CN109641066B - 新的IgG结合肽和含有该肽的多功能抗原结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本文公开了包含至少一种多功能重组蛋白支架和至少一种抗原特异性结合结构域的多功能抗原结合蛋白。还提供了编码该多功能抗原结合蛋白的多核苷酸、含有所公开的多核苷酸的载体以及经遗传工程改造以表达该多核苷酸的细胞。公开了使用该多功能抗原结合蛋白的方法。

Description

新的IgG结合肽和含有该肽的多功能抗原结合蛋白
相关申请的引用
本申请要求享有2016年6月17日提交的美国临时专利申请号62/351,335的权益，其全部内容结合于本文中作为参考。
政府权利
本发明是在国立卫生研究院(NIH)授予的经费号R01CA149425-03的政府资助下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本文公开了新的IgG结合肽和包含该肽的多功能抗原结合蛋白。
背景技术
在20世纪70年代中期，由于杂交瘤技术实现了单克隆抗体的长期杂交瘤生产，因此科学家和临床医生一直在努力获得其治疗疾病的治疗潜力。多年来，科学已经推动了抗体技术的前沿，允许开发嵌合抗体、人源化抗体和免疫功能性抗体片段如Fab和双抗体。现今，有许多抗体治疗剂用于治疗如癌症、传染病和自身免疫性病症的疾病，仅举几例。除了现有的治疗方法之外，更多的治疗方法即将出现，而科学界正在兴奋地开发新的和/或更有效的基于抗体的治疗方法。
尽管近年来已证明抗体治疗剂是成功的，至少有25种这样的治疗剂已获得FDA批准，但它们并非没有缺点。抗体的一些缺点包括其大尺寸(约150kD)并且它们通常需要合适的翻译后加工。抗体的大尺寸可能降低其靶向某些疾病的能力，疾病如癌症或神经性病症，其可能需要穿过血脑屏障。许多抗体需要通过真核细胞进行的合适的翻译后加工的事实通常要求抗体治疗剂产生于哺乳动物细胞培养物中并随后从其中纯化，相对于在细菌中产生的蛋白而言，这可能会阻碍总抗体产生并增加生产成本。
为了克服抗体的一些缺点，已经开发了非抗体合成蛋白。非抗体合成蛋白的一些实例包括抗体片段，如Fab、scFv、双抗体、
Figure BDA0001970594780000021
和
Figure BDA0001970594780000022
仅举几例。这些蛋白虽然比抗体小并对某些应用适用，但通常不具有与通过免疫效应细胞表达的抗体受体如Fc受体进行相互作用的能力，这种相互作用能增强免疫***的活性。
发明内容
本文公开了结合于IgG的新的多功能重组蛋白支架。多功能重组蛋白支架能够包含多肽、由多肽组成或基本上由多肽组成，该多肽至少：(a)与如SEQ ID NO:28中所示的huZZ具有90％的同一性或(b)与如SEQ ID NO:29中所示的huZZ1具有90％的同一性。
本文还公开了多功能抗原结合蛋白，其包含结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架和至少一种抗原特异性结合结构域，其中结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架包含含有使肽能够模拟蛋白A的IgG结合结构域的突变的人多肽，并且其中至少一个抗原特异性结合结构域包含抗原特异性肽、抗原特异性抗体或其片段，或它们的组合。
所公开的多功能抗原结合蛋白由至少一种可以与至少一种称为抗原特异性结合结构域的抗原特异性多肽序列连接以形成多功能抗原结合蛋白的多功能重组蛋白支架或框架区段制成。本文描述的重组蛋白支架可以赋予所需的功能特征，如结合抗体的片段可结晶(Fc)区的能力，从而使多功能抗原结合蛋白能够同时结合特定抗原和Fc受体。
结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架包括这样的人多肽：其含有使肽能够模拟具有结合某些抗体同种型的能力的蛋白A(一种金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)细胞壁组分)的IgG结合结构域的突变。在一些实施方式中，结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架包含人源化蛋白A IgG结合结构域。在一些实施方式中，结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架可以包含α2-巨球蛋白受体相关蛋白的一部分。结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架可以衍生自包含SEQ ID NO:27的α2-巨球蛋白受体相关蛋白的未突变部分。因此，多功能抗原结合蛋白可以包含结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架和至少一个抗原特异性结合结构域，所述结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架衍生自包含SEQ ID NO:27的α2-巨球蛋白受体相关蛋白的未突变部分。可替代地，结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架可以衍生自α2-巨球蛋白受体相关蛋白的突变部分。例如，至少一种多功能重组蛋白支架可以包含与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽或与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽。
多功能抗原结合蛋白可以包含结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架和至少一个抗原特异性结合结构域，所述结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架包含与如SEQID NO:28中所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽。在一些方面中，结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架包含与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽。在一些方面中，抗原特异性结合结构域可以是抗原特异性肽，包含与SEQ ID NO:12至24中的任一项为至少90％的同一性的多肽。在其他方面中，抗原特异性结合结构域可以是抗原特异性抗体，包括与如SEQ ID NO:30所示的4D5scFv为至少90％的同一性的多肽。
本文还提供了编码所公开的多功能抗原结合蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸可以编码包含与如SEQ ID NO:31至36为至少90％的同一性的氨基酸序列、由如SEQ ID NO:31至36为至少90％的同一性的氨基酸序列组成或基本上由如SEQ ID NO:31至36为至少90％的同一性的氨基酸序列组成的多功能抗原结合蛋白。
本文还提供了编码多核苷酸的载体和经遗传工程改造以表达所公开的载体的细胞。为简洁起见，仅提供了具有所描述的多核苷酸序列的有限数量的载体；然而，用于表达公开的抗原结合蛋白的可替代的载体和多核苷酸组合对于本领域理解遗传密码的简并性的技术人员而言将是显而易见的。另外，充分设想的是所公开的载体可以用于转化原核细胞和/或真核细胞以促进所描述的抗原结合蛋白的表达。在一些实施方式中，所描述的载体用于促进细菌如大肠杆菌中的蛋白表达。虽然任何大肠杆菌菌株都可以用于表达本文所描述的蛋白，但一些优选的菌株包括：BL21(DE3)，
Figure BDA0001970594780000041
(DE3)-RP，
Figure BDA0001970594780000042
(DE3)-RIL，BL21-(DE3)-pLysS(Stratagene)。真核细胞也可以与所描述的载体一起使用以促进蛋白表达。虽然本领域技术人员会认识到多种真核细胞将会适合于此目的，但一些优选的实施方式包括哺乳动物细胞和昆虫细胞。例如，在一个实施方式中，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞可以与所描述的载体一起使用以促进本文提供的多功能抗原结合蛋白的表达。在替代实施方式中，昆虫细胞如Sf9细胞或S2细胞可以与所描述的载体一起使用以促进本文提供的多功能抗原结合蛋白的表达。此外，本领域技术人员会理解的是，本文未明确公开的可替代的载体可以用于表达所描述的多功能抗原结合蛋白或复制编码所描述的多功能抗原结合蛋白的核酸的相同目的。
本文还描述了包含任何公开的多功能抗原结合蛋白和药用载体的组合物。此类组合物可以用于将所描述的抗原结合蛋白给予至受试者，或储存，或维持所描述的抗原结合蛋白。任何的所描述的抗原结合蛋白都可以用于产生这样的组合物，其可以包括一种以上公开的抗原结合蛋白。此外，此类组合物可以包括其他试剂，如治疗剂、防腐剂、抗微生物剂等。
本文还提供了使用所描述的多功能抗原结合蛋白的方法。例如，多功能抗原结合蛋白可以用于治疗或预防受试者中的疾病。所描述的治疗或预防疾病的方法可以用于向需要这种治疗的受试者给予具有多功能抗原结合蛋白的组合物。
本文还公开了使用本文公开的多功能抗原结合蛋白检测所关注的抗原的方法。此类方法适用于在受试者中、在从受试者获得的样品中离体或体外的抗原检测。
附图说明
当结合附图阅读时，将进一步理解发明内容以及以下的详细描述。为了举例说明所公开的组合物和方法的目的，在附图中显示了组合物和方法的示例性实施方式；然而，组合物和方法并不限于所公开的具体实施方式。
在附图中：
图1A图示说明了蛋白A中的IgG结合结构域(PDB:IDEE的G链，暗色)与α2-巨球蛋白受体相关蛋白(PDB:2FCW，亮色)中的α-螺旋区的三维结构比对，而图1B图示说明了2FCW模板与示例性huZZ结构域的比对。
图2，包括图2A-图2D，图示说明了多功能抗原结合蛋白与T6-17的FACS结合。将10μg含有与4D5scFv连接的细菌ZZ(图2B)，huZZ(图2C)或1V66(图2D)序列的多功能抗原结合蛋白与表达HER2的T6-17细胞一起培养。洗涤后，然后将细胞与FITC标记的抗小鼠二级抗体一起培养。在图2A中，仅使用了二级抗体。只有当4D5scFvZZ或4D5scFv-huZZ呈递于细胞时才能捕获FITC标记的抗体。
图3，包括图3A-图3B，图示说明了huZZ，而非野生型2FCW序列，结合于抗体的Fc区。不同的抗体分子h4D5(上图)，m4D5(中图)和mF77(下图)固定于芯片上并容许以指定的浓度与(图3A)4D5scFv-huZZ或(图3B)4D5scFv-2FCW(WT)相互作用(图3A)。检测到h4D5和mF77与h4D5scFv-huZZ的相互作用。
图4，包括图4A-图4C，图示说明了huZZ可以在溶液中与Fc形成复合物。(图4A)293T表达的4D5scFv-huZZ与h4D5(左)、m4D5(中)和mF77(右)的结合。(图4B)来自尺寸排阻FPLC柱Superdex 200的4D5scFv-huZZ(绿线)、Fc(红线)和4D5scFv-huZZ与Fc的混合物的洗脱。(图4C)4D5scFv-huZZ和Fc混合物洗脱的4-11级分通过SDS-PAGE进行分析。在这些级分中都可以看到4D5scFv-huZZ和Fc条带。
图5，包括图5A-图5B，图示说明了含有huZZ的多功能抗原结合蛋白具有与含有原始ZZ的多功能抗原结合蛋白相当的体外和体内活性。(图5A)T6-17细胞在4D5scFv-ZZ-mIFN或4D5scFv-huZZ-mIFN的存在下的增殖。(图5B)4D5scFv-ZZ-mIFN和4D5scFv-huZZ-mIFN在植入BALB/c中的CT26-HER2肿瘤中的体内活性。
具体实施方式
通过参考结合附图的以下详细描述，可以更容易理解所公开的组合物和方法，附图组成了本公开的一部分。应该理解的是，所公开的组合物和方法并不限于本文描述和/或示出的具体组合物和方法，并且本文使用的术语仅出于通过举例的方式描述具体实施方式的目的，并非旨在限制要求保护的组合物和方法。
除非另外明确说明，否则关于可能的机制或作用模式或改进原因的任何描述仅仅是说明性的，并且所公开的组合物和方法并不受任何此类所提出的正确性或不正确性或改进的行为或理由的方式限制。
在整个这份文本中，描述涉及组合物和使用所述组合物的方法。在本公开描述或要求保护与组合物相关的特征或实施方式的情况下，这样的特征或实施方式同样适用于使用所述组合物的方法。同样的是，在本公开描述或要求保护与使用组合物的方法相关的特征或实施方式的情况下，这样的特征或实施方式同样适用于组合物。
除非上下文另有明确规定，否则对具体数值的引用至少包括具体数值。当表达值的一个范围时，则另一个实施方式包括从一个具体值和/或到另一个具体值。此外，对范围中的值的引用包括范围内的每个值。所有范围都是包括性和可组合的。
当通过使用先行词“约”将这些值表示为近似值时，则应该理解为具体值组成了另一个实施方式。
当用于引用数值范围、截止值或特定值时，术语“约”用于表示所列举的值可以从所列出的值变化多达10％。由于本文使用的许多数值是通过实验确定的，本领域技术人员应该理解的是，在不同的实验中，这种测定可能会发生变化，并且经常次数也会变化。由于这种固有的变化，本文中使用的这些值不应被认为是不适当的限制。因此，术语“约”用于包括指定的值±10％或更小的变化，±5％或更小的变化，±1％或更小的变化，±0.5％或更小的变化，或±0.1％的变化。应当理解的是，为了清楚起见，在单独的实施方式的上下文中描述公开的组合物和方法的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的公开的组合物和方法的各种特征也可以单独提供或以任何亚组合提供。
正如在本文中所使用的，单数形式“一个(a)”，“一种(an)”和“该(the)”包括复数形式。
在整个说明书和权利要求中使用了与说明书的各方面有关的各种术语。除非另有说明，否则这些术语都将提供本领域中它们的普通含义。其他具体定义的术语应以与本文提供的定义一致的方式解释。
术语“包含(comprising)”旨在包括术语“基本上由......组成(consistingessentially of)”和“由......组成(consisting of)”所涵盖的实例。术语“基本上由......组成”旨在包括术语“由......组成”所涵盖的实例。
正如在本文中所使用的，术语“细胞毒性剂”或“细胞抑制剂”是指抑制细胞的生物学过程或降低细胞的活力或增殖潜力的试剂。细胞毒性剂或细胞抑制剂可以以多种方式起作用，例如，但不限于，通过诱导DNA损伤、诱导细胞周期阻滞、抑制DNA合成、抑制转录、抑制翻译或蛋白合成、抑制细胞***或诱导细胞凋亡。正如在本文中所使用的，术语“化学治疗剂”是指优先杀死、抑制肿瘤细胞的生长或抑制肿瘤细胞的转移或破坏快速增殖细胞的细胞周期的细胞毒性剂、细胞抑制剂和抗肿瘤剂。化学治疗剂包括，但不限于，合成化合物、天然和重组细菌毒素、天然和重组真菌毒素、天然和重组植物毒素、可裂变核素和放射性核素。化学治疗剂的具体实例包括，但不限于，商陆抗病毒蛋白、相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒素(ricin)及其每个A链、地肤子皂苷(苦瓜蛋白，momordin)、皂草素(saporin)、异株泻根毒蛋白(bryodin)1、三角梅核糖体失活蛋白(bouganin)、白树毒素(gelonin)、白喉毒素(Diphtheria toxin)、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、志贺毒素(Shigatoxin)、卡奇霉素(calicheamicin)、美登醇(maytansinoid)、铅-212、铋-212、砹-211、碘-131、钪-47、铼-186、铼-188、钇-90、碘-123、碘-124、碘-125、溴-77、铟-111、硼-10、锕系元素、六甲蜜胺(altretamine)、放线菌素D、普卡霉素(plicamycin)、嘌呤霉素、短杆菌肽D、多柔比星、秋水仙碱、细胞松弛素B、环磷酰胺、依米丁(吐根碱，emetine)、美登素(maytansine)、安吖啶(amsacrine)、顺铂、依托泊苷、依托泊苷邻醌(etoposideorthoquinone)、替尼泊苷(teniposide)、柔红霉素(daunorubicin)、吉西他滨(gemcitabine)、多柔比星、米托蒽醌、二蒽、博来霉素、甲氨蝶呤、长春地辛、阿霉素、长春新碱、长春碱、BCNU、紫杉醇、特罗凯(tarceva)、阿瓦斯汀(avastin)、丝裂霉素(mitomycin)、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺和某些细胞因子如TNF-α和TNF-β。
“多核苷酸”，同义地称为“核酸分子”或“核酸”，是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链DNA、作为单链和双链区域的混合物的DNA、单链和双链RNA以及作为单链和双链区域的混合物的RNA、包含DNA和RNA的杂种分子，其可以是单链的或者更通常是双链的或单链和双链区的混合物。另外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，以及具有出于稳定性或其他原因而经修饰的主链的DNA或RNA。例如，“修饰的”碱基包括三苯甲基化的碱基和不常见的碱基，例如肌苷。可以对DNA和RNA进行各种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常在自然界中发现的化学、酶促或代谢修饰形式的多核苷酸，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”还包括相对短的核酸链，通常称为寡核苷酸。
本文所用的术语“百分比同一的”、“序列同一性”和“百分比同一性”是指两种或更多种多肽之间相同(即，同一的)的氨基酸百分比。两个或多个多肽之间的序列同一性可以通过比对多肽的氨基酸序列并对所比对的多肽中含有相同氨基酸残基的位置数进行评分并将其与比对的多肽中不同位置的数目进行比较而确定。多肽可以在位置上不同，例如，通过含有不同的氨基酸(即，取代或突变)或缺少氨基酸(即，一个或两个多肽中的氨基酸***或氨基酸缺失)。序列同一性可以通过将含有相同氨基酸残基的位置数除以多肽中氨基酸残基总数而计算。例如，百分比同一性可以通过将包含相同氨基酸残基的位置数除以多肽中的氨基酸残基总数乘以100而计算。
关于核酸或氨基酸序列的“基本上相同”是指两个或更多个序列之间至少约65％的同一性。优选术语是指两个或更多个序列之间至少约70％的同一性、更优选至少约75％的同一性、更优选至少约80％的同一性、更优选至少约85％的同一性、更优选至少约90％的同一性、更优选至少约91％的同一性、更优选至少约92％的同一性、更优选至少约93％的同一性、更优选至少约94％的同一性、更优选至少约95％的同一性、更多优选至少约96％的同一性、更优选至少约97％的同一性、更优选至少约98％的同一性、更优选至少约99％或更高的同一性。这种同一性可以使用mBLAST算法(Altschul et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-8；Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-7)确定。
正如在本文中所使用的，“与…至少90％的同一性”包括与所参考的条目(例如，生物学序列)至少90％的同一性、91％的同一性、92％的同一性、93％的同一性、94％的同一性、95％的同一性、96％的同一性、97％的同一性、98的同一性、99％的同一性或100％的同一性。
“载体”是复制子，如质粒、噬菌体、粘粒或病毒，其中可以可操作地***另一个核酸区段，从而引起区段的复制或表达。
术语“可操作地连接”或“可操作地***”是指将对于编码序列的表达所必需的调节序列置于相对于编码序列的适当位置的核酸分子中，而使之可以表达编码序列。举例而言，当启动子可以控制编码序列的转录或表达时，启动子与编码序列就可操作地连接。编码序列可以在正义或反义方向与启动子或调节序列可操作地连接。术语“可操作地连接”有时应用于表达载体中的其他转录控制元件(例如，增强子)的排列。
当已将这种DNA引入细胞内时，细胞就已被外源核酸或异源核酸如DNA“转化”或“转染”。转化DNA可以或不可以整合(共价连接)到细胞的基因组中。例如，在原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，转化DNA可以保持于游离元件如质粒上。关于真核细胞，通过真核细胞建立由含有转化DNA的子细胞群组成的细胞系或克隆的能力而验证稳定转化的细胞或“稳定细胞”。“克隆”是通过有丝***从单个细胞或共同祖先衍生的细胞群体。“细胞系”是可以在体外稳定生长许多代的原代细胞的克隆。
“生物分子”包括蛋白、多肽、核酸、脂质、单糖、多糖、及其所有片段、类似物、同系物、缀合物和衍生物。
术语“表达”和“生产”在本文中同义使用，并是指基因产物的生物合成。这些术语涵盖将基因转录成RNA。这些术语还包括将RNA翻译成一种或多种多肽，并进一步包括所有天然存在的转录后和翻译后修饰。抗体或抗原结合片段的表达/生产可以是在细胞的细胞质内，和/或进入细胞外环境(milieu)中，如细胞培养物的生长培养基中。
术语“处治(treating)”或“治疗(treatment)”是指在伤害、病理或病症的减弱或改善方面的任何成功或成功的标志，包括任何客观或主观参数，如症状的减轻、缓解、减轻或使伤害、病理或病症对患者更容易忍受，退化或衰退的速度减慢，使退化的最终点不太衰弱，改善受试者的身体或精神健康，或延长生存期。症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数；包括身体检查、神经***检查和/或精神病学评价的结果。
“有效量”和“治疗有效量”在本文中可以互换使用，并是指如本文所描述的有效实现特定生物学或治疗结果，如但不限于本文所公开的、所描述的或所示例的生物或治疗结果的抗体、抗原结合片段或抗体组合物的量。治疗有效量的抗体或其抗原结合片段可以根据各种因素而变化，因素如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体或其抗原结合片段引发个体中的所需响应的能力。这些结果可以包括，但不限于，如通过本领域适合的任何方法确定的对癌症的治疗。
术语“药用”是指在不是生物学上或以其他方式不需要的化合物、添加剂或组合物。例如，添加剂或组合物可以与多功能抗原结合蛋白一起给予至受试者，而不会引起任何不希望的生物学效应或以不希望的方式与包含它的药物组合物的任何其他组分相互作用。化合物、添加剂或组合物是否是“药用的”可以取决于医学领域中众所周知的因素，如疾病的类型、年龄、体重、健康状况、性别、患者的药物敏感性、给予途径、给予方法、给予频率、治疗持续时间、以及同时组合混合或给予的药物。
“药用载体”是指不干扰一种或多种活性成分的生物活性的有效性并对其给予的宿主无毒的介质。
除非另有说明，“抗体”是指免疫球蛋白(IgG、IgA、IgE、IgM、IgD和IgY)的所有同种型，包括各同种型的各种单体和聚合体形式。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区，如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。已经开发了各种技术用于产生抗体片段，包括抗体的蛋白水解消化和宿主细胞中的重组生产；然而，用于生产抗体片段的其他技术对于技术人员而言是显而易见的。在一些实施方式中，所选抗体片段是单链Fv片段(scFv)。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常而言，Fv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv和其他抗体片段的综述，参见James D.Marks,Antibody Engineering,Chapter 2,Oxford University Press(1995)(Carl K.Borrebaeck,Ed.)。
“支架”是指这样的重组多肽结构，其可以提供另一种蛋白或多肽可以连接或融合的框架以允许增加蛋白或肽的稳定性或将蛋白或肽置于更优选的构象或形式以介导所需的生物活性。
正如在本文中所使用的，术语“受试者”是指任何动物，特别是哺乳动物。尽管本文举例说明了小鼠肿瘤生长的抑制，但任何类型的哺乳动物都可以使用所公开的方法进行治疗。例如，所公开的方法适用于人、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猫、狗、猴、驴、牛、马、猪等。因此，方法适用于人和非人动物，但优选用于小鼠和人，最优选用于人。“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。
正如在本文中所使用的，“治疗有效量”是指如本文描述的多功能抗原结合蛋白有效实现特定的生物学或治疗效果，如但不限于公开的生物学或治疗学效果的用量。治疗有效量可以根据各因素如疾病状态、年龄、性别和个体体重以及组合物在受试者中引起所需反应的能力而变化。例如，治疗有效量的示例性指标包括改善的患者健康、肿瘤负荷的减轻、癌症生长的抑制或减缓和/或癌细胞向体内其他位置转移的不存在。
“处治”、“治疗”等术语是指治疗性治疗，并包括降低症状的严重性和/或频率，消除症状和/或症状的根本原因，减少症状和/或其根本原因的频率或可能性，改善或补救由与Her2/neu受体中的缺陷相关的疾病如癌症直接或间接引起的损害。适合于用所公开的方法和/或用法治疗和/或预防的癌症的合适类型包括，但不限于，乳癌和胃癌。正如在本文中所使用的，“Her2/neu受体中的缺陷”包括导致异常表达和/或功能的任何缺陷，包括但不限于，扩增、激活或失活突变、杂合性缺失、全部或部分受体的缺失、氨基酸***等。
与未接受治疗的受试者的预期存活相比，治疗还包括延长存活期。
在支架或抗原结合蛋白的上下文中的“连接”是指直接或间接“连接至”。间接连接可以由多肽接头介导，多肽接头如聚甘氨酸或甘氨酸-丝氨酸多肽，例如，GGGGS(SEQ IDNO:25)或GGGGGS(SEQ ID NO:26)。其他此类接头在本领域中是已知的，并应该视为包括于该术语中。
新的重组蛋白支架
本文公开了结合于IgG的多功能重组蛋白支架。
结合于IgG的多功能重组蛋白支架包括含有使多肽能够模拟蛋白A的IgG结合结构域的突变的人多肽。在一些实施方式中，结合于IgG的多功能重组蛋白支架可以包含α2-巨球蛋白受体相关蛋白的一部分(本文称为“2FCW”)，如图1B所示。例如，结合于IgG的多功能重组蛋白支架可以衍生自包含SEQ ID NO:27的α2-巨球蛋白受体相关蛋白的未突变部分。或者，多功能重组蛋白支架可以包含与如SEQ ID NO:28所示的huZZ结构域为至少90％的同一性的多肽、由与如SEQ ID NO:28所示的huZZ结构域为至少90％的同一性的多肽组成或基本上由与如SEQ ID NO:28所示的huZZ结构域为至少90％的同一性的多肽组成。在一些实施方式中，多功能重组蛋白支架可以包含与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1结构域为至少90％的同一性的多肽、由与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1结构域为至少90％的同一性的多肽组成或基本上由与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1结构域为至少90％的同一性的多肽组成。
表1.示例性huZZ结构域
Figure BDA0001970594780000151
在一些实施方式中，多功能重组蛋白支架可以包含与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽、由与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽组成或基本上由与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽组成。在一些实施方式中，多功能重组蛋白支架可以包含与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽、由与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽组成或基本上由与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽组成。
结合于IgG的多功能重组蛋白支架可以包含人源化蛋白A IgG结合结构域。
所描述的重组支架蛋白的一个方面是提供允许一个或多个抗原特异性结合结构域(即，抗原特异性肽或抗原特异性抗体或其片段)承担(assume)使肽结合抗原的构象的框架的能力。抗原结合蛋白的一个合乎需要的方面是它多聚化。多聚体单元将会有可能具有更多可用的功能性抗原结合位点，其可以增加抗原结合蛋白结合其抗原的亲合力和总体倾向。
本文还提供了包含SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29所示序列的多肽。
本文还提供了编码多功能重组蛋白支架的多核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸编码具有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的huZZ。在一些实施方式中，多核苷酸编码具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的huZZ1。
多功能抗原结合蛋白
本文公开了多功能抗原结合蛋白，其包含结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架和至少一种抗原特异性结合结构域，
其中结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架包含含有使肽能够模拟蛋白A的IgG结合结构域的突变的人多肽；并且
其中至少一个抗原特异性结合结构域包含抗原特异性肽、抗原特异性抗体或其片段、或它们的组合。
结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架包含含有使多肽能够模拟蛋白A的IgG结合结构域的突变的人多肽。在一些实施方式中，结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架可以包含α2-巨球蛋白受体相关蛋白的一部分。例如，结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架可以衍生自包含SEQ ID NO:27的α2-巨球蛋白受体相关蛋白的未突变部分。可替代地，至少一种多功能重组蛋白支架可以包含与所公开的huZZ结构域之一为至少90％的同一性的多肽，由与所公开的huZZ结构域之一为至少90％的同一性的多肽组成或基本上由与所公开的huZZ结构域之一为至少90％的同一性的多肽组成。在一些实施方式中，至少一种多功能重组蛋白支架可以包含与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽、由与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽组成或基本上由与如SEQ IDNO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽组成。在一些方面中，例如，至少一种多功能重组蛋白支架是如SEQ ID NO:28所示的huZZ。在一些实施方式中，至少一种多功能重组蛋白支架可以包含与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽、由与如SEQID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽组成或基本上由与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽组成。在一些方面中，例如，至少一种多功能重组蛋白支架是如SEQ ID NO:29所示的huZZ1。
结合于IgG的多功能重组蛋白支架可以包含人源化蛋白A IgG结合结构域。因此，本文中提供的多功能抗原结合蛋白包含至少一个结合于IgG的多功能重组蛋白支架和至少一个抗原特异性结合结构域，其中结合于IgG的至少一个多功能重组蛋白支架包含人源化蛋白A IgG结合结构域，并且其中至少一个抗原特异性结合结构域包含抗原特异性肽、抗原特异性抗体或其片段，或它们的组合。
优选地，至少一种多功能重组蛋白支架与抗原特异性结合结构域连接，并且可以结合除了可以被抗原特异性结合结构域结合的抗原之外的蛋白。因此，多功能抗原结合蛋白不仅可以用作一个或多个抗原特异性结合结构域的支架，还可以执行一种或多种可替代的功能，如结合非抗原蛋白。这类多功能抗原结合蛋白具有两个基本特征：1)提供维持、增强或允许抗原特异性结合结构域与其抗原结合的能力的框架的能力，和2)实施力至少一种独立的生物学功能，如与另一种非抗原蛋白的结合的能力。例如，除了提供用于抗原特异性结合结构域的结构框架之外，多功能抗原结合蛋白可以具有结合抗体的Fc部分的能力。引入这种支架的多功能抗原结合蛋白将会不仅具有可以结合对应于抗原特异性结合结构域的抗原的能力，而且还具有与细胞表面上的受体相互作用的能力。
至少一种抗原特异性结合结构域包含抗原特异性肽，抗原特异性抗体或其片段，或它们的组合。合适的抗原特异性肽包括，但不限于，SEQ ID NO:12至24中所示的多肽。在一些实施方式中，抗原特异性肽可以包含与SEQ ID NO:12至24中的任一项为至少90％的同一性的多肽，由与SEQ ID NO:12至24中的任一项为至少90％的同一性的多肽组成或基本上由与SEQ ID NO:12至24中的任一项为至少90％的同一性的多肽组成。在一些实施方式中，抗原特异性肽可以包含SEQ ID NO:12至24中的任一项的多肽，由SEQ ID NO:12至24中的任一项的多肽组成或基本上由SEQ ID NO:12至24中的任一项的多肽组成。例如，合适的抗原特异性抗体包括全长抗体或其片段如scFv、Fab和/或Fc。例如，抗原特异性抗体可以是如SEQ ID NO:30所示的4D5scFv。因此，在一些实施方式中，抗原特异性抗体可以包含与如SEQID NO:30中所示的4D5scFv为至少90％的同一性的多肽、由与如SEQ ID NO:30中所示的4D5scFv为至少90％的同一性的多肽组成或基本上由与如SEQ ID NO:30中所示的4D5scFv为至少90％的同一性的多肽组成。在一些实施方式中，抗原特异性抗体可以包含SEQ IDNO:30所示的4D5scFv多肽，由SEQ ID NO:30所示的4D5scFv多肽组成或基本上由SEQ IDNO:30所示的4D5scFv多肽组成。
因此，本文公开的多功能抗原结合蛋白包含结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架和至少一种抗原特异性结合结构域，其中至少一种多功能重组蛋白支架包含与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽、由与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽组成或基本上由与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽组成，并且抗原特异性结合结构域是包含与SEQ ID NO:12至24中的任一项为至少90％的同一性的多肽、由与SEQ ID NO:12至24中的任一项为至少90％的同一性的多肽组成或基本上由与SEQ ID NO:12至24中的任一项为至少90％的同一性的多肽组成的抗原特异性肽。在一些实施方式中，多功能抗原结合蛋白可以包含结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架和至少一种抗原特异性结合结构域，其中至少一种多功能重组蛋白支架包含与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽、由与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽组成或基本上由与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽组成，并且抗原特异性结合结构域是包含与SEQ ID NO:12至24中的任一项为至少90％的同一性的多肽、由与SEQ ID NO:12至24中的任一项为至少90％的同一性的多肽组成或基本上由与SEQ ID NO:12至24中的任一项为至少90％的同一性的多肽组成的抗原特异性肽。
本文还公开了多功能抗原结合蛋白，其包含结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架和至少一种抗原特异性结合结构域，其中至少一种多功能重组蛋白支架包含与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽、由与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽组成或基本上由与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽组成，并且抗原特异性结合结构域是包含与如SEQ ID NO:30所示的4D5scFv为至少90％的同一性的多肽、由与如SEQ ID NO:30所示的4D5scFv为至少90％的同一性的多肽组成或基本上由与如SEQ ID NO:30所示的4D5scFv为至少90％的同一性的多肽组成的抗原特异性抗体。在一些实施方式中，多功能抗原结合蛋白具有与如SEQ ID NO:31所示的4D5scFv-huZZ为至少90％的同一性的氨基酸序列。在一些方面中，多功能抗原结合蛋白具有SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
多功能抗原结合蛋白可以包含结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架和至少一种抗原特异性结合结构域，其中至少一种多功能重组蛋白支架包含与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽、由与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽组成或基本上由与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽组成，并且抗原特异性结合结构域是包含与如SEQ ID NO:30所示的4D5scFv为至少90％的同一性的多肽、由与如SEQ ID NO:30所示的4D5scFv为至少90％的同一性的多肽组成或基本上由与如SEQ ID NO:30所示的4D5scFv为至少90％的同一性的多肽组成的抗原特异性抗体。在一些实施方式中，多功能抗原结合蛋白具有与如SEQ ID NO:32所示的4D5scFv-huZZ1为至少90％的同一性的氨基酸序列。在一些方面中，多功能抗原结合蛋白具有SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
多功能重组蛋白支架可以位于抗原特异性结合结构域的N-末端、抗原特异性结合结构域的C-末端或嵌入抗原特异性结合结构域内。例如，所公开的huZZ结构域可以与scFV或Fab区连接或嵌入Fc区内。尽管所提供的示例性多功能抗原结合蛋白在抗原特异性结合结构域的C-末端具有蛋白支架，但这些示例性构建体并不意味着是限制性的。
多功能抗原结合蛋白可以进一步包含与多功能重组蛋白支架、抗原特异性结合结构域或这两者连接的干扰素(IFN)或其部分。合适的IFN包括，但不限于，人IFN(hIFN)和小鼠IFN(mIFN)。在一些实施方式中，例如，多功能抗原结合蛋白可以包含SEQ ID NO:33所示的4D5scFv-huZZ-hIFN、由SEQ ID NO:33所示的4D5scFv-huZZ-hIFN组成或基本上由SEQ IDNO:33所示的4D5scFv-huZZ-hIFN组成。在一些实施方式中，例如，多功能抗原结合蛋白可以包含与如SEQ ID NO:34中所示的4D5scFv-huZZ-mIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列、由与如SEQ ID NO:34中所示的4D5scFv-huZZ-mIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列组成或基本上由与如SEQ ID NO:34中所示的4D5scFv-huZZ-mIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，例如，多功能抗原结合蛋白可以包含与如SEQ ID NO:35中所示的4D5scFv-huZZ1-hIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列、由与如SEQ ID NO:35中所示的4D5scFv-huZZ1-hIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列组成或基本上由与如SEQ IDNO:35中所示的4D5scFv-huZZ1-hIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，例如，多功能抗原结合蛋白可以包含与如SEQ ID NO:36中所示的4D5scFv-huZZ1-mIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列、由与如SEQ ID NO:36中所示的4D5scFv-huZZ1-mIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列组成或基本上由与如SEQ ID NO:36中所示的4D5scFv-huZZ1-mIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列组成。
多功能抗原结合蛋白可以被标记有或以其他方式缀合于各种化学或生物分子部分，例如，用于治疗或诊断应用的那些。这些部分可以是细胞毒性的，例如，细菌毒素、病毒毒素、放射性同位素等。部分可以是可检测的标记，例如，荧光标记、放射性标记、生物素、蛋白标记等，例如，聚组氨酸标签。因此，在一些实施方式中，多功能抗原结合蛋白可以进一步包含表位标签、荧光团、放射性同位素、酶或它们的任何组合。在一些方面中，表位标签是聚组氨酸标签。合适的聚组氨酸标签包括，但不限于，6×His标签。
此外，增溶因子可以附加或连接到多功能抗原结合蛋白上。因此，在一些实施方式中，多功能抗原结合蛋白可以进一步包含提高溶解性的蛋白结构域。例如，合适的增溶因子包括硫氧还蛋白(thioredoxin)(Trx)(SEQ ID NO:37)。
多功能重组蛋白支架和抗原特异性结合结构域可以直接或间接连接。例如，重组蛋白支架可以通过多肽接头间接连接至抗原特异性结合结构域，接头如聚甘氨酸或甘氨酸-丝氨酸接头。在一些实施方式中，多功能抗原结合蛋白可以进一步包含具有一个或多个甘氨酸残基的接头，其中所述接头将至少一个多功能重组蛋白支架连接至至少一个抗原特异性结合结构域。例如，合适的接头包括包含与如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26为至少90％的同一性的多肽的接头。在一些实施方式中，接头可以由SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，接头可以基本上由SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26组成。其他接头在本领域中是公知的，并认为处于本文提供的主题的范围内。(参见，例如，Robinson and Sauer,95 PNAS 5929-34(1998)，Tang et al.,271(26)J.Bio.Chem.15682-86(1996))。另外，本文描述的抗原结合蛋白的各组分可以通过本领域熟知的基因工程技术将它们各自的基因区段拼接至一起而彼此直接连接。
多功能抗原结合蛋白可以进一步包含一种或多种如本文所公开的其他多功能重组蛋白支架。例如，一种或多种另外的多功能蛋白支架可以包含经过设计以模拟免疫球蛋白重链的CH2结构域的蛋白区段、由经过设计以模拟免疫球蛋白重链的CH2结构域的蛋白区段组成或基本上由经过设计以模拟免疫球蛋白重链的CH2结构域的蛋白区段组成。这类支架的一个实施方式的一个例子是SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或基本上类似于SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在其他实施方式中，一种或多种另外的多功能蛋白支架可以包含蛋白A的一部分、由蛋白A的一部分组成或基本上由蛋白A的一部分组成。这类型的支架的一个实例体现为SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或基本上类似于SEQ ID NO:3的氨基酸序列。此外，一种或多种另外的多功能蛋白支架可以包含GITRL蛋白的一部分、由GITRL蛋白的一部分组成或基本上由GITRL蛋白的一部分组成。除结合抗原之外，具有GITRL区段的抗原结合蛋白还将会具有与展示GITRL受体的细胞，如T细胞相互作用的能力。这种支架的一个实例体现为SEQID NO:4的氨基酸序列，或基本上类似于SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
多功能抗原结合蛋白可以采用多种形式。例如，多功能重组蛋白支架可以与一个或多个抗原特异性结合结构域连接或组合以形成具有结合抗原和细胞蛋白的能力的多功能抗原结合蛋白。另外，多功能抗原结合蛋白可以通过组合两种或更多种多功能重组蛋白支架而产生，其中抗原特异性结合结构域与至少一种多功能重组蛋白支架连接。此外，多功能抗原结合蛋白可以通过组合两种或更多种多功能重组蛋白支架而产生，其每种支架都与同一抗原特异性结合结构域连接。另外，多功能抗原结合蛋白可以通过组合两种或多种多功能重组蛋白支架而产生，其每种支架都与不同的抗原特异性结合结构域连接。对于本领域技术人员显而易见的是，存在许多可能的组合，通过这些组合人们就可以使用一种或多种多功能重组蛋白支架和一种或多种抗原特异性结合结构域产生多功能抗原结合蛋白，并且为简洁起见，每种可能性并未在本文中明确描述，但这种支架组合和抗原特异性结合结构域都被认为落入本公开的范围内。
多功能抗原结合蛋白可以由具有与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽的多功能重组蛋白支架和一个或多个以SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4的氨基酸序列为例的多功能重组蛋白支架产生。在一些实施方式中，多功能抗原结合蛋白可以由具有与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽的多功能重组蛋白支架和一个或多个以SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列为例的多功能重组蛋白支架产生。另外，所描述的多功能抗原结合蛋白可以引入任何数量的抗原特异性结合结构域肽，如SEQ ID NO:12至24的抗原特异性肽和SEQ ID NO:30的抗原特异性抗体。可以通过采用抗原特异性结合结构域、将与如SEQ ID NO:28所示的任何huZZ为至少90％的同一性的多肽与经过设计以模拟如SEQ ID NO:2所示的免疫球蛋白重链的CH2结构域的一部分的蛋白连接而产生多功能抗原结合蛋白。例如，与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽可以限于如SEQ ID NO:6所示的AHNP-CH2模拟物。在其他方面中，与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽可以限于如SEQ ID NO:6所示的AHNP-CH2模拟物。多功能抗原结合蛋白的另一个实施方式可以通过采用抗原特异性结合结构域、将与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽与如SEQ ID NO:3所示的蛋白AZZ结构域的一部分连接而产生。抗原特异性结合结构域可以是抗原特异性肽，如SEQ ID NO:12所示的AHNP。例如，与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽可以与如SEQ ID NO:7所示的AZZ连接。在其他方面中，与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽可以与如SEQ ID NO:7所示的AZZ连接。抗原特异性结合结构域可以是抗原特异性抗体或其部分，如4D5scFv。例如，与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽可以与如SEQ ID NO:10所示的4D5scFv-ZZ连接。在一些方面中，与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1具有90％的同一性的多肽可以与如SEQ ID NO:10所示的4D5scFv-ZZ连接。可以通过将与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽与连接到现有的抗原结合蛋白如SEQ ID NO:5所示的ALZ的如SEQ ID NO:3所示的ZZ支架组合以产生多功能抗原结合蛋白。例如，与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽可以与如SEQ ID NO:9所示的ALZ-ZZ连接。在其他方面中，与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽可以与如SEQ ID NO:9所示的ALZ-ZZ连接。可以通过采用抗原特异性结合结构域、将与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽连接至如SEQ ID NO:4所示的一部分GITRL蛋白而产生多功能抗原结合蛋白。抗原特异性结合结构域可以是抗原特异性肽如SEQ ID NO:12所示的AHNP。例如，与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽可以与如SEQ ID NO:8所示的AGITRL连接。在一些方面中，与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽可以与如SEQ ID NO:8所示的AGITRL连接。抗原特异性结合结构域可以是抗原特异性抗体或其部分，如4D5scFv。例如，与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽可以与如SEQ ID NO:11所示的4D5scFv-GITRL连接。在其他方面中，与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1具有90％的同一性的多肽可以与如SEQ ID NO:11所示的4D5scFv-GITRL连接。
在一些实施方式中，可以通过采用如SEQ ID NO:12所示的抗原特异性结合结构域如AHNP、将与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性的多肽与衍生自如SEQ IDNO:1所示的亮氨酸拉链结构域(如衍生自FOX3P蛋白的亮氨酸拉链结构域)的重组多肽连接而产生多功能抗原结合蛋。在一些实施方式中，可以通过采用如SEQ ID NO:12所示的抗原特异性结合结构域如AHNP、将与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性的多肽与衍生自如SEQ ID NO:1所示的亮氨酸拉链结构域(如衍生自FOX3P蛋白的亮氨酸拉链结构域)的重组多肽连接而产生多功能抗原结合蛋白。
本文举例说明的多功能抗原结合蛋白已经用抗原特异性肽AHNP或抗原结合抗体4D5scFv制成。本公开的这个实践方面不应该视为限制所公开的支架仅与AHNP或4D5scFv一起使用，因为显而易见的是这些支架可以与多种抗原特异性肽和scFv蛋白或其他抗体片段一起使用。此外，虽然提供的具体氨基酸序列代表本文举例说明的具体实施方式，但应该理解的是，对序列进行某些氨基酸取代、缺失或添加，序列不会改变支架或抗原结合蛋白的功能。
表2.重组蛋白支架和抗原特异性结合结构域的示例性氨基酸序列
Figure BDA0001970594780000261
Figure BDA0001970594780000271
Figure BDA0001970594780000281
Figure BDA0001970594780000291
对于4D5scFv-huZZ序列：4D5scFv用斜体表示；示例性链接器是粗体；huZZ和huZZl有下划线；IFN有双下划线。
编码多功能抗原结合蛋白的多核苷酸
本文还公开了编码任何公开的多功能抗原结合蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸编码与如SEQ ID NO:31所示的4D5scFv-huZZ为至少90％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，多核苷酸编码与如SEQ ID NO:32中所示的4D5scFv-huZZ1为至少90％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，多核苷酸编码与如SEQ ID NO:33所示的4D5scFv-huZZ-hIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，多核苷酸编码与如SEQ ID NO:34所示的4D5scFv-huZZ-mIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，多核苷酸编码与如SEQ ID NO:35所示的4D5scFv-huZZ1-hIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，多核苷酸编码与如SEQ ID NO:36中所示的4D5scFv-huZZ1-mIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列。
所公开的多核苷酸还可以引入用于维持、复制和/或表达编码所描述的抗原结合蛋白或其所描述的部分的多核苷酸的载体中。因此，本文提供的是包含以下各项的载体：(a)编码与如SEQ ID NO:31所示的4D5scFv-huZZ为至少90％的同一性的氨基酸序列的多核苷酸；(b)编码与如SEQ ID NO:32所示的4D5scFv-huZZ1为至少90％的同一性的氨基酸序列的多核苷酸；(c)编码与如SEQ ID NO:33所示的4D5scFv-huZZ-hIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列的多核苷酸；(d)编码与如SEQ ID NO:34所示的4D5scFv-huZZ-mIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列的多核苷酸；(e)编码与如SEQ ID NO:35所示的4D5scFv-huZZ1-hIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列的多核苷酸；或(f)编码与如SEQ ID NO:36所示的4D5scFv-huZZ1-mIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列的多核苷酸。以上所描述的载体可以用于工程改造细胞以表达由本文公开的多核苷酸编码的多功能抗原结合蛋白或其所描述的部分。
本文描述的重组蛋白支架和抗原特异性结合结构域可以是通过重组工艺方法制备的，并且因此可以包括衍生自一种以上物种的氨基酸序列(即嵌合构建体)或可以经过工程改造而具有人的或人样的氨基酸组成(即人源化构建体)。因此，本文提供了包含能够编码所描述的重组蛋白支架和抗原特异性结合结构域的多核苷酸的载体。载体可以是表达载体。因此提供了含有编码所关注的多肽的序列的重组表达载体。表达载体可以含有一种或多种另外的序列，如但不限于，调节序列(例如，启动子，增强子)，选择标记和多腺苷酸化信号。用于转化多种宿主细胞的载体是本领域技术人员熟知的。它们包括，但不限于，质粒、噬菌粒、粘粒、杆状病毒、杆粒(bacmid)、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)，以及其他细菌、酵母和病毒载体。本文描述的载体可以整合到宿主基因组中或独立地维持于细胞或细胞核中。
设想于本说明书范围内的重组表达载体包括编码至少一种可以与合适的调节元件可操作地连接的重组蛋白的合成、基因组或cDNA衍生的核酸片段。此类调节元件可以包括转录启动子、编码合适mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。表达载体，尤其是哺乳动物表达载体，还可以包括一个或多个非转录元件，如复制起点、与待表达基因连接的合适启动子和增强子、其他5'或3'侧接非转录序列、5'或3'非翻译序列(如所必需的核糖体结合位点)、多腺苷酸化位点、剪接供体和受***点或转录终止序列。还可以引入赋予在宿主中复制的能力的复制起点。这些载体可以整合到宿主基因组中或独立维持于细胞或细胞核中。
本文描述的载体可以用于采用编码所公开的重组蛋白支架或抗原特异性结合结构域的基因转化各种细胞。因此，本文提供了经工程改造以表达任何所公开的多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体的细胞。例如，本文提供的是包含以下各项的细胞：(a)编码与如SEQ ID NO:31所示的4D5scFv-huZZ为至少90％的同一性的氨基酸序列的多核苷酸；(b)编码与如SEQ ID NO:32所示的4D5scFv-huZZ1为至少90％的同一性的氨基酸序列的多核苷酸；(c)编码与如SEQ ID NO:33所示的4D5scFv-huZZ-hIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列的多核苷酸；(d)编码与如SEQ ID NO:34所示的4D5scFv-huZZ-mIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列的多核苷酸；(e)编码与如SEQ ID NO:35所示的4D5scFv-huZZ1-hIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列的多核苷酸；或(f)编码与如SEQ ID NO:36所示的4D5scFv-huZZ1-mIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列的多核苷酸。
载体可以用于产生重组蛋白支架或产生抗原特异性结合域的细胞或细胞系。因此，另一方面特征在于用包含编码重组蛋白支架或抗原特异性结合域的核酸序列的载体转化的宿主细胞，例如本文公开和示例的那些。本文公开的宿主细胞可以是原核或真核细胞。例如，宿主细胞可以是细菌。在优选的实施方式中，细菌宿主细胞是大肠杆菌。当然，宿主细胞也可以是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。许多其他此类宿主细胞、原核和真核细胞在本领域内是已知的，并被认为属于本公开的范围内。
本领域已知许多技术用于将外源基因引入细胞中，并根据本文描述和举例说明的各种实施方式可以用于构建重组细胞以实现实施本发明方法的目的。所使用的技术应该提供异源基因序列向宿主细胞的稳定转移，而使异源基因序列由细胞后代可遗传和可表达，并使受体细胞的必需的发育和生理功能不被破坏。可以使用的技术包括，但不限于，染色体转移(例如，细胞融合、染色体介导基因转移、微细胞介导基因转移)，物理方法(例如，转染、原生质球融合、显微注射、电穿孔、脂质体载体)，病毒载体转移(例如，重组DNA病毒、重组RNA病毒)等。磷酸钙沉淀和细菌原生质体与哺乳动物细胞的聚乙二醇(PEG)诱导融合也可以用于转化细胞。
治疗受试者疾病的方法
本文公开了在有此需要的受试者中治疗和/或预防疾病的方法，包括向受试者给予治疗有效量的包含一种或多种所公开的多功能抗原结合蛋白的组合物。
本文还公开了用于在有此需要的受试者的疾病的治疗和/或预防中使用的包含一种或多种所公开的多功能抗原结合蛋白的组合物。
本文还提供了包含一种或多种所公开的多功能抗原结合蛋白的组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
在一些实施方式中，方法和/或用途包括向受试者给予治疗有效量包含具有与如SEQ ID NO:31所示的4D5scFv-huZZ为至少90％的同一性的氨基酸序列的多功能抗原结合蛋白的组合物。在一些实施方式中，方法和/或用途包括向受试者给予治疗有效量包含具有与如SEQ ID NO:32所示的4D5scFv-huZZ1为至少90％的同一性的氨基酸序列的多功能抗原结合蛋白的组合物。在一些实施方式中，方法和/或用途包括向受试者给予治疗有效量包含具有与如SEQ ID NO:33所示的4D5scFv-huZZ-hIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列的多功能抗原结合蛋白的组合物。在一些实施方式中，方法和/或用途包括向受试者给予治疗有效量包含具有与如SEQ ID NO:34所示的4D5scFv-huZZ-mIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列的多功能抗原结合蛋白的组合物。在一些实施方式中，方法和/或用途包括向受试者给予治疗有效量包含具有与如SEQ ID NO:35所示的4D5scFv-huZZ1-hIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列的多功能抗原结合蛋白的组合物。在一些实施方式中，方法和/或用途包括向受试者给予治疗有效量包含具有与如SEQ ID NO:36所示的4D5scFv-huZZ1-mIFN为至少90％的同一性的氨基酸序列的多功能抗原结合蛋白的组合物。
所公开的方法和/或用途可以用于治疗和/或预防与Her2/neu受体中的缺陷相关的疾病。在一些实施方式中，所公开的方法和/或用途可以用于治疗癌症。适合于用公开的方法和/或用途治疗和/或预防的合适癌症类型包括，但不限于，乳癌和胃癌。正如在本文中所使用的，“Her2/neu受体中的缺陷”包括导致异常表达和/或功能，包括但不限于扩增、激活或失活突变、杂合性缺失、全部或部分受体缺失，氨基酸***等的任何缺陷。
公开的多功能抗原结合蛋白可以与一种或多种化学治疗剂如，但不限于，放射性核素，毒素和细胞毒性和细胞抑制剂缀合。在其他实施方式中，多功能抗原结合蛋白可以与一种或多种化学治疗剂组合使用。本文的多功能抗原结合蛋白可以单独使用或与生物分子或化学治疗剂如细胞毒性剂或细胞抑制剂一起(例如，共给予或与之缀合)使用。在一些实施方式中，化学治疗剂可以是放射性核素，包括但不限于铅-212、铋-212、砹-211、碘-131、钪-47、铼-186、铼-188、钇-90、碘-123、碘-124、碘-125、溴-77、铟-111和可裂变的核素如硼-10或锕系元素。在其他实施方式中，化学治疗剂可以是毒素或细胞毒性药物，商陆抗病毒蛋白、相思豆蛋白、蓖麻毒素及其各自的A链、地肤子皂苷、皂草素、异株泻根毒蛋白1、三角梅核糖体失活蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素、志贺毒素、卡奇霉素、美登醇、六甲蜜胺、放线菌素D、普卡霉素、嘌呤霉素、短杆菌肽D、多柔比星、秋水仙碱、细胞松弛素B、环磷酰胺、依米丁、美登素、安吖啶、顺铂、依托泊苷、依托泊苷邻醌、替尼泊苷、柔红霉素、吉西他滨、多柔比星、米托蒽醌、二蒽、博来霉素、甲氨蝶呤、培美曲塞、顺铂、长春地辛、阿霉素、长春新碱、长春碱、BCNU、紫杉醇、特罗凯、阿瓦斯汀、丝裂霉素、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺、某些细胞因子如TNF-α和TNF-β等。多功能抗原结合蛋白与这些试剂的缀合方法在文献中是已知的。
在一些实施方式中，组合物可以进一步包含药用载体。因此，本文还提供了包含一种或多种所公开的多功能抗原结合蛋白和药用载体的组合物。
组合物可以配制成本领域已知和合适的各种制剂中的任何一种，包括本文描述和举例说明的那些。在一些实施方式中，组合物可以是水性制剂。水性溶液可以通过将多功能抗原结合蛋白在水或合适的生理缓冲液中掺混，并根据需要可选地加入合适的着色剂，矫味剂，防腐剂，稳定剂和增稠剂等而制备。水性悬浮液也可以通过将多功能抗原结合蛋白用粘性材料如天然或合成树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和其他熟知的悬浮剂一起分散于水或生理缓冲液中而制备。
还包括液体制剂和旨在在使用前不久转化为液体制剂的固体形式制剂。这些液体包括溶液、悬浮液、糖浆、浆液和乳液。液体制剂可以通过常规方法采用药用添加剂而制备，药用添加剂如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆，纤维素衍生物或氢化食用脂肪或油)；乳化剂(例如，卵磷脂或***胶)；非水性载体(例如，杏仁油，油性酯或分馏植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。除活性剂外，这些制剂还可以含有着色剂、矫味剂、稳定剂、缓冲剂、人造和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。组合物可以是用于在使用前采用合适的载体如无菌水、生理缓冲液、盐水溶液或酒精进行构建的粉末或冻干形式。
组合物可以配制用于向受试者进行注射。为了进行注射，组合物可以配制于水性溶液如水或醇中，或配制于生理上相容的缓冲液如汉克斯(Hanks)溶液、林格氏(Ringer)溶液或生理盐水缓冲液中。溶液可以含有配制剂如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。注射制剂也可以制备成旨在在使用前不久转化为适于注射的液体形式制剂，例如，通过使用前用合适的载体如无菌水，盐溶液或酒精构建的固体形式制剂。
组合物配制于持续释放的媒介物或贮库制剂中。这种长效制剂可以通过植入(例如，皮下或肌肉内)或通过肌内注射给予。因此，例如，组合物可以用合适的聚合物质或疏水物质(例如，作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂进行配制，或配制成微溶衍生物，例如，作为微溶盐。脂质体和乳液是适合用作疏水性药物载体的递送载体的众所周知的实例。
多功能抗原结合蛋白和/或包含其的组合物可以以任何可接受的剂型如胶囊、片剂、水悬浮液、溶液等口服给予。多功能抗原结合蛋白还可以肠胃外给予，包括但不限于：皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鼻内、局部、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。通常而言，多功能抗原结合蛋白将通过，例如，注射进行静脉内或腹膜内给予。
所公开的组合物适用于本文提供的方法和/或用途，用于治疗或预防受试者的疾病。在一个实施方式中，治疗方法包括向需要这种治疗的受试者给予治疗有效量的一种或多种多功能抗原结合蛋白。类似的上，在一个实施方式中，所描述的预防受试者疾病的方法包括向对此有需要的受试者给予治疗量的一种或多种多功能抗原结合蛋白。一种治疗或预防疾病的优选方法涉及受试者中与Her2/neu受体或EGFR相关的疾病，其中治疗或预防包括向受试者给予包含本文的多功能抗原结合蛋白的组合物。
受试者可以以每日剂量范围约0.01μg至约500mg的多功能抗原结合蛋白/kg受试者体重给予至少一种多功能抗原结合蛋白。向受试者给予的剂量也可以根据每天给予的至少一种多功能抗原结合蛋白的总量进行测量。在一些实施方式中，受试者每天给予约5至约5000毫克的至少一种多功能抗原结合蛋白。在一些实施方式中，每天向受试者给予高达约10毫克的至少一种多功能抗原结合蛋白。在一些实施方式中，每天向受试者给予高达约100毫克的至少一种多功能抗原结合蛋白。在一些实施方式中，向受试者每天给予高达约250毫克的至少一种多功能抗原结合蛋白。在一些实施方式中，向受试者每天给予高达约500毫克的至少一种多功能抗原结合蛋白。在一些实施方式中，向受试者每天给予高达约750毫克的至少一种多功能抗原结合蛋白。在一些实施方式中，向受试者每天给予高达约1000毫克的至少一种多功能抗原结合蛋白。在一些实施方式中，向受试者每天给予高达约1500毫克的至少一种多功能抗原结合蛋白。在一些实施方式中，向受试者每天给予高达约2000毫克的至少一种多功能抗原结合蛋白。在一些实施方式中，受试者每天给予高达约2500毫克的至少一种多功能抗原结合蛋白。在一些实施方式中，受试者每天给予高达约3000毫克的至少一种多功能抗原结合蛋白。在一些实施方式中，向受试者每天给予高达约3500毫克的至少一种多功能抗原结合蛋白。在一些实施方式中，向受试者每天给予高达约4000毫克的至少一种多功能抗原结合蛋白。在一些实施方式中，向受试者每天给予高达约4500毫克的至少一种多功能抗原结合蛋白。在一些实施方式中，向受试者每天给予高达约5000毫克的至少一种多功能抗原结合蛋白。在一些实施方式中，多功能抗原结合蛋白每周或每两周向受试者进行给予。
对于有效治疗，本领域技术人员可以推荐适合于所治疗的受试者的剂量方案和剂量。只要需要，可以优选每天给予一至四次或更多次。如果组合物配制于持续递送载体中，则计量剂量可以较不频繁地发生。剂量方案也可以根据活性药物浓度而变化，这可取决于受试者的需要。
检测所关注的抗原的方法
本文还提供了检测受试者中所关注的抗原的方法，包括向受试者给予任何公开的多功能抗原结合蛋白，和检测多功能抗原结合蛋白与所关注的抗原的结合。所关注的抗原包括，但不限于，Her2/neu受体。
本文进一步提供了适用于检测受试者中所关注的抗原的多功能抗原结合蛋白，其中将多功能抗原结合蛋白给予至受试者并且将多功能抗原结合蛋白与目标抗原结合。被检测到。
在一些实施方式中，方法和/或用途包括向受试者给予具有与如SEQ ID NO:31所示的4D5scFv-huZZ为至少90％的同一性的氨基酸序列的多功能抗原结合蛋白，和检测与Her2/neu受体的结合。在一些实施方式中，方法和/或用途包括向受试者给予具有与如SEQID NO:32所示的4D5scFv-huZZ1为至少90％的同一性的氨基酸序列的多功能抗原结合蛋白，并检测与Her2/neu受体的结合。
所公开的方法和/或用途适用于受试者中、从受试者中获得的样品中的离体或体外抗原检测。
合适的检测技术包括，但不限于，蛋白印迹(Western blot)、显微术、ELISA、FACS、放射性标记的检测等。
检测疾病相关的蛋白或代谢物的方法
本文公开了检测Her2/neu受体的方法，包括将含有Her2/neu受体的样品暴露于本文公开的任何多功能抗原结合蛋白，和检测多功能抗原结合蛋白与样品的结合。在一些方面中，检测在体外进行。在一些实施方式中，方法包括将含有Her2/neu受体的样品暴露于具有与如SEQ ID NO:31所示的4D5scFv-huZZ为至少90％的同一性的氨基酸序列的多功能抗原结合蛋白，并检测多功能抗原结合蛋白与样品的结合。在一些实施方式中，方法包括将含有Her2/neu受体的样品暴露于具有与如SEQ ID NO:32所示的4D5scFv-huZZ1为至少90％的同一性的氨基酸序列的多功能抗原结合蛋白，并检测多功能抗原结合蛋白与样品的结合。
在一些实施方式中，样品是衍生自患有与Her2/neu受体中的缺陷相关的疾病的受试者的生物样品。公开的方法适用于离体或体外检测受试者中，由受试者获得的样品中的Her2/neu受体。
本文公开的多功能抗原结合蛋白可以用于检测受试者或从受试者获得的样品中的致病试剂或疾病相关蛋白或代谢物，其由此可以允许进行诊断。本文描述的方法可以特别适用于检测或以其他方式评价受试者中Her2/neu受体或EGFR的表达。例如，人们可以向患者注射本文所描述的的抗原结合蛋白中的一种的可检测标记的实施方式，并检测受试者中信号的定位和/或强度。或者，人们可以将含有Her2/neu受体或EGFR的样品暴露于本文所描述的受体特异性抗原结合蛋白，并检测所述抗原结合蛋白与所述样品的结合。
合适的检测技术包括，但不限于，蛋白印迹、显微术、ELISA、FACS、放射性标记的检测等。
本文提供了以下实施例以进一步描述本文中更详细描述的一些实施方式。它们旨在举例说明，而非限制所公开的实施方式。
实施例
实施例1.识别结构上类似于蛋白A IgG结合结构域的人蛋白
先前已经开发了一类携带与免疫球蛋白的Fc区相互作用的蛋白A的IgG结合结构域的多功能重组蛋白支架(Zhang，2013)。多功能重组蛋白支架还可以通过抗原特异性结合结构域(例如，scFv)与靶标(例如，肿瘤细胞上的受体)结合。因此，工程化改造的多功能抗原结合蛋白将指导朝向肿瘤细胞的免疫效应细胞功能并具有潜在的治疗应用(Cai etal.，2013)。
本文提供了一种创建表现出像Z结构域并与IgG的Fc区结合的人蛋白的新方法。这种人源化的Z结构域被称为huZZ，如果它们在人体中用作治疗剂，将取代多功能抗原结合蛋白中的细菌源的Z结构域而会降低免疫原性。此外，使用所报道的噬菌体展示或其他类似的分子方法，huZZ可以用于取代Z结构域而产生对明确的靶标的亲和蛋白。这方面的一个例子是基于细菌蛋白A的Z结构域开发的“亲合体(Affibody)”。
为了创建Z结构域的人源化形式，金黄色葡萄球菌蛋白A(PDB代码：1DEE)的IgG结合结构域的晶体结构(Graille et al.，2000)首先用作使用Dali Web服务器(http://ekhidna.biocenter.helsinki.fi/dali server)(Holm and Rosenstrom,2010)搜索蛋白数据库(Protein Data Bank)(http://www.rcsb.org/pdb)中的类似结构的模型。从Dali输出列表中选择出人蛋白，并排除不可溶于溶剂的相似结构部分。选择两种类似的结构：α2-巨球蛋白受体相关蛋白(PDB ID：2FCW)(Fisher et al.,2006)，其与IDEE的G链相比具有2.7埃的rmsd(图1A)；和SUMO连接酶PIAS1(PDB ID：1V66)(Okubo et al.,2004)，其具有rmsd 3.1埃。然后将相应的片段提交给SWISS-MODEL服务器(Schwede et al.,2003)并生成结构模型。
基于模型，创建出短接头(QGD)以连接2FCW中的螺旋。晶体结构(PDB：1FC2)(Deisenhofer，1981)揭示了人IgG Fc与蛋白A的片段B之间的相互作用。基于这种复合物，在2FCW序列中设计了几个突变以模拟IgG结合域中有助于与Fc的相互作用的氨基酸残基，如图1B所示。新序列命名为huZZ。将类似的设计应用于PIAS1序列，并且该序列命名为1V66。
实施例2.验证huZZ与IgG的结合
合成huZZ的cDNA并亚克隆以产生含有抗体特异性抗体(scFv)4D5scFvhuZZ的多功能抗原结合蛋白。使用T6-17细胞系的FACS实验验证huZZ是否与IgG相互作用。T6-17细胞表达HER2并可以被4D5scFv识别。当采用含有ZZ(来自蛋白A的结构域Z)或huZZ的多功能抗原结合蛋白涂覆这些细胞时，就可以捕获FITC标记的第二蛋白(图2)。PIAS1设计也表达为4D5scFv-1V66，但它未能捕获二级抗体，表明FITC标记的抗体与细胞的结合依赖于结构域Z或huZZ。在该实验中，huZZ似乎具有与结构域Z相当的结合活性。为了进一步说明huZZ与IgG分子的结合，使用芯片上的固定化IgG物种进行SPR实验。如表3中所示，4D5scFv-huZZ显示出与m4D5(人IgG1)、mF77(小鼠IgG3)的良好结合，但与m4D5(小鼠IgG1)的结合不太好。在SPR研究中测定的亲和力稍微低于蛋白A对IgG的亲和力。然而，huZZ对人IgG1和小鼠IgG3的结合模式和偏好与蛋白A的结合模式和偏好相似。作为对照，产生了含有2FCW的宽类型序列的构建体，4D5scFv-2FCW。这种对照构建体未能显著结合任何抗体分子，表明引入2FCW模板的突变对于huZZ与Fc片段的结合是关键的。
表3.通过SPR测定的4D5scFv-huZZ和4D5scFv-2FCW(WT)对不同IgG分子的结合亲和力(KD，μM)
Figure BDA0001970594780000411
4D5scFv-huZZ和对照构建体4D5scFv-2FCW在细菌中表达，并使用镍-琼脂糖凝胶纯化。将其进一步浓缩至10μM并对0.005％PBST透析，然后将其用于Biacore结合实验，n.d.：没有检测到。
实施例3.4D5scFv-huZZ在293T细胞中的表达
将4D5scFv-huZZ cDNA也克隆到哺乳动物表达载体中并在293T细胞中表达它。使用类似的biacore分析测试法，据观察，293T-表达的4D5scv-huZZ对IgG1的结合亲和力(图4)比细菌表达的蛋白更好。如图4A所示，293T蛋白与h4D5结合具有0.62μM的KD。与m4D5的结合也检测到1.25μM的KD。它们都比细菌表达的蛋白观察到的结果更好(图3)。然而，对mF77(IgG3亚型)的亲和力大致相同。
当4D5scFv-huZZ与IgG1的Fc片段混合时，在溶液中形成了复合物。如图4B所示，4D5scFv-huZZ和Fc均从尺寸排阻FPLC洗脱，分子量分别为61和52kDa的主要单峰。4D5scFv-huZZ和Fc的混合物显示出两个分子量大得多的峰。第一个峰(级分#4-7，～572kDa)属于大聚集体。第二个峰(级分#9-11)具有估计分子量165kDa。根据SDS PAGE分析，2个峰含有两个分子，但4D5scFv-huZZ含量似乎高于Fc含量。这些数据表明4D5scFv-huZZ和Fc在溶液中形成了二聚体，并且当混合时可以彼此形成复合物。
实施例4.huZZ Grababody对肿瘤细胞的体外和体内活性
接着，分析了含有原始细菌结构域Z序列或人源化序列huZZ和干扰素γ(IFN-γ)的两种多功能抗原结合蛋白的活性。在对T6-17细胞系的MTT分析中，4D5scFv-ZZ-mIFN和4D5scFv-huZZ-mIFN均显示出抑制增殖的剂量依赖性活性(图5A)并且二者在3～10μg/mL之间达到了50％的抑制。具有原始结构域Z序列的4D5scFv-ZZ-mIFN具有比4D5scFv-huZZ-mIFN略微更好的活性。
为了证明含huZZ多功能抗原结合蛋白的体内活性，使用了CT26-HER2植入肿瘤模型。HER2肿瘤谱系CT-26-HER2建立于BALB/c背景中(Jaime-Ramirez et al.,2011)。这是HER2靶向疗法的抗性模型，因为肿瘤细胞携带了致癌K-RasG12D突变(Zhang et al.,2009；Castle et al.,2014)。CT-26-HER2肿瘤的生长可以在BALB/c小鼠中进行研究，以了解宿主免疫细胞对HER-2靶向疗法的影响。植入的肿瘤通过在动物的两侧皮下注射CT-26-HER2肿瘤细胞(1×106)而建立。在接种肿瘤细胞后第二天开始通过i.p.注射对重组蛋白的处理，每周5次。如图5B所示，4D5scFv-ZZ-mIFN和4D5scFv-huZZ-mIFN都可以以0.05mg/kg的剂量抑制肿瘤生长。huZZ构建体具有比原始ZZ构建体稍好的体内活性。
本领域技术人员会理解的是，对本发明的优选实施方式可以作出许多变化和修改，并且这种变化和修改作出并不会脱离本发明的精神。因此，所附权利要求旨在涵盖落入本发明的真实精神和范围内的所有这些等同变化。
本文档中引用或描述的每个专利、专利申请和出版物的公开内容都以其全部内容结合于本文中作为参考。
实施方式
以下实施方式列表旨在补充而不是取代或代替先前的描述。
实施方式1.一种多功能抗原结合蛋白，包含结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架和至少一种抗原特异性结合结构域，
i.其中结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架包含含有使肽能够模拟蛋白A的IgG结合结构域的突变的人多肽；和
ii.其中至少一个抗原特异性结合结构域包含抗原特异性肽，抗原特异性抗体或其片段，或它们的组合。
实施方式2.实施方式1的多功能抗原结合蛋白，其中结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架包含α2-巨球蛋白受体相关蛋白的一部分。
实施方式3.实施方式2的多功能抗原结合蛋白，其中结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架衍生自包含SEQ ID NO:27的α2-巨球蛋白受体相关蛋白的未突变部分。
实施方式4.前述实施方式中的任一项的多功能抗原结合蛋白，其中至少一种多功能重组蛋白支架包含的多肽：
(a)与如SEQ ID NO:28所示的huZZ为至少90％的同一性；或
(b)与如SEQ ID NO:29所示的huZZ1为至少90％的同一性。
实施方式5.实施方式4的多功能抗原结合蛋白，其中至少一种多功能重组蛋白支架具有SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29所示的序列。
实施方式6.前述实施方式中的任一项的多功能抗原结合蛋白，其中至少一种多功能重组蛋白支架连接于抗原特异性结合结构域并可以结合除了由抗原特异性结合结构域结合的抗原之外的蛋白。
实施方式7.前述实施方式中的任一项的多功能抗原结合蛋白，其中抗原特异性肽包含与SEQ ID NO:12至24中的任一项为至少90％的同一性的多肽。
实施方式8.实施方式1至6中的任一项的多功能抗原结合蛋白，其中抗原特异性抗体包含与如SEQ ID NO:30所示的4D5scFv为至少90％的同一性的多肽。
实施方式9.实施方式8的多功能抗原结合蛋白，所述多功能抗原结合蛋白具有的氨基酸序列：
(a)与如SEQ ID NO:31所示的4D5scFv-huZZ为至少90％的同一性；或
(b)与如SEQ ID NO:32所示的4D5scFv-huZZ1为至少90％的同一性。
实施方式10.前述实施方式中的任一项的多功能抗原结合蛋白，进一步包含提高溶解性的蛋白结构域。
实施方式11.前述实施方式中的任一项的多功能抗原结合蛋白，进一步包含表位标签、荧光团、放射性同位素、酶或它们的任何组合。
实施方式12.实施方式11的多功能抗原结合蛋白，其中所述表位标签是聚组氨酸标签。
实施方式13.前述实施方式中的任一项的多功能抗原结合蛋白，进一步包含具有一个或多个甘氨酸残基的接头，其中所述接头将至少一个多功能重组蛋白支架连接至至少一个抗原特异性结合结构域。
实施方式14.实施方式13的多功能抗原结合蛋白，其中接头包含与SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26为至少90％的同一性的多肽。
实施方式15.前述实施方式中的任一项的多功能抗原结合蛋白，进一步包含干扰素(IFN)多肽或其部分。
实施方式16.实施方式15的多功能抗原结合蛋白，所述多功能抗原结合蛋白具有的氨基酸序列：
(a)与如SEQ ID NO:33所示的4D5scFv-huZZ-hIFN为至少90％的同一性；
(b)与如SEQ ID NO:34所示的4D5scFv-huZZ-mIFN为至少90％的同一性；
(c)与如SEQ ID NO:35所示的4D5scFv-huZZ1-hIFN为至少90％的同一性；或
(d)与如SEQ ID NO:36所示的4D5scFv-huZZ1-mIFN为至少90％的同一性。
实施方式17.一种编码前述实施方式中的任一项的多功能抗原结合蛋白的多核苷酸。
实施方式18.一种经遗传工程改造人表达实施方式17的多核苷酸的细胞。
实施方式19.一种包含实施方式1至16中的任一项的多功能抗原结合蛋白和药用载体的组合物。
实施方式20.一种治疗或预防有此需要的受试者中的疾病的方法，包括向受试者给予治疗有效量的包含实施方式1至16中的任一项的多功能抗原结合蛋白的组合物。
实施方式21.实施方式20的方法，其中疾病与Her2/neu受体中的缺陷相关。
实施方式22.实施方式20或21的方法，其中组合物进一步包含药用载体。
实施方式23.一种检测受试者中所关注的抗原的方法，包括，
向受试者给予实施方式1至16中的任一项的多功能抗原结合蛋白并检测多功能抗原结合蛋白与所关注的抗原的结合。
实施方式24.实施方式23的方法，其中所关注的抗原是Her2/neu受体。
实施方式25.一种检测Her2/neu受体的方法，包括将含有Her2/neu受体的样品暴露于实施方式1至16中的任一项的多功能抗原结合蛋白，并检测多功能抗原结合蛋白与样品的结合。
实施方式26.实施方式25的方法，其中样品是衍生自患有与Her2/neu受体中的缺陷相关的疾病的受试者的生物样品。
实施方式27.一种包含如以下各项所示的序列的多肽：SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ IDNO:36。
实施方式28.一种编码实施方式27的多肽的多核苷酸。
序列表
<110> 宾夕法尼亚大学理事会
<120> 新的IgG结合肽和含有该肽的多功能抗原结合蛋白
<130> 103241.006201
<140> PCT/US2017/037881
<141> 2017-06-16
<150> 62/351,335
<151> 2016-06-17
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 68
<212> PRT
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<223> 人工序列的描述：合成的多肽
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Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu Met Val Gln Ser
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Leu Glu Gln Gln Leu Val Leu Glu Lys Glu Lys Leu Ser Ala Met Gln
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Ala His Leu Ala Gly Lys Met Ala Leu Thr Lys Ala Ser Ser Val Ala
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Ser Ser Asp Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
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Phe Pro Ala Pro Leu Ala Pro Gly Gly Leu Tyr Leu Gly Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
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Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
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Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
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<212> PRT
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<223> 人工序列的描述：合成的多肽
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Gly Gly Gly Ser Met Ala Ser Asp Phe Leu Lys His Cys Gln Ala Asp
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His Leu Leu Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu
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Met Val Gln Ser Leu Glu Gln Gln Leu Val Leu Glu Lys Glu Lys Leu
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Ser Ser Val Ala Ser Ser Asp Lys Leu Glu His His His His His His
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Gly Gly Gly Ser Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala
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Gly Gly Gly Ser Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys
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Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro
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Gln Phe Ile Ser Leu Glu His His His His His His
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Met Ala Phe Cys Asp Gly Phe Tyr Ala Cys Tyr Met Asp Val Gly Gly
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Gly Gly Gly Ser Met Ala Ser Asp Phe Leu Lys His Cys Gln Ala Asp
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His Leu Leu Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu
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His
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Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile
20 25 30
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 16
Tyr Cys Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Cys Tyr
1 5 10
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 17
Tyr Cys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Tyr
1 5 10
<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 18
Tyr Cys Gly Tyr Ser Ser Thr Ser Tyr Cys Phe Val Met Asp
1 5 10
<210> 19
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 19
Tyr Cys Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Tyr Phe Asp
1 5 10 15
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
<400> 20
Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Ser Tyr Cys Tyr Ala Met Asp
1 5 10 15
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 21
Phe Cys Met Glu Glu Ser Gly Gly Asn Tyr Cys Tyr
1 5 10
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 22
Tyr Cys Ala Leu Arg Gly Gly Val Tyr Trp Pro Cys Tyr
1 5 10
<210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 23
Tyr Cys Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Cys Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 24
Tyr Cys Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly Cys Tyr
1 5 10
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 26
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的肽
<400> 26
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 27
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 27
Glu Glu Pro Arg Val Ile Asp Leu Trp Asp Leu Ala Gln Ser Ala Asn
1 5 10 15
Leu Thr Asp Lys Glu Leu Glu Ala Phe Arg Glu Glu Leu Lys His Phe
20 25 30
Glu Ala Lys Ile Gln Gly Asp Gly Tyr Thr Val Lys Lys His Leu Gln
35 40 45
Asp Leu Ser Gly Arg Ile Ser Arg Ala Arg His
50 55
<210> 28
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> F, L, I, V 或 Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> N, Q, K 或 R
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> F 或 Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Y, W, S 或 V
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> L, F, V, Y 或 H
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> H, R, D, N 或 K
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> R, H, Q 或 K
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> N, Q, S, E 或 D,
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> I 或 L
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> Q, S, E, A 或 K
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> S, V, L, G 或 D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> 可能存在或可能不存在
<400> 28
Xaa Glu Pro Arg Val Gln Xaa Leu Xaa Xaa Leu Ala Xaa Xaa Ala Asn
1 5 10 15
Leu Thr Asp Lys Glu Xaa Xaa Ala Phe Xaa Xaa Glu Leu Lys His Phe
20 25 30
Xaa Ala Lys Ile Gln Lys Gly Asp Gly Tyr Thr Val Lys Lys His Leu
35 40 45
Gln Asp Leu Ser Gly Arg Ile Ser Arg Ala Arg His
50 55 60
<210> 29
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 29
Phe Glu Pro Arg Val Gln Asn Leu Phe Tyr Leu Ala Leu His Ala Asn
1 5 10 15
Leu Thr Asp Lys Glu Arg Asn Ala Phe Ile Gln Glu Leu Lys His Phe
20 25 30
Ser Ala Lys Ile Gln Gly Asp Gly Tyr Thr Val Lys Lys His Leu Gln
35 40 45
Asp Leu Ser Gly Arg Ile Ser Arg Ala Arg His
50 55
<210> 30
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 30
Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr
85 90 95
Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala Thr
100 105 110
Pro Ser His Asn Ser His Gln Val Pro Ser Ala Gly Gly Pro Thr Ala
115 120 125
Asn Ser Gly Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
130 135 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asn Ile
145 150 155 160
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
180 185 190
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 31
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (259)..(259)
<223> F, L, I, V 或 Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (265)..(265)
<223> N, Q, K 或 R
<220>
<221> MOD_RES
<222> (267)..(267)
<223> F 或 Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (268)..(268)
<223> Y, W, S 或 V
<220>
<221> MOD_RES
<222> (271)..(271)
<223> L, F, V, Y 或 H
<220>
<221> MOD_RES
<222> (272)..(272)
<223> H, R, D, N 或 K
<220>
<221> MOD_RES
<222> (280)..(280)
<223> R, H, Q 或 K
<220>
<221> MOD_RES
<222> (281)..(281)
<223> N, Q, S, E 或 D,
<220>
<221> MOD_RES
<222> (284)..(284)
<223> I 或 L
<220>
<221> MOD_RES
<222> (285)..(285)
<223> Q, S, E, A 或 K
<220>
<221> MOD_RES
<222> (291)..(291)
<223> S, V, L, G 或 D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (296)..(296)
<223> 可能存在或可能不存在
<400> 31
Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr
85 90 95
Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala Thr
100 105 110
Pro Ser His Asn Ser His Gln Val Pro Ser Ala Gly Gly Pro Thr Ala
115 120 125
Asn Ser Gly Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
130 135 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asn Ile
145 150 155 160
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
180 185 190
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Val Asp Xaa Glu Pro Arg Val Gln Xaa Leu Xaa Xaa Leu Ala Xaa Xaa
260 265 270
Ala Asn Leu Thr Asp Lys Glu Xaa Xaa Ala Phe Xaa Xaa Glu Leu Lys
275 280 285
His Phe Xaa Ala Lys Ile Gln Lys Gly Asp Gly Tyr Thr Val Lys Lys
290 295 300
His Leu Gln Asp Leu Ser Gly Arg Ile Ser Arg Ala Arg His Leu Glu
305 310 315 320
His His His His His His
325
<210> 32
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 32
Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr
85 90 95
Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala Thr
100 105 110
Pro Ser His Asn Ser His Gln Val Pro Ser Ala Gly Gly Pro Thr Ala
115 120 125
Asn Ser Gly Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
130 135 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asn Ile
145 150 155 160
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
180 185 190
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Val Asp Phe Glu Pro Arg Val Gln Asn Leu Phe Tyr Leu Ala Leu His
260 265 270
Ala Asn Leu Thr Asp Lys Glu Arg Asn Ala Phe Ile Gln Glu Leu Lys
275 280 285
His Phe Ser Ala Lys Ile Gln Gly Asp Gly Tyr Thr Val Lys Lys His
290 295 300
Leu Gln Asp Leu Ser Gly Arg Ile Ser Arg Ala Arg His Leu Glu His
305 310 315 320
His His His His His
325
<210> 33
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (259)..(259)
<223> F, L, I, V 或 Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (265)..(265)
<223> N, Q, K 或 R
<220>
<221> MOD_RES
<222> (267)..(267)
<223> F 或 Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (268)..(268)
<223> Y, W, S 或 V
<220>
<221> MOD_RES
<222> (271)..(271)
<223> L, F, V, Y 或 H
<220>
<221> MOD_RES
<222> (272)..(272)
<223> H, R, D, N 或 K
<220>
<221> MOD_RES
<222> (280)..(280)
<223> R, H, Q 或 K
<220>
<221> MOD_RES
<222> (281)..(281)
<223> N, Q, S, E 或 D,
<220>
<221> MOD_RES
<222> (284)..(284)
<223> I 或 L
<220>
<221> MOD_RES
<222> (285)..(285)
<223> Q, S, E, A 或 K
<220>
<221> MOD_RES
<222> (291)..(291)
<223> S, V, L, G 或 D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (296)..(296)
<223> 可能存在或可能不存在
<400> 33
Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr
85 90 95
Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala Thr
100 105 110
Pro Ser His Asn Ser His Gln Val Pro Ser Ala Gly Gly Pro Thr Ala
115 120 125
Asn Ser Gly Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
130 135 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asn Ile
145 150 155 160
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
180 185 190
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Val Asp Xaa Glu Pro Arg Val Gln Xaa Leu Xaa Xaa Leu Ala Xaa Xaa
260 265 270
Ala Asn Leu Thr Asp Lys Glu Xaa Xaa Ala Phe Xaa Xaa Glu Leu Lys
275 280 285
His Phe Xaa Ala Lys Ile Gln Lys Gly Asp Gly Tyr Thr Val Lys Lys
290 295 300
His Leu Gln Asp Leu Ser Gly Arg Ile Ser Arg Ala Arg His Leu Glu
305 310 315 320
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu
325 330 335
Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr
340 345 350
Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys
355 360 365
Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn
370 375 380
Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu
385 390 395 400
Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp
405 410 415
Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg
420 425 430
Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala
435 440 445
Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Leu Glu His His His His
450 455 460
His His
465
<210> 34
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (259)..(259)
<223> F, L, I, V 或 Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (265)..(265)
<223> N, Q, K 或 R
<220>
<221> MOD_RES
<222> (267)..(267)
<223> F 或 Y
<220>
<221> MOD_RES
<222> (268)..(268)
<223> Y, W, S 或 V
<220>
<221> MOD_RES
<222> (271)..(271)
<223> L, F, V, Y 或 H
<220>
<221> MOD_RES
<222> (272)..(272)
<223> H, R, D, N 或 K
<220>
<221> MOD_RES
<222> (280)..(280)
<223> R, H, Q 或 K
<220>
<221> MOD_RES
<222> (281)..(281)
<223> N, Q, S, E 或 D,
<220>
<221> MOD_RES
<222> (284)..(284)
<223> I 或 L
<220>
<221> MOD_RES
<222> (285)..(285)
<223> Q, S, E, A 或 K
<220>
<221> MOD_RES
<222> (291)..(291)
<223> S, V, L, G 或 D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (296)..(296)
<223> 可能存在或可能不存在
<400> 34
Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr
85 90 95
Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala Thr
100 105 110
Pro Ser His Asn Ser His Gln Val Pro Ser Ala Gly Gly Pro Thr Ala
115 120 125
Asn Ser Gly Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
130 135 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asn Ile
145 150 155 160
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
180 185 190
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Val Asp Xaa Glu Pro Arg Val Gln Xaa Leu Xaa Xaa Leu Ala Xaa Xaa
260 265 270
Ala Asn Leu Thr Asp Lys Glu Xaa Xaa Ala Phe Xaa Xaa Glu Leu Lys
275 280 285
His Phe Xaa Ala Lys Ile Gln Lys Gly Asp Gly Tyr Thr Val Lys Lys
290 295 300
His Leu Gln Asp Leu Ser Gly Arg Ile Ser Arg Ala Arg His Leu Glu
305 310 315 320
Gly Gly Gly Gly Ser His Gly Thr Val Ile Glu Ser Leu Glu Ser Leu
325 330 335
Asn Asn Tyr Phe Asn Ser Ser Gly Ile Asp Val Glu Glu Lys Ser Leu
340 345 350
Phe Leu Asp Ile Trp Arg Asn Trp Gln Lys Asp Gly Asp Met Lys Ile
355 360 365
Leu Gln Ser Gln Ile Ile Ser Phe Tyr Leu Arg Leu Phe Glu Val Leu
370 375 380
Lys Asp Asn Gln Ala Ile Ser Asn Asn Ile Ser Val Ile Glu Ser His
385 390 395 400
Leu Ile Thr Thr Phe Phe Ser Asn Ser Lys Ala Lys Lys Asp Ala Phe
405 410 415
Met Ser Ile Ala Lys Phe Glu Val Asn Asn Pro Gln Val Gln Arg Gln
420 425 430
Ala Phe Asn Glu Leu Ile Arg Val Val His Gln Leu Leu Pro Glu Ser
435 440 445
Ser Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Arg Leu Glu His His His His His
450 455 460
His
465
<210> 35
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 35
Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr
85 90 95
Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala Thr
100 105 110
Pro Ser His Asn Ser His Gln Val Pro Ser Ala Gly Gly Pro Thr Ala
115 120 125
Asn Ser Gly Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
130 135 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asn Ile
145 150 155 160
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
180 185 190
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Val Asp Phe Glu Pro Arg Val Gln Asn Leu Phe Tyr Leu Ala Leu His
260 265 270
Ala Asn Leu Thr Asp Lys Glu Arg Asn Ala Phe Ile Gln Glu Leu Lys
275 280 285
His Phe Ser Ala Lys Ile Gln Gly Asp Gly Tyr Thr Val Lys Lys His
290 295 300
Leu Gln Asp Leu Ser Gly Arg Ile Ser Arg Ala Arg His Leu Glu Gly
305 310 315 320
Gly Gly Gly Ser Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys
325 330 335
Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu
340 345 350
Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile
355 360 365
Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe
370 375 380
Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp
385 390 395 400
Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe
405 410 415
Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys
420 425 430
Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala
435 440 445
Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Leu Glu His His His His His
450 455 460
His
465
<210> 36
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 36
Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr
85 90 95
Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala Thr
100 105 110
Pro Ser His Asn Ser His Gln Val Pro Ser Ala Gly Gly Pro Thr Ala
115 120 125
Asn Ser Gly Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
130 135 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asn Ile
145 150 155 160
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
180 185 190
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Val Asp Phe Glu Pro Arg Val Gln Asn Leu Phe Tyr Leu Ala Leu His
260 265 270
Ala Asn Leu Thr Asp Lys Glu Arg Asn Ala Phe Ile Gln Glu Leu Lys
275 280 285
His Phe Ser Ala Lys Ile Gln Gly Asp Gly Tyr Thr Val Lys Lys His
290 295 300
Leu Gln Asp Leu Ser Gly Arg Ile Ser Arg Ala Arg His Leu Glu Gly
305 310 315 320
Gly Gly Gly Ser His Gly Thr Val Ile Glu Ser Leu Glu Ser Leu Asn
325 330 335
Asn Tyr Phe Asn Ser Ser Gly Ile Asp Val Glu Glu Lys Ser Leu Phe
340 345 350
Leu Asp Ile Trp Arg Asn Trp Gln Lys Asp Gly Asp Met Lys Ile Leu
355 360 365
Gln Ser Gln Ile Ile Ser Phe Tyr Leu Arg Leu Phe Glu Val Leu Lys
370 375 380
Asp Asn Gln Ala Ile Ser Asn Asn Ile Ser Val Ile Glu Ser His Leu
385 390 395 400
Ile Thr Thr Phe Phe Ser Asn Ser Lys Ala Lys Lys Asp Ala Phe Met
405 410 415
Ser Ile Ala Lys Phe Glu Val Asn Asn Pro Gln Val Gln Arg Gln Ala
420 425 430
Phe Asn Glu Leu Ile Arg Val Val His Gln Leu Leu Pro Glu Ser Ser
435 440 445
Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Arg Leu Glu His His His His His His
450 455 460
<210> 37
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多肽
<400> 37
Gly Ala Gly Thr Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Thr Ala Phe Gln
1 5 10 15
Lys Ala Leu Lys Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser
20 25 30
Ala Thr Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser
35 40 45
Leu Ser Glu Lys Tyr Ser Asn Val Ile Phe Leu Glu Val Asp Val Asp
50 55 60
Asp Cys Gln Asp Val Ala Ser Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr
65 70 75 80
Phe Gln Phe Phe Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala
85 90 95
Asn Lys Lys Lys Leu Glu Ala Thr Ile Asn Lys Leu Val
100 105
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的6xHis标签
<400> 38
His His His His His His
1 5

Claims (22)

1.一种多功能抗原结合蛋白，包含结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架和至少一种抗原特异性结合结构域，
其中，所述结合于IgG的至少一种多功能重组蛋白支架包含人多肽，所述人多肽含有使该肽能够模拟蛋白A的IgG结合结构域的突变；
其中，所述至少一个抗原特异性结合结构域包含抗原特异性肽、抗原特异性抗体，或它们的组合；并且
所述至少一种多功能重组蛋白支架由SEQ ID NO : 29所示的序列组成。
2.根据权利要求1所述的多功能抗原结合蛋白，其中，所述至少一种多功能重组蛋白支架与所述抗原特异性结合结构域连接，并能够结合至除了能够由所述抗原特异性结合结构域结合的抗原之外的蛋白。
3.根据权利要求1所述的多功能抗原结合蛋白，其中，所述抗原特异性肽是SEQ ID NO :12至17以及SEQ ID NO : 24中的任一项的多肽。
4.根据权利要求1所述的多功能抗原结合蛋白，其中，所述抗原特异性抗体是如SEQ IDNO : 30所示的4D5scFv的多肽。
5.根据权利要求4所述的多功能抗原结合蛋白，所述多功能抗原结合蛋白具有如SEQID NO : 32所示的4D5scFv-huZZ1的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的多功能抗原结合蛋白，进一步包含提高溶解性的蛋白结构域。
7.根据权利要求1所述的多功能抗原结合蛋白，进一步包含表位标签、荧光团、放射性同位素、酶或它们的任何组合。
8.根据权利要求7所述的多功能抗原结合蛋白，其中，所述表位标签是聚组氨酸标签。
9.根据权利要求1所述的多功能抗原结合蛋白，进一步包含具有一个或多个甘氨酸残基的接头，其中，所述接头将所述至少一个多功能重组蛋白支架与所述至少一个抗原特异性结合结构域连接。
10.根据权利要求9所述的多功能抗原结合蛋白，其中，所述接头是SEQ ID NO : 25或SEQ ID NO : 26的多肽。
11.根据权利要求1所述的多功能抗原结合蛋白，进一步包含干扰素（IFN）多肽。
12.根据权利要求11所述的多功能抗原结合蛋白，所述多功能抗原结合蛋白具有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：
（a）如SEQ ID NO : 35所示的4D5scFv-huZZ1-hIFN；和
（b）如SEQ ID NO : 36所示的4D5scFv-huZZ1-mIFN。
13.一种编码根据权利要求1至12中的任一项所述的多功能抗原结合蛋白的多核苷酸。
14.一种经遗传工程改造以表达根据权利要求13所述的多核苷酸的细胞。
15.一种包含根据权利要求1至12中的任一项所述的多功能抗原结合蛋白和药用载体的组合物。
16.治疗有效量的包含根据权利要求1至12中的任一项所述的多功能抗原结合蛋白的组合物在制备用于治疗或预防需要其的受试者中的疾病的药物中的应用。
17.根据权利要求16所述的应用，其中，所述疾病与Her2/neu受体中的缺陷有关。
18.根据权利要求16或17所述的应用，其中，所述组合物进一步包含药用载体。
19.根据权利要求1至12中的任一项所述的多功能抗原结合蛋白在制备用于检测受试者中所关注的抗原的制剂中的应用，其中，所述检测包括向所述受试者给予所述多功能抗原结合蛋白，和检测所述多功能抗原结合蛋白与所述所关注的抗原的结合。
20.根据权利要求19所述的应用，其中，所关注的抗原是Her2/neu受体。
21.根据权利要求1至12中的任一项所述的多功能抗原结合蛋白在制备用于检测Her2/neu受体的制剂中的应用，其中，所述检测包括将含有所述Her2/neu受体的样品暴露于所述多功能抗原结合蛋白，和检测所述多功能抗原结合蛋白与所述样品的结合。
22.根据权利要求21所述的应用，其中，所述样品是衍生自患有与所述Her2/neu受体中的缺陷相关的疾病的受试者的生物样品。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103649326A (zh) * 2011-03-08 2014-03-19 宾夕法尼亚大学理事会 用于治疗和诊断用途的抗体样蛋白
WO2015041303A1 (ja) * 2013-09-18 2015-03-26 東ソー株式会社 Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤、ならびに当該吸着剤を用いた抗体の精製方法および識別方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010120514A2 (en) * 2009-03-31 2010-10-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Antigen-binding proteins comprising recombinant protein scaffolds
EP2432487B1 (en) * 2009-05-21 2016-03-02 American National Red Cross Inhibition of prion protein propagation by receptor associated protein (rap). its derivatives, mimetics and synthetic peptides
EP4137519A1 (en) * 2013-08-09 2023-02-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Fusion protein comprising ifn-gamma and anti-erbb antibody for the treatment of cancers

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103649326A (zh) * 2011-03-08 2014-03-19 宾夕法尼亚大学理事会 用于治疗和诊断用途的抗体样蛋白
WO2015041303A1 (ja) * 2013-09-18 2015-03-26 東ソー株式会社 Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤、ならびに当該吸着剤を用いた抗体の精製方法および識別方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"PREDICTED: alpha-2-macroglobulin receptor-associated protein isoform X2 [Pan paniscus]，Accession number：XP_008957232";Genbank;《Genbank》;20140902;第1页 *

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