KR102034311B1

KR102034311B1 - 리포칼린-2를 이용한 혈관성 치매의 진단방법

Info

Publication number: KR102034311B1
Application number: KR1020170118938A
Authority: KR
Inventors: 석경호; 김재홍; 이호원; 고판우
Original assignee: 경북대학교 산학협력단; 경북대학교병원
Priority date: 2017-09-15
Filing date: 2017-09-15
Publication date: 2019-10-18
Also published as: KR20190031072A

Abstract

본 발명은 리포칼린-2를 이용한 혈관성 치매의 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 리포칼린-2 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 혈관성 치매의 진단용 조성물, 진단용 키트 및 혈관성 치매의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 리포칼린-2를 정성 또는 정량 분석하는 방법에 대한 것이다.
상기 리포칼린-2는 혈관성 치매환자에서 정상군 대비 유의적으로 증가된 수준을 보일 뿐만아니라, 특히 혈장과 같은 체액 시료를 통해서 측정 가능하므로 측정의 용이성이 크기 때문에 혈관성 치매 진단의 바이오마커로서 효용성이 우수하다.

Description

리포칼린-2를 이용한 혈관성 치매의 진단방법{Method for diagnosing vascular dementia using lipocalin-2}

본 발명은 리포칼린-2를 이용한 혈관성 치매의 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 리포칼린-2 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 혈관성 치매의 진단용 조성물, 진단용 키트 및 혈관성 치매의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 리포칼린-2를 정성 또는 정량 분석하는 방법에 대한 것이다.

다양한 신경계 질환이 보고되고 있으며, 특히 인구 고령화에 따라 65세 이상 노인 인구 10명 중 1명 꼴로 치매를 겪고 있어 이러한 신경계 질환들에 대한 관심이 높아지고 있다. 치매는 하나의 단일 질환이라기보다는 후천적으로 발생한 다발성 인지기능 저하로 인하여 사회생활 및 일상생활에 유의한 장애가 발생한 상태로서, 알츠하이머병, 뇌혈관질환, 우울증, 대사성 질환, 갑상선 질환, 비타민 결핍증, 감염성 뇌질환, 정상압수두증 등 다양한 원인질환을 가진다. 그러나 이러한 원인질환들은 복합적으로 작용하는 경우가 많고, 또 이러한 원인질환들이 발생하였다고 해서 반드시 치매의 발생을 의미하지는 않기 때문에 상기 원인질환에 기여하는 특정 인자(factor)가 치매에 있어서는 어떻게 작용하는지는 아직까지도 연구자들에게 많은 논란이 있고 연구를 요한다.

여러 가지 치매 유형 중, 혈관성 치매는 혈관성 위험인자들의 조절을 통해 인지기능장애를 예방할 수 있을 뿐만 아니라 호전될 수도 있기 때문에 조기 발견 및 진단이 매우 중요하다. 그러나 혈관성 치매를 임상에서 진단하기에는 많은 어려움이 있으며 이로 인해 효과적인 치료법도 그다지 많이 개발되지 못한 실정이다. 그러한 이유는 혈관성 치매가 단일 질환으로 보기 보다는 매우 다양한 질환들을 포함하고 있기 때문으로 생각된다. 흔히, 혈관성 치매가 단순히 뇌혈관 질환으로 발생한다고 생각하기 쉽지만 뇌혈관 질환이 있다고 해서 반드시 혈관성 치매가 발병하는 것은 아니다. 혈관성 치매가 발병하기 위해서는 실제로 여러 가지 요인들이 치매의 발병에 영향을 미친다. 이런 요인들에는 혈관성 위험인자, 대뇌 피질의 변화, 대뇌 백질의 변화, 개인의 특성 및 유전적 요소 들이 관여한다.

한편, 경도 인지 장애(MIC), 혈관의 허혈성 병변, 뇌졸중, 알츠하이머 치매, 혈관성 치매들 간에 일부 선후 관계가 보고되고 있으나, 이러한 선후 관계가 반드시 후 질병의 발생을 의미하지 않고 실제 어떤 인자가 선후 관계에 높은 개연성을 가지는지는 많은 논란이 있으며 연구적 필요성이 제기되고 있다. 일례로, 선행된 인지장애와 치매의 관련성이 보고 되고 있으나 기억상실성 경도인지장애로 진단받은 사람이 실제 혈관성 치매로 발전될 확률은 10 내지 15%/년 정도이며, 일반인구 집단에서 예측 타당도는 낮은 것으로 알려졌다(Blossom CM Stephan et al., Beyond mild cognitive impairment: vascular cognitive impairment, no dementia (VCIND), Alzheimers Res Ther20091:4). 또한 일례로 혈관성 치매의 발병에 있어서 뇌의 허혈성 변화들이 그 원인 중의 하나로 보고 되고 있으나, 실제로 일과성 허혈발작이 발생한 후 6-12 개월 내에 혈관성 치매로 발전하는 경우는 30%정도이다 (Abhijeet Jagtap et al., Biomarkers in vascular dementia: A recent update, Biomarkers and Genomic Medicine (2015) 7, 43e56). 뿐만아니라 뇌졸중후 혈관성 치매로 발전하는 경우는 약 10 ~ 30% 정도에 불과하다(Pendlebury ST. et al., Dementia in patients hospitalized with stroke: rates, time course, and clinico-pathologic factors, Int J Stroke. 2012 Oct;7(7):570-81)

현재 치매는 크게 알츠하이머성 치매, 혈관성 치매 및 기타 치매로 분류되고 있다. 치매의 정확한 분류 및 이에 따른 차별적 검출은 치료 전략에 있어서 큰 영향을 미친다. 또한 치료 가능한 치매도 치료할 시기를 놓치면 뇌의 구조적 변화가 생겨 치료가 불가능하게 되며, 치료 가능한 치매 증세의 회복 정도는 손상 정도에 따라 달라 질 수 있으므로, 정확한 조기 진단과 적절한 치료를 받는다면 좋은 결과를 얻을 수 있다. 이처럼 구체적 질환 종류를 조기에 파악하여 적절한 제제를 적시에 적용하는 것이 매우 중요하다. 따라서 바이오마커 분석을 바탕으로 치매 종류를 결정할 긴박한 필요성이 있다. 뿐만아니라 이러한 바이오마커는 조기에 정확한 진단을 용이하게 하기 위하여 쉽게 측정되는 것이 좋으며, 특히 뇌 질환에 있어서 뇌 조직이나 신경조직을 침습적으로 채취하는데에는 상당한 위험성과 2차 합병증을 유발하는 등의 많은 어려움이 있는 것이 고려되어야한다.

당업계에 이러한 치매 증상을 구분하기 위한 마커들이 보고되고 있으나, 실질적으로 효용성 있는 마커에 대해서는 많은 논란이 있다. 일례로 호모시스테인(homocysteine)은 알츠하이머 환자들의 혈청에서 그 수준이 상승되는 것으로 알려져 있는 반면, 혈관성 치매 환자에서도 혈장 내 호모시스테인 수준이 상승되며 이것이 혈관성 치매 환자의 해마 및 대뇌 피질위축과 관련성이 있음이 보고되어(Abhijeet Jagtap et al., Biomarkers in vascular dementia: A recent update, Biomarkers and Genomic Medicine (2015) 7, 43e56), 호모시스테인의 역할에 대해서 논란이 있다. 이처럼 구체적인 치매 종류를 차별적으로 진단해내기 위한 바이오마커들의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 혈관성치매 환자에서 리포칼린-2의 체액(특히, 혈장)내 수준이 현격하게 상승되는 것을 통해, 리포칼린-2의 혈관성치매 진단에 대한 바이오마커로서의 효용성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은, 리포칼린-2 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 혈관성 치매의 진단용 조성물 및 이를 포함하는 혈관성 치매 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 혈관성 치매의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 피검체로부터 채취한 시료로부터 리포칼린-2 발현 수준을 정성 또는 정량분석 하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리포칼린-2 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 혈관성 치매의 진단용 조성물 및 이를 포함하는 혈관성 치매 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 혈관성 치매의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 피검체로부터 채취한 시료로부터 리포칼린-2 발현 수준을 정성 또는 정량분석 하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 모두 포함하는 개념이다. 바람직하게 본 발명에서의 진단은 리포칼린-2 단백질의 발현 수준을 측정하여 혈관성 치매의 존재 또는 발병 여부를 확인하는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어‘혈관성 치매(Vascular dementia,VaD)’는 뇌혈관의 손상에 의해 사회생활 및 일상생활이 불가한 정도의 인지기능 저하를 동반하는 치매를 의미하는 것으로서, 퇴행성 뇌질환(일례로 알츠하이머) 및 상기 퇴행성 뇌질환에 기인하는 치매와는 대비되며, 경도인지장애(mild cognitive impairment, MCI) 등 치매에 선행되어 나타날 수 있는 단순 인지적 결함 증상들과도 구분된다.

상기 퇴행성 뇌질환이란 뇌의 일부분의 신경세포가 서서히 퇴화하면서 신경전달에 장애가 생겨 발생하는 질환을 말한다. 퇴행성 신경질환의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅톤 질환, 다발성 경화증 등이 있다.

상기 경도 인지 장애(MCI)는 임상적으로 치매 없이 최근 기억의 경미한 정도의 손상, 또는 나이 또는 교육적 배경으로 기대되는 것을 초과하는 정도로 그 밖의 인지 기능의 상당한 손상을 특징으로 한다. 경도 인지 장애는 기억력 호소(memory complaint); 비정상적인 일상 생활 활동; 비정상적인 일반적 인지 기능; 나이에 비해 비정상적인 기억력; 치매가 없음 등을 진단의 기준으로 한다.

본 발명에서 용어 '발현(expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어 '단백질'은 '폴리펩타이드(polypeptide)' 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 발명에서 용어'폴리뉴클레오티드(polynucleotide)' 또는 '핵산'은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 'mRNA'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자로부터 아미노산 서열을 특정하게 되는 리보솜으로 유전 정보(유전자 특이적 염기 서열)를 전달하는 RNA이다.

본 발명은 리포칼린-2 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 혈관성 치매의 진단용 조성물 및 이를 포함하는 혈관성 치매 진단용 키트를 제공한다.

상기 ‘리포칼린-2 발현수준 측정’이란 리포칼린-2 단백질 또는 리포칼린-2 코딩 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 의미한다.

본 발명에서 리포칼린-2 단백질은 바람직하게 인간 유래의 것으로 알려진 것이라면 그 구체적 서열이 특별히 제한되지 않으나, 일례로 GenBank accession number: NP_005555.1(서열번호 1) 등으로 공지된 것을 사용할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 리포칼린-2 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 일 수 있다. 상기 리포칼린-2 단백질은 일례로 GenBank accession number: NM_005564(mRNA, 서열번호 2)등의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해서 코딩되는 것으로 알려져 있다.

상기 리포칼린-2 단백질의 발현수준을 측정하는 제제는, 당업계에 단백질의 발현수준 측정에 사용가능한 것으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 리포칼린-2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머일 수 있다.

본 발명에서 용어 '항체(antibody)'는 항원성 부위에 특이적으로 결합하는 면역글로불린(immunoglobulin)을 의미한다. 본 발명에서의 리포칼린-2 항체는 리포칼린-2 이외의 다른 단백질에는 반응하지 않고, 리포칼린-2 단백질에만 특이적으로 결합하는 항체이다. 본 발명에서 리포칼린-2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질(리포칼린-2)에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 상기 항체는 리포칼린-2 코딩 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 수득하고, 수득한 단백질을 동물에 주입하여 생성되는 항체를 수득하는 등의 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. 상기 리포칼린-2 항체는 리포칼린-2 전장 서열 단백질을 통해 제작되는 것일 수도 있고, 또는 리포칼린-2 단백질의 항원성 부위를 포함하는 폴리펩타이드 단편을 이용하여 제조할 수도 있다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 다클론항체(polyclonal antibody) 또는 단일클론항체(monoclonal antibody)를 포함한다. 또한 항원-항체 결합성(반응)을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며, 리포칼린-2 에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편, 즉 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 리포칼린-2 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다.

본 발명에서 용어‘앱타머’는 시료 내의 검출하고자 하는 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는 것으로, 특이적으로 시료 내의 표적 단백질의 존재를 확인할 수 있다. 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에따라, 확인하고자 하는 표적 단백질(본 발명에서는 리포칼린-2 단백질)에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 앱타머 칩의 관능기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 NH2로 변형을 시킴으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 리포칼린-2 코딩 유전자의 발현 수준을 측정한다는 의미는 상기 리포칼린-2 유전자로부터 파생되는 전사물들의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 의미이고, 일례로 리포칼린-2 mRNA 발현 수준을 측정하는 것을 포함한다.

따라서 리포칼린-2 코딩 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 상기 유전자로부터 발현된 mRNA를 검출하는 제제를 의미하는 것일 수 있다. 따라서 리포칼린-2 코딩 유전자를 검출하는 제제는, 상기 유전자로부터 발현된 mRNA에 특이적으로 부착 또는 혼성화(hybridization)하는 리간드라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 프라이머(쌍) 또는 프로브 일 수 있다.

상기 “프라이머”는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서 리포칼린-2 mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머는 리포칼린-2 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 리포칼린-2 mRNA 또는 리포칼린-2 cDNA의 특정 구간을 증폭하여 리포칼린-2 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 리포칼린-2 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다. 프라이머는 당업자라면 리포칼린-2 mRNA 또는 cDNA 염기서열을 참조하여 용이하게 디자인할 수 있다.

'프로브(probe)'는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서는 리포칼린-2 mRNA에 상보적인 프로브를 피검체의 시료와 혼성화 반응(hybridization)을 수행하여 리포칼린-2 mRNA의 발현양을 측정함으로써 혈관성 치매의 진단에 이용할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 리포칼린-2 mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.

본 발명의 진단용 키트에는 리포칼린-2의 발현 수준을 측정하기 위하여 선택적으로 리포칼린-2 단백질을 마커로 인식하는 항체, 앱타머 또는 리포칼린-2 mRNA를 마커로 인식하는 프라이머, 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 양태로서 상기 키트는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme-linked immunospecific assay, 효소면역측정법), 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS(Fluorescence activated cell sorter) 또는 단백질 칩 방법을 수행하기 위해 필요한 공지의 필수요소 및 부수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일례로, 상기 키트는 리포칼린-2 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 목적 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 상기 키트는 추가적으로 대조군 단백질(예를 들어, 정상 선방세포 특이적 마커 단백질)에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 상기 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(항체와 컨주게이트된 형태로서) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 잉여의 발색 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 항체와 결합된 단백질 마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다.

또한 상기 키트는 당업계에 프라이머(프라이머쌍) 또는 프로브를 구성품으로 제공하는 분석 키트로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소연쇄반응), RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, 서던 블랏팅 또는 DNA 마이크로어레이 칩용 키트 등을 포함한다.

일례로, 상기 진단 키트는 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 중합효소반응 키트는 마커 유전자(mRNA)에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자(mRNA)의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7bp 내지 50bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10bp 내지 30bp의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), DNA 폴리머라아제(예를 들어 Taq-폴리머라아제) 및 역전사효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 혈관성 치매 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 채취한 시료로부터 리포칼린-2 발현 수준을 정성 또는 정량분석하는 방법을 제공한다.

구체적으로 상기 방법은 (a) 피검체의 시료로부터 리포칼린-2 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 리포칼린-2 발현 수준을 정상인과 비교하고, 정상인에 비해 리포칼린-2 발현 수준이 증가한 피검체를 혈관성 치매에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어‘분석’은 바람직하게‘측정’을 의미하는 것일 수 있고, 상기 정성분석은 목적하는 물질의 존재 여부를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있으며, 상기 정량분석은 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준) 또는 양의 변화를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 본 발명에서 분석 또는 측정은 정성적인 방법과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한없이 수행될 수 있으며, 바람직하게는 정량적인 측정이 수행되는 것일 수 있다.

이하, 상기 방법을 각 단계에 따라 설명한다.

상기 (a) 단계는 피검체(잠재 환자)로부터 제공된 시료에서 리포칼린-2 발현 수준을 측정하는 단계이다.

상기 시료는 혈관성 치매의 발병 여부를 진단하고자 하는 피검체에서 채취된 것이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 각종 분비물, 소변, 대변 등일 수 있다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료(체액 시료)를 사용하는 것일 수 있으며, 일례로 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 또는 질 분비물, 소변 및 뇌척수액을 사용하는 것일 수 있다. 본 발명은 혈관성 치매가 발생된 직접적 뇌 병변조직 외의 체액시료(일례로, 혈장)를 통해 진단이 가능하여, 진단의 효용성, 신속성, 편이성 및 안전성 등이 증가된다는 점에서 기술적 의의가 크다. 본 발명에서 상기 시료는 가장 바람직하게는 혈액, 혈장, 또는 혈청일 수 있다.

상기 시료는 검출 또는 진단에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.

상기 (a) 단계에서 리포칼린-2 발현 수준 측정은 리포칼린-2 단백질 또는 리포칼린-2 코딩 유전자 발현 수준을 측정하는 것을 의미한다.

상기 단백질 발현 수준 측정은 당업계에 공지된 단백질 발현 측정 방법에 의한 것이라면 측정 방법이 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme-linked immunospecific assay), 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역염색법(면역조직화학염색 및 면역형광염색 등 포함), 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS(Fluorescence activated cell sorter) 또는 단백질 칩방법 중 어느 하나를 이용하는 것일 수 있다.

상기 유전자 발현 수준 측정은 당업계에 공지된 유전자 발현 측정 방법에 의한 것이라면 측정 방법이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 PCR(polymerase chain reaction), RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(southern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용하는 것일 수 있다.

상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 측정한 피검체 시료의 리포칼린-2 발현 수준을 정상인과 비교하고, 정상인에 비해 리포칼린-2 발현 수준이 증가한 피검체를 혈관성 치매에 걸린 것으로 판정하는 단계이다.

상술한 (a) 단계의 방법으로 측정한 피검체 시료의 리포칼린-2 발현 수준(유전자 또는 단백질 수준을 모두 포함)을, 동일한 방법으로 측정한 정상인 시료의 리포칼린-2 발현 수준과 비교한다. 이때 상기 시료는 피검체와 정상인 간에 동일한 종류 또는 동일한 방법에 의해 수득된 시료인 것이 바람직하다. 리포칼린-2의 발현 수준이 건강한 정상인에 비하여 증가한 피검체를 혈관성 치매에 걸린 것으로 판정한다.

리포칼린-2는 혈관성 치매환자에서 정상군 대비 유의적으로 증가된 수준을 보일 뿐만아니라, 특히 혈장과 같은 체액 시료를 통해서 측정 가능하므로 측정의 용이성이 크기 때문에 혈관성 치매 진단의 바이오마커로서 효용성이 우수하다.

도 1은 정상 대조군과 혈관성 치매(VaD) 환자군에서 혈장 내의 리포칼린-2(LCN2) 수준을 unpaired two-tailed Student’s t test (p<.0001)에 기반하여 비교평가한 결과를 나타낸다. 각 실험군에서의 가로 막대는 LCN2 수준의 평균값을 나타낸다.
도 2는 바이오마커로서 혈관성 치매(VaD) 환자군의 혈장 내 리포칼린-2(LCN2) 수준에 대한 ROC 곡선(Receiver operating charateristic curve)을 나타낸다(AUC: area under curve).

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

혈관성치매(VaD) 진단을 위한 혈장 내 리포칼린-2의 바이오마커로서의 효용성 확인

1) 실험방법

환자: 경북대학교 병원 치매 클리닉(대구, 한국)을 방문한 환자들 가운데 참가자들을 모집했다. 모든 참가자 또는 보호자로부터 정보 제공 동의를 얻었다. 본연구는 지연윤리위원회의 승인을 받았다. 경북대학교 병원에서 2014년 1월부터 2016년 5월까지 VaD 진단을받은 9명의 환자와 건강한 28명의 피험자로 이루어진 총 37명을 연구 대상으로 삼았다. VaD 환자들은 다음 기준에 따라 선정되었다: (1) 40세 이상; (2) DSM-IV 기준(Black & Grant, 2014) 또는/및 NINDS-AIREN 기준(Roman et al., 1993) 충족; (3) 두개골-MRI(cranial-MRI)상에서 유의한 뇌혈관 변화 증거; (4) Mini-Mental State Examination (MMSE) 점수 10-26. 진단 당시, 대사 원인(metabolic causes)에 의한 인지손상 환자를 배제하기 위하여 혈액 스크리닝 테스트가 수행되었다. 또한 초기 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disorders), 공간-점유 병변(space-occupying lesions), 또는 뇌엽성 출혈(lobar hemorrhage)로 진단받은 환자들도 본 실험에서 배제하였다. 대조군인 28명의 피험자들은 건강하고, 지적으로 활동적이었으며, 뇌혈관 질환, 심혈관 질환 또는 신경 장애의 병력이 없었다. 또한 알려지지 않은 원인을 배제하기 위하여 Cranial MRI와 혈액 스크리닝 검사를 수행하였다.

혈장 샘플 : 하루 전날 8시간이상 금식한 환자들로부터 대정맥에서 채혈 한 혈액을 EDTA 튜브에 넣은 후, 프로테아제 저해제 칵테일(Roche Diagnostics)을 넣고 부드럽게 섞어주었다. 상기 EDTA 처리 혈액을 3000 rpm의 속도로 10분간 원심분리하여, 혈장을 분리하였다. 수집 된 혈장 샘플을 드라이 아이스상에서 즉시 냉동시킨 다음 -80℃ 냉동고에 보관 하였다.

혈장 내 리포칼린 -2 측정: Quantikine 키트(R&D systems) 또는 Duo-set ELISA 키트(R&D systems)를 사용하여 인간 혈장 시료에서 LCN2 수준을 측정하였다. 100㎕의 혈장(1 : 400)을 사용하여 96-웰 플레이트에서 제조사의 프로토콜에 따라 상기 ELISA assay가 수행되었다. 사용된 human recombinant LCN2의 standard 농도는 39.06 ~ 2500 pg/ml이다. 재조합 LCN2 단백질 수준은 혈장 샘플의 총 단백질 함량으로 표준화되었다. 모든 측정은 이중으로 수행되었다.

통계적 분석: 통계 분석은 unpaired two-tailed Student’s t-test, Tukey multiple comparison test를 이용한 one-way ANOVA 또는 two-way ANOVA를 사용하여 다른 그룹의 평균을 비교함으로써 수행되었다. SPSS version 14.0K 소프트웨어(SPSS Inc., Chicago, IL)를 사용하여 데이터 세트를 분석하였다. 통계적 유의성은 p <0.05에서 확립되었다.

2) 실험결과

도 1에서 보는 바와 같이, 정상대조군은 평균적으로 33.376 ± 3.53 ng/ml 의 수치를 나타냈으나 VaD 환자들은 90.06±612.71ng/ml의 수치를 나타내어, VaD 환자에서 현격하게 혈장내 리포칼린 수준이 높아지는 것을 확인하였다.

또한 ROC 곡선으로 바이오 마커로서 VaD 환자 혈장 내 LCN2 수준의 예측 중요성(predictive significance)을 평가하였다. 도 2에서 보는 바와 같이, VaD 환자에서 ROC 곡선 아래 면적(AUC, 즉 정확도)은 0.952(95 % CI : 0.000 ~ 1.000, P = 0.00005, 컷오프 값 : 49.32, 민감도 : 88.9 %, 특이도 : 10.7 %)이었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 리포칼린-2를 이용한 혈관성 치매의 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 리포칼린-2 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 혈관성 치매의 진단용 조성물, 진단용 키트 및 혈관성 치매의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 리포칼린-2를 정성 또는 정량 분석하는 방법에 대한 것이다.

상기 리포칼린-2은 혈관성 치매환자에서 정상군 대비 유의적으로 증가된 수준을 보일 뿐만아니라, 특히 혈장과 같은 체액 시료를 통해서 측정 가능하므로 측정의 용이성이 크기 때문에 혈관성 치매 진단의 바이오마커로서 효용성이 우수하므로, 체외진단 산업등의 분야에서 산업상 이용가능성이 크다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> Method for diagnosing vascular dementia using lipocalin-2 <130> NP17-0059 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 198 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human lipocalin-2 <400> 1 Met Pro Leu Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala Leu 1 5 10 15 His Ala Gln Ala Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro 20 25 30 Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu 50 55 60 Asp Lys Asp Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu 65 70 75 80 Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys 85 90 95 Asp Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe 100 105 110 Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val 115 120 125 Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys 130 135 140 Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg 145 150 155 160 Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser 165 170 175 Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile 180 185 190 Asp Gln Cys Ile Asp Gly 195 <210> 2 <211> 597 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human lipocalin-2 mRNA <400> 2 atgcccctag gtctcctgtg gctgggccta gccctgttgg gggctctgca tgcccaggcc 60 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 120 aacttccagg acaaccaatt ccaggggaag tggtatgtgg taggcctggc agggaatgca 180 attctcagag aagacaaaga cccgcaaaag atgtatgcca ccatctatga gctgaaagaa 240 gacaagagct acaatgtcac ctccgtcctg tttaggaaaa agaagtgtga ctactggatc 300 aggacttttg ttccaggttg ccagcccggc gagttcacgc tgggcaacat taagagttac 360 cctggattaa cgagttacct cgtccgagtg gtgagcacca actacaacca gcatgctatg 420 gtgttcttca agaaagtttc tcaaaacagg gagtacttca agatcaccct ctacgggaga 480 accaaggagc tgacttcgga actaaaggag aacttcatcc gcttctccaa atctctgggc 540 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggctga 597

Claims

리포칼린-2 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 혈관성 치매의 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 리포칼린-2 발현 수준 측정은 리포칼린-2 단백질 또는 리포칼린-2 코딩 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 제제는
(a) 리포칼린-2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머; 또는
(b) 리포칼린-2 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 리포칼린-2 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 리포칼린-2 mRNA는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
리포칼린-2 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 혈관성 치매 진단용 키트.
혈관성 치매의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피검체로부터 채취한 시료로부터 리포칼린-2 발현 수준을 정성 또는 정량분석하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 방법은
(a) 피검체의 시료로부터 리포칼린-2 발현 수준을 측정하는 단계;및
(b) 상기 리포칼린-2 발현 수준을 정상인과 비교하고, 정상인에 비해 리포칼린-2 발현 수준이 증가한 피검체를 혈관성 치매에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 또는 질분비물, 소변 및 뇌척수액으로 이루어진 군에서 선택되는 체액 시료인것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 리포칼린-2 발현 수준 측정은 리포칼린-2 단백질 또는 리포칼린-2 코딩 유전자 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트면역전기영동, 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 유전자 발현 수준 측정은 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(southern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 의한 것을 특징으로 하는 방법.