KR101771128B1 - 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 골질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 골질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명은 골 재형성(bone remodeling)에 관여하는 두가지 주요 세포인 파골세포 및 조골세포에서 CrkⅡ의 역할을 최초로 제시한다. 본 발명은 골 재형성에 관여하는 CrkⅡ의 활성 또는 발현을 억제시킴으로써 파골세포의 활성 및 발현을 억제시키고, 조골세포의 활성 및 발현을 촉진시켜 이중적 기능을 갖는다.

Description

골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical Composition for Preventing or Treating Bone Diseases}

본 발명은 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

대표적인 뼈 질환 중 하나인 골다공증은 노령화에 따른 골격대사 이상에 의해서 뼈의 절대량이 감소됨에 따라 나타나는 대표적인 대사질환의 하나이다. 골다공증은 골밀도 감소 및 골조직의 미세구조 파괴로 인하여 작은 충격에도 척추와 대퇴, 요골 등이 쉽게 골절되는 질환으로 심한 관절통증을 유발하고, 평생 불구로 만들기도 하며 이로 인해 사망에 이를 수 있는 매우 흔하고 치명적인 질환이다. 정상적인 뼈는 파골세포에 의해 매일 조금씩 흡수 분해되고, 조골세포에 의해 분해된 양만큼 새로운 뼈가 채워지는 ‘골재형성’과정을 통해 항상성이 유지된다. 그러나 고령화, 여성의 폐경 등과 같은 다양한 요인에 의해 조골세포에 의한 새로운 뼈 형성 보다 파골세포에 의한 뼈 흡수가 증가하게 되면 골다공증과 같은 뼈 질환이 유발 된다(Nature 2003; 15:423(6937):337-342., Annu Rev Immunol 2006; 24: 33-63.).

CrkⅡ는 어뎁터 단백질로 다양한 세포외 자극에 의해 활성화되어 세포내 신호전달에 관여한다. CrkⅡ는 하나의 SH2 도메인과 두 개의 SH3 도메인으로 구성된다. SH2 도메인은 팍실린(paxillin), Cas 및 c-Cbl 등과 같은 타이로신이 인산화된 단백질(tyrosine-phosphorylated proteins)과 결합하고 다른 어뎁터 단백질이나 타이로신 카이네이즈(tyrosine kinases) 등과 결합한다. SH3 도메인은 Ras-패밀리 GTPases를 활성화 시키는 DOCK180과 결합한다. 최근 CrkⅡ가 암세포 등의 이동성에 중요한 역할을 한다고 보고되었다(Mol Cancer Res 2005, 3; 183, Mol Cell Biol 1992, 12(8): 3482-3489., Cell Growth Differ 1992, 3(7): 451-460., Oncogene 2001, 20(44): 6348-6371., Genes Dev 1998, 12(21): 3331-3336.).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 골다공증을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있는 신규한 생체분자를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 CrkⅡ가 파골세포(osteoclast)의 골 분해를 촉진하고 조골세포(osteoblast)의 골 형성을 억제시킴에 따라 동물(예컨대, 사람, 마우스)의 세포 또는 조직에서 이의 억제를 통해 골다공증을 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다

따라서, 본 발명의 목적은 골질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 골질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 골질환 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 CrkⅡ 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 골다공증을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있는 신규한 생체분자를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 CrkⅡ가 파골세포(osteoclast)의 골 분해를 촉진하고 조골세포(osteoblast)의 골 형성을 억제시킴에 따라 동물(예컨대, 사람, 마우스)의 세포 또는 조직에서 이의 억제를 통해 골다공증을 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 확인하였다.

본 발명은 골 재형성(bone remodeling)에 관여하는 두가지 주요 세포인 파골세포 및 조골세포에서 CrkⅡ의 역할을 최초로 규명하였다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CrkⅡ 활성 억제제 또는 발현 억제제는 파골세포의 분화 또는 활성을 억제한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CrkⅡ 활성 억제제 또는 발현 억제제는 조골세포의 분화 또는 활성을 촉진시킨다.

상기 CrkⅡ 활성 억제제 또는 발현 억제제는 당업계의 공지된 다양한 생체분자를 적용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, 천연추출물 또는 화학물질을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 CrkⅡ 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열의 단편에 대한 siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), DNAzyme 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분으로서 서열목록 제2서열 내지 제9서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 siRNA를 포함한다.

상기 서열목록 제2서열은 CrkⅡ를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 서열목록 제1서열의 781번째 내지 799번째 뉴클레오타이드 서열이다. 상기 서열목록 제3서열은 서열목록 제2서열의 상보적인 서열이다. 상기 서열목록 제4서열은 서열목록 제1서열의 914번째 내지 93번째 뉴클레오타이드 서열이다. 상기 서열목록 제5서열은 서열목록 제4서열의 상보적인 서열이다. 상기 서열목록 제6서열은 서열목록 제1서열의 847번째 내지 865번째 뉴클레오타이드 서열이다. 상기 서열목록 제7서열은 서열목록 제6서열의 상보적인 서열이다. 상기 서열목록 제8서열은 서열목록 제1서열의 263번째 내지 281번째 서열이다. 상기 서열목록 제9서열은 서열목록 제8서열의 상보적인 서열이다.

본 발명에서 용어 “siRNA”는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다(Degot S, et al. 2002; Degot S, et al. 2004; Ballut L, et al. 2005).

본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(CrkⅡ mRNA 서열에 상응하는(corresponding) 서열)과 안티센스 가닥(CrkⅡ mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다.

또한, 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기, 그리고 가장 바람직하게는 20-30 염기이다.

siRNA 말단 구조는 CrkⅡ 유전자의 발현을 RNAi(RNA interference) 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.

본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA는 서열목록 제2서열 내지 제9서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 포함된 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 하기 실시예에서 입증된 바와 같이, siRNA는 파골세포의 분화 및 활성을 억제하고 조골세포의 분화 및 활성을 촉진시킴으로써 골질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 골질환은 골다공증, 뼈의 손상, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 또는 대사성골질환이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 골질환은 골다공증이다.

본 명세성서 용어 “골다공증”은 골질량의 감소와 구조적 이상으로 뼈가 약해져 부러지기 쉬운 상태가 되는 질환을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 국소 주입, 근육 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 골질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) CrkⅡ를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 처리하는 단계; 및

(b) 상기 CrkⅡ의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 분석하는 단계, 상기 시험물질이 CrkⅡ의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 억제시키면 골질환 치료제로 판단된다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 본 발명의 CrkⅡ을 발현하는 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 접촉시킨다. 본 발명의 CrkⅡ을 포함하는 세포는 CrkⅡ을 내인적으로(endogenous) 발현하는 세포 또는 일시적으로(transiently) CrkⅡ이 고발현된 세포를 포함하며, 이에 특별히 제한되지 않고, 가장 바람직하게는 골조직(osseous tissue) 유래 세포이다. 본 발명 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”은 본 발명의 CrkⅡ의 발현에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, 천연추출물 또는 화학물질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이어, 시험물질이 처리된 세포에서 본 발명의 CrkⅡ mRNA 또는 단백질의 발현량을 분석한다. 상기 시험물질이 CrkⅡ mRNA 또는 단백질의 발현량을 억제시키면 골질환 치료제로 판단된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 골질환은 골다공증, 뼈의 손상, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 또는 대사성골질환이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 골질환은 골다공증이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 골질환 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 CrkⅡ 단백질 또는 CrkⅡ 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 골질환 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 인체 또는 포유동물로부터 얻어지는 모든 시료, 예컨대, 골 조직 유래 세포, 오줌, 타액, 혈액, 혈장 또는 혈청 시료를 의미하며, 특별히 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 골조직(osseous tissue) 유래 세포이다.

본 발명의 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 골질환 상태의 동정, 골질환의 단계 결정 또는 치료에 대한 골질환의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명의 명세서에서 용어 “예후”는 질병의 진행 가능성 과정, 특히, 질병의 차도, 질병의 재생, 골질환 재발 측면에서의 예측을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서의 예후는 골질환 환자의 질병이 완치될 가능성을 의미한다.

본 발명의 골질환 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법은 면역분석 방식, 유전자 증폭 방식 또는 혼성화 방식에 의해 실시될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 면역분석(immunoassay) 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 골질환 마커(예컨대, CrkⅡ)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 골질환을 진단하는 데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역 형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시 예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 CrkⅡ에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트 (BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움 (NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트 (naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF (enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌 (비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS (2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민 (OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT (nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS (phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시 예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 마커에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료를 반응 시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, CrkⅡ 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed. Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에 는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 변형 예에 따르면, 항체 대신에 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646 (1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727 (1998) 에 상세하게 개시되어 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 골질환을 진단할 수 있다. 즉, 생물학적 시료에서 본 발명의 CrkⅡ 단백질이 고발현 되어 시그널이 정상 생물학적 시료(예컨대, 골조직 유래 세포 또는 조직, 혈액, 혈장 또는 혈청)보다 강하게 나오는 경우에는 골질환으로 진단된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 유전자 증폭 방식에 의해 실시될 수 있다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 골질환 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법이 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 골 조직 또는 세포, 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변)에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 mRNA 양을 조사하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 결정한다.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열 안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 생물학적 시료에서 본 발명 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현이 정상 시료(예컨대, 정상 골 세포 또는 조직, 혈액, 혈장 또는 혈청)보다 낮게 나오는 경우에는 골질환으로 진단된다.

따라서 본 발명의 골질환 마커의 검출 방법을 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적 으로 (ⅰ) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 마커는 골질환에서 고발현되는 생체 분자이다. 이러한 마커의 고발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “고발현”은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 높은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 마커가 정상세포 또는 조직과 비교하여 2-5배 정도 고발현 되는 경우, 본 발명에서의 “고발현”으로 판정하고 골질환이 발병 또는 발생했다고 판정한다.

본 발명의 골질환 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법은 혼성화 방식에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.

상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 골질환 여부를 판단할 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생물학적 시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있으며, 바람직하게는 골 조직세포에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.

예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에 서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약 (10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethyl benzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 골질환 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 골질환 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 골 조직 또는 세포)보다 강하게 나오는 경우에는 골질환으로 진단된다.

본 발명의 또다른 양태 따르면, 본 발명은 CrkⅡ에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 골질환 진단용 키트를 제공한다.

상기 골질환 진단용 키트는 ‘골질환의 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법’에서 기술한 ‘면역분석 방식’과 거의 유사하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 골질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 골질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 골 재형성(bone remodeling)에 관여하는 두가지 주요 세포인 파골세포 및 조골세포에서 CrkⅡ의 역할을 최초로 제시한다.

(c) 본 발명은 골 재형성에 관여하는 CrkⅡ의 활성 또는 발현을 억제시킴으로써 파골세포의 분화 및 활성을 억제시키고, 조골세포의 분화 및 활성을 촉진시켜 이중적 기능을 갖는다.

도 1은 CrkⅡ siRNA를 형질도입한 파골세포에서 세포 분화를 감소시키는 효과를 나타낸다.
도 2는 CrkⅡ siRNA를 형질도입한 파골세포에서 세포 활성을 감소시키는 효과를 나타낸다.
도 3은 CrkⅡ siRNA를 형질도입한 조골세포에서 세포 분화를 촉진시키는 효과를 나타낸다.
도 4는 CrkⅡ siRNA를 형질도입한 조골세포에서 골형성을 촉진시키는 효과를 나타낸다.
도 5는 CrkⅡ siRNA를 형질도입한 조골세포에서 세포 분화 및 활성 마커 유전자인 Runx2, ALP 및 BSP의 mRNA 발현 증가를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

파골세포 배양

6-8 주령의 ICR 마우스(수컷, 다물사이언스)로부터 골수성 전구세포를 분리하여 30 ng/㎖ M-CSF(Macrophage colony stimulating factor) 및 20-100 ng/㎖ RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)를 포함하는 α-MEM(Minimum Essential Medium alpha)로 3-4일 동안 배양하였다. 파골세포의 분화 정도를 확인하기 위해 tatrate-resistant acid phosphate(TRAP)로 염색하여 파골세포의 형성을 확인하고 현미경(Leica, Wetzlar, 독일) 하에서 파골세포의 수를 확인하였다. 파골세포 분화 후, TRAP 염색을 위하여 세포를 10% 포르말린으로 고정시키고 TRAP으로 10분 이상 염색하여 물로 세척 후 현미경 하에서 확인하였다. 핵이 3개 이상인 TRAP-양성 다핵(multinuclear) 세포(TRAP+ MNCs)를 세어서 파골세포 분화 정도를 평가하였다. 파골세포의 골 흡수 정도를 확인하기 위해서는 히드록시아파타이트(hydroxyapatite)-코팅 플레이트에 파골세포 전구세포를 배양하여 파골세포 분화를 유도하였다. 파골세포 분화 후 세포를 제거하고 골 흡수된 면을 현미경하에서 관찰하였다.

조골세포 배양

생후 1일령의 ICR 마우스(암컷, 수컷, 다물사이언스)의 두개골로부터 조골세포를 분리하여 100 ng/㎖ BMP2(Bone morphogenetic protein 2), 50 ㎍/㎖ 아스코르브산(ascorbic acid; AA) 및 100 mM β-글리세로인산염(β-glycerophosphate; β-GP)를 처리하여 3-6일 동안 배양하였다. 조골세포의 분화 및 활성도를 확인하기 위해 알칼리 인산염(Alkaline phosphate; ALP) 분석을 수행하거나 혹은 알리자린 레드(Alizarin red)로 염색하였다. ALP 분석을 위해서 조골세포 분화를 약 3일 정도 유도한 후 세포를 용해하였다. 비색적 인산효소 기질인 p-니트로페닐 인산염(p-Nitrophenyl phosphate; pNPP)을 첨가하고 10분 정도 반응 시킨 후, 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 알리자린 레드로 염색하기 위해 조골세포 분화를 약 6일 정도 유도하였다. 현미경으로 광물화 결절(mineralization nodule)이 관찰되면, 세포를 고정한 후 알리자린 레드 S로 염색하였다. 염색된 세포는 현미경으로 관찰 후 스캔닝하여 이미지를 저장한 후 염화세틸피리디늄(cetylpyridinium chloride; CPC)으로 염색된 알리자린 레드를 용해하고 반응물은 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

결과

CrkⅡ 타겟의 siRNA를 이용한 파골세포의 분화 및 활성 억제 효과 확인

파골세포 분화 억제 효과

M-CSF가 있을 때 RANKL는 파골세포 전구세포를 성숙한 파골세포로 분화시킨다. RANKL에 의한 파골세포 분화에 대하여 siRNA에 의한 CrkⅡ 발현 억제가 어떤 영향을 주는지 확인하였다. 마우스 CrkⅡ 유전자를 표적으로 하는 siRNA 올리고머를 이중 가닥[센스: 5‘-GGUGAGCUGGUAAAGGUUA-3’(서열목록 제2서열), 안티센스: 5‘-UAACCUUUACCAGCUCACC-3’(서열목록 제3서열), 센스: 5‘-GAGUAUAGCUCGACAGUUU-3’(서열목록 제4서열), 안티센스: 5‘-AAACUGUCGAGCUAUACUC-3’(서열목록 제5서열), 센스: 5‘-CGAGGUCACUUCCCAUUCA-3’(서열목록 제6서열), 안티센스: 5‘-UGAAUGGGAAGUGACCUCG-3’(서열목록 제7서열) 또는 센스: 5‘-GAAUAGGAGAUCAAGAAUU-3’(서열목록 제8서열), 안티센스: 5‘-AAUUCUUGAUCUCCUAUUC-3’(서열목록 제9서열)으로 디자인한 후 대조군인 CrkⅡ 비특이적 올리고머와 함께 바이오니아에서 제작 및 구입하였다. 파골세포 전구세포에 100 nM 대조군 올리고머 및 CrkⅡ siRNA를 각각 리포펙타민 RNAiMax 시약(invitrogen)와 상온에서 20분간 반응시킨 후 파골세포 전구세포에 형질도입 한 뒤 30 ng/㎖ M-CSF 및 50 ng/㎖ RANKL를 처리하여 10% 소태아혈청을 함유한 a-MEM 배지에서 3일 동안 배양하였다. 파골세포를 확인하고자 배양된 세포는 TRAP으로 염색한 후 현미경 하에서 TRAP에 양성인 세포 중 세개 이상의 핵을 가진 세포의 개수를 측정하였다. 그 결과 도 1에서와 같이 대조군 올리고머를 도입한 세포에 비해 CrkⅡ siRNA를 도입한 세포에서 파골세포의 수가 감소함을 알 수 있었다.

파골세포 활성 억제 효과

파골세포에 의한 골 흡수에 대하여 siRNA에 의한 CrkⅡ의 발현 억제가 어떤 영향을 주는지 확인하고자 히드록시아파타이트가 코팅된 플레이트(Coring)에서 파골세포 전구세포를 하루 동안 배양한 후 100 nM 대조군 올리고머 및 CrkⅡ siRNA를 각각 리포펙타민 RNAiMax 시약(invitrogen)을 이용하여 형질도입 하였다. 이 후, 파골세포 분화를 유도하기 위해 30 ng/㎖ M-CSF 및 50 ng/㎖ RANKL를 처리하여 10% 소태아혈청을 함유한 a-MEM 배지에서 3일 동안 배양하였다. 플레이트에서 세포를 깨끗이 제거한 후 파골세포에 의해 흡수된 부위를 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 도 2에서와 같이 대조군 올리고머를 도입한 세포에 비해 CrkⅡ siRNA를 도입한 세포에서 파골세포의 활성이 감소함을 알 수 있었다.

CrkⅡ 타겟의 siRNA를 이용한 조골세포의 분화 및 활성 촉진 효과 확인

조골세포 분화 촉진 효과

조골세포 분화에 siRNA에 의한 CrkⅡ 발현 억제가 어떤 영향을 주는지 확인하고자 ALP(Alkaline phosphatase) 활성도를 측정하였다. 조골세포에 100 nM 대조군 올리고머와 CrkⅡ siRNA를 각각 리포펙타민 RNAiMax 시약(invitrogen)을 이용하여 형질도입한 후 조골세포 분화 유도 배지[BMP2(100 ng/㎖), 아스코프브산(50 ㎍/㎖), β-글리세로인산염(100 mM) 및 10% 소태아혈청을 포함하는 α-MEM]에서 3일 동안 배양하였다. 3일 후 배지를 제거하고 세포에 조골세포 용해 버퍼[50 mM Tris-HCl(pH 7.4), 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA]를 웰 당 150 ㎕씩 첨가하여 20분 이상 반응시켰다. 첨가한 버퍼 일부를 회수한 후 p-니트로페닐 인산염 기질(Sigma-Aldrich)과 상온에서 10분 동안 반응 시킨 뒤에 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 도 3에서와 같이 대조군 올리고머를 도입한 세포에 비해 CrkⅡ siRNA를 도입한 세포에서 ALP 활성이 증가됨을 알 수 있었으며, 이는 조골세포에서 CrkⅡ의 발현 억제가 조골세포 분화를 촉진시킴을 시사한다.

조골세포 활성 촉진 효과

조골세포 활성에 siRNA에 의한 CrkⅡ 발현 억제가 어떤 영향을 주는지 확인하고자 석회화 결절 형성 정도를 측정하였다. 조골세포에 대조군 올리고머와 CrkⅡ siRNA를 각각 리포펙타민 RNAiMax 시약(invitrogen)을 이용하여 형질도입한 후 조골세포 분화 유도 배지[BMP2(100 ng/㎖), 아스코르브산(50 ㎍/㎖), β-글리세로인산염(100 mM) 및 10% 소태아혈청을 포함하는 α-MEM]에서 6일 동안 배양하였다. 처음 조골세포 분화 유도 배지를 첨가한 날을 ‘0일’로 하여 3일 후 배지를 한번 교체해 주었다. 6일 후 배지를 제거한 후 70% 에탄올 용액으로 1시간 동안 고정 시킨 후 40 mM 알리자린 레드(pH 4.2)로 10분 동안 염색하고 증류수로 세척하였다. 석회화 결절 형성 정도를 측정하고자 이미지를 스캔한 후 알리자린 레드 용액 분석을 위하여 10% 세틸피리디늄(Sigma) 용액으로 용해한 후 추출된 용액의 흡광도를 562 ㎚에서 측정하였다. 그 결과 도 4에서와 같이 대조군 올리고머를 도입한 세포에 비해 CrkⅡ siRNA를 도입한 세포에서 석회화 결절 형성이 증가됨을 알 수 있었으며, 이는 조골세포에서 CrkⅡ의 발현 억제가 조골세포의 골 형성을 촉진시킴을 시사한다.

조골세포 분화 관련 유전자의 발현 증가 확인

조골세포 분화 및 활성에 관여하는 유전자들의 발현에 siRNA에 의한 CrkⅡ 발현 억제가 어떤 영향을 주는지 확인하였다. 조골세포에 대조군 올리고머와 CrkⅡ siRNA를 각각 리포펙타민 RNAiMax 시약(invitrogen)을 이용하여 형질도입한 후 조골세포 분화 유도 배지[BMP2 (100 ng/㎖), 아스코르브산(50 ㎍/㎖), β-글리세로인산염(100 mM) 및 10% 소태아혈청을 포함하는 α-MEM]에서 6일 동안 배양하였다. 처음 조골세포 분화 유도 배지를 첨가한 날을 ‘0일’로 하여 3일 후 배지를 한번 교체해 주었다. 6일 후 배지를 제거하고 배양된 세포에 Qiazol(Qiagen)을 처리하여 세포를 용해하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Superscript II 역전사효소(Life Technologies)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 정량적 실시간 PCR은 SYBR 혼합물(Qiagen)을 이용하여 수행하였고, 상대적인 mRNA 발현량은 내부 표준 유전자인 GAPDH를 이용하여 보정 및 계산하였다. 그 결과 도 5에서와 같이 대조군 올리고머를 도입한 세포에 비해 CrkⅡ siRNA를 도입한 세포에서 조골세포의 분화 또는 활성 마커 유전자인 Runx2, ALP, BSP의 mRNA 발현이 증가됨을 확인하였다.

PCR은 Rotor-Gene Q real-time PCR cycler를 이용하여 94도 10분 (94도 15초, 58도 20초, 72도 30초)로 40 싸이클 수행하였다. 이용된 프라이머의 서열은 표 1과 같다.

유전자	서열
RunX2	정방향	5’-CCC AGC CAC CTT TAC CTA CA-3’
	역방향	5’-CAG CGT CAA CAC CAT CAT TC-3’
ALP	정방향	5’-CAA GGA TAT CGA CGT GAT CAT G-3’
	역방향	5’-GTC AGT CAG GTT GTT CCG ATT C-3’
BSP	정방향	5’-GGA AGA GGA GAC TTC AAA CGA AG-3’
	역방향	5’-CAT CCA CTT CTG CTT CTT CGT TC-3’
GAPDH	정방향	5’-TGA CCA CAG TCC ATG CCA TCA CTG-3’
	역방향	5’-CAG GAG ACA ACC TGG TCC TCA GTG-3’

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Pharmaceutical Composition for Preventing or Treating Bone Diseases <130> PN150584 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 915 <212> DNA <213> Mus musculus v-crk sarcoma virus CT10 oncogene homolog (avian) (Crk), transcript variant 2 <400> 1 atggcgggca acttcgactc ggaggagcgg agtagctggt actggggccg cctgagccgg 60 caggaggcgg tggcgctatt gcagggccag cggcacgggg tgttcctggt gcgggactcg 120 agcaccagcc ccggggacta tgtgcttagc gtctccgaaa actcgcgcgt ctcccactac 180 atcatcaaca gcagcggccc gcgccctcca gtgcctccgt cgcccgctca gcctccgccg 240 ggagtgagtc cctccaggct ccgaatagga gatcaagaat ttgattcatt gcctgcttta 300 ctggaattct acaaaataca ctatttggac actacaacat tgatagaacc agtggccaga 360 tcaaggcagg gtagtggagt gattctcagg caggaggagg cagagtatgt gcgggccctc 420 tttgacttta atgggaatga tgaagaagat cttcccttta agaaaggaga catcctgaga 480 atccgggata agcctgaaga gcagtggtgg aatgcagagg acagcgaagg aaagaggggg 540 atgattcctg tcccttacgt ggagaagtat agacctgcct ccgcctcagt atcggctctg 600 attggaggta accaggaggg ttcccaccca cagccactgg gtgggccgga gcctgggccc 660 tatgcccaac ccagcgtcaa cactccgctc cctaacctcc agaatgggcc catttatgcc 720 agggttatcc agaagcgagt ccctaatgcc tacgacaaga cagccttggc tttggaggtc 780 ggtgagctgg taaaggttac gaagattaat gtgagtggtc agtgggaagg ggagtgtaat 840 ggcaaacgag gtcacttccc attcacacat gtccgtctgc tggatcaaca gaatcccgat 900 gaggacttca gctga 915 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against CrkII <400> 2 ggugagcugg uaaagguua 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against CrkII <400> 3 uaaccuuuac cagcucacc 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against CrkII <400> 4 gaguauagcu cgacaguuu 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against CrkII <400> 5 aaacugucga gcuauacuc 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against CrkII <400> 6 cgaggucacu ucccauuca 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against CrkII <400> 7 ugaaugggaa gugaccucg 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against CrkII <400> 8 gaauaggaga ucaagaauu 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA against CrkII <400> 9 aauucuugau cuccuauuc 19

Claims (13)

1. CrkⅡ의 발현 억제제로서, CrkⅡ의 발현을 억제하는 siRNA, shRNA, miRNA, PNA(peptide nucleic acids) 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 CrkⅡ 발현 억제제는 파골세포의 분화 또는 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 CrkⅡ 발현 억제제는 조골세포의 분화 또는 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 삭제
5. 제 1 항에 있어서, 상기 siRNA은 서열목록 제2서열 내지 제9서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 골질환은 골다공증, 뼈의 손상, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 또는 대사성골질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 다음의 단계를 포함하는 골질환 치료제의 스크리닝 방법:
   (a) CrkⅡ를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 처리하는 단계; 및
   (b) 상기 CrkⅡ의 mRNA의 발현량을 분석하는 단계, 상기 시험물질이 CrkⅡ의 mRNA의 발현량을 억제시키면 골질환 치료제로 판단된다.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 세포는 동물의 골조직(osseous tissue)으로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
   
9. 제 7 항에 있어서, 상기 골질환은 골다공증, 뼈의 손상, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 또는 대사성골질환인 것을 특징으로 하는 방법.
   
10. 골질환 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 분리된 생물학적 시료에 있는 CrkⅡ의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 방법을 통해 골질환 진단 또는 예후 분석 마커를 검출하는 방법.
    
11. 제 10 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 골조직(osseous tissue) 유래 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
    
12. 삭제
13. 삭제

Images