CN107356758B

CN107356758B - 一种肺癌检测试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN107356758B
Application number: CN201710743671.0A
Authority: CN
Inventors: 李红俊; 韩冀皖; 陆易仕·阿尔坚德·穆尔
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-08-25
Filing date: 2017-08-25
Publication date: 2019-11-22
Anticipated expiration: 2037-08-25
Also published as: CN107356758A

Abstract

本发明涉及生物医疗领域，具体而言，涉及一种肺癌检测试剂盒及其使用方法。所述试剂盒包括：固相载体及第二磁性纳米颗粒溶液，所述固相载体固定包被有第一磁性纳米颗粒；所述第一磁性纳米颗粒包被有GM1捕获剂，所述第二磁性纳米颗粒包被有GM1检测剂；其中，所述GM1捕获剂和GM1检测剂为结合GM1的配对抗体；或所述GM1捕获剂为GM1抗体，所述GM1检测剂为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的GM‑TAG蛋白；或所述GM1捕获剂为所述的GM‑TAG蛋白，所述GM1检测剂为GM1抗体。本发明所提供的检测工具适合大规模制造，使用方便，适合广泛普及；有早期发现肺癌的能力，且诊查可靠性强。

Description

一种肺癌检测试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及生物医疗领域，具体而言，涉及一种肺癌检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

肺癌(Lung cancer，LC)是世界上最主要的癌症，每年大约有130万人死于肺癌。全国肿瘤登记中心的陈万青等于2016年1月25日在CA Cancer J Clin杂志上发表了2015中国癌症统计数据。据报告，中国2015年有429.2万例癌症新发病例，281.4万例癌症死亡。肺癌成为最常见的癌症，也是癌症死亡的首要原因。

由于多种环境变化，包括老龄化，与肺癌相关的健康威胁和死亡可能还会增加。根据细胞学和细胞起源，肺癌可以被划分为多个亚种类。主要类型包括非小细胞癌(NSCLC)和小细胞癌(SCLC)。

尽管放射学、外科、以及化学疗法获得了进步，过去30年肺癌的5年生存率基本没有变化，只有15％的病人在最初的诊断后生存5年或者5年以上。这些低的生存率主要是由于一些同时存在的病症妨碍了早期的诊断，限制了治疗干预的效果。

目前的低通量诊断方法包括痰涂片、胸部X光以及CT扫描。这些方法只有当病人有特殊症状，例如长期的咳嗽，吐痰，咳血，不适，疼痛或者减重，并前往医院看医生时才使用，因而这些方法并不适合对大量人群进行高通量筛查。另外，这些方法具有较高的假阳性，必须配合随后的侵入性手段，例如支气管镜或者组织活检，进行确诊。细胞学检测基于细胞形态，结构和解剖学，可以使用苏木精和曙红染色进行处理。该手段被广泛应用于医疗诊断，并被作为癌症筛查活检的黄金标准。苏木精给细胞核染色，然后用曙红Y的溶液复染色，曙红Y给细胞质组分染色，通常包括细胞内和细胞外蛋白质。该染色方法可以用于关键致癌蛋白的原位测定；例如上皮生长因子受体(EGFR)，细胞周期蛋白D或K-Kas。与这些针对抗癌蛋白的抗体相关的连接酶，如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)或荧光染料如荧光素可用于发现在活检中任何癌基因的量或细胞位置。类似地，使用肿瘤抑制物抗体，例如p53或视网膜母细胞瘤蛋白(pRB)，可用于发现弱的迹象或改变的细胞位置；这类方法都可以提示癌变的可能性在增加。虽然这类方法比较成熟，但是速度较慢，不能用于大规模高通量筛查。

许多方法希望能更有效地诊断肺癌。例如，针对可以编码蛋白的核酸，使用特定的引物或者探针来诊断肺癌，其数值被认为可以指示肺癌的状态(即磷脂酰肌醇-聚糖特异性磷脂酶D；GPLD1)。然而，这种使用蛋白作为肺癌诊断生物标志物的方法还没有商业化的先例。由于早期肺癌分散于肺的不同位置，任何使用血液进行检测的方法很难检测出早期的肺癌，因为血液通常反映的是整个循环***的状况。因此，需要研发一种低成本和有效的方法用于快速诊断，并且易于经常使用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肺癌检测试剂盒及其使用方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种肺癌检测试剂盒，所述试剂盒包括：

固相载体及第二磁性纳米颗粒溶液，所述固相载体固定包被有第一磁性纳米颗粒；

所述第一磁性纳米颗粒包被有GM1捕获剂，所述第二磁性纳米颗粒包被有GM1检测剂；

其中，所述GM1捕获剂和GM1检测剂为结合GM1的配对抗体；

或所述GM1捕获剂为GM1抗体，所述GM1检测剂为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的GM-TAG蛋白；

或所述GM1捕获剂为所述的GM-TAG蛋白，所述GM1检测剂为GM1抗体。

其中GM-TAG蛋白和抗体结合于所述GM1的不同抗原表位。

本发明提供的试剂盒用于快速方便地诊断肺癌。该试剂盒的使用效果具有简便、快速、灵敏、特异、稳定等优点。

基于申请人之前的科学研究，申请人使用痰(从底部呼吸道，特别是气管和支气管咳出的粘液)来进行诊断。这使得检测变得简单和容易。申请人之前的中英国际研究已经确认了一些化学生物标志物，这使得本发明提供的方法相对于其他方法可以更快更经济地诊断肺癌，同时病人也不会有不适感。基于这些生物标志物，申请人开发了用于诊断的工具。

在申请人之前的研究中，质谱仪平台可以很容易地从痰样中建立数据库，对这些数据的分析，可以发现临床相关的数据。使用主成分分析和高内涵分析方法，可以将健康的对照组从那些需要进行进一步肺癌检查的病人们区分出来。虽然随后并不是所有的这些病人都被确认为肺癌患者，那些疑似肺癌患者具有那些被医生认为与癌症相关的症状，应该被划分为“非健康”。为了进一步确认区分癌症与非癌症的生物标志物，需要更复杂的数据挖掘工具。ROC曲线是一个广泛使用的判断生物标志物作用的工具。ROC曲线显示真阳性与假阳性之间的关系，从而可以决定一个代谢物的使用效果。ROC曲线下的面积可以代表一个参数的分类性能：肺癌与非肺癌。通过使用ROCCET分析，申请人确定了一系列的LTQ-MS-代谢物，这些代谢物的AUC值大于0.8，这是一个确认该物质是否有用的临界值。这些代谢物在癌症痰样中浓度相对较高。

GM1(monosialoganglioside)是含一个唾液酸的神经节苷脂，亦称单唾液酸四已糖神经节苷脂，又称唾液酸糖鞘脂，分子量为1574。GM1主要用于神经组织研究，但是可以在大多数细胞类型中发现他们参与细胞-细胞识别，细胞-基质附着，细胞生长和细胞分化。申请人已经发现糖鞘脂在痰中的浓度增加是肺癌早期检测的一个关键生物标志物，准确率在80％以上。其他有类似的应用，例如与血蓝蛋白相融合在病人组织活检中检测小细胞癌。

糖鞘脂的一个重要特征是它会与某些细菌病原体产生的某些毒素内的基序结合，例如霍乱毒素的B亚基。这与霍乱的致病性相关联，但是GM1结合位点可以与B亚单位蛋白的其余部分分离，并且丧失致病作用。类似的还有全世界发病率和死亡率的重要因素的肠毒素性大肠杆菌(ETEC)。ETEC释放的主要毒力因子是热不稳定肠毒素LT，其在结构和功能上类似于霍乱毒素。LTB结合糖鞘脂，毒素的宿主受体，但与A型血糖和大肠杆菌脂多糖的相互作用也已经在过去十年中被确认了。

申请人经研究发现了能够与GM1高亲和性结合的蛋白GM-TAG，应当注意，该蛋白质在C-末端具有组氨酸标签(SEQ ID NO:1所示)，这意味着它的分离是经济的。

多组氨酸标记的重组蛋白可以在大肠杆菌中方便地表达。可通过离心获取细菌，并将所得细胞沉淀物裂解以释放细胞蛋白质。在含有钴离子的亲和树脂中培育后，将标记的蛋白质分离，多组氨酸标签以高亲和力与其结合。然后洗涤树脂以除去没有相互作用的蛋白质。然后可以如下所述进一步应用GM-TAG。

优选的，如上所述的肺癌检测试剂盒，所述第一磁性纳米颗粒和第二磁性纳米颗粒均为Fe₃O₄磁性纳米颗粒。

磁性纳米颗粒行成以磁性材料为中心，可包被生物高分子的核壳结构，不但具备良好的磁导向性，也具有良好的生物相融性，可与蛋白质结合，进行免疫反应。

优选的，如上所述的肺癌检测试剂盒，所述第一磁性纳米颗粒和第二磁性纳米颗粒的粒径为10～60nm；优选为15～40nm；更优选为18～25nm。

磁性纳米粒子的粒径对捕获剂或检测剂的偶联数量有着很大的影响，从而影响着最终反应的灵敏度。

优选的，如上所述的肺癌检测试剂盒，所述试剂盒还包括洗脱剂；

优选的，所述洗脱剂为PBS。

优选的，如上所述的肺癌检测试剂盒，所述试剂盒还包括样品稀释剂；

优选的，所述样品稀释剂为PBST。

本发明所述的PBST溶液为含5％Tween-20的PBS溶液。

优选的，如上所述的肺癌检测试剂盒，所述试剂盒还包括磁力计。

优选的，如上所述的肺癌检测试剂盒，所述固相载体为EP管或细胞培养板。

优选的，如上所述的肺癌检测试剂盒，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为已知浓度的GM1溶液。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种使用如上所述的肺癌检测试剂盒检测GM1蛋白的方法，包括：

1).将待检测样本滴加到固相载体中进行孵育；

2).洗脱多余的将待检测样本，加入第二磁性纳米颗粒溶液进行孵育；

3).洗脱多余的第二磁性纳米颗粒后，将固相载体，用磁力计检测磁力信号，并将所得信号值代入预先建立的磁力信号-GM1浓度标准曲线中计算得到所述待检测样本中GM1的含量。

优选的，如上所述的方法，所述待检测样本为痰或唾液。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、本发明所提供的检测工具适合大规模制造；

2)、本发明所提供的检测工具易于使用，可以作为日常筛查手段，可以大规模普及使用；

3)、本发明所提供的检测工具具有早期发现肺癌的能力；

4)、本发明所提供的检测工具具有超过80％以上的较高的诊查可靠性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为磁力信号-GM1浓度标准曲线示意图；

图2为实施例1的实施方式示意图；其中，GM1被简写为GM；

图3为实施例2的实施方式示意图；其中，GM1被简写为GM。

具体实施方式

本发明提供了一种基于GM-TAG的工具，这种工具使用纳米颗粒检测作为基于磁力计的平台的一部分。

该工具基于磁力计，该类平台可以有手持类型。当电流通过一个小线圈时，磁力计产生一个磁场。如果磁性颗粒被放入这个磁场，对磁场的影响与磁性颗粒的数量成比例。这种影响可以通过高度敏感的磁力计来感知并用于诊断。磁力计可以在几分钟之内给出结果，而通常使用的ELISA方法需要几个小时来给出结果。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本发明所提供的检测工具的使用方法如下：

1).将待检测样本稀释后滴加到固相载体中进行孵育；

2).PBS洗脱多余的将待检测样本，加入第二磁性纳米颗粒溶液进行孵育；

3).洗脱多余的第二磁性纳米颗粒后，将固相载体上的磁性颗粒洗脱，用磁力计检测磁力信号，并将所得信号值代入预先建立的磁力信号-GM1浓度标准曲线中计算得到所述待检测样本中GM1的含量。

磁力信号-GM1浓度标准曲线的建立方式与正常检测时一致，检测不同浓度的GM1标准品的磁力强度，并制作标准曲线(图1)。

磁性纳米颗粒与人体GM1抗体相关。当存在GM1时，这将会在捕获抗体和与GM1作用的检测抗体之间形成一个三明治区域。线圈中的电流变化与和抗体相关的磁性纳米颗粒数量相关。样本中GM1越多，就会有更多的纳米颗粒与磁场作用(图2)。当没有GM1时，可以观察到更低的背景干扰。关掉磁场，磁力计中所有的抗体都会被清除，从而可以测量下一个样本。可以安装第二个磁力线圈，来检测磁力信号，确认容器已经干净。

GM1的浓度可以指示肺癌风险的大小。

实施例2

在本实施例中，提供了针对实施例1进行改进的一种新型的试剂盒。固定包被在固相载体上的GM1捕获抗体被GM-TAG蛋白代替(图2)。GM-TAG与GM1分子的结合位置与“游离”的GM1检测抗体的不同。因此，对于GM1的检测位置不存在竞争。这将增强GM-TAG，GM1-GM1检测抗体三明治区域的敏感性。其他方面，这两个工具完全相同。

实施例3

在本实施例中，提供了针对实施例1进行改进的一种新型的试剂盒。“游离”的GM1检测抗体被GM-TAG蛋白代替。GM-TAG与GM1分子的结合位置与GM1捕获抗体的GM1检测抗体的不同。因此，对于GM1的捕获位置不存在竞争。这将增强GM-TAG，GM1-GM1捕获抗体三明治区域的敏感性。其他方面，这两个工具完全相同。

实验例

目前该技术已经分别使用英国和中国的样本进行了测试。其中英国样本共67人，其中包括33名健康对照样本。剩下34人中包括肺癌与非肺癌病人。使用我们的方法，对肺癌/非肺癌的诊断准确率整体达到了80％。中国样本共50人，其中包括15名健康对照样本。使用我们的方法，通过与确认的标志物进行对比，对肺癌/非肺癌的诊断准确率同样达到了80％的水平。值得注意的是，在这些样本中，对小细胞癌的诊断准确率达到了100％。

案例1：一位45岁的男性病人告诉医生说他严重咳嗽，气短以及发烧。医生发现他平均一天吸20支香烟，并且要求他提供痰样，使用该发明的方法进行检测。医生可以对该病人进行确诊。使用该技术，整个诊断周期小于24小时。

案例2：一位55岁的病人由于胸痛，咳嗽，吐痰以及吸烟史而住院。医生要求她提供了痰样，并使用我们的方法进行检测。该方法将病人痰样中的化合物与我们发现的标志物相对照。根据对比结果，该检测认为病人患有2期肺癌。医生随后通过其他方法，包括胸部X光透视等，确认该诊断结果并提供相应的治疗。

案例3：一位72岁男性，有吸烟史，由于未知原因的体重减少，持续的咳嗽，以及上楼梯时比较困难，前往社区医院检查。医生要求他提供了痰样。使用我们的方法进行检测，通过与标志物的对比，发现该病人肺癌阳性。根据该检测结果，社区医生将该病人送往专门医院进行进一步检查，确认了检查结果。

案例4：一位79岁女性，有吸烟史，由于持续的咳嗽，吐痰，以及气喘，咨询医生。社区医生要求她提供了痰样。该样本使用我们的方法与标志物进行对比。结果显示肺癌阴性。社区医生为了确保不误诊，将该病人送往专门的医院呼吸科，证明是其他呼吸***问题，并进行了相应的治疗。

案例5：一位84岁的病人，曾经被诊断为肺癌。由于有复发的症状，需要进行诊断。但是传统诊断手段对具有这些严重症状的病人可能造成的伤害及由此带来的发病率及死亡率，已经不能进行这些诊断。为了监控病情发展，该病人被要求提供痰样。使用我们的方法，我们可以快速提供准确的检测结果，供医生参考，并制定相应的治疗方法。

案例6：一位77岁的女性病人，有吸烟史，未知原因的体重减轻，气喘，以及无法长距离步行前往社区医院诊断。社区医生采集了痰样，并使用我们的方法进行检测，发现该病人肺癌阳性，因此将该病人提交专门医院进行针对性治疗。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 李红俊; 韩冀皖; 陆易仕·阿尔坚德·穆尔(Mur,Luis Alejandro Jose)

<120> 一种肺癌检测试剂盒及其使用方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Arg Gly Ser Met Ala Asn Ile Asn Asp Ser Lys Ile Leu Ser Leu

1 5 10 15

Gln Asn Arg Lys Asn Thr Leu Val Asp Thr Ser Gly Tyr Asn Ala Glu

20 25 30

Val Ser Glu Glu Gly Asp Val Gln Leu Asn Pro Ile Phe Pro Phe Asp

35 40 45

Phe Lys Leu Gly Ser Ser Gly Glu Asp Arg Gly Lys Val Ile Val Thr

50 55 60

Gln Asn Glu Asn Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Ser Phe Ser Ile

65 70 75 80

Ser Phe Trp Ile Arg Ile Asn Lys Trp Val Ser Asn Leu Pro Gly Tyr

85 90 95

Thr Ile Ile Asp Ser Val Lys Asn Asn Ser Gly Trp Ser Ile Gly Ile

100 105 110

Ile Ser Asn Phe Leu Val Phe Thr Leu Lys Gln Asn Glu Asp Ser Glu

115 120 125

Gln Ser Ile Asn Phe Ser Tyr Asp Ile Ser Asn Asn Ala Pro Gly Tyr

130 135 140

Asn Lys Trp Phe Phe Val Thr Val Thr Asn Asn Met Met Gly Asn Met

145 150 155 160

Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Ile Asp Thr Ile Lys Val Lys Glu

165 170 175

Leu Thr Gly Ile Asn Phe Ser Lys Thr Ile Thr Phe Glu Ile Asn Lys

180 185 190

Ile Pro Asp Thr Gly Leu Ile Thr Ser Asp Ser Asp Asn Ile Asn Met

195 200 205

Trp Ile Arg Asp Phe Tyr Ile Phe Ala Lys Glu Leu Asp Gly Lys Asp

210 215 220

Ile Asn Ile Leu Phe Asn Ser Leu Gln Tyr Thr Asn Val Val Lys Asp

225 230 235 240

Tyr Trp Gly Asn Asp Leu Arg Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr Met Val Asn

245 250 255

Ile Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Met Tyr Ala Asn Ser Arg Gln Ile Val

260 265 270

Phe Asn Thr Arg Arg Asn Asn Asn Asp Phe Asn Glu Gly Tyr Lys Ile

275 280 285

Ile Ile Lys Arg Ile Arg Gly Asn Thr Asn Asp Thr Arg Val Arg Gly

290 295 300

Gly Asp Ile Leu Tyr Phe Asp Met Thr Ile Asn Asn Lys Ala Tyr Asn

305 310 315 320

Leu Phe Met Lys Asn Glu Thr Met Tyr Ala Asp Asn His Ser Thr Glu

325 330 335

Asp Ile Tyr Ala Ile Gly Leu Arg Glu Gln Thr Lys Asp Ile Asn Asp

340 345 350

Asn Ile Ile Phe Gln Ile Gln Pro Met Asn Asn Thr Tyr Tyr Tyr Ala

355 360 365

Ser Gln Ile Phe Lys Ser Asn Phe Asn Gly Glu Asn Ile Ser Gly Ile

370 375 380

Cys Ser Ile Gly Thr Tyr Arg Phe Arg Leu Gly Gly Asp Trp Tyr Arg

385 390 395 400

His Asn Tyr Leu Val Pro Thr Val Lys Gln Gly Asn Tyr Ala Ser Leu

405 410 415

Leu Glu Ser Thr Ser Thr His Trp Gly Phe Val Pro Val Ser Glu Pro

420 425 430

Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys His His His His His

435 440 445

His

Claims

1.肺癌检测试剂盒在制备肺癌诊断剂的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：

其中，所述GM1捕获剂为GM1抗体，所述GM1检测剂为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的GM-TAG蛋白；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一磁性纳米颗粒和第二磁性纳米颗粒均为Fe₃O₄磁性纳米颗粒。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一磁性纳米颗粒和第二磁性纳米颗粒的粒径为10～60nm。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述第一磁性纳米颗粒和第二磁性纳米颗粒的粒径为15～40nm。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述第一磁性纳米颗粒和第二磁性纳米颗粒的粒径为18～25nm。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括洗脱剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述洗脱剂为PBS。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述样品稀释剂为PBST。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括磁力计。

11.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述固相载体为EP管或细胞培养板。

12.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为已知浓度的GM1溶液。