ES2339791T3 - Ciclizacion de peptidos sobre resina. - Google Patents
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Abstract
Método de síntesis de péptidos, que comprende las etapas de: a. sintetizar un péptido enlazado a una fase sólida cuyo péptido comprende al menos un residuo de cisteína, homo- o nor-cisteína, cuya cisteína es protegida en su cadena lateral por un grupo S-terc-butilsulfenilo; y b. ya sea acoplar N-terminalmente otro aminoácido que tiene un radical 3-[(2-carboxietilo)ditio]propionilo en su Nα u, o desproteger el Nα del aminoácido N-terminal y reaccionar el Nα libre con 3,3''-ditiopropionimida para proporcionar la correspondiente Nα-3-[(2-carboxietil)ditio]propionamida, o desproteger el Nα del aminoácido N-terminal y reaccionar el Nα libre con un compuesto de fórmula IV IVR7-S-S-[CH2]2-COOH en donde R7 es arilo-, incluyendo heteroarilo-, o es aralquilo-, alquilarilo- o alquilo- que puede estar además sustituido con halógeno, amido, éster y/o éter; y c. reaccionar el péptido con un reactivo separador del grupo protector S-terc-butilsulfenilo, y d. ciclizar el péptido sobre resina por medio de la formación de un enlace disulfuro, con preferencia ciclizar el péptido en presencia de aire y/u oxígeno.
Description
Ciclización de péptidos sobre resina.
La presente invención se refiere a un método de
formación de enlaces disulfuro en la síntesis de péptidos en fase
sólida (SPPS).
Se puede emplear una amplia variedad de grupos
protectores para la protección de residuos de cisteína, por
ejemplo, tritilo, acetamidometilo, t-butilo,
trimetilacetamidometilo, 2,4,6-trimetoxibencilo,
metoxitritilo, t-butilsul-
fenilo.
fenilo.
Como es muy usual, el grupo tritilo se emplea
para la protección convencional de la cadena lateral de cisteína
durante la síntesis de péptidos. Para la protección de cisteínas que
posteriormente son ciclizadas a cistina, en su amplia mayoría se ha
utilizado el grupo protector acetamidometilo (acm) junto con
oxidación con yodo (Kamber et al., 1980, Helv. Chim. Acta
63, 899-915; Rietman et al., 1994, Int. J.
Peptide Protein Res. 44, 199-206).
Se ha descrito una multitud de agentes oxidantes
distintos del yodo al objeto de permitir la formación de cistina en
la ciclización en fase sólida (ejemplos derivados de Albericio et
al., en: Chan and White, eds., 'FMOC
Solid-phase Peptide Synthesis',Oxford university
Press 2000, p. 91 a 114: glutationa en tampón acuoso, DMSO,
ferricianuro potásico, reactivo de Ellman,
5,5'-ditiobis-(ácido
2-nitrobenzoico), yodo, trifluoracetato de talio
(III), alquiltriclorosilano-sulfóxido, oxidación
mediada por trifluormetanosulfonato de plata-DMSO
en un medio fuertemente
ácido.
ácido.
Normalmente, todos esos métodos dan lugar a
múltiples productos secundarios indeseables y requieren largos
tiempos de reacción del orden de 10-20 horas para
lograr un rendimiento óptimo.
Volkmer-Engert et al. (J.
Peptide Res. 51, 1998, 365-369) describen la
formación oxidativa de enlaces disulfuro catalizada con carbón
vegetal mediante el uso de oxígeno disuelto en el disolvente acuoso.
Se ha dicho que el uso de controles cuidadosos prueban que el
depósito de oxígeno físicamente disuelto en el medio acuoso era
necesario y suficiente para cargar el carbón vegetal con oxígeno
para la oxidación. El uso de carbón vegetal, en comparación con la
pulverización tradicional de aire en ausencia de catalizador,
aceleraba la velocidad de reacción de forma
drástica.
drástica.
El uso de carbón vegetal requiere
inevitablemente llevar a cabo dicha reacción en solución homogénea
pero no sobre resina; además, las posteriores etapas de reacción de
desprotección no tolerarían la presencia continua de carbón vegetal
el cual es imposible de eliminar de la fase sólida de
péptido-resina.
La WO 03/093302 describe la ciclización de un
péptido que contiene triptófano en solución después de su
liberación desde una fase sólida. El péptido tiene una
cisteinilcarboxamida C-terminal cuya función tiol
de la cadena lateral está sin proteger y cuyo péptido experimenta
además una derivación N-terminal con una mitad
mercaptopropionamida o
3-[(2-carboxietil)ditio]propionamida.
La protección y/o desprotección de la cadena lateral amídica de
cisteína llega a ser superflua por la presencia de la cadena lateral
que efectúa el anclaje del péptido sobre la resina por vía del
enlace de tioéster de dicha cadena lateral de cisteína. La
derivación N-terminal con ditiopropionato tiene
lugar antes de escindirse de la resina. La ciclización tiene lugar
después de la escisión desde la resina, por tanto en solución, por
medio de una formación de puente disulfuro entre cisteína y la mitad
tiopropionamida. La escisión respecto del soporte sólido y la
desprotección global, excepto para la función tiopropionilo, antes
de la ciclización, es un hecho obligado en este esquema.
Como un inconveniente, debe tenerse un cuidado
sumo a la hora de preservar la mitad tiopropionamida durante la
escisión y desprotección global. Atherton et al. (1985, J.
Chem. Perkin Trans. I., 2065) indicaron que el uso popular de
tioanisol que tiene la doble función de barredor y de promotor de la
acidólisis, para efectuar la escisión respecto de la resina,
también dio lugar a una desprotección parcial prematura de cisteínas
protegidas con acm, terc-butilo y
terc-butilsulfenilo. La vía de síntesis general es
intrincada, ya que las muchas etapas involucradas afectan de manera
negativa a los rendimientos que pueden obtenerse por esta vía. La
ciclización ha de realizarse en solución altamente diluida para
prevenir la dimerización. En realidad, en la descripción de esta
referencia no se indica de forma explícita los rendimientos
obtenidos.
Un objeto de la presente invención consiste en
trazar otro método u otro método mejorado más simple y directo para
sintetizar péptidos cíclicos enlazados por disulfuro por medio de la
síntesis en fase sólida. Este objeto es conseguido, de acuerdo con
la presente invención, a través de un método de síntesis de péptidos
que comprende las etapas
de:
de:
- a.
- sintetizar un péptido enlazado a una fase sólida, cuyo péptido comprende al menos un residuo de cisteína, homo- o nor-cisteína, cuya cisteína es protegida en su cadena lateral por un grupo S-terc-butilsulfenilo; y
\newpage
- b.
- ya sea acoplar N-terminalmente otro aminoácido que tiene un radical 3-[(2-carboxietilo)ditio]propionilo en su N\alpha u, opcionalmente, desproteger el N\alpha del aminoácido N-terminal y reaccionar el N\alpha libre con 3,3'-ditiopropionimida para proporcionar la correspondiente N\alpha-3-[(2-carboxietil)ditio]propionamida, o desproteger el N\alpha del aminoácido N-terminal y reaccionar el N\alpha libre con un compuesto de fórmula IV
IVR_{7}-S-S-[CH_{2}]_{2}-COOH
- en donde R_{7} es arilo-, incluyendo heteroarilo-, o es aralquilo-, alquilarilo- o alquilo- que puede estar además sustituido con halógeno, amido, éster y/o éter; y
- c.
- reaccionar adicionalmente el péptido con un reactivo separador del grupo protector S-terc-butilsulfenilo, con preferencia reaccionar el péptido con una trifenil- o trialquil-fosfina sustituida o insustituida, y
- d.
- ciclizar el péptido por medio de la formación de un enlace disulfuro entre, normalmente, la cisteína y la mitad 3-tiopropionamida en el N\alpha, en presencia de aire y/u oxígeno.
El péptido de acuerdo con la presente invención
puede ser cualquier péptido que comprenda aminoácidos naturales o
no naturales tales como, por ejemplo, homocisteína, homoarginina,
D-ciclohexilalanina, penicilamina (Pen) u ornitina
(Orn). Los términos espina dorsal o cadena principal del péptido,
cadena lateral y los prefijos "nor-" y "homo-" están
considerados en el presente contexto de acuerdo con las definiciones
de IUPAC-IUB (Joint IUPAC-IUB
Commission on Biochemical Nomenclature, "Nomenclature and
symbolism for amino acids and Peptides", Pure Appl. Chem., 56,
595-624 (1984). En su significado más estrecho,
preferido, representa la presencia de solo un grupo de puente
metileno extra en la porción de la cadena lateral.
Debe prestarse una atención especial a una
protección adicional de la cadena lateral, en particular cuando se
hace referencia a otros residuos de cisteína, homo- o
nor-cisteína incluidos en la secuencia péptida y
que se desea que permanezcan protegidos durante la reacción de
ciclización y no participen en esta última. Con preferencia, dichos
otros residuos que comprenden una mitad sulfhidrilo son protegidos
por grupos protectores no sensibles a trialquilfosfina, más
preferentemente, dicho grupo protector no sensible a sulfhidrilo se
elige del grupo consistente en grupos protectores tritilo,
terc-butilo, acetatamidometilo, acetamidometilo
alquilado y tritilo alquilado. A nivel general, se pueden emplear
grupos protectores de la cadena lateral como los normalmente
utilizados en la técnica (véase, por ejemplo, Bodansky, M.
Principles of Peptide Syntesis, ver a continuación) para proteger
cadenas laterales susceptibles que de otro modo podrían ser
modificados en los ciclos de acoplamiento y desprotección. Ejemplos
de aminoácidos con cadenas laterales susceptibles son Cys, Asp, Glu,
Ser, Arg, Homo-Arg (Har), Tyr, Thr, Lys, Om, Pen,
Trp, Asn y Gln. Alternativamente, se puede efectuar una modificación
química posterior en la síntesis en fase sólida de la amida péptida
para proporcionar una cadena lateral deseada. Por ejemplo, como se
indica ampliamente en diferentes referencias (EP-301
850; Yajima et al., 1978, J. Chem. Soc Chem. Commun., p.482;
Nishimura et al., 1976, Chem. Pharm. Bull. 24: 1568), se
puede preparar homoarginina por guanidación de un residuo de lisina
comprendido en la cadena péptida o se puede preparar una arginina
por guanidación de un residuo de ornitina comprendido en la cadena
péptida, si bien esto es únicamente una opción más laboriosa y por
tanto menos preferible. Concretamente, el acoplamiento, por ejemplo,
de Har requiere tiempos de acoplamiento prolongados y la reposición
de los reactivos de acoplamiento. De acuerdo con la presente
invención, una modalidad preferida consiste en acoplar Arg o Har,
preferentemente cuando se utiliza como Fmoc-Arg y
Fmoc-Har respectivamente, sin el uso de grupos
protectores de la cadena lateral. Esto se puede conseguir
asegurando que después de acoplar el residuo individual Arg o Har,
la mitad guanidino sea protonada cuantitativamente antes de
cualesquiera otras reacciones de acoplamiento y forme un par iónico
estable con el donador de protones en disolvente orgánico. Esto se
logra preferentemente tratando la amida péptida unida a la resina
con un exceso con el auxiliar de acoplamiento ácido BtOH o similar,
como se describe en una modalidad preferida ofrecida con mayor
detalle a continuación en la sección experimental. Otro ejemplo de
barrer la carga del grupo guanidinio consiste en utilizar sales de
tetrafenilborato de HAR protegida con Fmoc durante la síntesis, como
se describe en US 4.954.616.
Ejemplos de grupos protectores adecuados para
las cadenas laterales individuales de aminoácidos que se presentan
en las modalidades preferidas del péptido de acuerdo con la presente
invención son:
Con preferencia, la cadena lateral de arginina
puede ser opcionalmente protegida de manera covalente durante la
síntesis, por ejemplo, con tosilo, benciloxicarbonilo,
pentametilencromanosulfonilo (Pmc),
pentametildihidrobenzofuransulfonilo (Pbf),
4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo
(Mtr) y su homólogo
4-tBu-2,3,5,6-tetrametilo
(Tart), adamantiloxicarbonilo o Boc. Se prefieren en gran medida
Pmc, Pbf, Mtr o Tart para proteger Arg, siendo con suma preferencia
Pbf.
Trp se protege preferentemente durante la
síntesis con Boc. Opcionalmente puede ser
N-protegido con formilo o
sim-mesitilensulfonilo.
Grupos protectores adecuados de la cadena
lateral de ácido carboxílico, por vía de la esterificación del
grupo carboxi de la cadena lateral son, por ejemplo, adamantilo,
terc-butilo, alilo, bencilo (Z), y con preferencia
el grupo caiboxi se protege por conversión a un éster de
terc-butilo. Ni que decir tiene que la separación
de los citados grupos protectores puede requerir diferentes químicas
de desprotección, como es bien conocido (véase Bodansky, M., a
continuación).
El soporte de fase sólida o resina puede ser
cualquier soporte conocido en la técnica que resulte adecuado para
utilizarse en la síntesis en fase sólida. Esta definición en fase
sólida. Esta definición de fase sólida implica que el péptido es
unido o enlazado, por vía de un grupo de enlace o de agarre (handle)
funcional, a la fase sólida o resina, quedando implicado dicho
grupo de enlace o conector cuando se habla de "fase sólida" en
el presente contexto. Ejemplos de fases sólidas son, por ejemplo,
soportes de poliestireno que pueden estar además funcionalizados,
por ejemplo, con p-metilbenzhidrilamina por ejemplo,
soportes funcionalizados rígidos tales como polidimetilacrilamida
encapsulada con kieselguhr (pepsyn K), sílice o vidrio de porosidad
controlada. La matriz de resina de la fase sólida puede también
estar constituida por una resina de poliestireno-PEG
anfífila (por ejemplo, Tentagel, véase US-4908405)
o resina de PEG-poliamida o
PEG-poliéster, por ejemplo, Kempe et al., J.
Am. Chem. Soc. 1996,118, 7083; véase también US 5.910.554, US
2003078372 A1. La pureza del producto obtenido sobre dichas resinas
mixtas de PEG es mejor que la del producto obtenido sobre resinas
tradicionales, pero la carga de la resina es normalmente menos
eficiente y/o la estabilidad química, en particular en medios
ácidos, no suele ser satisfactoria. Las resinas de
poliestireno-PEG son las que consiguen mayores
cargas, pero se obtiene un carácter anfífilo más bajo como
consecuencia de la disminución del contenido en PEG.
Con preferencia, el soporte sólido está basado
en un poliestireno, PEG tal como, por ejemplo, especialmente un
PS-PEG anfífilo o una matriz o resina polimérica de
polidimetilacrilamida.
De acuerdo con la presente invención, el péptido
se puede enlazar por vía de una cadena lateral de aminoácido,
habitualmente la cadena lateral del aminoácido
C-terminal salvo que dicho aminoácido sea el mismo
residuo de cisteína protegido con
S-t-Bu-sulfenilo de
acuerdo con la presente invención, o se puede enlazar por vía del
grupo \alpha-carboxi C-terminal a
una resina por vía de un enlace éster, tioéster o amida. Ejemplos
son soportes sólidos que tienen radicales aminometilo, carboxilo o
bromometilo, por ejemplo, o aquellos soportes que se han sometido a
derivación por medio de conectores o handles conocidos tales como,
por ejemplo, Wang, tritilo, 2-clorotritilo,
4-metoxitritilo, "amida Rink"
4-(2',4'-dimetoxibencilaminometil)fenoxi,
resina Sieber
9-amino-6-fenilmetoxixanteno,
4-hidroximetilfenoxiacetilo o ácido
4-hidroximetilbenzoico (requiriendo el último el
acoplamiento del primer aminoácido por medio de un protocolo de
esterificación catalizado con p-dimetilaminopiridina
que puede resultar en la racemización de aminoácidos susceptibles,
por ejemplo, Trp y en particular cisteína, véase Athernon, E. et
al., 1981, J. Chem. Soc. Chem. Commun., p.336 ff) linker.
Métodos para proporcionar enlaces tioéster en una resina han sido
descritos con detalle y a este respecto se puede hacer referencia a
WO 04/050686. En una modalidad preferida de la presente invención,
los enlaces tioéster para unir la mitad péptida a la fase sólida no
son reivindicados en la presente invención dado que son vulnerables
a piperidina al 20% y también al tratamiento con nucleófilos tal
como trifenilfosfina.
La amida Rink, la resina Sieber (Tetrahedron
Lett. 1987, 28, 2107-2110) o resinas similares del
tipo 9-amino-xantenilo, las resinas
PAL (Albericio et al., 1987, Int. J. Pept. Protein Research
30, 206-216) o los derivados de tritilamina
especialmente sustituidos de acuerdo con Meisenbach et al.,
1997, Chem. Letters, p. 1265 f.) son ejemplos de un enlazador o
handle de los cuales se genera o libera una
C\alpha-carboxamida tras la escisión del péptido
desde la resina o fase sólida. Ni que decir tiene que el uso de
tales enlazadores amídicos depende, como es lógico, del tipo de
síntesis en fase sólida realizada, es decir, ya sea una química de
protección Boc tradicional o ya sea una química de protección Fmoc
ortogonal, ahora usual, que se utilice para el acoplamiento; el
enlazador de resina amídico Boc-específico es PAM,
por ejemplo. Por tanto, las fases sólidas que comprenden dichos
grupos enlazadores reciben el nombre de "fases sólidas productoras
de amidas" en el presente contexto.
Con preferencia, el péptido es anclado en la
fase sólida bien por un enlace amida o un enlace éster por vía del
terminal C. Más preferentemente, la fase sólida es una fase sólida
sensible a los ácidos o lábil a los ácidos con respecto a la
escisión de la mitad peptidilo desde la fase sólida, incluso más
preferentemente es una fase sólida lábil al ácido y generadora de
amida. Dichas fases sólidas lábiles a los ácidos requieren al menos
0,1% de ácido difluoracético (TFA), más preferentemente al menos
0,5% de TFA en un disolvente aprótico polar para la escisión desde
la resina. Con suma preferencia, la fase sólida es una fase sólida
sensible a los ácidos que se escinde bajo condiciones débilmente
alcalinas, es decir, una cantidad de 0,1 a 10% de TFA en dicho
disolvente es suficiente para conseguir una eficiencia de escisión
de al menos 90% tras la incubación a temperatura ambiente durante
hasta 5 horas. Dichas fases sólidas altamente lábiles a los ácidos
son, por ejemplo, resinas de 2-clorotritilo, resina
Sieber, resina PAL o resina de ácido
4-(4-hidroximetil-3-metoxifenoxi)-butírico
(HMPB), dando lugar Siber y Rink a péptido amidado en el terminal C
tras la acidólisis. Dichas fases sólidas lábiles a los ácidos son
particularmente vulnerables a las químicas de desprotección sobre
resina respecto a los grupos de protección de la cadena lateral y,
por tanto, debe prestarse una atención particular en estos
casos.
En el caso del anclaje de la cadena lateral por
vía del residuo de cisteína C-terminal al grupo
handle de un soporte sólido, en enlace de conexión debe ser un
enlace tioéter o tioéster. Otros residuos adecuados para el anclaje
de la cadena lateral son los grupos carboxi de cadenas laterales
ácidas, grupos hidroxi y en particular el grupo
\varepsilon-amino de lisina. Ni que decir tiene
que en el caso del anclaje de la cadena lateral, generalmente el
grupo carboxi libre C-terminal ha de ser protegido
por esterificación o amidación antes de llevar a cabo la primera
reacción de acoplamiento, por ejemplo, empleando
Fmoc-Lys-carboxamida para la
reacción de enlace de la función amino de la cadena lateral a la
fase sólida.
En una modalidad preferida, la cisteína
protegida con S-terc-butilsulfenilo
es el residuo C-terminal del péptido y se enlaza
por vía del terminal carboxi por medio de un enlace éster o amida a
la fase sólida, con la condición de que dicho enlace de conexión no
sea una mitad éster bencílico sino preferentemente una resina lábil
a los ácidos que es escindida bajo condiciones de reacción
débilmente ácidas como se ha definido anteriormente. Una cisteína
C-terminal está particularmente expuesta a ser
objeto de racemización en condiciones ácidas.
La separación de grupos protectores
S-terc-butilsulfonilo respecto de la
cisteína por medio de reacción con fosfinas terciarias ha sido
descrita, por ejemplo, mediante el uso de tributilfosfina (Atherton
et al., 1985, J. Chem. Soc., Perkin I. 2057) y
trietilfosfina (Huang et al, 1997, Int. J. Pept. Protein Res.
48, 290). Se emplea la misma etapa de desprotección, de acuerdo con
la presente invención, para escindir el enlace disulfuro de la
N\alpha-3-[(2-carboxietil)-ditio]propionamida,
teniendo sus homólogos un número diferente de grupos metileno o del
compuesto de fórmula IV. El grupo
terc-butilsulfenilo se escinde más frecuentemente
por medio de reactivos tiólicos tal como, por ejemplo,
\beta-mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT) o
fosfinas terciarias (Huang et al., 1997 Int. J. Pept.
Protein Res. 48, 290; Rietmann et al., 1985, Recl. Trav.
Chim. Pays-Bas, 1141). Preferentemente, la fosfina
terciaria es trifenilfosfina o es una trifenilfosfina alquilada o
alcoxilada, tal como, por ejemplo,
tri-(p-metoxifenil)-fosfina o
incluso, más preferentemente, es una trialquilfosfina en donde el
alquilo puede ser el mismo o diferente y en donde cada alquilo es un
alquilo C_{1} a C_{7}, preferentemente C_{1} a C_{4}, y
puede ser alquilo ramificado o lineal. Con preferencia, el alquilo
es lineal. Ejemplos son metilo, etilo, propilo,
i-propilo, n-butilo,
i-butilo. En particular se prefieren
tri-n-butilfosfina y
trietilfosfina. El alquilo puede estar además opcionalmente
sustituido con halógeno, metoxi o etoxi o, si es compatible con el
sistema disolvente, carboxi o, preferentemente, está insustituido.
De manera sorprendente, de acuerdo con la presente invención, se ha
comprobado de forma inesperada que la escisión de disulfuro por
medio de fosfinas también se puede emplear con las resinas muy
lábiles a los ácidos escindibles en condiciones de reacción
débilmente ácidas, tal como la resina Sieber o
2-CTC, por ejemplo. Con frecuencia se observa que
los reactivos tiólicos reducen y, por tanto, escinden disulfuros
mediante la formación de productos de bisulfuro propiamente dichos.
Mientras que en el caso de DTT, se favorece el cierre de anillo
intramolecular, en el caso de
\beta-mercaptoetanol, es factible cualquier
producto de reacción intramolecular, por ejemplo, por vía de la
reacción del intercambio de disulfuro. Además, entonces, incluso los
disulfuros recientemente formados pueden experimentar una reacción
de intercambio adicional. El amplio uso de reactivos tiólicos
conduce aparentemente al temor de reacciones secundarias tal como,
por ejemplo, fugas desde la resina cuando se emplean reactivos de
fosfinas terciarias.
Los reactivos de acoplamiento para la síntesis
de péptidos son bien conocidos en la técnica (véase Bodanszky, M.,
Principles of Peptide Synthesis, 2^{nd} ed. Springer Verlag
Berlin/Heidelberg, 1993; también véase la explicación del papel de
los aditivos o auxiliares de acoplamiento allí descritos). Los
reactivos de acoplamiento pueden ser anhídridos mixtos (por
ejemplo, T3P: anhídrido propano fosfónico) u otros agentes
acilantes tales como ésteres o halogenuros de ácido activos (por
ejemplo, ICBF, cloroformato de isobutilo) o pueden ser
carbodiimidas (por ejemplo,
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida),
derivados activos de benzotriazina (DEPBT:
3-(dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotriazina-4(3H)-ona)
o derivados de sales de uronio o fosfonio de benzotriazol.
A la vista de lograr el mejor rendimiento, un
tiempo de reacción corto y la protección contra la racemización
durante el alargamiento de la cadena, es más preferible que el
reactivo de acoplamiento se seleccione del grupo consistente en
sales de uronio y sales de fosfonio del benzotriazol capaces de
activar una función de ácido carboxílico libre, junto con la
condición de que la reacción se lleve a cabo en presencia de una
base. Ejemplos adecuados y también preferidos de sales de
acoplamiento a base de uronio o fosfonio son, por ejemplo:
HBTU (hexafluorfosfato de
O-(1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio),
BOP (hexafluorfosfato de
benzotriazol-1-iloxi-tris
(dimetilamino)fosfonio),
PiBOP (hexafluorfosfato de
benzotriazol-1-iloxi-tripirrolidinofosfonio),
PiAOP, HCTU (hexafluorfosfato de
O-(1H-6-clorobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio),
TCTU (tetrafluoroborato de
O-1H-6-clorobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio),
HATU (tetrafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio),
TATU
(tetrafluoroborato de
O-(7-azabenzotriazol-1
-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio),
TOTU (tetrafluoroborato de
O-[ciano(etoxicarbonil)metileneamino]-N,N,N',N'-tetrametiluronio),
HAPyU (hexafluofosfato de
O-(benzotriazol-1-yl)oxydipyrrolidinouronium
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, cuando se utiliza DEPBT o
similar, reactivos de sales de uronio o fosfonio, se necesita otro
reactivo o segundo reactivo de base débil para llevar a cabo la
etapa de acoplamiento.
Esto coincide con el uso de una base cuyo ácido
conjugado tenga un valor pKa de 7,5 a 15, más preferentemente de
7,5 a 10, con la exclusión de una función
\alpha-amino de un péptido o aminoácido o derivado
de aminoácido, y cuya base es preferentemente una amina terciaria
estéricamente impedida. Ejemplos de dicha otra base preferida son
la base de Hünig (N,N-diisopropiletilamina),
N,N-dialquilanilina,
2,4,6-trialquilpiridina o
N-alquilmorfolina, siendo el alquilo un alquilo
C_{1}-C_{4} lineal o ramificado, y siendo más
preferentemente N-metilmorfolina o colidina
(2,4,6-trimetilpiridina), con suma preferencia
colidina. Ejemplos de alquilo C_{1}-C_{4} son,
por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo,
n-butilo, terc-butilo,
isobutilo.
El uso de aditivos de acoplamiento, en
particular de aditivos de acoplamiento del tipo benzotriazol, es
también conocido (véase Bodanszky, supra). Su uso es
particularmente preferido cuando se emplean antes de dichos
reactivos de acoplamiento de sales de uronio o fosfonio altamente
activantes. Por tanto, es preferible además que el aditivo reactivo
de acoplamiento sea un compuesto hidroxi nucleófilo capaz de formar
ésteres activos, teniendo más preferentemente una función
N-hidroxi ácida nucleófila en donde N es imida o es
N-acilo o triazeno
N-arilo-sustituido, con suma
preferencia el aditivo de acoplamiento es un derivado de
N-hidroxibenzotriazol (o un derivado de
1-hidroxi-benzotriazol) o es un
derivado de N-hidroxibenzotriazol. Dichos compuestos
N-hidroxi como aditivos de acoplamiento han sido
descritos de forma extensa y amplia en WO 94/07910 y
EP-410 182, cuyas respectivas descripciones se
incorporan aquí solo con fines de referencia. Ejemplos son, por
ejemplo, N-hidroxisuccinimida,
N-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina
(HOOBt),
1-hidroxi-7-azabenzotriazol
(HOAt) y N-hidroxibenzotriazol (HOBt). En
particular se prefieren los derivados de
N-hidroxibenzotriazina y, en una modalidad sumamente
preferida, el aditivo reactivo de acoplamiento es
hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina.
Los compuestos de sales amónicas de aditivos de acoplamiento son
conocidos y su uso en la química de acoplamiento ha sido descrito
por ejemplo, en US 4806641.
En otra modalidad particularmente preferida, el
reactivo de acoplamiento de sal de uronio o fosfonio es un reactivo
de sal de uronio, preferentemente HCTU, TCTU o HBTU, más
preferentemente HCTU o TCTU, y con suma preferencia se emplea en la
reacción en combinación con
N-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina
o una sal de la misma. Esta modalidad se prefiere especialmente
para utilizarse en la etapa de alargamiento de la cadena en la
síntesis del péptido después de la separación del grupo
N\alpha-protector lábil a las bases, pero también
se puede emplear para la reacción de lactamización durante la
ciclización de la cadena lateral.
En el contexto de la presente invención, ha de
observarse que HCTU y TCTU se definen como estando abarcados por el
término "reactivo de sal de uronio" a pesar de que estos
compuestos y posibles análogos comprenden, como se ha demostrado,
una mitad isonitroso en lugar de una mitad uronio por medio de
análisis de la estructura cristalina (O. Marder, Y. Shvo, y F.
Albericio "HCTU and TCTU: New Coupling Reagents: Development and
Industrial Applications". Poster, Presentation Gordon Conference
February 2002), proporcionando, en su lugar, un sustituyente
n-amidino en el núcleo heterocíclico a una
estructura de guanidinio. En el presente contexto, dicha clase de
compuestos recibe la denominación de "subclase de tipo
guanidinio" de reactivos de sal de uronio de acuerdo con la
presente invención.
La desprotección del N\alpha lábil a las bases
se puede efectuar tal como se describe usualmente en la técnica,
por ejemplo, con 20% de piperidina en
N-metilmorfolina en el caso de la química Fmoc. De
forma más amplia, la química de protección Fmoc o Boc para el
terminal N se aplica normalmente en síntesis en fase sólida pero en
la técnica se conocen otras químicas de protección N\alpha
opcionales que pueden aplicarse cuando no interfieran con la
presente invención para desarrollar la ciclización de péptidos
portadores de disulfuro del péptido conjugado con la resina.
La referida química de acoplamiento también se
puede emplear para el acoplamiento del compuesto de fórmula IV,
R_{7}-SS-[CH_{2}]_{2}-COOH
como se ha definido anteriormente. Este compuesto se puede producir
fácilmente, por ejemplo, mediante reacción de la respectiva
dicarboximida simétrica, por ejemplo, con un alcanol o
alquilamina.
La ciclización se lleva a cabo de acuerdo con la
presente invención en presencia de una primera base débil en un
disolvente orgánico aprótico polar. El reactivo de oxidación que
media la ciclización puede ser cualquiera mencionado en Chan and
White, eds., "Fmoc Solid-phase Peptide
Synthesis", Oxford University Press 2000, p. 91 a 114:
glutationa en tampón acuoso, DMSO, ferricianuro potásico, reactivo
de Ellman 5,5'-ditiobis-(ácido
2-nitrobenzoico), yodo, trifluoracetato de
talio(III), sulfóxido de alquiltriclorosilano, oxidación
mediada por trifluormetanosulfonato de plata-DMSO
en un medio fuertemente ácido, en donde no es del todo impracticable
para su uso en la ciclización sobre resina en otro sistema
disolvente orgánico para la solvatación del péptido protegido, tal
como es la oxidación mediada con carbón vegetal. Otro método general
reside en el uso de cloruro de carboetoxisulfenilo para la
formación del enlace disulfuro (Le-Nguyen, D., 1986,
Int. J. Peptide Protein Res. 27, 285-292). Teniendo
en cuenta el sistema disolvente, en una modalidad preferida la
ciclización se efectúa mediante oxidación mediada por DMSO como se
describe con mayor detalle, por ejemplo, en US 5144006, haciendo
que el DMSO sea un oxidante y a la vez un
co-disolvente miscible además de los disolventes a
continuación mencionados, eventualmente en presencia de pequeñas
cantidades de agua. El DMSO proporciona velocidades de reacción
aceptablemente rápidas, es un co-disolvente
desnaturalizante y ayuda a solubilizar el sustrato péptido.
Teniendo en cuenta su efecto oxidante sobres las cadenas laterales
de metionina, su uso en la ciclización sobre resina, antes de la
desprotección de las cadenas laterales del aminoácido, es mucho más
conveniente que su uso normal en solución con péptidos
desprotegidos.
En una modalidad sumamente preferida, dicha
ciclización se realiza en presencia de aire y/u oxígeno, pero
especialmente en ausencia de un catalizador heterogéneo, acelerador
de la velocidad, para lograr la oxidación de los grupos tiol con el
fin de formar enlaces disulfuro. Con preferencia, la ciclización se
lleva a cabo en ausencia sustancialmente de catalizador, es decir,
en ausencia de una cantidad catalíticamente eficaz o sustancial de
un catalizador heterogéneo.
De acuerdo con la presente invención y en
particular cuando se lleva a cabo con aire y/u oxígeno como
reactivo oxidante, más preferentemente con aire/oxígeno en ausencia
de dicho catalizador heterogéneo o en fase sólida, la etapa de
ciclización de acuerdo con el presente método es eficiente de forma
notable y solo requiere alrededor de 0,5 a 2 horas de tiempo de
reacción, permitiendo ello una conversión completa, literalmente
cuantitativa, del educto al producto deseado bajo condiciones de
reacción muy suaves (temperatura ambiente normalmente, siendo el
intervalo de temperatura conveniente de 10ºC a 80ºC aunque, como es
lógico, ha de tenerse en cuenta la temperatura de reflujo del
disolvente). Sin que exista precedente alguno, en esta situación
todavía es completa la conversión. Esto constituye un logro
sobresaliente que todavía no ha sido conseguido en la ciclización
del péptido activada por enlaces disulfuro, ni todavía han sido
contempladas dichas condiciones de reacción de ciclización simples,
suaves y rápidas con anterioridad. Jamás surgen problemas tediosos
de mezcla y separación para un catalizador heterogéneo. Al mismo
tiempo, la velocidad de reacción es totalmente paralela con aquella
de la reacción portadora de catalizador del estado de la técnica.
Debido al curso de reacción directo, casi se evita por completo la
formación de productos secundarios.
Disolventes apróticos polares adecuados son, por
ejemplo, acetonitrilo, dimetilformamida, diclorometano,
N-metilpirrolidona, tetrahidrofurano. En contraste
con agua, dicho disolvente normalmente puede no disolver
físicamente cantidades relevantes de oxígeno para suministrar la
formación oxidativa de enlaces disulfuro como se ha descrito con
anterioridad para los sistemas catalíticos acuosos.
Por tanto, debe prestarse atención al suministro
de aire, aire/oxígeno u oxígeno puro. El aire/oxígeno se puede
suministrar mediante un diseño especial de propulsores de agitación
a fondo o de formación de vórtices, utilizados para la agitación,
pulverización de gas en el líquido. El gas puede ser aire u oxígeno
puro o aire enriquecido con oxígeno. En una modalidad
particularmente preferida, el área superficial grande del fondo y/o
paredes del recipiente reactor está perforada con el fin de rociar
gas en el líquido, bajo agitación a fondo.
También es posible utilizar diferentes modos de
protección para cisteínas en uno de los péptidos de la presente
invención. Por ejemplo, otras cisteínas en la cadena péptida pueden
ser protegidas tradicionalmente por grupos protectores Acm, para
proporcionar otro enlace disulfuro regio-específico
entre cisteínas internas por medio de oxidación convencional con
yodo en solución después de la escisión a partir de la resina y
después de que el enlace disulfuro inicial de acuerdo con la
presente invención ha tenido lugar sobre la resina.
El primer reactivo de base débil es una base
débil cuyo ácido conjugado tiene un valor pKa de 7,5 a 16, más
preferentemente de 8 a 10, y con preferencia es una amina terciaria
estéricamente impedida. Ejemplos preferidos de dichas y otras bases
son la base de Hünig (N,N-diisopropiletilamina),
N,N-dialquilanilina,
2,4,6-trialquilpiridina o
N-alquilmorfolina, siendo el alquilo un alquilo
C_{1}-C_{4} lineal o ramificado, tal como
metilo, etilo, n-propilo,
i-propilo, n-butilo, siendo con suma
preferencia N-metilmorfolina, colidina
(2,4,6-trimetilpiridina) o base de Hünig.
Preferentemente, la separación de los grupos
protectores de disulfuro, concretamente la separación del grupo
S-terc-butil-sulfenilo,
se efectúa en presencia de un primer reactivo de base débil para
evitar cualquier riesgo de fuga desde la resina por una pequeña
acidólisis, es decir, a un pH de 7,5 a 2, más preferentemente de 8
a 11. Opcionalmente, mediante el uso de disolventes apróticos
polares, tal como THF o acetonitrilo, que son libremente miscibles
con agua, para esa finalidad se pueden utilizar sales básicas tal
como, por ejemplo, acetato sódico en solución acuosa. Esta
modalidad es preferible particularmente cuando se emplean fosfinas
terciarias para dicha etapa de escisión o separación del grupo
disulfuro. Combinando un suministro de oxígeno adecuado junto con
dicha separación del grupo protector de disulfuro, puede ser
posible, en otra modalidad de la presente invención, por ejemplo,
cuando se utiliza un disolvente orgánico aprótico polar junto con el
suministro de oxígeno en presencia de una amina terciaria y cuando
se emplea fosfina terciaria para la desprotección que es inerte al
oxígeno, como decíamos es posible llevar a cabo tanto la
desprotección de disulfuro como la ciclización no solo en un único
recipiente de reacción sino incluso como una sola etapa de
reacción.
Dado que el presente método permite la
ciclización sobre resina, no se necesita por tanto una fuerte
dilución tediosa y que disminuye el rendimiento del péptido para
favorecer la ciclización
intra-sobre-intermolecular como
previamente ha sido necesario en la mayoría de los métodos descritos
en el estado de la técnica.
El modo de operación de la invención sobre
resina permite una ciclización intra-molecular
rápida y eficiente únicamente, sin que surja en absoluto la
posibilidad de dimerización.
En otra modalidad preferida, el péptido es el
péptido de fórmula I. El término "grupo protector" ha de
considerarse como siendo un grupo protector para una funcionalidad
determinada de una cadena lateral o para una cadena lateral
específica, cuyo grupo protector pueda ser utilizado sin
complicación alguna en la síntesis de péptidos en fase sólida con
terc-butoxicarbonil (Boc) o
9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), convencional.
Dichos grupos protectores, así como el uso de grupos protectores
específicos para funcionalidades específicas de una cadena lateral,
son bien conocidos en la técnica y constituye una técnica usual
(véase Chan et al., ed., supra; Bodanszky et
al. supra).
En otra modalidad posible, el péptido es
opcionalmente sintetizado sobre una fase sólida no mediante unión
covalente permanente de la mitad peptidilo a una fase sólida, sino
por unión reversible no covalente a la fase sólida por medio de un
complejo de quelato metálico estable (revelación del producto hecha
de forma conjunta por Lonza AG, Base, Switzerland y AplaGen GmbH,
Baesweiler, Germany, Octubre 2004), similar a la tecnología ya
establecida de hexa-His tag empleada en la
purificación de proteína. Dichas modalidades futuras de enlace a la
fase sólida no covalente o similar, quedan abarcadas por la presente
invención, así como el modo preferido de poner en práctica la
presente invención como se ha indicado anteriormente y como se
aplicará también a esta modalidad en la forma indicada a
continuación.
Los péptidos ciclizados de manera favorable y
conjugados en fase sólida adecuados, han sido descritos con
anterioridad y su combinación con las modalidades preferidas citadas
anteriormente y a continuación, constituyen otros objetos de la
presente invención.
Un primer objeto es un péptido de fórmula I
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R4, R5 son H o un grupo
protector de Arg, R2 es un grupo protector de ácido carboxílico y R3
es un grupo protector de Trp y R1 es una fase sólida en una unión
con enlace tioéster, éster o amida a la espina dorsal del
péptido.
Con preferencia, en dicho péptido R4, R5 son H y
R3 es N-benciloxicarbonilo y R2 es
terc-butilo.
Preferentemente, dicha fase sólida es una resina
Sieber u otra resina que comprenda un enlazador o handle generador
de amida que, consecuentemente, constituye una unión con enlace
amida a la espina dorsal del péptido.
Un segundo objeto es un péptido, preferentemente
un péptido que comprende al menos un grupo protector de la cadena
lateral de aminoácido, en donde el péptido está unido a una fase
sólida por vía del residuo C-terminal o por vía de
una cadena lateral de aminoácido, caracterizado porque el péptido es
un péptido cíclico que comprende una mitad de fórmula II
\vskip1.000000\baselineskip
en donde n y m se eligen de manera
independiente en el intervalo de 1 a 10, preferentemente n es 2 y m
es 1 (proporcionando una mitad cisteinilo), N\alpha es el
nitrógeno N-terminal de la espina dorsal del
péptido y C* es el C\alpha de un residuo de aminoácido de la
espina dorsal del péptido, siendo R6 la mitad cíclica
N-terminal de la espina dorsal del péptido que
termina con dicho N\alpha, y siendo R5 la mitad
C-terminal de la espina dorsal del péptido que está
unida a la fase sólida, con la condición de que N no es N\alpha,
y en donde preferentemente R6 comprende al menos 3, más
preferentemente al menos 4 residuos de aminoácido intervinientes.
Para mayor claridad, R5 ha de ser considerado como
C*H(-CO-NH-R') o
C*H(-CO-O-R') o eventualmente
C*H(-CO-S-R'), comprendiendo R' una
fase sólida que posiblemente incluye un enlazador o handle, R5 y
opcionalmente un número de residuos de aminoácido enlazados a dicha
fase sólida. Con preferencia, R5 y R6 comprenden hasta 200, más
preferentemente hasta 100, con suma preferencia hasta 50 residuos de
aminoácido.
Un objeto más es un péptido, preferentemente un
péptido que comprende al menos un grupo protector de la cadena
lateral de aminoácido distinto de un grupo
S-terc-butilsulfenilo en un residuo
de cisteína, homo- o nor-cisteína, cuyo péptido
está enlazado a una fase sólida por vía del residuo
C-terminal, caracterizado porque el péptido
comprende al menos un residuo de cisteína, homo- o nor- cisteína que
está protegido en su cadena lateral por un grupo
S-terc-butilsulfenilo y que está
sustituido en el terminal N en su N\alpha para constituir una
mitad amida de fórmula III
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde n es 1 a 10,
preferentemente n es
2.
De nuevo uno objeto más consiste en un péptido,
preferentemente un péptido que comprende al menos un grupo
protector de la cadena lateral de aminoácido distinto de un grupo
S-terc-butilsulfenilo en un residuo
de cisteína, homo- o nor-cisteína, cuyo péptido está
enlazado a una fase sólida por vía del residuo
C-terminal, caracterizado porque el péptido
comprende al menos un residuo de cisteína, homo- o
nor-cisteína que tiene un grupo tiol libre en su
cadena lateral y que está sustituido en el
N-terminal en su N\alpha para constituir la mitad
amida de fórmula III
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde n es 1 a 10,
preferentemente n es
2.
Similarmente, dichos péptidos del último y
penúltimo objeto de la presente invención comprenden de nuevo
preferentemente hasta 200, más preferentemente hasta 100, con suma
preferencia hasta 50 residuos de aminoácido. Ni que decir tiene que
la elección de la resina tendrá también un impacto sobre el
rendimiento obtenido a la hora de sintetizar péptidos muy largos, e
incluso puede ser un requisito previo para sintetizar péptidos de
100 residuos de aminoácido y el empleo de más resinas de PEG, por
ejemplo, puede ser normalmente una buena elección para tal caso.
Además, ni que decir tiene que la secuencia individual de
aminoácidos del péptido puede muy bien influenciar la longitud
máxima de la cadena y la eficiencia de acoplamiento obtenible con
un péptido determinado; un ejemplo ampliamente conocido es la
agregación inter-cadenas desfavorable de hebras
péptidas durante la síntesis lineal como consecuencia de la
formación \beta-laminar y unión entre las
cadenas.
Se seleccionó eptifibatide como un péptido
modelo protegido para la ciclización sobre resina, con objeto de
desarrollar el nuevo método mejorado de la presente invención; con
anterioridad, se ha descrito en US 5.318.899 un método de síntesis
en fase sólida para eptifibatide.
La estrategia global de síntesis se indica en la
tabla I a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La síntesis de
Fmoc-Cys(S-tBu)-OH
ha sido descrita ya con anterioridad (Rietman et al., 1994,
Synth, Commun v24, p.1323 f). La resina Sieber fue un producto de
Novabiochem y se adquirió en Calbiochem-Novabiochem
(perteneciente a EMD Biosciences, California/USA). Todos los
aminoácidos Fmoc, incluyendo
Fmoc-Cys(S-tBu)-OH
(cat. No. B-1530) fueron adquiridos en Bachem AG
(Bubendorf, Switzerland).
La carga de resina fue de 0,52 mmol/g y un total
de 10 g de resina Sieber. El tiempo de acoplamiento durante la
carga fue de dos veces el tiempo de acoplamiento convencional,
concretamente 60 minutos en total. Los acoplamientos fueron
realizados con 2 eq. de cada uno de
6-cloro-HOBt, TCTU, base de Hünig
(diisopropiletilamina), en diclorometano. Los lavados fueron con
N-metilpirrolidona (NMP).
La desprotección Fmoc fue realizada en 3 ciclos
de 15 minutos, 10% de piperidina en
N-metilpirrolidona, la eficiencia de la escisión y
el término de la síntesis se analizaron mediante reacción con
ninhidrina y HPLC de fase inversa, respectivamente.
El acoplamiento del residuo
Fmoc-Har (Bachem, Bubendorf, Switzerland) tuvo lugar
en presencia de 1 eq. de HOBt por eq. de aminoácido (para mantener
protonado el grupo guanidino); el aminoácido Fmoc fue incubado
previamente con HOBt y 1 eq. de diisopropilcarbodiimida en NMP y
luego se mezcló con la resina. El acoplamiento de Har requirió 180
minutos (otro aa: 30 min) seguido por un segundo ciclo con reactivos
reconstituidos de aproximadamente 60 minutos. De este modo, se
podría coincidir con la eficiencia de acoplamiento estándar de
99,8% como para los otros residuos. La escisión Fmoc tuvo lugar como
anteriormente. En concreto, después de la escisión Fmoc y
posteriores lavados con NMP, el lavado repetido con HOBt fue
realizado para prevenir el hinchamiento adicional de la resina.
Nota: el acoplamiento prolongado empleando TCTU
es también factible para el acoplamiento de Arg sin utilizar ningún
grupo protector distinto del apareamiento iónico anterior con HOBt.
El apareamiento iónico adicional con HOBt es una modalidad
preferida en comparación con el uso de la química de protección de
acoplamiento covalente para Arg, tal como, por ejemplo, pbf, lo
cual puede resultar problemático en relación con las reacciones
secundarias durante la desprotección.
La reacción con
3,3'-ditiopropionimida (Novabiochem) tuvo lugar en
DMF enfriada a menos de 10ºC en un baño de hielo. Se añadió 1 eq.
de diisopropilcarbodiimida a la mezcla de reacción durante 10
minutos con agitación, mientras se controlaba la temperatura para
que permaneciera por debajo de 15-20ºC. A
continuación, la mezcla de reacción se añadió al producto de
péptido unido a resina, desprotegido, de la sección 1.2. Se dejó
proceder el acoplamiento durante 6 horas a temperatura ambiente.
Se escindieron partes alícuotas de productos de
reacción a partir de la resina con 60% de TFA y se analizó mediante
LC-(electropulverización) MS. La conversión fue cuantitativa, aunque
se detectaron dos picos principales de producto (<25%) de
producto secundario: dipéptido). Por tanto, el rendimiento para esta
etapa fue de >75%.
\vskip1.000000\baselineskip
La resina se suspendió y se lavó tres veces en
tetrahidrofurano (THF). La reacción se llevó a cabo durante hora a
temperatura ambiente con 50 eq. de tributilfosfina reconstituida
como 19% (v/v) PBu3/77% (v/v) THF/4% (v/v) solución acuosa saturada
de acetato sódico; la sal precipitada se separó por filtración antes
de su uso. La reacción procedió de manera uniforme para
proporcionar un pico dominante de producto. El rendimiento fue
determinado por HPLC de fase inversa y resultó una cantidad de 98,9%
de producto puro.
\vskip1.000000\baselineskip
{}\hskip3,4cm6
1.5
Ciclización para dar
Mpa-Har-Gly-Asp(tBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys-Sieber
El conjugado de péptido-resina
de 1.4 se lavó para hincharlo y luego se lavó 3 veces en NMP. La
ciclización se llevó a cabo incubando la resina durante 1 hora a
temperatura ambiente con 6% de DIEA (base de Hünig) en NMP; la
reacción se efectuó en un recipiente de vidrio vertical que
comprendía, en su porción inferior una frita de vidrio G3
(16-40 \mum) sellada y que bisectaba de manera
horizontal. La frita de vidrio o placa fritada fue ventilada con
aire desde la parte inferior, permitiendo que el aire burbujeara de
un lado a otro de toda la sección transversal del espacio de
reactante cubierto con disolvente por encima de la frita, en donde
la resina quedó flotando mediante el burbujeo de aire procedente
desde la parte inferior. Se obtuvo un producto uniforme,
estrictamente puro, sin que aparecieran productos secundarios
distintos o fragmentados después de esta etapa de reacción. La
conversión a producto fue de 100%, determinada independientemente
por HPLC de fase inversa y por LC-MS. La
RP-HPLC se llevó a cabo en una columna
Hypersil-Keystone^{TM} Betabasic (Thermo Electron
Corp., Waltham Mass/USA) C18 150 x 4,6 mm, con un volumen de
inyección de 15 \mul y detección en 262 nm a una temperatura de
la columna de 35ºC. Se practicó
gradiente.
gradiente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La desprotección global fue preparada hinchando
la resina tres veces en diclorometano (DCM). La mezcla de la fase de
reacción de escisión fue preparada para que estuviera constituida
por
\vskip1.000000\baselineskip
- 86,5%
- TFA (785 eq.)
- 4,5%
- Tioanisol (36.5 eq.)
- 3%
- Fenol (32.4 eq.)
- 3%
- DCM (38 eq.)
- 3%
- H2O (178 eq.)
\newpage
La reacción tuvo lugar a 15ºC durante 2 horas en
un dispositivo sacudidor orbital que giraba lentamente. La reacción
fue terminada y el producto se precipitó, después de separar la
resina por filtración, mediante la adición gota a gota de éster
metílico de ácido terc-butírico. El producto
consistía en un pico uniforme; no pudo detectarse ningún producto
secundario principal. Las condiciones anteriores de la desprotección
global han sido ensayadas utilizando un control y se comprobó que
no afectaban a los puentes disulfuro preformados en los péptidos.
La conversión en esta última etapa fue de >99%, tal como se
determinó por RP-HPLC y LC-MS, como
se indica detalladamente en la sección 1.5 anterior.
Claims (16)
1. Método de síntesis de péptidos, que comprende
las etapas de:
- a.
- sintetizar un péptido enlazado a una fase sólida cuyo péptido comprende al menos un residuo de cisteína, homo- o nor-cisteína, cuya cisteína es protegida en su cadena lateral por un grupo S-terc-butilsulfenilo; y
- b.
- ya sea acoplar N-terminalmente otro aminoácido que tiene un radical 3-[(2-carboxietilo)ditio]propionilo en su N\alpha u, o desproteger el N\alpha del aminoácido N-terminal y reaccionar el N\alpha libre con 3,3'-ditiopropionimida para proporcionar la correspondiente N\alpha-3-[(2-carboxietil)ditio]propionamida, o desproteger el N\alpha del aminoácido N-terminal y reaccionar el N\alpha libre con un compuesto de fórmula IV
IVR_{7}-S-S-[CH_{2}]_{2}-COOH
- en donde R_{7} es arilo-, incluyendo heteroarilo-, o es aralquilo-, alquilarilo- o alquilo- que puede estar además sustituido con halógeno, amido, éster y/o éter; y
- c.
- reaccionar el péptido con un reactivo separador del grupo protector S-terc-butilsulfenilo, y
- d.
- ciclizar el péptido sobre resina por medio de la formación de un enlace disulfuro, con preferencia ciclizar el péptido en presencia de aire y/u oxígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicha cisteína se encuentra a por lo
menos 3, más preferentemente por lo menos 5 residuos de aminoácidos
separada del residuo de aminoácido N-terminal de
dicho péptido.
3. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la resina de fase sólida se elige entre
2-clorotritilo (CTC) o una resina productora de
amida.
4. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque el péptido tiene al menos otro grupo
protector de la cadena lateral que incluye otros residuos de
cisteína, homo- o nor-cisteína protegidos de manera
diferente.
5. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la cisteína es el último residuo
C-terminal.
6. Método según la reivindicación 1 o 6,
caracterizado porque la separación de al menos el grupo
S-terc-butilsulfenilo se lleva a
cabo por reacción del péptido con una trialquilfosfina.
7. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la péptido es ciclizado en presencia de
una base débil en un disolvente aprótico polar.
8. Método según la reivindicación 1 o 7,
caracterizado porque el enlace del péptido a la fase sólida
es lábil a los ácidos, preferentemente lábil en 60% de TFA en
diclorometano a temperatura ambiente.
9. Método según la reivindicación 5,
caracterizado porque la resina es una resina Sieber.
10. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque en una etapa posterior, el péptido se
escinde de la resina, preferentemente bajo condiciones de
desprotección global.
\newpage
11. Péptido de fórmula I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R4, R5 son H o un grupo
protector de Arg, R2 es un grupo protector de ácido carboxílico y R3
es un grupo protector de Trp y R1 es una fase sólida en una unión
con enlace tioéster, éster o amida a la espina dorsal del
péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Péptido según la reivindicación 11,
caracterizado porque R4 y R5 son H y R3 es N-
benciloxicarbonilo y R2 es terc-butilo.
13. Péptido según la reivindicación 12,
caracterizado porque la fase sólida es una resina Sieber que
consecuentemente está enlazada mediante un enlace amida a la espina
dorsal del péptido.
14. Péptido, preferentemente un péptido que
comprende al menos un grupo protector de la cadena lateral de
aminoácido, en donde el péptido está unido a una fase sólida por vía
del residuo C-terminal o por vía de una cadena
lateral de aminoácido, caracterizado porque el péptido es un
péptido cíclico que comprende una mitad de fórmula II
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde n y m se eligen de manera
independiente en el intervalo de 1 a 10, preferentemente n es 2 y m
es 1 (proporcionando una mitad cisteinilo), N\alpha es el
nitrógeno N-terminal de la espina dorsal del péptido
y C* es el C\alpha de un residuo de aminoácido de la espina
dorsal del péptido, siendo R6 la mitad cíclica
N-terminal de la espina dorsal del péptido que
termina con dicho N\alpha, y siendo R5 la mitad C- terminal de la
espina dorsal del péptido que está unida a la fase sólida, con la
condición de que N no es N\alpha, y en donde preferentemente R6
comprende al menos 3, más preferentemente al menos 4 residuos de
aminoácido
intervinientes.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Péptido, preferentemente un péptido que
comprende al menos un grupo protector de la cadena lateral de
aminoácido distinto de un grupo
S-terc-butilsulfenilo en un residuo
de cisteína, homo- o nor-cisteína, cuyo péptido
está enlazado a una fase sólida por vía del residuo
C-terminal, caracterizado porque el péptido
comprende al menos un residuo de cisteína, homo- o
nor-cisteína que está protegido en su cadena lateral
por un grupo S-terc-butilsulfenilo
y que está sustituido en el terminal N en su N\alpha para
constituir una mitad amida de fórmula III
en donde n es 1 a 10,
preferentemente n es
2.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Péptido, preferentemente un péptido que
comprende al menos un grupo protector de la cadena lateral de
aminoácido distinto de un grupo
S-terc-butilsulfenilo en un residuo
de cisteína, homo- o nor-cisteína, cuyo péptido
está enlazado a una fase sólida por vía del residuo
C-terminal, caracterizado porque el péptido
comprende al menos un residuo de cisteína, homo- o
nor-cisteína que tiene un grupo tiol libre en su
cadena lateral y que está sustituido en el
N-terminal en su N\alpha para constituir la mitad
amida de fórmula III
en donde n es 1 a 10,
preferentemente n es
2.
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