) 단백질인 타우(Tau)의 비정상적 신경 섬유 엉킴 현상 등의 병리학적 특징을 관찰할 수 있으나, 뇌조직을 직접 채취해야만 하는 조직생검 이외에 알츠하이머 질환의 발생가능성을 확인할 수 있는 확실한 바이오 마커가 없어 알츠하이머를 효과적으로 예방 하는데 매우 큰 한계가 있다.

따라서 알츠하이머 질환의 효과적인 치료를 위해서는 병의 조기 진단이 필수적으로 요구됨에도 불구하고, 현재까지 알츠하이머 질환을 정확하고 신속하게 진단할 수 있는 방법은 거의 없는 실정이다.

한편, 인체기관을 구성하는 모든 세포 내에서는 항상성을 유지하기 위하여 단백질들의 생성 및 분해가 지속적으로 이루어진다. 단백질의 분해는 대부분 유비퀴틴 프로테아좀 시스템(Ubiquitin-Proteasome System, UPS)을 통하여 조절되며, 세포내 다양한 현상들을 통제하기 위하여, 손상되거나(damage) 미스폴딩 (misfolding) 혹은 비정상적 응집(aggregation) 및 발현(abnormal expression)된 불필요한 단백질들은 유비퀴틴(ubiquitin) 단백질이 일련의 유비퀴틴화 (ubiquitination) 효소반응에 의하여 표지되어 최종적으로 프로테아좀에 의한 분해가 이루어진다.

또한, 분해된 다른 단백질들은 작은 구조의 펩타이드(peptide) 형태가 되어 각종 면역반응 및 다양한 신호전달 기전에도 관여한다. 단백질의 유비퀴틴화는 생화학적 측면으로 볼 때 ATP 의존적 (ATP-dependent)이며, E1(activating)-E2(conjugating)-E3(ligating)의 효소들에 의하여 순차적으로 일어난다.

이러한 단백질의 유비퀴틴화에 관여하는 효소 중에서, E2 효소는 현재까지 인간세포 내에 40여개가 존재한다고 알려져 있다. 약 1000~1500개 이상이 인간세포 내에서 발현된다고 알려진 E3 효소와 비교해보면 E2 효소는 매우 적은 양으로 존재하기 때문에 세포의 항상성을 유지시키는데 매우 중요한 단백질로 여겨지고 있고, 퇴행성 뇌질환에 E3 효소뿐만 아니라, E2 효소들의 발현 및 활성의 관여 가능성이 예측되고 있다.

그러나 아직까지 단백질의 유비퀴틴화에 관여하는 효소 중에서 E2 효소군에 속하는 Ube2h 단백질과 알츠하이머와의 관련성에 대해서는 연구된 바가 없다.

대한민국 등록특허 제10-1363576호

이에 본 발명자들은 알츠하이머 질환의 진단을 위한 새로운 바이오마커로서 Ube2h를 사용할 수 있음을 확인하였고, 나아가 Ube2h를 억제할 경우 알츠하이머를 예방 또는 치료할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

그러므로 본 발명의 목적은 Ube2h 유전자를 함유하는, 알츠하이머 질환 진단 마커용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 Ube2h 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 알츠하이머 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 조성물을 포함하는, 알츠하이머 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 Ube2h의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 알츠하이머 질환의 발병을 예측 또는 진단하기 위한 정보 제공방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Ube2h 유전자를 함유하는, 알츠하이머 질환 진단 마커용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Ube2h 유전자는 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한 본 발명은 Ube2h 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 알츠하이머 질환 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Ube2h 유전자는 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Ube2h 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 물질은 Ube2h에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체일 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는, 알츠하이머 질환 진단용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 Ube2h의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 Ube2h의 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 6 내지 서열번호 9로 이루어진 군 중에서 선택되는 염기서열로 이루어진 Ube2h siRNA일 수 있다.

또한 본 발명은, (a) 알츠하이머 질환이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 Ube2h 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 Ube2h 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 정상 대조군 시료의 해당 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 알츠하이머 질환의 발병을 예측 또는 진단하기 위한 정보 제공방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Ube2h 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 측정 결과 정상 대조군과 비교하여 Ube2h 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준이 증가한 경우, 알츠하이머 질환이 발병된 것으로 판정하는 단계를 더 추가할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈장일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 알츠하이머 질환의 마커 유전자인 Ube2h는 정상군에 비해 알츠하이머가 유발된 개체의 혈액 또는 혈장에서 특이적으로 발현양이 증가되어 있으며, 상기 유전자의 발현을 억제할 경우, 알츠하이머 질환의 원인물질로 알려진 타우 단백질의 억제를 통해 알츠하이머 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있으므로 본 발명에서 발굴한 Ube2h 유전자는 알츠하이머 질환의 진단 및 치료를 위한 타겟으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 알츠하이머 질환이 유발된 마우스 및 정상 마우스로부터 수득한 전혈(whole blood) 및 혈장(plasma)에서 Ube2h mRNA의 발현수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 알츠하이머 질환이 유발된 마우스 및 정상 마우스로부터 수득한 전혈(whole blood)에서 Ube216 mRNA의 발현수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 알츠하이머 질환이 유발된 마우스 및 정상 마우스로부터 수득한 뇌 조직(Cortex; 대뇌피질)에서 Ube2h mRNA 및 Ube216 mRNA의 발현수준을 각각 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 총 RNA-시퀀싱을 이용하여 대뇌피질 신경세포에서 Ube2h 및 Ube2l6 유전자의 발현이 가장 활발히 일어나는 영역을 분석한 결과이다.
도 5는 Ube2h 유전자의 발현부위를 디자인한 영역에 해당하는 시퀀스를 나타낸 것으로, 노란색 표시 부분은 Ube2h 엑손 6의 영역을 나타낸 것이고, 파란색 표시 부분은 Ube2h 엑손 7의 영역을 나타낸 것이며, 붉은색의 시퀀스는 유전자의 전사 시작 영역과 종료 영역을 나타낸 것이다.
도 6은 Ube2h에 대한 siRNA 처리에 따른 단백질들의 발현 수준을 웨스턴 블럿을 통해 확인한 것으로, 알츠하이머 유발 인자인 타우 단백질, E3 효소인 Parkin 단백질, Ube216 단백질 및 유비퀴틴화된 단백질의 발현 수준을 확인한 것이다.

본 발명은 알츠하이머 질환의 진단을 위한 새로운 바이오마커로서 Ube2h를 사용할 수 있음을 최초로 규명한 점에 특징이 있다.

Ube2h(Ubiquitin-conjugating enzyme E2 H)는 단백질의 유비퀴틴화에 관여하는 단백질로서, 유비퀴틴 접합효소인 E2의 효소 중 하나이다.

한편, 아직까지 Ube2h가 알츠하이머 질환의 진단을 위한 마커로서의 용도 또는 알츠하이머 질환의 치료제로서 연구된 바가 없다.

이러한 점에서 본 발명의 일실시예에서는, Ube2h의 알츠하이머 질환의 진단마커로서의 사용 가능성을 확인하기 위해, 알츠하이머 질환이 유발된 마우스 및 정상 마우스로부터 혈액 및 뇌 조직을 각각 분리한 후, 각 시료에서의 Ube2h mRNA 수준을 측정하였다.

그 결과, 특이하게도 뇌 조직을 대상으로 분석한 질환 마우스 및 정상 마우스에서는 Ube2h mRNA의 발현차이가 크지 않은 것으로 나타난 반면, 혈액(전혈(whole) 및 혈장(plasma) 시료를 대상으로 한 분석에서는 알츠하이머 질환 마우스가 정상 마우스에 비해 Ube2h mRNA이 특이적으로 증가되어 있는 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 Ube2h 유전자의 발현이 알츠하이머 질환이 유발될 경우, 정상에 비해 Ube2h mRNA가 월등히 증가되어 있으며, 이러한 확인은 조직이 아닌 혈액을 대상으로 용이하게 검출할 수 있음을 확인함으로써, Ube2h를 알츠하이머 질환을 진단할 수 있는 새로운 바이오마커로 사용가능함을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 보다 효율적인 알츠하이머 질환의 진단을 위해, Ube2h의 전체 유전자 서열 중에서 발현 정도가 높은 영역이 있는지를 GWAS 기반의 분석을 통해 확인하였다.

즉, Ube2h 유전자로부터 발현되는 mRNA에 대하여 각각의 엑손 부위에 대한 발현 수준을 분석하였는데, 총 7개의 엑손으로 구성된 Ube2h 유전자 중에서, 6번째 엑손과 7번째 엑손이 다른 엑손 부위에 비해 상대적으로 높은 발현수준을 보이는 것을 확인하였고, 따라서 Ube2h의 전장 유전자 서열 중에서 6번째 엑손과 7번째 엑손의 일부 영역에 해당하는 서열번호 1로 표시되는 서열을 이용할 경우, 알츠하이머 질환의 발병 여부를 효과적으로 진단할 수 있음을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 Ube2h 유전자를 포함하는, 알츠하이머 질환 진단 마커용 조성물을 제공할 수 있으며, 또한, Ube2h 유전자의 발현수준을 측정하는 물질을 포함하는, 알츠하이머 질환 진단용 조성물을 제공할 수 있다.

상기 본 발명에서 Ube2h 유전자의 발현수준은, 바람직하게 Ube2h 유전자가 발현된 mRNA 수준 또는 단백질 수준을 의미한다.

상기 mRNA 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 Ube2h 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 상기 Ube2h 유전자 전체 또는 유전자의 일부 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 Ube2h 유전자의 cDNA 전체 염기서열은 서열번호 4에 나타낸 바와 같고, Ube2h 유전자 서열 중에서 엑손 6의 염기서열은 서열번호 2에, 엑손 7의 염기서열은 서열번호 3에 나타내었으며, 본 발명의 일실시예에서 Ube2h의 엑손 6 및 엑손 7의 일부 서열로 구성된 영역을 서열번호 1로 나타내었다.

따라서 본 발명에서 알츠하이머 질환 진단을 위한 마커는, 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1로 이루어진 염기서열을 사용할 수 있다.

또한, 상기 Ube2h 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 증폭반응을 통해 수득할 수 있는 프라이머들이라면 모두 사용 가능하며, 본 발명의 일실시예에서는 서열번호 10 및 11의 프라이머 쌍을 사용하였다.

본 발명에서 상기 “프라이머”란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.

상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서, 상기 “프로브”라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 본 발명의 Ube2h 마커 유전자로부터 발현된 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다.

바람직하게 상기 Ube2h 마커 유전자로부터 발현된 단백질은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 “항체”는 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 제조된 것을 사용할 수 있는데, 상기 항체의 제조는 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 알츠하이머 질환 진단용 마커 또는 상기 알츠하이머 질 진단용 조성물을 포함하는 알츠하이머 질환 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 알츠하이머 질환 진단용 키트는 상기 마커 유전자인 Ube2h 유전자의 mRNA 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.

본 발명의 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다.

나아가, 본 발명에 따른 키트는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으며, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다.

DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은, (a) 알츠하이머 질환이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 Ube2h 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 Ube2h 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 정상 대조군 시료의 해당 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 알츠하이머 질환의 발병을 예측 또는 진단하기 위한 정보 제공방법을 제공한다.

상기에서 유전자의 mRNA 수준 또는 단백질의 양을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 알츠하이머 질환의 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있고, 바람직하게는 혈액 또는 혈장일 수 있다.

상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 마커 유전자의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양과 알츠하이머 질환 환자 또는 의심환자에서의 마커 유전자의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 대조군과 비교함으로써 알츠하이머 질환의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.

보다 구체적으로 상기 Ube2h 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 측정 결과 정상 대조군과 비교하여 Ube2h 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준이 증가한 경우, 알츠하이머 질환이 발병된 것으로 판정할 수 있다.

나아가 본 발명자들은 알츠하이머 질환의 혈액에서 정상군의 혈액에 비해 Ube2h가 과발현 되어 있다는 사실 이외에도, Ube2h 유전자의 발현을 억제시킬 경우, 알츠하이머 질환의 발병인자인 타우(Tau)의 발현을 억제하여 알츠하이머를 예방, 개선 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.

그러므로 본 발명은 Ube2h의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

바람직하게 상기 Ube2h의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드는 Ube2h의 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi, siRNA 또는 shRNA일 수 있고, 상기 siRNA는 서열번호 6 내지 9로 이루어진 군 중에서 선택되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 상기 유전자의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, 상기 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.

또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 "RNAi"는 RNA Interference를 지칭하는 말로, 우리말로 풀이하면 RNA 간섭이라는 뜻을 지니고 있다. RNA 간섭은 대부분의 생물체 사이에서 잘 보존되어 있는 특이적 유전자억제 현상이다. 바이러스 감염에 대한 방어나 트랜스포손을 억제하기 위하여 혹은 비정상적 mRNA를 제거하기 위하여 세포가 사용하는 유전자 감시기작의 일종으로 생각되고 있다. 특히, small RNA에 의한 유전자 억제현상을 넓은 의미에서 RNA간섭이라 하고, 좁은 의미의 RNA 간섭은 siRNA에 의한 mRNA 분해 현상을 뜻한다. 또한 RNA간섭은 siRNA를 이용한 유전자 억제 실험 기술을 뜻하기도 한다.

본 발명에서 "siRNA라는 용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.

또한, 본 발명에 따른 상기 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 투여란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.

또한, 상기에서 유효량 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

알츠하이머 질환 유발 시 Ube2h의 혈액 내 발현증가 확인

알츠하이머 질환 특이적인 유전자의 변화를 확인하기 위해 24주령 알츠하이머병 모델인 5XFDA 마우스의 대뇌피질과 혈액으로부터 RNA를 각각 추출하였다. 이때 대조군으로는 정상 마우스의 대뇌피질과 혈액으로부터 RNA를 각각 추출하여 분석하였다.

알츠하이머병 유발 마우스 및 정상 마우스에서 수득한 혈액은 다시 전혈(Whole blood)과 혈장(Plasma)로 분리하였고, 전혈과 혈장으로부터 각각 RNA를 추출하였다. 희생된 마우스에서 바로 얻은 신선한 뇌 조직과 전혈 및 혈장의 RNA 추출은 당업계에 알려진 트리졸(Trizol) 시약을 이용하여 수행하였으며, 고순도의 RNA를 얻기 위하여 다음과 같은 과정을 추가로 수행하였다. 먼저, 조직을 트리졸 시약과 함께 넣고 파쇄한 후 상온에서 약 1시간 정도 인큐베이션을 하였고, 이후 파쇄물의 총 부피의 1/5에 해당하는 고순도 클로로포름을 첨가한 다음 RNA 추출을 진행하였다. 전혈 및 혈장도 상기 조직을 대상으로 수행한 방법과 같이 트리졸 시약을 첨가하고 1시간 가량 상온에서 인큐베이션을 하였다. 정제된 RNA는 나노드랍(Nano drop)을 이용하여 농도와 순도를 측정하였고 260/280 ratio는 1.8~2.0 사이를 유지하였다.

다음으로 각각의 정제된 RNA는 랜덤 프라이머(random primer)를 이용하여 cDNA로 합성되었고, RT-qPCR을 위해 20ng/ul로 희석하였으며 실험 수행 시 30ng의 양을 사용하였다.

정상군과 알츠하이머병 마우스로부터 수득한 각각의 RNA를 바탕으로 RT-qPCR을 수행한 결과, 알츠하이머가 유발된 전혈(whole blood) 및 혈장(plasma)에서 Ube2h의 유전자 발현이 정상군에 비해 1.75배 및 5배로 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 1 참조). 한편, 그러나 E2 효소군에 속하는 다른 유전자인 Ube2l6 유전자의 발현은 정상군과 알츠하이머 유발군 모두에서 변함이 없이 거의 동일한 수준으로 발현이 되는 것으로 나타났다(도 2 참조).

나아가 특이하게도 마우스의 뇌 조직을 대상으로 분석한 Ube2h 및 Ube2l6의 발현수준은 정상군과 알츠하이머 유발군 모두에서 큰 변화가 없는 것으로 나타났다도 3 참조). 또한 상기 실험에서 Ube2h mRNA의 분석을 위해 사용한 Ube2h에 대한 PCR 프라이머 서열은 다음과 같다.

Ube2h(F) 정방향 프라이머: 5‘-CCATAGATCCTCTCAATGGTG-3’(서열번호 10)

Ube2h(R) 역방향 프라이머: 5’-CTCTTCCGTTGCGTACTTCT-3’(서열번호 11)

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 Ube2h 유전자의 발현변화의 측정을 통해 알츠하이머의 발병 여부를 진단할 수 있다는 것을 알 수 있었고, 특히 알츠하이머 질환 유발시 Ube2h 유전자의 발현변화는 혈액, 즉 전혈과 혈장 시료를 통해 확인할 수 있으며, 보다 정확하게는 혈장 시료로부터 확인할 수 있음을 알 수 있었다. 반면 알츠하이머 질환의 발병 여부에 따른 Ube2h 유전자의 발현변화가 뇌 조직에서는 크게 확인할 수 없음을 알 수 있었다.

또한, 같은 E2 효소군에 속해 있지만 Ube2h 유전자가 아닌 다른 유전자인 Ube2l6 유전자의 발현 변화는 정상군과 알츠하이머 유발군 모두에서 큰 변화를 보이지 않음을 확인함으로써, Ube2h를 알츠하이머 질환 특이적인 새로운 바이오마커로 사용 가능함을 확인할 수 있었다.

<실시예 2>

알츠하이머 질환의 진단을 위한 Ube2h의 구체적인 마커 부위 규명

상기 실시예 1의 결과를 통해 알츠하이머 질환의 진단을 위한 새로운 바이오마커로서 Ube2h의 가능성을 확인함에 따라, 본 발명자들은 보다 효율적으로 Ube2h의 검출을 통해 알츠하이머 질환을 진단할 수 있는 Ube2h 유전자의 특정 타겟 부위 여부를 분석하기 위한 실험을 수행하였다.

먼저 쥐의 대뇌피질 신경세포로부터 얻은 GWAS 데이터를 바탕으로 E2 효소군에 속하는 Ube2h 유전자 및 Ube2 subfamily의 발현을 분석하였다. 이때 실험에 사용된 쥐의 신경세포는 임신 16.5주령의 태아에 붙어 얻은 대뇌피질 신경세포로서 배양 후 분화 6일(DIV6)째에 total RNA-시퀀싱을 수행하였다.

시퀀싱 분석 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 대뇌피질 신경세포에서 Ube2h 및 Ube2 subfamily (Ube2l6) 유전자의 발현이 활발히 일어나는 것을 확인하였고, 특히 Ube2h 유전자의 경우, 총 7개의 엑손으로 구성이 되어 있는데, 이중에서 6번째 엑손 및 7번째 엑손에서 가장 강한 유전자의 발현이 보이고 있음을 GWAS 데이터를 통해 확인하였다.

따라서 본 발명자들은 이러한 결과를 통해, Ube2h의 유전자 전체를 확인할 필요 없이, 유전자의 발현이 가장 강하게 나타나는 엑손 6 및 7에 해당하는 부분의 발현 수준을 검출한다면, 보다 효율적으로 정확하게 알츠하이머 질환을 진단할 수 있음을 알 수 있었다. 구체적으로, 본 발명에서 규명한 알츠하이머 질환의 진단에 사용 가능한 Ube2h의 유전자 영역은 도 5에 나타내었는데, 도 5에서 노란색 부분은 Ube2h의 엑손 6의 영역을 나타낸 것이고, 파란색 부분은 엑손 7의 영역을 나타낸 것이며, 노란색 영역에서 굵은색 표기의 시퀀스에서부터 파란색 영역의 굵은색 표기의 시퀀스에 해당하는 서열번호 1의 염기서열이 본 발명에서 규명한 알츠하이머 질환의 진단을 위한 새로운 바이오마커에 해당한다. 또한 Ube2h의 엑손 6의 영역에 해당하는 염기서열은 서열번호 2로 나타내었고, Ube2h의 엑손 7의 영역에 해당하는 염기서열은 서열번호 3으로 나타내었다.

<실시예 3>

Ube2h의 발현 억제 시 타우 (tau) 단백질의 발현 억제를 통한 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료 효과 분석

알츠하이머 질환이 발병이 되면 발병 개체의 혈액 시료에서 Ube2h의 발현 수준이 정상군에 비해 현저하게 증가된다는 사실을 확인함으로써, 본 발명자들은 Ube2h의 발현을 억제할 경우, 알츠하이머 질환을 예방 또는 치료할 수 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

이를 위해 Ube2h 유전자의 발현을 억제할 수 있는 siRNA를 이용하여, 인간배아유래 신장내피세포인 HEK293T (Human embryonic kidney 293T cell) 세포주에 각각 처리한 후, 알츠하이머 질환의 유발 원인으로 알려진 타우 단백질의 발현 억제 여부를 웨스턴 블럿을 통해 확인하였으며, 이때 E2 효소군에 속하는 다른 단백질인 Ube2l6와 E3 효소인 Parkin 단백질의 발현수준도 함께 분석하였다.

또한 상기 실험에서 사용한 Ube2h siRNA의 염기서열은 다음과 같다.

① siUbe2h #1 염기서열:

Ube2h siRNA-1(Antisense):5’-GUGGUUAGUUAACCGUACU-3’(서열번호 6)

Ube2h siRNA-1 (Sense):5’-AGUACGGUUAACUAACCAC-3’(서열번호 7)

② siUbe2h #2 염기서열:

Ube2h siRNA-2(Antisense):5’-UGAUAGGUAGAUGUGAGUA-3’(서열번호 8)

Ube2h siRNA-2(Sense):5’-UACUCACAUCUACCUAUCA-3’(서열번호 9)

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, Ube2h에 대한 siRNA 처리 시, Ube2h의 발현은 억제되는 것으로 나타났고, 알츠하이머 질환의 유발인자인 Tau의 발현도 억제되는 것으로 나타났다.

한편, Ube2h에 대한 siRNA 처리 시, Ube2l6와 E3 효소인 Parkin의 발현에는 큰 변화가 없는 것으로 나타났고, Ube2h 단백질은 유비퀴틴을 E3 효소에 전달하는 E2 활성을 가지기 때문에 이러한 활성이 억제되어 유비퀴틴화된 단백질의 양도 다소 감소된 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 통해 Ube2h의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 억제제는 Tau의 발현억제를 통해 알츠하이머 질환을 예방, 치료 또는 개선할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Korea Brain Research Institute <120> Use of Ube2h for Diagnosis or Treatment of Alzheimer's Disease <130> NPDC81696 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Alzheimer's Disease diagnosis biomarker polynucleotide sequence <400> 1 ccatagatcc tctcaatggt gacgctgcag ccatgtacct ccaccgacca gaagagtaca 60 agcagaaaat taaagagtac atccagaagt acgcaacgga agag 104 <210> 2 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ube2h exon 6 polynucleotide sequence <400> 2 atcttaccaa tatatttgag tccttcctgc cccagttgct ggcctatcct aaccccatag 60 atcctctcaa tggtgacgct gcagccatgt acctccaccg accagaagag tacaagcaga 120 aaattaaag 129 <210> 3 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ube2h exon 7 polynucleotide sequence <400> 3 agtacatcca gaagtacgca acggaagagg ccctgaagga acaggaagag ggcactggcg 60 acagctcatc ggagagttct atgtctgact tctcagaaga tgaggcccag gacatggagt 120 tgtag 125 <210> 4 <211> 552 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ube2h cDNA sequence <400> 4 atgtcatccc ccagtcccgg caagaggcgg atggacacgg acgtagtcaa gctcattgaa 60 agcaaacatg aggttacaat cctaggagga ctcaatgaat tcgttgtcaa gttttacgga 120 ccacaaggaa caccatatga aggcggggtg tggaaagtga gagtggacct tcctgataaa 180 taccctttca agtctccatc tataggattc atgaataaaa ttttccatcc caacattgat 240 gaagcgtcag gaactgtgtg tctagatgta attaatcaaa cttggacagc tctctatgat 300 cttaccaata tatttgagtc cttcctgccc cagttgctgg cctatcctaa ccccatagat 360 cctctcaatg gtgacgctgc agccatgtac ctccaccgac cagaagagta caagcagaaa 420 attaaagagt acatccagaa gtacgcaacg gaagaggccc tgaaggaaca ggaagagggc 480 actggcgaca gctcatcgga gagttctatg tctgacttct cagaagatga ggcccaggac 540 atggagttgt ag 552 <210> 5 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ube2h amino acid sequence <400> 5 Met Ser Ser Pro Ser Pro Gly Lys Arg Arg Met Asp Thr Asp Val Val 1 5 10 15 Lys Leu Ile Glu Ser Lys His Glu Val Thr Ile Leu Gly Gly Leu Asn 20 25 30 Glu Phe Val Val Lys Phe Tyr Gly Pro Gln Gly Thr Pro Tyr Glu Gly 35 40 45 Gly Val Trp Lys Val Arg Val Asp Leu Pro Asp Lys Tyr Pro Phe Lys 50 55 60 Ser Pro Ser Ile Gly Phe Met Asn Lys Ile Phe His Pro Asn Ile Asp 65 70 75 80 Glu Ala Ser Gly Thr Val Cys Leu Asp Val Ile Asn Gln Thr Trp Thr 85 90 95 Ala Leu Tyr Asp Leu Thr Asn Ile Phe Glu Ser Phe Leu Pro Gln Leu 100 105 110 Leu Ala Tyr Pro Asn Pro Ile Asp Pro Leu Asn Gly Asp Ala Ala Ala 115 120 125 Met Tyr Leu His Arg Pro Glu Glu Tyr Lys Gln Lys Ile Lys Glu Tyr 130 135 140 Ile Gln Lys Tyr Ala Thr Glu Glu Ala Leu Lys Glu Gln Glu Glu Gly 145 150 155 160 Thr Gly Asp Ser Ser Ser Glu Ser Ser Met Ser Asp Phe Ser Glu Asp 165 170 175 Glu Ala Gln Asp Met Glu Leu 180 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ube2h siRNA-1(Antisense) <400> 6 gugguuaguu aaccguacu 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ube2h siRNA-1(Sense) <400> 7 aguacgguua acuaaccac 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ube2h siRNA-2(Antisense) <400> 8 ugauagguag augugagua 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ube2h siRNA-2(Sense) <400> 9 uacucacauc uaccuauca 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ube2h(F) primer <400> 10 ccatagatcc tctcaatggt g 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ube2h(R) primer <400> 11 ctcttccgtt gcgtacttct 20

Claims (14)

1. Ube2h 유전자를 함유하는, 알츠하이머 질환 진단 마커용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 Ube2h 유전자는 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 알츠하이머 질환 진단 마커용 조성물.
3. Ube2h 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 알츠하이머 질환 진단용 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 Ube2h 유전자는 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 알츠하이머 질환 진단용 조성물.
5. 제3항에 있어서,
   상기 Ube2h 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 알츠하이머 질환 진단용 조성물.
6. 제3항에 있어서,
   상기 물질은 Ube2h에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체인 것을 특징으로 하는, 알츠하이머 질환 진단용 조성물.
7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 알츠하이머 질환 진단용 키트.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. (a) 알츠하이머 질환이 의심되는 환자의 분리된 혈액 또는 혈장으로부터 Ube2h 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 Ube2h 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 정상 대조군 시료의 해당 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는,
    알츠하이머 질환의 발병을 예측 또는 진단하기 위한 정보 제공방법.
12. 제11항에 있어서,
    상기 Ube2h 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 측정 결과 정상 대조군과 비교하여 Ube2h 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준이 증가한 경우, 알츠하이머 질환이 발병된 것으로 판정하는 단계를 더 추가하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머 질환의 발병을 예측 또는 진단하기 위한 정보 제공방법.
13. 삭제
14. 제11항에 있어서,
    상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머 질환의 발병을 예측 또는 진단하기 위한 정보 제공방법.

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