KR20060017585A

KR20060017585A - 암 치료용 펩타바디

Info

Publication number: KR20060017585A
Application number: KR1020057018924A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 디퍼스; 실바인 클라우티에; 진-피에르 마치; 닐스 홀러; 오마 팻타
Original assignee: 유니베르시떼 드 로잔느
Priority date: 2003-04-04
Filing date: 2004-04-05
Publication date: 2006-02-24
Also published as: US20060233808A1; NO20055209L; CA2521393A1; WO2004087766A2; JP2007527206A; CN1798770A; ATE514718T1; NO20055209D0; CN1798770B; EP1613661B1; MXPA05010575A; AU2004226162A1; EP1613661A2; WO2004087766A3; BRPI0409554A

Abstract

본 발명은 특정 암 세포의 증식을 억제하는데 유용한, 상피세포 성장인자 수용체(EGFR)의 구성원에 결합하는 분리된 재조합 융합 펩타바디(peptabody)에 관한 것이다. 또한, 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디를 코딩하는 핵산, 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디를 활성 성분으로 포함하는 키트 및 약학적 조성물이 개시되어 있다. 아울러, 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디의 제조방법과 암 예방 또는 치료용 약물의 제조를 위한 이의 용도가 제시되어 있다.

펩타바디, EGFR, 항암

Description

암 치료용 펩타바디{peptabody for cancer treatment}

본 발명은 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor)에 결합하는 다중체 분자(multimeric molecules)에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 수용체의 발현이 병원성 표현형과 관련된 질환을 치료하는데 사용될 수 있는, 상피세포 성장인자 수용체의 구성원에 결합하는 분리된 재조합 융합 펩타바디(isolated and recombinant fusion peptabody)에 관한 것이다. 상기 질환에는 전립선암, 방광암, 유방암, 두부 및 경부암(head and neck cancer), 흑색종(melanoma) 등이 있다. 또한, 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디를 코딩하는 핵산, 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디를 활성 성분으로 포함하는 키트 및 약학적 조성물이 개시되어 있다. 아울러, 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디의 제조방법과 암 예방 또는 치료용 약물의 제조를 위한 이의 용도가 제시되어 있다.

최근의 연구는 원인론적으로 성장인자 수용체 티로신 키나아제의 중요한 역할과 인간 암의 진행을 밝혀내었다. 이러한 생물학적 수용체는 이들을 발현하는 세포막 내에 트랜스멤브레인 도메인을 통하여 고정되어 있다. 세포외부 도메인 (extracellular domain)은 성장인자에 결합한다. 성장인자가 세포외부 도메인에 결합함으로써 세포 내부(intracellular) 키나아제 도메인에 신호가 전달된다. 이러한 신호가 세포의 증식과 분화에 역할을 담당하는 것이다.

상피세포 성장인자(EGF) 수용체 패밀리의 구성원들은 중요한 성장인자 수용체 티로신 카나아제이다. 성장인자 수용체의 EGF 수용체 패밀리의 첫번째 구성원으로 약 165 kD의 명확한 분자량을 가지는 당단백질이 발견되었다. 미국 특허 4,943,533 호에 Mendelsohn에 의하여 개시된 이 당단백질은 EGF 수용체로 알려져 있다. EGF 수용체에 EGF가 결합하거나 TGF-알파가 결합하면 세포 사멸로 이르게 된다.

성장인자 수용체의 EGF 수용체 패밀리의 또 다른 구성원은 HER2로도 알려진 erbB-2 또는 p185(Coussens et al., Science 230(1985), 1132-1139; Yamamoto et al., Nature 319(1986)., 230-234)가 있다. c-erbB-2 유전자에 의해 발현되는 수용체 ErbB-2는 인간 neu 암유전자(oncogene)에 의해 발현되는 단백질과 동일하다. ErbB-2 아미노산 서열은 EGF 수용체의 서열과 다르지만 상동성이 매우 높다. ErbB-2는 암 치료를 위한 효율적인 타겟으로 고려되고 있다. ErbB-2 에 대한 단일클론 항체인 Herceptin은 ErbB-2가 과발현된 전이 유방암에 대하여 좋은 결과를 보이며 임상에서 현재 사용되고 있다.

EGF 수용체 패밀리의 다른 구성원으로 erbB-3/HER-3(Kraus et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA 86 (1989), 9193-9197; Plowman et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87 (1990), 4905-4909) 및 erbB-4/HER-4가 있다.

많은 수용체 티로신 키나아제는 인간 암에서 특이하게 많은 수가 발견되고 있다. 예를 들어, 상피세포 유래의 많은 암들은 세포막에 EGF 수용체를 높은 수준으로 발현한다. EGFR은 성장, 증식 등을 통제하여 세포 수명에 중추적인 역할을 한다. 수용체의 활성화는 리간드 결합과 후속하는 수용체 이중체화(두 수용체의 연합)으로 일어난다. 정상적인 세포 기능과 생존을 유지하기 위해 EGFR이 필요하지만, EGFR의 발현은 암세포의 성장과 생존에도 뚜렷이 기여하는 것으로 나타난다. ErbB 신호화(signaling)의 조절 장애는 유전자 증폭 및 수용체 전사, 번역 또는 단백질 안정성을 증가시키는 ErbB 돌연변이를 포함하는 다양한 메커니즘에 의해 일어난다. EGF 수용체를 발현하는 암의 예들은 폐암, 유방암, 두부 및 경부암 및 방광암 뿐만 아니라 아교모세포종을 포함한다. EGF 수용체의 증폭 및/또는 암세포막에서의 과발현은 좋지 않은 예후와 관련되어 있다.

세포 외부 영역(extracellular region)에 특이적인 특정 단일클론 항체(MAbs), 티로신 키나아제(TK) 도메인(수용체 활성화에 필요)의 억제자 및 항 센스 치료법(anti-sense therapy)을 포함하는 다양한 접근 방법이 ErbB 패밀리 수용체를 타겟으로 하여 개발되고 있다.

종양 항원(tumor antigen)에 대해 유도된 항체, 특별히 단일클론 항체는 잠재적인 항암제로 분석되고 있다. 상기 항체는 여러 메커니즘을 통하여 종양의 성장을 억제할 수 있다. 예를 들어, 항체는 항체 의존적 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 통하여 면역학적으로 종양의 성장을 억제할 수 있다.

다르게는, 항체는 성장인자가 그 수용체에 결합하는 것과 경쟁함으로써 상기 수용체를 발현하는 종양의 성장을 억제할 수 있다. 또 다른 접근법에서는 독소(toxin)가 종양 항원에 대해 유도된 항체와 컨쥬게이션 된다. 항체 부분이 종양에 컨쥬게이트를 이끌면 독성 부분에 의하여 암세포가 죽게 된다.

항체 및 항체 단편들을 항암제로 사용하는 것은 기대할 만하지만 극복해야 하는 문제들도 있다. 예를 들어, 단일클론 항체는 하이브리도마에서 생성된다. 상업적 생산에 있어서의 하이브리도마는 박테리아 같은 다른 발현계에서의 상업적 생산보다 덜 효율적이다. 게다가, 단일클론 항체는, 보통 인간이 아닌 동물에서 생산되고 이러한 항체는 인간에게 면역원으로 작용할 수 있다. 이러한 면역원성은 상기 항체를 인간 치료에 이용하는데 있어서 유효성을 감소시킨다.

EGFR 경로의 억제를 위한 두 번째 접근법은 EGFR TK의 활성화를 억제하는 억제제의 사용이다. 억제제는 자가인산화의 감소를 초래하면서 TK 도메인에 결합하 기 위해 ATP와 경쟁한다. 억제제의 예로는 Astra Zeneca (Sweden)의 ZD1839, Novartis (Switzerland)의 PKI-166, Glaxo Smith Kline (UK)의 GSK572016 이 있다.

MAb와 TK 억제제 간 약물학적, 메카니즘적 차이가 있지만, 전임상 결과 두 방법 모두 세포 증식을 억제하고 일반 치료법과 병행하였을때 부가적 또는 상호상승적인 세포독성을 나타냄을 제시하였다.

안티센스 기술은 암 치료법에 있어서 흥미있고 기대할 만한 것으로 나타나고 있지만 임상 사용에 이르기 위해서는 추가적인 개발이 요구된다.

수년 전 "펩타바디"(Terskikh et al., 1997 "Peptabody: a new type of high avidity binding protein" Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94(5): 1663-8)라 명명된 기대할 만한 새로운 타입의 (avidity) 분자가 개발되었다. 이 펩타바디 분자는 또한 WO 9818943(Kajava et al.)에 2 단위 이상을 포함하는 올리고머로 개시되었는데, 여기서 각 단위는 수용자(리간드)에 결합할 수 있는 도메인과 올리고머화 할 수 있는 펩티드 도메인을 포함하고 상기 올리고머화 할 수 있는 도메인은 항체가 아니거나 항상 영역(constant region)으로부터 유래된 기능적 항체 단편이다. 또한, 상기 올리고머의 용도와 합성이 개시되어 있다. 다중체화 도메인(multimerization domain)은 인간 연골 올리고머 기질 폴리펩타이드(human cartilage oligomeric matrix polypeptide(COMP))의 일부로 구성되는데, 이것은 힌지 영역 또는 스페이서(인간 IgA로부터 유래된 19 개 아미노산)에 융합되어 있다. 이 펩타바디의 결합 도메인인 짧은 펩타이드 리간드는 힌지(hinge)의 C 말단 부분 에 위치해 있다. 이 5중체(pentamer) 분자는 효과적인 수용체 타겟팅에 있어서 단일클론 항체에 비하여 다음과 같은 두 가지 주된 이점을 가진다:

- 협력적 결합(cooperative binding)에 의하여 타겟 수용체에 대한 avidity가 크게 향상될 수 있다.

- 수용체의 상호연결(crosslinking)이 타겟 세포에 큰 생물학적 영향을 유도할 수 있다.

펩타바디 분자의 개념은 높은 수준의 타겟을 발현하는 세포에 강한 결합을 허용하나 타겟 분자의 저밀도는 펩타바디 결합에 우호적이지 않다.

모노머 폴리펩타이드 사슬은 길이가 짧기 때문에 올리고머는 화학적으로 합성될 수 있다. 펩타이드 리간드의 N 말단 위치는 첫번째 핵심 분자(예를 들어 5중체화 도메인 및 링커)를 합성하도록 하고 시료를 나누어 N 말단에서 다른 펩타이드 서열과 합성을 계속한다. 그러므로, 짧은 펩타이드의 올리고머화는 폴딩 문제를 을 회피하고 단사슬 Fv 단편과 같은 상대적으로 복잡한 단백질의 올리고머화 동안에 경험되었던 발현의 어려움을 극복하게 한다.

ErbB-2 수용체와 특이적으로 반응하는 5중체 펩타바디 분자를 합성하려는 시도가 최근에 보고되었다(Houimel et al., (1997) "Selection of peptides and synthesis of pentameric Peptabody molecules reacting specifically with ErbB-2 receptor Int . J. Cancer 2001; 92: 748-755). ErbB-2 세포 외부 도메인 단백질 (ECD)에 결합하는 헥사펩타이드는 파지 디스플레이 라이브러리에 의해서 선별되고 상기 기술된 5중체 펩타바디 분자를 구축하는데 사용되었다. 그러나, 펩타바디에 의한 세포사멸 유도의 증거가 발견되지 않았다. 증식 억제가 관찰된 것은 아마도 부분적인 애고니스트(agonist) 효과나 항 ErbB-2 MAb(Harwerth et al. "Monoclonal antibodies against the extracellular domain of ErbB-2 receptor function as partial ligand agonist" J. Biol . Chem . 1992; 267: 15160-7)를 위해 기재된 바와 같이 수용체 이중체화의 억제 때문으로 보인다. 상기 선별된 헥사펩타이드가 이의 리간드에 대한 친화도가 상대적으로 낮기 때문에 보다 긴 펩타이드 분자를 제조하는 것이 제안되었다. 그러나, 그 복잡함 때문에 이러한 타입의 재조합 융합 펩타바디 분자의 생산은 지금까지 보고되지 않았다.

최근의 연구는 상피세포 성장인자 수용체(EGF-R, erbB-1)를 과발현하는 암이 좋지 않은 임상 결과와 관련되어 있음을 나타낸다(Mendelsohn J (2002) "Targeting the epidermal growth factor receptor for cancer therapy J. Clin . Oncol. 20:1S-13S). 그러므로, 효과적이며 저렴하게 생산될 수 있고 인간에게 면역원성이 없거나 거의 없으며 상피세포 성장인자 수용체의 한 구성원, 특히 암세포에서 다수로 발현되는 ErbB-1에 대하여 높은 친화도로 결합하는 "펩타바디"와 같은 개선된 항암제에 대한 지속적인 요구가 있다. 본 발명의 목적은 상기 기법의 이점을 조합시킨 새로운 항암제를 제공하는 것이다.

본 발명의 여러 목적은 이미 기술한 것으로부터 명백하듯이 항암제로서 높은 잠재성을 가지는, 새로운 재조합 융합 폴리펩타이드를 생산함으로써 달성된다.

그 일 측면으로서, 본 발명의 목적은 특정 암 세포의 증식을 억제하는데 유용한, 상피세포 성장인자 수용체(EGFR)의 일 구성원에 결합하는, 분리된 재조합 융합 펩타바디를 제공한다. 또한, 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디를 코딩하는 핵산, 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디를 활성 성분으로 포함하는 키트 및 약학적 조성물이 개시되어 있다. 아울러, 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디의 제조방법과 암 예방 또는 치료용 약물의 제조를 위한 이의 용도가 제시되어 있다.

다른 목적들과 이점들은 계속되는 발명의 상세한 설명의 검토로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 명백할 것이며 다음의 도면 및 첨부된 청구항을 참조하여 전개된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 다음의 정의는 본 발명의 이해를 촉진하기 위하여 제시되었다.

WO9818943(Kajava et al.)에 개시된 "펩타바디"는 전체적으로 본 명세서 내에 참조로 삽입되어 있다. 이것은 이상 세포 신호를 유도하기 위한 다중체화(multimerization) 개념을 이용한 높은 avidity 분자이다. 다중체화 도메인은 힌지 영역과 스페이서(인간 IgA로부터 유래된 19개 아미노산을 바람직하게 포함하는) 및 수용자(리간드)에 결합할 수 있는 결합 도메인과 융합되어 있는 인간 연골 올리고머 기질 단백질(COMP)의 부분으로 구성되어 있다. 펩타바디는 효과적인 수용체 타겟팅을 위해서 단일클론 항체 접근방법 쪽으로 두 가지 주된 이점을 갖는다.

1) 협력적 결합(cooperative binding)에 의하여 타겟 수용체에 대한 avidity가 크게 향상될 수 있다.

2) 수용체의 강한 상호연결(crosslinking)이 세포 성장 지체 및/또는 세포사멸(도 1 참조)을 유도하면서 타겟 세포에 큰 생물학적 영향을 초래할 수 있다.

펩타바디 분자의 개념은 저밀도의 타겟 분자가 펩타바디에 결합하는 것에는 우호적이지 않지만 높은 수준의 타겟을 발현하는 세포에는 강한 결합을 하도록 허용한다. "데카바디(decabodies)"는 열개의 팔(arm)을 가져 열 개의 결합 도메인을 가진다는 차이점을 제외하고는 같은 원리로 구축되었다. 그러므로, 본 발명의 보호 범위는 이러한 분자들이 항상 표현되어 언급되지 않을지라도 데카바디까지 확장된다.

"ErbB 수용체"의 한 구성원이, ErbB 수용체 패밀리에 속하는 수용체 단백질 티로신 키나아제(recetor protein tyrosine kinase)이며 이는 EGFR, ErbB3 및 ErbB4 수용체와 향후 상기 패밀리에 속하는 것으로 확인되는 다른 구성원을 포함한다. ErbB2 수용체는 상기 정의에 포함되지 않으며 따라서 본 발명에 따른 분리된 재조합 융합 펩타바디의 타겟이 아니다. ErbB2 수용체는 일반적으로 ErbB2 리간드에 결합할 수 있는 세포 외부 도메인; 지질친화적(lipophilic) 트랜스멤브레인 도메인; 보존된 세포 내부 티로신 키나아제 도메인; 및 인산화될 수 있는 몇 개의 티로신 잔기를 가지고 있는 카르복시 말단 신호화 도메인을 포함하고 있다. ErbB 수용체는 ErbB 수용체의 "자연 서열"이거나 이의 "아미노산 서열 변이체"일 수 있다. 바람직하게는, ErbB 수용체는 인간 ErbB 수용체의 자연 서열이다.

"ErbB1", "상피세포 성장인자 수용체" 및 "EGFR"이란 용어는 본 명세서에서상호변환적으로 쓰였으며, 자연적으로 발생하는 이소형태(isoforms) 또는 이것의 변이형태(예, a deletion mutant EGFR as in Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990))를 포함하여 Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914(1987)에 개시되었듯이 EGFR을 가리킨다. "erbB1"라는 용어는 EGFR 단백질 산물을 코딩하는 유전자를 가리킨다.

"ErbB2" 및 "HER2"라는 표현은 본 명세서에서 상호변환적으로 쓰였으며, 예를 들어 Semba et al., PNAS(USA) 82:6497-6501 (1985) 및 Yamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986) (Genebank accession number X03363)에 기술된 바와 같이 인간 HER2 단백질을 가리킨다. "erbB2"란 용어는 인간 ErbB2를 코딩하는 유전자를, "neu"는 래트(rat) p185를 코딩하는 유전자를 가리킨다. 상기 정의된 바와 같이, ErbB2 수용체는 본 발명의 분리된 재조합 융합 펩타바디의 타겟이 아니며 그러므로 본 발명의 범위에서 벗어난다.

"ErbB3" 및 "HER3"는 예를 들어 U.S. Pat. Nos. 5,183,884 와 5,480,968 및 Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)에 기술된 바와 같이 수용체 폴리펩타이드를 가리킨다.

본 명세서 내에서 "ErbB4" 및 "HER4"는 WO99/19488에 개시된 바와 같이 이소 형태 및 이의 변이 형태를 포함하여 예를 들어 EP 599 274; Plowman et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:1746-1750 (1993); and Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)에 기술된 바와 같이 수용체 폴리펩타이드를 가리킨다.

"ErbB 리간드"는 ErbB 수용체에 결합 및/또는 ErbB 수용체를 활성화하는 폴리펩타이드를 의미한다. EGF 리간드 패밀리는 서로 구별되는 ErbB 수용체 호모와 헤테로다이머(Lopez-Torrejon et al., 2002 "Human betacellulin structure modelled from other members of EGF family J. Mol . Model . 8:131-44)에 결합하여 활성화시킬 수 있는지에 따라 세 가지 군으로 나뉠 수 있다. 첫번째 군은 EGF, 앰피레귤린(amphiregulin), TGF 알파(transforming growth factor alpha)로 구성되며, EGFR에 직접 결합한다. 두번째 군은 헤레귤린(heregulin)이 있으며 결합을 위해 ErbB3 또는 ErbB4와의 헤테로다이머가 형성되어야 한다. 세번째 군에는 헤파린 결합 상피세포 성장인자 및 에피레귤린(epiregulin)이 있으며 이들은 EGFR 또는 ErbB4에 결합하기 때문에 양쪽 특이적(bispecific)이다.

본 명세서에서 특별히 흥미있는 ErbB 리간드로는 EGF 같은 자연 서열 인간 ErbB 리간드(Savage et al., J. Biol . Chem . 247:7612-7621 (1972)); TGF 알파( Marquardt et al., Science 223:1079-1082 (1984)); 신경초종 또는 각질세포 자가분비 성장인자(Shoyab et al. Science 243:1074-1076(1989); Kimura et al. Nature 348:257-260(1990); and Cook et al. Mol . Cell . Biol . 11:2547-2557 (1991)); 베타세룰린(Shing et al., Science 259:1604-1607 (1993); and Sasada et al. Biochem. Biophys . Res . Commun . 190:1173 (1993)); 헤파린 결합-상피세포 성장인자(HB-EGF)(Higashiyama et al., Science 251:936-939 (1991)); 에피레귤린(Toyoda et al., J. Biol . Chem . 270:7495-7500 (1995); and Komurasaki et al. Oncogene 15:2841-2848 (1997)); 헤레귤린(이하 참조); neuregulin-2(NRG-2)(Carraway et al., Nature 387:512-516 (1997)); neuregulin-3(NRG-3)(Zhang et al., Proc . Natl . Acad . Sci . 94:9562-9567 (1997)) neuregulin-4(NRG-4)( Harari et al. Oncogene 18:2681-89(1999)) 또는 크립토(cripto)(CR-1)(Kannan et al. J. Biol . Chem. 272(6):3330-3335 (1997)) 등이 있다. EGFR에 결합하는 ErbB 리간드는 EGF, TGF-알파, 앰피레귤린, 베타세룰린, HB-EGF 및 에피레귤린을 포함한다. ErbB3에 결합하는 ErbB 리간드는 헤레귤린을 포함한다. ErbB4에 결합할 수 있는 ErbB 리간드는 베타세룰린, 에피레귤린, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 및 헤레귤린을 포함한다. VGF(vaccinia growth factor) 같은 바이러스 EGF 유사 리간드, SFGF(shope fibroma growth factor) 또는 MGF(Myxoma growth factor)가 본 발명의 범위에 포함된다.

"자연 서열" 폴리펩타이드는 자연에서 유래된 폴리펩타이드(예, ErbB 수용체 또는 ErbB 리간드)와 동일한 아미노산 서열을 가지는 것을 말한다. 상기 자연 서열 폴리펩티드는 자연에서 분리되거나 재조합 또는 인위적 수단에 의해 생산될 수 있다. 그러므로, 자연 서열 폴리펩타이드는 자연적으로 존재하는 인간 폴리펩타이드, 쥐 폴리펩타이드 또는 다른 포유류 종의 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

"단편" 이란 EGFR에 결합할 수 있는 각 폴리펩타이드의 서열과, 길이에 있어 적어도 50% 아미노산을 공유하는 서열을 가리킨다. 이러한 서열은 이들이 유도된 자연 서열과 같은 특성을 나타내는 한 사용될 수 있다. 바람직하게는 이러한 서열은 EGFR에 결합할 수 있는 각 폴리펩타이드의 서열과 길이에 있어 적어도 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상의 아미노산을 공유한다.

본 발명은 EGFR에 결합할 수 있는 앞서 기술한 서열들의 "변이체"를 또한 포함한다. "아미노산 서열 변이체" 또는 "변이체" 는 자연 서열 폴리펩타이드와 어느 정도 다른 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드를 의미하는 것으로, 하나 이상의 아미노산이 같은 성질을 가지는 또 다른 것으로 치환되는 보존적 아미노산 치환에 의하여 자연 서열과 달라지게 된다. 통상, 아미노산 서열 변이체는 자연 ErbB 리간드의 적어도 하나의 수용체 결합 도메인 또는 자연 ErbB 수용체의 적어도 하나의 리간드 결합 도메인과, 적어도 약 70% 이상의 상동성을 가지며, 바람직하게는 상기 수용체 또는 리간드 결합 도메인과 적어도 약 80%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%의 상동성을 가진다. 아미노산 서열 변이체는 자연 아미노산 서열 내의 특정 위치에 치환, 결실 및/또는 삽입되어 있다. 본 명세서 내에서 보존적 아미노산 치환은 다음의 다섯 군 중 하나 이내에서의 교환으로 정의된다.

1. 작은 지방족, 비극성 또는 약한 극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly

2. 극성, 양으로 대전된 잔기: His, Arg, Lys

3. 극성, 음으로 대전된 잔기 및 그 아미드: Asp, Asn, Glu, Gln

4. 큰 방향족 잔기: Phe, Tyr, Trp

5. 큰, 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, ILe, Val, Cys

"상동성(homology)"은 최대값의 상동성 %를 달성하기 위해 필요한 경우 갭을 도입하고 서열을 정렬한 후의 동일한 아미노산 서열 잔기 %로 정의된다. 정렬을 위한 방법과 컴퓨터 프로그램은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있다. 상기 프로그램 중 하나는 Genetech, Inc.의 "Align 2" 로 이것은 1991년 12월 10일 United States Copyright Office, Washington, D.C. 20559에 사용자 문서와 함께 제출되었다.

펩타바디의 "인핸서" 서열은 원핵 또는 진핵 시스템에서 펩타바디 또는 데카바디의 생산을 크게 높이기 위해서 분리된 재조합 융합 펩타바디 또는 데카바디의 N 말단 부분에 위치시킨 펩타이드 서열이다.

본 명세서 내에 사용된 "프로모터"는 유전자의 발현을 조절하는 핵산 서열을 가리킨다. "프로모터 서열"은 세포 내에서 RNA 중합효소에 결합하여 코딩 서열의 하류로 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터 서열 내에는 RNA 중합효소 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인(보존 서열)뿐만 아니라 전사 개시 부위(뉴클레아제 S1으로 맵핑하여 정의되는)가 발견된다. 진핵세포의 프로모터는 항상은 아니지만 자주 "TATA" 박스와 "CAT" 박스를 포함한다. 원핵세포의 프로모터는 -10 및 -35 보존 서열 외에 샤인달가노(Shine Dalgarno) 서열을 포함한다.

핵산 서열은 이것이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계를 가지도록 위치되었을 때 "작동되게 연결(operably linked)" 되어 있다고 한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 분비에 참여하는 프리프로테인으로 발현되면 선행 서열(presequence) 또는 분비 리더 서열 DNA가 폴리펩타이드 코딩 DNA와 작동되게 연결되어 있고; 프로모터가 코딩 서열의 전사에 영향을 미치면 프로모터가 코딩 서열과 작동되게 연결되어 있고; 리보솜 결합 자리가 번역을 촉진하도록 위치해 있으면 리보솜 결합 자리가 코딩 서열과 작동되게 연결되어 있는 것이다. 연결(linking)은 편리한 제한 부위(restriction site)에서 라이게이션에 의해 이루어진다. 그러한 부위가 존재하지 않으면 인위적 올리고뉴클레오티드 어댑터나 링커가 일반적인 방법에 따라 사용된다.

"분리된" 및 "정제된" 이라는 용어는 본 발명의 재조합 융합 펩타바디 혹은 상기 재조합 융합 펩타바디를 코딩하는 핵산이 본 발명에 따라 존재하는 상태를 가리킨다. 펩타바디 분자 및 핵산은 자연적 환경 또는 재조합 DNA 기술에 의해 인비트로 혹은 인비보에서 제조될 때 제조 환경(예, 세포 배양)에서 함께 발견되는 다른 폴리펩타이드나 핵산과 같이 이들이 자연적으로 연합되는 물질이 없거나 실질적으로 없는 상태일 것이다.

"정제된 DNA를 진핵 혹은 원핵 숙주 세포로 도입" 또는 "트랜스펙션"은 세포외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정을 말한다. "트랜스펙션된 세포"란 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다.

"숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포" 는 본 명세서에서 본 발명의 하나 이상의 DNA 또는 벡터가 도입되는 진핵 또는 원핵 세포를 가리키기 위하여 상호변환적으로 사용되었다. 상기 용어는 특정 대상 세포만이 아니라 그 자손 혹은 잠재적 자손까지도 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 어떤 변형이 돌연변이 혹은 환경적 영향 때문에 후속 세대에 일어날 수 있기 때문에 사실 상기 자손은 부모 세포와 동일하지는 않지만, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 상기 용어의 범주 내에서 여전히 포함된다.

"진핵 세포"는 진핵 생물체로부터 유래된 어떠한 포유류 혹은 비포유류 세포도 의미한다. 세포 배양 조건에서 유지되어 트랜스펙션 될 수 있는 어떠한 진핵 세포도 포함하지만 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다. 특별히 바람직한 세포 타입은 줄기 세포, 배아 줄기 세포, CHO 세포, COS, BHK21, NIH3T3, HeLa, C2C12, 암세포, 및 1차 분화되거나 미분화된 세포 등이다. 다른 적합한 세포는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려져 있다.

"세포사멸(apotosis)" 혹은 "세포괴사(necrosis)"를 유도하는 펩타바디는 어넥신 V(annexin V), DNA 단편화, 및/혹은 막 기공(apoptotic body)에 의해 결정된 프로그램된 세포사를 유도한다. 상기 세포는 보통 ErbB 수용체를 과발현한다. 바람직하게 상기 세포는 유방, 전립선, 난소, 위, 자궁 내막, 침샘, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 또는 방광 암세포 등이다. 인비트로에서 상기 세포는 SK-BR-3, BT474, Calu 3 세포, MDA-MB-453, MDA-MB-361 또는 SKOV3 세포일 수 있다. 세포사멸과 관련된 세포 사건들을 평가하는데는 다양한 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, PS 전위(phosphatidyl serine translocation)는 아넥신 결합에 의하여 측정될 수 있고, DNA 단편화는 DNA 래더링(laddering)을 통해 평가될 수 있으며 DNA 단편화와 더불어 핵/크로마틴 응축은 저이배체(hypodiploid) 세포의 증가로 평가될 수 있다.

"치료"는 치료와 예방적(prophylatic or preventative) 측정 모두를 가리킨다. 치료를 요하는 대상들은 질환을 예방하려는 대상뿐만 아니라 이미 질환을 가진 대상도 포함한다. 그러므로 본 명세서에서 치료받는 포유류는 상기 질환을 가진 것으로 진단되거나, 사전 조치를 받아야 하거나 혹은 상기 질환에 민감한 것으로 진단될 수 있다.

치료 목적을 위한 "포유류"는 인간, 가축 및 농장 가축 및 동물원, 스포츠 혹은 개, 말, 고양이, 소, 원숭이 등의 애완용 동물을 포함하여 포유류로 분류되는 어떠한 동물도 가리킨다. 바람직하게는 상기 포유류는 인간이다.

"치료학적으로 유효한 용량"이란 포유류에서 질환 혹은 장애를 치료하기에 유효한 약의 용량을 의미한다. 암의 경우에는 상기 약의 치료학적으로 유효한 용량은 암세포의 수를 감소시키거나; 암의 크기를 감소시키거나; 기관 주위에 암세포의 침투를 억제(예, 어느 정도 늦추고 바람직하게는 중지)하거나; 암 전이를 억제(예, 어느 정도 늦추고 바람직하게는 중지)하거나; 어느 정도까지 암 성장을 억제하거나; 및/또는 어느 정도까지 암과 관련된 증상의 하나 이상을 경감시킨다. 존재하는 암세포의 성장을 방지 및/또는 죽일 수 있는 정도에서는 상기 약은 세포증식 억제 및/또는 세포독성을 가진다. 본 발명에서 "치료학적으로 유효한 용량"은 성장이나 진행에서 임상적으로 중요한 변화 혹은 타겟 세포 덩어리의 세포분열 활성, 암세포 혹은 암의 그룹 또는 병리학적 다른 성질을 예방하거나 적어도 30 % 정도, 바람직하게는 적어도 50% 정도, 바람직하게는 적어도 70% 정도, 바람직하게는 적어도 80% 정도, 바람직하게는 적어도 90% 정도 감소시킨다.

"암" 및 "암성(性)"는 포유 동물에서 통제되지 않는 세포 성장이 전형적인 특징인 생리학적 상태를 말한다. 암의 예로는 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma)(지방육종(liposarcoma)포함), 신경내분비종(neuroendocrine tumor), 중피종(mesothelioma), 신경초종(schwanoma), 수막종(meningioma), 샘암종(adenocarcinoma), 흑색종(melanoma), 백혈병(leukemia), 악성 림프종(lymphoid malignancy)을 포함하며 이에 제한되는 것은 아니다. 좀더 상세하게는, 상기 암은 편평세포암종(squamous cell cancer)(편평상피세포암(epithelial squamous cell cancer)포함), 소세포폐암(small-cell lung cancer), 비소세포폐암(non-small cell lung cancer), 폐샘암종(adenocarcinoma of the lung), 폐편평암종(squamous carcinoma of the lung)을 포함하는 폐암(lung cancer), 복막종(cancer of the peritoneum), 간세포성종(hepatocellular cancer), 위암종(gastric or stomach cancer), 위장관종(gastrointestinal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 아교모세포종(glioblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간암(hepatoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁암(endometrial or uterine carcinoma), 침샘암(salivary gland carcinoma), 신장암(kidney and renal cancer), 전립선암(prostate cancer), 외음암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간암종(hepatic carcinoma), 항문암종(anal carcinoma), 음경암종(penile carcinoma), 고환암(testicular cancer), 식도정맥류암(esophageal cancer), 담도암(biliary tract) 및 두부 및 경부암(head and neck cancer)을 포함한다.

"ErbB-발현 암"은 세포 표면에 ErbB 단백질이 존재하는 세포를 포함하는 암이다.

ErbB 수용체의 "과발현이 특징인" 암은 암세포에서 ErbB 수용체의 활성화 정도가 같은 조직 타입의 비암성 세포(non-cancerous cell)에서의 상기 수용체의 활성화보다 상당히 큰 암을 의미한다. 상기 과도한 활성화는 암세포에서 ErbB 수용체가 과발현되어 있고/또는 ErbB 수용체의 활성화에 이용될 수 있는 ErbB 리간드의 정상 수준보다 큰 원인에 기인한다. 상기 과도한 활성화는 암세포의 악성 상태를 초래하고/또는 암세포의 악성 상태에 의하여 초래될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 ErbB 수용체의 증폭 및/또는 과발현이 일어나서 상기 ErbB 수용체의 과도한 활성화를 초래하는지 판단하기 위하여 상기 암은 진단 혹은 예후 분석에 놓이게 된다. 다르게는 혹은 부가적으로, 암세포에서 ErbB 리간드의 증폭 및/또는 과발현이 일어나서 상기 수용체의 과도한 활성화를 초래하는지 판단하기 위하여 상기 암은 진단 혹은 예후 분석에 놓이게 된다.

ErbB 수용체를 "과발현" 하는 암은, 같은 조직 타입의 비암성 세포와 비교하여 ErbB1과 같이 세포 표면에 ErbB 수용체를 상당히 높은 수준으로 발현하는 암이다. 상기 과발현은 유전자 증폭 혹은 증가된 전사 또는 번역에 의하여 초래될 수 있다. ErbB 수용체의 과발현은 세포 표면에 존재하는 ErbB 단백질의 증가된 수준을 평가하여 진단 혹은 예후 분석에서 판단될 수 있다(면역화학분석(IHC) 등에 의하여).

"포함(comprise)"이란 용어는 일반적으로 include의 의미로 쓰였으며 하나 이상의 특징 또는 성분의 존재를 허용하는 것을 의미한다.

"약학적으로 허용되는"은 생리학적으로 수인되고 인간에 투여되었을 때 알레르기 또는 비슷한 성가신 반응-급성위연동이상항진, 현기증 등-을 일으키지 않는 조성물의 분자적 본질을 말한다.

펩타바디의 비인간(설치류 등) 부분의 "인간화된" 형태, 특히 인간 연골 올리고머 기질 폴리펩타이드 및 면역글로불린 폴리펩타이드의 힌지 영역은 비인간 면역글로불린에서 유래된 최소한의 서열을 포함하는 키메릭 부분을 의미한다.

"키메릭" 부분에 의하여 상기 서열의 기능적 부분을 포함할 수 있는 아미노산 서열이 예정되며 이는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 분자생물학 기법에 의하여 얻어질 수 있다. "키메릭 단백질"은 예를 들어 자연에서는 존재하지 않는, 다른 기원을 가지는 두 개 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 단백질을 가리킨다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드는 하나의 DNA 서열에 의하여 코딩되는 분리된 재조합 융합 펩타바디이다. 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디는 상피세포 성장인자 수용체의 구성원인 ErbB1, ErbB3 및 ErbB4에 결합하며 바람직하게는 ErbB1에 결합한다. 본 발명의 분리된 재조합 융합 펩타바디는 적어도,

(a) 인간화된(humanized) 또는 인간 연골 올리고머 기질 폴리펩타이드(human cartilage oligomer matrix polypeptide)의 부분;

(b) 힌지(hinge) 부분; 및

(c) 3차원 구조를 가지는 모티프를 적어도 포함하는 상피세포 성장인자 수용체 리간드를 적어도 포함한다.

상기 분리된 재조합 융합 펩타바디는 상피세포 성장인자 수용체를 발현하는 세포, 바람직하게는 암세포, 보다 바람직하게는 ErbB를 발현하는 암세포에서 세포사(세포사멸(apoptosis) 및/또는 세포괴사(necrosis))를 유도할 수 있다. ErbB를 발현하는 암세포는 바람직하게는 ErbB 수용체의 과도한 활성화로 특징지어진 세포 혹은 ErbB 수용체를 "과발현"하는 세포이다.

"3차원 구조" 혹은 3차 구조는 단백질의 전체적인 3D 구조로서 달리 표현하면 단백질 또는 폴리펩타이드가 접히는 형태를 말한다. 단백질 분자는 복잡한 3차원 구조로 접히는 긴 사슬 아미노산 서열로부터 만들어진다. 단백질의 기능을 결정하는 것은 종종 기하학적 모양이다.

본 발명의 상피세포 성장인자 수용체 리간드는 긴 아미노산 서열을 포함하며, EGFR 리간드는 바람직하게는 복잡한 폴립펩타이드, 보다 바람직하게는 단백질이다. 상피세포 성장인자 수용체 리간드는 바람직하게는 전체 길이 서열인 것으로 이해된다. 표 1은 강한 친화도와 활성을 가지고 EGFR에 결합하기 위해 필요한 최소한의 아미노산 서열을 나타내며, 적어도 10 개 아미노산, 바람직하게는 20 개 아미노산, 보다 바람직하게는 20 개 이상의 아미노산을 포함한다. EGF 폴리펩티드 리간드의 경우에는 효과적인 EGFR 활성화를 위하여 요구되는 최소한의 EGF 부위가 세 영역의 루프를 연루시켜 단백질의 폴딩을 유도하는 구조적 모티프임이 나타나 있다.

EGF 및 상기 성장인자 패밀리의 모든 다른 구성원은 6개의 보존된 시스테인 잔기가 스패이싱되어 3개의 이황화 결합(disulfide bridge)으로 배열된 특징을 가지고 있다. 두 보존된 글리신 잔기와 조합하여 이것은 적절하게 ErbB 수용체에 결합하는데 필요한 3차원 스캐폴드를 제공한다(Campbell et al., 1990. Biochem . Pharmacol. 40, 35-40). 선형 N 말단 영역과 선형 C 말단 영역 및 네 번째와 다섯 번째 시스테인 사이에 존재하는 하나의 아미노산 힌지와 더불어 시스테인 스페이싱에 기초하여 이러한 분자들은 A-루프(Cys6-Cys20), B-루프(Cys14-Cys31), 및 C-루프(Cys33-Cys42)로 표시되는 세 루프 영역으로 나뉠 수 있다(Stortelers et al., 2002. Biochemistry , 41 (13), 4292-4301). 높은 친화도로 결합하기 위해서는 EGF 수용체 결합 도메인에서 특정 잔기와 조합하여 리간드의 적절한 3차원 구조가 필요하다.

상기 분리된 재조합 융합 펩타바디는 세포, 바람직하게는 진핵세포, 보다 바람직하게는 척추동물 세포 및 가장 바람직하게는 인간 세포와 같은 포유류 세포의 표면에 있는 EGFR 분자를 인식한다. 세포 표면에서 정의된 구조에 대하여 결합이 특이적이다. 높은 친화도, 바람직하게는 결합 상수가 5-10 nM 및 바람직하게는 9 nM로 결합이 이루어진다.

바람직하게는 본 발명의 분리된 재조합 융합 펩타바디는 온전히 인간으로부터 유래하거나 또는 인간화되어 있다. 구체적으로, 연골 올리고머 기질 폴리펩타이드 및 힌지의 일부분이 온전히 인간으로부터 유래하거나 또는 인간화되어 있다. 올리고머화 할 수 있는 펩티드 도메인(COMP, 즉, 인간화된 혹은 인간 연골 올리고머 기질 폴리펩타이드의 일부분)과 상피세포 성장인자 수용체의 구성원에 결합할 수 있는 도메인이 스페이서(힌지 영역)를 통하여 연결되어 결합 도메인에 큰 유동성 등을 부여하게 된다. 예를 들어, 스페이서의 프롤린 풍부 서열은 2차 구조 요소의 형성을 방지하고 그 결과 고정된 3D 구조를 가지는 것을 방지하도록 한다. 또한, 프롤린 잔기의 형태적 속박력 때문에 일반적으로 다소 경직되어 있는 스페이서 유사 영역은 다가 결합(multivalent binding)의 협력도(cooperativity)에 유리한 영향을 준다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 올리고머화 할 수 있는 인간화된 또는 인간 연골 올리고머 기질 폴리펩타이드의 일부분과 EGFR의 구성원에 결합할 수 있는 EGFR 리간드가 면역 글로불린 폴립펩타이드의 힌지 영역의 일부분(스페이서)-바람직하게는 프롤린 풍부 영역-을 통하여 연결되어 있다.

인간화된 또는 인간 연골 올리고머 기질 폴리펩타이드(COMP)의 일부분은 올리고머화 및 자가조립을 하여 자발적으로 5중체(pentamer)를 형성할 수 있는 펩타이드 도메인이다. 본 발명의 올리고머의 바람직한 실시예는 인비보 및/또는 인비트로에서 올리고머를 형성할 수 있는 자가 조립 분자를 들 수 있다.

바람직한 실시예에서 분리된 재조합 융합 펩타바디는 다중체(multimer), 즉, 펩타바디 분자의 이중체 혹은 삼중체이다.

본 발명의 분리된 재조합 융합 펩타바디의 구축은 다음의 면에서 선행기술과 다르다. 힌지의 부분, 바람직하게는 면역글로불린 폴리펩타이드의 부분은 인간화된 연골 올리고머 기질 폴리펩타이드 부분(hCOMP)의 C 말단에 위치해 있고, EGFR 리간드는 상기 힌지 영역의 C 말단에 위치해 있으며, 인핸서 서열은 hCOMP 부분의 N 말단에 위치해 있다. 이러한 차이점으로부터 효과가 개선되고 생산 수율이 좋아진다.

바람직하게는 본 발명의 분리된 재조합 융합 펩타바디는 추가적으로 인핸서 서열을 포함한다. 상기 인핸서 서열은 YSFE, YSFED, YSFEDL, YSFEDLY, YSFEDLYR, YSFEDLYRR, 이의 단편, 이의 키메라 분자 및 이의 변이체를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 인핸서, 바람직하게는 상기 선택된 인핸서 서열이 N 말단에 존재하면 생산 수율을 20 내지 100 배 더 높일 수 있다(도 25 및 도 26 참조). 그러나, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 범위를 이탈하지 않고 다른 적절한 인핸서 서열을 선택할 수 있다.

상기 상피세포 성장인자 수용체 리간드는,

(a) 상피세포 성장인자 폴리펩타이드, 그 단편들 또는 변이체들,

(b) 성장 억제(growth blocking) 펩타이드, 그 단편들 또는 변이체들,

(c) TGF 알파 폴리펩타이드, 그 단편들 또는 변이체들,

(d) 형질세포 확산 펩타이드(plasmocyte spreading peptide), 그 단편들 또는 변이체들,

(e) 마비(paralytic peptide) 펩타이드, 그 단편들 또는 변이체들,

(f) 심장 작용(cardioactive) 펩타이드, 그 단편들 또는 변이체들,

(g) 앰피레귤린(amphiregulin) 폴리펩타이드, 그 단편들 또는 변이체들,

(h) 헤파린-바인딩 성장인자 유사(heparin-binding epidermal growth factor-like) 폴리펩타이드, 그 단편들 또는 변이체들,

(i) 베타세룰린(betacellulin) 폴리펩타이드, 그 단편들 또는 변이체들, 또는

(j) 바이러스 EGF 유사 폴리펩타이드, 그 단편들 또는 변이체들을 포함하는 군으로부터 선택된다.

이들의 키메릭 부분도 또한 예견되는 것으로 이해되어야 한다. EGFR 리간드의 단편들은 이것들이 유도된 자연 서열과 같은 성질을 나타내는 한 사용될 수 있다.

표 1은 본 발명의 분리된 재조합 융합 펩타바디에 융합되어 있는 다양한 EGF 수용체 리간드를 나타낸다.

분리를 좋게 하기 위해 본 발명의 분리된 재조합 융합 펩타바디는 추가로 폴리히스티딘 태그 서열을 포함한다. 분리는 친화 크로마토그래피 또는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 다른 편리한 기법으로 수행될 수 있다. 친화 크로마토그래피 정제를 위하여, 분리된 재조합 융합 펩타바디 또는 폴리히스티딘 태그 서열에 특이적으로 결합하는 항체를 사용할 수 있다. 아가로스 비드에 연결된 Ni² ⁺-니트릴로트리아세트산과 같은, 폴리히스티딘 태그 서열에 특이적으로 결합하는 다른 친화 분자들도 본 발명의 범주에 포함된다.

나아가, 분리된 재조합 융합 펩타바디의 N 말단은 적어도 하나의 추가적인 기능적 도메인 또는 이펙터 영역, 마커와 같이 효소 부위 또는 세포독성 부위 또는 친화 크로마토그래피 등에서 사용될 수 있는 금속 원자 혹은 다른 구조적 화합물 등에 추가적인 결합성질을 부가하는 영역을 첨가하여 바람직하게 변형될 수 있다.

이펙터 영역의 예로는 진단 목적을 위하여 탐지할 있는 분자나 탐지부로서 스트렙타비딘 또는 HRP(horseradish peroxidase)등의 효소나 특정한 결합 성질을 가지는 펩타이드가 있다. 탐지부는 표지된 아비딘 등과 같이, 같은 기원(cognate)의 특이적 탐지부에 결합함으로써 탐지될 수 있는 바이오틴과 같은 화학적 부분도 추가적으로 포함할 수 있다.

탐지부는 또한, 형광 표지 및 MRI-CT 이미지를 위하여 당업계에서 일반적으로 사용하는 표지(label)를 포함할 수 있다. 많은 수의 형광 물질이 알려져 있으며 표지로 이용가능하다. 이들은 플루오로세인(fluorescein), 로다민(rhodamine), 오라민(auramine), Texas Red, AMCA blue 및 Lucifer Yellow 등을 포함한다.

분리된 재조합 융합 펩타바디는 방사능 동위원소 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 121I, 124I, 125I, 131I, 111In, 211At, 198Au, 67Cu, 225Ac, 213bu, 99Tc 및 186Re 와 같이 탐지부로서 방사성 표지를 가질 수 있다. 방사능 표지가 사용되면 특이적 결합 물질을 확인하고 정량하기 위하여 알려진, 현재 이용가능한 카운팅 과정이 이용될 수 있다. 상기 표지가 효소인 경우에는 당업계에 알려진 현재 이용되는 색측정법(colorimetric techniques), 분광광도법(spectrophotometric techniques), 형광분광광도법(fluorospectrophotometric techniques), 전류측정법(amperometric techniques) 또는 기체정량분석법(gasometric techniques)에 의하여 탐지될 수 있다.

방사능 표지된 분리된 재조합 융합 펩타바디는 인비트로 진단기법과 인비트로 방사능이미지 기법에 유용하다. 본 발명의 다른 일 측면에서는, 방사능 표지된 분리된 재조합 융합 펩타바디는 방사능면역요법, 특히 암 치료에 유용하다. 또 다른 측면에서는 방사능 표지된 분리된 재조합 융합 펩타바디는 암세포(cancer cells), 전암성 세포(precancerous cells), 종양세포(tumor cells) 및 과증식 세포(hyperproliferative cell)를 제거하기 전, 제거하는 동안 또는 제거한 후 상기 세포의 존재 여부 및/또는 그 위치를 확인하고 가리킬 수 있어 방사능 면역가이드 수술 기법(radioimmuno-guided surgery techniques)에 유용하다.

인비보 이미징(in vivo imaging)의 경우에는 본 발명의 분리된 재조합 융합 펩타바디가 방사능 동위원소가 아니라 이미징 물질에 컨쥬게이션 될 수 있다. 상기 이미징 물질은 자기공명이미지강화제(magnetic resonance image enhancing agent)를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 예를 들어 분리된 재조합 융합 펩타바디가 킬레이팅 그룹을 통하여 많은 수의 파라마그네틱 이온과 로딩된다. 킬레이팅 그룹은 EDTA, 포피린(porphyrins), 폴리아민 크라운 에테르(polyamines crown ethers) 및 폴리옥심(polyoximes) 등이 있다. 파라마그네틱 이온에는 gadolinium, iron, manganese, rhenium, europium, lanthanium, holmium 및 erbium 등이 있다.

바람직하게는 상기 이펙터 영역은 사이토톡신 즉, 세포 성장을 억제할 수 있거나 세포의 파괴를 초래할 수 있는 폴리펩타이드를 포함한다. 사이토톡신은 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae)로부터 유래된 디프테리아 톡신(diphtheria toxin), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래된 엑소톡신, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)로부터 유래된 안트락스 톡신(anthrax toxins), 시겔라(Shigella)로부터 유래된 시가톡신(Shigatoxin), 대장균으로부터 유래된 시가 유사 톡신(Shiga-like toxins), 보다텔라 페르투시스(Bordatella pertussis)로부터 유래된 페루투시스 톡신(pertussis toxins) 또는 이들의 톡신 영역 등의 박테리아 사이토톡신일 수 있다. 바람직하게는, 박테리아 사이토톡신은 슈도모나스 애루기노사(ATCC 25313-25363)로부터 유래된 엑소톡신 A 또는 이의 톡신 영역 즉, 도메인 II, Ib 및/또는 III일 수 있다.

한편, 상기 사이토톡신은 식물로부터 유래할 수도 있다. 식물 톡신으로는 리신(ricin)(Lamb et al., Eur .J. Biochem . 148, 265-270 (1985)), 아브린(Wood et al., Eur.J.Biochem. 198, 723-732 (1991)), 사포린(Benatti et al., Eur .J. Biochem . 183, 465-470 (1989))과 같은 리보자임 불활성화 단백질, pokeweed 항바이러스 단백질(Kataoka et al., Plant Mol.Biol.20, 879-886 (1992)), 젤로닌(Nolan et al., Gene 134, 223-227 (1993)) 또는 트리코산틴(Shaw et al., Gene 97, 267-272 (1991)) 등이 있다.

보다 바람직한 실시예에서는 상기 이펙터 영역은 리보뉴클라아제, 특히 소 췌장 RNaseA(Carsana et al., Nucleic Acids Res . 16, 5491-5502 (1988)), 인간 안지오제닌(angiogenin)(Kurachi et al., Biochemistry 24, 5494-5499 (1985)) 또는 인간 에오지노필 유래 뉴로톡신(human eosinophil-derived neurotoxin)(Rosenberg et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86, 4460-4464 (1989))과 같이 포유류에서 유래된 리보뉴클라아제를 포함한다. 가장 바람직하게는 상기 리보뉴클라아제는 인간에서 유래된다.

5-플루오로우라실 또는 리신(ricin)과 같은 다른 세포독성 약물 및 박테리아 카르복시펩티다아제 또는 니트로리덕타아제(nitroreductase)과 같이 종양 자리에서 전약물(prodrug)을 활성 약물로 전환할 수 있는 효소가 사용될 수 있다.

본 발명의 분리된 재조합 융합 펩타바디는 필요에 따라 혈류 또는 CSF로 주사하거나 종양 자리 혹은 그 근처에 직접 주사하는 등 적합한 경로를 통하여 환자에게 투여될 수 있다. 정확한 용량은 펩타바디가 진단용인지 치료용인지, 종양의 크기와 위치, 펩타바디의 정확한 성질 그리고 분리된 재조합 융합 펩타바디에 붙은 탐지가능한 혹은 기능적인 표지의 성질을 포함하는 여러 인자에 의존한다. 방사성핵종(radionuclia)이 치료용으로 쓰이는 경우 적절한 최대 1회 용량은 약 45 mCi/m2에서 최대 약 250 mCi/m2까지이다.

본 발명의 또 다른 주제는 상기 정의된 것처럼 분리된 재조합 융합 펩타바디를 코딩하는, 분리되고 정제된 DNA 분자 및 상기 분리되고 정제된 DNA 분자의 적어도 한 카피를 포함하는 벡터이다.

본 명세서에서 사용된 DNA는 폴리디옥시뉴클레오티드, 이중사슬 DNA, 단일사슬 DNA, 하나 혹은 두 사슬이 두 개 이상의 단편으로 구성되는 이중사슬 DNA, 하나 혹은 두 사슬이 중단되지 않은 포스포디에스테르 골격을 가지는 이중 사슬 DNA, 하나 이상의 단일 사슬 부분 및 하나 이상의 이중 사슬 부분을 포함하는 DNA, DNA 사슬이 완전히 상보적인 이중 사슬 DNA, DNA 사슬이 부분적으로만 상보적인 이중 사슬 DNA, 환형 DNA, 공유결합되어 닫힌 DNA(covalently-closed DNA), 선형 DNA, 상호 공유결합으로 연결된 DNA(covalently cross-linked DNA), cDNA, 화학적으로 합성된 DNA, 반합성된 DNA(semi-synthetic DNA), 생합성된 DNA, 자연적으로 분리된 DNA, 효소 처리된 DNA, 잘라낸 DNA(sheared DNA), 방사능 표지된 DNA 및 형광 크롬(fluorochrome) 표지된 DNA와 같이 표지된 DNA, 하나 이상의 비자연적으로 생성된 핵산 종을 포함하는 DNA를 포함하여 어떠한 폴리디옥시뉴클레오티드도 사용될 수 있다. 분리된 재조합 융합 펩타바디를 코딩하는 DNA 서열 혹은 그 일부분은, 포스포트리에스테르 방법 등의 일반적인 화학적 방법 또는 자동합성법 및 PCR 방법에 의하여 합성될 수 있다. 본 발명에 따른 분리된 재조합 융합 펩타바디를 코딩하는 , 정제되고 분리된 DNA 서열은 효소적 기법으로 생산될 수 있다. 그러므로, 미리 정의된 인식 서열에서 핵산 분자를 자르는 제한효소는, 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디 혹은 그 부분을 코딩하는 DNA(RNA)와 같은 핵산 서열을 포함하는 보다 큰 핵산 분자로부터 핵산 서열을 분리하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 이미 언급된 서열의 변이체, 즉, 같은 성질을 가지는 다른 뉴클레오티드에 의하여 하나 이상의 뉴클레오티드가 치환되는 보존적 뉴클레오티드 치환에 의하여 참조 서열과 달라지는 뉴클레오티드 서열을 또한 포함한다.

벡터는 진핵, 원핵 또는 진핵 및 원핵 생물에서 복제될 수 있다. 이것은 박테리오파지 람다와 같이 숙주 게놈안으로 삽입될 수 있는 벡터 또는 플라스미드와 같이 염색체 외부에서 존재하는 벡터일 수 있으며 바람직하게는 상기 벡터는 플라스미드이다.

나아가, 상기 벡터는 발현벡터 즉, 상기 분리되고 정제된 DNA 서열이 프로모터에 작동되게 연결되어 있는 벡터일 수 있다. 이것은 본 발명의 분리된 재조합 융합 펩타바디를 코딩하는, 분리되고 정제된 DNA 서열이, 발현 즉, 삽입된 분리되고 정제된 DNA 서열의 전사 및 번역을 허락하는 적절한 조절 서열의 통제를 받고 있음을 의미한다. 원핵 숙주 세포를 위한 적절한 발현벡터가 Sambrook et al., Molecular Cloning; a Laboratory Manual, 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, especially in Chapters 1-4 and 17에 기재되어 있다. 포유류 세포에서 클로닝된 유전자의 발현을 위한 적절한 벡터는 Sambrook et al., Chapter 16에 나타나 있다. 프로모터 서열, 터미네이터 서열, 폴리아데닐레이션 서열, 마커 유전자 및 다른 서열을 적절하게 포함하는 조절 서열을 포함하는 적합한 벡터는 선택되거나 구축될 수 있다.

본 발명의 DNA 서열을 발현함에 있어, 수많은 다양한 호스트/발현벡터 조합이 가능하다. 유용한 발현벡터는 염색체의 부분, 비염색체 부분 및 합성 DNA 서열로 구성된다. 적절한 벡터는 SV40 유도체 및 알려진 박테리아 플라스미드 예를 들어, 대장균 플라스미드 col El, pCRl, pBR322, pMB9 및 그 유도체, RP4 등의 플라스미드; NM989 등의 파지 X의 수많은 유도체와 같은 파지 DNA 및 M13 등의 다른 파지 DNA 및 필라멘트 단일 사슬 파지 DNA; 2u 플라스미드 또는 그 유도체와 같은 효모 플라스미드; 곤충 또는 포유류 세포에 유용한 벡터와 같은 진핵세포에 유용한 벡터; 플라스미드와 파지 DNA의 조합으로 생성되는 파지 DNA 또는 다른 발현 조절 서열 등을 채택하여 변형되는 플라스미드와 같은 벡터를 포함한다.

많은 다양한 발현 조절 서열(작동되게 연결된 DNA 서열의 발현을 조절하는 서열)은 본 발명의 DNA 서열을 발현하기 위하여 상기 벡터에 사용될 수 있다. 그러한 유용한 발현 조절 서열은 예를 들어 SV40, CMV, 백시니아, 폴리오마 또는 아데노바이러스, lac 시스템, trp 시스템, TAC 시스템, TRC 시스템, LTR 시스템, 파지 X의 주 작동자 및 프로모터 영역, fd 외피 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세르산 키나아제(3-phosphoglycerate kinase) 혹은 다른 해당 효소(glycolytic enzyme)의 프로모터, Pho5 등의 산 포스파타아제의 프로모터, 효모 교배 인자(yeast-mating factor)의 프로모터, 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 다른 서열 및 이들의 다양한 조합을 포함한다.

본 발명의 발현벡터의 특별한 예로서 대장균 벡터 pMS238-5-TGF, pMS238-5-225, pMS238-225-5, pMS240-5-225, pMS242-5-5 KDEL, pMS238-5-5 및 pMS246-5-5 KDEL이 있다. 바람직하게는 상기 발현벡터는 pQE-09(도 27)이다. 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 플라스미드 단편의 뉴클레오티드 서열 및 이에 상응하는 아미노산 서열이 도 2, 도 23, 도 24 및 도 27에 나타나 있다. 또한, 서열번호 1 및 2에 펩타바디 EGF(p-EGF)의 서열이, 서열번호 3 및 4에 p-GBP의 서열이 첨부되어 있다.

본 발명의 또 다른 주제는 상기 정의된 바와 같이 분리되고 정제된 DNA 분자를 발현하는 숙주세포, 구체적으로는 상기 DNA 분자를 포함하는 발현벡터로 안정적으로 형질전환된 숙주세포이다.

본 발명의 DNA 서열을 발현하기에 유용한 단세포 숙주세포가 많다. 이러한 숙주는 잘 알려진 진핵 및 원핵 숙주를 포함하며, 이에는 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스 스트레인, 효모와 같은 곰팡이 및 CHO, YB/20, NSO, SP2/0, Rl. l, B-W 및 L-M 세포, 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (예, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, 및 BMT10)와 같은 동물세포, 곤충세포(Sf9 등) 및 조직 배양 중의 인간 세포 및 식물세포가 있다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 박테리아 세포, 보다 바람직하게는 대장균 세포이다.

모든 벡터, 모든 발현 조절 서열 및 모든 숙주가 본 발명의 DNA 서열을 동등하게 잘 발현시키도록 작동하는 것으로 이해되지 않을 것이다. 모든 숙주가 같은 발현시스템을 가지고 동등하게 잘 작동되는 것으로 이해되어서도 안 될 것이다. 그러나, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 원하는 발현을 달성하기 위하여 부당한 실험 없이 벡터, 발현 조절 서열, 및 숙주를 적절하게 선택할 수 있을 것이다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서, 벡터가 숙주 안에서 작동하여야 하기 때문에 숙주를 고려해야 한다. 벡터의 카피 수, 상기 카피 수를 조절하는 능력, 및 상기 벡터에 의하여 코딩되는 항생제 마커와 같은 다른 단백질의 발현도 고려되어야 한다.

발현 조절 서열을 선택함에 있어 다양한 인자가 보통 고려된다. 여기에는 예를 들어, 그 시스템의 상대적 강도, 조절 정도, 발현되는 특정 DNA 서열과의 양립가능성(compatibility), 구체적으로는 잠재적 2차 구조의 측면을 포함한다. 적합한 단세포 숙주는, 발현되는 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 숙주에 대한 독성, 및 발현산물의 정제의 용이성뿐만 아니라 선택된 벡터와의 양립가능성, 분비 특성, 단백질을 올바르게 폴딩할 수 있는 능력 및 발효 요구도 등을 고려하여 선택될 것이다.

이러한 인자들을 고려하여 당업자는 발효나 대규모 동물 세포 배양에서 본 발명의 DNA 서열을 발현하는 다양한 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 구축할 수 있다.

숙주 세포는 펩타바디 생산을 위하여 상기 기술한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고 프로모터를 유도하고, 형질전환체를 선별하거나 펩타바디 생산을 증가시키기 위해 적절히 변형된 일반적인 영양배지에서 배양된다.

본 발명의 분리된 재조합 융합 펩타바디를 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), and Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma)과 같은 상업적으로 이용가능한 배지가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, Ham et al., Meth . Enz . 58:44 (1979), Barnes et al., Anal . Biochem. 102:255 (1980), U.S. Pat. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430 또는 WO 87/00195 에 기재된 여하한 배지도 숙주 세포의 배양 배지로 사용될 수 있다. 상기 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장호르몬(인슐린, 트랜스페린 또는 EGF 등), 염(염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산 등), 완충용액(HEPES 등), 뉴클레오티드(아데노신 및 티미딘 등), 항생제(GENTAMYCIN(TM) 약물 등), 보조첨가제(최종 농도가 보통 마이크로몰 영역인 무기 화합물로 정의되는), 및 포도당 또는 등가 에너지원이 공급된다. 다른 필요한 보충제는 당업자에게 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도 및 pH와 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 더불어 기존에 사용된 것들로서 당업자에게 명백하다.

본 발명의 또 다른 주제는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 어쥬번트와 선택적으로 조합되는, 약학적으로 유효한 양의 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디를 활성 성분으로 포함하는 약학적 조성물이다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 어쥬번트를 포함한다. 상기 담체, 희석제 및 어쥬번트는 무독성이며 활성 성분의 약효를 방해하지 않아야 한다. 상기 약학적 조성물은 바람직하게는 암 치료 또는 예방, 세포 증식 억제를 위해 약제의 제조에 사용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 종양의 성장을 억제하기 위한 물질인 항암제로 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 용액, 서스펜션, 파우더, 동결건조제, 연고제, 팅크제 등의 어떤 적합한 형태로도 제조될 수 있다. 상기 조성물은 주사(전신 혹은 지역적으로) 또는 국소적으로 등의 어떤 적합한 방법을 통해서도 투여될 수 있다. 상기 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 경구, 국소(topical) 혹은 정맥 내 또는 피내 주사와 같은 투여 경로에 따른다.

경구 투여를 위한 약학적 조성물은 정제, 캡슐제, 파우더 혹은 액제 형태일 수 있다. 정제는 젤라틴이나 어쥬번트와 같은 고체 담체를 포함할 수 있다. 액제 형태의 약학적 조성물은 일반적으로 물, 페트롤리움, 동물 또는 식물 오일, 미네랄 오일 또는 합성 오일 등의 액체 담체를 일반적으로 포함할 수 있다.

생리식염수, 덱스트로스 또는 다른 다당류 용액 또는 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다.

정맥 주사 혹은 환부로의 주사를 위해서, 활성 성분은 발열원(pyrogen)이 없고 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 가지는 비경구적으로 허용되는 수용액 형태이어야 할 것이다. 당업계에서 관련 기술을 가진자는 염화나트륨 주사, 링거 주사, 락테이트 링거 주사(Lactated Ringer's Injection)와 같은 등장성의 부형제(isotonic vehicle)등을 이용하여 적절하게 용액을 제조할 수 있다. 보존제, 안정제, 완충용액, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다.

각각의 약학적으로 유효한 양은 치료받는 특정 환자, 치료 대상 질환, 투여방법에 따를 수 있다. 나아가, 상기 약학적으로 유효한 양은 사용된 특정 폴리펩타이드, 특히 상기 폴리펩타이드가 부가적으로 세포 독성 성분을 포함하고 있는지에 따른다. 치료는 대개 상기 약학적 조성물을 보통 몇 시간, 며칠 혹은 몇 주 간격을 두어 여러 번 투여하는 것을 포함한다. 상기 폴리펩타이드의 약학적으로 유효한 용량 단위는 보통 치료받는 환자의 체중 kg 당 0.001 ng에서 100 ug 범위에 있다.

본 발명에 따라 사용된 약학적 조성물은 저장을 목적으로, 원하는 순도의 상기 정의된 분리된 재조합 융합 펩타바디의 약학적으로 유효한 양과 약학적으로 허용되는 담체, 부형제(excipient) 혹은 안정제(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol , A. Ed . (1980))를 섞어 동결건조 형태나 수용액 상태로 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 채택되는 용량과 농도에서 리시피언트에게 독성이 없으며, 완충용액으로 인산, 시트르산 및 다른 유기산을; 항산화제로 아스코르브산 및 메티오닌(methionine)을; 보존제(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride, benzethonium chloride; phenol, butyl orbenzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; and m-cresol 등); 저분자량(10 잔기 이하) 폴리펩타이드; 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류; 이당류 및 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염 형성 카운터 이온; Zn-단백질 착물과 같은 금속 착물(comlexes); 및/또는 TWEEN(TM), PLURONICS(TM) 또는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.

본 명세서에서 약학적 조성물 또는 제형(formulation)은 처치되는 특별한 지시를 목적으로, 필요에 따라 하나 이상의 활성 성분을, 바람직하게는 서로 역작용하지 않는 상보적인 활성을 가지는 것들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나의 제형에서는 EGFR, ErbB2 (ErbB2의 여러 에피토프에 결합하는 항체 등), ErbB3, ErbB4, 또는 VEGF(vascular endothelial factor)에 결합하는 항체들을 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 다르게는 혹은 부가적으로, 치료받는 상태에 따라 상기 약학적 조성물을 단독으로 혹은 다른 치료, 치료제(therapeutics) 또는 치료물질과 동시에 혹은 순차적으로 조합하여 투여할 수 있음은 명백하다. 바람직하게는 상기 약학적 조성물은 화학요법제, 세포독성 물질, 사이토카인, 성장억제제, 항호르몬제, EGFR에 타겟된 약물, 항 혈관신생물질(anti-angiogenic agent), 항암물질, 면역조절제 및/또는 심장보호제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 분자들은 의도된 바를 위하여 효과적인 양으로 조합되어 적절하게 존재한다.

보다 일반적으로, 이러한 항암물질(anti-cancer agents)은 티로신 키나아제 억제제 혹은 인산화 케스케이드 억제제, 번역후 조절자(post-translational modulators), 세포성장 또는 분열 억제제(항세포분열제(anti-mitotics) 등), 또는 신호전달 억제제일 수 있다. 다른 치료법으로는 아스피린, 파라세타몰(paracetamol), 이부프로펜(ibuprofen) 또는 케토프로펜(ketoprofen) 등의 비스테로이드계 항염증제와 같은 통증경감제 또는 모르핀 또는 항구토제와 같은 아편제(opiates)를 적량 투여하는 것을 포함한다. 상기 조성물은 티로신 키나아제 억제제(AG1478 및 ZD1839, STI571, OSI-774, SU-6668를 포함하나 이에 제한되지 않는다), doxorubicin, temozolomide, cisplatin, carboplatin, nitrosoureas, procarbazine, vincristine, hydroxyurea, 5-fluoruracil, cytosine arabinoside, cyclophosphamide, epipodophyllotoxin, carmustine, lomustine, 및/ 또는 다른 화학요법제와 순차적으로(즉, 미리 또는 이후) 또는 동시에 조합하여 투여될 수 있다. 그러므로, 상기 물질들은 항 EGFR 특이적 물질 또는 AG1478, ZD1839, STI571, OSI-774, 또는 SU-6668와 같은 티로신 키나아제 억제제일 수 있고, 보다 일반적으로는 doxorubicin, cisplatin, temozolomide, nitrosoureas, procarbazine, vincristine, hydroxyurea, 5-fluoruracil, cytosine arabinoside, cyclophosphamide, epipodophyllotoxin, carmustine 또는 lomustine과 같은 항암 및 항종양 물질일 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 덱사메타손과 같은 호르몬, 인터루킨, 종양괴사인자(TNF)와 같은 면역조절자 또는 다른 성장인자 또는 면역반응을 자극하고 암세포 또는 종양의 제거 또는 감소를 촉진하는 사이토카인과 함께 투여될 수 있다.

활성 성분 또는 물질은 또한, 코아세르베이션 기법(coacervation techniques) 또는 인터페이셜 폴리머화(interfacial polymerization)-그 예로, 콜로이드 약물 전달 시스템(liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nano-particles and nanocapsules 등) 또는 마이크로에멀젼으로 각각 hydroxymethylcellulose 또는 gelatin-microcapsules 및 poly-(methylmethacylate) microcapsules화-등에 의하여 마이크로캡슐에 트랩되어 제조될 수 있다. 상기 기법은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol , A. Ed . (1980)에 개시되어 있다.

지효성 제제(Sustained-release preparations)가 제조될 수 있다. 지효성 제제의 적합한 예는 항체를 포함하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 기질(semi permeable matrices of solid hydrophobic polymers)을 포함하며, 상기 기질은 필름 또는 마이크로캡슐 등의 모양으로 형성된 형태를 가진다. 지효성 기질의 예로서 폴리에스테르, 하이드로겔 (poly(2-hydroxyethyl-methacrylate 등), 또는 폴리비닐알콜, 폴리락타이드(polylactides) (U.S. Pat. No. 3,773,919), L-글루탐산 및 [감마]에틸-L-글루탐산의 코폴리머, 비분해성 에틸렌비닐아세트산, LUPRON DEPOT(TM)과 같은 분해성 젖산-글리콜산 코폴리머 (젖산-글리콜산 코폴리머와 leuprolide 아세트산으로 구성된 주사가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티릭산을 포함한다.

인비보로 투여되는 제형은 멸균되어야 한다. 이는 살균 여과막을 이용한 여과 등에 의하여 쉽게 가능하다.

상기 기술한 분리된 재조합 융합 펩타바디의 약학적으로 유효한 양을 활성 물질로 포함하는 약학적 조성물은 다양한 질환 및 장애를 치료하기 위하여 사용할 수 있을 것으로 판단된다. 일반적으로 상기 치료의 대상 질환 또는 장애는 암이다. 구체적으로, 본 발명은 상피세포 성장인자 수용체(ErbB 발현 암)를 발현하는 암, 바람직하게는 ErbB 수용체의 과도한 활성화로 특징지어진 암 또는 ErbB 수용체를 "과발현"하는 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 치료 대상이 되는 암의 종류는 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 백혈병 및 악성림프종(lymphoid malignancy)을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로는 상기 암에는 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 지방육종(liposarcoma), 신경내분비종(neuroendocrine tumor), 중피종(mesothelioma), 신경초종(schwanoma), 수막종(meningioma), 샘암종(adenocarcinoma), 흑색종(melanoma), 백혈병(leukemia), 악성 림프종(lymphoid malignancy), 편평세포암종(squamous cell cancer), 편평상피세포암(epithelial squamous cell cancer), 폐암(lung cancer), 소세포폐암(small-cell lung cancer), 비소세포폐암(non-small cell lung cancer), 폐샘암종(adenocarcinoma of the lung), 폐편평암종(squamous carcinoma of the lung), 복막종(cancer of the peritoneum), 간세포성종(hepatocellular cancer), 위암종(gastric or stomach cancer), 위장관종(gastrointestinal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 아교모세포종(glioblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간암(hepatoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁암(endometrial or uterine carcinoma), 침샘암(salivary gland carcinoma), 신장암(kidney and renal cancer), 전립선암(prostate cancer), 외음암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간암종(hepatic carcinoma), 항문암종(anal carcinoma), 음경암종(penile carcinoma), 고환암(testicular cancer), 식도정맥류암(esophageal cancer), 담도암(biliary tract) 및 두부 및 경부암(head and neck cancer)을 포함한다. 보다 바람직하게는 본 명세서에서 치료 대상이 되는 암은 두부암(head cancer), 경부암(neck cancer), 방광암 또는 흑색종(melanoma)이다.

본 발명은 또한, 세포를 본 발명의 분리된 재조합 융합 펩타바디와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포사멸 및/또는 세포괴사를 유도하는 방법을 제공한다. 접촉되는 세포는 바람직하게는 상기 기재된 암세포이다.

본 발명의 목적은 또한, 세포를 본 발명의 분리된 재조합 융합 펩타바디와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포증식을 억제하는 방법을 제공하는 것이다. 접촉되는 세포는 바람직하게는 상기 기재된 암세포이다.

질환, 특히 암을 예방하거나 치료하기 위하여 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디의 적절한 용량은 상기 정의된 바와 같이 치료 대상이 되는 질환의 타입, 상기 질환의 중증도(severity) 및 경과, 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디가 예방적 혹은 치료적 목적으로 투여되는 것인지, 전요법(previous therapy), 환자의 임상 병력 및 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디에 대한 반응 및 참석 의사의 재량에 따라 달라질 수 있다. 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디는 한번에 혹은 여러 번에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 1 ug/kg 내지 15 mg/kg (예, 0.1-20 mg/kg) 정도의 펩타바디가 질환의 타입 및 중증도에 따라 한번 이상의 투여나 연속적인 주입 등에 의하여 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 용량이 된다. 일반적인 하루 용량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ug/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위가 될 수 있다. 며칠 이상에 걸친 반복된 투여를 위해서는 상태에 따라 질환 증상의 원하는 억제 효과가 나타날 때까지 치료를 지속한다. 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디의 바람직한 용량은 약 0.005 mg/kg 내지 약 1.0 mg/kg의 범위 내에 있다. 그러므로, 약 0.05 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 조합) 중의 하나 이상의 용량을 환자에게 투여할 수 있다. 상기 용량은 매 주마다, 혹은 매 3주마다(e.g. such that the patient receives from about two to about twenty, e.g. about six doses of the isolated and recombinant fusion peptabody) 등과 같이 간헐적으로 투여될 수 있다. 초기에 로딩 용량이 높을수록, 이후에 하나 이상 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 대표적인 용량 투여 방안은 분리된 재조합 융합 펩타바디를 초기에 약 0.4 mg/kg 로딩하고 매주 약 0.2mg/kg 투여를 계속하는 것이다. 그러나, 다른 용량 투여 방안도 유용할 수 있다. 본 치료법의 진행경과는 일반적인 기법과 분석법에 의해 쉽게 모니터링 될 수 있다.

본 발명의 분리된 재조합 융합 펩타바디의 높은 특이성은 이것을 유전자 치료법에도 사용가능할 수 있게 하는데, 예를 들어, 활성화 또는 비활성화를 위한 목적이나, 독성 성분과 연결되어 있다면 파괴하기 위한 목적으로 특정 수용체를 타겟팅하는 것이다. 본 명세서 내에 기재된 발현벡터로 이미 트랜스펙션된 숙주 세포의 사용에 기초하는 세포치료법(cell therapy)도 본 발명의 범주 내에 있다.

본 발명은 상기 정의된 재조합 융합 펩타바디를 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 어쥬번트와 선택적으로 조합하여 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암 진단방법을 추가로 고려한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 정의된 바와 같이 적어도 하나의 탐지부를 가지는 분리된 재조합 융합 펩타바디와, 선택적으로 시약 및/또는 사용 지침을 포함하는, 인간 환자에서 상피세포 성장인자 수용체를 발현하는 암 진단용 키트를 제공한다.

특별히 이상적인(aberrant) EGFR 발현과 관계되는 EGFR 상태를 인비트로에서 평가하기 위한 진단 분석 및 키트는 환자 샘플(암, 전암 상태, 과증식 세포성장과 관련된 상태를 가지거나 가지는 것으로 의심되는 것을 포함) 혹은 종양 샘플을 진단, 평가 및 모니터링 하는데 이용할 수 있다. EGFR 상태를 평가하는 것은 어떤 약의 임상 실험이나 특정 화학요법제 특히, 다른 물질과 대비하여 그 조합을 포함하여 본 발명의 분리된 재조합 융합 펩타바디의 투여를 위하여 환자의 적합성을 판단하는 경우에도 유용하다.

본 연구에 가장 통상적으로 사용되는 탐지부의 표지는 방사능 물질, 효소, UV에 노출되면 형광을 띄는 케미칼 및 기타 물질이 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디와, 선택적으로 시약 및/또는 사용 지침을 포함하는, 인간 환자에서 상피세포 성장인자 수용체를 발현하는 암 치료용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 화학요법제, 항 EGFR 항체, 방사능면역요법제(radioimmunotherapeutic agents) 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 부가적인 항암물질을 포함하는 별도의 약학적 용량 형태를 추가로 포함할 수 있다.

일반적으로, 상기 키트는 용기 및 라벨 또는 용기와 관련된 포장 삽입물(package insert on or associated with the container) 을 포함한다. 적절한 용기로는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지 등을 들 수 있다. 상기 용기는 유리나 플라스틱과 같은 다양한 소재로부터 만들어질 수 있다. 상기 용기는 상기 상태를 치료하는데 유효한 조성물을 담고 살균된 접근 포트(예를 들어, 상기 용기는 피하 주사바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 가지는 바이알 혹은 정맥내 용액 봉지일 수 있다)를 가질 수 있다. 상기 조성물에서 적어도 하나의 활성 물질은 본 발명의 분리된 재조합 융합 펩타바디이다. 라벨 또는 포장 삽입물(package insert)은 상기 조성물이 암과 같은 선택 상태를 치료하는데 사용되는 것임을 가리킨다. 하나의 실시예에서, 상기 라벨과 포장 삽입물은 EGFR에 결합하는 본 발명의 분리된 재조합 융합 펩타바디를 포함하는 상기 조성물이 EGFR, ErbB3 및 ErbB4로 구성되는 군으로부터 선택되는 (바람직하게는 EGFR) ErbB 수용체를 발현하는 암을 치료하는데 사용될 수 있음을 가리킨다. 또한, 상기 라벨과 포장삽입물은 치료 받는 환자가 EGFR, ErbB3 또는 ErbB4로부터 선택되는 ErbB 수용체의 과도한 활성화로 특징지어지는 암을 가지고 있음을 가리킬 수 있다.

이와 다르게는 또는 부가하여 상기 키트는 주사용 정균작용(bacteriostatic)물(BWFI), 인산 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액과 같은 약학적으로 허용되는 완충용액을 포함하는 2차(혹은 3차) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 다른 완충용액, 희석제, 필터, 주사 바늘 및 시린지를 포함하여 상업적 및 사용자의 견지에서 바람직한 다른 물건들을 포함할 수 있다.

선행기술의 펩타바디는 몇 가지 방법으로 제조될 수 있다. 수용자(리간드)에 결합할 수 있는 도메인이 상대적으로 짧기 때문에 선행기술의 펩타바디는 고체상 합성(solid phase synthesis) 등을 통해서 바람직하게 화학적으로 제조된다.

다르게는, 혼합 공정이 보고된 바 있다. 고안 단위의 부분이 적절한 숙주에 의해 발현되고 화학적으로 합성된 부분에 연결된다. 예를 들어, 올리고머화 부분은 미생물에 의해 합성되고 수용자(acceptor)에 결합할 수 있는 도메인을 부가하기 위해 화학적 합성법으로 신장한다.

폴리펩타이드 또는 단백질 같은 복잡한 구조와 크기를 가지는 리간드를 위한 유전공학이 아직 보고되지 않았다. 융합 단백질로 고안 단위를 발현함으로써 겨우 헥사펩타이드 길이의 작은 리간드가 얻어진다. 그들 중 대부분은 불용성 형태로 생산되며, 이는 고안 단위에 복잡한 구조를 생산하는 어려움을 암시한다.

본 발명의 분리된 재조합 융합 펩타바디는 유전공학 기법에 의하여 바람직하게 생산된다. 상기 개시된 바와 같이 발현벡터는, 상기 기재한 적절한 숙주 세포내에서 발현되는 분리된 재조합 융합 펩타바디를 코딩하는 완전한 DNA 서열을 위한 발현 카세트를 포함하도록 구축된다. 적절한 발현 카세트는 유전공학에 있어 일반적인 기법에 따라 제조될 수 있다. 원하는 분리된 재조합 융합 펩타바디의 합성에 필요한 정보 외에, 상기 발현 카세트는 부가적으로 생산된 단백질의 분비를 명령하는 신호 서열을 포함할 수 있다.

본 발명은,

a) 상기 기재된 바와 같이 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디를 코딩하는 분리되고 정제된 DNA 분자를 구축하는 단계;

b) 적절한 조건하에서 세포계에서 상기 분리되고 정제된 DNA 분자의 발현을 허용하는 단계; 및

c) 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디를 회수하는 단계를 포함하는, 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디를 생산하는 방법을 제공한다.

펩타바디는 연골 올리고머 기질 단백질의 다중체화에 의해 형성되는 다중체 분자이다. 이는 모노머가 적절한 조건(낮은 변성 조건)하에서 서로 혼합되면 자발적으로 일어난다. 그러나, 5중체 형성의 효율은 물리-화학 조건 및 모노머의 농도에 따라 다양할 수 있다. 게다가, 리간드, 특히 이황화 결합(disulphide bridges)을 포함하는 리간드의 복잡성은 펩타바디 다중체(multimers of peptabodies) 또는 집합체(aggregates)의 형성을 초래할 수 있다.

상기 기재된 바와 같이, 세포발현계 혹은 숙주 세포는 진핵 또는 원핵 세포이다. 바람직하게는, 상기 세포발현계는 원핵세포이다.

단계 b)의 적절한 조건은 상기 세포발현계를 10-40℃ 에서 2-40 시간 동안, 바람직하게는 37℃에서 8-16 시간 동안 배양하는 것이다.

나아가, 상기 c) 단계는 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디를 세포발현계로부터 분리하고 이어 정제 및 리폴딩 하는 과정에 의해 달성된다.

상기 재조합 융합 펩타바디가 분비되면 추출되고 배양 배지로부터 회수할 수 있으며, 분비되지 않으면, 세포발현계로부터 추출하여 HPLC(high performance liquid chromatography), 젤 전기영동, 친화크로마토그래피, 한외여과(ultrafiltration), 이온교환 등의 공지 기술에 의해 정제하여 회수될 수 있다. 특정 재조합 융합 펩타바디를 정제하는데 사용되는 실제 조건은 부분적으로, 순 전하(net charge), 소수성, 친수성 등의 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에게 명백하다. 친화 크로마토그래피 정제를 위하여, 재조합 융합 펩타바디 또는 His 태그에 특이적으로 결합하는 항체가 사용될 수 있다. Ni² ⁺ 니트릴로트리아세트산이 연결된 아가로스 비드 및 His 태그에 특이적으로 결합하는 다른 친화 분자가 또한, 본 발명의 범주 내에 있다. 정제는 환원제의 존재하에서 수행되어 오염물질이 제거된다.

상기 리폴딩 과정은 리폴딩 완충용액에서 직접 희석에 의하여 수행하고 추가로 시리얼 투석(serial dialysis) 과정을 포함한다. 중요한 것은 원형재현(renaturing) 용액에서 변형된 펩타바디를 신속히 희석하여야 하는 것이다.

분리된 재조합 융합 펩타바디의 회수는 집합체 형성(aggregate formation)을 방지하기 위하여 낮은 농도에서 수행되었다. 바람직하게는, 리폴딩 완충용액에서의 직접 희석으로 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디의 최종 농도가 실시예 4에서 나타난 것과 같이, 300 nM 이하, 가장 바람직하게는 100 nM 이하가 된다.

실시예 4에 나타난 바와 같이, 시리얼 투석(serial dialysis)은 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3 또는 4개, 훨씬 보다 바람직하게는 적어도 5개의 다른 투석 완충용액을 포함한다. 그러나, 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고, 다른 투석 순서나 시리얼을 선택할 수 있다.

상기 리폴딩 과정에서는 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디를 농축하기 전에 산화한다.

본 발명에 따라 생산된 펩타바디는 특별히 안정적이다. 펩타바디 분자의 안정성이란, 불용성 형태로의 전환이나 집합체(aggragate)의 형성이나 펩타바디의 다중체 형성이나 생물학적 활성의 손실 없이 분자가 안정적으로 수용성 형태를 유지하는 것을 의미한다.

본 발명의 또다른 목적은 단백질 생산 활성을 증가시키기 위하여 정제되고 분리된 인핸서 서열을 제공하는 것이다. 상기 정제되고 분리된 인핸서 서열은 바람직하게는 YSFE, YSFED, YSFEDL, YSFEDLY, YSFEDLYR 및 YSFEDLYRR, 이의 단편, 이의 키메라 분자 및 이의 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된다.

"단백질 생산 증가 활성"은 다음과 같이 정의되는 정제되고 분리된 인핸서 서열의 활성을 가리킨다: 진핵 또는 원핵 세포 내에 적절한 조건에서 도입된 후 상기 인핸서 서열 없이 트랜스펙션된 세포 배양과 비교하여 높은 수준의 단백질 생산을 할 수 있는 활성을 말한다. 상기 인핸서 서열은 또한, 인간 칼리크레인 hK2(적어도 3배 생산 증가) 또는 인간 세르핀 ACT(적어도 2배 생산 증가)과 같은 다른 타입의 재조합 단백질의 생산을 증가시킬 수 있다(실시예 7 참조). 보통, 상기 증가는 1.5 내지 100 배, 바람직하게는 3 내지 10 배 (도 25, 26 참조)이다.

당업자는 본 명세서에 기재된 발명이 특히 기재된 것 외에 변형 및 수정될 수 있음을 인지할 수 있다. 본 발명이 그 정신과 필수적인 특징으로부터 벗어나지 않고 상기 모든 변형과 수정을 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 본 발명은 또한, 본 명세서 내에서 개별적으로 또는 집합적으로 및 어느 혹은 모든 조합 또는 단계나 특징의 어떠한 둘 이상의, 참조되거나 지시된 단계, 특징, 조성물 및 화합물을 모두 포함한다. 본 개시는 그러므로 제한적이 아니라 설명된 모든 국면에서 첨부된 청구항에 의해 지시되는 발명의 범위를 고려해야 하며, 상기 의미와 등가물 범위의 모든 변형이 포함되는 것으로 의도되어 있다.

다양한 참조가 본 명세서 전체에서 인용되고 있으며, 각각은 전체로서 참조에 의해 본 명세서 내에 삽입되어 있다.

앞선 기재가 다음의 실시예를 참조하여 좀더 완전히 이해될 것이다. 그러나하기 실시예는 본 발명을 실시하기 위한 대표적인 방법으로서 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도된 것은 아니다.

도 1은 펩타바디의 개념과 이것이 의도하는 효과를 나타낸 도면이다. 좌측 부는 저밀도 수용체를 발현하는 세포를 나타내며, 펩타바디는 EGFR 경로의 활성화 없이 하나의 모노머에 결합한다. 우측부는 고밀도 수용체를 발현하는 암세포로서 EGFR의 집결(recruitment)이 세포사멸을 유도한다.

도 2는 항-EGFR 펩타바디의 구축과 생산을 나타낸다. 펩타바디 모노머의 개략도는, 인핸서(박테리아 계에서 생산을 증가시키는 서열), 히스티딘 태그(6×His), hCOMP(인간 올리고머 기질 폴리펩타이드의 49 개 아미노산), 힌지(인간 IgA의 19개 아미노산) 및 hEGFR(인간 상피세포 성장인자 전체 서열)의 여러 부분(영역)을 포함한다. EGF 펩타바디 및 이와 관련없는 펩타바디의 아미노산 서열이 또 나타나 있다.

도 3은 펩타바디의 모노머(m p-IRR, m p-EGF) 및 펜타머(P-IRR 및 P-EGF)의 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색 결과를 나타낸다.

도 4는 인간 A431 암세포주에 펩타바디 및 Mab-425가 결합하는 것을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸다.

도 5는 인간 A431 암세포주에 펩타바디 EGF 및 Mab-425 간 경쟁 분석을 나타낸다. 펩타바디 EGF의 농도가 증가하지만 Mab-425 농도(2.5nM)는 고정되었다.

도 6은 펩타바디 EGF(p-EGF) 및 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 여러 농도로 처리한 1, 2 및 3일 후 표피유사(epidermoid) 암세포 A431의 생존율 분석 결과를 나타낸다. 억제%는 대조구와 비교하여 살아있는 세포의 비로 계산된다.

도 7은 펩타바디 EGF(p-EGF) 또는 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 처리한 2일 후 무혈청 DMEM 배지에서 표피유사(epidermoid) 암세포 A431의 인비트로 배양 결과를 가시화한 것이다.

도 8은 펩타바디 EGF(p-EGF) 및 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 여러 농도로 처리한 1, 2 및 3일 후 인간 전립선 암세포 DU 145의 생존율 분석 결과를 나타낸다. 억제%는 대조구와 비교하여 살아있는 세포의 비로 계산된다.

도 9는 펩타바디 EGF(p-EGF) 또는 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 처리한 2일 후 무혈청 DMEM 배지에서 인간 전립선 암세포 DU 145의 인비트로 배양 결과를 가시화한 것이다.

도 10은 펩타바디 EGF(p-EGF) 및 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 여러 농도로 처리한 1, 2 및 3일 후 인간 전립선 암세포 LNCaP의 생존율 분석 결과를 나타낸다. 억제%는 대조구와 비교하여 살아있는 세포의 비로 계산된다.

도 11은 펩타바디 EGF(p-EGF) 또는 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 처리한 2일 후 무혈청 DMEM 배지에서 인간 전립선 암세포 LNCaP의 인비트로 배양 결과를 가시화한 것이다.

도 12는 펩타바디 EGF(p-EGF) 및 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 여러 농도로 처리한 1, 2 및 3일 후 인간 전립선 암세포 PC-3의 생존율 분석 결과를 나타낸다. 억제%는 대조구와 비교하여 살아있는 세포의 비로 계산된다.

도 13은 펩타바디 EGF(p-EGF) 또는 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 처리한 2일 후 무혈청 DMEM 배지에서 인간 전립선 암세포 PC-3의 인비트로 배양 결과를 가시화한 것이다.

도 14는 펩타바디 EGF(p-EGF) 및 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 여러 농도로 처리한 1, 2 및 3일 후 인간 유방암 세포 MCF-7의 생존율 분석 결과를 나타낸다. 억제%는 대조구와 비교하여 살아있는 세포의 비로 계산된다.

도 15는 펩타바디 EGF(p-EGF) 또는 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 처리한 2일 후 무혈청 DMEM 배지에서 인간 유방암 암세포 MCF-7의 인비트로 배양 결과를 가시화한 것이다.

도 16은 펩타바디 EGF(p-EGF) 및 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 여러 농도로 처리한 1, 2 및 3일 후 인간 정상 근육세포의 생존율 분석 결과를 나타낸다. 억제%는 대조구와 비교하여 살아있는 세포의 비로 계산된다.

도 17은 펩타바디 EGF(p-EGF) 또는 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 처리한 2일 후 무혈청 DMEM 배지에서 인간 정상 근육세포의 인비트로 배양 결과를 가시화한 것이다.

도 18은 펩타바디 EGF(p-EGF) 및 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 10 nM 농도로 처리한 1, 3, 6 및 24 시간 후 여러 인간 세포주(A431: 표피유사 암, MCF-7: 인간 유방암, DU 145: 인간 전립선암, UM-UC-3 및 T24: 인간 방광암, Na8: 인간 흑색종)의 생존율 분석 결과를 나타낸다. 억제%는 대조구와 비교하여 살아있는 세포의 비로 계산된다.

도 19는 인간 A431 표피유사 암세포에 대한 펩타바디 EGF(p-EGF) 및 관련없는 펩타바디(p-IRR)의 세포사멸 효과를 측정하기 위한 FACS Annexin V 염색 프로토콜을 나타낸다. 표피유사 A-431 암 세포를 0분(T₀), 30분(T₃₀), 60분(T₆₀), 180분(T₁₈₀) 또는 360분(T₃₆₀) 동안 각각 10 nM의 p-EGF 및 10 nM의 p-IRR 으로 처리하였다. Annexin V-FITC 결합에 있어서의 변화를 FACS로 분석하였다. 도 19A: p-EGF(짙은 선) 및 p-IRR(옅은 선)의 비교, 세포사멸 유도. 도 19B: 세포사멸 유도 펩타 바디의 타임 코스.

도 20은 비환원 또는 환원 조건하에서 펩타바디의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. MDP01: 펩타바디 EGF, MDP03: 펩타바디 GBP, MDP00: 관련없는 펩타바디.

도 21은 MTT 방법을 이용한 암세포에 대한 세포독성 분석 결과를 나타낸다. 암세포는 펩타바디 또는 EGFR에 특이적인 단일클론 항체와 함께 2ug/ml 농도에서 배양하였다.

도 22는 관련없는 펩타바디 MDP00의 DNA 서열 및 단백질 서열을 나타낸다. 이탤릭체에 개시코돈 ATG(메티오닌) 및 정지코돈 TAA(*)이 있고, 짙은 글씨체에 인핸서 펩타이드가, 밑줄친 부분에 His 태그가, 정상 글씨체에 인간 COMP가, 짙은 이탤릭체에 힌지 영역(인간)이 있다.

도 23은 펩타바디 EGF의 DNA 및 단백질 서열을 나타낸다. MDP01: 이탤릭체에서 개시코돈 ATG(메티오닌) 및 정지코돈 TAA(*)이 있고, 짙은 글씨체에 인핸서 펩타이드가, 밑줄친 부분에 His 태그가, 정상 글씨체에 인간 COMP가, 짙은 이탤릭체에 힌지 영역(인간)이 그리고 밑줄친 짙은 글씨체에 상피세포 성장인자(EGF)가 있다.

도 24는 펩타바디 GBP의 DNA 및 단백질 서열을 나타낸다. MDP03: 이탤릭체에서 개시코돈 ATG(메티오닌) 및 정지코돈 TAA(*)이 있고, 짙은 글씨체에 인핸서 펩타이드가, 밑줄친 부분에 His 태그가, 정상 글씨체에 인간 COMP가, 짙은 이탤릭체에 힌지 영역(인간)이, 그리고 밑줄친 짙은 글씨체에 성장결합펩타이드(GBP)가 있다.

도 25는 여러 인핸서에 융합된 데카바디(decabody)의 생산과 관련된 것이다. 박테리아계를 이용하여 데카바디를 생산하고 SDS-PAGE 하여 쿠마시 블루 염색한 결과가 나타나 있다. A는 불용성 분획을, B는 수용성 분획을 나타낸다.

도 26은 여러 인핸서에 융합된 펩타바디의 생산에 관련된 것이다. 박테리아계를 이용하여 데카바디를 생산하고 웨스턴 블롯 분석한 결과가 나타나 있다. 우레아 박테리아 추출물에 대한 항 His 항체를 이용하여 탐지하였다.

도 27은 플라스미드 pQE-09의 맵을 나타낸다.

실시예 1:

펩타바디 항 EGFR 구축 및 생산

인간 상피세포 성장인자를 코딩하는 유전자는 전체 길이 유전자를 포함하고 있는 플라스미드로부터 증폭하고, 적절한 효소로 소화하여 펩타바디 유전자를 포함하는 플라스미드 내로 삽입하였다. 박테리아에서 펩타바디를 37℃, 밤새 유도하고 응집체(inclusion body)로 생산하였다. 대장균 세포를 실온에서 변성 용액(8M 우레아)에서 용해하여 원심분리 후 펩타바디 분자를 친화 크로마토그래피로 정제하고 리폴딩 완충용액에서 직접 희석으로 리폴딩 시켰다(도 3 참조).

종양세포의 EGF 수용체에 펩타바디 EGF를 결합

결합분석은 단일클론 항체 Mab 425(Retuximab®로 사용되는), 펩타바디 EGF 및 관련없는 펩타바디를 이용하여 A431 세포에서 수행되었다. 간단하게, 10000 여개 세포가 96 웰 플레이트 상에서 10 시간 동안 배양 배지/10% FCS 내에서 파종(seeding)되었다. 배지를 제거하고 펩타바디 또는 단일클론 항체를 부착된 세포와 함께 90 분 동안 얼음 위에서 다른 농도로 배양하였다. 세척 후, MAb 425 및 펩타바디를 위하여 각각 퍼옥시다아제가 컨쥬게이션된 폴리클로날-항 Fab 또는 퍼옥시다아제가 컨쥬게이션된 단일클론 항-His를 이용하여 분석하였다(도 4 참조). 6.67 nM MAb 425와 증가하는 양(0.1 내지 200 nM)의 펩타바디 EGF 간 경쟁 분석이 수행되었으며, MAb 425와 펩타바디 EGF가 EGF 수용체의 같은 결합 자리를 놓고 경쟁한 다는 것을 나타내었다(도 5 참조).

실시예 2:

여러 암세포주에 대한 인비트로 작용

생존도 분석을 이용하여 인간 암세포에 대한 펩타바디의 영향이 평가되었다. 간단하게, 2500 세포가 10% 송아지 태아 혈청의 DMEM 내 96 웰 플레이트 상에서 파종되었다. 하루가 지난 후, 배지를 제거하여 펩타바디 존재하에서 OPTIMEM으로 교체하였다. 여러 시간에 세포의 수를 평가하기 위하여 MTT 분석을 이용하여 플레이트를 평가하였다.

표피유사 암세포 A431

도 6은 펩타바디 EGF(p-EGF) 및 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 여러 농도로 처리한 1, 2 및 3일 후 표피유사(epidermoid) 암세포 A431의 생존도 분석 결과를 나타낸다. 억제%는 대조구와 비교하여 살아있는 세포의 비로 계산된다. 도 7은 펩타바디 EGF(p-EGF) 또는 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 처리한 2일 후 무혈청 DMEM 배지에서 표피유사(epidermoid) 암세포 A431의 인비트로 배양 결과를 가시화 한 것이다.

인간 전립선암 DU145

도 8은 펩타바디 EGF(p-EGF) 및 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 여러 농도로 처 리한 1, 2 및 3일 후 인간 전립선 암세포 DU 145의 생존율 분석 결과를 나타낸다. 억제%는 대조구와 비교하여 살아있는 세포의 비로 계산된다. 도 9는 펩타바디 EGF(p-EGF) 또는 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 처리한 2일 후 무혈청 DMEM 배지에서 인간 전립선 암세포 DU 145의 인비트로 배양 결과를 가시화 한 것이다.

인간 전립선암 LNCaP

도 10은 펩타바디 EGF(p-EGF) 및 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 여러 농도로 처리한 1, 2 및 3일 후 인간 전립선 암세포 LNCaP의 생존율 분석 결과를 나타낸다. 억제%는 대조구와 비교하여 살아있는 세포의 비로 계산된다. 도 11은 펩타바디 EGF(p-EGF) 또는 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 처리한 2일 후 무혈청 DMEM 배지에서 인간 전립선 암세포 LNCaP의 인비트로 배양 결과를 가시화한 것이다.

인간 전립선암 PC-3

도 12는 펩타바디 EGF(p-EGF) 및 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 여러 농도로 처리한 1, 2 및 3일 후 인간 전립선 암세포 PC-3의 생존도 분석 결과를 나타낸다. 억제%는 대조구와 비교하여 살아있는 세포의 비로 계산된다. 도 13은 펩타바디 EGF(p-EGF) 또는 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 처리한 2일 후 무혈청 DMEM 배지에서 인간 전립선 암세포 PC-3의 인비트로 배양 결과를 가시화한 것이다.

인간 유방암 MCF-7

도 14는 펩타바디 EGF(p-EGF) 및 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 여러 농도로 처리한 1, 2 및 3일 후 인간 유방암 세포 MCF-7의 생존도 분석 결과를 나타낸다. 억제%는 대조구와 비교하여 살아있는 세포의 비로 계산된다. 도 15는 펩타바디 EGF(p-EGF) 또는 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 처리한 2일 후 무혈청 DMEM 배지에서 인간 유방암 암세포 MCF-7의 인비트로 배양 결과를 가시화한 것이다.

인간 정상 근육세포에 대한 조절

도 16은 펩타바디 EGF(p-EGF) 및 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 여러 농도로 처리한 1, 2 및 3일 후 인간 정상 근육세포의 생존도 분석 결과를 나타낸다. 억제%는 대조구와 비교하여 살아있는 세포의 비로 계산된다. 도 17은 펩타바디 EGF(p-EGF) 또는 관련없는 펩타바디(p-IRR)를 처리한 2일 후 무혈청 DMEM 배지에서 인간 정상 근육세포의 인비트로 배양 결과를 가시화한 것이다.

여러 암세포주에 대한 인비트로 작용

생존도 분석을 이용하여 인간 암세포에 대한 펩타바디의 영향이 평가되었다. 간단하게, 2500 세포가 10% 송아지 태아 혈청의 DMEM 내 96 웰 플레이트 상에서 파종되었다. 하루가 지난 후, 배지를 제거하여 펩타바디 존재하에서 OPTIMEM으로 교체하였다. 하루 이내 여러 시간에 인간 암세포에 대한 10 nM 펩타바디의 영향을 평가하였다(도 18 참조). 또한, 더 낮은 펩타바디의 농도로 3일 동안 평가되었다. 세포의 수를 평가하기 위하여 MTT 분석을 이용하여 매 시간에 플레이트를 평가하였 다. 결론적으로, 관련없는 펩타바디 p-IRR(블랭크)과 비교하여 펩타바디 p-EGF가 존재할 때 강한 세포성장 억제 효과를 관찰하였다(도 7, 9, 11, 13 및 15 참조).

실시예 3:

세포사멸(apoptosis) 탐지

A-431 세포(웰 당 500 ul내 5x10⁵ 개)를 DMEM 배지에서 배양하고 24 시간 후 상기 배지를 10 nM 의 p-EGF 또는 p-IRR를 함유하고 있는 500 ul의 무혈청 OPTIMEM 배지로 교체하였다. 0분과 360 분 사이(T₀, T₃₀, T₆₀, T₁₈₀, T₃₆₀)의 지시된 시점에, 부착되고 부유하는 세포를 모아 세포막 바깥 표면의 포스파티딜세린을 탐지하는 아넥신 V-FITC 세포사멸 탐지 키트(Apotech, Switzerland)를 이용하여 함께 세포사멸 분석을 수행하였다. 간단하게, 세포를 PBS 와 염색 완충용액으로 각각 한번 세척하고 실온에서 15분 동안 50 ul의 아넥신 V-FITC(5ug/ml)로 염색하였다. 염색된 세포 플레이트를 염색 완충용액과 FACS 완충용액(1x PBS, 5% FCS, 0.02% NaN₃)으로 각각 한번 세척하고 200ul의 FACS 완충용액으로 재현탁한 후 FACS로 계수하고 분석하였다. 펩타바디 EGF는 30분 후에 명확하게 A431 세포의 사멸을 유도하였으나, 펩타바디 IRR은 영향이 없었다(도 19a 및 도 19b 참조).

실시예 4:

펩타바디 생산과 리폴딩 프로토콜

- 박테리아에서의 생산: 재조합 단백질의 생산을 위하여 펩타바디를 코딩하는 플라스미드를 가지고 있는 대장균 TG1 스트레인을 사용하였다. 밤새 전배양(pre-culture)하여 얻은 신선한 배양액을 100 ug/mL의 앰피실린이 보충된 250 ml의 2×TY 배지에서 1/100로 희석하여 37℃에서 배양을 시작하였다. 0.6 O.D.(600 nm)에서 250 mM isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG)로 배양액을 유도하였다.

- 정제: 유도한지 16시간 후, 박테리아를 원심분리하여 모으고, 펠렛을 실온에서 두 시간 동안 25 mL의 변성용액(8 M urea, 1x PBS, 10 mM β-mercaptoethanol, pH 7,4)에 재현탁 하였다. 불용성 물질을 10000 g에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛을 모으고 상등액을 250 ul의 Ni² ⁺-NTA 아가로스 비드(Qiagen)와 혼합하였다. 실온에서 로테이션 2시간 후 레진을 세척용액(5 M urea, 1x PBS, 10 mM β-mercaptoethanol, 20 mM Imidazole, pH 7.4)으로 3번 세척하였다. 단백질은 2.5 mL의 일루션 완충용액(5M urea, 1x PBS, 10 mM β-mercaptoethanol, 150 mM Imidazole, pH 7.4)으로 일루션 하였다.

- 리폴딩:

* 1.25 mg의 일루션된 단백질을 250 ml의 리폴딩 완충용액(50 mM Tris, 50 mM NaCl, 10 mM β-mercaptoethanol, 0.1% Triton-X100, pH=8.2)으로 재빠르게 최종 농도가 5ug/ml 이하로 희석하고, 이 상태에서 적어도 6시간 동안 유지하였다.

* 단백질은 다음의 완충용액을 순서로 이용하여 투석하였다(4 L의 배스);

투석 완충용액 1: 50 mM Tris, 50mM NaCl, 1mM b-mercaptoethanol 0.1% Triton- X100, pH=8.2, 6시간,

투석 완충용액 2: 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.1% Triton-X100, pH=8.2, 하룻밤,

투석 완충용액 3: 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.01% Triton-X100, pH=8.2, 4시간,

투석 완충용액 4: 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.001% Triton-X100, pH=8.2, 4시간,

투석 완충용액 5: 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pH=8.2 하룻밤, 거품발생 배스에서.

상기와 같이 리폴딩 된 단백질은 질소 스터링 세포 시스템 및 초원심분리 장치 (Millipore)를 이용하여 최종 부피가 250 ul가 되도록 농축하여 -80℃ 에 보관하였다.

실시예 5:

재료

프라이머는 Microsynth(Switzerland)에서, 분자생물학적 시약(Taq Polymerase, Ligase, Phosphatase)은 Promega(Germany)에서, 발현벡터 pQE-09 및 Ni-NTA 아가로스 컬럼은 Qiagen(Germany)에서 구입하였다.

펩타바디 항-EGFR의 생산

1) 발현벡터의 제조

발현벡터 pQE-09는 Xhol 및 Notl 제한효소를 이용하여 소화(digestion) 하였 다.

2) GBP/EGF/관련없는 펩타바디

성장-억제 펩타이드(GBP)를 코딩하는 합성유전자, Pseudaletia separate의 혈액림프에서 유래된 25 아미노산으로 구성되는 곤충 생체 성장인자(insect biogenic growth factor)가 펩타바디 GBP를 구축하기 위하여 사용되었다.

인간 상피세포 성장인자를 코딩하는 유전자를 전체 길이 유전자를 가지는 플라스미드로부터 PCR을 통하여 증폭하였다.

GBP 또는 EGF는 BglII/Not1으로 소화된 데카바디 분자를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드에 삽입되어 있다. 펩타바디 부분(Cartilage Oligomeric Matrix Protein -COMP-, 힌지, 리간드)은 특이적 프라이머 및 PCR을 이용하여 증폭하였다. 이에 따른 산물은 pQE-90 발현벡터로 삽입하기 위하여 소화하였다.

3) GBP/EGF/관련없는 펩타바디의 생산

펩타바디는 박테라아 세포질에서 응집체로 생산되어 5중체화 된 모노머에 상응하는 안정한 수용성 형태로 리폴딩 되었다.

- 인간 상피세포 성장인자를 코딩하는 유전자는 전체 길이 유전자를 가지는 플라스미드로부터 PCR에 의하여 증폭하였다.

- GBP 또는 EGF 유전자는 본 발명에 따라 변형된 펩타바디 유전자를 가지는 플라스미드에 삽입되었다.

이에 따른 산물은 pQE-90 발현벡터로 삽입하기 위하여 소화하였다.

4) GBP/EGF/관련없는 펩타바디의 생산 및 정제

펩타바디는 박테리아 세포질에서 37℃에서 밤새 유도하여 응집체 형태로 생산되었다. 대장균 세포를 실온에서 2시간 동안 8M 우레아에서 용해하고 원심분리하여 상기 용해물(lysate)을 Ni-NTA 아가로스 비드와 90 분 동안 혼합하였다. 펩타바디 분자는 이미다졸/우레아 용액으로 일루션 하였다.

5) GBP/EGF/관련없는 펩타바디의 리폴딩

펩타바디 분자는 리폴딩 완충용액(50 mM Tris HCl pH 8.3, 0.01 Triton ×100, 10 mM β-mercaptoethanol)에서 최종 농도가 5 ug/ml(희석은 100 배 이상이어야 한다) 되게 직접희석에 의하여 리폴딩한 후 50 mM Tris HCl pH 8.3, 10mM β-mercaptoethanol 에서 24 시간 동안 그리고 50 mM Tris HCl pH 8.3 에서 2일 동안 투석되었다.

6) GBP/EGF/관련없는 펩타바디의 최종 정제

투석이 끝난 펩타바디를 음이온 교환 컬럼에 놓고 염구배(salt gradient)를 이용하여 일루션을 행하였다. 도 20은 그 결과로서, 비환원성 또는 환원성 조건에서 펩타바디를 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내고 있다. MDP01은 펩타바디 EGF를, MDP03은 펩타바디 GBP를, MDP00은 관련없는 펩타바디를 나타낸다.

펩타바디 항-EGFR의 종양세포에 대한 작용

리폴딩된 펩타바디의 세포독성 효과를 평가하기 위하여 여러 종양세포(A431: 인간 표피유사 암세포, DU-145 및 PC-3: 인간 전립선 종양 세포)에 대하여 테스트 하였다. 도 21은 그 결과로서, MTT 분석을 이용하여 암세포에 대한 세포독성 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 암세포는 펩타바디, 또는 EGFR에 특이적인 단일클론 항체와 2ug/ml의 농도에서 배양하였다. MDP01 및 MDP03이 EGF 수용체에 결합하는 퍼센트는 EGF 수용체에 특이적인 단일클론 항체 MAb 425보다 상당히 높은 것으로 나타났다(데이타 없음). 펩타바디 존재하에서 A431 및 DU145 암세포주의 증식이 감소하고, 세포사멸이 증가하는 것이 관찰되었지만 PC-3은 MDP03에 대하여 덜 민감하였다.

결론적으로, 펩타바디는 단일클론 항체 425보다 암세포의 사멸을 중재하는 효과가 강한 것으로 나타났다.

실시예 6:

펩타바디 인핸서 서열

여러 버전의 펩타바디가 과거 동안 개발되어 왔다. 그러나, 그것들 대부분이 의미있게 생산되지 않기 때문에 펩타바디/데카바디 생산에 있어 많은 다양성이 관찰되었다.

실시예 7:

단백질 레벨에 대한 인핸서 서열의 평가가 다른 단백질들을 이용하여 수행되었다. 인핸서 서열(E0, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, 도 25 및 도 26 참조)이 인간 칼리크레인 2 유전자(human kallikrein 2 gene) 또는 인간 세르핀 a1-항키모트립신 유전자(human serpin a1-antichymotrypsin gene)의 N 말단에 융합되었고, IPTG 유도 후 37℃에서 하루 밤 배양하여 단백질 레벨을 평가하였다. 인핸서 서열이 인간 칼리크레인 hK2(적어도 3배) 및 인간 세르핀 ACT(적어도 2배)의 생산을 증가시킨다.

<110> Universite de Lausanne <120> PEPTABODIES FOR CANCER TREATMENT <130> IPF6968 <150> US 60/460,490 <151> 2003-04-04 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence peptabody EGF MDP01 <400> 1 atgtatagct ttgaagatct ggctagccat catcatcacc atcatggaga cctgggcccg 60 cagatgctgc gtgaactgca ggaaaccaac gctgctctgc aggacgttcg tgactacctg 120 cgtcagctgg ttcgtgaaat caccttcctg aaaaacaccg ttatggaatg cgacgcttgc 180 ggtatgcagc agactagtcc gcctactccg ccaactccgt ctccgtctac tccgccaact 240 ccgtctccga gatccaattc tgactctgaa tgcccattgt ctcacgacgg ttactgcttg 300 cacgacggtg tttgcatgta catcgaagct ctggacaaat acgcttgcaa ctgcgttgtt 360 ggttacatcg gtgaacgttg ccaataccga gatctgaaat ggtgggaact gcgttaa 417 <210> 2 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein sequence peptabody EGF MDP01 <400> 2 Met Tyr Ser Phe Glu Asp Leu Ala Ser His His His His His His Gly 1 5 10 15 Asp Leu Gly Pro Gln Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala 20 25 30 Leu Gln Asp Val Arg Asp Tyr Leu Arg Gln Leu Val Arg Glu Ile Thr 35 40 45 Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys Asp Ala Cys Gly Met Gln Gln 50 55 60 Thr Ser Pro Pro Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr 65 70 75 80 Pro Ser Pro Arg Ser Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp 85 90 95 Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp 100 105 110 Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln 115 120 125 Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg 130 135 <210> 3 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence peptabody GBP MDP03 <400> 3 atgtatagct ttgaagatct ggctagccat catcatcacc atcatggaga cctgggcccg 60 cagatgctgc gtgaactgca ggaaaccaac gctgctctgc aggacgttcg tgactacctg 120 cgtcagctgg ttcgtgaaat caccttcctg aaaaacaccg ttatggaatg cgacgcttgc 180 ggtatgcagc agactagtcc gcctactccg ccaactccgt ctccgtctac tccgccaact 240 ccgtctccga gatctgaaaa cttttccggc ggctgcgtgg cgggctatat gcgtaccccg 300 gatggccgtt gcaaaccgac cttttatcag taa 333 <210> 4 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein sequence peptabody GBP MDP03 <400> 4 Met Tyr Ser Phe Glu Asp Leu Ala Ser His His His His His His Gly 1 5 10 15 Asp Leu Gly Pro Gln Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala 20 25 30 Leu Gln Asp Val Arg Asp Tyr Leu Arg Gln Leu Val Arg Glu Ile Thr 35 40 45 Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys Asp Ala Cys Gly Met Gln Gln 50 55 60 Thr Ser Pro Pro Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr 65 70 75 80 Pro Ser Pro Arg Ser Glu Asn Phe Ser Gly Gly Cys Val Ala Gly Tyr 85 90 95 Met Arg Thr Pro Asp Gly Arg Cys Lys Pro Thr Phe Tyr Gln 100 105 110

Claims

(a) 인간화된(humanized) 또는 인간 연골 올리고머 기질 폴리펩타이드(human cartilage oligomer matrix polypeptide)의 일부분;

(b) 힌지(hinge)의 일부분; 및

(c) 3차원 구조를 가지는 모티프를 적어도 포함하는 상피세포 성장인자 수용체 리간드를 적어도 포함하는,

상피세포 성장인자 수용체(EGFR)의 구성원(a member)에 바인딩하는 분리된 재조합 융합 펩타바디로서, 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디는 상피세포 성장인자 수용체를 발현하는 세포에서 세포사를 유도할 수 있는 분리된 재조합 융합 펩타바디.
제1항에 있어서, 상기 상피세포 성장인자 수용체의 구성원이 ErbB1, ErbB3, 또는 ErbB4인 것을 특징으로 하는 분리된 재조합 융합 펩타바디.
제2항에 있어서, 상기 상피세포 성장인자 수용체의 구성원이 ErbB1인 것을 특징으로 하는 분리된 재조합 융합 펩타바디.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 온전히 인간 또는 인간화된 것을 특징으로 하는 분리된 재조합 융합 펩타바디.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디가 다중체(multimeric)인 것을 특징으로 하는 분리된 재조합 융합 펩타바디.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지의 일부분이 면역글로불린 폴리펩타이드의 부분이고, 인간화된 연골 올리고머 기질 폴리펩타이드 부분의 C 말단에 위치해 있는 것을 특징으로 하는 분리된 재조합 융합 펩타바디.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상피세포 성장인자 수용체 리간드가 상기 힌지 부분의 C 말단에 위치해 있는 것을 특징으로 하는 분리된 재조합 융합 펩타바디.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화된 연골 올리고머 기 질 폴리펩타이드 부분의 N 말단에 인핸서 서열이 위치하도록 인핸서 서열을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 재조합 융합 펩타바디.
제8항에 있어서, 상기 인핸서 서열은 YSFE, YSFED, YSFEDL, YSFEDLY, YSFEDLYR 및 YSFEDLYRR을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 재조합 융합 펩타바디.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상피세포 성장인자 수용체 리간드는,

(a) 상피세포 성장인자 폴리펩타이드, 그 단편들 또는 변이체들,

(b) 성장 억제 펩타이드, 그 단편들 또는 변이체들,

(c) TGF 알파 폴리펩타이드, 그 단편들 또는 변이체들,

(d) 형질세포 확산 펩타이드(plasmocyte spreading peptide), 그 단편들 또는 변이체들,

(e) 마비(paralytic peptide) 펩타이드, 그 단편들 또는 변이체들,

(f) 심장 작용 펩타이드, 그 단편들 또는 변이체들,

(g) 앰피레귤린(amphiregulin) 폴리펩타이드, 그 단편들 또는 변이체들,

(h) 헤파린-바인딩 상피세포 성장인자 유사(heparin-binding epidermal growth factor-like) 폴리펩타이드, 그 단편들 또는 변이체들,

(i) 베타세룰린(betacellulin) 폴리펩타이드, 그 단편들 또는 변이체들, 또는

(j) 바이러스 EGF 유사 폴리펩타이드, 그 단편들 또는 변이체들을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 재조합 융합 펩타바디.
제10항에 있어서, 상기 상피세포 성장인자 수용체 리간드는 전체 길이 서열로 존재하는 것을 특징으로 하는 분리된 재조합 융합 펩타바디.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리히스티딘 태그 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 재조합 융합 펩타바디.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 이펙터(effector) 영역을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 재조합 융합 펩타바디.
제13항에 있어서, 상기 이펙터 영역은 사이토톡신을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 재조합 융합 펩타바디.
제13항에 있어서, 상기 이펙터 영역은 탐지부(detection moiety)을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 재조합 융합 펩타바디.
제15항에 있어서, 상기 탐지부는 형광인 것을 특징으로 하는 분리된 재조합 융합 펩타바디.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 분리된 재조합 융합 펩타바디를 코딩하는 분리되고 정제된 DNA 서열.
제17항의 분리되고 정제된 DNA 서열의 적어도 한 카피를 포함하는 벡터.
제18항에 있어서, 상기 분리되고 정제된 DNA 분자에 작동되게 연결된 프로모 터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제17항의 분리되고 정제된 DNA 분자를 발현할 수 있는 원핵 또는 진핵의 숙주 세포.
활성 성분으로서 약학적으로 유효한 양의 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 분리된 재조합 융합 펩타바디를, 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 어쥬번트와 선택적으로 조합하여 포함하는 약학적 조성물.
암 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 제21항의 약학적 조성물의 용도.
제22항에 있어서, 상기 암은 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 지방육종(liposarcoma), 신경내분비종(neuroendocrine tumor), 중피종(mesothelioma), 신경초종(schwanoma), 수막종(meningioma), 샘암종(adenocarcinoma), 흑색종(melanoma), 백혈병(leukemia), 악성 림프종(lymphoid malignancy), 편평세포암종(squamous cell cancer), 편평상피세포암(epithelial squamous cell cancer), 폐암(lung cancer), 소세포폐암(small-cell lung cancer), 비소세포폐암(non-small cell lung cancer), 폐샘암종(adenocarcinoma of the lung), 폐편평암종(squamous carcinoma of the lung), 복막종(cancer of the peritoneum), 간세포성종(hepatocellular cancer), 위암종(gastric or stomach cancer), 위장관종(gastrointestinal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 아교모세포종(glioblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간암(hepatoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁암(endometrial or uterine carcinoma), 침샘암(salivary gland carcinoma), 신장암(kidney and renal cancer), 전립선암(prostate cancer), 외음암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간암종(hepatic carcinoma), 항문암종(anal carcinoma), 음경암종(penile carcinoma), 고환암(testicular cancer), 식도정맥류암(esophageal cancer), 담도암(biliary tract) 및 두부 및 경부암(head and neck cancer)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 용도.
제23항에 있어서, 상기 암은 두부암(head cancer), 경부암(neck cancer), 방광암(bladder cancer) 또는 흑색종(melanoma)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물 의 용도.
환자에게 제21항의 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암 치료 또는 예방방법으로서, 상기 암은 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 지방육종(liposarcoma), 신경내분비종(neuroendocrine tumor), 중피종(mesothelioma), 신경초종(schwanoma), 수막종(meningioma), 샘암종(adenocarcinoma), 흑색종(melanoma), 백혈병(leukemia), 악성 림프종(lymphoid malignancy), 편평세포암종(squamous cell cancer), 편평상피세포암(epithelial squamous cell cancer), 폐암(lung cancer), 소세포폐암(small-cell lung cancer), 비소세포폐암(non-small cell lung cancer), 폐샘암종(adenocarcinoma of the lung), 폐편평암종(squamous carcinoma of the lung), 복막종(cancer of the peritoneum), 간세포성종(hepatocellular cancer), 위암종(gastric or stomach cancer), 위장관종(gastrointestinal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 아교모세포종(glioblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간암(hepatoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 자궁내막 또는 자궁암(endometrial or uterine carcinoma), 침샘암(salivary gland carcinoma), 신장암(kidney and renal cancer), 전립선암(prostate cancer), 외음암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간암종(hepatic carcinoma), 항문암종(anal carcinoma), 음경암종(penile carcinoma), 고환암(testicular cancer), 식도정맥류암(esophageal cancer), 담도암(biliary tract) 및 두부 및 경부암(head and neck cancer)으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 상피세포 성장인자 수용체를 발현하는 암의 치료 또는 예방방법.
제25항에 있어서, 상기 암은 두부암(head cancer), 경부암(neck cancer), 방광암(bladder cancer) 또는 흑색종(melanoma)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 분리된 재조합 융합 펩타바디와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포사멸(apoptosis) 및/또는 세포괴사(necrosis) 유도 방법.
제27항에 있어서, 상기 세포는 암세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 분리된 재조합 융합 펩타바디와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 증식 억제 방법.
제29항에 있어서, 상기 세포는 암세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 또는 제16항의 분리된 재조합 융합 펩타바디를 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 어쥬번트와 선택적으로 조합하여 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암 진단방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 분리된 재조합 융합 펩타바디와, 선택적으로 시약 및/또는 사용 지침을 포함하는, 인간 환자에서 상피세포 성장인자 수용체를 발현하는 암 치료용 키트.
제32항에 있어서, 화학요법제, 항 상피세포 성장인자 수용체 항체, 방사능면역요법제 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 부가적인 항암제를 포함하는 별도의 약학적 용량 형태를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 키트.
제15항 또는 제16항의 분리된 재조합 융합 펩타바디와, 선택적으로 시약 및/또는 사용 지침을 포함하는, 인간 환자에서 상피세포 성장인자 수용체를 발현하는 암 진단용 키트.
a) 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 분리된 재조합 융합 펩타바디를 코딩하는, 분리되고 정제된 DNA 분자를 구축하는 단계;

b) 적절한 조건하에서 세포계에서 상기 분리되고 정제된 DNA 분자의 발현을 허용하는 단계; 및

c) 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디를 회수하는 단계를 포함하는,

제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 분리된 재조합 융합 펩타바디를 생산하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 세포발현계는 원핵세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 적절한 조건은 2-40 시간 동안 10-40℃의 온도에서 상기 세포발현계를 배양하는 것인 방법.
제37항에 있어서, 상기 적절한 조건은 8-16 시간 동안 37℃의 온도에서 배양하는 것인 방법.
제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 c) 단계는 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디를 세포발현계로부터 분리하고 이어 정제 및 리폴딩 과정을 수행하여 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제39항에 있어서, 상기 정제 과정은 환원제의 존재하에서 수행되어 오염물을 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
제39항에 있어서, 상기 리폴딩 과정은 리폴딩 완충용액에서 직접 희석에 의하여 수행되고 추가로 시리얼 투석(serial dialysis) 과정을 거치는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제41항에 있어서, 상기 리폴딩 완충용액에서의 직접 희석은 분리된 재조합 융합 펩타바디의 최종 농도가 300nM 이하로 되게 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제41항에 있어서, 상기 시리얼 투석(serial dialysis) 과정은 적어도 두 개의 다른 투석 완충용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제41항에 있어서, 상기 리폴딩 과정은 상기 분리된 재조합 융합 펩타바디의 농축 전에 산화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
단백질 생산을 증가시키는 활성을 가지는, 상기 정제되고 분리된 인핸서 서열로서, 상기 서열이 YSFE, YSFED, YSFEDL, YSFEDLY, YSFEDLYR, YSFEDLYRR, 이의 단편, 이의 키메릭 분자 및 이의 변이체를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정제되고 분리된 인핸서 서열.