KR20060052889A - 생체 활성 분자 사이의 결합을 결정하기 위한 자기 입자의사용 - Google Patents

Abstract

적어도 제 1 입자 또는 마이크로캐리어, 예를 들어 비드와, 또한 마이크로캐리어일 수 있는 제 2 입자, 예를 들어 제 2 비드를 사용하여 생체 활성 분자와 같은 미생물 구성 요소 사이의 상호 작용을 결정하기 위한 도구 및 그에 따른 장치뿐만 아니라 분석이 개시되어 있다. 적어도 제 1 마이크로캐리어는 자기를 띤다. 두 비드가 사용되고 비드 모두가 자기를 띠는 경우, 비드는 자기 모멘트의 크기가 서로 다른 것이 바람직하다. 서로 다른 강도의 결합을 구별하기 위해 생체 활성 분자 사이의 결합을 기계적 응력 하에 배치하기 위한 수단이 제공된다. 한 가지 양상에서, 제 2 비드(더 큰 자기 모멘트를 갖는)는 포획 분자(자체는 일반적으로 이동 또는 고정 표면에 결합된)에 약하게 결합된 더 작은 자기 모멘트를 갖는 비드에 연결된 표적 분자를 자기에 의해 제거하는데 사용된다. 대안적으로, 유체 마찰력은 약한 결합을 파괴하기 위해 입자 중 하나에 가해진다. 실시예에 따라, 제 1 비드 및/또는 제 2 입자는 검출 목적으로 사용될 수 있다.

Description

생체 활성 분자 사이의 결합을 결정하기 위한 자기 입자의 사용{USE OF MAGNETIC PARTICLES FOR DETERMINING BINDING BETWEEN BIOACTIVE MOLECULES}

본 발명은 바이러스, 원생동물(protozoa), 박테리아(bacteria)와 같은 미생물 구성 요소(microbiological entity)와 이러한 것들의 세포 소기관(organelle)과, 리포솜 및 단백질 또는 DNA와 같은 생체 활성 분자 사이의 상호 작용을 결정하기 위한 방법, 장치 및 도구를 기술한다. 본 발명은 특히 생체 활성 분자와 같은 미생물 구성 요소와 다른 구성 요소 사이의 비특이적(a-specific) 및 특이적(specific) 결합을 구별하기 위한 해답을 제시한다. 본 발명은, 단백질 마이크로 어레이(microarray)와 같은 생화학적 및 의약적 진단 분석(diagnosis assay)의 설계와 사용에 응용된다.

바이오센싱(biosensing)의 목표는 고농도의 배경 물질(예를 들어, 알부민 mmol/l)을 갖는 복합 혼합물(예를 들어, 혈액)에서 저 농도의 특이적 표적 분자(target molecule){예를 들어, pmol/l 범위 이하인 종양 표지(marker)}를 검출하는 것이다. 가장 흔히 쓰이는 바이오센싱 방법은 포획 분자(capture molecule)(예를 들어, 항체, 핵산 등)로 표면을 코팅하는 것이다. 이러한 분자들은 후속적으로 검출되는 표적을 포획한다. 표적 분자의 검출은 표지(label)를 가지고 또는 표지 없 이 수행될 수 있다. 표지 단계(labeling step)는 표면에 포획되기 전 또는 후에 일어날 수 있다. 표지는 표적에 직접 결합되거나, 예를 들어 다른 생체 활성 분자를 통해 간접 결합될 수 있다. 가장 많이 쓰이는 광학 표지, 예를 들어 형광 분자(fluorescent molecule)가 검출을 위해 사용된다.

바이오센싱에 있어 중요한 문제는 검출 표지 또는 표적 분자가 바이오 센서의 표면 또는 포획 분자에 비특이적 결합을 하는 것이다. 이는 배경 신호를 발생시키는데, 이 신호는 바이오 센서의 분석 감도와 특이성을 감소시킨다. 진단 분석에서, 비특이적 결합은 스트린전시 절차(stringency procedure)를 사용하여 감소될 수 있다. 스트린전시 절차의 목적은 원치 않는 비특이적 흡착(adsorption) 결합을 분리시키고, 포획 분자와 (표지된) 표적 분자 사이의 특이적 상호 작용만을 유지하는 것이다. 가장 흔하게 쓰이는 스트린전시 방법은 세척 단계이다. 세척 용액의 조성과 온도는 주어진 분석에 대한 배경을 감소시키도록 세심하게 조절된다.

서로 다른 많은 분자들이 바이오칩(biochip) 또는 (마이크로) 어레이(microarray)라 불리는 단일 표면에서 동시에 측정되는 다중-분석 검출(multi-analyte detection)에 점점 더 초점이 맞춰지고 있다. 바이오칩 표면은 많은 지점(spot)("포획 지점")으로 구성되는데, 모든 지점은 서로 다른 포획 분자 또는 분자들을 포함한다. 다중-분석 센서를 위한 스트린전시 전체 칩 세척 단계를 형성하는 것은 어려운데, 그 이유는 서로 다른 특이적 상호 작용의 범위는 방해받지 않은 상태로 유지되어야 하고, 서로 다른 표적 및 포획 분자의 본래 상태는 보존되어야 하면서, 다수의 가능한 배경 신호는 억제될 필요가 있기 때문이다. 그 결과는 더 낮 은 분석 감도와 더 낮은 분석 특이성이다. 다중-분석 스트린전시 문제는 단백질 검출에 매우 중요한데, 그 이유는 단백질과 단백질-단백질의 상호 작용이 매우 이질적이고, 특정 세척 단계가 단백질 변성(denaturation) 및 단백질-단백질 상호 작용에 미치는 영향이 매우 중요할 수 있기 때문이다.

단백질 어레이 또는 마이크로 어레이의 이러한 주요 단점은, 1760-1763년에 Macbeatch 와 Schreiber(2000)에 의해 Science지 289호에 개시된 논문에서 인식되었는데, 이 논문은 천연 단백질(native protein)의 현미경 유리 슬라이드에의 응용에 대해 기술하고 있다. 비특이적 단백질-단백질 결합은 표적 분자와 결합하기 전에, BSA를 포획 분자에 첨가하여 감소된다. 2002년 12월, 단백질 마이크로 어레이 기술에 대해 기술된 검토 논문{Macbeath(2002)에 의해 Nature Genetics지 32호, S526-532 페이지에 기술}은 잠재적인 해답을 제시하지 않고 단백질 어레이 기술의 핵심 특징으로서 특이성을 측정하는 문제를 언급한다. 현재까지 가장 성공적인 단백질 어레이 기술의 응용은 면역학 분야에서 성취된다. 항원과 항체 사이의 가장 높은 결합 강도는 스트린전시 세척 조건이 항원과 항체의 비특이적 상호 작용을 해결하도록 해준다.

스트린전시 문제를 해결하는 화학적 방법은 표적과 더 강하게 그리고 더 특이적으로 상호 작용할 수 있는 포획 분자를 설계하는 것이다. 한 가지 예는 광-압타머(photo-aptamer)인데, 이것은 표적 분자의 특정 지점에서 교차 결합할 수 있는 광-반응성 기(photo-reactive group)를 가진 합성 포획 분자이다{Brody & Gold J. (2000)Biotechnol지 7호 5-13 페이지에 검토}. 광-압타머를 포함하는 포획 표면이 샘플에 노출되고 광-여기(photo-excitation) 단계가 적용될 때, 압타머 결합 지점에 꼭 맞는 분자는 이 지점에 공유 결합된다. 이후, 엄격한 세척 단계는 광반응하지 않은 분자를 제거하도록 적용될 수 있다. 광-압타머 연구의 단점은 이러한 연구가 모든 표적에 대해 새로운 광-압타머의 설계를 필요로 하고, 광-여기 단계가 필요하며, 광-교차 결합 단계 자체가 특이적 및 비특이적 결합 분자를 구별하지 않고, 이것이 종료점(endpoint) 검출 방법이라는 점이다.

미국특허출원 US2002/0001855호에는 두 분자 사이의 결합 강도를 검출하는 방법이 개시되어 있는데, 이 두 분자 중 하나는 제 1 표면에 결합되고, 자기를 띠도록 표지된 (magnetically labeled) 다른 분자와 접촉하게 된다. 이후, 제 1 표면은 자기장을 갖는 제 2 표면에 근접하게 되는데, 이 자기장은 자기 표지에 끄는 힘을 가하고, 두 분자 사이의 결합 강도에 따라 분리될 것이다. 이러한 시스템의 주요 단점은 제 2 표면과 분석의 감도를 제한하는 자기 표지(제 1 표면에 존재) 사이의 물리적인 거리이다. 제 2 표면은 자기장 그래디언트(magnetic field gradient)가 발생되는 디바이스이다. 이러한 디바이스는 작은 자석의 그리드(grid)로서 만들어진다. 그 결과, 디바이스는 그리드 표면 가까이에 높은 자기장 그래디언트의 영역을 갖는다. 국부적인 그래디언트의 크기와 높은 그래디언트 영역이 디바이스 외부로 돌출되는 거리는 요소에 의해 생성되는 자기장과 그리드를 이루는 자기 요소의 크기에 의해 결정된다. 이러한 디바이스의 단점은 자기장 그래디언트가 거리의 함수로서 급격하게 감소한다는 점이다. 따라서, 높은 그래디언트는 그리드 표면에 매우 근접하게만 존재한다. 따라서, 디바이스는 생물학적 결합 표면에 매우 근접해 야 하는데, 이는 샘플 유체의 존재와, 생물학적 결합 표면 위에 덮개 플레이트(cover plate)를 갖는 유체 챔버(chamber)의 존재 때문에 일반적으로 불가능하다.

생체 활성 분자와 같은 미생물 구성 요소 사이의 상호 작용 또는 결합을 결정하기 위한 개선된 방법, 특히 특이적 결합과 비특이적 결합과 같은 서로 다른 강도의 결합을 구별할 수 있는 방법, 장치 및 도구의 설계가 필요하다. 특이적 결합과 비특이적 결합을 구별하는 것은, 그 구별이 광범위한 포획 및 표적 분자에 동시에 적용 가능해야 하는 다중-분석 센서에 특히 필요하다. 다중-분석 센서에서 스트린전시를 향상시키기 위해 완충액(buffer) 조건을 변화시키는 것이 매우 제한적으로만 이루어질 수 있기 때문에 단백질 다중-분석 센서가 필요하다. 또한, 이러한 방법이 마이크로 어레이 구성(set-up)에서 실제로 사용되도록, 감도의 손실 없이 규모를 축소할 필요가 있다.

본 발명의 목적은, 예를 들어 단백질 또는 DNA와 같은 생체 활성 분자와 같은 미생물 구성 요소 사이, 또는 생체 활성 분자와 바이러스, 박테리아, 원생동물, 리포솜, 또는 그 단편, 특히 위에서 언급된 필요성을 적어도 하나 충족시키는 미생물 구성 요소 사이의 상호 작용을 결정하기 위한 대안적인 방법, 장치 및 도구를 제공하는 것이다.

본 발명은, 예를 들어 자기를 띠는 비드 또는 생체 활성 분자인 적어도 하나의 입자 또는 마이크로캐리어(microcarrier)와, 예를 들어 제 2 비드 또는 미생물 구성 요소인 마이크로캐리어일 수 있는 제 2 입자를 사용하여, 생체 활성 분자 또는 다른 미생물 구성 요소 사이의 상호 작용을 결정하기 위한 도구 및 장치뿐만 아니라 분석을 기술한다. 적어도 제 1 입자 또는 마이크로캐리어는 자기를 띤다. 두 비드가 사용되고 두 비드 모두 자기를 띠는 경우, 비드는 자기 모멘트(moment)의 크기가 서로 다른 것이 바람직하다. 액체의 조건이 생체 활성 분자 사이 또는 생체 활성 분자와 다른 미생물 구성 요소 사이 또는 미생물 구성 요소 사이의 결합을 촉진하고, 결합을 기계적 응력 하에 배치하고, 따라서 서로 다른 강도의 결합을 구별하도록 하기 위한 수단이 제공된다. 일 양상에서, 예를 들어 제 2 비드(더 큰 자기 모멘트를 갖는)는 포획 분자에 약하게 결합된(그 자체는 일반적으로 이동 또는 고정 표면에 결합) 더 작은 자기 모멘트를 갖는 비드에 연결된 표적 분자를 자기에 의해 제거하는데 사용된다. 다른 실시예에 따르면, 예를 들어, 유체 흐름(fluid flow)에 의해 발생된 기계적 마찰력은 결합에서 기계적 응력을 유도하기 위해 입자 중 적어도 하나에 가해진다. 실시예에 따라, 제 1 비드 및/또는 제 2 입자는 검출 목적으로 사용될 수 있다.

명백히, 제 1 및/또는 제 2 입자는 개별적인 입자일 수 있지만, 또한, 예를 들어 입자들의 클러스터(cluster) 또는 입자들의 사슬(chain)과 같은 입자들의 집합(collection)의 일부일 수 있다.

입자들의 사슬은 자기장의 존재 하에 쉽게 형성된다. 이러한 입자들의 사슬은 액체에서 쉽게 이동된다. 또한, 입자들의 상기 사슬은 그 단부에서 강한 자기장 그래디언트를 갖고, 이는 스트린전시 특성에 유리하다.

일 양상에서, 본 발명은, 자기장에서 적어도 하나가 자기를 띠는 제 1 및 제 2 입자를 사용하여, 액체에서 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 결합 강도를 구별하는 방법을 제공하고, 이러한 방법은, 제 1 미생물 구성 요소와 제 2 미생물 구성 요소 사이의 결합을 위한 액체 내의 조건을 제공하면서, 액체에서 이동하는 제 1 입자와 제 1 미생물 구성 요소 사이에 복합체(complex)를 제공하고; 액체에서 이동하는 제 2 입자를 복합체에 근접하게 이끌고; 제 1 강도의 결합은 파괴하고 더 큰 제 2 강도의 결합은 파괴하지 않도록 자기장을 가하면서, 제 1 및 제 2 미생물 구성 요소 사이의 결합에 기계적 응력을 가하기 위해 제 1 및/또는 제 2 입자에 작용하는 것을 포함한다. 본 발명의 실시예에서, 입자 사이의 상대적 힘을 생성하도록 제 1 및 제 2 입자에 직접 힘이 가해진다. 이러한 상대적 힘은 이어서 결합에서 기계적 응력을 발생시키거나 유도한다. 제 1 및 제 2 입자는 입자 사이에 발생된 상대적 힘이 입자를 파괴시키지 않고 결합시키도록 기계적 강도를 가져야 한다. 그에 따라, 입자는 단단한 코어(core), 뼈대(scaffold) 또는 매트릭스(matrix)를 포함할 수 있다. 결합 강도의 구별은 특이적 결합과 비특이적 결합의 구별을 위해 사용될 수 있다. 제 1 미생물 구성 요소는 표적 분자일 수 있고, 제 2 미생물 구성 요소는 포획 분자, 예를 들어 두 분자가 모두 액체에 있는 경우 표적을 포획할 수 있는 포획 분자일 수 있다. 제 1 및 제 2 입자 모두가 자기 입자일 수 있거나 하나의 입자만이 자기를 띨 필요가 있다. 제 1 자기 입자는 미생물 구성 요소에 결합될 수 있고 제 2 자기 입자는 미생물 구성 요소에 결합될 필요가 없다. 제 1 자기 입자는 표적 미생물 구성 요소에 결합될 수 있다. 제 1 자기 입자의 자기 특성은, 예를 들어 자기장 그래디언트를 액체에 배치하고 표적에 결합된 자기 입자를 특정 위치로 끌어 당겨, 표적을 농축하는데 사용될 수 있다. 제 1 및/또는 제 2 자기 입자는 상자성이거나 임의의 다른 자기 형태일 수 있다.

제 1 자기 입자는, 예를 들어 제 2 자기 입자의 자기 모멘트보다 10배 더 작은 자기 모멘트를 가질 수 있다. 대안적으로, 제 1 및 제 2 입자는 모두 자기를 띠고 동일한 자기 모멘트를 갖는다. 제 1 자기 입자의 크기는 제 2 자기 입자의 크기보다 더 작을 수 있다. 제 1 자기 입자는 1 nm 내지 1 ㎛, 예를 들어 10 nm 내지 200 nm의 직경을 갖는 것이 바람직하다. 제 2 자기 입자는 적어도 100 nm의 직경을 가질 수 있다.

제 1 또는 제 2 미생물 구성 요소는 임의의 적합한 구성 요소일 수 있지만 일부 실시예에서는 단백질 또는 펩티드가 바람직하다. 보통, 하나 이상의 제 1 미생물 구성 요소 및/또는 하나 이상의 제 2 미생물 구성 요소가 샘플에 존재한다. 제 1 또는 제 2 미생물 구성 요소는 어레이 상의 포획 지점에 배열될 수 있다. 이는 검출 목적에 편리하다. 예를 들어, 어레이는 서로 다른 포획 지점에 적어도 10 개의 서로 다른 포획 미생물 구성 요소를 포함할 수 있다. 포획 지점은 0.1 내지 10⁴ ㎛²의 공간을 차지할 수 있다.

본 발명의 일부 실시예에서, 제 1 및 제 2 입자 모두는 미생물 구성 요소에 결합된다. 예를 들어, 제 1 입자는 표적 미생물 구성 요소에 결합될 수 있고, 제 2 입자는 이어서 포획 미생물 구성 요소에 결합된다. 대안적으로, 제 1 입자는 제 1 표적 미생물 구성 요소에 결합될 수 있고, 제 2 입자는 제 2 표적 미생물 구성 요소에 결합될 수 있다. 제 1 또는 제 2 미생물 구성 요소는 항체일 수 있다. 단일클론성(monoclonal) 항체는 높은 수준의 특이성을 특정 단백질에 제공할 수 있다.

또 다른 양상에서, 제 1 입자와 제 2 입자 중 하나의 입자만이 자기를 띠고 다른 입자는 자기를 띠지 않는다. 비자기(non-magnetic) 입자는 자기 입자보다 더 클 수 있다. 본 발명은 유체 마찰력을 제 1 또는 제 2 입자에 가하는 것을 포함한다. 이러한 경우에, 제 2 입자에 가해진 유체 마찰력은 크기 차이로 인해 제 1 입자보다 훨씬 더 크다. 비자기 입자의 서로 다른 크기는 서로 다른 결합 강도를 구별하기 위해 사용될 수 있다.

가해지는 자기장은 1.10^-4 내지 10 Tesla, 예를 들어 0.01 내지 0.1 Tesla일 수 있다. 제 1 및 제 2 입자가 자기를 띠는 경우, 자기장은 제 1 입자와 제 2 입자 사이에 인력 또는 반발력(repulsive force) 또는 다양한 발진력(oscillating force) 또는 교류시키는 힘(alternating force)을 발생시킬 수 있다.

본 발명은 또한 결합된 제 1 및 제 2 미생물 구성 요소와 제 3 자기 입자를 접촉시키는 것을 포함하는데, 여기서 제 3 자기 입자는 제 1 또는 제 2 자기 입자의 자기 모멘트보다 더 큰 자기 모멘트를 갖는다.

본 발명은 또한 포획 및 표적 생체 활성 분자와 같은 포획 미생물 구성 요소와 표적 미생물 구성 요소 사이의 제 1 결합과 제 2 결합을 구별하기 위해 제 1 및 제 2 입자를 사용하는 방법을 제공하고, 제 1 결합은 제 2 결합과 다른 강도를 갖는데, 입자 중 적어도 하나는 자기를 띤다. 이러한 방법은, 적어도 하나의 포획 미생물 구성 요소를 갖는 샘플을, 제 1 입자에 결합된 적어도 하나의 표적 미생물 구성 요소와 접촉시키고, 결합되지 않은 포획 미생물 구성 요소의 경우에, 포획 미생물 구성 요소와 표적 미생물 구성 요소 사이의 결합을 하게 하는 조건을 제공하고, 샘플을 결합되지 않은 제 2 입자와 접촉시키거나 샘플을 미생물 구성 요소에 결합된 제 2 입자와 접촉시키고, 자기장을 가하며, 표적 미생물 구성 요소와 포획 미생물 구성 요소 사이의 결합이 제 1 결합인지 제 2 결합인지 구별하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 액체에서 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 강도의 결합을 구별하기 위한 장치 또는 도구를 제공하고, 이러한 도구는 적어도 하나의 입자가 자기를 띠고, 입자 모두가 액체에서 이동하는 제 1 입자와 제 2 입자와, 제 1 미생물 구성 요소와 제 2 미생물 구성 요소 사이의 결합에 기계적인 응력을 가하고 서로 다른 강도의 결합을 구별하기 위해 제 1 및 제 2 입자에 작용하는 수단과, 적어도 자기장 발생기를 포함하는 기계적 응력을 가하기 위한 수단을 포함한다. 기계적 응력을 가하는 수단은 제 1 또는 제 2 입자에 유체 마찰력을 가하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이러한 도구는 기판 상의 포획 지점에 배열된 미생물 구성 요소의 어레이를 더 포함할 수 있다. 도구는 또한 어레이에 대해 입자의 측면 이동을 일으키는 여기를 발생시키는 수단을 포함할 수 있다.

도구는 특이적 결합 생체 활성 분자의 확인, 분리, 정제를 위해 사용될 수 있다. 도구는 마이크로유체 디바이스(microfluidic device)로 제조되는 것이 바람직하다.

종속항은 본 발명의 개별 실시예를 한정한다.

본 발명은 지금부터 다음 도면을 참조하여 설명될 것이다.

도 1 내지 도 4는 본 발명의 서로 다른 실시예를 나타내고, 도 5 및 6은 종래 기술을 나타낸다. 모든 도면에서, 비드는 개방된 원(1)과 폐쇄되고 채워진 원(2)으로 표시된다. 포획 분자(C)는 점선으로, 표적 분자(T)는 실선으로 표시된다. 도시된 구성은 포획 및 표적 분자가 서로 결합되고 비드는 표적-포획 복합체에서 파괴하는 힘(disruptive force)을 실행하기에 충분히 근접하게 이동한 상황을 나타낸다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따라, 제 2 자기 비드(2)가 표적 분자에 결합된 자기 비드(1)에 인력을 수행하는 마이크로 어레이를 상세하게 나타낸 도면.

도 2 내지 도 4는 본 발명의 실시예에 따라, 포획 분자에 결합된 표적 분자를 나타내는데, 여기서 제 2 비드(2)는 자기 비드(1)에 반발력을 수행한다. 도 2 및 도 3에서, 각각 하나의 표적 분자 및 2 개의 표적 분자는 포획 분자에 결합된다. 도 4에서, 제 2 비드(2*)는 비자기 비드이고 반발력은 자기력 및 유체 마찰력이다.(*로 표시)

도 5는 도 1 또는 도 2의 방법을 수행할 수 있는 본 발명의 실시예에 따른 장치의 개략적인 도면.

도 6은 도 4의 방법을 수행할 수 있는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 장치의 개략적인 도면.

본 발명은 특정 실시예에 대해 특정 도면을 참조하여 설명될 것이지만, 본 발명은 제한적이지 않고 청구항에 의해서만 제한된다. 도시된 도면은 개략적으로만 도시되었고 비제한적이다. 도면에서, 일부 요소의 크기는 과장될 수 있고 예시적인 목적으로 축척을 따라 도시되지 않았다. "포함하는"이라는 용어가 본 명세서의 설명 및 청구항에 사용된 경우, 이는 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않는다. 부정관사 또는 정관사가 사용된 경우, 단수 명사, 예를 들어 "하나의" ,"그"로 지칭될 때, 이는 그밖에 다른 것들이 특정하게 지정되지 않는다면, 그 명사의 복수를 포함한다.

또한, 발명의 상세한 설명 및 청구항에서 제 1, 제 2 및 제 3 등과 같은 용어는 유사한 요소를 구별하기 위해 사용되지만, 반드시 연속적이거나 연대기적인 순서를 설명하기 위한 것은 아니다. 이렇게 사용된 용어가 적합한 상황에서 서로 호환되어 사용될 수 있고, 본 명세서에서 설명된 본 발명의 실시예는 설명되거나 도시된 것과는 다른 순서로 조작될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

또한, 발명의 상세한 설명과 청구항에서 상부, 하부, 위, 아래 등과 같은 용어는 설명적인 목적으로 사용되었고, 반드시 상대적인 위치를 설명하기 위해 사용된 것은 아니다. 이렇게 사용된 용어는 적합한 상황에서 서로 호환되어 사용될 수 있고, 본 명세서에서 설명된 본 발명의 실시예는 설명되거나 도시된 것과 다른 배향으로 조작될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

본 발명은 미생물 구성 요소 사이의 상호 작용(예를 들어, 바이러스, 박테리 아, 원생동물 및 항체와 같은 생체 활성 분자 사이. 이러한 상호 작용은 일반적으로 단백질-단백질 또는 펩티드-펩티드 상호 작용) 또는 일반적으로 생체 활성 분자 사이(예를 들어, 펩티드-펩티드 또는 단백질-단백질 상호 작용)의 검출을 위한 관찰에 기초하고, 특히 다중-분석 센서에 있어, 포획 분자-표적 상호 작용의 정확한 물리화학적 성질에 관계없는 물리적 (스트린전시) 힘에 의해 약하게 또는 비특이적으로 결합된 분자를 제거하는 것이 유리할 것이다. 더 일반적으로, 본 발명의 목적은 생체 활성 분자 또는 미생물 구성 요소 사이의 약한 상호 작용과 강한 상호 작용을 구별하거나 제 1 상호 작용과 더 약한 제 2 상호 작용을 구별하는 것이다.

이러한 방법이 가할 수 있어야 하는 최소한의 힘은 F_min=E_min/w-max로부터 측정될 수 있는데, 여기서 E_min은 상호 작용의 가장 낮은 에너지이고, w_max는 상호 작용의 가장 큰 길이 규모이다. E_min은 생체 활성 분자 또는 다른 미생물 구성 요소 사이의 상호 작용이 일어나는 열 에너지에 의해 얻어진다. w_max 값은 생물학적 상호 작용{예를 들어, 이온, 반 데르 발스, 수소 결합, 소수성/친수성, 입체(steric)}의 최대 상호 작용 범위에 의해 결정된다. E_min=k_bT로, 본 발명의 실시예에 의해 T=300 k, w_max=40 nm, 최소 힘 0.1 pN이라는 결과가 얻어졌다.

본 발명은 다중-분석 바이오칩(biochip)에서 배경 신호를 억제하기 위한 물리적 방법을 제공한다. 두 가지 타입의 입자가 연관되는데, 이 입자들은, 예를 들어 한 가지 또는 몇 가지 크기의 중요한 양에 의해 자기 모멘트에 있어서 서로 다른 자기 입자의 두 가지 타입이다: (ⅰ) 제 1 비드 또는 검출 표지의 일부로서 크 기가 더 작을 수 있는 페리틴 같은(ferrtin-like) 자기 단백질 또는 마그네토좀(magnetosome)과 같은 미생물 구성 요소 (ⅱ) 제 2 비드 또는 페리틴 같은 자기 단백질과 같은 미생물 구성 요소 또는 마그네토좀 또는 마그네토스피릴륨 마그네토택튬(magnetospirrillum magnetotactum)과 같은 자기 세포. 예를 들어, 비드가 사용될 때, 제 2 비드는 작은 비드를 끌어당기고 운반하기 위해 크기가 더 클 수 있다. 큰 입자와 작은 입자 사이의 힘은 강한 생체 분자 상호 작용과 약한 생체 분자 상호 작용을 구별하기에 충분한 Pico Newton 범위에 있다. 이러한 방법은 광범위한 검출 원리와 디바이스 설계에 응용될 수 있다. 화학적 및 물리적 스트린전시 방법은 본 발명과 결합될 수 있다.

본 발명에 따라, 물리적 힘을 가하는 실제적인 방법은 적어도 하나의 자기 또는 상자성 입자 또는 마이크로캐리어, 예를 들어, 비드 또는 미생물 구성 요소에 의존한다. 본 발명에 따라, 입자 또는 마이크로캐리어는 예를 들어. 구, 원통 또는 막대(rod), 입방체(cube), 타원형(oval) 등의 형태와 같은 임의의 형태를 가질 수 있거나, 박테리아, 마그네토좀, 리포솜 또는 원생동물과 같은 다양한 형태를 가질 수 있다. 자기 마이크로캐리어 또는 입자가 생체 활성 분자에 결합될 때, 힘은 자기장 그래디언트를 통해 가해질 수 있다. 자기 마이크로캐리어 또는 입자에 미치는 힘(F)은 다음과 같다.

F = ∇(m.B) = m∇B 식(1)

여기서, m은 마이크로캐리어 또는 입자의 자기 모멘트이고, B는 자기장이다. 우측 어림값은, 예를 들어 자기 포화에 의해 유발된 일정한 입자 모멘트에 적용된 다.

본 발명의 한 가지 양상에 따라, 자기력은 예를 들어, 비드와 같은 표지와 같은 제 1 마이크로캐리어 또는 입자와 제 2 비드, 예를 들어 제 1 자기 비드와 근접하게 접촉하게 될 수 있는 제 2 자기 또는 비자기 비드와 같은 제 2 비드와 같은 제 2 마이크로 캐리어 또는 입자의 결합을 이용해 발생된다.

다음에서, 본 발명은 주로 비드의 사용과 관련해 설명될 것이다. 그러나, 본 발명이 비드의 사용에 제한되지는 않는다. 다음에서, '제 1 비드' 및 '제 2 비드'가 참조될 것이지만, "제 1" 또는 "제 2"의 사용과 "비드"라는 용어는 어떠한 제한 없이 해석되어야 한다. 본 발명에서 사용된 "비드"는 비드가 구 형태이지만, 예를 들어 구, 원통 또는 막대, 입방체, 타원형 등의 형태와 같은 임의의 적합한 형태를 가질 수 있거나, 한정되거나 일정한 형태를 가질 수 없다는 것을 의미하지는 않는다. 또한, "비드"라는 용어가 다음에서 사용되지만, 본 발명은, 예를 들어 마그네토좀, 박테리아, 바이러스, 원생동물, 리포솜, 자기를 띠거나 자기를 띠지 않는 언급된 비드에 상당하는 단백질 복합체인 미생물 구성 요소와 같은 입자의 사용을 포함한다. 예를 들어, 마그네토좀은 자기 박테리아에서 자연적으로 발생하는 자기 입자이고, 그로부터 분리될 수 있으며, 자기 비드로 작용할 수 있는 반면, 리포솜은 보통 비자기 비드로 사용될 수 있는 합성 입자이다.

유사한 고찰이 "생체 활성 분자"라는 용어에 적용된다. 다음에서, 주로 생체 활성 분자에 대해 설명할 것이지만, 본 발명은 언급된 분자에 상당하는 단백질 복합체뿐만 아니라, 마그네토좀, 박테리아, 바이러스, 원생동물, 리포솜, 또는 임의 의 그 단편과 같은 미생물 구성 요소의 사용을 포함한다. "미생물 구성 요소"라는 용어는 넓게 해석되어야 한다. 이것은 단백질, 펩티드, RNA, DNA, 지질(lipid), 인지질 및 탄수화물 또는 유사한 것과 같은 생체 활성 분자를 포함한다. 생체 활성 분자라는 용어는 또한 세포막의 일부, 특히 수용체(receptor)를 포함할 수 있는 세포막의 일부와 같은 세포 단편을 포함한다. 생체 활성 분자라는 용어는 또한 잠재적으로 생체 활성 분자와 결합할 수 있는 작은 화합물과 연관된다. 본 명세서에서의 예는 리간드(ligand), 촉진제(agonist), 길항제(antagonist), 저해제(inhibitor), 또는 조절자(modulator)이다. 생체 활성 분자는 분리되거나 합성된 분자일 수 있다. 합성된 분자는 변형된 아미노산 또는 뉴클레오티드(nucleotide)와 같이 자연적으로 발생하지 않는 화합물을 포함할 수 있다. 대안적으로, 생체 활성 분자는 분해질(lysate), 세포 단편, 세포 소기관, 완전한 세포(intact cell) 또는 미생물(예를 들어, 바이러스 또는 박테리아)의 문맥 내에 존재할 수 있다. 생체 활성 분자는 또한 혈액 또는 혈청(serum) 또는 다른 신체 유체 또는 분비물(secretion), 또는 음식, 물 샘플 및 다른 것들과 같은 생체 활성 분자를 포함하는 임의의 다른 샘플과 같은 배지에 존재할 수 있다. "미생물 구성 요소"라는 용어는 또한 바이러스, 박테리아, 원생동물 및 다른 세포 기관, 또는 그 단편, 또는 마그네토좀과 같은 세포 미생물의 일부 또는 소기관, 또는 리포솜과 같은 합성 미생물 조직을 포함할 수 있다.

분자 사이의 상호 작용은 결합을 지칭하고 약한 결합(일반적으로 비특이적 또는 무특이적)과 강한 결합(일반적으로 특이적 결합)을 포함한다. "약한", "비특 이적" 및 "강한", "특이적" 결합이라는 용어는 결합의 특정한 정도 또는 절대적인 강도와 반드시 관련된 것은 아니고, 상대적 관계를 정의하는데, 즉 "강한" 또는 "특이적"은 "약한" 또는 "무특이적" 또는 "비특이적"보다 더 강한 결합을 갖는다는 것을 의미한다. 생체 활성 분자 사이의 약한 결합은 0.1 pN 이하의 힘으로 결합된 것으로 이해된다.

'표적' 및 '포획 분자'로 언급되는 생체 활성 분자 사이에 본 발명에서 결정된 상호 작용은 언급된 임의의 나열된 생체 활성 분자 사이일 수 있고, 수용체/리간드, 수용체/저해제, 효소(enzyme)/기질, 항체/항원, DNA/RNA, RNA/RNA, 바이러스/분자, 박테리아/분자, 리포솜/분자 등의 조합에 제한되지 않는다. 결정된 상호 작용의 바람직한 타입은 표적 또는 포획 분자 중 적어도 하나는 단백질 또는 펩티드인 타입이다. 더 바람직한 상호 작용의 타입은 표적 및 포획 분자 모두가 단백질 또는 펩티드인 타입이다.

적어도 하나의 결합을 포함하는 분자 및/또는 생물학적 구성 요소 사이의 상호 작용은 본 발명에 따라 광범위하게 해석되어져야 한다. 다음의 복합체들은 예로서만 제공된다.

- 포획 분자에 결합된 표적 분자,

- 제 2 표적 분자에 결합된 포획 분자에 결합된 제 1 표적 분자,

- 바이러스에 결합된 포획 분자,

- 제 2 포획 분자에 결합된 바이러스에 결합된 제 1 포획 분자,

- 바이러스/세포 분자 복합체.

하나의 입자가 자기를 띠는 두 입자 시스템을 위해 올바른 환경을 선택하여, 감도의 증가가 얻어질 수 있다. 생체 활성 분자를 분리하고 농축하기 위한 자기 비드의 사용은 잘 알려져 있다{예를 들어, 1998년 6월 22일, B. Sinclair에 의해 The Scientist 12(13), 17 페이지에 기술된 "To bead or not to bead: Applications of magnetic bead technology"; 또는 David Wild에 의해 기술된"The Immunoassay Handbook"(Nature Publishing Group, London, 2001, ISBN 1-56159-270-6); 또는 Urs Hafeli et al에 의해 기술된 "Scientific and Clinical Application of Magnetic Carriers" (Plenum Press, New York, 1997), ISBN:0-306-45687-7}. 이러한 응용에서, 포획 분자는 자기 비드에 결합되고, 그 후 자기력은 결합 표적을 제거하거나 농축하기 위해 가해진다. 보통 이러한 실험은 평균 단백질 크기인 10 nm 보다 상당히 더 큰 1 ㎛ 이상의 크기를 갖는 비드로 수행된다. 이러한 비드가 본 발명의 문맥에서 사용될 수 있지만, 그 크기는 입체 장애(steric hindrance)로 인해 마이크로 어레이 구성의 중대한 단점을 제공할 수 있다. 입체 장애는 포획 지점의 규모 축소뿐만 아니라 센싱의 동적 범위를 제한한다. 규모 축소는 포획 지점에 있어 바람직한데, 그 이유는 포획 분자의 더 높은 밀도를 갖는 더 작은 포획 지점이 단위 면적 당 더 높은 표적 농도를 유발할 것이고, 센싱의 소음에 대해 더 큰 신호 비를 제공할 것이기 때문이다. 따라서, 이것은 마이크로 어레이에서 필요한 감도를 얻을 수 있도록 할 것이다.

일 양상에서, 적어도 제 1 비드는 생체 활성 분자에 부착되고 제 2 비드는 생체 활성 분자에 부착되지 않는다. 그러나, 본 발명의 특정 실시예에 따라, 생체 활성 분자는 제 1 및 제 2 비드 모두에 부착될 수 있다. 가장 바람직하게는, 이러한 경우, 생체 활성 분자는 동일하지 않을 것이다.

적어도 하나가 자기를 띠거나 상자성인 비드는 자기장 또는 다른 타입의 힘 의 장(force field) 응용이 표적-포획 분자 상호 작용에서 무특이적으로 결합된 표적의 제거를 초래하도록 사용된다. "자기"라는 용어는 자기 입자의 임의의 적합한 형태, 예를 들어, 자기, 상자성, 초상자성(superparamagnetic), 철자기(ferromagnetic)와 같은 자기 입자, 즉 자기장에서 영구적으로 또는 일시적으로 자기 쌍극자를 생성하는 임의의 형태의 자기를 포함한다. 본 발명을 수행하기 위해, 비드 형태의 제한은 없지만, 구 형태의 입자가 현재 확실한 방식으로 제조하기에 가장 쉽고 가장 저렴하다. 자기 인력을 향상시키기 위해, 비드는 자기 불규칙성, 예를 들어 표면에 첨가된 높은 곡률의 입자, 돌출, 침정(needle) 등이 제공될 수 있다. 비드는 또한 예를 들어, 구가 아닌 형태로 인해 영구적인 자기 모멘트를 가질 수 있다. 본 발명의 바람직한 자기 입자는 초상자성 입자이다. 이들은 일반적으로 철자기 물질의 하나 또는 많은 작은 구 코어(spherical core)(3 내지 30 nm)로 이루어진다. 이들의 작은 크기 때문에, 코어는 단일 자기 영역(domain)으로 구성된다. 초상자성 비드의 경우에, 자기 모멘트는 외부 자기장에 의해 발생된다. 구 형태 때문에, 자기 모멘트는 쉽게 입자 내에서 회전할 수 있다. 초상자성 입자는 그 자기 모멘트가, 가해진 자기장의 부재시 사라지고, 이어서 자기 집합체를 최소화한다는 장점을 갖는다. 비구 형태 및/또는 더 큰 코어를 갖는 입자의 장점은, 자기 모멘트가 일반적으로 크고, 이것이 자기 조작을 촉진시킨다는 점이다.

입자의 집합체는 교류 자기장과 같은 여기 방법을 가하여 제거될 수 있다.

본 발명의 실시예에 따라, 비드는 모두 자기 비드, 가장 바람직하게는 서로 다른 자기 모멘트를 갖는 자기 비드이다. 자기를 띠지 않는(자기 모멘트 = 0) 한 세트의 비드는 또한 본 발명의 이러한 양상 내에 포함된다. 본 발명의 또 다른 실시예(예에서 설명된)에 따라, 두 비드는 동일한 자기 모멘트를 가질 수 있다.

본 발명의 일 양상에 따라, 상호 작용하는 분자 중 하나는 자기 비드에 결합된다. 바람직하게, 표적은 본 발명의 제 1 비드에 연결된다. 그러나, 포획 분자가 자기 비드 중 하나에 결합되거나, 서로 다른 포획 분자가 각각 자기 비드에 결합되는 배열이 본 발명 내에서 또한 생각될 수 있다는 것이 이해된다.

본 발명의 양상에 따라, 제 1 비드는 제 2 비드보다 더 작고, 동일하거나 심지어 더 큰 크기를 가질 수 있다. 그러나, 제 1 비드가 표적 생체 분자에 부착될 때, 제 1 비드가 상세하게 더 설명된 몇 가지 장점에 있어, 제 2 비드보다 더 작은 것이 바람직하다. 제 1 및 제 2 비드는 동일한 조성을 가질 수 있다. 이러한 경우에, 얻어질 수 있는 자기 모멘트는 비드의 크기와 관련이 있다. 그러나, 제 1 및 제 2 비드의 조성이 서로 다른 특정 실시예가 생각될 수 있다. 이러한 경우에, 크기와 자기 모멘트 사이의 상호 관계는 분리된다.

제 1 및 제 2 비드의 크기는 본래 본 발명의 제한 요소가 아니다. 그러나, 바이오칩 상의 상호 작용을 검출하기 위해, 작은 크기의 비드가 유리할 것이다. 마이크로미터 크기의 비드가 표지로 사용될 때, 이는 모든 표지가 적어도 1 ㎛²의 면 적을 차지하기 때문에 규모 축소를 제한한다. 결과로서 얻어진 바이오칩 크기는 다음과 같이 측정될 수 있다: 모든 포획 지점에서, 적어도 1000 개의 입자가 3%(N^-1/2)변수의 통계의 계산 변화를 얻기 위해 수집될 필요가 있다. 1000의 동적 범위를 얻기 위해, 모든 지점은 적어도 1000 ×1000 = 10⁶ ㎛²의 면적을 필요로 한다. 1000-플렉스 바이오칩은 포획 지점에 대해 1000 ×10⁶ ㎛² = 10 cm²의 전체 면적을 필요로 할 것이고, 이에 더하여 지점 사이의 개방 면적 등을 더 필요로 할 것이다. 이는 바이오칩에 대해 꽤 큰 면적이며, 비용 효율적인 면에서 cm² 범위보다는 mm² 범위이어야 한다. 또한, 입체 장애 때문에, 마이크로미터 크기의 비드는, 보통 표면에서 제곱 마이크로미터당 1 보다 더 큰 표적 농도를 생성할 분석 조건(예를 들어, 표적 농도, 포획 탐침 친화도, 표면상의 포획 탐침 밀도)에 표지로 적합하지 않다. 또한 작은 입자는 더 우수한 확산 특성을 갖고, 일반적으로 큰 입자보다 더 낮은 침전 경향을 나타낸다.

본 발명에 따라, 제 1 비드는 1 내지 500 나노미터, 더 바람직하게는 5 내지 100 나노미터의 크기 범위에 있는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 제 2 비드는 50 nm 내지 5 마이크로미터 크기 범위에 있는 것이 바람직하다. 그러나, 두 비드는 모두 3 nm 내지 5 마이크로미터 범위에서 동일한 크기를 가질 수 있다.

자기 또는 상자성 비드가 본 발명의 양상에 따라 사용되는 경우, 자기장의 응용은 제 1 비드와 제 2 비드(두 비드 모두 자기를 띰) 사이의 반발력 및/또는 인 력 또는 자기장 그래디언트로 인한 비드 중 하나의 이동을 초래할 수 있다. 비드를 만드는 데 사용되는 본 발명의 입자는 자기화된 물질 또는 자기화 가능한 물질로 만들어질 수 있지만, 또한 자기 입자가 부착되거나 통합될 수 있는 중합체와 같은 중실(solid) 또는 다공성 물질일 수 있다. 비드에서 또 다른 물질과 합성되는 자기 입자의 사용은 자기 모멘트와 비드의 크기 사이의 직접적인 관계를 분리시키는 것을 가능하게 한다. 비드에서 자기 입자 복합체의 사용은 또한 비드의 무게를 변형시키는 것을 가능하게 한다. 비드에서 자기 입자 복합체의 사용은 또한 예를 들어, 발색단(chromophoric group)과 같은 단백질 및/또는 검출 표지와 반응하기 위한 작용기의 통합을 가능하게 한다.

자기 물질을 포함하는 비드의 잘 알려진 예는 Dynabeads^TM이다. Dynabeads M450(4.5 미크론의 직경)은 단량체 에폭시드로 코팅될 수 있는데, 이는 에폭시와 히드록시 기의 혼합물을 생성시킨다. Dynabeads M-280(2.8 미크론의 직경)은 p-톨루엔 술포닐 클로라이드와의 반응에 의해 토실옥시 기로 변환된 히드록실 기를 갖는 폴리스티렌 비드이다. 자기 비드는, 예를 들어 고처리량 임상 면역학적 검증 도구, 샘플 정제, 세포 추출 등과 같은 생물학적 분석에 널리 사용된다. 몇 가지 진단 회사(Roche社, Bayer社, Johnson & Johnson社, Abbott社, BioMerieux社 등)는, 예를 들어 면역학적 검증, 핵산 추출 및 샘플 정제를 위해, 자기 비드를 갖는 시약을 제조하고 판매한다. 자기 비드는 나노미터부터 마이크로미터까지의 범위의 다양한 크기로 상업적으로 이용 가능하다. 본 발명의 비드를 생체 활성 분자에 부착하 거나 결합하기 위해, 비드는 히드록실, 카르복실, 알데히드 또는 아미노기와 같은 작용기를 가질 수 있다. 이들은 일반적으로, 이러한 작용기 중 하나를 갖는 중합체의 표면 코팅을 제공하기 위해, 예를 들어 히드록실 기를 제공하기 위해 폴리글리콜과 함께 폴리우레탄 또는 히드록실기를 제공하기 위해 셀룰로오스 유도체, 카복실기를 제공하기 위해 아크릭산 또는 메타 아크릴산의 공중합체, 아미노기를 제공하기 위해 아미노알킬화된 중합체와 같은 작용기를 제공하기 위해, 예를 들어 코팅되지 않은 단일 분산, 초상자성 비드를 처리하여 제공될 수 있다. 미국특허 US4654267호는 이러한 많은 표면 코팅의 도입을 개시한다. 다른 코팅된 입자는 미국특허 US4336173, 4459378 및 4654267에 따른 비드의 변형에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 스티렌-디비닐벤젠으로부터 제조되고 3.15 ㎛의 직경을 갖는 대규모 망상형(macroreticular) 다공성 중합체 입자는 다공의 표면에 -NO₂ 기를 주입하기 위해 HNO₃으로 처리되었다. 이어서, 입자는 Fe²⁺ 수용액에 분산되었다. Fe²⁺는 다공 내의 불용성의 철 옥시-히드록시 화합물을 침전시키는 -NO₂에 의해 산화된다. 가열 후, 철은 다공성 입자의 부피를 통해 자기 철 산화물의 미세하게 분리된 조직(grain)으로 존재한다. NO₂ 기는 Fe²⁺와의 반응에 의해 NO₂ 기로 환원된다. 다공을 채우고 표면에 바람직한 작용기를 주입하기 위해, 서로 다른 단량체가 다공과 표면에서 중합하게 된다. 바람직한 타입의 입자의 경우에, 표면은 -(CH₂CH₂O)8-10 결합을 통해 중합체 백본에 연결된 -OH기를 갖는다. 다른 바람직한 경우는 메타크릴산 의 중합을 통해 얻어진 -COOH기를 갖는다. 예를 들어, 처음에 비드에 존재한 NH₂ 기는 미국특허 US 4654267에 개시된 디에폭시드와 반응될 수 있고, 뒤이어 말단 비닐 기를 제공하기 위해 메타크릴산과 반응한다. 메타크릴산과의 공중합체 용액은 아래에 언급된 R452 비드에서와 같이 말단 카르복실기를 갖는 중합체 코팅을 생성한다. 유사하게, 아미노글리세롤과 같은 히드록실아민과의 반응이 히드록시 기를 주입하면서, 아미노기는 디에폭시드와의 반응의 위의 산물과 디아민을 반응시켜 주입될 수 있다.

생체 활성 분자와 비드의 결합은 비가역적일 수 있지만, 또한 입자와 생체 활성 분자 사이의 교차 결합을 위한 연결 분자의 사용에 의해 가역적이 될 수 있다. 이러한 연결체의 예는 특정 단백질 분해 인식 장소를 갖는 펩티드, 특정 제한 효소에 대한 인식 장소를 갖는 올리고뉴클레오티드 시퀀스(sequence), 또는 환원 가능한 이황화물 기를 포함하는 화학적으로 가역적인 교차 결합 기를 포함한다. 다양한 가역적인 교차 결합 기는 Pierce Biotechnology Inc.社(Rockford, IL, USA)로부터 얻을 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따라, 표적 분자와 포획 분자 사이의 특이적 상호 작용의 검출(즉, 비특이적 결합 분자 및/또는 표지의 제거 후)은 본 발명의 대부분의 실시예에 따라 제 1 입자인 생체 분자에 연결된 입자의 특성에 기초하여 행해진다. 검출은 제 1 입자의 자기 특성에 기초하여 행해지는 것이 바람직하다.

본 발명의 양상에 따라, 자기장은 본 발명의 제 1 및 제 2 비드를 포함하는 샘플에 가해진다. 자기장은 본 발명에서 기술된 자기 비드에 다른 효과를 제공하기 위해 당업자에게 알려진 몇 가지 방식으로 가해질 수 있다. 자기장은 하나 또는 두 입자에서 자기 모멘트의 배향을 생성하기에 충분히 커야하고, 바람직하게는 두 입자 모두에서 자기 모멘트를 포화시킨다. 바람직한 자기장은 입자의 타입(예를 들어, 초상자성, 철자기, 구 또는 비구)에 의존한다. 본 발명에 따라, 자기장은 1.10^-4 Tesla 내지 10 Tesla의 범위, 바람직하게는 0.01 내지 1 Tesla의 범위에 있다. 자기장은 영구 자석 또는 전자석, 예를 들어 솔레노이드(solenoid)에 의해 발생될 수 있다. 다양한 자기장은 자석 코일에서 전류를 변화시켜 발생될 수 있지만, 자기 물질(단단한 자석 또는 연성 자석)의 기계적 이동에 의해서도 발생될 수 있다.

자기장 그래디언트는 전류 와이어 가까이에서 발생될 수 있지만, 자기 물질에서 곡선 또는 뾰족한 형태에 의해서도 발생될 수 있다. 자기 입자에 가해진 자기장 그래디언트는 0.01 T/m 내지 10⁵ T/m, 바람직하게는 0.1 T/m 내지 10⁴ T/m의 범위에 있다.

결합된 표적 분자 또는 자기 입자의 검출은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 자기에 의해 행해질 수 있다. 예를 들어, 검출은 마그네토 저항(magneto-resistive) 센서의 사용 또는 자기 유도 방법 등, 기계적 방법{표면 또는 대량 음파, 수정 미량 천칭(crystal microbalance), 진동 세포막 등}, 광학 방법{표면 플라스몬 공명(plasmon resonance), 광학 간섭, 회절, 표면 향상된 공명 라만 분산(resonant Raman scattering), 광학 분산 등), 전기적 방법(예를 들어, 입자의 화 학적 형성에 의해 보조되는 전도 등)에 의해 수행될 수 있거나, 또는 심지어 대량 분광과 같은 다른 분석 도구가 사용될 수 있다. 비드가, 예를 들어 추가적인 광학 활성 성분, 추가적인 전자 활성 성분 등을 포함하는 복합 검출 표지의 일부인 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 검출은 광학적으로(예를 들어, 형광체, 소실 자기장 여기 형광체, 형광체 분극, 화학 루미네선스, 전자화학 루미네선스, 표면 향상 라만 분산 등), 전기적으로(예를 들어, 전도를 통해, 산화환원 전류에 의해 등), 기계적으로 등에 의해 일어날 수 있다. 특수 표지 설계는 다음과 같은 본 발명의 범위 내에 포함된다.

- 예를 들어, 향상된 안정성, 전도 특성, 광학 특성(예를 들어, 분산, 플라스몬 공명) 등을 위한 금속 피복 층을 갖는 자기 코어.

- 광학 활성 성분에 의해 둘러싸인 자기 코어 또는 자기 코어들.

- 예를 들어, 효소, 산화환원 분자, 산화환원 효소인 (생)화학 활성 분자, 에 의해 둘러싸인 자기 코어 또는 자기 코어들.

- 생체 활성 및/또는 다른 기능 화합물이 결합되는, 예를 들어 덱스트란과 같은 유기물 층으로 코팅된 자기 코어 또는 자기 코어들.

- 예를 들어, 폴리스티렌(보통 라텍스로 알려짐), PMMA와 같은 중합체 구 내에 캡슐화된(capsulated) 자기 코어 또는 자기 코어들. 중합체 매트릭스 내에 다른 신호 분자(예를 들어, 형광단)는 삽입될 수 있거나 공중합될 수 있다.

- 페리틴과 같은 생물 활성 자기 입자.

- 예를 들어, 마그네토좀, 리포솜과 같은 자기 및/또는 검출 성분을 갖는 소 낭(vesicle).

자기 나노입자의 기술 및 응용의 예는 또한 2003년 5월 22-24일, 독일, Jena에서 열린 "Bioconjugated nanoparticles in molecular diagnostics and therapy"와 같은 최근 회의에서 찾을 수 있다. www.ipht-jena.de/BEREICH_3/molnano/nanoparticles2003을 보면 2003년 6월 12-13일에 프랑스, 파리에서 열린 "2nd international meeting on the diagnostics applications of magnetic microspheres"를 찾을 수 있다.

다른 실시예에서, 제 1 비드는 항원에 국한되지 않지만, 발색단, 친화도 표지와 같은 검출을 위한 추가 표지를 가질 수 있다. 검출을 위한 표지는, 비드가 중합체 금속 비드에 대한 경우일 수 있는 검출 표지와 반응하기 위한 추가 작용기를 포함할 때, 용이하게 자기 비드에 가해질 수 있다. 예를 들어, 작용기를 통해 직접, 또는 연결체(linker) 또는 사슬(tether)을 통해 간접적으로, 또는 바이오틴/스트렙타비딘과 같은 중간 분자를 사용하여, 비드에 표지를 결합하는 몇 가지 기술이 선행 기술에 알려져 있다.

제 1 실시예

도 1에 개략적으로 도시된 본 발명의 제 1 실시예에 따라, 생체 활성 분자 사이의 상호 작용의 검출이 수행되어, 생체 활성 물질(C)(바람직하게는 포획 분자라 지칭)은, 예를 들어 표면(5)이 포획 분자가 결합하는 중합체와 같은 물질을 포함하는 경우 직접, 또는 연결 분자(3)를 통해 간접으로 표면(5)에 결합된다. 본 명세서에서 사용된 표면(5)은 생체 활성 분자로 직접적으로(예를 들어, 교차 결합에 의해) 또는 간접적으로 코팅하기에 적합한, 유리, 플라스틱, 유기 수정 또는 무기 수정(예를 들어, 규소), 비결정 유기 또는 비결정 무기 물질(예를 들어, 규소질화물, 규소산화물, 규소옥시질화물, 알루미늄산화물)과 같은 고정 기판, 매트릭스 또는 그리드에 관한 것이다. 적합한 표면 물질 및 연결 화학은 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어 1994년, 미국, 워싱턴 DC, 1994 Symposium Book Series 556에 미국 화학 협회의 A.M. Usmani 와 N. Akmal에 의해 기술된 "Diagnostic Biosensor Polymers", Y.Lvov와 H.Mohwald(Marcel Dekker, New York, 2000)에 의해 편집된 "Protein Architecture, Interfacing Molecular Assemblies and Immobilization Biotechnology", David Wild(Nature Publishing Group, London, 2001, ISBN 1-56159-270-6)에 의해 기술된 "The Immunoassay Handbook", 또는 Kress-Rogers(ISBN 0-8493-8905-4)에 의해 기술된 "Handbook of Biosensors and Electronic Noses. Medicine, Food and the Environment"에 기술되어 있다. 본 발명은 평면 센서 표면(예를 들어, 평면 유리 바이오칩)에서 수행될 수 있지만, 플로-스루 시스템(flow-through system)(예를 들어, 다공성 알루미늄 산화물, 다공성 규소, 또는 마이크로 비드를 포함하는 다공성 컬럼(column)으로 만들어진 플로-스루 센서)에서 수행될 수 있다.

제 1 실시예의 양상에 따라, 서로 다른 자기 모멘트를 갖는 두 비드(1,2) 각각은 도 1에 개략적으로 도시된 포획 분자-표적 분자 상호 작용의 검출에서 조절, 예를 들어 비특이적 결합을 최소화하기 위해 사용된다. 알려지거나 추정상의 표적(들)(T)을 포함하는 하나의 생체 활성 분자 또는 생체 활성 분자의 혼합물은 (직접 또는 간접으로) 제 1 비드(1)에 연결된다. 제 1 비드(1)는 제 2 비드(2)보다 더 작은 자기 모멘트를 갖는다. 표면(5)은 하나의 포획 분자 또는 바람직하게는 포획 분자(C)의 선택으로 코팅된다. 코팅 표면은 더 큰 자기 모멘트를 갖는 제 2 비드(2)를 첨가함과 동시에 또는 첨가하기 전에 표적/혼합과 접촉되고, 그 자체는 생체 활성 분자에 결합되지 않는다. 적합한 자기장(M)의 응용(도면은 평면외 자기장을 도시하지만, 이는 필수적이지는 않다)은 제 1 비드(1)를 제 2 비드(2)에 끌어당기는 결과를 낳을 것이다. 제 1 및 제 2 비드(1,2)의 자기 모멘트와 자기장(M)의 강도는 표지된 생체 활성 분자(T)와 포획 분자(C) 또는 그 표면(5)과의 더 약하거나 비특이적 상호 작용이 분자(T)의 제거, 즉 표적 분자(T)와 포획 분자(C) 사이의 결합의 파괴를 초래하도록 선택된다. 분리된 표적 분자는 제거될 수 있다. 다른 한편, 제 1 및 제 2 비드(1,2)의 자기 모멘트와 자기장(M)의 강도는 더 강한, 예를 들어 특이적 표적-포획 분자 상호 작용이 두 비드(1,2)사이의 자기 인력에 의해 파괴되지 않고 검출될 수 있도록 선택된다.

이러한 실시예의 몇 가지 응용은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 알려진 리간드의 구조적으로 연관된 아날로그(analogue)의 집합 또는 작은 화합물(포획 분자)의 큰 집합은 표면에 가해질 수 있어서, 단일 단백질(표적 분자)은 단백질이 리간드 아날로그에 약하고, 적당하고, 강한 결합을 분석하기 위해 사용될 수 있다. 유사한 분석이 몇 가지 단백질을 갖고 사용될 수 있다. 이는 분석된 단백질을 위한 촉진제와 길항제에 대한 추정 상의 선도 화합물을 발견하게 해 준다. 본 명세서에서, 약하게 또는 강하게 결합하는 단백질은 가능한 부작용에 대해 지적할 것이다.

작은 화합물이 표면에 연결되기 쉬운지 자기 비드에 연결되지 쉬운지에 따라, 단백질 성분이 표면에 부착되고 작은 화합물은 용액에 존재하는 유사한 분석이 수행될 수 있다.

본 발명의 이러한 실시예는 또한 단백질 기술에 사용될 수 있다. 특정 지점을 향하거나 무작위로 돌연변이가 일어난 단백질의 집합은 특정 화합물(작은 분자 또는 다른 단백질 또는 단백질들)의 결합을 위해 그리드 표면에 배치될 수 있고 스크리닝(screening)될 수 있다. 이러한 배열을 갖고, 정상 리간드를 갖는 작거나 변형된 결합 친화도를 갖는 단백질이 결정될 수 있지만, 이는 변형된 결합 특성 또는 변형된 리간드 특이성을 나타내는 돌연변이를 또한 나타낼 것이다. 선행 예의 교시에 따라, 유사한 실험이 단백질과 DNA, RNA, 탄수화물, 지질, 인지질, 다른 세포 구성 요소와의 상호 작용을 위해 설계될 수 있다. 또한 세포, 소낭, 병원체 및 다른 생물 조직이 검출될 수 있다. 본 발명의 이러한 실시예는 생체 활성 분자의 검출에 적합하지만, 또한 생체 활성 분자의 분리 및 정제에 적합하다.

본 발명의 실시예에 따라 결정되는 상호 작용의 바람직한 타입은 포획 분자와 표적 분자가 모두 단백질인 타입이다. 이러한 타입의 응용은 알려진 단백질(포획 분자)의 집합이 그리드에 결합되는 소위 단백질 어레이이다. 표적 분자를 포함하는 생물학 샘플은 제 1 자기 비드로 표지되고 표적 분자와 포획 분자 사이의 결합을 위해 분석된다. 이후, 제 2 입자는 더 약하게, 예를 들어 비특이적으로 포획 분자에 결합된 이러한 표적 분자를 확인하거나 제거하기 위해 사용된다.

본 발명은 특이적 결합 및 비특이적 결합을 구별하기 위해서 완충액 조건을 변화시킬 필요 없이 이러한 방법을 수행하도록 해준다.

단백질 마이크로어레이에서 작용할 때, 제 1 자기 비드의 크기는 중요할 수 있다. 마이크로미터 크기의 비드는 어레이 센서에서 표지로 사용되었다(예를 들어, 1998년에 Baselt D.R., Lee G.U. et al.,에 의해 바이오 센서 및 바이오일렉트로닉스 13호 731-739 페이지에 기술된 'A biosensor based on magnetoresistance technology'). 자기력은 큰 자기 모멘트 때문에 큰 비드에 쉽게 가해질 수 있지만, 큰 비드는 단백질-단백질 마이크로어레이와 같은 실험에서 많은 중요한 단점을 갖는다.

- 표면에 결합할 기회를 갖기 위해, 표지는 상당한 시간 동안 센서 표면과 상호 작용할 필요가 있다. 비드와 표면과의 상호 작용 효율은 대부분 표지의 확산 속도에 의해 결정된다. 마이크로미터 크기의 입자의 확산은 매우 느리고(1초 당 약 1 ㎛, D∼10^-12 m²), 이는 전체 분석 시간을 늘린다.

- 느린 확산 속도, 표면과의 긴 상호 작용 시간 및 입자의 큰 표면적은 큰 비드가 비특이적인 방식으로 표면에 부착되는 가능성을 증가시킨다.

- 마이크로미터 크기의 입자는 분석에 손상을 주는 침전 속도를 나타낸다.

- 마이크로미터 크기의 입자는 유속에 민감하다. 분석 동안, 용액은 종종 새로 공급되거나 교반되며(배양 동안), 서로 다른 유체는 연속해서 가해질 수 있다. 큰 비드가 표지로 사용될 때, 이들은 이러한 유체 이동에 의해 제어되지 않는 방식 으로 센서로부터 끊어질 수 있다. 그 결과, 마이크로미터 크기의 표지는 종결점 검출에만 적용될 수 있고, 심지어 이 경우, 유체 조작은 세심한 주의를 갖고 수행될 필요가 있다.

- 작은 비드는 큰 비드보다 더 높은 농도에서 유체에 분산될 수 있다(단위 부피 당 비드 수의 면에서). 따라서, 작은 비드는 표적 분자와 센서 표면과 더 높은 상호 작용 비율을 갖게 한다.

따라서, 마이크로미터 이하 크기를 갖는 비드를 사용하는 것이 유리하다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시예에 따라, 하위 마이크로미터 제 1 자기 비드는 500 나노미터 이하 수 나노미터까지의 범위의 크기가 사용된다.

작은 입자를 사용하는 경우, 비드의 자기 모멘트가 감소한다는 문제가 발생한다. 모멘트는 비드의 반경의 제 3 힘을 갖는 비드의 부피에 비례한다. 예를 들어, 35 nm의 크기를 갖는 초상자성 비드와 약 10 nm의 자기 코어는 10^-18 A.m² 정도의 자기 모멘트를 갖는다. 심지어 10³ T/m의 큰 외부 그래디언트를 갖고, 1 fN [식 (1)]만의 힘이 얻어진다. 이는 생체 활성 분자 사이의 강한 결합으로부터 약한 결합을 분리하는데 대체로 불충분하다. 따라서, 이러한 작은 입자들은 자기장 그래디언트가 매우 증가되는 경우에만 사용될 수 있다.

자기 그래디언트를 증가시키는 알려진 방법은 매우 큰 곡률 또는 뾰족한 형태를 갖는 자기 물질을 사용하는 것이다. 예를 들어, 100 마이크로미터의 정점 곡률을 갖는 자기 침정(needle)은 정점에서 약 1T/100 마이크로미터=10⁴ T/m의 자기장 그래디언트를 발생시킨다(자기 물질의 포화 자기도는 약 1T). 그러나, 특히 정점으로부터 100 마이크로미터보다 더 이동하는 경우, 이 그래디언트는 신속하게 사라진다. 다시 말하면, 높은 자기장 그래디언트는 항상 공간적으로 비균질하고, 국부적으로만 적용된다. 따라서, 자기장 그래디언트를 발생시키는 자기 물질은 액츄에이션(actuation)될 필요가 있는 제 1 비드에 가능한 한 근접하게 와야 한다. 이는 제 1 비드와 제 2 비드 사이의 강한 자기 상호 작용으로 해석된다. 한편, 그래디언트 발생 방법은 센서를 가로질러 유속(유속 채널은 보통 50 마이크로미터의 높이 이상의 높이를 갖는다)을 교란시켜서는 안 되고, 자기장과 자기장 그래디언트의 크기와 배향을 시간에 맞게 간단히 제어하는 것을 가능하게 해야 한다.

본 발명은 일 양상에 있어 제 1 비드에 자기력을 가하는, 즉 유체 내에 제 2 자기 비드에 의해 제 1 비드에 역동적으로 근접하는 새로운 방법을 제안한다. 제 2 비드의 자기 모멘트는 국부적으로 제 1 비드에서 큰 자기장 그래디언트를 발생시킨다. 이는 제 1 비드와 제 2 비드 사이의 강한 자기 상호 작용으로 해석된다. 한편, 더 큰 자기 모멘트 때문에, 제 2 비드는 비교적 작은 자기장으로 자기에 의해 액츄에이션되거나, 또는 서로 다른 방법에 의해 액츄에이션된다.

입자의 자기 모멘트는 비드와 그에 따른 스트린전시 사이의 힘을 결정하는 것이다. 포획 분자와 표적 분자 사이의 증가하는 결합 강도를 갖는 표지된 포획 분자를 단계적으로 제거하기 위해, 본 발명의 방법은 증가하는 자기 모멘트를 갖는 제 3 자기 입자 중 적어도 하나의 타입을 갖는 연속 세척 단계로 수행될 수 있고, 이러한 모멘트는 제 2 자기 비드의 모멘트보다 더 크다. 이러한 단계적인 세척은 또한 포획 분자와 표적 분사 사이의 결합 강도를 더 좁은 범위 내에서 측정할 수 있게 한다. 증가하는 결합 강도를 단계적으로 제거하는 다른 방법은 자기 모멘트가 가해진 자기장과 함께 증가하는 비드를 사용하면서 더 큰 외부 자기장을 연속적으로 가하는 것이다.

위의 실시예에 따라, 제 2 비드를 재사용하는 것이 가능하다. 이러한 제 2 비드는 제 1 비드에 접근하고, 이어서 약하게 결합된 제 1 비드를 제거하고, 이후 초기 접근 지점으로부터 멀리 이동하고, 후속적으로 그 밖의 표면에 결합된 제 1 비드를 제거하는데 재사용될 수 있다.

위의 실시예에 따라, 비특이적으로 결합되고 제 2 비드에 결합하여 제거된 이러한 생체 활성 분자에 연결된 제 1 비드를 재사용하는 것이 또한 가능하다.

위의 실시예에 따른 표적 검출은 몇 가지 방법으로 설계될 수 있다.

- 표적은 표적이 센서 표면에 결합하기 전에 표적을 작은 자기 비드와 결합하여 표지될 수 있다. 이러한 사전 표지(pre-labeling)는 일반적인 방식(예를 들어, 비드는 그 표면에서 일반적인 단백질 결합 화학을 갖는다)으로 또는 포획 분자(예를 들어, 자기 비드를 갖는 항체)에 대해 특이적 결합을 갖는 생체 활성 분자로 수행될 수 있다.

- 작은 자기 비드는 또한 일반적 또는 특이적 방식으로, 센서 표면에 결합된 후 표적에 부착될 수 있다.

- 분석은 결합 분석, 경쟁 분석, 치환 분석 등일 수 있다. 자기력을 다분자 복합체에 적용하는 것은 분자 분리의 가능성을 증가시킨다. 이는 치환 분석의 속도 를 증가시키는 것을 도와줄 수 있고, 이는 포획 분자의 높은 친화도와 낮은 분리 비율 때문에 매우 일반적으로 느리다.

제 1 실시예의 예

자기 비드 사이의 힘을 결정.

비드의 몇 가지 조합이 가능하다. 비드의 크기(더 작을수록 좋음)와 자기 특성(자기 모멘트, 자기 이완) 사이에 균형이 잘 맞출 필요가 있다. 이 예는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 두 쌍의 입자에 대한 서로 다른 매개변수에 대한 비교 연구를 제시한다.

다음에서 우리는 두 가지 상황을 고려할 것이다.

다음의 예에서, 제 1 비드와 제 2 비드는 크기가 다르고, 그에 따라 자기 모멘트가 다르다. 실제적인 이유로, 본 발명의 제 1 비드와 제 2 비드는 '작은' 비드와 '큰' 비드로 언급될 것이다.

예 A.

제 1(작은) 비드: 직경 100 nm, m=10^-16A.m², 초상자성

제 2(큰) 비드: 직경 1-㎛ m=10^-13A.m², 초상자성

예 B.

제 1(작은) 비드: 직경 35 nm, m=10^-18A.m², 초상자성

제 2(큰) 비드: 직경 100 nm, m=10^-15A.m², 고농도의 자기 물질

숫자로 나타낸 예에서, m은 비드의 포화 자기 모멘트를 나타낸다. 예들은 제 2 비드가 0.1 pN보다 더 큰 두 비드 사이의 힘을 발생시키는 제 1 비드에 큰 자기장 그래디언트를 발생시킬 수 있도록 선택되었다. 다음의 계산에 있어, 입자는 구에 가깝다.

큰 비드와 작은 비드 사이의 힘

제 1 비드와 제 2 비드 사이의 인력을 측정하기 위해, 두 개의 자기화 비드 사이의 힘은 자기 모멘트의 크기, 모멘트의 상대적 배향 및 비드의 상대적 위치에 의해 결정된다. 외부에 의해 가해진 자기장의 방향을 따라 비드간의 접근(극간의 접근)에 있어, 쌍극자-쌍극자 인력은 다음과 같이 주어진다.

식 (2)

여기서, m₁ 및 m₂는 각 비드의 모멘트이고, x는 중심간의 분리이다.

제 2 비드가 제 1 비드에 가할 수 있는 최대 자기력은 비드가 가장 근접하게 접촉하는 경우에 발생한다.

예 A에 있어, 인력은 접촉하는 경우(x=0.55 ㎛), 50 nm(x=0.6 ㎛)의 표면간의 분리에 대해 46 pN으로 계산된다.

예 B에 있어, 인력은 접촉하는 경우(x=67.5 nm), 10 nm(x=77.5 nm)와 29 pN의 표면간의 거리에 대해 17 pN으로 계산된다.

따라서, 이러한 실시예에 따른 방법은 10 피코 뉴톤 정도의 발단력을 갖는 더 강한 생체 활성 분자 상호 작용과 더 약한 생체 활성 분자 상호 작용을 구별하는 가능성을 제공한다.

큰 비드의 속도

큰 자기 모멘트 때문에, 제 2 비드는 외부에 의해 가해진 자기장 그래디언트에 의해 유체 내에서 조작될 수 있다. 제 2 입자(큰 비드)에 대한 조작 속도는 점성 배지에서 구형 입자의 내유성에 대한 식을 사용하여 측정될 수 있다.

F = 6 πη rv 식 (3)

여기서, η는 유체의 점성, r은 입자의 반경, v는 비드로부터 멀어지는 둘러싸는 유체에 대한 입자 속도를 나타낸다.

10³ T/m의 그래디언트를 갖고, 예 A의 제 2 비드는 100 pN [식 (2)]와 10 mm/s [식 (3)]의 속도를 경험한다. 동일한 그래디언트에서, 예 B의 제 2 비드는 1 pN의 힘과 1 mm/s의 속도를 갖는다. 이는 100 nm 내지 1 ㎛ 범위 내의 제 2 비드가 자기장이 가해질 때, 센서 표면을 향해 그리고 센서 표면으로부터 멀리 신속하게(mm/s) 이동될 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 크기와 자기 모멘트의 이러한 범위는 본 발명의 방법에서 더 약한 결합과 더 강한 결합, 예를 들어 특이적 결합과 비특이적 결합을 구별하기에 충분한 힘을 얻는데 이용될 수 있다(또한 실시예 2 및 3 참조).

반복 스트린전시

모두 용액에 존재하는 경우, 제 1 및 제 2 비드는 용액에서 서로 거의 영향을 주지 않는다는 것을 알 수 있다.

(ⅰ) 두 가지 주어진 상황에서, 제 1 비드와 제 2 비드의 자기 모멘트의 비는 10 이상, 예를 들어 10³이다. 그 결과, 각각의 분리된 비드와 그 속도에 대한 자기력은 또한 크기의 정도만큼 다르다. 이는 제 2 비드가, 용액에 있는 제 1 비드가 거의 액츄에이션되지 않는 동안, 센서를 향해 그리고 센서로부터 멀리 자기에 의해 이동될 수 있다는 것을 의미한다.

(ⅱ) 제 1 비드는 제 2 비드가 매우 근접하게 접근할 때만 입자간의 상당한 힘을 느낀다[힘은 식 (2)에서 x^-4만큼 감소]. 이러한 근접한 접근은 제 1 비드가 고정되는 표면에서 쉽게 성취되지만, 두 비드가 모두 용액에 있을 때는 매우 낮은 가능성을 갖는다.

그 결과, 두 비드의 스트린전시 절차는 느슨하게 결합된 제 1 비드를 표면으로부터 규칙적으로 제거하면서 반복될 수 있다. 이후, 센서 위상은 분석의 종결점에서 폴링(polling)되기보다는 규칙적으로 모니터링(monitoring)될 수 있다. 그 결과 얻어진 센서에 대한 역학 및 동역학 기록은 생물학적 측정의 향상된 신뢰도, 정확성 및 속도의 장점을 제공한다.

큰 비드의 측면 조작

현재까지, 제 2 비드가 표면과 필수적으로 수직인 곡선(trajectory)을 갖는 센서 표면을 향해 그리고 센서 표면에서 멀리 이동된다는 것이 가정되었다. 제 2 비드가 약하게 결합된 제 1 비드를 잡는 효율은 또한 센서 표면을 따라 제 2 비드의 측면 이동을 발생시켜 증가될 수 있다. 측면 이동은, 예를 들어 유체의 전단 흐름, 음파 여기, 또는 자기 액츄에이션과 같은 임의의 적합한 수단에 의해 발생될 수 있다. 이러한 임의의 수단은 칩에서 발생된 그래디언트를 통해서 뿐만 아니라 외부 자기장 그래디언트로 인해, 예를 들어 온칩(on-chip) 전류 와이어를 통해 전류를 통과시켜 생성될 수 있다. 온칩 전류 와이어는 그래디언트가, 에너지 소비가 거의 없이 결합 표면에 매우 근접하게 발생되는 장점을 갖는다. 온칩 전류 와이어 둘레에 발생된 자기장 그래디언트는 다음과 같다.

식 (4)

여기서, I는 와이어를 통하는 전류이고, r은 와이어로부터의 거리이다. 예로써, 10 ㎛ 거리에 있는 10 mA의 전류는 20 T/m의 자기장 그래디언트를 발생시킨다. 비드가 외부에 의해 가해진 균일한 자기장에 의해, 자기에 의해 포화되고, 추가적인 비균일 자기장이 온칩의 전류 와이어에 의해 발생된다고 가정하자. 20 T/m의 그래디언트는 예 A의 큰 비드에 대해 0.2 mm/s의 속도를 제공하고, 상황 B의 제 2 비드에 대해 21 ㎛/s의 속도를 제공한다. 센서가 10 ㎛의 폭을 갖는 경우, 제 2 비드는 초당 다수 또는 수회 센서를 가로질러 이동될 수 있다. 이러한 측면 이동은 센서 표면을 제 2 비드에 노출을 증가시킬 수 있고, 약하게 결합된 제 1 비드를 잡을 가능성을 증가시킬 수 있다.

큰 비드의 집합체

이러한 두 개의 비드의 스트린전시 실시예는 두 가지 이유로, 자기 집합체에 비교적 민감하지 않다.

(ⅰ)제 1, 예를 들어 더 낮은 자기 모멘트를 갖는 작은 비드는 자기장에서 집합체를 형성하는 경향이 거의 없다.

(ⅱ)고정된 제 1 비드에 대한 스트린전시 힘은 단일의 가장 근접한 제 2 비드에 의해 결정된다[cf, 식 (2)에서 x^-4]. 비드로부터 더 멀어진 힘은 무시해도 좋고, 따라서, 제 2 비드의 잠재적인 클러스터링은 제 1 비드에 가해지는 힘을 변화시키지 않는다.

그러나, 제 2 비드(더 높은 자기 모멘트를 갖는)의 매우 큰 집합체는 집합체가 센서 표면에 감소된 접근성을 가질 수 있기 때문에 회피되는 것이 바람직하다. 집합체는, 얼마의 시간 동안 자기장을 스위칭 오프하여, 매우 낮은 잔여 모멘트를 갖는 비드를 사용하여(예를 들어, 빠른 자기 이완, 작은 자기 영역, 초상자성 때문에), 반접착(anti-stick) 코팅을 사용하여, 유체 전단 응력에 의해, 제 2 비드를 적당 농도 사용하여, 그리고 자기장의 배향을 변화시켜(예를 들어, 자기장의 크기와 방향을 변화시켜 사용) 감소될 수 있다.

검출이 표적 분자 또는 제 1 비드에서 수행된다는 것을 주목하라. 민감한 검출 영역에 존재할 수 있는 제 2 비드로부터의 잘못된 신호를 피하기 위해, 제 2 비드는 측정 동안 신호 제공(signal contribution)을 발생시키지 않는 것이 바람직하다. 예를 들어, 검출은 형광 표지를 갖는 제 1 비드를 통해 행해지는 반면, 이러한 표지는 제 2 비드에 존재하지 않는다.

예 2

본 발명의 바람직한 실시예에 따른 스트린전시 절차는 도 5를 참조하여 설명될 것이다. 도 5의 디바이스는 마이크로유체 디바이스로 수행될 수 있다.

1. 더 낮은 자기 모멘트와 선택적으로 더 작은 크기를 갖는 제 1 비드(1)는 표적 분자에 부착되고 소스(11)에 제공된다. 밸브(1)와 펌프(13)의 제어 하에, 이들은 포획 지점, 즉 기판(16)의 센서 표면에 결합된 포획 분자를 갖는 기판(16)이 있는 측정 챔버(15)에 주입된다. 표면을 향한 비드의 운반은 유속, 교반, 또는 자기장 그래디언트의 인가에 의해 향상될 수 있다.

2. 표적 분자에 부착된 제 1 비드(1)는 포획 분자에의 결합에 의해 센서 표면에 고정된다. 이러한 실시예의 변형은 생체 활성 분자 사이의 상호 작용의 다른 강도를 갖는 바이오칩(16)상의 다른 포획 지점의 제공이다. 따라서, 약한 생체 활성 분자 상호 작용을 갖는 포획 지점에 대해 다소 더 낮은 자기 모멘트를 갖는 제 1 비드(1)와, 강한 상호 작용을 갖는 포획 지점에 대해 다소 더 높은 자기 모멘트를 갖는 제 1 비드(1)를 선택하는 것이 유리할 수 있다.

3. 더 큰 자기 모멘트를 갖는 제 2 비드(2)는 밸브(2)와 펌프(13)의 작동에 의해 소스(10)로부터 공급된다. 제 2 비드는 선택적으로 제 1 비드(1) 보다 더 큰 크기를 가질 수 있다. 제 2 비드(2)는 제 1 비드(1)가 고정된 센서 표면을 향해 이동된다. 이러한 이동은, 예를 들어 하나 이상의 영구 자석 또는 전자석과 같은 자기장 발생기(14)에 의해 발생된 자기력에 의해 유발될 수 있다. 액체의 흐름은 또 한 밸브(3)와 펌프(13)의 작동에 의해 소스(12)로부터 제공될 수 있다. 제 2 비드(2)의 곡선의 최적의 제어에 있어, 센서 표면 위의 유속뿐만 아니라 자기력이 또한 고려되고 동기화되어야 한다.

4. 제 2 비드(2)가 제 1 비드(1)에 접근할 때, 제 1 비드(1)는 제 2 비드(2)를 향해 끌어당기는 자기력을 경험한다. 센서 표면으로부터 분리된 약하게 결합된 제 1 비드(1)는 제 2 비드(2)를 향해 끌어당겨지고 제 2 비드에 자기에 의해 부착된다. 센서 표면에 강하게 결합된 제 1 비드(1)는 센서 표면에 머무른다.

5.제 1 비드-제 2 비드의 복합체는 자기 인력 때문에 형성되지만, 이러한 두 비드의 복합체가 즉시 센서 표면으로부터 멀어지지는 않는 것이 가능하다. 이러한 경우, 추가적인 여기가 표면, 예를 들어 형성된 복합체를 표면으로부터 끌어당기는 자기장 그래디언트, 센서 표면을 따라 전단력을 발생시키는 전단 흐름, 초음파 여기 등으로부터 복합체를 제거하도록 가해질 수 있다. 이러한 여기는 제 1 비드가 표면에 약하게 결합된 복합체를 제거한다.

6. 제 2 비드(2) - 제 1 비드(1)가 부착되거나 부착되지 않은 - 는 센서 표면으로부터, 예를 들어 소스(12)에서 유체를 사용한 세척에 의해 출구(19)로 제거된다. 그 결과, 초기에 센서 표면에 약하게 결합된 제 1 비드(1)는 현재 센서로부터 제거된다.

7. 현재 포획 분자에 부착을 유지하는 제 1 자기 비드(1)는 임의의 적합한 기술, 예를 들어 센서 회로(18)를 사용한 기판(16)의 아래에 위치한 자기 센서(17)에 의해 센싱될 수 있다. 제 1 비드(1)가 광학 활성 물질, 예를 들어 염료 또는 형 광 물질로 표지된다면, 제 1 비드(1)의 존재는 광학적으로 검출될 수 있다. 비드가 방사성 물질을 함유한다면, 이들은 방사성 방출에 의해 검출될 수 있다.

위의 시퀀스는 제 2 비드(2)의 동일한 세트로 여러 번 반복될 수 있다. 이러한 방법은 웰 플레이트(well plate)(예를 들어, 마이크로타이터 플레이트) 또는 마이크로유체 카트리지 중 하나에 적용될 수 있다. 웰 플레이트는 자동화된 고처리량 용도에 매우 적합하고, 카트리지는 센서 둘레에 매우 높은 정도의 기능 통합과 유체 소형화를 가능하게 한다.

제 2 실시예

도 2에 개략적으로 도시된 본 발명의 제 2 실시예에 따라, 생체 활성 분자에 각각 결합된 두 비드(1,2)가 사용된다. 비드(1,2)는 선택적으로 동일한 자기 모멘트를 갖는다. 한 가지 실험적인 배열에서, 두 비드(1,2)는 각각 표적(T) 분자와 포획 (C) 분자에 결합될 수 있다. 대안적인 배열에서, 두 비드(1,2)는 포획 분자(C)의 서로 다른 부분에 결합하는 두 개의 서로 다른 표적 분자(T1,T2)에 결합된다(도 3 참조). 예를 들어, 두 개의 서로 다른 표적 분자(T1,T2)는 포획 분자인 동일한 항원의 서로 다른 에피토프(epitope)를 향한 단일클론성 또는 복합클론성 중 하나인 항체일 수 있다.

두 배열 모두에서, 표면에 코팅되거나 용액에 존재하는 포획 분자(C)는 각각의 결합 장소 또는 에피토프에 결합될 하나 또는 두 비드 모두와 결합된 표적 분자(T1,T2)와 접촉하도록 유도된다. 그러나, 비드(1,2)의 다른 조합이 또한 비특이적 결합 때문에 생성될 수 있다. 자기 벡터(magnetic vector)의 방향을 신속히 변화시 키는, 자기장(M)의 응용은 예를 들어, 일시적인 자기장이 두 비드와 결합하는 축에 수직인지 평행인지에 따라, 두 비드(1,2) 사이의 자기 반발력 또는 인력을 발생시킬 것이다. 두 비드(1,2) 사이의 자기 모멘트의 크기와 다양한 자기장(M)의 크기는 하나 또는 두 표적 분자(T1,T2) 모두가 특이적으로 결합하지 않은 경우, 인력과 반발력이 분자(T1,T2)의 제거, 즉 비드-비드 상호 작용이 파괴되는 것을 유발하도록 선택된다. 두 비드(1,2)의 자기 모멘트의 크기와 다양한 자기장(M)의 크기는 또한 하나 이상의 표적 분자(T1,T2)가 특이적으로, 예를 들어 각각의 에피토프에 특이적으로 결합된 두 개의 복합클론성 또는 단일클론성 항체인 경우, 이들은 제거되지 않도록 또한 선택된다. 근접한 두 개의 비드(1,2) 모두의 존재는, 예를 들어 광학적으로 검출될 수 있다. 근접한 두 개의 비드의 조합이, 두 선택 결합, 예를 들어 두 항체 결합에 더하여 다양한 자기장의 응용에 의한 스트린전시의 제어가 존재한다면 발생할 수 있다는 사실 때문에, 근접하게 결합된 비드(1,2)의 존재는 포획 분자(C)의 존재의 확실한 암시이다. 특히, 복합클론성 항체가 사용되는 경우, 비특이적 결합 또는 다른 에피토프에의 교차 반응성은 증가되고 다양한 자기장의 응용과 그에 따른 결합에 대한 힘은, 바람직한 결합만큼 특이적이 아닌 결합을 제거하는데 사용될 수 있다. 따라서, 표적 분자(T1,T2)로서 두 개의 결합된 항체를 사용하는 경우, 항원{포획 분자(C)}의 특이적 검출은 정제된 단일클론성 항체에 대한 필요성 없이, 즉 높은 수준의 특이성에 대한 필요성 없이 얻어질 수 있다.

자기장은 인력, 즉 두 비드(1,2)를 서로 미는 힘, 또는 반발력, 즉 두 비드(1,2)를 서로 끌어당기는 힘을 유발할 수 있다. 두 비드(1,2) 모두가 표적 및 포획 분자(T1,T2,C)를 통해 함께 결합되는 경우, 이들은 매우 근접하고, 두 비드의 축에 수직인 자기장이 발생되는 경우, 비드(1,2)는 서로 반발한다. 자기 비드(1,2)가 자기장에 일렬로 배열되고 일반적으로 처음부터 유체에 무작위 배향을 갖기 때문에, 자기장은 반발력을 얻도록 일정하게 변화되어야 한다. 자기 벡터의 방향을 변화시키는 것은, 빠르게 회전하는 자기장을 발생시키거나 3차원에서 무작위로 또는 의사-무작위적으로(pseudo-randomly) 이동하는 자기장을 발생시키기 위해, 회전하는 자기장에 의해, 예를 들어 코일에서 AC 전류의 상과 크기를 제어하기 위한 전류 제어기를 서로 직각인 세 개의 코일에 제공하여 수행될 수 있다. 이러한 자기장은 두 비드(1,2) 모두에서 자기 모멘트의 배향을 발생시키기에 충분한, 바람직하게는 비드에서 자기 모멘트를 포화시킬만큼 커야 한다. 필요한 자기장(M)은 입자(초상자성, 철자기, 구 형태 또는 비구 형태의 비드)의 타입에 의존한다. 두 자기 비드(1,2) 사이의 쌍극자 상호 작용의 포텐셜 에너지(potential energy)(U)는 다음과 같다.

식 (5)

여기서,

은 두 비드 코어 사이의 거리가 각각 r=거리인 각 비드의 자기 모멘트를 나타낸다.

비드간의 힘(F)은 에너지의 그래디언트에 의해 주어진다.

F = - △U 식 (6)

자기력은 비드 모멘트(외부에 의해 인가된 자기장에 의해 영향을 받은)와 비 드간의 축의 상대적 배향에 의존한다. 비드 모멘트가 서로 일렬을 이루고 비드간의 축에 수직으로 배향되는 경우, 다음과 같은 크기의 상호 간의 반발력이 존재한다.

식 (7)

비드 모멘트가 서로 일렬을 이루고 두 비드 모두 비드간의 축에 평행으로 배향되는 경우, 이어서 다음과 같은 크기의 상호 간의 인력이 존재한다.

식 (8)

위의 실시예는 조직으로부터 포획 분자의 제거를 필요로 하는 분석에 사용될 수 있다. 한 가지 예는 입으로부터의 단백질 제거이다. 제 1 자기 비드로 표지된 표적 분자(T1)는 입으로 주입되고 구강에서 단백질과 합성되도록 허용된다. 이러한 복합체는 이어서 모든 비드를 제거하기 위해 자석을 사용하여 입으로부터 제거된다. 이어서 표적 분자(T2)로 표지된 제 2 자기 비드는 회수된 제 1 비드에 첨가되고, 두 비드 사이의 복합체 형성이 가능해진다. 이어서 강하게 결합되지 않은 제 1 비드-제 2 비드 복합체를 파괴하기 위해, 빠르게 회전하는 자기장이 가해진다. 두 비드의 잔여 복합체는 특이적 결합을 갖는다. 제 1 및 제 2 잔여 비드 복합체의 존재는 이어서 임의의 적합한 수단, 예를 들어 광학적으로 결정될 수 있다.

제 3 실시예

본 발명의 제 3 실시예에 따라, 두 비드(1,2)가 사용되는데, 그 중 하나만이 자기 모멘트를 갖는다 - 도 4 참조. 두 생체 활성 분자(C,T) 사이의 비특이적 결합은, 흐름(F)과, 자기장 그래디언트(MG)의 응용에 의해 다른 분자에 부착된 자기 비 드에 작용하는 (2) 반대 자기력에 분자를 배치하여, 하나의 분자{C 또는 T 중 하나, 그러나 도 4에는 포획 분자(C)로 도시}에 부착된 비자기 비드(2)에서 발생된 유체력(fluidic force)의 조합에 의해 파괴된다. 이러한 응용은 또한 마이크로 어레이와 같은 중실 기판에 포획 분자(C)를 부착할 필요 없이 용액에서 본 발명을 수행하도록 해준다.

비자기 비드는 상업적으로 이용 가능하다. 임의의 적합한 비자기 비드 물질, 예를 들어 고체 또는 반고체 물질이 사용될 수 있다. 예는 라텍스, 폴리스티렌, 교차 결합된 덱스트란, 메틸스티렌, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 디에틸아크릴아미드를 포함한다.

예를 들어, 0.5 ㎛의 반경을 갖는 비자기 비드(2)와 η= 1.10^-3 Pa.s의 점도를 갖는 물인 유체, 유속 v=약 1mm/s를 갖는 물 및 9.4 pN의 유체 마찰력을 갖는 유체가 비자기 비드(2)에 가해진다. m=1.10^-15 Am²이고 자기장 그래디언트(MG)가 dB/dz=1.10⁴ T/m이고 10pN의 자기력을 갖는 자기 비드(1)가 자기 비드(1)에 가해진다(자기 비드는 매우 작고 유속에 의해 영향을 받지 않는다). 따라서, 비드(1)의 자기 모멘트를 조작하여, 자기 및 비자기 비드(1,2)의 크기와 액체의 흐름, 상황은, 반작용하는 유체력과 자기력이 균형을 이루도록 형성될 수 있다. 생체 활성 분자(T,C) 사이의 결합이 강할 때(예를 들어, 특이적), 복합체는 액체 흐름에서 동일한 위치로 유지될 것이다. 약한(예를 들어, 비특이적) 결합의 경우, 결합은 반대 힘에 의해 유도되는 장력(tension)에 의해 파괴될 것이고, 생체 활성 분자(C,T)는 자기장을 따라 이동하거나 액체에 부유하여 함께 흐를 것이다.

이 분석은 또한 생물 세포, 바이러스 또는 다른 생물 조직, 예를 들어 리포솜 또는 소낭으로 수행될 수 있다. 이러한 조직은 압축 또는 인장 응력(tensile stress) 하에 놓여진 생물 복합체의 일부일 수 있거나, 또는 이러한 조직 자체는 제 2 비드로 작용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 양상에 따라, 비드를 사용하지만 생물 조직을 포함하는 임의의 적합한 입자로 만들어질 수 있는 비드를 사용할 필요는 없다.

액체 흐름에서, 결합된 포획 및 표적 분자(C,T)의 복합체의 정확한 위치는, 예를 들어 광학적으로 결정되거나 측정될 수 있다. 한 가지 예는 장치의 특정 위치에서 비드의 존재의 광학 검출을 가능하게 하는 자기 및/또는 비자기 비드에서 발색단을 사용하는 것이다. 흐름 및/또는 자기장은 유속에서 고정된 위치로 복합체를 고정하도록 또는 특정 방향으로 특정 속도로 복합체를 이동시키도록 적응될 수 있다. 이러한 실시예를 갖고, 특이적 결합을 갖는 포획-표적 분자 복합체를 정제하고/하거나 농도를 진하게 하는 것이 가능하다.

대안적으로, 이러한 시스템은 자기 및 비자기 비드(1,2)에 결합된 포획 및 표적 분자(C,T)를 포함하는 샘플을 분류하는데 사용될 수 있다. 선택된 크기 때문에, 큰 비자기 비드는 더 작은 자기 비드(1)보다 더 큰 유체력을 만나게 될 것이다. 샘플을 결합된 표적 및 포획 분자(C,T)와 접촉시킨 후, 결합된 표적 분자와 결합되지 않은 표적 분자를 끌어당기는 자기장 그래디언트가 가해지는 반면, 다른 분자는 제자리에 남아 있고 제거될 수 있다. 증가하는 반대 유체력이 이후 가해질 때 , 우선 비특이적 포획-표적 결합이 파괴될 것이고, 포획 분자는 흐름으로 인해 제거될 것이고, 두 번째로, 결합되지 않은 표적 분자가 자기장에 의해 끌어당겨지도록 유지될 것인 반면, 특이적으로 결합된 복합체는 흐름으로 인해 제거될 것이다.

이러한 실시예의 변형 형태에서, 각각 서로 다른 크기의 비자기 비드를 갖는 서로 다른 타입의 포획 분자가 사용된다. 흐름 비율 및/또는 자기장은 비자기 비드의 크기에 따라 표적-포획 분자를 분리하기 위해 조작된다.

상술된 결합 분자의 확인 및/또는 정제는 유속과 자기장이 발생될 수 있는 임의의 시스템에서 수행될 수 있다. 자기장은 외부에 의해 또는 내부에 의해(예를 들어, 코일 또는 자기 물질) 발생될 수 있다. 샘플의 부피는, 예를 들어 미국특허 US5,866,345에 기술된 메소스케일(mesoscale)의 흐름 시스템을 사용하여 검출 영역 부피를 1 nl의 마이크로리터 범위까지 축소될 수 있다.

제 3 실시예의 예

제 3 실시예의 예는 마이크로유체 디바이스로 수행될 수 있는 도 6을 참조하여 설명될 것이다. 자기 유체 역학 용기(hydromagnetic bottle)는 영역(28)에 제공된다. 소스(20)로부터의 유체는, 예를 들어 영역(27, 28, 29)을 통해 제어 가능한 펌프(21)에 의해 흘러서 30으로부터 출구로 빠져나가도록 유발된다. 영역(27,29)은 영역(28)에서 흐름 비율에 각각 비교되어 흐름을 증가하고 감소시키도록 성형된다. 자기장 그래디언트는 적합한 자기장 발생기(24), 예를 들어 하나 이상의 영구 자석 또는 전자석에 의해 영역(27-29)에 제공된다. 자기장은 도 6의 왼쪽을 향한 방향으로 자기 비드를 끌어당긴다. 소스(20)로부터 액체의 흐름은 도 6에서 오른쪽을 향 해 비드를 유도하는 경향이 있다. 제 1 자기 비드(1){보통 제 2 비자기 비드(2)보다 크기가 훨씬 더 큼}은 표적 분자로 표지 되고, 포획 분자로 폐지된 제 2 비자가 비드(2)와 접촉하게 된다. 그 결과는 생체 활성 분자 결합에 의해 함께 결합된 일부 비드(1,2)의 혼합물이다. 힘이 균형을 이룰 때, 적어도 하나의 생체 활성 분자를 통해 서로에 부착된 제 1 및 제 2 비드의 결합은, 예를 들어 이들이 적합한 검출 시스템, 예를 들어 광학 또는 자기 시스템에 의해 검출될 수 있는 영역(28)에서 고정되어 유지된다. 비드와 생체 활성 분자의 혼합물은 25에서, 예를 들어 영역(27)에서 주입된다. 초기에는, 소스(20)로부터 액체의 흐름은 낮을 수 있거나 액체는 고정될 수 있다. 자기장 그래디언트의 효과는 도 6의 왼쪽을 향해 제 1 자기 비드(1)를 끌어당기는 것일 것이다. 비드(1,2)가 너무 멀리 가는 것을 방지하기 위해, 광학 필터(23)가 제공될 수 있다. 펌프(21)는 이어서 유속을 서서히 증가시키도록 활성화된다. 초기에, 제 1 비드(1)에 결합되지 않은 비자기 비드(2)와 파편(debris)은 출구(30)를 통해 시스템 밖으로 씻겨나갈 것이다. 비드(1,2) 조합의 유속의 힘(fluid flow rate)이 충분히 높은 수준에 도달할 때, 이러한 조합은 오른쪽으로 이동할 것이다. 이들이 영역(29)에 들어갈 때, 유속은 감소되고, 자기장 그래디언트에 의해 발생된 힘은 비드가 출구(30)에 도달하는 것을 방지하는 것을 지배할 것이다. 유속이 약간 너무 낮으면, 자기장 그래디언트는 도 6의 왼쪽을 향해 비드 조합(1,2)의 일부를 움직이는 경향이 있을 것이다. 그러나, 영역(27)에 더 높은 유속이 존재할 때, 유체의 힘이 지배하고, 결합이 더 멀리 가는 것을 방지할 것이다. 그 결과는 비드(1,2)의 결합이 자기 유체 역학 용기(28)에 갇히게 될 것이다. 본 명세서에서, 비드(1) 및/또는 비드(2) 사이의 결합은 반대 자기와 유체력에 의해 유발된 응력 하에 배치될 것이다. 결합이 비특이적이라면, 결합은 파괴될 것이고, 제 1 자기 비드(1)는 필터(23)를 향해 이동할 것이고, 비자기 입자는 시스템으로부터 씻겨나갈 것이다. 이에 따라, 자기 유체 역학 용기(28)에 유지되는 비드 결합은 특이적 결합을 가질 것이다.

Claims (25)

1. 액체에서 미생물 구성 요소(microbiological entity) 사이의 서로 다른 강도의 결합을 구별하기 위해 자기장에서 자기를 띠는 제 1 및 제 2 입자 중 적어도 하나를 사용하는 방법으로서,

   - 상기 액체에서 이동하는 제 1 입자와, 제 1 미생물 구성 요소 사이에 복합체(complex)를 제공하고,

   - 상기 제 1 미생물 구성 요소와 제 2 미생물 구성 요소 사이의 결합을 위해 상기 액체 내 조건을 제공하고,

   - 상기 액체에서 이동하는 제 2 입자를 상기 복합체에 근접하게 이끌고,

   - 제 1 강도의 결합은 파괴하고 더 큰 강도의 제 2 결합은 파괴하지 않기 위해 상기 전기장을 인가하면서, 상기 제 1 미생물 구성 요소와 제 2 미생물 구성 요소 사이의 결합에 기계적 응력(mechanical stress)을 가하기 위해 상기 제 1 및/또는 제 2 입자에 작용하는 것을

   포함하는, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 강도의 결합을 구별하기 위해 자기장에서 자기를 띠는 입자 중 적어도 하나를 사용하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 결합 강도의 구별은 특이적(specific) 및 비특이적 (a-specific) 결합을 구별하기 위해 사용되는, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 결합 강도를 구별하기 위해 자기장에서 자기를 띠는 입자 중 적어도 하나를 사용하 는 방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 제 1 미생물 구성 요소는 표적 분자(target molecule)이고 상기 제 2 미생물 구성 요소는 포획 분자(capture molecule)인, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 결합 강도를 구별하기 위해 자기장에서 자기를 띠는 입자 중 적어도 하나를 사용하는 방법.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 입자 모두는 자기를 띠는 입자인, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 결합 강도를 구별하기 위해 자기장에서 자기를 띠는 입자 중 적어도 하나를 사용하는 방법.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 입자는 미생물 구성 요소와 결합되고 자기를 띠는 제 2 입자는 미생물 구성 요소와 결합되지 않는, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 결합 강도를 구별하기 위해 자기장에서 자기를 띠는 입자 중 적어도 하나를 사용하는 방법.
6. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 상기 제 2 입자는 미생물 구성 요소와 결합되는, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 결합 강도를 구별하기 위해 자기장에서 자기를 띠는 입자 중 적어도 하나를 사용하는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 제 1 입자는 표적 미생물 구성 요소와 결합되고 상기 제 2 입자는 포획 미생물의 구성 요소와 결합되는, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 결합 강도를 구별하기 위해 자기장에서 자기를 띠는 입자 중 적어도 하나를 사용하는 방법.
8. 제 6항에 있어서, 상기 제 1 입자는 제 1 표적 미생물 구성 요소에 결합되고 상기 제 2 입자는 제 2 표적 미생물 구성 요소와 결합되는, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 결합 강도를 구별하기 위해 자기장에서 자기를 띠는 입자 중 적어도 하나를 사용하는 방법.
9. 제 4항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기를 띠는 제 1 및/또는 제 2 입자는 상자성(paramagnetic)인, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 결합 강도를 구별하기 위해 자기장에서 자기를 띠는 입자 중 적어도 하나를 사용하는 방법.
10. 제 4항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 자기 입자는, 상기 제 2 자기 입자의 자기 모멘트(moment)보다 10배 더 작은 자기 모멘트를 갖는, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 결합 강도를 구별하기 위해 자기장에서 자기를 띠는 입자 중 적어도 하나를 사용하는 방법.
11. 제 4항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 자기 입자의 크기는 상기 제 2 자기 입자의 크기보다 더 작은, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 결합 강도를 구별하기 위해 자기장에서 자기를 띠는 입자 중 적어도 하나를 사용하는 방법.
12. 제 4항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 자기 입자는 1 nm 내지 1 ㎛, 더 바람직하게는 10 nm 내지 200 nm의 직경을 갖는, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 결합 강도를 구별하기 위해 자기장에서 자기를 띠는 입자 중 적어도 하나를 사용하는 방법.
13. 제 4항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 자기 입자는 적어도 100 nm이 직경을 갖는, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 결합 강도를 구별하기 위해 자기장에서 자기를 띠는 입자 중 적어도 하나를 사용하는 방법.
14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 또는 제 2 미생물 구성 요소는 어레이(array) 상의 포획 지점(capture spot)에 배열되는, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 결합 강도를 구별하기 위해 자기장에서 자기를 띠는 입자 중 적어도 하나를 사용하는 방법.
15. 제 1 항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 입자 중 하나만이 자기성(magnetic)이고, 다른 하나의 입자는 비자기성(non-magnetic)인, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 결합 강도를 구별하기 위해 자기장에서 자기를 띠는 입자 중 적어도 하나를 사용하는 방법.
16. 제 15항에 있어서, 상기 비자기(non-magnetic)성 입자는 상기 자기 입자보다 더 큰, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 결합 강도를 구별하기 위해 자기장에서 자기를 띠는 입자 중 적어도 하나를 사용하는 방법.
17. 제 1 항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 유체 마찰력(fluid frictional force)을 상기 제 1 또는 제 2 미생물 구성 요소에 가하는 단계를 더 포함하는, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 결합 강도를 구별하기 위해 자기장에서 자기를 띠는 입자 중 적어도 하나를 사용하는 방법.
18. 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 강도의 결합을 구별하기 위한 도구(tool)로서,

    - 적어도 하나가 자기를 띠는 제 1 입자 및 제 2 입자와,

    - 상기 제 1 미생물 구성 요소와 상기 제 2 미생물 구성 요소 사이의 결합에 기계적 응력을 가하고 서로 다른 강도의 결합을 구별하기 위해 상기 제 1 및 제 2 입자에 작용하는 수단과, 적어도 자기장 발생기(generator)를 포함하는 기계적 응력을 가하는 수단을

    포함하는, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 강도의 결합을 구별하는 도구.
19. 제 18항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 입자 모두는 자기성(magnetic)이거나, 상기 제 1 입자는 자기성(magnetic)이고, 상기 제 2 입자는 비자기성(non-magnetic)인, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 강도의 결합을 구별하는 도구.
20. 제 18항 또는 제 19항에 있어서, 제 1 및/또는 제 2 입자는 미생물의 구성 요소에 결합되는, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 강도의 결합을 구별하는 도구.
21. 제 18항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물 구성 요소는 단백질 또는 펩티드(peptide)와 같은 생체 활성 분자(bioactive molecule)인, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 강도의 결합을 구별하는 도구.
22. 제 18항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 기계적 응력을 가하기 위한 상기 수단은, 유체 마찰력을 상기 제 1 또는 제 2 입자에 가하기 위한 수단을 포함하는, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 강도의 결합을 구별하는 도구.
23. 제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 기판의 포획 지점에 배열된 미생물 구성 요소의 어레이를 더 포함하는, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 강도의 결합을 구별하는 도구.
24. 제 18항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어레이에 대해 상기 입자의 측면 이동을 일으키는 여기(excitation)를 발생시키기 위한 수단을 더 포함하는, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 강도의 결합을 구별하는 도구.
25. 제 18항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 특이적으로 결합된 생체 활성 분자의 확인(identification), 분리(isolation), 정제(purification)를 위한, 미생물 구성 요소 사이의 서로 다른 강도의 결합을 구별하는 도구.

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