JP2013502421A - 癌治療のためのcd44融合タンパク質の使用方法 - Google Patents
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Abstract
CD44拮抗薬を用いた医薬組成物及び癌の治療方法を開示する。特定の側面においてこれらの医薬組成物及び方法は、神経膠腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、胃癌、食道癌、頭部癌、頸部癌、膵癌、又は黒色腫などの癌を有する哺乳動物を、CD44融合タンパク質を用いて治療する工程を含む。これらCD44融合タンパク質はCD44−Fc融合タンパク質を含み、かつ、ヒアルロン酸の検出に用いることができる。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
(関連出願)
[0001]本出願は2009年8月21日に出願の米国仮特許出願第61/274,813号の優先権を主張し、その全文は参照により本明細書に組み込まれる。
[0001]本出願は2009年8月21日に出願の米国仮特許出願第61/274,813号の優先権を主張し、その全文は参照により本明細書に組み込まれる。
(政府後援研究に関する説明)
[0002]国防総省、陸軍感染症研究所からの助成金W81XWH−06−1−0246及び国立衛生研究所、国立癌研究所からの助成金R01CA135158−01A1による資金援助を受けたことに基づき、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
[0002]国防総省、陸軍感染症研究所からの助成金W81XWH−06−1−0246及び国立衛生研究所、国立癌研究所からの助成金R01CA135158−01A1による資金援助を受けたことに基づき、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
(技術分野)
[0003]本発明は、CD44融合タンパク質及びこれら融合タンパク質の誘導体を含む医薬組成物、並びにCD44融合タンパク質及びこれら融合タンパク質の誘導体を用いる癌の治療法に関する。特定の側面においてこれらの医薬組成物及び方法は、神経膠腫を含む癌を治療するための、及び癌の外科的切除を含む様々な治療介入後の癌再発を防止するための、単剤としてのCD44融合タンパク質の使用、及びその他の抗癌治療との併用におけるCD44融合タンパク質の使用を含む。その他の側面においてこれらの医薬組成物及び方法は、神経膠腫及びその他の癌型を治療するためのその他の抗癌治療と併用するための、又はその他の抗癌治療の前若しくは後における、CD44融合タンパク質の使用を含む。その他の治療介入を行った後に、癌幹細胞の拡大を阻止するため、及び癌の再発及び転移を遅らせる又は停止させるための維持療法としてCD44融合タンパク質を用いることができる。別の側面では、その他の抗癌治療と並行して投与される医薬組成物又は方法の組み合わせは、神経膠腫及びその他の癌型の治療に相乗効果をもたらす。その他の側面においてこれらの医薬組成物及び方法は、早期の癌診断及び予後、並びに抗癌治療に対する患者の反応を評価するための、HAを含むCD44リガンドを検出するためのCD44融合タンパク質の使用を含む。
[0003]本発明は、CD44融合タンパク質及びこれら融合タンパク質の誘導体を含む医薬組成物、並びにCD44融合タンパク質及びこれら融合タンパク質の誘導体を用いる癌の治療法に関する。特定の側面においてこれらの医薬組成物及び方法は、神経膠腫を含む癌を治療するための、及び癌の外科的切除を含む様々な治療介入後の癌再発を防止するための、単剤としてのCD44融合タンパク質の使用、及びその他の抗癌治療との併用におけるCD44融合タンパク質の使用を含む。その他の側面においてこれらの医薬組成物及び方法は、神経膠腫及びその他の癌型を治療するためのその他の抗癌治療と併用するための、又はその他の抗癌治療の前若しくは後における、CD44融合タンパク質の使用を含む。その他の治療介入を行った後に、癌幹細胞の拡大を阻止するため、及び癌の再発及び転移を遅らせる又は停止させるための維持療法としてCD44融合タンパク質を用いることができる。別の側面では、その他の抗癌治療と並行して投与される医薬組成物又は方法の組み合わせは、神経膠腫及びその他の癌型の治療に相乗効果をもたらす。その他の側面においてこれらの医薬組成物及び方法は、早期の癌診断及び予後、並びに抗癌治療に対する患者の反応を評価するための、HAを含むCD44リガンドを検出するためのCD44融合タンパク質の使用を含む。
[0004]標準的な抗癌治療は主に、正常な細胞と腫瘍細胞とを区別する腫瘍細胞の特性、一般的にはより高い増殖速度及び明確に異なる代謝性要求を標的とするものである。標準的な化学療法は特定の群の悪性腫瘍にとっては有効であるが、重篤な毒性を有することから、大部分の固形腫瘍に対する効果は限定的である。より近年の標的治療法は、特定の過剰に活性化した癌遺伝子及び癌細胞中のキナーゼを標的とするように設計されている。それらは通常、化学療法よりも毒性の低いものであるが、それらの効果は、腫瘍細胞の不均一性、それらの依存度を異常なシグナル伝達経路から別の経路へと切り替える能力、及び新しい変異を獲得した抵抗性クローンの出現により制限されている。従って、単に癌細胞を標的としても、大部分の固形悪性腫瘍は治癒できそうにないことが次第に明らかとなってきている(Araujo et al., 2007; Zhang et al., 2009)。最近の数多くの観察から蓄積されたデータは、宿主の微小環境が癌の進行に本質的に寄与し、癌幹細胞ニッチの維持を補助し、そして治療に対する癌細胞の反応を調節することを示しており、このことは、腫瘍微小環境の要素が抗癌治療の重要な標的となり得ることを意味している(Gilbertson and Rich, 2007;Hideshima et al., 2007;Hoelzinger et al., 2007;Mantovani et al., 2008;Mishra et al., 2009;Podar et al., 2009)。
[0005]腫瘍微小環境には、内皮細胞、周細胞、白血球、及び線維芽細胞を含む浸潤宿主細胞、並びに細胞外マトリックス(ECM)の構成要素が含まれる。腫瘍細胞間及びそれらの微小環境間における重要な相互作用及びクロストークは、細胞間接着を含むそれらの表面受容体、及び潜在的な治療標的であるECM受容体によって仲介されている。例えば、多発性骨髄腫(MM)細胞のECMへの接着が細胞接着依存性薬剤耐性(CAMDR)を付与していることが、上手く示されている(Hideshima et al., 2007)。MMのCAMDRの根底をなす分子基盤については現在も研究が行われているが、宿主微小環境間の相互作用及びその相互作用によって活性化されるシグナル伝達経路の下流にある数多くのその他の癌型についての研究はあまり行われていない。腫瘍細胞−ECM間相互作用において重要な調節物質、並びにそれに対応し、癌の進行及び治療への耐性を促進する下流のシグナル伝達経路を同定することは、癌細胞及びそれらの微小環境を同時に標的とする、新規で、かつ、より効果的な治療法の開発に役立つと考えられる。
[0006]神経膠腫は原発性脳腫瘍の最も一般的な型であり、かつ、神経前駆細胞の形質転換から生じ得る様々な度合いの分化及び悪性度を有する一群の腫瘍を構成する(Giese et al., 2003;Maher et al., 2001)。これらの腫瘍の内で最も悪性なものは多形性膠芽腫(GBM)としても知られる星細胞腫のグレード4であり、これは高い浸潤特性及び非常に高い化学療法剤耐性を示す。積極的で多様な治療にも関わらず、GBMは不治であり、予測される平均生存期間は1年未満であり、5年を超えて生存する患者の割合は5%未満である(Davis et al., 1998)。そのため、化学療法剤及び現存する標的治療に対するGBMの耐性を低減させるための新規治療標的の同定、新しい薬剤及び新規併用療法を開発する必要に迫られている。
[0007]中枢神経系には、ヒアルロン酸又はヒアルロナンとしても知られている、高レベルで広範囲に分布したグリコサミノグリカン ヒアルロン酸(HA)が含まれている(Park et al, 2008)。神経膠腫では、主要な細胞表面HA受容体であり、細胞間接着及び細胞−マトリックス間接着に介在し、細胞移動及びシグナル伝達を促進するCD44が発現される(Stamenkovic and Yu, 2009)。CD44は多形性細胞表面受容体であり、様々な細胞機能に関与する(Sherman et al., 1994;Stamenkovic, 2000;Stamenkovic I, 2009;Toole, 2004)。CD44は様々な悪性腫瘍において亢進され、その発現の上昇は、いくつかの癌型の予後不良とも関連している(Lim et al., 2008;Matsumura and Tarin, 1992;Pals et al., 1989;Yang et al., 2008)。CD44は黒色腫(Ahrens et al, 2001;Guo et al., 1994)及び乳癌(Yu and Stamenkovic, 1999, 2000;Yu et al., 1997)の成長及び進行において重要な役割を担っていると考えられている。しかし悪性神経膠腫の進行、並びにGBM細胞及びその他の型の癌細胞の化学療法及び標的治療に対する反応においてCD44がどの程度寄与しているかについてはほとんど分かっていない。
[0008]CD44が複数のシグナル伝達構成要素を関連があり、複数の受容体チロシンキナーゼ(TK)のコレセプターとして役立つことが示されてきているが(Sherman et al., 1994;Stamenkovic, 2000;Toole, 2004)、これまでのところ、CD44によって制御されるシグナル伝達経路の全体は1つも明らかになっていない。CD44の細胞質ドメインは、エズリン−ラジキシン−モエシン(ERM)ファミリータンパク質(Tsukita and Yonemura, 1997)及びマーリン(Morrison et al., 2001;Sainio et al., 1997)を含むBand 4.1スーパーファミリーのメンバーと相互作用して皮質アクチンフィラメントと原形質膜との間のリンカーとなり、そしてアクチン細胞骨格の編成及び細胞運動を制御する(McClatchey and Giovannini, 2005;Okada et al., 2007)。ショウジョウバエ(Drosophila)においてマーリンは、細胞増殖の抑制及び分化段階にある上皮細胞のアポトーシスの促進に重要な役割を担うヒッポ(Hpo)シグナル伝達経路の上流で機能する(Hamaratoglu et al., 2006;Huang et al., 2005;Pellock et al., 2007)。ショウジョウバエのhpo遺伝子は、セリン/トレオニンキナーゼであるワーツ(Wts)をリン酸化して活性化させる、セリン/トレオニンキナーゼをコードしている。ワーツは、転写コアクチベーターであるヨーキー(Yki)をリン酸化して不活性化し、その結果、dIAP及びサイクリンEを含む、共通した一連の下流標的遺伝子が抑制される(Hamaratoglu et al., 2006;Huang et al., 2005;Matallanas et al., 2008;Pellock et al., 2007)。まだ完全には解明されていないが、ヒッポ経路は哺乳類に保存されていると考えられており、そのいくつかの構成要素は腫瘍のサプレッサーであると予想されている(Lau et al., 2008;Zeng and Hong, 2008)。Hpo、Wts、Yki、及びdIAPの哺乳類ホモログはそれぞれ、Mammalian Sterile Twenty様(MST)キナーゼ1及び2(MST1/2)(Lehtinen et al., 2006;Ling et al., 2008;Matallanas et al., 2008)、Large tumor suppressorホモログ1及び2(Lats1及び2)(Hao et al., 2008;Takahashi et al., 2005)、Yes−関連タンパク質(YAP)(Overholtzer et al., 2006)、及びcellular Inhibitor of Apoptosis(cIAP1/2)(Srinivasula and Ashwell, 2008)である。哺乳類のヒッポシグナル伝達経路の上流にある構成要素は同定されていない。
[0009]神経膠腫を含む多くの悪性腫瘍に対して現在使用可能な治療の効果は相対的に低く、かつ、これらの疾患を有する患者の予後は不良であり、診断後の予測余命が短い。そのため、治療のための新しい標的、薬剤、及び併用療法が必要である。加えて、神経膠腫及びそれらの幹細胞を含む腫瘍細胞全体、並びにそれらの微小環境を同時に標的とすることができるものは特に有効となるだろう。本発明はそのような方法を提供するものである。
[0010]本発明の特定の態様では、治療介入のため又は哺乳動物の癌の再発を阻害するための方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要とする哺乳動物に、CD44の細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含む有効量のCD44融合タンパク質を投与する工程を含み、ここで癌は神経膠腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、黒色腫、腎細胞癌、胃癌、食道癌、膵癌、肝臓癌、又は頭頸部癌である。
[0011]本発明の特定の側面では、哺乳動物における癌の治療方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要とする哺乳動物に、CD44の細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含む有効量のCD44融合タンパク質、及び任意に薬学上許容可能な担体又は希釈剤を投与する工程を含み、ここでCD44融合タンパク質は、CD44融合タンパク質をコードしている発現ベクターを含むウイルスを介して投与される。
[0012]本発明の特定の側面では、哺乳動物における癌の治療方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要とする哺乳動物に、CD44の細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含む有効量のCD44融合タンパク質、及びb)薬学上許容可能な担体又は希釈剤を投与する工程を含み、ここでCD44融合タンパク質は精製タンパク質として投与される。
[0013]本発明の特定の側面では、哺乳動物における癌の治療方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要とする哺乳動物に、CD44の細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含む有効量のCD44融合タンパク質を投与する工程を含み、ここでCD44の細胞外ドメインは、CD44s、CD44v3−v10、CD44v8−v10、CD44v4−vl0、CD44v5−v10、CD44v6−v10、CD44v7−v10、CD44v9−v10、CD44v10、CD44v9、CD44v8、CD44v7、CD44v6、CD44v5、CD44v4、CD44v3、CD44sR41A、CD44v3−v10R41A、CD44v8−v10R41A、CD44v4−v10R41A、CD44v5−v10R41A、CD44v6−v10R41A、CD44v7−v10R41A、CD44v9−v10R41A、CD44v10R41A、CD44v9R41A、CD44v8R41A、CD44v7R41A、CD44v6R41A、CD44v5R41A、CD44v4R41A、又はCD44v3R41Aである。
[0014]本発明のその他の態様では、a)CD44の細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含むCD44融合タンパク質、ここでCD44の細胞外ドメインはCD44v3−v10、CD44v8−v10、CD44s、CD44v4−v10、CD44v5−v10、CD44v6−v10、CD44v7−v10、CD44v9−v10、CD44v10、CD44v9、CD44v8、CD44v7、CD44v6、CD44v5、CD44v4、CD44v3、CD44sR41A、CD44v3−v10R41A、CD44v8−v10R41A、CD44v4−v10R41A、CD44v5−v10R41A、CD44v6−v10R41A、CD44v7−v10R41A、CD44v9−v10R41A、CD44v10R41A、CD44v9R41A、CD44v8R41A、CD44v7R41A、CD44v6R41A、CD44v5R41A、CD44v4R41A、又はCD44v3R41Aであり、及びb)薬学上許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
[0015]本発明のその他の側面では、哺乳動物における癌の治療方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要とする哺乳動物に、CD44の細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含む有効量のCD44融合タンパク質を、1つ以上のさらなる抗癌治療と共に投与する工程を含む。
[0016]本発明の特定の側面において、さらなる抗癌治療とは、外科的な治療、化学療法、放射線治療、標的治療、及び免疫療法である。本発明の特定の側面においてさらなる抗癌治療とは、放射線治療である。本発明のその他の側面においてさらなる抗癌治療とは、外科的な治療である。
[0017]本発明の特定の側面において、さらなる抗癌治療とは、化学療法である。本発明の特定の側面において化学療法とは、テモゾロミド、カルムスチン、ドセタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、エピルビシン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、サトラプラチン、イクサベピロン、パシタキセル(pacitaxel)、ゲムシタビン、カペシタビン、ドキソルビシン、エトポシド、メルファラン、ヘキサメチルアミン、イリノテカン、又はトポテカンである。本発明の別の側面において化学療法とは、テモゾロミド又はカルムスチンである。
[0018]本発明の特定の側面において、さらなる抗癌治療とは、標的治療である。本発明の特定の側面において標的治療とは、受容体チロシン阻害剤である。本発明の特定の側面において標的治療とは、erbB受容体の阻害剤である。本発明の特定の側面において標的治療とは、c−Metの阻害剤である。本発明の特定の側面において標的治療とは、VEGFRの阻害剤である。本発明の特定の側面において標的治療とは、アポトーシス及びストレス応答を促進する薬剤である。本発明の特定の側面において標的治療とは、Wntシグナル伝達経路の阻害剤である。本発明の特定の態様において標的治療とは、トラスツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、BIBW2992、CI−1033、PF−2341066、PF−04217903、AMG 208、JNJ−38877605、MGCD−265、SGX−523、GSK1363089、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、BIBF1120、パゾパニブ、ベバシズマブ、バタラニブ、アキシチニブ、E7080、ペリホシン、MK−2206、テムシロリムス、ラパマイシン、BEZ235、GDC−0941、PLX−4032、イマチニブ、AZD0530、ボルテゾミブ、XAV−939、アドベキシン(Ad5CMV−p53)、Genentech−化合物8/cIAP−XIAP阻害剤、又はAbbott Laboratories−化合物11である。
[0019]本発明のその他の態様では、a)CD44の細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含むCD44融合タンパク質、ここでCD44の細胞外ドメインはCD44v3−v10、CD44v8−v10、CD44s、CD44v4−v10、CD44v5−v10、CD44v6−v10、CD44v7−v10、CD44v9−v10、CD44v10、CD44v9、CD44v8、CD44v7、CD44v6、CD44v5、CD44v4、CD44v3、CD44sR41A、CD44v3−v10R41A、CD44v8−v10R41A、CD44v4−v10R41A、CD44v5−v10R41A、CD44v6−v10R41A、CD44v7−v10R41A、CD44v9−v10R41A、CD44v10R41A、CD44v9R41A、CD44v8R41A、CD44v7R41A、CD44v6R41A、CD44v5R41A、CD44v4R41A、又はCD44v3R41Aであり、及びb)癌細胞において細胞毒性又は細胞増殖抑制性ストレスを誘導する少なくとも1つの治療薬、及びc)薬学上許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
[0020]本発明の別の態様では、a)CD44の細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含むCD44融合タンパク質、ここでCD44の細胞外ドメインはCD44v3−v10、CD44v8−v10、CD44s、CD44v4−v10、CD44v5−v10、CD44v6−v10、CD44v7−v10、CD44v9−v10、CD44v10、CD44v9、CD44v8、CD44v7、CD44v6、CD44v5、CD44v4、CD44v3、CD44sR41A、CD44v3−v10R41A、CD44v8−v10R41A、CD44v4−v10R41A、CD44v5−v10R41A、CD44v6−v10R41A、CD44v7−v10R41A、CD44v9−v10R41A、CD44v10R41A、CD44v9R41A、CD44v8R41A、CD44v7R41A、CD44v6R41A、CD44v5R41A、CD44v4R41A、又はCD44v3R41Aであり、b)癌細胞中のEGFR/erbB−2/erbB−3/erbB−4/c−Met/VEGFRRTKを阻害する少なくとも1つの治療薬、及びc)薬学上許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。本発明の特定の側面では、EGFR/erbB−2/erbB−4/c−Met/VEGFR RTKの阻害剤としては、トラスツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、BIBW2992、CI−1033、PF−2341066、PF−04217903、AMG 208、JNJ−38877605、MGCD−265、SGX−523、GSK1363089、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、BIBF1120、パゾパニブ、ベバシズマブ、バタラニブ、アキシチニブ、及びE7080が挙げられる。
[0021]本発明の別の態様では、a)CD44の細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含むCD44融合タンパク質、ここでCD44の細胞外ドメインは、CD44v3−v10、CD44v8−v10、CD44s、CD44v4−v10、CD44v5−v10、CD44v6−v10、CD44v7−vl0、CD44v9−v10、CD44v10、CD44v9、CD44v8、CD44v7、CD44v6、CD44v5、CD44v4、CD44v3、CD44sR41A、CD44v3−10R41A、CD44v8−v10R41A、CD44v4−v10R41A、CD44v5−v10R41A、CD44v6−v10R41A、CD44v7−v10R41A、CD44v9−v10R41A、CD44v10R41A、CD44v9R41A、CD44v8R41A、CD44v7R41A、CD44v6R41A、CD44v5R41A、CD44v4R41A、又はCD44v3R41Aであり、b)癌細胞中のIAPを阻害する又はストレスを促進する少なくとも1つの治療薬、及びc)薬学上許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。本発明の特定の側面では、IAP阻害剤又はストレス促進剤としては、アドベキシン(Ad5CMV−p53)、Genentech−化合物8/cIAP−XIAP阻害剤、Abbott Laboratories−化合物11、ペリホシン、MK−2206、テムシロリムス、ラパマイシン、BEZ235、GDC−0941、PLX−4032、イマチニブ、AZD0530、ボルテゾミブ、又はAV−939が挙げられる。
[0022]本発明のその他の態様では、a)CD44の細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含むCD44融合タンパク質をコードしている発現ベクターを含むウイルス、ここでCD44の細胞外ドメインはCD44v3−v10、CD44v8−v10、CD44s、CD44v4−v10、CD44v5−v10、CD44v6−v10、CD44v7−v10、CD44v9−v10、CD44v10、CD44v9、CD44v8、CD44v7、CD44v6、CD44v5、CD44v4、CD44v3、CD44sR41A、CD44v3−v10R41A、CD44v8−v10R41A、CD44v4−v10R41A、CD44v5−v10R41A、CD44v6−v10R41A、CD44v7−v10R41A、CD44v9−v10R41A、CD44v10R41A、CD44v9R41A、CD44v8R41A、CD44v7R41A、CD44v6R41A、CD44v5R41A、CD44v4R41A、又はCD44v3R41Aであり、及びb)薬学上許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
[0023]上記態様の特定の側面では、癌は神経膠腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、黒色腫、腎細胞癌、胃癌、食道癌、膵癌、肝臓癌又は頭頸部癌である。本発明の特定の態様において神経膠腫は、星細胞腫である。本発明のその他の態様において神経膠腫は、多形性膠芽腫である。本発明の特定の態様において哺乳動物はヒトである。
[0024]上記態様の特定の側面においてCD44の細胞外ドメインは、CD44v3−v10である。上記態様のその他の側面においてCD44の細胞外ドメインは、CD44v8−v10である。上記態様の別の側面においてCD44の細胞外ドメインは、CD44sである。上記態様の別の側面においてCD44の細胞外ドメインは、CD44v6−v10である。
[0025]本発明のその他の態様では、試料中のヒアルロン酸を検出する方法を提供し、この方法は、試料をCD44の細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含む、標識したCD44融合タンパク質に接触させる工程を含む。特定の態様において試料は癌生検又は癌切片である。その他の態様において試料は患者の体液試料であり、血液、血清、血漿、又は尿である。その他の態様において標識は、ビオチン、蛍光標識、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、磁気ビーズ、又は放射性標識である。一層さらに別の側面においてこの方法は、試料中で標識したCD44融合タンパク質をインキュベートする工程及びヒアルロン酸に結合した標識を定量する工程を含む。一層さらに別の側面においてCD44の細胞外ドメインは、CD44v3−v10、CD44v8−v10、CD44s、CD44v4−v10、CD44v5−v10、CD44v6−v10、CD44v7−vl0、CD44v9−v10、CD44v10、CD44v9、CD44v8、CD44v7、CD44v6、CD44v5、CD44v4、又はCD44v3である。
[0026]本発明のその他の態様では、哺乳動物における癌の診断方法を提供する。この方法は、ヒアルロン酸の検出について記載した任意の方法に従って、哺乳動物から得た試料中のヒアルロン酸を検出する工程を含み、そして試料中のヒアルロン酸の量が正常な対照試料よりも高いことが癌の存在を示すものとなる。特定の態様において癌は、神経膠腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌、膵癌、又は黒色腫である。特定のその他の態様においてこの方法は、試料中のCD44を検出する工程からさらになり、ここで試料中のヒアルロン酸及びCD44の量が正常な対照試料よりも高いことが癌の存在を示すものとなる。
[0027]本発明のその他の態様では、哺乳動物における癌の状態の変化を決定する方法を提供する。この方法は、哺乳動物から第1の試料を回収する工程、ヒアルロン酸の検出について記載した任意の方法に従って、哺乳動物から得られた第1の試料中のヒアルロン酸を検出する工程、哺乳動物から第2の試料を回収する工程、ヒアルロン酸の検出について記載した任意の方法に従って、哺乳動物から得られた第2の試料中のヒアルロン酸を検出する工程を含み、ここで第2の試料中のヒアルロン酸量と第1の試料におけるヒアルロン酸量の差が、この哺乳動物における癌の状態の変化を示すものとなる。
[0028]本発明のこれら及びその他の側面は、本明細書、請求項及び図表を考慮することにより、当業者に明かとなるであろう。
[0092]本発明は、哺乳動物の癌を治療、予防、又は診断するための医薬組成物及び方法を提供する。本発明はさらに、哺乳動物の神経膠腫を治療又は予防するための医薬組成物及び方法を提供する。本発明は、哺乳動物の多形性膠芽腫及びその他の癌型を治療又は予防するための医薬組成物及び方法を提供する。本発明はさらに、神経膠腫細胞及びその他の癌型の細胞の、神経膠腫及びその他の癌型への治療による酸化、細胞毒性及び標的治療ストレスに対する感受性を高めるための医薬組成物及び方法を対象とする。酸化ストレスは、化学療法又は放射線治療を含むがこれらには限定されない治療によって誘導される。一側面では、CD44拮抗薬として作用するCD44融合タンパク質を、神経膠腫又は結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、黒色腫、腎細胞癌、胃癌、食道癌、膵癌、肝臓癌、及び頭頸部癌を含むその他の癌型の治療、予防、又は診断のために哺乳動物に投与する。別の側面では、癌幹細胞を除去及び/又は抑制するために、CD44融合タンパク質を単独で及び/又はその他の治療介入と併用して投与する。標的治療はEGFR、erbB−2、erbB−3、erbB−4及びc−Met受容体キナーゼ又はその他の受容体チロシンキナーゼの阻害剤であってもよい。別の側面では、標的治療はcIAP、XIAP、及びサバイビンを含むIAPの阻害剤であってもよい。一層さらに別の側面では、標的治療はp53、p21、プーマ、及びp38/JNKキナーゼのエンハンサー/刺激剤/安定化剤である。別の側面において標的治療は、PI3K、mTOR、プロテアソーム阻害剤、及び血管形成阻害剤の阻害剤を含む、癌細胞に対するアポトーシスストレスを促進する又は誘導する薬剤である。一層さらに別の側面において標的治療は、Wntシグナル伝達経路の阻害剤である。
神経膠腫
[0093]神経膠腫は原発性脳腫瘍の最も一般的な型であり、かつ、神経前駆細胞の形質転換から生じ得る様々な度合いの分化及び悪性度を有する一群の腫瘍を構成する(Giese et al., 2003; Maher et al., 2001)。これらの腫瘍の内で最も悪性なものは多形性膠芽腫(GBM)としても知られる星細胞腫の悪性度4であり、化学療法、放射線治療、及び現存する標的治療に対するその耐性から、星細胞腫の悪性度4は不治である(Davis et al., 1998)。本実施例において示したように神経膠腫は、高レベルの、主要な細胞表面HA受容体であるCD44を発現している。
[0093]神経膠腫は原発性脳腫瘍の最も一般的な型であり、かつ、神経前駆細胞の形質転換から生じ得る様々な度合いの分化及び悪性度を有する一群の腫瘍を構成する(Giese et al., 2003; Maher et al., 2001)。これらの腫瘍の内で最も悪性なものは多形性膠芽腫(GBM)としても知られる星細胞腫の悪性度4であり、化学療法、放射線治療、及び現存する標的治療に対するその耐性から、星細胞腫の悪性度4は不治である(Davis et al., 1998)。本実施例において示したように神経膠腫は、高レベルの、主要な細胞表面HA受容体であるCD44を発現している。
[0094]細胞毒性薬、放射線及び標的治療への耐性が、GBM及びその他の悪性癌の治療を成功させるための主な障害となっている。増加している証拠は、神経膠腫CSCを含む、化学療法及び放射線治療に対する高い耐性をもつ癌幹細胞(CSC)の存在、及びこれらが治療介入後の、GBMを含む悪性癌の再発の原因であることを示唆している(Hambardzumyan et al., 2008; Reya et al., 2001)。膠芽腫CSCの形成及び維持におけるCD44の役割を明らかにする試みは始まったばかりであるが、CD44は白血病及び乳、結腸、卵巣、前立腺、膵臓、及び頭頸部癌を含む数多くの腫瘍における主要な細胞表面CSCマーカーとして確立されている(Croker and Allan, 2008; Reya et al. 2001; Stamenkovic and Yu, 2009)。CD44が骨髄における白血病CSCの生着に必要であること(Jin et al., 2006; Krause et al., 2006)、及び結腸直腸癌CSCと機能的に関連していること(Du et al., 2008)が示されてきた。これらの観察は、CSCの維持及び/又は機能においてCD44が重要な役割を担っている可能性を示唆している。本実施例は、CD44がGBM細胞でのヒッポストレス/アポトーシスシグナル伝達経路の活性化を弱め、生体外ではGBM細胞をテモゾロミド(TMZ)及び酸化ストレスから保護し、そして生体内では化学的予防機能をもたらすことを示すものである。さらに、CD44の発現をノックダウンすると神経膠腫瘍様塊の自己再生能が阻害され、CD44の拮抗剤であるhsCD44s−Fc融合タンパク質を発現させるとGBMCSCの生体での成長が阻害される。これらは、CD44が癌幹細胞の維持において重要な役割を担っていることを示唆している。
乳癌
[0095]乳癌は米国女性で最も多く見られる癌であり、女性における、癌による死亡の第二原因である。早期検出及び治療の改善により、乳癌死亡率は徐々に低下している。しかしながら、2009年の乳癌による死亡は、未だに40,170例あったと予測されている(http://www.cancer.gov/cancertopics/types/breast)。死亡の大部分は乳癌細胞の転移能、及び現行の治療に対する耐性を生じる能力によって引き起こされている。この事実により、悪性乳癌のこれら致死の能力に対抗する、より有効な及び新規の標的治療が早急に必要とされている。癌幹細胞(CSC)の分野における近年の進歩により、治療耐性及び乳癌を含む悪性癌の再発は、治療介入に対して高い耐性をもつ、***CSC(BCSC)を含むごく少量のCSCの存在による可能性があることが示された(Al-Hajj et al., 2003; Dean et al., 2005; Reya et al., 2001)。CSCは、それらの自己再生能、様々な細胞系統に分化することができる能力、及び腫瘍細胞の組織を再構成することのできる能力によって特徴付けられる(Al-Hajj et al., 2003; Reya et al., 2001)。
[0095]乳癌は米国女性で最も多く見られる癌であり、女性における、癌による死亡の第二原因である。早期検出及び治療の改善により、乳癌死亡率は徐々に低下している。しかしながら、2009年の乳癌による死亡は、未だに40,170例あったと予測されている(http://www.cancer.gov/cancertopics/types/breast)。死亡の大部分は乳癌細胞の転移能、及び現行の治療に対する耐性を生じる能力によって引き起こされている。この事実により、悪性乳癌のこれら致死の能力に対抗する、より有効な及び新規の標的治療が早急に必要とされている。癌幹細胞(CSC)の分野における近年の進歩により、治療耐性及び乳癌を含む悪性癌の再発は、治療介入に対して高い耐性をもつ、***CSC(BCSC)を含むごく少量のCSCの存在による可能性があることが示された(Al-Hajj et al., 2003; Dean et al., 2005; Reya et al., 2001)。CSCは、それらの自己再生能、様々な細胞系統に分化することができる能力、及び腫瘍細胞の組織を再構成することのできる能力によって特徴付けられる(Al-Hajj et al., 2003; Reya et al., 2001)。
[0096]乳癌には、腫瘍細胞及び宿主の間質を含む、不均一な細胞集団が含まれる。多くの癌研究は癌細胞に焦点を当ててきた。増加している証拠により、微小環境が乳癌の進行及びそれらの治療に対する反応の制御において必須の役割を担っていることが示されてきた(Al-Hajj et al., 2003; Liu et al., 2007)。さらに、BCSCの維持には十分な宿主微小環境が必要である。そのため、この致死的な疾患を根絶するためには、BCSC及びそれらの微小環境を標的とする新しい治療薬の開発が必須である。腫瘍細胞及びそれらの微小環境との間の物理的な相互作用及び機能的なクロストークは主に、細胞間及び細胞−ECM(細胞外マトリックス)間の接着に関与する、細胞表面受容体によって仲介される。CD44は、ECMに構成要素として豊富に含まれるヒアルロン酸(HA)の主要な細胞表面受容体であり、かつ、BCSCを含むCSCの重要なマーカーである(Collins et al, 2005; Patrawala et al., 2006; Ponti et al., 2005; Reya et al., 2001)。CD44+/CD24-BCSCは高い腫瘍原性、転移可能性、及び化学耐性を示す(Collins et al., 2005; Reim et al, 2009; Shipitsin et al., 2007)。CD44のリガンドであるHAの乳癌間質における蓄積は、予後不良と相関している(Tammi et al., 2008)。
前立腺癌
[0097]前立腺癌は米国人男性の癌による死亡の第二原因である。ホルモン非依存性/難治性転移性前立腺癌(HRPC)の予後は非常に悪く、後期疾患のための治療の選択肢は限られている。そのため、この致死的な疾患に対抗するためのより効果的な治療及び新規標的治療が早急に必要とされている。これを達成するためには、まず、前立腺癌の進行、転移、及び化学療法に対する耐性に重要な役割を担っている新規標的を同定することが必須である。CSC研究における近年の進歩により、CSCが化学療法及び放射線治療に対して高い耐性をもち、治療介入後の腫瘍再発の原因であると考えられることが示された(Dean et al., 2005; Reya et al., 2003)。CD44は、前立腺癌を含む様々なヒト癌の、幹細胞又は始原細胞の主要な細胞表面マーカーである(Collins et al., 2005; Hurt et al., 2008; Maitland and Collins, 2008)。
[0097]前立腺癌は米国人男性の癌による死亡の第二原因である。ホルモン非依存性/難治性転移性前立腺癌(HRPC)の予後は非常に悪く、後期疾患のための治療の選択肢は限られている。そのため、この致死的な疾患に対抗するためのより効果的な治療及び新規標的治療が早急に必要とされている。これを達成するためには、まず、前立腺癌の進行、転移、及び化学療法に対する耐性に重要な役割を担っている新規標的を同定することが必須である。CSC研究における近年の進歩により、CSCが化学療法及び放射線治療に対して高い耐性をもち、治療介入後の腫瘍再発の原因であると考えられることが示された(Dean et al., 2005; Reya et al., 2003)。CD44は、前立腺癌を含む様々なヒト癌の、幹細胞又は始原細胞の主要な細胞表面マーカーである(Collins et al., 2005; Hurt et al., 2008; Maitland and Collins, 2008)。
[0098]現在の抗癌治療及び標的選択は、その活性が癌細胞を弱めると考えられる(Sharma et al., 2007)、高頻度で変異したキナーゼに特に集中している。これらの手法は概念的には有効であり、そして著明な効果に支持されているが、それらは、耐性をもつ腫瘍細胞の出現により妨害される。これらの腫瘍細胞は、標的そのものの変異特性に関係している可能性のある機序を介して標的としたシグナル伝達経路をバイパスすることができる。現在では主に、そのシグナル伝達経路が見たところいかに重要であっても、1つのシグナル伝達経路のみを標的としている治療介入は、癌細胞が新しい遺伝的及び後成的な変化を獲得するにつれて比較的容易に回避されると考えられている。そのため、代替手法は、腫瘍形成に重要な誘因とは異なり、単一の機能的な腫瘍細胞特性のいずれにおいても中心的なものではないが、異なるシグナル伝達経路の共受容体としての調節、腫瘍細胞と宿主組織の微小環境との間の相互作用、及び様々な形態のストレスに対する腫瘍細胞の反応を含む、複数の機能に関与する多機能分子を同定するものになるかも知れない。腫瘍の成長及び進行におけるそれらの明かな有効性から、そのような分子は悪性腫瘍で亢進されているが、高頻度には変異を生じないと考えられる。腫瘍−宿主間相互作用の仲介及びいくつかの重要なシグナル伝達経路活性の調節に必須な、これら多機能型の標的を選択的に阻害すると、特に化学療法及び放射線治療、並びにこれらの必須なシグナル伝達経路に対する、及び/又は癌細胞に対するストレスを促進・誘導する標的治療との併用で阻害すると、その結果、現在の治療を阻む薬剤耐性が克服され、より高い効果及び/又は臨床的有益性の持続が達成される可能性がある。本発明は、CD44が複数の癌に対するそのような標的の1つであり、CD44−Fc融合タンパク質などの可溶性ヒトCD44融合タンパク質を含むCD44の拮抗薬が抗癌剤として有効であることを示すものである。我々の前臨床試験の結果は、悪性神経膠腫、乳癌、前立腺癌、黒色腫、膵癌、肝臓癌、及び頭頸部癌、結腸癌、卵巣癌、及び肺癌においてCD44を標的とする治療の可能性を強く支持するものである。例えば、図3〜4、23、26〜27、30〜31、及び33は、ヒトCD44に対するshRNAが、動物モデル中のヒト膠芽腫(Xu et al., 2010)、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、及び卵巣癌の生体での成長を阻害することを示している。図12、17、36、40、及び41は、CD44−Fc融合タンパク質の発現が、動物モデル中のヒト膠芽腫、黒色腫、頭頸部癌腫、膵癌、及び肝臓癌の生体での成長を阻害することを示している。図13、24、及び29は、精製したCD44−Fc融合タンパク質が、動物モデル中のヒト膠芽腫、乳癌、及び前立腺癌を生体内で阻害することを示している。さらに、これらの包括的なデータから、これらの癌型ではCD44が主要な治療標的であり、そしてCD44融合タンパク質及びCD44に対するshRNAを含むCD44の拮抗薬が、ヒト膠芽腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、黒色腫、頭頸部癌腫、膵癌、及び肝臓癌に対する有効な薬剤であることが確立された。
[0099]多様な癌型でCD44が亢進されている、及び/又は重要な役割を担っているという事実に基づき、ヒト神経膠腫結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、黒色腫(Stamenkovic and Yu, 2009)、頭頸部癌腫(Aillles and Prince, 2009; Nelson and Grandis, 2007)、膵癌(Hong et al., 2009; Klingbeil et al., 2009; Lee et al., 2008)、及び肝臓癌(Barbour et al., 2003; Yang et al., 2008)、に加えて、以下の癌、すなわち悪性中皮腫(Ramos-Nino et al., 2007; Tajima et al., 2010)、肉腫(Yoshida et al., 2008)、腎細胞癌(図37〜38、)(Lim et al, 2008; Lucin et al., 2004; Yildiz et al., 2004)、食道癌(図43)(Li et al., 2005; Nozoe et al., 2004)、ウィルムス腫瘍(Ghanem et al, 2002)、膀胱癌(Stavropoulos et al., 2001)、多発性骨髄腫(Mitsiades, 2005; Ohwada et al., 2008)、胃癌(図42)、及び神経鞘腫(Bai et al., 2007)においてもCD44が治療標的となる可能性がある。
CD44及び細胞のシグナル伝達
[00100]CD44はいくつかのシグナル伝達経路の調節に関与してきた。CD44はc−Metの共受容体として機能し(Matzke et al., 2007)、そしてRTKのErbBファミリーからのシグナルを調節する(Turley et al., 2002)。CD44はc−Src及び焦点接着キナーゼ(FAK)(Turley et al., 2002)を活性化し、そしてRac1の活性化を介して細胞運動を促進する(Murai et al., 2004)。しかしながらこれまでのところ、CD44由来のシグナルを仲介する、核となる単一の完全な経路は確立されていない。CD44は、ERMファミリータンパク質(Tsukita and Yonemura, 1997)及び、神経線維腫症2型(NF2)遺伝子の産物であるマーリン(Morrison et al., 2001; Sainio et al., 1997)と相互作用する。マーリン突然変異又はマーリン発現の欠損は、神経鞘腫、髄膜腫、及び上衣腫の発症によって特徴付けられるNF2疾患を引き起こす(Gutmann et al., 1997; Kluwe et al., 1996)。ショウジョウバエでは、マーリンはヒッポシグナル伝達経路の上流で機能するが、マーリンと哺乳類のヒッポ経路オルソログとの間のはっきりとした関係については完全には明らかになっていない。近年我々は、マーリンがヒトGBMの強力な阻害剤であること、及び神経膠腫細胞ではMST1/2−Lats2のシグナル伝達を活性化することにより、マーリンがMST1/2の上流で機能することを示した(Lau et al., 2008)。これらの観察は、哺乳類のヒッポシグナル伝達経路がGBMの進行において重要な役割を担っている可能性を示唆している。本発明は、酸化及び細胞毒性に反応して内生CD44が枯渇すると、癌細胞では、MST1/2及びLats1/2の強固かつ持続したリン酸化/活性化、YAPのリン酸化/不活性化、及びcIAP1/2の発現の低下が生じることを示すものである。これらの効果は、マーリンのリン酸化/不活性化及び切断型カスパーゼ−3レベルの上昇と関係している。一方、より高レベルの内生CD44はマーリンのリン酸化/不活性化を促進し、哺乳類でのヒッポシグナル伝達経路に同等な経路のストレス誘導性の活性化を阻害し、そしてcIAP1/2を亢進し、これらにより、アポトーシスの指標であるカスパーゼ−3の開裂の阻害を引き起こす。これらの結果は、CD44が哺乳類のヒッポシグナル伝達経路(マーリン−MST1/2−Lats1/2−YAP−cIAP1/2)の上流に位置することを示し、そしてCD44が、ストレス及びストレス誘導性アポトーシスに対する腫瘍細胞の応答を弱める機能を有することを示唆している。
[00100]CD44はいくつかのシグナル伝達経路の調節に関与してきた。CD44はc−Metの共受容体として機能し(Matzke et al., 2007)、そしてRTKのErbBファミリーからのシグナルを調節する(Turley et al., 2002)。CD44はc−Src及び焦点接着キナーゼ(FAK)(Turley et al., 2002)を活性化し、そしてRac1の活性化を介して細胞運動を促進する(Murai et al., 2004)。しかしながらこれまでのところ、CD44由来のシグナルを仲介する、核となる単一の完全な経路は確立されていない。CD44は、ERMファミリータンパク質(Tsukita and Yonemura, 1997)及び、神経線維腫症2型(NF2)遺伝子の産物であるマーリン(Morrison et al., 2001; Sainio et al., 1997)と相互作用する。マーリン突然変異又はマーリン発現の欠損は、神経鞘腫、髄膜腫、及び上衣腫の発症によって特徴付けられるNF2疾患を引き起こす(Gutmann et al., 1997; Kluwe et al., 1996)。ショウジョウバエでは、マーリンはヒッポシグナル伝達経路の上流で機能するが、マーリンと哺乳類のヒッポ経路オルソログとの間のはっきりとした関係については完全には明らかになっていない。近年我々は、マーリンがヒトGBMの強力な阻害剤であること、及び神経膠腫細胞ではMST1/2−Lats2のシグナル伝達を活性化することにより、マーリンがMST1/2の上流で機能することを示した(Lau et al., 2008)。これらの観察は、哺乳類のヒッポシグナル伝達経路がGBMの進行において重要な役割を担っている可能性を示唆している。本発明は、酸化及び細胞毒性に反応して内生CD44が枯渇すると、癌細胞では、MST1/2及びLats1/2の強固かつ持続したリン酸化/活性化、YAPのリン酸化/不活性化、及びcIAP1/2の発現の低下が生じることを示すものである。これらの効果は、マーリンのリン酸化/不活性化及び切断型カスパーゼ−3レベルの上昇と関係している。一方、より高レベルの内生CD44はマーリンのリン酸化/不活性化を促進し、哺乳類でのヒッポシグナル伝達経路に同等な経路のストレス誘導性の活性化を阻害し、そしてcIAP1/2を亢進し、これらにより、アポトーシスの指標であるカスパーゼ−3の開裂の阻害を引き起こす。これらの結果は、CD44が哺乳類のヒッポシグナル伝達経路(マーリン−MST1/2−Lats1/2−YAP−cIAP1/2)の上流に位置することを示し、そしてCD44が、ストレス及びストレス誘導性アポトーシスに対する腫瘍細胞の応答を弱める機能を有することを示唆している。
[00101]さらに本発明は、CD44をノックダウンすると、酸化及び細胞毒性ストレスに曝露した神経膠腫細胞において、MST1/2キナーゼのエフェクターとして既知の、p38/JNKストレスキナーゼの活性化が上昇及び持続することを示している。加えて酸化ストレスはCD44欠損神経膠腫細胞において、JNK/p38の下流エフェクターとして既知のp53、及びその標的遺伝子であるp21及びプーマの持続した上向き調節を誘導したが、高レベルの内生CD44を含むGBM細胞はJNK/p38の活性化を弱め、そしてp53、p21、及びプーマの誘導を阻害した。これらの機械論的な結果は、より良い臨床転帰を達成するためにCD44融合タンパク質を含むCD44拮抗薬を、p53、p21、プーマ、及びp38/JNKキナーゼの薬理学的エンハンサー/刺激剤/安定剤並びにcIAP及びXIAPを含むIAPの阻害剤との相乗効果において使用できることを示唆している。
[00102]受容体チロシンキナーゼ(RTK)は様々な正常な細胞機能、形質転換、及び腫瘍の進行において中心的な役割を果たしている。肝細胞成長因子(HGF)及びその受容体であるc−Metが脳腫瘍の成長及び進行を促進することが知られている(Abounader and Laterra, 2005)。HGF及びc−Metの発現の上昇はしばしば、神経膠腫の悪性度、血管密度、及び予後不良と関連している。さらに、HGF及び/又はc−Metの過剰発現は、それらの阻害とは対照的に、神経膠腫形成を遮断する(Abounader and Laterra, 2005)。加えて、EGFRの増幅がGBM症例のおよそ40%において生じ、予後不良の予測因子となっている(Voelzke et al., 2008)。本発明は、CD44を枯渇させると、NGF又はウシ胎仔血清(FBS)ではなく、EGFRリガンド及びHGFを用いて誘導したErk1/2の活性化が阻害されることを示しており(図7)、このことはCD44がこれらRTKの共受容体/刺激剤として機能しており、かつ、悪性神経膠腫細胞及びその他の癌型におけるそれらのシグナル伝達活性を強めることを示唆している。RTKのシグナル伝達を制御するCD44の詳細な機序についてはさらなる研究が必要であるが、HA受容体としてのその機能により説明できる可能性がある。CD44は細胞表面において、その多価リガンドであるHAによる結合によって、大きな塊を形成している。これらの凝集体はしばしば、複数のシグナル伝達イベントの開始が起こる、脂質ラフト又はその他の特定の膜ドメイン中に存在する。加えて、CD44は、HB−EGF及び塩基性FGFを含む多数のヘパリン結合成長因子と結合する、細胞表面プロテオグリカンとして発現する場合もある。RTK共受容体としてCD44は、そのため、RTKの多量体化を促進することにより及び/又は対応するRTKの適切なリガンドを提示することにより、シグナル伝達を高めることができる。これらの機械論的な結果は、より良い臨床転帰を達成するために、CD44融合タンパク質を含むCD44拮抗薬を、EGFR、erbB−2、erbB−4及びc−Met受容体キナーゼの薬理学的な阻害剤との相乗効果において使用することが可能であることを示唆している。
CD44融合タンパク質
[00103]CD44は複数のリガンドの受容体であるため、CD44の細胞外ドメインと、ヒトIgG1の定常領域(Fc)のような非CD44分子との融合タンパク質を用いた手法は、CD44に対する機能遮断抗体よりも優れたものである。CD44の各遮断抗体は1つ又はいくつかのリガンドの相互作用のみを遮断することしができないが、CD44−Fc融合タンパク質は、CD44の細胞外ドメイン介在性の、CD44とそのリガンドとの間の全ての相互作用を遮断する。加えて、CD44はプロテアーゼによって細胞表面から遊離されるが、このことはシグナル伝達経路及びCD44介在性機能を誘引するものとして機能的に重要な過程だと考えられている(Stamenkovic and Yu, 2009)。可溶性CD44融合タンパク質は、CD44シェダーゼと相互作用するドメインを含む。そのためCD44融合タンパク質は、全CD44リガンドを遊離させ、そして捕捉することができる。CD44融合タンパク質のこれらの特徴は、CD44の機能に拮抗するための長所となる。
[00103]CD44は複数のリガンドの受容体であるため、CD44の細胞外ドメインと、ヒトIgG1の定常領域(Fc)のような非CD44分子との融合タンパク質を用いた手法は、CD44に対する機能遮断抗体よりも優れたものである。CD44の各遮断抗体は1つ又はいくつかのリガンドの相互作用のみを遮断することしができないが、CD44−Fc融合タンパク質は、CD44の細胞外ドメイン介在性の、CD44とそのリガンドとの間の全ての相互作用を遮断する。加えて、CD44はプロテアーゼによって細胞表面から遊離されるが、このことはシグナル伝達経路及びCD44介在性機能を誘引するものとして機能的に重要な過程だと考えられている(Stamenkovic and Yu, 2009)。可溶性CD44融合タンパク質は、CD44シェダーゼと相互作用するドメインを含む。そのためCD44融合タンパク質は、全CD44リガンドを遊離させ、そして捕捉することができる。CD44融合タンパク質のこれらの特徴は、CD44の機能に拮抗するための長所となる。
[00104]それぞれ異なるCD44細胞外ドメインのセグメントとヒトIgG1の定常領域(Fc)との融合タンパク質であるCD44−Fcタンパク質は、多機能性膜貫通受容体の「トラップ」型融合タンパク質として作用する。これは腫瘍全体や癌幹細胞を標的とするだけでなく、腫瘍微小環境(内皮細胞、周細胞、白血球、炎症性細胞、及び線維芽細胞、を含むがこれらには限定されない浸潤宿主細胞、腫瘍−宿主細胞間相互作用、並びに腫瘍−宿主ECM間相互作用など)もまた標的とする。鍵となる、腫瘍細胞とその微小環境との間の相互作用及びクロストークは、細胞間接着及び、有力な治療標的となる可能性のあるECM受容体により仲介される(Marastoni et al., 2008)。CD44の発現はしばしば、腫瘍細胞、癌幹細胞、及び腫瘍微小環境においてより高く、正常な組織においてより低い。そのため、CD44は癌治療の理想的な標的である。
[00105]CD44タンパク質は、NH−末端HA−結合領域及び膜に近い領域をもつ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン(TM)、及びCOOH−末端細胞質尾部(CT)を含む(Peach et al., 1993; Stamenkovic et al, 1989)。1つのCD44遺伝子は20のエクソンを含んでいる。数多くのCD44変異体を生じさせるために、これらのうちの少なくとも10のエクソン、すなわちエクソン6〜15又は変異体エクソンv1〜v10を選択的スプライシングすることができる(Screaton et al., 1993; Screaton et al., 1992)。CD44の標準的な形態(CD44s)は、転写産物の選択的スプライシングによる産物であり、基本的なエクソンの全て、すなわちエクソン1〜5、16〜18及び20を含む。
[00106]本発明の一側面では、D44拮抗薬として作用するCD44融合タンパク質を、神経膠腫又はその他の癌型の治療又は予防のために哺乳動物に投与する。一側面では、CD44融合タンパク質を、さらなる抗癌治療又は神経膠腫を含む腫瘍の外科的切除の前に、外科的切除と同時に、又は後に投与する。CD44の枯渇が神経膠腫瘍様塊(図18)、腫瘍様塊(図28C)、及び卵巣CSC細胞塊(図34E)の形成を阻害すること、及びCD44の過剰発現がGBMCSCの生体での成長を阻害すること(図17D)、及び精製したCD44−Fc融合タンパク質がBCSCの生体での成長を阻害すること(図29)を我々が示してきたように、CD44は癌幹細胞にとって重要である。CSCはしばしば癌治療後も生き残るため、目に見える疾患がなかったとしても、これら治療後のCD44融合タンパク質による治療は癌の再発及び転移の阻害に重要である。別の側面では、細胞毒性ストレス又はその他の形のストレスを誘導する治療の前に、それら治療と同時に、又は後に、CD44融合タンパク質を投与する。一層さらに別の側面では、CD44融合タンパク質を単剤として、又は神経膠腫及びその他の癌型の外科的治療の前若しくは後に、その他の抗癌治療と併用して投与する。この場合、CD44融合タンパク質とさらなる治療薬との投与は相乗効果をもたらす。一側面では、CD44融合タンパク質を精製タンパク質として投与する。別の側面では、CD44融合タンパク質を、ウイルス粒子中にパッケージングした若しくはパッケージングしていないウイルス発現ベクターの形態で、又は担体としてナノ粒子を用いて投与する。一側面においてウイルス粒子は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ関連ウイルス(AAV)である。一側面においてアデノウイルスは、複製しない、遺伝子を挿入しない、血清型2、5、6、7、又は8アデノウイルスベクターである。一側面においてCD44融合タンパク質は、CD44の細胞外ドメインのそれぞれのセグメントに融合させたヒトIgG1の定常領域を含む、CD44−Fc融合タンパク質である。別の側面においてCD44細胞外ドメインは、CD44s、CD44v3−v10、CD44v6−v10、CD44v8−v10、CD44sR41A、CD44v3−v10R41A、CD44v6−v10R41A、及びCD44v8−v10R41A由来である。さらに別の側面においてCD44細胞外ドメインは、CD44v4−v10、CD44v5−v10、CD44v7−v10、CD44v9−v10、CD44v3、CD44v4、CD44v5、CD44v6、CD44v7、CD44v9、CD44v10、又はR41A変異を含む上記CD44のアイソフォームに由来するものである。さらに別の側面において細胞外ドメインは、エクソン1〜17の異なる組み合わせ、又はCD44の細胞外ドメインの異なる欠損、変異、重複、若しくは倍加に由来する。
[00107]CD44の細胞外ドメインはエクソン1〜5、v1〜v10(又はエクソン6〜10)、エクソン16、及びエクソン17によりコードされている。CD44sの細胞外ドメインは、エクソン1〜5、16、及び17を含む。CD44変異体(CD44v2−v10、CD44v3−v10、CD44v8−v10、CD44v4−v10、CD44v5−v10、CD44v6−v10、CD44v7−v10、CD44v9−v10、CD44v10、CD44v9、CD44v8、CD44v7、CD44v6、CD44v5、CD44v4、CD44v3、及びCD44v2)は、エクソン1〜5、それぞれ異なる組み合わせの変異体エクソン(v2〜v10)、エクソン16、及びエクソン17を含む(図46)。
表1:ヒト(Homo sapien)免疫グロブリン重鎖定常領域ガンマ1の定常領域(Fc)、ヒトCD44の野生型細胞外ドメイン、R41A変異を含むヒトCD44の細胞外ドメイン、及びCD44−Fc融合タンパク質のヌクレオチド及びアミノ酸配列。
[00108]免疫グロブリン重鎖定常領域ガンマ1の定常領域(Fc)(配列番号1)及びCD44シグナルペプチド(配列番号2)からなる融合タンパク質(配列番号3)を、CD44−Fc融合タンパク質の抗腫瘍活性の陰性対照として用いることができる。いくつかの態様では、CD44融合タンパク質のCD44細胞外ドメインは、ヒトCD44遺伝子のエクソン1〜17(図46)のそれぞれ異なる組み合わせによってコードされるCD44細胞外ドメインの断片を含む。いくつかの態様では、CD44の細胞外ドメインは任意の長さであってよく、それらは細胞外ドメインの約50〜約100、約100〜約150、約100〜約200、約100〜約300、約100〜約400、約100〜約500、約100〜約600、又は約100〜約651アミノ酸残基を含む。いくつかの態様においてCD44の細胞外ドメインは、ポリペプチド配列の修飾を含む。修飾は、変異、挿入、置換、欠損などのいずれの修飾であってもよいが、これらには限定されるものではない。いくつかの態様において断片は、ArgからAlaへの変異を含む。いくつかの態様においてArgからAlaへの変異は、完全長CD44タンパク質の41番目の位置に対応する位置に生じる(一例を配列番号6に示す)。当業者は、単剤として及び/又はその他の抗癌治療との併用のいずれかにおいて投与する場合に、どの修飾がCD44融合タンパク質の抗癌効果を高めるかを決定することができる。当業者はこれを、例えば、修飾されたCD44融合タンパク質を単剤として及び/又はその他の抗癌治療と併用する場合の抗癌効果を決定するための、腫瘍成長実験及び転移実験を生体で実施することにより、行うことができる。
[00109]別の側面においてCD44融合タンパク質は、別の非CD44分子に融合させた野生型CD44又はR41ACD44変異体の細胞外ドメインの、それぞれ異なるセグメントを含む。いくつかの態様において非CD44分子は、毒素、ペプチド、ポリペプチド、小分子、薬剤などである。いくつかの態様において非CD44分子は、6−His−タグ、GSTポリペプチド、HA−タグ、ヒトIgG1の定常領域(Fc)、又はv5−タグである。いくつかの態様では、精製後にこれらのタグをタンパク分解による切断によって除去できるように、タンパク質分解酵素開裂部位をタグ配列の前に挿入する。
[00110]ヒト可溶性CD44−Fc(hsCD44)融合タンパク質を、実施例の材料及び方法の部分に記載したように、ヒトCD44sの細胞外ドメイン(配列番号4)、CD44v3−v10(配列番号7+配列番号8)、CD44v8−v10(配列番号7+配列番号9)、CD44v6−v10(配列番号7+配列番号20)、CD44v3−v10R41A(配列番号6+配列番号8)、CD44v8−v10R41A(配列番号6+配列番号9)、CD44sR41A(配列番号5)をヒトIgG1の定常領域(Fc)に融合することにより生成する。例えば、完全長CD44v3−v10変異体は、エクソン1〜5、v3〜v10、16〜18、及び20を含む。CD44−v8−v10は、エクソン1〜5、v8〜v10、16〜18、及び20を含む。R41A変異は、CD44がその主要なリガンドのうちの1つであるヒアルロン酸に結合する能力を阻害し(Peach et al, 1993)、そして全てのCD44イソ型はこの残基を含む。
[00111]その他のCD44変異体とヒトIgG1の定常領域(Fc)との融合タンパク質は、実施例において使用したものと同様の方法で、強力な抗癌剤として効果的に作用する。これらの融合タンパク質は、CD44v4−v10−、CD44−5−v10−、CD44v7−v10−、CD44v9−v10−、CD44v10−、CD44v3−、CD44v4−、CD44v5−、CD44v6−、CD44v7−、CD44v8−、及びCD44v9−Fc又はR41A変異を有する上記CD44のイソ型(Peach et al., 1993)、及びヒトIgG1の定常領域(Fc)に融合させた、それぞれ異なるCD44細胞外ドメイン/エクソンのそれぞれ異なる組み合わせ及び/又は修飾を含むが、これらには限定されない。修飾は、変異、挿入、置換、欠損など任意の修飾であってよいが、これらに限定されるものではない、。CD44細胞外ドメインはまた、エクソン1〜17のそれぞれ異なる組み合わせ、又は、CD44の細胞外ドメインのそれぞれのセグメントの異なる欠損、変異、重複、若しくは倍加に由来するものであってもよい。
[00112]いくつかの態様では、CD44融合タンパク質をコードしている核酸分子をプロモーターに操作可能に連結する。いくつかの態様においてプロモーターは、原核細胞及び/又は、COS−7、CHO、293、ヒト膠芽腫細胞、及びその他のヒト癌細胞を含む真核細胞での発現を促進することができる。プロモーターは、核酸分子の発現を誘導することができるいずれのプロモーターであってよい。プロモーターの例としては、CMV、SV40、pEF、アクチンプロモーター、などが挙げられるがこれらには限定されない。いくつかの態様において核酸分子は、DNA又はRNAである。いくつかの態様において核酸分子は、ウイルス、ベクター、又はプラスミドである。いくつかの態様では、制御物質の有無により、その発現が開始又は停止することができるように、核酸分子の発現が制御される。そのようなシステムの例としては、テトラサイクリン−ON/OFFシステムが挙げられるがこれには限定されない。
[00113]可溶性組換えCD44HA−結合ドメイン(CD44−HABD)が、ニワトリ及びマウス生体での血管形成を妨げることが発見されており、また、黒色腫及び膵臓腺癌の成長を阻害する(Pall et al., 2004)。可溶性CD44は、細胞表面CD44のヒアルロン酸への結合を妨げることにより、黒色腫の成長を阻害する(Ahrens et al., 2001)。CD44−受容体グロブリンはB16F10マウス黒色腫転移の肺転移を阻害し、かつ、CD44−受容体グロブリンは、免疫グロブリンカッパ軽鎖の定常領域に結合した、CD44s又はCD44v10の細胞外部分を含む(Zawadzki et al., 1998)。可溶性CD44s−免疫グロブリン融合タンパク質は、ヒトリンパ腫細胞、ナマルバの生体での成長を阻害する(Sy et al., 1992)。
[00114]効果を改善するために、これらのCD44−Fc融合タンパク質を修飾することができる。これらの修飾には、分子を多量体化することが知られているアンギオポエチンのコイルドコイルドメインのようなその他のタンパク質の一部分に、CD44細胞外ドメインを融合させることにより、異なるリガンド結合部位を含む複数の反復ドメインを挿入することが含まれる
CD44R41A変異体対野生型CD44融合体
[00115]CD44の主要なリガンドはヒアルロン酸(HA)である。CD44は、オステオポンチン(Verhulst et al., 2003; Zhu et al., 2004)、フィブロネクチン、I及びIV型コラーゲン(Ponta et al., 1998)、セリグリシン、ラミニン(Naor et al., 1997)、MMP−9(Yu and Stamenkovic, 1999, 2000)、MMP−7(Yu et al, 2002)、及びフィブリン(Alves et al., 2008)などのその他リガンドも有する。CD44はまた、複数の受容体チロシンキナーゼ(Orian-Rousseau and Ponta, 2008; Ponta et al., 2003)、P−セレクチン(Alves et al., 2008)、E−セレクチン(Dimitroff et al., 2001; Hidalgo et al., 2007; Katayama et al., 2005)、デス受容体(DR)(Hauptschein et al., 2005)、及び膜型マトリックスメタプロテアーゼ1(MT1MMP)(Kajita et al., 2001)とも関係する。
CD44R41A変異体対野生型CD44融合体
[00115]CD44の主要なリガンドはヒアルロン酸(HA)である。CD44は、オステオポンチン(Verhulst et al., 2003; Zhu et al., 2004)、フィブロネクチン、I及びIV型コラーゲン(Ponta et al., 1998)、セリグリシン、ラミニン(Naor et al., 1997)、MMP−9(Yu and Stamenkovic, 1999, 2000)、MMP−7(Yu et al, 2002)、及びフィブリン(Alves et al., 2008)などのその他リガンドも有する。CD44はまた、複数の受容体チロシンキナーゼ(Orian-Rousseau and Ponta, 2008; Ponta et al., 2003)、P−セレクチン(Alves et al., 2008)、E−セレクチン(Dimitroff et al., 2001; Hidalgo et al., 2007; Katayama et al., 2005)、デス受容体(DR)(Hauptschein et al., 2005)、及び膜型マトリックスメタプロテアーゼ1(MT1MMP)(Kajita et al., 2001)とも関係する。
[00116]CD44のHA結合部位はNH2−末端(残基21〜178)に位置する。R41をAに変換することによるCD44の修飾は、CD44がHAに結合する能力を阻害する(Banerji et al., 2007; Peach et al., 1993)。そのため、R41をAに変換することによるCD44−Fc融合タンパク質の修飾は、HA以外のCD44リガンドを効果的に捕捉することができるCD44−Fc融合タンパク質を生じることができる。これらの突然変異はまた、細胞外マトリックス(ECM)でのHAによるこれら融合タンパク質の捕捉を低下させることにより、融合タンパク質のバイオアベイラビリティを高めると考えられる。これらのR41A突然変異はまた、CD44 41A−Fc融合タンパク質のバイオアベイラビリティの上昇により、その他のCD44リガンド及びCD44シェダーゼを捕捉する能力がより高い融合タンパク質を生じ得る。このことは、CD44及びこれらのその他リガンド又はCD44の遊離との間の相互作用が、特定のステージ及び/又は特定の治療の後で、特定の型の癌の進行を引き起こしている場合に特に重要となるだろう。我々は、CD44v3−v10R41A−Fc融合タンパク質が十分なレベルの抗GBM活性を保持していることを示し(図12C−c)、このことは、癌におけるCD44のHA依存性及びHA非依存性の機能の概念を支持している。
CD44融合タンパク質の発現及び精製
[00117]本発明は、CD44融合タンパク質をコードしている、単離した核酸分子(ポリヌクレオチド)を提供する。
[00117]本発明は、CD44融合タンパク質をコードしている、単離した核酸分子(ポリヌクレオチド)を提供する。
[00118]いくつかの態様において核酸分子は、組換えウイルスベクターである。「組換えウイルスベクター」とは、目的のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードしている核酸を送達する場合に、媒体として使用可能なウイルスゲノムを用いて構築したコンストラクトを指す。組換えウイルスベクターは当該分野において周知であり、広く報告されている。組換えウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらは慣習的な方法及び出発材料を用いて調製される。
[00119]標準的な技術及び容易に入手可能な出発材料を用いて、核酸分子を調製することができる。核酸分子を発現ベクター中に組み込んで、次にこれを宿主細胞に組み込んでもよい。タンパク質の生産に周知の組換え発現系に使用される宿主細胞は周知であり、かつ、容易に入手可能である。宿主細胞の例としては、細菌細胞(例えば大腸菌(E.coli)、S.cerevisiaeなどの酵母細胞)、昆虫細胞(例えば、S.frugiperda)、非ヒト哺乳類の組織培養細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞及びCos−7細胞)、ヒト組織培養細胞(例えば、293細胞及びヒーラ細胞)、膠芽腫細胞、及びその他のヒト癌細胞が挙げられる。CD44−Fc融合タンパク質を含む、CD44融合タンパク質をコードしている核酸を含んでいる全ての発現コンストラクトは、CD44のNH2−末端シグナルペプチドをコードしている核酸を含む。その結果、これらのCD44融合タンパク質は細胞培養培地中に分泌される(図12A、図29A、図36A、図40B、及び図41B)。
[00120]いくつかの態様は、周知の発現系において使用するための市販の発現ベクター中に、DNA分子を挿入する工程を含む。これは当該分野において既知の技術により達成することができる。例えば、市販のプラスミドであるpSE420(Invitrogen、サンディエゴ、カリフォルニア)を大腸菌内でタンパク質を生産させるために使用してもよい。市販のプラスミドpYES2(Invitrogen、サンディエゴ、カリフォルニア)を、酵母のS.cerevisiae株中でタンパク質を生産させるために使用してもよい。市販のMAXBACTM complete baculovirus expression system(Invitrogen、サンディエゴ、カリフォルニア)を、例えば、昆虫細胞中でタンパク質を生産させるために使用してもよい。市販のプラスミドであるpcDNAI、pcDNA3、又はPEF6/v5−His(Invitrogen、サンディエゴ、カリフォルニア)を、例えば、Cos−7、CHO、及び293細胞などの哺乳類の細胞中でタンパク質を生産させるために使用してもよい。慣習的な技術及び容易に入手可能な出発材料を用いてタンパク質を生産するために、当業者はこれら市販の発現ベクター及びシステム又はその他を使用することができる(例えば、Sambrook et al., eds., 2001、前記を参照のこと)。従って、所望のタンパク質又は断片を、プロセッシングされた形の多様なタンパク質又は断片を生じる、原核及び真核システムの両方で調製することができる。
[00121]当業者は、周知の方法及び容易に入手可能な出発材料を用いて、その他の市販の発現ベクター及びシステム又は生産ベクターを使用してもよい。プロモーター及びポリアデニル化シグナル、及び好ましくはエンハンサーのような必須の制御配列を含む、様々な宿主細胞のための発現系は容易に入手可能であり、かつ当該分野において知られている(例えば、Sambrook et al., eds., 2001を参照のこと)。
[00122]いくつかの態様では、核酸分子を遺伝子コンストラクトとして調製することもできる。「遺伝子コンストラクト」は、核酸分子の遺伝子発現に必要な制御配列を含む。エレメントには、プロモーター、開始コドン、終止コドン、及びポリアデニル化シグナルが含まれる。加えて、タンパク質又は断片をコードしている配列の遺伝子発現のために、エンハンサーを使用することができる。これらのエレメントを所望のポリペプチドをコードしている配列に操作可能に連結すること、及び投与した患者又は細胞中でその制御エレメントを操作できることが必要である。開始コドン及び終止コドンは通常、所望のタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の一部分であると考えられる。しかしながら、この遺伝子コンストラクトを投与した患者又は細胞中で、これらのエレメントが機能することが必要である。開始及び終止コドンは、コード配列とインフレームでなければならない。使用するプロモーター及びポリアデニル化シグナルは細胞中で機能するものでなければならない。本発明の実施に有用なプロモーターの例としては、シミアンウイルス40プロモーター(SV40)、マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーター、HIVロングターミナルリピート(LTR)などのヒト免疫不全ウイルス(HIV)プロモーター、モロニーウイルス、ALV、CMV最初期などのサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、エプスタイン−バーウイルス(EBV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)並びにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン及びヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子のプロモーターが挙げられるがこれらには限定されない。本発明の実施に有用なポリアデニル化シグナルの例としては、SV40ポリアデニル化シグナル及びLTRポリアデニル化シグナルが挙げられるがこれらには限定されない。いくつかの態様では、SV40ポリアデニル化シグナルを指す、pCEP4プラスミド(Invitrogen、サンディエゴ、カリフォルニア)中のSV40ポリアデニル化シグナルを用いた。DNA分子は、DNA発現に必要な制御エレメントに加えて、その他のエレメントもまた含んでいてもよい。そのようなさらなるエレメントにはエンハンサーが含まれる。エンハンサーを、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン及び、CMV、RSV及びEBV由来のエンハンサーのようなウイルスエンハンサーを含むがこれらには限定されない群より選択してもよい。コンストラクトを染色体外で維持するため、及び細胞中で多コピーのコンストラクトを生産するために、哺乳類の複製起点をもつ遺伝子コンストラクトを提供することができる。Invitrogen(サンディエゴ、カリフォルニア)のpCEP4及びpREP4プラスミドはエプスタイン−バーウイルスの複製起点及び核抗原EBNA−1のコード領域を含む。これらにより、多コピーのエピソーム複製が生じるが、挿入は起こらない。いくつかの態様において核酸分子は、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、及びレンチウイルスを含むがこれらには限定されない、感染性のウイルス粒子中にパッケージングされる。いくつかの態様において核酸分子は、感染性粒子を含まない。いくつかの態様において核酸分子は、ナノ粒子により担体と混合される。
[00123]CD44融合タンパク質は、CD44融合cDNAコンストラクトを含む発現ウイルスコンストラクトを感染させた細胞によって生産され、そしてCD44−Fc融合タンパク質用の血清を含まない細胞培養培地中で又はその他全てのCD44融合タンパク質用の10%FBSを含む培地中で発現される。CD44融合タンパク質はアフィニティカラムを用いて精製する。例えばCD44−Fc融合タンパク質は、記述されているように(Sy et al., 1992)プロテインAカラムを用いて精製し、異なるエピトープタグにより標識されている可溶性CD44は、適切な抗体を結合させたアフィニティカラムを用いて精製する。
その他のCD44拮抗薬
[00124]一側面においてCD44拮抗薬は、CD44融合タンパク質である。別の側面においてCD44拮抗薬は小分子である。さらに別の側面においてCD44拮抗薬は、ヒトCD44に対するshRNA又はsiRNAである(配列番号31〜38)。別の側面では、ヒトCD44に対するshRNA及び/又はsiRNAを、ウイルス粒子にパッケージングした又はパッケージングしていないウイルスベクターの形で投与する。一側面においてウイルス粒子は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ関連ウイルス(AAV)である。別の側面においてアデノウイルスは、複製していなく、遺伝子を挿入しない、血清型2、5、6、7、又は8アデノウイルスベクターである。別の側面では、ヒトCD44に対するshRNAを、ナノ粒子を含むその他の担体と共に投与する。別の側面では、ヒトCD44に対するshRNAを単独で又はその他の治療と併用して投与する。別の側面では、ヒトCD44に対するshRNAを、腫瘍の外科的切除を含むその他の抗癌治療の前又は後に投与する。
[00124]一側面においてCD44拮抗薬は、CD44融合タンパク質である。別の側面においてCD44拮抗薬は小分子である。さらに別の側面においてCD44拮抗薬は、ヒトCD44に対するshRNA又はsiRNAである(配列番号31〜38)。別の側面では、ヒトCD44に対するshRNA及び/又はsiRNAを、ウイルス粒子にパッケージングした又はパッケージングしていないウイルスベクターの形で投与する。一側面においてウイルス粒子は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ関連ウイルス(AAV)である。別の側面においてアデノウイルスは、複製していなく、遺伝子を挿入しない、血清型2、5、6、7、又は8アデノウイルスベクターである。別の側面では、ヒトCD44に対するshRNAを、ナノ粒子を含むその他の担体と共に投与する。別の側面では、ヒトCD44に対するshRNAを単独で又はその他の治療と併用して投与する。別の側面では、ヒトCD44に対するshRNAを、腫瘍の外科的切除を含むその他の抗癌治療の前又は後に投与する。
定義
[00125]以下の定義は、本発明を明瞭にする及び説明する目的のためだけに提供されるものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
[00125]以下の定義は、本発明を明瞭にする及び説明する目的のためだけに提供されるものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
癌
[00126]「癌」とは、上皮細胞組織(癌腫)、血液細胞(白血病、リンパ球腫、及び骨髄腫)、結合組織(肉腫)由来細胞の、又は神経膠の若しくは支持細胞(神経膠腫)の、異常な悪性増殖を指す。例えば、本明細書に記載した本発明を、肺、***、リンパ、胃腸(例えば結腸)、及び尿生殖路、前立腺、卵巣、咽頭、及び神経系などの系に影響を及ぼす様々な器官系の悪性腫瘍、並びに、多くの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌及び/又は精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸癌及び食道癌などの悪性腫瘍を含むがこれらには限定されない腺癌を治療する又は予防するために使用してもよい。治療可能な固形腫瘍の例としては、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮肉腫、神経膠腫、星細胞腫、多形性膠芽腫(GBM)、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫、などが挙げられる。一側面において本発明は、腎細胞癌、中皮腫、肉腫、又は多発性骨髄腫の治療に関する。一側面において本発明は、結腸癌に治療に関する。別の側面において本発明は、肺癌の治療に関する。別の側面において本発明は、卵巣癌の治療に関する。さらなる側面において本発明は、乳癌の治療に関する。別の側面において本発明は、前立腺癌の治療に関する。さらなる側面において本発明は、肝癌の治療に関する。さらなる側面において本発明は、頭頸部の扁平上皮癌の治療に関する。さらなる側面において本発明は、黒色腫の治療に関する。さらなる側面において本発明は、膵癌の治療に関する。さらに別の側面において本発明は、星細胞腫の治療に関する。特定の側面において本発明は、多形性膠芽腫を含む神経膠腫の治療に関する。
[00126]「癌」とは、上皮細胞組織(癌腫)、血液細胞(白血病、リンパ球腫、及び骨髄腫)、結合組織(肉腫)由来細胞の、又は神経膠の若しくは支持細胞(神経膠腫)の、異常な悪性増殖を指す。例えば、本明細書に記載した本発明を、肺、***、リンパ、胃腸(例えば結腸)、及び尿生殖路、前立腺、卵巣、咽頭、及び神経系などの系に影響を及ぼす様々な器官系の悪性腫瘍、並びに、多くの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌及び/又は精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸癌及び食道癌などの悪性腫瘍を含むがこれらには限定されない腺癌を治療する又は予防するために使用してもよい。治療可能な固形腫瘍の例としては、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮肉腫、神経膠腫、星細胞腫、多形性膠芽腫(GBM)、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫、などが挙げられる。一側面において本発明は、腎細胞癌、中皮腫、肉腫、又は多発性骨髄腫の治療に関する。一側面において本発明は、結腸癌に治療に関する。別の側面において本発明は、肺癌の治療に関する。別の側面において本発明は、卵巣癌の治療に関する。さらなる側面において本発明は、乳癌の治療に関する。別の側面において本発明は、前立腺癌の治療に関する。さらなる側面において本発明は、肝癌の治療に関する。さらなる側面において本発明は、頭頸部の扁平上皮癌の治療に関する。さらなる側面において本発明は、黒色腫の治療に関する。さらなる側面において本発明は、膵癌の治療に関する。さらに別の側面において本発明は、星細胞腫の治療に関する。特定の側面において本発明は、多形性膠芽腫を含む神経膠腫の治療に関する。
癌幹細胞
[00127]癌幹細胞(CSC)又は癌始原細胞(CIC)は、自己再生能及びさまざま系統の細胞に分化する能力を有する、ごく少数の癌細胞である。これらの細胞は、治療介入後の腫瘍の維持及び再増殖の原因である(Reya et al., 2001)。CSCもまた、化学療法及び放射線治療、並びにその他の形態の癌治療に対して高い耐性をもつ。CD44は、多くの種類のCSCに対する主要な細胞表面マーカーである(Stamenkovic and Yu, 2009)。
[00127]癌幹細胞(CSC)又は癌始原細胞(CIC)は、自己再生能及びさまざま系統の細胞に分化する能力を有する、ごく少数の癌細胞である。これらの細胞は、治療介入後の腫瘍の維持及び再増殖の原因である(Reya et al., 2001)。CSCもまた、化学療法及び放射線治療、並びにその他の形態の癌治療に対して高い耐性をもつ。CD44は、多くの種類のCSCに対する主要な細胞表面マーカーである(Stamenkovic and Yu, 2009)。
抗癌治療
[00128]用語「抗癌治療」とは、外科的治療、化学療法、放射線治療、標的剤治療、遺伝子治療、免疫治療及び、癌及び悪性腫瘍を治療するための少なくとも2つの単独療法を組み合わせた併用療法を含むが、これらに限定されるものではない。
[00128]用語「抗癌治療」とは、外科的治療、化学療法、放射線治療、標的剤治療、遺伝子治療、免疫治療及び、癌及び悪性腫瘍を治療するための少なくとも2つの単独療法を組み合わせた併用療法を含むが、これらに限定されるものではない。
放射線治療
[00129]用語「放射線療法」又は「放射線治療」とは、癌を治療するために高エネルギーの放射線を使用することを指す。放射線治療には、外部から当てる放射線、例えば線形加速器を用いた外部ビーム放射線治療、及び、放射線源を体表面近く又は体腔内中に設置する小線源治療が含まれる。使用される一般的な放射性同位元素にはセシウム(137Cs)、コバルト(60Co)、ヨウ素(13II)、リン−32(32P)、金−198(198Au)、イリジウム−192(192Ir)、イットリウム−90(90Y)、及びパラジウム−109(109Pd)が含まれるがこれらには限定されない。放射線は通常、グレイ(Gy)の単位で測定され、1Gyは100ラドである。
[00129]用語「放射線療法」又は「放射線治療」とは、癌を治療するために高エネルギーの放射線を使用することを指す。放射線治療には、外部から当てる放射線、例えば線形加速器を用いた外部ビーム放射線治療、及び、放射線源を体表面近く又は体腔内中に設置する小線源治療が含まれる。使用される一般的な放射性同位元素にはセシウム(137Cs)、コバルト(60Co)、ヨウ素(13II)、リン−32(32P)、金−198(198Au)、イリジウム−192(192Ir)、イットリウム−90(90Y)、及びパラジウム−109(109Pd)が含まれるがこれらには限定されない。放射線は通常、グレイ(Gy)の単位で測定され、1Gyは100ラドである。
化学療法及び標的治療
[00130]「化学療法」とは抗癌剤を用いた治療を指す。この用語は、白金系薬剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗有糸***剤、抗微小管剤、植物アルカロイドを含む、多数のクラスの薬剤、及び抗主要抗生物質、キナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、EGFR阻害剤、HER二量体化阻害剤、VEGF阻害剤、抗体、並びにアンチセンスヌクレオチド、siRNA、及びshRNAを包含する。そのような化学療法剤には、アドリアマイシン、メルファラン、ara−C、カルムスチン(BCNU)、テモゾロミド、イリノテカン、BiCNU、ブスルファン、CCNU、ペントスタチン、プラチナベースの薬剤であるカルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、エピルビシン、ダカーバジン、5−フルオロウラシル(5−FU)、ロイコボリン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキサート、アルトレタミン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、クロラムブチル、ミトキサントロン、シタラビン、ナイトロジェンマスタード、メルカプトプリン、ミトキサントロン、パクリタキセル(タキソール(登録商標))、ドセタキセル、トポテカン、カペシタビン(ゼローダ(登録商標))、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、チオグアニン、チオテパ、ポロフィドトキシン、フィルグラスチム、ポルフィマーナトリウム、レトロゾール、アミフォスチン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、エピタロン(epithalone)A及びB、トレチノイン(tretinioin)、ロイスタチン、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、エトポシド、ゲムシタビン、サトラプラチン、イクサベピロン、ヘキサメチルアミン、及びサリドマイドが含まれるがこれらには限定されない。
[00130]「化学療法」とは抗癌剤を用いた治療を指す。この用語は、白金系薬剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗有糸***剤、抗微小管剤、植物アルカロイドを含む、多数のクラスの薬剤、及び抗主要抗生物質、キナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、EGFR阻害剤、HER二量体化阻害剤、VEGF阻害剤、抗体、並びにアンチセンスヌクレオチド、siRNA、及びshRNAを包含する。そのような化学療法剤には、アドリアマイシン、メルファラン、ara−C、カルムスチン(BCNU)、テモゾロミド、イリノテカン、BiCNU、ブスルファン、CCNU、ペントスタチン、プラチナベースの薬剤であるカルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、エピルビシン、ダカーバジン、5−フルオロウラシル(5−FU)、ロイコボリン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキサート、アルトレタミン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、クロラムブチル、ミトキサントロン、シタラビン、ナイトロジェンマスタード、メルカプトプリン、ミトキサントロン、パクリタキセル(タキソール(登録商標))、ドセタキセル、トポテカン、カペシタビン(ゼローダ(登録商標))、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、チオグアニン、チオテパ、ポロフィドトキシン、フィルグラスチム、ポルフィマーナトリウム、レトロゾール、アミフォスチン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、エピタロン(epithalone)A及びB、トレチノイン(tretinioin)、ロイスタチン、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、エトポシド、ゲムシタビン、サトラプラチン、イクサベピロン、ヘキサメチルアミン、及びサリドマイドが含まれるがこれらには限定されない。
[00131]標的治療薬は、ハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)、リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)、キャンパス(登録商標)(アレムツズマブ)、ゼヴァリン(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン)、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、ベキサール(登録商標)(トシツモマブ)、アービタックス(登録商標)(セツキシマブ)、ベバシズマブ(アバスチン(登録商標))、パニツムマブ(ベクチビックス(登録商標))、ゲムツズマブ(マイロターグ(登録商標))などのモノクローナル抗体を含むがこれらには限定されない。その他の標的治療薬は、タモキシフェン、イリノテカン、ボルテゾミブ、STI−571(グリベック(登録商標)、イマチニブメシル酸塩)、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ、BIBF1120、パゾパニブ、ネラチニブ、BIBW2992、CI−1033、PF−2341066、PF−04217903、AMG 208、JNJ−38877605、MGCD−265、SGX−523、GSK1363089、アキシチニブ、バタラニブ、E7080、スニチニブ、ソラフェニブ、トセラニブ(Toceranib)、レスタウルチニブ、セマクサニブ、セジラニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、レスタウルチニブ、ペリホシン、MK−2206、テムシロリムス、ラパマイシン、BEZ235、GDC−0941、PLX−4032、イマチニブ、AZD0530、ボルテゾミブ、XAV−939、アドベキシン(Ad5CMV−p53)、Genentech−化合物8/cIAP−XIAP阻害剤、Abbott Laboratories−化合物11、インターロイキン(例えば、2及び12)並びにインターフェロン、例えばアルファ及びガンマ、huBr−E3、ジーナセンス(Genasense)、ガナイト(Ganite)、FIT−3リガンド、MLN491RL、MLN2704、MLN576、及びMLN518を含むがこれらには限定されない。抗血管形成剤には、BMS−275291、ダルテパリン(フラグミン(登録商標))2−メトキシエストラジオール(2−ME)、サリドマイド、CC−5013(サリドマイドアナログ)、マスピン、コンブレタスタチンA4リン酸塩、LY317615、ダイズイソフラボン(ゲニステイン;ダイズタンパク質単離物)、AE−941(ネオバスタット(Neovastat)TM;GW786034)、抗VEGF抗体(ベバシズマブ;アバスチンTM)、PTK787/ZK 222584、VEGF−トラップ、ZD6474、EMD 121974、抗αvγ3インテグリン抗体(Medi−522;ビタキシン(Vitaxin)TM)、カルボキシアミドトリアゾール(CAI)、セレコキシブ(セレブレックス(登録商標))、ハロフジノン臭化水素酸塩(テンポスタチンTM)、及びロフェコキシブ(VIOXX(登録商標))が含まれるがこれらには限定されない。
[00132]用語「遺伝子治療」は、CD44融合タンパク質をコードしているベクターの投与を含む。いくつかの態様においてベクターは、ヒトCD44に対するshRNA(配列番号31〜38)を有する。いくつかの態様においてベクターは、感染性ウイルス粒子中にパッケージングされる。そのような感染性ウイルス粒子には、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、及びレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。いくつかの態様においてベクターは、感染性粒子を含まない。いくつかの態様においてベクターは、ナノ粒子と混合され、そしてナノ粒子によって送達される。遺伝子治療は、CD44−Fc融合体をコードしているヌクレオチド、アンチセンスヌクレオチド、siRNA、及びヒトCD44に対するshRNAを含む場合もある。
発現コンストラクト
[00133]用語「発現コンストラクト」は、標的核酸配列又はその発現が所望される配列、及び、選択した宿主細胞中での標的核酸の正しい転写及び翻訳をもたらす操作可能に連結した発現制御配列エレメントを含む核酸配列を意味する。そのような配列エレメントは、プロモーター、開始コドン、終止コドン、及びポリアデニル化シグナルを含んでいてもよい。加えて、タンパク質又は断片をコードしている配列の遺伝子を発現させるために、エンハンサーを用いることができる。「発現コンストラクト」はさらに、「ベクター配列」からなっていてもよい。「ベクター配列」とは、本発明の組換えDNA技術において、プラスミド、コスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、及び酵母人工染色体を含む(がこれらには限定されない)発現コンストラクトのクローニング及び増殖を促進する効果を有する、当該分野において確立された任意の複数の核酸配列を意味する。
[00133]用語「発現コンストラクト」は、標的核酸配列又はその発現が所望される配列、及び、選択した宿主細胞中での標的核酸の正しい転写及び翻訳をもたらす操作可能に連結した発現制御配列エレメントを含む核酸配列を意味する。そのような配列エレメントは、プロモーター、開始コドン、終止コドン、及びポリアデニル化シグナルを含んでいてもよい。加えて、タンパク質又は断片をコードしている配列の遺伝子を発現させるために、エンハンサーを用いることができる。「発現コンストラクト」はさらに、「ベクター配列」からなっていてもよい。「ベクター配列」とは、本発明の組換えDNA技術において、プラスミド、コスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、及び酵母人工染色体を含む(がこれらには限定されない)発現コンストラクトのクローニング及び増殖を促進する効果を有する、当該分野において確立された任意の複数の核酸配列を意味する。
[00134]本発明の発現コンストラクトは、発現コンストラクトのクローニング及び増殖を促進するベクター配列を含む場合がある。様々な真核及び原核宿主細胞中での複製及び/又は発現のための数多くのベクター、プラスミド、真菌、ウイルスベクターを含む、が記述されてきた。本発明に有用な標準的なベクターは当該分野において周知であり、これらには、プラスミド、コスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、及び酵母人工染色体が含まれる(がこれらに限定されるものではない)。ベクター配列は、大腸菌(Escherichia coli)中で増殖するための複製起点;SV40の複製起点;宿主細胞中で選抜するためのアンピシリン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、及びブラストサイジン耐性遺伝子;及び/又は、優勢な選択マーカーと目的の遺伝子を増幅させる遺伝子(例えば、CD44−Fc融合遺伝子)を含んでいてもよい。プラスミドベクター及び、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、セムリキ森林ウイルス及びアデノ関連ウイルスなどのウイルスベクターを含む好適なベクターは周知であり、そして商業的供給源(Promega、マジソン、ウィスコンシン;Stratagene、ラホーヤ、カリフォルニア;GIBCO/BRL、ゲーサーズバーグ、メリーランド)から購入可能であり、又は、当業者は構築することができる(例えば、Sambrook et al., eds., 2001, Meth. EnzymoL, Vol. 185, Goeddel, ed. (Academic Press, Inc., 1990); Jolly, Cane. Gene Ther. 1:51-64, 1994; Flotte, J. Bioenerg. Biomemb. 25:37-42, 1993; Kirshenbaum et al., J. Clin. Invest. 92:381-387, 1993を参照のこと)。
発現させる及び発現
[00135]用語「発現させる」及び「発現」は、遺伝子又はDNA配列の情報が顕在化することを許容する又は誘導すること、例えば、対応する遺伝子又はDNA配列の転写、翻訳及び翻訳後修飾に関与する細胞機能を活性化することによってタンパク質を生産すること、を意味する。DNA配列は、細胞中又は細胞によって、タンパク質などの「発現産物」を形成するように発現される。発現産物そのもの、例えば生じたタンパク質は、細胞により「発現された」ということもできる。発現産物を、細胞内、細胞外又は分泌と特徴付けることができる。用語「細胞内」とは、細胞の中にあるもの、を意味する。用語「細胞外」とは、細胞の外にあるもの、を意味する。一定量の物質が、細胞上又は細胞内のどこかから細胞の外に表れる場合、この物質は細胞により「分泌」される。
[00135]用語「発現させる」及び「発現」は、遺伝子又はDNA配列の情報が顕在化することを許容する又は誘導すること、例えば、対応する遺伝子又はDNA配列の転写、翻訳及び翻訳後修飾に関与する細胞機能を活性化することによってタンパク質を生産すること、を意味する。DNA配列は、細胞中又は細胞によって、タンパク質などの「発現産物」を形成するように発現される。発現産物そのもの、例えば生じたタンパク質は、細胞により「発現された」ということもできる。発現産物を、細胞内、細胞外又は分泌と特徴付けることができる。用語「細胞内」とは、細胞の中にあるもの、を意味する。用語「細胞外」とは、細胞の外にあるもの、を意味する。一定量の物質が、細胞上又は細胞内のどこかから細胞の外に表れる場合、この物質は細胞により「分泌」される。
導入
[00136]用語「導入」とは、レトロウイルス又はレンチウイルス中にパッケージングした、ウイルス発現ベクター中の「外生」核酸(すなわち、外因性又は細胞外遺伝子、DNA又はRNA配列)を、細胞中に導入することを意味する。分子生物学で一般的な技術を用いて、適切な細胞へのウイルスの導入を行う。一側面において細胞は、Cos−7及び293細胞である。別の側面において細胞は、ヒトGBM細胞、ヒト結腸癌細胞、ヒト前立腺癌細胞、ヒト乳癌細胞、ヒト黒色腫細胞、ヒト肺癌細胞、ヒト卵巣癌細胞、ヒト悪性中皮腫細胞、ヒト肉腫細胞、ヒト膵癌細胞、ヒト肝癌細胞、ヒト頭頸部扁平上皮細胞癌細胞、及びヒト多発性骨髄腫細胞である。
[00136]用語「導入」とは、レトロウイルス又はレンチウイルス中にパッケージングした、ウイルス発現ベクター中の「外生」核酸(すなわち、外因性又は細胞外遺伝子、DNA又はRNA配列)を、細胞中に導入することを意味する。分子生物学で一般的な技術を用いて、適切な細胞へのウイルスの導入を行う。一側面において細胞は、Cos−7及び293細胞である。別の側面において細胞は、ヒトGBM細胞、ヒト結腸癌細胞、ヒト前立腺癌細胞、ヒト乳癌細胞、ヒト黒色腫細胞、ヒト肺癌細胞、ヒト卵巣癌細胞、ヒト悪性中皮腫細胞、ヒト肉腫細胞、ヒト膵癌細胞、ヒト肝癌細胞、ヒト頭頸部扁平上皮細胞癌細胞、及びヒト多発性骨髄腫細胞である。
遺伝子
[00137]用語「遺伝子」とは、1つ以上のタンパク質又な酵素の全部又は一部分、及び任意に、例えばその遺伝子が発現する条件を決定するプロモーター及びエンハンサー配列などの制御DNA配列を含む、特定のアミノ酸配列をコードしている又はそれに対応するDNA配列を意味する。
[00137]用語「遺伝子」とは、1つ以上のタンパク質又な酵素の全部又は一部分、及び任意に、例えばその遺伝子が発現する条件を決定するプロモーター及びエンハンサー配列などの制御DNA配列を含む、特定のアミノ酸配列をコードしている又はそれに対応するDNA配列を意味する。
[00138]
コード配列は細胞中において、RNAポリメラーゼがコード配列をRNA、特にmRNAに転写する場合に発現制御配列の「制御下にある」又は制御配列と「操作可能に連結して」いる。その後、トランス−RNAはスプライシングされ(イントロンを含む場合)、このコード配列によりコードされるタンパク質に翻訳される。
コード配列は細胞中において、RNAポリメラーゼがコード配列をRNA、特にmRNAに転写する場合に発現制御配列の「制御下にある」又は制御配列と「操作可能に連結して」いる。その後、トランス−RNAはスプライシングされ(イントロンを含む場合)、このコード配列によりコードされるタンパク質に翻訳される。
[00139]用語「発現制御配列」とは、コード配列の転写を制御するために連結させたプロモーター及び任意にエンハンサー又は抑制エレメントを指す。好ましい側面においてこのエレメントは、複製起点である。
アンチセンスヌクレオチド、siRNA、及びshRNA
[00140]アンチセンスヌクレオチドは、「センス」鎖のヌクレオチドに相補的なRNA又はDNAの鎖である。アンチセンスヌクレオチドはこれらセンス鎖に結合し、これらを不活性化させる。shRNAは遺伝子発現を抑制させるために用いられる。アンチセンスヌクレオチドを遺伝子治療に用いることができる。
[00140]アンチセンスヌクレオチドは、「センス」鎖のヌクレオチドに相補的なRNA又はDNAの鎖である。アンチセンスヌクレオチドはこれらセンス鎖に結合し、これらを不活性化させる。shRNAは遺伝子発現を抑制させるために用いられる。アンチセンスヌクレオチドを遺伝子治療に用いることができる。
[00141]低分子干渉RNA(siRNA)は、どちらか一方の末端に2ヌクレオチドの3’突出を有する、長さ20〜25ヌクレオチドの、ある種の二本鎖RNA分子である。siRNAは、特定の遺伝子の発現を干渉する、RNA干渉(RNAi)の経路で機能する。
[00142]低分子又は短いヘアピン型RNA(shRNA)は、RNA干渉を介して遺伝子の発現を抑制することができる、緊密なヘアピン構造を形成するRNA配列である。shRNAは一般に、センス及びアンチセンス鎖をヘアピン構造にする、その標的遺伝子由来の2本の逆方向反復配列を含む。センス及びアンチセンス鎖は、shRNA中でループを形成する短いスペーサー配列によって離されており、そして末端には、転写終止位置として機能する複数個のTの鎖がある。この配置が、短いヘアピン型RNAとして折り畳まれることが予想されるRNA転写物を生産する。shRNAを、ウイルスベクターを含むベクターを用いて細胞内に導入する。ベクターをウイルス粒子中にパッケージングすることもできる。shRNAを有するベクターは、U6、HI、又はCMV(Open BiosystemsのshRNAmir用pGIPZ)プロモーターにより、それらの転写を引き起こす。shRNAmirは、microRNAに適したshRNAである。このベクターは一般に娘細胞に受け継がれ、それにより遺伝子サイレンシングが遺伝するものとなる。shRNAヘアピンは、細胞により機械的にsiRNAへと分解され、これはその後RNA誘導性のサイレンシング複合体(RISC)と結合する。この複合体が標的mRNAに結合して標的mRNAを分解し、サイレンシング効果をもたらす。ベクター又はウイルス中にパッケージングされたsiRNA及びshRNAを、CD44遺伝子を含む遺伝子の発現をノックダウンさせるために、遺伝子治療に用いることができる。
約又はおよそ
[00143]用語「約」又は「およそ」は、当業者により決定された特定の値が許容範囲内にあることを意味する。この値は、部分的には、どのようにして値を測定又は決定したか、例えば測定システムの限界、により異なる。例えば「約」は、特定の値の20%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%まで、その上さらにより好ましくは1%までの範囲を意味する可能性がある。あるいは、特に生物系又は過程に関してこの用語は、量の範囲が、値の好ましくは5倍以内、及びより好ましくは2倍以内にあることを意味する可能性がある。特にことわりがない限り、用語「約」は、特定の値が許容できる誤差範囲内にあることを意味する。
[00143]用語「約」又は「およそ」は、当業者により決定された特定の値が許容範囲内にあることを意味する。この値は、部分的には、どのようにして値を測定又は決定したか、例えば測定システムの限界、により異なる。例えば「約」は、特定の値の20%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%まで、その上さらにより好ましくは1%までの範囲を意味する可能性がある。あるいは、特に生物系又は過程に関してこの用語は、量の範囲が、値の好ましくは5倍以内、及びより好ましくは2倍以内にあることを意味する可能性がある。特にことわりがない限り、用語「約」は、特定の値が許容できる誤差範囲内にあることを意味する。
Include又はComprise
[00144]本明細書で用いられる場合、「include」と「comprise」との用語は、同意語として用いられる。本明細書で使用する場合、用語「1つ」及び「1種」は、「1つ(1種)以上」の列挙した構成要素を指すものと理解されるべきである。代替表現(例えば、「又は」)の使用は、1つ、又はその代替表現の任意の組み合わせのいずれかを意味するものと理解されるべきである。
[00144]本明細書で用いられる場合、「include」と「comprise」との用語は、同意語として用いられる。本明細書で使用する場合、用語「1つ」及び「1種」は、「1つ(1種)以上」の列挙した構成要素を指すものと理解されるべきである。代替表現(例えば、「又は」)の使用は、1つ、又はその代替表現の任意の組み合わせのいずれかを意味するものと理解されるべきである。
単離した
[00145]本明細書で使用する場合、用語「単離した」は、該当する物質を、それが通常見い出される環境から除去することを意味する。従って、単離した生物材料は、細胞要素、すなわちその材料が見いだされる又は生産される細胞の構成要素、を含まない場合がある。単離した核酸分子には、例えば、PCR産物、単離したmRNA、cDNA、又は制限断片が含まれる。単離した核酸分子には、例えば、プラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入した配列もまた含まれる。単離核酸分子は、好ましくは、それらを含み得るゲノムから切り出され、そして、非制御配列、非コード配列、又はゲノム中に含まれる場合にその核酸分子の上流又は下流に位置するその他の遺伝子に、任意に結合させることができる。単離したタンパク質は、それらが細胞中で関連しているその他のタンパク質若しくは核酸、又は両方と任意に関係していてもよく、あるいは膜関連タンパク質の場合には、細胞膜と細胞膜と任意に関係していてもよい。
[00145]本明細書で使用する場合、用語「単離した」は、該当する物質を、それが通常見い出される環境から除去することを意味する。従って、単離した生物材料は、細胞要素、すなわちその材料が見いだされる又は生産される細胞の構成要素、を含まない場合がある。単離した核酸分子には、例えば、PCR産物、単離したmRNA、cDNA、又は制限断片が含まれる。単離した核酸分子には、例えば、プラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入した配列もまた含まれる。単離核酸分子は、好ましくは、それらを含み得るゲノムから切り出され、そして、非制御配列、非コード配列、又はゲノム中に含まれる場合にその核酸分子の上流又は下流に位置するその他の遺伝子に、任意に結合させることができる。単離したタンパク質は、それらが細胞中で関連しているその他のタンパク質若しくは核酸、又は両方と任意に関係していてもよく、あるいは膜関連タンパク質の場合には、細胞膜と細胞膜と任意に関係していてもよい。
精製した
[00146]用語「精製した」は、本明細書で使用する場合、無関係の物質、すなわち、得られる材料由来の天然の物質を含む、汚染物質を減少させる又は除去する条件下において単離した材料を指す。単離した材料は好ましくは、実質的に、細胞、又は、組織培養要素、汚染物質などを含む培養要素を含まない。本明細書で使用する場合、用語「実質的に含まない」は、材料の分析試験の文脈において、操作に関する用語として用いられる。好ましくは、実質的に汚染物質を含まない精製した材料は、少なくとも純度が50%であり、又は純度60%、70%、80%であり、より好ましくは、純度90%であり、そしてより好ましくは、その上さらに少なくとも純度99%である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、免疫検定、組成分析、生物学的検定、及びその他の当該分野において既知の方法により評価することができる。
[00146]用語「精製した」は、本明細書で使用する場合、無関係の物質、すなわち、得られる材料由来の天然の物質を含む、汚染物質を減少させる又は除去する条件下において単離した材料を指す。単離した材料は好ましくは、実質的に、細胞、又は、組織培養要素、汚染物質などを含む培養要素を含まない。本明細書で使用する場合、用語「実質的に含まない」は、材料の分析試験の文脈において、操作に関する用語として用いられる。好ましくは、実質的に汚染物質を含まない精製した材料は、少なくとも純度が50%であり、又は純度60%、70%、80%であり、より好ましくは、純度90%であり、そしてより好ましくは、その上さらに少なくとも純度99%である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、免疫検定、組成分析、生物学的検定、及びその他の当該分野において既知の方法により評価することができる。
核酸分子
[00147]「核酸分子」又は「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖形態又は二本鎖ヘリックスいずれかの、リボヌクレオシド(アデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン;「RNA分子」)又はデオキシリボヌクレオシド(デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、又はデオキシシチジン;「DNA分子」)リン酸エステルの多量体形態、又は、チオリン酸エステル及びチオエステルなどの任意のそのリン酸エステル類似物を指す。二本鎖DNA−DNA、DNA−RNA及びRNA−RNAヘリックスであってもよい。用語核酸分子、具体的にはDNA又はRNA分子は、その分子の一次及び二次構造のみを指し、それらのいずれか特定の3次構造を限定するものではない。従って、この用語は、二本鎖DNAの中でも、とりわけ、直鎖状(例えば、制限断片)又は環状DNA分子、プラスミド、及び染色体を含む。特定の二本鎖DNA分子の構造について議論する場合、本明細書においては、配列を一般的な記載習慣に従って、DNAの非転写鎖(すなわち、mRNAに相同な配列を有する鎖)に沿って配列を5’から3’方向でのみ記述してもよい。「組換えDNA分子」は、分子生物学的な操作を行ったDNA分子である。
[00147]「核酸分子」又は「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖形態又は二本鎖ヘリックスいずれかの、リボヌクレオシド(アデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン;「RNA分子」)又はデオキシリボヌクレオシド(デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、又はデオキシシチジン;「DNA分子」)リン酸エステルの多量体形態、又は、チオリン酸エステル及びチオエステルなどの任意のそのリン酸エステル類似物を指す。二本鎖DNA−DNA、DNA−RNA及びRNA−RNAヘリックスであってもよい。用語核酸分子、具体的にはDNA又はRNA分子は、その分子の一次及び二次構造のみを指し、それらのいずれか特定の3次構造を限定するものではない。従って、この用語は、二本鎖DNAの中でも、とりわけ、直鎖状(例えば、制限断片)又は環状DNA分子、プラスミド、及び染色体を含む。特定の二本鎖DNA分子の構造について議論する場合、本明細書においては、配列を一般的な記載習慣に従って、DNAの非転写鎖(すなわち、mRNAに相同な配列を有する鎖)に沿って配列を5’から3’方向でのみ記述してもよい。「組換えDNA分子」は、分子生物学的な操作を行ったDNA分子である。
[00148]本発明では、標準的な分子生物学、微生物学、組換えDNA、免疫学、細胞生物学及びその他の当該分野の中で関連する技術を用いることができる。例えば、特に、Sambrook et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y.; Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al., eds. (2005) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Bonifacino et al., eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Coligan et al., eds. (2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Coico et al., eds. (2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Coligan et al., eds. (2005) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Enna et al., eds. (2005) Current Protocols in Pharmacology John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Hames et al., eds. (1999) Protein Expression: A Practical Approach. Oxford University Press: Oxford; Freshney (2000) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 4th ed. Wiley-Liss;を参照のこと。上に列挙した現在のプロトコールは、毎年、複数回更新される。
CD44融合組成物
[00149]特定の態様において、本発明は、哺乳動物の神経膠腫又はその他の癌型を治療する又は予防するための医薬組成物に関する。さらに別の側面において本発明は、哺乳動物の様々な癌幹細胞を標的とする医薬組成物に関する。別の側面では、本発明はさらに、神経膠腫又はその他の癌型の治療による、放射線、細胞毒性、及び標的治療ストレスに対する、神経膠腫細胞を含む様々な癌細胞及び癌幹細胞の感受性を高める医薬組成物を指向する。別の側面において医薬組成物は、神経膠腫又はその他の癌型の治療又は予防のためのCD44拮抗薬として作用するCD44融合タンパク質を含む。別の側面において医薬組成物は、CD44の細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含むCD44−Fc融合タンパク質を含む。別の側面において医薬組成物は、CD44s、CD44v2−v10、CD44v3−v10、CD44v8−v10、CD44v4−v10、CD44v5−v10、CD44v6−v10、CD44v7−v10、CD44v9−v10、CD44v10、CD44v9、CD44v8、CD44v7、CD44v6、CD44v5、CD44v4、CD44v3、CD44v2、CD44sR41A、CD44v2−v10R41A、CD44v3−V10R41A、CD44v8−v10R41A、CD44v4−v10R41A、CD44v5−v10R41A、CD44v6−v10R41A、CD44v7−v10R41A、CD44v9−v10R41A、CD44v10R41A、CD44v9R41A、CD44v8R41A、CD44v7R41A、CD44v6R41A、CD44v5R41A、CD44v4R41A、CD44v3R41A、及びCD44v2R41AのCD44細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含むCD44−Fc融合タンパク質を含む。別の側面においてCD44融合タンパク質は、別の非CD44分子に融合させた、野生型CD44又はR41ACD44変異体の、上述した細胞外ドメインのそれぞれ異なるセグメントを含む。いくつかの態様において非CD44分子は、毒素、ペプチド、ポリペプチド、小分子、薬剤などである。いくつかの態様において非CD44分子は、6−His−タグ、GSTポリペプチド、HA−タグ、又はv5−タグである。いくつかの態様では、精製後にこれらのタグをタンパク分解による切断によって除去できるように、プロテアーゼ開裂部位をタグ配列の前に挿入するだろう。例えば、HRV3C(14 3C型ヒトライノウイルス)プロテアーゼ開裂部位(LEVLFQ↓GP)を、v5及びHisエピトープタグのCOOH−末端の前に配置することができる。HRV3Cプロテアーゼ(Novagen)は、配列LEVLFQ↓GPを40℃で特異的に切断するので、COOH末端タグを効果的に除去するために用いた。
[00149]特定の態様において、本発明は、哺乳動物の神経膠腫又はその他の癌型を治療する又は予防するための医薬組成物に関する。さらに別の側面において本発明は、哺乳動物の様々な癌幹細胞を標的とする医薬組成物に関する。別の側面では、本発明はさらに、神経膠腫又はその他の癌型の治療による、放射線、細胞毒性、及び標的治療ストレスに対する、神経膠腫細胞を含む様々な癌細胞及び癌幹細胞の感受性を高める医薬組成物を指向する。別の側面において医薬組成物は、神経膠腫又はその他の癌型の治療又は予防のためのCD44拮抗薬として作用するCD44融合タンパク質を含む。別の側面において医薬組成物は、CD44の細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含むCD44−Fc融合タンパク質を含む。別の側面において医薬組成物は、CD44s、CD44v2−v10、CD44v3−v10、CD44v8−v10、CD44v4−v10、CD44v5−v10、CD44v6−v10、CD44v7−v10、CD44v9−v10、CD44v10、CD44v9、CD44v8、CD44v7、CD44v6、CD44v5、CD44v4、CD44v3、CD44v2、CD44sR41A、CD44v2−v10R41A、CD44v3−V10R41A、CD44v8−v10R41A、CD44v4−v10R41A、CD44v5−v10R41A、CD44v6−v10R41A、CD44v7−v10R41A、CD44v9−v10R41A、CD44v10R41A、CD44v9R41A、CD44v8R41A、CD44v7R41A、CD44v6R41A、CD44v5R41A、CD44v4R41A、CD44v3R41A、及びCD44v2R41AのCD44細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含むCD44−Fc融合タンパク質を含む。別の側面においてCD44融合タンパク質は、別の非CD44分子に融合させた、野生型CD44又はR41ACD44変異体の、上述した細胞外ドメインのそれぞれ異なるセグメントを含む。いくつかの態様において非CD44分子は、毒素、ペプチド、ポリペプチド、小分子、薬剤などである。いくつかの態様において非CD44分子は、6−His−タグ、GSTポリペプチド、HA−タグ、又はv5−タグである。いくつかの態様では、精製後にこれらのタグをタンパク分解による切断によって除去できるように、プロテアーゼ開裂部位をタグ配列の前に挿入するだろう。例えば、HRV3C(14 3C型ヒトライノウイルス)プロテアーゼ開裂部位(LEVLFQ↓GP)を、v5及びHisエピトープタグのCOOH−末端の前に配置することができる。HRV3Cプロテアーゼ(Novagen)は、配列LEVLFQ↓GPを40℃で特異的に切断するので、COOH末端タグを効果的に除去するために用いた。
[00150]
一側面において、CD44拮抗薬の医薬組成物は、精製したCD44−Fc融合タンパク質を含む精製したCD44融合タンパク質である。別の側面においてこの医薬組成物は、CD44−Fc融合タンパク質を含むCD44融合タンパク質を有するウイルスである。さらに別の側面において医薬組成物は、ヒトCD44(例えば、配列番号.34、35、及び36)に対するsiRNA/shRNAである。さらなる側面において医薬組成物は、CD44の機能に拮抗する小分子である。
一側面において、CD44拮抗薬の医薬組成物は、精製したCD44−Fc融合タンパク質を含む精製したCD44融合タンパク質である。別の側面においてこの医薬組成物は、CD44−Fc融合タンパク質を含むCD44融合タンパク質を有するウイルスである。さらに別の側面において医薬組成物は、ヒトCD44(例えば、配列番号.34、35、及び36)に対するsiRNA/shRNAである。さらなる側面において医薬組成物は、CD44の機能に拮抗する小分子である。
[00151]いくつかの態様にでは、神経膠腫は星細胞腫である。その他の態様では、神経膠腫は多形性膠芽腫である。その他の態様では、癌型は、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、黒色腫、悪性中皮腫、肉腫、腎臓癌、GI管癌、膵癌、肝癌、頭頸部扁平上皮細胞癌腫、及び多発性骨髄腫である。
[00152]医薬組成物として処方する場合、本発明の治療用化合物を薬学上許容可能な担体又は賦形剤と混合してもよい。本明細書で使用する場合、句「薬学上許容可能な」とは、ヒトに投与した場合に、生理学的に耐容でき、及び通常はアレルギー反応又は急性胃蠕動、めまいなどの同様の副作用を引き起こさないと考えられる化学物質及び組成物を指す
[00153]本発明により提供される組成物をそのまま治療に用いることが可能であるが、これを医薬製剤として、例えば、使用する予定の投与経路及び標準的な薬務に関連して選択した、好適な医薬賦形剤、希釈剤、又は担体と混合して投与することが好ましい場合もある。従って、一側面において本発明は、少なくとも1つの活性組成物又は薬学上許容可能なその誘導体、及び薬学上許容可能な賦形剤、希釈剤、及び/又は担体を含む医薬組成物又は製剤を提供する。賦形剤、希釈剤及び/又は担体は、製剤のその他の成分と混合可能であるという意味において「許容できる」ものでなければならず、そしてその受容者にとって有害であってはならない。
[00153]本発明により提供される組成物をそのまま治療に用いることが可能であるが、これを医薬製剤として、例えば、使用する予定の投与経路及び標準的な薬務に関連して選択した、好適な医薬賦形剤、希釈剤、又は担体と混合して投与することが好ましい場合もある。従って、一側面において本発明は、少なくとも1つの活性組成物又は薬学上許容可能なその誘導体、及び薬学上許容可能な賦形剤、希釈剤、及び/又は担体を含む医薬組成物又は製剤を提供する。賦形剤、希釈剤及び/又は担体は、製剤のその他の成分と混合可能であるという意味において「許容できる」ものでなければならず、そしてその受容者にとって有害であってはならない。
[00154]本発明の組成物を、ヒトのための医学又は獣医学において用いる、任意の適した投与経路用に処方することができる。
[00155]用語「担体」とは、化合物と共に投与する、希釈剤、佐剤、賦形剤、又は媒体を指す。そのような医薬担体は、食塩水、水、及び石油、動物油、植物油又は落花生油、大豆油、鉱油、ごま油のような合成したものなどを含む油、などの無菌的な液体であってもよい。好ましくは、水又は食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液が担体として、特に注射剤として用いられる。あるいは、担体は1つ以上の結合剤(圧縮丸薬用)、流動促進剤、カプセル化剤、香料、及び着色料を含むがこれらには限定されない、固体剤形の担体であってもよい。好適な医薬担体は、E.W. Martinによる、「Remington's Pharmaceutical Sciences」 (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042)に記載されている。
[00155]用語「担体」とは、化合物と共に投与する、希釈剤、佐剤、賦形剤、又は媒体を指す。そのような医薬担体は、食塩水、水、及び石油、動物油、植物油又は落花生油、大豆油、鉱油、ごま油のような合成したものなどを含む油、などの無菌的な液体であってもよい。好ましくは、水又は食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液が担体として、特に注射剤として用いられる。あるいは、担体は1つ以上の結合剤(圧縮丸薬用)、流動促進剤、カプセル化剤、香料、及び着色料を含むがこれらには限定されない、固体剤形の担体であってもよい。好適な医薬担体は、E.W. Martinによる、「Remington's Pharmaceutical Sciences」 (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042)に記載されている。
[00156]本発明の非経口投与用調整物は、無菌的な水性又は非水性溶液、懸濁液、又は乳濁液を含む。非水性溶媒又は媒体の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油及びトウモロコシ油などの植物油、ゼラチン並びに、オレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルが挙げられる。そのような剤形はまた、佐剤、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤を含んでいてもよい。医薬組成物を例えば、細菌保持フィルターを用いたろ過、組成物への滅菌剤の添加、放射線の組成物への照射、又は組成物を加熱することにより、無菌的にすることができる。それらをまた、滅菌水又はその他の無菌的な注入可能な媒体を用いて、使用する直前に調製することもできる。
[00157]一側面では、医薬組成物を液体の経口製剤として投与する。その他の経口剤形は当該分野において周知であり、錠剤、カプレット、ジェルキャップ、カプセル、丸薬、及び医療食品を含む。錠剤を、例えば、乾式又は流動層造粒法を用いた周知の打錠技術により製造することができる。
[00158]そのような経口製剤を、1つ以上の好適な賦形剤、希釈剤、及び担体と共に、標準的な方法で使用するための製剤として提示してもよい。薬学上許容可能な賦形剤は、生理活性物質と、希釈剤、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、崩壊剤、着色剤を含むその他の成分とを特定の剤形に形成することを補助又は可能にする。保存剤、安定剤、色素及び香味剤さえも、医薬組成物中に添加することができる。保存剤の例としては、安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸、及びp−ヒドロキシ安息香酸エステルが挙げられる。酸化防止剤及び沈殿防止剤もまた使用することができる。賦形剤は、その所望される機能に加えて、毒性がなく、摂取に当たり耐容性が良好であり、かつ生理活性物質の吸収を干渉しない場合に薬学上許容可能である。
[00159]治療上使用される許容可能な賦形剤、希釈剤、及び担体は医薬分野において周知であり、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy. Lippincott Williams & Wilkins (A.R. Gennaro edit. 2005)に記載されている。医薬賦形剤、希釈剤、及び担体は、使用する予定の投与経路及び標準的な薬務により、選択することができる。
[00160]一側面においてCD44拮抗薬の医薬組成物は、CD44融合タンパク質である。別の側面においてCD44拮抗薬の医薬組成物は、CD44融合タンパク質をコードしている発現ベクターを含むウイルスである。別の側面において医薬組成物は、ウイルス粒子にパッケージングした又はパッケージングしていない、ヒトCD44に対するshRNAを有するベクターである。一側面においてウイルス粒子は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ関連初する(AAV)である。別の側面においてアデノウイルスは、複製しない、遺伝子を挿入しない、血清型2、5、6、7、又は8アデノウイルスベクターである。
[00161]別の側面では、医薬組成物を静脈内に又は腹腔内に投与する。さらに別の側面では、腫瘍を除去した後に残った腔/空間に医薬組成物を混合したゲルマトリックス−ガロシアニン製剤を充填することにより、医薬組成物を投与する。
[00162]特定の態様において、本発明は、CD44−Fc融合タンパク質を用いて、HAを含むCD44リガンドを検出する方法に関する。これらの方法は、癌の診断及び予後並びに患者の治療反応の評価に有用である。
治療方法
[00163]本明細書に記載した本発明を、癌又は悪性腫瘍の治療に用いることができる。一側面において本発明は、CD44融合組成物を単独で使用するか、本明細書で定義した放射線治療、化学療法、若しくは標的治療と併用する、前立腺癌、結腸癌、乳癌、肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、膵癌、及び卵巣癌の治療に関する。別の側面において本発明は、CD44融合組成物を単独で使用するか、放射線治療、化学療法、若しくは標的治療と併用する、星細胞腫の治療に関する。さらに別の側面において本発明は、CD44融合組成物を単独で使用するか、放射線治療、化学療法、若しくは標的治療と併用する、悪性中皮腫、肉腫、及び多発性骨髄腫の治療に関する。特定の側面において本発明は、CD44融合組成物を単独で使用するか、放射線治療、化学療法、若しくは標的治療の併用する、多形性膠芽腫の治療に関する。別の特異的側面において本発明は、CD44融合組成物を単独で使用するか、カルムスチン(BCNU)、テモゾロミド、ドセタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、エピルビシン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイコボリン、ミトキサントロン、サトラプラチン、イクサベピロン、パシタキセル、ゲムシタビン、カペシタビン、ドキソルビシン、エトポシド、メルファラン、ヘキサメチルアミン、イリノテカン、トポテカン、ハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)、アービタックス(登録商標)(セツキシマブ)、パニツムマブ(ベクチビックス(登録商標))、ベバシズマブ(アバスチン(登録商標))、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ、ネラチニブ、BIBW2992、CI−1033、PF−2341066、PF−04217903、AMG 208、JNJ−38877605、MGCD−265、SGX−523、GSK1363089、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、BIBF1120、パゾパニブ、バタラニブ、アキシチニブ、E7080、ペリホシン、MK−2206、テムシロリムス、ラパマイシン、BEZ235、GDC−0941、PLX−4032、イマチニブ、AZD0530、ボルテゾミブ、XAV−939、化合物8(Genentech)(Zobel et al., 2006)及び化合物11(Abbott Laboratories)(Oost et al., 2004)などのcIAP/XIAP阻害剤、又はアドベキシン(Ad5CMV−p53)と併用する、多形性膠芽腫及びその他の癌型の治療に関する。
[00163]本明細書に記載した本発明を、癌又は悪性腫瘍の治療に用いることができる。一側面において本発明は、CD44融合組成物を単独で使用するか、本明細書で定義した放射線治療、化学療法、若しくは標的治療と併用する、前立腺癌、結腸癌、乳癌、肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、膵癌、及び卵巣癌の治療に関する。別の側面において本発明は、CD44融合組成物を単独で使用するか、放射線治療、化学療法、若しくは標的治療と併用する、星細胞腫の治療に関する。さらに別の側面において本発明は、CD44融合組成物を単独で使用するか、放射線治療、化学療法、若しくは標的治療と併用する、悪性中皮腫、肉腫、及び多発性骨髄腫の治療に関する。特定の側面において本発明は、CD44融合組成物を単独で使用するか、放射線治療、化学療法、若しくは標的治療の併用する、多形性膠芽腫の治療に関する。別の特異的側面において本発明は、CD44融合組成物を単独で使用するか、カルムスチン(BCNU)、テモゾロミド、ドセタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、エピルビシン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイコボリン、ミトキサントロン、サトラプラチン、イクサベピロン、パシタキセル、ゲムシタビン、カペシタビン、ドキソルビシン、エトポシド、メルファラン、ヘキサメチルアミン、イリノテカン、トポテカン、ハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)、アービタックス(登録商標)(セツキシマブ)、パニツムマブ(ベクチビックス(登録商標))、ベバシズマブ(アバスチン(登録商標))、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ、ネラチニブ、BIBW2992、CI−1033、PF−2341066、PF−04217903、AMG 208、JNJ−38877605、MGCD−265、SGX−523、GSK1363089、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、BIBF1120、パゾパニブ、バタラニブ、アキシチニブ、E7080、ペリホシン、MK−2206、テムシロリムス、ラパマイシン、BEZ235、GDC−0941、PLX−4032、イマチニブ、AZD0530、ボルテゾミブ、XAV−939、化合物8(Genentech)(Zobel et al., 2006)及び化合物11(Abbott Laboratories)(Oost et al., 2004)などのcIAP/XIAP阻害剤、又はアドベキシン(Ad5CMV−p53)と併用する、多形性膠芽腫及びその他の癌型の治療に関する。
[00164]状態、障害又は症状を「治療(する)」には、(1)その状態、障害又は症状に罹患している又は素因があると考えられるが、まだその状態、障害又は症状の臨床症状若しくは準臨床的症状を経験していない又は呈していないヒト若しくはその他の哺乳動物で進行している、その状態、障害又は症状の臨床症状の発現を予防する又は遅延させること、(2)その状態、障害又は症状を阻害すること、すなわち、疾患若しくはその再発(維持療法の症例においては)、又は少なくとも1つの臨床症状若しくはその準臨床的症状を停止させる、低減させる又は遅延させること、及び/又は(3)疾患を軽減すること、すなわち、その状態、障害又は症状又は少なくとも1つのその臨床症状若しくは準臨床的症状の退行を引き起こすこと、が含まれる。
[00165]癌の治療に関連して本明細書において定義する「有効量」とは、癌細胞又は腫瘍の成長を、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%、減少させる、縮小する、阻害する、又はさもなければ、無効にするであろう量である。従って、「有効量」は、癌を有する対象に、その化合物の投与した場合に、有益な臨床転帰がもたらされる、化合物の量である。「有益な臨床転帰」には、例えば、腫瘍容積の減少、転移の減少、癌に関連した症状の重篤度の低下及び/又は、治療を行わなかった場合と比較した、哺乳動物の寿命の増加が挙げられる。当然のことながら、単独及び/又は化学療法若しくは標的治療との併用治療に必要とされる本発明のCD44融合タンパク質の量は、投与経路、治療を必要とする状態の性質、並びに患者の年齢、体重及び症状により多様になり、最終的には不随する医師又は獣医師の判断によることになる。これらの組成物は通常、有効量の本発明組成物を単独で、又は任意の放射線治療、化学療法、若しくはその他の標的治療との並行における有効量を含む予備的な用量は動物試験によって決定することができ、また、ヒト投与のための投与量のスケーリングは、当該分野において周知の方法により行うことができる。
[00166]治療を受ける患者に対する利益は、統計学的に有意又は、少なくとも患者若しくは医師が知覚できるもののいずれかである。
[00167]本発明は、癌及び悪性腫瘍を治療するための外科治療、化学療法、放射線治療、標的治療、及び免疫治療などを含むがこれらには限定されないその他の抗癌治療と併用する、CD44融合タンパク質などのCD44拮抗薬を含む医薬組成物の使用を提供する。本発明は、その他の抗癌治療と併用した場合に、癌治療の相乗効果をもたらす。
[00167]本発明は、癌及び悪性腫瘍を治療するための外科治療、化学療法、放射線治療、標的治療、及び免疫治療などを含むがこれらには限定されないその他の抗癌治療と併用する、CD44融合タンパク質などのCD44拮抗薬を含む医薬組成物の使用を提供する。本発明は、その他の抗癌治療と併用した場合に、癌治療の相乗効果をもたらす。
[00168]本発明はさらに、神経膠腫及びその他の癌細胞の、神経膠腫又はその他の癌型の治療に起因する細胞毒性及び標的治療ストレスに対する感受性を高める医薬組成物を指向する。一側面では、本発明の組成物をその他の抗癌治療の前、その他の抗癌治療と同時に、又は後に投与する。別の側面では、本発明の組成物を、酸化又は細胞毒性ストレスを引き起こす治療の前、又はそれら治療と同時に、又はその後に投与する。本発明の特定の一側面では、ストレスは放射線治療によって引き起こされる。本発明の別の特定の側面では、ストレスは化学療法によって引き起こされる。別の側面では、本発明の組成物を、腫瘍の外科的切除の後に投与する。
[00169]一側面では、単独で又は放射線、化学療法、又はその他の標的治療と併用して使用する、CD44融合タンパク質のようなCD44拮抗薬の医薬組成物を、ゲルマトリックス−ガロシニアン製剤と混合し、そして神経膠腫を含む腫瘍を除去した後に残った腔/空間に充填することにより投与する。別の側面では、CD44融合タンパク質のウイルス発現コンストラクト又はヒトCD44に対するshRNAを含むウイルスをゲルマトリックス−ガロシニアン製剤と混合し、単独で又は放射線、化学療法又はその他の標的治療と併用して、神経膠腫を含む腫瘍を除去した後に残った腔/空間に充填することにより哺乳動物に投与する。
[00170]一側面では医薬組成物を、腫瘍病変、残存腫瘍病変、又は外科的手術後の手術の縁に隣接した正常な組織への経皮注射又は病巣内注射により投与する。別の側面では、医薬組成物の初回の腫瘍内定位注入を、1日目に10分間かけて投与する。患者は次に腫瘍の切除を受け、そして4日目に、切除した腫瘍腔壁への医薬組成物の一連の1分間注入を受ける。一側面では、医薬組成物を、外科的に除去できない癌組織の周辺又は近傍に、病巣内注射によって投与する。
[00171]肺癌には、医薬組成物を、気管支肺胞洗浄により、又は気管支鏡を介して気管支内病変に直接注入することにより、又は、蛍光透視鏡、超音波、若しくはCTスキャンを用いた複数回の経皮的穿刺を介して局所腫瘍に投与する。一側面では、医薬組成物を、医薬組成物を発現するように導入した、CD34+骨髄前駆細胞、間葉幹細胞、又はその他の成熟幹細胞又は誘導性多能性幹細胞を用いて癌病変に送達する。一側面においては、医薬組成物を、化学療法、放射線治療、及びその他の標的治療の前に、それらの治療と同時に、又は後に投与する。
投与及び用量
[00172]CD44融合タンパク質及び本発明の製剤を、局所的に、非経口的に、経口的に、吸入により、座剤として、又はその他の当該分野において既知の方法により、投与することができる。用語「非経口」には、注入(例えば、静脈内、腹腔内、硬膜外、鞘内、筋内、管腔内、気管内、皮下、病巣内、又は腫瘍内の)が含まれる。
[00172]CD44融合タンパク質及び本発明の製剤を、局所的に、非経口的に、経口的に、吸入により、座剤として、又はその他の当該分野において既知の方法により、投与することができる。用語「非経口」には、注入(例えば、静脈内、腹腔内、硬膜外、鞘内、筋内、管腔内、気管内、皮下、病巣内、又は腫瘍内の)が含まれる。
[00173]本発明の組成物の投与は、1日1回、1日2回、又はより高頻度になり得るが、疾患又は障害の維持段階においては、頻度を、例えば、1日1回若しくは1日2回の代わりに、2日若しくは3日毎に1回に減少させてもよい。用量及び投与頻度は、当業者には既知の急性段階の臨床徴候の少なくとも1つ以上、好ましくは2つ以上が減少又はなくなるという、寛解期の維持を決定する臨床徴候によって多様になり得る。より一般的には、用量及び頻度は、部分的には、本化合物を用いた治療が検討される疾患又は障害の病理学的な徴候並びに臨床及び準臨床的症状の退行によって異なるだろう。例えば本発明を、静脈内又は腹膜内に、約1〜3週間毎、15mg/kgで投与することができる。
[00174]上述した詳細を考慮すると、CD44融合タンパク質の一般的な用量は、約10mg/kg〜約30mg/kgの範囲となるだろう。好ましい用量範囲は、約10mg/kg〜約15mg/kg程度になる。特定の態様では、患者は、例えば、1日1回の静脈内又は腹膜内投与を1ヶ月当たり8日間、1週間に2回、又は1週間に1回、受ける場合がある。
[00175]上述した詳細を考慮すると、CD44融合タンパク質をコードしている発現ベクター又はヒトCD44に対するshRNAを含むウイルスの用量は通常、約5×10e9cfu〜約10×10e10cfuの範囲となるだろう。特定の態様において患者は、単位用量のウイルスを、例えば、静脈内、腫瘍内、又は腫瘍周辺への注入を介して、1週間に1回若しくは2回受ける場合がある。
[00176]上述した詳細を考慮すると、静脈により3日連続で投与されるBCNUの用量は、通常、約50mg/m2〜約200mg/m2の範囲となり、そしてこの工程を6週間間隔で繰り返してもよい(Pinkerton and Rana, 1976)。静脈により3日連続で投与する、好ましい用量の範囲は約100mg/m2〜約150mg/m2程度であり、この工程を6週間間隔で繰り返す。
[00177]上述した詳細を考慮すると、1日1回、静脈内注入により90分間かけて、又は経口用カプセル剤により投与するTMZの用量は通常、約50mg/m2〜約200mg/m2でよい。好ましい用量の範囲は、1日1回、約75mg/m2〜約150mg/m2程度である。特定の態では、患者は例えば、1日1回、静脈内に、1ヶ月当たり5日、TMZの投与を受ける場合がある(http://www.cancer.gov/cancertopics/druginfo/fda−temozolomide)。
[00178]上述した詳細を考慮すると、ドセタキセルの用量は通常、約50mg/m2〜約200mg/m2の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約60mg/m2〜約100mg/m2程度である。特定の態様では、患者は例えば、iv注入により、3週間毎にドセタキセルの投与を受ける場合がある(http://www.drugs.com/ppa/docetaxel.html)。
[00179]上述した詳細を考慮すると、カルボプラチンの用量は通常、約200mg/m2〜約400mg/m2の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約300mg/m2〜約400mg/m2程度である。特定の態様では、患者は例えば、4週間に1回、静脈内に、カルボプラチンの投与を受ける場合がある(http://www.drugs.eom/pro/carboplatin.html#DA)。
[00180]上述した詳細を考慮すると、シスプラチンの用量は通常、約20mg/m2〜約120mg/m2の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約75mg〜約100mg程度である。特定の態様では、患者は例えば、静脈内に1日1回、3週間当たり5日、シスプラチンの投与を受け、それを3回繰り返すだろう。
[00181]上述した詳細を考慮すると、シクロホスファミドの用量は通常、約1mg/kg/日〜約5mg/kg/日の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約2mg/kg/日〜約5mg/kg/日程度である。特定の態様では、患者は例えば、1日1回、静脈内又は経口的にシクロホスファミドの投与を受ける場合がある。
[00182]上述した詳細を考慮すると、フルオロウラシルの用量は通常、約12mg/kg〜約400mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約15mg〜約100mg程度である。特定の態様では、患者は例えば、1日1回、連続して4日間、静脈内にフルオロウラシルの投与を受ける場合がある。
[00183]上述した詳細を考慮すると、短時間のiv注入により投与されるミトキサントロンの用量は通常、約10mg/m2〜約20mg/m2の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約12mg/m2〜約14mg/m2程度である。特定の態様では、患者は例えば、21日に1回、静脈内に、ミトキサントロンの投与を受ける場合がある。
[00184]上述した詳細を考慮すると、パシタキセルの用量は通常、約3時間で、用量100mg/m2〜約200mg/m2の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約3時間で、用量が175mg/m2程度である。特定の態様では、患者は例えば、3ヶ月毎に1回、静脈内に、パシタキセルの投与を受ける場合がある。
[00185]上述した詳細を考慮すると、トポテカンの用量は通常、毎日、約0.5mg/m2〜約2.5mg/m2の範囲でよい。トポテカンを、iv注入により、30分間かけて、又は経口剤の摂取により投与することができる。好ましい用量の範囲は、約0.75mg/m2〜mg/m2/日程度である。
[00186]上述した詳細を考慮すると、トラスツズマブの用量は通常、約2mg/kg/週〜約8mg/kg/週の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約2mg/kg〜約4mg/kg程度である。特定の態様では、患者は例えば、1週間に1回、若しくは3週間おきに、静脈内に、トラスツズマブの投与を受ける場合がある(http://www.drugs.com/ppa/trastuzumab.html)。
[00187]上述した詳細を考慮すると、セツキシマブの用量は通常、約200mg/m2〜約400mg/m2の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約250mg/m2〜約300mg/m2程度である。特定の態様では、患者は例えば、1週間に1回、静脈内に、セツキシマブの投与を受ける場合がある(http://www.drugs.com/ppa/cetuximab.html)。
[00188]上述した詳細を考慮すると、パニツムマブの用量は通常、約2mg/kg〜約10mg/kgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約5mg/kg〜約6mg/kg程度である。特定の態様では、患者は例えば、14日に1回、静脈内に、パニツムマブの投与を受ける場合がある。
[00189]上述した詳細を考慮すると、ゲフィチニブの用量は通常、約100mg〜約400mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約250mg程度である。特定の態様では、患者は例えば、毎日1つ、250mgの錠剤でゲフィチニブの投与を受ける場合がある。
[00190]上述した詳細を考慮すると、エルロチニブの用量は通常、約25mg〜約300mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約100mg〜約150mg程度である。特定の態様では、患者は例えば、1日1錠、経口的に、エルロチニブの投与を受ける場合がある。
[00191]上述した詳細を考慮すると、ラパチニブの用量は通常、約1000mg/日〜約3000mg/日の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約1250mg/日〜約1500mg/日程度である。特定の態様では、患者は例えば、1日1錠、経口的に、ラパチニブの投与を受ける場合がある。
[00192]上述した詳細を考慮すると、BIBW2992の用量は通常、約20mg/日〜約100mg/日の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約50mg/日〜約70mg/日程度である。特定の態様では、患者は例えば、4週間のうちの14日間、1日1回、経口的にBIBW2992の投与を受け、その後14日間は投与を受けないだろう(Eskens et al., 2008)。
[00193]上述した詳細を考慮すると、CI−1033の用量は通常、約50mg/日〜約200mg/日の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約100mg/日〜約150mg/日程度である。特定の態様では、患者は例えば、28日の期間の内、連続した21日の間、経口的にCI−1033の投与を受ける場合がある(Campos et al., 2005; Nemunaitis et al., 2005)。
[00194]上述した詳細を考慮すると、PF−2341066の用量は通常、約5mg/kg/日〜約50mg/kg/日の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約20mg/kg/日〜約30mg/kg/日程度である。特定の態様では、患者は例えば、1日1回、経口的に)、PF−2341066の投与を受ける場合がある(Zou et al., 2007)。
[00195]上述した詳細を考慮すると、スニチニブの用量は通常、約12mg〜約80mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約40mg〜約50mg程度である。特定の態様では、患者は例えば、投与計画に基づいて1日1回、4週間スニチニブの投与を受け、その後2週間は投与を受けないだろう。
[00196]上述した詳細を考慮すると、ソラフェニブの用量は通常、約200mg〜約400mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約100mg〜約200mg程度である。特定の態様では、患者は例えば、1日2回、経口的に、ソラフェニブの投与を受ける場合がある。
[00197]上述した詳細を考慮すると、アドベキシン(Ad5CMV−p53)の用量は通常、卵巣癌については、約1日1回の腹腔内注入を3週間当たり5日間の範囲でよい。治療を21日毎に繰り返してもよい。肝臓癌については、アドベキシンの用量は通常、1日目に、最大2つまでの病巣に約1回の経皮注入を行う。治療を、最大6工程まで、28日毎に繰り返す。乳癌については、アドベキシン(Ad5CMV−p53)の用量は通常、1日目及び2日目の病巣内注入である。治療を最大6工程、3週間毎に繰り返す。神経膠腫については、1日目に、アデノウイルスp53(Ad−p53)の初回の腫瘍内定位注入を10分間かけて行う。次に患者は腫瘍の切除受け、そして4日目に、切除した腫瘍腔壁へのAd−p53の一連の1分注入を受ける。特定の態様では、アドベキシンを、化学療法又は放射線治療と同時に、又はそれらの後に投与する。
[00198]上述した詳細を考慮すると、Genentech−化合物8、すなわちcIAP−XIAP阻害剤(Zobel et al, 2006)の用量は通常、約50mg〜約400mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約100mg〜約200mg程度である。特定の態様では、患者は、例えば8/cIAP−XIAP阻害剤を、1日1回、静脈内に投与をされてもよい。
[00199]上述した詳細を考慮すると、Abbott Laboratories−化合物11(Oost et al., 2004)の用量は通常、約50mg〜約400mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約100mg〜約200mg程度である。特定の態様では、患者は、例えば化合物11を、1日1回、静脈内に、投与されてもよい。
[00200]上述した詳細を考慮すると、エピルビシンの初回用量は通常、静脈注入で、約100〜120mg/m2の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約75mg〜約100mg程度である。特定の態様では、患者は例えば、1日目にエピルビシンの静脈内投与を受け、その後21日毎に6回の工程が繰り返されてもよい。
[00201]上述した詳細を考慮すると、オキサリプラチンの用量は通常、静脈内注入を介して、約50mg〜200mg/処置の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約75mg〜約150mg程度である。特定の態様では、患者は例えば、2週間毎に、5−FU/LVと併用してオキサリプラチンの投与を受ける場合がある。佐剤の使用については、合計6ヶ月間(12工程)の治療が推奨される。一般的な治療計画は以下の通りである:1日目、250〜500mLの5%デキストロース注射剤に溶解したオキサリプラチン85mg/m2を静脈注入する。D5Wに溶解し、別々の輸液バッグに入れたUSP(D5W)及びロイコボリン200mg/m2を同時に、Yラインを用いて120分間かけて静脈注入する。その後、400mg/m2の5−FUを2〜4分間かけて静脈ボーラス投与し、さらに500mLのD5W(推奨)に溶解した5−FU、600mg/m2を22時間の持続注入で静脈注入する。2日目、ロイコボリン200mg/m2を120分間かけて静脈注入し、その後400mg/m2の5−FUを2〜4分間かけて静脈ボーラス投与し、さらに500mLのD5W(推奨)に溶解した5−FU、600mg/m2を22時間の持続注入で静脈注入する。
[00202]上述した詳細を考慮すると、メトトレキサートの用量は通常、毎日の経口投与又は5日間の工程の筋内投与で、約15〜30mgの範囲でよい。そのような工程を3〜5回繰り返すことが、通常必要とされる。好ましい用量の範囲は、約20mg程度である。特定の態様では、患者は、その他の抗癌剤と併用して、メトトレキサートの投与を受ける場合がある。
[00203]上述した詳細を考慮すると、ビンブラスチンの用量は通常、以下の通りである。成人に対する治療は、体表面積(bsa)当たり3.7mg/m2の単回静脈内投与により開始する。成人に対する単純化した、保守的な1週間間隔の用量漸増法の概要は以下のようになるだろう:初回用量は3.7mg/m2bsa、2回目の用量は5.5mg/m2bsa、3回目の用量は7.4mg/m2bsa、4回目の用量は9.25mg/m2bsa、そして5回目の用量は11.1mg/m2bsaである。成人に対する最大投与量が18.5mg/m2bsaに達し、それを超えない間は、上述した漸増法を用いることができる。この薬剤の投与については、7日に1回の頻度を超えないようにすることが推奨される。
[00204]上述した詳細を考慮すると、ビンクリスチンは、1週間に1回、静脈内に投与される。ビンクリスチンの初期用量は通常、小児患者に対しては1.5〜2mg/m2であり、成人に対しては1.4mg/m2である。
[00205]上述した詳細を考慮すると、サトラプラチンの初期用量は通常、5週間おきに連続して5日間、1日1回、約100〜120mg/m2の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約80mg/m2程度である。
[00206]上述した詳細を考慮すると、イクサベピロンの初期用量は通常、3週間毎に、約40mg/m2を3時間の静脈投与とする範囲でよい。体表面積が2.2m2を超える患者については、2.2m2に基づいて算出する。イクサベピロンをカペシタビンと併用して用いることができる。
[00207]上述した詳細を考慮すると、ゲムシタビンの用量は通常、21日間の各工程の1日目及び8日目に、約1000mg/m2を30分の静脈投与とする範囲でよい。特定の態様では、ゲムシタビンをパクリタキセル(乳癌)及びシスプラチン(肺癌)と併用して用いることができる。
[00208]上述した詳細を考慮すると、ゲムシタビンの用量は通常、21日間の各工程の1日目及び8日目に、約1000mg/m2を30分の静脈投与とする範囲でよい。特定の態様では、ゲムシタビンをパクリタキセル(乳癌)及びシスプラチン(肺癌)と併用してもよい。上述した詳細を考慮すると、単回静脈投与として21日間隔で投与するドキソルビシンの用量は通常、単剤として用いる場合には60〜75mg/m2である。加齢、又は前治療、又は新生骨髄浸潤により、十分な骨髄予備能をもたない患者には、より低用量で投与すべきである。特定の態様では、ドキソルビシンを、その他の認可された化学療法と同時に用いてもよい。その他の化学療法剤と併用して用いる場合、21〜28日毎に単回静脈内注入で投与される、最も一般的に用いられるドキソルビシンの用量は40〜60mg/m2である。
[00209]上述した詳細を考慮すると、通常用量のドキシル(ドキソルビシンHClリポソーム製剤)を、注入反応のリスクを最小限に抑えるために、用量30〜50mg/m2を、1mg/分の初期速度で、静脈内に投与する。多発性骨髄腫の患者には、3週間の工程の第1、4、8及び11日目に、1.3mg/m2のボルテゾミブを静脈内に最初に投与する。4日目のボルテゾミブ投与の後、ドキシル30mg/m2を1時間の静脈投与により投与する。
[00210]上述した詳細を考慮すると、通常用量のエトポシド(エトホホス)を、用量35mg/m2/日で4日間、から用量50mg/m2/日で5日間、の範囲で静脈内に投与する。特定の態様では、エトポシドをその他の抗癌剤と併用してもよい。
[00211]上述した詳細を考慮すると、通常用量のメルファラン(アルケラン錠剤)を1日1回、約6mg(3錠剤)用量で、経口投与する。治療を2〜3週間続けた後、投薬を最大4週間まで停止する。特定の態様では、メルファランを、ボルテゾミブを含むその他の抗癌剤と併用してもよい。
[00212]上述した詳細を考慮すると、ヘキサレン(登録商標)カプセルとしてのヘキサメチルアミン(ヘキサレン、アルトレタミン、ヘキサスタット)は、経口投与する。用量は、体表面積に基づいて計算する。ヘキサレン(登録商標)カプセルを、260mg/m2/日の用量で、28日間の工程のうちの連続して14日又は21日間のいずれかで投与することができる。1日当たりの総量を、4回に分けて食後及び就寝前に投与する。ヘキサレン(登録商標)カプセルを一時的に中止し(14日以上)、そしてその後、200mg/m2/日の用量で再開する。
[00213]上述した詳細を考慮すると、イリノテカン(カンプト)を単剤として、若しくはフルオロウラシル及びロイコボリンと併用して、1週間に1回、4週間、125mg/m2の用量で、90分の静脈投与により用いることができる。又は、単剤として350mg/m2の用量で、3週間毎、90分の静脈投与により、若しくはフルオロウラシル及びロイコボリンと併用して、180mg/m2の用量で、1週間おきに3回、90分の静脈投与により用いることができる。
[00214]上述した詳細を考慮すると、PF−04217903の用量は通常、1日2回の経口投与で、約50mg〜約1000mgの範囲でよい。治療工程は21日間になると考えられる。好ましい用量の範囲は、約100mg〜約500mg程度である。
[00215]上述した詳細を考慮すると、AMG208の用量は通常、1日2回の経口投与で、約10mg〜約1000mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約100mg〜約500mg程度である。
[00216]上述した詳細を考慮すると、JNJ−38877605の用量は通常、1日1回若しくは2回の経口投与で、約10mg〜約1000mgの範囲でよい。治療期間は21日間になると考えられる。好ましい用量の範囲は、約100mg〜約500mg程度である。
[00217]上述した詳細を考慮すると、MGCD−265の用量は通常1日1回7日間経口投与し、その後7日間投与を停止する、28日間の工程で、約24mg/m2〜約340mg/m2の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約200mg〜約500mg程度である。
[00218]上述した詳細を考慮すると、SGX−523の用量は通常、1日2回14日間経口投与し、その後7日間投与を停止する、という治療を21日毎に繰り返す計画で、約10mg〜約500mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約100mg〜約200mg程度である。
[00219]上述した詳細を考慮すると、GSK1363089の用量は通常、を1日目から5日目まで投与し、その後9日間投与を停止する14日間の投与計画では約240mg/日の範囲でよく、1日1回の投与計画では約80mg/日の範囲でよい。この薬剤は経口的に投与される。好ましい用量の範囲は、約80mg〜約200mg程度である。
[00220]上述した詳細を考慮すると、バンデタニブの用量は通常、1日1回の経口投与で約100mg〜約500mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約100mg〜約300mg程度である。
[00221]上述した詳細を考慮すると、BIBF1120の用量は通常、1日2回、20日間連続して投与する投与計画で、約100mg〜約250mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約100mg〜約200mg程度である。
[00222]上述した詳細を考慮すると、ボトリエント(パゾパニブ)の推奨用量は、食事の前後に(食事の少なくとも1時間前若しくは2時間後)、1日1回の経口投与で、約200mg〜約800mgの範囲でよい。
[00223]上述した詳細を考慮すると、ベバシズマブの用量は通常、2週間おきに約5mg〜10mg/kg;5−FU系化学療法剤の静脈投与と併用する場合には2週間おきに5mg/kg又は10mg/kg;カルボプラチン及びパクリタキセルと併用する場合には3週間おきに約15mg/kg;インターフェロンアルファと併用する場合には2週間おきに約10mg/kg;及びパクリタキセルと併用する場合には2週間おきに約10mg/kg、の範囲でよい。20日間連続して投与する治療計画では、ベバシズマブを90分間の静脈内注入により投与する。好ましい用量の範囲は、約100mg〜約200mg程度である。
[00224]上述した詳細を考慮すると、バタラニブの用量は通常、1日1回経口的に、28日間連続して投与する治療計画で、約250mg〜約2000mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約1000mg〜約1500mg程度である。
[00225]上述した詳細を考慮すると、アキシチニブの用量は通常、1日2回の経口投与で、約5mg〜約30mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約5mg〜約10mg程度である。
[00226]上述した詳細を考慮すると、E7080の用量は通常、28日間の工程のうちの2〜6日間に1日2回、経口で継続的に投与する計画で、約0.1mg〜12mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約5mg〜約10mg程度である。
[00227]上述した詳細を考慮すると、ペリホシンの用量は通常、経口投与で、約100〜600mg/週の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約200mg〜約400mg程度である。
[00228]上述した詳細を考慮すると、MK−2206の用量は通常、隔日で28日間、経口投与する工程で、約30mg〜60mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約30mg〜約50mg程度である。
[00229]上述した詳細を考慮すると、テムシロリムスの用量は通常、1週間に1回、30〜60分間の注入による投与で、約25mg〜約50mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約30mg程度である。
[00230]上述した詳細を考慮すると、ラパマイシンの用量は通常、1日1回の経口投与で、約10mg〜40mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約20mg〜約30mg程度である。
[00231]上述した詳細を考慮すると、BEZ235の用量は通常、第一工程の1〜28日目には、1日1回の経口投与で、約10mg〜45mgの範囲でよい。工程を28日毎に繰り返す。好ましい用量の範囲は、約20mg〜約30mg程度である。
[00232]上述した詳細を考慮すると、GDC−0941の用量は通常、1日1回又は1日2回の経口投与で、約60mg〜80mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約40mg〜約50mg程度である。
[00233]上述した詳細を考慮すると、PLX−4032の用量は通常、1日2回の経口投与で、約200mg〜960mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約300mg〜約500mg程度である。
[00234]上述した詳細を考慮すると、イマチニブの用量は通常、1日1回又は1日2回の経口投与で、約400mg〜800mgの範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約400mg〜約500mg程度である。
[00235]上述した詳細を考慮すると、AZD0530の用量は通常、経口投与で、約100mg〜500mg/週の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約100mg〜約250mg程度である。
[00236]上述した詳細を考慮すると、ベルケード(ボルテゾミブ)の用量は通常、メルファラン及びプレドニゾンの経口投与と併用し、6週間の工程を9回繰り返す計画では、3〜5回のボーラス2回静脈注射で1.3mg/m2である。第1工程から第4工程では、ボルテゾミブを1週間に2回投与する(第1、4、8、11、22、25、29及び32日目)。第5から第9工程では、ボルテゾミブを1週間に1回投与する(第1、8、22及び29日目)。ボルテゾミブの連続投与の間隔は、少なくとも72時間空けなくてはならない。
[00237]上述した詳細を考慮すると、XAV−939の用量は通常、経口投与で、約100mg〜500mg/週の範囲でよい。好ましい用量の範囲は、約100mg〜約250mg程度である。
[00238]上述した詳細を考慮すると、本明細書で記載したようにCD44−Fc融合タンパク質は癌細胞の細胞毒性薬に対する感受性を高めるため、これら融合タンパク質と併用する場合、化学療法薬又は細胞毒性薬の用量は通常使用する用量よりも少なくなるだろう。
[00239]本発明を下記の実際の実施例を用いてさらに記載するが、これらは本発明をさらに説明することを目的とするものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
材料及び方法
[00240]下記の実施例においては、以下の材料と方法を用いた。
材料及び方法
[00240]下記の実施例においては、以下の材料と方法を用いた。
患者の神経膠腫試料
[00241]ペンシルバニア大学及びオハイオ州立大学のCooperative Human Tissue Network(CHTN)から神経膠腫組織を得た。ヒト組織研究に関する認可されたプロトコールに従ってヒト組織を使用した。
[00241]ペンシルバニア大学及びオハイオ州立大学のCooperative Human Tissue Network(CHTN)から神経膠腫組織を得た。ヒト組織研究に関する認可されたプロトコールに従ってヒト組織を使用した。
発現データ検索
[00242]Oncomineデータベース(www.oncomine.org、Compendia Bioscience、Ann Arbor、MI)を使用して、ヒト神経膠腫組織及びその他のヒト癌型における、それらの正常な対応物と比較した場合の、CD44のmRNAの発現レベルを検索した。
[00242]Oncomineデータベース(www.oncomine.org、Compendia Bioscience、Ann Arbor、MI)を使用して、ヒト神経膠腫組織及びその他のヒト癌型における、それらの正常な対応物と比較した場合の、CD44のmRNAの発現レベルを検索した。
発現プロファイリング及びリアルタイム定量PCR(qPCR)
[00243]遺伝子発現プロファイルを比較するために、ヒトU133v2ジーンチップ(Affymetrix)を用いた。プローブとしては、標準的なプロトコールに従って感染させてプールした、3つの独立したプローブである、ピューロマイシン耐性U87MG又はマーリンを再発現するWM793細胞(U87MG/Wm793マーリン)又は空のレトロウイルスで感染させた(U87MG/WM793wt)を用いた。
[00243]遺伝子発現プロファイルを比較するために、ヒトU133v2ジーンチップ(Affymetrix)を用いた。プローブとしては、標準的なプロトコールに従って感染させてプールした、3つの独立したプローブである、ピューロマイシン耐性U87MG又はマーリンを再発現するWM793細胞(U87MG/Wm793マーリン)又は空のレトロウイルスで感染させた(U87MG/WM793wt)を用いた。
細胞株及び試薬
[00244]ヒト神経膠腫細胞、U138MG、LN118、LN229、及びA172細胞(ATCC);SNB19、SNB75、SNB78、U118MG、U87MG、U251、U373MG、SF763、SF767、SF268、SF539、SF188、SF295、及びSF242(UCSF及びNCI)、及び正常なヒト星状細胞(NHA、ALLCELLAS,Inc)を提供者及び製造業者の説明に従って維持した。抗−MST1/2、−Lats1/2(Bethy lLab)、−CD44、−Erk1/2、−AKT、−JNK、−p21、−p38、−p53、−cIAP1/2、及び−マーリン(Santa Cruz)、−アクチン(Sigma)、−ネスチン(Millipore)、−sox−2(R&Dsystems)、−v5エピトープ、−リン酸化マーリン、−プーマ(Invitrogen)、−切断型カスパーゼ3、−リン酸化Erk1/2、−リン酸化AKT、−リン酸化JNK、−リン酸化p38、−リン酸化MST1/2、−リン酸化Lats1、−リン酸化YAP(Cell signaling)、−YAP、−リン酸化Lats2(Abnova)及び−ヘパラン硫酸(HS、CalBiochem)抗体を実施例において使用した。ChemiconのApoptagキット、及びRocheの抗Brduを使用した。
[00244]ヒト神経膠腫細胞、U138MG、LN118、LN229、及びA172細胞(ATCC);SNB19、SNB75、SNB78、U118MG、U87MG、U251、U373MG、SF763、SF767、SF268、SF539、SF188、SF295、及びSF242(UCSF及びNCI)、及び正常なヒト星状細胞(NHA、ALLCELLAS,Inc)を提供者及び製造業者の説明に従って維持した。抗−MST1/2、−Lats1/2(Bethy lLab)、−CD44、−Erk1/2、−AKT、−JNK、−p21、−p38、−p53、−cIAP1/2、及び−マーリン(Santa Cruz)、−アクチン(Sigma)、−ネスチン(Millipore)、−sox−2(R&Dsystems)、−v5エピトープ、−リン酸化マーリン、−プーマ(Invitrogen)、−切断型カスパーゼ3、−リン酸化Erk1/2、−リン酸化AKT、−リン酸化JNK、−リン酸化p38、−リン酸化MST1/2、−リン酸化Lats1、−リン酸化YAP(Cell signaling)、−YAP、−リン酸化Lats2(Abnova)及び−ヘパラン硫酸(HS、CalBiochem)抗体を実施例において使用した。ChemiconのApoptagキット、及びRocheの抗Brduを使用した。
初代ヒト神経膠腫、肺、乳、及び卵巣癌細胞塊の確立
[00245]新鮮なヒト神経膠芽腫、肺癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、及び黒色腫組織を、ペンシルバニア大学及びオハイオ州立大学のCooperative Human Tissue Network(CHTN)より得た。組織を0.4%のI型コラゲナーゼ(Sigma、C0130)を用いてばらばらの細胞になるまで分離し、そしてB27(Invitrogen)、EGF(10ng/mL、BD Biosciences)、及びFGF−2(20ng/mL、BD Biosciences)を添加したDMEM/F12である、無血清癌幹細胞培地を入れた超低接着性プレートにプレーティングした。最初の細胞塊が形成された後、腫瘍様塊を含む癌細胞塊を、0.05%トリプシン−エチレンジアミン4酢酸(EDTA)を用いて細胞塊を分離することにより、およそ2週間おきに継代した。
[00245]新鮮なヒト神経膠芽腫、肺癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、及び黒色腫組織を、ペンシルバニア大学及びオハイオ州立大学のCooperative Human Tissue Network(CHTN)より得た。組織を0.4%のI型コラゲナーゼ(Sigma、C0130)を用いてばらばらの細胞になるまで分離し、そしてB27(Invitrogen)、EGF(10ng/mL、BD Biosciences)、及びFGF−2(20ng/mL、BD Biosciences)を添加したDMEM/F12である、無血清癌幹細胞培地を入れた超低接着性プレートにプレーティングした。最初の細胞塊が形成された後、腫瘍様塊を含む癌細胞塊を、0.05%トリプシン−エチレンジアミン4酢酸(EDTA)を用いて細胞塊を分離することにより、およそ2週間おきに継代した。
CD44−Fc融合発現ベクター及びノックダウンコンストラクトの構築
[00246]ヒト脾臓のトータルRNAをClontechから得た。ヒト皮膚組織(CHTN−ペンシルバニア大学)及びT47Dヒト乳癌細胞(ATCC)のトータルRNAを、RNeasy Mini Kit(Qiagen)を用いて製造業者の説明に従って単離した。5μgのトータルRNAから、Superscript II RNaseH-逆転写酵素(Invitrogen)を用いてcDNAを合成した。ヒト脾臓のcDNAを鋳型とし、PfuDNAポリメラーゼ(Stratagene)、及び以下のプライマーセット:フォワードプライマー、5’−gacaaaactcacacatgcccaccg−3’(配列番号71)及びリバースプライマー、5’tcatttacccggagacagggagag−3’(配列番号72)を用いたPCRにより、ヒトFc断片を得た。ヒトCD44v3−v10、CD44v8−v10、及びCD44を含む、多くのCD44アイソフォームを発現しているヒトの皮膚及びT47Dヒト乳癌細胞が得られた。ヒトの皮膚及びT47DcDNAの混合物を鋳型とし、PfuDNAポリメラーゼ(Stratagene)、以下のプライマーセット:フォワードプライマー、5’−accatggacaagttttggtggcac−3’(配列番号73)及びリバースプライマー、5’−ttctggaatttggggtgtccttat−3’(配列番号74)を用いたPCRにより、ヒトの可溶性CD44アイソフォームを得た。得られた全てのPCR産物をpEF6/v5−HisTOPO発現ベクター(Invitrogen)中にクローニングした。正しいヒトFc断片及び可溶性CD44を含むクローンを同定した。次にこれらの断片をレトロウイルス発現ベクターであるpQCXIP(BD Bioscience)中にサブクローニングし、ヒト可溶性CD44−Fc(hsCD44)融合発現コンストラクトを生成した。Mfe1制限酵素部位(CAATTG)を用いて、可溶性ヒトCD44v3−v10、v8−v10、又は可溶性CD44を、ヒトFc断片にインフレームで融合させた。これらの発現コンストラクト及び293細胞中のpVSVG/GP2Rを用い、製造業者の説明(BD)に従ってレトロウイルスを生成した。全ての発現コンストラクトをDNA塩基配列決定法により確認した。
[00246]ヒト脾臓のトータルRNAをClontechから得た。ヒト皮膚組織(CHTN−ペンシルバニア大学)及びT47Dヒト乳癌細胞(ATCC)のトータルRNAを、RNeasy Mini Kit(Qiagen)を用いて製造業者の説明に従って単離した。5μgのトータルRNAから、Superscript II RNaseH-逆転写酵素(Invitrogen)を用いてcDNAを合成した。ヒト脾臓のcDNAを鋳型とし、PfuDNAポリメラーゼ(Stratagene)、及び以下のプライマーセット:フォワードプライマー、5’−gacaaaactcacacatgcccaccg−3’(配列番号71)及びリバースプライマー、5’tcatttacccggagacagggagag−3’(配列番号72)を用いたPCRにより、ヒトFc断片を得た。ヒトCD44v3−v10、CD44v8−v10、及びCD44を含む、多くのCD44アイソフォームを発現しているヒトの皮膚及びT47Dヒト乳癌細胞が得られた。ヒトの皮膚及びT47DcDNAの混合物を鋳型とし、PfuDNAポリメラーゼ(Stratagene)、以下のプライマーセット:フォワードプライマー、5’−accatggacaagttttggtggcac−3’(配列番号73)及びリバースプライマー、5’−ttctggaatttggggtgtccttat−3’(配列番号74)を用いたPCRにより、ヒトの可溶性CD44アイソフォームを得た。得られた全てのPCR産物をpEF6/v5−HisTOPO発現ベクター(Invitrogen)中にクローニングした。正しいヒトFc断片及び可溶性CD44を含むクローンを同定した。次にこれらの断片をレトロウイルス発現ベクターであるpQCXIP(BD Bioscience)中にサブクローニングし、ヒト可溶性CD44−Fc(hsCD44)融合発現コンストラクトを生成した。Mfe1制限酵素部位(CAATTG)を用いて、可溶性ヒトCD44v3−v10、v8−v10、又は可溶性CD44を、ヒトFc断片にインフレームで融合させた。これらの発現コンストラクト及び293細胞中のpVSVG/GP2Rを用い、製造業者の説明(BD)に従ってレトロウイルスを生成した。全ての発現コンストラクトをDNA塩基配列決定法により確認した。
欠損及び点突然変異生成
[00247]可溶性ヒトCD44−Fc融合タンパク質コンストラクトであるCD44s−、CD44v3−v10−、CD44v8−v10−、CD44v4−v10−、CD44v6−v10−、CD44v7−v10−、CD44v9−v10−、及びCD44v10−Fcを生成した。可溶性ヒトCD44−Fc融合タンパク質コンストラクトであるCD44v5−v10−、CD44v9−、CD44v8−、CD44v7−、CD44v6−、CD44v5−、CD44v4−、及びCD44v3−Fcを、欠損突然変異生成により生成した。欠損突然変異生成は、レトロウイルス発現ベクターpQCXIP(BD Bioscience)に導入した可溶性ヒトCD44v3−v10−Fcを鋳型として、ExSite突然変異生成キット(Stratagene)及び、欠損させるセグメントの前後24ヌクレオチド配列に相当する適切なプライマーを用いて行う(Bai et al., 2007)。
[00248]可溶性ヒトCD44R41A−Fc変異型融合タンパク質コンストラクトである、CD44sR41A−、CD44v8−v10R41A−、及びCD44v3−v10R41A−Fcを生成した。可溶性ヒトCD44R41A−Fc変異型融合タンパク質コンストラクトであるCD44v4−v10R41A−、CD44v5−v10R41A−、CD44v6−v10R41A−、CD44v7−V10R41A−、CD44v9−v10R41A−、CD44v10R41A−、CD44v9R41A−、CD44v8R41A−、CD44v7R41A−、CD44v6R41A−、CD44v5R41A−、CD44v4R41A−、CD44v3R41A−Fcを、点突然変異により生成してもよい。CD44sR41A−、CD44v8−v10R41A−、及びCD44v3−v10R41A−Fc中の点突然変異を、レトロウイルス発現ベクターpQCXIP(BD Bioscience)に導入した可溶性ヒトCD44s−、CD44v8−v10−、CD44v3−v10−Fcを鋳型として、QuikChange(登録商標)II部位特異的突然変異生成キット(Stratagene)、及び適切なプライマー対:フォワード、5’-gtg gag aaa aat ggt gcc tac agc atc tct cgg-3’(配列番号75)及びリバース、5’-ccg aga gat gct gta ggc acc att ttt ctc cac-3’(配列番号76)を用いて生成した。これらの発現コンストラクト及びpVSVG/GP2−293細胞を用い、製造業者の説明に従って(BD Bioscience)、レトロウイルスを生成した。さらなるCD44R41A−Fcコンストラクトを生成するために、同様の方法を用いてもよい。
[00247]可溶性ヒトCD44−Fc融合タンパク質コンストラクトであるCD44s−、CD44v3−v10−、CD44v8−v10−、CD44v4−v10−、CD44v6−v10−、CD44v7−v10−、CD44v9−v10−、及びCD44v10−Fcを生成した。可溶性ヒトCD44−Fc融合タンパク質コンストラクトであるCD44v5−v10−、CD44v9−、CD44v8−、CD44v7−、CD44v6−、CD44v5−、CD44v4−、及びCD44v3−Fcを、欠損突然変異生成により生成した。欠損突然変異生成は、レトロウイルス発現ベクターpQCXIP(BD Bioscience)に導入した可溶性ヒトCD44v3−v10−Fcを鋳型として、ExSite突然変異生成キット(Stratagene)及び、欠損させるセグメントの前後24ヌクレオチド配列に相当する適切なプライマーを用いて行う(Bai et al., 2007)。
[00248]可溶性ヒトCD44R41A−Fc変異型融合タンパク質コンストラクトである、CD44sR41A−、CD44v8−v10R41A−、及びCD44v3−v10R41A−Fcを生成した。可溶性ヒトCD44R41A−Fc変異型融合タンパク質コンストラクトであるCD44v4−v10R41A−、CD44v5−v10R41A−、CD44v6−v10R41A−、CD44v7−V10R41A−、CD44v9−v10R41A−、CD44v10R41A−、CD44v9R41A−、CD44v8R41A−、CD44v7R41A−、CD44v6R41A−、CD44v5R41A−、CD44v4R41A−、CD44v3R41A−Fcを、点突然変異により生成してもよい。CD44sR41A−、CD44v8−v10R41A−、及びCD44v3−v10R41A−Fc中の点突然変異を、レトロウイルス発現ベクターpQCXIP(BD Bioscience)に導入した可溶性ヒトCD44s−、CD44v8−v10−、CD44v3−v10−Fcを鋳型として、QuikChange(登録商標)II部位特異的突然変異生成キット(Stratagene)、及び適切なプライマー対:フォワード、5’-gtg gag aaa aat ggt gcc tac agc atc tct cgg-3’(配列番号75)及びリバース、5’-ccg aga gat gct gta ggc acc att ttt ctc cac-3’(配列番号76)を用いて生成した。これらの発現コンストラクト及びpVSVG/GP2−293細胞を用い、製造業者の説明に従って(BD Bioscience)、レトロウイルスを生成した。さらなるCD44R41A−Fcコンストラクトを生成するために、同様の方法を用いてもよい。
可溶性CD44−Fc及び可溶性CD44R41A−Fc融合タンパク質の生産及び精製
[00249]hsCD44v3−v10−Fc、hsCD44v6−v10−FC、hsCD44v8−v10−Fc、hsCD44s−Fc、hsCD44v3−v10R41A−Fc、hsCD44v8−v10R41A−Fc、及びhsCD44sR41A−Fcコンストラクトを含むレトロウイルスを感染させたCos−7細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS)を含むRPMI中で、コンフルエンスに達するまで培養した。その後培地を無血清RPMI培地(SFM)に交換し、さらに3日間培養した。SFMを回収し、プロテインAカラム(GE Healthcare Biosciences)を用いて精製した。プロテインAカラムから溶出する前に、結合させたCD44−Fc融合タンパク質調整物のいくらかを、へパリナーゼI(10単位/ml)及びへパリナーゼIII(2単位/ml)を用いて、37℃で4時間処理した。
[00249]hsCD44v3−v10−Fc、hsCD44v6−v10−FC、hsCD44v8−v10−Fc、hsCD44s−Fc、hsCD44v3−v10R41A−Fc、hsCD44v8−v10R41A−Fc、及びhsCD44sR41A−Fcコンストラクトを含むレトロウイルスを感染させたCos−7細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS)を含むRPMI中で、コンフルエンスに達するまで培養した。その後培地を無血清RPMI培地(SFM)に交換し、さらに3日間培養した。SFMを回収し、プロテインAカラム(GE Healthcare Biosciences)を用いて精製した。プロテインAカラムから溶出する前に、結合させたCD44−Fc融合タンパク質調整物のいくらかを、へパリナーゼI(10単位/ml)及びへパリナーゼIII(2単位/ml)を用いて、37℃で4時間処理した。
ルシフェラーゼレポーター検定
[00250]U87MGwt及びU87MGマーリンS518D、U87MGマーリン、及びU87MGマーリンS518A細胞での標準的なWntシグナル伝達を測定するために、TCF/LEF結合部位及び陰性対照コンストラクトであるFopFlashを含む、ベータ−カテニン応答性ルシフェラーゼレポーターコンストラクト(TopFlash、Addgene)を用いた。FopFlashは変異型TCF/LEF結合部位を含む。これらの、導入した神経膠腫細胞に、これらのレポーターを一過的に導入した。同じ実験を3回行った。Modulus Microplate Luminometer/Fluorometer(Turner Biosystems)を用い、製造業者の説明に従って(Promega)、これら導入細胞におけるルシフェラーゼ活性を、感染の24時間後に測定した。
[00250]U87MGwt及びU87MGマーリンS518D、U87MGマーリン、及びU87MGマーリンS518A細胞での標準的なWntシグナル伝達を測定するために、TCF/LEF結合部位及び陰性対照コンストラクトであるFopFlashを含む、ベータ−カテニン応答性ルシフェラーゼレポーターコンストラクト(TopFlash、Addgene)を用いた。FopFlashは変異型TCF/LEF結合部位を含む。これらの、導入した神経膠腫細胞に、これらのレポーターを一過的に導入した。同じ実験を3回行った。Modulus Microplate Luminometer/Fluorometer(Turner Biosystems)を用い、製造業者の説明に従って(Promega)、これら導入細胞におけるルシフェラーゼ活性を、感染の24時間後に測定した。
[00251]ヒトCD44の発現をノックダウンするために、ヒトCD44に対する複数のshRNAmir(expression Arrest(商標)microRNA-adapted shRNA)及びTRC(RNAiコンソーシアム)コンストラクト、並びに標的をもたないshRNAmir及び標的をもたないTRC対照コンストラクトをOpen Biosystems及びAddgene(非営利プラスミド保存団体、www.addgene.org)から得た。これらのshRNAを含むレンチウイルスを製造業者の説明に従って生成した。Expression Arrest(商標)microRNA-adapted shRNA(shRNAmir)は、天然のmicroRNA一次転写産物を模倣するように設計されており、このため、内生RNAi経路による特定のプロセッシング及びより有効なノックダウンが可能になっている。microRNA−30用の設計には、mir−30ループ及びコンテクスト配列(Silva et al., 2005)が含まれている。
表2:CD44アンチセンスコンストラクトの配列表
レンチウイルス及びレトロウイルスの導入(transduction)
[00252]U87MG及びU251ヒト神経膠腫細胞を6−ウェルプレートに播種し、一晩生育させた。サブコンフルエンスに達したU87MG及びU251細胞に、まず、ルシフェラーゼとハイグロマイシン耐性遺伝子を含むレトロウイルスを導入し、次に、ピューロマイシン耐性遺伝子を有する空のレトロウイルス発現ベクター又はヒト可溶性(hs)CD44−Fc融合コンストラクトを含むレトロウイルスを導入した。集めた薬剤耐性細胞の集団を増殖させ、それら導入した遺伝子産物の発現を評価するために、その細胞の一部を用いた。hsCD44−Fc融合タンパク質の発現レベルを検出するために、抗CD44及び抗ヒトIgG抗体を用いた。
[00252]U87MG及びU251ヒト神経膠腫細胞を6−ウェルプレートに播種し、一晩生育させた。サブコンフルエンスに達したU87MG及びU251細胞に、まず、ルシフェラーゼとハイグロマイシン耐性遺伝子を含むレトロウイルスを導入し、次に、ピューロマイシン耐性遺伝子を有する空のレトロウイルス発現ベクター又はヒト可溶性(hs)CD44−Fc融合コンストラクトを含むレトロウイルスを導入した。集めた薬剤耐性細胞の集団を増殖させ、それら導入した遺伝子産物の発現を評価するために、その細胞の一部を用いた。hsCD44−Fc融合タンパク質の発現レベルを検出するために、抗CD44及び抗ヒトIgG抗体を用いた。
[00253]ヒトCD44に対するshRNA又は標的をもたない対照shRNAを含むレンチウイルスを用い、製造業者の説明に従ってCD44をノックダウンした。感染細胞をそれらのハイグロマイシン及びピューロマイシン耐性能により選抜した。集めた薬剤耐性細胞集団を増殖させ、その細胞の一部を用いて内生CD44の発現レベルを評価した。抗CD44抗体(Santa Cruz)を用いて内生CD44レベルを評価した。
腫瘍様塊への遺伝子導入
[00254]ヒト腫瘍様塊(HGS)を0.05%トリプシン−エチレンジアミン4酢酸(EDTA、Cellgro(登録商標))を用いて分離させ、支持細胞層無しで胚性幹細胞を維持及び増殖させるために設計されたBD BioCoat(商標)マトリゲル(商標)マトリックス6−ウェルプレート上に播種した。これらの細胞にヒトCD44に対するshRNAを含むレンチウイルスを感染させた。ピューロマイシンを用いて選抜した後、集めた薬剤耐性細胞の集団を単一の細胞になるまで懸濁し、超低接着性プレートに入れた無血清癌幹細胞培地(B27(Invitrogen)、EGF(10ng/mL、BD Biosciences)、及びFGF−2(20ng/mL、BD Biosciences)を添加したDMEM/F12)中で培養し、細胞塊を再形成させた。
[00254]ヒト腫瘍様塊(HGS)を0.05%トリプシン−エチレンジアミン4酢酸(EDTA、Cellgro(登録商標))を用いて分離させ、支持細胞層無しで胚性幹細胞を維持及び増殖させるために設計されたBD BioCoat(商標)マトリゲル(商標)マトリックス6−ウェルプレート上に播種した。これらの細胞にヒトCD44に対するshRNAを含むレンチウイルスを感染させた。ピューロマイシンを用いて選抜した後、集めた薬剤耐性細胞の集団を単一の細胞になるまで懸濁し、超低接着性プレートに入れた無血清癌幹細胞培地(B27(Invitrogen)、EGF(10ng/mL、BD Biosciences)、及びFGF−2(20ng/mL、BD Biosciences)を添加したDMEM/F12)中で培養し、細胞塊を再形成させた。
CD44発現のウェスタンブロット解析
[00255]RIPA緩衝液(150mM NaCl、5mM EDTA、1%トライトン、0.1%SDS、2mM PMSF、2μg/mlロイペプチン、及び0.05U/mlアプロチニンを含む50mM Tris−HCl(pH7.4))、又は色素を含まない4×SDSレムリー試料緩衝液のいずれかを用いて細胞を抽出し、Bio−RadDcタンパク質検定試薬を用いてタンパク質濃度を決定した。抽出したタンパク質50〜100gを10%SDS−PAGEを用いて分離した。電気泳動の後、ゲルをHybond−ECL膜(Amersham、アーリントンハイツ、IL)上にブロッティングした。抗CD44抗体(Santa Cruz)を用いてCD44を検出した。
[00255]RIPA緩衝液(150mM NaCl、5mM EDTA、1%トライトン、0.1%SDS、2mM PMSF、2μg/mlロイペプチン、及び0.05U/mlアプロチニンを含む50mM Tris−HCl(pH7.4))、又は色素を含まない4×SDSレムリー試料緩衝液のいずれかを用いて細胞を抽出し、Bio−RadDcタンパク質検定試薬を用いてタンパク質濃度を決定した。抽出したタンパク質50〜100gを10%SDS−PAGEを用いて分離した。電気泳動の後、ゲルをHybond−ECL膜(Amersham、アーリントンハイツ、IL)上にブロッティングした。抗CD44抗体(Santa Cruz)を用いてCD44を検出した。
CD44発現の免疫細胞化学
[00256]CD44をノックダウンした又はノックダウンしていない神経膠腫細胞を、10%FBS RPMIを入れた35mmシャーレ中で24時間培養した。細胞を3.7%パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで洗浄し、その後2%脱脂粉乳を用いてブロッキングした。抗CD44抗体(Santa Cruz)及びFITC結合抗マウス二次抗体(Sigma)を用いて細胞表面上のCD44を検出した。
[00256]CD44をノックダウンした又はノックダウンしていない神経膠腫細胞を、10%FBS RPMIを入れた35mmシャーレ中で24時間培養した。細胞を3.7%パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで洗浄し、その後2%脱脂粉乳を用いてブロッキングした。抗CD44抗体(Santa Cruz)及びFITC結合抗マウス二次抗体(Sigma)を用いて細胞表面上のCD44を検出した。
フルオレセイン標識HA(FL−HA)結合検定
[00257]FL−HA結合検定を、既に記載されているように行った(Xu and Yu, 2003; Yu and Stamenkovic, 1999)。簡単に説明すると、全量5×105個の、遺伝子を導入した神経膠腫細胞を、PRMI/10%FBS及びピューロマイシンを入れた35mmシャーレ中に播種した。翌日、培地を20μg/mlのFl−HAを含む新しいRPMI/10%FBSと交換した。24時間後、PBSを用いて細胞をしっかりと洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、包埋し、そして蛍光顕微鏡を用いて観察した。
[00257]FL−HA結合検定を、既に記載されているように行った(Xu and Yu, 2003; Yu and Stamenkovic, 1999)。簡単に説明すると、全量5×105個の、遺伝子を導入した神経膠腫細胞を、PRMI/10%FBS及びピューロマイシンを入れた35mmシャーレ中に播種した。翌日、培地を20μg/mlのFl−HAを含む新しいRPMI/10%FBSと交換した。24時間後、PBSを用いて細胞をしっかりと洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、包埋し、そして蛍光顕微鏡を用いて観察した。
腫瘍の皮下成長実験
[00258]認可されたIACUCプロトコールに従ってマウスを用いた。伝子を導入したU87MG及びU251神経膠腫細胞の集団を集め、腫瘍の皮下成長実験に用いた。2×l06又は5×l06個の神経膠腫細胞又は5×106個の神経膠腫細胞を各免疫不全B6.129S7−Rag1tmmom(Rag1、Jackson Lab)マウスの皮下に注入した。感染させた神経膠腫それぞれについて6匹のマウスを用いた。固形腫瘍が観察できるようになってきたら(注入の10〜15日後)、5〜7週間、3日おきに、神経膠腫由来の固形腫瘍の最長径と最短径をデジタル測径器で測定した。腫瘍容積は以下の式から算出した:腫瘍容積=1/2×(最短の径)2×最長の径(mm3)。実験の終了時に腫瘍を固定し、組織学的及び免疫組織学的解析用に切片を作成した。
[00258]認可されたIACUCプロトコールに従ってマウスを用いた。伝子を導入したU87MG及びU251神経膠腫細胞の集団を集め、腫瘍の皮下成長実験に用いた。2×l06又は5×l06個の神経膠腫細胞又は5×106個の神経膠腫細胞を各免疫不全B6.129S7−Rag1tmmom(Rag1、Jackson Lab)マウスの皮下に注入した。感染させた神経膠腫それぞれについて6匹のマウスを用いた。固形腫瘍が観察できるようになってきたら(注入の10〜15日後)、5〜7週間、3日おきに、神経膠腫由来の固形腫瘍の最長径と最短径をデジタル測径器で測定した。腫瘍容積は以下の式から算出した:腫瘍容積=1/2×(最短の径)2×最長の径(mm3)。実験の終了時に腫瘍を固定し、組織学的及び免疫組織学的解析用に切片を作成した。
腫瘍の頭蓋内成長実験
[00259]認可されたIACUCプロトコールに従ってマウスを用いた。遺伝子を導入したU87MG及びU251細胞の集団を集め、腫瘍の頭蓋内成長実験に用いた。U87MG(10μlのHBSS中に4×l05細胞/Rag1マウス)又はU251細胞(10μlのHBSS中に2×105細胞/Rag1マウス)を、ブレグマに、すなわち矢状抱合の2mm右側、かつ、頭蓋表面から3mm下に注入した。注入後、マウスをしっかりと観察し、生存期間を記録した。窮迫及び罹病の徴候が見られたマウス安楽死させ、その日に死亡したものと見なした。生存しているマウスの数を記録した。生存率は以下の式から算出した:生存率(%)=(現在生存しているマウスの数/実験に用いたマウスの総数)×100%。頭蓋内注入から40又は60日後も症状を呈さなかったマウスは安楽死させ、その組織を解析した。
[00259]認可されたIACUCプロトコールに従ってマウスを用いた。遺伝子を導入したU87MG及びU251細胞の集団を集め、腫瘍の頭蓋内成長実験に用いた。U87MG(10μlのHBSS中に4×l05細胞/Rag1マウス)又はU251細胞(10μlのHBSS中に2×105細胞/Rag1マウス)を、ブレグマに、すなわち矢状抱合の2mm右側、かつ、頭蓋表面から3mm下に注入した。注入後、マウスをしっかりと観察し、生存期間を記録した。窮迫及び罹病の徴候が見られたマウス安楽死させ、その日に死亡したものと見なした。生存しているマウスの数を記録した。生存率は以下の式から算出した:生存率(%)=(現在生存しているマウスの数/実験に用いたマウスの総数)×100%。頭蓋内注入から40又は60日後も症状を呈さなかったマウスは安楽死させ、その組織を解析した。
頭蓋内神経膠腫の生物発光画像解析
[00260]生きている動物の頭蓋内での神経膠腫の成長を観察するために、生物発光画像法を用いた。内部リボソーム侵入部位(IRES)及びハイグロマイシン耐性遺伝子を有する、レトロウイルスを用いたルシフェラーゼ発現ベクターをU87MG及びU251細胞に感染させた。ハイグロマイシン耐性U87MG−Luc及びU251−Luc細胞は高レベルのルシフェラーゼを発現する。これらの細胞に、次に標的をもたないshRNAs又はヒトCD44に対するshRNAを含むレンチウイルスを感染させた。これらの2重薬剤耐性細胞を、Rag−1マウス頭蓋内のブレグマに、すなわち矢状縫合の2mm右側、かつ、頭蓋表面から3mm下に注入した。注入の3、6、9、13、17日後、D−ルシフェリンを注入し、その12分後に頭蓋内腫瘍の生物発光画像を取得した。実験はマウントサイナイ医科大学(Mount Sinai School of Medicine)のInvivo Molecular Imaging Shared Facilityで行い、画像はIVIS−200画像処理装置(Xenogen)を用いて、同じ強度スケーリングで取得した。
[00260]生きている動物の頭蓋内での神経膠腫の成長を観察するために、生物発光画像法を用いた。内部リボソーム侵入部位(IRES)及びハイグロマイシン耐性遺伝子を有する、レトロウイルスを用いたルシフェラーゼ発現ベクターをU87MG及びU251細胞に感染させた。ハイグロマイシン耐性U87MG−Luc及びU251−Luc細胞は高レベルのルシフェラーゼを発現する。これらの細胞に、次に標的をもたないshRNAs又はヒトCD44に対するshRNAを含むレンチウイルスを感染させた。これらの2重薬剤耐性細胞を、Rag−1マウス頭蓋内のブレグマに、すなわち矢状縫合の2mm右側、かつ、頭蓋表面から3mm下に注入した。注入の3、6、9、13、17日後、D−ルシフェリンを注入し、その12分後に頭蓋内腫瘍の生物発光画像を取得した。実験はマウントサイナイ医科大学(Mount Sinai School of Medicine)のInvivo Molecular Imaging Shared Facilityで行い、画像はIVIS−200画像処理装置(Xenogen)を用いて、同じ強度スケーリングで取得した。
組織学的解析及び免疫組織学的解析
[00261]生体内での神経膠腫細胞の増殖率を決定するために、5−ブロモ−2’−デオキシ−ウリジン(BrdU)をマウスの腹膜内(i.p.)に注入し、その4時間後に安楽死させた。神経膠腫を含む腫瘍を実験動物から摘出してホルマリン(フィッシャー)で固定し、PBSで洗浄し、30%、70%、95%、及び100%エタノール並びにキシレンを通して脱水し、その後パラフィンワックス(フィッシャー)で包埋した。5〜10μmの切片を作成してスライドグラス上に乗せ、そして組織学的解析用に、ヘマトキシリン及びエオシン(フィッシャー)で染色した。切片を、増殖している細胞を検出するためには抗BrdU又は抗Ki67抗体と、アポトーシスを起こしている細胞をその位置で検出するためにはApoptagキットと共にインキュベートした(Lau et al. 2008)。
[00261]生体内での神経膠腫細胞の増殖率を決定するために、5−ブロモ−2’−デオキシ−ウリジン(BrdU)をマウスの腹膜内(i.p.)に注入し、その4時間後に安楽死させた。神経膠腫を含む腫瘍を実験動物から摘出してホルマリン(フィッシャー)で固定し、PBSで洗浄し、30%、70%、95%、及び100%エタノール並びにキシレンを通して脱水し、その後パラフィンワックス(フィッシャー)で包埋した。5〜10μmの切片を作成してスライドグラス上に乗せ、そして組織学的解析用に、ヘマトキシリン及びエオシン(フィッシャー)で染色した。切片を、増殖している細胞を検出するためには抗BrdU又は抗Ki67抗体と、アポトーシスを起こしている細胞をその位置で検出するためにはApoptagキットと共にインキュベートした(Lau et al. 2008)。
シグナル伝達経路タンパク質のウェスタンブロット解析
[00262]U87MG−NT細胞(標的をもたないTRC−NT及びshRNAmir−NTコンストラクトを含むレンチウイルスの混合物を感染させたU87MG細胞)及びU87MGshRNA−CD44細胞(ヒトCD44に対するshRNA、TRC−CD44#3及びshRNAmir−CD44#lを含むレンチウイルスの混合物を感染させたU87MG細胞)を、媒体、60μmのH2O2、又は40μg/mlのTMZで30分、2時間、24時間、48時間、及び72時間処理した。細胞を、色素を含まない4xSDSレムリー試料緩衝液を用いて溶解した。タンパク質濃度をBio−RadDcタンパク質検定試薬を用いて決定した。全タンパク質100μgを各レーンにローディングした。タンパク質泳動の内部対照としてはアクチンを用いた。異なるシグナル伝達調節物質に対して用いた抗体を図中に示す。
[00262]U87MG−NT細胞(標的をもたないTRC−NT及びshRNAmir−NTコンストラクトを含むレンチウイルスの混合物を感染させたU87MG細胞)及びU87MGshRNA−CD44細胞(ヒトCD44に対するshRNA、TRC−CD44#3及びshRNAmir−CD44#lを含むレンチウイルスの混合物を感染させたU87MG細胞)を、媒体、60μmのH2O2、又は40μg/mlのTMZで30分、2時間、24時間、48時間、及び72時間処理した。細胞を、色素を含まない4xSDSレムリー試料緩衝液を用いて溶解した。タンパク質濃度をBio−RadDcタンパク質検定試薬を用いて決定した。全タンパク質100μgを各レーンにローディングした。タンパク質泳動の内部対照としてはアクチンを用いた。異なるシグナル伝達調節物質に対して用いた抗体を図中に示す。
[00263]異なる成長因子で処理したU87MG−TN及びU87MGshRNA−CD44細胞由来の細胞溶解物を用いてもまた、ウェスタンブロットを行った。2×105個の神経膠腫細胞を6−ウェルプレートに24時間播種し、無血清培地に交換し、さらに72時間培養した。血清飢餓U87MG細胞をFBS、NGF(10ng/ml)、EGF(2ng/ml)、HB−EGF(5ng/ml)、ベータセルリン(BTC、5ng/ml)、エピレグリン(Epr、5ng/ml)、アンフィレグリン(AR、5ng/ml)、又はHGF(20ng/ml)で12時間処理した、あるいは処理しなかった。細胞を、色素を含まない4×SDSレムリー試料緩衝液を用いて溶解し、タンパク質濃度をBio−RadDcタンパク質検定試薬を用いて決定した。全タンパク質100μgを各レーンに充填した。タンパク質負荷の内部対照としてはアクチンを用いた。異なるシグナル伝達調節物質に対して用いた抗体を図中に示す。
酸化ストレスの投与
[00264]H2O2を無血清神経膠腫培地(RPMI)中に、最終濃度が60μΜになるように添加した。60μmのH2O2存在下で、神経膠腫細胞を30分、2時間、24時間、48時間、及び72時間培養した。
[00264]H2O2を無血清神経膠腫培地(RPMI)中に、最終濃度が60μΜになるように添加した。60μmのH2O2存在下で、神経膠腫細胞を30分、2時間、24時間、48時間、及び72時間培養した。
化学療法剤の投与
[00265]TMZを無血清神経膠腫培地(RPMI)中に、最終濃度が40g/mlになるように添加した。40μg/mlのTMZ存在下で、神経膠腫細胞を30分、2時間、24時間、48時間、及び72時間培養した。
[00265]TMZを無血清神経膠腫培地(RPMI)中に、最終濃度が40g/mlになるように添加した。40μg/mlのTMZ存在下で、神経膠腫細胞を30分、2時間、24時間、48時間、及び72時間培養した。
ビオチンで標識したCD44−Fc融合タンパク質を用いたHAの検出方法及びHAの検出による癌の診断方法
[00266]精製したCD44−Fc融合タンパク質(hsCD44s−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、及びhsCD44v3−v10−Fc)を、EZ−Linkビオチン化キット(Thermo Scientific)を用い、製造業者の説明に従ってビオチンで標識した。ヒト腫瘍のパラフィン切片を脱パラフィンし、水和した。2%BSAでブロッキングした後、切片をビオチン化CD44−Fc融合タンパク質(1μg/ml)と共に、4度で一晩インキュベートした。VECTASTAIN ABCキットを用いてビオチン化CD44−Fc融合タンパク質を検出した。
[00266]精製したCD44−Fc融合タンパク質(hsCD44s−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、及びhsCD44v3−v10−Fc)を、EZ−Linkビオチン化キット(Thermo Scientific)を用い、製造業者の説明に従ってビオチンで標識した。ヒト腫瘍のパラフィン切片を脱パラフィンし、水和した。2%BSAでブロッキングした後、切片をビオチン化CD44−Fc融合タンパク質(1μg/ml)と共に、4度で一晩インキュベートした。VECTASTAIN ABCキットを用いてビオチン化CD44−Fc融合タンパク質を検出した。
[00267]血漿HAレベルを検出するために、乳癌を有する各トランスジェニックマウス(MMTV−PyVT及びMMTV−ActErbb2、Jackson Lab)、MSSM−GBMCSC−1又は神経膠腫261細胞由来の神経膠腫を有するRag−1マウス、又は正常な対照マウスから、少なくとも200μlの血液を採取した。各型のマウスそれぞれ6匹から血液試料を採取し、すぐに血漿試料を調整した。各試料から調整した50μlの血漿をそれぞれ、CD44−Fc融合タンパク質を予め塗布しておいたエライサプレートの3つのウェルにローディングした。ビオチン化CD44−Fc融合タンパク質及びAP−結合型アビジンを用いて、HAに結合したCD44−Fcを検出した。発色を、エライサ測定器を用いて405nmで測定した。
前立腺、結腸、乳、肺、卵巣、肝臓、膵臓、及び頭頸部癌モデル、並びに黒色腫モデル
[00268]PC3/Mヒト前立腺癌細胞、HCT116及びKM20L2ヒト結腸癌細胞、MX−2及びSW613ヒト乳癌細胞、NCI−H125ヒト非小細胞肺癌細胞、NCIH460、ヒト大細胞肺癌細胞、及びOVCAR−3ヒト卵巣癌細胞に、ルシフェラーゼ及びヒトCD44に対するshRNA又は対照である標的をもたないshRNAを導入し、それらのハイグロマイシン及びピューロマイシン耐性能により選抜した。Ml4ヒト黒色腫細胞、SCC−4ヒト頭頸部癌腫細胞、BXPC−3ヒト膵癌細胞、及びSK−Hep−1ヒト肝臓癌細胞に、CD44s−Fc、CD44v3−v10−Fc、及びCD44v8−v10−Fcコンストラクト又は空の発現ベクターを含むレトロウイルスを導入した。集めた、薬剤耐性癌細胞の集団を、腫瘍の皮下成長実験に用いた。これらの癌細胞5×106個を、各免疫不全B6.129S7−Rag1tmMom(Rag1、Jackson Lab)マウスの皮下に注入した。感染させた癌細胞それぞれの型につき、6匹のマウスを用いた。実験の終了時に、最長径と最短径をデジタル測径器で測定した。腫瘍容積は以下の式から算出した:腫瘍容積=1/2×(最短の径)2×最長の径(mm3)。実験の終了時に腫瘍を固定し、組織学的及び免疫組織学的解析用に切片を作成した。
[00268]PC3/Mヒト前立腺癌細胞、HCT116及びKM20L2ヒト結腸癌細胞、MX−2及びSW613ヒト乳癌細胞、NCI−H125ヒト非小細胞肺癌細胞、NCIH460、ヒト大細胞肺癌細胞、及びOVCAR−3ヒト卵巣癌細胞に、ルシフェラーゼ及びヒトCD44に対するshRNA又は対照である標的をもたないshRNAを導入し、それらのハイグロマイシン及びピューロマイシン耐性能により選抜した。Ml4ヒト黒色腫細胞、SCC−4ヒト頭頸部癌腫細胞、BXPC−3ヒト膵癌細胞、及びSK−Hep−1ヒト肝臓癌細胞に、CD44s−Fc、CD44v3−v10−Fc、及びCD44v8−v10−Fcコンストラクト又は空の発現ベクターを含むレトロウイルスを導入した。集めた、薬剤耐性癌細胞の集団を、腫瘍の皮下成長実験に用いた。これらの癌細胞5×106個を、各免疫不全B6.129S7−Rag1tmMom(Rag1、Jackson Lab)マウスの皮下に注入した。感染させた癌細胞それぞれの型につき、6匹のマウスを用いた。実験の終了時に、最長径と最短径をデジタル測径器で測定した。腫瘍容積は以下の式から算出した:腫瘍容積=1/2×(最短の径)2×最長の径(mm3)。実験の終了時に腫瘍を固定し、組織学的及び免疫組織学的解析用に切片を作成した。
さらなる癌モデル
[00269]Rag−1マウスでの異種稙片及び同所性中皮腫腫瘍モデル:5×l06個のヒト悪性中皮腫細胞、すなわちH−MESO−1、H−MESO−1A、及び/又はMSTO−211H(ATCC及びフレデリックにあるNCI−DCTD腫瘍/細胞株保存所)を、免疫不全Rag1マウスの右胸腔に、皮下的及び同所的に注入する。
[00269]Rag−1マウスでの異種稙片及び同所性中皮腫腫瘍モデル:5×l06個のヒト悪性中皮腫細胞、すなわちH−MESO−1、H−MESO−1A、及び/又はMSTO−211H(ATCC及びフレデリックにあるNCI−DCTD腫瘍/細胞株保存所)を、免疫不全Rag1マウスの右胸腔に、皮下的及び同所的に注入する。
[00270]異種稙片黒色腫モデル:5×106個のヒト黒色腫細胞、MEWO、SKMEL5、SKMEL2、及び/又はA375(ATCC及びフレデリックにあるNCI−DCTD腫瘍/細胞株保存所)を、免疫不全Rag1マウスの皮下に注入する。
[00271]異種稙片肉腫モデル:5×106個のヒト肉腫細胞、すなわちSKN−MC及びA673細胞(ATCC)を、免疫不全Rag1マウスの皮下に注入する。
[00272]異種稙片膵癌モデル:5×106個のヒト膵癌細胞、すなわちPanc−1、HPAC、MIA PaCa−2、及び/又はAsPC−1膵癌細胞を、免疫不全Rag1マウスの皮下に注入する。
[00272]異種稙片膵癌モデル:5×106個のヒト膵癌細胞、すなわちPanc−1、HPAC、MIA PaCa−2、及び/又はAsPC−1膵癌細胞を、免疫不全Rag1マウスの皮下に注入する。
[00273]異種稙片肝癌モデル:5×106個のヒト肝癌細胞、すなわちHep 3B2.1−7肝癌細胞を、免疫不全Rag1マウスの皮下に注入する。
[00274]異種稙片多発性骨髄腫モデル:5×106個のヒト多発性骨髄腫細胞、すなわちU266及びMC/CAR細胞を、免疫不全Rag1マウスの皮下に注入する。
[00274]異種稙片多発性骨髄腫モデル:5×106個のヒト多発性骨髄腫細胞、すなわちU266及びMC/CAR細胞を、免疫不全Rag1マウスの皮下に注入する。
[00275]Rag−1マウスでの腹水卵巣癌モデル:5×106個のヒトSKOV3ip及びOVCAR−3ipヒト卵巣癌細胞を、免疫不全Rag−1マウスの腹膜内(ip)に注入する。
[00276]異種稙片及び/又は骨転移性前立腺癌モデル:5×106個のヒト前立腺癌細胞、すなわち22Rvlを、Rag−1マウスの皮下に又は各Rag−1マウスの心臓内に、それぞれ注入する。
[00277]異種稙片及び/又は転移性肺癌モデル:5×106個のヒト肺癌細胞、すなわちA549及びLX529を、Rag−1マウスの皮下に又はRag−1マウスの静脈内に、それぞれ注入する。
[00278]異種稙片及び同所性乳癌モデル:5×106個のヒト乳癌細胞、すなわちMX−2及びSW613を、Rag−1マウスの皮下に又はRag−1マウスの***脂肪体に、それぞれ注入する。
[00279]癌幹細胞モデル:新しいヒト膠芽腫、ヒト黒色腫、肺、乳、前立腺、卵巣、頭頸部、腎臓、及び結腸癌組織を、ペンシルバニア大学及びオハイオ州立大学のCooperative Human Tissue Network(CHTN)から得た。0.4%のI型コラゲナーゼ(Sigma、C0130)を用いて、組織を単一の細胞になるまで分離させ、その後、B27(Invitrogen)、EGF(10ng/mL、BD Biosciences)、及びFGF−2(20ng/mL、BD Biosciences)を添加したDMEM/F12である無血清癌幹細胞培地を入れた超低接着性プレート中にプレーティングした。最初の細胞塊が形成された後、およそ1週間に1回の頻度で、腫瘍細胞塊を0.05%トリプシン−エチレンジアミン4酢酸(EDTA)で分離することにより継代した。腫瘍細胞塊をRag−1マウスの皮下に埋め込んだ。
統計分析
[00280]対照及び実験群間の腫瘍容積及び成長速度の統計的な差異を解析するために、一元配置型ANOVAによる統計分析を行った。生存実験についてはログランク検定を行った。p<0.05の場合の差を統計的に有意であると見なした。
[00280]対照及び実験群間の腫瘍容積及び成長速度の統計的な差異を解析するために、一元配置型ANOVAによる統計分析を行った。生存実験についてはログランク検定を行った。p<0.05の場合の差を統計的に有意であると見なした。
実施例1
ヒト多形性膠芽腫(GBM)ではCD44は亢進されている
[00281]GBMでのCD44の発現レベルを決定するために、www.oncomine.orgで使用可能な遺伝子発現データセットを検索した。4つの独立したデータセットにおいてCD44転写産物は、正常な脳と比較して(図1A、試験1、2、及び4)(Bredel et al., 2005; Liang et al., 2005; Sun et al., 2006)又は正常な白質と比較して(図1A、試験3)(Shai et al., 2003)、ヒトGBMで一貫して亢進されていた。初期腫瘍から作成したパラフィン切片の免疫組織化学染色より、8例の正常なヒトの脳と比較して、解析した14例全てのGBMでCD44が亢進されていることが示された(図IB)。
ヒト多形性膠芽腫(GBM)ではCD44は亢進されている
[00281]GBMでのCD44の発現レベルを決定するために、www.oncomine.orgで使用可能な遺伝子発現データセットを検索した。4つの独立したデータセットにおいてCD44転写産物は、正常な脳と比較して(図1A、試験1、2、及び4)(Bredel et al., 2005; Liang et al., 2005; Sun et al., 2006)又は正常な白質と比較して(図1A、試験3)(Shai et al., 2003)、ヒトGBMで一貫して亢進されていた。初期腫瘍から作成したパラフィン切片の免疫組織化学染色より、8例の正常なヒトの脳と比較して、解析した14例全てのGBMでCD44が亢進されていることが示された(図IB)。
[00282]神経膠腫の成長及び進行におけるCD44の機能を解析するために、様々なヒト神経膠腫細胞株でのCD44タンパク質の発現レベルを決定した。ATCC、UCSF、及びフレデリックにあるNCI−DCTD腫瘍/細胞株保存所より入手したヒト神経膠腫細胞株を用いた。試験したヒト神経膠腫細胞の大部分が、正常なヒト星状細胞(NHA)に比べて高レベルのCD44を発現しており、発現されたイソ型の大部分は、標準的な85−90kDaの形態のものであった(CD44s、図1C)。それらの高いCD44発現レベル及び免疫不全マウスでの腫瘍原性に基づいて、神経膠腫の成長及び進行におけるCD44の機能、並びに、それによりCD44がその過程に貢献している可能性のある機序を研究するために、U87MG及びU251ヒト神経膠腫細胞を選択した。
実施例2
レンチウイルスを用いたshRNAは、ヒト多形性膠芽腫(GBM)細胞でのCD44の発現を効果的にノックダウンする
[00283]U251及びU87MG細胞での内生CD44の発現を効果的にノックダウンするために、一連のヒトCD44−特異的TRC−shRNA(shRNA−TRC−CD44#l−#5)及びshRNAmir(shRNArnir−CD44#l−#3)コンストラクト(Open Biosystems)をスクリーニングした。陰性対照として、標的をもたない対照shRNA(shRNA−TRC−NT及びshRNAmir−NT)を加えた。これらのshRNAベクターはレンチウイルスを用いたものであり、かつ、内部リボソーム侵入部位(IRES)/GFP及び/又はshRNA挿入断片の3’末端に位置するピューロマイシン耐性遺伝子を含む。shRNAmirコンストラクト中の要素であるIRESは、全てのピューロマイシン耐性細胞が、挿入されたshRNAを発現させることを保証し、また、shRNAの発現の指標として、GFPの発現を用いることを効果的に可能にする。ルシフェラーゼを導入し、ルシフェラーゼを発現しているU87MG−Luc及びU251−Luc細胞に、これらのshRNAコンストラクトを含むレンチウイルスを感染させた。ルシフェラーゼ活性により、これらの細胞の頭蓋内での成長が効率的に観察できるようになった(Lau et al., 2008)。ピューロマイシンを用いて感染した細胞を選抜した後、集めたピューロマイシン耐性GBM細胞集団における内生CD44の発現レベルを評価した。リアルタイムqPCR(データは示さない)、ウェスタンブロット解析(図2A)及び免疫細胞化学(図2B、D)によって評価したように、これら2種類の神経膠腫細胞株では、3つのshRNAmirコンストラクトのうちの2つ(shRNAmir−CD44#l及びshRNAmir−CD44#3)及び1−2TRC−shRNA(shRNA−TRC−CD44#3及び/又はshRNA−TRC−CD44#4)で、CD44の発現が効果的にノックダウンされた。その他のCD44−特異的shRNAにおいても、CD44の発現は多様な程度で減少したが、標的をもたない対照は、効果を示さなかった。CD44はHAの主要な細胞表面受容体であるので、CD44を発現していない細胞の、フルオレセイン標識HA(FL−HA)への結合能を評価した。CD44の発現を効果的にノックダウンすると、神経膠腫細胞のFL−HAへの結合能及びFL−HAの取り込みが劇的に減少したが、標的をもたないshRNAはいずれの効果も示さなかった(図2C、及びデータは示さない)。
レンチウイルスを用いたshRNAは、ヒト多形性膠芽腫(GBM)細胞でのCD44の発現を効果的にノックダウンする
[00283]U251及びU87MG細胞での内生CD44の発現を効果的にノックダウンするために、一連のヒトCD44−特異的TRC−shRNA(shRNA−TRC−CD44#l−#5)及びshRNAmir(shRNArnir−CD44#l−#3)コンストラクト(Open Biosystems)をスクリーニングした。陰性対照として、標的をもたない対照shRNA(shRNA−TRC−NT及びshRNAmir−NT)を加えた。これらのshRNAベクターはレンチウイルスを用いたものであり、かつ、内部リボソーム侵入部位(IRES)/GFP及び/又はshRNA挿入断片の3’末端に位置するピューロマイシン耐性遺伝子を含む。shRNAmirコンストラクト中の要素であるIRESは、全てのピューロマイシン耐性細胞が、挿入されたshRNAを発現させることを保証し、また、shRNAの発現の指標として、GFPの発現を用いることを効果的に可能にする。ルシフェラーゼを導入し、ルシフェラーゼを発現しているU87MG−Luc及びU251−Luc細胞に、これらのshRNAコンストラクトを含むレンチウイルスを感染させた。ルシフェラーゼ活性により、これらの細胞の頭蓋内での成長が効率的に観察できるようになった(Lau et al., 2008)。ピューロマイシンを用いて感染した細胞を選抜した後、集めたピューロマイシン耐性GBM細胞集団における内生CD44の発現レベルを評価した。リアルタイムqPCR(データは示さない)、ウェスタンブロット解析(図2A)及び免疫細胞化学(図2B、D)によって評価したように、これら2種類の神経膠腫細胞株では、3つのshRNAmirコンストラクトのうちの2つ(shRNAmir−CD44#l及びshRNAmir−CD44#3)及び1−2TRC−shRNA(shRNA−TRC−CD44#3及び/又はshRNA−TRC−CD44#4)で、CD44の発現が効果的にノックダウンされた。その他のCD44−特異的shRNAにおいても、CD44の発現は多様な程度で減少したが、標的をもたない対照は、効果を示さなかった。CD44はHAの主要な細胞表面受容体であるので、CD44を発現していない細胞の、フルオレセイン標識HA(FL−HA)への結合能を評価した。CD44の発現を効果的にノックダウンすると、神経膠腫細胞のFL−HAへの結合能及びFL−HAの取り込みが劇的に減少したが、標的をもたないshRNAはいずれの効果も示さなかった(図2C、及びデータは示さない)。
実施例3
CD44の発現を抑制すると、U87MG及びU251細胞の増殖阻害、及び生体内でのアポトーシス促進が生じ、これによりこれら細胞の皮下成長が阻害される
[00284]CD44の発現の低下が、どのように生体内での神経膠腫成長に影響を及ぼすのかを決定するために、まず、異なる程度のCD44の抑制を示す、遺伝子を導入し、集めたU87MG及びU251細胞集団を腫瘍の皮下(s.c.)成長実験に用いた。これらの細胞でのCD44発現の低下は、GBM細胞注入から5週間後の腫瘍容積の減少と相関している(図3A−B)。さらに、対照である標的をもたないshRNA、shRNA−TRC−NT及びshRNAmir−NT、又はCD44の発現を効果的にノックダウンする2つのCD44−特異的shRNA、すなわちshRNATRC−CD44#3及びshRNAmirCD44#lを感染させた神経膠腫細胞から得られた成長曲線は、CD44の抑制が有意に神経膠腫の皮下成長を阻害することを示した(図3C−D)。CD44のノックダウンによる成長阻害効果の根底をなす機序の解析を始めるために、導入したU87MG及びU251細胞のその位置での増殖及び生存を解析した。CD44の発現をノックダウンするshRNAは、神経膠腫細胞の増殖を阻害し(図3E−e−h)、生体内でのアポトーシスを促進したが(図3Ε−i−1)、対照である標的をもたないshRNAはそのような効果を示さなかった。
CD44の発現を抑制すると、U87MG及びU251細胞の増殖阻害、及び生体内でのアポトーシス促進が生じ、これによりこれら細胞の皮下成長が阻害される
[00284]CD44の発現の低下が、どのように生体内での神経膠腫成長に影響を及ぼすのかを決定するために、まず、異なる程度のCD44の抑制を示す、遺伝子を導入し、集めたU87MG及びU251細胞集団を腫瘍の皮下(s.c.)成長実験に用いた。これらの細胞でのCD44発現の低下は、GBM細胞注入から5週間後の腫瘍容積の減少と相関している(図3A−B)。さらに、対照である標的をもたないshRNA、shRNA−TRC−NT及びshRNAmir−NT、又はCD44の発現を効果的にノックダウンする2つのCD44−特異的shRNA、すなわちshRNATRC−CD44#3及びshRNAmirCD44#lを感染させた神経膠腫細胞から得られた成長曲線は、CD44の抑制が有意に神経膠腫の皮下成長を阻害することを示した(図3C−D)。CD44のノックダウンによる成長阻害効果の根底をなす機序の解析を始めるために、導入したU87MG及びU251細胞のその位置での増殖及び生存を解析した。CD44の発現をノックダウンするshRNAは、神経膠腫細胞の増殖を阻害し(図3E−e−h)、生体内でのアポトーシスを促進したが(図3Ε−i−1)、対照である標的をもたないshRNAはそのような効果を示さなかった。
実施例4
CD44の発現をノックダウンすると、U87MG及びU251神経膠腫の頭蓋内での成長が阻害される
[00285]神経膠腫の頭蓋内成長に及ぼすCD44ノックダウンの効果を決定するために、高レベルのルシフェラーゼを発現し、かつ、十分にCD44が抑制されている、二重の薬剤耐性神経膠腫細胞集団のプールを、免疫不全Rag−1マウスの頭蓋内に注入した。注入から3、6、9、及び13日後に、IVIS−200画像処理装置(Xenogen)を用いて、頭蓋内腫瘍の生物発光画像を取得した(図4A及びデータは示さない)。材料と方法に記載したように、試験期間の間、その生存についてマウスをしっかりと観察した。CD44の発現を抑制すると腫瘍の頭蓋内成長は有意に阻害され、標的をもたないshRNAを導入したU87MG/U251−Luc細胞を注入したマウスと比較して、実験動物の生存期間は長くなった(図4B)。
CD44の発現をノックダウンすると、U87MG及びU251神経膠腫の頭蓋内での成長が阻害される
[00285]神経膠腫の頭蓋内成長に及ぼすCD44ノックダウンの効果を決定するために、高レベルのルシフェラーゼを発現し、かつ、十分にCD44が抑制されている、二重の薬剤耐性神経膠腫細胞集団のプールを、免疫不全Rag−1マウスの頭蓋内に注入した。注入から3、6、9、及び13日後に、IVIS−200画像処理装置(Xenogen)を用いて、頭蓋内腫瘍の生物発光画像を取得した(図4A及びデータは示さない)。材料と方法に記載したように、試験期間の間、その生存についてマウスをしっかりと観察した。CD44の発現を抑制すると腫瘍の頭蓋内成長は有意に阻害され、標的をもたないshRNAを導入したU87MG/U251−Luc細胞を注入したマウスと比較して、実験動物の生存期間は長くなった(図4B)。
[00286]CD44の発現の低下が神経膠腫の頭蓋内成長に及ぼす効果を検討するために、U87MG−luc及びU251−Luc細胞を用い、CD44に対する2つの有効なshRNAを含む(shRMAmir#1及び#3、図2及びデータは示さない)TRIPZレンチウイルスTet−OnshRNAmirコンストラクト(Open Biosystems)により、誘導可能なCD44ノックダウンの系を構築した。これらのTRIPZコンストラクトは、ドキシサイクリン(Dox)存在下でshRNAを発現し、U87MG及びU251細胞中のCD44の発現を効果的にノックダウンするが、対照である標的をもたないTRIPZ shRNAはCD44の発現にはいずれの効果も示さない(データは示さない)。神経膠腫細胞を頭蓋内注入前に3日間、免疫不全Rag−1マウスに、通常の又はドキシサイクリンを染みこませた(625ppm;Harlan-Teklad)固形飼料を与えた。実験期間を通じて実験マウスには、継続して、通常の又はドキシサイクリンを染みこませた固形飼料を与えた。CD44の誘導性ノックダウンは、神経膠腫の頭蓋内成長を阻害し、かつ、マウスの生存期間を延長させ(データは示さない)、これらの結果は最初の観察を支持するものである。
実施例5
CD44の発現を低下させると、神経膠腫細胞の生体内での細胞毒性薬に対する感受性が高まる
[00287]GBMに対する第一の細胞毒性薬は、テモゾロミド(TMZ)及びカルムスチン(BCNU)である。CD44が転移性乳癌細胞に必須の生存シグナルを提供するというこれまでの観察に基づき(Yu et al., 1997)、CD44の発現を低下させると、生存シグナルの伝達が阻害される可能性、並びに神経膠腫細胞のBCNU及びTMZ処理への生体内での感受性が高められる可能性について検討した。内生CD44が低下した、又はそうではないU87MG−Luc及びU251−Luc細胞を、マウスの頭蓋内に注入し、その後連続して、単回用量のBCNU(10mg/kg、静脈内)又はTMZ(5mg/kg、腹腔内)を処理した。BCNU及びTMZは単剤として用いた場合、神経膠腫の成長に対して、弱い及び中程度の阻害効果を示す(図4C−D)。しかしながら、CD44のノックダウンとBCNU又はTMZの併用が神経膠腫の頭蓋内形成の阻害に対して相乗効果をもたらし、マウスの生存期間の中間値の著明な増大によって決定されるように、CD44を抑制すると神経膠腫細胞のBCNU及びTMZへの反応の感受性が上がる(図4D)。
CD44の発現を低下させると、神経膠腫細胞の生体内での細胞毒性薬に対する感受性が高まる
[00287]GBMに対する第一の細胞毒性薬は、テモゾロミド(TMZ)及びカルムスチン(BCNU)である。CD44が転移性乳癌細胞に必須の生存シグナルを提供するというこれまでの観察に基づき(Yu et al., 1997)、CD44の発現を低下させると、生存シグナルの伝達が阻害される可能性、並びに神経膠腫細胞のBCNU及びTMZ処理への生体内での感受性が高められる可能性について検討した。内生CD44が低下した、又はそうではないU87MG−Luc及びU251−Luc細胞を、マウスの頭蓋内に注入し、その後連続して、単回用量のBCNU(10mg/kg、静脈内)又はTMZ(5mg/kg、腹腔内)を処理した。BCNU及びTMZは単剤として用いた場合、神経膠腫の成長に対して、弱い及び中程度の阻害効果を示す(図4C−D)。しかしながら、CD44のノックダウンとBCNU又はTMZの併用が神経膠腫の頭蓋内形成の阻害に対して相乗効果をもたらし、マウスの生存期間の中間値の著明な増大によって決定されるように、CD44を抑制すると神経膠腫細胞のBCNU及びTMZへの反応の感受性が上がる(図4D)。
実施例6
CD44は、哺乳類のヒッポシグナル伝達経路に同等な経路の活性化を弱め、ヒトGBM細胞でのストレス制御及びアポトーシス反応で重要な役割を果たした
[00288]放射線治療はGBM患者に別の選択肢を提供する。放射線治療及びいくつかの細胞毒性薬は、それらの抗神経膠腫効果を生じる、主要な細胞死誘導物質である活性酸素種(ROS)を生成する。神経膠腫細胞に対するCD44ノックダウンの化学感作効果の根底をなす分子機構を解析するために、H2O2で誘導した酸化ストレス及びTMZで誘導した細胞毒性ストレスへのGBM細胞の反応に、CD44発現の低下がどのように影響するかを観察した。対照である標的をもたないshRNAmir−NT及びTRC−NT、又はCD44に対する2つの最も有効なshRNAの混合物(shRNAmirCD44#l及びTRC−CD44#3、図2)を含むウイルス混合物をU87MG細胞に導入し、これらの実験に用いた。ヒトGBM細胞で内生CD44の発現を低下させると、細胞の酸化及び細胞毒性ストレスへの反応が高まり、維持され、そしてこれら細胞の生存能力が低下した(図5及びデータは示さない)。
CD44は、哺乳類のヒッポシグナル伝達経路に同等な経路の活性化を弱め、ヒトGBM細胞でのストレス制御及びアポトーシス反応で重要な役割を果たした
[00288]放射線治療はGBM患者に別の選択肢を提供する。放射線治療及びいくつかの細胞毒性薬は、それらの抗神経膠腫効果を生じる、主要な細胞死誘導物質である活性酸素種(ROS)を生成する。神経膠腫細胞に対するCD44ノックダウンの化学感作効果の根底をなす分子機構を解析するために、H2O2で誘導した酸化ストレス及びTMZで誘導した細胞毒性ストレスへのGBM細胞の反応に、CD44発現の低下がどのように影響するかを観察した。対照である標的をもたないshRNAmir−NT及びTRC−NT、又はCD44に対する2つの最も有効なshRNAの混合物(shRNAmirCD44#l及びTRC−CD44#3、図2)を含むウイルス混合物をU87MG細胞に導入し、これらの実験に用いた。ヒトGBM細胞で内生CD44の発現を低下させると、細胞の酸化及び細胞毒性ストレスへの反応が高まり、維持され、そしてこれら細胞の生存能力が低下した(図5及びデータは示さない)。
[00289]MSTl/2は、酸化ストレス誘導性アポトーシスの仲介において重要な役割を果たしており(Lehtinen et al., 2006)、また、我々はMST1/2がヒトGBM細胞ではマーリンの下流で機能することを示してきた(Lau et al., 2008)。高レベルの内生CD44を発現しているGBM細胞と比較すると、内生CD44が抑制された細胞では酸化ストレスに反応して、MST1/2及びLats1/2の強固かつ持続したリン酸化/活性化、YAPのリン酸化/不活性化、及びcIAP1/2の発現の低下が生じる(図5A−B)。これらの効果は、マーリンのリン酸化/不活性化、切断型カスパーゼ−3レベルの上昇、及び細胞の生存能力の低下と関連している(図5B及び3E、及びデータは示さない)。一方、より高レベルの内生CD44はマーリンのリン酸化/不活性化を促進し、哺乳類でのヒッポシグナル伝達経路に同等な経路のストレス誘導性の活性化を阻害し、そしてcIAP1/2をアップレギュレートし、これらにより、カスパーゼ−3の開裂阻害及びアポトーシスを引き起こす(図5A、3E、データは示さない)。これらの結果は、CD44が哺乳類のヒッポシグナル伝達経路(マーリン−MST1/2−Lats1/2−YAP−cIAP1/2)の上流に位置することを示し、そしてCD44が、ストレス及びストレス誘導性アポトーシスに対する腫瘍細胞の応答を弱めることに機能していることを示唆している。
[00290]MST1/2キナーゼが複数の下流エフェクターをもつこと、及び複数のシグナル伝達経路に関与していることから、MST1/2の既知のエフェクターもまた、ここで新しく確立したCD44−MST1/2シグナル伝達軸の下流で機能しているのがどうかについて解析した。これらの結果は、示すCD44をノックダウンすると、酸化ストレスに曝露させた神経膠腫細胞でのJNK及びp38ストレスキナーゼの活性化が上昇し、維持されることを示している(図5D)。加えて酸化ストレスはCD44欠損神経膠腫細胞において、JNK/p38の下流エフェクターとして既知のp53、及びその標的遺伝子であるp21及びプーマの持続した上向き調節を誘導したが(図5D)、高レベルの内生CD44を含むGBM細胞はJNK/p38の活性化を弱め、そしてp53、p21、及びプーマの誘導を阻害した(図5C)。
[00291]カスパーゼ−3の開裂は、細胞のアポトーシスの指標となる。H2O2処理を用いた生体外でのデータはカスパーゼ−3の開裂を示しており(図5B)、このことは、ヒトGBM細胞での内生CD44の発現の低下と酸化ストレスの併用により、GBMの腫瘍サイズが減少する可能性を示唆している。
[00292]生体にH2O2を投与してはいないが、化学療法及び放射線治療はH2O2を生じる作用をもつ。図4(C−D)は、ヒトGBM細胞での内生CD44の発現の低下と化学療法薬の併用により、腫瘍サイズが減少し、生存期間が延長したことを示している。そのため、両方の型の治療がH2O2の生産を生じる可能性があることから、ヒトGBM細胞の内生CD44の発現の低下と放射線治療の併用が、GBMの腫瘍サイズの減少及び生存期間の延長をもたらすと予測される。
[00293]CD44の抑制が、神経膠腫細胞の生体内での生物毒性薬に対する感受性をどのように高めるのかを解析するために(図4C〜D)、図5で記載した実験と同様の実験を行った。この実験では、高い又は低いCD44を発現している神経膠腫細胞の細胞毒性ストレスを誘導するために、H2O2ではなくTMZを用いた。それらの酸化ストレスに対する反応と同様に、ごく低レベルのCD44を発現している神経膠腫細胞では、TMZに曝露すると、MST1/2の強固かつ持続したリン酸化/活性化、並びに、cIAPレベルの低下、JNKではなくp38の活性化、及びp53及びその標的遺伝子であるp21の亢進と関係するYAPのリン酸化/不活性化が起こる(図6)。これらの結果は、哺乳類のヒッポシグナル伝達経路の活性化を弱めることによって腫瘍細胞のストレス/アポトーシス反応を阻害におけるCD44の新規役割を確立し、そして、宿主防御及び治療介入を含む多様な原因による腫瘍細胞のストレス耐性において、どのようにCD44の亢進が重要な役割を果たしているかの最初の分子的解釈を提供するものである。
実施例7
CD44は、神経膠腫細胞中のErbB及びc−Met受容体チロシンキナーゼ(RTK)介在性成長−シグナル伝達経路を調節した
[00294]生体内での結果は、CD44のノックダウンがGBM細胞の生体内での増殖を阻害することを示す(図3E)。RTKシグナル伝達経路が神経膠腫の進行に強く関与するというこれまでの試験から、CD44が、CD44を抑制した神経膠腫細胞の生体内での増殖の低下に関与する可能性のあるErbB及びc−MetRTKシグナル伝達経路の共刺激因子であることがわかってきた(Orian-Rousseau et al., 2002; Toole, 2004; van der Voort et al., 1999)。CD44のノックダウンが、EGFファミリーリガンド誘導性及びHGF誘導性の下流のシグナル伝達経路の活性化を弱めるかどうかを決定するために、高レベル又は低レベルのCD44を発現している血清飢餓U87MG細胞を、EGFファミリーリガンド、ヘパリン−結合EGF(HB−EGF)、ベータセルリン(BTC)、アンフィレグリン(AR)及びエピレグリン(Epr)、HGF、NGF、を含む異なるRTKリガンド、及び10%のウシ胎仔血清(FBS)で処理した。CD44発現の低下により、EGFファミリーリガンド−及びHGF−誘導性のErk1/2キナーゼのリン酸化は低減したが、AKTキナーゼのリン酸化は低減しなかった。また、NGF−及びFBS−誘導性のErk1/2のリン酸化は低減しなかった(図7)。これらは、CD44は増殖を優先的に調節するが、これら成長因子によって活性化された生存シグナル伝達経路を調節するものではなく、CD44がヒッポ経路を介して生存シグナル伝達経路を制御することを示唆している。
CD44は、神経膠腫細胞中のErbB及びc−Met受容体チロシンキナーゼ(RTK)介在性成長−シグナル伝達経路を調節した
[00294]生体内での結果は、CD44のノックダウンがGBM細胞の生体内での増殖を阻害することを示す(図3E)。RTKシグナル伝達経路が神経膠腫の進行に強く関与するというこれまでの試験から、CD44が、CD44を抑制した神経膠腫細胞の生体内での増殖の低下に関与する可能性のあるErbB及びc−MetRTKシグナル伝達経路の共刺激因子であることがわかってきた(Orian-Rousseau et al., 2002; Toole, 2004; van der Voort et al., 1999)。CD44のノックダウンが、EGFファミリーリガンド誘導性及びHGF誘導性の下流のシグナル伝達経路の活性化を弱めるかどうかを決定するために、高レベル又は低レベルのCD44を発現している血清飢餓U87MG細胞を、EGFファミリーリガンド、ヘパリン−結合EGF(HB−EGF)、ベータセルリン(BTC)、アンフィレグリン(AR)及びエピレグリン(Epr)、HGF、NGF、を含む異なるRTKリガンド、及び10%のウシ胎仔血清(FBS)で処理した。CD44発現の低下により、EGFファミリーリガンド−及びHGF−誘導性のErk1/2キナーゼのリン酸化は低減したが、AKTキナーゼのリン酸化は低減しなかった。また、NGF−及びFBS−誘導性のErk1/2のリン酸化は低減しなかった(図7)。これらは、CD44は増殖を優先的に調節するが、これら成長因子によって活性化された生存シグナル伝達経路を調節するものではなく、CD44がヒッポ経路を介して生存シグナル伝達経路を制御することを示唆している。
実施例8
U87MGマーリン及びWM793マーリン細胞の転写産物プロファイリングは、CD44によって負に調節されるCD44の下流エフェクターであるマーリンが、複数の重要なシグナル伝達経路における重要な制御因子の調節因子であることを示唆している
[00295]CD44及びマーリンは、その他の各機能を負に制御する(Bai et al., 2007 及び Xu et al., 2010)。U87MG細胞は、マーリンの成長阻害効果に対して劇的な反応を示し(Lau et al., 2008)、このことは、マーリンの発現が負に調節され、かつ、CD44の発現が正に調節されていても、マーリンの下流のシグナル伝達経路がこれらの細胞において完全であることを示唆している。この細胞モデルは、差次的に発現する遺伝子、及びマーリンの再発現に反応して変化したシグナル伝達経路を同定するための非常に良い機会を提供する。これら差次的に発現する遺伝子は、ヒト神経膠腫中でマーリンの機能が欠損又は抑制され、そしてCD44が正に調節された場合に、過活性又は低下すると考えられるマーリン及びCD44の必須の下流エフェクターのいずれかを表す可能性がある。これらシグナル伝達経路の再制御は、神経膠腫原性及び/又はこの疾患の進行の停止を引き起こす可能性がある。
U87MGマーリン及びWM793マーリン細胞の転写産物プロファイリングは、CD44によって負に調節されるCD44の下流エフェクターであるマーリンが、複数の重要なシグナル伝達経路における重要な制御因子の調節因子であることを示唆している
[00295]CD44及びマーリンは、その他の各機能を負に制御する(Bai et al., 2007 及び Xu et al., 2010)。U87MG細胞は、マーリンの成長阻害効果に対して劇的な反応を示し(Lau et al., 2008)、このことは、マーリンの発現が負に調節され、かつ、CD44の発現が正に調節されていても、マーリンの下流のシグナル伝達経路がこれらの細胞において完全であることを示唆している。この細胞モデルは、差次的に発現する遺伝子、及びマーリンの再発現に反応して変化したシグナル伝達経路を同定するための非常に良い機会を提供する。これら差次的に発現する遺伝子は、ヒト神経膠腫中でマーリンの機能が欠損又は抑制され、そしてCD44が正に調節された場合に、過活性又は低下すると考えられるマーリン及びCD44の必須の下流エフェクターのいずれかを表す可能性がある。これらシグナル伝達経路の再制御は、神経膠腫原性及び/又はこの疾患の進行の停止を引き起こす可能性がある。
[00296]マーリンの強力な抗神経膠腫効果を調節する下流エフェクターを同定するために、高レベルのマーリンを発現している、それぞれ独立して遺伝子を導入した3種類のU87MGマーリン及びU87MGWT細胞の集団それぞれの遺伝子発現プロファイルを、ヒトU133v2ジーンチップ(Affymetrix)を用いて比較した。マイクロアレイの結果は、U87MGマーリンでのマーリンの発現はU87MGWT細胞での発現よりも〜3倍高いことを示した。U87MGWTと比較して、U87MGマーリン細胞で発現が上昇した362の遺伝子と、発現が低下した364の遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、接着、移動、アクチン−細胞骨格構成、細胞周期、生存、及びシグナル伝達に関与する遺伝子として分類が可能である。これらの遺伝子を、機能的に関連する遺伝子群として分類するために、David Functional Annotation Bioinformatics Microarray解析ソフトウェア(http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp、NIAID/NIH)にデータを移した。これらの転写産物を機能経路に基づいて分類した後我々は、マーリンの再発現が、ヒッポシグナル伝達経路を活性化する転写産物の発現、及びWntシグナル伝達経路を阻害する分子のを上昇させ、並びに、Wnt及びHGF/c−Met及びプレイオトロフィン(PTN)/未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)シグナル伝達経路を活性化する転写産物の発現を低下させることを見いだした(図8)。
[00297]マーリンによって誘導される、異なる腫瘍型間で共通した発現プロファイルの変化を見いだすために、ヒト黒色腫の成長に及ぼすマーリンの効果について解析した。マーリンの発現がヒト黒色腫細胞株では負に調節され、野生型マーリンの発現の上昇がWM793ヒト黒色腫細胞の生体内での皮下成長を有意に阻害することが明らかになった(データは示さない)。WM793WT及びWM793マーリン細胞の発現産物プロファイルをさらに評価した結果、マーリンの発現が、その多くが抗腫瘍特性を示す697の遺伝子の発現を上昇させ、その多くが腫瘍促進活性を示す736の遺伝子を負に調節することが示された(データは示さない)。これら有意に正及び負に調節された遺伝子を、機能的な関連に基づいて分類し、マーリン発現の上昇が有意に影響を及ぼしたシグナル伝達経路を生成するために、David Functional Annotation Bioinformatics Microarray解析ソフトウェアにデータを移した。これらの出力データを次に、U87MG神経膠腫細胞由来のデータと比較し、マーリンにより誘導された共通の変化を同定した。これらのデータにより、マーリンの発現の上昇がヒッポを活性化し、そしてWnt及びc−Metシグナル伝達経路を阻害することが示された(図8)。
実施例9
マーリンはWntシグナル伝達を阻害する
[00298]次に、これらのマーリンに誘導される発現の変化を機能レベルで解析した。標準的なWntシグナル伝達が、T−細胞因子/リンパ球エンハンサー因子(TCFLEF)転写因子のコアクチベーターである、ベータ−カテニンの発現レベルを調節することによって遺伝子の発現を制御していることから、ベータ−カテニン反応性ルシフェラーゼレポーターコンストラクトであるTopFlash(Addgene)を用いてレポーター検定を行った。変異型TCF/LEF結合部位を含むFopFlashを陰性対照として用いた。ベータ−カテニンの転写活性が、野生型マーリン及びマーリンS518Aによって阻害されるが、マーリンS518Dによっては阻害されないことが見いだされた(図9)(Lau et al., 2008)。
マーリンはWntシグナル伝達を阻害する
[00298]次に、これらのマーリンに誘導される発現の変化を機能レベルで解析した。標準的なWntシグナル伝達が、T−細胞因子/リンパ球エンハンサー因子(TCFLEF)転写因子のコアクチベーターである、ベータ−カテニンの発現レベルを調節することによって遺伝子の発現を制御していることから、ベータ−カテニン反応性ルシフェラーゼレポーターコンストラクトであるTopFlash(Addgene)を用いてレポーター検定を行った。変異型TCF/LEF結合部位を含むFopFlashを陰性対照として用いた。ベータ−カテニンの転写活性が、野生型マーリン及びマーリンS518Aによって阻害されるが、マーリンS518Dによっては阻害されないことが見いだされた(図9)(Lau et al., 2008)。
実施例10
CD44及びマーリン介在性シグナル伝達イベント、並びにそれらのクロストークの可能性
[00299]CD44及びマーリン介在性シグナル伝達イベント及びそれらのクロストークの可能性の実用モデル(ショウジョウバエのヒッポシグナル伝達経路の構成要素を下線で表す):マーリンは哺乳類のヒッポ(マーリン−MST1/2−LATS1/2−YAP)及びJNK/p38シグナル伝達経路の上流において機能し、かつ、ストレス、ストレス誘導性アポトーシス、及び増殖/生存シグナルに対する細胞反応の制御において必須の機能をもつ。マーリンはCD44の機能に拮抗し、そしてRTK活性、並びに、RTKによる成長及び生存シグナルを阻害する。CD44は哺乳類のヒッポシグナル伝達経路の上流で機能し、そしてRTKの活性を亢進する。
CD44及びマーリン介在性シグナル伝達イベント、並びにそれらのクロストークの可能性
[00299]CD44及びマーリン介在性シグナル伝達イベント及びそれらのクロストークの可能性の実用モデル(ショウジョウバエのヒッポシグナル伝達経路の構成要素を下線で表す):マーリンは哺乳類のヒッポ(マーリン−MST1/2−LATS1/2−YAP)及びJNK/p38シグナル伝達経路の上流において機能し、かつ、ストレス、ストレス誘導性アポトーシス、及び増殖/生存シグナルに対する細胞反応の制御において必須の機能をもつ。マーリンはCD44の機能に拮抗し、そしてRTK活性、並びに、RTKによる成長及び生存シグナルを阻害する。CD44は哺乳類のヒッポシグナル伝達経路の上流で機能し、そしてRTKの活性を亢進する。
実施例11
CD44の拮抗薬であるhsCD44−Fc融合タンパク質は、マウスモデルでのヒトGBMに対する有効な治療薬として役立つ
[00300]前臨床マウスモデルでの神経膠腫の進行を阻害するために、CD44の拮抗薬が使用可能かどうかを決定するために、CD44v3−v10、CD44v8−v10、CD44s、CD44v3−v10R41A、CD44v8−v10R41A、又はCD44sR41Aの細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域(Fc)(Holash et al., 2002; Kim et al., 2002; Sy et al., 1992)で構成される、複数の融合タンパク質を開発した(図11)。これら融合タンパク質の抗体様特性は、生体外での生産及び精製の相対的な簡便性に加えて、それらに生体内での有利な薬物動態学的及び生体内分布プロファイルを与えるものである。リガンドを捕捉すること、及び/又は内生受容体の機能を干渉することにより、受容体−Fc融合タンパク質は機能していると考えられる。
CD44の拮抗薬であるhsCD44−Fc融合タンパク質は、マウスモデルでのヒトGBMに対する有効な治療薬として役立つ
[00300]前臨床マウスモデルでの神経膠腫の進行を阻害するために、CD44の拮抗薬が使用可能かどうかを決定するために、CD44v3−v10、CD44v8−v10、CD44s、CD44v3−v10R41A、CD44v8−v10R41A、又はCD44sR41Aの細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域(Fc)(Holash et al., 2002; Kim et al., 2002; Sy et al., 1992)で構成される、複数の融合タンパク質を開発した(図11)。これら融合タンパク質の抗体様特性は、生体外での生産及び精製の相対的な簡便性に加えて、それらに生体内での有利な薬物動態学的及び生体内分布プロファイルを与えるものである。リガンドを捕捉すること、及び/又は内生受容体の機能を干渉することにより、受容体−Fc融合タンパク質は機能していると考えられる。
[00301]R41をAに変異させると、CD44のHAに結合する能力が消失する。しかしながら、変異型CD44のその他全てのリガンド及びCD44シェダーゼに結合する能力は保存されるようであり、このことは、CD44が腫瘍促進活性を示すためにHA以外のリガンド及びCD44シェダーゼが非常に重要であると考えられることから、重要である。HA結合の消失が特定の癌に対するCD44R41A−Fc活性のいくらかを低減する可能性があることから、この修飾が生体内分布及び生物学的利用率を改善する可能性がある。
[00302]CD44のv3エクソンは、ヘパラン硫酸(HS)側鎖への共有結合に必要なSer−Gly−Ser−Glyモチーフを含む(Bennett et al., 1995)。hsCD44v3−v10−Fcタンパク質はHSにより修飾されるかどうかを評価するために、精製したhsCD44s−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、及びhsCD44v3−v10−Fc融合タンパク質をへパリナーゼI/IIIで処理して又は処理せずに、プロテインAカラムから溶出した。次にこれらのタンパク質を3枚のエライサプレートに塗布した。BSAでブロッキングした後、塗布したタンパク質の抗HS抗体との反応性を試験した。呈色検定により評価した反応の強度を、プレート上に塗布した融合タンパク質の相対量を表す抗CD44抗体との反応性を用いて正規化した。これらの結果は、hsCD44v3−v10−FcのみがHSによって修飾され、抗HS抗体により染色されたことを示した。観察された反応性は、へパリナーゼI又はIIIへの処理にたいして感受性であった(図11C)。
[00303]U87MG及びU251細胞に、これらのCD44−Fc及びCD44R41A−Fc融合タンパク質をコードしている発現コンストラクト又は空の発現ベクターを含むレトロウイルスを導入した。集めたピューロマイシン耐性細胞は、高レベルのhsCD44v3−v10−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、hsCD44s−Fc、hsCD44v3−v10R41A−Fc、hsCD44v8−v10R41A−Fc、hsCD44sR41A−Fc融合タンパク質を発現した(図11A、図12A)。可溶性CD44−Fc融合タンパク質が、FL−HAの内生GBM細胞表面CD44への結合を変化させることができるかどうかについて評価した。CD44−Fc融合タンパク質の発現がFL−HAのGBM細胞への結合を低減させることを見いだした(図11B)。次にこれらの細胞のRag−1マウスでの皮下及び頭蓋内成長を、空のベクターを感染させた細胞の成長と比較した。hsCD44v3−v10−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、及びhsCD44s−Fcの発現はU87MG及びU251細胞の皮下及び頭蓋内成長を著明に阻害し、そして頭蓋内腫瘍をもつマウスの生存期間を有意に延長させた。hsCD44v3−v10−Fc融合タンパク質が最も著明な阻害効果を示した(図12B及びC)。
[00304]CD44は、HA、オステオポンチン、ヘパリン結合成長因子、フィブロネクチン、セリグリシン、ラミニン、MMP−9、及びフィブリンを含む複数のリガンドをもち(Bennett et al., 1995; Ponta et al., 2003; Stamenkovic, 2000; Stamenkovic and Yu, 2009; Toole, 2004)、そして複数のRTK及びその他の細胞表面受容体と共同する(Orian-Rousseau et al., 2002; Stamenkovic, 2000; Stamenkovic and Yu, 2009)。CD44の機能の多くは、HAとの相互作用により仲介されており(Toole, 2004)、この機能はR41A単一突然変異により消失する(Peach et al., 1993)。CD44−HA相互作用のみがCD44のGBM促進活性の原因かどうかを決定するために、hsCD44sR41A−Fc又はhsCD44v3−v10R41A−Fcを発現しているU87MG及びU251細胞の集団を準備し、それらの抗GBM効果を、それらの野生型対応物への効果と比較した。野生型CD44−Fc融合タンパク質とは異なり、CD44R41A−Fcタンパク質はFL−HAのGBM細胞への結合を阻害することはできない(図11B及びデータは示さない)。しかしながら、hsCD44sR41A−Fcが弱い抗GBM効果を示す一方で、hsCD44v3−v10R41A−Fcは十分なレベルの抗GBM活性を保持し(図12C−c及びデータは示さない)、このことは、hsCD44v3−v10−Fc融合タンパク質が試験した3種類のCD44−Fc融合タンパク質の内で最も強力な抗GBM効果を有するという知見と一致し、HAの捕捉に追加した作用機序を示唆している。さらにこれらの結果は、CD44、特にCD44変異体がHA依存性及びHA非依存性両方の系で腫瘍の進行を促進することを示唆している。
[00305]最後に、5×105個のU87MG又はU251細胞をRag−1マウス注入することより、予め準備しておいた頭蓋内神経膠腫での、精製したhsCD44s−Fc融合タンパク質の抗GBM効力を評価した。頭蓋内腫瘍を5日間生育させ、その後、5mg/kgのヒトIgG又は精製したhsCD44s−Fc融合タンパク質を含む0.9%NaClを、3日毎に静脈内に注入することにより、実験終了までマウスを治療した。hsCD44s−Fc融合タンパク質を全身に送達すると、U87MG及びU251細胞の頭蓋内成長が著明に阻害され、実験マウスの生存期間の中央値が有意に(p<0.001)延長されたが、ヒトIgGの全身送達ではそのような結果は起こらなかった(図13A−B)。マウスを安楽死させる時点でGBM及び脳組織を回収して切片を作成し、そしてhsCD44−Fc融合タンパク質の生体内分布を評価するために抗ヒトIgG抗体で染色した。結果から、hsCD44−Fc融合タンパク質は腫瘍血管を容易に貫通して顕著な神経膠腫内分布パターンを示し、その大部分が完全な血液脳関門の存在によると考えられる、隣接した正常な脳組織にある融合タンパク質はごくわずかであることがわかった(図13C)。これらの結果は、CD44−Fcタンパク質が、出血している血管を含む腫瘍組織で優先的に蓄積されることを示している。さらにこの結果は、hsCD44−Fc融合タンパク質がGBMに対する有効な治療薬である可能性を示している。加えて、融合タンパク質の全身性送達による毒性の可能性を評価するために、正常な宿主組織をH&E染色した。全体的及び組織学的な検査を注意深く行ったが、明らかな毒性及び正常な組織の壊死は観察されなかった(図13D)。
実施例12
CD44をノックダウンすると、癌細胞のerbB及びc−MetRTK阻害薬への反応の感受性が高まる
[00306]図7に示すように、CD44はErbB及びc−MetRTK由来成長シグナルの増強に重要な役割を果たしている。CD44のノックダウンがGBM細胞のerbB及びc−MetRTKの薬理学的阻害剤に対する反応の感受性を高めるかどうかを決定するために、神経膠腫細胞の生死判別試験を、さまざまな濃度のerbB及びc−MetRTK阻害剤の存在下で、CD44をノックダウンして又はノックダウンせずに行った。結果から、CD44の発現をノックダウンしたshRNAにより、二重阻害剤であるEGFR/erbB−2(BIBW2992)、EGFR/erbB2/4のpan阻害剤(CI−1033)及びc−Met阻害剤(SU11274;LC Laboratories、Selleck Chemicals Co.)へのU87MG細胞の反応の感受性が高まることが示された(図14)。このことは、CD44及びerbB又はc−Metを共に標的とすることにより、これらの分子が重要な役割を果たしている癌への相乗的な阻害効果が達成できるという証拠をもたらすものである。
CD44をノックダウンすると、癌細胞のerbB及びc−MetRTK阻害薬への反応の感受性が高まる
[00306]図7に示すように、CD44はErbB及びc−MetRTK由来成長シグナルの増強に重要な役割を果たしている。CD44のノックダウンがGBM細胞のerbB及びc−MetRTKの薬理学的阻害剤に対する反応の感受性を高めるかどうかを決定するために、神経膠腫細胞の生死判別試験を、さまざまな濃度のerbB及びc−MetRTK阻害剤の存在下で、CD44をノックダウンして又はノックダウンせずに行った。結果から、CD44の発現をノックダウンしたshRNAにより、二重阻害剤であるEGFR/erbB−2(BIBW2992)、EGFR/erbB2/4のpan阻害剤(CI−1033)及びc−Met阻害剤(SU11274;LC Laboratories、Selleck Chemicals Co.)へのU87MG細胞の反応の感受性が高まることが示された(図14)。このことは、CD44及びerbB又はc−Metを共に標的とすることにより、これらの分子が重要な役割を果たしている癌への相乗的な阻害効果が達成できるという証拠をもたらすものである。
実施例13
hsCD44−Fc融合タンパク質は、GBM細胞の化学療法及び標的治療に対する反応の感受性を高める
[00307]CD44拮抗薬であるhsCD44s−Fc融合タンパク質が、化学療法薬及びerbB及びc−MetRTKの薬理学的阻害剤に対するGBM細胞の反応の感受性を高めるかどうかを決定するために、神経膠腫細胞の生死判別試験を様々な濃度のTMZ、すなわちerbB及びc−MetRTKの阻害剤、の存在下又は非存在下で、精製したhsCD44s−Fc融合タンパク質又はヒトIgGを加えて又は加えずに行った。結果から、hsCD44s−Fc融合タンパク質が二重阻害剤であるEGFR/erbB−2(BIBW2992)、EGFR/erbB2/4のpan阻害剤(CI−1033)、及びc−Met阻害剤のTMZ(PF−2341066、Selleck Chemicals Co.)へのU87MG細胞の反応の感受性が高まったが、ヒトIgGではそのような効果が見られなかったことが示された(図15)。
hsCD44−Fc融合タンパク質は、GBM細胞の化学療法及び標的治療に対する反応の感受性を高める
[00307]CD44拮抗薬であるhsCD44s−Fc融合タンパク質が、化学療法薬及びerbB及びc−MetRTKの薬理学的阻害剤に対するGBM細胞の反応の感受性を高めるかどうかを決定するために、神経膠腫細胞の生死判別試験を様々な濃度のTMZ、すなわちerbB及びc−MetRTKの阻害剤、の存在下又は非存在下で、精製したhsCD44s−Fc融合タンパク質又はヒトIgGを加えて又は加えずに行った。結果から、hsCD44s−Fc融合タンパク質が二重阻害剤であるEGFR/erbB−2(BIBW2992)、EGFR/erbB2/4のpan阻害剤(CI−1033)、及びc−Met阻害剤のTMZ(PF−2341066、Selleck Chemicals Co.)へのU87MG細胞の反応の感受性が高まったが、ヒトIgGではそのような効果が見られなかったことが示された(図15)。
実施例14
hsCD44s−Fc融合タンパク質は、正常細胞パネルに対する弱い細胞毒性を示す
[00308]良い癌の治療標的を定義するために用いられる2つの重要な特徴は、腫瘍細胞中での標的の発現が高く、正常な細胞ではその発現が低いかないこと、及び腫瘍細胞の標的機能への高い依存性である。CD44はこれらの基準を満たしている。正常な細胞に対してCD44−Fc融合タンパク質が毒性を有する可能性を評価するために、正常細胞パネルを用い、様々な量の精製したhsCD44s−Fc融合タンパク質の存在下又は非存在下で細胞の生死判別試験を行った。この結果は、CD44−Fc融合タンパク質は、正常なヒト星状細胞(NHA)、シュワン細胞、繊維芽細胞(HGF−1)及び内皮細胞(HUVEC)に対しては、U251GBM細胞に対してよりも低い毒性を有することが示された(図16)。
hsCD44s−Fc融合タンパク質は、正常細胞パネルに対する弱い細胞毒性を示す
[00308]良い癌の治療標的を定義するために用いられる2つの重要な特徴は、腫瘍細胞中での標的の発現が高く、正常な細胞ではその発現が低いかないこと、及び腫瘍細胞の標的機能への高い依存性である。CD44はこれらの基準を満たしている。正常な細胞に対してCD44−Fc融合タンパク質が毒性を有する可能性を評価するために、正常細胞パネルを用い、様々な量の精製したhsCD44s−Fc融合タンパク質の存在下又は非存在下で細胞の生死判別試験を行った。この結果は、CD44−Fc融合タンパク質は、正常なヒト星状細胞(NHA)、シュワン細胞、繊維芽細胞(HGF−1)及び内皮細胞(HUVEC)に対しては、U251GBM細胞に対してよりも低い毒性を有することが示された(図16)。
実施例15
CD44はGBMCSCの自己再生及び生体内での成長に必要である
[00309]幹細胞は自己再生する特徴を示す。神経膠腫CSC細胞塊の自己再生能にCD44が寄与しているかどうかを決定するために、新しいGBM組織(CHTN)由来の初代ヒト腫瘍様塊(HGS)を調整した。新しいGBM組織由来のヒトGBMCSC細胞塊、MSSM−GBMCSC−1及び−2は自己再生能を有し、幹細胞マーカー(Sox−2及びネスチン)を発現し、及び、目的の遺伝子を発現させるために又は発現をノックダウンするためにレトロウイルス及びレンチウイルスを用いて容易に形質転換することが可能である(図17A〜C)。これらGBMCSC中のCD44の発現するshRNAは細胞塊の形成を阻害し(図18)、このことは、CD44が神経膠腫幹細胞の維持に重要であること、及びその標的化は癌幹細胞の除去及び悪性癌再発の停止を助けることを示している。加えて、MSSM−GBMCSC−1及び−2が容易にRag−1マウスに侵襲性頭蓋内腫瘍を形成すること(図17D及びデータは示さない)、及びhsCD44s−Fc融合タンパク質の過剰発現がMSSM−GBMCSC−1細胞の頭蓋内成長を阻害することが見いだされた(図17D−b)。
CD44はGBMCSCの自己再生及び生体内での成長に必要である
[00309]幹細胞は自己再生する特徴を示す。神経膠腫CSC細胞塊の自己再生能にCD44が寄与しているかどうかを決定するために、新しいGBM組織(CHTN)由来の初代ヒト腫瘍様塊(HGS)を調整した。新しいGBM組織由来のヒトGBMCSC細胞塊、MSSM−GBMCSC−1及び−2は自己再生能を有し、幹細胞マーカー(Sox−2及びネスチン)を発現し、及び、目的の遺伝子を発現させるために又は発現をノックダウンするためにレトロウイルス及びレンチウイルスを用いて容易に形質転換することが可能である(図17A〜C)。これらGBMCSC中のCD44の発現するshRNAは細胞塊の形成を阻害し(図18)、このことは、CD44が神経膠腫幹細胞の維持に重要であること、及びその標的化は癌幹細胞の除去及び悪性癌再発の停止を助けることを示している。加えて、MSSM−GBMCSC−1及び−2が容易にRag−1マウスに侵襲性頭蓋内腫瘍を形成すること(図17D及びデータは示さない)、及びhsCD44s−Fc融合タンパク質の過剰発現がMSSM−GBMCSC−1細胞の頭蓋内成長を阻害することが見いだされた(図17D−b)。
実施例16
CD44は様々なヒト癌型において正に調節されている
[00310]結腸癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮細胞癌腫、腎細胞癌、黒色腫、胃癌、及び食道癌でのCD44の発現レベルを決定するために、www.oncomine.orgで使用可能な遺伝子発現データセットを検索した。我々は、CD44の転写産物がヒト結腸(図19A、19C)(Graudens et al., 2006; Notterman et al., 2001)、卵巣(図32A)(Hendrix et al., 2006)、頭頸部扁平上皮細胞癌腫(図38A、図39)(Ginos et al., 2004)、腎細胞癌(図37、図38B)(Gumz et al, 2007)、黒色腫(図35A〜B)、胃癌(図42)、及び食道癌(図43)において、それらの正常な対応物と比較して亢進されていることを見いだした。データはoncomine(www.oncomine.org)より取得した。
CD44は様々なヒト癌型において正に調節されている
[00310]結腸癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮細胞癌腫、腎細胞癌、黒色腫、胃癌、及び食道癌でのCD44の発現レベルを決定するために、www.oncomine.orgで使用可能な遺伝子発現データセットを検索した。我々は、CD44の転写産物がヒト結腸(図19A、19C)(Graudens et al., 2006; Notterman et al., 2001)、卵巣(図32A)(Hendrix et al., 2006)、頭頸部扁平上皮細胞癌腫(図38A、図39)(Ginos et al., 2004)、腎細胞癌(図37、図38B)(Gumz et al, 2007)、黒色腫(図35A〜B)、胃癌(図42)、及び食道癌(図43)において、それらの正常な対応物と比較して亢進されていることを見いだした。データはoncomine(www.oncomine.org)より取得した。
[00311]加えて、初代ヒト腫瘍のパラフィン切片の免疫組織化学的解析により、CD44が悪性/転移性結腸癌(図19B)、前立腺癌(図22)、悪性乳癌(図25)、及び転移性卵巣癌(図32B〜C)において、それらの正常な対応組織又は初代腫瘍と比較して亢進されていることを示した。
実施例17
CD44の発現をノックダウンすると、様々なヒト癌細胞の生体内での成長が阻害された
[00312]HCT116及びKM20L2ヒト結腸癌細胞、PC3/Mヒト前立腺癌細胞、MX−2及びSW613ヒト乳癌細胞、NCI−H125及びNCI−H460ヒト肺癌細胞、及びOVCAR−3ヒト卵巣癌細胞での内生CD44発現をノックダウンするために、一連のヒトCD44−特異的TRC−shRNA(shRNA−TRC−CD44#1〜#5)及びshRNAmir(shRNAmir−CD44#1〜#3)コンストラクト(Open Biosystems)をスクリーニングした。スクリーニングでの陰性対照として、標的をもたない対照shRNA(shRNA−TRC−NT及びshRNAmir−NT)を加えた。これらのshRNAコンストラクトを含むレンチウイルスを癌細胞に感染させた。感染した細胞を、ピューロマイシンを用いて選抜した後、集めたピューロマイシン耐性癌細胞中の内生CD44の発現レベルを評価した。ウェスタンブロット解析によって評価したように、少なくとも2つのshRNAが、これらの癌細胞でのCD44の発現を効果的にノックダウンした(図20A、21A、23A、26A、27A、30〜31A、及び33A)。その他のCD44に特異的なshRNAは様々な程度でCD44の発現を低下させたが、標的をもたない対照は効果を示さなかった。それぞれの度合いでCD44の抑制を示している、これら遺伝子を導入した癌細胞の集団を、CD44の発現の低下がどのようにそれらの生体内での皮下成長に影響を及ぼしているかを決定するための、腫瘍の皮下(s.c.)成長実験に用いた。この結果から、これらの細胞を注入して6週間後の腫瘍容積の低下と、これら細胞でのCD44の発現の低下には相関があることが示された(図20〜21B、23B、26〜27B、30〜31B、及び33B)。このことは、CD44がこれらの型の癌細胞の生体内での成長に必要であり、そのため、CD44がこれらの癌型の治療介入の最初の標的であることを示している。
CD44の発現をノックダウンすると、様々なヒト癌細胞の生体内での成長が阻害された
[00312]HCT116及びKM20L2ヒト結腸癌細胞、PC3/Mヒト前立腺癌細胞、MX−2及びSW613ヒト乳癌細胞、NCI−H125及びNCI−H460ヒト肺癌細胞、及びOVCAR−3ヒト卵巣癌細胞での内生CD44発現をノックダウンするために、一連のヒトCD44−特異的TRC−shRNA(shRNA−TRC−CD44#1〜#5)及びshRNAmir(shRNAmir−CD44#1〜#3)コンストラクト(Open Biosystems)をスクリーニングした。スクリーニングでの陰性対照として、標的をもたない対照shRNA(shRNA−TRC−NT及びshRNAmir−NT)を加えた。これらのshRNAコンストラクトを含むレンチウイルスを癌細胞に感染させた。感染した細胞を、ピューロマイシンを用いて選抜した後、集めたピューロマイシン耐性癌細胞中の内生CD44の発現レベルを評価した。ウェスタンブロット解析によって評価したように、少なくとも2つのshRNAが、これらの癌細胞でのCD44の発現を効果的にノックダウンした(図20A、21A、23A、26A、27A、30〜31A、及び33A)。その他のCD44に特異的なshRNAは様々な程度でCD44の発現を低下させたが、標的をもたない対照は効果を示さなかった。それぞれの度合いでCD44の抑制を示している、これら遺伝子を導入した癌細胞の集団を、CD44の発現の低下がどのようにそれらの生体内での皮下成長に影響を及ぼしているかを決定するための、腫瘍の皮下(s.c.)成長実験に用いた。この結果から、これらの細胞を注入して6週間後の腫瘍容積の低下と、これら細胞でのCD44の発現の低下には相関があることが示された(図20〜21B、23B、26〜27B、30〜31B、及び33B)。このことは、CD44がこれらの型の癌細胞の生体内での成長に必要であり、そのため、CD44がこれらの癌型の治療介入の最初の標的であることを示している。
実施例18
精製したCD44−Fc融合タンパク質はヒト前立腺癌の生体内での成長を阻害する
[00313]3種類のヒト前立腺癌細胞株におけるCD44の発現を評価した。最も攻撃的な前立腺細胞株であるPC3/M細胞が最も高レベルのCD44を発現していることが明らかになった(図24A)。PC3/M細胞の生体内での成長に及ぼす精製したhsCD44−Fc融合タンパク質の効果を評価するために、5×106個のPC3/M細胞を各Rag−1マウスの皮下に注入した。腫瘍容積が〜150mm3に達するまで、腫瘍を〜2週間生育させた。腫瘍サイズによりマウスを6群に分け(6匹/群)、そして10mg/mlのhsCD44s−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、hsCD44v6−v10−Fc、hsCD44v3−v10−Fc、又はヒトIgG、又は0.9%NaClを、5μlの注入量で4回腫瘍内注入することにより処理した(図24B)。対照群(ヒトIgG又は0.9%NaClでの治療群)の腫瘍の最も長い径が1cmに達したところで実験を停止した。腫瘍を全て摘出し、重量を測定した。腫瘍重量の平均+/−SDとしてデータを表す。この結果から、CD44−Fc融合タンパク質がPC3/M細胞の生体内での成長を有意に阻害したが、0.9%NaClは阻害しなかったことが示された(図24B)。
精製したCD44−Fc融合タンパク質はヒト前立腺癌の生体内での成長を阻害する
[00313]3種類のヒト前立腺癌細胞株におけるCD44の発現を評価した。最も攻撃的な前立腺細胞株であるPC3/M細胞が最も高レベルのCD44を発現していることが明らかになった(図24A)。PC3/M細胞の生体内での成長に及ぼす精製したhsCD44−Fc融合タンパク質の効果を評価するために、5×106個のPC3/M細胞を各Rag−1マウスの皮下に注入した。腫瘍容積が〜150mm3に達するまで、腫瘍を〜2週間生育させた。腫瘍サイズによりマウスを6群に分け(6匹/群)、そして10mg/mlのhsCD44s−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、hsCD44v6−v10−Fc、hsCD44v3−v10−Fc、又はヒトIgG、又は0.9%NaClを、5μlの注入量で4回腫瘍内注入することにより処理した(図24B)。対照群(ヒトIgG又は0.9%NaClでの治療群)の腫瘍の最も長い径が1cmに達したところで実験を停止した。腫瘍を全て摘出し、重量を測定した。腫瘍重量の平均+/−SDとしてデータを表す。この結果から、CD44−Fc融合タンパク質がPC3/M細胞の生体内での成長を有意に阻害したが、0.9%NaClは阻害しなかったことが示された(図24B)。
実施例19
ヒトの悪性乳癌細胞が浸潤した宿主の間質は高レベルのCD44を発現し、侵襲性乳癌の間質は高レベルのHAを蓄積する
[00314]乳癌の進行及び乳癌幹細胞(BCSC)の維持におけるCD44の機能を決定するために、ヒト悪性乳癌組織(ペンシルバニア大学のCHTNから得た)中のCD44タンパク質及びHAレベルを測定した。正常な***組織と比較すると(図25A)、宿主の間質に浸潤した乳癌細胞でCD44は高度に正に調節されている(図25B〜C)。加えて、HAは、正常な***間質(図25D)と比較して、悪性乳癌間質において蓄積される(図25E)。ビオチン化CD44−Fc融合タンパク質を用いてパラフィン切片中のHAを検出した。
ヒトの悪性乳癌細胞が浸潤した宿主の間質は高レベルのCD44を発現し、侵襲性乳癌の間質は高レベルのHAを蓄積する
[00314]乳癌の進行及び乳癌幹細胞(BCSC)の維持におけるCD44の機能を決定するために、ヒト悪性乳癌組織(ペンシルバニア大学のCHTNから得た)中のCD44タンパク質及びHAレベルを測定した。正常な***組織と比較すると(図25A)、宿主の間質に浸潤した乳癌細胞でCD44は高度に正に調節されている(図25B〜C)。加えて、HAは、正常な***間質(図25D)と比較して、悪性乳癌間質において蓄積される(図25E)。ビオチン化CD44−Fc融合タンパク質を用いてパラフィン切片中のHAを検出した。
実施例20
ヒトBCSC及び生体内での乳癌モデルの確立;BCSCの自己再生及び維持、並びにBCSCの生体内での成長にCD44が必要であることを示している
[00315]研究から、腫瘍原性のBCSCには腫瘍様塊が多く含まれていることが示されてきた(Al-Hajj et al., 2003; Reya et al., 2001)。新しい悪性ヒト乳癌組織由来の、3種類の異なる初代腫瘍様塊の調整物(MSSM−BCSC−1、−2、及び−3)を確立した。これらのMSSM−BCSCは、癌幹細胞マーカーであるCD44を高レベルで、CD24を低レベルで発現している(図28)。これらはまた、幹細胞マーカーであるSox−2、Oct3/4、Nanog、及び/又はSSEA−1も発現しており(図28B及びデータは示さない)、かつ、腫瘍様塊形成検定では自己再生能を(図28C−a〜c)、そして免疫不全Rag−1マウスに移植した場合には腫瘍原性を示す(図28E)。図28Aに示したようにMSSM−BCSCでは、CD44の複数のイソ型、並びに標準形態のCD44(CD44s、下側のバンド)が発現している。我々は、目的の遺伝子を発現させるため又はその発現をノックダウンするために、レトロウイルス及びレンチウイルスを用いてBCSCに遺伝子を導入するプロトコールを確立した。ルシフェラーゼを含むレトロウイルスをこれらのMSSM−BCSCに導入した。G418により選抜した後の細胞は、それらの生体内での成長を追跡することを可能にするルシフェラーゼを高レベルで発現している薬剤耐性のMSSM−BCSC−Luc細胞集団である(図28E)。さらに、CD44の発現を標的としたshRNAは腫瘍様塊の形成を阻害したが、標的をもたないshRNAは腫瘍様塊の形成にはいずれの効果も示さなかったことが見いだされた(図28C−d〜f、D)。この結果は、BCSCの自己再生及び維持にCD44が重要であること、並びにその標的及び機能不全が乳癌幹細胞の除去及び悪性疾患の再発防止に関わる可能性を示すものである。
ヒトBCSC及び生体内での乳癌モデルの確立;BCSCの自己再生及び維持、並びにBCSCの生体内での成長にCD44が必要であることを示している
[00315]研究から、腫瘍原性のBCSCには腫瘍様塊が多く含まれていることが示されてきた(Al-Hajj et al., 2003; Reya et al., 2001)。新しい悪性ヒト乳癌組織由来の、3種類の異なる初代腫瘍様塊の調整物(MSSM−BCSC−1、−2、及び−3)を確立した。これらのMSSM−BCSCは、癌幹細胞マーカーであるCD44を高レベルで、CD24を低レベルで発現している(図28)。これらはまた、幹細胞マーカーであるSox−2、Oct3/4、Nanog、及び/又はSSEA−1も発現しており(図28B及びデータは示さない)、かつ、腫瘍様塊形成検定では自己再生能を(図28C−a〜c)、そして免疫不全Rag−1マウスに移植した場合には腫瘍原性を示す(図28E)。図28Aに示したようにMSSM−BCSCでは、CD44の複数のイソ型、並びに標準形態のCD44(CD44s、下側のバンド)が発現している。我々は、目的の遺伝子を発現させるため又はその発現をノックダウンするために、レトロウイルス及びレンチウイルスを用いてBCSCに遺伝子を導入するプロトコールを確立した。ルシフェラーゼを含むレトロウイルスをこれらのMSSM−BCSCに導入した。G418により選抜した後の細胞は、それらの生体内での成長を追跡することを可能にするルシフェラーゼを高レベルで発現している薬剤耐性のMSSM−BCSC−Luc細胞集団である(図28E)。さらに、CD44の発現を標的としたshRNAは腫瘍様塊の形成を阻害したが、標的をもたないshRNAは腫瘍様塊の形成にはいずれの効果も示さなかったことが見いだされた(図28C−d〜f、D)。この結果は、BCSCの自己再生及び維持にCD44が重要であること、並びにその標的及び機能不全が乳癌幹細胞の除去及び悪性疾患の再発防止に関わる可能性を示すものである。
実施例21
精製したCD44−Fc融合タンパク質は、BCSCの生体内での成長を阻害する
[00316]BCSCの生体内での成長に及ぼす精製したhsCD44−Fc融合タンパク質の効果を評価するために、1×106個のMSSM−BCSC−1細胞を各Rag−1マウスの皮下に注入した。腫瘍容積が〜200mm3に達するまで、腫瘍を約3週間生育させた。腫瘍サイズによりマウスを6群に分け(6匹/群)、そして10mg/mlのhsCD44s−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、hsCD44v6−v10−Fc、hsCD44v3−v10−Fc、若しくはヒトIgG、又は0.9%NaClを注入量5μlで4回、腫瘍内に注入することにより治療した(図29)。対照群(ヒトIgG又は0.9%NaClでの治療群)の腫瘍の最も長い径が1cmに達したところで実験を停止した。腫瘍を全て摘出し、重量を測定した。この結果から、CD44−Fc融合タンパク質がBCSCの生体内での成長を有意に阻害したが、0.9%NaClは阻害しなかったことが示された(図29)。
精製したCD44−Fc融合タンパク質は、BCSCの生体内での成長を阻害する
[00316]BCSCの生体内での成長に及ぼす精製したhsCD44−Fc融合タンパク質の効果を評価するために、1×106個のMSSM−BCSC−1細胞を各Rag−1マウスの皮下に注入した。腫瘍容積が〜200mm3に達するまで、腫瘍を約3週間生育させた。腫瘍サイズによりマウスを6群に分け(6匹/群)、そして10mg/mlのhsCD44s−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、hsCD44v6−v10−Fc、hsCD44v3−v10−Fc、若しくはヒトIgG、又は0.9%NaClを注入量5μlで4回、腫瘍内に注入することにより治療した(図29)。対照群(ヒトIgG又は0.9%NaClでの治療群)の腫瘍の最も長い径が1cmに達したところで実験を停止した。腫瘍を全て摘出し、重量を測定した。この結果から、CD44−Fc融合タンパク質がBCSCの生体内での成長を有意に阻害したが、0.9%NaClは阻害しなかったことが示された(図29)。
実施例22
CD44は、ヒト卵巣癌の間質では正に調節されている
[00317]ヒト卵巣癌の進行にCD44が寄与しているかどうかを評価するために、www.oncomine.orgで使用可能な遺伝子発現データセットを検索した。その結果、正常な卵巣と比較して、ヒト卵巣癌ではCD44の転写産物が亢進していることが見いだされた(図32A)。免疫組織化学的解析により、CD44及びそのリガンドであるHAが、正常な卵巣と比較して、第III期及び第IV期のヒト卵巣癌において亢進されていることがわかった(図32B〜D及びデータは示さない)。
CD44は、ヒト卵巣癌の間質では正に調節されている
[00317]ヒト卵巣癌の進行にCD44が寄与しているかどうかを評価するために、www.oncomine.orgで使用可能な遺伝子発現データセットを検索した。その結果、正常な卵巣と比較して、ヒト卵巣癌ではCD44の転写産物が亢進していることが見いだされた(図32A)。免疫組織化学的解析により、CD44及びそのリガンドであるHAが、正常な卵巣と比較して、第III期及び第IV期のヒト卵巣癌において亢進されていることがわかった(図32B〜D及びデータは示さない)。
実施例23
CD44は、卵巣癌幹細胞(OCSC)の自己再生及び維持に重要である
[00318]腹水卵巣癌モデルを確立するために、Rag−1免疫不全マウスにSKOV3及びOVCAR−3親細胞を腹腔内(ip)移植し、一連の生体内選抜を行った。これらの選抜から得られたSKOV3ip及びOVCAR−3ip細胞は、Rag−1マウスの皮下並びに腹水に腫瘍を形成する(図34A及びデータは示さない)。さらに、新しい転移性卵巣癌組織由来のCD44+OCSC細胞塊(MSSM−OCSC−1及び−2)を生成した。これらのMSSM−CSC細胞は、癌幹細胞マーカーであるCD44を高レベルで、及び幹細胞マーカーであるSox−2、Oct3/4、及びNanogをも発現している(図34B)。さらに、腫瘍様塊形成検定においては自己再生能を(図34E−a〜c)、そしてRag−1マウスに移植した場合には腫瘍原性を示す(図34C及びデータは示さない)。我々は、目的の遺伝子を発現させるため又はその発現をノックダウンするために、レトロウイルス及びレンチウイルスを用いてOCSCに効率的に遺伝子を導入するプロトコールを確立した。CD44の発現をノックダウンするshRNAは細胞塊の形成を阻害したが、標的をもたないshRNAは細胞塊の形成にはいずれの効果も示さなかったことが見いだされ(図34E−d−f、34F)、このことは、CD44がOCSC自己再生及び維持に重要であり、その標的が卵巣癌幹細胞の除去及び疾患の再発防止に関わる可能性を示している。
CD44は、卵巣癌幹細胞(OCSC)の自己再生及び維持に重要である
[00318]腹水卵巣癌モデルを確立するために、Rag−1免疫不全マウスにSKOV3及びOVCAR−3親細胞を腹腔内(ip)移植し、一連の生体内選抜を行った。これらの選抜から得られたSKOV3ip及びOVCAR−3ip細胞は、Rag−1マウスの皮下並びに腹水に腫瘍を形成する(図34A及びデータは示さない)。さらに、新しい転移性卵巣癌組織由来のCD44+OCSC細胞塊(MSSM−OCSC−1及び−2)を生成した。これらのMSSM−CSC細胞は、癌幹細胞マーカーであるCD44を高レベルで、及び幹細胞マーカーであるSox−2、Oct3/4、及びNanogをも発現している(図34B)。さらに、腫瘍様塊形成検定においては自己再生能を(図34E−a〜c)、そしてRag−1マウスに移植した場合には腫瘍原性を示す(図34C及びデータは示さない)。我々は、目的の遺伝子を発現させるため又はその発現をノックダウンするために、レトロウイルス及びレンチウイルスを用いてOCSCに効率的に遺伝子を導入するプロトコールを確立した。CD44の発現をノックダウンするshRNAは細胞塊の形成を阻害したが、標的をもたないshRNAは細胞塊の形成にはいずれの効果も示さなかったことが見いだされ(図34E−d−f、34F)、このことは、CD44がOCSC自己再生及び維持に重要であり、その標的が卵巣癌幹細胞の除去及び疾患の再発防止に関わる可能性を示している。
実施例24
CD44はヒト黒色腫で正に調節されている:
[00319]ヒト黒色腫の進行にCD44が寄与しているかどうかを評価するために、www.oncomine.orgで使用可能な遺伝子発現データセットを検索した。その結果、正常な皮膚と比較して、ヒト黒色腫ではCD44転写産物が亢進していることが見いだされた(図35B)。ウェスタンブロット解析によってもまた、正常なメラニン細胞と比較して、ヒト悪性黒色腫細胞においてCD44が亢進されていることが示された(図35C)。
CD44はヒト黒色腫で正に調節されている:
[00319]ヒト黒色腫の進行にCD44が寄与しているかどうかを評価するために、www.oncomine.orgで使用可能な遺伝子発現データセットを検索した。その結果、正常な皮膚と比較して、ヒト黒色腫ではCD44転写産物が亢進していることが見いだされた(図35B)。ウェスタンブロット解析によってもまた、正常なメラニン細胞と比較して、ヒト悪性黒色腫細胞においてCD44が亢進されていることが示された(図35C)。
実施例25
hsCD44v3−v10−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、及びhsCD44s−Fcはヒト黒色腫細胞の生体内での皮下成長を阻害する
[00320]hsCD44−Fc融合タンパク質の発現が黒色腫の生体内での成長に及ぼす効果を評価するために、それぞれ異なるCD44−Fc融合タンパク質(hsCD44s−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、又はhsCD44v3−v10−Fc)を発現しているM14細胞、又は空の発現ベクターを導入したM14細胞2×106個を各Rag−1マウスの皮下に注入した。腫瘍を〜4週間生育させた。試験終了時に腫瘍を全て摘出し、重量を測定した。腫瘍重量の平均+/−SDとしてデータを表す。この結果から、CD44−Fc融合タンパク質、特にhsCD44v3−v10−Fcが、M14細胞黒色腫の生体内での成長を有意に阻害したことが示された(図36B)。
hsCD44v3−v10−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、及びhsCD44s−Fcはヒト黒色腫細胞の生体内での皮下成長を阻害する
[00320]hsCD44−Fc融合タンパク質の発現が黒色腫の生体内での成長に及ぼす効果を評価するために、それぞれ異なるCD44−Fc融合タンパク質(hsCD44s−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、又はhsCD44v3−v10−Fc)を発現しているM14細胞、又は空の発現ベクターを導入したM14細胞2×106個を各Rag−1マウスの皮下に注入した。腫瘍を〜4週間生育させた。試験終了時に腫瘍を全て摘出し、重量を測定した。腫瘍重量の平均+/−SDとしてデータを表す。この結果から、CD44−Fc融合タンパク質、特にhsCD44v3−v10−Fcが、M14細胞黒色腫の生体内での成長を有意に阻害したことが示された(図36B)。
実施例26
CD44はヒト頭頸部癌では正に調節されている
[00321]ヒト頭頸部癌の進行にCD44が寄与しているかどうかを評価するために、www.oncomine.orgで使用可能な遺伝子発現データセットを検索した。その結果、それらの正常な対応部分と比較して、ヒト頭頸部癌ではCD44の転写産物が亢進していることが見いだされた(図38A、図39)。さらに、抗CD44抗体(Santa Cruz)を用いてヒト頭頸部癌腫細胞でのCD44の発現をウェスタンブロットにより評価した。これらの癌細胞でのCD44の発現レベルは、それらの生体内での腫瘍原性と関連している(図40A)。
CD44はヒト頭頸部癌では正に調節されている
[00321]ヒト頭頸部癌の進行にCD44が寄与しているかどうかを評価するために、www.oncomine.orgで使用可能な遺伝子発現データセットを検索した。その結果、それらの正常な対応部分と比較して、ヒト頭頸部癌ではCD44の転写産物が亢進していることが見いだされた(図38A、図39)。さらに、抗CD44抗体(Santa Cruz)を用いてヒト頭頸部癌腫細胞でのCD44の発現をウェスタンブロットにより評価した。これらの癌細胞でのCD44の発現レベルは、それらの生体内での腫瘍原性と関連している(図40A)。
実施例27
hsCD44v3−v10−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、及びhsCD44s−Fcは、ヒト頭頸部癌細胞の生体内での皮下成長を阻害する
[00322]hsCD44−Fc融合タンパク質の発現が頭頸部癌細胞の生体内での成長に及ぼす効果を評価するために、それぞれ異なるCD44−Fc融合タンパク質(hsCD44s−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、又はhsCD44v3−v10−Fc)を発現しているSCC−4細胞、又は空の発現ベクターを導入したSCC−4細胞5x106個を、各Rag−1マウスの皮下に注入した。腫瘍を〜2ヶ月生育させた。試験終了時に腫瘍を全て摘出し、重量を測定した。腫瘍重量の平均+/−SDとしてデータを表す。この結果から、CD44−Fc融合タンパク質、特にhsCD44v3−v10−Fc及びhsCD44v8−v10−Fcが、SCC−4細胞の生体内での成長を有意に阻害したことが示された(図40C)。
hsCD44v3−v10−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、及びhsCD44s−Fcは、ヒト頭頸部癌細胞の生体内での皮下成長を阻害する
[00322]hsCD44−Fc融合タンパク質の発現が頭頸部癌細胞の生体内での成長に及ぼす効果を評価するために、それぞれ異なるCD44−Fc融合タンパク質(hsCD44s−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、又はhsCD44v3−v10−Fc)を発現しているSCC−4細胞、又は空の発現ベクターを導入したSCC−4細胞5x106個を、各Rag−1マウスの皮下に注入した。腫瘍を〜2ヶ月生育させた。試験終了時に腫瘍を全て摘出し、重量を測定した。腫瘍重量の平均+/−SDとしてデータを表す。この結果から、CD44−Fc融合タンパク質、特にhsCD44v3−v10−Fc及びhsCD44v8−v10−Fcが、SCC−4細胞の生体内での成長を有意に阻害したことが示された(図40C)。
実施例28
hsCD44v3−v10−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、及びhsCD44s−Fcは、ヒト膵臓及び肝臓癌細胞の生体内での皮下成長を阻害する
[00323]ヒト膵臓及び肝臓癌腫細胞でのCD44の発現を、抗CD44抗体(Santa Cruz)を用いたウェスタンブロットにより評価した。結果から、BXPC−3、PAN−08−13、PAN−08−27、PAN−10−05膵癌細胞及びSK−HEP−1肝臓癌細胞では、複数のCD44イソ型が発現していることがわかった(図41A)。
hsCD44v3−v10−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、及びhsCD44s−Fcは、ヒト膵臓及び肝臓癌細胞の生体内での皮下成長を阻害する
[00323]ヒト膵臓及び肝臓癌腫細胞でのCD44の発現を、抗CD44抗体(Santa Cruz)を用いたウェスタンブロットにより評価した。結果から、BXPC−3、PAN−08−13、PAN−08−27、PAN−10−05膵癌細胞及びSK−HEP−1肝臓癌細胞では、複数のCD44イソ型が発現していることがわかった(図41A)。
[00324]hsCD44−Fc融合タンパク質の発現が、膵臓及び肝臓癌細胞の生体内での成長に及ぼす効果を評価するために、それぞれ異なるCD44−Fc融合タンパク質(hsCD44s−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、又はhsCD44v3−v10−Fc)を発現しているBXPC−3及びSK−HEP−1細胞、又は空の発現ベクターを導入したBXPC−3及びSK−HEP−1細胞5×106個を、各Rag−1マウスの皮下に注入した。腫瘍を〜5週間生育させた。試験終了時に腫瘍を全て摘出し、重量を測定した。腫瘍重量の平均+/−SDとしてデータを表した。この結果から、CD44−Fc融合タンパク質がBXPC−3及びSK−HEP−1の生体内での成長を有意に阻害したことが示された(図41C〜D)。
実施例29
ビオチンで標識したCD44−Fc融合タンパク質を用いたHAの検出方法及びHAの検出による癌の診断方法
[00325]精製したCD44−Fc融合タンパク質(hsCD44s−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、及びhsCD44v3−vl0−Fc)を、EZ−Linkビオチン化キット(Thermo Scientific)を用い、製造業者の説明に従ってビオチンで標識した。ヒト腫瘍のパラフィン切片を脱パラフィンし、水和した。2%のBSAでブロッキングした後、切片をビオチン化CD44−Fc融合タンパク質(bCD44−Fc、1μg/ml)と共に、4度で一晩インキュベートした。VECTASTAINABCキットを用いてビオチン化CD44−Fc融合タンパク質を検出した。我々の結果は、正常な***又は卵巣の間質(図25D及びデータは示さない)と比較して、悪性乳癌及び転移性卵巣癌の間質では(図25E、図32D)、HAが亢進されていることを示した。bCD44−Fcの陽性染色はHAに特異的なものであり、この組織切片をヒアルロニダーゼで前処理すると切片は染色されない(データは示さない)。
ビオチンで標識したCD44−Fc融合タンパク質を用いたHAの検出方法及びHAの検出による癌の診断方法
[00325]精製したCD44−Fc融合タンパク質(hsCD44s−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、及びhsCD44v3−vl0−Fc)を、EZ−Linkビオチン化キット(Thermo Scientific)を用い、製造業者の説明に従ってビオチンで標識した。ヒト腫瘍のパラフィン切片を脱パラフィンし、水和した。2%のBSAでブロッキングした後、切片をビオチン化CD44−Fc融合タンパク質(bCD44−Fc、1μg/ml)と共に、4度で一晩インキュベートした。VECTASTAINABCキットを用いてビオチン化CD44−Fc融合タンパク質を検出した。我々の結果は、正常な***又は卵巣の間質(図25D及びデータは示さない)と比較して、悪性乳癌及び転移性卵巣癌の間質では(図25E、図32D)、HAが亢進されていることを示した。bCD44−Fcの陽性染色はHAに特異的なものであり、この組織切片をヒアルロニダーゼで前処理すると切片は染色されない(データは示さない)。
[00326]乳、卵巣、膀胱癌、及び前立腺癌を含む多くの癌において、HAが亢進されていることがよく知られている(Simpson and Lokeshwar, 2008; Tammi et al., 2008; Toole, 2004の総説、及びGolshani et al., 2008を参照のこと)。HAレベルは腫瘍の進行及び転移と関係している(Toole and Hascall, 2002)。HAの上昇は、胃腸管、乳及び卵巣癌の予後不良、疾患進行、並びに全生存及び疾患特異的生存の短縮と関係している(Anttila et al., 2000; Tammi et al., 2008)。尿中のHAを測定することが膀胱癌の診断の正確なマーカーとなることが示されている(Lokeshwar et al., 2000)。
[00327]HAの血漿レベルを検出するために、乳癌を有する各トランスジェニックマウス(MMTV−PyVT及びMMTV−ActErbb2、Jackson Lab)、MSSM−GBMCSC−1又は神経膠腫261細胞由来の神経膠腫を有する各Rag−1マウス、又は対照となる各正常マウスから、血液200μlを採取した。各型につき6匹のマウスから血液試料を採取し、ただちに血漿を調整した。各試料から調整した50μlの血漿をそれぞれ、CD44−Fc融合タンパク質予め塗布しておいたエライザプレートの3つのウェルに充填した。ビオチン化CD44−Fc融合タンパク質及びAP−結合型アビジンを用いて、HAに結合したCD44−Fcを検出した。発色を、エライサ測定器を用いて405nmで測定した。この結果から、正常なマウス由来の試料と比較して、腫瘍をもつマウス由来の血漿試料ではHAが亢進されていることが示され(図44)、このことは、ビオチン化CD44−Fc融合タンパク質が、癌患者の血漿、血清、及び尿中のHAレベルの検出に使用可能であり、また、診断的及び予後試薬として有効であることを示している。
実施例30
CD44の発現の低下は、細胞毒性薬に対する前立腺細胞の生体内で感受性を高める
[00328]前立腺癌に対する第一選択及び第二選択細胞毒性薬は、ドセタキセル、ミトキサントロン、サトラプラチン、及びイクサベピロンである。内生CD44が抑制されている又は抑制されていないPC3/M−Luc及び22Rvl−Luc細胞をマウスの皮下に注入し、そしてドセタキセル又はミトキサントロンを用いて継続的に治療する。
CD44の発現の低下は、細胞毒性薬に対する前立腺細胞の生体内で感受性を高める
[00328]前立腺癌に対する第一選択及び第二選択細胞毒性薬は、ドセタキセル、ミトキサントロン、サトラプラチン、及びイクサベピロンである。内生CD44が抑制されている又は抑制されていないPC3/M−Luc及び22Rvl−Luc細胞をマウスの皮下に注入し、そしてドセタキセル又はミトキサントロンを用いて継続的に治療する。
実施例31
CD44の拮抗薬、すなわちhsCD44v3−v10−Fc、hsCD44v6−v10−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、及びhsCD44s−Fcは、マウスモデルでの様々な癌に対する有効な治療薬として役立つ
[00329]CD44の拮抗薬が、前臨床マウスモデルでの様々なヒト癌の進行を阻害するかどうかを決定するために、CD44v3−v10−Fc、CD44v6−v10−Fc、CD44v8−v10−Fc、CD44v6−v10−Fc、又はCD44sなどの可溶性CD44融合タンパク質を、それぞれ異なる癌マウスモデルを用いて試験する。
CD44の拮抗薬、すなわちhsCD44v3−v10−Fc、hsCD44v6−v10−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、及びhsCD44s−Fcは、マウスモデルでの様々な癌に対する有効な治療薬として役立つ
[00329]CD44の拮抗薬が、前臨床マウスモデルでの様々なヒト癌の進行を阻害するかどうかを決定するために、CD44v3−v10−Fc、CD44v6−v10−Fc、CD44v8−v10−Fc、CD44v6−v10−Fc、又はCD44sなどの可溶性CD44融合タンパク質を、それぞれ異なる癌マウスモデルを用いて試験する。
[00330]これらのCD44−Fc融合cDNAをレトロウイルスベクター(Clontech)中に挿入した。このレトロウイルスベクターは、全てのピューロマイシン耐性細胞が挿入した融合遺伝子を発現するように、cDNA断片とピューロマイシン耐性遺伝子の間に配置したIRES要素を含む。これらの融合タンパク質をコードしている発現コンストラクト又は空の発現ベクターを含むレトロウイルスを、ヒト癌細胞、MEWO及びA375ヒト黒色腫細胞;Lovoヒト結腸癌細胞;Panc−1、HPAC、MIAPaCa−2、及び/又はAsPC−1ヒト膵癌細胞;Hep3B2.1−7ヒト肝癌細胞;SCC、−9、−15、及び/又は−25、ヒト頭頸部扁平上皮細胞癌腫細胞;U266及びMC/CARヒト多発性骨髄腫細胞;SKOV3ip及びOVCAR−3ipヒト卵巣癌細胞;及び22Rvlヒト前立腺癌細胞;A549、LX529、NCI−H460、及び/又はNCI−H125ヒト肺癌細胞;MX−2及び/又はSW613ヒト乳癌細胞;SKN−MC及びA673ヒト肉腫;H−MESO−1、H−MESO−1A、又はMSTO−211Hヒト悪性中皮腫細胞;及び/又は様々な細胞由来のヒト癌幹細胞に導入する。ピューロマイシンを用いて感染した細胞を選抜した後の薬剤耐性癌細胞の集団は、hsCD44v3−v10−Fc、hsCD44v6−v10−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、及びhsCD44s−FcなどのCD44融合タンパク質を高レベルで発現すると考えられる。これらの細胞を用いて、それらのRag−1マウスでの成長、並びに化学療法及びその他の標的治療に対するそれらの反応を評価する。
[00331]さらに、CD44拮抗薬が化学療法及びその他の標的治療に対する様々な腫瘍細胞の反応の感受性を高めるかどうかを決定するために、CD44の抑制及び/又はhsCD44−Fc融合タンパク質を単独で、又は化学療法薬であるRTK阻害薬/IAP阻害薬/p53活性分子と併用して用い、生体外での腫瘍細胞の生存試験を行う。
考察
[00332]要約すると、本実施例及び図は、CD44がヒト膠芽腫、結腸癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮細胞癌腫、腎細胞癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、黒色腫、及び食道癌を含む複数のヒト癌型において亢進されていることを示すものである。ヒトCD44に対するshRNA及び/又は様々なCD44−Fc融合タンパク質を含むCD44の拮抗薬は、ヒト膠芽腫、結腸、乳、前立腺、肺、黒色腫、膵癌、肝臓癌、頭頸部癌腫、膵臓、及び卵巣のマウスモデル生体内での成長を阻害する。さらに、実施例は、CD44はヒトGBMで正に調節されており、CD44をノックダウンすると、神経膠腫細胞の増殖が阻害され、アポトーシス促進されるため、GBMの生体内での成長が阻害されることを示している。加えて実施例は、CD44又はCD44−Fc融合タンパク質の抑制が、化学療法及び標的治療薬に対するGBM細胞の生体内での感受性を高めることを始めて示し、このことは、CD44が神経膠腫、結腸、乳、前立腺、肺、黒色腫、膵癌、肝臓癌、頭頸部癌腫、及び卵巣癌に対する有効な治療標的である可能性を示している。hsCD44s−Fc、hsCD44v6−v10−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、又はhsCD44v3−v10−FCなどの、ヒト可溶性CD44−Fc融合タンパク質の形態でのCD44拮抗薬及びCD44−特異的shRNAが、ヒト膠芽腫、結腸、乳、前立腺、肺、黒色腫、膵癌、肝臓癌、頭頸部癌腫、及び卵巣癌のマウスモデルでの有効な治療薬であることが明らかになった。CD44のshRNAは、遺伝子治療に使用すること、及びナノ粒子として送達することもまた可能である。
[00332]要約すると、本実施例及び図は、CD44がヒト膠芽腫、結腸癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮細胞癌腫、腎細胞癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、黒色腫、及び食道癌を含む複数のヒト癌型において亢進されていることを示すものである。ヒトCD44に対するshRNA及び/又は様々なCD44−Fc融合タンパク質を含むCD44の拮抗薬は、ヒト膠芽腫、結腸、乳、前立腺、肺、黒色腫、膵癌、肝臓癌、頭頸部癌腫、膵臓、及び卵巣のマウスモデル生体内での成長を阻害する。さらに、実施例は、CD44はヒトGBMで正に調節されており、CD44をノックダウンすると、神経膠腫細胞の増殖が阻害され、アポトーシス促進されるため、GBMの生体内での成長が阻害されることを示している。加えて実施例は、CD44又はCD44−Fc融合タンパク質の抑制が、化学療法及び標的治療薬に対するGBM細胞の生体内での感受性を高めることを始めて示し、このことは、CD44が神経膠腫、結腸、乳、前立腺、肺、黒色腫、膵癌、肝臓癌、頭頸部癌腫、及び卵巣癌に対する有効な治療標的である可能性を示している。hsCD44s−Fc、hsCD44v6−v10−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、又はhsCD44v3−v10−FCなどの、ヒト可溶性CD44−Fc融合タンパク質の形態でのCD44拮抗薬及びCD44−特異的shRNAが、ヒト膠芽腫、結腸、乳、前立腺、肺、黒色腫、膵癌、肝臓癌、頭頸部癌腫、及び卵巣癌のマウスモデルでの有効な治療薬であることが明らかになった。CD44のshRNAは、遺伝子治療に使用すること、及びナノ粒子として送達することもまた可能である。
[00333]本実施例は、CD44が哺乳類のヒッポストレス及びアポトーシスシグナル伝達経路(マーリン−MST1/2−Lats1/2−YAP−cIAP1/2)の上流で、また他の2つの下流のストレスキナーゼであるJNK及び/又はp38の上流で、それらのエフェクターであるp53及びカスパーゼと共に機能していることを始めて示すものである(図5及び図6)。それらはまた、CD44が、化学療法薬及び活性酸素種(ROS)によって誘導されるストレス及びアポトーシスシグナル伝達経路の活性化の抑制に必須の役割を果たし、CD44の機能が欠損すると、それらシグナル伝達経路の持続した活性化が引き起こされ、そしてGBM細胞及びその他の癌細胞のアポトーシスが促進されることの証拠を提供するものである(図10の実用モデルを参照のこと)。
[00334]これらの実施例は、CD44を抑制すると、EGFRリガンド及びHGFによって誘導されるErk1/2の活性化が阻害されるが、NGF又はFBSによって誘導される活性化は阻害されないことを示しており(図7)、このことは、CD44がこれらRTKの共受容体として機能し、そしてそれらの悪性神経膠腫細胞及びその他の癌細胞などにおけるシグナル伝達活性を増強することを示唆している。CD44がRTKのシグナル伝達を制御している機序の解明にはさらなる研究が必要であるが、HA受容体としてのその機能により説明することができるであろう。CD44は、その多価リガンドであるHAとの結合に際して、細胞表面に大きな凝集体を形成する。これらの凝集体はしばしば、複数のシグナル伝達イベントが生じる脂質ラフト又はその他の特定の膜ドメイン中に含まれる。加えてCD44は、HB−EGF及び塩基性FGFを含む多数のヘパリン結合成長因子と結合する細胞表面プロテオグリカンとして発現する場合もある。RTK共受容体としてのCD44は、そのため、RTKの多量体化を促進することにより、及び/又は対応するRTKの適切なリガンドを提示することにより、シグナル伝達を高めることができる。CD44v3−v1−Fc融合タンパク質が、EGFファミリーリガンド、VEGF、bFGFなどの腫瘍血管新生因子、及びアンギオポエチンを含むヘパリン結合成長因子の生理活性を調節する能力から、これらのリガンド、それらに対応するRTK、及びそれらの下流のシグナル伝達経路を標的とする数多くの併用療法においてCD44拮抗薬が使用可能であることが示唆される。
[00335]CD44拮抗薬、すなわちhsCD44−Fc融合タンパク質、具体的にはhsCD44s−Fc、hsCD44v8−v10−Fc、又はhsCD44v3−v10−Fcコンストラクトはマウスモデルにおいて、GBM、乳癌、前立腺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、及び膵癌に対抗する強い活性を示し、そして乳及び卵巣癌幹細胞の自己再生を阻害した。これらの結果から、これら致命的な癌が将来根絶されることが期待される。ヒトsCD44−Fc融合タンパク質は、GBM細胞及びその他の癌細胞において発現しているCD44の機能を干渉するだけでなく、腫瘍が浸潤している宿主細胞で発現しているCD44の機能もまた干渉する可能性がある。これらの宿主細胞は、癌におけるその他の分子による効果と同様に、これら癌型の進行に必須の役割を果たしていると考えられる(Budhu et al., 2006; Orimo et al., 2005)。
[00336]ヒトGBMに対して現在使用可能な治療の第一選択肢は化学療法及び放射線治療であるが、両方ともその場しのぎの手段である(Chamberlain, 2006)。悪性黒色腫、肺癌、及び膵癌に対する有効な治療はほぼ皆無である。肝臓癌、頭頸部癌、後期結腸癌、後期/薬剤耐性乳及び前立腺癌に対する有効な治療もない。よりよい臨床転帰をもたらす1つの手段は、微小環境由来の生存シグナル及び薬剤耐性の仲介に必須の役割を果たす標的、並びにそれらの拮抗薬が、放射線、化学療法及び標的治療薬対するこれら腫瘍細胞の反応の感受性を高める可能性がある標的を同定することである。実施例は、CD44が、酸化及び細胞毒性ストレス誘導性アポトーシスシグナル伝達から、癌細胞を保護するのに重要な役割を果たし、RTKシグナル伝達を増強することを示している。これらは、CD44が、放射線、化学療法、及び標的治療に対する悪性神経膠腫及びその他の型の癌細胞の感受性を高めるための理想的な治療標的となる可能性を示唆している。
[00337]これらの実施例及び図は、CD44が、ヒト膠芽腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、膵癌、及び卵巣癌を含むがこれらに限定されるものではない様々なヒト癌型に対する第一の標的であること、並びに、CD44−Fc融合タンパク質及びshRNAを含むCD44拮抗薬を単剤として使用した場合及び、化学療法及び/又は放射線治療、及びerbB受容体、c−Met、IAP、及び活性型p53に対する標的治療と併用した場合に、強力な抗癌剤となることを示した。これらの実施例及び図はまた、CD44−Fc融合タンパク質が、化学療法及び/又は放射線治療などの細胞毒性薬に対する癌細胞の感受性を高めることを示している。そのため、これら融合タンパク質は特に、腫瘍細胞のストレスを誘導する及び/又は促進する、それらの薬剤と併用することが可能である。
[00338]
これらの実施例及び図はまた、を示している。これらCD44−Fc融合タンパク質がHAに特異的に結合するため、例えば癌組織の組織切片及び体液中(血液、血漿、血清、及び尿)のHAの検出に使用可能である。そのため、これら融合タンパク質を、HAレベルが上昇している癌の診断に使用することが可能であり、このことは現在使用可能な方法よりも初期において癌を検出すること、及び生命の救済をもたらす可能性がある。これらの融合タンパク質をまた、HAレベルの上昇を検出するために使用することが可能であり、このことは、予後及び治療効果の早期評価において重要であり、患者の全生存を改善させる、各個人により有効な治療計画をもたらすと考えられる。より正確に予測するために、HAレベルと並行して、これら腫瘍試料及び体液試料中のCD44のレベルを評価することができる。HA及びCD44レベルの測定は、標準的な免疫学的手法及び検出法により行うことができる。
これらの実施例及び図はまた、を示している。これらCD44−Fc融合タンパク質がHAに特異的に結合するため、例えば癌組織の組織切片及び体液中(血液、血漿、血清、及び尿)のHAの検出に使用可能である。そのため、これら融合タンパク質を、HAレベルが上昇している癌の診断に使用することが可能であり、このことは現在使用可能な方法よりも初期において癌を検出すること、及び生命の救済をもたらす可能性がある。これらの融合タンパク質をまた、HAレベルの上昇を検出するために使用することが可能であり、このことは、予後及び治療効果の早期評価において重要であり、患者の全生存を改善させる、各個人により有効な治療計画をもたらすと考えられる。より正確に予測するために、HAレベルと並行して、これら腫瘍試料及び体液試料中のCD44のレベルを評価することができる。HA及びCD44レベルの測定は、標準的な免疫学的手法及び検出法により行うことができる。
[00339]本発明の範囲は、本明細書において記載した特定の態様によって制限されるものではない。実際に、前述した詳細及び添付の図から、本明細書に記載した修正に加えて、様々な修正が当業者には明かであろう。そのような修正は添付の請求項の範囲内であると見なされる。
[00340]当然のことながら、全ての値はおおよその値であり、また説明のために示されるものである。
[00341]本出願を通して、特許、特許出願、出版物、製品の説明、及びプロトコールが引用される。それらの全体を参照することにより、その開示は本明細書に組み込まれるものとする。
[00341]本出願を通して、特許、特許出願、出版物、製品の説明、及びプロトコールが引用される。それらの全体を参照することにより、その開示は本明細書に組み込まれるものとする。
参考文献
Claims (73)
- 神経膠腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌、膵癌、及び黒色腫からなる群より選択される哺乳動物の癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする該哺乳動物に、該癌の治療に有効な量の、CD44の細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含むCD44融合タンパク質を投与する工程を含む、方法。
- 該CD44融合タンパク質を、該CD44融合タンパク質をコードしている発現ベクターを含むウイルスを介して投与する、請求項1に記載の方法。
- 該神経膠腫が星細胞腫である、請求項1に記載の方法。
- 該神経膠腫が多形性膠芽腫である、請求項1に記載の方法。
- 該哺乳動物がヒトである、請求項1に記載の方法。
- CD44の細胞外ドメインが、CD44s、CD44v3−v10、CD44v8−v10、CD44v4−v10、CD44v5−v10、CD44v6−v10、CD44v7−v10、CD44v9−v10、CD44v10、CD44v9、CD44v8、CD44v7、CD44v6、CD44v5、CD44v4、CD44v3、CD44sR41A、CD44v3−v10R41A、CD44v8−v10R41A、CD44v4−v10R41A、CD44v5−v10R41A、CD44v6−v10R41A、CD44v7−v10R41A、CD44v9−v10R41A、CD44v10R41A、CD44v9R41A、CD44v8R41A、CD44v7R41A、CD44v6R41A、CD44v5R41A、CD44v4R41A、及びCD44v3R41Aからなる群より選択されるドメインである、請求項1に記載の方法。
- CD44の細胞外ドメインがCD44v3−v10である、請求項6に記載の方法。
- CD44の細胞外ドメインがCD44v8−v10である、請求項6に記載の方法。
- CD44の細胞外ドメインがCD44v6−v10である、請求項6に記載の方法。
- a)CD44v3−v10、CD44v8−v10、CD44s、CD44v4−v10、CD44v5−v10、CD44v6−v10、CD44v7−v10、CD44v9−v10、CD44v10、CD44v9、CD44v8、CD44v7、CD44v6、CD44v5、CD44v4、CD44v3、CD44sR41A、CD44v3−v10R41A、CD44v8−v10R41A、CD44v4−v10R41A、CD44v5−v10R41A、CD44v6−v10R41A、CD44v7−v10R41A、CD44v9−v10R41A、CD44v10R41A、CD44v9R41A、CD44v8R41A、CD44v7R41A、CD44v6R41A、CD44v5R41A、CD44v4R41A、及びCD44v3R41Aからなる群より選択されるCD44の細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含むCD44融合タンパク質;及び
b)薬学上許容可能な担体又は希釈剤;
を含む医薬組成物。 - CD44の細胞外ドメインがCD44v3−v10である、請求項10に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44v8−v10である、請求項10に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44v6−v10である、請求項10に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44v3−v10R41Aである、請求項10に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44v8−v10R41Aである、請求項10に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44sR41Aである、請求項10に記載の医薬組成物。
- 神経膠腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌、膵癌、及び黒色腫からなる群より選択される哺乳動物の癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする該哺乳動物に、該癌の治療に有効な量の請求項10に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
- 該神経膠腫が星細胞腫である、請求項17に記載の方法。
- 該神経膠腫が多形性膠芽腫である、請求項17に記載の方法。
- 該哺乳動物がヒトである、請求項17に記載の方法。
- 哺乳動物の癌の治療方法であって、そのような治療を必要とする該哺乳動物に、該癌の治療に有効な量の、CD44の細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含むCD44融合タンパク質、及び1種類以上のさらなる抗癌治療を投与するか又は施す工程を含む治療方法。
- 該抗癌治療が、外科的治療、化学療法、放射線治療、標的治療、及び免疫治療からなる群より選択される治療である、請求項21に記載の方法。
- 該抗癌治療が化学療法である、請求項21に記載の方法。
- 該化学療法が、テモゾロミド、カルムスチン、ドセタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、エピルビシン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、サトラプラチン、イクサベピロン、パシタキセル、ゲムシタビン、カペシタビン、ドキソルビシン、エトポシド、メルファラン、ヘキサメチルアミン、イリノテカン、及びトポテカンからなる群より選択される化学療法である、請求項23に記載の方法。
- 該化学療法がテモゾロミド又はカルムスチンである、請求項24に記載の方法。
- 該抗癌治療が放射線治療である、請求項21に記載の方法。
- 該抗癌治療が外科的治療である、請求項21に記載の方法。
- 該抗癌治療が標的治療である、請求項21に記載の方法。
- 該標的治療が、トラスツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、BIBW2992、CI−1033、PF−2341066、PF−04217903、AMG208、JNJ−38877605、MGCD−265、SGX−523、GSK1363089、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、BIBF1120、パゾパニブ、ベバシズマブ、バタラニブ、アキシチニブ、E7080、ペリホシン、MK−2206、テムシロリムス、ラパマイシン、BEZ235、GDC−0941、PLX−4032、イマチニブ、AZD0530、ボルテゾミブ、XAV−939、アドベキシン(Ad5CMV−p53)、Genentech−化合物8/cIAP−XIAP阻害剤、及びAbbott Laboratories−化合物11からなる群より選択される標的治療である、請求項28に記載の方法。
- a)CD44v3−v10、CD44v8−v10、CD44s、CD44v4−v10、CD44v5−v10、CD44v6−v10、CD44v7−v10、CD44v9−v10、CD44v10、CD44v9、CD44v8、CD44v7、CD44v6、CD44v5、CD44v4、CD44v3、CD44sR41A、CD44v3−v10R41A、CD44v8−v10R41A、CD44v4−v10R41A、CD44v5−v10R41A、CD44v6−v10R41A、CD44v7−v10R41A、CD44v9−V10R41A、CD44v10R41A、CD44v9R41A、CD44v8R41A、CD44v7R41A、CD44v6R41A、CD44v5R41A、CD44v4R41A、及びCD44v3R41Aからなる群より選択されるCD44の細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含むCD44融合タンパク質;
b)癌細胞で細胞毒性又は細胞増殖抑制ストレスを生じる、少なくとも1種類の治療薬;及び
c)薬学上許容可能な担体又は希釈剤;
を含む医薬組成物。 - CD44の細胞外ドメインがCD44v3−v10である、請求項30に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44v8−v10である、請求項30に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44v6−v10である、請求項30に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44sである、請求項30に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44v3−v10R41Aである、請求項30に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44v8−v10R41Aである、請求項30に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44sR41Aである、請求項30に記載の医薬組成物。
- 神経膠腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌、膵癌、及び黒色腫からなる群より選択される哺乳動物の癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする該哺乳動物に、該癌の治療に有効な量の請求項30に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
- 該神経膠腫が星細胞腫である、請求項38に記載の方法。
- 該神経膠腫が多形性膠芽腫である、請求項38に記載の方法。
- 該哺乳動物がヒトである、請求項38に記載の方法。
- a)CD44v3−v10、CD44v8−v10、及びCD44s、CD44v4−v10、CD44v5−v10、CD44v6−v10、CD44v7−v10、CD44v9−v10、CD44v10、CD44v9、CD44v8、CD44v7、CD44v6、CD44v5、CD44v4、CD44v3、CD44sR41A、CD44v3−v10R41A、CD44v8−V10R41A、CD44v4−v10R41A、CD44v5−v10R41A、CD44v6−v10R41A、CD44v7−v10R41A、CD44v9−v10R41A、CD44v10R41A、CD44v9R41A、CD44v8R41A、CD44v7R41A、CD44v6R41A、CD44v5R41A、CD44v4R41A、及びCD44v3R41Aからなる群より選択されるCD44の細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含むCD44融合タンパク質;
b)癌細胞中のEGFR/erbB−2/erbB−3/erbB−4/c−MetRTK又はIAPの阻害剤である、少なくとも1種類の治療薬;及び
c)薬学上許容可能な担体又は希釈剤;
を含む医薬組成物。 - CD44の細胞外ドメインがCD44v3−v10である、請求項42に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44v8−v10である、請求項42に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44sである、請求項42に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44v6−v10である、請求項42に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44sR41Aである、請求項42に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44v3−v10R41Aである、請求項42に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44v8−v10R41Aである、請求項42に記載の医薬組成物。
- 該阻害剤が、トラスツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、BIBW2992、CI−1033、PF−2341066、PF−04217903、AMG208、JNJ−38877605、MGCD−265、SGX−523、GSK1363089、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、BIBF1120、パゾパニブ、ベバシズマブ、バタラニブ、アキシチニブ、E7080、ペリホシン、MK−2206、テムシロリムス、ラパマイシン、BEZ235、GDC−0941、PLX−4032、イマチニブ、AZD0530、ボルテゾミブ、XAV−939、アドベキシン(Ad5CMV−p53)、Genentech−化合物8/cIAP−XIAP阻害剤、及びAbbott Laboratories−化合物11からなる群より選択される阻害剤である、請求項42に記載の医薬組成物。
- a)CD44v3−v10、CD44v8−v10、CD44s、CD44v4−v10、CD44v5−v10、CD44v6−v10、CD44v7−v10、CD44v9−v10、CD44v10、CD44v9、CD44v8、CD44v7、CD44v6、CD44v5、CD44v4、CD44v3、CD44sR41A、CD44v3−v10R41A、CD44v8−v10R41A、CD44v4−v10R41A、CD44v5−v10R41A、CD44v6−v10R41A、CD44v7−v10R41A、CD44v9−v10R41A、CD44v10R41A、CD44v9R41A、CD44v8R41A、CD44v7R41A、CD44v6R41A、CD44v5R41A、CD44v4R41A、及びCD44v3R41Aからなる群より選択されるCD44の細胞外ドメインの融合させたヒトIgG1の定常領域を含むCD44融合タンパク質をコードしている発現ベクターを含むウイルス;及び
b)薬学上許容可能な担体又は希釈剤;
を含む医薬組成物。 - CD44の細胞外ドメインがCD44v3−v10である、請求項51に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44v8−v10である、請求項51に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44v6−v10である、請求項51に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44sである、請求項51に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44v3−v10R41Aである、請求項51に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44v8−v10R41Aである、請求項51に記載の医薬組成物。
- CD44の細胞外ドメインがCD44sR41Aである、請求項51に記載の医薬組成物。
- 神経膠腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌、膵癌、及び黒色腫からなる群より選択される哺乳動物の癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする該哺乳動物に、該癌の治療に有効な量の請求項51に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
- 該神経膠腫が星細胞腫である、請求項59に記載の方法。
- 該神経膠腫が多形性膠芽腫である、請求項59に記載の方法。
- 該哺乳動物がヒトである、請求項59に記載の方法。
- 試料を、CD44の細胞外ドメインに融合させたヒトIgG1の定常領域を含む標識したCD44融合タンパク質と接触させる工程を含む、該試料中のヒアルロン酸を検出する方法。
- 該試料が癌生検又は癌切片である、請求項63に記載の方法。
- 該試料が、血液、血清、血漿及び尿からなる群より選択される患者の体液試料である、請求項63に記載の方法。
- 該標識が、ビオチン、蛍光標識、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、磁気ビーズ、及び放射性標識からなる群より選択される、請求項63に記載の方法。
- 該標識がビオチンである、請求項63に記載の方法。
- 該試料中の標識したCD44融合タンパク質をインキュベートする工程、及びヒアルロン酸に結合した該標識を定量する工程をさらに含む、請求項63に記載の方法。
- CD44の細胞外ドメインが、CD44v3−v10、CD44v8−v10、CD44s、CD44v4−v10、CD44v5−v10、CD44v6−v10、CD44v7−v10、CD44v9−v10、CD44v10、CD44v9、CD44v8、CD44v7、CD44v6、CD44v5、CD44v4、及びCD44v3からなる群より選択されるドメインである、請求項63に記載の方法。
- 哺乳動物から得た試料中のヒアルロン酸を、請求項63〜69のいずれか1項に記載の方法に従って検出する工程を含む哺乳動物の癌を診断する方法であって、該試料中のヒアルロン酸の量が正常な対照試料中の量よりも多いことが、癌の存在の指標となる、哺乳動物の癌を診断する方法。
- 該癌が、神経膠腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、腎細胞癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌、膵癌、及び黒色腫からなる群より選択される癌である、請求項70に記載の方法。
- 該試料中のCD44を検出する工程をさらに含み、該試料中のヒアルロン酸及びCD44の量が正常な対照試料中の量よりも多いことが癌の存在の指標となる、請求項70に記載の方法。
- 哺乳動物における癌の状態の変化を決定する方法であって、
(a)該哺乳動物から第1の試料を採取する工程と、
(b)該哺乳動物由来の第1の試料中のヒアルロン酸を、請求項63〜69のいずれか1項に記載の方法に従って検出する工程と、
(c)該哺乳動物から第2の試料を採取する工程と、
(d)該哺乳動物由来の第2の試料中のヒアルロン酸を、請求項63〜69のいずれか1項に記載の方法に従って検出する工程、
を含み、該第1試料中のヒアルロン酸の量と該第2試料中のヒアルロン酸の量の差が、該哺乳動物の癌の状態の変化の指標となる癌の状態を決定する方法。
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