KR20070084099A

KR20070084099A - 수지 상 펩티드 고리화

Info

Publication number: KR20070084099A
Application number: KR1020077010506A
Authority: KR
Inventors: 스테판 바라이; 올레크 베르비츠키; 토마스 차이터
Original assignee: 론자 아게
Priority date: 2004-10-19
Filing date: 2005-10-18
Publication date: 2007-08-24
Also published as: JP2008517016A; KR20120088855A; ATE455123T1; KR101276463B1; AU2005298991B2; PT1805203E; EP1805203A2; TW200628487A; CN101111510B; WO2006045483A3; JP4927746B2; KR101222774B1; ES2339791T3; DK1805203T3; EP1805203B1; WO2006045483A2; AU2005298991A1; US20080200647A1; US7994280B2; IL182575A0

Abstract

하기 화학식 I 의 신규 화합물이 고안된다.

[화학식 I]

Description

수지 상 펩티드 고리화{ON-RESIN PEPTIDE CYCLIZATION}

본 발명은 고체상 펩티드 합성(solid phase peptide synthesis: SPPS) 에 있어서 디술피드-결합 형성 방법에 관한 것이다.

시스테인 잔기의 보호화를 위해서 매우 다양한 보호기가 사용될 수 있는데, 예컨대 트리틸, 아세트아미도메틸-, t-부틸, 트리메틸아세트아미도메틸, 2,4,6-트리메톡시벤질, 메톡시트리틸, t-부틸술페닐이 있다.

가장 일반적으로는, 트리틸기가 펩티드 합성 동안 표준 시스테인 측쇄 보호화에 사용된다. 후속적으로 시스틴으로 고리화되는 시스테인을 보호화하기 위해, 요오드 산화와 함께 아세트아미도메틸 (acm)- 보호기가 가장 광범위하게 사용되어 왔다 (Kamber 등, 1980, Helv. Chim. Acta 63, 899-915; Rietman 등, 1994, Int. J. Peptide Protein Res. 44, 199-206).

요오드 이외의 다수의 산화제가 액상 고리화에서 시스틴 형성을 위한 것으로 기재되어 있다 (Albericio 등의 문헌 [Chan 및 White, eds 'FMOC Solid-phase Peptide Synthesis', Oxford university Press 2000, p. 91 ~ 114]에서 도출한 예: 수성 완충액 내 글루타티온, DMSO, 포타슘 페리시아나이드, Ellman 시약인 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산), 요오드, 탈륨(III)트리플루오로아세테이트, 알킬트 리클로로실란-술폭시드, 강산성 매질 중에서의 실버 트리플루오로메탄술포네이트-DMSO 매개 산화).

통상적으로, 모든 이러한 방법은 바람직스럽지 않은 다수인 부생성물을 초래하고, 최적의 수율을 수득하기 위해서는 10 내지 20 시간 범위의 장시간의 반응 시간을 요구한다.

Volkmer-Engert 등 (J. Peptide Res. 51, 1998, 365-369) 에는, 수성 용매에 용해시킨 산소를 이용한 디술피드 결합의 차콜(charcoal)-촉매된 산화 형성이 기재되어 있다. 주의깊게 제어한 결과, 수성 매질에 물리적으로 용해된 산소 풀(pool)이 필수적이며 이는 산화에 있어서 차콜에 산소를 적재하기에 충분한 것으로 입증되었다. 촉매 부재하에서 전통적인 공기-분사(air-sparging)와 비교시, 차콜을 이용하는 것은 반응 속도가 급격히 가속화된다.

차콜을 이용하는 경우에는 불가피하게도 수지 상에서가 아닌 균질액 중에서 상기와 같은 반응을 수행해야 한다; 탈보호화의 후속 반응 단계에서는 계속되는 차콜의 존재가 용인되지 않을 것이나, 이를 펩티드-수지 고체상으로부터 제거하는 것은 불가능하다.

WO 03/093302 에는, 고체상으로부터의 방출 후 용액 중에 펩티드를 함유하는 트립토판의 고리화에 대해 기재되어 있다. 펩티드는 C-말단 시스테이닐-카르복사미드를 가지며, 이의 측쇄 티올 관능기는 비보호화되고, 또한 상기 펩티드는 3-술프히드릴-프로피온아미드 또는 3,3'-디티오-(1-카르복시-프로필) 프로피온아미드 부분 둘 중 하나로 N-말단 유도체화된다. 시스테인 아미드 측쇄의 보호화 및/또는 탈보호화는 상기 시스테인 측쇄의 티오에스테르 결합을 통한 수지 상에서의 펩티드 측쇄 고정에 의해 필요 이상이 된다. 디티오-프로피오네이트로의 N-말단 유도체화는 수지로부터의 절단 전에 발생한다. 고리화는 수지로부터의 절단 후에 발생하며, 이는 용액 중에서이고, 시스테인 및 티오-프로피온아미드 부분 사이의 디술피드 다리결합 형성에 의한 것이다. 고체 지지체로부터의 절단 및 전체적인 탈보호화는 티오프로피오닐 관능을 제외하고는 고리화 이전에 있어서 이 전략에 있어서 필수적이다.

절단 및 전체적인 탈보호화 동안에 티오-프로피온아미드 부분을 유지하는 점에 있어서 최대한도로 주의해야 하는 점이 단점이다. Atherton 등(1985, J. Chem. Perkin Trans. I., 2065) 은, 수지로부터 절단하는데 있어서 스캐빈저(scavenger) 및 산분해 촉진제의 이중 기능을 가진 티오아니솔을 대중적으로 사용하는 것 또한 acm, tert-부틸 및 tert-부틸술페닐 보호화된 시스테인의 부분적인 조기 탈보호화를 야기시킨다는 것을 보고했다. 종합적인 합성 경로는 복잡하며, 이러한 방식으로 수득될 수 있는 수율에 악영향을 끼치는 다수의 단계가 포함되어 있다. 고리화는 이량체화(dimersation) 을 방지하기 위해서 고 희석액 중에서 실시되어야 한다. 수득된 수량의 명확한 지시는 실질적으로는 본 명세서에 나타내지 않았다.

본 발명의 목적은 고체상 합성을 이용하여 디술피드 결합된 고리형 펩티드를 합성하는 보다 손쉽고 간단한, 다른 또는 향상된 방법을 고안하는 것이다. 상기 목적은, 본 발명에 따른 하기 단계를 포함하는 펩티드 합성 방법에 의해 해결된다:

a. 고체상에 연결된 펩티드를 합성하는 단계로, 상기 펩티드는 하나 이상의 시스테인, 호모- 또는 노르-시스테인 잔기를 포함하며, 상기 시스테인은 그의 측쇄에 S-tert.부틸-술페닐기에 의해 보호화되는 단계,

b. 그의 Nα 상에 3,3'-디티오-(1-카르복시-프로필)-프로피오닐-라디칼을 가진 N-말단 추가 아미노산을 커플링하거나 또는 임의로는 N-말단 아미노산의 Nα를 탈보호화하고 자유 Nα를 3,3'-디티오-프로피온산 이미드와 반응시켜 상응하는 Nα-3,3'-디티오-(1-카르복시-프로필)-프로피온아미드를 수득하거나, 또는 N-말단 아미노산의 Nα를 탈보호화하고 자유 Nα를 하기 화학식 IV 의 화합물과 반응시키는 단계:

R₇-S-S-[CH2]₂-COOH IV

[식 중, R7 은 이종핵 아릴- 을 포함하는 아릴- 이거나, 또는 아르알킬-, 알킬아릴- 또는 알킬- 로 추가로 할로게노, 아미도, 에스테르 및/또는 에테르로 치환될 수 있다],

c. 상기 펩티드를 S-tert.부틸-술페닐-보호기 제거 시약과 추가로 반응시키는 단계로, 바람직하게는 상기 펩티드를 치환 또는 비치환된 트리스페닐- 또는 트리스알킬포스핀과 반응시키는 단계, 및

d. 공기 및/또는 산소의 존재하에서, Nα 상의 시스테인 및 3-티오-프로피온아미드 부분 사이에서 정식으로 디술피드 결합 형성을 이용해 상기 펩티드를 고리화하는 단계.

본 발명에 따른 펩티드는 천연 또는 비천연 아미노산, 예컨대 호모시스테인, 호모아르기닌, D-시클로헥실-알라닌, 페니실린아미드 (Pen) 또는 오르니틴 (Orn) 을 포함하는 임의의 펩티드일 수 있다. 펩티드 골격 또는 주쇄, 측쇄 및 접두사 '노르-' '호모-'라는 용어들은 본 발명의 맥락에서 IUPAC-IUB 정의 (Joint IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, 'Nomenclature and symbolism for amino acids and Peptides', Pure Appl . Chem ., 56, 595-624 (1984)) 에 따라 해석된다. 보다 좁고 바람직한 의미로서, '호모-' 는 측쇄 부분에 단 하나의 여분의 메틸렌 다리 원자단에 해당된다.

특히 고리화 반응에 참여하지 않고 상기 반응 동안에 보호화된 채로 잔류하도록 의도된 상기 펩티드 서열에 포함된 추가적인 시스테인, 호모- 또는 노르-시스테인 잔기를 언급할 때, 추가적인 측쇄 보호화에 특별히 유의해야 한다. 바람직하게는, 이와 같은 추가적인 술프히드릴-부분 포함 잔기들은 비(non)-트리알킬포스핀민감성 보호기로 보호화되며, 더욱 바람직하게는, 상기 비-민감성 술프히드릴보호기는 트리틸-, tert-부틸-, 아세트아미도메틸-, 알킬화 아세트아미도메틸-, 알킬화 트리틸- 보호기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일반적인 수준에서, 당업계에서 흔히 이용되는 측쇄 보호기 (예컨대 하기 Bodansky, M., Principles of Peptide Synthesis, s, 참조) 는 커플링 및 탈보호화 사이클에서 다르게 변형될 수 있는 취약한(susceptible) 측쇄들을 보호하는데 사용될 수 있다. 취약한 측쇄를 가진 아미노산의 예는, Cys, Asp, Glu, Ser, Arg, 호모-Arg(Har), Tyr, Thr, Lys, Orn, Pen, Trp, Asn 및 Gln 이다. 대안적으로, 목적하는 측쇄를 수득하기 위해서 펩티드 아미드의 고체상 합성 후 화학적 변형을 수행할 수도 있다. 예를 들어, 상이한 참조문헌들에서 상세히 개시된 바(EP-301 850; Yajima 등, 1978, J. Chem. Cos. Chem. Commun., p.482; Nishimura 등, 1976, Chem. Pharm. Bull. 24:1568), 펩티드 사슬 내에 포함된 리신 잔기의 구아니딘화 (guanidation) 에 의해 호모아르기닌 (Har) 을 제조하거나 또는 펩티드 사슬 내에 포함된 오르니틴 잔기의 구아니딘화에 의해 아르기닌을 제조할 수 있으나, 이는 덜 바람직하고, 더욱 고된 선택사항일 때에만 선택된다. 특히, 예컨대 Har 의 커플링에는 장시간의 커플링 시간 및 커플링 시약의 보충이 요구된다. 본 발명에 따르면, 바람직하게는 Arg 또는 Har 가 각각 FMOC-Arg 및 FMOC-Har 로서 사용될 때 측쇄 보호기를 사용하지 않고 이들을 커플링하는 것이 한 가지 바람직한 구현예이다. 이는, 개별 Arg 또는 Har 잔기의 커플링 후, 임의의 추가적인 커플링 반응 전에 구아니디노 부분이 정량적으로 양성자화되고 유기 용매 중에서 양성자 공여체와 안정한 이온 쌍을 형성하는 것을 확실히 함으로써 성취될 수 있다. 이는 하기 실험 섹션에서 한 바람직한 구현예로 더욱 상세히 기술되는 바와 같이 바람직하게는 수지 결합된 펩티드 아미드를 과량의 산성 커플링 보조 BtOH 등으로 처리함으로써 성취된다. 구아니디늄기의 전하를 스캐빈징하는 또 다른 예는 US 4,954,616 에 개시된 바와 같이 합성을 위해 Fmoc-보호화된 HAR 의 테트라페닐 보레이트 염을 사용하는 것이다.

본 발명에 따른 펩티드의 바람직한 구현예에서, 각 아미노산 측쇄에 대한 적합한 보호기의 예는 하기이다:

바람직하게는, 아르기닌 측쇄는 임의로는 합성 동안에 예를 들어, 토실, 벤질옥시카르보닐, 펜타메틸렌클로만술포닐 (Pmc), 펜타메틸디히드로벤조푸란술포닐 (Pbf), 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐 (Mtr) 및 그의 4-tbu-2,3,5,6-테트라메틸 동족체 (tart), 아다만틸옥시카르보닐 또는 Boc 로 공유결합되어 보호화될 수 있다. Pmc, Pbf, Mtr 또는 Tart 는 Arg 보호화하는데 있어서 매우 바람직하며, 가장 바람직하게는 Pbf 이다.

Trp 는 합성 동안 바람직하게 Boc 로 보호화될 수 있다. 임의로는, 이는 포르밀 또는 sym-메시틸렌-술포닐로 N-보호화될 수 있다.

측쇄 카르복시기의 에스테르화에 의한 적합한 카르복실산 측쇄 보호기는 예를 들어 아다만틸, tert.부틸, 알릴, 벤질 (Z)이고, 카르복시기가 tert.부틸 에스테르로 변환됨으로써 보호화되는 것이 바람직하다. 익히 공지된 바와 같이 언급된 보호기의 제거가 상이한 탈보호화 화학 작용을 요구할 수 있다는 점은 말할 나위도 없다 (하기 Bodansky, M., 참조).

고체상 지지체 또는 수지는, 고체상 합성에서 사용하기에 적당한 당업계에 공지된 임의의 지지체일 수 있다. 고체상에 대한 이러한 정의는 펩티드가 관능성 링커(linker) 또는 핸들 (handle) 기를 통해 고체상 또는 수지에 결합 또는 연결되는 것을 포함하며, 상기 링커는 본 문맥에서 '고체상'을 언급하는 경우에 함 축된다. 고체상의 예에는 예를 들어, p-메틸벤질-히드릴아민으로 추가로 관능화될 수 있는 폴리스티렌 지지체, 또는 강성(rigid) 관능화된 지지체, 예컨대 Kieselgur-캡슐화 폴리디메틸아크릴아미드(펩신 K; pepsyn K), 실리카 또는 제어 다공성 글라스(controlled pore glass) 이다. 고체상의 수지 매트릭스는 또한 친양쪽성(amphiphilic) 폴리스티렌-PEG 수지(예를 들어, Tentagel, US4908405 참조) 또는 PEG-폴리아미드 또는 PEG 폴리에스테르 수지로 구성될 수도 있으며, 예를 들어, 문헌 [Kempe 등, J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7083; 또한 cp. US5,910,554, US2003078372 A1]에 나타나 있다. 상기 혼합된 PEG 수지 상에 수득된 생성물의 순도는 전통 수지 상에서보다 더 우수하나, 수지 하중은 통상적으로 덜 효율적이고/이거나 특히 산성 매질에서 화학 안정성이 종종 만족스럽지 않다. 폴리스티렌-PEG 수지는 고 하중에 이르지만, PEG 함량이 감소되므로 더 낮은 친양쪽성이 획득된다.

바람직하게는, 고체 지지체는 폴리스티렌, PEG, 예컨대 예를 들어 특히 양쪽성 PS-PEG 또는 폴리디메틸아크릴아미드 중합체 매트릭스 또는 수지를 기재로 한 것이다.

본 발명에 의하면, 펩티드는 아미노산 측쇄, 전형적으로는 상기 아미노산이 본 발명에 따른 바로 그 하나의 S-tBu-술페닐-보호화된 시스테인 잔기이지 않는 한, C-말단 아미노산의 측쇄를 통해 결합될 수 있거나, 또는 에스테르, 티오에스테르 또는 아미드 결합에 의해 수지로 C-말단 α-카르복시기를 통해 결합될 수 있다. 그 예에는 예를 들어 아미노-메틸, 카르복실 또는 브로모메틸 또는 요오도메틸 라디칼을 가진 고체 지지체, 또는 공지된 링커 또는 핸들, 예컨대 Wang, 트리틸, 2-클로로-트리틸-, 4-메톡시트리틸-, 'Rink 아미드' 4-(2',4'-디메톡시벤질-아미노메틸)-페녹시-, Sieber 수지 (9-아미노-6-페닐메톡시-잔텐-), 4-히드록시메틸페녹시아세틸-, 또는 4-히드록시메틸벤조산[후자는 p-디메틸아미노피리딘-촉매된 에스테르화 프로토콜에 의해 첫번째 아미노산을 결합시키는 것을 필요로 하며, 이는 취약한 아미노산, 예컨대 Trp 및 특히 시스테인의 라세미화를 야기할 수 있음, 문헌 (Atherton, E. 등, 1981, J. Chem. Soc. Chem. Coramun., p.336 ff) 참조] 링커로 유도된 상기 지지체가 있다. 수지에 티오에스테르 연결을 제공하는 방법은 WO 04/050686 에 상세히 개시되어 있고 추가로 참조되어 있다. 본 발명의 바람직한 한 구현예에서, 펩티드 부분을 고체상에 결합하기 위한 티오에스테르 연결은 20% 피페리딘에 취약하고 또한 트리스페닐포스핀과 같은 친핵성으로의 처리에 취약하므로 청구권을 포기하였다.

Rink 아미드, Sieber 수지 (Tetrahedron Lett. 1987, 28, 2107-2110) 또는 유사한 9-아미노-잔테닐형 수지, PAL 수지 (Albericio 등, 1987, Int. J. Pept. Protein Research 30, 206-216) 또는 문헌 [Meisenbach 등, 1997, Chem. Letters, p. 1265 f.] 에 따른 특별히 치환된 트리틸-아민 유도체는, Cα-카르복스아미드가 수지 또는 고체상으로부터 펩티드의 절단시에 생성 또는 유리되는 링커 또는 핸들의 예이다. 상기 아미드 링커를 사용하는 것은 실시되는 고체상 합성의 유형, 즉 전통적인 Boc 또는 현재는 관례가 된 커플링에 사용되는 직교 Fmoc 보호화 화학작용에 의존적인 것은 물론 말할 필요도 없다; 예를 들어, Boc-특이적 아미드 수지 링커는 PAM 이다. 따라서, 상기 링커기를 포함하는 고체상은 본 문맥에서 '아미드-생성 고체상'으로 지칭된다.

바람직하게는, 펩티드는 C-말단을 통한 아미드 또는 에스테르 결합에 의해 고체상에 고정된다. 더욱 바람직하게는, 상기 고체상은 고체상으로부터 펩티딜 부분의 절단에 있어서, 산-민감성 또는 산 불안정성 고체상이고, 보다 더욱 바람직하게는, 이는 아미드 생성 산 불안정성 고체상이다. 이러한 산 불안정성 고체상은 수지로부터의 절단에 있어서 극성의 비양성자성 용매 중의 0.1% 이상의 트리플루오로아세트산 (TFA), 더욱 바람직하게는 0.5% 이상의 TFA 를 요구한다. 가장 바람직하게는, 상기 고체상은 약산성 조건하에서 절단되는 산-민감성 고체상인데, 즉 상기 용매 중의 0.1 내지 10% TFA 는 실온에서 5 시간 이하 인큐베이션시에 90% 이상의 절단 효율을 달성하기에 충분하다. 이러한 고도의 산 불안정성 고체상은 예를 들면 2-클로로트리틸 수지, Sieber 수지, PAL 수지 또는 4-(4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시)-부티르산 (HMPB) 수지이고, 여기서 Sieber 및 Rink 는 산분해시 C-말단 아미드화 펩티드를 생성한다. 이러한 산 불안정성 고체상은 측쇄 보호기에 대한 수지 상 탈보호화 화학 작용에 특히 취약하며, 따라서 이러한 경우 특별한 주의를 기울여야 한다.

고체 지지체의 핸들 기에 C-말단 시스테인 잔기를 통한 측쇄 고정의 경우, 상기 연결 결합은 티오에테르 또는 티오에스테르 결합이어야 한다. 측쇄 고정을 위한 또 다른 적당한 잔기는, 산성 측쇄의 카르복시기, 히드록시기 및 특히 리신의 ε-아미노기이다. 측쇄 고정의 경우, 통상적으로 C-말단 유리 카르복시 기를, 예컨대 측쇄 아미노 관능기의 고체상에의 연결 반응을 위해서 FMOC-Lys-카르복스아미드를 사용하는 등 첫번째 커플링 반응 수행 전에 에스테르화 또는 아미드화로 보호화하여야 하는 것은 물론이다.

바람직한 구현예에서, S-tert-부틸-술페닐 보호화된 시스테인은 상기 펩티드의 C-말단 잔기이고, 이는 카르복시-말단을 통해 에스테르 또는 아미드 결합에 의해 상기 고체상에 결합되고, 단, 상기 연결 결합은 벤질에스테르 부분이 아니고, 바람직하게는 상기 정의된 약산성 반응 조건하에서 절단되는 산 불안정성 수지이다. C-말단 시스테인은 특히 산성 조건에서 라세미화되기 쉬운 경향이 있다.

3차 포스핀과의 반응에 의해 수행되는, 시스테인으로부터의 S-tert-부틸-술페닐 보호기의 제거가 기재되어 있는데, 이는 예를 들어 트리부틸포스핀 (Atherton 등, 1985, J. Chem. Soc, Perkin I. 2057) 및 트리에틸포스핀 (Huang 등, 1997, Int. J. Pept. Protein Res. 48, 290) 을 사용함에 의한 것이다. 동일한 탈보호화 단계가 본 발명에 의하면 사용되어 Nα-3,3'-디티오-(1-카르복시-프로필)-프로피온아미드, 메틸렌기 개수가 상이한 이의 동족체 또는 화학식 IV 의 화합물의 디술피드 결합을 절단시킨다. tert-부틸술페닐기는 예컨대 β-메르캅토-에탄올 또는 디티오-트레이톨 (DTT) 또는 3차 포스핀 등의 티올 시약에 의해 가장 흔하게 절단된다 (Huang 등,1997 Int. J. Pept. Protein Res. 48, 290; Rietmann 등, 1985, Recl. Trav. Chim. Pays-Bas, 1141). 바람직하게는, 3차 포스핀은 트리페닐포스핀 또는 알킬화 또는 알콕시화 트리페닐포스핀, 예컨대 트리-(p-메톡시페닐)-포스핀, 또는 보다 더욱 바람직하게는 트리알킬포스핀이고, 이 때 알킬은 상동 또는 상이할 수 있고, 각 알킬은 C1 내지 C7 알킬, 바람직하게는 C1 내지 C4 알킬이고, 분지형 또는 선형 알킬일 수 있다. 바람직하게는, 상기 알킬은 선형이다. 예로서, 메틸, 에틸, 프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸이 있다. 트리-n-부틸-포스핀 및 트리-에틸포스핀이 특히 바람직하다. 상기 알킬은 임의로는 할로게노, 메톡시 또는 에톡시로 추가로 치환될 수 있고, 또는 호의적인 경우 용매 시스템인 카르복시로 추가로 치환될 수 있고, 또는, 바람직하게는, 비치환이다. 놀랍게도, 본 발명에 따르면, 포스핀을 이용한 디술피드 절단이 또한 약산성 반응 조건에서 절단될 수 있는 산 불안정성 수지, 예를 들어 Sieber 또는 2-CTC 수지 등에 대하여 사용될 수 있음이 예상치 못하게 발견되었다. 티올 시약 자체가 디술피드 생성물을 형성함으로써 디술피드를 환원 및 따라서 절단하는 것이 종종 간과된다. DTT 의 경우, 분자내 고리 폐쇄가 촉진되는 반면에, β-메르캅토에탄올의 경우에는, 예를 들어 디술피드 교환 반응에 의한 임의의 분자간 반응 생성물이 생길 가능성이 있다. 또한, 새로이 형성된 디술피드 조차도 추가적인 교환 반응을 거칠 수 있다. 티올 시약을 광범위하게 사용할 경우, 3차 포스핀 시약 사용시에 수지로부터의 누출 (leakage) 등의 부반응이 일어날 우려가 명백히 있다.

펩티드 합성용 커플링 시약은 당업계에 익히 공지되어 있다(하기 참조: Bodansky, M., Principles of Peptide Synthesis, 제2판 Springer Verlag Berlin/Heidelberg, 1993; 상기 문헌 내의 커플링 첨가제 또는 보조제의 역할에 대한 논의 참조). 커플링 시약은 혼합 무수물 (예컨대 T3P: 프로판 포스폰 산 무수물) 또는 기타 아실화제, 예컨대 활성화 에스테르 또는 산 할로겐화물 (예컨대 ICBF, 이소부틸-클로로포르메이트) 일 수 있고, 또는 이들은 카르보디이미드 (예컨대 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드), 활성화 벤조트리아진-유도체 (DEPBT: 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온) 또는 벤조트리아졸의 우로늄 (uronium) 또는 포스포늄 염 유도체일 수 있다.

최상의 수율, 짧은 반응 시간 및 사슬 신장 동안의 라세미화에 대항한 보호화의 관점에서, 반응을 염기의 존재하에서 수행함과 함께 커플링 시약을 유리 카르복실산 관능기를 활성화할 수 있는 벤조트리아졸의 우로늄 염 및 포스포늄 염으로 이루어진 군에서 선택하는 것이 더욱 바람직하다. 이러한 우로늄 또는 포스포늄 커플링 염의 적당하고 이와 유사한 바람직한 예는 예컨대 HBTU (O-1H-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), BOP (벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트), PyBOP (벤조트리아졸-1-일-옥시-트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트), PyAOP, HCTU (O-(1H-6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), TCTU (O-1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트), HATU (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), TATU (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트), TOTU (O-[시아노(에톡시카르보닐)메틸렌아미노]-N,N,N',N"-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트), HAPyU (O-(벤조트리아졸-1-일)옥시비스-(피롤리디노)-우로늄 헥사플루오로포스페이트이 다.

바람직하게는, DEPBT 또는 그런 종류의 다른 것, 우로늄 또는 포스포늄 염 시약을 사용하는 경우, 상기 커플링 단계를 수행함에 있어서 추가적인 또는 제 2 의 약염기 시약이 필요하다. 펩티드 또는 아미노산 또는 아미노산 유도체의 α-아미노 관능기를 제외한 콘쥬게이션된 산의 pKa 값이 pKa 7.5 내지 15, 더욱 바람직하게는 pKa 7.5 내지 10 인 염기가 이에 부합되며, 상기 염기는 바람직하게는 3차의 입체 장애(hindered) 아민이다. 이와 같으며 추가적인 바람직한 예는 Hunig-염기 (N,N-디이소프로필에틸아민), N,N'-디알킬아닐린, 2,4,6-트리알킬피리딘 또는 N-알킬-모르폴린 (이때 상기 알킬은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬임) 이고, 더욱 바람직하게는 이는 N-메틸모르폴린 또는 콜리딘 (2,4,6-트리메틸피리딘) 이고, 가장 바람직하게는 이는 콜리딘이다. C1-C4 알킬의 예는 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, tert.부틸, 이소부틸이다.

커플링 첨가제, 특히 벤조트리아졸형의 커플링 첨가제의 사용이 또한 공지되어 있다(상기 Bodansky 참조). 이들의 사용은 고도 활성화하는 상기 언급한 우로늄 또는 포스포늄 염 커플링 시약 사용시 특히 바람직하다. 따라서, 상기 커플링 시약 첨가제가 활성화 에스테르를 형성할 수 있는 친핵성 히드록시 화합물로서 더욱 바람직하게는 산성의 친핵성 N-히드록시 관능기 (이 때, N 은 이미드이거나 또는 N-아실 또는 N-아릴 치환된 트리아제노임) 를 갖는 화합물인 것이 더욱 바람직하고, 가장 바람직하게는 상기 커플링 첨가제는 N-히드록시-벤조트리아졸 유도체 (또는 1-히드록시-벤조트리아졸 유도체) 또는 N-히드록시-벤조트리아진 유도 체이다. 이러한 커플링 첨가제인 N-히드록시 화합물들은 WO 94/07910 및 EP-410 182 에 대규모로 폭넓게 기술되어 있으며, 상기 각 명세서는 본원에 참조병합된다. 예로서, 예컨대 N-히드록시-숙신이미드, N-히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HOOBt), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt) 및 N-히드록시-벤조트리아졸 (HOBt) 이 있다. N-히드록시-벤조트리아진 유도체가 특히 바람직하고, 가장 바람직한 구현예에서 커플링 시약 첨가제는 히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진이다.

커플링 첨가제의 암모늄 염 화합물이 공지되어 있으며, 커플링 화학 반응에서 이들의 사용은 예를 들어 US4806641 에 기재되어 있다.

추가적인 특히 바람직한 구현예에서, 우로늄 또는 포스포늄 염 커플링 시약은 우로늄 염 시약이고, 바람직하게는 HCTU, TCTU 또는 HBTU 이고, 더욱 바람직하게는 HCTU 또는 TCTU 이고, 가장 바람직하게는 이를 N-히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 또는 이의 염과 조합하여 반응에 사용한다. 상기 구현예는 주로 염기 불안정성 Nα-보호기의 제거 후 펩티드 합성의 사슬 신장 단계에서의 사용에서 바람직하나, 이는 측쇄 고리화 도중의 락탐화 반응에 사용되는 것이 낫다.

HCTU 및 TCTU 및 가능한 유사체들이 결정 구조 분석에서 우로늄 부분 보다는 이소니트로소 부분을 포함하여 헤테로시클릭 코어 상의 N-아미디노 치환기가 대신에 구아니듐 구조를 야기하는 것으로 나타났지만(O. Marder, Y. Shvo, 및 F. Albericio "HCTU and TCTU : New Coupling Reagents: Development and Industrial Applications", Poster, Presentation Gordon Conference February 2002), 본 발명의 맥락에서, HCTU 및 TCTU 는 '우로늄 염 시약'이라는 용어에 의해 포괄되는 것으로서 정의됨을 유의해야 한다. 본 발명의 맥락에서, 화합물의 이러한 부류는 본 발명에 따라 우로늄 염 시약의 '구아니디늄형 하위부류'로 지칭된다.

염기 불안정성 Nα 의 탈보호화는, 예컨대 Fmoc 화학 작용 사용시 N-메틸 모르폴린 중의 20% 피페리딘을 이용하는 등 당업계에서 일상적으로 행해지는 바와 같이 수행될 수 있다. 가장 광범위하게는, N-말단에 대한 Fmoc 또는 Boc 보호화 화학 작용이 관례적으로 고체상 합성에 적용되나, 또 다른 임의적 Nα 보호화 화학 작용이 당업계에 공지되어 있으며, 이들은 수지-콘쥬게이션된 펩티드의 디술피드-기인 펩티드 고리화를 고안하는 본 발명을 해치지 않는 한 적용가능하다.

상기 커플링 화학 작용이 상기에서 정의된 화학식 IV 인 R₇-S-S-[CH2]₂-COOH 의 화합물의 커플링에 사용될 수 있다. 이러한 화합물은 예를 들어, 각각의 대칭 카르복실산 이미드를, 예를 들어 알칸올 또는 알킬아민과 반응시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다.

고리화는 본 발명에 따라 극성의 비양성자성 유기 용매 중에서 제 1 약염기의 존재하에서 수행된다. 산화제 매개 고리화는 하기와 같이 문헌 [Chan and White, eds., 'FMOC Solid-phase Peptide Synthesis', Oxford university Press 2000, p. 91 내지 114]에서 언급된 임의의 것일 수 있다: 수성 완충액 내 글루타티온, DMSO, 포타슘 페리시아나이드, Ellman 시약인 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤 조산), 요오드, 탈륨(III)트리플루오로아세테이트, 알킬트리클로로실란-술폭시드, 강산성 매질 중에서의 실버 트리플루오로메탄술포네이트-DMSO 매개 산화로, 여기서 이는 차콜 매개된 산화와 같이, 보호화된 펩티드의 용매화를 위한, 더욱이 유기 용매 시스템 중 수지 상 고리화에서 사용하기에는 완전히 실행불가능한 것은 아니다. 또 다른 일반적인 방법은 디술피드 결합 형성을 위한 카르보에톡시술페닐 클로라이드의 사용이다(Le-Nguyen, D., 1986, Int. J. Peptide Protein Res. 27, 285-292). 용매 시스템의 이유로, 한 바람직한 구현예에서는 고리화가 US5144006 에서 상세하게 기재된 바와 같이 DMSO로 매개된 산화에 의해 실시되는데, 여기서 DMSO 는 결국에는 소량의 물의 존재하에서 산화제 및 하기에 언급된 용매에 더하여 혼화될 수 없는 공용매 둘 모두로 된다. DMSO 는 허용가능한 신속한 반응 속도를 제공하며, 변성(denaturing) 공용매이며 펩티드 기질을 가용하는데 도움을 준다. 메티오닌 측쇄 상에 이의 산화 작용이 제공되면, 아미노산 측쇄의 탈보호화 이전에 수지 상 고리화에서의 이를 사용하는 것은 탈보호화된 펩티드로 용액에서 이를 일반적으로 사용하는 것보다도 훨씬 더 편리하다.

가장 바람직한 구현예에서는, 상기 고리화는 디술피드 결합을 형성하도록 티올기를 산화시키기 위해서는 공기 및/또는 산소의 존재하에서 그러나 특히 반응 속도를 가속화하는 불균일 촉매의 부재하에서 실시된다. 바람직하게는, 고리화는 촉매 없이, 즉 촉매적 유효량 또는 상당량의 불균일 촉매의 부재하에서 실시된다.

본 발명에 따르고, 특히 공기 및/또는 산소를 산화제로서 사용하여, 더욱 바 람직하게는 상기 불균일 또는 고체상 촉매의 부재하에서 공기/산소를 사용하여 실시되는 경우에는, 본 방법에 따른 고리화 단계는 현저하게 유효하며, 단지 약 0.5 내지 2 시간의 반응 시간만을 필요로 하여, 매우 온건한 반응 조건 (전형적으로 주위온도, 적당한 온도 범위는 10 ℃ 내지 80 ℃ 이나, 용매의 환류 온도가 물론 고려되어야 함) 하에서 유리체(educt)의 목적 생성물로의 사실상 정량적인 완전한 변환이 가능해진다. 전례없이, 변환은 여전히 그후로도 완전하다. 이는 두드러진 성취이며, 디술피드-결합에 의한 펩티드의 고리화는 아직까지 성취되지 않았고, 상기와 같은 단순하고 온건하며 신속한 고리화 반응 조건이 이전에 고안된 적도 없다. 불균일 촉매에 대한 번거로운 혼합 및 분리 문제는 전혀 일어나지 않는다. 또한, 반응 속도는 선행 기술의 촉매-기인 반응의 반응 속도와 완전히 대등하다. 반응의 수월한 과정 때문에, 부생성물의 형성이 거의 완전히 회피된다.

적당한 극성의 비양성자성 용매는 예컨대 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디클로로메탄, N-메틸-피롤리돈, 테트라히드로푸란이다. 물과는 반대로, 이러한 용매는 보통 이전의 수성 촉매 시스템에 있어서 기재된 것 만큼의 디술피드 결합의 산화적 형성을 제공하기에 적절한 양의 산소를 물리적으로 용해시키지 못할 수 있다.

따라서, 공기, 공기/산소 또는 순수 산소의 공급에 유의해야 한다. 공기/산소는 충분한 교반, 볼텍싱 (vortexing), 교반에 사용되는 프로펠러의 특수한 설계, 액체 내로의 기체 분사에 의해 공급될 수 있다. 상기 기체는 공기 또는 순수 산소 또는 산소가 풍부한 공기일 수 있다. 한 가지 특히 바람직한 구현예에서는, 반응 용기의 바닥 및/또는 벽의 넓은 표면 영역을 구멍을 내어 충분한 교반하에서 기체가 액체 내로 분사되도록 한다.

또한 시스테인에 있어서 상이한 보호화 방법이 본 발명의 한 펩티드 상에서 사용되는 것도 가능하다. 예를 들어, 펩티드 사슬에서의 추가 시스테인은 acm 보호기로 전통적으로 보호화될 수 있고, 내부 시스테인 사이에서의 추가의 위치 특이적 디술피드 결합을 제공하기 위해서는 수지로부터의 절단 후에 용액 중 표준 요오드 산화를 이용하고 본 발명에 따른 최초의 디술피드 결합 후에 수지 상에서 일어난다.

상기 제 1 약염기 시약은 콘쥬게이션된 산의 pKa 값이 pKa 7.5 내지 15, 더욱 바람직하게는 pKa 8 내지 10 인 약염기이고, 바람직하게는, 이는 3차 입체 장애 아민이다. 이러한 추가적인 바람직한 예는, Hunig-염기 (N,N-디이소프로필에틸아민), N,N-디알킬-아닐린, 2,4,6-트리알킬피리딘 또는 N-알킬-모르폴린 (이 때, 알킬은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸임) 이고, 가장 바람직하게는 이는 N-메틸모르폴린, 콜리딘 (2,4,6-트리메틸피리딘) 또는 Hunig-염기이다.

바람직하게는 디술피드 보호기의 제거에 앞서, 특히 S-tert-부틸-술페닐기의 제거를 실시하는데, 이 때 약간의 산분해에 의한 수지로부터의 임의의 누출의 위험성을 피하기 위하여 제 1 약염기 시약의 존재하에서, 즉 pH 7.5 내지 12, 더욱 바람직하게는 pH 8 내지 11 에서 실시한다. 임의로는, 물과 자유로이 혼화가능 한 극성 비양성자성 용매, 예컨대 THF 또는 아세토니트릴을 사용함으로써, 상기 목적을 위해 수용액 중의 아세트산나트륨과 같은 염기성 염을 사용할 수도 있다. 이 구현예는 상기한 디술피드기 절단 또는 제거 단계를 위해 3차 포스핀을 사용할 경우 특히 바람직하다. 이러한 디술피드 보호기 제거에 수반되는 적당한 산소 공급을 조합함으로써, 본 발명의 또 다른 구현예에서는, 예컨대 3차 아민의 존재하에서 산소 공급과 함께 극성의 비양성자성 유기 용매를 사용하는 경우 및 산소에 불활성인 탈보호화용 3차 포스핀을 사용하는 경우, 단일 용기 (one-pot) 반응으로 뿐 아니라 심지어 단일 반응 단계로 디술피드 탈보호화 및 고리화 모두를 수행하는 것이 가능할 수 있다.

본 발명은 수지-상 고리화가 가능하므로, 이는 이전 선행 기술에 기술된 대부분의 방법에서 요구된 바와 같은, 분자간 고리화보다 분자내 고리화에 우위를 두기 위해 지루하고 수율이 감소되는, 펩티드의 강한 희석을 추가로 요구하지 않는다.

본 발명의 수지-상 작업 양식은 신속하고 효율적인 분자내 고리화만을 가능하게 하여, 이량체화의 여지를 전혀 제공하지 않는다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 펩티드는 화학식 I 의 펩티드이다. 보호기라는 용어는, 표준 tert-부틸옥시카르보닐 (Boc) 또는 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 고체상 펩티드 합성에서의 사용에 순응하는, 주어진 측쇄 관능기 또는 특정 측쇄용 보호기로서 해석되어야 한다. 이러한 보호기 및 특정 측쇄 관능기용 특정 보호기의 사용은 당업계에 익히 공지되어 있고 일상적이다(상기 s. Chan 등; 상기 Bodansky 등).

한 가지 추가의 가능한 구현예에서, 단백질 정제에 이용되는 확립된 헥사-His 태그 기술과 유사하게, 펩티딜 부분을 고체상에 영구적으로 공유 결합시킴으로써가 아니라, 안정한 금속 킬레이트 착물에 의해 고체상에 비공유적으로 가역적으로 결합시킴으로써 고체상에서 펩티드가 임의로 합성된다 [Lonza AG (Basel, Switzerland) 사와 AplaGen GmbH (Baesweiler, Germany) 가 연합하여 만든 제품 뉴스, October 2004]. 이러한 비공유적 고체상 연결 또는 유사한 장래의 구현예들은 또한 본 발명에 포함되며, 상기 및 하기에서 개시된 본 발명을 실행하는 바람직한 양식은 상기 구현예에도 적용된다.

상기 기재된 바와 같은, 고체상 콘쥬게이션되고, 유리하게 고리화된 적합한 펩티드 및 상기 및 하기 바람직한 구현예와의 이들의 조합이 또한 본 발명의 목적이다.

제 1 목적은 하기 화학식 I 의 펩티드이다:

[식 중, R4, R5 는 H 또는 Arg-보호기이고, R2 는 카르복실산 보호기이고, R3 은 Trp-보호기이고, R1 은 펩티드 골격으로의 티오에스테르, 에스테르 또는 아미드 결합 연결된 고체상이다].

바람직하게는, 상기 펩티드에서 R4, R5 는 H 이고, R3 은 N-벤질-옥시카르보닐이고 R2 는 tert-부틸이다.

바람직하게는, 상기 고체상은 결과적으로 펩티드 골격으로 아미드 결합 연결되는 아미드-생성 링커 또는 핸들을 포함하는 Sieber 수지 또는 기타 수지이다.

제 2 목적은 펩티드, 특히 하나 이상의 아미노산 측쇄 보호기를 포함하는 펩티드로, 여기서 펩티드는 C-말단 잔기 또는 아미노산 측쇄를 통해 고체상에 연결되며, 상기 펩티드가 하기 화학식 II 의 부분을 포함하는 고리형 펩티드인 것을 특징으로 한다:

[식 중, n, m 은 1 ~ 10 의 범위로부터 독립적으로 선택되고, 바람직하게는 n = 2 이고 m = 1 (시스테이닐 부분을 산출함)이고, Nα 는 펩티드 골격의 N-말단 질소이고, C* 은 펩티드 골격의 아미노산 잔기의 Cα이고, R6 은 상기 Nα로 종결하는 N-말단의 절반의 고리형 펩티드 골격이며, R5 는 고체상에 연결되는 C-말단의 절반의 펩티드 골격으로, 단, N ≠ Nα이다]. 바람직하게는 식 중 R6 는 3 개 이상, 더욱 바람직하게는 4 개 이상의 개재(intervening) 아미노산 잔기를 포함한다. 명쾌하기 위하여, R5 는 C*H(-CO-NH-R') 또는 C*H(-CO-O-R') 또는 최종적으로 C*H(-CO-S-R')에 해당하는 것으로 해석되며, 여기서 R' 는 가능하게는 링커 또는 핸들을 포함한 고체상이고, R5 및 임의로는 다수의 아미노산 잔기가 상기 고체상에 연결된다. 바람직하게는, R5 및 R6 은 200 개 이하, 더욱 바람직하게는 100 개 이하, 가장 바람직하게는 50 개 이하의 아미노산 잔기를 포함한다.

추가적인 목적은 펩티드, 바람직하게는 시스테인, 호모- 또는 노르-시스테인 잔기 상에 S-tert.부틸-술페닐기 이외에 하나 이상의 아미노산 측쇄 보호기를 포함하는 펩티드로, 여기서 펩티드는 C-말단 잔기를 통해 고체상에 연결되며, 상기 펩티드가 그의 측쇄에서 S-tert.부틸-술페닐기로 보호화되고 그의 Nα에서 N-말단 치 환되어 하기 화학식 III 의 아미드 부분을 구성하는, 하나 이상의 시스테인, 호모- 또는 노르-시스테인 잔기를 포함하는 것을 특징으로 한다:

[식 중, n=1 내지 10, 바람직하게는 n= 2].

또한, 추가 목적은 펩티드, 바람직하게는 시스테인, 호모- 또는 노르-시스테인 잔기 상에 S-tert.부틸-술페닐기 이외에 하나 이상의 아미노산 측쇄 보호기를 포함하는 펩티드로, 여기서 펩티드는 C-말단 잔기를 통해 고체상에 연결되며, 상기 펩티드가 그의 측쇄에서 자유 티올기를 갖고 그의 Nα 에서 N-말단 치환되어 하기 화학식 III 의 아미드 부분을 구성하는, 하나 이상의 시스테인, 호모- 또는 노르-시스테인 잔기를 포함하는 것을 특징으로 한다:

[화학식 III]

[식 중, n=1 내지 10, 바람직하게는 n= 2].

마찬가지로, 본 발명의 목적 중 마지막 및 끝에서 두번째의 상기 펩티드는 또한 바람직하게는 200 개 이하, 더욱 바람직하게는 100 개 이하, 가장 바람직하게 는 50 개 이하의 아미노산 잔기를 포함한다. 수지 선택이 또한 100 개 이상의 아미노산 잔기의 펩티드 합성의 필요 요건이지 않는 한, 매우 긴 펩티드를 합성하는 경우에 수득되는 수율에 영향을 끼칠 것이라는 점에서는 말할 나위 없다. 예를 들어, PEG 수지는 통상적으로 상기에 있어서 양호한 선택일 수 있다. 또한, 펩티드의 각 아미노산 서열이 최대 사슬 길이 및 제공된 펩티드로 수득될 수 있는 커플링 효능에 영향을 끼치는 것은 당연하다는 점은 말할 나위 없으며; 광범위하게 공지된 예로는, 베타-시트 형성 및 사슬간 결합으로 인한 선형 합성 동안에 불리한 펩티드의 사슬간 응집 위협이다.

실험

본 발명인 신규하고 개선된 방법을 고안하기 위해 노력하여, 엡티피바타이드(eptifibatide) 를 수지 상 고리화에 대한 보호화된 모델 펩티드로서 선택하였다; 엡티피바타이드의 고체상 합성 방법은 이미 US5,318,899 에 기재되어 있다.

총괄적인 합성 방법을 하기 표 I 에 개시하였다.

1.1 선형 펩티드 Gly -Asp( tBu )- Trp ( Boc )-Pro- Cys (S- tBu )- Sieber 의 FMOC SPPS

FMOC-Cys(S-tBu)-OH 의 합성은 이전에 기술되었다(Rietman 등, 1994, Synth. Commun. v24, p. 1323 f). Sieber 수지는 Novabiochem 제품이었고, Calbiochem-Novabiochem (EMD Biosciences 소속, California/U.S.A.) 으로부터 구입하였다. FMOC-Cys(S-tBu)-OH (카탈로그 번호 B-1530) 을 포함하여 모든 FMOC 아미노산은 Bachem AG (Bubendorf, Switzerland) 로부터 구입하였다.

수지를 0.52 mmol/g 으로 로딩하였고, 총 10 g 의 Sieber 수지를 로딩하였다. 로딩을 위한 커플링 시간은 표준 커플링 시간의 두 배, 즉 총 60 분이었다. 디클로로메탄 중에서 각각 1 당량의 6-클로로-HOBt, TCTU, Hunig-염기 (디이소프로필에틸아민) 의 존재하에서 각각 2 당량의 각 아미노산으로 커플링을 수행하였다. N-메틸-피롤리돈 (NMP) 으로 세정하였다.

N-메틸-피롤리돈 중의 10% 피페리딘으로 15 분의 3 회 사이클로 FMOC 탈보호화를 수행하였다; 절단 효율 및 합성의 완료를 각각 닌히드린 반응 및 역상 HPLC 로 분석하였다.

1.2 상기 1. 1 로부터의 펩티드를 Har - Gly -Asp( tBu )- Trp ( Boc )-Pro-Cys(S-tBu)-Sieber 로 신장

아미노산 1 당량당 1 당량의 HOBt 의 존재하에서 FMOC-Har 잔기 (Bachem, Burgendforf, Switzerland) 의 커플링을 진행하였다 (구아니디노기의 양성자화를 유지하기 위함); FMOC 아미노산을 NMP 중의 1-당량의 디이소프로필-카르보디이미드 및 HOBt 로 예비인큐베이션한 후, 상기 수지와 혼합하였다. Har 커플링은 180 분 (기타 aa: 30 분) 이 걸렸고, 그 후, 약 60 분간 보충 시약들로 제 2 의 사이클을 진행하였다. 이러한 방식으로, 다른 잔기들에 대해 표준 99.8 % 커플링 효율을 이룰 수 있었다. FMOC 절단은 이전과 같이 진행하였다. 특히, FMOC 절단 및 그 후의 NMP 세정 후, HOBt 로 반복 세정을 행하여 수지의 추가적인 팽윤을 방지하였다.

주의: TCTU 를 이용한 연장된 커플링이 또한 HOBt 와의 상기 이온쌍 이외에 어떠한 보호기도 이용하지 않는 Arg 커플링에 있어서도 적합하다. HOBt 와의 추가의 이온쌍은, 예를 들어 Pbf 와 같이 Arg 에 대한 공유 결합된 보호화 화학 작용을 이용한 것과 비교시에 바람직한 구현예로, 상기는 탈보호화 동안 부반응에 있어서 문제될 수 있다.

1.3 상기 1. 2 로부터의 펩티드 수지를 ( Mpa )2- Har - Gly -Asp( tBu )- Trp ( Boc )-Pro-Cys(S-tBu)-Sieber 로 유도체화

3,3'-디티오프로피온이미드 (Novabiochem) 와의 반응을 얼음조에서 10℃ 미만으로 냉각시킨 DMF 중에서 실시하였다. 1 당량의 디이소프로필-카르보디이미드를 반응 혼합물에 10 분에 걸쳐 교반하면서 첨가하는 동안 온도를 15 ~ 20℃ 아래로 유지시키도록 조절했다. 이후에, 반응 혼합물을 1.2 섹션의 탈보호화되고 수지-결합된 펩티드 생성물에 첨가했다. 6 시간 동안 주위 온도에서 커플링을 진행하였다.

반응 생성물 분취량을 60% TFA 으로 수지로부터 절단하고, LC-(전기분무) MS 로 분석했다. 변환은 정량적이었으나, 2 개의 주요 생성물 피크가 검출되었다 (<25% 부생성물:디펩티드). 이에 따른 상기 단계의 수율은 75% 초과였다.

1.4 Bu ₃ P 를 이용한 탈보호화

수지를 테트라히드로푸란 (THF) 중에 3 회 현탁 및 세정하였다. 19%(v/v) PBu₃/77%(v/v) THF/4%(v/v) 아세트산나트륨의 포화 수용액으로 구성된 50 당량 트리부틸포스핀으로 실온에서 1 시간 동안 반응을 수행하였다; 사용 전에 침전된 염을 여과제거하였다. 반응은 일정하게 진행되어 하나의 우세한 생성물 피크를 나타냈다. 역상 HPLC 로 수율을 측정하였는데, 순수한 생성물이 98.9% 에 달하는 것으로 나타났다.

1.5

의 수득을 위한 고리화

1.4 로부터의 펩티드-수지 콘쥬게이트를 팽윤된 채로 세정하고 NMP 중에서 3 회 세정하였다. 상기 수지를 NMP 중의 6% DIEA (Hunig-염기) 와 함께 실온에서 1 시간동안 인큐베이션하여 고리화를 수행하였다; 반응은 하부에 수평하게 이등분된 밀봉된 G3 (16-40 ㎛) 유리 프릿 (frit) 이 있는 수직형 유리 용기에서 수행되었다. 상기 유리 프릿 또는 소결 플레이트 (fritted plate) 에 하부로부터 공기를 분사하여, 공기가 상기 프릿 위의 용매로 덮힌 반응물 공간의 횡단면 전체를 가로질러 버블링되게 하여 그 안에서 수지가 아래로부터의 버블링 공기에 의해 부유하도록 하였다. 완전히 순수한 균일한 생성물이 수득되었는데, 상기 반응 단계 후 눈에 띄거나 또는 부서진 부생성물이 나타나지 않았다. 역상 HPLC 및 LC-MS 둘 다로 독립적으로 측정한 바 생성물로의 변환은 100% 이었다. Hypersil-Keystone^TM Betabasic (Thermo Electron Corp., Waltham Mass./U.S.A.) C18 150x4.6 mm 컬럼 상에서, 35 ℃ 의 컬럼 온도에서 주입 부피 15 ㎕ 및 262 nm 에서의 검출에 의해 RP-HPLC 를 수행하였다. 구배 진행 (Gradient run) 은 하기와 같다:

1.6 전체적인 탈보호화

수지를 디클로로메탄 (DCM) 중에서 3 회 팽윤시켜 전체적인 탈보호화를 수행하였다. 절단 반응 상 혼합물을 하기와 같이 구성되도록 제조하였다:

86.5% TFA (785 당량)

4.5% 티오아니솔 (36.5 당량)

3% 페놀 (32.4 당량)

3% DCM (38 당량)

3% H₂O (178 당량)

천천히 회전하는 회전식 진탕 장치 상 15 ℃ 에서 2 시간 동안 반응을 진행시켰다. 반응이 종결되면, 수지를 여과 제거한 후 tert-부티르산 메틸 에스테르를 적가하여 생성물을 침전시켰다. 상기 생성물은 일정한 피크였고; 두드러진 부생성물은 검출할 수 없었다. 전체적인 탈보호화에 대한 상기 조건들을 제어하에 시험하였는데, 펩티드 내에 미리 형성된 디술피드 가교에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 상기 1.5 섹션에서 상세히 기재된 바와 같은 RP-HPLC 및 LC-MS 으로 측정시 마지막 단계에서 변환은 99% 초과였다.

Claims

하기 단계를 포함하는 펩티드 합성 방법:

a. 고체상에 연결된 펩티드를 합성하는 단계로, 상기 펩티드는 하나 이상의 시스테인, 호모- 또는 노르-시스테인 잔기를 포함하며, 상기 시스테인은 그의 측쇄에서 S-tert.부틸-술페닐기에 의해 보호화되는 단계,

b. 그의 Nα 상에 3,3'-디티오-(1-카르복시-프로필)-프로피오닐-라디칼을 가진 N-말단 추가 아미노산을 커플링하거나 또는 N-말단 아미노산의 Nα를 탈보호화하고 자유 Nα를 3,3'-디티오-프로피온산 이미드와 반응시켜 상응하는 Nα-3,3'-디티오-(1-카르복시-프로필)-프로피온아미드를 수득하거나, 또는 N-말단 아미노산의 Nα를 탈보호화하고 자유 Nα를 하기 화학식 IV 의 화합물과 반응시키는 단계:

[화학식 IV]

R₇-S-S-[CH2]₂-COOH IV

[식 중, R7 은 이종핵 아릴을 포함하는 아릴- 이거나, 또는 아르알킬-, 알킬아릴- 또는 알킬- 로, 이는 추가로 할로게노, 아미도, 에스테르, 카르복시 또는 에테르로 치환될 수 있다],

c. 상기 펩티드를 S-tert.부틸-술페닐-보호기 제거 시약과 반응시키는 단계, 및

d. 디술피드 결합 형성을 이용해 상기 펩티드를 고리화하는 단계, 바람직하 게는 공기 및/또는 산소의 존재하에서 상기 펩티드를 고리화하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 시스테인이 상기 펩티드의 N-말단 아미노산 잔기로부터 3 개 이상, 더욱 바람직하게는 5 개 이상의 아미노산 잔기 간격으로 떨어져 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 고체상 수지가 2-클로로-트리틸 (CTC) 또는 아미드-생성 수지로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 펩티드가 상이하게 보호화된 추가의 시스테인, 호모- 또는 노르-시스테인 잔기를 포함하여 하나 이상의 추가 측쇄 보호기를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 시스테인이 마지막 C-말단 잔기인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 6 항에 있어서, 적어도 S-tert.부틸 술페닐기의 제거가 트리알킬포스핀과의 상기 펩티드의 반응으로 성취되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 펩티드가 극성의 비양성자성 용매 중의 약염기의 존 재하에서 고리화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 펩티드의 고체상으로의 연결이 산 불안정성이고, 바람직하게는 실온에서 디클로로-메탄 중의 60% TFA 에서 불안정성인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 수지가 Sieber 수지인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 후속 단계에서, 상기 펩티드가, 바람직하게는 전체적인 탈보호화의 조건하에서, 상기 수지로부터 절단되는 것을 특징으로 하는 방법.
하기 화학식 I 의 펩티드:

[화학식 I]

[식 중, R4, R5 는 H 또는 Arg-보호기이고, R2 는 카르복실산 보호기이고, R3 은 Trp-보호기이고, R1 은 펩티드 골격으로의 티오에스테르, 에스테르 또는 아미드 결합 연결된 고체상이다].
제 11 항에 있어서, R4, R5 가 H 이고, R3 이 N-벤질-옥시카르보닐이고, R2 가 tert-부틸인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 12 항에 있어서, 고체상이 그 결과 펩티드 골격으로의 아미드 결합 연결된 Sieber 수지인 것을 특징으로 하는 펩티드.
바람직하게는 하나 이상의 아미노산 측쇄 보호기를 포함하고, C-말단 잔기 또는 아미노산 측쇄를 통해 고체상에 연결되는 펩티드로서, 하기 화학식 II 의 부분을 포함하는 고리형 펩티드인 것을 특징으로 하는 펩티드:

[화학식 II]

[식 중, n, m 은 1 ~ 10 의 범위에서 독립적으로 선택되고, Nα 는 펩티드 골격의 N-말단 질소이고, C* 는 펩티드 골격의 아미노산 잔기이며, R6 은 상기 Nα로 종결하는 N-말단의 절반의 고리형 펩티드 골격이고, R5 는 고체상에 연결되는 C-말단의 절반의 펩티드 골격으로, 단, N ≠ Nα이며, 바람직하게는, 식 중 R6 은 3 개 이상, 더욱 바람직하게는 4 개 이상의 개재 아미노산 잔기를 포함한다].
바람직하게는 시스테인, 호모- 또는 노르-시스테인 잔기 상에 S-tert.부틸-술페닐기 이외의 하나 이상의 아미노산 측쇄 보호기를 포함하고, C-말단 잔기를 통해 고체상에 연결되는 펩티드로서, 그의 측쇄에서 S-tert.부틸-술페닐기로 보호화되고 그의 Nα에서 N-말단 치환되어 하기 화학식 III 의 아미드 부분을 구성하는, 하나 이상의 시스테인, 호모- 또는 노르-시스테인 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드:

[화학식 III]

[식 중, n=1 내지 10, 바람직하게는 n= 2].
바람직하게는 시스테인, 호모- 또는 노르-시스테인 잔기 상에 S-tert.부틸-술페닐기 이외에 하나 이상의 아미노산 측쇄 보호기를 포함하고, C-말단 잔기를 통해 고체상에 연결되는 펩티드로서, 그의 측쇄에서 자유 티올기를 갖고 그의 Nα 에서 N-말단 치환되어 하기 화학식 III 의 아미드 부분을 구성하는 하나 이상의 시스테인, 호모- 또는 노르-시스테인 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드:

[화학식 III]

[식 중, n=1 내지 10, 바람직하게는 n= 2].