CN101111510A

CN101111510A - 树脂上肽环化

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Publication number: CN101111510A
Application number: CNA2005800435892A
Authority: CN
Inventors: S·瓦雷; O·韦尔比茨基; T·赛特
Original assignee: Lonza AG
Current assignee: Peptide laboratories (PPL) holding company
Priority date: 2004-10-19
Filing date: 2005-10-18
Publication date: 2008-01-23
Anticipated expiration: 2025-10-18
Also published as: DK1805203T3; KR20120088855A; US20080200647A1; EP1805203A2; ATE455123T1; AU2005298991A1; WO2006045483A2; JP4927746B2; US7994280B2; CN101111510B; AU2005298991B2; IL182575A0; EP1805203B1; PT1805203E; BRPI0516929A; TW200628487A; WO2006045483A3; IL182575A; DE602005018952D1; KR101222774B1

Abstract

肽合成方法，包括步骤：a.合成连接于固相的肽，该肽含至少一个半胱、高－或去甲－半胱氨酸残基，所述半胱氨酸在其侧链受S－叔丁基－硫基的保护；b.使在Nα上具有3，3’－二硫代－(1－羧基－丙基)－丙酰－基团的另一氨基酸发生N－末端偶联，或使N－末端氨基酸的Nα脱保护并使游离Nα与3，3’－二硫代－丙酸亚胺反应获得相应的Nα－3，3’－二硫代－(1－羧基－丙基)－丙酰胺，或使N－末端氨基酸的Nα脱保护并使游离Nα与式IV R7－S－S－[CH₂]₂－COOH的化合物反应，R7是包括杂核芳基的芳基－或是芳烷基－、烷基芳基－或烷基－，其可进一步被卤素、氨基、酯、羧基或醚取代，c.使该肽与S－叔丁基－硫基－保护基去除剂反应，d.形成二硫键使肽环化，优选在空气和/或氧气的存在下环化所述肽。

Description

树脂上肽环化

本发明涉及在固相肽合成(SPPS)中形成二硫键的方法。

可采用多种保护基来保护半胱氨酸残基，例如三苯甲基、乙酰氨基甲基-、叔丁基、三甲基乙酰氨基甲基、2，4，6-三甲氧基苄基、甲氧基三苯甲基、叔丁基硫基(t-butylsulfenyl)。

在肽合成过程中最常见的是使用三苯甲基进行标准半胱氨酸侧链保护。在对随后环化成胱氨酸的半胱氨酸的保护中，最广泛使用的是伴随碘氧化作用的乙酰氨基甲基(acm)-保护基(Kamber等，1980，Helv.Chim.Acta 63，899-915；Rietman等，1994，Int.J.Peptide Protein Res.44，199-206)。

已描述了除碘以外的多种氧化剂，它们使得胱氨酸得以在液相肽环化作用中形成(例子来源于Albericio等，在Chan和White编辑的“FMOC Solid-phasePeptide Synthesis”《FMOC固相肽合成》，Oxford university Press 2000，第91-114页：水性缓冲液中的谷胱甘肽、DMSO、铁***、Ellman试剂5，5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)、碘、三氟乙酸铊(III)、烷基三氯甲硅烷-亚砜、三氟甲烷磺酸银-DMSO(在强酸性中介导氧化作用)。

通常，所有的这些方法都会产生不希望的多种副产物，且需要将反应时间延长到10-20小时来获得最佳产率。

Volkmer-Engert等(J.Peptide Res.51，1998，365-369)描述了使用溶于水性溶剂中的氧进行的炭催化的二硫键的氧化形成。仔细控制证明了自然溶解于水性介质的一定量的氧气是必需的，且足以用氧负载炭来进行氧化反应。与传统没有催化剂存在的空气鼓泡法(air-sparging)相比，使用炭显著加速了反应速度。

使用炭就不可避免地需要在均相溶液中而不是在树脂上进行该反应；后继的脱保护反应步骤不能耐受炭的继续存在，虽然不可能从肽-树脂固相上去除炭。

WO 03/093302描述了从固相上释放后的含色氨酸的肽在溶液中的环化。该肽带有C-末端半胱氨酰-羧酰胺(carboxamide)，其侧链巯基官能团未被保护，且还用3-巯基-丙酰胺或3，3’-二硫代-(1-羧基-丙基)丙酰胺部分对所述肽的N-末端进行衍生。通过半胱氨酸侧链的硫酯键将肽以其侧链锚定在树脂上，该方法不再需要半胱氨酸酰胺侧链的保护和/或脱保护。在从树脂上切割下之前，用二硫代丙酸盐(酯)进行了N-末端的衍生化。由此从树脂上切割下以后，通过在半胱氨酸和硫代丙酰胺部分之间形成二硫桥在溶液中发生环化。在环化之前从固相上切割下和全面脱保护(除了硫代丙酰官能团以外)在本方案中是强制性进行的。

在切割和全面脱保护期间必须极其注意保持硫代-丙酰胺部分是一个缺点。Atherton等(1985，J.Chem.Perkin Trans.I.，2065)报道了具有双功能性的苯甲硫醚(作为从树脂上切割的清除剂和酸解促进剂)的广泛应用同样造成了受acm、叔丁基、叔丁基硫基保护的半胱氨酸的部分地、过早地脱保护。—整个合成路线很复杂，该方法在许多步骤中会对产率发生不良影响。必须在高度稀释的溶液中进行环化才能防止二聚化。在其描述中并未明确揭示获得的产率。

本发明的一个目的是提供通过固相合成更为简便和直接的合成二硫键化环肽的其它或改进方法。根据本发明，通过包含以下步骤的肽合成方法来实现本发明的目的：

a.合成连接于固相的肽，该肽包含至少一个半胱氨酸、高-或去甲-半胱氨酸(nor-cysteine)残基，所述半胱氨酸在其侧链受到S-叔丁基-硫基的保护，

b.对Nα上具有3，3’-二硫代-(1-羧基-丙基)-丙酰基-残基的另一氨基酸进行N-末端偶联，或任选地对该N-末端氨基酸的Nα进行脱保护并使游离Nα与3，3’-二硫代-丙酸亚胺反应，获得相应的Nα-3，3’-二硫代-(1-羧基-丙基)-丙酰胺，或者对N-末端氨基酸的Nα进行脱保护并使游离的Nα与式IV的化合物反应

R₇-S-S-[CH2]₂-COOH IV

其中，R₇是芳基(芳基包括杂核芳基-)或是芳烷基-、烷基芳基-或烷基，其可进一步被卤素、氨基(amido)、酯和/或醚取代，

c.使该肽进一步与S-叔丁基-硫基-保护基去除剂反应，优选使该肽与取代或未取代的三苯基-或三烷基膦反应，

d.在空气和/或氧气的存在下，通过形式上在半胱氨酸和Nα上的3-硫代丙酰胺部分形成二硫键来使得该肽环化。

本发明的肽可为含有天然或非天然氨基酸(例如高半胱氨酸、高精氨酸、D-环己基-丙氨酸、青霉素酰胺(Pen)或鸟氨酸(Orn))的肽。术语肽骨架或主链、侧链和字首‘去甲(nor)-’、‘高-’在上下文中按照IUPAC-IUB所定义(联合IUPAC-IUB委员会对生物化学命名的定义，‘Nomenclature and symbolism foramino acids and Peptides’，《氨基酸和肽的命名法和符号》，Pure Appl.Chem.，56，595-624(1984)。‘高-’狭义而言，优选含义为在侧链部分仅含有一个额外的亚甲基桥接基团。

必须尤其关注其它侧链的保护，尤其是在指在环化反应过程中，不参与环化反应且要保持被保护的肽序列中的其它半胱氨酸、高-或去甲-半胱氨酸残基。优选该含有巯基部分的其它残基被非三烷基膦敏感性保护基保护，更优选该非敏感性巯基保护基选自以下基团：三苯甲基-、叔丁基、乙酰氨基甲基-、烷基化的乙酰氨基甲基-、烷基化的三苯甲基-保护基。

在通常水平上，可将本领域中常用的侧链保护基(参见例如Bodansky，M.，Principles of Peptide Synthesis，《肽合成原理》，s.如下)用于保护敏感性的侧链，这些侧链如果不受到保护会在偶联和脱保护循环中被改变。具有敏感性侧链的氨基酸的例子是：Cys、Asp、Glu、Ser、Arg、高-Arg(Har)、Tyr、Thr、Lys、Orn、Pen、Trp、Asn和Gln。或者，可对肽酰胺进行固相合成后化学修饰以获得所需的侧链。例如，正如在不同参考文献中详细描述(EP-301850；Yajima等，1978，J.Chem.Cos.Chem.Commun.，第482页；Nishimura等，1976，Chem.Pharm.Bull.24：1568)，可通过肽链中所含赖氨酸残基的胍基化反应(guanidation)来制备高精氨酸，可通过肽链中所含鸟氨酸残基的胍基化反应来制备精氨酸，虽然这不是最优选的，而仅是更为费事的选择。特别是，偶联例如Har需要延长偶联时间和补充偶联剂。根据本发明的一个偶联Arg或Har的优选实施方式，优选分别用作FMOC-Arg和FMOC-Har时，不用侧链保护基。这可通过如下实现：确保单个Arg或Har残基的后偶联(post-coupling)，在任何其它偶联反应之前使胍基部分定量质子化，并与有机溶剂中的质子供体形成稳定的离子对。其优选通过如下方法来实现：如下文的实验部分更详细描述的优选实施方式中所述，用过量酸性偶联辅助剂BtOH等处理与树脂连接的肽酰胺。清除胍鎓上电荷的另一例子是在合成中使用Fmoc保护的HAR的四苯基硼酸盐(如US 4,954,616中所述)。

在本发明肽的优选实施方式中出现的用于单独氨基酸侧链的适合保护基的例子如下：

优选任选地在合成中用如下基团共价保护精氨酸侧链，例如：甲苯磺酰基、苄氧羰基、五甲基色原磺酰基(pentamethylenchromanesulfonyl，Pmc)、五甲基二氢苯并呋喃磺酰基(Pbf)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰(Mtr)及其4-叔丁基-2，3，5，6-四甲基同系物(tart)、金刚烷氧基羰基或Boc。强烈推荐用Pmc、Pbf、Mtr或Tart保护Arg，最优选Pbf。

在合成中优选用Boc保护Trp。任选地，其可为用甲酰或均-2，4，6-三甲基苯-磺酰基(sym-mesitylene-sulfonyl)进行N-保护。

适合的羧酸侧链保护基(通过侧链羧基的酯化反应)为例如：金刚烷基、叔丁基、烯丙基、苄基(Z)，优选将羧基转化为叔丁酯来对其进行保护。毋庸置疑，去除所述的保护基需要不同的脱保护化学，就如众所周知的那样(参见，M.，下文中)。

固相载体或树脂可为本领域已知适用于固相合成的任何载体。该固相的定义包括肽通过功能性接头或手臂(handle)基团键连或连接到固相或树脂，在本申请全文中提及‘固相’时隐含接头。固相的例子为例如：聚苯乙烯载体，其可被例如对-甲基苄基-羟胺进一步官能化(例如)；或刚性(rigid)官能化载体，例如硅藻土包封的聚二甲基丙烯酰胺(pepsyn K)、二氧化硅或受控的孔玻璃。固相的树脂基质也可由以下物质构成：两亲性苯乙烯-PEG树脂(例如Tentagel，参见US4908405)或PEG-聚酰胺或PEG-聚酯树脂，例如Kempe等，J.Am.Chem.Soc.1996，118，7083；还可参见US5，910,554、US2003078372 A1。在混合PEG树脂上获得的产物的纯度优于在传统树脂上获得的产物的纯度，然而其树脂负载通常却较不充分和/或其化学稳定性(尤其是在酸性介质中)常不令人满意。聚苯乙烯-PEG树脂可达到较高的负载，但是由于PEG含量的降低而导致了两亲性较低。

优选的固相载体基于聚苯乙烯、PEG例如尤其是两亲性PS-PEG或聚二甲基丙烯酰胺聚合物基质或树脂。

根据本发明，肽可通过氨基酸侧链连接，通常为C-末端氨基酸的侧链，除非该氨基酸是仅有的本发明用S-tBu-硫基-保护的半胱氨酸残基，或可通过C-末端α-羧基通过酯、硫酯或酰胺键连接到树脂。例子为含有氨基-甲基、羧基或溴甲基或碘甲基或由已知接头或手臂衍生而来的固相载体，所述的接头或手臂例如：Wang、三苯甲基、2-氯-三苯甲基-、4-甲氧基三苯甲基-、‘Rink酰胺’4-(2’，4’-二甲氧基苄基-氨甲基)-苯氧基-、Sieber树脂9-氨基-6-苯基甲氧基-呫吨-、4-羟甲基苯氧基乙酰基-或4-羟甲基苯甲酸(后者需要第一个氨基酸的附着，该附着通过对-二甲基氨基吡啶催化的酯化反应方法得到外消旋的敏感性氨基酸，例如Trp以及尤其是半胱氨酸，参见Atherton，E.等，1981，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，第336 ff页)接头。提供到树脂的硫酯连接的方法在WO 04/050686中有详细描述并可对其进行参考。在本发明的一个优选实施方式中，放弃了用于肽部分与固相连接的硫酯键，因此易受20％哌啶破坏且易受亲核试剂(例如三苯基膦)处理的破坏。

Rink酰胺、Sieber树脂(Tetrahedron Lett.1987，28，2107-2110)或类似的9-氨基-呫吨基-类树脂、PAL树脂(Albericio等，1987，Int.J.Pept.Protein Research30，206-216)或如Meisenbach等描述的特异性取代的三苯甲基-氨基衍生物，1997，Chem.Letters，第1265 f.页)是从树脂或固相上切除肽时产生或释放出Cα-羧酰胺的接头或手臂的例子。毋庸置疑，该酰胺接头的使用取决于所进行固相合成的类型，即用于偶联的是传统的Boc或现在惯用的正交Fmoc保护化学；例如Boc-特异性酰胺树脂接头是PAM。因此，包含该接头的固相在本申请上下文中被称为‘产生酰胺的固相’。

优选，肽以C末端的酰胺或酯键锚定于固相。更优选，就肽部分从固相的切除而言，固相是酸敏感性或酸不稳定性固相，更为优选的是其为产生酰胺的酸不稳定性固相。从树脂切割时，该酸不稳定性固相需要至少0.1％的三氟乙酸(TFA)，更优选至少0.5％的TFA在极性溶剂中的溶液。最优选，所述固相是酸敏感性固相，其在弱酸性条件下被切除，即在室温下孵育最多5小时时，0.1-10％TFA在所述溶剂中的溶液足以产生至少90％的切割效力。该高度酸不稳定性固相为例如：2-氯三苯甲基树脂、Sieber树脂、PAL树脂或4-(4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基)-丁酸(HMPB)树脂，Sieber和Rink在酸解时产生C末端酰胺化的肽。该酸不稳定性固相尤其容易受到对侧链保护基进行的树脂上脱保护化学反应的破坏，因此在这些情况下应尤为注意。

在侧链通过C-末端半胱氨酸残基锚定到固相载体的手臂基团上的情况下，连接键必须为硫酯或硫醚键。更适合于侧链锚定的残基是酸性侧链的羧基、羟基和尤其是赖氨酸的ε-氨基。毋庸置疑，在侧链锚定时，通常在进行第一偶联反应之前，通过酯化或酰胺化来保护C-末端游离羧基，例如通过使用FMOC-Lys-氨甲酰用于将侧链氨基官能团连接到固相的连接反应中。

在优选的实施方式中，S-叔丁基-硫基保护的半胱氨酸是肽的C-末端残基，并通过羧基末端以酯或酰胺键的方式连接到固相，前提是所述连接键不是苄基酯部分，而优选为在如上所述的弱酸性反应条件下可被切除的酸不稳定性树脂。在酸性条件下C-末端半胱氨酸尤其易于发生外消旋。

已描述了通过与叔膦的反应从半胱氨酸上去除S-叔丁基-硫基保护基的方法，例如使用三丁基膦(Atherton等，1985，J.Chem.Soc.，Perkin I.2057)和三乙基膦(Huang等，1997，Int.J.Pept.Protein Res.48，290)。根据本发明可将同样的脱保护步骤用于断裂Nα-3，3’-二硫代-(1-羧基-丙基)-丙酰胺、具有不同数量亚甲基的它的同系物或式IV化合物的二硫键。最常用的是以硫醇试剂来断裂叔丁基硫基，例如使用β-巯基-乙醇或二硫苏糖醇(DTT)或叔膦(Huang等，1997 Int.J.Pept.Protein Res.48，290；Rietmann等，1985，Recl.Trav.Chim.Pays-Bas，1141)。优选所述叔膦为三苯基膦或为烷基化或烷氧基化的三苯基膦，例如三-(对-甲氧基苯基)-膦或更优选为烷基相同或不同的三烷基膦其中各烷基为C1-C7烷基，优选C1-C4，且可为支链或直链烷基。优选该烷基为直链烷基。例子是：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基。尤为优选三正丁基膦和三乙基膦。烷基可任选地被卤素、甲氧基或乙氧基取代，或与溶剂***相适应的羧基，或优选未被取代。令人惊讶的是，根据本发明出乎意料地发现在使用膦的二硫键切割中，还可使用在弱酸性条件下可切除的对酸非常不稳定的树脂，例如Sieber或2-CTC树脂。—常被忽视的是硫醇试剂通过本身形成二硫化物来还原并断裂二硫化物。在DTT的情况下，分子内闭环是有利的，在β-巯基乙醇的情况下，任何分子内反应产物(例如二硫化物交换反应的产物)都是可行的。此外，即便是新形成的二硫化物也会发生进一步的交换反应。硫醇试剂的广泛使用似乎是因为担心在使用叔膦试剂时会发生诸如从树脂泄漏的副反应。

用于肽合成的偶联剂在本领域中是熟知的(参见Bodansky，M.，Principles ofpeptide synthesis，《肽合成原理》第二版，Springer Verlag Berlin/Heidelberg，1993；还可参见其中关于偶联添加物或辅助剂的讨论)。偶联剂可为混合的酐(例如T3P：丙烷膦酸酐)或其它酰化剂，例如活性酯或酸的卤化物(例如ICBF，氯甲酸异丁酯)；或它们可为碳化二亚胺(例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺)；活化的苯并三嗪(benzotriazin)衍生物(DEPBT：3-(二乙氧基磷酰氧)-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮)或苯并***的脲鎓或鏻盐衍生物。

就最佳产率、在链延伸过程中采用短的反应时间和抗外消旋的保护而言，更优选偶联剂选自苯并***的脲鎓和鏻盐，它们能活化游离羧酸官能团且在碱的存在下进行反应。适合且同样优选的此类脲鎓或鏻偶联盐的例子是例如HBTU(O-1H-苯并***-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)、BOP(苯并***-1-基-氧-三-(二甲基氨基)-鏻六氟磷酸盐)、PyBOP(苯并***-1-基-氧-三吡咯烷并鏻六氟磷酸盐)、PyAOP、HCTU(O-(1H-6-氯-苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)、TCTU(O-1H-6-氯苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐)、HATU(O-(7-氮杂苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)、TATU(O-(7-氮杂苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐)、TOTU(O-[氰基(乙氧羰基)亚甲基氨基]-N，N，N’，N”-四甲基脲鎓四氟硼酸盐)、HAPyU(O-(苯并***-1-基)氧双-(吡咯烷并)-脲鎓六氟磷酸盐。

优选地，当使用DEPBT等时，脲鎓或鏻盐试剂，在偶联步骤中还需要其它或第二种弱碱性试剂。这可通过使用其共轭酸的pKa值为pKa7.5-15，优选pKa7.5-10的碱来匹配，除了肽或氨基酸或氨基酸衍生物的α-氨基官能团，所述碱优选为立***阻的叔胺。优选的这些和其它的例子是Hünig-碱(N，N-二异丙基乙胺)、N，N’-二烷基苯胺、2，4，6-三烷基吡啶或N-烷基-吗啉，其中的烷基为直链或支链C1-C4烷基，更优选其为N-甲基吗啉或可力丁(2，4，6-三甲基吡啶)，最优选的是可力丁。C1-C4烷基的例子是例如：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基。

还已知对偶联添加剂的使用，尤其是对苯并***类偶联添加剂的使用(参见Bodansky，同上)。在使用高度活性的前述脲鎓或鏻盐偶联剂时，它们的使用尤为优选。因此，进一步优选的偶联添加剂是能形成活性酯的亲核羟基化合物，更优选具有酸性亲核N-羟基官能团，其中N是亚胺或N-酰基或N-芳基取代的三氮烯基(triazeno)，最优选的偶联添加剂是N-羟基-苯并***衍生物(或1-羟基-苯并***衍生物)或是N-羟基-苯并三嗪衍生物。该偶联添加剂N-羟基化合物在WO94/07910和EP-410182中有大量和广泛的描述，其中相应的揭示被纳入本文作为参考。例子是例如：N-羟基-琥珀酰亚胺、N-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HOOBt)，1-羟基-7-氮杂苯并***(HOAt)和N-羟基-苯并***(HOBt)。尤为优选N-羟基-苯并三嗪衍生物，在最优选的实施方式中，偶联添加剂是羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪。

偶联添加剂的铵盐化合物是已知的，它们在偶联化学中的使用在例如US4806641中已有描述。

在尤为优选的实施方式中，脲鎓和鏻盐偶联剂是脲鎓盐试剂，优选HCTU，TCTU或HBTU，更优选HCTU或TCTU，最优选将其与N-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪或其盐一起用于反应中。该实施方式主要优选用于肽合成中除去碱不稳定性Nα-保护基后的链延伸步骤，但也可用于侧链环化中的内酰胺化反应。

在本发明的上下文中，应注意到将HCTU和TCTU定义为包含于术语‘脲鎓盐试剂’中，尽管通过晶体结构分析已显示这些化合物和可能的类似物包含肟基部分，而不是脲鎓部分(O.Marder，Y.Shvo和F.Albericio，“HCTU and TCTU：New Coupling Reagents：Development and Industrial Applications”《HCTU和TCTU：新偶联剂：开发和工业应用》，Poster，Presentation Gordon Conference2002年2月)，而是由杂环核心上的N-脒基取代基产生胍鎓结构。在本发明的上下文中，此类化合物被称为本发明的脲鎓盐试剂的‘胍鎓类亚类’。

碱不稳定性Nα的脱保护可如本领域中的常规做法进行，例如在Fmoc化学的情况下，使用20％的哌啶的N-甲基吗啉溶液。最广泛的是，在固相合成中常规地将Fmoc或Boc保护化学用于N-末端，然而其它任选的Nα保护化学在本领域中是已知的，且可在不干扰本发明的情况下应用于与树脂连接的肽的带二硫化物(disulfide-borne)的肽环化。

前述的偶联化学还可用于偶联式IV的化合物，即如前所定义的R₇-S-S-[CH2]₂-COOH。可很容易地通过例如相应的对称羧酸亚胺与例如烷醇或烷基胺的反应来生产该化合物。

根据本发明在第一弱碱的的存在下在极性非质子有机溶剂中进行环化反应。介导环化作用的氧化剂可为如Chan和White编的‘FMOC Solid-phase peptidesynthesis’(《FMOC固相肽合成》，Oxford university Press 2000，第91-114页)的任何氧化剂：谷胱甘肽在水性缓冲液中的溶液、DMSO、铁***、Ellman氏试剂5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、碘，三氟乙酸铊(III)、烷基三氯硅烷-亚砜、三氟甲烷磺酸银-DMSO，其在强酸性介质中介导的氧化反应，其在用于其它有机溶剂***中的树脂上环化中并不是完全不切实际的，所述的有机溶剂***用于溶剂化受保护的肽，例如炭介导的氧化反应。另一通用方法是在二硫键形成中使用炭乙氧基亚磺酰氯(carboethoxysulfenyl chloride)(Le-Nguyen，D.，1986，Int.J.Peptide Protein Res.27，285-292)。由于溶剂***的原因，在一个优选实施方式中，用例如在US5144006中有更详细描述的DMSO介导的氧化来进行环化，除了以下提及的溶剂以外还在DMSO中补充了氧化剂和可混溶的共溶剂，还可存在少量的水。DMSO提供了可接受的快的反应速率，是一种变性共溶剂，并有助于肽基质的溶解。鉴于其对甲硫氨酸侧链的氧化作用，在氨基酸侧链脱保护之前将其用于树脂上环化比将其用于含有脱保护的肽的常规用法更为便利。

在最优选的实施方式中，所述环化在空气和/或氧气的存在下进行而明显不含多相的、加速反应的催化剂，从而获得巯基的氧化以形成二硫键。优选在基本上不含催化剂的情况下进行环化，即不存在催化有效量或大量的多相催化剂。

根据本发明，尤其是在将空气和/或氧气用作氧化剂的实施中，更优选在不含所述多相或固相催化剂的情况下用空气/氧气作为氧化剂，根据本发明进行的环化步骤非常有效且仅需要0.5-2小时的反应时间，从而在非常温和的反应条件(通常为环境温度，有利的温度范围为10-80℃，虽然理所当然地要将溶剂的回流温度考虑进去)下使得离析物得以切实定量地完全转化为所需产物。从而，转化史无前例地完全不产生气体(complete still)。这是一个杰出的成就，在二硫键驱动的肽环化中尚未有人取得过，也从未有人在先发明过如此简便、温和且迅速的反应条件。不会产生对多相催化剂繁重的混合和分离的问题。反应速率还完全可与现有技术中含催化剂的反应相比拟。由于反应过程直接，几乎完全避免了形成副产物。

适合的极性非质子溶剂是例如：乙腈、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、N-甲基-吡咯烷酮、四氢呋喃。与水相反，这些溶剂通常不能在物理上溶解相对量的氧以补充氧化形成二硫键(该反应在之前的水性催化剂***中曾有描述)。

因此，必须小心地提供空气、空气/氧气或纯氧气。可通过如下方式提供空气/氧气：彻底搅拌、涡旋、用于搅拌的特殊设计的螺旋桨、将气体向液体中鼓泡。该气体可为空气或纯氧气或富含氧气的空气。在一个尤为优选的实施方式中，在具有大的底部和/或壁表面积的反应容器上穿孔以在完全搅拌中将气体向液体中鼓泡。

也可能将不同的半胱氨酸保护模式用于本发明的同一条肽上。例如，通常可用acm保护基保护肽链中的其它半胱氨酸，以提供内部半胱氨酸间的其它区域专一性二硫键，所述区域专一性二硫键是在从树脂上切割下之后并在本发明的初始二硫键在树脂上形成之后，通过溶液中的标准碘氧化产生的。

第一弱碱试剂是其共轭酸的pKa值为pKa 7.5-15，更优选pKa 8-10的弱碱，其优选为立***阻的叔胺。优选的这些和其它的例子是Hünig-碱(N，N-二异丙基乙胺)、N，N’-二烷基苯胺、2，4，6-三烷基吡啶或N-烷基-吗啉，其中的烷基为直链或支链C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基)，最优选其为N-甲基吗啉、可力丁(2，4，6-三甲基吡啶)或Hünig-碱。

优选使二硫化物保护基(特别是S-叔丁基-硫基的去除)的优先去除在第一弱碱试剂的存在下进行，以避免因次要酸解而造成的从树脂上泄漏的任何风险，即在pH 7.5-12，更优选8-11。任选地，通过使用可与水自由混溶的极性非质子溶剂(例如THF或乙腈)，可出于该目的使用碱式盐(例如乙酸钠)的水溶液。在使用叔膦进行所述二硫基切割或去除步骤时，尤为优选本实施方式。通过同时将适合的供氧与二硫化物保护基的去除相结合，可能在本发明的另一实施方式中以单罐反应甚至在单个反应步骤中进行二硫化物的脱保护和环化，本发明的另一实施方式例如当在叔胺的存在下，使用极性非质子有机溶剂和供氧下进行反应，和使用叔膦进行对氧气呈惰性的脱保护反应。

由于本发明的方法可实现树脂上环化，其还无需象现有技术中所述的大部分方法所要求的那样对肽进行繁琐而降低产率的高度稀释以有助于分子内而不是分子间环化。

本发明的树脂上操作模式仅使得分子内环化快速而有效地进行，而完全不会发生二聚化。

在其它优选的实施方式中，所述肽是式I的肽。术语保护基解释为用于指定侧链官能团或特定侧链的保护基，所述保护基适用于标准叔丁氧羰基(Boc)或9-芴基甲氧羰基(Fmoc)固相肽合成。此类保护基以及对特定侧链官能团的特定保护基的使用在本领域中是熟知的且是常规的(s.Chan等编，同上；Bodansky等同上)。

在另一可能的实施方式中，任选地使肽部分不通过与固相间永久性的共价结合，而是通过其与固相的非共价可逆结合，在固相上合成所述肽，所述非共价结合是通过稳定的金属螯合络合物(Lonza AG的产品联合报导，Basel，Switzerland and AplaGen GmbH，Baesweiler，Germany，2004年10月)实现的，其类似于用于蛋白质纯化中的已确立的六-His标签技术(hexa-His tagtechnology)。该非共价固相连接或类似的其它实施方式也包含在本发明中、上文所述的本发明操作的优选模式中以及下文中该实施方式的应用中。

本发明的其它目的还包括前文所描述的适合的与固相偶联的且有利环化的肽，以及将它们与上文和下文所述优选实施方式的结合。

第一个目的是式I的肽

其中R4、R5是H或Arg-保护基，R2是羧酸保护基，R3是Trp-保护基，R1是以硫酯、酯或酰胺键连接到肽骨架的固相。

优选在该肽中，R4、R5是H，R3是N-苄-氧羰基，R2是叔丁基。

优选所述固相是随后以酰胺键连接到肽骨架的Sieber树脂或包含可产生酰胺的接头或手臂的其它树脂。

第二个目的是肽，优选包含至少一个氨基酸侧链保护基的肽，其中所述肽通过C-末端残基或通过氨基酸侧链连接到固相，其特征为所述肽是包含式II部分的环状肽

其中n、m各自独立地选自1-10，优选n＝2和m＝1(得到半胱氨酰部分)，Nα是肽骨架N-末端的氮，C^*上该肽骨架氨基酸残基的Cα，R6是以所述Nα封端的肽骨架环状半部的N-末端，R5是与固相连接的肽骨架的C-末端半部，前提是N≠Nα，优选R6包含至少3个，更优选至少4个***的氨基酸残基。为了清楚起见，R5解释为等于C^*H(-CO-NH-R’)或C^*H(-CO-O-R’)或最后C^*H(-CO-S-R’)，R’包括可能包含接头或手臂、R5和任选的一定数量的与所述固相连接的氨基酸残基的固相。优选R5和R6包含多达200个，更优选多达100个，最优选多达50个氨基酸残基。

另一目的是肽，优选包含至少一个不是半胱氨酸、高或去甲-半胱氨酸残基上的S-叔丁基-硫基的氨基酸侧链保护基，所述肽通过C-末端残基与固相连接，其特征是所述肽包含在其侧链受S-叔丁基-硫基保护的至少一个半胱氨酸、高或去甲-半胱氨酸残基，在其Nα经N-末端取代构成式III的酰胺部分

其中n＝1-10，优选n＝2。

另一目的是肽，优选包含至少一个不是半胱氨酸、高或去甲-半胱氨酸残基上的S-叔丁基-硫基的氨基酸侧链保护基，所述肽通过C-末端残基与固相连接，其特征是所述肽包含在其侧链具有游离巯基的至少一个半胱氨酸、高或去甲-半胱氨酸残基，在其Nα经N-末端取代构成式III的酰胺部分

其中n＝1-10，优选n＝2。

同样，本发明最后和第二个目的中所述的肽优选包含多至200个，更优选多至100个，最优选多至50个氨基酸残基。毋庸置疑，在合成非常长的肽时，对于树脂的选择也会影响到所得的产率，即便前提不是要合成100个氨基酸残基或更多残基的肽。对此PEG树脂(例如)通常是一个好的选择。此外毋庸置疑，肽的独有氨基酸序列可对最大链长和用给定的肽所能获得的偶联效力产生很大的影响；广为知晓的例子是在线性合成中因β-折叠片的形成和链间结合而造成的不利肽链间聚集风险。

实验

选择依替巴肽作为树脂上环化的受保护模型肽，以设计本发明新的改进的方法；依替巴肽的固相合成方法在之前的US5,318,899中已有描述。

整个合成策略如下表I中所示：

表I

1.1直链肽Gly-Asp(tBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(S-tBu)-Sieber的FMOC SPPS

之前已有对FMOC-Cys(S-tBu)-OH合成的描述(Rietman等，1994，Synth.Commun.第24卷，第1323 f页)。Sieber树脂是Novabiochem的产品，购自Calbiochem-Novabiochem(属于EMD Biosciences，California/U.S.A.)。所有FMOC氨基酸，包括FMOC-Cys(S-tBu)-OH(产品目录号：B-1530)均购自Bachem AG(Bubendorf，瑞士)。

以0.52mmol/g装载树脂，总共10g Sieber树脂。装载的偶联时间是标准偶联时间的2倍，即总共60分钟。在二氯甲烷中，在各1当量6-氯-HOBt、TCTU、Hünig-碱(二异丙基乙胺)的存在下，偶联各2当量的相应氨基酸。用N-甲基-吡咯烷酮(NMP)进行洗涤。

在10％的哌啶的N-甲基-吡咯烷酮溶液中进行3个循环，15分钟的FMOC脱保护，分别以茚三酮反应和反相HPLC对切割效力和合成的完成进行分析。

1.2 将1.1的肽延伸为Har-Gly-Asp(tBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(S-tBu)-Sieber

在1当量HOBt/当量氨基酸(为了保持胍基的质子化)的存在下偶联FMOC-Har残基(Bachem，Burgendforf，瑞士)；以HOBt和1当量二异丙基碳化二亚胺的NMP溶液预孵育FMOC氨基酸，然后与树脂混合。Har偶联用了180分钟(其它氨基酸为30分钟)，然后补充试剂进行约60分钟的第二个循环。以此方式，可与其它残基的标准99.8％的偶联效力相匹配。

如既往进行FMOC的切割。特别地，在FMOC切割和后继NMP洗涤后，用HOBt重复洗涤以防止树脂的进一步膨胀。

注意：对于不使用保护基，而不是采用上文所述含HOBt的离子对的Arg偶联，采用TCTU的延伸偶联也是可行的。与对Arg采用共价偶联保护化学剂(例如Pbf)进行保护相比，含HOBt的其它离子对是优选的实施方式，这是因为前者在脱保护过程中可能产生副反应。

1.3从1.2的肽-树脂衍生到(Mpa)2-Har-Gly-Asp(tBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys (S-tBu)-Sieber的衍生反应

在冷却到低于10℃(冰浴冷却)的DMF中进行与3，3’-二硫代丙亚胺(Novabiochem)的反应。在10分钟内向反应混合物中加入1当量二异丙基-碳化二亚胺。搅拌下，将温度控制在低于15-20℃。其后，向来自1.2部分中的脱保护、与树脂结合的肽产物中加入反应混合物。在室温下进行6小时的偶联。

用60％TFA从树脂上切割下反应产物试样(aliquot)，用LC-(电喷射)MS进行分析。转化是定量的，虽然检测到两个主要产物峰(＜25％副产物：二肽)。因此本步骤的产率＞75％。

1.4用Bu₃P脱保护

在四氢呋喃(THF)中悬浮树脂并洗涤三次。在室温下与50当量三丁基膦反应1小时，所述三丁基膦由19％(v/v)PBu₃/77％(v/v)THF/4％(v/v)乙酸钠的饱和水溶液组成；用前滤除沉淀的盐。反应均一地进行产生了一个产物主峰。以反相HPLC测定产率，得到了产率等于98.9％的纯产物。

1.5环化获得

对1.4中获得的肽-树脂偶联物进行洗涤溶胀，在NMP中洗涤3次。在室温下以6％DIEA(Hünig-碱)的NMP溶液孵育该树脂1小时来实现环化；在垂直玻璃容器中进行反应，该容器包含在其下部用(G316-40μm)玻璃料封闭的水平二等分分隔。从该玻璃料或烧结板下方通入空气，使得空气向玻璃料上被溶剂覆盖的反应物表面的整个横截面鼓泡，其中所述树脂被下方鼓泡的空气浮起。获得了十分纯净均一的产物，在该反应步骤之后未出现不同或破碎的副产物。独立地用反相HPLC和LC-MS测定所得的产物转化率均为100％。RP-HPLC是在Hypersil-Keystone^TM Betabasic(Thermo Electron Corp.，Waltham Mass./U.S.A.)C18150×4.6mm柱上进行的，注射量为15μl，在35℃的柱温下于262nm检测。

梯度运行为：

时间乙腈(0.1％TFA)/水(0.1％TFA)

0 60 40

5 97 3

16 97 3

17 60 40

1.6全面脱保护

全面脱保护的准备工作是在二氯甲烷(DCM)中溶胀树脂三次。制备组成如下的切割反应相混合物：

86.5％ TFA(785当量)

4.5％苯甲硫醚(36.5当量)

3％苯酚(32.4当量)

3％ DCM(38当量)

3％ H2O(178当量)

在缓慢旋转的轨道式摇动装置上，于15℃进行2小时的反应。终止反应，沉淀产物，滤除树脂后，逐滴加入叔丁酸甲酯。—产物为单个峰；未检测到主要的副产物。—对对照测试了全面脱保护的上述条件，并未发现对肽中已形成的二硫桥的影响。以上文1.5部分中所述的RP-HPLC和LC-MS测得该最后步骤的转化率＞99％。

Claims

1.肽合成的方法，所述方法包括以下步骤：

a.合成连接于固相的肽，所述肽包含至少一个半胱氨酸、高-或去甲-半胱氨酸残基，所述半胱氨酸在其侧链受到S-叔丁基-硫基的保护

b.使在其Nα上具有3，3’-二硫代-(1-羧基-丙基)-丙酰-基团的另一氨基酸发生N-末端偶联，或使N-末端氨基酸的Nα脱保护并使该游离Nα与3，3’-二硫代-丙酸亚胺反应获得相应的Nα-3，3’-二硫代-(1-羧基-丙基)-丙酰胺，或者使N-末端氨基酸的Nα脱保护并使该游离Nα与式IV的化合物反应

R7-S-S-[CH₂]₂-COOH IV

其中R7是包括杂核芳基的芳基-，或是芳烷基-、烷基芳基-或烷基-，

其可进一步被卤素、氨基、酯、羧基或醚所取代，

c.使该肽与S-叔丁基-硫基-保护基去除剂反应，

d.通过形成二硫键使所述肽环化，优选在空气和/或氧气的存在下环化所述肽。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述半胱氨酸离开所述肽的N-末端氨基酸残基至少3个，更优选至少5个氨基酸残基。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相树脂选自2-氯-三苯甲基(CTC)树脂或产生酰胺的树脂。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肽具有至少一个其它侧链保护基，该保护基包括受到不同保护的其它半胱氨酸、高-或去甲-半胱氨酸残基。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述半胱氨酸是最后的C末端残基。

6.如权利要求1或6所述的方法，其特征在于，至少S-叔丁基-硫基的去除是通过使所述肽与三烷基膦反应完成的。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肽是在弱碱的存在下在极性非质子溶剂中环化的。

8.如权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述肽与固相的连接键是酸不稳定的，优选于室温下在60％TFA的二氯甲烷溶液中不稳定。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述树脂是Sieber树脂。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，优选在全面脱保护的条件下，在后继的步骤中将肽从树脂上切除。

11.式I的肽

其中R4、R5是H或Arg-保护基，R2是羧酸保护基，R3是Trp-保护基，R1是以硫酯、酯或酰胺键连接到所述肽骨架的固相。

12.如权利要求11所述的肽，其特征在于，R4、R5是H，R3是N-苄-氧羰基，R2是叔丁基。

13.如权利要求12所述的肽，其特征在于，所述固相是Sieber树脂，其随后通过酰胺键连接到所述肽的骨架。

14.肽，其优选包含至少一个氨基酸侧链保护基，其中所述肽通过C-末端残基或通过氨基酸侧链连接于固相，其特征在于，所述肽是包含式II部分的环状肽：

其中n、m独立地选自1-10，Nα是该肽骨架的N-末端的氮，C^*是该肽骨架氨基酸残基的Cα，R6是以所述Nα封端的该肽骨架的N-末端环状半部，R5是连接到固相的该肽骨架的C-末端半部，前提是N≠Nα，优选其中R6包含至少3个，更优选至少4个***的氨基酸残基。

15.肽，其优选包含至少一个不是半胱氨酸、高或去甲-半胱氨酸残基上的S-叔丁基-硫基的氨基酸侧链保护基，所述肽通过C-末端残基与固相连接，其特征在于，所述肽包含在其侧链受S-叔丁基-硫基保护的至少一个半胱氨酸、高或去甲-半胱氨酸残基，在其Nα经N-末端取代构成式III的酰胺部分

其中n＝1-10，优选n＝2。

16.肽，其优选包含至少一个不是半胱氨酸、高或去甲-半胱氨酸残基上的S-叔丁基-硫基的氨基酸侧链保护基，所述肽通过C-末端残基与固相连接，其特征在于，所述肽包含在其侧链具有游离巯基的至少一个半胱氨酸、高或去甲-半胱氨酸残基，在其Nα经N-末端取代构成式III的酰胺部分

其中n＝1-10，优选n＝2。