KR20040102024A - 유전적 장애의 검출 방법 - Google Patents

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KR20040102024A KR10-2004-7013657A KR20047013657A KR20040102024A KR 20040102024 A KR20040102024 A KR 20040102024A KR 20047013657 A KR20047013657 A KR 20047013657A KR 20040102024 A KR20040102024 A KR 20040102024A
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Abstract

본 발명의 유전적 장애의 검출에 유용한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 관심있는 유전자좌의 대립유전자의 서열을 결정하는 단계, 및 관심있는 유전자좌의 대립유전자의 비율을 정량하는 단계를 포함하며, 여기서 비율은 염색체 이상의 존재 또는 부재를 나타낸다. 본 발명은 또한 태아의 염색체 이상을 검출하는 비침습적 방법을 제공한다. 본 발명은 특히 태아 DNA의 서열을 결정하는 비침습적 방법으로서 유용하다.

Description

유전적 장애의 검출 방법{METHODS FOR DETECTION OF GENETIC DISORDERS}
염색체 이상은 사람에서 유전적 결함의 유의한 부분을 차지한다. 사람 세포의 핵은 46개의 염색체를 포함하는데, 이것은 유전적 명령을 포함하며, 세포의 작용을 결정한다. 46개 염색체의 절반은 각각의 부모로부터 기원한다. 정상적인 남자에서는 서로가 상당히 다른 성염색체를 제외하면, 모계 기원의 염색체 및 부계 기원의 염색체는 짝을 이루는 세트를 형성한다. 이 쌍들은 난자가 정자에 의해 수정될 때 결합되었다. 때때로, 염색체의 형성 또는 결합 중 하나에서 에러가 발생하여, 너무 많거나 또는 너무 적은 수의 염색체를 갖는, 또는 어떤 방식으로 혼합된 염색체를 갖는 수정란이 형성된다. 각각의 염색체는 다수의 유전자를 함유하기 때문에, 염색체 이상은 많은 신체 시스템에 영향을 주고 종종 발생학적 장애 (예를 들어, 정신 지체)를 포함하는 심각한 선천적 결함을 야기할 수 있다.
세포는 자연적으로 또는 화합물, 발암물질, 및 방사선에 노출된 후 절단된 염색체 말단을 재결합시킬 수 있다. 염색체 내에 재결합이 발생하면, 두 개의 잘려진 부분 사이의 염색체 단편은 전도되고 역위로서 분류된다. 역위를 갖는다면, 유전적 물질의 손실은 없지만; 그러나, 역위는 중추적 유전자의 붕괴를 야기하거나, 또는 질병 관련 상태를 유발하는 융합 유전자를 생산할 수 있다.
상호 전위에서, 두 개의 비-상동 염색체는 단편을 절단하고 교환한다. 이 시나리오에서, 두 개의 비정상적인 염색체가 생기는데 각각은 다른 염색체로부터 유래된 부분으로 구성되며 그것 자체의 부분이 결핍된다. 전위가 균형을 이룬 형태의 것이라면, 개체는 비정상적인 표현형을 나타내지 않을 것이다. 그러나, 전위를 갖는 개체에서의 배아-세포 형성 도중, 난자 또는 정자에 있는 염색체의 정확한 분배가 종종 실패하여, 유산, 기형, 또는 자손의 정신 지체를 일으킨다.
로버트손 전위에서, 두 개의 말단동원체형 염색체 (중심에 위치하지 않은 동원체를 갖는 염색체)의 동원체가 융합하여 하나의 거대한 중부동원체형 염색체를 생성한다. 동원체 융합을 갖는 개체의 핵형은 정상 염색체 배수보다 하나 적다.
과다 또는 과소 염색체를 생성하는 에러는 또한 질병 표현형을 일으킬 수 있다. 예를 들어, X 염색체의 결실 (X 1염색체성)은 터너 증후군을 일으키고, 반면 21번 염색체의 추가적인 복제는 다운 증후군을 일으킨다. 에드워드 증후군, 및 파타우 증후군과 같은 다른 질병은 각각 18번 염색체, 및 13번 염색체의 추가적인 복제에 의해 야기된다.
가장 통상적인 염색체 이상 중 하나는 다운 증후군으로 알려져있다. 다운 증후군의 평가된 발병률은 1000명 중 1명 내지 1,100명 중 1명이다. 매년 약 3,000 내지 5,000 명의 아이들이 미국에서 이러한 염색체 이상을 갖고 태어난다. 다운 증후군에 걸린 아이들 중 대다수(대략 95%)는 여분의 21번 염색체를 갖는다. 대부분, 여분의 염색체는 모계로부터 기원한다. 그러나, 다운 증후군에 걸린 사람들 중 약 3-4%에서, 21번 염색체와 14번 또는 22번 염색체 사이에서의 전위로 인해 유전적 비정상이 나타난다. 결국, 모자이크 현상이라 불리는 또 다른 염색체 문제는 다운 증후군에 걸린 개체 중 약 1%에서 주의된다. 모자이크 현상은 임신 직후 세포 분열에서의 에러 결과인 것으로 생각된다.
염색체 이상은 선천성이고, 그러므로 태아기 진단은 출산 전 태아의 건강 및 상태를 측정하는데 사용될 수 있다. 태아기 진단으로 획득되는 지식이 없다면, 태아 또는 산모 또는 둘 모두에 대한 불행한 결과가 생길 수 있다. 선천성 기형은 20 내지 25%의 주생기 사망 원인이 된다. 특히, 태아기 진단은 임신의 잔여 기간을 관리하고, 출산 과정에서 생길 수 있는 가능한 합병증에 대해 준비하고, 신생아에서 발생할 수 있는 문제들을 준비하고, 미래의 임신에 영향을 미칠 수 있는 상태를 발견하는데 도움이 된다.
초음파 검사법, 양수 천자, 융모막 융모 생검(CVS), 모계 혈액 중 태아 혈구, 모계 혈청 알파-페토단백질, 모계 혈청 베타-HCG, 및 모계 혈청 에스트리올을 포함하는, 태아기 진단에 이용가능한 다양한 비-침습성 및 침습성 기술이 있다. 그러나, 비-침습적인 기술은 덜 특이적이고, 고도의 특이성 및 고감도를 갖는 기술은 매우 침습적이다. 더욱이, 대부분의 기술은 극대의 효율성을 위해 임신 도중 특정한 기간 동안만 적용될 수 있다.
초음파 검사법
이 기술은 무해한 비-침습성 방법이다. 양막강에 있는 태아를 포함하는, 상이한 조직 및 기관에 의해 만들어지는 공명의 패턴으로부터 가시적인 이미지를 생성하는데 고주파의 음파가 사용된다. 발생중인 배아는 임신 약 6주에 가시화될 수 있다. 주요 내부 기관 및 사지는 임신 약 16 내지 20 주에 어떤 것이 비정상인지 결정하도록 평가될 수 있다.
초음파 검사법은 태아의 크기 및 위치, 양수의 양, 및 태아의 해부학적 외형을 측정하는데 사용될 수 있지만; 그러나, 이 방법에는 제한이 있다. 형태학적 이상이 종종 특색을 이루지 않고 단지 잠재적인 다운 증후군과 같은 잠재적 이상은 전혀 검출되지 않을 수 있다.
양수 천자
이것은 바늘이 산모의 하복부를 통해 자궁 내부의 양막강 내로 통과하는 고도로 침습적인 방법이다. 이 방법은 임신 약 14주에 수행될 수 있다. 태아기 진단에 있어서, 대부분의 양수 천자는 임신 14 내지 20주 사이에 수행된다. 그러나, 양수 천자에 앞서, 임신 연령, 태아 및 태반의 위치를 측정하고, 충분한 양수가 존재하는지를 측정하기 위해 초음파 검사가 수행된다. 양수 내에는 (대부분이 태아 피부에서 유래한) 태아 세포가 존재하며 이것은 염색체, 생화학, 및 분자 생물학적 분석을 위해 배양물에서 배양될 수 있다.
여분 또는 결실 염색체 또는 염색체 단편과 같은 거대한 염색체 이상은 핵형분석에 의해 검출될 수 있는데, 이것은 세포에서 유래된 모든 46개 염색체의 식별 및 분석을 포함하고 크기 및 구조에 있어서 미묘한 차이에 기초하여, 염색체의 매치되는 쌍으로 정열한다. 이러한 체계적인 표현에서, 염색체 수 및 구조에서의 비정상이 분명해진다. 본 방법은 전형적으로 완성까지 7 내지 10일이 소요된다.
양수 천자가 직접적인 유전 정보를 제공하는데 사용될 수 있는 반면, 유산 및 모계 Rh 감작을 포함하는 위험이 이러한 방법에 연관된다. 양수 천자 후 태아 사망률의 증가된 위험은 보통 기대되는 것보다 약 0.5%를 상회한다. Rh 음성 산모는 RhoGam으로 치료될 수 있다.
융모막 융모 생검 (CVS)
이 방법에서, 질을 경유하여 자궁 경부 및 자궁을 통해 초음파 유도를 받는 발생중인 태반으로 카테터를 통과시킨다. 카테터의 도입으로 태반 융모막 융모 유래의 세포를 획득하여, 태아의 핵형을 측정하기 위한 염색체 분석을 포함하는 다양한 기술에 의해 분석되는 것이 허용된다. 세포들은 또한 생화학적 또는 분자 생물학적 분석을 위해 배양될 수 있다. 전형적으로, CVS는 임신 9.5 내지 12.5 주에 수행된다.
CVS는 침습적인 방법이라는 단점을 가지며, 태아에 있어서 낮지만 유의한 비율의 사망률을 갖는데; 이 사망률은 양수 천자를 행한 산모에서 보다 더 높은 약 0.5 내지 1%이다. 드물게, CVS는 태아에서의 사지 결함과 연관될 수 있다. 또한 산모의 Rh 감작 가능성이 존재한다. 더욱이, 발생중인 태반 내의 모계 혈구가 태아 세포 대신에 체취되어 염색체 분석을 혼란시킬 수 있는 가능성 또한 존재한다.
모계 혈청 알파-페토단백질 (MSAFP)
발생중인 태아는 두 가지 주요 혈액 단백질인 알부민 및 알파-페토단백질 (AFP)을 갖는다. 모친은 전형적으로 그 혈액 내에 알부민만을 가지므로, MSAFP 시험은 태아 유래의 AFP 수준을 측정하는데 이용될 수 있다. 보통은, 적은 양의 AFP만이 양수로 접근가능하고 태반을 가로질러 모친의 혈액으로 통과한다. 그러나, 태아가 신경관 결함이 있으면, 더 많은 AFP가 양수로 흘러나간다. 신경관 결함은 무뇌증 (신경관의 두부 말단 폐쇄의 실패) 및 이분 척추 (신경관의 미부 말단 폐쇄의 실패)를 포함한다. 이러한 결함의 발생률은 미국에서 1000명당 약 1 내지 2명이다. 또한, 태아 복벽에 결함이 있으면, 태아 유래의 AFP는 더 높은 양으로 모친 혈액에 도달할 것이다.
MSAFP의 양은 임신 연령에 따라 증가하며, 따라서 정확한 결과를 제공하는 MSAFP 시험을 위해서, 임신 연령을 반드시 알아야 한다. 또한, 모친의 인종 및 임신성 당뇨병의 존재는 정상인 것으로 생각되는 MSAFP의 수준에 영향을 미칠 수 있다. MSAFP는 평균의 배수(MoM)로서 전형적으로 보고된다. MoM이 커질수록, 결함의 존재 가능성도 커진다. MSAFP 시험은 임신 16주에서 18주 사이에 최대의 감도를 갖지만, 임신 15주에서 22주 사이에 사용될 수 있다. MSAFP는 다운 증후군 또는 다른 염색체 이상이 존재할 때 더 낮게 나오는 경향이 있다.
MSAFP 시험은 비-침습성이지만, MSAFP는 100% 특이적인 것은 아니다. MSAFP는 태아 신경관 또는 복벽 결함에 관련되지 않은 다양한 이유로 인해 상승될 수 있다. 상승된 MSAFP의 가장 통상적인 원인은 태아 임신 연령의 잘못된 판단이다.그러므로, MSAFP 시험의 결과는 결코 명확하고 결정적인 것으로는 고려되지 않는다.
모계 혈청 베타-HCG
임신 및 자궁 내로 발생중인 배아 착상 후 약 1주일 초기에, 영양막은 검출 가능한 베타-HCG (사람 융모막 고나도트로핀의 베타 서브유닛)를 생산하는데, 이것은 임신을 진단하는데 이용될 수 있다. 베타-HCG는 또한 모계 혈청에서 정량될 수 있고, 베타-HCG의 양이 정상일 때보다 더 적기 때문에, 절박유산 또는 자궁외 임신이 의심될 때 임신 초기에 유용할 수 있다.
늦은 두 번째 세 달의 중기에, 베타-HCG는 MSAFP와의 조합으로 염색체 이상, 특히 다운 증후군을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 감소된 MSAFP와 짝을 이룬 상승된 베타-HCG는 다운 증후군을 암시한다. 높은 수준의 HCG는 영양막 질병(자궁벽 자궁관 임신)을 암시한다. 상승된 HCG를 동반한 초음파검사법 상에서 태아의 부재는 포상기태형 모반을 암시한다.
모계 혈청 에스트리올
모계 혈정 내 에스트리올의 양은 생존 가능한 태아, 적절하게 기능하는 태반, 및 모친의 건강 상태에 의존한다. 디히드로에피안드로스테론(DHEA)은 태아의 부신에서 생산되어, 태반에서 에스트리올로 대사된다. 에스트리올은 모친의 혈액으로 들어가서 모친의 신장에 의해 소변으로 또는 모친의 간에 의해 담즙으로 분비된다. 세 번째 세 달에서 측정된, 정상 수준의 에스트리올은 태아의 일반적인 건강 상태의 지표를 제공할 것이다. 에스트리올 수준이 떨어지면, 태아가 위험하며즉각적인 송달이 필요하다. 에스트리올은 다운 증후군이 존재할 때 및 무뇌증을 동반한 부신 형성저하증이 있을 때 감소하는 경향이 있다.
삼중 스크린 시험
삼중 스크린 시험은 모계 혈청 알파-페토단백질 (MSAFP), 사람 융모막 고나도트로핀(hCG), 및 비접합 에스트리올(uE3)의 분석을 포함한다. 혈액 시험은 보통 최종 생리 이후 16 내지 18주에 수행된다. 삼중 스크린 시험은 비-침습성이기는 하지만, 비정상적인 시험 결과가 선천적 결함을 나타내는 것은 아니다. 차라리, 시험은 증가된 위험을 지시할 뿐이며 그 이상의 시험이 필요하다는 것을 제시한다. 예를 들어, 1,000명 중 100명의 여성은 삼중 스크린 시험으로부터 비정상적인 결과를 가질 것이다. 그러나, 100명 중 2 내지 3명만이 선천성 결함을 갖는 태아를 가질 것이다. 이러한 높은 허위 양성 반응의 발생률은 임신한 여성에게 상당한 스트레스 및 불필요한 걱정을 야기한다.
모계 혈액으로부터 분리된 태아 세포
모계 혈액 내에 태아의 핵이 있는 세포의 존재는 이들 세포를 비침습적 태아기 진단에 사용하는 것을 가능하게 한다 (Walknowska, 등, Lancet 1 : 1119-1122, 1969; Lo 등, Lancet 2: 1363-65,1989 ; Lo 등, Blood 88: 4390-95,1996). 태아 세포는 분류되어 특정 DNA 서열을 찾는 다양한 기술에 의해 분석될 수 있다 (Bianchi 등, Am. J. Hum. Genet. 61 : 822-29, (1997) ; Bianchi 등, PNAS 93 : 705-08,(1996)). 형광성 제자리 혼성화(FISH) 는 모계 혈액으로부터 회수된 태아 세포의 특정 염색체를 식별하고 3염색체성 및 1염색체성 X와 같은 이수성 상태를진단하는데 적용될 수 있다. 또한, 모계 혈액 내 태아 세포수는 이수성 임신에서 증가하는 것으로 보고되었다.
FISH 방법은 현미경 하에서 특정 염색체 또는 유전자의 검출을 가능하게 하는 발색 형광 태그로 표지된 DNA 프로브를 사용한다. FISH를 이용하면, 표준 핵형 분석에 의해 검출될 수 없는 미묘한 유전적 비정상이 손쉽게 식별될 수 있다. 이 방법은 전형적으로 완료하는데 24 내지 48 시간이 소요된다. 게다가, 다중-발색 DNA FISH 프로브의 패널을 사용하면, 비정상적인 염색체 복제수를 확인할 수 있다.
태아 세포의 분리 및 배양에 있어서 개선되어 왔지만, 다수의 태아 혈액 세포를 얻는 것은 여전히 어렵다. 태아 핵형의 이형을 확실히 측정하거나 또는 다른 비정상에 대한 검정에는 충분하지 않을 수 있다. 더욱이, 대부분의 기술들은 시간이 걸리고, 고 인력의 투입을 필요로 하며, 높은 작업처리량 방식을 충족시키기가 어렵다.
모계 혈액 유래의 태아 DNA
태아 DNA는 모계 혈장 및 혈청에서 검출되고 정량되었다 (Lo 등, Lancet 350 : 485-487 (1997) ; Lo 등, Am. J. hum. Genet. 62 : 768-775 (1998)). 다수의 태아 세포 타입이 모계 혈액 순환계에서 발생하는데, 이것은 태아 과립세포, 림프세포, 유핵 적혈구, 및 영양막 세포를 포함한다 (Pertl, and Bianchi, Obstetrics and Gynecology 98 : 483-490 (2001)). 태아 DNA는 임신 7주에 혈청에서 검출될 수 있고, 임신 기간과 더불어 증가한다. 모계 혈청 및 혈장에 존재하는 태아 DNA는 태아 세포 분리 방법으로 얻은 DNA의 농도와 비교된다.
순환하는 태아 DNA는 태아의 성별을 결정하는데 사용된다(Lo 등, Am. J. hum. Genet. 62 : 768-775 (1998)). 또한, 태아의 붉은털원숭이 D 유전자형은 태아의 DNA를 사용하여 검출된다. 그러나, 순환하는 태아 DNA의 진단적 및 임상적 적용은 태아에는 존재하되 모친에는 없는 유전자에 제한된다 (Pertl and Bianchi, Obstetrics and Gynecology 98 : 483-490 (2001)). 따라서, 태아 DNA의 서열을 결정하고 태아에 있는 염색체 이상의 명확한 진단을 제공할 수 있는 비-침습적 방법의 필요성이 여전히 존재한다.
발명의 개요
본 발명은 돌연변이 및 염색체 이상을 포함하는 유전적 장애의 검출 방법에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 돌연변이 및, 전위, 염기전환, 1염색체성, 3염색체성, 및 다른 이수체, 결실, 첨가, 증폭, 단편화, 전위 및 재배열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 염색체 이상을 검출하는데 사용된다. 다수의 이상이 동시에 검출될 수 있다. 본 발명은 또한 산모의 샘플에서 유래한 태아 DNA 서열을 결정하는 비-침습적 방법을 제공한다. 본 발명은 야생형 서열과 비교될 때, 점 돌연변이, 해독 프레임 변형, 전이, 염기전환, 첨가, 삽입, 결실, 첨가-결실, 프레임-변형, 미스센스, 역 돌연변이, 및 마이크로새틀라이트 변경을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유전자 서열에 있어서의 어떤 변경을 검출하는데 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 염색체 이상을 검출하는 방법에 관한 것이며 상기 방법은: (a) 주형 DNA 상의 관심있는 유전자좌의 대립유전자 서열을 결정하는 단계, 및 (b) (a)의 관심있는 유전자좌로부터 확인된 관심있는 이형접합성 유전자좌 상의 대립유전자에 대한 비율을 정량하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 비율은 염색체 이상의 존재 또는 부재를 가리킨다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 태아 DNA 상의 관심있는 유전자좌의 서열을 결정하는 비-침습적 방법을 제공하는데, 상기 방법은 : (a) 개체로부터 샘플을 획득하는 단계; (b) (a)의 샘플에 세포 용해 저해제를 첨가하는 단계; (c) (b)의 샘플로부터 주형 DNA를 획득하는 단계 (여기에서, 상기 주형 DNA는 태아 DNA 및 모계 DNA를 포함한다) ; 및 (d) 주형 DNA 상의 관심있는 유전자좌의 서열을 결정하는 단계를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 주형 DNA는 세포, 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 눈물, 질 분비액, 제대혈, 융모막 융모, 양수, 배아 조직, 배아, 2-세포기 배아, 4-세포기 배아, 8-세포기 배아, 16-세포기 배아, 32-세포기 배아, 64-세포기 배아, 128-세포기 배아, 256-세포기 배아, 512-세포기 배아, 1024-세포기 배아, 림프액, 뇌척수액, 점막 분비액, 복막액, 복수, 대변 물질, 또는 체삼출물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 샘플로부터 획득된다.
한 구체예에서, 주형 DNA는 임신한 자성 샘플로부터 획득된다. 바람직한 구체예에서, 주형 DNA 는 임신한 사람 여성으로부터 획득된다.
또 다른 구체예에서, 주형 DNA는 배아로부터 획득된다. 바람직한 구체예에서, 주형 DNA는 배아 유래의 단일 세포로부터 획득된다.
또 다른 구체예에서, 세포 용해 저해제가 샘플에 첨가되고 이것은 포름알데히드, 및 포름알데히드의 유도체, 포르말린, 글루타르알데히드, 및 글루타르알데히드의 유도체, 가교제, 1차 아민 반응성 가교제, 설프히드릴 반응성 가교제, 설프히드릴 첨가제 또는 디설피드 환원제, 탄수화물 반응성 가교제, 카르복실 반응성 가교제, 광반응성 가교제, 절단가능한 가교제, AEDP, APG, BASED, BM(PEO)3, BM(PEO)4, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BS3, BSOCOES, DFDNB, DMA, DMP, DMS, DPDPB, DSG, DSP, DSS, DST, DTBP, DTME, DTSSP, EGS, HBVS, sulfo-BSOCOES, Sulfo-DST, 또는 Sulfo-EGS를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 구체예에서, DNA 파괴를 막는 작용제가 샘플에 첨가되고 이것은 DNase 저해제, 염화 아연, 에틸렌디아민테트라아세트산, 구아니딘-HCl, 이소티오시안산 구아니딘, N-라우로일사르코신, 및 Na-도데실술페이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
바람직한 구체예에서, 주형 DNA는 임신한 자성 유래 혈액의 혈장으로부터 획득된다. 또 다른 구체예에서, 주형 DNA는 임신한 자성 유래 혈액의 혈청으로부터 획득된다.
또 다른 구체예에서, 주형 DNA는 태아 DNA 및 모계 DNA를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 주형 DNA 상의 관심있는 유전자좌는 관심있는 모계 동형접합성 유전자좌로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 주형 DNA 상의 관심있는 유전자좌는 관심있는 모계 이형접합성 유전자좌로부터 선택된다.
또 다른 구체예에서, 주형 DNA 상의 관심있는 유전자좌는 부계 동형접합성유전자좌로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 주형 DNA 상의 관심있는 유전자좌는 관심있는 부계 이형접합성 유전자좌로부터 선택된다.
한 구체예에서, 단일 염색체 상의 관심있는 다수의 유전자좌의 대립유전자 서열이 결정된다. 바람직한 구체예에서, 다수의 염색체 상의 관심있는 다수의 유전자좌의 대립유전자 서열이 결정된다.
또 다른 구체예에서, 관심있는 유전자좌의 대립유전자 서열을 결정하는 단계는 대립유전자 특이적 PCR, 겔 전기영동법, ELISA, 질량 분광법, 혼성화, 프라이머 확장법, 형광 분극화, 형광 공명 에너지 전달, 서열 분석 DNA 마이크로어레이, 서던 블롯, 슬롯 블롯, 도트 블롯, 및 MALDI-TOF 질량 분광법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 방법을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 관심있는 유전자좌의 대립유전자 서열을 결정하는 단계는 (a) 제 1 및 제 2 프라이머를 사용하여 관심있는 유전자좌를 증폭하는 단계 (여기에서 제 2 프라이머는 관심있는 유전자를 함유하는 5' 돌출부를 생성하도록 하는 제한 효소의 인식 부위를 포함한다) ; (b) 제 2 프라이머 상의 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 증폭된 DNA를 절단하는 단계; (c) 주형으로서 관심있는 유전자를 함유하는 5' 돌출부를 사용함으로써 (b)의 절단된 DNA 내로 뉴클레오티드를 통합하는 단계; 및 (d) (c)의 DNA 서열을 결정함으로써 관심있는 유전자좌의 서열을 결정하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 증폭은 중합효소 연쇄반응(PCR)을 포함한다. 더 이상의 구체예에서, PCR의 첫번째 사이클 어닐링 온도는 제 2 프라이머의 어닐링 길이의 용융 온도가 될 수 있다. 또 다른 구체예에서, PCR의 두번째 사이클 어닐링 온도는 주형 DNA를 어닐링하는, 제 1 프라이머의 3' 영역의 용융 온도가 될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 나머지 사이클의 어닐링 온도는 제 2 프라이머의 전체 서열의 용융 온도가 될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 제 2 프라이머 상의 인식 부위는 제한 효소와의 결합 부위로부터 좀 떨어진 곳을 절단하여 5' 돌출부를 생성하는 제한 효소를 위한 것인데, 이 돌출부는 관심있는 유전자좌를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 제 2 프라이머 상의 인식 부위는 IlS 형 제한 효소를 위한 것이다. IlS 형 제한 효소는 Alw I, Alw26 I, Bbs I, Bbv I, BceA I, Bmr I, Bsa I, Bst71 I, BsmA I, BsmB I, BsmF I, BspM I, Ear I, Fau I, Fok I, Hga I, Ple I, Sap I, SSfaN I, 및 Sthi32 I을 포함하고, 더 바람직하게는 BceA I 및 BsmF I이지만 이에 제한되지 않는다.
한 구체예에서, 제 2 프라이머의 3'말단은 관심있는 유전자좌에 인접한다.
또 다른 구체예에서, 제 2 프라이머의 어닐링 길이는 35-30, 30-25, 25-20, 20-15, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 및 4 염기 이하로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 구체예에서, 관심있는 유전자좌를 증폭하는 단계는 제한 효소 인식 부위의 부분을 함유하는 제 1 및 제 2 프라이머를 사용하는 단계를 포함하는데, 여기에서 상기 인식 부위는 적어도 하나의 변화가능한 뉴클레오티드를 함유하고, 증폭후 전체 제한 효소 인식 부위가 생성되며, 상기 프라미어의 3' 영역은 주형 DNA에 매치되지 않는 염기를 함유하고, 상기 제한 효소로의 절단은 관심있는 유전자좌를 포함한 5' 돌출부를 생성한다.
바람직한 구체예에서, BsaJ I (5'C↓CNNGG 3'), BssK I (5'↓CCNGG 3'), Dde I (5'C↓TNAG 3'), EcoN I (5'CCTNN↓NNNAGG 3'), Fnu4H I (5'GC↓NGC 3'), Hinf I (5'G↓ANTC 3'), PflF 1 (5' GACN↓NNGTC 3'), Sau96 I (5'G↓GNCC 3'), ScrF I (5'CC↓NGG 3'), Tthl 11 I (5'GACN↓NNGTC 3'), 및 더욱 바람직하게는 Fnu4H I 및 EcoN I을 포함하지만 이에 제한되지 않는 제한 효소를 위한 인식 부위가 증폭 후 생성된다.
또 다른 구체예에서, 제 1 및/또는 제 2 프라이머의 5' 영역은 제한 효소를 위한 인식 부위를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 제한 효소 인식 부위는 관심있는 유전자좌를 포함한 5' 돌출부를 생성하는 제한 효소 인식 부위와는 상이하다.
더이상의 구체예에서, 본 발명의 방법은 제 1 및/또는 제 2 프라이머의 5' 영역에 있는 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 DNA를 절단하는 단계를 포함한다.
제 1 및/또는 제 2 프라이머는 5' 말단에 태그를 포함할 수 있다. 바람직하게, 제 1 프라이머는 5' 말단에 태그를 포함한다. 태그는 증폭된 DNA를 주형 DNA로부터 분리하는데 사용될 수 있다. 태그는 표지된 뉴클레오티드를 함유하지 않은 증폭 DNA로부터 표지된 뉴클레오티드를 함유한 증폭된 DNA를 분리하는데 사용될 수 있다. 태그는 예를 들어, 방사선 동위원소, 형광 리포터 분자, 화학발광 리포터 분자, 항체, 항체 절편, 헵텐, 비오틴, 비오틴의 유도체, 포토비오틴, 이미노비오틴, 디곡시게닌, 아비딘, 효소, 아크리디늄, 당, 효소, 아포효소, 동형다량체적 올리고뉴클레오티드, 호르몬, 강자성 부분, 상자성 부분, 반자성 부분, 인광성 부분,발광성 부분, 전자화학발광성 부분, 염색성 부분, 검출가능한 전자 회전 공명, 전기적 용량, 유전체적 상수 또는 전기 전도성을 갖는 부분, 및 그것의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게, 태그는 비오틴이다. 비오틴 태그는 스트렙타비딘 매트릭스를 사용하여 주형 DNA로부터 증폭된 DNA를 분리하는데 사용된다. 스트렙타비딘 매트릭스는 마이크로타이터 플레이트의 웰에 코팅된다.
본 발명의 방법에서 뉴클레오티드의 통합은 E. coli DNA 중합효소, E. coli DNA 중합효소 I의 클레노우 절편, T7 DNA 중합효소, T4 DNA 중합효소, T5 DNA 중합효소, 클레노우 부류 중합효소군, Taq 중합효소, Pfu DNA 중합효소, Vent 중합효소, 박테리오파지 29, REDTaqT™ Genomic DNA 중합효소, 또는 시퀘나제(sequenase)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 DNA 중합효소에 의한 것이다. 뉴클레오티드의 통합은 표지된 및 표지되지 않은 뉴클레오티드의 혼합물을 사용하는 단계를 더욱 포함한다. 하나의 뉴클레오티드, 2개의 뉴클레오티드, 3개의 뉴클레오티드, 4개의 뉴클레오티드, 5개의 뉴클레오티드, 또는 5개 이상의 뉴클레오티드가 통합될 수 있다. 표지된 및 표지되지 않은 뉴클레오티드의 조합이 통합될 수 있다. 표지된 뉴클레오티드는 디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 및 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트로 구성된 군으로부터 선택된다. 표지된 뉴클레오티드는 방사선 분자, 형광 분자, 항체, 항체 단편, 헵텐, 탄수화물, 비오틴, 및 비오틴의 유도체, 인광성 부분, 발광 부분, 전자화학발광 부분, 염색 부분, 및 검출가능한 전자 회전 공명, 전기적 용량, 유전체적 상수 또는 전기 전도성을 갖는 부분로 구성된 군으로부터 선택된 분자로 표지된다. 바람직하게, 표지된 뉴클레오티드는 형광 분자로 표지된다. 형광 표지된 뉴클레오티드의 통합은 형광 및 표지되지 않은 뉴클레오티드의 혼합물을 사용하는 단계를 더욱 포함하다.
한 구체예에서, 관심있는 유전자좌 서열의 결정은 통합된 뉴클레오티드를 검출하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 검출은 겔 전기영동법, 모세관 전기영동법, 미세채널 전기영동법, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법, 형광 검출법, 형광 분극법, DNA 서열결정, 생거 디데옥시 서열결정, ELISA, 질량 분광법, 비행 시간 질량 분광법, 4중극자 질량 분광법, 자기 영역 질량 분광법, 전기 영역 질량 분광법, 형광측정법, 적외선 분광법, 자외선 분광법, 팔렌티오스타틱 전류측정법, DNA 혼성화, DNA 마이크로어레이, 서던 블롯, 슬롯 블롯, 및 도트 블롯으로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의한다.
한 구체예에서, 주형 DNA의 단일 염색체 상에 있는 하나에서 수십 내지 수백에서 수천 개의 관심있는 유전자좌의 대립유전자 서열이 결정된다. 바람직한 구체예에서, 다수의 염색체 상에 있는 하나에서 수십 내지 수백에서 수천 개의 관심있는 유전자좌의 대립유전자 서열이 결정된다.
바람직한 구체예에서, 관심있는 유전자좌는 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 돌연변이를 함유한 것으로 추정된다. 방법은 관심있는 다수의 유전자좌 서열을 동시에 결정하는데 사용될 수 있다. 주형 DNA는 단일 염색체로부터 유래된 다수의 유전자좌를 포함할 수 있다. 주형 DNA는 상이한 염색체로부터 유래된 다수의 유전자좌를 포함할 수 있다. 주형 DNA 상의 관심있는 유전자좌는 하나의 반응에서 증폭될 수 있다. 대안으로, 주형 DNA 상에 있는 각각의 관심있는 유전자좌는 독립적인 반응에서 증폭될 수 있다. 증폭된 DNA는 절단에 앞서 모아질 수 있다. 관심있는 유전자좌를 함유한 표지된 각각의 DNA는 관심있는 유전자좌 서열을 결정하기에 앞서 분리될 수 있다. 한 구체예에서, 관심있는 유전자좌 중 적어도 하나는 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 돌연변이를 함유한 것으로 추정된다.
또 다른 구체예에서, 하나의 염색체 상의 관심있는 이형접합 유전좌자에 위치한 대립유전자의 비율은 상이한 염색체 상의 관심있는 이형접합성 유전자좌에 위치한 대립유전자의 비율에 비교된다. 비교될 수 있는 염색체에 관하여 제한이 있는 것은 아니다. 어떠한 염색체 상의 관심있는 이형접합성 유전자좌에 위치한 대립유전자의 비율도 어떤 다른 염색체 상의 이형접합성 유전자좌에 위치한 대립유전자의 비율에 비교될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 한 염색체 상의 관심있는 다수의 이형접합성 유전자좌에 위치한 대립유전자의 비율이 합계되어, 상이한 염색체 상의 관심있는 다수의 이형접합성 유전자좌에 위치한 대립유전자의 비율에 비교된다.
또 다른 구체예에서, 한 염색체 상의 관심있는 이형접합성 유전자좌에 위치한 대립유전자의 비율은 2, 3, 4 또는 4개 이상 염색체 상의 관심있는 이형접합성 유전자좌에 위치한 대립유전자의 비율에 비교된다. 또 다른 구체예에서, 한 염색체 상의 관심있는 다수의 유전자좌에 위치한 대립유전자의 비율은 2, 3, 4, 또는 4 이상 염색체 상의 관심있는 다수의 유전자좌에 위치한 대립유전자좌의 비율에 비교된다.
또 다른 구체예에서, 한 염색체 상의 관심있는 유전자좌에 위치한 대립유전자의 비율은 상이한 염색체 상의 관심있는 유전자좌에 위치한 대립유전자의 비율에 비교되는데, 여기에서 비율에서의 차이는 염색체 이상의 존재 또는 부재를 가리킨다. 또 다른 구체예에서, 한 염색체 상의 관심있는 다수의 유전자좌에 위치한 대립유전자의 비율은 상이한 염색체 상의 관심있는 다수의 유전자좌에 위치한 대립유전자의 비율에 비교되는데, 여기에서 비율에서의 차이점은 염색체 이상의 존재 또는 부재를 가리킨다.
또 다른 구체예에서, 임신한 자성의 샘플로부터 얻은 주형 DNA 상의 하나에서 수십 내지 수백에서 수천 개의 관심있는 유전자좌 서열이 결정된다. 한 구체예에서, 관심있는 유전자좌는 하나의 염색체 상에 있다. 또 다른 구체예에서, 관심있는 유전자좌는 다수의 염색체 상에 있다.
본 발명은 염색체 이상 및 돌연변이를 포함하는 유전적 장애의 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 태아 유래의 DNA 서열을 결정하기 위한, 신속하고 비-침습적인 방법을 제공한다. 방법은 태아에서 전위, 염기전환, 1염색체성, 3염색체성, 및 다른 이수체, 결실, 첨가, 증폭, 전위 및 재배열을 포함하는 염색체 이상의 검출에 특히 유용하다.
도 1A는 이중 나선 DNA 분자를 나타낸 개략도이다. 프라이머의 쌍은 굽은 화살표로 나타내고, 관심있는 유전자좌의 측면은 염기 N14에서 삼각형 기호로 나타낸다. 관심있는 유전자좌는 단일 뉴클레오티드 다형성, 점 돌연변이, 삽입, 결실, 전위 등일 수 있다. 각 프라이머는 제 1 프라이머에서 "a" 영역으로 나타내고 제 2 프라이머에서 "d" 영역으로 나타낸, 5' 말단으로부터 약 10 염기에 제한 효소 인식 부위를 포함한다. 제한효소 인식 부위 "a"는 어떠한 형태의 제한 효소를 위한 것일 수 있지만 인식 부위 "d"는 그것의 인식 부위로부터 "n" 뉴클레오티드를 절단하여 5' 돌출부를 남기고 3'말단이 함몰되도록 하는 제한 효소를 위한 것이다. 이러한 효소의 예는 BceAI 및 BsmFI을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 5' 돌출부는 3' 함몰 말단 내로 뉴클레오티드의 통합을 위한 주형으로서 작용한다.
제 1 프라이머는 정제를 위해 5' 말단에 비오틴으로 변형된다. 프라이머의 3'말단 서열은 프라이머가 관심있는 유전자좌의 상류 및 하류 쪽으로 원하는 거리에서 어닐링되는 것이다. 제 2 프라이머는 관심있는 유전자좌에 근접하여 어닐링되고; 영역 "c"로서 나타낸 어닐링 부위는 제 2 프라이머의 3'말단이 관심있는 유전자좌로부터 하나의 염기만큼 떨어져 어닐링되도록 디자인된다. 제 2 프라이머는 이 프라이머 상의 영역 "d"를 인식하는 제한 효소로의 절단이 관심있는 유전자좌를 포함하는 5' 돌출부를 생성하도록 제공되는 관심있는 유전자좌로부터 어떠한 거리에 어닐링될 수 있다. 영역 "b"로 나타낸 제 1 프라이머의 어닐링 부위는 약 20 염기이다.
도 1B는 PCR에 의한 증폭의 첫 번째 사이클 중 어닐링 및 확장 단계를 나타낸 개략도이다. 증폭의 첫번째 사이클은 대략 주형 DNA에 어닐링되는 제 2 프라이머 3' 영역의 용융 온도에서 수행되는데, 이 영역은 영역 "c"로서 나타내며 본 실시예에서는 13 염기 쌍이다. 이 온도에서, 제 1 및 제 2 프라이머 모두는 그들 각각의 상보적 가닥에 어닐링되고 확장을 시작하며, 점선으로 나타낸다. 첫번째 사이클에서, 제 2 프라이머가 확장되고 제 1 프라이머가 다음 사이클에서 어닐링될 수 있는 영역 b를 복제한다.
도 1C는 PCR 증폭의 두번째 사이클에서 변성 후 어닐링 및 확장 단계를 나타낸 개략도이다. 증폭의 두번째 사이클은 더 높은 어닐링 온도(TM2)에서 수행되는데, 이 온도는 대략 주형 DNA에 어닐링되는 제 1 프라이머의 영역 "b"로 나타낸 3'영역 20 bp의 용융 온도이다. 그러므로 TM2에서, 영역 b에 상보적인 영역 b'를 포함한 제 1 프라이머는 반응의 첫번째 사이클에서 복제되었던 DNA에 결합할 수 있다. 그러나, TM2에서 제 2 프라이머는 원래의 주형 DNA로 또는 반응의 첫번째 사이클에서 복제되었던 DNA에 어닐링될 수 없는데, 이것은 어닐링 온도가 너무 높기 때문이다. 제 2 프라이머는 원래의 주형 DNA 중 13 염기에 어닐링될 수 있지만 TM2는 20 염기의 대략적인 용융 온도에서 계산된다.
도 1D는 증폭의 세번째 사이클 중 변성 후 어닐링 및 확장 반응을 나타낸 개략도이다. 이 사이클에서, 어닐링 온도 TM3은 대략 영역 "c" 및 "d"를 포함하는, 완전한 제 2 프라이머의 용융 온도이다. "c"+"d"의 길이는 약 27-33 bp이므로, TM3는 TM1 및 TM2 보다 상당히 높다. 이러한 더 높은 TM에서, 영역 c' 및 d'를 포함하는 제 2 프라이머는 2번째 사이클에서 복제된 DNA에 어닐링된다.
도 lE는 증폭의 나머지 사이클을 위한 어닐링 및 확장 반응을 나타낸 개략도이다. 나머지 사이클에 대한 어닐링 온도는 TM3으로, 이것은 대략 전체 제 2 프라이머의 용융 온도이다. TM3에서, 제 2 프라이머는 영역 c' 및 d'를 포함하는 주형에 결합하고 제 1 프라이머는 영역 a' 및 b를 포함하는 주형에 결합한다. 처음 세 사이클에서 각 사이클의 어닐링 온도를 TM1, TM2, 및 TM3으로부터 연속적으로 상승시킴으로써, 비특이적 증폭이 상당히 감소된다.
도 IF는 증폭된 관심있는 유전자좌가 고체 매트릭스에 결합된 것을 나타낸 개략도이다.
도 1G는 증폭된 DNA를 제한 효소 "d"로 절단한 후 결합된 것을 나타낸 개략도이다. "하류" 말단은 상청액으로 방출되고, 어떤 적당한 완충액으로 세척함으로써 제거될 수 있다. 관심있는 유전자좌를 포함한 상류 말단은 고체 매트릭스에 결합된 채로 남아있다.
도 1H는 표지된 ddNTP로 "채우기" 후의, 결합된 증폭 DNA를 나타낸 개략도이다. DNA 중합효소는 관심있는 유전자좌 (N14)에 상보적인 염기 (N'14)에 "채우기"를 하는데 사용된다. 본 실시예에서, ddNTP 만이 이 반응에 존재하고, 관심있는 유전자좌 또는 관심있는 SNP 만이 채워진다.
도 1I는 제한 효소 "a"로 절단한 후의 표지된, 결합 DNA를 나타낸 개략도이다. 표지된 DNA는 상청액으로 방출되어, 통합되어 있는 염기를 식별하도록 수집될 수 있다.
도 2는 관심있는 각각의 유전자좌에 프라이머가 인접하도록 특이적으로 어닐링되는, n 개의 관심있는 유전자좌 및 n 개의 프라이머 쌍 (x1, y1부터 xn, yn)을 갖는 이중 가닥 DNA 주형을 나타낸 개략도이다. 제 1 프라이머는 ·으로 나타낸 5' 말단에 비오틴화되어 있고, 제한 효소 인식 부위 "a"를 포함하는데, 이 효소는 어떠한 형태의 제한 효소도 될 수 있다. 제 2 프라이머는 제한 효소 인식 부위 "d"를 포함하는데, 여기에서 "d"는 인식 부위로부터 "n" 개의 뉴클레오티만큼 떨어진 곳을 절단하고, 관심있는 유전자좌를 포함하는 5' 돌출부 및 함몰된 3'말단을 생성하는 제한 효소를 위한 인식 부위이다. 제 2 프라이머는 각각의 관심있는 유전자좌에 근접하여 어닐링된다. 제 2 프라이머에서 제한 효소 부위 "d"의 정확한위치는 제한 효소 "d"로 관심있는 각 유전자좌의 PCR 생산물을 절단하는 것이 관심있는 유전자좌를 함유한 5' 돌출부 및 3'함몰 말단을 생성하도록 디자인된다. 제 1 프라이머의 어닐링 부위는 약 20 염기의 길이이고 각각의 연속적인 제 1 프라이머가 각각의 제 2 프라이머로부터 더 멀리 떨어지도록 선택된다. 예를 들어, 1번 유전자좌에서 제 1 및 제 2 프라이머의 3'말단이 떨어져 있는 Z 염기 쌍이면, 2번 유전자좌에서는, 제 1 및 제 2 프라이머의 3'말단이 떨어져 있는 Z + K 염기 쌍인데, 여기에서, K = 1, 2, 3 또는 3 이상의 염기이다. 유전자좌 N을 위한 프라이머는 떨어져 있는 ZN-1+ K 염기 쌍이다. 각각의 연속하는 제 1 프라이머를 그들 각각의 제 2 프라이머와 더욱 떨어져 있게 만드는 목적은 (도 1B-II에서 설명된 것과 같이 증폭, 정제, 절단 및 표지된 후에 생성된) "채워진" 제한 절편이 크기에서 상이하고, 각각의 관심있는 개별적 유전자좌의 검출을 가능하도록 예를 들어 전기 영동법에 의해 분리될 수 있게 하는 것이다.
도 3은 다수의 어닐링 온도를 이용한 SNP의 PCR 증폭을 도시한다. 36명의 지원자로부터 유래된 게놈 DNA 주형을 포함한 샘플은 다음의 네 가지 SNP에 대하여 분석되었다 : SNP HC21500340 (1 레인), 사람 염색체 21 cSNP 데이터베이스에 지정된 것과 같은 식별 번호, 21번 염색체 상에 위치; SNP TSC 0095512 (2 레인), 1번 염색체 상의 위치, SNP TSC 0214366 (3 레인), 1번 염색체 상에 위치 ; 및 SNP TSC 0087315 (4 레인), 1번 염색체 상에 위치. 각 SNP는 세 가지 상이한 어닐링 온도 프로토콜을 사용하여 PCR에 의해 증폭되었고, 여기에서는 낮은 긴축 어닐링 온도;중간 긴축 어닐링 온도 ; 및 높은 긴축 어닐링 온도로서 지칭된다. 어닐링 온도 프로토콜에 관계없이, 각 SNP는 40 사이클의 PCR로 증폭되었다. 각 PCR 반응의 변성 단계는 30초 동안 95℃에서 수행되었다.
도 3A는 낮은 긴축 어닐링 온도 프로토콜을 이용한 4가지 상이한 SNP의 PCR 증폭을 설명한 겔 사진을 도시한다.
도 3B는 중간 긴축 어닐링 온도 프로토콜을 이용한 4가지 상이한 SNP의 PCR 증폭을 설명한 겔 사진을 도시한다.
도 3C는 높은 긴축 어닐링 온도 프로토콜을 이용한 4가지 상이한 SNP의 PCR 증폭을 설명한 겔 사진을 도시한다.
도 4A. 염색체 21에 위치한 사람 염색체 21 cSNP 데이터베이스에 의해 할당된, SNP HC21S00027의 DNA 서열의 묘사이다. 제 1 프라이머 및 제 2 프라이머는 상기 및 하기에 각각 나와있고, HC21S00027의 서열. 제 1 프라이머는 비오티닐화되고 EcoRI에 대한 제한 효소 인식 부위를 함유한다. 제 2 프라이머는 BsmF I에 대한 제한 효소 인식 부위를 함유하고 DNA 서열에 어닐링되는 13 염기를 함유한다. SNP은 R (A/G) 및 r (T/C) (R에 상보적)에 의해 표시된다.
도 4B. 염색체 21에 위치한 사람 염색체 21 cSNP 데이터베이스에 의해 할당된, SNP HC21S00027의 DNA 서열의 묘사이다. 제 1 프라이머 및 제 2 프라이머가 상기 및 하기에 각각 나와있다, HC21S00027의 서열. 제 1 프라이머는 비오티닐화되고 EcoRI에 대한 제한 효소 인식 부위를 함유한다. 제 2 프라이머는 BceA I에 대한 제한 효소 인식 부위를 함유하고 DNA 서열에 어닐링되는 13 염기를 가진다.SNP는 R (A/G) 및 r (T/C) (R에 상보적)에 의해 표시된다.
도 4C. 염색체 1로부터의 SNP TSC0095512의 DNA 서열의 묘사. 제 1 프라이머 및 제 2 프라이머는 상기 및 하기에 각각 나타나있다, TSC0095512의 서열. 제 1 프라이머는 비오티닐화되고 EcoRI에 대한 제한 효소 인식 부위를 함유한다. 제 2 프라이머는 BsmF I에 대한 제한 효소 인식 부위를 함유하고 DNA 서열에 어닐링되는 13 염기를 가진다. SNP는 S (G/C) 및 s (C/G) (S에 상보적)에 의해 표시된다 .
도 4D. 염색체 1로부터의 SNP TSC0095512의 DNA 서열의 묘사. 제 1 프라이머 및 제 2 프라이머는 상기 및 하기에 각각 나타나있다, TSC0095512의 서열. 제 1 프라이머는 비오티닐화되고 EcoRI에 대한 제한 효소 인식 부위를 함유한다. 제 2 프라이머는 BceA I에 대한 제한 효소 인식 부위를 함유하고 DNA 서열에 어닐링되는 13 염기를 가진다. SNP는 S (G/C) 및 s (C/G) (S에 상보적)에 의해 표시된다.
도 5A-5D. 도 4A-4D에 기술된 프라이머로 증폭 후에 SNP HC21S00027 (도 5A 및 5B) 및 SNP TSC0095512 (도 5C 및 5D)의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 개략도. 프라이머 서열에서의 인식 부위가 굵게 표시되어 있다.
도 6A-6D. 적당한 타입 US 제한 효소로 절단한 후에 각각 증폭된 SNP의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 개략도. 도 6A 및 6B는 각각 IIS 형 제한 효소 BsmF I 및 BceA I로 절단된 SNP HC21500027의 단편들을 나타낸다. 도 6C 및 6D는 각각 IIS 형 제한 효소 BsmF I 및 BceA I로 절단된, SNP TSC0095512의 단편들을 나타낸다.
도 7A-7D. 3'함몰된 말단을 "채우기 " 위한 주형으로서 절단된 SNP 부위의 5' 돌출부를 사용하는 형광 표지된 뉴클레오티드 혼합을 나타내는 개략도. 도 7A및 7B는 통합 표지된 ddNTP (*R-dd= 형광 디데옥시 뉴클레오티드)로 절단된 SNP HC21 S00027 유전자좌를 나타낸다. 도 7C 및 7D는 통합 표지된 ddNTP (*S-dd= 형광 디데옥시 뉴클레오티드)으로 절단된 SNP TSC0095512 유전자좌를 나타낸다. ddNTPs의 사용은 3'함몰된 말단이 관심있는 뉴클레오티드 또는 5' 돌출부에 존재하는 SNP 부위에 상보적인 하나의 뉴클레오티드에 의해 확장되는 것을 보장한다.
도 7E. SNP 부위를 함유하는 5' 돌출부 안으로의 dNTPs 및 a ddNTP의 편입을 나타내는 개략도. SNP HC21S00007는 BsmF I으로 절단되었고, 이것은 4개의 염기 5' 돌출부를 발생시킨다. dNTPs과 ddNTPs의 혼합물의 사용은 3'함몰된 말단이 하나의 뉴클레오티드 (dNTP이 먼저 통합된다) ; 두개의 뉴클레오티드 (dNTP는 ddNTP 다음에 통합된다) ; 세개의 뉴클레오티드 (두개의 dNTP는 ddNTP 다음에 통합된다) ; 또는 네개의 뉴클레오티드(세개의 dNTP는 ddNTP 다음에 통합된다)가 연장하도록 허용한다. 모든 네개의 생성물은 크기에 의해 분리될 수 있고, 통합된 뉴클레오티드 검출된다(*R-dd= 형광 디데옥시 뉴클레오티드). SNP 또는 유전자좌 부위에 해당하는 제 1 뉴클레오티드의 검출, 및 다음의 세개의 뉴클레오티드는 추가의 수준의 특질 보장을 제공한다. SNP는 R (A/G) 및 r (T/C) (R에 상보적)에 의해 표시된다.
도 8A-8D. 고체 지지 매트릭스, 즉 스트렙타비딘 코팅된 웰로부터 "채워진" SNP의 방출. HC21S00027은 도 8A 및 8B에 나와있는 반면, SNP TSC0095512은 도 8C 및 8D에 나와있다. "채워진" SNP은 용액중에서 자유롭고, 검출될 수 있다.
도 9A. BceAI로 절단된 SNP HC21S00027의 서열결정. 네개의 "채우기" 반응이 나와있다; 각각의 반응은 하나의 형광 표지된 뉴클레오티드, ddGTP, ddATP, ddTTP, 또는 ddCTP, 및 미표지된 ddNTP를 함유하였다. BceA I로 절단에 의해 발생된 5' 돌출부 및 이 SNP 부위에 있는 예상된 뉴클레오티드가 나타나있다.
도 9B. SNP TSC0095512의 서열결정. SNP TSC0095512은 BceA I에 대한 인식 부위를 함유한 제 2 프라이머로 그리고 개별적인 반응에서, BsmF I에 대한 인식 부위를 함유한 제 2 프라이머로 증폭된다. 네개의 채우기 반응은 각각의 PCR 생산물에 대해 나와있다; 각각 반응은 하나의 형광 표지된 뉴클레오티드, ddGTP, ddATP, ddTTP, 또는 ddCTP, 및 미표지된 ddNTP를 함유한다. BceA I 및 BsmF I로 절단에 의해 발생된 5' 돌출부 및 예상된 뉴클레오티드가 표시되어 있다.
도 9C. BsmF I에 대한 인식 부위를 함유한 제 2 프라이머로 증폭 후에 SNP TSC0264580의 서열결정. 네개의 채우기 반응이 나와있다; 각각의 반응은 하나의 형광 표지된 뉴클레오티드를 함유하고, 이것은 ddGTP, ddATP, ddTTP, 또는 ddCTP 및 미표지된 ddNTP였다. 두개의 다른 5' 돌출부들이 표시되어 있다: 하나는 센스 가닥에서 멀리있는 11 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥에서 멀리있는 15 뉴클레오티드로 절단된 DNA 분자를 나타내고 나머지는 센스 가닥에서 멀리있는 10 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥에서 멀리 있는 14 뉴클레오티드로 절단된 DNA 분자를 나타낸다. 예상된 뉴클레오티드도 또한 표시된다.
도 9D. BsmF 1에 대한 인식 부위를 함유한 제 2 프라이머로 증폭된 SNP HC21 S00027의 서열결정. 표지된 ddNTPs 및 미표지된 dNTPs의 혼합물은 BsmF I으로 절단에 의해 발생된 5' 돌출부를 채우기 위해 사용되었다. 두개의 다른 5' 돌출부가 기술되어 있다: 하나는 센스 가닥에서 멀리있는 11 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥에 멀리있는 15 뉴클레오티드로 절단된 DNA 분자를 나타내고 나머지는 센스 가닥에 멀리있는 10 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥에 멀리있는 14 뉴클레오티드로 절단된 DNA 분자를 나타낸다. SNP으로부터의 뉴클레오티드, SNP 부위에서의 뉴클레오티드 (샘플은 36 개체로부터의 DNA 주형을 함유하였고 ; 두 뉴클레오티드 모두 샘플에서 나타낼 것으로 기대될 것이다), 및 SNP의 세개의 뉴클레오티드 하류가 표시되어 있다.
도 10. 염색체 21에 위치한 다중 SNPs의 서열결정. SNPs HC21S00131, 및 HC21S00027, 및 염색체 1위에 있는 SNPs TSC0087315, SNP TSC0214366, SNP TSC0413944, 및 SNP TSC0095512은 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유한 제 2 프라이머와의 개별적인 PCR 반응에서 증폭되었다. 프라이머는 각각 증폭된 관심있는 유전자좌가 다른 크기이도록 디자인되었다. 증폭 후에, 반응은 단일 샘플 및 그 샘플에서 수행된 방법의 모든 후속 단계에서 모아졌다(도 lF-lI에 대해 기술된 바와 같음). 각각의 SNP 및 각각의 SNP에서 발견된 뉴클레오티드가 표시되어 있다.
도 11. 모체 혈액 중의 태아 DNA의 백분율의 정량.
혈액은 동의서에 승인한 임신한 여성으로부터 얻어졌다. DNA를 분리하였고 일련의 희석을 실행하여 샘플에 존재하는 태아 DNA의 백분율을 결정하였다. 염색체 Y에 위치하는 SRY 유전자는 태아 DNA를 검출하는데 사용되었다. 염색체 7에 위치하는 낭포성 섬유증 유전자는 모성 및 태아 DNA 둘다를 검출하는데 사용되었다.
도 11 A. EDTA로 처리된 혈액 샘플로부터 분리된 DNA 주형을 사용하는 SRY유전자 및 낭포성 섬유증 유전자의 증폭.
도 11B. 포르말린 및 EDTA로 처리된 혈액 샘플로부터 분리된 DNA 주형을 사용하는 SRY 유전자 및 낭포성 섬유증 유전자의 증폭.
도 12. 3염색체성 21 (다운 증후군)으로 이전에 유전형결정된 개체의 유전자 분석. 이전에 3염색체성 21로 유전형된 동의서에 승인한 개체로부터의 혈액을 수집하였다. DNA는 분리되었고, 염색체 21에서의 두개의 SNPs 및 염색체 13에서의 두개의 SNPs는 유전형결정되었다. 겔의 사진에서 나타낸 바와 같이, 염색체 21에서의 SNPs은 두개의 뉴클레오티드 불균형한 비율이었다. 겔의 시각적 검사는 염색체 21에 대해 분석된 SNP 부위에서의 두개의 뉴클레오티드중 하나의 뉴클레오티드가 더욱 강도가 크다는 것을 증명하고, 그것이 50 : 50 비율로 존재하지 않는다는 것을 암시한다. 그러나, 겔의 시각적 검사는 염색체 13에서 분석된 이형접합체 SNP 부위에서의 뉴클레오티드가 예상된 50 : 50 비율로 존재한다는 것을 암시한다.
도 13. 하나의 형광 표지된 뉴클레오티드를 사용하는 SNPs TSC0837969, TSC0034767, TSC1130902, TSC0597888, TSC0195492, TSC0607185의 두 대립유전자의 서열 결정. 표지된 ddGTP는 BsmF I로의 절단에 의해 발생된 돌출부를 채우기 위해 미표지된 dATP, dCTP, dTTP의 존재하에서 사용되었다. 채워진 가닥에서의 가변부를 선행하는 뉴클레오티드는 구아닌이 아니었고, 채워진 가닥에서 가변부 후의 뉴클레오티드는 구아닌이 아니었다. 채워진 가닥에서 가변부 후의 뉴클레오티드 두개의 염기는 구아닌이었다. 가변부에서 구아닌을 함유하는 대립유전자는 표지된 ddGTP로 채워진다. 구아닌을 함유하지 않는 대립유전자는 미표지된 dATP, dCTP,또는 dTTP로 채워지고, 중합효소는 돌출부에 상보적인 위치 3에서 표지된 ddGTP가 채워질때까지 계속해서 뉴클레오티드를 통합시킨다.
도 14. 개체군 내에서 가변적인 대립유전자로 SNPs의 확인. 염색체 13에 위치한 7 SNPs의 두개의 대립유전자의 서열은 245명의 개체로부터 얻어진 DNA로 구성된 주형 DNA를 사용하여 결정되었다. 표지된 ddGTP는 BsmF I로의 절단에 의해 발생된 돌출부를 채우기 위해 미표지된 dATP, dCTP, dTTP의 존재하에서 사용되었다. 채워진 가닥에서 가변부를 선행하는 뉴클레오티드는 구아닌이 아니었고, 채워진 가닥에서 가변부 후의 뉴클레오티드는 구아닌이 아니었다. 채워진 가닥에서 가변부 후에 뉴클레오티드 두개의 염기는 구아닌이었다. 가변부에서 구아닌을 함유하는 대립유전자는 표지된 ddGTP로 채워진다. 구아닌을 함유하지 않는 대립유전자는 미표지된 dATP, dCTP, 또는 dTTP로 채워지고, 중합효소는 돌출부에 상보적인 위치 3 에서 표지된 ddGTP가 채워질때까지 계속해서 뉴클레오티드를 통합시킨다.
도 15. 이형접합성 SNPs에서 하나의 대립유전자에서 나머지 대립유전자에 대한 비율의 결정. SNP TSC0607185에 대해 관찰된 뉴클레오티드는 센스 가닥에서 시토신(대립유전자 1이라 부름) 및 티미딘(대립유전자 2라 부름)이다. 대립유전자 2 대 대립유전자 1의 비는 5명의 개체로부터 분리된 주형 DNA를 사용하여 계산되었다. 대립유전자 2 대 대립유전자 1 (대립유전자 2/대립유전자 1)의 비는 시종일관 1 : 1이었다.
SNP TSC1130902에 대해 관찰된 뉴클레오티드는 센스 가닥에서 구아닌 (대립유전자 1이라 명명) 및 아데닌 (대립유전자 2이라 명명)이다. 대립유전자 2 대 대립유전자 1의 비는 5명의 개체로부터 분리된 주형 DNA로부터 계산되었다. 대립유전자 2 대 대립유전자 1(대립유전자 2/대립유전자l)의 비는 시종일관 75 : 25이었다.
도 16. SNP TSCO 108992에서의 대립유전자 2 대 대립유전자 1의 비율은 염색체 21의 여분의 복제물을 함유하는 주형 DNA에서 계산될 때 선형으로 남아있다.
SNP TSC0108992는 네명의 개체로부터의 주형 DNA를 사용하여 증폭되었고, 두개의 개별적인 채우기 반응(A 및 B로서 표지)은 각각 PCR 반응 (표지 1 내지 4)에 대해 수행되었다. 정상 개체로부터의 주형 DNA에서의 대립유전자 2 대 대립유전자 1의 계산된 비율은 0.47이었다. 0. 50의 이론적으로 예측된 비율로부터의 편차는 다운 증후군을 갖는 개체로부터 분리된 주형 DNA에서 선형으로 남아있었다.
도 17A. SNP 염색체 21에 위치한 정상 유전자 핵형을 갖는 개체로부터 분리된 주형 DNA의 분석. SNP TSC0108992은 여기서 기술된 방법을 사용하여 증폭되었고, IIS 형 제한 효소 BsmF I으로 절단된 후에, 5' 돌출부는 표지된 ddTTP, 및 미표지된 dATP, dCTP, 및 dGTP를 사용하여 채워진다. 세개의 개별적인 PCR 반응이 수행되었고, 및 각각 PCR 반응은 두개의 샘플으로 분리되었다. 대립유전자 2 대 대립유전자 1 (대립유전자 2/ (대립유전자 2 + 대립유전자 1))의 비율이 계산되었고, 이것은 평균 0.50이였다. 다
도 17B. 3염색체성 21 유전자 핵형을 갖는 개체로부터 분리된 주형 DNA으로부터 염색체 21에 위치한 SNP의 분석. SNP TSC0108992는 여기서 기술된 방법을 사용하여 증폭되었고, IIS 형 제한 효소 BsmF I로 절단후에, 5' 돌출부는 표지된 ddTTP, 및 미표지된 dATP, dCTP, 및 dGTP를 사용하여 채워졌다. 세개의 개별적인PCR 반응을 수행하였고, 각각 PCR 반응은 두개의 샘플로 분리되었다. 대립유전자 2 대 대립유전자 1 (대립유전자 2/ (대립유전자 2 + 대립유전자 1))의 비율을 계산하였고, 이것은 평균 0.30이였다.
도 17C. 3: 1 (3염색체성 21: 정상)의 비로 3염색체성 21를 갖는 개체로부터의 주형 DNA, 및 정상 유전자 핵형을 갖는 개체로부터의 주형 DNA으로 구성된 혼합물로부터 염색체 21에 위치한 SNP의 분석. SNP TSC0108992은 여기서 기술된 방법을 사용하여 주형 DNA 의 혼합물로부터 증폭되었고, IIS 형 제한 효소 BsmF 1로의 절단후에, 5' 돌출부는 표지된 ddTTP, 및 미표지된 dATP, dCTP, 및 dGTP를 사용하여 채워졌다. 세개의 개별적인 PCR 반응은 수행되었고, 및 각각 PCR 반응은 두개의 샘플로 나뉘어졌다. 대립유전자 2 대 대립유전자 1 (대립유전자 2/ (대립유전자 2 + 대립유전자 1))의 비율이 계산되었고, 이것은 평균 0.319이였다.
도 17D. 1 : 1 (3염색체성 21 : 정상)의 비율로 3염색체성 21을 갖는 개체로부터의 주형 DNA, 및 정상 유전자 핵형을 갖는 개체로부터의 주형 DNA로 구성되는 혼합물로부터 염색체 21에 위치한 SNP의 분석. SNP TSC0108992은 여기서 기술된 방법을 사용하여 DNA 주형의 혼합물로부터 증폭되었고, IIS 형 제한 효소 BsmF I로의 절단후에, 5' 돌출부는 표지된 ddTTP, 및 미표지된 dATP, dCTP, 및 dGTP를 사용하여 채워졌다. 세개의 개별적인 PCR 반응을 수행하였고, 각각 PCR 반응은 두개의 샘플로 분리되었다. 대립유전자 2 대 대립유전자 1 (대립유전자 2/ (대립유전자 2 + 대립유전자 1))의 비율이 계산되었고, 이것은 평균 0.352였다.
도 17E. 3염색체성 21를 갖는 개체로부터의 주형 DNA, 및 정상 유전자 핵형을 갖는 개체로부터의 주형 DNA기 1: 2.3 (3염색체성 21: 정상)의 비로 구성된 혼합물로부터 염색체 21에 위치한 SNP의 분석. SNP TSC0108992는 여기서 기술된 방법을 사용하여 주형 DNA의 혼합물로부터 증폭되고, 타입 US 제한 효소 BsmF I로의 절단 후에, 5' 돌출부는 표지된 ddTTP, 및 미표지된 dATP, dCTP, 및 dGTP를 사용하여 채워졌다. 세개의 개별적인 PCR 반응을 수행하였고, 각각 PCR 반응은 두개의 샘플로 나누었다. 대립유전자 2 대 대립유전자 1 (대립유전자 2/ (대립유전자 2 + 대립유전자 1))의 비율이 계산되었고, 이것은 평균 0.382였다.
도 17F. 3염색체성 21을 갖는 개체로부터 주형 DNA, 및 정상 유전자 핵형을 갖는 개체로부터의 주형 DNA로 1: 4 (3염색체성 21: 정상)의 비로 구성된 혼합물로부터 염색체 21에 위치한 SNP의 분석. SNP TSC0108992는 여기서 기술된 방법을 사용하여 주형 DNA의 혼합물로부터 증폭되고, IIS 형 제한 효소 BsmF I으로 절단후에, 5' 돌출부는 표지된 ddTTP, 및 미표지된 dATP, dCTP, 및 dGTP를 사용하여 채워졌다. 세개의 개별적인 PCR 반응을 수행하였고, 각각의 PCR 반응은 두개의 샘플로 나뉘었다. 대립유전자 2 대 대립유전자 1 (대립유전자 2/ (대립유전자 2 + 대립유전자 1))의 비율을 계산하였고, 이것은 평균 0.397이였다.
도 18A. 주형 DNA으로부터 증폭된 9개 (9) SNPs의 아가로스 겔 분석.
9개 SNPs의 각각은 여기서 기술된 방법을 사용하여 유전자 DNA으로부터 증폭되었다.
레인 1은 SNP TSC0397235에 해당하고, 레인 2은 TSC0470003에 해당하고, 레인 3은 TSC 1649726에 해당하고, 레인 4은 TSC1261039에 해당하고, 레인 5은TSC0310507에 해당하고, 레인 6은 TSC1650432에 해당하고, 레인 7은 TSC1335008, 레인 8은 TSC0128307에 해당하고 레인 9은 TSC0259757에 해당한다.
도 18B. 본래의 주형 DNA는 염색체 13위의 다양한 영역에 어닐링된 12 염기 프라이머를 사용하여 증폭되었다. 100 다른 프라이머 세트는 염색체 13을 통해 영역을 증폭하는데 사용되었다. 9 SNPs의 각각에 대해서, 관심있는 유전자좌로부터의 대략 130 염기 및 관심있는 유전자좌의 130 염기 하류에 어닐링한 프라이머가 사용되었다. 총 100 다른 프라이머 세트를 함유한 이러한 증폭 반응은 관심있는 유전자좌를 함유하는 영역을 증폭하는데 사용되었다. 결과의 PCR 생산물은 이어지는 PCR 반응에서 사용되었고, 여기서 9 SNPs의 각각은 제 1 프라이머 및 제 2 프라이머를 사용하여 개별적으로 증폭되었고, 이때 제 2 프라이머는 IIS 형 제한 효소 BsmF I에 대한 결합 부위를 함유하였다. SNPs는 도 18A에서와 동일한 순서로 로딩되었다.
도 19A. 본래의 주형 DNA (IA) 및 다중화 주형 DNA(M1-M3)에서 SNP TSC047003에 대한 대립유전자 2 대 대립유전자 1 의 백분율의 정량. 이때 DNA는 관심있는 유전자좌의 상류 및 하류에서 150 염기에 어닐링한 12 염기 프라이머를 사용하여 먼저 증폭되었다. 그후, 세개의 개별적인 PCR 반응을 제 1 및 제 2 프라이머를 사용하여 다중화 주형 DNA위에서 수행하였다.
도 19B. 본래의 주형 DNA (IA) 및 다중화 주형 DNA(M1-M3)에서 SNP TSC1261039에 대한 대립유전자 2 대 대립유전자 1의 백분율의 정량. 여기서 DNA 는 관심있는 유전자좌의 상류 및 하류에서 150 염기를 어닐링한 12 염기 프라이머를사용하여 먼저 증폭되었다. 그후, 세개의 개별적인 PCR 반응을 제 1 및 제 2 프라이머를 사용하여 다중화 주형 DNA위에서 수행하였다.
도 19C. 본래의 주형 DNA (IA) 및 다중화 주형 DNA(M1-M3)에서 SNP TSC310507에 대한 대립유전자 2 대 대립유전자 1의 백분율의 정량. 여기서 DNA는 관심있는 유전자좌의 상류 및 하류에서 150 염기를 어닐링한 12 염기 프라이머를 사용하여 먼저 증폭되었다. 그후, 세개의 개별적인 PCR 반응을 제 1 및 제 2 프라이머를 사용하여 다중화 주형 DNA에서 수행하였다.
도 19D. 본래의 주형 DNA (IA) 및 다중화 주형 DNA(M1-M3)에서 SNP TSC1335008에 대한 대립유전자 2 대 대립유전자 1의 백분율의 정량. 여기서 DNA는 관심있는 유전자좌의 상류 및 하류에서 150 염기를 어닐링한 12 염기 프라이머를 사용하여 먼저 증폭되었다. 그후, 세개의 개별적인 PCR 반응을 제 1 및 제 2 프라이머를 사용하여 다중화 주형 DNA에서 수행하였다.
도 20. 임신한 여성으로부터 분리한 혈장 DNA 로부터의 태아 DNA의 검출. 모계 DNA이 동종접합 네개의 SNP를 혈장 DNA에서 분석하였다. 모계 DNA는 TSC0838335 (레인 1)에서 아데닌에 대해 동종접합성이었던 반면, 혈장 DNA는 이형접합성 패턴(레인 2)을 나타내었다. 태아 DNA에서 나타난 구아닌 대립유전자는, 모체의 신호와 분명히 구별되었다. 모계 DNA 및 혈장 DNA 모두는 TSC0418134 (레인 3 및 4)에서의 아데닌에 대해 동종접합성이었다. 모계 DNA는 TSC0129188 (레인 5)에서의 구아닌에 대해 동종접합성인 반면, 혈장 DNA는 이형접합성 패턴 (레인 6)을 나타내었다. 아데닌 대립유전자는 태아 DNA를 나타내었다. 모계 DNA 및 혈장 DNA 모두는TSC0501389 (레인 7 및 8)에서의 아데닌에 대해 동종접합성이었다.
본 발명은 돌연변이, 삽입, 결실, 및 염색체 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유전적 장애를 검출하는 방법을 제공하며, 태아의 유전 이상의 검출에 특히 유용하다. 방법은 전위, 첨가, 증폭, 염기전환, 역위, 이수체, 다수체, 1염색체성, 3염색체성, 21번 3염색체, 13번 3염색체, 14번 3염색체성, 15번 3염색체성, 16번 3염색체성, 18번 3염색체성, 22번 3염색체성, 삼수체, 사수체, 및 XO, XXY, XYY, 및 XXX를 포함하는 성염색체 이상의 검출에 특히 유용하다. 방법은 또한 태아 DNA의 서열을 결정하기 위한 비-침습적 기술을 제공한다.
본 발명은 염색체 이상을 검출하는 방법으로 지시되며, 방법은 : (a) 주형 DNA 상의 관심있는 유전자좌의 대립유전자 서열을 결정하는 단계; 및 (b) (a)의 관심있는 유전자좌로부터 동정된 관심있는 이형접합성 유전자좌에 위치한 대립유전자의 비율을 정량하는 단계를 포함하는데, 여기에서 상기 비율은 염색체 이상의 존재 또는 부재를 가리킨다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 태아 DNA 상의 관심있는 유전자좌의 서열을 결정하는 비-침습적 방법을 제공하는데, 상기 방법은: (a) 임신한 여성으로부터 샘플을 획득하는 단계; (b) (a)의 샘플에 세포 용해 저해제를 첨가하는 단계; (c) (b)의 샘플로부터 주형 DNA를 획득하는 단계 (여기에서, 상기 주형 DNA는 태아 DNA 및 모친의 DNA를 포함한다); 및 (d) 주형 DNA 상의 관심있는 유전자좌의 서열을 결정하는 단계를 포함한다.
DNA 주형
"관심있는 유전자좌"는 핵산의 더 큰 영역 내에 있는 선택된 핵산 영역을 의미한다. 관심있는 유전자좌는 1-100, 1-50, 1-20, 또는 1-10 뉴클레오티드, 바람직하게는 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 또는 1 뉴클레오티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
여기에서 사용될 때, "대립유전자"는 한 염색체 상에서 동일한 위치를 점유하고 있는 DNA의 유전자 또는 비-암화화 영역의 몇몇 엇갈린 형태 중 하나이다. 용어 대립유전자는 박테리아, 바이러스, 균류, 원생동물, 곰팡이, 효모, 식물, 사람, 비-사람, 동물 및 고세균을 포함하지만 이에 제한되지 않는 어떤 생물로부터 유래한 DNA를 설명하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 박테리아는 전형적으로 하나의 거대한 DNA 가닥을 갖는다. 박테리아 DNA에 있어서 용어 대립유전자는 하나의 세포에서 발견되는 유전자의 형태를 지칭하는 것으로 이 유전자는 동일한 종의 다른 박테리아 세포에 있는 동일한 유전자 형태와 비교된다.
대립유전자는 동일한 서열을 가질 수 있고 또는 단일 뉴클레오티드 또는 하나 이상의 뉴클레오티드에서 변화할 수 있다. 각 염색체의 두 복제물을 갖는 생물에 있어서, 두 염색체 모두가 동일한 대립유전자를 갖는다면, 상태는 동형접합성으로 지칭된다. 두 염색체에 존재하는 대립유전자가 상이하다면, 상태는 이형접합성으로 지칭된다. 예를 들어, 관심있는 유전자좌가 1번 염색체 상의 SNP X이고, 모친의 염색체가 SNP X에 아데닌을 함유하며 (A 대립유전자) 부친의 염색체가 SNP X에 구아닌을 함유하면 (G 대립유전자), 개체는 SNP X에서 이형접합성이다.
여기에서 사용될 때, 염기 서열은 하나의 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 연속적인 뉴클레오티드의 동일성을 의미한다. 단일 뉴클레오티드의 경우 (예를 들어, SNP), 여기에서 "염기 서열" 및 "동일성"은 호환적으로 사용된다.
용어 "염색체 이상"은 대상 염색체와 정상 동형접합성 염색체 구조간의 일탈로 지칭된다. 용어 "정상"은 특별한 종의 건강한 개체에서 발견되는 우세한 핵형 또는 결합 패턴을 지칭한다. 염색체 이상은 숫적 또는 구조적일 수 있으며, 이수체, 다수체, 역위, 3염색체성, 1염색체성, 중복, 결실, 염색체 일부의 결실, 첨가, 염색체 일부의 첨가, 삽입, 염색체의 절편, 염색체의 영역, 염색체 재배열, 및 전위를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 염색체 이상은 병적 상태의 존재 또는 병적 상태를 발생시키는 경향과 상호연관될 수 있다. 여기에서 정의된 것과 같이, 단일 뉴클레오티드 다형성 ("SNP")은 염색체 이상이 아니다.
개체에 관하여 여기에서 사용될 때, "돌연변이체 대립유전자"는 질병 상태와 연관된 변이 대립유전자를 지칭한다.
용어 "주형"은 본 발명의 증폭에 사용될 수 있는 어떠한 핵산 분자를 지칭한다. 자연적으로는 이중 가닥이 아닌 RNA 또는 DNA가 주형 DNA로 사용되도록 이중 가닥 DNA로 만들어질 수 있다. 어떠한 이중 가닥 DNA 또는 다수의 상이한 이중 가닥 DNA 분자를 함유한 제제는 주형 DNA에 포함된 관심있는 유전자좌 또는 유전자좌군을 증폭하는 주형 DNA로서 사용될 수 있다.
주형 DNA는 사람, 비-사람, 포유류, 파충류, 소, 고양이, 개, 염소, 돼지, 원숭이, 유인원, 고릴라, 황소, 젖소, 곰, 말, 양, 가금, 마우스, 래트, 물고기, 돌고래, 고래, 및 상어를 포함하지만 이에 제한되지 않는 어떠한 공급원으로부터 획득될 수 있다.
주형 DNA는 조직의 핵산-함유 샘플, 체액(예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 눈물, 복막액, 복수, 질 분비액, 림프액, 뇌척수액 또는 점막 분비액), 제대혈, 융모막 융모, 양수, 배아, 2-세포기 배아, 4-세포기 배아, 8-세포기 배아, 16-세포기 배아, 32-세포기 배아, 64-세포기 배아, 128-세포기 배아, 256-세포기 배아, 512-세포기 배아, 1024-세포기 배아, 배아 조직, 림프액, 뇌척수액, 점막 분비액, 또는 다른 체삼출물, 대변 물질, 그리고 이러한 공급원과 동일한 핵산을 함유하고 있는 개별적인 세포 또는 추출물, 및 당업계에 주지된 방법을 이용한 세포내 구조물(예를 들어, 미토콘드리아)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 어떤 적절한 샘플로부터 유래할 수 있다.
한 구체예에서, 주형 DNA는 임신한 자성의 샘플로부터 얻을 수 있다.
또 다른 구체예에서, 주형 DNA는 배아로부터 얻을 수 있다. 바람직한 구체예에서, 주형 DNA는 배아의 단일 세포로부터 얻을 수 있다.
한 구체예에서, 주형 DNA 태아 DNA이다. 태아 DNA는 모계 혈액, 모계 혈청, 모계 혈장, 태아 세포, 제대혈, 융모막 융모, 양수, 세포 또는 조직을 포함하지만 이에 제한되지 않는 공급원으로부터 얻을 수 있다.
또 다른 구체예에서, 포름알데히드, 포름알데히드의 유도체, 포르말린, 글루타르알데히드, 글루타르알데히드의 유도체, 1차 아민 반응성 가교제, 설프히드릴 반응성 가교제, 설프히드릴 첨가제 또는 디설피드 환원제, 탄수화물 반응성 가교제, 카르복실 반응성 가교제, 광반응성 가교제, 절단가능 가교제, AEDP, APG, BASED, BM (PEO) 3, BM (PEO) 4, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BS3, BSOCOES, DFDNB, DMA, DMP, DMS, DPDPB, DSG, DSP, DSS, DST, DTBP, DTME, DTSSP, EGS, HBVS, sulfo-BSOCOES, Sulfo-DST, 또는 Sulfo-EGS를 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포 용해 저해제가 샘플에 첨가된다. 또 다른 구체예에서, 2, 3, 4, 5 또는 5 이상의 세포 용해 저해제가 샘플에 첨가될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 주형 DNA는 모계 DNA 및 태아 DNA 모두를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 주형 DNA는 임신한 자성의 혈액으로부터 획득된다. 혈액은 정맥천자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 혈액-채취를 위한 어떤 표준 기술을 사용하여 수집된다. 예를 들어, 혈액은 팔꿈치 안쪽 또는 손의 뒷면의 정맥으로부터 채취될 수 있다. 혈액 샘플은 태아 임신 중 어느 시기에서든 임신한 자성으로부터 수집될 수 있다. 예를 들어, 혈액은 사람 여성으로부터 태아 임신 1-4, 4-8, 8-12, 12-16, 16-20, 20-24, 24-28, 28-32, 32-36, 36-40, 또는 40-44 주, 및 바람직하게는 태아 임신 8-28 주 사이에 수집될 수 있다.
혈액 샘플은 모계 세포로부터 혈장을 분리하기 위해 원심분리된다. 혈장 및 모계 세포 부분은 별개의 반응관으로 옮겨져 재-원심분리된다. 혈장 부분은 무세포 태아 DNA 및 모계 DNA를 함유한다. 어떠한 표준 DNA 분리 기술이 태아 DNA 및 모계 DNA를 분리하는데 사용될 수 있고 QIAGEN에서 제공되는 QIAamp DNA 혈액 미디키트(카탈로그 번호 51183)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
바람직한 구체예에서, 혈액은 EDTA를 포함하지만 이에 제한되지 않는 마그네슘 킬레이터를 포함하는 기구 내로 수집될 수 있고, 4℃에서 저장된다. 임의적으로, EGTA를 포함하되 이에 제한되지 않는 칼슘 킬레이터가 첨가될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 포름알데히드, 포름알데히드 유도체, 포르말린, 글루타르알데히드, 글루타르알데히드 유도체, 1차 아민 반응성 가교제, 설프히드릴 반응성 가교제, 설프히드릴 첨가제 또는 디설피드 환원제, 탄수화물 반응성 가교제, 카르복실 반응성 가교제, 광반응성 가교제, 절단가능 가교제, AEDP, APG, BASED, BM (PEO) 3, BM (PEO) 4, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BS3, BSOCOES, DFDNB, DMA, DMP, DMS, DPDPB, DSG, DSP, DSS, DST, DTBP, DTME, DTSSP, EGS, HBVS, sulfo-BSOCOES, Sulfo-DST, 또는 Sulfo-EGS를 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포 용해 저해제가 샘플에 첨가된다.
또 다른 구체예에서, 주형 DNA는 임신한 자성 혈액의 혈장 또는 혈청으로부터 획득된다. 모계 혈장 내 태아 DNA의 비율은 0.39 내지 11.9%이다 (Pertl, and Bianchi, Obsteirics and Gynecology 98 : 483-490 (2001)). 혈장 샘플 내 DNA의 대부분은 모친의 것이며, 이것은 태아의 유전자형 분석에 DNA를 사용하는 것을 어렵게 한다. 그러나, 모계 혈장 내 태아 DNA의 비율을 증가시키는 방법은 태아 DNA의 서열을 결정하는 것을 허용하며, 돌연변이, 삽입, 결실, 및 염색체 이상을 포함하는 유전적 이상의 검출을 허용한다. 모계 혈액 샘플에 세포 용해 저해제를 첨가하는 것은 태아 DNA의 상대적 비율을 증가시킬 수 있다. 모계 및 태아 세포 모두의 용해가 저해됨에도 불구하고, 세포의 대다수는 모계의 것이며, 유리된 태아 DNA의 비율이 상대적으로 증가한다. 실시예 4를 참조한다.
또 다른 구체예에서, 큰 보어(boar) 바늘, 짧은 바늘, 층류를 증가시키는 바늘 코팅(예를 들어, 테플론), 층류를 증가시키기 위한 바늘의 사면 변화, 또는 혈류 속도를 감소시키는 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 세포 용해의 양을 감소시키는 어떠한 혈액 채취 기술, 방법, 프로토콜, 또는 기구가 사용될 수 있다. 태아 세포는 모친의 면역 체계에 의해 파괴되는 것으로 생각된다. 그러나, 모계 세포 용해의 대부분은 혈액 채취의 결과로서 발생하는 것으로 생각된다. 따라서, 세포 용해를 예방하거나 또는 감소시키는 방법은 샘플 내의 모계 DNA 양을 감소시키고, 유리된 태아 DNA의 상대적 비율을 증가시킨다.
또 다른 구체예에서, 세포의 구조적 원형을 보존하는 작용제는 세포 용해의 양을 감소시키는데 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, DNase 저해제, 염화아연, 에틸렌디아민테트라아세트산, 구아니딘-HCl, 이소티오시안산 구아니딘, N-라우로일사르코신, 및 Na-도데실설페이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는, DNA의 파괴를 막는 작용제가 혈액 샘플에 첨가될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 태아 DNA는 태아 세포로부터 획득되는데, 여기에서 상기 태아 세포는 모친의 혈액, 제대혈, 융모막 융모, 양수, 배아 조직 및 모친의 자궁경부 또는 질로부터 획득된 점막을 포함하지만 이에 제한되지 않는 공급원으로부터 분리될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 태아 세포는 모계 말초 혈액으로부터 분리된다. 태아 세포에 특이적인 항체는 모계 혈청으로부터 태아 세포를 정제하는데 사용될 수 있다 (Mueller 등, Lancet 336 : 197-200 (1990) ; Ganshirt-Ahlert 등,Am. R Obstet. Gynecol.166 : 1350-1355 (1992)). 유체 세포 측정 기술은 또한 태아 세포를 증식시키는데 사용될 수 있다 (Herzenberg 등,PNAS 76: 1453-1455 (1979) ; Bianchi 등,PNAS 87: 3279-3283 (1990) ; Bruch 등,Prenatal Diagnosis 11: 787-798 (1991)). 미국 특허 제 5,432,054는 또한 넓은 상단부와 좁은 모세관형 기저부를 가진 폴리에틸렌관을 사용하여, 태아의 비핵성 적혈구를 분리하는 방법을 설명한다. 가변성 속도 프로그램을 이용한 원심분리는 분자 밀도에 기초한 모세관에서의 적혈구 퇴적을 귀결시킨다. 태아 적혈구를 포함하는, 저밀도 적혈구를 함유한 밀도 부분이 회수되고 차별적으로 용혈되어 모계 적혈구를 우선적으로 파괴한다. 고장성 배지 중 밀도 구배는 적혈구를 분리하는데 사용된다. 고장액의 사용은 적혈구를 수축시키는데, 이것은 그것의 밀도를 증가시켜 더 짙은 림프구로부터의 정제를 용이하게 한다. 태아 세포를 분리한 후, 태아 DNA는 당업계의 표준 기술을 사용하여 정제될 수 있다.
분석되는 핵산은 어떠한 핵산도 될 수 있다 (예를 들어, 게놈, 플라스미드, 코스미드, 효모 인공 염색체, 유일한 DNA 서열을 포함하는 인공 또는 인조 DNA, 및 cDNA와 같이 RNA 샘플로부터 역전사된 DNA). RNA의 서열은 주형 DNA로서 사용되기 위해 이중 가닥 DNA로 제조될 수 있는지 본 발명에 따라 측정될 수 있다.
용어 "프라이머" 및 "올리고뉴클레오티드"는 주형에 어닐링되고 그 주형의복제물 합성을 촉발하는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 언급할때 호환적이다.
"증폭" DNA는 예를 들어, 중합효소 연쇄반응에 의해 1회 또는 여러번 "복제"된 DNA이다. 다량의 DNA가 검정에 이용 가능하면, 다시 말해 충분한 수의 관심있는 유전자좌 복제물이 검정되는 샘플 내에 이미 존재하면, 관심있는 유전자좌의 DNA를 훨씬 더 많은 수의 복제물로 "증폭"시킬 필요는 없다. 차라리, 제한 효소 인식 부위가 이중 가닥이 되도록 허용하는 헤어핀 구조를 포함할 수 있는 적절한 프라이머를 사용하여, 주형 DNA를 1회 "복제"하면 충분할 수 있다.
"복제된 DNA"에서 "복제"는 1회 복제된 DNA, 또는 하나 이상의 복제물로 증폭된 DNA를 지칭한다.
한 구체예에서, 핵산은 핵산의 공급원을 함유한 원래 샘플에서 직접 증폭된다. 핵산이 추출된 것이가, 정제된 것인가 또는 분리된 것인가는 중요하지 않으며 ; 증폭될 수 있는 형태로 제공될 필요성만이 존재한다. 증폭에 앞서, 프라이머와 핵산 주형을 혼성화하는 것은 요구되지 않는다. 예를 들어, 증폭은 당업계에 주지된 표준 프로토콜을 사용하여 세포 또는 샘플 세포용해물에서 수행될 수 있다. 고체 지지물 상에 있거나, 고정된 생물학적 표본에 있거나, 또는 그렇지 않으면 비-DNA 물질을 함유한 조성물에 있고 이러한 고체 지지물 또는 고정된 표본 또는 조성물 내의 비-DNA 기질로부터 우선 추출됨 없이 증폭될 수 있는 DNA는, DNA가 적절한 프라이머에 어닐링될 수 있고, 복제될 수 있고, 특히 증폭될 수 있는 한, 그리고 복제 또는 증폭된 생성물이 여기에서 설명된 것과 같이 회수되어 사용될 수 있는한, 더 이상의 정제 없이 직접 사용될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 핵산은 증폭에 앞서 당업계에 주지된 방법을 사용하여 원래 샘플에 존재하는 비-핵산 물질로 부터 추출, 정제 또는 분리된다.
또 다른 구체예에서, 핵산은 핵산의 공급원을 함유한 원래 샘플로부터 추출, 정제 또는 분리되고, 증폭에 앞서 핵산은 효소 절단, 수동 절단, 및 초음파 파쇄를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당업계에 주지된 다수의 방법을 사용하여 절편화된다. 예를 들어, DNA는 하나 이상의 제한 효소로 절단될 수 있는데, 이 효소는 관심있는 유전자좌에는 존재하지 않는 인식 부위, 특히 8 염기 또는 6 염기 쌍의 인식 부위를 갖는다. 전형적으로, DNA는 50, 100, 250, 500, 1,000, 5,000, 10,000, 50,000 및 100,000 염기 쌍 길이를 포함하는, 어떠한 원하는 길이로 절편화될 수 있다. 또 다른 구체예에서, DNA는 약 1000 내지 2000 염기 쌍의 평균 길이로 절편화된다. 그러나, DNA가 절편화 되어야만 할 필요는 없다.
관심있는 유전자좌를 함유한 DNA의 절편은 절편화된 DNA로부터 증폭 전에 정제될 수 있다. 이러한 절편은 관심있는 유전자좌를 회수하는 갈고리로서 증폭에 사용될 프라이머를 사용함으로써 (아래 "프라이머 디자인" 편 참조) 관심있는 유전자좌에 어닐링되는 이러한 프라이머의 능력에 따라 정제될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 태그-변형 프라이머가 사용된다 (예를 들어, 비오틴화 프라이머).
관심있는 유전자좌를 함유한 DNA 절편을 정제함으로써, 증폭 반응의 특이성이 증가될 수 있다. 이것은 주형 DNA의 비특이적 영역의 증폭을 최소화할 수 있다. DNA 절편의 정제는 또한 증가된 특이성을 갖는 관심있는 다수의 유전자좌의다중 PCR (중합효소 연쇄반응) 또는 증폭을 허용할 수 있다.
서열결정되는 관심있는 유전자좌는 서열 단독에 기초하여 선택될 수 있다. 사람에서, 142만 종 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)이 설명되었다 (Nature 409: 928-933 (2001); The SNP Consortium LTD). 평균적으로, 1.9 kb의 사람 게놈 당 하나의 SNP가 존재한다. 그러나, 본 발명에 따라 서열결정되는 관심있는 유전자좌를 선택할 때 관심있는 유전자좌 사이의 거리는 고려될 필요가 없다. 게놈 DNA에 존재하는 하나 이상의 관심있는 유전자좌가 분석될 때, 선택된 관심있는 유전자좌는 동일한 염색체 상에 또는 상이한 염색체 상에 존재할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 선택된 관심있는 유전자좌는 한 염색체 상의 특정 영역에서 클러스터를 형성할 수 있다. 다수의 관심있는 유전자좌는 DNA의 어떤 파손 또는 절편화가 있을 지라도, 관심있는 다수의 유전자좌가 연결되어 남아 있도록 DNA의 영역 내에 위치할 수 있다. 예를 들어, DNA가 획득되고 자연적 힘에 의해 5 kb의 절편으로 파손되면, 다수의 관심있는 유전자좌는 5 kb 영역 내에서 선택될 수 있다. 이것은 각 절편이 그 절편 내의 관심있는 유전자좌에 의해 측정된 것과 같이, 실험 단위로서 작용하는 것을 허용하고, 다수의 염색체 상에 있는 관심있는 유전자좌를 비교하는데 있어서 일어날 수 있는 어떤 실험적 잡음을 감소시킬 수 있다.
염색체 상의 관심있는 유전자좌는 10-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5000-10,000 및 10,000 염기 쌍을포함하지만 이에 제한되지 않는 서로간의 어떠한 거리도 될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 증폭되는 서열의 길이는 가급적 관심있는 유전자좌와 상이하여 관심있는 유전자좌가 크기로 분리될 수 있도록 한다.
사실, 본 발명의 장점은 전체 유전자 서열을 복제하는 프라이머를 사용할 필요가 없다는 것이다. 오히려, 복제된 관심있는 유전자좌는 전체 유전자의 적은 부분 또는 DNA의 비-암호화 영역의 적은 부분뿐이다. 전체 유전자를 서열결정하는 것은 이것이 비용 및 연기된 결과를 증가시킬 수 있기 때문에 장점이 없다. 원하는 염기 또는 관심있는 유전자좌만을 서열결정하는 것은 방법의 전체적인 효율을 최대화하는데, 이것은 최대 수의 관심있는 유전자좌의 서열이 최단 시간 및 최소 비용으로 측정되기 때문이다.
큰 수의 서열이 함께 분석될 수 있기 때문에, 본 발명의 방법은 특히 다수의 관심있는 유전자좌의 대규모 스크리닝을 할 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여, 특히 동시에 어떤 수의 관심있는 유전자좌도 분석되고 프로세싱될 수 있다. 샘플은 동시에 하나의 관심있는 유전자좌 또는 다수의 관심있는 유전자좌에서의 서열을 결정하도록 분석될 수 있다. 관심있는 유전자좌는 단일 염색체 상에 또는 다수의 염색체 상에 존재할 수 있다.
대안으로, 포괄적인 유전 스크리닝이 요구될 때, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-100, 100-250, 250-500, 500-1,000, 1,000-2,000, 2,000-3,000, 3,000-5,000, 5,000-10,000, 10,000-50,000 또는 50,000 이상의 관심있는 유전자좌가 동시에 분석될 수 있다. 이러한 포괄적인 유전 스크리닝은 개개인을 식별하기 위한 또는 SNP 유전자형 분석을 위한 유전적 지문을 제공하도록 본 발명의 방법을 이용할 때 요구될 수 있다.
복제되는 관심있는 유전자좌는 암호화 서열 내에 있거나 또는 암호화 서열의 외부에 있을 수 있다. 바람직하게, 복제되는 하나 이상의 관심있는 유전자좌는 유전자 내에 존재한다. 바람직한 구체예에서, 복제되는 주형 DNA는 관심있는 게놈 암호화 서열 (인트론 또는 엑손) 내에 존재하는 유전자좌 또는 유전자좌 군이다. 대단히 바람직한 구체예에서, 엑손 DNA 서열이 복제된다. 관심있는 유전자좌는 돌연변이가 질병을 일으키거나 또는 질병 상태의 원인이 되는 것으로 공지된 부위가 될 수 있다. 관심있는 유전자좌는 단일 뉴클레오티드 다형성의 부위가 될 수 있다. 대안으로, 복제되는 관심있는 유전자좌는 암호화 서열의 외부, 예를 들어 전사 조절 영역, 및 특히 프로모터, 인핸서, 또는 리프레서 서열에 존재할 수 있다.
관심있는 유전자좌 서열의 측정 방법
미국 특허 제 6,251,639호에 설명된 것과 같이, 대립유전자 특이적 PCR, PCR, 질량 분광법, MALDI-TOF 질량 분광법, 혼성화, 프라이머 확장법, 형광 검출, 형광 공명 에너지 전달(FRET), 형광 분극화, DNA 서열결정, 생거 디데옥시 서열결정, DNA 서열결정 겔, 자동 DNA 서열결정기 상에서의 모세관 전기영동법, 미세채널 전기영동법, 마이크로어레이, 서던 블롯, 도트 블롯, 및 단일 프라이머 직선 핵산 증폭을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 핵산 서열에 대한 정보를 제공하는 어떠한 방법이 사용될 수 있다.
서열을 결정하는 바람직한 방법은 2002년 3월 11일에 제출된 미국 특허출원제 10/093,618호에 설명되었고, 이것의 전문은 참고문헌으로서 본원에 수록된다.
I. 프라이머 디자인
공통서열을 포함하는 공개된 서열은 주형 DNA의 증폭용 프라이머를 디자인하거나 또는 선택하도록 사용될 수 있다. 관심있는 유전자좌에 인접한 프라이머의 구조에 사용될 서열은 관심있는 유전자좌 서열의 검사에 의해 선택될 수 있다. 최근 공개된 사람 게놈 서열은 원하는 관심있는 사람 유전자좌에 인접한 프라이머를 디자인하는 것으로부터 유용한 공통서열 정보의 공급원을 제공한다.
관심있는 유전자좌에 "인접하는" 것은 한 프라이머 3'영역의 적어도 한 부분이 주형 DNA의 안티센스 가닥에 상보적이고 관심있는 유전자좌의 부위로부터 유래하며 (정방향 프라이머), 다른 프라이머의 3'영역 중 적어도 한 부분이 주형 DNA의 센스 가닥에 상보적이고 관심있는 유전자좌의 하류에 존재하는 (역방향 프라이머)것 과 같이 프라이머의 서열이 존재하는 것을 의미한다. "프라이머 쌍"은 정방향 및 역방향 프라이머의 쌍으로 의도된다. 프라이머 쌍의 두 프라이머 모두는 프라이머의 확장을 허용하는 방식으로 어닐링되어, 확장이 관심있는 유전자좌의 영역에서 주형 DNA를 증폭하게 된다.
프라이머는 당업계에 주지된 방법을 이용한 적절한 서열의 클로닝 및 직접적인 화학 합성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다 (Narang et aL, Methods Enzymol. 68 : 90 (1979) ; Brown 등, Methods Enzymol. 68 : 109 (1979)). 프라이머는 또한 Operon Technologies, Amersham Pharmacia Biotech, Sigma, 및 Life Technologies와 같은 상업적 공급체로부터 얻을 수 있다.
프라이머는 동일한 용융 온도를 가질 수 있다. 프라이머의 길이는 원하는 용융 온도를 갖는 프라이머를 생산하도록 5' 말단 또는 3'말단에서 확장되거나 단축될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 프라이머 쌍 중 하나의 프라이머는 다른 프라이머 보다 길 수 있다. 바람직한 구체예에서, 프라이머의 3'어닐링 길이는 프라이머 쌍 내에서 상이하다. 또한, 각 프라이머 쌍의 어닐링 위치는 프라이머 쌍의 서열 및 길이는 원하는 용융 온도를 갖도록 디자인될 수 있다. 25 염기쌍 이하 프라이머의 용융 온도를 측정하기 위한 가장 간단한 등식은 월레스 법칙이다 (Td = 2 (A+T) + 4 (G+C)). 컴퓨터 프로그램은 또한 프라이머를 디자인하는데 사용될 수 있고, 이는 Array Designer Software(Arrayit Inc.), Oligonucleotide Probe Sequence Design Software for Genetic Analysis(Olympus Optical Co.), NetPrimer, 및 Hitachi Software Engineering 사의 DNAsis를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 각 프라이머의 TM(용융 온도 또는 어닐링 온도)는 Net Primer(http ://premierbiosoft.com/ netprimer/netprlaunch/netprlaunch.html에서 무료로 얻을 수 있는 웹 기반 소프트웨어; 2002년 4월 17일 개시 인터넷 주소)와 같은 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산된다.
또 다른 구체예에서, 프라이머의 어닐링 온도는 어떠한 증폭 사이클 이후 재계산되어 증가될 수 있고, 각 사이클은 1, 2, 3, 4, 5 사이클, 6-10 사이클, 10-15 사이클, 15-20 사이클, 20-25 사이클, 25-30 사이클, 30-35 사이클, 또는 35-40 사이클을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 개시 증폭 사이클 이후, 프라이머의 5'절반은 각각의 관심있는 유전자좌로부터 생성물에 통합되고, 따라서 TM은 각 프라이머의 5' 절반 및 3' 절반의 서열 모두에 기초하여 재계산될 수 있다.
예를 들어, 도 1B에서, 증폭의 제 1 사이클은 대략, 주형 DNA에 어닐링되는 제 2 프라이머의 3'영역 (영역 "c") 13 염기의 용융 온도에서 수행된다. 제 1 사이클 이후, 어닐링 온도는 TM2로 상승될 수 있는데, 이는 대략 영역 "b"로서 나타낸 제 1 프라이머의 주형 DNA에 어닐링되는 3'영역의 용융 온도이다. 제 2 프라이머는 원래 DNA 주형에서 13 염기만을 어닐링하기 때문에 원래 주형 DNA에 결합할 수 없고, TM2는 대략 제 1 프라이머의 3' 어닐링 영역인 약 20 염기의 용융 온도이다(도 1C). 그러나, 제 1 프라이머는 첫번째 사이클에서 복제된 DNA에 결합할 수 없다. 세번째 사이클에서, 어닐링 온도는 TM3으로 상승되며, 이는 대략, 영역 "c" 및 "d"로 나타낸 제 2 프라이머의 전체 서열의 용융 온도이다. PCR의 제 2 사이클로부터 생산된 DNA 주형은 영역 c' 및 d'를 모두 포함하므로, 제 2 프라이머는 TM3에서 어닐링되고 확장될 수 있다 (도 1D). 나머지 사이클은 TM3에서 수행된다. 제 1 프라이머의 전체 서열은 (a + b') 제 3 PCR 사이클로부터 주형에 어닐링되고, 확장될 수 있다 (도 IE). 어닐링 온도를 증가시키는 것은 비-특이적 결합을 감소시켜 반응의 특이성을 증가시키고, 특히 대략 3x109염기 쌍 길이인 사람 게놈 DNA로 부터 관심있는 유전자좌를 증폭할 때 유용할 수 있다.
여기에서 사용될 때, 어닐링 온도에 관한 용어 "대략"은 지정된 온도의 10℃ 내의 온도를 포함하도록 사용된다.
한 구체예에서, 하나의 프라이머 쌍이 각각의 관심있는 유전자좌에 사용된다. 그러나, 각각의 관심있는 유전자좌에 대해 다수의 프라이머 쌍이 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 프라이머는 프라이머 쌍 중 하나 또는 둘 모두가 5' 영역에 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)에 대한 서열을 포함하도록 디자인된다.
여기에서 사용될 때, 제한 효소가 DNA를 절단하는 위치에 관해서, "센스" 가닥은 제한 효소가 절단할 때 5'에서 3' 방향으로 해독하는 가닥이다. 예를 들어, BsmF I은 아래 서열을 인식한다 :
5'GGGAC(N)103' 5'(N)14GT000 3'
3'CCCTG(N)145' 3'(N)10CAGGG 5'
센스 가닥은 제한 효소가 절단하는 방향에 있어서 5'에서 3'으로 해독되기 때문에 "GGGAC" 서열을 포함한 가닥이다.
여기에서 사용될 때, 제한 효소가 DNA를 절단하는 위치에 관해서, "안티센스" 가닥은 제한 효소가 절단할 때 3'에서 5' 방향으로 해독하는 가닥이다.
또 다른 구체예에서, 프라이머 쌍 중 하나의 프라이머는 인식 부위로부터 "n" 뉴클레오티드 떨어져 절단하고, 관심있는 유전자좌를 포함하는 함몰된 3'말단 및 5' 돌출부를 생성하게 하는 제한 효소를 위한 제한 효소 인식 부위를 포함하도록 디자인된다 (여기에서는 "제 2 프라이머"로서 지칭된다). "N"은 인식 부위로부터 제한 효소에 의한 절단 부위까지의 거리이다. 다시 말해, 프라이머 쌍 중 제 2 프라이머는 인식 부위에서 DNA를 절단하지 않고 인식 부위로부터 "n" 뉴클레오티드 떨어진 곳을 절단하는 제한 효소를 위한 인식 부위를 포함한다. 예를 들어, 인식 서열이 제한 효소 BceA I을 위한 것이라면, 효소는 센스 가닥에 있는 인식 부위로부터 10 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥에 있는 인식 부위로부터 12 뉴클레오티드 떨어진 곳을 절단할 것이다.
프라이머의 3'영역 및 바람직하게는, 3'절반은 관심있는 유전자좌에 인접하는 서열에 어닐링되도록 디자인된다 (도 1A). 제 2 프라이머는 프라이머 상에 존재하는 제한 효소 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 절단하는 것이 관심있는 유전자좌를 포함하는 5' 돌출부를 생성하도록 관심있는 유전자좌로부터 어떠한 거리로 어닐링될 수 있다. 5' 돌출부는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 및 8 염기 이상을 포함하되 이에 제한되지 않는 어떠한 크기의 것도 될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 관심있는 유전자좌에 보다 가깝게 어닐링되는 프라이머 (제 2 프라이머)의 3' 말단은 관심있는 유전자좌로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 14 염기 이상 떨어지거나 또는 관심있는 유전자좌에서 어닐링될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 제 2 프라이머는 프라이머 쌍의 다른 프라이머보다 관심있는 유전자좌에 더욱 가깝게 어닐링되도록 디자인된다 (다른 프라이머는 여기에서 "제 1 프라이머"로 지칭된다). 제 2 프라이머는 정방향 또는 역방향 프라이머가 될 수 있고 제 1 프라이머는 각각 역방향 또는 정방향 프라이머가 될 수 있다.제 1 또는 제 2 프라이머가 정방향 프라이머이어야 하는가 아니면 역방향 프라이머이어야 하는가는 어떠한 디자인이 더 양호한 서열결정 결과를 제공할 것인가에 의해 결정될 수 있다.
예를 들어, 관심있는 유전자좌에 더 가깝게 어닐링되는 프라이머는 제한 효소 BsmF I을 위한 인식 부위를 포함할 수 있는데, 이 효소는 센스 가닥에 있는 인식 부위로 부터 10 뉴클레오티드, 및 안티센스 가닥에 있는 인식 부위로부터 14 뉴클레오티드를 절단한다. 이 경우, 프라이머는 제한 효소 인식 부위가 관심있는 유전자좌로부터 13 염기, 12 염기, 10 염기 또는 11 염기가 되도록 디자인 될 수 있다. 인식 부위가 관심있는 유전자좌로부터 13 염기라면, BsmF I으로의 절단은 5' 돌출부(RXXX)을 생성하는데, 여기에서 관심있는 유전자좌(R)는 돌출부 내의 제 1 뉴클레오티드이고 (3'에서 5'으로 해독), X는 임의의 뉴클레오티드이다. 인식 부위가 관심있는 유전자좌로부터 12 염기라면, BsmF I으로의 절단은 5' 돌출부(XRXX)을 생성하는데, 여기에서 관심있는 유전자좌(R)는 돌출부에서 제 2 뉴클레오티드이다(3'에서 5'으로 해독). 인식 부위가 관심있는 유전자좌로부터 11 염기라면, BsmF I으로의 절단은 5' 돌출부(XXRX)을 생성하는데, 여기에서 관심있는 유전자좌 (R)는 돌출부에서 제 3 뉴클레오티드이다(3'에서 5'으로 해독). 제한 효소 인식 부위 및 관심있는 유전자좌 간의 거리는 제한 효소로의 절단이 관심있는 유전자좌를 포함하는 5' 돌출부를 생성하도록 디자인되어야 한다. 인식 부위 및 관심있는 유전자좌 간의 효율적인 거리는 제한 효소의 선택에 의존하여 변화할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 다른 프라이머에 비해 관심있는 유전자좌에 더 가깝게어닐링되는 프라이머는 관심있는 유전자좌를 포함하는 5' 돌출부가 관심있는 유전자좌 부위에 있는 뉴클레오티드에 독립적으로, 절단 부위에서 동일한 서열을 나타내게끔 디자인될 수 있다. 예를 들어, 관심있는 유전자좌에 더 가깝게 어닐링되는 프라이머는 제한 효소 BsmF I을 위한 인식 부위 (5'GGGAC 3')가 관심있는 유전자좌로부터 13 염기 떨어지도록 디자인되면, 제한 효소가 안티센스 가닥을 관심있는 유전자좌로부터 하나의 염기만큼 떨어져 절단될 수 있다. 관심있는 유전자좌에 있는 뉴클레오티드는 절단 부위에 인접해 있고, DNA 분자로부터 DNA 분자까지 다양할 수 있다. 절단 부위에 인접한 뉴클레오티드가 동일하도록 요구된다면, BsmF I을 위한 제한 효소 인식 부위가 관심있는 유전자좌로부터 12 염기 떨어지도록 프라이머를 디자인할 수 있다. BsmF I으로의 절단은 5' 돌출부를 생성할 수 있는데, 여기에서 관심있는 유전자좌 부위는 돌출부의 제 2 위치에 존재하며 (3'에서 5'으로 해독) 더 이상 절단 부위에 인접하지 않는다. 제한 효소 인식 부위가 관심있는 유전자좌로부터 12 염기 떨어지도록 프라이머를 디자인하는 것은 관심있는 유전자좌에 존재하는 뉴클레오티드에 독립적으로, 절단 부위에 인접한 뉴클레오티드가 동일해지는 것을 허용한다. 또한, 제한 효소 BsmF I 인식 부위가 관심있는 유전자좌 부위로부터 11 또는 10 염기가 되도록 디자인된 프라이머는 관심있는 유전자좌에 있는 뉴클레오티드에 독립적으로, 절단 부위에 인접한 뉴클레오티드가 동일해지는 것을 허용한다. 이와 유사한 프라이머 디자인 전략은 관심있는 유전자좌에 있는 뉴클레오티드에 독립적으로, 절단 부위에 인접한 뉴클레오티드가 동일하도록 다른 제한 효소를 채택할 수 있다.
제 1 (정방향 또는 역방향) 프라이머의 3'말단은 관심있는 유전자좌로부터 선택된 거리에서 어닐링되도록 디자인될 수 있다. 바람직하게, 예를 들어 이 거리는 관심있는 유전자좌로부터 10-25, 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000 및 1000 염기 이상 떨어진다. 제 1 프라이머의 어닐링 부위는 각각의 연속적인 상류 프라이머가 그 각각의 하류 프라이머로부터 더욱 더 떨어지도록 선택될 수 있다.
예를 들어, 관심있는 1번 유전자좌에 있는 제 1 및 제 2 프라이머의 3'말단이 별개의 Z 염기라면, 관심있는 2번 유전자좌에 있는 상류 및 하류 프라이머의 3'말단은 별개의 Z + K 염기인데, 여기에서 K 는 1, 2, 3, 4, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 900-1000, 또는 1000 이상의 염기이다 (FIG 2). 제 1 프라이머를 그 각각의 제 2 프라이머로부터 더욱더 따로 떨어지게 만드는 목적은 모든 관심있는 유전자좌의 PCR 생산물 크기가 상이하여 예를 들어, 서열결정 겔 상에서 분리될 수 있게 하기 위함이다. 이것은 이후 단계에서 PCR 생산물을 모음으로써 복합화되는 것을 허용한다.
한 구체예에서, 제 1 또는 제 2 프라이머의 5' 영역은 어떤 타입의 제한 효소를 위한 인식 부위를 가질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제 1 및/또는 제 2 프라이머의 5' 영역은 관심있는 유전자좌를 포함하는 5' 돌출부를 생성하는데 사용되는 제한 효소 인식 부위와는 상이한 적어도 하나의 제한 효소 인식 부위를 갖는다.
한 구체예에서, 제 1 프라이머의 5' 영역은 어떤 타입의 제한 효소를 위한 인식 부위를 가질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제 1 프라이머는 제 2 프라이머에 있는 제한 효소 인식 부위와는 상이한 적어도 하나의 제한 효소 인식 부위를 갖는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 제 1 프라이머는 제 2 프라이머 보다 관심있는 유전자좌로부터 더욱 떨어져서 어닐링된다.
바람직한 구체예에서, 제 2 프라이머는 BceA I 및 BsmF I (각각 2 염기 5' 돌출부 및 4 염기 5' 돌출부을 생성)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 IIS 형 제한 효소를 위한 제한 효소 인식 서열을 포함한다. IIS 형 제한 효소는 (종래의 II 형 효소와 같이 전후대칭이 아닌) 비대칭 염기 서열을 인식하기 때문에 바람직하다. II 형 제한 효소는 인식 부위의 외부, 전형적으로는 인식 부위의 20 염기쌍 이내의 외부인 특이화된 위치에서 DNA를 절단한다. 이 특징은 IIS 형 제한 효소 및 그것의 인식 부위를 본 발명의 방법에서 특히 유용한 것으로 만든다. 바람직하게, 본 방법에서 사용되는 IIS 형 제한 효소는 5' 돌출부 및 함몰된 3'을 생성한다.
다양한 종류의 IIS 형 제한 효소가 공지되며 이러한 효소는 박테리아, 파지, 원시박테리아 및 진핵 조류의 바이러스로부터 분리되었고, 시중 구입이 가능하다 (Promega, Madison WI ; New England Biolabs, Beverly, MA ; Szybalski W. 등, Gene 100 : 13-26, 1991). 본 방법에 유용할 수 있는 IIS 형 제한 효소의 예는 표 1에 열거된 것과 같은 효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
효소-공급원 인식/절단 부위 공급회사
Alw I -Acinetobacter IwoMffii GGATC (4/5) NE Biolabs
Alw26 I-Acinetobacter IwoMffii GTCTC (1/5) Promega
Bbs I -Bacillus laterosporus GAAGAC (2/6) NE Biolabs
Bbv I -Bacillus brevis GCAGC (8/12) NE Biolabs
BceA I -Bacillus cereus 1315 IACGGC (12/14) NE Biolabs
Bmr I -Bacillus megaterium CTGGG (5/4) NE Biolabs
Bsa I -Bacillus stearothermophilus 6-55 GGTCTC (1/5) NE Biolabs
Bst71 I -Bacillusstearothermophilus 71 GCAGC (8/12) Promega
BsmA I -Bacillus stearothermophilus A664 GTCTC (1/5) NE Biolabs
BsmB I -Bacillus stearothermophilus B61 CGTCTC (1/5) NE Biolabs
BsmF I -Bacillus stearothermophilus F GGGAC (10/14) NE Biolabs
BspM I -Bacillus species M ACCTGC (4/8) NE Biolabs
Ear I -Enterobacter aerogenes CTCTTC (1/4) NE Biolabs
Fau I -Flavobacterium aquatile CCCGC (4/6) NE Biolabs
Fok I -Flavobacterium okeonokoites GGATG (9/13) NE Biolabs
Hga I -Haemophilus gallinarum GACGC (5/10) NE Biolabs
Ple I -Pseudomonas lemoignei GAGTC (4/5) NE Biolabs
Sap I -Saccharopolyspora species GCTCTTC (1/4) NE Biolabs
SfaN I -Streptococcus faecalis ND547 GCATC (5/9) NE Biolabs
Sthl32 I -Streptococcus thermophilus ST132 CCCG (4/8) 제조 공급회사 없음(Gene 195 : 201-206 (1997))
한 구체예에서, 프라이머 쌍은 하나의 제한 효소에 대해 유일한 제한 효소 인식 부위를 제공하는 각 프라이머의 5' 영역에 서열을 갖는다.
또 다른 구체예에서, 프라이머 쌍은 하나 이상의 제한 효소에 의해 인식되는, 특히 하나 이상의 IIS 형 제한 효소를 위한 인식 부위를 제공하는 각 프라이머의 5' 영역에 서열을 갖는다. 예를 들어, 어떤 공통서열은 하나 이상의 효소에 의해 인식될 수 있다. 예를 들어, BsgI, Eco571 및 BpmI 모두는 공통서열(G/C) TGnAG를 인식하고 안티센스 가닥 상의 16 염기 및 센스 가닥 상의 14 염기를 절단한다. 이러한 공통서열을 제공하는 프라이머는 BsgI, Eco571 및 BpmI과 같은 어떠한 제한 효소에 의해 인식 될 수 있는 부위를 갖는 생성물을 야기할 수 있다.
인식 부위로부터 떨어진 곳에서 DNA를 절단하여, 함몰된 3' 말단 및 5' 돌출부를 생산하는 다른 제한 효소는 III 형 제한 효소를 포함한다.
예를 들어, 제한 효소 EcoP15I는 서열 5' CAGCAG 3'을 인식하고 센스 가닥 상의 하류 25 염기 및 안티센스 가닥 상의 27 염기를 절단한다. 새로운 제한 효소가 끊임없이 발견될 것이며 본 발명에서의 사용에 손쉽게 적용될 수 있다는 것이 당업자에게 더욱 분명할 것이다.
또 다른 구체예에서, 제 2 프라이머는 제한 효소를 위한 인식 서열의 일부를 포함할 수 있는데, 여기에서 제한 효소를 위한 전체 인식 부위는 제한 효소로의 절단이 관심있는 유전자좌를 포함하는 5' 돌출부를 생성하도록 주형 DNA를 증폭시킨 후 생성된다. 예를 들어, BsmF I을 위한 인식 부위는 5'GGGACN10 ↓3'이다. 제 2 프라이머의, 주형 DNA에 어닐링되는 3'영역은 뉴클레오티드 "GGG"로 끝날 수 있는데, 이것은 주형 DNA와 상보적이지 말아야 한다. 3'어닐링 영역이 약 10 내지 20 염기라면, 마지막 3 염기가 어닐링되지 않더라도, 프라이머는 확장되고 BsmF I 부위를 생성한다.
제 2 프라이머 : 5'GGAAATTCCATGATGCGTGGG→
주형 DNA 3'CCTTTAAGGTACTACGCANlN2N3TG 5'
5'GGAAATTCCATGATGCCTNl,N2,N3,AC 3'
제 2 프라이머는 주형 DNA에 어닐링 되도록 디자인할 수 있는데, 여기에서 주형 DNA의 다음 두 염기는 티미딘 및 구아닌으로서, 아데노신 및 시토신이 프라이머 내로 통합되어 BsmF I을 위한 인식 부위인, 5' GGGACN10 ↓3'을 형성한다. 제 2 프라이머는 BsmF I으로의 절단이 관심있는 유전자좌를 포함하는 5' 돌출부를 생성하는 방식으로 어닐링 되도록 디자인될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 제 2 프라이머는 제한 효소를 위한 전체 또는 완전한 인식 부위 또는 인식 부위의 일부를 포함할 수 있고, 이는 인식 부위에서 절단하는 제한 효소로의 절단이 관심있는 유전자좌를 포함하는 5' 돌출부를 생성하는 것과 같은 주형 DNA의 프라이머-의존 복제 후 전체 인식 부위를 생성한다. 예를 들어, 제한 효소 BsaJ I은 하기 인식 부위에 결합한다 : 5'C↓CN1N2GG 3'. 제 2 프라이머는 주형 DNA에 어닐링되는 프라이머의 3'영역이 "CC"로 끝나도록 디자인되며, 관심있는 SNP는 "N1"으로 나타내고, SNP의 주형 서열 하류는 "N2GG"이다.
제 2 프라이머 : 5'GGAAATTCCATGATGCGTACC→
주형 DNA 3'CCTTTAAGGTACTACGCATGGN1N2CC 5'
5'GGAAATTCCATGATGCCTACCN1,N2,GG 3'
BsaJ I으로의 절단 후, 하기 서열의 5' 돌출부가 생성될 수 있다.
5'C 3'
3'GGN1N2CC 5'
뉴클레오티드 구아닌이 관심있는 유전자좌에 있는 것으로 보고되지 않는다면, 3'함몰 말단은 표지되지 않은 시토신으로 채워질 수 있고, 이는 돌출부에서 제 1 뉴클레오티드에 상보적이다. 과량의 시토신을 제거한 후, 표지된 ddNTP는 관심있는 유전자좌를 나타내는 다음 뉴클레오티드 N에서 채워 넣도록 사용될 수 있다. BssK I (5'↓CCNGG 3'), Dde I (5'C↓TNAG 3'), EcoN I (5'CCTNN↓NNNAGG 3'), Fnu4H I (5'GC↓NGC 3'), Hinf I (5'G↓ANTC 3') PflF I (5'GACN↓NNGTC 3'), Sau96 I (5'G↓GNCC 3'), ScrF I (5' CC↓NGG 3'), 및 Tthl 11 I (5'GACN↓NNGTC 3')을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 제한 효소가 사용될 수 있다.
제 2 프라이머의, 주형 DNA에 어닐링되는 3'영역이 주형 DNA에 100% 상보적일 필요는 없다. 예를 들어, 제 2 프라이머의 3'말단에 있는 마지막 1, 2 또는 3 뉴클레오티드는 주형 DNA에 미스매치될 수 있다. 주형 DNA에 어닐링되는 프라이머의 영역은 프라이머를 표적화하고, 프라이머가 확장되는 것을 허용한다. 마지막 두 개의 뉴클레오티드가 주형 DNA에 상보적이지 않더라도, 프라이머는 확장되어 제한 효소 인식 부위를 생성할 것이다. 예를 들어, 제 2 프라이머의 마지막 두 뉴클레오티드는 "CC"이다. 제 2 프라이머는 주형 DNA 에 어닐링하여 "CC"가 뉴클레오티드 Na, 및 Nb와 상보적이지 않더라도 확장을 허용한다.
제 2 프라이머 : 5'GGAAATTCCATGATGCGTACC→
주형 DNA 3'CCTTTAAGGTACTACGCATNa,Nb,N1,N2,CC 5'
5'GGAAATTCCATGATGCCTANaNbN1N2GG 3'
BsaJ I으로의 절단 후, 하기 서열의 5' 돌출부가 생성될 수 있다.
5'C 3'
3'GGN1N2CC 5'
뉴클레오티드 구아닌이 관심있는 유전자좌에서 보고되지 않는다면, 5' 돌출부는 표지되지 않은 시토신으로 채워질 수 있다. 과량의 시토신은 세척으로 제거하고, 표지된 ddNTP으로 채워 넣을 수 있다. 통합된 제 1 뉴클레오티드 (N1')는 관심있는 유전자좌에 상응한다. 관심있는 유전자좌에 구아닌이 보고되면, 관심있는 유전자좌는 표지되지 않은 시토신으로 채워질 수 있고 관심있는 유전자좌의 뉴클레오티드 하류가 검출될 수 있다. 예를 들어, 가상의 N2는 아데닌이다. 관심있는 유전자좌가 구아닌이라면, 표지되지 않은 시토신은 반응에서 채우기 하는데 사용될 수 있다. 시토신을 제거한 후, 표지된 티미딘으로의 채우기 반응이 사용될 수 있다. 표지된 티미딘은 관심있는 유전자좌가 구아닌일 경우에만 통합될 수 있다. 따라서, 관심있는 유전자좌의 서열은 관심있는 유전자좌의 뉴클레오티드 하류를 검출함으로써 측정될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 제 1 및 제 2 프라이머는 제한 효소를 위한 인식 서열의 일부를 포함하는데, 여기에서 제한 효소를 위한 전체 인식 부위는 제한 효소로의 절단이 관심있는 유전자좌를 포함하는 5' 돌출부를 생성하는 것과 같은 주형 DNA의 증폭 이후에 생성된다. BssK I (5'↓CCNGG 3'), Dde I (5'C↓TNAG 3'), EconI (5'CCTNN↓NNNAGG 3'), Fnu4H I (5'GC↓NGC 3'), Hinf I (5'G↓ANTC 3'), PflF I (5'GACN↓NNGTC 3'), Sau96 I (5' G↓GNCC 3'), ScrF I (5' CC↓NGG 3'), 및 Tth1 11 I (5' GACN↓NNGTC 3')을 포함하지만 이에 제한되지 않는 제한 효소를 위한 하나 또는 하나 이상의 다양한 뉴클레오티드를 포함하는 인식 부위가 생성될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 제 1 및 제 2 프라이머의 3'영역은 제한 효소를 위한 부분적인 서열을 포함하는데, 여기에서 부분적인 서열은 주형 DNA와의 1, 2, 3, 4 또는 4개의 미스매치를 포함한다 ; 이 미스매치는 제한 효소 인식 부위를 생성한다. 3'말단에서 묵과될 수 있는 미스매치의 수는 프라이머의 길이에 의존한다. 예를 들어, 관심있는 유전자좌가 N1으로 표시되면, 제 1 프라이머는 아래에 영역 "a"로서 나타난, 주형 DNA에 상보적인 것으로 디자인될 수 있다. 제 1 프라이머의 3'영역이 "CC"로 종결되면, 이는 주형 DNA에 상보적인 것이 아니다. 제 2 프라이머는 주형 DNA에 상보적인 것으로 디자인되는데, 이것은 아래에 영역 "b"로서 나타낸다. 제 2 프라이머의 3'영역은 "CC"로 종결되고, 이는 주형 DNA에 상보적인 것이 아니다.
제 1 프라이머 5'aCC→
주형 DNA 3'a'AAN1,N2,TTb'5'
5'aTTN1N2AAb3'
←CCb'5' 제 2 프라이머
증폭 1 라운드 후 하기 생성물이 생성될 수 있다.
5'aCCN1N2AAb3'
및
5'bCCN2,N1,AAa'3'.
2번째 사이클에서, 프라이머는 첫번째 PCR 사이클로부터 생성된 주형에 어닐링될 수 있다.
5'aCCN1N2AAb3'
←CCb'5'
←CCa5'
5'b'CCN2N1AAa'3'
PCR의 2번째 사이클 후, 하기 생성물이 생성될 수 있다.
5' a CCN1N2GGb3'
3' a' GGN1N2CCb'5'
BsaJ I을 위한 제한 효소 인식 부위가 생성되고, BsaJ I으로의 절단 후, 관심있는 유전자좌를 포함하는 5' 돌출부가 생성된다. 관심있는 유전자좌는 하기 상술된 것과 같이 검출될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 프라이머 쌍은 각 프라이머의 5' 영역에 둘 이상의 제한 효소에 의해 인식되는 둘 이상의 인식 부위를 제공하는 서열을 갖는다.
가장 바람직한 구체예에서, 프라이머 쌍은 5' 영역, 특히 5' 말단에 상이한 제한 효소 인식 부위를 갖으므로, 상이한 제한 효소가 어떤 원치 않는 서열을 절단하도록 요구된다. 예를 들어, 관심있는 "A" 유전자좌에 대한 제 1 프라이머는 제한 효소 "X"에 의해 인식되는 서열을 포함하는데, X는 어떤 타입의 제한 효소가 될 수 있고, 관심있는 "A" 유전자좌에 대한 제 2 프라이머는 제한 효소 "Y"를 위한 서열을 포함할 수 있는데, 이 효소는 "n" 뉴클레오티드를 절단해 버리고 5' 돌출부 및 함몰된 3'말단을 남기는 IIS 형 제한 효소이다. 증폭된 DNA를 스트렙타비딘으로 코팅한 웰에 결합시킨 후, 효소 "Y"로 절단하고 세척한 후, 표지된 뉴클레오티드로 채워 넣고 세척한 다음, 고체 매트릭스로부터 관심있는 유전자좌를 포함한 DNA 절편을 방출할 수 있는 제한 효소 "X"로 절단할 수 있다. 관심있는 유전자좌는 관심있는 유전자좌, 예를 들어 SNP 부위에서 "채우기"를 한 표지된 뉴클레오티드를 검출함으로써 분석될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따라 증폭되는 상이한 관심있는 유전자좌를 위한 제 2 프라이머는 5' 영역에 동일한 제한 효소를 위한 인식 서열을 포함하고 이와 마찬가지로 모든 제 1 프라이머 또한 동일한 제한 효소 인식 부위를 포함하는데, 이 효소는 제 2 프라이머를 인식하는 효소와 상이한 효소이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따라 증폭되는 다수의 관심있는 유전자좌를 위한 제 2 프라이머는 5' 영역에 상이한 제한 효소를 위한 제한 효소 인식 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따라 증폭되는 다수의 관심있는 유전자좌를위한 제 1 프라이머는 5' 영역에 상이한 제한 효소를 위한 제한 효소 인식 서열을 포함한다. 다수의 제한 효소 서열은 모아진 관심있는 유전자좌가 고체 지지체로부터 방출되는 순서에 영향을 미치는 기회를 제공한다. 예를 들어, 50개의 관심있는 유전자좌가 증폭되면, 제 1 프라이머는 정제를 위해 5' 말단에 태그 및 제한 효소 인식 부위를 가질 수 있고, 제 2 프라이머는 IIS 형 제한 효소를 위한 인식 부위를 가질 수 있다. 예를 들어, 몇몇 제 1 프라이머는 EcoR I을 위한 제한 효소 인식 부위를 가질 수 있고, 다른 제 1 프라이머는 Pst I을 위한 인식 부위를 가질 수 있고, 또 다른 제 1 프라이머는 BamH I을 위한 인식 부위를 가질 수 있다. 증폭 후, 관심있는 유전자좌는 제 1 프라이머 상에 있는 태그의 도움으로 고체 지지물에 결합될 수 있다. 하나의 제한 효소로 효소 절단을 수행함으로써, 관심있는 증폭된 유전자좌는 순차적으로 방출될 수 있다. 제 1 효소 절단이 EcoR I으로 수행되면, EcoR I의 인식 부위를 포함한 제 1 프라이머로 증폭된 관심있는 유전자좌는 방출되어 수집되고, 반면 다른 관심있는 유전자좌는 고체 지지물에 결합하여 남는다. 증폭된 관심있는 유전자좌는 하나의 제한 효소로 동시에 절단함으로써 고체 지지물로부터 선택적으로 방출될 수 있다. 제 1 프라이머에서 상이한 제한 효소 인식 부위의 사용은 더 많은 수의 관심있는 유전자좌가 단일 반응관에서 증폭되는 것을 허용한다.
바람직한 구체예에서, 각 프라이머의 제한 효소 절단 부위의 어떠한 5' 영역은 절편 조작, 프로세싱, 동정 및/또는 정제에 제공되는 작용기로 변형될 수 있다. 이러한 작용기, 또는 태그의 예는 비오틴, 비오틴의 유도체, 탄수화물, 햅텐, 염료, 방사성 분자, 항체, 및 항체의 절편, 펩티드, 및 면역성 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 구체예에서, 주형 DNA는 1회 복제 이상으로 증폭됨 없이, 1회 복제될 수 있다. 이것은 다수의 관심있는 유전자좌 복제가 이미 샘플 내에 존재하고 더 이상의 복제가 필요 없는, 분석에 이용가능한 DNA가 다량으로 존재할 때 유용하다. 이 구체예에서, 프라이머는 5' 영역에 "헤어핀" 구조를 포함하도록 디자인되어, 서열이 다시 2중으로 되고 상보적인 방식으로 그 서열 내부에 어닐링되는 것이 바람직하다. 주형 DNA가 1회만 복제되면, 인식 부위를 포함하는 DNA 서열은 "헤어핀" 구조인 경우를 제외하고는 단일-가닥으로 될 수 있다. 그러나, 헤어핀 구조가 존재하면, 그 영역은 효과적으로 이중 가닥이 되므로, 제한 효소에 의한 활성에 이중 가닥의 기질을 제공하게 된다.
반응 조건이 편리하다는 점에서, DNA의 관심있는 유전자좌 또는 유전자좌 군을 분석하기 위한 모든 프라이머 쌍은 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 함께 혼합될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 모든 프라이머 쌍은 단일 반응 용기에서 주형 DNA와 혼합된다. 이러한 반응 용기는, 예를 들어 반응관, 또는 마이크로타이터 플레이트의 웰이 될 수 있다.
대안으로, 뉴클레오티드에 대한 경쟁을 피하고 프라이머 이합체 및 프라이머에 대한 어닐링 온도의 어려움을 최소화하기 위해, 각각의 관심있는 유전자좌 또는 관심있는 유전자좌 군의 소집단은 별개의 반응관 또는 웰에서 증폭되어, 원한다면 후에 생성물이 수집될 수 있다. 예를 들어, 개별적인 반응물은 관심있는 유전자좌또는 SNP 부위를 포함하는 5' 돌출부 및 3' 함몰 말단을 생성하는 제한 효소로의 절단 전에 단일 반응 용기 내로 수집될 수 있다. 바람직하게, 각 프라이머 쌍의 프라이머는 같은 양의 몰로 제공된다. 또한, 특히 바람직하게, 각각의 상이한 프라이머 쌍은 사용되는 다른 쌍에 비해 같은 양의 몰로 제공된다.
또 다른 구체예에서, 관심있는 유전자좌의 효과적인 증폭을 허용하는 프라이머 쌍의 조합이 사용될 수 있다 (예를 들어, 도 2 참조). 이러한 조합은 본 발명의 방법에 사용되기 전에 결정될 수 있다. 다중-웰 플레이트 및 PCR 기계는 서로 효과적으로 작동하는 프라이머 쌍을 선택하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, Eppendorf Mastercycler 구배 PCR 기계와 같은 구배 PCR 기계는 각각의 프라이머 쌍을 위한 최적 어닐링 온도를 선택하는데 사용될 수 있다. 유사한 성질을 갖는 프라이머 쌍은 단일 반응관에서 함께 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 96-웰 또는 그 이상의 플레이트를 포함하되 이에 제한되지 않는 다중-샘플 용기는 다수의 주형 DNA로부터 관심있는 유전자좌를 위한 최적 PCR 조건에서 동일한 프라이머 쌍을 갖는 하나의 관심있는 유전자좌를 증폭하는데 사용될 수 있다. 대안으로, 개별적인 다중-샘플 용기는 각각의 관심있는 유전자좌의 증폭에 사용될 수 있으며 각 주형 DNA에 대한 생성물은 나중에 수집된다.
다수의 관심있는 유전자좌의 증폭 결과는 각각의 관심있는 유전자좌 서열을 갖는 대표적 PCR 생산물을 포함하는 조제물이다. 예를 들어, 한 사람으로부터 유래된 DNA가 주형 DNA로서 사용되고 질병에 관련된 수백의 관심있는 유전자좌가 주형 DNA로부터 증폭되었다면, 증폭된 DNA는 각각의 관심있는 유전자좌로부터 유래한소량의, PCR 생산물의 혼합물이다. 이러한 조제물은 각각의 관심있는 유전자좌에 있거나 또는 몇몇 관심있는 유전자좌 군에만 존재하는 서열을 결정하도록 동시에 분석될 수 있다. 게다가, 조제물은 DNA를 보존하여 후에 분석될 수 있는 방식으로 저장될 수 있다. 증폭된 DNA에 포함된 정보는 형광 검출, 서열결정, 겔 전기영동, 및 질량 분광법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 어떤 적당한 방법에 의해 밝혀질 수 있다 (하기 "통합된 뉴클레오티드의 검출"편 참조).
II. 관심있는 유전자좌의 증폭
주형 DNA는 PCR (중합효소 연쇄반응), 3SR (자기보존 서열 반응), LCR (리가제 연쇄반응), RACE-PCR (cDNA 말단의 고속 증폭), PLCR (중합효소 연쇄반응 및 리가제 연쇄반응의 조합), Q-베타 파아지 증폭(Shah 등, J. Medical Micro. 33 : 1435-41 (1995)), SDA(가닥 전이 증폭), SOE-PCR(스플라이스 오버랩 연장 PCR) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 어떤 적당한 방법을 사용하여 증폭될 수 있다. 이들 방법은 본원에 명기된 방출가능 프라이머 중재 사이클 증폭 반응의 변형을 디자인하는데 사용될 수 있다. 가장 바람직한 구체예에서, 주형 DNA는 PCR(PCR : A Practical Approach, M. J. McPherson, 등, IRL Press (1991) ; PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Innis, 등, Academic Press (1990) ; 및 PCR Technology : Principals and Applications of DNA Amplification, H. A. Erlich, Stockton Press (1989))를 사용하여 증폭된다. PCR은 또한 미국 특허 제 4,683,195 ; 4,683,202 ; 4,800,159 ; 4,965,188 ; 4,889,818 ; 5,075,216 ; 5,079,352 ; 5,104,792, 5,023,171 ; 5,091,310 ; 및5,066,5 84를 포함하는, 다수의 미국 특허에서 설명된다.
전형적인 PCR 반응의 성분은 주형 DNA, 프라이머, 반응 완충액 (중합효소의 선택에 의존), dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, 및 dCTP) 및 DNA 중합효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적절한 PCR 프라이머는 상기 고찰된 것과 같이 디자인되고 제조될 수 있다 (상기 "프라이머 디자인"편 참조). 간단히 말해, 반응물은 95℃에서 2분 동안 가열되어 주형 DNA의 가닥을 분리하고, (디자인된 프라이머의 어닐링 온도를 계산함으로써 측정된) 적당한 온도에서 냉각하여 프라이머가 주형 DNA에 어닐링되도록 한 후, 72℃로 2분 동안 가열하여 확장되도록 한다.
바람직한 구체예에서, 어닐링 온도는 증폭의 처음 3개의 사이클에서 증가되어 비-특이적 증폭을 감소시킨다. 하기 실시예 1을 참조한다. PCR 첫번째 사이클의 TM1은 대략 주형 DNA에 어닐링되는 제 2 프라이머의 3' 영역의 용융 온도이다. 어닐링 온도는 2-10 사이클에서, 바람직하게는 2번째 사이클에서, 주형 DNA에 어닐링되는 제 1 프라이머의 3'영역의 대략적인 용융 온도인 TM2로 상승될 수 있다. 어닐링 온도가 2번째 사이클에서 상승되면, 어닐링 온도에서의 차후 증가까지 어닐링 온도는 대략 동일하게 유지된다. 결국, 어닐링 온도가 TM2로 증가되는 어떤 사이클에서, 바람직하게는 3번째 사이클에서, 어닐링 온도는 TM3으로 상승될 수 있는데, 이것은 전체 제 2 프라이머의 대략적인 용융 온도이다. 3번째 사이클 후, 나머지 사이클에 대한 어닐링 온도는 대략 TM3에서 일 수 있거나 또는 더 증가될 수 있다. 이 예에서, 어닐링 온도는 2번째 사이클 및 3번째 사이클에서 증가된다. 그러나, 어닐링 온도는 더 이상의 온도 증가 없이 사이클 1에서의 낮은 어닐링 온도로부터 사이클 2의 높은 어닐링 온도로 증가될 수 있거나 또는 어닐링 온도는 어떤 수의 점진적인 단계로 낮은 어닐링 온도로부터 높은 어닐링 온도까지 점진적으로 변화할 수 있다. 예를 들어, 어닐링 온도는 사이클 2, 3, 4, 5, 6 등에서 변화할 수 있다.
어닐링 후, 각 사이클에서의 온도는 "확장" 온도로 증가하여 프라이머가 "확장"되도록 하며 확장 후 각 사이클의 온도는 변성 온도로 증가된다. 크기에서 500 염기 쌍 미만인 PCR 생산물에 있어서, 각 사이클의 확장 단계는 제외하고 변성 및 어닐링 단계만 수행할 수 있다. 전형적인 PCR 반응은 상기 설명된 것과 같이 25 내지 45 사이클의 변성, 어닐링 및 확장으로 구성된다. 그러나, 앞서 서술한 것과 같이, 한 사이클의 증폭이 본 발명의 실행에 충분할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 다수의 프라이머 세트는 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 또는 20 사이클 이상 동안 주형 DNA를 증폭하는데 사용될 수 있고, 증폭된 생성물은 단일 프라이머 세트 또는 다수의 프라이머 세트의 일부로 반응에서 더욱 증폭된다. 바람직한 구체예에서, 낮은 농도의 각 프라이머 세트는 프라이머-이합체 형성을 최소화하는데 사용된다. 낮은 농도의 시작 DNA는 다수의 프라이머 세트를 사용하여 증폭될 수 있다. 1-10,10-20, 20-30,30-40, 40-50,50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-1000, 및 1000 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는 프라이머 세트는 처음 증폭 반응에 사용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 증폭된 생성물은 단일 프라이머 세트로 제 2 반응에서증폭된다. 또 다른 구체예에서, 증폭된 생성물은 2-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150, 150-200, 200-250, 및 250 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 프라이머 쌍 세트로 더욱 증폭된다.
다수의 프라이머 세트는 주형 DNA의 최소량이 검출될 수 있는 유전자좌의 수에 제한되지 않도록 관심있는 유전자좌를 증폭할 수 있다. 예를 들어, 주형 DNA가 단일 세포로부터 분리되거나 또는 모계 주형 DNA 및 태아 주형 DNA 모두를 포함하는 임신한 자성으로부터 주형 DNA가 획득되면, 낮은 농도의 각 프라미어 세트는 관심있는 유전자좌를 증폭하는 제 1 증폭 반응에서 사용될 수 있다. 낮은 농도의 프라이머는 프라이머-이합체의 형성을 감소시키고 프라이머가 주형 DNA에 어닐링되어 중합효소로 하여금 확장하게 하는 가능성을 증가시킨다. 다수의 프라이머 세트로 수행되는 최적의 사이클 수는 프라이머의 농도에 의해 결정된다. 제 1 증폭 반응 후, 관심있는 유전자좌를 더욱 증폭하기 위해 추가적인 프라이머가 첨가될 수 있다. 대안으로, 증폭된 생성물은 각 반응에서의 단일 프라이머 또는 다수의 프라이머 세트 중 일부를 사용하여 더욱 증폭될 수 있다. 예를 들어, 150 개의 프라이머 세트가 제 1 증폭 반응에 사용되었다면, 10 프라이머 세트는 제 1 반응으로부터의 생성물을 더욱 증폭하는데 사용될 수 있다.
E. coli DNA 중합효소, E. coli DNA 중합효소 1의 Klenow 절편, T7 DNA 중합효소, T4 DNA 중합효소, Taq 중합효소, Pfu DNA 중합효소, Vent DNA 중합효소, 박테리오파아지 29, REDTaq™ Genomic DNA 중합효소, 또는 시퀘나제를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 프라이머 확장을 촉매작용하는 어떠한 DNA 중합효소도 사용될수 있다. 바람직하게는, 열 안정성 DNA 중합효소가 사용된다. "핫-스타트(hot-start)" PCR 또한 수행될 수 있는데 여기에서 반응은 중합효소의 첨가에 앞서 95℃에서 2분 동안 가열되거나 또는 사이클 1에서 제 1 가열 단계까지 중합효소가 비활성인 상태로 유지될 수 있다. "핫 스타트" PCR은 비특이적 증폭을 최소화하는데 사용될 수 있다. 어떠한 수의 PCR 사이클이 DNA 증폭에 사용될 수 있는데, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45 사이클을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 가장 바람직한 구체예에서, 수행된 PCR 사이클 수는 각각의 관심있는 유전자좌가 같은 몰수로 생산되는 것으로 한다.
III. 증폭된 DNA의 정제
증폭된 DNA의 정제는 본 발명의 실행에 있어서 불필요하다. 그러나, 한 구체예에서, 정제가 바람직하다면, 프라이머 (제 1 또는 제 2 프라이머)의 5' 말단이 태그로 변형되어 PCR 생산물의 정제를 용이하게 할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제 1 프라이머는 PCR 생산물의 정제를 용이하게 태그로 변형된다. 상이한 집단 내로 PCR 생산물을 분리하는 것이 요구될 때 상이한 변형이 이용될 수 있음에도 불구하고, 변형은 모든 프라이머에 대해 동일한 것이 바람직하다.
태그는 방사선 동위원소, 형광 리포터 분자, 화학발광 리포터 분자, 항체, 항체 절편, 헵텐, 비오틴, 비오틴의 유도체, 포토비오틴, 이미노비오틴, 디곡시게닌, 아비딘, 효소, 아크리디늄, 당, 효소, 아포효소, 동형다량체적 올리고뉴클레오티드, 호르몬, 강자성 부분, 상자성 부분, 반자성 부분, 인광성 부분, 발광성 부분, 전자화학발광성 부분, 염색성 부분, 검출가능한 전자 회전 공명, 전기적 용량,유전체적 상수 또는 전기 전도성을 갖는 부분, 및 그것의 조합이 될 수 있다.
한 예로서, 프라이머의 5' 말단은 비오틴화될 수 있다 (Kandpal 등,NucleicAcids Res. 18: 1789-1795 (1990) ; Kaneoka 등,Biotechniques 10: 30-34 (1991) ; Green 등,Nucleic Acids Res. 18: 6163-6164 (1990)). 비오틴은 게놈 DNA로부터 또는 관심있는 것이 아닌 다른 어떤 DNA 분자로부터 복제 DNA를 정제하는데 사용될 수 있는 친화적 태그를 제공한다. 비오틴화된 분자는 Roche Molecular Biochemicals 사의 스트렙타웰 투명한 고결합성 플레이트(Roche Molecular Biochemical, 2001 생화학제품 카탈로그에 기재된, 카탈로그 번호 1 645 692)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 스트렙타비딘 코팅 매트릭스를 사용하여 정제될 수 있다.
관심있는 각 유전자좌의 PCR 생산물은 스트렙타비딘 코팅 플레이트의 개별적인 웰에 위치된다. 대안으로, 관심있는 유전자좌의 PCR 생산물은 수집되어 Roche Molecular Biochemicals 사의 고 결합성 플레이트인 스트렙타웰(Roche Molecular Biochemical, 2001 생화학제품 카탈로그에 기재된, 카탈로그 번호 1 645 692)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 스트렙타비딘 코팅 매트릭스 내에 위치된다.
증폭된 DNA는 또한 예를 들어, 표준 프로토콜을 이용한 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법과 같은 당업계에 공지된 비-친화적 방법을 사용하여 주형 DNA로부터 분리될 수 있다.
IV. 증폭된 DNA의 효소 절단
증폭된 DNA는 당업계에 공지된 표준 프로토콜을 사용하여 제 1 또는 제 2 프라이머 상에 제공되는 서열을 인식하는 제한 효소로 절단될 수 있다(도. 6A-6D). 제한 효소 절단은 당업계에 주지된 표준 프로토콜을 사용하여 수행된다. 효소는 제 1 또는 제 2 프라이머로 생성되는 제한 효소 인식 부위에 의존하여 사용된다. 프라이머 상에 생성되는 제한 효소 인식 부위의 상세 설명에 대해서는, 상기 "프라이머 디자인"편을 참조한다.
IIS 형 제한 효소는 이것이 인식 부위 외부의 대략 10 내지 20 염기 쌍을 절단한다는 점에서 유용하다. 바람직하게, 사용된 IIS 형 제한 효소는 5' 돌출부 및 함몰된 3'말단을 생성하는 것으로, BceA I 및 BsmF I을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, 표 1 참조). 가장 바람직한 구체예에서, (정방향 또는 역방향의) 제 2 프라이머는 BsmF I 또는 BceA I을 위한 제한 효소 인식 서열을 포함한다. IIS 형 제한 효소인 BsmF I은 핵산 서열 GGGAC를 인식하고, 안티센스 가닥에서 인식 부위로부터 14 뉴클레오티드 및 센스 가닥에서 인식 부위로부터 10 뉴클레오티드를 절단한다. BsmF I로의 절단은 4 염기의 5' 돌출부를 생성한다.
예를 들어, 증폭 후 제한 효소 인식 부위가 관심있는 유전자좌로부터 13 염기가 되도록 제 2 프라이머가 디자인되면, 절단 후 관심있는 유전자좌는 5' 돌출부에서 첫번째 염기이고(3'에서 5'으로 해독), 함몰된 3'말단은 관심있는 유전자좌로부터 하나의 염기이다. 3'함몰 말단은 관심있는 유전자좌에 상보적인 뉴클레오티드로 채워 넣을 수 있다. 돌출부의 한 염기는 디데옥시뉴클레오티드로 채워 넣을 수 있다. 그러나, 돌출부의 1, 2, 3 또는 4 염기가 데옥시뉴클레오티드 또는 디데옥시뉴클레오티드 및 데옥시뉴클레오티드의 혼합물을 사용하여 채워 넣어질 수 있다.
제한 효소 BsmF I은 DNA를 센스 가닥에서는 인식 부위로부터 10 뉴클레오티드 절단하고 안티센스 가닥에서는 인식 부위로부터 14 뉴클레오티드를 절단한다. 그러나, 서열 의존 방식에서, 제한 효소 BsmF I은 또한 센스 가닥에서는 인식 부위로부터 11 뉴클레오티드 절단하고 안티센스 가닥에서는 인식 부위로부터 15 뉴클레오티드를 절단한다. 따라서, 10/14에서 절단된 DNA 분자 및 11/15에서 절단된 DNA 분자로 구성된 두 집단의 DNA 분자가 절단 후 존재한다. BsmF I을 위한 인식 부위가 증폭된 생성물에서 관심있는 유전자좌로부터 13 염기라면, DNA 분자는 11/15 지점에서 절단되어 돌출부의 제 2 지점에 관심있는 유전자좌를 포함하는 5' 돌출부를 생성할 것이다(3'에서 5'으로 해독). DNA 분자의 3'함몰 말단은 표지된 뉴클레오티드로 채워 넣어질 수 있다. 예를 들어, 표지된 디데옥시뉴클레오티드를 사용하면, 11/15에서 절단된 분자의 3'함몰 말단은 관심있는 유전자좌에서 유해된 염기에 상응하는 하나의 염기로 채워지고, 10/14에서 절단된 분자의 3'함몰 말단은 관심있는 유전자좌에 상응하는 하나의 염기로 채워질 수 있다. 10/14 지점에서 절단된 DNA 분자 및 11/15 지점에서 절단된 DNA 분자는 크기 및, 통합된 뉴클레오티드의 검출에 의해 분리될 수 있다. 이것은 관심있는 유전자좌 앞에 있는 뉴클레오티드의 검출, 관심있는 유전자좌의 검출, 및 잠재적으로 관심있는 유전자좌 뒤의 세 염기 검출을 모두 허용한다.
대안으로, 관심있는 유전자좌로부터 유래한 염기 및 관심있는 유전자좌가 상이한 뉴클레오티드라면, 11/15에서 절단된 분자의 3'함몰 말단은 상류 염기에 상보적인 데옥시뉴클레오티드로 채워 넣어질 수 있다. 잔류 데옥시뉴클레오티드는 세척으로 제거하고, 관심있는 유전자좌 부위는 표지된 데옥시뉴클레오티드, 표지되지 않은 데옥시뉴클레오티드, 표지된 디데옥시뉴클레오티드, 또는 표지되지 않은 디데옥시뉴클레오티드 중 하나로 채워 넣어질 수 있다. 채우기 반응 후, 뉴클레오티드는 어떠한 적당한 방법에 의해 검출될 수 있다. 따라서, dNTP로의 첫번째 채우기 반응 후, 10/14 및 11/15에서 절단된 분자의 3'함몰 말단은 관심있는 유전자좌로부터 떨어진다. 3'함몰 말단은 하나의 염기로 채워 넣어질 수 있는데, 이것은 관심있는 유전자좌, 2 염기, 3 염기 또는 4 염기에 상응한다.
제한 효소 BceA I은 핵산 서열 ACGGC를 인식하고 센스 가닥에서는 인식 부위로부터 12 뉴클레오티드를 절단하고 안티센스 가닥에서는 인식 부위로부터 14 뉴클레오티드를 절단한다. 제 2 프라이머 상에서 BceA I을 위한 인식 부위로부터의 거리가 관심있는 유전자좌로부터 13 염기가 되도록 디자인하면 (도. 4A-4D 참조), BceA I으로의 절단은 관심있는 유전자좌를 포함하는 2 염기의 5' 돌출부 및 관심있는 유전자좌로부터 유래한 함몰된 3'말단을 생성할 것이다. 관심있는 유전자좌는 5' 돌출부에서 제 1 뉴클레오티드이다(3'에서 5'으로 해독).
BsmF I 보다는 훨씬 더 낮은 빈도로 나타나기는 하지만, 제한 효소 BceA I에서도 대체 절단이 나타난다. 제한 효소 BceA I은 센스 가닥에서는 인식 부위로부터 13 뉴클레오티드 그리고 안티센스 가닥에서는 인식 부위로부터 15 뉴클레오티드를 절단할 수 있다. 따라서, 12/14에서 절단된 DNA 분자 및 13/15에서 절단된 DNA 분자로 구성된 두 집단의 DNA 분자가 존재한다. 제한 효소 인식 부위가 증폭된 생성물에서 관심있는 유전자좌로부터 13 염기라면, 13/15 지점에서 절단된 DNA 분자는 돌출부의 제 2 지점에서 관심있는 유전자좌를 포함하는 5' 돌출부를 생성한다 (3'에서 5'으로 해독). 표지된 디데옥시뉴클레오티드는 DNA 분자의 3'함몰 말단을 채워 넣는데 사용될 수 있다. 3/15에서 절단된 DNA 분자는 채워진 관심있는 유전자좌 유래의 염기를 가질 것이고, 12/14에서 절단된 DNA 분자는 채워진 관심있는 유전자좌 부위를 가질 것이다. 13/15에서 절단된 DNA 분자 및 12/14에서 절단된 것은 크기 및, 검출되는 통합된 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다. 따라서, 대체 절단은 추가적인 서열 정보를 얻는데 사용될 수 있다.
대안으로, 5' 돌출부에 있는 두 염기가 상이하다면, 13/15에서 절단된 DNA 분자의 3'함몰 말단은 돌출부에 있는 제 1 염기에 상보적인 데옥시뉴클레오티드로 채워 넣어질 수 있고, 과량의 데옥시뉴클레오티드는 세척으로 제거한다. 채우기 반응 후, 12/14에서 절단된 DNA 분자 및 13/15에서 절단된 DNA 분자는 관심있는 유전자좌로부터 유래한 것이다. 3'함몰 말단은 표지된 데옥시뉴클레오티드, 표지되지 않은 데옥시뉴클레오티드, 표지된 디데옥시뉴클레오티드, 또는 표지되지 않은 디데옥시뉴클레오티드 중 하나로 채워 넣어질 수 있다.
복제된 관심있는 유전자좌 중 어떤 것에 대하여 프라이머가 상이한 인식 부위를 제공한다면, 모든 필요한 제한 효소는 복제된 DNA를 절단하도록 동시에 첨가될 수 있다. 대안으로, 상이한 제한 효소 절단은 그 제한 효소에 특이적으로 생성물이 절단되도록 동시에 하나의 제한 효소를 사용하여 서열 내에 만들어질 수 있다.
효소의 농도, 온도, 완충액 조건, 및 절단 시간을 포함하지만 이에 제한되지 않는 최적 제한 효소 절단 조건은 각 제한 효소에 대하여 최적화될 수 있다. 예를 들어, 원할 경우, 25-16, 16-12℃, 12-8℃, 8-4 ℃, 또는 4-0℃를 포함하지만 이에 제한되지 않는 더 낮은 온도에서 제한 효소 절단을 수행함으로써 IIS 형 제한 효소 BsmF I에서 나타나는 대체 절단이 감소될 수 있다.
V. 표지된 뉴클레오티드의 통합
제 2 프라이머 상의 서열을 인식하는 제한 효소로의 절단은 관심있는 유전자좌를 포함하는 함몰된 3'말단 및 5' 돌출부를 생성한다(도 1G). 함몰된 3'말단은 표지되지 않거나 또는 표지된 뉴클레오티드 또는 표지되지 않은 뉴클레오티드와 표지된 뉴클레오티드의 조합 하에서 5' 돌출부를 주형으로 사용하여 채워 넣어질 수 있다. 뉴클레오티드는 검출을 허용하는 어떤 타입의 화학기 또는 부분로 표지될 수 있고 이것은 방사성 분자, 형광 분자, 항체, 항체 절편, 헵텐, 탄수화물, 비오틴, 및 비오틴의 유도체, 인광성 부분, 발광 부분, 전자화학발광 부분, 염색 부분, 및 검출가능한 전자 회전 공명, 전기적 용량, 유전체적 상수 또는 전기 전도성을 갖는 부분를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 뉴클레오티드는 하나 이상의 화학기 또는 부분로 표지될 수 있다. 각 뉴클레오티드는 동일한 화학기 또는 부분로 표지될 수 있다. 대안으로, 각각의 상이한 뉴클레오티드는 상이한 화학기 또는 부분로 표지될 수 있다. 표지된 뉴클레오티드는 dNTPs, ddNTPs, 또는 dNTPs 및 ddNTPs의 혼합물이 될 수 있다. 표지되지 않은 뉴클레오티드는 dNTPs, ddNTPs 또는 dNTPs 및 ddNTPs의 혼합물이 될 수 있다.
뉴클레오티드를 통합하기 위해 어떤 조합의 뉴클레오티드가 사용될 수 있고 이것은 표지되지 않은 데옥시뉴클레오티드, 표지된 데옥시뉴클레오티드, 표지되지 않은 디데옥시뉴클레오티드, 표지된 디데옥시뉴클레오티드, 표지 및 표지되지 않은 데옥시뉴클레오티드의 혼합물, 표지 및 표지되지 않은 디데옥시뉴클레오티드의 혼합물, 표지된 데옥시뉴클레오티드 및 표지된 디데옥시뉴클레오티드의 혼합물, 표지된 데옥시뉴클레오티드 및 표지되지 않은 디데옥시뉴클레오티드의 혼합물, 표지되지 않은 데옥시뉴클레오티드 및 표지되지 않은 디데옥시뉴클레오티드의 혼합물, 표지되지 않은 데옥시뉴클레오티드 및 표지된 디데옥시뉴클레오티드의 혼합물, 디데옥시뉴클레오티드 유사체, 데옥시뉴클레오티드 유사체, 디데옥시뉴클레오티드 유사체 및 데옥시뉴클레오티드 유사체의 혼합물, 인산화 뉴클레오시드 유사체, 2'-데옥시뉴클레오티드-5'-삼인산, 및 변형된 2'-데옥시뉴클레오티드-5'-삼인산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 도 1H에 나타난 것과 같이, 중합효소의 존재 하에서, 3'함몰 말단은 5' 돌출부를 주형으로서 사용하여 형광 ddNTP로 채워 넣어질 수 있다. 통합된 ddNTP는 형광 검출법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 어떤 적당한 방법을 사용하여 검출될 수 있다.
모든 4개의 뉴클레오티드는 상이한 형광기로 표지될 수 있는데, 이것은 반응이 모든 4개의 표지된 뉴클레오티드의 존재하에서 수행되도록 할 수 있다. 대안으로, 4개의 독립적인 "채우기" 반응은 각각의 관심있는 유전자좌에 대해 수행될 수 있는데 ; 4개의 각 반응물은 상이한 표지된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다 (예를들어, ddATP*, ddTTP*, ddGTP*, 또는 ddCTP*, 여기에서 *는 표지된 뉴클레오티드를 나타낸다). 각각의 뉴클레오티드는 상이한 화학기 또는 동일한 화학기로 표지될 수 있다. 표지된 뉴클레오티드는 디데옥시뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드가 될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 뉴클레오티드는 플루오레세인, 피렌, 7-메톡시쿠마린, Cascade Blue. TM., Alexa Flur 350, Alexa Flur 430, Alexa Flur 488, Alexa Flur 532, Alexa Flur 546, Alexa Flur 568, Alexa Flur 594, Alexa Flur 633, Alexa Flur 647, Alexa Flur 660, Alexa Flur 680, AMCA-X, 디알킬아미노쿠마린, Pacific Blue, Marina Blue, BODIPY 493/503, BOD1PY Fl-X, DTAF, Oregon Green 500, Dansyl-X, 6-FAM, Oregon Green 488, Oregon Green 514, Rhodamine Green-X, Rhodol Green, Calcein, Eosin, 브롬화 에티듐, NBD, TET, 2',4',5',7'-테트라브로모설폰플루오레세인, BODIPY-R6G, BODIPY-FI BR2, BODIPY 530/550, HEX, BODIPY 558/568, BODIPY-TMR-X., PyMPO, BODIPY 564/570, TAMRA, BODIPY 576/589, Cy3, Rhodamine Red-x, BODIPY 581/591, 카르복시크로다민, Texas Red-X, BODIPY-TR-X., Cy5, SpectrumAqua, SpectrumGreen #1, SpectrumGreen #2, SpectrumOrange, SpectrumRed, 또는 나프토플루오레세인을 포함하지만 이에 제한되지 않는 형광 염료로 표지될 수 있다.
또 다른 구체예에서, "채우기" 반응은 형광물질로 표지된 dNTP로 수행될 수 있는데, 여기에서 뉴클레오티드는 상이한 형광기로 표지된다. 통합된 뉴클레오티드는 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)를 포함하지만 이에 제한되지않는 어떤 적당한 방법에 의해 검출될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 표지된 ddNTP 및 표지되지 않은 dNTP의 혼합물은 SNP 또는 관심있는 유전자좌의 함몰된 3'말단을 채워 넣는데 사용될 수 있다. 바람직하게, 5' 돌출부는 하나 이상의 염기로 구성되고, 2, 3, 4, 5, 6 또는 6 이상의 염기를 포함하되 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 5' 돌출부가 서열 "XGAA"로 구성된다면 (여기에서 X는 관심있는 유전자좌, 예를 들어 SNP이다), 표지된 ddNTP 및 표지되지 않은 dNTP의 혼합물로 채워 넣는 것은 몇몇 상이한 DNA 절편을 생산할 수 있다. 표지된 ddNTP가 "X" 지점에서 통합되면, 반응이 종결되어 단일의 표지된 염기가 통합될 것이다. 그러나 표지되지 않은 dNTP가 통합되면, 중합효소는 표지된 ddNTP가 통합될 때까지 다른 염기를 계속해서 통합시킨다. 처음 두 개의 통합된 뉴클레오티드가 dNTP이고, 세번째가 ddNTP이면, 3'함몰 말단은 세 염기에 의해 확장될 것이다. 이 DNA 절편은 1, 2, 또는 4 염기로 확장되는 다른 DNA 절편으로부터 크기에 의해 분리될 수 있다. 표지된 ddNTP 및 표지되지 않은 dNTP의 혼합물은 돌출부의 모든 염기가 채워지는 것을 허용하며, 관심있는 유전자좌, 예를 들어, SNP에 대한 추가적인 서열 정보를 제공한다(도. 7E 및 9D 참조).
표지된 뉴클레오티드의 통합 후, 증폭된 DNA는 제 1 프라이머에 의해 제공된 서열을 인식하는 제한 효소로 절단될 수 있다. 예를 들어, 도 11에서, 증폭된 DNA는 영역 "a"에 결합하는 제한 효소로 절단되는데, 이것은 스트렙타비딘 매트릭스로부터 통합된 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 절편을 방출한다.
대안으로, 각각의 관심있는 유전자좌에 대한 각 프라이머 쌍 중 하나의 프라이머는 마이크로타이터 플레이트의 웰을 포함하지만 이에 제한되지 않는 고체 지지물 매트릭스에 부착될 수 있다.
예를 들어, 스트렙타비딘-코팅 마이크로타이터 플레이트는 프라이머 쌍으로 증폭 반응을 하는데 사용될 수 있는데, 여기에서 하나의 프라이머는 비오틴화 된다. 우선, 비오틴화된 프라이머를 스트렙타비딘-코팅 마이크로타이터 플레이트에 결합시킨다. 그 다음, 플레이트를 관심있는 유전자좌의 PCR 증폭을 위한 반응 용기로서 사용한다. 증폭 반응이 완료된 후, 과량의 프라이머, 염, 및 주형 DNA는 세척으로 제거될 수 있다. 증폭된 DNA는 마이크로타이터 플레이트에 부착되어 잔존한다. 증폭된 DNA는 제 2 프라이머 상의 서열을 인식하여 관심있는 유전자좌를 포함하는 5' 돌출부를 생성하는 제한 효소로 절단할 수 있다. 절단된 절편은 세척으로 제거될 수 있다. 절단 후, SNP 부위 또는 관심있는 유전자좌는 5' 돌출부에서 노출된다. 함몰된 3'말단은 표지된 뉴클레오티드로 채워지고, 이것은 중합효소의 존재하에서 형광s ddNTP를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 표지된 DNA는 제 1 프라이머의 5' 영역에 있는 제한 효소 서열로 절단됨으로써 마이크로타이터 플레이트 내에서 상청액으로 방출될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 하나의 뉴클레오티드는 유전자의 다수의 대립유전자 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 확장 반응을 종결시키는 뉴클레오티드는 한 유전자의 다수의 대립유전자 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 하나의 대립유전자에서, 종결 뉴클레오티드는 상기 대립유전자의 5' 돌출부에 있는 관심있는 유전자좌에 상보적이다. 뉴클레오티드가 통합되고 반응이 종결된다. 상이한 대립유전자에서, 종력 뉴클레오티드는 관심있는 유전자좌에 상보적인 것이 아니며, 이는 상이한 대립유전자의 관심있는 유전자좌에 비-종결 뉴클레오티드가 통합되는 것을 허용한다. 그러나, 종결 뉴클레오티드는 상기 상이한 대립유전자의 5' 말단에 있는 관심있는 유전자좌로부터 하류인 뉴클레오티드에 상보적이다. 대립유전자의 서열은 종결 뉴클레오티드의 통합 패턴을 분석함으로써 측정될 수 있다. 종결 뉴클레오티드는 표지되거나 또는 표지되지 않을 수 있다.
또 다른 구체예에서, 종결 뉴클레오티드는 확장 반응을 종결시키거나 저지하며, 디데옥시뉴클레오티드, 디데옥시뉴클레오티드 유도체, 디데옥시뉴클레오티드 유사체, 디데옥시뉴클레오티드 동족체, 황 화학기를 갖는 디데옥시뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드 유도체, 데옥시뉴클레오티드 동족체, 데옥시뉴클레오티드 유사체, 황 화학기를 갖는 데옥시뉴클레오티드, 아라비노시드 삼인산, 아라비노시드 삼인산 유사체, 아라비노시드 삼인산 동족체, 또는 아라미노시드 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 구체예에서, 형광 염료를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 하나의 신호 생성 부분 태그로 표지된 종결 뉴클레오티드는 관심있는 유전자좌의 대립유전자 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 하나의 신호 생성 부분 태그로 표지된 단일 뉴클레오티드의 사용은 상이한 형광 부분를 사용할 때 발생할 수 있는 어떤 어려움을 제거한다. 더욱이, 하나의 신호 생성 부분 태그로 표지된 하나의 뉴클레오티드를 관심있는 유전자좌의 대립유전자 서열 측정에 사용하는 것은 반응의 수를 줄이고, 피펫사용으로 인한 오차를 제거한다.
예를 들어, 제 2 프라이머가 BsmF1에 대한 제한효소 인식부위를 함유한다면, 절단 후 4개 염기의 5' 돌출부를 생성할 것이다. 제 2 프라이머는 관심있는 좌가 그 돌출부의 제 1 위치에 위치하도록 디자인될 수 있다. 대표적 돌출부는 아래에 도시되는데, R은 관심있는 유전자좌를 가리킨다.
5' CAC
3' GTG R T G G
돌출부 위치 1 2 3 4
가변부가 동형접합성인지 이형접합성인지 측정하기 위하여, 한 개의 신호 생산 부분 태그를 갖는 한 개의 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 예를 들어, 위치 2, 3 또는 4에서의 돌출부 내에 아데닌 또는 구아닌이 있다면, 만약 가변부에 아데닌 (A) 또는 구아닌 (G)이 있다면, 아데닌 또는 구아닌은, 관심있는 유전자좌의 대립유전자의 서열을 결정하기 위하여 사용될 수 있다.
예를 들어, 돌출부의 위치 2의 뉴클레오티드가, 아데닌에 상보적인 티미딘인 경우, 관심있는 유전자좌의 대립유전자의 서열을 결정하기 위하여, 표지된 ddATP, 비표지된 dCTP, dGTP, 및 dTTP가 사용될 수 있다. ddATP는 형광 염료를 포함하지만 이에 한정되지 않는 어떤 신호 생성 부분으로도 표지될 수 있다. 만약 주형 DNA가 아데닌과 동형접합성이면, 표지된 ddATP*는 대립유전자의 돌출부에 상보적 위치 1에 통합될 것이고 돌출부에 상보적 위치 2, 3 및 4 뉴클레오티드 통합은 관찰되지 않을 것이다.
대립유전자 1 5' CCCA*
3' GGG T T G G
돌출부 위치 1 2 3 4
대립유전자 2 5' CCCA*
3' GGG T T G G
돌출부 위치 1 2 3 4
돌출부에 상보적 위치 1에서 표지된 ddATP의 통합에 대응하는 한 개의 신호가 관찰될 것이고, 이는 이 위치의 아데닌에 대하여 그 개체가 동형접합성임을 나타낸다. 이 표지 방법은 상이한 양자계수를 갖는 상이한 염료를 사용하는 것으로부터 발생될 수 있는 어떤 문제점도 제거한다.
동형접합성 구아닌:
만약 주형 DNA가 구아닌에 대하여 동형접합성이면, ddATP는 돌출부에 상보적 위치 1에 통합되지 않을 것이지만, ddATP는 첫번째 가능한 위치에 통합될 것이고, 그것은 이 경우에는 돌출부에 상보적 위치 2이다. 예를 들어 만약 돌출부의 두번째 위치가 티미딘에 해당한다면 다음과 같다:
대립유전자 1 5' CCCG A*
3' GGG C T G G
돌출부 위치 1 2 3 4
대립유전자 2 5' CCCG A*
3' GGG C T G G
돌출부 위치 1 2 3 4
돌출부에 상보적 위치 2에서 표지된 ddATP의 통합에 대응하는 한 개의 신호가 관찰될 것이고, 이는 구아닌에 대하여 그 개체가 동형접합성임을 나타낸다. 돌출부에 대하여 상보적 위치 2에서 채워진 분자는 돌출부에 상보적 위치 1에서 채워진 분자와 상이한 분자량을 갖을 것이다.
이형접합성 조건:
대립유전자 1 5' CCCA*
3' GGG T T G G
돌출부 위치 1 2 3 4
대립유전자 2 5' CCCG A*
3' GGG C T G G
돌출부 위치 1 2 3 4
두 개의 신호가 관찰될 것인데; 제 1 신호는 돌출부에 상보적 위치 1에 채워지는 ddATP에 대응하고 제 2 신호는 돌출부에 상보적 위치 2에 채워지는 ddATP에 대응한다. 두 개의 신호는 분자량에 기초하여 분리될 수 있는데; 대립유전자 1과 대립유전자 2는 단일 염기쌍 만큼 분리될 것이며, 이는 신호의 용이한 검출 및 정량화를 허용한다. 위치 1에서 채워지는 분자는, 겔 전기영동, 모세관 겔 전기영동, DNA 서열결정, 및 질량분광측정을 포함하지만 이에 한정되지 않는 분자량에 기초한 어떤 분리 방법을 사용하여 위치 2에서 채워지는 분자와 구별될 수 있다. 뉴클레오티드는 꼭 화학적 부분으로 표지될 필요는 없는데; 상이한 대립유전자에 대응하는 DNA 분자는 분자량에 기초하여 분리될 수 있다.
돌출부의 위치 2가 아데닌에 상보적이지 않으면, 위치 3 또는 위치 4가 아데닌에 상보적일 수 있다. 예를 들어, 돌출부의 위치 3은 뉴클레오티드 아데닌에 상보적일 수 있고, 그 경우 표지된 ddATP는 양쪽 대립유전자의 서열을 결정하기 위하여 사용될 수 있다.
아데닌에 대한 동형접합성:
대립유전자 1 5' CCCA*
3' GGG T G T G
돌출부 위치 1 2 3 4
대립유전자 2 5' CCCA*
3' GGG T G T G
돌출부 위치 1 2 3 4
구아닌에 대한 동형접합성:
대립유전자 1 5' CCCG C A*
3' GGG C G T G
돌출부 위치 1 2 3 4
대립유전자 2 5' CCCG C A*
3' GGG C G T G
돌출부 위치 1 2 3 4
이형접합성:
대립유전자 1 5' CCCA*
3' GGG T T G G
돌출부 위치 1 2 3 4
대립유전자 2 5' CCCG C A*
3' GGG C G T G
돌출부 위치 1 2 3 4
두 개의 신호가 관찰될 것인데; 제 1 신호는 돌출부에 상보적 위치 1에 채워지는 ddATP에 대응하고 제 2 신호는 돌출부에 상보적 위치 3에 채워지는 ddATP에 대응한다. 두 개의 신호는 분자량에 기초하여 분리될 수 있는데; 대립유전자 1과 대립유전자 2는 2 개의 염기쌍 만큼 분리될 것이며, 이는 분자량에 기초하여 분리하는 어떤 방법을 사용하여 검출될 수 있다.
대안으로, 위치 2 및 위치 3이 아데닌에 상보적이지 않고 (즉, 돌출부의 위치 2 및 3이 구아닌, 시토신 또는 아데닌이고) 위치 4가 아데닌에 상보적이라면, 양쪽 대립유전자의 서열을 결정하기 위하여 표지된 ddATP가 사용될 수 있다.
아데닌에 대한 동형접합성:
대립유전자 1 5' CCCA*
3' GGG T G G T
돌출부 위치 1 2 3 4
대립유전자 2 5' CCCA*
3' GGG T G G T
돌출부 위치 1 2 3 4
돌출부에 상보적 위치 1에서 ddATP로 채워진 분자의 분자량에 대응하는 한 개의 신호가 관찰될 것이며, 이는 그 개체가 가변부에서 아데닌에 대하여 동형접합성임을 나타낸다.
구아닌에 대한 동형접합성:
대립유전자 1 5' CCCG C C A*
3' GGG C G G T
돌출부 위치 1 2 3 4
대립유전자 2 5' CCCG C C A*
3' GGG C G G T
돌출부 위치 1 2 3 4
돌출부에 상보적 위치 4에서 ddATP로 채워진 분자의 분자량에 대응하는 한 개의 신호가 관찰될 것이며, 이는 그 개체가 가변부에서 구아닌에 대하여 동형접합성임을 나타낸다.
이형접합성:
대립유전자 1 5' CCCA*
3' GGG T G G T
돌출부 위치 1 2 3 4
대립유전자 2 5' CCCG C C A*
3' GGG C G G T
돌출부 위치 1 2 3 4
두 개의 신호가 관찰될 것인데; 제 1 신호는 돌출부에 상보적 위치 1에 채워지는 ddATP에 대응하고 제 2 신호는 돌출부에 상보적 위치 4에 채워지는 ddATP에 대응한다. 두 개의 신호는 분자량에 기초하여 분리될 수 있는데; 대립유전자 1과 대립유전자 2는 3 개의 염기쌍 만큼 분리될 것이며, 이는 신호의 용이한 검출 및 정량화를 허용한다. 위치 1에서 채워지는 분자는 분자량에 기초하여 위치 4에서 채워지는 분자와 구별될 수 있다.
위에서 논의한 바와 같이, 만약 가변부가 아데닌 또는 구아닌 둘 중 하나를 포함한다면, 양쪽 대립유전자를 결정하기 위하여 표지된 아데닌 또는 표지된 구아닌이 사용될 수 있다. 돌출부의 위치 2, 3 또는 4가 아데닌에 상보적은 아니지만 그 위치들 중 어느 하나가 구아닌에 상보적이라면, 주형 DNA가 아데닌 또는 구아닌에 대하여 동형접합성인지 이형접합성인지 결정하기 위하여 표지된 ddGTP가 사용될 수 있다. 예를 들어, 만약 돌출부의 위치 3이 시토신에 대응한다면, 만약 주형 DNA가 구아닌에 대하여 동형접합성이거나, 아데닌에 대하여 동형접합성이거나 또는 이형접합성이라면 다음 신호가 예상될 것이다:
구아닌에 대하여 동형접합성:
대립유전자 1 5' CCCG*
3' GGG C T C T
돌출부 위치 1 2 3 4
대립유전자 2 5' CCCG*
3' GGG C T C T
돌출부 위치 1 2 3 4
돌출부에 상보적인 위치 1에서 ddGTP로 채워진 분자의 분자량에 대응하는 한 개의 신호가 관찰될 것이고, 이는 그 개체가 구아닌에 대하여 동형접합성임을 나타낸다.
아데닌에 대하여 동형접합성:
대립유전자 1 5' CCCA A G*
3' GGG T T C T
돌출부 위치 1 2 3 4
대립유전자 2 5' CCCA A G*
3' GGG T T C T
돌출부 위치 1 2 3 4
돌출부에 상보적인 위치 3에서 ddGTP로 채워진 분자의 분자량에 대응하는 한 개의 신호가 관찰될 것이고, 이는 그 개인이 가변부에서 아데닌에 대하여 동형접합성임을 나타낸다.
이형접합성:
대립유전자 1 5' CCCG*
3' GGG C T C T
돌출부 위치 1 2 3 4
대립유전자 2 5' CCCA A G*
3' GGG T T C T
돌출부 위치 1 2 3 4
두 개의 신호가 관찰될 것인데; 제 1 신호는 돌출부에 상보적 위치 1에 채워지는 ddGTP에 대응하고 제 2 신호는 돌출부에 상보적 위치 3에 채워지는 ddGTP에 대응한다. 두 개의 신호는 분자량에 기초하여 분리될 수 있는데; 대립유전자 1과 대립유전자 2는 2 개의 염기쌍 만큼 분리될 것이며, 이는 신호의 용이한 검출 및 정량을 허용한다.
어떤 IIS 형 제한효소 또한 위에서 논의한 바와 같은 대안적 절단을 나타낸다. 예를 들어, BsmFI은 인식 부위로부터 10/14 및 11/15를 절단한다. 그러나, 절단 패턴은 상호 배타적이지 않은데; 만약 특정 서열에서 11/15 절단 패턴이 관찰된다면, 10/14 절단 또한 관찰된다. 만약 제한효소 BsmFI이 인식부위로부터 10/14 에서 절단한다면 5' 돌출부는 X1X2X3X4가 될 것이다. 만약 제한효소 BsmFI이 인식부위로부터 11/15 에서 절단한다면 5' 돌출부는 X0X1X2X3가 될 것이다. 만약 돌출부의 위치 X0가 표지된 뉴클레오티드에 상보적이라면, 표지된 뉴클레오티드는 위치 X0에서 통합될 것이고 증가된 수준의 품질 확인을 제공한다. 그것은 추가적 서열 정보를 제공한다.
예를 들어, 만약 가변부가 아데닌이나 구아닌이고 돌출부의 위치 3은 아데닌에 상보적이라면, 가변부에서의 유전자형을 결정하기 위하여 표지된 ddATP가 사용될 수 있다. 만약 11/15 돌출부의 위치 0이 아데닌에 상보적인 뉴클레오티드를 함유한다면, ddATP가 채워질 것이고 추가의 신호가 관찰될 것이다.
이형접합성:
10/14 대립유전자 1 5' CCAA*
3' GGT T G T G
돌출부 위치 1 2 3 4
10/14 대립유전자 2 5' CCAGC A*
3' GGT C G T G
돌출부 위치 1 2 3 4
11/15 대립유전자 1 5' CCA*
3' GG T T G T
돌출부 위치 0 1 2 3
11/15 대립유전자 2 5' CCA*
3' GG T C G T
돌출부 위치 0 1 2 3
세 개의 신호가 관찰될 것인데; 하나는 돌출부에 상보적 위치 0에 통합된 ddATP에 대응하고, 하나는 돌출부에 상보적 위치 1에 통합된 ddATP에 대응하고, 하나는 돌출부에 상보적 위치 3에 통합된 ddATP에 대응한다. 돌출부에 상보적 위치 0, 1 및 3에 채워진 분자는 분자량에 있어서 상이하고 겔 전기영동 및 질량분광측정을 포함하지만 이에 한정되지 않는 분자량에 기초하여 분리하는 어떤 기술을 사용하여 분리될 수 있다.
한 대립유전자에 대한 다른 대립유전자의 비율을 정량하기 위하여 또는 야생형 DNA 서열 존재하에서 돌연변이 DNA의 상대적 양을 측정할 때, 정확하고 고감도의 검출 방법이 사용되어야 한다. IIS 형 제한 효소에 의하여 나타나는 교대 절단은, 제한효소가 두가지 대립유전자에 대하여 동일하게 교대 절단 패턴(11/15)을 보이지 않을 수 있기 때문에, 한 대립유전자에 대한 다른 대립유전자의 비율을 측정하는데 어려움을 증가시킬수 있다. 예를 들어, 대립유전자 1은 80%가 10/14에서 절단되고 20%가 11/15에서 절단될 수 있다. 그러나 두 대립유전자는 서열이 상이하기 때문에, 대립유전자 2는 90%가 10/14에서 절단되고 20%가 11/15에서 절단될 수 있다.
정량화 목적으로, 돌출부의 위치 0의 뉴클레오티드가 표지된 뉴클레오티드에 상보적이지 않을 때에는 교대 절단 문제가 제거될 수 있다. 예를 들어, 가변부가 아데닌이나 구아닌에 해당하고 돌출부의 위치 3 이 아데닌에 상보적이면 (즉 티미딘이 돌출부의 위치 3에 위치한다면), 가변부의 유전자형을 결정하기 위하여 표지된 ddATP가 사용될 수 있다. 11/15 절단성에 의하여 생성된 돌출부의 위치 0이 아데닌에 상보적이지 않으면 (즉 돌출부의 위치 0이 구아닌, 시토신 또는 아데닌에 해당하면), 인식부위로부터 11/15에서 절단된 단편으로부터 추가의 신호가 관찰되지 않을 것이다. 돌출부에 대하여 상보적 위치 0은 비표지 뉴클레오티드로 채워질 수 있고, 이는 제한효소의 교대 절단 패턴으로부터 관찰되는 어떤 복잡함도 제거한다. 이 방법은 돌연변이 또는 단일 뉴클레오티드 다형성을 포함하지만 이에 한정되지 않는 가변부의 비율을 정량하는 고도로 정확한 방법을 제공한다.
예를 들어, SNP X가 아데닌 또는 구아닌일 수 있다면, 이 표지 방법은, 제한효소가 가변적 절단패턴의 관점에서 대립유전자 사이의 어떤 차이점을 나타내는지 여부를 결정하지 않고, 아데닌에 대응하는 대립유전자 및 구아닌에 대응하는 대립유전자의 정량을 허용한다.
이형접합성:
10/14 대립유전자 1 5' CCGA*
3' GGC T G T G
돌출부 위치 1 2 3 4
10/14 대립유전자 2 5' CCGGC A*
3' GGC C G T G
돌출부 위치 1 2 3 4
BsmFI의 교대 절단 성질에 의하여 생성된 돌출부는 아래에 도시된다:
11/15 대립유전자 1 5' CC
3' GG C T G T
돌출부 위치 0 1 2 3
11/15 대립유전자 2 5' CC
3' GG C C G T
돌출부 위치 0 1 2 3
표지된 ddATP 및 비표지 dGTP, dCTP, dTTP로 채운 후, 다음 분자가 생성될 것이다:
11/15 대립유전자 1 5' CC GA*
3' GG C T G T
돌출부 위치 0 1 2 3
11/15 대립유전자 2 5' CC GGCA*
3' GG C C G T
돌출부 위치 0 1 2 3
두 개의 신호가 관찰되는데; 하나는 돌출부에 상보적 위치 1에서 ddATP로 채워진 분자에 대응하는 것이고 다른 하나는 돌출부에 상보적 위치 3에서 ddATP로 체워진 분자에 대응하는 것이다. 11/15 돌출부의 위치 0은 비표지 뉴클레오티드로 채워지고, 이는 대립유전자 1 상의 가변부의 뉴클레오티드와 대립유전자 2 상의 가변부의 뉴클레오티드의 비율을 정량하는데 어떤 어려움도 제거한다.
아데닌, 아데닌 유도체, 아데닌 유사체, 구아닌, 구아닌 유도체, 구아닌 유사체, 시토신, 시토신 유도체, 시토신 유사체, 티미딘, 티미딘 유도체, 또는 티미딘 유사체, 또는 아데닌, 아데닌 유도체, 아데닌 유사체, 구아닌, 구아닌 유도체, 구아닌 유사체, 시토신, 시토신 유도체, 시토신 유사체, 티미딘, 티미딘 유도체, 또는 티미딘 유사체의 어떤 조합을 포함하는 어떤 뉴클레오티드도 사용될 수 있다.
뉴클레오티드는 방사성 분자, 형광 분자, 항체, 항체 단편, 헵튼, 탄수화물, 비오틴, 비오틴 유도체, 인광 부분, 냉광 부분, 전기화학냉광 부분, 착색 부분, 및 검출가능한 전자 회전 공명, 전기적 용량, 유전체 상수 또는 전기 전도율을 갖는 부분을 포함하지만 이에 한정되지 않는 어떤 화학적 기 또는 부분으로도 표지될 수 있다. 뉴클레오티드는 하나 이상의 화학적 기 또는 부분으로 표지될 수 있다.
다른 구체예에서, 표지된 및 비표지 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 표지된 디데옥시뉴클레오티드 및 표지된 데옥시뉴클레오티드; 표지된 디데옥시뉴클레오티드 및 비표지 데옥시뉴클레오티드; 비표지 디데옥시뉴클레오티드 및 비표지 데옥시뉴클레오티드; 및 비표지 디데옥시뉴클레오티드 및 표지된 데옥시뉴클레오티드를 포함하지만 이에 한정되지 않는 데옥시뉴클레오티드 및 디데옥시뉴클레오티드의 어떤 조합도 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, PCR 반응에서 화학적 부분으로 표지된 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 그 때, 제한효소로 절단한 후에 생성되는 5' 돌출부를 채우기 위하여 비표지 뉴클레오티드가 사용된다. 비표지 종결자 뉴클레오티드가 관심있는 유전자좌의 대립유전자의 서열을 결정하기 위하여 비표지 뉴클레오티드 존재 하에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 만약 표지된 dTTP가 PCR 반응에서 사용되었다면 BsmFI로 절단한 후에 다음의 5' 돌출부가 생성될 수 있다:
10/14 대립유전자 1 5' CT*GA
3' GG C T G T G
돌출부 위치 1 2 3 4
10/14 대립유전자 2 5' CT*GGC A
3' GA C C G T G
돌출부 위치 1 2 3 4
비표지 dATP, 비표지 dCTP, 비표지 dGTP가 돌출부를 채우는데 사용될 수 있다. 두 개의 신호가 생성될 수 있는데; 한 신호는 돌출부에 상보적 위치 1에 비표지 ddATP로 채워진 DNA 분자에 대응하고, 제 2 신호는 돌출부에 상보적 위치 3에 비표지 ddATP로 채워진 DNA 분자에 대응한다. DNA 분자는 분자량에 기초하여 분리될 수 있고, PCR 반응 동안에 통합되었던 dTTP의 형광에 의하여 검출될 수 있다.
관심있는 표지된 DNA 유전자좌 부위는 형광 검출, DNA 서열결정 겔, 자동화 DNA 서열결정기 상의 모세관 전기영동, 미세채널 전기영동, 다른 서열결정 방법, 질량분광, 비행시간 질량분광, 4극 질량분광, 자기함수 질량분광, 전자 함수 질량분광, 적외선분광, 자외선 분광, 팔렌티오스타틱 전류측정을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 방법에 의하여, 또는 서던 블롯, 슬롯 블롯, 도트 블롯, 및 DNA 마이크로어레이를 포함하는, DNA 단편이 "프로브" 및 "표적"으로서 유용한 DNA 혼성화 기술, ELISA, 형광학, 및 형광 공명 에너지 전달(FRET) 에 의하여 분석될 수 있다.
이 표지 방법은 극도로 민감하여 관심있는 유전자좌의 대립유전자의 검출을 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6-1:10, 1:11-1:20, 1:21-1:30, 1:31-1:40, 1:41-1:50, 1:51-1:60, 1:61-1:70, 1:71-1:80, 1:81-1:90, 1:91-1:100, 1:101-1:200, 1:250, 1:251-1:300, 1:301-1:400, 1:401-1:500, 1:501-1:600, 1:601-1:700, 1:701-1:800, 1:801-1:900, 1:901-1:1000, 1:1001-1:2000, 1:2001-1:3000, 1:3001-1:4000, 1:4001-1:5000, 1:5001-1:6000, 1:6001-1:7000, 1:7001-1:8000, 1:8001-1:9000, 1:9001-1:10,000, 1:10,001-1:20,000, 1:20,001-1:30,000, 1:30,001-1:40,000, 1:40,001-1:50,000, 및 1:50,000 초과를 포함하지만 이에 한정되지 않는다양한 비율로 허용한다.
예를 들어, 이 표지 방법은 한 개의 신호생성 부분으로 표지된 한 개의 뉴클레오티드가, SNP 유전자좌에서 대립유전자의 서열을 결정하는데, 또는 정상 대립유전자의 집단 중에서 돌연변이 대립유전자를 검출하는데, 또는 항생제 감수성 박테리아로부터의 대립유전자 중에서 박테리아 세포로부터의 항생제 내성을 암호화하는 대립유전자를 검출하는데, 또는 병원성 박테리아 균주로부터의 대립유전자 중에서 비병원성 박테리아 균주로부터의 대립유전자를 검출하는데 사용되는 것을 허용한다.
위에서 나타낸 바와 같이, 관심있는 특정 유전자좌에서의 대립유전자의 서열을 결정하기 위하여 단일 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 이 방법은 한 개체가 특정 돌연변이에 대하여 동형접합성인지 이형접합성인지 결정하거나, 특정 SNP 부위에서 대립유전자의 서열을 결정하는데 특히 유용하다. 이 표지 방법은 다양한 염료의 양자 계수에 기인한 어떤 오차도 제거한다. 그것은 또한 반응을 한 웰의 마이크로타이터 플레이트나 단일 에펜돌프 시험관을 포함하지만 이에 한정되지 않는 단일 반응 용기에서 진행하는 것을 허용한다.
이 표지 방법은 동일한 샘플에서의 다수 유전적 신호의 검출에 특히 유용하다. 예를 들어, 이 방법은 모계 DNA와 태아 DNA 둘 다를 함유하는 임신 여성의 혈액, 혈청 또는 혈장 내의 태아 DNA의 검출에 특히 유용하다. 모계 DNA와 태아 DNA는 97:3 같은 비율로 혈액, 혈청 또는 혈장 내에 존재할 수 있지만, 상기 방법은 태아 DNA를 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 이 표지 방법은 동일한 집단 내의두 가지, 세 가지 또는 네 가지 상이한 유전적 신호를 검출하기 위하여 사용될 수 있다.
이 표지 방법은 야생형 대립유전자의 큰 집단 중에 존재하는 돌연변이 대립유전자를 검출하는데 특히 유용하다. 게다가, 이 표지 방법은, 야생형 대립유전자의 큰 집단 내에서 단일 돌연변이 세포의 검출을 허용한다. 예를 들어, 이 표지 방법은 정상 세포의 큰 집단 중에서 단일 암세포를 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 전형적으로, 암세포는 DNA 서열 중에 돌연변이를 갖는다. 야생형 DNA 서열의 큰 백그라운드가 있더라도, 돌연변이 DNA 서열은 확인될 수 있다. 이 표지 방법은 결장, 신장, 유방, 방광, 간, 신장, 뇌, 허파, 전립선 및 백혈병을 포함하는 혈암을 포함하지만 이에 한정되지 않는 어떤 유형의 암을 스크리닝, 검출 또는 진단하는데 사용될 수 있다.
이 표지방법은 또한 박테리아, 균류, 바이러스, 조류 및 마이코박테리아를 포함하지만 이에 한정되지 않는 병원성 생체를 검출하는데 사용될 수 있다. 그것은 또한 박테리아, 균류, 바이러스, 조류 및 마이코박테리아를 포함하지만 이에 한정되지 않는 미생물의 병원성 균주와 미생물의 비병원성 균주 사이를 구별하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 에스케리키아 콜리 (Eschericia coli) (E.coli)의 다수 균주가 있는데, 대부분은 비병원성이다. 그러나, E. 콜리 (E.coli) 0157 같은 일부 균주는 병원성이다. 상기된 표지 방법은 때로 개체의 정상의 정상세균총에 동반되는 비병원성 생체의 큰 집단내에서 병원성 미생물을 검출하는데 사용될 수 있다.
VI. 관심있는 유전자좌의 분석
관심있는 유전자좌는 형광 검출, DNA 서열결정 겔, 자동화 DNA 서열결정기 상의 모세관 전기영동 (예를 들어 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer 또는 ABI Prism 3700 Genetic Analyzer), 미세채널 전기영동, 다른 서열결정 방법, 생거 디데옥시 서열결정, 질량분광, 비행시간 질량분광, 4극 질량분광, 자기함수 질량분광, 전자 함수 질량분광, 적외선분광, 자외선 분광, 팔렌티오스타틱 전류측정을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 방법에 의하여, 또는 서던 블롯, 슬롯 블롯, 도트 블롯, 및 DNA 마이크로어레이를 포함하는, DNA 단편이 "프로브" 및 "표적"으로서 유용한 DNA 혼성화 기술, ELISA, 형광학, 및 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 의하여 분석될 수 있다.
관심있는 유전자좌는 겔 전기영동을 사용하여 분석된 후 통합된 뉴클레오티드의 형광검출이 이어질 수 있다. 관심있는 유전자좌를 분석하거나 해독하기 위한 다른 방법은 96웰 스트렙타비딘 코팅된 플레이트 상에서 직접 형광 플레이트 해독기나 형광측정기를 사용하는 것이다. 플레이트를 형광 플레이트 해독기나 Pharmacia 9200 Typhoon 같은 스캐너 상에 위치시켜 관심있는 각 유전자좌를 해독할 수 있다.
대안으로, 관심있는 유전자좌의 PCR 생산물은 수집될 수 있고 "채우기" 이후에 (도 10), 생산물은, 적당한 어떤 방법을 사용하여 크기에 따라 분리되고, 형광 검출, DNA 서열결정 겔, 자동화 DNA 서열결정기 상의 모세관 전기영동, 미세채널 전기영동, 다른 서열결정 방법, 생거 디데옥시 서열결정, 서던 블롯, 슬롯 블롯,도트 블롯, 및 DNA 마이크로어레이를 포함하는 DNA 혼성화 기술, 질량분광, 비행시간 질량분광, 4극 질량분광, 자기함수 질량분광, 전자 함수 질량분광, 적외선분광, 자외선 분광, 팔렌티오스타틱 전류측정을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동이 DNA를 크기에 따라 분리하기 위하여 사용될 수 있고 겔은 각 밴드내 형광의 색상을 결정하기 위하여 (예를 들어, ABI 377 DNA 서열결정기 또는 Pharmacia Typhoon 9200) 스캔된다.
다른 구체예에서, 관심있는 유전자좌는 관심있는 유전자좌의 3' 쪽인 뉴클레오티드의 통합을 검출함으로써 결정될 수 있는데, 상기 뉴클레오티드는 관심있는 유전자좌에서의 가능한 뉴클레오티드와 상이한 뉴클레오티드이다. 이 구체예는 SNP의 서열결정 및 검출에 특히 유용하다. DNA 중합효소가 뉴클레오티드를 통합시키는 효율 및 속도는 각 뉴클레오티드 마다 다르다.
사람 게놈 프로젝트로부터의 데이터에 따르면, 전체 SNP의 99%는 2원체이다. 관심있는 SNP의 3' 쪽 뉴클레오티드를 결정하기 위하여 사람 게놈의 서열이 사용될 수 있다. SNP 부위의 3' 쪽 뉴클레오티드가 SNP 부위에서의 가능한 뉴클레오티드와 상이한 때, SNP 부위의 서열을 결정하기 위하여 SNP의 한 개 염기 이상의 3' 쪽 염기인 뉴클레오티드가 사용될 수 있다.
예를 들어, 염색체 13 상의 SNP X 서열을 결정한다고 가정하자. 사람 게놈의 서열은 SNP X가 아데노신 또는 구아닌일 수 있고 관심있는 유전자좌의 3' 쪽 뉴클레오티드는 티미딘인 것으로 나타낸다. 증폭 후 관심있는 유전자좌로부터 13 염기 떨어지도록 디자인된 BsmFI에 대한 제한효소 인식부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 SNP X를 함유하는 DNA 단편을 증폭시킨다. 제한효소 BsmFI에 의한 절단은, 아데노신 또는 구아닌일 수 있는 관심있는 유전자좌를 함유하는 5' 돌출부를 생성한다. 절단 산물은 두개의 "채우기" 반응으로 나눌수 있다: 하나는 dTTP를 함유하고 다른 반응은 dCTP를 함유한다. 만약 관심있는 유전자좌가 구아닌에 대하여 동형접합성이면, dCTP와 혼합된 DNA 분자 만이 채워질 것이다. 만약 관심있는 유전자좌가 아데닌에 대하여 동형접합성이라면, dTTP와 혼합된 DNA 분자만이 채워질 것이다. 만약 관심있는 유전자좌가 이형접합성이라면, dCTP와 혼합된 DNA 분자가 dTTP와 혼합된 DNA 분자와 함께 채워질 것이다. 잔여 dNTP를 제거하기 위하여 세척한 후, 샘플은 표지된 ddATP로 채원지는데, 그것은 관심있는 유전자좌의 3' 쪽인 뉴클레오티드 (티미딘)에 상보적이다. 이전 반응에 의하여 채워진 DNA 분자는 표지된 ddATP로 채워질 것이다. 만약 그 개체가 아데닌에 대하여 동형접합성이라면, dTTP와 혼합된 DNA 분자는 이어서 표지된 ddATP 분자로 채워질 것이다. 그러나, dCTP 분자와 혼합된 DNA 분자는 그 뉴클레오티드를 통합하지 않았을 것이고 따라서 ddATP를 통합시킬 수 없다. dTTP와 혼합한 분자에서만 표지된 ddATP가 검출됨은 염색체 13 상의 SNP X의 뉴클레오티드가 아데노신임을 나타낸다.
다른 구체예에서, 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 돌연변이의 존재 또는 부존재에 대하여 대규모 스크리닝이 수행될 수 있다. 하나의 염색체 또는 다수의 염색체 상의 하나에서 수십 수백 수천 개의 관심있는 유전자좌가 상기 "프라이머 디자인" 절에서 기재된 바와 같은 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 프라이머는각 증폭된 관심있는 유전자좌가 상이한 크기가 되도록 디자인될 수 있다 (도 2). 관심있는 다수 유전자좌는 단일 염색체, 다수 염색체, 다수 유전자, 단일 유전자 또는 그것의 어떤 조합 상의 다수의 관심있는 유전자좌를 나타내는 한 개체로부터의 DNA 샘플일 수 있다.
사람 데이터를 분석할 때, 공지 서열은 한 개체(예를 들어 DNA가 현재 분석되고 있는 개체)로부터 결정된 구체적 서열일 수 있고, 또는 사람 게놈의 일부로서 공표된 것과 같은 보존적 서열일 수도 있다.
관심있는 이형접합성 유전자좌에서의 대립유전자 비율
한 구체예에서, 관심있는 이형접합성 유전자좌에서의 대립유전자 비율이 계산될 수 있다. 관심있는 유전자좌에서의 뉴클레오티드의 비율은 GeneScan 및 ImageQuant를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 정량될 수 있다. 예를 들어 이형접합성 SNP에 대하여, 두개의 뉴클레오티드가 있고 각각은 1:1 비율로 존재할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 다수 이형접합성 SNP가 계산될 수 있다.
한 구체예에서, 관심있는 이형접합성 유전자좌에서 대립유전자의 가변 뉴클레오티드의 비율은 계산될 수 있다. 관심있는 유전자좌에 존재하는 각 가변 뉴클레오티드의 비율은 GeneScan 및 ImageQuant를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 정량될 수 있다. 예를 들어, 이형접합성 SNP에 대하여, 두개의 뉴클레오티드가 있고 각각은 1:1 비율로 존재할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 다수 이형접합성 SNP 의 비율이 계산될 수 있다.
다른 구체예에서, 한 염색체 상의 관심있는 이형접합성 유전자좌에서의 대립유전자의 비율이 합하여지고 상이한 염색체 상의 관심있는 이형접합성 유전자좌에서의 대립유전자의 비율과 비교된다. 바람직한 구체예에서, 한 염색체 상의 관심있는 다수 이형접합성 유전자좌에서의 대립유전자의 비율이 합하여지고 상이한 염색체 상의 관심있는 다수 이형접합성 유전자좌에서의 대립유전자 비율과 비교된다. 염색체 1 상의 SNP 1, SNP 2, SNP 3, SNP 4 등으로부터 얻어지는 비율이 합하여질 수 있다. 그 후 이 비율은 SNP A, SNP B, SNP C, SNP D 등으로부터 얻어지는 비율과 비교될 수 있다.
예를 들어, 100 개의 SNP가 염색체 1 상에서 분석될 수 있다. 이들 100 개의 SNP 중, 50개가 이형접합성이라고 가정하자. 염색체 1 상의 이형접합성 SNP에서의 대립유전자 비율이 합하여질 수 있고, 약 50:50의 비율이 주어질 것이다. 마찬가지로, 염색체 21 상의 분석된 100개의 SNP 중 50 개가 이형접합성이라고 가정하자. 염색체 21 상의 이형접합성 SNP에서의 대립유전자 비율이 합하여 진다. 정상적 염색체 수가 있는 경우, 비율은 약 50:50일 것이고, 따라서 염색체 1과 21로부터 얻어진 비율 사이에는 차이점이 없을 것이다. 그러나, 염색체 21의 추가적 복제물이 있는 경우, 추가적 대립유전자가 제공될 것이고 비율은 약 66:33이 될 것이다. 그러므로 이형접합성 SNP에서의 뉴클레오티드 비율은 염색체 이상의 존재 또는 부존재를 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 홀배수성, 다배수성, 역위, 3염색체성, 1염색체성, 중복, 결실, 염색체일부결실, 첨가, 염색체일부첨가, 염색체 단편 또는 염색체 영역 삽입, 염색체 재배열, 및 전위를 포함하는 어떤 염색체 이상도 검출될 수 있다. 이 방법은 3염색체성 13, 3염색체성 18, 3염색체성 21, XXY 및 XYY의 검출에 특히 유용하다.
본 발명은 관심있는 이형접합성 유전자좌에서의 대립유전자의 비율을 정량하기 위한 방법을 제공한다. 관심있는 유전자좌는 단일 뉴클레오티드 다형성, 돌연변이를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 유전자의 전체 서열을 증폭하거나 특정 유전자 산물의 양을 정량하는 것을 필요로 하지 않는다. 본 발명은 정량적 PCR에 의존하지 않는다.
태아 염색체 이상의 검출
상기 "DNA 주형"이라는 제목의 절에서 논의한 바와 같이 주형 DNA는 임신한 여성의 샘플로부터 얻을 수 있는데, 여기서 주형 DNA는 모계 주형 DNA 및 태아 주형 DNA를 모두 포함한다. 한 구체예에서, 주형 DNA는 임심한 여성의 혈액으로부터 얻는다. 바람직한 구체예에서, 주형 DNA는 임신한 여성의 혈액으로부터의 혈장 또는 혈청으로부터 얻는다.
한 구체예에서, 임신한 여성의 샘플로부터의 주형 DNA는 모계 주형 DNA와 태아 주형 DNA 둘다를 포함한다. 한 구체예에서, 모계 주형 DNA는, 세포, 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 눈물, 질분비액, 림프액, 뇌척수액, 점막분비액, 복막액, 복수, 대변, 또는 체삼출물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 어떤 핵산 함유 공급원으로부터 얻고 서열결정하여, 임신한 여성 샘플로부터 얻어진 주형 DNA 상에서 분석되는 관심있는 동형접합성 또는 이형접합성 유전자좌를 확인할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 모계 주형 DNA 상의 관심있는 다수 유전자좌의 대립유전자의 서열이 관심있는 동형접합성 유전자좌를 확인하기 위하여 결정된다. 다른 구체예에서, 모계 주형 DNA 상의 관심있는 다수 유전자좌의 대립유전자의 서열은 관심있는 이형접합성 유전자좌를 확인하기 위하여 결정된다. 모계 주형 DNA 상의 관심있는 유전자좌의 대립유전자의 서열은 단일 반응 또는 다수 반응에서 결정될 수 있다.
예를 들어, 만약 염색체 21 상에서 100 개의 모계 유전자좌 및 염색체 1 상에서 100 개의 모계 유전자좌가 분석된다면, 각 염색체 상에서 관심있는 약 50 유전자좌는 동형접합성이고, 50 유전자좌는 이형접합성이라고 예상할 것이다. 50 개의 관심있는 동형접합성 유전자좌, 또는 50 개의 관심있는 이형접합성 유전자좌, 또는 50 개의 관심있는 동형접합성 유전자좌 및 50 개의 관심있는 이형접합성 유전자좌, 또는 각 염색체 상의 관심있는 동형접합성 및 이형접합성 유전자좌의 어떤 조합도, 임신 여성으로부터의 샘플로부터의 주형 DNA를 사용하여 분석될 수 있다.
임신한 여성의 샘플로부터의 주형 DNA 상의 관심있는 유전자좌는 위에서 기재한 증폭, 분리, 절단, 채우기 및 검출 방법을 사용하여 분석된다. 모계 주형 DNA 상의 관심있는 유전자좌를 분석하기 위하여 사용된 것과 동일한 프라이머를 임신 여성으로부터의 샘플로부터의 주형 DNA를 스크리닝하기 위하여 사용한다. 많은 관심있는 유전자좌가 임신 여성의 샘플로부터의 주형 DNA 상에서 분석될 수 있다. 예를 들어, 1, 1-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-500, 500-1000, 1000-2000,2000-3000, 3000-4000, 또는 4000 개 초과의 동형접합성 관심있는 모계 유전자좌가 임신한 여성 샘플로부터의 주형 DNA에서 분석될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 다수 염색체 상의 관심있는 다수 유전자좌가 분석된다.
관심있는 동형접합성 모계 유전자좌의 집단으로부터, 임신 여성으로부터의 샘플로부터의 주형 DNA로부터의 관심있는 이형접합성 및 동형접합성 유전자좌 둘다가 존재할 것인데; 관심있는 이형접합성 유전자좌는 더 분석될 수 있다. 관심있는 이형접합성 유전자좌에서, 대립유전자의 비율은 존재하는 염색체의 수를 결정하는데 사용될 수 있다.
염색체이상에 전형적으로 연관되지 않는 염색체상의 관심있는 이형접합성 유전자좌에서의 대립유전자의 비율을 결정함으로써, 임신 여성으로부터의 샘플에 존재하는 태아 DNA의 백분율이 계산될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 염색체 상의 관심있는 다수 이형접합성 유전자좌에서의 대립유전자의 비율이, 태아 DNA의 백분율을 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 사람 게놈에서 가장 큰 염색체인 염색체 1은 태아 DNA의 백분율은 측정하기 위하여 사용될 수 있다.
예를 들어, SNP X가 모계 주형 DNA에서 동형접합성 (A/A)이라고 가정하자. SNP X에서, 태아 DNA와 모계 DNA 둘다를 함유할 수 있는, 임신한 여성 샘플로부터의 주형 DNA은 이형접합성(A/G)이다. 모친은 SNP X에서 동형접합성이고 따라서 구아닌은 태아 DNA에 기인한 것이므로 뉴클레오티드 구아닌은 태아 DNA를 나타낸다. SNP X의 구아닌은 샘플내 태아 DNA의 백분율을 계산하기 위하여 사용될 수 있다.
대안으로, 태아 DNA의 백분율을 구하기 위하여 둘 이상의 염색체상의 관심있는 다수 유전자좌가 시험될 수 있다. 예를 들어, 염색체 13 및 18 상에 염색체 이상을 갖는 생체는 생존할 수 없으므로, 태아 DNA의 백분율을 구하기 위하여 관심있는 다수 유전자좌는 염색체 13 및 18 상에서 시험될 수 있다.
대안으로, 샘플내 태아 DNA의 양을 구하기 위하여 남성 태아에 대한 Y 염색체 상의 마커가 사용될 수 있다. 일련의 희석 패널이 임신한 여성 샘플로부터 분리된 주형 DNA를 사용하여 제작될 수 있고, 정량적 PCR 분석이 수행된다. 두 개의 PCR 반응이 수행되는데: 한 PCR 반응은 Y 염색체 상의 마커, 예를 들어 SRY를 증폭시키는 것이고 다른 한 반응은 어떤 상염색체 상의 영역을 증폭시키는 것이다. 태아 DNA의 양은 다음 식을 사용하여 계산될 수 있다:
태아 DNA 백분율: (Y 염색체가 검출되는 마지막 희석률/상염색체가 검출되는 마지막 희석률)*2*100
모계 대립유전자에 대한 부계 대립유전자의 예상되는 비율은 임신한 여성 샘플 내에 존재하는 태아 DNA의 양에 의존한다. 예를 들어, 만약 SNP A에서, 모친은 동형접합성 A/A이고 태아는 이형접합성 A/G 라면, A:G 비율이 염색체 이상을 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 만약 태아 DNA가 모계 혈액 내 DNA의 50 %라면, 모계 뉴클레오티드가 아데닌이고 부친에서 기인한 나머지 뉴클레오티드는 구아닌인 SNP A에서, (모계 주형 DNA로부터 유래한 두 개의 아데닌과 태아 주형 DNA로부터 유래한 하나의 아데닌) 아데닌 대 (태아 주형 DNA로부터의) 구아닌의 비율은 75:25가 될 것으로 예상될 것이다. 그러나, 만약 태아가 이 특정 염색체에 대하여 3염색체성을 갖고, 추가의 염색체가 모계에서 기인한 것고, 따라서 추가의 아데닌 뉴클레오티드가 존재한다면, 83.4:16.6의 비율 (태아 DNA는 모계 혈액중의 DNA의 50%이므로 태아에서 기인한 각 뉴클레오티드는 두 개의 아데닌과 한 개의 구아닌이고 각각 샘플 내 전체 DNA의 16.66%이다)이 예상될 것이다. 그러므로, 아데닌에 대한 신호에서 8% 증가와 구아닌 신호에서 8% 감소가 검출될 것이다. 반면, 만약 추가의 염색체가 부친에서 기인한 것이고 따라서 추가의 구아닌이 존재한다면, 66.6:33.4의 비율이 예상될 것이다.
그러나, 만약 태아 DNA가 모계 혈액의 40%라면, 3염색체성이 없을 때 예상되는 비율은 80:20이다. 만약 태아가 3염색체성이고 추가의 염색체가 모친에 의해 제공된 것이면, 예상되는 비율은 86.6:13.3이다. 아데닌에 대한 신호의 6.6% 증가와 구아닌에 대한 신호 6.6% 감소가 검출될 것이다.
다른 구체예에서, 다수 염색체 상의 관심있는 다수 유전자좌가 시험될 수 있다. 한 염색체 상의 각 관심있는 이형접합성 유전자좌에서의 대립유전자에 대한 비율이 더해지고 상이한 염색체 상의 각 관심있는 유전자좌에서의 대립유전자에 대한 비율과 비교될 수 있다. 비교되는 염색체는 염색체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X 및 Y를 포함하지만 이에 한정되지 않는 사람 기원의 것일 수 있다. 다수 염색체로부터 얻어지는 비율은 단일 염색체 또는 다수 염색체에 대하여 얻어지는 비율과 비교될 수 있다.
한 구체예에서, 비교에 사용되는 염색체 중 하나는 염색체 13, 16; 18, 21, 22, X 또는 Y일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 염색체 13, 18 및 21 상의 비율이 비교된다.
예를 들어, 임신한 여성 샘플 내 40%가 태아 DNA라고 가정하면, 염색체 1 상의 관심있는 이형접합성 유전자좌에서의 대립유전자 비율은 80:20일 것이다. 마찬가지로, 염색체 21 상의 관심있는 이형접합성 유전자좌에서 대립유전자의 비율은 80:20의 비율로 존재할 것이다. 그러나, 태아가 3염색체성 21번을 갖고 추가의 염색체는 모친 유래이면, 염색체 21 상의 관심있는 이형접합성 유전자좌에서의 뉴클레오티드는 86.6:13.3의 비율로 존재할 것이다. 반대로, 염색체 1에 대한 비율은 80:20으로 유지될 것이고, 그러므로 염색체 21에서의 모계 뉴클레오티드에서의 6.6% 증가는 추가의 염색체 또는 염색체의 일부임을 나타낼 것이다. 한 개 내지 수십 내지 수백 내지 수천 개의 관심있는 유전자좌가 분석될 수 있다.
다른 구체예에서, 임신한 여성 샘플로부터의 주형 DNA 상의 관심있는 유전자좌가 유전자형결정될 수 있는데; 관심있는 이형접합성 및 동형접합성 유전자좌가 확인될 것이다. 염색체 이상의 존재 또는 부존재를 결정하기 위하여 관심있는 유전자좌에서의 대립유전자 비율이 사용될 수 있다. 임신한 여성 샘플로부터의 주형 DNA는 모계 주형 DNA 및 태아 주형 DNA 둘다를 함유한다. 각 SNP에서 모계 주형 DNA 또는 태아 주형 DNA에 대하여 3가지 가능성이 있는데: 대립유전자 1에 대하여 이형접합성, 동형접합성, 또는 대립유전자 2에 대하여 동형접합성이다. 아데닌 또는 구아닌인 SNP에 대한 가능한 뉴클레오티드 비율은 표2에 나타낸다. 표2에 나타난 비율은 임신한 여성 샘플 내 DNA의 50%가 태아 DNA인 것으로 계산된 것이다.
세 가지 뉴클레오티드 비율이 있는데: 100% 단일 뉴클레오티드, 50:50, 또는 75:25이다. 이들 비율은 임신한 여성 샘플 내에 존재하는 태아 DNA의 양에 의존하여 변화할 것이다. 그러나, 태아 DNA의 백분율은 분석되는 염색체에 관계없이 일정할 것이다. 그러므로, 만약 염색체가 두개의 복제수로 존재한다면 상기 측정된 비율이 나타날 것이다.
반면, 추가의 염색체가 존재한다면 이들 백분율이 변화될 것이다. 예를 들어 SNP X가 아데닌 또는 구아닌일 수 있고 임신한 여성 샘플내 태아 DNA의 백분율이 50%라고 가정하자. 염색체 1 상의 관심있는 유전자좌의 분석은 상기 논의된 100:0, 50:50, 및 75:25 비율을 제공할 것이다. 추가의 염색체가 있는 A/G인 SNP에 대한 가능한 비율은 표 3에서 제공된다.
한 염색체에서 추가의 복제물이 있는 이형접합성 SNP에서의 대립유전자에 대한 가능한 비율은 100:0, 60:40, 및 80:20이다. 이들 비율 중 둘인 60:40, 및 80:20는 두개의 염색체 복제물로부터 얻어진 이형접합성 SNP에서의 대립유전자 비율과 상이하다. 위에서 논의한 바와 같이, 이형접합성 SNP에서의 뉴클레오티드에 대한 비율은 샘플내 존재하는 태아 DNA의 양에 의존한다. 그러나, 염색체 이상이 있지 않는 한, 비율은 그것이 몇이든지 염색체에 관계없이 일정하게 유지될 것이다.
염색체 상의 관심있는 이형접합성 유전자좌에서의 대립유전자 비율은 상이한 염색체 상의 관심있는 이형접합성 유전자좌에서의 대립유전자 비율과 비교될 수 있다. 예를 들어, 염색체 1 상의 관심있는 다수 유전자좌에 대한 비율 (SNP 1, SNP 2, SNP 3, SNP 4, 등에서의 비율)은 염색체 21 상의 관심있는 다수 유전자좌에 대한 비율 (SNP A, SNP B, SNP C, SNP D 등에서의 비율)과 비교될 수 있다. 어떤 염색체도 어떤 다른 염색체와 비교될 수 있다. 비교될 수 있는 염색체 수의 제한은 없다.
표 2와 3에서의 데이터를 다시 언급하면, 두 개의 복제수로 존재하는 염색체 1 상의 이형접합성 SNP에서의 뉴클레오티드에 대한 비율은 75:25 및 50:50이었다. 한편, 세 개의 복제수로 존재하는 염색체 21 상의 이형접합성 SNP에서의 뉴클레오티드에 대한 비율은 60:40과 80:20이었다. 이들 두 비율의 차이는 염색체 이상을 나타낸다. 비율은 모계 혈청에 존재하는 태아 DNA의 다양한 정도의 전체 범위에 대하여 사전에 계산될 수 있다. 표2 및 3은 관심있는 모계 동형접합성 및 이형접합성 둘 다가 태아 염색체 이상의 존재를 검출하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
상기 예는 이형접합성 SNP에서의 뉴클레오티드에 대한 비율이 어떻게 추가적 염색체의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는지를 설명한다. 동일한 형태의 분석이 염색체 재배열, 전위, 미니염색체, 염색체영역의 중복, 1염색체성, 염색체 영역의 결실, 및 염색체의 단편을 검출하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 태아 유전자 산물의 양을 정량하지도 않고, 본 발명이 Y 염색체 상에서 발견되는 유전자의 분석에 제한되는 것도 아니다. 본 발명은 단지 부계적으로 유전되는 핵산의 검출에 의존하지도 않고, 그렇다기 보다는, 본 발명은 SNP를 포함하는 관심있는 유전자좌에서 모계 대 부계 유전 대립유전자의 비율을 계산하는 것을 허용하는 방법을 제공한다.
어떤 생체의 어떤 염색체도 본 발명의 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 사람에서, 본 발명의 방법을 사용하여 염색체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X 또는 Y가 분석될 수 있다. 어떤 염색체상의 관심있는 이형접합성 유전자좌에서의 대립유전자의 비율이 다른 어떤 염색체 상의 관심있는 이형접합성 유전자좌에서의 대립유전자의 비율과 비교될 수 있다. 본 발명은 모친 또는 부친의 유전자형결정을 필요로 하지 않는다.
그러므로, 본 발명은 신속하고 정확하며 결정적인 태아에서의 염색체 이상의 검출을 위한, 태아 세포의 분리의 필요가 없는 비침습적 기술을 제공한다. 본 발명은 또한 태아로부터의 DNA 서열을 결정하기 위한 비침습적 방법을 제공한다. 본 발명은, 점돌연변이, 해독 프레임 변형, 전이, 염기전환, 첨가, 삽입, 결실, 첨가-결실, 프레임 변형, 미스센스, 역돌연변이 및 마이크로새틀라이트 변형을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 야생형 서열에 비교되는 유전자 서열의 어떤 변형을 검출하는데 사용될 수 있다.
짧은 종렬반복단을 사용한 태아 염색체 이상의 검출
짧은 종렬반복단(STR)은 보통 2 내지 5 개의 염기쌍 길이의 짧은 DNA 서열로서, 머리-꼬리 방식으로 수차례 반복되는 것이다. 종렬적으로 반복되는 DNA 서열은 전 사람 게놈에 걸쳐 널리 분포하고, 집단내 개인 사이에서 충분히 다양성을 보인다. 미니새틀라이트는 9 내지 80 염기쌍의 중심 반복을 갖는다.
다른 구체예에서, 짧은 종렬반복단은 태아 염색체 이상을 검출하는데 사용될 수 있다. 주형 DNA는 세포, 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 눈물, 질분비액, 림프액, 뇌척수액, 점막분비액, 복막액, 복수, 대변, 또는 체삼출물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 샘플을 함유하는 핵산으로부터 얻을 수 있다. 다른 구체예에서, 세포 용해 저해제가 샘플 함유 핵산에 첨가된다. 바람직한 구체예에서, 주형 DNA는 임신한 여성의 혈액으로부터 얻어진다. 다른 구체예에서, 주형 DNA는 임신한 여성의 혈액으로부터의 혈장 또는 혈청으로부터 얻는다.
임신한 여성의 혈액으로부터 얻어지는 주형 DNA는 태아 DNA 및 모계 DNA 둘 다를 함유할 것이다. 태아 DNA는 모친 및 부친으로부터의 STR을 포함한다. 모친 및 부친 사이의 STR의 차이가 염색체 이상의 검출에 사용될 수 있다.
짧은 종렬반복단의 증폭을 위하여 프라이머가 디자인될 수 있다. 중합효소 연쇄반응, 자기보존 서열 반응, 리가제 연쇄반응, cDNA 말단의 고속 증폭, 중합효소 연쇄반응 및 리가제 연쇄반응, Q-베타 파아지 증폭, 가닥 전이 증폭, 및 스플라이스 오버랩 연장 중합효소 연쇄반응을 포함하지만 이에 한정되지 않는 어떤 증폭방법도 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서 PCR이 사용된다.
1-5, 5-10, 10-50, 50-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-1000 및 1000 초과를 포함하지만 이에 한정되지 않는 많은 짧은 종렬반복단도 분석될 수 있다. 짧은 종렬반복단은 단일 PCR 반응 또는 다수 PCR 반응에서 분석될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 다수 염색체로부터의 STR이 분석된다.
증폭 후, PCR 생산물은 겔 전기영동, 및 질량분광측정을 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 방법에 의하여 분석될 수 있다. 임신한 여성 주형 DNA는 모계 및 부계 기원의 STR을 포함한다. 부계 기원의 STR은 태아 DNA를 나타낸다. 부계 및 모계 STR은 길이가 같을 수도 있고, 모계 및 부계 STR은 길이가 다를 수도 있다.
이형접합성 STR은 모계 및 부계 STR이 길이가 다른 것이다. 각 PCR 생산물의 양이 각 이형접합성 STR에 대하여 정량될 수 있다. 정상적인 수의 염색체를 갖는 경우, 각 PCR 생산물의 양은 대략 동량이어야 한다. 그러나, 추가적 염색체가 있는 경우에는, STR PCR 생산물 중 하나는 더 많은 양으로 존재할 것이다.
예를 들어, 염색체 1 상의 다수 STR이 임신한 여성의 혈액으로부터 얻어진 주형 DNA 상에서 분석될 수 있다. 각 STR은 모계이든 부계 기원이든, 대략 동일한 양으로 나타나야 한다. 마찬가지로, 두개의 염색체 21을 갖는 경우 각 STR은 대량 동일한 양으로 존재하여야 한다. 그러나, 만약 3염색체성 21을 갖는다면, STR PCR 생산물중 하나는, 모계 및 부계가 길이가 다른 경우 (이형접합성 STR), 더 많은 양으로 나타나야 할 것이다. 한 염색체 상의 각 이형접합성 STR에 대한 비율은상이한 염색체 상의 각 이형접합성 STR에 대한 비율과 비교될 수 있는데, 여기에서 그 차이는 염색체이상의 존재 또는 부재의 지표가 된다.
키트
본 발명의 방법은 방법에서 사용되는 시약을 키트의 형태로 제공함으로써 가장 편리하게 실시될 수 있다. 키트는 하나 이상의 다음 요소: 키트의 사용에 대한 서지적 설명서, 별개의 용기 또는 포장에 담긴 적당한 완충액, 염, DNA 추출 세제, 프라이머, 뉴클레오티드, 표지된 뉴클레오티드, 5' 말단 변형 물질, 및 만약 필요하다면 적당한 순도의 물을 바람직하게 함유하고, 이같은 요소는 키트 사용자가 본원발명의 방법에 따라 적당한 핵산 샘플을 추출하고 그것을 분석하도록 허용한다. 키트와 제공되는 프라이머는, 키트의 목적과 키트를 사용하여 시험될 바람직한 DNA에 따라서 다양할 것이다.
키트는 또한 바람직한 또는 다양한 단일 뉴클레오티드 다형성, 특히 바람직하지 않은 상태 또는 질병과 관련된 것을 검출하기 위하여 디자인될 수 있다. 예를 들어, 키트는 다른 요소들 중에 헌팅톤병과 관련된 관심있는 하나 이상의 유전자좌를 증폭하기 위한 한 세트 또는 여러 세트의 프라이머를 포함할 수 있다. 다른 키트는 타입 I 또는 타입 II 당뇨병을 발병시키는 경향과 관련된 유전자에 대한 한 세트 또는 여러 세트의 프라이머를 다른 요소들 중에 포함할 수 있다. 또한, 다른 키트는 심장병을 발병시키는 경향과 관련된 유전자에 대한 한 세트 또는 여러 세트의 프라이머를 다른 요소들 중에 포함할 수 있다. 이같은 키트에 대한 사용의 상세한 사항은 아래 "이용" 절에서 제공된다.
이용
본 발명의 방법은 개체의 유전자형을 아는것이 바람직한 경우 언제나 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 유전병의 검출에 특히 유용하다. 본 발명의 방법은 태아에서의 유전병의 검출을 위한 비침습적 기술로서 특히 유용하다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 단일 뉴클레오티드 다형성의 확인을 위한 방법을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 방법은 3염색체성, 1염색체성, 중복, 결실, 첨가, 염색체 재배열, 전위, 및 다른 염색체수이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는 염색체 이상을 검출하는데 유용하다. 본 방법은 태아의 염색체 이상을 검출하는데 특히 유용하다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 태아의 질병, 특히 게놈 서열의 존제의 결과로서 발병하는 유전병, 또는 그것을 아는 것이 바람직한 개인에서 그것을 확인하는 것이 바람직한 다른 생물학적 상태의 존재의 확인을 위한 방법을 제공한다. 이같은 게놈 서열의 존재에 기초한 태아에서의 이 같은 서열의 확인은, 예를 들어 태아가 보인자인지를 결정하거나 태아가 특정 유전 성질, 상태 또는 질병을 발달시킬 소인이 있는지 여부를 평가하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 양친 및 어린이의 태아기의 유전 검사에서 특히 유용하다.
이 방법에 의하여 진단될 수 있는 질병의 예가 표 4에 열거된다.
본 발명의 방법은, 특징 또는 질병상태와 동반되는 관심있는 유전자좌, 특히 그 같은 특징 또는 상태와 가장 빈번하게 동반되는 유전자좌를 서열결정함으로써, 유전적 특징 또는 유전병과 연관되는 수십, 수백, 심지어 수천의 관심있는 유전자좌 같은 다수의 유전자좌에서 개체를 스크리닝하는데 유용하다. 본 발명은 심장병, 암, 내분비질환, 면역질환, 신경질환, 근골격질환, 안과질환, 유전이상, 3염색체성, 1염색체성, 변위, 전위, 피부질환 및 가족성질환을 포함하지만 이에 한정되지 않는 특정 일련의 질병을 분석하는데 유용하다.
본 발명의 방법은 또한 미지 서열의 DNA와 알려진 기원 또는 서열의 DNA 사이의 관계를 확인하거나 결정하는데, 예를 들어 친모 또는 친부의 확인 등에 사용될 수 있다.
지금까지 일반적으로 본 발명에 대하여 설명하였는데, 동일한 것이, 여기에 표함되는 구체적인 실제 실시예를 참고함으로써 더 잘 이해될 것인데, 이 실시예는 설명을 위한 목적일 뿐, 특히 명기하지 않는 한 한정하려는 의도가 아니다.
다음의 실시예는 설명일 뿐이고 청구범위에 정의된 발명의 범위를 제한하려고 의도된 것이 아니다.
실시예 1
DNA 서열을 PCR에 의하여 증폭시키는데, 이 때 사이클 1에서의 어닐링 단계를 특정 온도에서 수행한 후 사이클 2에서 증가시키고, 추가로 비-특이적 증폭을 감소시킬 목적으로 사이클 3에서 증가시켰다. PCR의 사이클 1의 TM1을, 주형 DNA에 어닐링하는 제 2 프라이머의 3' 영역의 온도를 계산함으로써 측정하였다. 예를 들면, 도 1B에서 TM1은 대략 영역 "c"의 용융 온도일 수 있다. 어닐링 온도를 사이클 2에서 TM2로 상승시켰는데, 그 온도는 대략 주형 DNA에 어닐링하는 제 1 프라이머의 3' 영역의 용융 온도였다. 예를 들어, 도 1C에서 어닐링 온도 (TM2)는 영역 "b"의 용융 온도에 상응한다. 사이클 3에서 어닐링 온도를 TM3로 상승시켰으며, 그 온도는 대략 제 2 프라이머의 전체 서열의 용융 온도였다. 예를 들어, 도 1D에서 어닐링 온도 (TM3)는 영역 "c" + 영역 "d"의 용융 온도에 상응한다. 나머지 증폭 사이클은 TM3에서 수행하였다.
주형 DNA의 제조
주형 DNA를 동의서에 승인한 사람 지원자로부터 정맥 천자에 의해 얻은 혈액의 5 ml 샘플로부터 제조하였다. 혈액을 36명의 지원자로부터 수집하였다. 주형 DNA를 QIAGEN에 의해 공급된 QIAamp DNA 혈액 미디 키트 (카탈로그 번호 51183)를 사용하여 각각의 혈액 샘플로부터 분리하였다. 36명의 지원자 각각으로부터 주형 DNA를 분리한 후 추가의 분석을 위하여 모았다.
프라이머 디자인
다음의 4가지 단일한 뉴클레오티드 다형성을 분석하였다: 사람 염색체 21 cSNP 데이터베이스 (도 3, 레인 1)에 의해 규정된 바와 같이 식별번호 SNP HC21S00340는 염색체 21상에 위치하였고; SNP TSC 0095512 (도 3, 레인 2)는 염색체 1상에 위치하였으며; SNP TSC 0214366 (도 3, 레인 3)은 염색체 1상에 위치하였고; SNP TSC 0087315 (도 3, 레인 4)는 염색체 1상에 위치하였다. SNP 콘소시엄 주식회사의 데이터베이스는 2002. 2. 14부터 유효한 웹사이트 주소 http://snp.cshl.org/에서 쉽게 찾아볼 수 있다.
SNP HC21S00340을 다음의 프라이머를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' TAGAATAGCACTGAATTCAGGAATACAATCATTGTCAC 3'
제 2 프라이머:
5' ATCACGATAAACGGCCAAACTCAGGTTA 3'
SNP TSC0095512는 다음의 프라이머를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' AAGTTTAGATCAGAATTCGTGAAAGCAGAAGTTGTCTG 3'
제 2 프라이머:
5' TCTCCAACTAACGGCTCATCGAGTAAAG 3'
SNP TSC0214366은 다음의 프라이머를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' ATGACTAGCTATGAATTCGTTCAAGGTAGAAAATGGAA 3'
제 2 프라이머:
5' GAGAATTAGAACGGCCCAAATCCCACTC 3'
SNP TSC 0087315는 다음의 프라이머를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' TTACAATGCATGAATTCATCTTGGTCTCTCAAAGTGC 3'
제 2 프라이머:
5' TGGACCATAAACGGCCAAAAACTGTAAG 3'
모든 프라이머는 3' 영역이 관심있는 각 유전자좌 양옆의 하류 또는 상류 중 어느 하나에 상보적이고, 5' 영역이 제한 효소 인식 부위를 함유하도록 디자인하였다. 제 1 프라이머는 5' 단부에 비오틴 태그를 함유하였고 제한 효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유하였다. 제 2 프라이머는 제한 효소 BceA I에 대한 인식 부위를 함유하였다.
PCR 반응
관심있는 4개의 유전자좌 전부를 PCR을 사용하여 주형 게놈 DNA로부터 증폭하였다 (미국 특허 제 4,683,195호 및 4,683,202호). PCR 반응의 성분은 다음과 같았다: 40 ng의 주형 DNA, 5 μM의 제 1 프라이머, 5 μM의 제 2 프라이머, 1X HotStar Taq Master Mix는 Qiagen (카탈로그 번호 203443)으로부터 얻었다. HotStar Taq Master Mix는 DNA 중합효소, PCR 완충제, 200 μM의 각각의 dNTP, 및 1.5 mM의 MgCl2를 함유하였다.
관심있는 SNP를 함유한 각 주형 DNA의 증폭은 본원에서 낮은 긴축 어닐링 온도, 중간 긴축 어닐링 온도, 및 낮은 긴축 어닐링 온도로 언급되는 세가지 상이한 연속적인 어닐링 온도를 사용하여 수행하였다. 어닐링 온도 프로토콜과는 관계없이 각 PCR 반응은 40 사이클의 증폭으로 구성되었다. PCR 반응은 QIAGEN에 의해 공급된 HotStar Taq Master Mix를 사용하여 수행하였다. 제조업체에 의해 지시된 바와 같이 반응을 첫번째 PCR 사이클 전에 95 ℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 각 연장 단계 후의 변성 단계는 95 ℃에서 30초 동안 수행하였다. 어닐링 반응을 온도가 조금도 증가되지 않으면서 효과적인 연장이 가능한 온도에서 수행하였다.
낮은 긴축 어닐링 반응은 처음 세 개의 사이클 각각에 세 개의 상이한 어닐링 온도를 포함하였다. 첫번째 사이클에 대한 어닐링 온도는 37 ℃에서 30초였고; 두번째 사이클에 대한 어닐링 온도는 57 ℃에서 30초였으며; 세번째 사이클에 대한 어닐링 온도는 64 ℃에서 30초였다. 어닐링을, 완료될 때까지 계속되는 사이클 동안 64 ℃에서 수행하였다.
겔의 포토그래프에서 알 수 있는 바와 같이 (도 3A), SNP TSC 0087315(레인 4)의 증폭 후에 다중 밴드가 관찰되었다. SNP HC21S00340 (레인 1), SNP TSC0095512 (레인 2) 및 SNP TSC0214366 (레인 3)의 증폭으로 높은 강도의 단일 밴드와 희미한 강도의 한 밴드가 생성되었는데, 그것은 큰 분자량의 것이었다. 낮은 어닐링 온도 조건이 사용되었을 경우 정확한 크기의 생성물이 생성되었고, 이것은 각 반응에서 우세한 생성물이었다.
중간 긴축 어닐링 반응은 처음 세 개의 사이클 각각에 세 개의 상이한 어닐링 온도를 포함하였다. 첫번째 사이클에 대한 어닐링 온도는 40 ℃에서 30초였고; 두번째 사이클에 대한 어닐링 온도는 60 ℃에서 30초였으며; 세번째 사이클에 대한 어닐링 온도는 67 ℃에서 30초였다. 어닐링을, 완료될 때까지 계속되는 사이클 동안 67 ℃에서 수행하였다. 낮은 긴축 어닐링 조건하에서 관찰된 것과 유사하게, SNP TSC0087315 (도 3B, 레인 4)의 증폭으로 중간 긴축 조건하에서 다중 밴드가 생성되었다. 다른 세개의 SNP (레인 1 내지 3)의 증폭으로 단일 밴드가 생성되었다. 이들 결과는 어닐링 길이가 13 염기인 프라이머를 사용하여 게놈 DNA로부터 관심있는 유전자좌를 분명하게 증폭하기 위해서는 가변적인 어닐링 온도가 사용될 수 있음을 증명한다.
높은 긴축 어닐링 반응은 처음 세 개의 사이클 각각에 세 개의 상이한 어닐링 온도를 포함하였다. 첫번째 사이클에 대한 어닐링 온도는 46 ℃에서 30초였고; 두번째 사이클에 대한 어닐링 온도는 65 ℃에서 30초였으며; 세번째 사이클에 대한 어닐링 온도는 72 ℃에서 30초였다. 어닐링을, 완료될 때까지 계속되는 사이클 동안 72 ℃에서 수행하였다. 겔의 포토그래프에서 알 수 있는 바와 같이 (도 3C), 높은 긴축 어닐링 온도를 사용한 SNP TSC0087315(레인 4)의 증폭으로 정확한 분자량의 단일 밴드가 생성되었다. 처음 세개의 사이클 각각에 대하여 어닐링 온도를 높임으로써 비특이적 증폭이 제거되었다. SNP TSC0095512 (레인 2)의 증폭으로 단일 밴드가 생성되었다. SNP HC21S00340 (레인 1) 및 SNP TSC0214366 (레인 3)은 높은 긴축 어닐링 온도에서 증폭하지 못하였지만 이들 SNP는 중간 긴축 어닐링 온도에서는 단일 밴드로서 증폭되었다. 이들 결과는 SNP TSC0087315 (도 3, 레인 4)에 대하여 증명된 바와 같이 비특이적인 PCR 생산물을 감소시키기 위해서 가변적인 어닐링 온도가 사용될 수 있음을 증명한다.
실시예 2
SNP들을 염색체 1 상에서 (TSC0095512), 13 상에서 (TSC0264580), 및 21 상에서 (HC21S00027) 분석하였다. SNP TSC0095512를 두 개의 상이한 세트의 프라이머를 사용하여 분석하였고, SNP HC21S00027은 뉴클레오티드의 통합에 대하여 두 가지 유형의 반응을 사용하여 분석하였다.
주형 DNA의 제조
주형 DNA를 동의서에 승인한 사람 지원자로부터 정맥 천자에 의해 얻은 혈액의 5 ml 샘플로부터 제조하였다. 주형 DNA를 QIAGEN에 의해 공급된 QIAamp DNA 혈액 미디 키트 (카탈로그 번호 51183)를 사용하여 분리하였다. 주형 DNA를 키트에 포함된 설명서에 따라서 분리하였다. 36명의 사람 지원자로부터 주형 DNA를 분리한 후 함께 모아서 제한 효소 EcoRI으로 절단하였다. 제한 효소 절단을 제조업체의 지시대로 수행하였다.
프라이머 디자인
SNP HC21S00027은 다음의 프라이머 세트를 사용하는 PCR 에 의해 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' ATAACCGTATGCGAATTCTATAATTTTCCTGATAAAGG 3'
제 2 프라이머:
5' CTTAAATCAGGGGACTAGGTAAACTTCA 3'
제 1 프라이머는 맨 끝 5' 단부에 비오틴 태그를 함유하였고, 제한 효소 EcoRI에 대한 뉴클레오티드 서열도 함유하고 있다. 제 2 프라이머는 제한 효소 BsmF I에 대한 뉴클레오티드 서열을 함유하였다 (도 4A).
또한 SNP HC21S00027을 제 1 프라이머는 동일하지만 제 2 프라이머는 다음의 서열을 가지고 있는 상이한 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭하였다:
제 2 프라이머:
5' CTTAAATCAGACGGCTAGGTAAACTTCA 3'
이 제 2 프라이머는 제한 효소 BceA I에 대한 인식 부위를 함유하고 있다 (도 4B).
SNP TSC0095512를 다음의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' AAGTTTAGATCAGAATTCGTGAAAGCAGAAGTTGTCTG 3'
제 2 프라이머:
5' TCTCCAACTAGGGACTCATCGAGTAAAG 3'
제 1 프라이머는 5' 단부에 비오틴 태그를 가지고 있고 EcoRI에 대한 제한 효소 인식 부위도 함유하고 있다. 제 2 프라이머는 BsmF I에 대한 제한 효소 인식 부위를 함유하였다 (도 4C).
또한 SNP TSCO095512를 제 1 프라이머는 동일하지만 제 2 프라이머는 다음의 서열을 가지고 있는 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 2 프라이머:
5' TCTCCAACTAACGGCTCATCGAGTAAAG 3'
이 제 2 프라이머는 제한 효소 BceA I에 대한 인식 부위를 함유하였다 (도 4D).
염색체 13 상에 위치한 SNP TSC0264580은 다음의 프라이머로 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' AACGCCGGGCGAGAATTCAGTTTTTCAACTTGCAAGG 3'
제 2 프라이머:
5' CTACACATATCTGGGACGTTGGCCATCC 3'
제 1 프라이머는 맨 끝의 5' 단부에 비오틴 태그를 함유하였고 EcoRI에 대한 제한 효소 인식 부위도 가지고 있다. 제 2 프라이머는 BsmF I에 대한 제한 효소 인식 부위를 함유하였다.
PCR 반응
관심있는 모든 유전자좌를 중합효소 연쇄반응을 사용하여 주형 DNA로부터 증폭하였다 (PCR, 미국 특허 제 4,683,195호 및 4,683,202호). 이 실시예에서 관심있는 유전자좌는 별개의 반응관에서 증폭하였지만, 또한 단일 PCR 반응으로 함께 증폭할 수도 있다. 특이성을 증가시키기 위해서 "핫-스타트" PCR을 사용하였다. PCR 반응을 QIAGEN에 의해 공급된 HotStarTaq Master Mix 키트 (카탈로그 번호 203443)를 사용하여 수행하였다. 반응 당 주형 DNA의 양과 프라이머의 양은 각각의 관심있는 유전자좌에 대해 최적화될 수 있지만, 이 실시예에서는 40 ng의 주형 사람 게놈DNA와 5 μM의 각각의 프라이머를 사용하였다. 40 사이클의 PCR을 수행하였다. 다음의 PCR 조건을 사용하였다:
(1) 95 ℃에서 15분 15초;
(2) 37 ℃에서 30초;
(3) 95 ℃에서 30초;
(4) 57 ℃에서 30초;
(5) 95 ℃에서 30초;
(6) 64 ℃에서 30초;
(7) 95 ℃에서 30초;
(8) 단계 6과 7을 39회 반복한다;
(9) 72 ℃에서 5분.
PCR의 처음 사이클에서 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 3' 어닐링 영역의 용융 온도인 37 ℃ 였다. PCR의 두번째 사이클의 어닐링 온도는 대략 주형 DNA에 어닐링하는 제 1 프라이머의 3' 영역의 용융 온도인 57 ℃ 였다. PCR의 세번째 사이클의 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 전체 서열의 용융 온도인 64 ℃ 였다. 나머지 사이클에 대한 어닐링 온도는 64 ℃였다. PCR의 처음 세 개의 사이클에서 TM1으로부터 TM2로, 그리고 TM3 로 어닐링 온도를 단계적으로 상승시키는 것은 특이성을 크게 개선시킨다. 이들 어닐링 온도는 대표적인 것으로서, 숙련된 전문가는 각 사이클에 대한 어닐링 온도가 사용되는 특정방향 프라이머에 따라 좌우되는 것을 인정할 것이다.
변성, 어닐링 및 확장의 온도와 시간은 다양한 설정들을 시도해 보고 최상의 결과를 제공하는 변수들을 사용함으로써 최적화될 수 있다. SNP HC21S00027 및 SNP TSC095512에 대한 PCR 생산물을 도 5A 내지 5D에 도시한다.
관심있는 단편의 정제
PCR 생산물을 게놈 주형 DNA로부터 분리하였다. 각각의 PCR 생산물을 Roche Diagnostics GmbH의 투명한 고결합성 플레이트인 스트렙타웰(Roche Molecular Biochemical, 2001 생화학제품 카탈로그에 기재된, 카탈로그 번호 1 645 692)의 4개의 별도의 반응 웰에 나누어 넣었다. 제 1 프라이머는 PCR 생산물이 스트렙타비딘 코팅된 웰에 결합되도록 하는 한편 게놈 주형 DNA는 결합되지 않도록 하는 5' 비오틴 태그를 함유했다. 스트렙타비딘 결합 반응을 써모믹서(써모믹서, Eppendorf)를 사용하여 1000 rpm에서 20분 동안 37 ℃에서 수행하였다. 각 웰을 흡인하여 결합되지 않은 물질을 제거하고 부드럽게 혼합하면서 1×PBS로 3회 세척하였다(Kandpal 등, Nucl. Acids Res. 18:1789-1795 (1990); Kaneoka 등, Biotechniques 10:30-34 (1991); Green 등, Nucl. Acids Res. 18:6163-6164 (1990)).
분리된 단편의 제한 효소 절단
정제된 PCR 생산물을 제 2 프라이머로부터의 PCR 생산물에 통합된 인식 부위에 결합하는 제한 효소를 사용하여 절단하였다. SNP HC21S00027 (도 6A 및 6B)과 SNP TSC0095512 (도 6C 및 6D)를 두개의 상이한 제 2 프라이머를 사용하여 별도의 반응으로 증폭하였다. 도 6A (SNP HC21S00027) 및 도 6C (SNP TSC0095512)는 제한효소 BsmF I (New England Biolabs 카탈로그 번호 R0572S)으로 절단시킨 후의 PCR 생산물을 도시한다. 도 6B (SNP HC21S00027) 및 도 6D (SNP TSC0095512)는 제한 효소 BceA I (New England Biolabs 카탈로그 번호 R0623S)으로 절단시킨 후의 PCR 생산물을 도시한다. 절단은 제한 효소와 함께 공급된 설명서에 따라서 스트렙타웰에서 수행하였다. SNP TSC0264580을 BsmF I으로 절단시켰다. 적절한 제한 효소로 절단시킨 다음 웰을 PBS로 3회 세척하여 절단된 단편들을 제거하였다.
표지된 뉴클레오티드의 통합
상술된 제한 효소 절단으로 5' 단부가 돌출된 DNA 단편이 얻어졌는데, 이것은 SNP 부위 또는 관심있는 유전자좌 및 3' 함몰 단부를 함유하였다. 5' 돌출부는 DNA 중합효소의 존재하에 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 통합을 가능하게 하는 주형으로서 작용하였다.
각 SNP에 대하여 반응마다 4 가지의 별도의 채우기를 수행하였다; 4 가지 반응 각각은 상이한 형광 표지된 ddATP (ddATP, ddATP, ddATP, 또는 ddATP)를 함유하였다. 다음의 성분들이 각 채우기 반응에 첨가되었다: 1 ㎕의 형광 표지된 ddATP, 0.5 ㎕의 표지되지 않은 ddNTP (40 μM)(이것은 형광 표지된 뉴클레오티드를 제외한 모든 뉴클레오티드를 함유하였다), 2 ㎕의 10 × 시퀘나제 완충제, 0.25 ㎕의 시퀘나제, 및 필요에 따라 20 ㎕ 반응에 필요한 물. 모든 채우기 반응은 40 ℃에서 10분 동안 수행하였다. 형광 표지되지 않은 ddATP 는 Fermentas Inc. (Hanover, MD)로부터 구매하였다. 다른 모든 표지화 시약을 Amersham 으로부터 구입하였다 (Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit, US 79565). 형광표지된 ddNTP의 존재하에 3' 함몰 단부는 한 염기씩 연장되었고, 그것은 SNP 또는 관심있는 유전자좌에 상응한다 (도 7A 내지 7D).
표지된 ddNTP와 표지되지 않은 dNTP의 혼합물을 또한 SNP HC21S00027의 "채우기" 반응에 사용하였다. "채우기" 조건은 상술한 것과 같되, 단 40 μM의 표지되지 않은 dNTP, 1 ㎕의 형광 표지된 ddATP, 1 ㎕의 형광 표지된 ddATP, 1 ㎕의 형광 표지된 ddATP 및 1 ㎕의 ddATP를 함유하고 있는 혼합물을 사용하였다. 형광 ddNTP는 Amersham으로부터 얻었다 (Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit, US 79565; Amersham은 형광 뉴클레오티드의 농도를 표시하지 않았다). SNP HC21S00027을 제한 효소 BsmF I으로 절단하고, 그 결과 4개의 염기로 된 5' 돌출부가 생성되었다. 도 7E에 도시된 바와 같이, 만약 통합된 첫번째 뉴클레오티드가 표지된 ddATP라면, 3' 함몰 단부는 한 염기씩 채워져서 SNP 또는 관심있는 유전자좌의 검출이 가능해진다. 그러나 만약 통합된 첫번째 뉴클레오티드가 dNTP라면, 중합효소는 ddNTP가 다 채워질 때까지 뉴클레오티드의 통합을 계속한다. 예를 들어 처음 두 개의 뉴클레오티드는 dNTP로 채워질 수 있고, 세번째 뉴클레오티드는 ddNTP로 채워져 돌출부의 세번째 뉴클레오티드의 검출이 가능해진다. 그러므로 전체 5' 돌출부의 서열을 결정될 수 있으며, 그것으로 각 SNP 또는 관심있는 유전자좌로부터 얻어지는 정보가 증가된다.
표지 후 각 스트렙타웰을 1×PBS (100 ㎕)로 3회 세척한다. 그런 다음 "채워진" DNA 단편이 효소와 함께 공급된 제조자의 설명서에 따라서 제한 효소 EcoRI을 사용한 절단에 의해 스트렙타웰로부터 방출된다(도 8A 내지 8D). 절단은 37 ℃에서1 시간 동안 120 rpm에서 진동시키면서 수행하였다.
관심있는 유전자좌의 검출
스트렙타비딘 매트릭스로부터 방출한 후 10 ㎕의 샘플중 2~3 ㎕를 48 웰 멤브레인 트레이(The Gel Company, 카탈로그 번호 TAM48-01)에 로딩하였다. 트레이안의 샘플을 48 Flow Membrane Comb (The Gel Company, 카탈로그 번호 AM48)으로 흡수하고, 36 cm의 5 % 아크릴아미드(우레아) 겔(BioWhittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, 카탈로그 번호 50691)에 넣는다.
샘플을 겔에서 3000 볼트에서 3분 동안 전기영동하였다. 멤브레인 콤을 제거하고 겔을 3 시간 동안 ABI 377 자동 서열결정 기계에서 이동시켰다. 통합된 표지된 뉴클레오티드를 형광에 의해 검출하였다.
도 9A에서 알 수 있는 바와 같이, 36개의 개별적인 샘플로부터 두개의 뉴클레오티드중 하나인 아데노신 또는 구아닌이 SNP HC21S00027에서 검출되었다. 이것들은 SNP HC21S00027에 존재하는 것으로 보고된 두개의 뉴클레오티드이다. (http://snp.cshl.org/snpsearch.shtml).
두개의 뉴클레오티드중 하나인 구아닌 또는 시토신 중 하나가 SNP TS00095512에서 검출되었다 (도 9B). 동일한 결과가 관심있는 유전자좌가 BceA I 에 대한 인식 부위를 함유한 제 2 프라이머로 증폭되었든 또는 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유한 제 2 프라이머로 증폭되었든 얻어졌다.
도 9C에서 알 수 있는 바와 같이, 두개의 뉴클레오티드중 하나, 아데노신 또는 시토신이 SNP TSC0264580에서 검출되었다. 이것들은 이 SNP 부위에 대해 보고된두개의 뉴클레오티드이다 (http://snp.cshl.org/snpsearch.shtml). 또한 관심있는 유전자좌로부터 한 염기 건너서 티미딘 염기가 검출되었다. 서열 의존 방식으로 BsmF I은 일부의 DNA를 10/14 위치에서 절단하고, 다른 DNA 분자에서는 동일한 서열을 11/15 위치에서 절단한다. 제한 효소 BsmF I이 센스 가닥에서 11개의 뉴클레오티드를 절단해내고 안티센스 가닥에서 15개의 뉴클레오티드를 절단해내는 경우에, 3' 함몰 단부는 SNP 부위로부터 한 염기 차이이다. SNP TSC0264580의 서열은 SNP 부위의 바로 앞에 있는 염기가 티미딘이었음을 나타냈다. 이 위치에 표지된 ddNTP를 통합시킴으로써 10/14 위치에서 절단된 단편보다 한 염기가 더 작은 단편이 생성되었다. 그러므로 11/15 위치에서 DNA 분자를 절단하면 SNP 부위 바로 앞에 있는 염기에 대한 서열 정보를 알 수 있게 되고, 10/14 위치에서 DNA 분자를 절단하면 SNP 부위 주변의 서열 정보를 알 수 있게 된다.
SNP HC21S00027을 BsmF I 에 대한 인식 부위를 함유한 제 2 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 표지된 ddNTP와 표지되지 않은 dNTP의 혼합물을 사용하여 BsmF I을 이용한 절단에 의해 생성된 5' 돌출부를 채웠다. 만약 dNTP가 통합되었다면 중합효소는 ddNTP가 통합될 때까지 뉴클레오티드 통합을 계속하였다. 각각이 한 염기씩 다른 DNA 단편의 집합체가 생성되었는데, 이것으로 돌출부의 완전한 서열을 결정하는 것이 가능하였다.
도 9D에서 알 수 있는 바와 같이 아데노신이 검출되었는데, 그것은 SNP 또는 관심있는 유전자좌 바로 앞에 있는 뉴클레오티드 (티미딘)에 상보하는 것이었다. 이 뉴클레오티드를 상기에서 상세하게 설명된 BsmF I의 11/15 절단 성질 때문에 검출하였다. SNP 부위에서는 구아닌과 아데노신을 검출하였는데, 그것들은 이 SNP 부위에 대해 보고된 두개의 뉴클레오티드이다 (도 9A). 두개의 뉴클레오티드가 SNP 부위에서 검출되었는데 그것은 염료의 분자량이 다르기 때문이었고, 그것으로 두개의 뉴클레오티드의 분리가 가능했다. 검출된 다음 뉴클레오티드는 티미딘이었으며, 이것은 SNP 부위의 바로 아래쪽에 있는 뉴클레오티드에 상보한다. 다음으로 검출된 뉴클레오티드는 구아닌이고, 이것은 SNP 부위보다 2 개의 염기만큼 아래쪽에 있는 뉴클레오티드에 상보하였다. 마지막으로 아데노신이 검출되었는데, 이것은 SNP 부위의 아래쪽으로 세번째 뉴클레오티드에 상보하였다. 서열 정보는 SNP 부위에 대해서만이 아니라 SNP 부위 바로 앞에 있는 뉴클레오티드와 SNP 부위 다음의 세개의 뉴클레오티드에 대해서도 얻어졌다.
관심있는 유전자좌중 돌연변이를 함유한 것은 없었다. 그러나 만약 관심있는 유전자좌중 하나가 점 돌연변이, 삽입, 결실, 전위 또는 상기 돌연변이들의 어떠한 조합을 포함한 돌연변이를 은닉하고 있다면 일치 또는 공개된 서열과의 비교에 의해 확인될 수 있었을 것이다. 관심있는 유전자좌의 각각의 서열을 관심있는 각 유전자좌에 있는 유전자의 천연의 비-질병 상태의 관련된 서열과 비교하면 그 서열에 돌연변이의 유무를 측정할 수 있다. 그런 다음 서열의 돌연변이의 발견이 지적된 질병의 존재로서, 또는 그 개체에서 고유한 그런 질병을 발생시키는 소양으로서 해석된다. 돌연변이된 서열 대 정상 또는 돌연변이되지 않은 서열의 상대적인 양은, 개체가 돌연변이된 서열의 하나 또는 두개의 대립유전자를 가지고 있는 지를 측정하고, 그로써 개체가 보인자인지, 또는 지적된 돌연변이가 우세한 또는 열성의 질병을 유발하는 지의 여부를 측정하기 위하여 평가할 수 있다.
실시예 3
염색체 1로부터 관심있는 유전자좌 4개와, 염색체 21로부터 관심있는 유전자좌 2개를 별도의 PCR 반응으로 증폭하고, 함께 모아서 분석하였다. 프라이머는 각각의 증폭된 관심있는 유전자좌가 상이한 크기를 가져서 관심있는 유전자좌의 결실이 가능해지도록 디자인하였다.
주형 DNA의 제조
주형 DNA를 동의서에 승인한 사람 지원자로부터 정맥 천자에 의해 얻은 혈액의 5 ml 샘플로부터 제조하였다. 주형 DNA를 QIAGEN에 의해 공급된 QIAamp DNA 혈액 미디 키트 (카탈로그 번호 51183)를 사용하여 분리하였다. 주형 DNA를 키트에 포함된 설명서에 따라 분리하였다. 36명의 사람 지원자로부터 주형 DNA를 분리한 후 추가의 분석을 위하여 단일 샘플에 모았다.
프라이머 디자인
SNP TSC 0087315를 다음의 프라이머를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' TTACAATGCATGAATTCATCTTGGTCTCTCAAAGTGC 3'
제 2 프라이머:
5' TGGACCATAAACGGCCAAAAACTGTAAG 3'
SNP TSC0214366을 다음의 프라이머를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' ATGACTAGCTATGAATTCGTTCAAGGTAGAAAATGGAA 3'
제 2 프라이머:
5' GAGAATTAGAACGGCCCAAATCCCACTC 3'
SNP TSC 0413944를 다음의 프라이머를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' TACCTTTTGATCGAATTCAAGGCCAAAAATATTAAGTT 3'
제 2 프라이머:
5' TCGAACTTTAACGGCCTTAGAGTAGAGA 3'
SNP TSC0095512를 다음의 프라이머를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' AAGTTTAGATCAGAATTCGTGAAAGCAGAAGTTGTCTG 3'
제 2 프라이머:
5' TCTCCAACTAACGGCTCATCGAGTAAAG 3'
SNP HC21S00131을 다음의 프라이머를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' CGATTTCGATAAGAATTCAAAAGCAGTTCTTAGTTCAG 3'
제 2 프라이머:
5' TGCGAATCTTACGGCTGCATCACATTCA 3'
SNP HC21S00027을 다음의 프라이머를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' ATAACCGTATGCGAATTCTATAATTTTCCTGATAAAGG 3'
제 2 프라이머:
5' CTTAAATCAGACGGCTAGGTAAACTTCA 3'
각 SNP에 대하여 제 1 프라이머는 제한 효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유하였고 맨 끝의 5' 단부에는 비오틴 태그를 가졌다. 각 SNP를 증폭하기 위하여 사용한 제 2 프라이머는 제한 효소 BceA I에 대한 인식 부위를 함유하였다.
PCR 반응
PCR 반응을 실시예 2에서 설명한 것과 같이 수행하되, 단 다음의 어닐링 온도를 사용하였다: PCR의 첫번째 사이클에 대한 어닐링 온도는 37 ℃에서 30초였고, PCR의 두번째 사이클에 대한 어닐링 온도는 57 ℃에서 30초였으며, PCR의 세번째 사이클에 대한 어닐링 온도는 64 ℃에서 30초였다. 모든 후속 사이클의 어닐링 온도는 30초 동안 64 ℃였다. 37 사이클의 PCR을 수행하였다. PCR 후에 각 반응으로부처 부피의 1/4을 취하여 단일관에 조합하였다.
관심있는 단편의 정제
PCR 생산물 (이제 하나의 샘플로 조합되므로 이하 "샘플"로 언급한다)을 실시예 2에서 설명한 바와 같이 게놈 주형 DNA로부터 분리하되, 단 샘플을 스트렙타웰 마이크로타이터 플레이트의 단일 웰에 결합시켰다.
분리된 단편의 제한 효소 절단
샘플을 제한 효소 BceA I으로 절단시켰는데, 그것은 제 2 프라이머의 인식 부위에 결합하였다. 제한 효소 절단은 효소와 함께 공급된 설명서에 따라 수행하였다. 제한 효소 절단 후에 웰을 1×PBS로 3회 세척하였다.
뉴클레오티드의 통합
상술한 제한 효소 절단으로 5' 돌출부를 가지는 DNA 분자가 생성되었는데, 그것은 SNP 부위 또는 관심있는 유전자좌와 3' 함몰 단부를 함유하였다. 5' 돌출부는 DNA 중합효소의 존재하에 뉴클레오티드의 통합을 가능하게 하는 주형으로서 작용하였다.
다음의 성분들을 채우기 반응에 사용하였다: 1 ㎕의 형광 표지된 ddATP; 1 ㎕의 형광 표지된 ddTTP; 1 ㎕의 형광 표지된 ddGTP; 1 ㎕의 형광 표지된 ddCTP; 2 ㎕의 10 × 서열 완충제, 0.25 ㎕의 시퀘나제, 및 20 ㎕의 반응액에 필요한 물. 채우기 반응은 40 ℃에서 10분 동안 수행하였다. 모든 표지화 시약은 Amersham으로부터 얻었다(Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core 키트(US 79565); 키트안에 제공된 ddNTP의 농도는 독점적인 것이며 Amersham에 의해 공개되지 않았다). 형광 표지된 ddNTP의 존재하에 3' 함몰 단부를 한 염기씩 채웠고, 그것은 SNP 또는 관심있는 유전자좌에 상응한다.
뉴클레오티드를 통합한 후에 스트렙타웰을 1×PBS (100 ㎕)로 3회 세정하였다. 그런 다음 "채워진" DNA 단편을 제조업체의 설명서에 따라서 제한 효소 EcoRI을 사용하는 절단에 의해 스트렙타웰로부터 방출하였다. 절단은 1 시간 동안 37 ℃에서 120 rpm에서 진동하면서 수행하였다.
관심있는 유전자좌의 검출
스트렙타비딘 매트릭스로부터 방출한 후 10 ㎕의 샘플중 2~3 ㎕를 48 웰 멤브레인 트레이 (The Gel Company, 카탈로그 번호 TAM48-01)에 로딩하였다. 트레이안의 샘플을 48 Flow Membrane Comb (The Gel Company, 카탈로그 번호 AM48)으로 흡수하고, 36 cm의 5 % 아크릴아미드 (우레아) 겔 (BioWhittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, 카탈로그 번호 50691)에 넣는다.
샘플을 겔에서 3000 볼트에서 3분 동안 전기영동하였다. 멤브레인 콤을 제거하고 겔을 3 시간 동안 ABI 377 자동 서열결정 기계에서 이동시켰다. 통합된 뉴클레오티드를 형광에 의해 검출하였다.
프라이머를 관심있는 각각의 증폭된 유전자좌가 크기에 차이가 있도록 디자인하였다. 도 10에서 알 수 있는 바와 같이 각각의 증폭된 관심있는 유전자좌는 약 5 내지 10개의 뉴클레오티드가 달랐으며, 이것으로 관심있는 유전자좌를 겔 전기영동에 의하여 상호 분리하는 것이 가능해졌다. SNP TSC0087315에 대하여 두개의 뉴클레오티드를 검출하였는데, 구아닌과 시토신이었다. 이것들은 SNP TSC0087315에 대해 보고된 두개의 뉴클레오티드이다 (http://snp.cshl.org/snpsearch.shtml). 샘플은 36명의 개체로부터 얻어진 주형 DNA를 포함하였고, 구아닌이 통합된 DNA 분자가 시토신이 통합된 DNA 분자와는 분자량이 다르기 때문이 각 뉴클레오티드에 대하여 구별되는 밴드들을 볼 수 있었다.
SNP HC21S00027에 대하여 두개의 뉴클레오티드를 검출하였는데, 구아닌과 아데노신이었다 (도 10). 이 SNP 부위에 대해 보고된 두개의 뉴클레오티드는 구아닌과 아데노신이다 (http://snp.cshl.org/snpsearch.shtml). 상기에서 논의된 바와 같이 샘플은 36명의 개체로부터 얻어진 주형 DNA를 포함하였고, 그래서 샘플중에두 가지 뉴클레오티드가 나타날 것으로 기대하였다. 구아닌이 통합된 DNA 단편의 분자량은 아데노신이 통합된 DNA 단편과는 구별되어서 두 가지의 뉴클레오티드가 모두 검출되는 것이 가능하였다.
SNP TSC0214366 에서 뉴클레오티드 시토신을 검출하였다 (도 10). 이 SNP 위치에 존재하는 것으로 보고된 두개의 뉴클레오티드는 티미딘과 시토신이다.
SNP TSC0413944 에서 뉴클레오티드 구아닌을 검출하였다 (도 10). 이 SNP에 대하여 보고된 두개의 뉴클레오티드는 구아닌과 시토신이다 (http://snp.cshl.org/snpsearch.shtml).
SNP TSC0095512 에서 뉴클레오티드 시토신을 검출하였다 (도 10). 이 SNP 부위에 대하여 보고된 두개의 뉴클레오티드는 구아닌과 시토신이다 (http://snp.cshl.org/snpsearch.shtml).
SNP HC21S00131에서 검출된 뉴클레오티드는 구아닌이었다. 이 SNP 부위에 대하여 보고된 두개의 뉴클레오티드는 구아닌과 아데노신이다 (http://snp.cshl.org/snpsearch.shtml).
상기에서 논의된 바와 같이, 샘플은 36명의 개체로부터 얻어진 DNA 주형을 포함하였고, 따라서 두 가지 뉴클레오티드가 모두 SNP 부위에서 나타날 것으로 기대하였다. SNP TSC0413944, TSC0095512, TSC0214366 및 HC21S00131에 대하여 두개의 뉴클레오티드중 하나가 검출되었다. 이들 SNP 부위에 대하여 보고된 두가지 뉴클레오티드는 둘 다 샘플중에 존재하지만 하나의 형광 염료가 다른 것을 제압하는 것 같다. 한 뉴클레오티드가 통합된 DNA 분자의 분자량은 다른 뉴클레오티드가 통합된 DNA 분자의 효과적인 분리를 가능하지 않도록 하였다. 그러나 SNP는 쉽게 상호 분리되었는데, 각 SNP에 대하여 적절한 뉴클레오티드가 통합되었다. 다중 염색체로부터 관심있는 다수의 유전자좌의 서열을, PCR 후에 단일한 샘플로서 처리하여 측정하였다.
형광 표지된 ddNTP를 함유하고 있는 단일 반응을 관심있는 다수의 유전자좌를 함유한 샘플을 사용하여 수행하였다. 또는 달리 4개의 별도의 채우기 반응을 수행할 수 있는데, 각 반응은 하나의 형광 표지된 뉴클레오티드 (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP)와 표지되지 않은 ddNTP (실시예 2 참조, 도 7A-7D 및 도 9A-9C)를 함유하였다. 4개의 별도의 "채우기" 반응은 관심있는 유전자좌에 존재하는 어떠한 뉴클레오티드의 검출을 가능하게 할 것이다. 예를 들어 만약 단일 개체로부터 얻어진 관심있는 다수의 유전자좌를 함유하는 샘플을 분석하는 것이고 상기 개체가 관심있는 하나 또는 그 이상의 유전자좌에서 이형접합성이라면, 4개의 별도의 "채우기" 반응은 관심있는 이형접합성 유전자좌에서 뉴클레오티드를 측정하는 데 사용될 수 있다.
또한 다중 개체로부터 얻어진 주형을 함유한 샘플을 분석하는 경우에는 4개의 별도의 "채우기" 반응은 뉴클레오티드가 관심있는 유전자좌에서 발견되는 빈도수와는 무관하게 샘플에 존재하는 뉴클레오티드의 검출을 가능하게 할 것이다. 예를 들어 만약 샘플이 50 개체로부터 얻어진 DNA 주형을 함유하고, 개체중 49개가 관심있는 유전자좌에 티미딘을 가지고 있으며, 하나의 개체만이 구아닌을 가지고 있다면, 각각의 "채우기" 반응이 도 9A 내지 9C에 도시되어 있는 것처럼 겔의 별도의 레인에서 진행되는 4개의 별개의 "채우기" 반응을 수행함으로써 구아닌을 검출할 수 있다. 다중 DNA 주형으로 구성된 샘플을 분석할 때 다중 "채우기" 반응은 관심있는 유전자좌에서 질량의 차이에 의해 다중 뉴클레오티드를 구별해야 할 필요성을 완화시킬 것이다.
이 실시예에서는 다중 단일 뉴클레오티드 다형성을 분석하였다. 또한 관심있는 다수의 유전자좌로부터, 그것에 한정되는 것은 아니지만 점 돌연변이, 변이, 염기전환, 전위, 삽입, 및 결실을 포함하여 돌연변이의 존재 또는 부재를 측정하는 것도 가능하다. 관심있는 다수의 유전자좌는 단일 염색체로부터 또는 다중 염색체로부터 얻어질 수 있다. 관심있는 다수의 유전자좌는 단일 유전자 또는 다중 유전자로부터더 얻어질 수 있다.
질병 표현형을 유발하거나 질병의 소인이 되는 관심있는 다수의 유전자좌의 서열을 결정할 수 있다. 예를 들면 누구나 암 또는 다른 어떠한 질병에 관여된 유전자 하나 수십개를 수백 내지 수천개로 증폭시킬 수 있다. 프라이머는 관심있는 각각의 증폭된 유전자좌의 크기가 다르도록 디자인될 수 있다. PCR 후에 증폭된 관심있는 유전자좌는 조합되어 단일 샘플로서 처리될 수 있다. 또는 달리 관심있는 다수의 유전자좌는 한 PCR 반응에서 증폭될 수 있거나 또는 관심있는 유전자좌의 총 수, 예컨대 100개가 여러 샘플로 나누어져, 예컨대 PCR 반응 당 관심있는 유전자좌 10개로 나누어져 나중에 모아질 수도 있다. 본원에서 증명되는 바, 질병 표현형의 소인이 되거나 유발하는 유전자의 1 ~ 수십 내지 수백 ~ 수천 개의 서열을 결정할 수 있다.
실시예 4
임신한 여성으로부터 얻은 샘플중의 유리 태아 DNA를 사용하여 태아의 염색체 서열을 결정하거나 염색체 이상을 검출하는 능력은 유리 태아 DNA의 낮은 백분율에 의하여 방해받아왔다. 유리 태아 DNA의 백분율을 증가시킴으로써 돌연변이, 삽입, 결실, 전위, 연기전환, 1염색체성, 3염색체성, 3염색체성 21, 3염색체성 18, 3염색체성 13, XXY, XXX, 다른 이수체, 결실, 첨가, 증폭, 전위 및 재배열의 검출이 증가될 수 있을 것이다. 임신한 여성으로부터 얻어진 혈장내 태아 DNA의 %를 세포 용해의 저해제의 존재 및 부재시에 모두 측정하였다. Y 염색체상에 있는 유전자 마커를 사용하여 태아 DNA %를 계산하였다.
주형 DNA의 제조
DNA 주형을 동의서에 승인한 사람 지원자로부터 정맥 천자에 의하여 5 ml의 혈액 샘플로부터 제조하였다. 혈액을 2개의 관(Fischer Scientific, 9 ml EDTA Vacuette tube, 카탈로그 번호 NC9897284)에 일정량씩 넣었다. 하나의 관에 포름알데히드 (25 ㎕/ml 혈액)를 넣었다. 다른 관에 있는 샘플은 EDTA의 존재를 제외하고는 처리하지 않은 채로 놓아두었다. 관을 1000 rpm에서 10분 동안 회전시켰다. 각 샘플의 2 ml의 상층액(혈장)을 새로운 관으로 옮겨서 3000 rpm 에서 10분 동안 회전시켰다. 각 샘플중 800 ㎕를 DNA 정제에 사용하였다. 혈액 세포로부터의 DNA의 정제를 위해 Qiagen Midi 키트를 사용하여 DNA를 분리하였다 (QIAmp DNA Blood Midi Kit, 카탈로그 번호 51183). DNA를 100 ㎕의 증류수로 용출하였다. 두개의 DNA 주형을 얻었다: 하나는 EDTA로 처리한 혈액 샘플로부터 얻었고, 다른 하나는EDTA와 포름알데히드로 처리한 혈액 샘플로부터 얻었다.
프라이머 디자인
두 개의 상이한 세트의 프라이머를 사용하였다: 한 프라이머 세트는 Y 염색체에 특이적이어서 태아 DNA에도 특이적이고, 다른 프라이머 세트는 낭포성 섬유증 유전자를 증폭시키도록 디자인하였는데, 그것은 모친과 태아 둘 다의 주형 DNA 상에 존재한다.
이 실시예에서 첫번째와 제 2 프라이머를 각 프라이머의 완전한 5' 나 3' 서열이 주형 DNA에 아닐되도록 디자인하였다. 이 실시예에서 태아는 XY 표현형을 가졌고, Y 염색체를 태아 DNA의 존재에 대한 마커로서 사용하였다. 다음의 프라이머를 디자인하여 Y 염색체 상에 있는 SRY 유전자를 증폭시켰다.
제 1 프라이머: 5' TGGCGATTAAGTCAAATTCGC 3'
제 2 프라이머: 5' CCCCCTAGTACCCTGACAATGTATT 3'
어떠한 유전자, 또는 영역의 일부, 또는 어떠한 염색체의 어떤 부분을 증폭시키기 위하여 디자인한 프라이머는 모친과 태아의 DNA를 검출하는 데 사용될 수 있다. 이 실시예에서는 다음의 프라이머를 디자인하여 낭포성 섬유증 유전자를 증폭시켰다.
제 1 프라이머: 5' CTGTTCTGTGATATTATGTGTGGT 3'
제 2 프라이머: 5' AATTGTTGGCATTCCAGCATTG 3'
PCR 반응
SRY 유전자와 낭포성 섬유증 유전자를 PCR을 사용하여 주형 게놈 DNA로부터증폭시켰다 (미국 특허 제 4,683,195호 및 4,683,202호). 증가된 특이성에 대해서는 "핫-스타트" PCR을 사용하였다. PCR 반응을 Qiagen에 의해 제공된 HotStarTaq Master Mix 키트 (카탈로그 번호 203443)를 사용하여 수행하였다. SRY 유전자의 증폭을 위해서는 Qiagen 정제 칼럼으로부터 용출된 DNA를 연속적으로 1:2로 희석하였다. 낭포성 섬유증 유전자의 증폭을 위해서는 Qiagen 정제 칼럼으로부터의 DNA를 1:4로 희석한 후 연속적으로 1:2로 희석하였다. 다음의 성분들을 각각의 PCR 반응에 사용하였다: 8 ㎕의 주형 DNA (희석되었거나 희석되지 않은), 1 ㎕의 각 프라이머 (5 μM), 10 ㎕의 HotStar Taq mix. 다음의 PCR 반응을 사용하였다:
(1) 95 ℃에서 15분
(2) 94 ℃에서 1분
(3) 54 ℃에서 15초
(4) 72 ℃에서 30초
(5) 단계 2 내지 4를 45 사이클 반복한다.
(6) 10 분동안 72 ℃.
태아 DNA의 정량
Qiagen 칼럼으로부터 용출된 DNA 주형을 다음의 농도로 연속적으로 희석하였다:1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024, 1:2048 및 1:4096. SRY 유전자의 증폭을 다음과 같이 희석된 주형을 사용하여 수행하였다: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512. 낭포성 섬유증 유전자의 증폭은 다음과 같이 희석된 DNA 주형을 사용하여 수행하였다: 1:4, 1:8, 1:16,1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024, 1:2048 및 1:4096. 동일한 일련의 희석을 EDTA 단독으로 처리한 혈장 샘플과 EDTA 및 포름알데히드로 처리한 혈장 샘플로부터 정제한 DNA 주형을 사용하여 수행하였다.
EDTA로 처리한 혈장 샘플로부터 분리한 DNA 주형을 사용한 PCR 반응의 결과는 도 11A에 도시한다. SRY 유전자를 희석하지 않은 DNA 주형, 및 1:2로 희석한 샘플로부터 증폭하였다 (도 11A). 다음의 7 개의 연속 희석에서는 SRY 유전자를 증폭시키지 않았다. 다른 한편으로 낭포성 섬유증 유전자를 1:256 까지의 연속적인 희석액에서 검출하였다. 혈장에 모계 DNA가 더 큰 백분율로 존재하기 때문에 낭포성 섬유증 유전자가 더 많이 존재할 것으로 기대되었다. 유전자 생성물의 증폭을 제공하는 마지막 희석 샘플은 낭포성 섬유증 유전자 또는 SRY 유전자의 복제물을 하나 가지는 것으로 추정되었다.
포름알데히드와 EDTA로 처리한 혈장 샘플로부터 얻어진 DNA 주형을 사용하는 PCR 반응의 결과를 도 11B에 도시한다. SRY 유전자를 희석하지 않은 DNA 주형, 및 1:2로 희석한 샘플로부터 증폭하였다 (도 11B). 그 다음 6개의 희석에서는 SRY 유전자는 증폭하지 않았다. 그러나 1:256 희석에서는 SRY 유전자가 검출되었다. 앞서의 6개의 일련의 희석이 SRY의 증폭에 대해서는 전부 네가티브였기 때문에 1:256 샘플에서의 증폭이 진정한 신호를 나타내는 것 같지는 않다. 이 샘플에서의 SRY 유전자의 증폭은 사용된 많은 수의 PCR 사이클로부터 유발된 실험적인 인공물인 것 같았다. 그러므로 1:256 샘플은 샘플중에 존재하는 태아 DNA의 양을 계산하는 데 사용하지 않았다.
낭포성 섬유증 유전자의 증폭을 1:16으로 희석한 샘플에서 검출하였다 (도 11B). 포르말린의 존재는 모계 세포의 세포 용해를 방지하므로 샘플중의 모계 DNA의 백분율은 더 낮다. 이것은 1:256의 희석에서도 증폭을 나타낸, EDTA로만 처리된 샘플과는 크게 대조된다.
모계 혈장에 존재하는 태아 DNA의 %를 다음의 식을 사용하여 계산하였다:
% 태아 DNA = (SRY 유전자의 양/낭포성 섬유증 유전자의 양)*2*100
SRY 유전자의 양은 유전자가 증폭된 가장 높은 희석률에 의해 표시하였다. 마찬가지로 낭포성 섬유증 유전자의 양도 그것이 증폭된 가장 높은 희석률로 표시하였다. 상기 식은 두개의 (2)의 곱셈 인자를 함유하는데, 그것은 SRY 유전자의 복제물이 하나만 있는 반면에 낭포성 섬유증 유전자의 복제물은 두개가 있다는 사실을 표준화하기 위하여 사용하였다.
상기 실시예에 대하여 EDTA로만 처리된 샘플중에 존재하는 태아 DNA의 백분율은 1.56 % (2/256*2*100)였다. 혈장에 존재하는 보고된 태아 DNA의 백분율은 0.39 내지 11.9 % 이다 (Pertl and Bianchi,Obstetrics and Gynecology, Vol. 98, No. 3, 483-490 (2001)). 포르말린과 EDTA로 처리된 샘플중에 존재하는 태아 DNA의 백분율은 25 % (2/16*2*100)였다. 실험을 수없이 반복하였고, 반복할 때마다 포르말린의 존재는 태아 DNA의 전체 백분율을 증가시켰다.
포르말린이 있을 때와 없을 때의 18개의 혈액 샘플로부터 얻어지는 % 태아 DNA를 상술한 바와 같이 계산하고, 단 1:5의 연속 희석을 수행하였다. 1:5 희석을 수행하였기 때문에 SRY 유전자나 낭포성 섬유증 유전자중 어느 하나의 검출을 가능하게 한 마지막 연속 희석은 한 개의 유전자 복제물을 함유할 수 있거나 4개의 유전자 복제물을 가질 수 있었다. 포르말린이 있거나 없을 때 18개의 샘플로부터 얻어진 결과를 하기 표 5에 요약한다. 낮은 범위는 마지막 희석 샘플이 한 개의 유전자 복제물을 가진 것을 나타내고, 높은 범위는 마지막 희석이 4개의 유전자 복제물을 가진 것을 나타낸다.
포르말린이 있을 때와 없을 때의 평균 백분율 태아 DNA
샘플 낮은 범위 높은 범위
포르말린 19.47 43.69
포르말린이 없을 때 7.71 22.1
태아 DNA의 총 증가는 모계 세포의 세포 용해를 감소시키고, 그로써 샘플중에 존재하는 모계 DNA의 양을 감소시킴으로써 이루어졌다. 이 실시예에서 포름알데히드를 세포의 용해를 방지하기 위하여 사용하였지만 세포 용해를 방지하거나 세포의 구조적 보존성을 증가시킬 수 있는 제제라면 어떠한 것이든지 사용할 수 있다. 둘 또는 둘 이상의 세포 용해 저해제를 사용할 수 있다. 모계 혈장중의 태아 DNA의 증가는 태아 DNA의 서열을 결정하는 것을 가능하게 하며, 따라서 비정상적인 DNA 서열 또는 염색체 이상, 예를 들어 그것들에 한정되는 것은 아니지만 점 돌연변이, 해독 프레임 변형, 변이, 염기전환, 첨가, 삽입, 결실, 첨가-결실, 프레임 변형, 미스센스, 역 돌연변이, 및 마이크로새틀라이트 변경, 3염색체성, 1염색체성, 다른 이수체, 증폭, 재배열, 전위, 염기전환, 결실, 첨가, 증폭, 단편, 전위, 및 재배열의 검출을 가능하게 한다.
실시예 5
3염색체성 21의 유전자형을 가지고 있는 개체로부터 얻어진 DNA 주형을 분석하였다. 관심있는 3개의 유전자좌를 염색체 13 상에서 분석하였고, 관심있는 2개의 유전자좌는 염색체 21 상에서 분석하였다.
주형 DNA의 제조
주형 DNA를 동의서에 승인한 사람 지원자로부터 정맥 천자에 의해 얻은 혈액의 5 ml 샘플로부터 제조하였다. 사람 지원자는 앞서 유전자형이 추가의 염색체 21 (3염색체성 21)을 가지고 있는 것으로 분류되었다. 주형 DNA를 QIAGEN에 의해 공급된 QIAamp DNA 혈액 미디 키트(카탈로그 번호 51183)를 사용하여 분리하였다.
프라이머 디자인
다음의 5개의 단일 뉴클레오티드 다형성을 분석하였다: SNP TSC 0115603은 염색체 21 상에 위치하였다; SNP TSC 03209610은 염색체 21 상에 위치하였다; SNP TSC 0198557은 염색체 13 상에 위치하였다; 그리고 SNP TSC 0200347은 염색체 13 상에 위치하였다. 다른 개체로부터 얻어진 DNA 주형을 내부 대조표준으로서 사용하였다. 앞서 구아닌에 대해 동형접합성인 것으로 확인된 SNP TSC 0200347을 내부 대조표준으로서 사용하였다. SNP 콘소시엄 회사의 데이터베이스는 2002. 4. 1 개시된 웹사이트인 http://snp.cshl.org/에서 쉽게 찾아볼 수 있다.
SNP TSC 0115603을 다음의 프라이머를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' GTGCACTTACGTGAATTCAGATGAACGTGATGTAGTAG 3'
제 2 프라이머:
5' TCCTCGTACTCAACGGCTTTCTCTGAAT 3'
제 1 프라이머를 5' 단부에서 비오티닐화하였고, 이것은 EcoRI에 대한 제한 효소 인식 부위를 함유하였다. 제 2 프라이머는 제한 효소 BceA I에 대한 인식 부위를 함유하였다.
SNP TSC 0309610을 다음의 프라이머를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' TCCGGAACACTAGAATTCTTATTTACATACACACTTGT 3'
제 2 프라이머:
5' CGAATAAGGTAGACGGCAACAATGAGAA 3'
제 1 프라이머는 5' 단부에 비오틴기를 함유하였고, 제한 효소 EcoRI에 대한 제한 효소 인식 부위를 함유하였다. 제 2 프라이머는 BceA I에 대한 제한 효소 인식 부위를 함유하였다.
제시된 SNP (ss) 813773 (NCBI Submitted SNP (ss) 데이터베이스에 의해 승인된 승인 번호)을 다음의 프라이머를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' CGGTAAATCGGAGAATTCAGAGGATTTAGAGGAGCTAA 3'
제 2 프라이머:
5' CTCACGTTCGTTACGGCCATTGTGATAGC 3'
제 1 프라이머는 5' 단부에 비오틴기를 함유하였고, 제한 효소 EcoRI에 대한인식 부위를 함유하였다. 제 2 프라이머는 BceA I에 대한 제한 효소 인식 부위를 함유하였다.
SNP TSC 0198557을 다음의 프라이머를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' GGGGAAACAGTAGAATTCCATATGGACAGAGCTGTACT 3'
제 2 프라이머:
5' TGAAGCTGTCGGACGGCCTTTGCCCTCTC 3'
제 1 프라이머는 5' 단부에 비오틴기를 함유하였고, 제한 효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유하였다. 제 2 프라이머는 BceA I에 대한 제한 효소 인식 부위를 함유하였다.
SNP TSC 0197279를 다음의 프라이머를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' ATGGGCAGTTATGAATTCACTACTCCCTGTAGCTTGTT 3'
제 2 프라이머:
5' TGATTGGCGCGAACGGCACTCAGAGAAGA 3'
제 1 프라이머는 5' 단부에 비오틴기를 함유하였고, 제한 효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유하였다. 제 2 프라이머는 제한 효소 BceA I에 대한 인식 부위를 함유하였다.
SNP TSC 0200347을 다음의 프라이머를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' CTCAAGGGGACCGAATTCGCTGGGGTCTTCTGTGGGTC 3'
제 2 프라이머:
5' TAGGGCGGCGTGACGGCCAGCCAGTGGT 3'
제 1 프라이머는 5' 단부에 비오틴기를 함유하였고, 제한 효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유하였다. 제 2 프라이머는 BceA I에 대한 제한 효소 인식 부위를 함유하였다.
PCR 반응
관심있는 5개의 유전자좌 전부를 PCR을 사용하여 주형 게놈 DNA로부터 증폭시켰다 (미국 특허 제 4,683,195호 및 4,683,202호). 증가된 특이성에 대해서는 "핫-스타트" PCR을 사용하였다. PCR 반응을 Qiagen에 의해 제공된 HotStarTaq Master Mix 키트(카탈로그 번호 203443)를 사용하여 수행하였다. 반응 당 주형 DNA와 프라이머의 양은 관심있는 각 유전자좌에 대해 최적화될 수 있으며, 이 실시예에서는 40 ng의 주형 사람 게놈 DNA와 5 μM의 각 프라이머를 사용하였다. 38 사이클의 PCR을 수행하였다. SNP TSC 0115603, SNP TSC 0309610 및 SNP TSC 02003437에 대해서는 다음의 PCR 조건을 사용하였다:
(1) 95 ℃에서 15분 15초;
(2) 42 ℃에서 30초;
(3) 95 ℃에서 30초;
(4) 60 ℃에서 30초;
(5) 95 ℃에서 30초;
(6) 69 ℃에서 30초;
(7) 95 ℃에서 30초;
(8) 단계 6과 7을 37회 반복한다;
(9) 72 ℃에서 5분.
SNP ss813773, SNP TSC 0198557, 및 SNP TSC 0197279에 대해서는 다음의 PCR 조건을 사용하였다:
(1) 95 ℃에서 15분 15초;
(2) 37 ℃에서 30초;
(3) 95 ℃에서 30초;
(4) 57 ℃에서 30초;
(5) 95 ℃에서 30초;
(6) 64 ℃에서 30초;
(7) 95 ℃에서 30초;
(8) 단계 6과 7을 37회 반복한다;
(9) 72 ℃에서 5분.
제 1 프라이머는 5' 말단에 비오틴 그룹과 제한 효소 EcoR Ⅰ에 대한 인식 부위를 포함한다. 제 2 프라이머는 BceA Ⅰ에 대한 제한 효소 인식 부위를 포함한다.
PCR 반응
총 5 개의 관심있는 유전자좌들이 주형 게놈 DNA로부터 PCR(미국특허 제4,683,195호 및 제 4,683,202호)을 사용하여 증폭되었다. 특이성을 증가시키기 위해서, "핫-스타트" PCR이 사용되었다. PCR 반응들은 QIAGEN 사(카탈로그 번호 203443)에 의해 공급되는 HotStartTaq Master Mix 키트를 사용하여 수행되었다. 반응에 대한 주형 DNA와 프라이머의 양은 관심있는 각 유전자좌마다 최적화 될 수 있다; 본 실시예에서, 40 ng의 주형 사람 게놈 DNA와 각각 5 μM의 프라이머가 사용되었다. 38 사이클의 PCR이 수행되었다. 다음의 PCR 조건들은 SNP TSC 0115603, SNP TSC 0309610, 및 SNP TSC 02003437에 사용되었다:
(1) 95 ℃에서 15 분 15 초;
(2) 42 ℃에서 30 초;
(3) 95 ℃에서 30 초;
(4) 60 ℃에서 30 초;
(5) 95 ℃에서 30 초;
(6) 69 ℃에서 30 초;
(7) 95 ℃에서 30 초;
(8) 단계 6 및 7을 39(37) 회 반복;
(9) 72 ℃에서 5 분.
다음의 PCR 조건들은 SNP ss813773, SNP TSC 0198557, 및 SNP TSC 0197279에 사용되었다:
(1) 95 ℃에서 15 분 15 초;
(2) 37 ℃에서 30 초;
(3) 95 ℃에서 30 초;
(4) 57 ℃에서 30 초;
(5) 95 ℃에서 30 초;
(6) 64 ℃에서 30 초;
(7) 95 ℃에서 30 초;
(8) 단계 6 및 7을 39(37) 회 반복; 및
(9) 72 ℃에서 5 분.
각 PCR의 첫번째 사이클에서, 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 3' 어닐링 영역의 용융 온도이다. PCR의 두번째 사이클에서 어닐링 온도는 대략 주형 DNA에 결합하는 제 1 프라이머의 3' 영역의 용융 온도이다. PCR의 세번째 사이클에서 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 전체 서열의 용융 온도이다. PCR의 처음 3 사이클에서 어닐링 온도의 TM1으로부터 TM2 및 TM3로의 단계적 증가는 특이성을 크게 증가시킨다. 이러한 결합 온도들은 대표적이며, 당업자라면 각 사이클에 대한 어닐링 온도는 사용된 프라이머에 의존한다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 변성, 어닐링 및 확장의 온도와 시간은 다양한 설정들을 시도해 보고 최상의 결과를 제공하는 변수들을 사용함으로써 최적화될 수 있다.
관심있는 단편의 정제
PCR 생산물을 PCR 반응 성분들로부터 제조자의 설명서에 따라서 QIAGEN 사의 MinElute PCR 정제 키트(카탈로그 번호 28006)을 사용하여 분리하였다. PCR 생산물을 20 μl의 증류수에 용출시켰다. 각각의 증폭된 SNP에 대하여, 1 μl의 PCR 생산물, 1 μl의 증폭된 내부 조절 DNA(SNP TSC 0200347), 및 8 μl의 증류수를 혼합하였다. 각 샘플의 5 μl를 Pierce 사의 스트렙타웰 마이크로타이터 플레이트(카탈로그 번호 15501)의 두개의 분리된 반응웰에 놓았다. 제 1 프라이머는 PCR 생산물이 스트렙타비딘 코팅된 웰에 결합되도록 하는 한편 게놈 주형 DNA는 결합되지 않도록 하는 5' 비오틴 태그를 함유했다. 스트렙타비딘 결합 반응을 써모믹서(Eppendorf)를 사용하여 45 ℃에서 1 시간 동안 150 rpm으로 수행하였다. 각 웰들을 비결합 물질들을 제거하기 위하여 흡인하였고, 가볍게 혼합하면서 1X PBS로 3번 세척하였다(Kandpal 등, Nucl. Acids Res. 18:1789-1795(1990); Kaneoka 등, Biotechniques 10:30-34(1991); Green 등, Nucl. Acids Res. 18:6163-6164(1990)).
분리된 단편들의 제한효소 절단
정제된 PCR 생산물을 제 2 프라이머로부터 PCR 생산물에 통합된 인식 부위에 결합하는 제한 효소로 절단하였다. 정제된 PCR 생산물을 제한 효소 BceA Ⅰ(New England Biolabs, 카탈로그 번호 R0623S)으로 절단하였다. 절단 반응은 제한 효소와 함께 공급된 설명서에 따라 마이크로타이터 플레이트의 웰에서 수행되었다. 적절한 제한 효소로 절단한 후에, 웰을 절단된 단편을 제거하기 위하여 PBS로 세번 세척하였다.
표지된 뉴클레오티드의 결합
상기 설명된 제한 효소 절단으로 5' 돌출부를 가진 DNA 단편을 얻었는데, 그것은 SNP 및 3' 함몰 말단을 포함하였다. 5' 돌출부는 DNA 중합효소의 존재하에서 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 통합을 허용하는 주형으로 작용한다.
각 SNP에 대하여, 두 채우기 반응을 수행하였다; 각 반응은 상이한 형광물질로 표지된 ddATP(특정의 SNP에 존재하는 것으로 보고된 뉴클레오티드들에 의존하는 ddATP, ddATP, ddATP, 또는 ddATP)를 함유한다. 예를들어, 뉴클레오티드 아데닌 및 티미딘은 SNP TSC 0115603에서 보고되었다. 그러므로, SNP TSC 0115603에 대한 절단된 PCR 생산물은 형광으로 표지된 ddATP 또는 형광으로 표지된 ddATP와 혼합된다. 각 반응은 내부 조절을 위한 형광으로 표지된 ddATP를 포함한다. 아래의 성분을 각 채우기 반응에 첨가하였다: 2 μl의 ROX-결합된 ddATP(각 SNP에 대하여 보고된 뉴클레오티드들에 의존), 2 μl의 ROX-결합된 ddATP(내부 조절), 2.5 μl의 10X 시퀘나제 버퍼, 2 μl의 시퀘나제, 및 25 μl 반응에 필요한 물. 모든 채우기 반응은 45 ℃에서 45 분 동안 수행되었다. 그러나 더 짧은 시간의 통합 기간이 사용될 수 있다. 비형광 표지된 ddNTPs가 Fermentas 사(Hanover, MD)로 부터 구입되었다. ROX-결합된 ddNTPs는 Perkin Elmer사로부터 구입하였다. 형광 표지된 ddNTPs의 존재 하에서, 3' 함몰 말단은 하나의 염기씩 확장되어지는데, 그것은 SNP 또는 관심있는 유전자좌에 상응하는 것이다.
표지화 후에, 각각의 스트렙타웰을 1X PBS (100 μl)로 3회 헹구었다.
그 다음 "채우기" DNA 단편을 제조자의 추천에 따른 제한 효소 EcoR I으로 절단함으로서 스트렙타웰로부터 방출시켰다. 절단은 120 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 1 시간 동안 수행되었다.
관심있는 유전자좌의 검출
스트렙타비딘 매트릭스로부터 방출한 후 10 ㎕의 샘플중 3 ㎕를 48 웰 멤브레인 트레이(The Gel Company, 카탈로그 번호 TAM48-01)에 로딩하였다. 트레이안의 샘플을 48 유동 멤브레인 콤(The Gel Company, 카탈로그 번호 AM48)으로 흡수하고, 36 cm의 5 % 아크릴아미드(우레아) 겔(BioWhittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, 카탈로그 번호 50691)에 넣는다.
샘플을 겔에서 3000 볼트에서 3분 동안 전기영동하였다. 멤브레인 콤을 제거하고 겔을 3 시간 동안 ABI 377 자동 서열결정 기계에서 이동시켰다. 통합된 표지된 뉴클레오티드를 형광에 의해 검출하였다.
도 12에서 나타난 바와 같이, SNP TSC 0115603는 표지된 ddTTP (레인 1)로 채워졌고, 별개의 반응에서는 표지된 ddATP (레인 3)로 채워졌다. 수정되지 않은 데이터를 사용한 뉴클레오티드들간의 계산된 비율은 66:34이며, 이것은 3염색체성 21을 가진 개체에 있어서 염색체 21 상의 SNP에 대한 이론적인 비율인 66:33 과 일치한다. ddTTP 및 ddATP는 염료의 통합 효율의 다양성을 최소화하기 위하여 동일한 형광 염료로 표지되었다. 그러나, 다른 형광 표지들이나 어떠한 검출가능한 표지를 가진 뉴클레오티드들이 사용될 수 있다. 다른 표지들이 사용될 경우에는 통합의 계수를 계산하는 것이 바람직하다.
각각의 채우기 반응은 분리된 웰에서 수행되므로 마이크로타이터 플레이트의 웰들 사이의 DNA 결합에 있어서 차이가 발생할 수 있는 가능성이 있다. 스트렙타비딘 코팅된 플레이트에 대한 DNA 결합의 잠재적인 다양성을 해결하기 위하여 내부 조절이 사용된다. 구아닌에 대한 동형접합성 내부조절(SNP TSC 0200347)이 두 분리된 웰로 샘플을 분리하기 이전에 샘플에 첨가되었고, 따라서, 동등한 양의 내부 조절이 각각의 웰에 존재하여야만 한다. 통합된 ddGTP의 양은 두 반응간에서 고정될 수 있다. 만약 각각의 웰에서 DNA의 양이 각각의 주형 분자에서 뉴클레오티드의 통합을 지원하는 조건으로서 규정된 포화 조건과 동일하다면, 반응은 포화 상태에서 수행되므로 통합된 ddGTP의 양은 동량이어야만 한다. 내부 조절을 사용하면, 통합된 ddATP 대 ddTTP의 비는 63.4:36.6이었다. 이 비율은 수정되지 않은 데이터로부터 얻어진 비율과 매우 유사한 것으로, 특별한 SNP에 대한 두 채우기 반응들에 있어서 작은 차이가 있음을 나타낸다.
3염색체성 21을 가진 개체로부터 DNA 주형 상에 다중 SNPs에서 대립유전자 빈도
SNP 대립유전자 최고 영역 대립유전자 비율 내부 조절 표준화된 최고 영역 대립유전자 비율(%)
TSC0115603 AT 55992951 6634 723661 55993227((723/661)*2951) 63.436.6
TSC0309610 TC 41262342 6436 14241631 41262045((1424/1631)*2342) 66.833.2
ss813773 AC 41994870 4654 808647 41996082((808/647)*4870) 4159
TSC0198557 TC 33852741 5545 719559 33853525((719/559)*2741) 4951
TSC0197279 TC 80857202 5347 27522520 80857865((2752/2520)*7202) 50.749.3
SNP TSC 0309610이 ddTTP (레인 3) 또는 ddCTP (레인 4)로 채워졌다(도 12). 수정되지 않은 데이터를 이용하면, 뉴클레오티드들에 대한 계산된 비는 64:36이었다. ddTTP 및 ddCTP는 동일한 형광 물질로 표지되었다. 상기 검토된 바와 같이, 내부 조절로 표준화한 후에 ddTTP와 ddCTP의 계산된 대립유전자 비율은 66. 8:33. 2이었다.(표 6). 다시, 수정되지 않은 데이터로부터 계산된 비율과 내부조절을 사용하여 계산된 비율 양자는 3염색체성을 가진 개체의 염색체 21상의 SNP에 대한 이론적인 비율인 66.6:33.4과 매우 유사하다.
이형접합성 SNPs에서 뉴클레오티드들에 대한 66:33의 비율이 3개의 복제물로 존재하는 염색체상에 유전자좌들을 나타낸다는 것을 증명하기 위해서, 염색체 13상의 SNPs가 분석되었다. 하나의 모계 염색체 13과 하나의 부계 염색체 13으로부터 유전자형이 이미 관찰되어진 개체로부터 혈액 샘플을 얻었다.
제안된 SNP (ss) 813773이 ddATP (레인 5) 또는 ddCTP (레인 6)로 채워졌다 (도 12). 수정되지 않은 데이터를 사용하여 이 이형접합성 SNP에서 뉴클레오티드에 대한 계산된 비율은 46 : 54이었다. 이 비율은 기대되어진 비율인 50 : 50의 10% 내이다. 중요하게도, 비율은 염색체에 추가적인 복제물이 있을 때에 기대되는 비율인 66 : 33에 근접하지 않는다.
내부 조절로 표준화 한 후, 계산된 비율은 41:59이었다. 기대된 결과와 대조적으로, 내부 조절로 표준화 한 계산된 비율과 이론상의 비율 사이에 불일치를 증가시켰다. 이러한 결과는 DNA 샘플을 알리쿼트할 때 발생하는 실험상의 오류일 것이다.
또한, "채우기" 반응을 위한 주형으로 사용되는 돌출부를 생성하는데 사용되는 제한 효소는 하나의 DNA 주형보다 다른 하나의 DNA 주형을 우선적으로 절단할 수 있는 가능성이 있다. SNP 부위에서의 뉴클레오티드에 대한 2 주형이 상이하다면, 이것은 절단에 영향을 줄 수 있다. 프라이머들은 SNP 부위의 뉴클레오티드와는 무관하고, 절단 부위에 인접한 뉴클레오티드들은 동일하도록 디자인될 수 있다("프라이머 디자인"으로 명명된 섹션에서 자세히 설명).
염색체 13상에 있는 SNP TSC 0198557이 한 반응에서 ddTTP (레인 7)로 다른 반응에서 ddCTP (레인 8)로 채워졌다 (도 12). 수정되지 않은 데이터를 사용하여, 이 SNP에서 뉴클레오티드들에 대한 계산된 비율은 55:45이었다. 내부조절로 표준화한 후, T:C의 계산된 대립유전자 비율은 49:51이었다. 표준화된 비율은 염색체 13의 2개의 복제물을 가진 개체에 대한 이론적인 비율인 50:50에 보다 근접하였다.
염색체 13상에 있는 SNP TSC 0197279이 한 반응에서 ddTTP (레인 9)로 다른 반응에서 ddCTP (레인 10)로 채워졌다 (도 12). 수정되지 않은 데이터를 사용하여, 이 SNP에서 뉴클레오티드들에 대한 계산된 비율은 53:47이었다. 내부조절로 표준화한 후, T:C의 계산된 대립유전자 비율은 50.7:49.3이었다. 이것은 염색체 13의 단지 3개의 복제물을 가진 개체에 대한 이론적인 비율인 50:50과 일치한다.
염색체 13상의 분석된 두개의 SNPs에서 뉴클레오티드들에 대한 비율은 근사적으로 50:50이었다. 하나의 SNP인 ss813773는 46:54의 비율을 보였고, 내부 조절로 표준화되었을 때에는 그 비율이 41:59이었다. 이러한 비율은 기대된 50:50과는 편차가 있지만 동시에, 이 비율들이 66:33의 비율이 나타내는 여분의 염색체를 나타내지는 않는다. 이 특정의 SNP로부터의 데이터가 결정적인 것은 아니지만, 오류 양성을 나타내는 것은 아니다. 이 SNP로부터의 데이터상에서 도출될 수 있는 결론은 없다. 그러나, 나머지 두개의 SNPs는 정상적인 수의 염색체들을 나타내는 데이터를 제공했다. 1-5, 5-10, 10-50, 50-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 900-1000, 1000-2000, 2000-3000, 그리고3000보다 더 큰 것을 제한없이 포함하는 염색체상의 다중 SNPs를 분석하는 것이 유리하다. 바람직하게, 특정한 염색체에 대한 비율들의 평균이 염색체 이상의 존재 여부를 결정하는데 사용될 수 있을 것이다. 그러나, 여전히 관심있는 하나의 유전자좌를 분석하는 것은 가능하다. 결정적이지 않은 데이터가 얻어진 경우에, 다른 관심있는 유전자좌가 분석될 수 있다.
3염색체성 21의 유전자형을 가진 개체로부터 DNA 주형을 얻었고, 그리고 염색체 21상의 SNPs의 대립유전자 빈도는 추가적인 염색체 21을 나타낸다. 추가적인 염색체는 매 SNP에 대해 추가적인 뉴클레오티드를 제공하고, 이와같이 이형접합성 SNP에서 전형적인 50 : 50의 비율이 변화한다. 이러한 결과는 다중 SNPs와 일치하고, 염색체 21상에서 발견된 SNPs 에 대해 특이적이다. 염색체 13상의 SNPs에 대한 대립유전자의 빈도는 약 50 : 50의 기대된 비율을 제공한다. 이러한 결과들은 본 SNP 검색 방법이 전위, 염기치환, 1염색체성, 3염색체성 21, 3염색체성 18, 3염체성 13, 다른 이수체, 결실, 첨가, 증폭, 전위, 재조합을 제한없이 포함하는 염색체 이상을 검사하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 6
동의서에 승인한 4명의 피험자로부터 게놈 DNA를 획득하였다. 염색체 13 상의 6개의 SNPs (TSC0837969, TSC0034767, TSC1130902, TSC0597888, TSC0195492, TSC0607185)가 주형 DNA를 사용하여 분석되었다. 이러한 SNPs에 관한 정보는 다음의 웹 사이트에서 확인할 수 있다(www. snp. chsl. org/snpsearch. shtml ; 웹 사이트는 2003년 2월 11일자로 개시).
하나의 형광 물질로 표지된 단일 뉴클레오티드를 6개의 선택된 SNP 부위에서 개체의 유전자형을 결정하는데 사용하였다. 프라이머는 6개의 SNPs를 단일반응으로 분석되어지도록 디자인되었다.
주형 DNA의 제조
동의서에 승인한 지원자로부터 정맥 천자에 의하여 획득된 9ml의 혈액으로부터 주형 DNA가 준비되었다. QIAGEN 사(카탈로그 번호 51183)에 의해 공급된 QIAmp DNA 혈액 미디키트를 사용하여 주형 DNA가 분리되었다. 주형 DNA는 Kit에 포함된 설명서에 따라 분리되었다.
프라이머의 디자인
SNP TSC0837969는 다음의 프라이머 세트를 사용하여 증폭되었다:
제 1 프라이머 : 5'GGGCTAGTCTCCGAATTCCACCTATCCTACCAAATGTC 3'
제 2 프라이머 : 5'TAGCTGTAGTTAGGGACTGTTCTGAGCAC 3'
제 1 프라이머는 5' 말단에 비오틴 태그를 가지고 제한 효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 포함한다. 제 1 프라이머는 관심있는 유전자좌로부터 44개의 염기들이 어닐링하게 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한 효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 포함한다.
SNP TSC0034767 (50)는 다음의 프라이머 세트를 사용하여 증폭되었다:
제 1 프라이머 : 5'CGAATGCAAGGCGAATTCGTTAGTAATAACACAGTGCA 3'
제 2 프라이머 : 5'AAGACTGGATCCGGGACCATGTAGAATAC 3'
제 1 프라이머는 5' 말단에 비오틴 태그를 가지고 제한 효소 EcoRI에 대한인식 부위를 포함한다. 제 1 프라이머는 관심있는 유전자좌로부터 50개의 염기들이 어닐링하게 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한 효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 포함한다.
SNP TSC1130902 (60)는 다음의 프라이머 세트를 사용하여 증폭되었다:
제 1 프라이머 : 5'TCTAACCATTGCGAATTCAGGGCAAGGGGGGTGAGATC 3'
제 2 프라이머 : 5'TGACTTGGATCCGGGACAACGACTCATCC 3'
제 1 프라이머는 5' 말단에 비오틴 태그를 가지고 제한 효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 포함한다. 제 1 프라이머는 관심있는 유전자좌로부터 60개의 염기들이 어닐링하게 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한 효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 포함한다.
SNP TSC0597888 (70)는 다음의 프라이머 세트를 사용하여 증폭되었다:
제 1 프라이머 : 5'ACCCAGGCGCCAGAATTCTTTAGATAAAGCTGAAGGGA3'
제 2 프라이머 : 5'GTTACGGGATCCGGGACTCCATATTGATC3'
제 1 프라이머는 5' 말단에 비오틴 태그를 가지고 제한 효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 포함한다. 제 1 프라이머는 관심있는 유전자좌로부터 70개의 염기들이 어닐링하게 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한 효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 포함한다.
SNP TSC0195492 (80)는 다음의 프라이머 세트를 사용하여 증폭되었다:
제 1 프라이머 : 5'CGTTGGCTTGAGGAATTCGACCAAAAGAGCCAAGAGAA
제 2 프라이머 : 5'AAAAAGGGATCCGGGACCTTGACTAGGAC3'
제 1 프라이머는 5' 말단에 비오틴 태그를 가지고 제한 효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 포함한다. 제 1 프라이머는 관심있는 유전자좌로부터 80개의 염기들이 어닐링하게 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한 효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 포함한다.
SNP TSC0607185 (90)는 다음의 프라이머 세트를 사용하여 증폭되었다:
제 1 프라이머 : 5'ACTTGATTCCGTGAATTCGTTATCAATAAATCTTACAT 3'
제 2 프라이머 : 5'CAAGTTGGATCCGGGACCCAGGGCTAACC 3'
제 1 프라이머는 5' 말단에 비오틴 태그를 가지고 제한 효소 EcoR I에 대한 인식 부위를 포함한다. 제 1 프라이머는 관심있는 유전자좌로부터 90개의 염기들이 어닐링하게 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한 효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 포함한다.
모든 관심있는 유전자좌들은 중합효소 연쇄반응(PCR, 미국특허 4, 683, 195 및 4, 683, 202, 참조로서 본원에 통합됨)을 사용하여 주형 게놈 DNA로부터 증폭되었다. 본 실시예에서, 관심있는 유전자좌들은 별개의 반응관에서 증폭되었지만, 그것들은 또한 단일 PCR 반응으로 함께 증폭될 수 있다. 증가된 특이성을 위하여, "핫-스타트" PCR이 이용되었다. PCR 반응들은 QIAGEN 사(카탈로그 번호 203443)에 의해 공급되는 HotStartTaq Master Mix 키트를 사용하여 수행되었다. 반응에 대한 주형 DNA와 프라이머의 양은 관심있는 각 유전자좌마다 최적화 될 수 있지만 본 실시예에서, 40 ng의 주형 사람 게놈 DNA와 각각 5 μM의 프라이머가 사용된다. 40 사이클의 PCR이 수행되었다. 다음의 PCR 조건들이 사용된다:
(1) 95 ℃에서 15 분 15 초;
(2) 37 ℃에서 30 초;
(3) 95 ℃에서 30 초;
(4) 57 ℃에서 30 초;
(5) 95 ℃에서 30 초;
(6) 64 ℃에서 30 초;
(7) 95 ℃에서 30 초;
(8) 단계 6 및 7을 39 회 반복;
(9) 72 ℃에서 5 분.
각 PCR의 첫번째 사이클에서, 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 3' 어닐링 영역의 용융 온도인 37 ℃이다. PCR의 두번째 사이클에서 어닐링 온도는 대략 주형 DNA에 결합하는 제 1 프라이머의 3' 영역의 용융 온도인 57 ℃이다. PCR의 세번째 사이클에서 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 전체 서열의 용융 온도인 64 ℃이다. 나머지 사이클에 대한 어닐링 온도는 64 ℃이다. PCR의 처음 세 사이클에서 어닐링 온도를 TM1으로부터 TM2 및 TM3로의 증가는 특이성을 크게 증가시킨다. 이러한 어닐링 온도들은 대표적이며, 당업계의 숙련자라면 매 사이클에 대한 어닐링 온도는 이용된 프라이머에 의존한다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
변성, 어닐링 및 확장의 온도와 시간은 다양한 설정들을 시도해 보고 최상의 결과를 제공하는 변수들을 사용함으로써 최적화될 수 있다. 본 실시예에서, 제 1 프라이머는 관심있는 유전자좌들로부터 다양한 거리에서 어닐링할 수 있도록 디자인 되었다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 제 1 프라이머의 결합 위치가 관심있는 유전자좌로부터 5-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50, 51-55, 56- 60, 61-65, 66-70, 71-75, 76-80, 81-85, 86-90, 91-95, 96-100, 101-105, 106-110, 111-115, 116-120, 121-125, 126-130, 131-140, 1410-160, 1610-180, 1810-200, 2010-220, 2210- 240, 2410-260,. 2610-280,. 2810-300, 3010-350, 3510-400, 4010-450, 450-500, 또는 500 염기 이상의 것이 될 수 있다는 것을 알 수 있다.
관심있는 단편의 정제
PCR 생산물들이 게놈 주형 DNA로부터 분리되었다. PCR 반응 후, 한 개체로부터의 각각의 PCR 반응 부피의 1/4이 Roche Diagnostics GmbH의 투명한 고결합성 스트렙타웰 플레이트의 한 웰로 함께 혼합되었다(Roche Molecular Biochemical, 2001 생화학제품 카탈로그에 기재된, 카탈로그 번호 1 645 692). 제 1 프라이머는 PCR 생산물이 스트렙타비딘 코팅된 웰에 결합되도록 하는 한편 게놈 주형 DNA는 결합되지 않도록 하는 5' 비오틴 태그를 함유했다. 스트렙타비딘 결합 반응은 써모믹서(Eppendorf)를 사용하여 37 ℃에서 20 분 동안 1000 rpm으로 수행되었다. 각 웰을 비결합 물질들을 제거하기 위하여 흡인하였고, 부드럽게 혼합하면서 1X PBS로 3번 세척하였다(Kandpal 등, Nucl. Acids Res. 18:1789-1795(1990); Kaneoka 등, Biotechniques 10:30-34(1991); Green 등, Nucl. Acids Res. 18:6163-6164(1990)).
분리된 단편들의 제한효소 절단
정제된 PCR 생산물들이 제 2 프라이머로부터 PCR 생산물들로 통합된 인식 부위에 결합하는 제한 효소 BsmF I으로 절단되었다. 절단은 제한 효소와 함께 공급된 설명서에 따라 스트렙타웰에서 수행되었다. 절단한 후에, 웰을 절단된 단편들을 제거하기 위하여 PBS로 세번 세척하였다.
표지된 뉴클레오티드의 결합
BsmF I 제한 효소 절단으로 5' 돌출부를 가진 DNA 단편을 수득하는데, 그것은 SNP 부위 또는 관심있는 유전자좌 및 3' 함몰 말단을 포함한다. 5' 돌출부는 DNA 중합효소의 존재하에서 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 통합을 허용하는 주형으로 작용한다.
아래에, SNP TSC0837969에 대한 5' 돌출부를 도식화한 것을 보여준다. 완전한 DNA 서열을 나타내지 않고 단지 돌출부만을 보여준다(여기에서 R은 가변부).
5'TTAA
3'AATT R A C A
돌출부 위치 1 2 3 4
5' 센스 가닥(여기서는 상부가닥으로 묘사됨) 상의 TSC0837969에 대한 관찰된 뉴클레오티드는 아데닌과 구아닌이다. 안티센스 가닥상의 돌출부 위치 3 은 구아닌과 상보적인 시토신이다. 이 가변부는 아데닌 또는 구아닌이 될 수 있기 때문에, 비표지된 dCTP, dTTP, 및 dATP의 존재 하에서 형광 표지된 ddGTP가 양 대립유전자의 서열을 결정하기 위해 사용된다. 구아닌에 대한 동형접합, 아데닌에 대한 동형접합 또는 이형접합에 대한 채우기 반응은 아래에 도식화 되었다.
TSC 0837969에서 구아닌에 대한 동형접합성:
대립유전자 1 5'TTAA G*
3'AATT C A C A
돌출부 위치 1 2 3 4
대립유전자 2 5'TTAA G*
3'AATT C A C A
돌출부 위치 1 2 3 4
표지된 ddGTP는 돌출부의 첫번째 위치로 통합된다. 유일하게 하나의 신호가 보여지는데, 그것은 돌출부의 첫번째 위치에 표지된 ddGTP로 채워진 분자에 해당한다.
TSC 0837969에서 아데닌에 대한 동형접합성:
대립유전자 1 5'TTAA A T G*
3'AATT T A C A
돌출부 위치 1 2 3 4
대립유전자 2 5'TTAA A T G*
3'AATT T A C A
돌출부 위치 1 2 3 4
비표지된 dATP는 돌출부 중 위치 1에 통합되고, 비표지된 dTTP는 돌출부 중 위치 2에 통합된다. 표지된 ddGTP는 돌출부 중 위치 3에 통합된다. 유일한 하나의 신호가 보여질 것이다; 위치 3에서 ddGTP로 채워진 분자는 위치 1에서 채워진 분자와 분자량이 다를 것인데, 이것은 아데닌 또는 구아닌에 대한 동형접합성인 개체를쉽게 확인할 수 있게 한다.
TSC0837969에서 이형접합성:
대립유전자 1 5'TTAA G*
3'AATT C A C A
돌출부 위치 1 2 3 4
대립유전자 2 5'TTAA A T G*
3'AATT T A C A
돌출부 위치 1 2 3 4
두개의 신호가 보여질 것이다; 하나의 신호는 위치 1에서 ddGTP로 채워진 DNA 분자에 해당하고, 두번째 신호는 돌출부의 위치 3에 채워진 분자에 해당한다. 두개의 신호는 분자량에 기초하여 겔 전기영동을 제한없이 포함하는 어떠한 기술을 사용하여도 분리될 수 있다.
아래에, SNP TSC0034767에 대한 5' 돌출부를 도식화한 것을 보여준다. 완전한 DNA 서열을 나타내지 않고 단지 돌출부만을 보여준다(여기에서 R은 가변부).
A C A R GTGT 3'
CACA 5'
4 3 2 1 돌출부 위치
5' 센스 가닥(여기서는 상부가닥으로 묘사됨) 상의 TSC0034767에 대한 관찰된 뉴클레오티드는 시토신과 구아닌이다. 돌출부의 위치 2는 아데닌에 해당하는데 그것은 티미딘에 상보적이다. 돌출부의 위치 3은 시토신에 해당하는데 그것은 구아닌에 상보적이다. 비표지된 dCTP, dTTP, 및 dATP의 존재하에서 형광 표지된 ddGTP가 양 대립유전자의 서열을 결정하기 위해 사용된다.
이 경우에 있어서, 제 2 프라이머는 관심있는 유전자좌와 어닐링하고, 따라서 안티센스 가닥(여기서는 하부가닥으로 묘사됨)상에서 채우기 반응이 일어난다. 센스 가닥 또는 안티 센스 가닥 중 어느 가닥이라도 IIS 형 제한 효소 인식 부위를 포함하는 제 2 프라이머가 관심있는 유전자좌의 상부에 어닐링하는지 하부에 어닐링하는지의 여부에 따라 채워질 수 있다.
아래에, SNP TSC 1130902에 대한 5' 돌출부를 도식화한 것을 보여준다. 완전한 DNA 서열을 나타내지 않고 단지 돌출부만을 보여준다(여기에서 R은 가변부).
5' TTCAT
3' AAGTA R T C C
돌출부 위치 1 2 3 4
5' 센스 가닥(여기서는 상부가닥으로 묘사됨) 상의 TSC1130902에 대한 관찰된 뉴클레오티드는 아데닌과 구아닌이다. 돌출부의 위치 2는 티미딘에 해당하고 돌출부의 위치 3은 시토신에 해당하는데 그것은 구아닌에 상보적이다. 비표지된 dCTP, dTTP, 및 dATP의 존재하에서 형광 표지된 ddGTP가 양 대립유전자의 서열을 결정하기 위해 사용된다.
아래에, SNP TSC0597888에 대한 5' 돌출부를 도식화한 것을 보여준다. 완전한 DNA 서열을 나타내지 않고 단지 돌출부만을 보여준다(여기에서 R은 가변부).
T C T R ATTC 3'
TAAG 5'
4 3 2 1 돌출부 위치
5' 센스 가닥(여기서는 상부가닥으로 묘사됨) 상의 TSC0597888에 대한 관찰된 뉴클레오티드는 시토신과 구아닌이다. 돌출부의 위치 3은 시토신에 해당하는데 그것은 구아닌에 상보적이다. 비표지된 dCTP, dTTP, 및 dATP의 존재하에서 형광 표지된 ddGTP가 양 대립유전자의 서열을 결정하기 위해 사용된다.
아래에, SNP TSC0607185에 대한 5' 돌출부를 도식화한 것을 보여준다. 완전한 DNA 서열을 나타내지 않고 단지 돌출부만을 보여준다(여기에서 R은 가변부).
C C T R TGTC 3'
ACAG 5'
4 3 2 1 돌출부 위치
5' 센스 가닥(여기서는 상부가닥으로 묘사됨) 상의 TSC0607185에 대한 관찰된 뉴클레오티드는 시토신과 티미딘이다. 이 경우에 있어서, 제 2 프라이머는 관심있는 유전자좌와 결합하고, 그것은 안티-센스 가닥이 채워지는 것을 가능하게 한다. 안티 센스 가닥(여기에서 하부 가닥으로 묘사됨)은 구아닌과 아데닌으로 채워질 것이다.
돌출부의 위치 2는 티미딘에 해당하는데 그것은 아데닌에 상보적이고, 돌출 부의 위치 3은 시토신에 해당하는데 그것은 구아닌에 상보적이다. 비표지된 dCTP, dTTP, 및 dATP의 존재하에서 형광 표지된 ddGTP가 양 대립유전자의 서열을 결정하기 위해 사용된다.
아래에, SNP TSC0195492에 대한 5' 돌출부를 도식화한 것을 보여준다. 완전한 DNA 서열을 나타내지 않고 단지 돌출부만을 보여준다.
5'ATCT
3'TAGA R A C A
돌출부 위치 1 2 3 4
이 위치에서 관찰된 뉴클레오티드들은 시토신과 구아닌이다(여기에서 상부 가닥으로 묘사됨). 돌출부의 위치 2는 아데닌에 해당하는데 그것은 티미딘에 상보적이고, 돌출부의 위치 3은 시토신에 해당하는데 그것은 구아닌에 상보적이다. 비표지된 dCTP, dTTP, 및 dATP의 존재하에서 형광 표지된 ddGTP가 양 대립유전자의 서열을 결정하기 위해 사용된다.
상기 나타난 바와 같이, 6개의 SNPs의 양 대립유전자들의 서열은 비표지된 dATP, dTTP, 및 dCTP의 존재 하에서 ddGTP로 표지됨으로서 결정되어질 수 있다. 다음의 구성요소들이 각각의 채우기 반응에 첨가된다 ; 1 l 의 형광 표지된 ddGTP, 0. 5 μl의 비표지된 ddNTPs(구아닌을 제외한 모든 뉴클레오티드를 포함) (40 M), 2 μl의 10X 시퀘나제 버퍼, 0. 25 μl의 시퀘나제, 그리고 20 μl 반응을 위해 필요한 물. 채우기 반응은 40 ℃에서 10 분동안 수행된다. 비-형광 표지된 ddNTP는 Fermentas 사(Hanover, MD)로부터 구입되었다. 나머지 다른 모든 표지용 시약은 Amersham 사 (Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit, US 79565)로부터 획득되었다.
표지를 한 후, 각각의 스트렙타웰이 1X PBS (100 μl)로 세번 헹구어졌다. "채워진" DNA 단편들이 효소의 공급과 함께 제공되는 제조자의 지시에 따른 제한 효소 EcoRI으로 절단됨에 의하여 스트렙타웰로부터 방출된다. 절단은 120 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 1시간 동안 수행된다.
관심있는 유전자좌의 검출
스트렙타비딘 매트릭스로부터의 방출 후, 샘플이 36 cm, 5% 아크릴아미드(우레아) 겔 (BioWhittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, 카탈로그 번호 50691)의 한 레인에 로딩되었다. 샘플은 3000 볼트에서 3 분간 겔에서 전기영동되었다. 겔을 3시간 동안 서열결정 기기(Hoefer SQ3 Sequencer)에서 전개시켰다. 겔을 장치에서 제거하였고 Typhoon 9400 Variable Mode Imager로 스캔되었다. 통합된 표지 뉴클레오티드가 형광으로 검출되었다.
도 11에 나타난 것과 같이, 레인 1 및 2에 있는 SNP TSC0837969에 대한 주형 DNA는 아데닌에 대한 동형접합성이다. 만약 개체가 아데닌에 대하여 동형접합인 경우, 아래의 채우기 반응이 일어날 것으로 예상된다 :
TSC 0837969에서 아데닌에 대한 동형접합성:
5'TTAA A T G*
3'AATT T A C A
돌출부 위치 1 2 3 4
비표지된 dATP는 돌출부에 상보적으로 위치 1에 통합된다. 비표지된 dTTP는 돌출부에 상보적으로 위치 2에 통합된다. 표지된 ddGTP는 돌출부에 상보적으로 위치 3에 통합된다. 유일한 하나의 밴드가 보여지는데, 그것은 아크릴아미드 겔에서대략 46 위치로 이동한다. 이것은 위치 1에 채워진 뉴클레오티드가 아데닌인 것을 나타낸다. 만약 채워진 뉴클레오티드가 구아닌이었다면, 밴드는 위치 44에서 나타났을 것이다.
그러나, 레인 3 및 4에 있는 SNP TSC0837969에 대한 주형 DNA는 이형접합성이다. 만약 개체가 이형접합성인 경우, 아래의 채우기 반응이 일어날 것으로 예상된다 :
TSC0837969에서의 이형접합성:
대립유전자 1 5'TTAA G*
3'AATT C A C A
돌출부 위치 1 2 3 4
대립유전자 2 5'TTAA A T G*
3'AATT T A C A
돌출부 위치 1 2 3 4
두개의 현저한 밴드가 관찰되었다; 한 밴드는 돌출부(G 대립유전자)에 상보적인 위치 1에서 ddGTP로 채워진 분자에 해당하고, 두번째 밴드는 돌출부(A 대립유전자)에 상보적인 위치 3에서 ddGTP로 채워진 분자에 해당한다. 두 밴드들은 겔 전기영동을 사용하여 분자량의 차이에 기초하여 분리되었다. 하나의 형광 표지된 뉴클레오티드 ddGTP는 어떤 개체가 SNP 위치에서 이형접합성인지를 결정하는데 사용된다. 이것은 단일 뉴클레오티드로서 두개의 다른 대립유전자를 효과적으로 검색할 수 있는 최초의 방법이다.
SNP TSC0034767에 대하여, 레인 1 및 3의 주형 DNA는 시토신 및 구아닌의 이형접합인데, 이것은 두개의 현저한 밴드에 의하여 뒷받침된다. 하부 밴드는 돌출부에 상보적인 위치 1에서 채워진 ddGTP에 해당한다. 약간 더 큰 분자량의 두번째 밴드는 위치 3에서 채워진 ddGTP에 해당하는데, 그것은 폴리머라아제가 돌출부에 상보적인 위치 3에 ddGTP를 통합될 때까지 뉴클레오티드들을 계속해서 통합하게 할 수 있는 돌출부의 위치 1에 비표지된 dCTP가 채워졌음을 나타낸다. 레인 2 및 4의 주형 DNA는 구아닌에 대한 동형접합성인데, 이것은 만약 ddGTP가 돌출부에 상보적인 위치 1에서 채워졌다면 보다 큰 분자량의 단일밴드가 나타났을 것이기 때문이다.
SNP TSC1130902에 대하여, 레인 1, 2, 및 4의 주형 DNA는 가변부에서 아데닌에 대한 동형접합인데, 이것은 겔 상의 대략적인 위치 62로 이동하는 더 큰 분자량을 가진 하나의 밴드에 의하여 뒷받침 된다. 레인 3의 주형 DNA는 두개의 현저한 밴드의 존재에 의하여 지시되는 것 처럼 가변부에 이형접합성이다. 하부 밴드는 돌출부에 상보적인 위치 1에서 ddGTP로 채워진 분자들에 해당한다(구아닌 대립유전자).큰 분자량의 밴드는 돌출부에 상보적인 위치 3에서 ddGTP 채워진 분자들에 해당한다(아데닌 대립유전자).
SNP TSC0597888에 대하여, 레인 1 및 4의 주형 DNA는 가변부에서 시토신에 대한 동형접합성이다; 레인 2의 주형 DNA는 가변부에서 이형접합성이고, 레인 3의 주형 DNA는 구아닌에 대한 동형접합성이다. 예상되는 채우기 반응들은 아래에 도식화하였다:
시토신에 대한 동형접합성:
대립유전자 1 T C T G ATTC 3'
G* A C TAAG 5'
4 3 2 1 돌출부 위치
대립유전자 2 T C T G ATTC 3'
G* A C TAAG 5'
4 3 2 1 돌출부 위치
구아닌에 대한 동형접합성:
대립유전자 l T C T C ATTC 3'
G* TAAG 5'
4 3 2 1 돌출부 위치
대립유전자 2 T C T C ATTC 3'
G* TAAG 5'
4 3 2 1 돌출부 위치
구아닌/시토신에 대한 이형접합성:
대립유전자 1 T C T G ATTC 3'
G* A C TAAG 5'
4 3 2 1 돌출부 위치
대립유전자 2 T C T C ATTC 3'
G* TAAG 5'
4 3 2 1 돌출부 위치
가변부의 구아닌에 대한 동형접합성 주형 DNA는 단일 밴드로 나타나는데, 이것은 돌출부에 상보적인 위치 1에서 ddGTP로 채워진 DNA분자들에 해당한다. 이러한 DNA분자들은 돌출부의 위치 3에서 ddGTP로 채워진 DNA 분자들과 비교하여 보다 작은 분자량이다(SNP TSC0597888에 대한 레인 3 참조). DNA 분자들은 분자량에 있어서 두개의 염기만큼 다르다.
가변부의 시토신에 대한 동형접합성 주형 DNA는 단일 밴드로 나타나는데, 이것은 돌출부에 상보적인 위치 3에서 ddGTP로 채워진 DNA분자들에 해당한다. 이러한 DNA분자들은 위치 1에서 ddGTP로 채워진 DNA 분자들과 비교하여 보다 큰 분자량의 위치로 이동했다 (SNP TSC0597888에 대한 레인 1 및 4 참조).
가변부의 이형접합성 주형 DNA는 두개의 밴드로 나타나는데, 하나의 밴드는 돌출부에 상보적인 위치 1에서 ddGTP로 채워진 DNA 분자들에 해당하는 것으로, 이는 보다 작은 분자량이고, 두번째 밴드는 돌출부에 상보적인 위치 3에서 ddGTP로 채워진 DNA 분자들에 해당하는 것으로, 보다 큰 분자량이다(SNP TSC0597888에 대한 레인 3 참조).
SNP TSC0195492에 대하여, 레인 1 및 3의 주형 DNA는 가변부에서 이형접합성인데, 그것은 두개의 현저한 밴드의 존재에 의하여 증명된다. 레인 2의 주형 DNA는 가변부에서 구아닌에 대한 동형접합성이다. 레인 4의 주형 DNA는 시토신에 대한 동형접합성이다. 이 SNP에 대한 유일한 하나의 밴드가 레인 4에서 관찰되고, 그것은 돌출부에 상보적인 위치 1에서 ddGTP로 채워진 DNA 분자들보다 높은 분자량을 가진다(레인 2, 3, 및 4을 비교).
관찰된 SNP TSC0607185에 대한 대립유전자는 시토신과 티미딘으로 조사되었다. 일관성을 위하여, SNP 컨소시움은 그들이 센스 가닥으로 나타났을때 관찰된 대립유전자를 표시한다(www. snp. cshl. org/shpsearch. shtml ; 웹사이트는 2003년 2월 11일 부터 개시). 이 SNP에 대하여, 제 2 프라이머는 관심있는 유전자좌와 어닐링하는데, 이것은 BsmF I으로 절단한 후 안티센스 가닥상에서 채우기 반응이 일어나는 것을 가능하게 한다.
레인 1 및 3의 주형 DNA는 이형접합성이다 ; 레인 2의 주형 DNA는 티미딘의 동형접합성이고, 레인 4의 주형 DNA는 시토신의 동형접합성이다. 안티센스 가닥은 ddGTP로 채워졌고, 그러므로 센스 가닥의 뉴클레오티드는 시토신에 해당한다.
예상되는 밴드의 위치들을 확정하기 위하여 분자량 마커들이 이용될 수 있다. 대안으로, 각각의 SNP를 분석하기 위하여 알려진 이형접합성 샘플이 이용될 수 있는데, 이것은 두개의 예상되는 밴드들의 위치를 정확하게 확정할 수 있을 것이다.
도 11에서 나타난 바와 같이, 하나의 형광 물질로 표지된 하나의 뉴클레오티드는 SNPs 및 단일 뉴클레오티드 변이를 포함하는(여기에 한정되는 것은 아니다) 가변부를 결정하는데 사용될 수 있다. 전형적으로, 한 개체가 SNP 위치에서 동형접합성인지 이형접합성인지 여부를 결정하기 위하여, 하나의 염료로 표지된 하나의 뉴클레오티드와 두번째 염료로 표지된 두번째 뉴클레오티드를 사용하여 다중 반응이 수행된다. 그러나, 이것은 두개의 염료들이 다른 양자 상수들을 가지기 때문에결과를 비교하는데 있어서 문제를 가진다. 다른 뉴클레오티드들이 같은 염료로서 표지된다 하더라도, 양자 상수들은 달라진다. 하나의 염료로서 표지된 하나의 뉴클레오티드의 이용은 다른 염료들의 양자 상수들로부터의 어떠한 착오도 제거한다.
본 실시예에서, 형광으로 표지된 ddGTP가 이용되었다. 그러나, 방사성 분자, 형광 분자, 항체, 항체 단편, 헵텐, 탄수화물, 비오틴, 비오틴 유도체, 인광 부분, 냉광 부분, 전기화학냉광 부분, 착색 부분, 및 검출가능한 전자 회전 공명, 전기 커패시턴스, 유전체 상수 또는 전기 전도율을 갖는 부분을 포함하지만 이에 한정되지 않는 어떠한 단일 생성 절편으로 태그된 뉴클레오티드에 적용할 수 있다. 또한, 표지된 ddATP, ddTTP, 또는 ddCTP가 사용될 수 있다.
상기 실시예는 두번째 대립유전자의 지시자로서 돌출부에 상보적인 위치 3에 이용되었다. 그러나, 돌출부의 위치 2 또는 4에서도 충분히 이용될 수 있다(뉴클레오티드의 통합에 대한 섹션 참조). 더욱이, 돌출부는 타입 ⅡS 효소 BsmF I으로 생성되었다 ; 그러나, 표 1에 나타난 효소를 제한없이 포함하여 그것의 결합 위치로부터 떨어진 DNA를 절단할 수 있는 것이라면 어떠한 효소도 이용될 수 있다.
또한, 상기 실시예에서, 채워지는 가닥상의 SNP 위치 바로 앞 뉴클레오티드는 구아닌이 아니다. 이것은 타입 ⅡS 제한 효소의 교대 절단 특성을 제거하는 어떠한 효과들을 제거한다. 예를들어, SNP TSC0837969에서, 센스 가닥의 SNP 위치의 뉴클레오티드는 아데닌이다. 만약 BsmF I이 교대 절단 특성을 나타낸다면, 다음의 돌출부분들은 아데닌 대립유전자 및 구아닌 대립유전자에 대해서 생성되어질 것이다 :
G 대립유전자-11/15 절단 5'TTA
3'AAT T C A C
돌출부 위치 0 1 2 3
채워진 후의 G 대립유전자 5'TTA AG*
3'AAT T C A C
돌출부 위치 0 1 2 3
A 대립유전자 11/15 절단 5'TTA
3'AAT T T A C
돌출부 위치 0 1 2 3
채워진 후의 A 대립유전자 5'TTA A A TG*
3'AAT T T A C
돌출부 위치 0 1 2 3
구아닌 대립유전자에 대하여, 돌출부의 위치 1은 dATP로 채워질 수 있는데, 이것은 폴리머라아제가 돌출부에 상보적인 위치 2에 ddGTP를 첨가시키는 것을 가능하게 한다. 위치 10/14에서 절단된 분자들과 위치 11/15에서 절단된 분자들 사이에서 검출할 만한 차이점은 없을 것이다.
아데닌 대립유전자에 대하여, 돌출부에 상보적인 위치 1은 dATP로 채워질 것이고, 위치 2는 dATP로 채워질 것이고, 위치 3은 dTTP로 채워질 것이고, 위치 4는 ddGTP로 채워질 것이다. 위치 10/14에서 절단된 분자들과 위치 11/15에서 절단된 분자량에 있어서 차이는 없을 것이다. 유일한 차이점들은 DNA 분자들이 가변부에아데닌을 포함하는지 구아닌을 포함하는지에 따라 달라진다.
도 11에서 나타난 바와 같이, 제 1 프라이머의 결합 지역의 위치는 다중 SNPs가 겔 상의 하나의 레인에서 분석될 수 있게 한다. 또한, 동일한 염료를 가진 동일한 뉴클레오티드를 이용하였을때, 단일 채우기 반응이 수행될 수 있다. 본 실시예에서, 하나의 레인에서 6개의 SNPs가 분석되었다. 그러나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-40, 410-50, 510-60, 610-70, 710-80, 810-100, 1010-120, 1210- 140, 1410-160, 1610-180, 1810-200, 및 200 이상을 포함하는(여기에 한정되는 것은 아니다) 어떠한 수의 SNPs라도 단일 반응으로 분석될 수 있다.
더욱이, 양 대립유전자들을 검출하기 위하여 이용된 하나의 표지된 뉴클레오티드는 표지된 뉴클레오티드들 어느 것도 가변부(11/15 절단의 위치 0에서 뉴클레오티드에 상보적) 바로 앞에서 발생하지 않고 제공된 다른 SNPs 세트를 검출하기 위하여 이용된 두번째 표지된 뉴클레오티드와 혼합될 수 있다. 예를들어, SNP X가 가변부에서 구아닌 또는 티미딘이 될 수 있고, 다음으로 BsmF I으로 절단된 후 생성된 5' 돌출이 따른다고 가정한다 :
SNP X 10/14 5'TTGAC
G 대립유전자 3'AACTG C A C T
돌출부 위치 1 2 3 4
SNPX11/15 5'TTGA
G 대립유전자 3'AACT G C A C
돌출부 위치 0 1 2 3
SNP X 10/14 5'TTGAC
T 대립유전자 3'AACTG A A C T
돌출부 위치 1 2 3 4
SNP X 11/15 5'TTGA
T 대립유전자 3'AACT G A A C
돌출부 위치 0 1 2 3
표지된 ddGTP, 비표지된 dATP, dCTP, 및 dTTP로 채우기 반응 후, 다음의 분자들이 생성되어질 것이다 :
SNP X 10/14 5' TTGAC G*
G 대립유전자 3' AACTG C A C T
돌출부 위치 1 2 3 4
SNP X 11/15 5' TTGA C G*
G 대립유전자 3' AACT G C A C
돌출부 위치 0 1 2 3
SNP X 10/14 5' TTGA C T T G*
T 대립유전자 3' AACTG A A C T
돌출부 위치 1 2 3 4
SNP X 11/15 5'TTGA C T T G*
T 대립유전자 3'AACT G A A C
돌출부 위치 0 1 2 3
이제, SNP Y가 가변부에서 아데닌 또는 티미딘이 될 수 있고, 다음으로 BsmF I으로 절단된 후 생성된 5' 돌출이 따른다고 가정한다.
SNP Y 10/14 5' GTTT
A 대립유전자 3' CAAA T G T A
돌출부 위치 1 2 3 4
SNPY 11/15 5' GTT
A 대립유전자 3' CAA A T G T
돌출부 위치 0 1 2 3
SNP Y 10/14 5' GTTT
T 대립유전자 3' CAAA A G T A
돌출부 위치 1 2 3 4
SNPY 11/15 5' GTT
T 대립유전자 3 'CAA A A G T
돌출부 위치 0 1 2 3
표지된 ddATP, 비표지된 dCTP, dGTP, 및 dTTP로 채우기 반응 후, 다음의 분자들이 생성되어질 것이다 :
SNP Y 10/14 5'GTTT A*
A 대립유전자 3'CAAA T G T A
돌출부 위치 1 2 3 4
SNPY 11/15 5'GTT T A*
A 대립유전자 3'CAAA T G T
돌출부 위치 0 1 2 3
SNPY 10/14 5'GTTT T C A*
T 대립유전자 3'CAAA A G T A
돌출부 위치 1 2 3 4
SNPY 11/15 5'GTT T T C A*
T 대립유전자 3'CAAA A G T
돌출부 위치 0 1 2 3
본 실시예에서, 표지된 ddGTP 및 표지된 ddATP는 양 대립유전자 SNP X 및 SNP Y를 각각 동정하기 위하여 사용된다. 채워진 가닥에서 SNP X의 바로 앞 뉴클레오티드(11/15 절단으로부터 돌출부의 위치 0에 상보적인 뉴클레오티드)는 구아닌 또는 아데닌이 아니다. 마찬가지로, 채워진 가닥상에 SNP Y의 바로 앞 뉴클레오티드는 구아닌 또는 아데닌이 아니다. 이것은 양 SNPs에 대한 채우기 반응이 표지된 ddGTP, 표지된 ddATP, 및 비표지된 dCTP 및 dTTP와 단일 반응이 발생하는 것을 가능하게 한다. 이것은 수행되는데 필요한 반응의 수를 감소시키고 단일 반응으로 분석될 수 있는 SNPs의 수를 증가시킨다.
각 SNP에 대한 제 1 프라이머들은 관심있는 유전자좌로부터 다른 거리에서 어닐링되게 하기 위하여 디자인될 수 있는데, 이것은 SNPs가 겔상에서 다른 위치들로 이동하는 것을 가능케한다. 예를들어, SNP X를 증폭하는데 이용되는 제 1 프라이머는 관심있는 유전자좌로부터 30 염기에서 어닐링할 수 있고, SNP Y를 증폭하는데 이용되는 제 1 프라이머는 관심있는 유전자좌로부터 35 염기에서 어닐링할 수 있다. 또한, 뉴클레오티드들은 중첩되지 않는 스펙트럼에서 방출되는 형광 물질로 표지될 수 있다. 겔을 전개 한 후에, 겔은 하나의 염료에 특이적인 파장에서 스캔될 수 있다. 단지 그러한 염료로 표지된 그러한 분자들만이 신호를 방출할 것이다. 그 후에 겔은 두번째 염료에 대한 파장으로 스캔될 수 있다. 단지 그러한 염료로 표지된 그러한 분자들만이 신호를 방출할 것이다. 본 방법은 단일 반응으로 분석될 수 있는 SNPs의 수의 최대한의 축소를 가능하게 한다.
본 실시예에서, 채워진 가닥상의 가변부 앞의 뉴클레오티드는 아데닌 또는 구아닌이 아니고, 센스 가닥 상에서 가변부 뒤의 뉴클레오티드는 아데닌 또는 구아닌이 될 수 없다. 본 방법은 표지된 뉴클레오티드의 어떠한 조합과도 동작할 수 있으며, 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 표지된 반응들이 혼합될 수 있는지 없는지를 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 만약 하나의 SNP가 티미딘으로 표지되고 두번째 SNP가 시토신으로 표지된다면, 센스 가닥 상의 각각의 가변부 바로 앞의 뉴클레오티드가 티미딘 또는 시토신이 아니고 센스 가닥 상의 가변부 바로 뒤의 뉴클레오티드가 티미딘 또는 시토신이 아니라면 SNPs는 단일 반응으로 표지될 수 있다.
본 방법은 하나의 대립유전자로부터의 신호를 교대 절단의 정도를 결정하거나 염료의 양자 계수를 보정하는 데서 오는 복잡함을 가하지 않고 두번째 대립유전자로부터의 신호와 비교할 수 있게 한다. 본 방법은 하나의 대립유전자와 다른 대립유전자에 대한 비율을 정량 분석하는데 있어서 특히 유용하다. 예를 들어, 본 방법은 염색체 이상을 검출하는데 유용하다. 이형접합 부위에서의 대립유전자들의 비는 약 1 : 1이 될 것이라고 기대된다(하나의 A 대립유전자 및 하나의 G 대립유전자). 그러나, 만약 여분의 염색체가 존재한다면, 그 비율은 약 1 : 2로 될 것이라고 예상된다(하나의 A 대립유전자 및 두개의 G 대립유전자 또는 두개의 A 대립유전자 및 하나의 G 대립유전자). 본 방법은 모계 DNA의 존제 하에서 태아 DNA를 검색할 때 특히 유용하다.
나아가, 본 방법은 하나의 샘플에서 두개의 유전자 신호를 검색하는데 유용하다. 예를 들어, 본 방법은 야생형 세포주들의 존재 하에서 변이주들을 검색할 수 있다(실시예 5 참조). 만약 변이주가 특정 유전자의 DNA 서열 상에 변이를 포함한다면, 본 방법은 변이 신호와 야생형 신호를 검색하는데 이용될 수 있다. 본 방법은 야생형 DNA 서열의 존재 하에서 변이 DNA 서열을 검색하는데 이용될 수 있다. 하나의 시그날 생성 단편을 가진 단일 뉴클레오티드가 이용되기 때문에 변이 DNA와 야생형 DNA의 비가 정량될 수 있다.
실시예 7
여러가지 종류의 암을 탐지하기 위한 비침습성 방법들은 질병의 상태나 사망률을 감소시키는 가능성을 가진다. 직장-결장암의 초기 진단을 위한 결장내시경술,바륨 관장법, 그리고 구불결장경검사를 포함하는 몇 가지 기술들이 발전되어왔다 ; 그러나 이러한 방법들은 침습성인 이유로 환자의 승낙 비율이 낮고 이로 인하여 그 이용이 제한되었다. 비침습성 유전자 검사는 직장암의 초기단계를 검사하는데 유용한 것이다.
1991년에 연구자들은 직장암의 형성에서 중요한 역할을 하는 선종성 결장폴립증(APC) 유전자를 동정하였다(Kinzler 등, Science 253 : 661-665, 1991). APC 유전자는 염색체 5q21-22에 8529 뉴클레오티드의 RNA 분자를 암호화하는 총 15개의 엑손으로 존재하는데, 이것은 300 Kd의 APC 단백질을 생산한다. APC 단백질들은 많은 세포들에서 발현되고 세포간 연접에 필수적이다.
APC 유전자의 변이는 일반적으로 직장암을 일으킨다(Tsao, J. 등, Am, J. Pathol. 145 : 531-534, 1994). APC 유전자에서의 변이의 거의 95 % 가 넌센스/틀이동 변이로 나타난다. 가장 일반적인 변이는 결장 1061 및 1309에서 발생한다; 이러한 결장에서의 변이는 생식세포성 변이의 1/3에 해당한다. 체세포성 변이에 관하여, 60 % 가 결장 1286 - 1513에서 발생하는데, 그것은 암호화 서열의 약 10 % 이다. 이 지역을 변이군 영역으로 명명하였다. APC 유전자에서 뉴클레오티드 치환(표 7 참조), 스플라이싱 착오(표 8 참조), 작은 결실(표 9 참조), 작은 삽입(표 10 참조), 작은 삽입/결실(표 11 참조), 총 결실(표 12 참조), 총 삽입(표 13 참조), 그리고 복합성 재조합(표 14 참조)을 포함하는 수 많은 타입의 변이가 확인되었다.
연구자들은 대변에서 APC 유전자에 변이를 가지는 세포들을 확보하기를 시도하였다(Traverso, G. 등, New England Journal of Medicine, Vol 346 : 311-320, 2002). APC 변이는 거의 모든 종양에서 발견되는 반면, 대변에서의 약 250 세포당 1 개에서 APC 유전자에 변이를 가진다. 대부분의 세포는 정상 세포로서 변으로 배출된다. 총 1 조개의 DNA를 보유하는 사람 DNA는 대변에서 발견된다; 대부분의 DNA는 세균성이다. Traverso 등에 의하여 디자인된 기술은 잘려진 단백질만을 유도하는 변이를 검출한다.
상기 검토한 바와 같이, APC 유전자에서의 수많은 돌연변이는 직장암의 형성에 관련된다. 그러므로, 직장암을 발견하기 위한 고감도, 비침습성 기술에 대한 요구가 아직 존재한다. 아래에, APC 유전자에서의 2개의 돌연변이를 검색하기 위한 방법들이 설명된다. 그러나 어떤한 개수의 변이도 여기에서 설명된 방법을 사용하여 분석될 수 있다.
주형 DNA 의 제조
대변 샘플에 제한되지 않고 이를 제한없이 포함하는 결장 세포를 함유하는 샘플로부터 주형 DNA 를 정제하였다. 주형 DNA 를 Ahlquist 등(Gastroenterology, 119: 1219-1227,2000)에 기재된 과정을 사용하여 정제하였다. 대변 샘플이 동결되었다면, 샘플을 실온에서 해동하여, Exactor 대변 진탕기(Exact Laboratories, Maynard, Mass.)로 균질화하였다. 균질화 한 후에, 각 샘플의 등량의 4 g 의 대변을 5분동안 2536 ×g 으로 원심분리하였다. 샘플을 10분동안 16,500 × g 으로 두번째 원심분리하였다. 37℃에서 1시간동안 20㎕ 의 RNase(0.5mg/㎖)와 함께 상청액을 인큐베이션하였다. ℓ 당 3몰의 아세트산 나트륨의 1/10 부피와 동량의 이소프로판올로 DNA 를 침전시켰다. DNA 를 5㎖ 의 TRIS-EDTA 중에서(0.01 몰 Tris/ℓ, (pH 7.4) 및 0.001 몰 EDTA/ℓ) 용해하였다.
프라이머 디자인
돌연변이가 코돈 1370 에 존재하는지를 결정하기 위해서, 다음의 프라이머를사용하였다.
제 1 프라이머 : 5'GTGCAAAGGCCTGAATTCCCAGGCACAAAGCTGTTGAA 3'
제 2 프라이머 : 5'TGAAGCGAACTAGGGACTCAGGTGGACTT
제 1 프라이머는 맨 끝의 5' 말단에 비오틴 표지와, 제한효소 EcoRI 에 대한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I 에 대한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
코돈 1302 에서 작은 결실이 존재하는지를 결정하기 위해서, 다음의 프라이머를 사용한다.
제 1 프라이머 : 5' GATTCCGTAAACGAATTCAGTTCATTATCATCTTTGTC 3'
제 2 프라이머 : 5' CCATTGTTAAGCGGGACTTCTGCTATTTG 3'
제 1의 프라이머는 5' 말단에 비오틴 표지를 가지며, EcoRI 에 대한 제한효소 인식부위를 포함한다. 제 2 프라이머는 BsmF I 에 대한 제한효소 인식부위를 포함한다.
PCR 반응
중합효소 연쇄반응(PCR, U.S. 특허번호 4,683,195 및 4,683,202, 본원에 참고문헌으로 수록됨)을 사용하여 주형 게놈 DNA 로부터 관심있는 유전자좌를 증폭시켰다. 관심있는 유전자좌를 별개의 반응관에서 증폭하였다(이들은 단일 PCR 반응에서 함께 증폭될 수 있다). 특이성 증가를 위해, 예를 들어, QIAGEN(카탈로그 번호 203443)사의 HotStarTaq Master Mix 키트를 사용하여 "핫-스타트" PCR 반응을 사용하였다. 본 실험에서는, 주형 사람 게놈 DNA의 40 ng 와 각각의 프라이머의 5μM을 사용한 것을 제외하고는, 반응마다 관심있는 각각의 유전자좌에 대한 주형 DNA 와 프라이머의 양을 최적화하였다. PCR 을 40사이클 수행하였다. 다음의 PCR 조건이 사용되었다:
(1) 95℃에서 15분 15초;
(2) 37℃에서 30초;
(3) 95℃에서 30초;
(4) 57℃에서 30초;
(5) 95℃에서 30초;
(6) 64℃에서 30초;
(7) 95℃에서 30초;
(8) 단계 6과 7을 39회 반복;
(9) 72℃에서 5분.
PCR 의 첫 사이클에서, 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 3' 어닐링 영역의 용융 온도인 37℃ 였다. PCR 의 두번째 사이클에서 어닐링 온도는 대략 주형 DNA 에 어닐링하는 제 1 프라이머의 3' 영역의 용융 온도인 57℃였다. PCR 의 세번째 사이클의 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 전 서열의 용융 온도인 64℃였다. 나머지 사이클에 대한 어닐링 온도는 64℃였다. PCR 의 첫번째 3 회의 사이클에서 TM1 에서 TM2 에서 TM3 로 어닐링 온도를 높임으로써 특이성을 증가시킨다. 이들 어닐링 온도는 대표적인 것이고, 숙련자라면 각 사이클에 대한 어닐링 온도는 사용된 특정의 프라이머 의존적이라는 것을 이해할 것이다.
변성, 어닐링 및 확장의 온도와 시간은 다양한 설정들을 시도해 보고 최상의 결과를 제공하는 변수들을 사용함으로써 최적화될 수 있다.
관심있는 단편의 정제
PCR 생산물을 게놈 주형 DNA 로부터 분리하였다. 각각의 PCR 생산물을 Roche Diagnostics GmbH 사의 고결합성 투명 플레이트인 스트렙타웰(2001 생화학제품 카탈로그, Roche 분자 생화학제에 열거된 카탈로그 번호 1 645 692)의 4개의 별개의 반응웰로 분할하였다. 제 1 프라이머는 PCR 생산물이 스트렙타비딘 코팅된 웰에 결합되도록 하는 한편 게놈 주형 DNA는 결합되지 않도록 하는 5' 비오틴 태그를 함유했다. 스트렙타비딘 결합 반응을 써모믹서(Eppendorf)를 사용하여 37℃에서 1000 rpm 으로 20분동안 수행하였다. 비결합된 물질이 제거되도록 각각의 웰을 흡인하였고, 부드럽게 혼합하면서, 1 X PBS 로 3회 세척하였다(Kandpal 등, Nucl. Acids Res. 18 : 1789-1795 (1990) ; Kaneoka 등, Biotechniques 10 : 30-34 (1991) ; Green 등, Nucl. Acids Res. 18 : 6163-6164 (1990)).
대안으로, PCR 생산물을 스트렙타비딘의 단일 웰에 위치시켜서 단일 웰에서 뉴클레오티드 통합 반응을 수행하였다.
분리된 단편의 제한효소 절단
정제된 PCR 생산물을 제 2 프라이머로부터의 PCR 생산물에 통합된 인식 부위에 결합하는, 제한효소 BsmF I(New EnglandBiolabs 카탈로그번호 R0572S)로 절단하였다. 제한효소와 함께 제공된 지침서에 따라 스트렙타웰에서 절단을 수행하였다. 적절한 제한효소로의 절단 후에, 절단된 단편을 제거하기 위해서 PBS 로 3회 세척하였다.
표지된 뉴클레오티드의 통합
상기에 기재된 제한효소 절단은 5' 돌출부를 가지고, 관심있는 유전자좌와 3' 함몰 말단을 포함하는 DNA 단편을 생산하였다. 5' 돌출부는 DNA 중합효소의 존재하에서 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 통합을 허용하는 주형으로서 기능한다.
각각의 관심있는 유전자좌에 대하여, 4개의 별개의 채우기 반응을 수행하였다: 4개의 반응물 각각은 상이한 형광성으로 표지된 ddNTP(ddATP, ddTTP, ddGTP, 또는 ddCTP)를 포함한다. 다음의 성분을 반응의 각 채우기 반응에 첨가하였다: 1㎕의 형광성으로 표지된 ddNTP, 0.5㎕의 비표지된 ddNTPs(40μM)(형광성으로 표지된 뉴클레오티드를 제외한 모든 뉴클레오티드를 포함한다), 2㎕ 의 10X 시퀘나제 완충액, 0.25㎕의 시퀘나제, 및 20㎕ 반응에 요구되는 물. 40℃에서 10분동안 반응에서 채우기를 수행하였다. Fermentas Inc.(Hanover, MD)로부터 비형광성으로 표지된 ddNTP 를 매입하였다. Amersham(Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit, US 79565)로부터 모든 다른 표지화 시약을 구입하였다. 형광성으로 표지된 ddNTP 의 존재하에서, 3' 함몰 말단을 1 염기씩 연장하였고, 이것은 관심있는 유전자좌에 해당한다.
표지된 ddNTP 와 비표지된 dNTP 의 혼합물이 또한 채우기 반응에 사용될 수 있다. "채우기" 조건은 40μM 비표지된 dNTPs, 1㎕의 형광성으로 표지된 ddATP, 1㎕의 형광성으로 표지된 ddTTP, 1㎕의 형광성으로 표지된 ddCTP, 및 1㎕ ddGTP 를포함하는 혼합물을 사용한다는 것을 제외하고는 상기에 기재된 바와 동일하다. 형광성 ddNTP 를 Amersham(Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit, US 79565; 형광성 뉴클레오티드의 농도는 독점적인 것이며 Amersham에 의해 공개되지 않았다)로부터 구입하였다. 관심있는 유전자좌를 제한효소 BsmF I 로 절단하여, 4 가지 염기의 5' 돌출부를 생성하였다. 통합된 첫번째 뉴클레오티드가 표지된 ddNTP 인 경우에는, 3' 함몰 말단이 1개의 염기씩 채워져서, 관심있는 유전자의 검출을 허용하였다. 그러나, 통합된 첫번째 뉴클레오티드가 dNTP 인 경우에는, 중합효소가 지속적으로 뉴클레오티드를 통합하여 ddNTP 가 채워졌다. 예를 들어, 제1의 2개의 뉴클레오티드는 dNTPs 로 채워질 수 있고, 3번째 뉴클레오티드는 ddNTP 로 채워질 수 있고, 이것이 돌출부에서 3번째 뉴클레오티드의 검출을 허용한다. 따라서, 전 5' 돌출부의 서열이 결정되고, 이것은 각 SNP 또는 관심있는 유전자좌로부터 얻은 정보을 증대시킨다. 이러한 형태의 채우기 반응은 특히 삽입, 결실, 삽입 및 결실, 재배열, 및 전위의 존재를 검출하는 경우에 유용하다.
대안으로, 단일 염료로 표지된 하나의 뉴클레오티드가 관심있는 유전자좌의 서열을 결정하는데 사용된다. 실시예 6 을 참조하시오. 이러한 방법은 상이한 염료가 사용될 때의 상이한 양자계수를 가지는 것과 같은 어떤 미묘한 에러를 제거한다.
표지화후에, 각 스트렙타웰을 1 X PBS(100㎕)로 3회 헹구었다. 효소와 함께 제공된 제조자의 설명서에 따라서, 제한효소 EcoRI 으로 절단시킴으로써 스트렙타웰로부터 "채워진" DNA 단편을 방출시켰다. 120rpm 으로 진탕하면서 37℃에서 1시간동안 절단을 수행하였다.
관심있는 유전자좌의 검출
스트렙타비딘 기질로부터의 방출후에, 샘플을 36cm 5% 아크릴아미드(우레아) 겔의 레인에 로딩하였다(BioWhittaker Molecular Applications, Long Ranger RunGel Packs, 칼탈로그 번호 50691). 샘플을 겔에 3분동안 3000 볼트로 전기영동하였다. 서열결정 장치(Hoefer SQ3 Sequencer)를 사용하여 3시간동안 겔을 진행시켰다. 통합된 표지 뉴클레오티드는 형광물질로 검출되었다.
별개의 채우기 반응을 수행할 때, 어떤 세포가 APC 유전자의 코돈 1370에서 돌연변이를 함유하는지를 결정하기 위해서, ddATP 및 ddTTP 에 대한 채우기 반응에 해당하는 겔 레인을 분석하였다. 정상 세포만 존재한다면, ddATP 를 가진 채우기 반응에 해당하는 레인은 밝은 신호를 나타낸다. ddTTP 를 가진 "채우기" 반응에 대해서는 어떤 신호도 검출되지 않았다. 그러나, 환자의 샘플이 APC 유전자의 코돈 1370 에서 돌연변이를 가진 세포를 함유한다면, ddATP를 가진 채우기 반응에 해당하는 레인은 밝은 신호를 나타내고, ddTTP 를 가진 채우기 반응에 해당하는 레인으로부터 신호가 검출된다. ddTTP 를 가진 채우기 반응에 해당하는 레인으로부터 신호의 강도는 샘플 중의 돌연변이 세포수를 나타낸다.
대안으로, 하나의 표지된 뉴클레오티드가 APC 유전자의 코돈 1370 에서 대립유전자의 서열을 결정하는데 사용된다. 코돈 1370에서, 정상의 서열은 AAA 이고, 이것은 아미노산 리신을 암호화한다. 그러나, 뉴클레오티드 치환이 코돈 1370에서 동정되었고, 이것은 결장직장암과 연관되어 있다. 구체적으로, A 의 T 로의 변화(AAA-TAA)는 전형적으로 코돈 1370에서 발견되었고, 이것은 정지 코돈을 만들었다. 단일 채우기 반응은 표지된 ddATP, 및 비표지된 dTTP, dCTP, 및 dGTP 를 사용하여 수행된다. 하나의 형광 염료로 표지된 단일 뉴클레오티드는 코돈 1370 을 암호화하는 정상 DNA 및 돌연변이 DNA 모두의 존재를 결정하는데 사용된다. 관련 DNA 서열은 굵은 글자체의 코돈 1370 에 해당하는 서열과 함께 하기에 기술된다:
5' CCCAAAAGTCCACCTGA
3' GGGTTTTCAGGTGGACT
BsmFI 로의 절단 후에, 다음 돌출부가 생성되었다.
5' CCC
3' GGG T T T T
돌출부 위치 1 2 3 4
환자 샘플이 코돈 1370에서 돌연변이를 포함하는 세포를 가지지 않는다면, 표지된 ddATP 의 통합에 해당하는 하나의 신호가 확인될 것이다.
5' CCCA*
3' GGG T T T T
돌출부 위치 1 2 3 4
그러나, 환자 샘플이 APC 유전자의 코돈 1370 에서 돌연변이를 함유한 세포를 가진다면, 코돈 1370에서 정상 서열에 해당하는 하나의 신호와, 코돈 1370에서 돌연변이 서열에 해당하는 제2의 신호가 확인된다. 신호는 그들이 분자량에서 상이하기 때문에 분명하게 동정된다.
정상 DNA 서열의 돌출부 : CCC
GGG T T T T
돌출부 위치 1 2 3 4
채우기 후의 정상 DNA 서열 : CCCA*
GGG T T T T
돌출부 위치 1 2 3 4
돌연변이 DNA 서열의 돌출부 : CCC
GGG A T T T
돌출부 위치 1 2 3 4
채우기 후의 돌연변이 DNA 서열 : CCCT A*
GGGAT T T
돌출부 위치 1 2 3 4
돌연변이 대립유전자가 존재할 때 2개의 신호가 확인된다. 야생형 DNA 분자 다음의 첫번째 염기에 돌연변이 DNA 분자가 채워진다. 분자량에 기초하여 구별하는 어떤 방법을 사용하여 2개의 신호를 분리하였다. 하나의 표지된 뉴클레오티드 (ddATP)를 사용하여 야생형 DNA 서열 및 돌연변이 DNA 서열 모두의 존재를 검출하였다. 표지화 방법은 수행에 필요한 반응의 수를 감소시키고, 환자 샘플에서 돌연변이 세포수에 대한 정확한 정량화를 허용한다. 샘플 중의 돌연변이 세포수는 환자 예후, 질병의 정도 및 심각성을 결정하는 데 사용된다. 상이한 염료를 사용하는 이러한 표지화 방법은 구별되는 양자계수를 가지는 연관된 합병증을 제거한다. 표지화 방법은 또한 피펫사용 반응과 연관된 에러를 제거한다.
별개의 채우기 반응이 수행될 때, 어떤 세포가 APC 유전자의 코돈 1302 에서 돌연변이를 함유하는지를 결정하기 위해서, ddTTP 및 ddCTP 에 대한 채우기 반응에 해당하는 겔 레인을 분석하였다. 정상 DNA 서열은 코돈 1302 를 암호화하는 서열과 함께 하기에 굵은 글자체로 기재된다.
정상 서열 5' ACCCTGCAAATAGCAGAA
3' TGGGACGTTTATCGTCTT
절단 후에, 다음 5' 돌출부가 생성된다:
5' ACCC
3' TGGG A C G T
돌출부 위치 1 2 3 4
채우기 반응 후에, 표지된 ddTTP 를 통합한다.
5' ACCCT*
3' TGGG A C G T
돌출부 위치 1 2 3 4
전형적으로 코돈 1302 를 암호화하는 APC 서열의 단일 염기의 결실은 결장직장암과 연관되어 있다. 돌연변이 DNA 서열은 관련 서열과 함께 하기에 굵은 글자체로 기재된다.
돌연변이 서열 : 5' ACCCGCAAATAGCAGAA
3' TGGGCGTTTATCGTCTT
절단 후 :
5' ACC
3' TGG G C G T
돌출부 위치 1 2 3 4
채우기 후 :
5' ACCC*
3' TGG G C G T
돌출부 위치 1 2 3 4
APC 유전자에 어떤 돌연변이도 존재하지 않는다면, ddCTP* 을 이용한 채우기 반응에 대하여 신호가 검출되지 않지만, ddTTP* 을 이용한 채우기 반응에 대해서는 밝은 신호가 검출된다. 그러나, APC 유전자에서 돌연변이를 가지는 환자 샘플 중의 세포가 존재한다면, ddCTP* 및 ddTTP* 을 이용한 채우기 반응에 대하여 신호를 확인된다.
대안으로, 단일 채우기 반응은 비표지 dNTP, 형광성으로 표지된 ddATP, 형광성으로 표지된 ddTTP, 형광성으로 표지된 ddCTP, 및 형광성으로 표지된 ddGTP 를 함유하는 혼합물을 사용하여 수행한다. 결실이 존재하지 않는다면, 표지된 ddTTP 가 통합된다.
5' ACCCT*
3' TGGG A C G T
돌출부 위치 1 2 3 4
그러나, T 가 결실된다면, 표지된 ddCTP* 가 통합된다.
5' ACCC*
3' TGGG C G T
돌출부 위치 1 2 3 4
티미딘 뉴클레오티드의 결실로 인한 분자량에 따라서 2 개의 신호가 분리된다. 돌연변이 세포가 존재한다면, 2개의 신호가 동일한 레인에서 발생하지만, 하나의 염기쌍으로 분리된다(이러한 원리는 도 9D 에서 증명된다). 결실은 DNA 단편의 분자량에서의 변화를 초래하고, 이것이 단일 채우기 반응이 정상 및 돌연변이 세포 모두의 존재를 검출하는데 사용되는 것을 허용한다.
상기 실시예에서, 뉴클레오티드 치환 및 작은 결실의 검출 방법이 기재된다. 그러나, 어떤 형태의 돌연변이의 검출에 사용될 수 있는 방법은 뉴클레오티드 치환(표7 참조), 스플라이싱 에러(표8 참조), 작은 결실(표9 참조), 작은 삽입(표 10 참조), 작은 삽입/결실(표11 참조), 총 결실(표12 참조), 총 삽입(표 13 참조), 및 복합성 재배열(표14 참조)를 제한없이 포함한다.
추가적으로, 상기 기재된 방법은 표4에 열거된 질환을 제한없이 포함하는 어떤 형태의 질환의 검출에 사용된다. 더욱이, 어떤 타입의 돌연변이 유전자는 표 4에 열거된 질환과 연관된 유전자, BRCA1, BRCA2, MSH6, MSH2, MLH1, RET, PTEN, ATM, H-RAS, p53, ELAC2, CDH1, APC, AR, PMS2, MLH3, CYP1A1, GSTP1, GSTM1, AXIN2, CYP19, MET, NAT1, CDKN2A, NQ01, trc8, RAD51, PMS1, TGFBR2, VHL, MC4R, POMC, NROB2, UCP2, PCSK1, PPARG, ADRB2, UCP3, glurl, cart, SORBS1, LEP, LEPR,SIM1, TNF, IL-6, IL-1, IL-2, IL-3, IL1A, TAP2, THPO, THRB, NBS1, RBM15, LIF, MPL, RUNX1, Her-2, 글루코코르티코이드 수용체, 에스트로겐 수용체, 티로이드 수용체, p21, p27, K-RAS, N-RAS, 망막아종 단백질, 위스코트 알드리히(Wiskott-Aldrich(WAS)) 유전자, 인자 V 리덴, 인자 II(프로트롬빈), 메틸렌 테트라히드로폴레이트 환원효소, 낭포성 섬유증, LDL 수용체, HDL 수용체, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유전자, SHOX 유전자, 산화질소 조절에 관여하는 유전자, 세포주기 조절에 관여하는 유전자, 종양 억제 유전자, 발암유전자, 신경변성과 연관된 유전자, 비만과 연관된 유전자를 제한없이 포함하며, 본원에 기재된 발명을 사용하여 검출된다. 약어는 본원에 참고로서 수록된, 휴먼진 돌연변이 데이터베이스에 열거된 단백질에 해당한다(2003년 2월 12일 개시된 웹사이트 주소 www.archive.uwcm.ac.uk./uwcm).
상기 실시예는 대변 샘플로부터의 돌연변이 세포 및 돌연변이 대립유전자의 검출을 증명한다. 그러나, 본원에 기재된 방법은 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 소변 샘플, 척수액, 림프액, 정액, 질 분비액, 복수액, 타액, 점막 분비액, 복막액, 대변 샘플, 체 삼출물, 모유, 폐 흡인물, 세포, 조직, 동일한 핵산을 함유하는 이러한 공급원의 각 세포 또는 추출물, 및 미토콘드리아 또는 엽록체와 같은 세포내 구조물을 제한없이 포함하는 어떤 생물학적 샘플로부터의 돌연변이 세포 검출에 사용된다. 더욱이, 본원에 기재된 방법은 법의학, 식품, 고고학, 농업 또는 무기질 샘플을 제한없이 포함하는 다양한 핵산 함유 공급원으로부터 돌연변이 세포 및 돌연변이 DNA 를 검출하는데 사용된다.
상기 실시예는 APC 유전자에서의 돌연변이 검출에 관한 것이다. 그러나, 본원에 기재된 발명은 질병과 연관이 있거나 질병의 소인이 되는 어떤 유전자내의 돌연변이를 검출하는데 사용된다.
예를 들어, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 P1 (GSTP1) 프로모토의 과메틸화는 전립선암에서 가장 일반적인 DNA 변경이다. 프로모토의 메틸화 상태는 이황화나트륨 및 본원에 기재된 방법을 사용하여 결정된다.
이황화나트륨으로의 처치는 비메틸화된 시토신 잔기를 우라실로 변경하고, 메틸화된 시토신은 변경되지 않은채 두었다. 본원에 기재된 방법을 사용하여, 때때로 메틸화된 GSTP1 프로모토의 영역이 증폭되도록 제1의 그리고 제 2 프라이머를 디자인하였다. 하기에, 이황화나트륨 처리전의 GSTP1 프로모토의 영역이 나타나 있다.
이황화나트륨 처리 전:
5' ACCGCTACA
3' TGGCGATCA
하기에, 이황화나트륨 처리, PRC 증폭, 및 IIS 형 제한 효소 BsmF I 으로의 절단후의 GSTP1 프로모토의 영역이 나타나 있다.
비메틸화
5' ACC
3' TGG U G A T
돌출부 위치 1 2 3 4
메틸화
5' ACC
3' TGG C G A T
돌출부 위치 1 2 3 4
표지된 ddATP, 비표지 dCTP, dGTP, 및 dTTP 는 5' 돌출부를 채우는데 사용된다. 다음 분자가 생성된다.
비메틸화
5' ACCA*
3' TGGUG A T
돌출부 위치 1 2 3 4
메틸화
5' ACC G C TA*
3' TGG C G A T
돌출부 위치 1 2 3 4
2개의 신호가 확인된다; 하나는 (비메틸화된) 돌출부에 상보적인 위치 1에서 ddATP 로 채워진 DNA 분자에 해당하고, 다른 하나는 (메틸화된) 돌출부에 상보적인 위치 4에서 ddATP 로 채워진 DNA 분자에 해당한다. 2개의 신호는 분자량에 따라서 분리된다. 대안으로, 채우기 반응은 하나의 반응에서는 표지된 ddGTP 를 사용하고, 다른 반응에서는 표지된 ddATP 를 사용하여 별개의 반응에서 수행된다.
본원에 기재된 방법은 전립선암을 스크리닝하는데 사용되고, 또한 질병의 진행정도와 심각성을 모니터하는데 사용된다. 메틸화 및 비메틸화 서열 모두의 검출에 있어서의 단일 뉴클레오티드의 사용은 정확한 정량화를 가능하게 하고, 메틸화된 서열에 대한 높은 수준의 감도를 제공하는데, 이는 질병의 초기 검출에 유용한 수단이 된다.
표 7-14 에 포함된 정보는 휴먼진 돌연변이 데이터베이스로부터 얻었다. 숙련된 기술자라면 어떤 유전자에 대한 대립유전자의 서열을 결정하는데 있어서, 본원에 제공된 정보를 사용하여 이들 방법을 어떻게 적용하여야 할지를 이해할 것이다. 다양한 유전자와 이들과 연관된 돌연변이가 다음 웹사이트: www.archive.uwcm. ac.uk./uwcm.에서 확인될 수 있다.
HIV
항-레트로바이러스 내성 HIV 바이러스 중의 돌연변이, 예를 들어 154V 돌연변이 또는 CCR532 대립유전자에 대한 개체 스크리닝 본원에 기재된 방법은 HIV 바이러스 중의 돌연변이를 검출하는데 사용될 수 있다. 처치 결과는 내성 스크리닝에 기초한 항레트로바이러스 요법을 수용한 개체에서 증가되었다. J. Durant 등The Lancet,353, 2195(1999)
심장학
울혈성 심부전 베타1 및 알파2c 아드레날린작용성 수용체의 상승적 다형성 본원에 기재된 방법은 이들 유전자좌의 유전자형에 사용될 수 있고, 매우 높은 심부전 위험을 가진 환자를 동정하는데 도움이 될 수 있다. K.Small 등New Eng. Jnl. Med.,347, 1135(2002)
실시예 8
단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)은 가장 흔한 형태의 서열 변형을 나타낸다; 사람 게놈에서 5% 이상의 개체군 빈도를 갖는 3백만개의 공통 SNP가 존재할 것으로 추정되었다. 안내자로서 이들 다형성을 사용한 게놈 지도가 개발되고 있는 중이다(http://research.marshfieldelinic.org/genetics/; 2003년 2월 13일 개시된 인터넷 주소)
대립유전자 빈도는 SNP에 따라 다양하다. 한 SNP에 대한 대립유전자 빈도는 50:50일 수 있는 반면, 다른 SNP에 대한 대립유전자 빈도는 90:10일 수 있다. 대립유전자 빈도가 50:50에 가까울수록, 어떤 특정한 개체가 그 SNP에서 이형접합성일 가능성이 더 크다. SNP 컨소시움은 일부 SNP들에 대해서는 대립유전자 정보를 제공하지만 다른 것들에 대해서는 제공하지 않는다. 특정한 SNP의 대립유전자 빈도는, 실시예 5에 설명된 비-침습성 태아기 스크리닝 방법에서 이 SNP의 유용성에 관한 가치 있는 정보를 제공한다. 모든 SNP가 사용될 수 있지만, 50:50에 가까운 대립유전자 빈도를 갖는 SNP가 바람직하다.
간단히 말해서, 모계 혈액은 태아 DNA를 함유한다. 모친이 동형접합성일 때 모계 DNA를 SNP를 시험함으로써 태아 DNA로부터 구별할 수 있다. 예를 들어, SNP X에서 모계 DNA는 구아닌에 대해 동형접합성일 수 있다. 아데닌 대립유전자와 구아닌 대립유전자에 해당하는 신호를 검출하여 증명한 바, 만일 임신한 여성의 혈장으로부터 얻어진 주형 DNA가 이형접합성이라면 아데닌 대립유전자를 태아 DNA의 표지로 사용할 수 있다(실시예 5 참조). SNP의 대립유전자 빈도가 50:50에 가까울수록, 특정한 SNP에서 모계 DNA와 태아 DNA 사이의 대립유전자 차이가 있을 가능성이 더 크다.
예를 들어, 만일 SNP X에서 관찰된 대립유전자가 아데닌과 구아닌이고 SNP가 90(A):10(G)의 대립유전자 빈도를 가진다면, 부모가 모두 이 특정 SNP에서 아데닌에 대해 동형접합성일 것이다. 따라서, 모계 DNA와 태아 DNA가 모두 아데닌에 대해 동형접합성일 것이며, 태아 DNA에 대한 별도의 신호는 존재하지 않는다. 그러나, 만일 SNP X에서 대립유전자 빈도가 50:50이고, 모친이 아데닌에 대해 동형접합성이라면, 모계 DNA가 SNP X에서 구아닌 대립유전자를 함유할 가능성이 더 높다.
아래에 SNP에서 대립유전자 빈도를 결정하는 방법이 제공된다. 13번 염색체에 위치된 7개의 SNP가 분석되었다. 이 방법은 어떤 SNP에 대해서도 이용할 수 있으며, SNP는 제한은 없지만 사람 염색체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X 및 Y 상의 SNP들을 포함한다.
주형 DNA의 제조
특정한 SNP의 대립유전자 빈도를 결정하기 위해서, 동의서에 승인한 250명의 개체로부터 DNA를 얻었다. 각각의 개체로부터, 혈액 샘플 9ml를 멸균 관(Fischer Scientific, 9ml EDTA Vacuette 관, 카탈로그 번호 NC9897284)에 채취했다. 이 관을 1000rpm에서 10분 동안 회전시켰다. 각 샘플의 상청액(혈장)을 제거하고, 통상'버피-코트'라 하는 잔류한 혈액 샘플 1ml를 새로운 관으로 옮겼다. 1x PBS 1ml를 각 샘플에 가했다.
QIAGEN에 의해 제공된 QIAmp DNA 혈액 미디키트(카탈로그 번호 51183)를 사용하여 주형 DNA를 분리했다. 주형 DNA는 키트에 포함된 설명서에 따라서 분리했다. 각 개체로부터의 DNA 0.76㎍씩을 함께 모아서, 이 DNA 총액을 모든 후속 반응에 사용했다.
프라이머 디자인
SNP TSC0903430을 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' GTCTTGCATGTAGAATTCTAGGGACGCTGCTTTTCGTC 3'
제 2 프라이머: 5'CTCCTAGACATCGGGACTAGAATGTCCAC 3'
제 1 프라이머는 제한효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유했으며, 관심있는 유전자좌로부터 82개의 염기를 어닐링하도록 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유했다.
SNP TSC0337961를 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' ACACAAGGCAGAGAATTCCAGTCCTGAGGGTGGGGGCC 3'
제 2 프라이머: 5' CCGTGTTTTAACGGGACAAGCTGTTCTTC 3'
제 1 프라이머는 제한효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유했으며, 관심있는 유전자좌로부터 92개의 염기를 어닐링하도록 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유했다.
SNP TSC0786441를 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' GTAGCGGAGGTTGAATTCTATATGTTGTCTTGGACATT 3'
제 2 프라이머: 5' CATCAGTAGAGTGGGACGAAAGTTCTGGC 3'
제 1 프라이머는 제한효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유했으며, 관심있는 유전자좌로부터 104개의 염기를 어닐링하도록 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유했다.
SNP TSC1168303를 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' ATCCACGCCGCAGAATTCGTATTCATGGGCATGTCAAA 3'
제 2 프라이머: 5' CTTGGGACTATTGGGACCAGTGTTCAATC 3'
제 1 프라이머는 제한효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유했으며, 관심있는 유전자좌로부터 64개의 염기를 어닐링하도록 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유했다.
SNP TSC0056188을 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' CCAGAAAGCCGTGAATTCGTTAAGCCAACCTGACTCCA 3'
제 2 프라이머: 5' TCGGGGTTAGTCGGGACATCCAGCAGCCC 3'
제 1 프라이머는 제한효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유했으며, 관심있는 유전자좌로부터 82개의 염기를 어닐링하도록 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유했다.
SNP TSC0466177를 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' CGAAGGTAATGTGAATTCCAAAACTTAGTGCCACAATT 3'
제 2 프라이머: 5' ATACCGCCCAACGGGACAGATCCATTGAC 3'
제 1 프라이머는 제한효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유했으며, 관심있는 유전자좌로부터 92개의 염기를 어닐링하도록 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유했다.
SNP TSC0197424를 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' AGAAACCTGTAAGAATTCGATTCCAAATTGTTTTTTGG 3'
제 2 프라이머: 5' CGATCATAGGGGGGGACAGGAGAGAGCAC 3'
제 1 프라이머는 제한효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유했으며, 관심있는 유전자좌로부터 104개의 염기를 어닐링하도록 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유했다.
제 1 프라이머를 관심있는 유전자좌로부터 다양한 거리에서 어닐링하도록 디자인했다. 당업자는 제 1 프라이머의 어닐링 위치가 관심있는 유전자좌로부터 어떤 위치일 수도 있다는 것을 이해할 것이며, 이 위치는 제한은 없지만 5-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50, 51-55, 56-60, 61-65, 66-70, 71-75, 76-80, 81- 85, 86-90, 91-95, 96-100, 101-105, 106-110, 111-115, 116-120, 121-125, 126-130, 131-140, 141-160, 161-180, 181-200, 201-220, 221-240, 241-260, 261-280, 281-300, 301-350, 351-400, 401-450, 451-500, 501-1000, 1001-2000, 2001-3000, 또는 3000 이상을 포함한다.
중합효소 연쇄반응(PCR, 여기 참고자료로 수록된 미국특허 No. 4,683,195 및 4,683,202)을 사용하여 주형 게놈 DNA로부터 모든 관심 있는 유전자좌를 증폭했다. 이 실시예에서는 관심있는 유전자좌를 별개의 반응관에서 증폭했지만, 그들은 단일PCR 반응에서 함께 증폭될 수도 있다. 특이성을 증가시키기 위해서 "핫-스타트" PCR을 사용했다. PCR 반응을 QIAGEN에 의해 제공된 HotStarTaq Master Mix 키트(카탈로그 번호 203443)을 사용하여 수행했다. 반응 당 주형 DNA와 프라이머의 양은 관심있는 각 유전자좌에 맞게 최적화될 수 있다. 이 실시예에서, 주형 사람 게놈 DNA(245명 개체로부터의 주형 DNA의 혼합물) 40ng과 각 프라이머 5μM를 사용했다. PCR 40사이클을 수행했다. 아래의 PCR 조건을 사용했다:
(1) 15분 15초간 95℃;
(2) 30초간 37℃;
(3) 30초간 95℃;
(4) 30초간 57℃;
(5) 30초간 95℃;
(6) 30초간 64℃;
(7) 30초간 95℃;
(8) 6 단계와 7단계를 39회 반복;
(9) 5분간 72℃.
첫번째 PCR 사이클에서 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 3' 어닐링 영역의 용융 온도였으며 이것은 37℃였다. 두번째 PCR 사이클에서 어닐링 온도는 대략 제 1 프라이머의 주형 DNA에 대해 어닐링하는 3' 영역의 용융 온도였으며 이것은 57℃였다. 세번째 PCR 사이클에서 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 전 서열의 용융 온도였으며 이것은 64℃였다. 나머지 사이클의 용융 온도는 64℃였다. 처음3번의 PCR 사이클에서 어닐링 온도를 TM1에서 TM2로 다시 TM3으로 단계적으로 올리는 것은 특이성을 크게 증가시킨다. 이들 어닐링 온도는 대표적인 것이며, 당업자는 각 사이클의 어닐링 온도가 사용된 특정방향 프라이머에 의존한다는 것을 이해할 것이다.
변성, 어닐링 및 확장의 온도와 시간은 다양한 설정들을 시도해 보고 최상의 결과를 제공하는 변수들을 사용함으로써 최적화될 수 있다.
관심있는 단편의 정제
PCR 생산물을 사용하지 않은 PCR 시약으로부터 분리했다. PCR 반응 후, SNP TSC0903430, SNP TSC0337961, 및 SNPTSC0786441의 반응 부피의 1/2을 단일 반응관에서 함께 혼합했다. SNP TSC1168303, TSC0056188, TSC0466177, 및 TSC0197424의 반응 부피의 1/2을 단일 반응관에 함께 모았다. 사용하지 않은 프라이머와 뉴클레오티드를 Qiagen MinElute PCR 정제 키트(Qiagen, 카탈로그 번호 28004)를 사용하여 반응물로부터 제거했다. 반응은 칼럼과 함께 제공된 제조자의 설명서에 따라서 수행했다.
분리된 단편의 제한효소 절단
정제된 PCR 생산물을 제 2 프라이머로부터 PCR 생산물로 결합된 인식 부위에 결합하는 제한효소 BsmF I로 절단했다. 절단은 제한효소와 함께 제공된 설명서에 따라서 에펜드로프 관에서 수행했다.
표지된 뉴클레오티드의 결합
BsmF I로의 제한효소 절단은 5' 돌출부를 갖는 DNA 단편을 제공했으며, 이것은 관심있는 SNP 부위 또는 유전자좌와 3' 함몰 단부를 함유했다. 5' 돌출부는 DNA 중합효소의 존재하에서 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 결합을 허용하는 주형으로서 기능했다.
실시예 6에 상세히 논의된 대로, SNP의 두 대립유전자의 서열은 한 표지되지 않은 뉴클레오티드의 존재하에서 나머지 하나의 표지된 뉴클레오티드로 결정될 수 있다. 다음의 성분을 각 채우기 반응에 첨가하였다: 형광 표지된 ddGTP 0.5㎕, 표지되지 않은 ddNTP 0.5㎕(40μM)(이것은 구아닌을 제외한 모든 뉴클레오티드를 함유했다), 10x 시퀘나제 완충액 2㎕, 시퀘나제 0.25㎕ 그리고 20㎕ 반응에 필요한 물. 채우기 반응을 40℃에서 10분 동안 수행했다. 이 실시예에서 사용된 중합효소는 시퀘나제였다. 그러나, 어떤 DNA 중합효소라도 채우기 반응에 사용될 수 있는데, 이 중합효소는 제한은 없지만E. coliDNA 중합효소,E. coliDNA 중합효소 I의 클레노우 단편, T7 DNA 중합효소, T4 DNA 중합효소, Taq 중합효소, Pfu DNA 중합효소, Vent DNA 중합효소, 박테리오파아지 29로부터의 중합효소, 및 REDTaqTMGenomic DNA 중합효소를 포함한다. 비-형광 표지된 ddNTP는 Fermentas Inc.(Hanover MD)에서 구입했으며, 다른 표지화 시약들은 모두 Amersham(US 79565, Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit)에서 얻었다.
관심있는 유전자좌의 검출
36cm 5% 아크릴아미드(요소) 겔(BioWhittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, 카탈로그 번호 50691)에 샘플을 로딩했다. 샘플을 3000볼트에서 3분간 겔로 전기영동했다. 이 겔을 서열결정 기기(Hoefer SQ3 Sequence)에서 3시간 동안 전개시켰다. 기기에서 겔을 꺼내어 Typhoon 9400 Variable Mode Imager로 스캔했다. 형광에 의해서 결합된 표지된 뉴클레오티드가 검출되었다.
아래에 SNP TSC0056188의 5' 돌출부가 도시된다(여기서, R은 가변부를 나타낸다). 전체 서열은 나타내지 않으며 돌출부를 증명할 수 있는 부분만을 나타낸다.
5' CCA
3' GGT R T C C
돌출부 위치 1 2 3 4
실시예 6에 상세히 나타낸 대로, 1개의 화학적 부분으로 표지된 1개의 뉴클레오티드를 사용하여 관심있는 유전자좌의 대립유전자의 서열을 결정할 수 있다. 5' 센스 가닥(여기서는 상부 가닥으로 나타냄) 상의 TSC0056188에서 관찰된 뉴클레오티드는 아데닌과 구아닌이다. 안티센스 가닥 상의 돌출부에서 세번째 위치는 시토신이며, 이것은 구아닌에 상보적이다. 가변부는 아데닌 또는 구아닌일 수 있으므로, 표지되지 않은 dCTP, dTTP, 및 dATP의 존재하에서 형광 표지된 ddGTP를 사용하여 두 대립유전자의 서열을 결정했다. 구아닌에 동형접합성이거나, 아데닌에 동형접합성이거나 또는 이형접합성인 개체에 대한 채우기 반응을 아래에 도시된다.
동형접합성 아데닌:
5' CCAAAG*
3' GGTTT C C
돌출부 위치 1 2 3 4
동형접합성 구아닌:
5' CCAG*
3' GGTCT C C
돌출부 위치 1 2 3 4
이형접합성:
대립유전자 1 5' CCAG*
3' GGT C T C C
돌출부 위치 1 2 3 4
대립유전자 2 5' CCAA A G*
3' GGT T T C C
돌출부 위치 1 2 3 4
도 14에 나타낸 대로, SNP TSC0056188에서 2개의 밴드가 검출되었다. 저분자량 밴드가 돌출부에 상보하는 위치 1에서 ddGTP로 채워진 DNA 분자에 해당했고, 이것은 구아닌 대립유전자를 나타낸다. 단일 염기에 의해 아래쪽 밴드와 분리된 위쪽 밴드는 돌출부에 상보적인 위치 3에서 ddGTP로 채워진 DNA 분자에 해당했다. 이 밴드는 아데닌 대립유전자를 나타내었다. 각 밴드의 강도는 강했으며, 이것은 각 대립유전자가 이 개체군을 잘 대표했다는 것을 의미한다. SNP TSC0056188은 높은 대립유전자 빈도를 갖는 대표적인 SNP이다.
아래에, SNP TST0337961에서 BsmF I로 절단한 후 생성된 5' 돌출부가 도시된다(여기서, R은 가변부를 나타낸다). 전체 서열은 나타내지 않으며 돌출부 부분만 나타낸다.
5' GGCA
3' CGGT R G C T
돌출부 위치 1 2 3 4
5' 센스 가닥(여기서는 상부 가닥으로 나타냄) 상의 SNP TSC0337961에서 관찰된 뉴클레오티드는 아데닌과 구아닌이다. 안티센스 가닥 상의 돌출부에서 제 3 위치는 시토신이며, 이것은 구아닌에 상보한다. 가변부는 아데닌 또는 구아닌일 수 있으므로, 표지되지 않은 dCTP, dTTP, 및 dATP의 존재하에서 형광 표지된 ddGTP를 사용하여 두 대립유전자의 서열을 결정했다. 구아닌에 동형접합성이거가, 아데닌에 동형접합성이거나 또는 이형접합성인 개체에 대한 채우기 반응을 아래에 도표로 나타낸다.
동형접합성 아데닌:
5' GCCAG*
3' CGGT C G C T
돌출부 위치 1 2 3 4
동형접합성 구아닌:
5' GCCCAACG*
3' CGGT T G C T
돌출부 위치 1 2 3 4
이형접합성:
대립유전자 1 5' GCCAG*
3' CGGT C G C T
대립유전자 2 5' GCCAACG*
3' CGGT T G C T
도 14에 나타낸 대로, 예상된 저분자량 밴드의 위치로 이동한 1개 밴드가 관찰되었다. 이 밴드는 돌출부에 상보적인 위치 1에서 ddGTP로 채워진 DNA 분자를 나타냈으며, 이것은 구아닌 대립유전자를 나타내고 있다. 돌출부에 상보적인 위치 3에서 ddGTP로 채워진 DNA 분자에 해당하는 밴드는 검출되지 않았다. SNP TSC0337961이 이 개체군 내에서 높은 가변성을 나타내지 않는 대표적인 SNP이다.
분석된 7개의 SNP 중에서 4개의 SNP(TSC1168303, TSC0056188, TSC0466177 및 TSC0197424)가 높은 대립유전자 빈도를 가졌다. 높은 강도의 2개 밴드가 4개의 SNP 각각에서 보였는데, 이것은 두 대립유전자가 이 개체군에서 잘 나타났다는 것을 의미한다.
그러나, SNP가 유용한 50:50의 대립유전자 빈도를 반드시 갖는 것은 아니다. 모든 SNP는 유용한 정보를 제공한다. 여기 설명된 방법은 SNP의 대립유전자 빈도나, 또는 제한은 없지만 점돌연변이를 포함하는 어떤 가변부를 결정하는 신속한 기술을 제공한다. 50:50, 51:49, 52:48, 53:47, 54:46, 55:45, 56:46, 57:43, 58:42, 59:41, 60:40, 61:39, 62:38, 63:37, 64:36, 65:35, 66:34, 67:33, 68:32, 69:31, 70:30, 71:29, 72:28, 73:27, 74:26, 75:25, 76:24, 77:23, 78:22, 79:21,80:20, 81:19, 82:18, 83:17, 84:16, 85:15, 86:14, 87:13, 88:12, 89:11, 90:10, 91:9, 92:8, 93:7, 94:6, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2, 99:1 그리고 100:0의 대립유전자 빈도가 유용할 수 있다.
SNP TSC0903430에서는 2개의 밴드가 보였다. 저분자량 밴드인 하나의 밴드는 표지된 ddGTP로 채워진 DNA 분자를 나타냈다. 더 약한 강도의 밴드는 돌출부에 상보적인 위치 3에서 표지된 ddGTP로 채워진 분자에 대해 보여졌으며, 이것은 시토신 대립유전자를 나타냈다. SNP TSC0903430는 낮은 대립유전자 빈도 변화를 갖는 SNP를 나타낸다. 이 개체군에서 대다수의 개체는 구아닌 대립유전자를 지니지만 시토신 대립유전자도 여전히 존재한다.
SNP TSC0337961 및 SNPTSC0786441에서는 높은 강도의 1개 밴드가 보였다. SNP TSC0337961와 SNP TSC0786441에서 모두 검출된 이 밴드는 돌출부에 상보적인 위치 1에서 ddGTP로 채워진 DNA 분자에 해당한다. 두번째 대립유전자를 나타내는, 돌출부에 상보적인 위치 3에서 채워진 DNA 분자로부터는 신호가 검출되지 않았다. SNP TSC0337961와 SNP TSC0786441는 이 개체군 내의 거의 가변성을 나타내지 않는 SNP를 대표한다.
도 14에 나타낸 대로, 관심있는 각 유전자좌를 증폭하는데 사용된 제 1 프라이머는 관심있는 유전자좌로부터 다양한 거리에서 어닐링하도록 디자인될 수 있다. 이것은 동일 반응에서 복수의 SNP가 분석되는 것을 허용한다. 관심있는 유전자좌로부터 특정한 거리에서 어닐링하도록 제 1 프라이머를 디자인함에 의해서, 단일 반응에서 어떤 수의 관심있는 유전자좌가 분석될 수 있으며, 이 수는 제한은 없지만 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, 91-100, 101-110, 111-120, 121-130, 131-140, 141-150, 151-160, 161-170, 171-180, 181-190, 191-200, 201-300, 301-400, 401-500, 그리고 500 이상을 포함한다.
실시예 6에 논의된 대로, 어떤 IIS 형 제한효소는 교대하는 절단 유형을 나타낸다. 예를 들어, IIS 형 제한효소 BsmF I는 전형적으로 결합부위로부터 10/14를 절단하지만, 결합부위로부터 11/15를 절단할 수도 있다. 교대 절단 효과를 제거하기 위해서, 채우기 반응에 사용되는 표지된 뉴클레오티드가 11/15 절단에 의해 생성된 돌출부의 위치 0에 상보적이지 않도록 선택되어야 한다(실시예 6에서 상세히 논의됨). 예를 들어, ddGTP로 표지한 경우, 채워진 가닥 상의 가변부 앞에 있는 뉴클레오티드는 구아닌이 아니어야 한다.
SNP TSC0056188에서 BsmF I에 의해 생성된 11/15 돌출부를 아래에 나타내며, 가변부를 굵은 글자체로 나타낸다:
TSC0056188 에 대한 11/15 돌출부
대립유전자 1 5' CC
3' GG TCT C
돌출부 위치 0 1 2 3
대립유전자 2 5' CC
3' GG TTT C
돌출부 위치 0 1 2 3
표지된 ddGTP, 표지되지 않은 dATP, dTTP, 및 dCTP로의 채우기 반응 후, 아래의 분자가 생성되었다.
11/15 대립유전자 1 5' CC AG*
3' GG T C T C
돌출부 위치 0 1 2 3
11/15 대립유전자 2 5' CC A A AG*
3' GG T T T C
돌출부 위치 0 1 2 3
2개의 신호가 보였는데, 한 밴드는 돌출부의 위치 1에서 ddGTP로 채워진 분자에 해당했고, 나머지 한 밴드는 돌출부에 상보적인 위치 3에서 ddGTP로 채워진 분자에 해당했다. 이들은 10/14 돌출부의 채우기 반응 후 생성된 동일한 DNA 분자이다. 따라서, 이 2개의 밴드는 교대 절단으로 인한 어떤 다의성 없이 비교될 수 있다.
여기 설명된 방법은 제한은 없지만 사람 염색체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X 및 Y 상의 SNP를 포함하는 어떤 SNP의 대립유전자 빈도를 결정하는데 이용할 수 있다. 단일 뉴클레오티드로의 표지 방법은 효소의 교대 절단 성질에 의해 발생할 수 있는 어떤 에러를 제거한다.
실시예 9
정의에 의하면 이형접합성 SNP는 한 뉴클레오티드가 다른 것이다. 이형접합성 SNP에서 대립유전자 1과 대립유전자 2는 1:1 비율로 존재할 수 있다. 그러나,DNA 중합효소가 다른 뉴클레오티드들보다 빠른 속도로 한 뉴클레오티드를 결합시키는 것이 가능하므로, 이형접합성 SNP에서 관찰된 비율은 이론적으로 예상된 1:1의 비율과 다를 수 있다.
아래에, 이형접합성 SNP에서 대립유전자 1 대 대립유전자 2의 예상된 비율을 효과적이고 정확하게 정량하도록 허용하는 방법이 설명된다.
주형 DNA의 제조
동의서에 승인한 24명의 개체로부터 주형 DNA를 얻었다. 각 개체로부터, 혈액 샘플 9ml를 멸균 관(Fischer Scientific, 9ml EDTA Vacuette 관, 카탈로그 번호 NC9897284)에 채취했다. 이 관을 제동시키지 않고 1000rpm에서 10분 동안 회전시켰다. 각 샘플의 상청액(혈장)을 제거하고, 통상 '버피-코트'라 하는 잔류한 혈액 샘플 1ml를 새로운 관으로 옮겼다. 1x PBS 1ml를 각 샘플에 가했다.
QIAGEN에 의해 제공된 QIAmp DNA 혈액 미디키트(카탈로그 번호 51183)를 사용하여 주형 DNA를 분리했다. 주형 DNA는 키트에 포함된 설명서에 따라서 분리했다.
프라이머 디자인
SNP TSC0607185를 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' ACTTGATTCCGTGAATTCGTTATCAATAAATCTTACAT 3'
제 2 프라이머: 5' CAAGTTGGATCCGGGACCCAGGGCTAACC 3'
SNP TSC1130902를 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' TCTAACCATTGCGAATTCAGGGCAAGGGGGGTGAGATC 3'
제 2 프라이머: 5' TGACTTGGATCCGGGACAACGACTCATCC 3'
제 1 프라이머는 5' 단부에 비오틴 태그와 제한효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유했고, 제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유했다. 제 1 프라이머는 관심있는 유전자좌로부터 다양한 거리에서 어닐링하도록 디자인되었다.
SNP TSC0607185에 대한 제 1 프라이머는 관심있는 유전자좌로부터 90개의 염기를 어닐링하도록 디자인되었다. SNP TSC1130902에 대한 제 1 프라이머는 관심있는 유전자좌로부터 60개의 염기를 어닐링하도록 디자인되었다.
중합효소 연쇄반응(PCR, 여기 참고자료로 수록된 미국특허 No. 4,683,195 및 4,683,202)을 사용하여 주형 게놈 DNA로부터 모든 관심 있는 유전자좌를 증폭했다. 이 실시예에서는 관심있는 유전자좌를 별개의 반응관에서 증폭했지만, 그들은 단일 PCR 반응에서 함께 증폭될 수도 있다. 특이성을 증가시키기 위해서 "핫-스타트" PCR을 사용했다. PCR 반응을 QIAGEN에 의해 제공된 HotStarTaq Master Mix 키트(카탈로그 번호 203443)을 사용하여 수행했다. 반응 당 주형 DNA와 프라이머의 양은 관심있는 각 유전자좌에 맞게 최적화될 수 있다. 이 실시예에서는 주형 사람 게놈 DNA 40ng과 각 프라이머 5μM를 사용했다. PCR 40사이클을 수행했다. 아래의 PCR 조건을 사용했다:
(1) 15분 15초간 95℃;
(2) 30초간 37℃;
(3) 30초간 95℃;
(4) 30초간 57℃;
(5) 30초간 95℃;
(6) 30초간 64℃;
(7) 30초간 95℃;
(8) 6 단계와 7단계를 39회 반복;
(9) 5분간 72℃.
첫번째 PCR 사이클에서 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 3' 어닐링 영역의 용융 온도였으며 이것은 37℃였다. 두번째 PCR 사이클에서 어닐링 온도는 대략 제 1 프라이머의 주형 DNA에 대해 어닐링하는 3' 영역의 용융 온도였으며 이것은 57℃였다. 세번째 PCR 사이클에서 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 전 서열의 용융 온도였으며 이것은 64℃였다. 나머지 사이클의 용융 온도는 64℃였다. 처음 3번의 PCR 사이클에서 어닐링 온도를 TM1에서 TM2로 다시 TM3으로 단계적으로 올리는 것은 특이성을 크게 증가시킨다. 이들 어닐링 온도는 대표적인 것이며, 당업자는 각 사이클의 어닐링 온도가 사용된 특정방향 프라이머에 의존한다는 것을 이해할 것이다.
변성, 어닐링 및 확장의 온도와 시간은 다양한 설정들을 시도해 보고 최상의 결과를 제공하는 변수들을 사용함으로써 최적화될 수 있다.
관심있는 단편의 정제
PCR 생산물을 게놈 주형 DNA로부터 분리했다. Roche Diagnostics GmbH의 투명한 고결합성 플레이트인 스트렙타웰(Roche Molecular Biochemical, 2001 생화학제품 카탈로그에 기재된, 카탈로그 번호 1 645 692)의 웰에 PCR 반응물의 반을 옮겼다. 제 1 프라이머는 PCR 생산물이 스트렙타비딘 코팅된 웰에 결합되도록 하는 한편 게놈 주형 DNA는 결합되지 않도록 하는 5' 비오틴 태그를 함유했다. 스트렙타비딘 결합 반응을 37℃에서 20분 동안 1000rpm에서 써모믹서(Eppendorf)를 사용하여 수행했다. 각 웰을 흡인하여 미결합 물질을 제거하고, 부드럽게 혼합하면서 1x PBS로 3회 세척했다(Kandpal 등, Nucl.Acids Res. 18:1789-1795 (1990); Kaneoka 등, Biotechniques 10:30-34 (1991); Green 등 Nucl. Acids Res. 18:6163-6164 (1990)).
분리된 단편의 제한효소 절단
정제된 PCR 생산물을 제 2 프라이머로부터 PCR 생산물로 결합된 인식 부위에 결합하는 제한효소 BsmF I로 절단했다. 절단은 제한효소와 함께 제공된 설명서에 따라서 스트렙타웰에서 수행했다. 절단 후 웰을 PBS로 3회 세척하여 절단된 단편을 제거했다.
표지된 뉴클레오티드의 결합
BsmF I로의 제한효소 절단은 5' 돌출부를 갖는 DNA 단편을 제공했으며, 이것은 관심있는 SNP 부위 또는 유전자좌와 3' 함몰 단부를 함유했다. 5' 돌출부는 DNA 중합효소의 존재하에서 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 결합을 허용하는 주형으로서 기능했다.
실시예 6에 상세히 논의된 대로, SNP의 두 대립유전자의 서열은 한 표지되지 않은 뉴클레오티드의 존재하에서 나머지 하나의 표지된 뉴클레오티드로 결정될 수있다. 다음의 성분을 각 채우기 반응에 첨가하였다: 형광 표지된 ddGTP 1㎕, 표지되지 않은 ddNTP 0.5㎕(40μM)(이것은 구아닌을 제외한 모든 뉴클레오티드를 함유했다), 10x 시퀘나제 완충액 2㎕, 시퀘나제 0.25㎕ 그리고 20㎕ 반응에 필요한 물. 각 채우기 반응을 40℃에서 10분 동안 수행했다. 비-형광 표지된 ddNTP는 Fermentas Inc.(Hanover MD)에서 구입했으며, 다른 표지화 시약들은 모두 Amersham(US 79565, Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit)에서 얻었다.
표지화 후, 각 스트렙타웰을 1x PBS(100㎕)로 3회 헹궜다. 다음에, 효소와 함께 제공된 제조자의 설명서에 따라서, 제한효소 EcoRI로의 절단에 의해 "채워진" DNA 단편을 스트렙타웰로부터 방출시켰다. 절단은 37℃에서 1시간 동안 120rpm으로 흔들면서 수행했다.
관심있는 유전자좌의 검출
36cm 5% 아크릴아미드(요소) 겔(BioWhittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, 카탈로그 번호 50691)에 샘플을 로딩했다. 샘플을 3000볼트에서 3분간 겔로 전기영동했다. 이 겔을 서열결정 기기(Hoefer SQ3 Sequence)에서 3시간 동안 전개시켰다. 기기에서 겔을 꺼내어 Typhoon 9400 Variable Mode Imager로 스캔했다. 형광에 의해서 결합된 표지된 뉴클레오티드가 검출되었다. 각 밴드를 둘러싸도록 상자를 그리고, Typhoon 9400 Variable Mode Imager 소프트웨어를 사용하여 밴드의 강도를 계산했다.
아래에, SNP TSC0607185의 5' 돌출부가 도시된다. 전체 DNA 서열은 재현하지 않으며 돌출부를 증명할 수 있는 부분만을 나타낸다(여기서, R은 가변부를 나타낸다).
G C T R TGTC 3'
ACAG 5'
4 3 2 1 돌출부 위치
5' 센스 가닥(여기서는 상부 가닥으로 나타냄) 상의 SNP TSC0607185 가변부에서 관찰된 뉴클레오티드는 시토신과 티미딘(여기서는 R로 나타냄)이다. 이 경우 제 2 프라이머는 관심있는 유전자좌에서부터 어닐링하며, 이것은 채우기 반응을 허용하여 안티센스 가닥(여기서는 하부 가닥으로 나타냄)을 일으킨다. 안티센스 가닥은 구아닌 또는 아데닌으로 채워질 것이다.
5' 돌출부의 위치 2는 아데닌에 상보적인 티미딘이고, 돌출부의 제 3 위치는 구아닌에 상보적인 시토신이다. 표지되지 않은 dCTP, dTTP 및 dATP의 존재하에서 형광 표지된 ddGTP를 사용하여 두 대립유전자의 서열을 결정했다. 채우기 반응 후, 아래의 DNA 분자가 발생되었다:
G C T C TGTC 3' 대립유전자 1
G* ACAG 5'
4 3 2 1 돌출부 위치
C C T T TGTC 3' 대립유전자 1
G* A A ACAG 5'
4 3 2 1 돌출부 위치
TSC0607185의 인식 부위로부터 11/15에서 절단하는 BsmF I에 의해 생성된 돌출부를 아래 나타낸다:
C T R T GTC 3' 11/15
CAG 5'
3 2 1 0 돌출부 위치
표지된 ddGTP가 채우기 반응에 사용되므로 인식 부위로부터 11/5를 절단한 분자로부터 새로운 신호는 발생하지 않을 것이다. 돌출부에 상보적인 위치 0은 표지되지 않은 dATP로 채워졌다. 돌출부에 상보적인 위치 1에서 표지된 ddGTP로 채워진 분자나, 또는 돌출부에 상보적인 위치 3에서 표지된 ddGTP로 채워진 분자로부터 발생된 신호들만 보였다.
24명의 개체 중에서 5명이 SNP TSC0607185에 대해 이형접합성이었다. 도 15에 나타낸 대로, 2개의 밴드가 검출되었다. 저분자량 밴드가 돌출부에 상보적인 위치 1에서 ddGTP로 채워진 DNA 분자에 해당했다. 고분자량 밴드는 돌출부에 상보적인 위치 3에서 ddGTP로 채워진 DNA 분자에 해당했다.
두 대립유전자의 비율을 5개의 이형접합성 샘플에 대해서 각각 계산했다(표 XVI 참조). 대립유전자 1에 대한 대립유전자 2의 평균 비율은 1.000, 표준 편차는 0.044였다. 따라서, SNP TSC0607185에서 대립유전자 비율은 매우 일정했다. 특정한 SNP에 대해 실험적으로 계산된 대립유전자 비율을 이후 SNP의 "p" 값이라고 한다. 분석된 게놈의 수가 통계적 표본추출로 인한 오차를 일으키지 않는 충분한 양이라면, SNP TSC0607185의 분석은 1:1의 대립유전자 비율을 일정하게 제공할 것이다.
만일 샘플이 소수의 게놈을 함유했다면, 프라이머가 다른 염색체에 우선하여 한 염색체에 대해 어닐링하는 것이 통계적으로 가능하다. 예를 들어, 샘플이 40개의 게놈을 함유하는 경우에, 이것은 전체적으로 대립유전자 1의 40개 염색체와 대립유전자 2의 40개 염색체에 해당하는데, 이런 경우에는, 프라이머가 대립유전자 1의 40개 염색체에 대해 어닐링할 수 있지만, 대립유전자 2에서는 단지 35개에 대해서만 어닐링할 수 있는 통계적 가능성이 있다. 이것은 대립유전자 1이 대립유전자 2에 우선하여 증폭되도록 하여, 대립유전자 2에 대한 대립유전자 1의 비율을 변경할 것이다. 이 문제는 샘플 안에 충분한 수의 게놈을 가짐으로써 제거된다.
SNP TSC0607185는 가변부에 있는 뉴클레오티드의 차이가 PCR 반응이나 제한효소로의 절단 또는 채우기 반응에 영향을 미치지 않는 SNP를 나타낸다. 형광 염료로 표지된 한 뉴클레오티드의 사용은, 한 대립유전자에 대한 밴드가 두번째 대립유전자에 대한 밴드와 정확히 비교될 수 있도록 보장한다. 2개의 상이한 레인들을 비교하거나, 염료의 양자 계수를 보정하는 데서 오는 복잡함을 가하지 않고 두번째 대립유전자로부터의 신호와 비교할 수 있게 한다. 추가하여, IIS 형 제한효소의 교대 절단 특성으로 인한 어떤 효과도 제거되었다.나
아래에, SNP TSC1130902의 5' 돌출부가 도시된다. 전체 DNA 서열은 재현하지 않으며 돌출부를 증명할 수 있는 부분만을 나타낸다(여기서, R은 가변부를 나타낸다).
5' TTCAT
3' AAGTA R T C C
돌출부 위치 1 2 3 4
5' 센스 가닥(여기서는 상부 가닥으로 나타냄) 상의 TSC1130902에서 관찰된 뉴클레오티드는 아데닌과 구아닌이다. 돌출부의 제 2 위치는 티미딘에 해당하고, 돌출부의 제 3 위치는 구아닌에 상보적인 시토신에 해당한다. 형광 표지된 ddGTP를 표지되지 않은 dCTP, dTTP 및 dATP의 존재하에 사용하여 두 대립유전자의 서열을 결정했다. 채우기 반응 후, 아래의 DNA 분자가 발생되었다:
대립유전자 1 5' TTCATG*
3' AAGTA C T C C
오버행 위치 1 2 3 4
대립유전자 2 5' TTCAT A AG*
3' AAGTA T T C C
돌출부 위치 T T C C
도 15에 나타낸 대로, 2개의 밴드가 검출되었다. 저분자량 밴드는 돌출부에 상보적인 위치 1에서 표지된 ddGTP로 채워진 DNA 분자에 해당했고(G 대립유전자), 단일 염기에 의해 아래쪽 밴드와 분리된 고분자량 밴드는 돌출부에 상보적인 위치 3에서 ddGTP로 채워진 DNA 분자에 해당했다(A 대립유전자).
24명의 개체 중에서 5명이 SNP TSC1130902에 대해 이형접합성이었다. 도 15에 나타낸 대로, 대립유전자 2에 해당하는 밴드에 비해 대립유전자 1에 해당하는 밴드가 더 강했다. 이것은 5명의 개체 각각에 대해 보였다. 대립유전자 1에 해당하는 밴드의 실제 강도는 개체에 따라 변했지만, 대립유전자 2에 해당하는 밴드보다는 항상 더 강했다. 이 5명의 개체에서 대립유전자 1에 대한 대립유전자 2의 평균 비율은 0.74116, 표준 편차는 0.017018이었다.
주형 DNA를 5명의 다른 개체들로부터 제조했다. 개별 PCR 반응, 개별 제한효소 절단, 및 개별 채우기 반응을 수행했다. 그러나, 각 주형 DNA에 대해서 대립유전자 1에 대한 대립유전자 2의 비율은 약 0.75였다. 이 SNP에 대한 "p" 값은 매우 일정했다.
예를 들어, SNP TSC1130902에서 "p" 값은 0.75였다. 충분한 수의 게놈을 함유하는 샘플을 제공하여 통계적 표본추출의 오차를 제거했을 때, 이 값으로부터의 어떤 편차는 13번 염색체에 비정상적인 복제수가 있다는 것을 의미한다. 만일 대립유전자 2의 추가의 복제물이 있다면, "p" 값은 예상된 0.75보다 더 높을 것이다. 그러나, 만일 대립유전자 1의 추가의 복제물이 있다면, "p" 값은 예상된 0.75보다 더 낮을 것이다. 특정한 SNP에 대해 계산된 "p" 값으로 그 SNP를 사용하여 염색체 이상성이 있는지 없는지를 결정할 수 있다. 단일 SNP에 대해 측정된 정확한 "p" 값이 염색체 이상성의 존재를 검출하는데 충분할 것이다.
어떤 SNP에서 한 대립유전자 대 나머지 한 대립유전자의 비율이 1:1의 이론적으로 예상된 비율로부터 왜 변하는지에 대해서 몇 가지 설명이 가능하다. 먼저, DNA 중합효소가 한 뉴클레오티드를 나머지 한 뉴클레오티드보다 더 빨리 결합시키는 것이 가능하다. 대립유전자들이 PCR에 의해 증폭되므로, 한 뉴클레오티드가 나머지 한 뉴클레오티드에 비해 아주 약간 선호된다고 해도 예상된 1:1의 비율이 변할 수 있다. 한 뉴클레오티드의 나머지 한 뉴클레오티드에 대한 이런 잠재적인 선호성은 채우기 반응에서는, 한 염료로 표지된 단일 뉴클레오티드가 사용되기 때문에 보이지 않는다.
또한, SNP 부위에 있는 가변성 뉴클레오티드가 두 대립유전자의 변성 속도에 영향을 미친는 것이 가능하다. 만일 대립유전자 1이 구아닌을 함유하고 대립유전자 2가 아데닌을 함유한다면, 이들 뉴클레오티드에서의 결합 강도의 차이가 DNA 가닥이 분리되는 속도에 영향을 미칠 수 있다. 다시 한 번, 대립유전자가 PCR에 의해 증폭됨으로써, 매우 미묘한 차이가 최종 결과에 큰 영향을 미칠 수 있다는 것을언급하는 것이 중요하다. 또한, SNP 부위에 있는 가변성 뉴클레오티드가 분리 후 두 가닥이 어닐링되는 속도에 영향을 미치는 것이 가능하다.
또는 달리, IIS 형 제한효소가 나머지 한 대립유전자에 비해 우선적으로 한 대립유전자를 절단하는 것이 가능하다. 상기 상세히 논의된 대로, IIS 제한효소는 인식 부위로부터 어떤 거리에서 절단한다. SNP 부위에 있는 가변성 뉴클레오티드가 제한효소 절단의 효율에 영향을 미치는 것이 가능하다. 어떤 SNP에서, 제한효소가 100%의 효율로 한 대립유전자를 절단하고, 나머지 한 대립유전자는 90%의 효율로 절단하는 것이 가능하다.
그러나, 대립유전자 2에 대한 대립유전자 1의 비율이 1:1의 이론적으로 예상된 비율에서 벗어난다는 사실이, 그 SNP의 유용성에 영향을 미치거나 유용성을 감소시키는 것은 아니다. 상기 증명된 대로, 각 SNP에 대한 "p" 값은 상이한 개체들에서 일정하다.
어떤 SNP에 대한 "p" 값은 어떤 수의 이형접합성 개체의 주형 DNA를 분석함에 의해서 계산될 수 있으며, 이 수는 제한은 없지만 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, 91-100, 101-110, 111-120, 121-130, 131-140, 141-150, 151-160, 161-170, 171-180, 181-190, 191-200, 201-210, 211-220, 221-230, 231-240, 241-250, 251-260, 261-270, 271-280, 281-290, 291-300, 그리고 300 이상을 포함한다.
여기 설명된 방법으로 어떤 SNP에 대한 "p" 값을 결정할 수 있다. 어떤 SNP들은 다른 SNP에 비해 더 일정하게 거동할 가능성이 있다. 사람 게놈에는 3백만개이상의 SNP가 있는데, 각 SNP가 어떻게 거동할 것인지 추측하는 것은 불가능하다. 각 SNP에 대한 "p" 값은 실험적으로 결정되어야 할 것이다. 여기 설명된 방법으로 매우 일정하고 재현가능한 "p" 값을 갖는 SNP를 확인할 수 있다.
실시예 10
실시예 9에 논의된 대로, SNP에서 한 대립유전자 대 나머지 한 대립유전자의 비는 이론적으로 예상된 비인 50:50에서 변할 수 있다. 염색체 장애를 가진 개체에서 한 대립유전자 대 나머지 한 대립유전자의 비가 직선을 유지한다면, 이들 SNP를 사용하여 추가 염색체의 존재를 검출할 수 있다. 예를 들어, 대립유전자 1 대 대립유전자 2의 백분율이 75:25인 SNP X에서, 다운증후군을 가진 개체는 대립유전자 1 대 대립유전자 2의 예상된 백분율이, 이 SNP에서 예상된 백분율로부터의 변화를 반영하도록 적합하게 조절되야 한다.
21번 염색체의 SNP TSC0108992에서 대립유전자 1 대 대립유전자 2의 백분율은 4명의 정상 개체의 주형 DNA와 다운증후군을 가진 개체의 주형 DNA를 사용하여 계산되었다. 하기 나타낸 대로, 한 대립유전자 대 나머지 대립유전자의 백분율은 다운증후군을 가진 개체에서 일정하였으며 직선을 유지했다.
주형 DNA 제조
정상 유전 핵형을 가진 4명의 개체와 21번 염색체의 여분의 복제물을 갖는 것으로 확인된 개체(다운증후군)로부터 DNA를 얻었다. 모든 개체에게서 동의서를 받았다. 다운증후군을 가진 개체는 그 부모에게서도 동의서를 받았다.
각각의 개체로부터 혈액 샘플 9ml를 멸균 관(Fischer Scientific, 9ml EDTAVacuette 관, 카탈로그 번호 NC9897284)에 채취했다. 주형 DNA를 QIAGEN에 의해 제공된 QIAmp DNA 혈액 미디키트(카탈로그 번호 51183)를 사용하여 분리했다. 주형 DNA는 키트에 포함된 설명서에 따라서 분리했다.
프라이머 디자인
SNP TSC0108992를 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' CTACTGAGGGCTCGTAGATCCCAATTCCTTCCCAAGCT 3'
제 2 프라이머: 5' AATCCTGCTTTAGGGACCATGCTGGTGGA 3'
제 1 프라이머는 5' 단부에 비오틴 태그와 제한효소 EcoRI 인식 부위를 함유했다. 제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I 인식 부위를 함유했다.
SNP TSC0108992를 중합효소 연쇄반응(PCR, 여기 참고자료로 수록된 미국특허 No. 4,683,195 및 4,683,202)을 사용하여 주형 게놈 DNA로부터 증폭했다. 특이성을 증가시키기 위해 "핫-스타트" PCR을 사용했다. PCR 반응을 QIAGEN에 의해 제공된 HotStarTaq Master Mix 키트(카탈로그 번호 203443)을 사용하여 수행했다. 반응 당 주형 DNA와 프라이머의 양은 관심있는 각 유전자좌에 맞게 최적화될 수 있다. 이 실시예에서, 주형 사람 게놈 DNA 50ng과 각 프라이머 5μM를 사용했다. PCR 38사이클을 수행했다. 아래의 PCR 조건을 사용했다:
(1) 15분 15초간 95℃;
(2) 30초간 37℃;
(3) 30초간 95℃;
(4) 30초간 57℃;
(5) 30초간 95℃;
(6) 30초간 64℃;
(7) 30초간 95℃;
(8) 6 단계와 7단계를 37회 반복;
(9) 5분간 72℃.
첫번째 PCR 사이클에서 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 3' 어닐링 영역의 용융 온도였으며 이것은 37℃였다. 두번째 PCR 사이클에서 어닐링 온도는 대략 제 1 프라이머의 주형 DNA에 대해 어닐링하는 3' 영역의 용융 온도였으며 이것은 57℃였다. 세번째 PCR 사이클에서 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 전 서열의 용융 온도였으며 이것은 64℃였다. 나머지 사이클의 용융 온도는 64℃였다. 처음 3번의 PCR 사이클에서 어닐링 온도를 TM1에서 TM2로 다시 TM3으로 단계적으로 올리는 것은 특이성을 크게 증가시킨다. 이들 어닐링 온도는 대표적인 것이며, 당업자는 각 사이클의 어닐링 온도가 사용된 특정방향 프라이머에 의존한다는 것을 이해할 것이다.
변성, 어닐링 및 확장의 온도와 시간은 다양한 설정들을 시도해 보고 최상의 결과를 제공하는 변수들을 사용함으로써 최적화될 수 있다.
관심있는 단편의 정제
PCR 생산물을 게놈 주형 DNA로부터 분리했다. 각 PCR 반응물을 2개의 샘플로 분할하고, Roche Diagnostics GmbH의 투명한 고결합성 플레이트인 스트렙타웰 (Roche Molecular Biochemical, 2001 생화학제품 카탈로그에 기재된, 카탈로그 번호 1 645 692)의 2개의 분리된 웰로 옮겼다. 각 PCR 반응물에 대해서 2개의 복제물이 각각 마이크로타이터 플레이트의 분리된 웰에 있었다. 제 1 프라이머는 PCR 생산물이 스트렙타비딘 코팅 웰에 결합되도록 하는 한편 게놈 주형 DNA는 결합되지 않도록 하는 5' 비오틴 태그를 함유했다. 스트렙타비딘 결합 반응을 20분 동안 37℃ 1000rpm에서 써모믹서(Eppendorf)를 사용하여 수행했다. 각 웰을 흡인하여 미결합 물질을 제거하고, 부드럽게 혼합하면서 1x PBS로 3회 세척했다(Kandpal 등, Nucl. Acids Res. 18:1789-1795 (1990); Kaneoka 등, Biotechniques 10:30-34 (1991); Green 등, Nucl.Acids Res. 18:6163-6164 (1990)).
분리된 단편의 제한효소 절단
정제된 PCR 생산물을 제 2 프라이머로부터 PCR 생산물로 결합된 인식 부위에 결합하는 제한효소 BsmF I로 절단했다. 절단은 제한효소와 함께 제공된 설명서에 따라서 스트렙타웰에서 수행했다. 절단 후, 이 웰을 1x PBS로 3회 세척하여 절단된 단편들을 제거했다.
표지된 뉴클레오티드의 결합
BsmF I로의 제한효소 절단은 5' 돌출부를 갖는 DNA 단편을 제공했으며, 이것은 관심있는 SNP 부위 또는 유전자좌와 3' 함몰 단부를 함유했다. 5' 돌출부는 DNA 중합효소의 존재하에서 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 결합을 허용하는 주형으로서 기능했다.
실시예 6에 상세히 논의된 대로, SNP의 두 대립유전자의 서열은 한 표지되지 않은 뉴클레오티드의 존재하에서 나머지 하나의 표지된 뉴클레오티드로 결정될 수있다. 다음의 성분을 각 채우기 반응에 첨가하였다: 형광 표지된 ddTTP 1㎕, 표지되지 않은 ddNTP 0.5㎕(40μM)(이것은 티미딘을 제외한 모든 뉴클레오티드를 함유했다), 10x 시퀘나제 완충액 2㎕, 시퀘나제 0.25㎕ 그리고 20㎕ 반응에 필요한 물. 각 채우기 반응을 40℃에서 10분 동안 수행했다. 비-형광 표지된 ddNTP는 Fermentas Inc.(Hanover MD)에서 구입했다. 다른 표지화 시약들은 모두 Amersham(US 79565, Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit)에서 얻었다.
표지화 후, 각 스트렙타웰을 1x PBS(100㎕)로 3회 헹궜다. 다음에, 효소와 함께 제공된 제조자의 설명서에 따라서, 제한효소 EcoRI로의 절단에 의해 "채워진" DNA 단편을 스트렙타웰로부터 방출시켰다. 절단은 37℃에서 1시간 동안 120rpm으로 흔들면서 수행했다.
관심있는 유전자좌의 검출
36cm 5% 아크릴아미드(요소) 겔(BioWhittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, 카탈로그 번호 50691)에 샘플을 로딩했다. 샘플을 3000볼트에서 3분간 겔로 전기영동했다. 이 겔을 서열결정 기기(Hoefer SQ3 Sequence)에서 3시간 동안 전개시켰다. 기기에서 겔을 꺼내어 Typhoon 9400 Variable Mode Imager로 스캔했다. 형광에 의해서 결합된 표지된 뉴클레오티드가 검출되었다. 각 밴드를 둘러싸도록 상자를 그리고, Typhoon 9400 Variable Mode Imager 소프트웨어를 사용하여 밴드의 강도를 계산했다.
아래에, SNP TSC0108992의 5' 돌출부가 도시된다. 전체 DNA 서열은 재현하지 않으며 돌출부를 증명할 수 있는 부분만을 나타낸다(여기서, R은 가변부를 나타낸다).
GTCC 3'
G A C R CAGG 5'
4 3 2 1 돌출부 위치
SNP TSC0108992에서 관찰된 뉴클레오티드는 센스 가닥(여기서는 상부 가닥으로 나타냄) 상의 아데닌과 티미딘이다. 돌출부의 위치 3이 아데닌에 해당하며, 이것은 티미딘에 상보한다. 표지된 ddTTP를 표지되지 않은 dATP, dCTP, 및 dGTP의 존재하에 사용했다. 표지된 ddTTP를 사용한 채우기 반응 후, 아래의 DNA 분자가 생성되었다:
T*G A GTCC 3' 대립유전자 1
G A C T CAGG 5'
4 3 2 1 돌출부 위치
T*GTCC 3' 대립유전자 2
G A C A CAGG 5'
4 3 2 1 돌출부 위치
한 표지된 뉴클레오티드를 채우기 반응에 사용했기 때문에 대립유전자 1과 대립유전자 2로부터 얻어진 값들을 비교하는데 어려움은 없었고, 두 대립유전자에 대한 채우기 반응은 한 시험관에서 일어났다. 11/15 돌출부가 10/14 돌출부와 마찬가지로 채워질 수 있었기 때문에 이 분석에서 BsmF I의 교대 절단 특성은 영향을미치지 않았다. 채우기 11/15 돌출부가 도시된다:
T*G A G TCC 3' 11/15 대립유전자 1
A C T C AGG 5'
3 2 1 0 돌출부 위치
T*G TCC 3' 11/15 대립유전자 2
A C A C AGG 5'
3 2 1 0 돌출부 위치
도 16에 나타낸 대로, 주형 DNA의 각 샘플에서 2개의 밴드가 보였다. 저분자량 밴드가 돌출부에 상보적인 위치 1에서 ddTTP로 채워진 DNA 분자에 해당했고, 고분자량 밴드는 돌출부에 상보적인 위치 3에서 ddTTP로 채워진 DNA 분자에 해당했다.
대립유전자 1에 대한 대립유전자 2의 백분율은 매우 일정하였다(표 XVII 참조). 이에 더하여, 어떤 주어진 개체에서의 반복된 PCR 반응도 유사한 결과를 나타냈다(표 XVII 참조). 대립유전자 1 대 대립유전자 2의 백분율은 대립유전자 1과 대립유전자 2의 값의 합으로 대립유전자 2의 값을 나눔으로써 계산되었다(대립유전자 2/(대립유전자 1+대립유전자 2)). 4명의 개체로부터, 대립유전자 1 대 대립유전자 2의 평균 백분율은 0.4773, 표준편차는 0.0097이었다. 다운증후군 개체로부터 분리된 주형 DNA에 대한 대립유전자 1 대 대립유전자 2의 백분율은 0.3086이었다.
정상 개체로부터의 주형 DNA를 사용했을 때 대립유전자 1에 대한 대립유전자2의 이론적으로 예상된 백분율은 0.50이다. 그러나, 실험적으로 결정된 백분율은 0.4773이었다. 21번 염색체의 여분의 복제물을 갖는 개체에서 대립유전자 1에 대한 대립유전자 2의 이론적으로 예상된 백분율은 0.33이다. SNP TSC0108992에 대한 대립유전자 1 대 대립유전자 2의 실험적으로 결정된 백분율은 0.3086이었다.
이론적으로 예상된 백분율과의 편차는 매우 일정하며 직선을 유지한다. 아래의 식은 21번 염색체의 여분의 복제물을 갖는 개체로부터 얻어진 주형 DNA에서도 SNP TSC0108992에서 대립유전자 1에 대한 대립유전자 2의 백분율이 직선을 유지한다는 것을 증명한다:
정상 개체로부터 얻어진 주형 DNA를 사용했을 때 대립유전자 1 대 대립유전자 2의 백분율이 0.47로 결정된다면, 다운증후군을 갖는 개체로부터의 주형 DNA를 사용했을 때의 대립유전자 1 대 대립유전자 2의 백분율은 0.3102일 것이다. 실험적으로 결정된 비율은 0.3086이었으며, 표준편차는 0.00186이었다. 다운증후군을 갖는 개체로부터의 주형 DND에 대해서, 대립유전자 1 대 대립유전자 2의 예상된 백분율과 실험적으로 결정된 백분율 사이에 차이는 없었다.
특정한 SNP에서, 한 대립유전자에 대한 나머지 대립유전자의 백분율은 매우 일정했으며 재현가능했고 직선이었다. 이것은 한 대립유전자 대 다른 대립유전자의 계산된 백분율과 무관하게 어떤 SNP라도 염색체 장애가 있는지 없는지를 결정하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 11
특정 SNP에서 대립유전자 1에 대한 대립유전자 2의 백분율은 매우 일정하다. 실험적으로 결정된 비율로부터의 통계적으로 유의한 편차는 염색체 이상성이 있다는 의미이다. 아래에, 21번 염색체의 SNP TSC0108992에서 대립유전자 1에 대한 대립유전자 2의 백분율을 정상 개체의 주형 DNA와 다운증후군 개체의 주형 DNA를 사용하여 계산했다. 블라인드 방식으로 다양한 양의 정상 DNA와 다운증후군 DNA를 함유하는 혼합물을 제조하여 분석했다.
주형 DNA의 제조
정상 유전자 핵형을 갖는 개체와 21번 염색체의 여분의 복제물을 갖는 것으로 확인된 개체(다운증후군)로부터 DNA를 얻었다. 두 개체로부터 동의서를 받았다. 다운증후군을 갖는 개체는 그 부모에게도 동의서를 받았다.
각각의 개체로부터 혈액 샘플 9ml를 멸균 관(Fischer Scientific, 9ml EDTA Vacuette 시험관, 카탈로그 번호 NC9897284)에 채취했다. 주형 DNA를 QIAGEN에 의해 제공된 QIAmp DNA 혈액 미디키트(카탈로그 번호 51183)를 사용하여 분리했다. 주형 DNA는 키트에 포함된 설명서에 따라서 분리했다.
주형 DNA의 혼합물
정상 핵형을 갖는 개체의 주형 DNA와 21번 염색체의 여분의 복제물을 갖는 개체의 주형 DNA를 10ng/㎕로 희석했다. 아래의 방식으로 정상 주형 DNA와 다운증후군 주형 DNA의 4가지 혼합물을 제조했다:
혼합물 1: 정상 DNA 32㎕ + 다운증후군 DNA 8㎕
혼합물 2: 정상 DNA 28㎕ + 다운증후군 DNA 12㎕
혼합물 3: 정상 DNA 20㎕ + 다운증후군 DNA 20㎕
혼합물 4: 정상 DNA 10㎕ + 다운증후군 DNA 30㎕
PCR 반응을 정상 주형 DNA와 다운증후군 개체의 주형 DNA에 대해 3회의 개별 PCR 반응을 셋업했다. 마찬가지로, 각 혼합물에 대해서도 3회의 개별 PCR 반응을 셋업했다.
프라이머 디자인
SNP TSC0108992를 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' CTACTGAGGGCTCGTAGATCCCAATTCCTTCCCAAGCT 3'
제 2 프라이머: 5' AATCCTGCTTTAGGGACCATGCTGGTGGA 3'
제 1 프라이머는 5' 단부에 비오틴 태그와 제한효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유했다. 제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유했다.
SNP TSC0108992를 중합효소 연쇄반응(PCR, 여기 참고자료로 수록된 미국특허 No. 4,683,195 및 4,683,202)을 사용하여 주형 게놈 DNA로부터 증폭했다. 특이성을 증가시키기 위해 "핫-스타트" PCR을 사용했다. PCR 반응을 QIAGEN에 의해 제공된 HotStarTaq Master Mix 키트(카탈로그 번호 203443)을 사용하여 수행했다. 반응 당 주형 DNA와 프라이머의 양은 관심있는 각 유전자좌에 맞게 최적화될 수 있다. 이 실시예에서는 주형 사람 게놈 DNA 50ng과 각 프라이머 5μM를 사용했다. PCR 38사이클을 수행했다. 아래의 PCR 조건을 사용했다:
(1) 15분 15초간 95℃;
(2) 30초간 37℃;
(3) 30초간 95℃;
(4) 30초간 57℃;
(5) 30초간 95℃;
(6) 30초간 64℃;
(7) 30초간 95℃;
(8) 6 단계와 7단계를 37회 반복;
(9) 5분간 72℃.
첫번째 PCR 사이클에서 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 3' 어닐링 영역의 용융 온도였으며 이것은 37℃였다. 두번째 PCR 사이클에서 어닐링 온도는 대략 제 1 프라이머의 주형 DNA에 대해 어닐링하는 3' 영역의 용융 온도였으며 이것은 57℃였다. 세번째 PCR 사이클에서 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 전 서열의 용융 온도였으며 이것은 64℃였다. 나머지 사이클의 용융 온도는 64℃였다. 처음 3번의 PCR 사이클에서 어닐링 온도를 TM1에서 TM2로 다시 TM3으로 단계적으로 올리는 것은 특이성을 크게 증가시킨다. 이들 어닐링 온도는 대표적인 것이며, 당업자는 각 사이클의 어닐링 온도가 사용된 특정방향 프라이머에 의존한다는 것을 이해할 것이다.
변성, 어닐링 및 확장의 온도와 시간은 다양한 설정들을 시도해 보고 최상의 결과를 제공하는 변수들을 사용함으로써 최적화될 수 있다.
관심있는 단편의 정제
PCR 생산물을 게놈 주형 DNA로부터 분리했다. 각 PCR 반응물을 2개의 샘플로 분할하고, Roche Diagnostics GmbH의 투명한 고결합성 플레이트인 스트렙타웰 (Roche Molecular Biochemical, 2001 생화학제품 카탈로그에 기재된, 카탈로그 번호 1 645 692)의 2개의 분리된 웰로 옮겼다. 각 PCR 반응물에 대해서 2개의 복제물이 각각 마이크로타이터 플레이트의 분리된 웰에 있었다. 제 1 프라이머는 PCR 생산물이 스트렙타비딘 코팅 웰에 결합되도록 하는 한편 게놈 주형 DNA는 결합되지 않도록 하는 5' 비오틴 태그를 함유했다. 스트렙타비딘 결합 반응을 20분 동안 37℃ 1000rpm에서 써모믹서(Eppendorf)를 사용하여 수행했다. 각 웰을 흡인하여 미결합 물질을 제거하고, 부드럽게 혼합하면서 1x PBS로 3회 세척했다(Kandpal 등, Nucl. Acids Res. 18:1789-1795 (1990); Kaneoka 등, Biotechniques 10:30-34 (1991); Green 등, Nucl.Acids Res. 18:6163-6164 (1990)).
분리된 단편의 제한효소 절단
정제된 PCR 생산물을 제 2 프라이머로부터 PCR 생산물로 결합된 인식 부위에 결합하는 제한효소 BsmF I로 절단했다. 절단은 제한효소와 함께 제공된 설명서에 따라서 스트렙타웰에서 수행했다. 절단 후, 이 웰을 1x PBS로 3회 세척하여 절단된 단편들을 제거했다.
표지된 뉴클레오티드의 결합
BsmF I로의 제한효소 절단은 5' 돌출부를 갖는 DNA 단편을 제공했으며, 이것은 관심있는 SNP 부위 또는 유전자좌와 3' 함몰 단부를 함유했다. 5' 돌출부는 DNA 중합효소의 존재하에서 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 결합을 허용하는 주형으로서 기능했다.
실시예 6에 상세히 논의된 대로, SNP의 두 대립유전자의 서열은 한 표지되지 않은 뉴클레오티드의 존재하에서 나머지 하나의 표지된 뉴클레오티드로 결정될 수 있다. 다음의 성분을 각 채우기 반응에 첨가하였다: 형광 표지된 ddTTP 1㎕, 표지되지 않은 ddNTP 0.5㎕(40μM)(이것은 티미딘을 제외한 모든 뉴클레오티드를 함유했다), 10x 시퀘나제 완충액 2㎕, 시퀘나제 0.25㎕ 그리고 20㎕ 반응에 필요한 물. 각 채우기 반응을 40℃에서 10분 동안 수행했다. 비-형광 표지된 ddNTP는 Fermentas Inc.(Hanover MD)에서 구입했다. 다른 표지화 시약들은 모두Amersham(US 79565, Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit)에서 얻었다.
표지화 후, 각 스트렙타웰을 1x PBS(100㎕)로 3회 헹궜다. 다음에, 효소와 함께 제공된 제조자의 설명서에 따라서, 제한효소 EcoRI로의 절단에 의해 "채워진" DNA 단편을 스트렙타웰로부터 방출시켰다. 절단은 37℃에서 1시간 동안 120rpm으로 흔들면서 수행했다.
관심있는 유전자좌의 검출
36cm 5% 아크릴아미드(요소) 겔(BioWhittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, 카탈로그 번호 50691)에 샘플을 로딩했다. 샘플을 3000볼트에서 3분간 겔로 전기영동했다. 이 겔을 서열결정 기기(Hoefer SQ3 Sequence)에서 3시간 동안 전개시켰다. 기기에서 겔을 꺼내어 Typhoon 9400 Variable Mode Imager로 스캔했다. 형광에 의해서 결합된 표지된 뉴클레오티드가 검출되었다. 각 밴드를 둘러싸도록 상자를 그리고, Typhoon 9400 Variable Mode Imager 소프트웨어를 사용하여 밴드의 강도를 계산했다.
도 17 A-F에 보이는 대로, 2개의 밴드가 보였다. 저분자량 밴드가 돌출부에 상보적인 위치 1에서 ddTTP로 채워진 DNA 분자에 해당했고, 고분자량 밴드는 돌출부에 상보적인 위치 3에서 ddTTP로 채워진 DNA 분자에 해당했다.
실험은 블라인드 방식으로 수행했다. 무슨 주형 DNA에 해당하는 시험관인지 알지 못하도록 시험관에 암호를 배정했다. 겔을 분석한 후, 각 시험관을 다음 카테고리로 분류했다: 정상 주형 DNA, 다운증후군 주형 DNA, 다운증후군 주형 DNA와정상 DNA의 3:1 혼합물, 정상 주형 DNA와 다운증후군 주형 DNA의 1:1 혼합물, 다운증후군 주형 DNA와 정상 주형 DNA의 1:2.3 혼합물, 그리고 다운증후군 DNA와 정상 주형 DNA의 1:4 혼합물. 각 PCR 반응에 대한 각 복제물은 적합한 카테고리로 성공적으로 분류되었으며, 이것은 총 DNA의 백분율이 아주 적은 경우에서도 이 방법을 사용하여 비정상 DNA를 검출할 수 있다는 것을 나타낸다.
정상 주형 DNA로부터, 세 PCR 반응에 대한 각 복제물에서 대립유전자 1에 대한 대립유전자 2의 백분율을 표 18에 나타낸다(또, 도 17A 참조). 대립유전자 1에 대한 대립유전자 2의 평균 백분율은 대립유전자 1과 대립유전자 2의 값의 합으로 대립유전자 2의 값을 나눔으로써 계산했으며(대립유전자 2/(대립유전자 1+대립유전자 2)), 그 결과는 평균 0.50025, 표준편차는 0.002897이었다. 따라서, 대립유전자 1과 대립유전자 2는 50:50의 비율로 존재했다. 밴드의 강도는 한 PCR 반응과 다른 PCR 반응에서 다를 수 있지만(반응 1과 반응 3을 비교, 한 PCR 반응 안에서의 강도 차이는 없었다. 더욱이, PCR 반응의 2개 복제물에서 얻어진 값은 매우 유사했다. 대부분의 변화는 PCR 반응들 간에 있었으며, 이것은 피펫 사용으로 인한 오차인 것 같았다.
다운증후군 주형 DNA로부터, 세 PCR 반응에 대한 각 복제물에서 대립유전자 1에 대한 대립유전자 2의 백분율을 표18에 나타낸다(또, 도 17B 참조). 대립유전자 1에 대한 대립유전자 2의 백분율은 대립유전자 1과 대립유전자 2의 값의 합으로 대립유전자 2의 값을 나눔으로써 계산했으며(대립유전자 2/대립유전자 1+대립유전자 2), 그 결과는 평균 0.301314, 표준편차는 0.012917이었다. 육안으로 겔을 분석하는 경우 조차도 대립유전자 2에 비해 대립유전자 1이 더 많은 복제수로 존재한다는 것이 분명하다(도 17B 참조). 다시 한 번, 대부분의 변화는 PCR 반응들 사이에서 발생했으며 한 PCR 반응의 복제물 안에서는 변화가 없었다. 대부분의 통계적 변동은 피펫 사용으로 인한 오차인 것 같았다.
단일 SNP의 분석이 염색체 이상성의 존재를 검출하는데 충분했다. SNP의 "p" 값을 알고 있고, 통계적 표본추출 오차가 분석에 도입되지 않도록 하는 충분한 수의 게놈이 있다면 한 개의 SNP로도 충분하다. 이 실험에서는 각 반응에서 대략 5,000개의 게놈이 있었다.
다운증후군 주형 DNA와 정상 주형 DNA의 3:1 혼합물로 구성된 반응은 정상 주형 DNA와도 그리고 다른 DNA 혼합물과도 분명히 구별되었다(도 17C 참조). 대립유전자 1 대 대립유전자 2의 계산된 백분율은 0.319089이고, 표준편차는 0.004346이었다(표18 참조). 마찬가지로, 다운증후군 주형 DNA와 정상 주형 DNA의 1:1 혼합물로 구성된 반응과 1:2.3 혼합물로 구성된 반응도 구별가능했으며(도 17D 및 17E 참조), 그 값은 다른 모든 반응으로부터 통계적으로 유의했다(표18 참조).
정상 주형 DNA의 양이 증가할수록 대립유전자 1 대 대립유전자 2의 백분율이 증가했다. 다운증후군 주형 DNA와 정상 주형 DNA의 1:4 혼합물에서, 대립유전자 1 대 대립유전자 2의 백분율은 0.397642였고, 표준편차는 0.001903이었다(도 17F 참조). 이 값과 정상 주형 DNA에서 얻어진 값의 차이는 통계적으로 유의하다. 따라서, 여기 설명된 방법은 샘플이 비정상 DNA의 상동성 샘플이 아닌 경우 조차도 염색체 이상성의 검출 허용한다.
상기 설명된 대로, 비정상적인 염색체 복제수를 갖는 DNA의 작은 단편의 존재가 정상 DNA가 많이 존재하는 중에서도 검출될 수 있다. 정상 DNA의 양이 증가하고 다운증후군 DNA의 양이 감소할수록 대립유전자 1과 2에 해당하는 밴드의 강도가 동등해졌다는 것이 육안으로도 분명했다.
상기 실시예는 21번 염색체 상에 위치한 SNP를 분석한 것이다. 그러나, 어떤 염색체 상의 어떤 SNP라도 분석될 수 있으며, 이것은 제한은 없지만 사람 염색체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X 및 Y, 그리고 태아 염색체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X 및 Y를 포함한다. 이에 더하여, 비-사람 유기체로부터의 염색체도 상기 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 어떤 염색체의 조합도 분석될 수 있다. 상기 실시예에서는 여분의 염색체가 검출되었다. 그러나, 같은 방법을 사용하여 1염색체성을 검출할 수도 있다.
실시예 12
상기 실시예 9에 논의된 대로, 이형접합성 SNP에서 대립유전자 2에 대한 대립유전자 1의 비율은 일정하다. 그러나, 대립유전자 1 대 대립유전자 2의 비에 영향을 미칠 수 있는 한 가지 요인은 적은 수의 게놈이다. 예를 들어, 40개의 게놈이 있는 경우에, 이것은 전체적으로 대립유전자 1의 40개 염색체와 대립유전자 2의 40개 염색체가 있다는 의미인데, 이런 경우에는, 프라이머가 대립유전자 1을 갖는 염색체 중 40개에 대해 어닐링할 수 있지만 대립유전자 2를 갖는 염색체 중에서는 단지 30개에 대해서만 어닐링할 수 있는 통계적 가능성이 있다. 이것은 대립유전자 2에 대한 대립유전자 1의 비율에 영향을 미칠 것이며, 특정 SNP에 대한 "p" 값에 오차를 일으킬 수 있는 영향을 미칠 수 있다.
전형적으로, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 PCR을 사용하는 전 게놈 증폭을 사용하여 게놈 DNA 샘플의 적은 양을 증가시킨다. 8, 10, 12 또는 14 염기의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 게놈을 증폭한다. 프라이머는 게놈 전체적으로 무작위로 어닐링한다고 생각되며, 적은 게놈 DNA 샘플을 게놈 분석을 위해 수 백 배 더 많은 DNA로 증폭할 것이다.
여기 설명된 방법은 전형적으로 전체 게놈이 관심의 대상이 아니라는 사실을 이용한다. 한 염색체 또는 복수 염색체나 전체 게놈을 나타내는 염색체들에 위치한 관심있는 특정한 유전자좌가 분석에 선택된다. 비록 관심있는 유전자좌가 전체 게놈에 대한 염색체들에 위치한다 할지라도, 관심있는 유전자좌를 함유하는 염색체들의 영역을 증폭하는 것이 바람직하다.
임신한 여성의 혈장으로부터 얻은 태아 DNA에서 주로 보여지는 소수 게놈의 한계를 극복하기 위해서, 다중 방법을 사용하여 게놈의 수를 증가시킬 수 있다. 아래 설명된 방법이 관심있는 유전자좌를 함유하는 염색체 또는 염색체들을 바람직하게 증폭한다.
주형 DNA의 제조
사람 지원자로부터 동의서를 제출받은 후 혈액 샘플 9ml를 멸균 관(Fischer Scientific, 9ml EDTA Vacuette 관, 카탈로그 번호 NC9897284)에 채취했다. 이 관을 1000rpm에서 10분 동안 회전시켰다. 각 샘플의 상청액(혈장)을 제거하고, 통상 '버피-코트'라 하는 잔류한 혈액 샘플 1ml를 새로운 관으로 옮겼다. 1x PBS 1ml를 각 샘플에 가했다. QIAGEN에 의해 제공된 QIAmp DNA 혈액 미디키트(카탈로그 번호 51183)를 사용하여 주형 DNA를 분리했다.
다중 프라이머 디자인
21번 염색체 상의 다양한 영역을 어닐링하도록 프라이머를 디자인하여 염색체 21에 위치된 관심있는 유전자좌의 복제수를 증가시켰다. 프라이머는 12개 염기 길이였다. 그러나, 어떤 길이의 프라이머라도 사용될 수 있으며, 제한은 없지만 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36-45, 46-55, 56-65, 66-75, 76-85, 86-95, 96-105, 106-115, 116-125, 그리고 125개 염기 이상을 포함한다. 프라이머는 센스 가닥과 안티센스 가닥을 모두 어닐링하도록 디자인했다.
21번 염색체에 위치된 9개의 SNP를 분석했다:
TSC0397235, TSC0470003, TSC1649726, TSC1261039, TSC0310507, TSC1650432, TSC1335008, TSC0128307, 및 TSC0259757.
어떤 수의 SNP도 분석될 수 있으며, 이것은 제한은 없지만 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, 91-100, 101-200, 201-300, 301-400, 401-500, 501-600, 601-700, 701-800, 801-900, 901-1000, 1001-2000, 2001-3000, 3001-4000, 4001-5000, 5001-6000, 6001-7000, 7001-8000, 8001-9000, 9001-10,000, 그리고 10,000 이상을 포함한다.
9개의 SNP 각각에 대해서, 12개 염기 프라이머를 관심있는 유전자좌의 상류 약 130개 염기를 어닐링하도록 디자인했고, 12개 염기 프라이머를 관심있는 유전자좌의 하류 약 130개 염기를 어닐링하도록 디자인했다(여기서 다중 프라이머라고 한다). 이 다중 프라이머는 관심있는 유전자좌로부터 어떤 거리에서 어닐링하도록 디자인될 수 있으며, 이것은 제한은 없지만 10-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, 91-100, 101-110, 111-120, 121-130, 131-140, 141-150, 151-160, 161-170, 171-180, 181-190, 191-200, 201-210, 211-220, 221-230, 231-240, 241-250, 251-260, 261-270, 271-280, 281-290, 291-300, 301-310, 311-320, 321-330, 331-340, 341-350, 351-360, 361-370, 371-380, 381-390, 391-400, 401-410, 411-420, 421-430, 431-440, 441-450, 451-460, 461-470, 471-480, 481-490, 491-500, 501-600, 601-700, 701-800, 801-900, 901-1000, 1001-2000, 2001-3000, 3001-4000, 4001-5000, 그리고 5000개 염기 이상을 포함한다. 이에 더하여, 1개의 SNP에 대해 한 세트 이상의 다중 프라이머가 사용될 수 있으며, 제한은 없지만 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 21-30, 31-40, 41-50, 그리고 50 이상을 포함한다.
이에 더하여, 91개 세트의 정방향과 역방향 프라이머를 사용하여 21번 염색체의 다른 영역을 증폭할 수 있으며, 이 때 프라이머의 총 세트는 100 세트이다(반응 당 200 프라이머). 이들 91개 프라이머 세트를 사용하여, 단일 반응에서 다수의 비-특이적 밴드의 발생 없이 다수의 프라이머가 사용될 수 있다는 것을 증명했다. 반응에는 어떤 수의 프라이머라도 사용될 수 있으며, 제한은 없지만 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, 91-100, 101-200, 201-300, 301-400, 401-500, 501-600, 601-700, 701-800, 801-900, 901-1000, 1001-2000, 2001-3000, 3001- 4000, 4001-5000, 5001-6000, 6001-7000, 7001-8000, 8001-9000, 9001-10,000, 10,001-20,000, 20,001-30,000, 그리고 30,000개 이상을 포함한다.
다중 프라이머들은 프라이머의 3' 단부에 동일한 뉴클레오티드를 갖도록 디자인되었다. 이 경우 다중 프라이머는 "AA"로 종결되었고, 여기서 AA는 아데닌을 나타낸다. 프라이머는 프라이머-2량체 형성을 최소화하는 방식으로 디자인되었다. 그러나, 프라이머는 어떤 뉴클레오티드로도 종결될 수 있는데, 이것은 제한은 없지만 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 아데닌과 구아닌의 어떤 조합, 아데닌과 시토신의 어떤 조합, 아데닌과 티미딘의 어떤 조합, 구아닌과 시토신의 어떤 조합, 구아닌과 티미딘의 어떤 조합, 또는 시토신과 티미딘의 어떤 조합을 포함한다. 이에 더하여, 다중 프라이머는 3' 단부에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 1개 이상의 동일한 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
SNP TSC0397235에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머: 5' CAAGTGTCCTAA 3'
역방향 프라이머: 5' CAGCTGCTAGAA 3'
SNP TSC0470003에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머: 5' GGTTGAGGGCAA 3'
역방향 프라이머: 5' CACAGCGGGTAA 3'
SNP TSC1649726에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머: 5' TTGACTTTTTAA 3'
역방향 프라이머: 5' ACAGAATGGGAA 3'
SNP TSC1261039에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머: 5' TGCAGGTCACAA 3'
역방향 프라이머: 5' TTCTTCTTATAA 3'
SNP TSC0310507에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머: 5' AGGACAACCTAA 3'
역방향 프라이머: 5' TGGTGTTCAGAA 3'
SNP TSC1650432에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머: 5' TCAGCATATGAA 3'
역방향 프라이머: 5' GTTGCCACACAA 3'
SNP TSC1335008에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머: 5' CCCAGCTAGCAA 3'
역방향 프라이머: 5' GGGTCACTGTAA 3'
SNPTSC0128307에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머: 5' TTAAATACCCAA 3'
역방향 프라이머: 5' TTAGGAGGTTAA 3'
SNP TSC0259757에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머: 5' ACACAGAATCAA 3'
역방향 프라이머: 5' CGCTGAGGTCAA 3'
21번 염색체에 따르는 다양한 영역에 대해 어닐링하는 91개의 추가 프라이머 세트를 반응에 포함시켰다:
세트 1:
정방향 프라이머: 5' AAGTAGAGTCAA 3'
역방향 프라이머: 5' CTTCCCATGGAA 3'
세트 2:
정방향 프라이머: 5' TTGGTTATTAAA 3'
역방향 프라이머: 5' CAACTTACTGAA 3'
세트 3:
정방향 프라이머: 5' CACTAAGTGAAA 3'
역방향 프라이머: 5' CTCACCTGCCAA 3'
세트 4:
정방향 프라이머: 5' ATGCATATATAA 3'
역방향 프라이머: 5' AGAGATCAGCAA 3'
세트 5:
정방향 프라이머: 5' TATATTTTTCAA 3'
역방향 프라이머: 5' CAGAAAGCAGAA 3'
세트 6:
정방향 프라이머: 5' GTATTGGGTTAA 3'
역방향 프라이머: 5' CTGACCCAGGAA 3'
세트 7:
정방향 프라이머: 5' CAGTTTTCCCAA 3'
역방향 프라이머: 5' AGGGCACAGGAA 3'
세트 8:
정방향 프라이머: 5' GTATCAGAGGAA 3'
역방향 프라이머: 5' GCATGAAAAGAA 3'
세트 9:
정방향 프라이머: 5' GATTTGACAGAA 3'
역방향 프라이머: 5'TACAGTTTACAA 3'
세트 10:
정방향 프라이머: 5' TGTGATTTTTAA 3'
역방향 프라이머: 5' TTATGTTCTCAA 3'
세트 11:
정방향 프라이머: 5' CAAGTACTTGAA 3'
역방향 프라이머: 5' CTTGTGTGGCAA 3'
세트 12:
정방향 프라이머: 5' AGACTTCTGCAA 3'
역방향 프라이머: 5' GTTGTCTTTCAA 3'
세트 13:
정방향 프라이머: 5' GGGACACTCCAA 3'
역방향 프라이머: 5' ATTATTATTCAA 3'
세트 14:
정방향 프라이머: 5' ACATGATGACAA 3'
역방향 프라이머: 5' TCAATTATAGAA 3'
세트 15:
정방향 프라이머: 5' CTATGGGCTGAA 3'
역방향 프라이머: 5' TGTGTGCCTGAA 3'
세트 16:
정방향 프라이머: 5' CCATTTGTTGAA 3'
역방향 프라이머: 5' TCTCCATCAAAA 3'
세트 17:
정방향 프라이머: 5' AATGCTGACAAA 3'
역방향 프라이머: 5' TTTCATGTCCAA 3'
세트 18:
정방향 프라이머: 5' GGCCTCTTGGAA 3'
역방향 프라이머: 5' TCATTTTTTGAA 3'
세트 19:
정방향 프라이머: 5' GGACTACCATAA 3'
역방향 프라이머: 5' AGTCACTCAGAA 3'
세트 20:
정방향 프라이머: 5' CCTTGGCAGGAA 3'
역방향 프라이머: 5' TTTCTGGTAGAA 3'
세트 21:
정방향 프라이머: 5' CCCCCCCCCGAA 3'
역방향 프라이머: 5' GCCCAGGCAGAA 3'
세트 22:
정방향 프라이머: 5' GAATGCGAAGAA 3'
역방향 프라이머: 5' TTAGGTAGAGAA 3'
세트 23:
정방향 프라이머: 5' TGCTTTGGTCAA 3'
역방향 프라이머: 5' GCCCATTAATAA 3'
세트 24:
정방향 프라이머: 5' TGAGATCTTTAA 3'
역방향 프라이머: 5' CAGTTTGTTCAA 3'
세트 25:
정방향 프라이머: 5' GCTGGGCAAGAA 3'
역방향 프라이머: 5' AGTCAAAGTCAA 3'
세트 26:
정방향 프라이머: : 5' TCTCTGCAGTAA 3'
역방향 프라이머: 5' TGAATAACTTAA 3'
세트 27:
정방향 프라이머: 5' CGGTTAGAAAAA 3'
역방향 프라이머: 5' CATCCCTTTCAA 3'
세트 28:
정방향 프라이머: 5' TCTCTTTCTGAA 3'
역방향 프라이머: 5' CTCAGATTGTAA 3'
세트 29:
정방향 프라이머: 5' TTTGCACCAGAA 3'
역방향 프라이머: 5' GGTTAACATGAA 3'
세트 30:
정방향 프라이머: 5' ATTATCAACTAA 3'
역방향 프라이머: 5' GCCATTTTGTAA 3'
세트 31:
정방향 프라이머: 5' GATCTAGATGAA 3'
역방향 프라이머: 5' TTAATGTATTAA 3'
세트 32:
정방향 프라이머: 5' CTAGGGAGACAA 3'
역방향 프라이머: 5' TGGAGGAGACAA 3'
세트 33:
정방향 프라이머: 5' CATCACATTTAA 3'
역방향 프라이머: 5' GGGGTCCTGCAA 3'
세트 34:
정방향 프라이머: 5' CAGTTGTGCTAA 3'
역방향 프라이머: 5' TCTGCAGCCTAA 3'
세트 35:
정방향 프라이머: 5' GAGTCATTTAAA 3'
역방향 프라이머: 5' TCTATGGATTAA 3'
세트 36:
정방향 프라이머: 5' CAAAAAGTAGAA 3'
역방향 프라이머: 5' AATATACTCCAA 3'
세트 37:
정방향 프라이머: 5' CGTCCAGCACAA 3'
역방향 프라이머: 5' GGATGGTGAGAA 3'
세트 38:
정방향 프라이머: 5' TCTCCTTTGTAA 3'
역방향 프라이머: 5' TCGTTATTTCAA 3'
세트 39:
정방향 프라이머: 5' GATTTTATAGAA 3'
역방향 프라이머: 5' AGACATAAGCAA 3'
세트 40:
정방향 프라이머: 5' TTCACCTCACAA 3'
역방향 프라이머: 5' GGATTGCTTGAA 3'
세트 41:
정방향 프라이머: 5' ACTGCATGTGAA 3'
역방향 프라이머: 5' TTTATCACAGAA 3'
세트 42:
정방향 프라이머: 5' TCAGTAACACAA 3'
역방향 프라이머: 5' TACATCTTTGAA 3'
세트 43:
정방향 프라이머: 5' TTGTTTCAGTAA 3'
역방향 프라이머: 5' TATGAGCATCAA 3'
세트 44:
정방향 프라이머: 5' CTCAGCAGGCAA 3'
역방향 프라이머: 5' ACCCCTGTATAA 3'
세트 45:
정방향 프라이머: 5' TCTGCTCAGCAA 3'
역방향 프라이머: 5' GTTCTTTTTTAA 3'
세트 46:
정방향 프라이머: 5' GTGATAATCCAA 3'
역방향 프라이머: 5' GAGCCCTCAGAA 3'
세트 47:
정방향 프라이머: 5' TTTATTGGTTAA 3'
역방향 프라이머: 5' GGTACTGGGCAA 3'
세트 48:
정방향 프라이머: 5' AGTGTTTTTCAA 3'
역방향 프라이머: 5' TGTTATTGGTAA 3'
세트 49:
정방향 프라이머: 5' GCGCATTCACAA 3'
역방향 프라이머: 5' AAACAAAAGCAA 3'
세트 50:
정방향 프라이머: 5' TATATGATAGAA 3'
역방향 프라이머: 5' TCCCAGTTCCAA 3'
세트 51:
정방향 프라이머: 5' AAAGCCCATAAA 3'
역방향 프라이머: 5' TGTCATCCACAA 3'
세트 52:
정방향 프라이머: 5' TTGTGAATGCAA 3'
역방향 프라이머: 5' GTATTCATACAA 3'
세트 53:
정방향 프라이머: 5' TGACATAGGGAA 3'
역방향 프라이머: 5' AGCAAATTGCAA 3'
세트 54:
정방향 프라이머: 5' AGTAGATGTTAA 3'
역방향 프라이머: 5' AAAAGATAATAA 3'
세트 55:
정방향 프라이머: 5' ACCTCATGGGAA 3'
역방향 프라이머: 5' TGGTCGACCTAA 3'
세트 56:
정방향 프라이머: 5' TTTGCATGGTAA 3'
역방향 프라이머: 5' GCGGCTGCCGAA 3'
세트 57:
정방향 프라이머: 5' TCAGGAGTCTAA 3'
역방향 프라이머: 5' GCCTACCAGGAA 3'
세트 58:
정방향 프라이머: 5' ATCTTCTGTTAA 3'
역방향 프라이머: 5' AGGTAAGGACAA 3'
세트 59:
정방향 프라이머: 5' TGCTTTGAGGAA 3'
역방향 프라이머: 5' AACAGTTTTAAA 3'
세트 60:
정방향 프라이머: 5' TTAAATGTTTAA 3'
역방향 프라이머: 5' ATAGAAAATCAA 3'
세트 61:
정방향 프라이머: 5' GTGTTGTGTTAA 3'
역방향 프라이머: 5' GAGGACCTCGAA 3'
세트 62:
정방향 프라이머: 5' AGAGGCTGAGAA 3'
역방향 프라이머: 5' GGTATTTATTAA 3'
세트 63:
정방향 프라이머: 5' ATTTATCTGGAA 3'
역방향 프라이머: 5' AGTGCAAACTAA 3'
세트 64:
정방향 프라이머: 5' TGAACACCTTAA 3'
역방향 프라이머: 5' AATTTTTTCTAA 3'
세트 65:
정방향 프라이머: 5' TTACTATTATAA 3'
역방향 프라이머: 5' TGCTATAGTGAA 3'
세트 66:
정방향 프라이머: 5' TGGACTATGGAA 3'
역방향 프라이머: 5' CTGCAGTCCGAA 3'
세트 67:
정방향 프라이머: 5' GCTACTGCCCAA 3'
역방향 프라이머: 5' TCACATGGTGAA 3'
세트 68:
정방향 프라이머: 5' GTGGCTCTGGAA 3'
역방향 프라이머: 5' GAATTCCATTAA 3'
세트 69:
정방향 프라이머: 5' TGGGGTGTCCAA 3'
역방향 프라이머: 5' GCAAGCTCCGAA 3'
세트 70:
정방향 프라이머: 5' ATGTTTTTTCAA 3'
역방향 프라이머: 5' AGATCTGTTGAA 3'
세트 71:
정방향 프라이머: 5' AAGTGCTGTGAA 3'
역방향 프라이머: 5' ACTTTTTTGGAA 3'
세트 72:
정방향 프라이머: 5' AATCGGCAGGAA 3'
역방향 프라이머: 5' GGCATGTCACAA 3'
세트 73:
정방향 프라이머: 5' AGGAAGAAAGAA 3'
역방향 프라이머: 5' CAGTTTCACCAA 3'
세트 74:
정방향 프라이머: 5' CACAGAATTTAA 3'
역방향 프라이머: 5' AAGAATAAGTAA 3'
세트 75:
정방향 프라이머: 5' GGGATAGTACAA 3'
역방향 프라이머: 5' TTCCCATGATAA 3'
세트 76:
정방향 프라이머: 5' TGATTAGTTGAA 3'
역방향 프라이머: 5' GCATTCAGTGAA 3'
세트 77:
정방향 프라이머: 5' AGGGAATATTAA 3'
역방향 프라이머: 5' GACCTTAGGTAA 3'
세트 78:
정방향 프라이머: 5' TTCTTTTCACAA 3'
역방향 프라이머: 5' CCAAACTAAGAA 3'
세트 79:
정방향 프라이머: 5' GTGCTCTTAGAA 3'
역방향 프라이머: 5' ATGAGTTTAGAA 3'
세트 80:
정방향 프라이머: 5' ATGAGCATAGAA 3'
역방향 프라이머: 5' GACAAATGAGAA 3'
세트 81:
정방향 프라이머: 5' AAACCCAGAGAA 3'
역방향 프라이머: 5' CCTCACACAGAA 3'
세트 82:
정방향 프라이머: 5' CACACTGTGGAA 3'
역방향 프라이머: 5' CACTGTACCCAA 3'
세트 83:
정방향 프라이머: 5' GTAGTATTTCAA 3'
역방향 프라이머: 5' TGGATACACTAA 3'
세트 84:
정방향 프라이머: 5' CCCATGATTCAA 3'
역방향 프라이머: 5' TCATAGGAGGAA 3'
세트 85:
정방향 프라이머: 5' AGGAAAGAGAAA 3'
역방향 프라이머: 5' ATATGGTGATAA 3'
세트 86:
정방향 프라이머: 5' GATGCCATCCAA 3'
역방향 프라이머: 5' ATACTATTTCAA 3'
세트 87:
정방향 프라이머: 5' GTGTGCATGGAA 3'
역방향 프라이머: 5' AGGTGTTGAGAA 3'
세트 88:
정방향 프라이머: 5' CAGCCTGGGCAA 3'
역방향 프라이머: 5' GGAGCTCTACAA 3'
세트 89:
정방향 프라이머: 5' AACTAAGGTTAA 3'
역방향 프라이머: 5' AACTTATGTTAA 3'
세트 90:
정방향 프라이머: 5' ATCTCAACAGAA 3'
역방향 프라이머: 5' TAACAATGTGAA 3'
세트 91:
정방향 프라이머: 5' AAGGATCAGGAA 3'
역방향 프라이머: 5' CTCAAGTCTTAA 3'
다중 PCR
중합효소 연쇄반응(PCR, 여기 참고자료로 수록된 미국특허 No. 4,683,195 및 4,683,202)을 사용하여 SNP TSC0397235, TSC0470003, TSC1649726, TSC1261039, TSC 0310507, TSC1650432, TSC1335008, TSC0128307, 및 TSC0259757를 둘러싼 21번 염색체 상의 영역들을 주형 게놈 DNA로부터 증폭했다. 이 PCR 반응은 관심있는 유전자좌의 상류 및 하류에서 대략 130개 염기를 어닐링하는 프라이머를 사용했다. 그것을 사용하여 관심있는 유전자좌의 복제수를 증가시켜 소수의 게놈으로 인해 생길 수 있는 어떤 오차를 제거했다.
특이성을 증가시키기 위해 "핫-스타트" PCR을 사용했다. PCR 반응을 QIAGEN에 의해 제공된 HotStarTaq Master Mix 키트(카탈로그 번호 203443)을 사용하여 수행했다. 반응 당 주형 DNA와 프라이머의 양은 관심있는 각 유전자좌에 맞게 최적화될 수 있다. 이 실시예에서는 주형 사람 게놈 DNA 15ng과 각 프라이머 5μM를 사용했다.
5mM 농도의 정방향 및 역방향 프라이머 각 2㎕씩을 한 개의 미소 원심분리관에 모아서 혼합했다. 이 프라이머 혼합물 8㎕를 총 40㎕(주형 DNA 1.5㎕, 멸균수 10.5㎕, 프라이머 혼합물 8㎕, 그리고 HotStar Taq 20㎕)의 PCR 반응 부피에 사용했다. PCR을 25사이클 수행했다. 아래의 PCR 조건을 사용했다:
(1) 15분간 95℃;
(2) 30초간 95℃;
(3) 30초간 4℃;
(4) 30초간 37℃;
(5) 2 단계에서 4단계를 24회 반복;
(9) 10분간 72℃.
변성, 어닐링 및 확장의 온도와 시간은 다양한 설정들을 시도해 보고 최상의 결과를 제공하는 변수들을 사용함으로써 최적화될 수 있다.
관심있는 단편의 정제
Qiagen MinElut PCR 정제 키트(Qiagen, 카탈로그 번호 28004)를 사용하여 반응으로부터 과잉의 프라이머와 뉴클레오티드를 제거했다. 반응은 칼럼과 함께 제공된 제조자의 설명서에 따라서 수행했다. DNA를 멸균수 100㎕로 용출했다.
PCR 반응 2회
SNP TSC0397235를 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' CGGTAAATCGGAGAATTCAAGTTGAGGCATGCATCCAT 3'
제 2 프라이머: 5' TCGGGGCTCAGCGGGACCACAGCCACTCC 3'
제 1 프라이머는 5' 단부에 비오틴 태그와 제한효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유했고, 관심있는 유전자좌로부터 103개 염기를 어닐링하도록 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유했다.
SNP TSC0470003를 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' GTAGCCACTGGTGAATTCGTGCCATCGCAAAAGAATAA 3'
제 2 프라이머: 5' ATTAGAATGATGGGGACCCCTGTCTTCCC 3'
제 1 프라이머는 5' 단부에 비오틴 태그와 제한효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유했으며, 관심있는 유전자좌로부터 80개 염기를 어닐링하도록 디자인되었다.제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유했다.
SNP TSC1649726를 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' ACGCATAGGAAGGAATTCATTCTGACACGTGTGAGATA 3'
제 2 프라이머: 5' GAAATTGACCACGGGACTGCACACTTTTC 3'
제 1 프라이머는 5' 단부에 비오틴 태그와 제한효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유했고, 관심있는 유전자좌로부터 113개 염기를 어닐링하도록 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유했다.
SNP TSC1261039를 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' CGGTAAATCGGAGAATTCAAGTTGAGGCATGCATCCAT 3'
제 2 프라이머: 5' TCGGGGCTCAGCGGGACCACAGCCACTCC 3'
제 1 프라이머는 5' 단부에 비오틴 태그와 제한효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유했으며, 관심있는 유전자좌로부터 54개 염기를 어닐링하도록 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유했다.
SNP TSC0310507를 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' TCTATGCACCACGAATTCAATATGTGTTCAAGGACATT 3'
제 2 프라이머: 5' TGCTTAATCGGTGGGACTTGTAATTGTAC 3'
제 1 프라이머는 5' 단부에 비오틴 태그와 제한효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유했으며, 관심있는 유전자좌로부터 93개 염기를 어닐링하도록 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유했다.
SNP TSC1650432를 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' CGCGTTGTATGCGAATTCCCTGGGGTATAAAGATAAGA 3'
제 2 프라이머: 5' CTCACGGGAACTGGGACACCTGACCCTGC 3'
제 1 프라이머는 5' 단부에 비오틴 태그와 제한효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유했고, 관심있는 유전자좌로부터 180개 염기를 어닐링하도록 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유했다.
SNP TSC1335008를 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' GTCTTGCCGCTTGAATTCCCATAGAAGAATGCGCCAAA 3'
제 2 프라이머: 5' TTGAGTAGTACAGGGACACACTAACAGAC 3'
제 1 프라이머는 5' 단부에 비오틴 태그와 제한효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유했으며, 관심있는 유전자좌로부터 94개 염기를 어닐링하도록 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유했다.
SNP TSC0128307을 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' AATACTGTAGGTGAATTCTTGCCTAAGCATTTTCCCAG 3'
제 2 프라이머: 5' GTGTTGACATTCGGGACTGTAATCTTGAC 3'
제 1 프라이머는 5' 단부에 비오틴 태그와 제한효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유했으며, 관심있는 유전자좌로부터 54개 염기를 어닐링하도록 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유했다.
SNP TSC0259757을 아래의 프라이머 세트를 사용하여 증폭했다:
제 1 프라이머: 5' TCTGTAGATTCGGAATTCTTTAGAGCCTGTGCGCTGAG 3'
제 2 프라이머: 5' CGTACCAGTACAGGGACGCAAACTGAGAC 3'
제 1 프라이머는 5' 단부에 비오틴 태그와 제한효소 EcoRI에 대한 인식 부위를 함유했고, 관심있는 유전자좌로부터 100개 염기를 어닐링하도록 디자인되었다. 제 2 프라이머는 제한효소 BsmF I에 대한 인식 부위를 함유했다.
모든 관심있는 유전자좌를 중합효소 연쇄반응(PCR, 여기 참고자료로 수록된 미국특허 No. 4,683,195 및 4,683,202)을 사용하여 주형 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 이 실시예에서는 관심있는 유전자좌를 별개의 반응관에서 증폭했지만, 그들은 단일 PCR 반응에서 함께 증폭될 수도 있다. 특이성을 증가시키기 위해서 "핫-스타트" PCR을 사용했다. PCR 반응을 QIAGEN에 의해 제공된 HotStarTaq Master Mix 키트(카탈로그 번호 203443)을 사용하여 수행했다.
다중 반응으로부터의 용출물(MinElute 칼럼으로부터 용출된 PCR 생산물) 1㎕를 각 PCR 반응의 주형 DNA로서 사용했다. 다중 샘플을 주형으로서 사용했을 때는 각 SNP를 3배로 증폭시켰다. 대조군으로서 각 SNP를 원 주형 DNA(다중 반응을 겪지 않은 DNA) 15ng으로부터 증폭시켰다. 반응 당 주형 DNA와 프라이머의 양은 관심있는 각 유전자좌에 맞게 최적화될 수 있으며, 이 실시예에서는 각 프라이머 5μM를 사용했다. PCR 40사이클을 수행했다. 아래의 PCR 조건을 사용했다:
(1) 15분 15초간 95℃;
(2) 30초간 37℃;
(3) 30초간 95℃;
(4) 30초간 57℃;
(5) 30초간 95℃;
(6) 30초간 64℃;
(7) 30초간 95℃;
(8) 6 단계와 7단계를 39회 반복;
(9) 5분간 72℃.
첫번째 PCR 사이클에서 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 3' 어닐링 영역의 용융 온도였으며 이것은 37℃였다. 두번째 PCR 사이클에서 어닐링 온도는 대략 제 1 프라이머의 주형 DNA에 대해 어닐링하는 3' 영역의 용융 온도였으며 이것은 57℃였다. 세번째 PCR 사이클에서 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 전 서열의 용융 온도였으며 이것은 64℃였다. 나머지 사이클의 용융 온도는 64℃였다. 처음 3번의 PCR 사이클에서 어닐링 온도를 TM1에서 TM2로 다시 TM3으로 단계적으로 올리는 것은 특이성을 크게 증가시킨다. 이들 어닐링 온도는 대표적인 것이며, 당업자는 각 사이클의 어닐링 온도가 사용된 특정방향 프라이머에 의존한다는 것을 이해할 것이다.
변성, 어닐링 및 확장의 온도와 시간은 다양한 설정들을 시도해 보고 최상의 결과를 제공하는 변수들을 사용함으로써 최적화될 수 있다.
아가로스 겔 분석
원 주형 DNA로부터의 각 SNP에 대해서 20㎕ PCR 반응물 중 4㎕씩을 아가로스 겔 전기영동으로 분석했다(도 18A 참조). 다중 주형으로부터 증폭된 각 SNP에 대해서도 20㎕ PCR 반응물 중 4㎕씩을 아가로스 겔 전기영동으로 분석했다(도 18B 참조).
도 18A에서 보여진 대로, 원 주형 DNA로부터 증폭된 SNP 9개 중 8개에 대해서, 높은 강도의 단일 밴드가 보였다(레인 1-3, 및 5-9). 이 밴드는 8개 SNP의 각각에 맞는 정확한 위치로 이동했다. 원 주형 DNA로부터의 TSC1261039의 증폭은 높은 강도의 밴드와 저분자량의 희미한 밴드(레인 4)를 생성했는데, 높은 강도의 밴드는 정확한 위치로 이동했다. 단지 2개의 밴드만 보였으며, 이 밴드들은 분자량을 기준으로 분명히 구별될 수 있었다. 여기 설명된 PCR 방법은 관심있는 유전자좌의 어떤 농축이나 부화 없이 게놈 DNA로부터 관심있는 유전자좌의 깨끗한 증폭을 허용한다.
도 18B에서 보여진 대로, 다중 주형 DNA로부터 SNP TSC0397235, TSC0470003, TSC0310507 및 TSC0128307를 증폭하는데 사용된 프라이머가 높은 강도의 단일 밴드를 생성했고, 이것은 정확한 위치로 이동했다(레인 1, 2, 5, 및 8). 다중 반응이 200개의 프라이머를 함유했다는 사실에도 불구하고 추가의 밴드는 도입되지 않았다. 이 다중 프라이머는 12개 염기 길이였고, 21번 염색체 상에 위치된 것들 이외의 다른 추가 서열들에 대해 어닐링했을 가능성이 있는데, 이 밴드는 2차 PCR 반응에서 증폭되지 않았기 때문에 생성물은 보이지 않았다. 2차 PCR 반응은 관심있는 유전자좌에 특이적인 프라이머와 비대칭 올리고뉴클레오티드를 사용했고, 어닐링 온도를 단계적으로 확대하여 게놈으로부터 특이적 증폭을 허용했다(실시예 1 참조).
다중 주형 DNA로부터 TSC1649726의 증폭은 1개의 높은 강도를 갖는 밴드와 2개의 약한 밴드를 생성했으며, 이들은 분자량을 기준으로 분명히 구별될 수 있었다(도 18B 레인 3 참조). 다중 주형 DNA로부터 TSC1261039의 증폭은 정확한 분자량의 높은 강도의 밴드와 저분자량의 희미한 밴드를 생성했다(도 18B 레인 4 참조). 저 분자량 밴드는 원 주형 DNA로부터 TSC1261039의 증폭에서 보였던 밴드와 동일한 크기였다(도 18A 레인4와 도 18B 레인 4를 비교). 따라서, 다중 주형 DNA에서 TSC1261039의 증폭은 어떤 추가의 비-특이적인 밴드들을 도입하지 않았다.
다중 주형 DNA로부터 SNP TSC1650432, TSC1335008 및 TSC0259757의 증폭은 1개의 높은 강도의 밴드와 1개의 약한 밴드를 생성했는데, 높은 강도의 밴드는 정확한 위치로 이동했다(레인 6, 7, 및 9). SNP TSC1650432와 TSC0259757에서 약한 밴드는 저분자량을 가졌고, 관심있는 밴드와 분명히 구별될 수 있었다(도 18B 레인 6 및 9 참조). SNP TSC1335008에서 약한 밴드는 약간 더 높은 분자량을 가졌다. 그러나, 원 주형 DNA로부터의 TSC1335008의 증폭 생성물과 비교함으로써 정확한 밴드가 확인될 수 있다(도 18A 레인 7과 도 18B 레인 7을 비교). 또, PCR 조건은 TSC1335008에 맞게 최적화될 수 있다. 모든 9개의 SNP는 정확하게 동일한 조건하에서 증폭되었고, 증폭된 SNP들에 대해서 분명히 구별될 수 있는 밴드들을 생성했다.
관심있는 단편의 정제
PCR 생산물을 게놈 주형 DNA로부터 분리했다. Roche Diagnostics GmbH의 투명한 고결합성 플레이트인 스트렙타웰(Roche Molecular Biochemical, 2001 생화학제품 카탈로그에 기재된, 카탈로그 번호 1 645 692)의 웰에 PCR 반응물의 반을 옮겼다. 제 1 프라이머는 PCR 생산물이 스트렙타비딘 코팅된 웰에 결합되도록 하는한편 게놈 주형 DNA는 결합되지 않도록 하는 5' 비오틴 태그를 함유했다. 스트렙타비딘 결합 반응을 37℃에서 20분 동안 1000rpm에서 써모믹서(Eppendorf)를 사용하여 수행했다. 각 웰을 흡인하여 미결합 물질을 제거하고, 부드럽게 혼합하면서 1x PBS로 3회 세척했다(Kandpal 등, Nucl.Acids Res. 18:1789-1795 (1990); Kaneoka 등, Biotechniques 10:30-34 (1991); Green 등, Nucl.Acids Res. 18:6163-6164 (1990)).
분리된 단편의 제한효소 절단
정제된 PCR 생산물을 제 2 프라이머로부터 PCR 생산물로 결합된 인식 부위에 결합하는 제한효소 BsmF I로 절단했다. 절단은 제한효소와 함께 제공된 설명서에 따라서 스트렙타웰에서 수행했다. 절단 후 웰을 PBS로 3회 세척하여 절단된 단편을 제거했다.
표지된 뉴클레오티드의 결합
BsmF I로의 제한효소 절단은 5' 돌출부를 갖는 DNA 단편을 제공했으며, 이것은 관심있는 SNP 부위 또는 유전자좌와 3' 함몰 단부를 함유했다. 5' 돌출부는 DNA 중합효소의 존재하에서 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 결합을 허용하는 주형으로서 기능했다.
실시예 6에 상세히 논의된 대로, SNP의 두 대립유전자의 서열은 한 표지되지 않은 뉴클레오티드의 존재하에서 나머지 하나의 표지된 뉴클레오티드로 결정될 수 있다. 다음의 성분을 각 채우기 반응에 첨가하였다: 형광 표지된 ddGTP 1㎕, 표지되지 않은 ddNTP 0.5㎕(40μM)(이것은 구아닌을 제외한 모든 뉴클레오티드를 함유했다), 10x 시퀘나제 완충액 2㎕, 시퀘나제 0.25㎕ 그리고 20㎕ 반응에 필요한 물. 각 채우기 반응을 40℃에서 10분 동안 수행했다. 비-형광 표지된 ddNTP는 Fermentas Inc.(Hanover MD)에서 구입했으며, 다른 표지화 시약들은 모두 Amersham(US 79565, Thermo Sequenase Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit)에서 얻었다.
표지화 후, 각 스트렙타웰을 1x PBS(100㎕)로 3회 헹궜다. 다음에, 효소와 함께 제공된 제조자의 설명서에 따라서, 제한효소 EcoRI로의 절단에 의해 "채워진" DNA 단편을 스트렙타웰로부터 방출시켰다. 절단은 37℃에서 1시간 동안 120rpm으로 흔들면서 수행했다.
관심있는 유전자좌의 검출
36cm 5% 아크릴아미드(요소) 겔(BioWhittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, 카탈로그 번호 50691)에 샘플을 로딩했다. 샘플을 3000볼트에서 3분간 겔로 전기영동했다. 이 겔을 서열결정 기기(Hoefer SQ3 Sequence)에서 3시간 동안 전개시켰다. 기기에서 겔을 꺼내어 Typhoon 9400 Variable Mode Imager로 스캔했다. 형광에 의해서 결합된 표지된 뉴클레오티드가 검출되었다. 각 밴드를 둘러싸도록 상자를 그리고, ImageQuant 소프트웨어를 사용하여 밴드의 강도를 계산했다.
아래에, BsmF I로 절단한 후의 TSC0470003에 대한 5' 돌출부가 도시된다:
5' CTCT
3' GAGA R A C C
돌출부 위치 1 2 3 4
TSC0470003에서 관찰된 뉴클레오티드들은 센스 가닥(여기서는 상부 가닥으로 나타냄) 상의 아데닌과 구아닌이다. 돌출부의 제 3 위치는 시토신에 해당하며, 이것은 구아닌에 상보한다. 표지된 ddGTP를 표지되지 않은 dATP, dCTP 및 dTTP의 존재하에 사용했다. 채우기 반응 후의 DNA 분자가 아래에 도시된다:
대립유전자 1 5' CTCTG*
3' GAGA C A C C
돌출부 위치 1 2 3 4
대립유전자 2 5' CTCTA T G*
3' GAGA T A C C
2개의 밴드가 보였는데, 저분자량 밴드는 돌출부에 상보적인 위치 1에서 ddGTP로 채워진 DNA 분자에 해당했고, 고분자량 밴드는 돌출부에 상보적인 위치 3에서 ddGTP로 채워진 DNA 분자에 해당했다(도 19 참조).
원 주형 DNA와 다중 주형 DNA로부터의 증폭 후 TSC0470003에서 대립유전자 1에 대한 대립유전자 2의 백분율을 계산했다. 단일 반응에서 1개의 형광 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 두 대립유전자를 검출함으로써 피펫 사용을 통해 도입되는 오차와 상이한 염료들의 양자 계수를 통해 도입되는 오차의 양을 줄였다.
SNP TSC0470003에서, 대립유전자 1에 대한 대립유전자 2의 백분율은 대립유전자 2와 대립유전자 1의 값의 합으로 대립유전자 2의 값을 나눔으로써 계산했다. 원 주형 DNA의 TSC0470003에서 대립유전자 2 대 대립유전자 1의 백분율은 0.539로계산되었다(표19 참조). 다중 주형 DNA의 각 SNP에 대해서는 3회의 PCR 반응을 수행했다. 다중 DNA의 TSC0470003에서 대립유전자 2 대 대립유전자 1의 평균 백분율은 0.49, 표준 편차는 0.0319였다(표19 참조). 원 주형 DNA와 다중 주형 DNA에서 얻어진 백분율 사이에 통계적으로 유의한 차이는 없었다.
SNP TSC1261039에서, 원 주형 DNA의 TSC1261039에서 대립유전자 2 대 대립유전자 1의 백분율은 0.44로 계산되었다(표19 참조). 다중 주형 DNA의 각 SNP에 대해서는 3회의 PCR 반응을 수행했다(도19B 참조). 다중 DNA의 TSC1261039에서 대립유전자 2 대 대립유전자 1의 평균 백분율은 0.168, 표준 편차는 0.05683이었다(표 19 참조). 원 주형 DNA와 다중 주형 DNA에서 얻어진 백분율 사이에 통계적으로 유의한 차이는 없었다.
다중 주형 DNA의 TSC1261039에서 대립유전자 2 대 대립유전자 1의 백분율에서 보여진 변동은 피펫 사용으로 인한 것 같았다. 이 변화는 복제의 수가 증가함에 따라 감소될 수 있다. 다수의 복제물에서 최소한의 통계적 변동을 갖는 백분율이 얻어질 수 있다.
마찬가지로, SNA TSC0310507과 TSC1335008에서 원 주형 DNA과 다중 주형 DNA에 대한 대립유전자 2 대 대립유전자 1의 백분율 사이에 통계적 차이는 없었다(표 19, 그리고 도 19C 및 19D 참조). 따라서, 다중 반응을 사용하여, 다양한 부위에서의 한 대립유전자와 나머지 한 대립유전자의 백분율에 영향을 미치지 않으면서, 관심있는 유전자좌를 함유하는 염색체 영역의 수를 증가시킬 수 있다.
여기 설명된 방법은 관심있는 유전자좌를 증폭하는데 두 가지 별개의 증폭 반응을 사용했다. 1차 PCR 반응에서, 올리고뉴클레오티드는 관심있는 유전자좌의 상류와 하류를 어닐링하도록 디자인되었다. 종래의 게놈 증폭과는 달리, 이들 프라이머는 축퇴되지 않았으며, 관심있는 유전자좌로부터 특정한 거리에서 어닐링했다. 그러나, 프라이머의 길이로 인해서, 이 프라이머가 게놈의 다른 영역들을 어닐링했을 가능성이 있다. 이들 프라이머를 사용하여 유전적 분석에 이용할 수 있는 DNA 양을 증가시켰다.
2차 PCR 반응은 실시예 1-6에 설명된 방법을 사용한다. 프라이머가 관심있는 유전자좌를 증폭하도록 디자인되었고, 서열은 관심있는 유전자좌에서 결정된다. 2차 PCR 반응의 조건은 다중 주형 DNA로부터 관심있는 유전자좌의 특이적 증폭을 허용했다. 만일 다중 반응으로부터 어떤 비-특이적 생성물이 있었다 해도, 그들은 관심있는 유전자좌의 증폭을 방해하지 않았다. 증폭이 원 주형 DNA에서 수행되었는지 또는 다중 주형 DNA에서 수행되었는지에 무관하게, 분석된 4개의 SNP에서 대립유전자 1에 대한 대립유전자 2의 백분율들에 통계적인 차이는 없었다.
이 실시예에서 분석된 SNP는 사람 21번 염색체 상에 위치했다. 그러나, 이 방법은 비-사람 및 사람 DNA에 적용될 수 있으며, 이것은 제한은 없지만 염색체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X 및 Y를 포함한다. 또한, 다중 방법은 제한은 없지만 뉴클레오티드 치환, 삽입, 결실, 및 재배열을 포함하는 유전적 돌연변이를 분석하는데 적용될 수 있다.
상기 방법을 사용하여 출발 주형 DNA의 양에 대한 제한 없이 언제든지 유전적 분석에 이용할 수 있는 DNA의 양을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 악성 세포의 전암성 및 전침입성 병소는 통상 견본 내 세포에서 작은 부분을 구성하며, 이것이 수행될 수 있는 유전적 분석의 수를 감소시킨다. 여기 설명된 방법이 유전적 분석에 이용할 수 있는 악성 DNA의 양을 증가시키는데 사용될 수 있다. 또한, 모계 혈액에 존재하는 태아 게놈의 수는 흔히 적은 양인데, 여기 설명된 방법을 사용하여 태아 DNA의 양을 증가시킬 수 있다.
실시예 13
임신한 여성의 혈액으로부터 분리된 혈장은 모계 주형 DNA와 태아의 주형 DNA를 모두 함유한다. 앞서 논의된 대로, 모계 혈장 중 태아 DNA의 백분율은 임신한 여성에 따라 다양하다. 그러나, 태아 DNA의 백분율은, 모계 주형 DNA가 동형접합성이고, 혈장으로부터 얻어진 주형 DNA가 이형접합성 패턴을 나타내는 경우에 SNP를 분석함으로써 결정될 수 있다.
예를 들어, 추정상의 SNP X 는 아데닌 또는 구아닌 중 어느 하나일 수 있고, SNP X 에 대한 모계 DNA 는 구아닌에 대하여 동형접합성이다. 실시예 6 에 기재된 표지화 방법은 혈장 샘플에서 주형 DNA 의 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 혈장 샘플이 SNP X 에서 동형접합성인 태아 DNA 를 함유한다면, IIS 형 제한 효소 BsmF I 로의 절단 및, 표지된 ddGTP, 비표지된 dATP, dTTP, 및 dCTP 를 이용한 채우기 반응후에 다음의 DNA 분자가 기대된다.
모계 대립유전자 1 5' GGGTG*
3' CCCA C T C A
모계 대립유전자 2 5' GGGTG*
3' CCCA C T C A
태아 대립유전자 1 5' GGGTG*
3' CCCA C T C A
태아 대립유전자 2 5' GGGTA A G*
3' CCCA T T C A
2개의 신호가 검출되고; 하나의 신호는 돌출부에 상보적인 위치 1에서 ddGTP 로 채워진 DNA 분자에 해당하고, 제2의 신호는 돌출부에 상보적인 위치 3에서 ddGTP 로 채워진 DNA 분자에 해당한다. 그러나, 모계 DNA 는 돌출부에 상보적인 위치 1에서 채워진 DNA 분자에 해당하는 구아닌에 대하여 동형접합성이다. 돌출부에 상보적인 위치 3에서 ddGTP 로 채워진 DNA 분자로부터의 신호는 아데닌 대립유전자에 해당하고, 이것은 태아 DNA 를 나타낸다. 이 신호가 태아 DNA 의 표지가 되며, 혈장 샘플중에 존재하는 태아 DNA 의 양을 측정하는데 사용될 수 있다.
염색체간에 태아 DNA 의 양에 있어서의 차이는 없다. 예를 들어, 염색체 1 로부터의 어떤 허용된 개체내의 태아 DNA 의 백분율은 염색체 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X 및 Y 로부터의 태아 DNA 의 백분율과 동일하다. 따라서, 하나의 염색체상의 SNPs 에 대해 계산된 대립유전자 비율은 다른 염색체상의 SNPs 에 대한 대립유전자 비율과 비교될 수 있다.
예를 들어, 염색체 1 상의 SNPs 에 대한 대립유전자 비율은 염색체 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X 및 Y 상의 SNPs 에 대한 대립유전자 비율과 동일하여야만 한다. 그러나, 태아가 3염색체성 또는 1염색체성을 제한없이 포함하는 염색체 이상을 가진다면, 이상 복제수가 존재하는 염색체에 대한 비율은 다른 염색체에 대한 비율과 상이할 것이다.
동의서에 승인한 임신한 여성으로부터 혈액을 수집하였다. 혈 샘플은 모계 DNA 가 동형접합성인 SNPs, 및 임신한 여성의 혈장에서 채취된 DNA 로부터 이형접합성 패턴을 나타낸 동일한 SNP 를 분석함으로써 태아 DNA 가 모계 혈장에서 검출될 수 있는지를 증명하는데 사용되었다.
전혈로부터 혈장의 제조
각 9 ㎖의 혈액(Fischer Scientific, 9 ㎖ EDTA Vacuette tubes, 카탈로그 번호 NC9897284)을 함유하는 4개의 관으로부터의 혈장을 분리하였다. 동의서에 승인한 임신한 여성으로부터 정맥천자에 의해서 혈액을 채취하였다. 혈을 수집한 다음, 포름알데히드(혈의 25㎕/ml)를 각 관에 첨가하였다. 관을 출하전까지 4℃에 놓았다. 관을 아이스팩을 함유한 발포 컨테이너로 페데럴 익스프레스를 통해 선적하였다.
혈을 1000 rpm 으로 10분동안 원심분리하였다. 원심분리에서 제동은 사용되지 않았다. 원심분리 단계를 반복하였다. 상청액을 새로운 관에 옮기고 3,000 rpm 으로 10분동안 진동시켰다. 원심분리상의 제동은 사용되지 않았다. 4개의 튜브 각각으로부터의 상청액을 모았고 2개의 관에 알리코트하였다. DNA를 정제하기전까지 혈장을 -80℃에서 저장하였다.
주형 DNA 를 QIAGEN 사의 QIAmp DNA 혈 미디 키트(카탈로그 번호 51183)를 사용하여 분리하였다. 주형 DNA 를 키트에 포함된 설명서에 따라서 분리하였다. 혈장으로부터의 주형 DNA 를 최종 부피 20㎕ 로 용출하였다.
모계 DNA 의 분리
상기에 기재된 샘플로부터 혈장을 제거한 다음, 통상 "버피-코팅"으로 지칭되는 남아있는 혈액 샘플의 1㎖ 를 새로운 관에 옮겼다. 1 X PBS 의 1㎖를 샘플에첨가하였다. QIAGEN 사의 QIAmp DNA 혈 미디 키트(카탈로그 번호 51183)를 사용하여 주형 DNA 를 분리하였다.
동형접합성 모계 SNP 의 동정
실시예 8은 개체군내의 매우 가변적인 SNP 를 동정하는 방법 또는 허용된 개체에 대한 동형접합성 SNP 를 동정하는 방법을 기술한다. 모계 DNA 가 동형접합성인 염색체 13상의 SNPs 를 동정하기 위해서, 실시예 8에 기재된 방법이 모계 주형 DNA 에 적용되었다. 많은 SNPs 가 스크리닝될 수 있다. 스크리닝될 수 있는 SNP 의 수는 분석될 필요가 있는 태아 DNA 에서 동형접합성 SNP 의 수에 비례한다.
실시예 6에 상세하게 기재된 대로, 특정 SNP 에서 2가지 대립유전자의 서열을 결정하기 위해서 하나의 표지된 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 본 실험에 있어서, 비표지된 dATP, dTTT, 및 dCTP 의 존재하에서 표지된 ddGTP 를 사용하여 서열이 결정될 수 있는 SNP 가 선택되었다. 그러나, 표지된 ddATP, ddTTT, 및 ddCTP 를 사용하여 서열이 결정될 수 있는 SNP 가 또한 사용될 수 있다. 구체적으로, 분석될 SNPs 를 선택하여서, 모든 서열이 동일한 뉴클레오티드로 또는, 4개의 뉴클레오티드의 조합으로 표지할 수 있다. 예를 들어, 400 SNPs 가 스크리닝된다면, 100개를 선택하여서, 서열이 표지된 ddATP 를 이용해 결정될 수 있으며, 100 개를 선택하여서, 서열이 표지된 ddTTP 를 이용해 결정될 수 있으며, 100 개를 선택하여서, 서열이 표지된 ddCTP 를 이용해 결정될 수 있거나, 또는 100 개를 선택하여서, 4개의 표지된 뉴클레오티드의 조합을 이용해 결정될 수 있다.
모계 DNA 가 동형접합성인 29 개의 SNPs 가 동정되었다: TSC0052277,TSC1225391, TSC0289078, TSC1349804, TSC0870209, TSC0194938, TSC0820373, TSC0902859, TSC0501510, TSC1228234, TSC0082910, TSC0838335, TSC0818982, TSC0469204, TSC1084457, TSC0466177, TSC1270598, TSC1002017, TSC1104200, TSC0501389, TSC0039960, TSC0418134, TSC0603688, TSC0129188, TSC1103570, TSC0813449, TSC0701940, TSC0087962, and TSC0660274. 이형접합성 SPNs 는 개체별로 다양할 것이다.
다중 프라이머 디자인
태아 게놈의 낮은 복제수는 전형적으로 모계 혈장에 존재한다. 염색체 13에 위치한 관심있는 유전자좌의 복제수를 증가시키기 위해서, 프라이머가 각각의 관심있는 유전자좌의 약 130 염기 상류와 130 염기 하류에 어닐링하도록 디자인하였다. 이것은 대립유전자간의 비율에 영향을 줄 수 있는, 적은 수의 게놈으로 실험할 때 발생할수 있는 통계학적 표본추출 오차를 감소시키기 위해서 수행되었다(실시예 11). 프라이머는 전장 12 염기였다. 그러나, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36-45, 46-55, 56-65, 66-75, 76-85, 86-95, 96-105, 106-115, 116-125, 및 125 염기 이상을 제한없이 포함하는, 어떤 길이의 프라이머도 사용될 수있다. 프라이머는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 모두에 어닐링되도록 디자인되었다.
프라이머는 프라이머-다이머의 형성을 감소시키기 위해서, 3' 말단에서 디뉴클레오티드 "AA" 로 종결하도록 디자인되었다. 그러나, 프라이머는 4개의 뉴클레오티드 중 어느 것으로 그리고, 4개의 뉴클레오티드의 조합으로 종결되도록 디자인될 수 있다.
SNPTSC0052277 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다.
정방향 프라이머 : 5' GACATGTTGGAA 3'
역방향 프라이머 : 5' ACTTCCAGTTAA 3'
SNPTSC1225391 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다.
정방향 프라이머 : 5' GTTTCCTGTTAA 3'
역방향 프라이머 : 5' CGATGATGACAA 3'
SNP TSC0289078 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다 :
정방향 프라이머 : 5' GAGTAGAGACAA 3'
역방향 프라이머 : 5' TCCCGGATACAA 3'
SNP TSC1349804 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' CATCCTCTAGAA 3'
역방향 프라이머 : 5' TATTCCTGAGAA 3'
SNP TSC0870209 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다 :
정방향 프라이머 : 5' AGTTTGTTTTAA 3'
역방향 프라이머 : 5' TATAAACGATAA 3'
SNP TSC0194938 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다 :
정방향 프라이머 : 5' TTTGACCGATAA 3'
역방향 프라이머 : 5' TGACAGGACCAA 3'
SNP TSC0820373 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' TTATTCATTCAA 3'
역방향 프라이머 : 5' AGTTTTTCACAA 3'
SNPTSC0902859 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' CACCTCCCTGAA 3'
역방향 프라이머 : 5' CCAGATTGAGAA 3'
SNP TSC0501510 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다 :
정방향 프라이머 : 5' TGTGTCCACCAA 3'
역방향 프라이머 : 5' CTTCTATTCCAA 3'
SNPTSC1228234 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다 :
정방향 프라이머 : 5' TCACAATAGGAA 3'
역방향 프라이머 : 5' TACAAGTGAGAA 3'
SNP TSC0082910 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' GAGTTTTCGTAA 3'
역방향 프라이머 : 5' GTGTGCCCCCAA 3'
SNP TSC0838335 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' GCACCACTGCAA 3'
역방향 프라이머 : 5' GAACACAATGAA 3'
SNP TSC0818982 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' TATCCTATTCAA 3'
역방향 프라이머 : 5' CAACCATTATAA 3'
SNP TSC0469204 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' TATGCTTTACAA 3'
역방향 프라이머 : 5' TTTGTTTACCAA 3'
SNP TSC1084457 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' AGGAAATTAGAA 3'
역방향 프라이머 : 5' TGTTAGACTTAA 3'
SNPTSC0466177 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' TATTTGGAGGAA 3'
역방향 프라이머 : 5' GGCATTTGTCAA 3'
SNP TSC1270598 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' ATACTCCAGGAA 3'
역방향 프라이머 : 5' CAGCCTGGACAA 3'
SNP TSC1002017 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' CCATTGCAGTAA 3'
역방향 프라이머 : 5' AGGTTCTCATAA 3'
SNP TSC1104200 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' TGTCATCATTAA 3'
역방향 프라이머 : 5' TGGTATTTGCAA 3'
SNPTSC0501389 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' TAGGGTTTGTAA 3'
역방향 프라이머 : 5' CCCTAAGTAGAA 3'
SNP TSC0039960 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' GTATTTCTTTAA 3'
역방향 프라이머 : 5' GAGTCTTCCCAA 3'
SNP TSC0418134 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다 :
정방향 프라이머 : 5' CAGGTAGAGTAA 3'
역방향 프라이머 : 5' ATAGGATGTGAA 3'
SNP TSC0603688 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' CAATGTGTATAA 3'
역방향 프라이머 : 5' AGAGGGCATCAA 3'
SNP TSC0129188 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' CCAGTGGTCTAA 3'
역방향 프라이머 : 5' TAAACAATAGAA 3'
SNP TSC1103570 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' GCACACTTTTAA 3'
역방향 프라이머 : 5' ATGGCTCTGCAA 3'
SNPTSC0813449 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' GTCATCTTGTAA 3'
역방향 프라이머 : 5' TGCTTCATCTAA 3'
SNPTSC0701940 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' AGAAAGGGGCAA 3'
역방향 프라이머 : 5' CTTTTCTTTCAA 3'
SNP TSC0087962 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다 :
정방향 프라이머 : 5' CTACTCTCTCAA 3'
역방향 프라이머 : 5' ACAGCATTATAA 3'
SNP TSC0660274 에 대한 다중 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머 : 5' ACTGCTCTGGAA 3'
역방향 프라이머 : 5'GCAGAGGCACAA 3'
다중 PCR
상기에 언급된 29 SNPs 를 둘러싸는 염색체 13의 영역을 중합효소 연쇄반응(PCR, U.S. 특허번호 4,683,195 및 4,683,202, 본원에 참고문헌으로 수록됨)을 사용하여 주형 게놈 DNA 로부터 증폭시켰다. 이 PCR 반응은 관심있는 각 유전자좌의 약 150 염기 상류 및 하류에 어닐링하는 프라이머를 사용하였다. 58 개의 프라이머를 혼합하였고, 이를 주형 DNA 를 증폭시키기 위한 단일 반응에서 사용하였다. 관심있는 유전자좌의 복제수를 증가시키기 위해서 반응을 수행하였고, 이것은 낮은 게놈수로부터 발생될 수 있는 에러를 제거한다.
특이성 증가를 위해서, "핫-스타트" PCR 반응을 사용하였다. QIAGEN 사의 HotStarTaq Master Mix 키트를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 반응마다 관심있는 유전자좌에 대한 주형 DNA 와 프라이머의 양을 최적화할 수 있다. 본 실험에서는, 20㎕ 의 혈장 주형 DNA 를 사용하였다.
5mM 농도에서, 각 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 2 ㎕ 를 단일 미세원심분리 관에 모았고, 이를 혼합하였다. 프라이머 혼합물중의 4㎕ 를 총 PCR 반응 부피 50㎕( 20㎕의 주형 혈장 DNA, 1㎕의 무균수, 4㎕의 프라이머 혼합물, 및 25㎕의 HotStar Taq.)에서 사용하였다. PCR 을 25 사이클 수행하였다. 다음 PCR 조건이 사용되었다:
(1) 95℃ 에서 15분;
(2) 95℃ 에서 30초;
(3) 4℃ 에서 30초;
(4) 37℃에서 30초;
(5) 단계 2-4 를 24 회 반복;
(6) 72℃ 에서 10분.
변성, 어닐링 및 확장의 온도와 시간은 다양한 설정들을 시도해 보고 최상의 결과를 제공하는 변수들을 사용함으로써 최적화될 수 있다. 관심있는 유전자좌의 복제수를 증가시키기 위해서, 프라이머 연장 예비증폭(PEP) (Zhang 등, PNAS, 89:5847-51, 1992), 변성 올리고뉴클레오티드 개시 PCR (DOP-PCR)(Tetenius 등, Genomics 13:718-25, 1992), 롤링 서클 복제를 수행하는, 박테리오파아지 29로부터의 DNA 중합효소를 사용하는 가닥 치환 증폭(Dean 등, Genomic Research 11:1095-99, 2001), 다중 치환 증폭(U.S. 특허 6,124,120), REPLI-gTM전 게놈 증폭 키트,및 표지된 PCR 을 제한없이 포함하는 다른 게놈 증폭 방법이 또한 사용될 수 있다.
관심있는 단편의 정제
Qiagen MinElute PCR 정제 키트(Qiagen, 카탈로그 번호 28004)를 사용하여 사용되지 않은 프라이머와 뉴클레오티드를 제거하였다. 칼럼과 함께 제공된 제조자의 설명서에 따라서 반응을 수행하였다. 100㎕의 무균수에서 DNA 를 용출시켰다.
PCR 반응 2
프라이머 디자인
SNPTSC0052277 을 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' CTCCGTGGTATGGAATTCCACTCAAATCTTCATTCAGA 3'
제 2 프라이머:
5' ACGTCGGGTTACGGGACACCTGATTCCTC 3'
SNP TSC1225391 을 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' TACCATTGGTTTGAATTCTTGTTTCCTGTTAACCATGC 3'
제 2 프라이머:
5' GCCGAGTTCTACGGGACAGAAAAGGGAGC 3'
SNP TSC0289078 을 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' TGCAGTGATTTCGAATTCGAGACAATGCTGCCCAGTCA 3'
제 2 프라이머:
5' TCTAAATTCTCTGGGACCATTCCTTCAAC 3'
SNP TSC1329804 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' ACTAACAGCACTGAATTCCATGCTCTTGGACTTTCCAT 3'
제 2 프라이머:
5' TCCCCTAACGTTGGGACACAGAATACTAC 3'
SNP TSC0870209 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' GTCGACGATGGCGAATTCCTGCCACTCATTCAGTTAGC 3'
제 2 프라이머:
5' GAACGGCCCACAGGGACCTGGCATAACTC 3'
SNP TSC0194938 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' TCATGGTAGCAGGAATTCTGCTTTGACCGATAAGGAGA 3'
제 2 프라이머:
5' ACTGTGGGATTCGGGACTGTCTACTACCC 3'
SNP TSC0820373 을 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' ACCTCTCGGCCGGAATTCGGAAAAGTGTACAGATCATT 3'
제 2 프라이머:
5' GCCGGATACGAAGGGACGGCTCGTGACTC 3'
SNP TSC0902859 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' CCGTAGACTAAAGAATTCCCTGATGTCAGGCTGTCACC 3'
제 2 프라이머:
5' ATCGGATCAGTCGGGACGGTGTCTTTGCC 3'
SNP TSC0501510 을 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' GCATAGGCGGGAGAATTCCCTGTGTCCACCAAAGTCGG 3'
제 2 프라이머:
5' CCCACATAGGGCGGGACAAAGAGCTGAAC 3'
SNP TSC1228234 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' GGCTTGCCGAGCGAATTCTAGGAAAGATACGGAATCAA 3'
제 2 프라이머:
5' TAACCCTCATACGGGACTTTCATGGAAGC 3'
SNP TSC0082910 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' ATGAGCACCCGGGAATTCTGATTGGAGTCTAGGCCAAA 3'
제 2 프라이머:
5'TGCTCACCTTCTGGGACGTGGCTGGTCTC3'
SNP TSC0838335 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' ACCGTCTGCCACGAATTCTGGAAAACATGCAGTCTGGT 3'
제 2 프라이머:
5' TACACGGGAGGCGGGACAGGGTGATTAAC 3'
SNP TSC0818982 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' CTTAAAGCTAACGAATTCAGAGCTGTATGAAGATGCTT 3'
제 2 프라이머:
5' AACGCTAAAGGGGGGACAACATAATTGGC 3'
SNP TSC0469204 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' TTGTAAGAACGAGAATTCTGCAACCTGTCTTTATTGAA 3'
제 2 프라이머:
5' CTTCACCACTTTGGGACACTGAAGCCAAC 3'
SNP TSC1084457 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' AACCATTGATTTGAATTCGAAATGTCCACCAAAGTTCA 3'
제 2 프라이머:
5' TGTCTAGTTCCAGGGACGCTGTTACTTAC 3'
SNP TSC0466177 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' CGAAGGTAATGTGAATTCTGCCACAATTAAGACTTGGA 3'
제 2 프라이머:
5' ATACCGGTTTTCGGGACAGATCCATTGAC 3'
SNP TSC1270598 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' CCTGAAATCCACGAATTCCACCCTGGCCTCCCAGTGCA 3'
제 2 프라이머:
5' TAGATGGTAGGTGGGACAGGACTGGCTTC 3'
SNP TSC 1002017 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' GCATATCTTAGCGAATTCCTGTGACTAATACAGAGTGC 3'
제 2 프라이머:
5' CCAAATATGGTAGGGACGTGTGAACACTC 3'
SNPTSC1104200 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머: 5' TGCCGCTACAGGGAATTCATATGGCAGATATTCCTGAA 3'
제 2 프라이머: 5' ACGTTGCGGACCGGGACTTCCACAGAGCC 3'
SNP TSC0501389 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' CTTCGCCCAATGGAATTCGGTACAGGGGTATGCCTTAT 3'
제 2 프라이머:
5' TGCACTTCTGCCGGGACCAGAGGAGAAAC 3'
SNP TSC0039960 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' TGTGGGTATTCTGAATTCCACAAAATGGACTAACACGC 3'
제 2 프라이머:
5'ACGTCGTTCAGTGGGACATTAAAAGGCTC 3'
SNP TSC0418134 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머: 5' GGTTATGTGTCAGAATTCTGAAACTAGTTTGGAAGTAC 3'
제 2 프라이머: 5' GCCTCAGTTTCGGGGACAGTTCTGAGGAC 3'
SNP TSC0603688 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머: 5' TGTAACACGGCCGAATTCCTCATTTGTATGAAATAGGT 3'
제 2 프라이머: 5' AATCTAACTTGAGGGACCGGCACACACAC 3'
SNP TSC0129188 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' AGTGTCCCCTTAGAATTCGCAGAGACACCACAGTGTGC 3'
제 2 프라이머:
5' TTTGCTACAGTCGGGACCCTTGTGTGCTC 3'
SNP TSC1103570 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' AGCACATCACTAGAATTCAATACCATGTGTGAGCTCAA 3'
제 2 프라이머:
5' AATCCTGCTTCCGGGACCTAACTTTGAAC 3'
SNP TSC0813449 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' TTTCATTTTCTGGAATTCCTCTAATGATTTTCTGGAGC 3'
제 2 프라이머:
5' CGTCGCCGCGTAGGGACTTTTTCTTCCAC 3'
SNP TSC0701940 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' TTACTTAATCCTGAATTCGAGAAAAGCCATGTTGATAA 3'
제 2 프라이머:
5' TCATGGGTCGCTGGGACTTTGCCCTCTGC 3'
SNPTSC0087962 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' ACTAACAGCACTGAATTCATTTTACTATAATCTGCTAC 3'
제 2 프라이머:
5' GTTAGCCGAGAAGGGACTGTCTGTGAAGC 3'
SNP TSC0660274 를 다음 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다:
제 1 프라이머:
5' AAATATGCAGCGGAATTCGTAAGTGACCTATTAATAAC 3'
제 2 프라이머:
5' GCGATGGTTACGGGGACAGCCAGGCAACC 3'
각각의 제 1 프라이머는 5' 말단에 비오틴 태그를 가졌고, EcoRI 에 대한 제한효소 인식부위를 함유하였으며, 관심있는 유전자좌로부터 특정 위치에 어닐링되도록 디자인되었다. 이것은 관심있는 유전자좌에 대하여 단일 반응이 수행되도록 하는데, 관심있는 각 유전자좌가 (제 1 프라이머의 어닐링 위치에 기초하여) 구별되는 위치로 이동하기 때문이다. 제 2 프라이머는 BsmF I 에 대한 제한효소 인식부위를 포함하였다.
관심있는 모든 유전자좌는 중합효소 연쇄반응을 사용하여 다중화 주형 DNA 로부터 증폭되었다(PCR, U.S. 특허번호 4,683,195 및 4,683,202, 본원에 참고문헌으로 수록됨). 본 실시예에서, 관심있는 유전자좌는 별개의 반응관에서 증폭되었지만, 이들은 또한 단일 PCR 반응에서 함께 증폭될 수 있다. 특이성을 증가시키기 위해서, "핫-스타트" PCR 을 사용하였다. QIAGEN 사의 HotStarTaq Master Mix 키트(카탈로그 번호 203443)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다.
반응마다 관심있는 각 유전자에 대한 다중화 주형 DNA 와 프라이머의 양을 최적화할 수 있다. MinElute 칼럼으로부터 용출된 다중화 주형 DNA 의 1㎕ 와 각프라이머의 5μM을 각 관심있는 유전자좌에 대한 PCR 반응에서 사용하였다. 상기에 기재된 29 SNPs 를 또한 모계 DNA 로부터 증폭하였다(PCR 반응에서 15ng 의 DNA 를 사용하였고; 프라이머 농도는 상기에 기재된 바와 같다). PCR 을 45 사이클 수행하였다. 다음 PCR 조건을 사용하였다.
(1) 95℃ 에서 15분 15초;
(2) 37℃ 에서 30초;
(3) 95℃ 에서 30초;
(4) 57℃에서 30초;
(5) 95℃ 에서 30초;
(6) 64℃ 에서 30초;
(7) 95℃ 에서 30초;
(8) 단계 6-7 을 39 회 반복;
(9) 72℃ 에서 5분.
PCR 의 첫 사이클에서, 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 3' 어닐링 영역의 용융 온도인 37℃ 였다. PCR 의 두번째 사이클에서 어닐링 온도는 대략 주형 DNA 에 어닐링하는 제 1 프라이머의 3' 영역의 용융 온도인 57℃였다. PCR 의 세번째 사이클의 어닐링 온도는 대략 제 2 프라이머의 전 서열의 용융 온도인 64℃였다. 나머지 사이클에 대한 어닐링 온도는 64℃였다. PCR 의 첫번째 3 사이클에서 TM1 에서 TM2 에서 TM3 로 어닐링 온도를 높임으로써 특이성을 증가시킨다. 이들 어닐링 온도는 대표적인 것이고, 숙련자라면 각 사이클에 대한 어닐링 온도는 사용된 특정의 프라이머에 의존적이라는 것을 이해할 것이다.
변성, 어닐링 및 확장의 온도와 시간은 다양한 설정들을 시도해 보고 최상의 결과를 제공하는 변수들을 사용함으로써 최적화될 수 있다. 본 실험에서, 제 1 프라이머는 관심있는 유전자좌로부터 다양한 거리에서 어닐링되도록 디자인되었다. 숙련자라면 제 1 프라이머의 어닐링 위치가 관심있는 유전자좌로부터 5-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50, 51-55, 56-60, 61-65, 66-70, 71-75, 76-80, 81-85, 86-90, 91-95, 96-100, 101-105, 106-110, 111-115, 116-120, 121-125, 126-130, 131-140, 140-160, 160-180, 180-200, 200-220, 220-240, 240-260, 260-280, 280-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 또는 500 염기 이상일 수 있다는 것을 이해할 것이다.
관심있는 단편의 정제
게놈 주형 DNA 로부터 PCR 생산물을 분리하였다. 각 PCR 생산물을 Roche Diagnostics GmbH 사의 투명한 고결합성 플레이트인 스트렙타웰(2001 생화학제품 카탈로그, Roche 분자 생화학제에 열거된 카탈로그 번호 1 645 692)의 웰에 놓았다. 대안으로, 관심있는 유전자좌가 분자량에 기초하여 분리되는 것이 허용되도록 제 1 프라이머가 디자인되기 때문에 PCR 생산물은 단일 웰에 수집될 수 있다. 제 1 프라이머는 PCR 생산물이 스트렙타비딘 코팅된 웰에 결합되도록 하는 한편 게놈 주형 DNA는 결합되지 않도록 하는 5' 비오틴 태그를 함유했다. 스트렙타비딘 결합 반응 써모믹서(Eppendorf)를 사용하여 1000 rpm 으로 20분동안 스트렙타비딘 결합 반응을 수행하였다. 비결합 물질을 제거하기 위하여 각 웰을 흡인하였고, 부드럽게혼합하면서 1 X PBS 로 3회 세척하였다(Kandpal 등, Nucl. Acids Res. 18:1789-1795(1990); Kaneoka 등, Biotechniques 10:30-34(1991); Green 등, Nucl. Acids Res. 18:6163-6164(1990).
분리된 단편의 제한효소 절단
정제된 PCR 생산물을 제 2 프라이머로부터의 PCR 생산물내에 통합된 인식 부위에 결합하는 제한효소 BsmF I 로 절단하였다. 제한효소와 함께 제공된 설명서에 따라서 절단물을 스트렙타웰에서 수행하였다. 절단 후에, 웰을 PBS 로 3회 세척하여 절단된 단편을 제거하였다.
표지된 뉴클레오티드의 통합
BsmF I 로 절단된 제한효소는 5' 돌출부를 가지고, SNP 부위 또는 관심있는 유전자좌 및 3' 함몰 말단을 함유하는 DNA 단편을 생산하였다. 5' 돌출부는 주형으로 기능하여 DNA 중합효소의 존재하에서 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 통합을 허용하였다.
실시예 6 에 기재된 대로, SNP 의 양 대립유전자의 서열은 다른 비표지된 뉴클레오티드의 존재하에서 하나의 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 돌출부를 채움으로서 결정될 수 있다. 다음 성분들이 각 채우기 반응에 첨가되었다: 1㎕ 의 형광성으로 표지된 ddGTP, 구아닌을 제외한 모든 뉴클레오티드를 함유하는 0.5㎕ 의 비표지된 ddNTPs(40μM), 2㎕의 10X 시퀘나제 완충액, 0.25㎕의 시퀘나제, 및 20㎕ 반응에 요구되는 물. Fermentas Inc. (Hanover, MD)로부터 형광성으로 표지되지 않은 ddNTP 를 구입하였다. 모든 다른 표지화 시약은 Amersham(Thermo Sequenase DyeTerminator Cycle Sequencing Core Kit, US 79565)로부터 구입하였다.
표지화후에, 각 스트렙타웰을 1 X PBS(100㎕)로 3회 세척하였다. 그 다음, 효소와 함께 제공된 제조자의 설명서에 따라서 제한효소 EcoRI 로의 절단에 의해서 스트렙타웰로부터 "채워진" DNA 단편을 방출시켰다. 120rpm 으로 교반하면서 37℃에서 1시간동안 절단시켰다.
관심있는 유전자좌의 검출
스트렙타비딘 매트릭스로부터의 방출 후에, 샘플을 36cm 5% 아크릴아미드(우레아) 겔(BioWhittaker Molecular Applications, Long Ranger Run Gel Packs, 카탈로그 번호 50691)에 로딩하였다. 샘플을 3000 볼트로 3분동안 겔에서 전기영동하였다. 겔을 장치로부터 제거하고 Typhoon 9400 가변성 모드 조영기에서 스캐닝하였다. 통합된 표지 뉴클레오티드를 형광물질로 검출하였다.
하기에 SNP TSC0838335 의 5' 돌출부가 도시된다. 돌출부를 기술하기 위한 일부분만이며, 전 서열을 나타낸 것은 아니다(R 은 가변부를 나타낸다).
10/14 5' TAA
3' ATT R A C A
돌출부 위치 1 2 3 4
TSC0838335 에 대해 관찰된 뉴클레오티드는 5' 센스 가닥상의 아데닌과 구아닌이다(본원에서 상부 가닥으로 기술). 돌출부의 위치 3에서의 뉴클레오티드는 시토신에 해당하고, 이것은 구아닌에 상보적이다. 표지된 ddGTP 는 비표지된 dATP, dCTP, 및 dTTP 의 존재하에서 양 대립유전자 서열을 결정하는데 사용될 수 있다.
제한효소 BsmF I 는 5' 돌출부를 제작하기 위해서 사용되었고, 이 제한효소는 전형적으로 인식 부위로부터 10/14 를 절단한다. 때때로, BsmF I 는 인식부위로부터 11/15 를 절단하여 다음 돌출부를 생성한다:
11/15 5' TA
3' AT T R A C
돌출부 위치 0 1 2 3
돌출부의 위치 0은 티미딘이고, 이것은 아데닌에 상보적이다. 돌출부에 상보적인 위치 0 은 비표지된 dATP 로 채워지고, 따라서 채우기 반응 후에, 효소가 인식부위로부터 10/14 또는 11/15 를 절단하는 것에 관계없이 정확히 동일한 분자가 생성된다. 채우기 반응 후에 생성된 DNA 분자가 하기에 기술된다.
G 대립유전자 10/14 5' TAAG*
3' ATT C A C A
돌출부 위치12 3 4
G 대립유전자 11/15 5' TA AG*
3' AT T C A C
돌출부 위치 012 3
A 대립유전자 10/14 5' TAAA TG*
3' ATTT A C A
돌출부 위치 1 234
A 대립유전자 11/15 5' TA A A TG*
3' AT T T A C
돌출부 위치 0 1 23
TSC0838335 에 대하여 증폭된 모계 주형 DNA 는 기대되는 위치로 이동된 더 높은 분자량 밴드의 단일 밴드를 나타냈으며, 이것은 "A" 대립유전자에 상응한다(도 20, 레인 1 참조). 모계 주형 DNA 는 SNP0838335 에서 아데닌에 대하여 동형접합성이였다.
그러나, 레인 2에서, 동일한 개체의 혈장으로부터 분리된 TSC0838335 에 대한 다중화 주형 DNA 의 증폭은 2 개의 밴드를 나타냈고; 하나는 "G" 대립유전자에 해당하는 더욱 낮은 분자량 밴드였고, 다른 하나는 "A" 대립유전자에 해당하는 더욱 높은 분자량 밴드였다. 임신한 여성의 혈장으로부터 분리된 주형 DNA 는 모계 주형 DNA 와 태아 주형 DNA 모두를 포함하였다.
도 20, 레인 1에 나타난 대로, 모계 주형 DNA 는 이 SNP 에서 아데닌에 대하여 동형접합성이였다(레인 1과 레인 2를 비교하시오). "G" 대립유전자는 태아 DNA 를 나타냈다. 모계 주형 DNA 와 태아 주형 DNA 로부터의 신호는 분명하게 구별되었다. "G" 대립유전자는 태아 DNA 에 대한 표지가 되었고, 샘플중에 존재하는 태아 DNA 의 양을 측정하는데 사용될 수 있다. 추가적으로, 일단 허용된 샘플에 대한 모계 혈장중의 태아 DNA 의 백분율이 결정된다면, 이러한 백분율로부터의 어떤 편차는 염색체 이상을 나타낸다. 이러한 방법은 태아 염색체 이상의 검출을 위한 제1의 비침습적인 방법을 제공한다.
도 20, 레인 3에 나타난 대로, SNP TSC0418134 에 대한 모계 DNA 의 분석은기대되는 위치로 이동한 더욱 높은 분자량 밴드의 단일 밴드를 생성하였고, 이것은 아데닌 대립유전자에 해당한다. 마찬가지로, 모계 혈장으로부터 분리된 다중화 주형 DNA 의 분석은 기대되는 위치로 이동한 아데닌 대립유전자의 단일 밴드를 나타냈다(도 20, 레인 4 참조). 모계 DNA 와 태아 DNA 모두는 TSC0418134 에서 아데닌에 대하여 동형접합성이다.
하기에, TSC0129188 에 대한 5' 돌출부가 도시된다(R 은 가변부를 나타낸다):
10/14 5' TCAT
3' AGTA R A C T
돌출부 위치 1 2 3 4
가변부(R)의 뉴클레오티드 상류는 센스 가닥의 구아닌에 해당하지 않는다. 따라서, BsmF I 의 11/15 절단 성질에 의해서 생성된 5' 돌출부는 10/14 절단에 의해서 생성된 5' 돌출부에 동일하게 채워질 것이다. 비표지된 dATP, dTTP, 및 dCTP 의 존재하에서 표지된 ddGTP 가 채우기 반응에 사용되었다. 채우기 반응 후에 생성된 DNA 분자가 하기에 기술된다:
A 대립유전자 10/14 5' TCAT A TG*
3' AGTA T A C T
돌출부 위치 1 2 3 4
G 대립유전자 10/14 5' TCATG*
3' AGTA CAC T
돌출부 위치 1 2 3 4
SNP TSC0129188 에 대한 모계 DNA 의 분석은 돌출부에 상보적인 위치 1에서 ddGTP 로 채워진 DNA 분자에 해당하는 단일 밴드를 나타내고, 이것은 "G" 대립유전자를 나타내었다(도 20, 레인 5 참조). 아데닌 대립유전자에 대하여서는 어떠한 밴드도 검출되지 않았고, 이것은 모계 DNA 가 구아닌에 대하여 동형접합성이라는 것을 나타낸다.
대조적으로, 모계 DNA 와 태아 DNA 모두를 함유하는 모계 혈장에서 얻은 다중화 주형 DNA 의 분석은 2개의 구별되는 밴드를 나타냈다(도 20, 레인 6 참조). 더욱 낮은 분자량 밴드는 "G" 대립유전자에 해당하는 반면에, 더욱 높은 분자량은 "A" 대립유전자에 해당한다. "A" 대립유전자는 태아 DNA 를 나타낸다. 따라서, 모계 DNA 와 태아 DNA 의 분별로 태아 세포를 분리하도록 허용하는 방법이 개발되어 왔다. 추가적으로, 모계 DNA 와 태아 DNA 사이의 차이를 검출하기 위해서 부계 DNA 샘플이 요구되지 않는다.
SNP TSC0501389 에 대한 모계 DNA 의 분석은 더욱 높은 분자량 위치로 이동한 단일 밴드를 나타내고, 이것은 "A" 대립유전자에 해당한다. "G" 대립유전자에 해당하는 어떠한 밴드도 검출되지 않았다. 유사하게, SNP TSC0501389 에 대한 모계 혈장에서 얻은 다중화 주형 DNA 의 분석은 더욱 높은 분자량 위치로 이동한 단일 밴드를 나타내고, 이것은 "A" 대립유전자에 해당한다. 모계 주형 DNA 와 태아 주형 DNA 모두는 SNP TSC0501389 에서 아데닌에 대한 동형접합성이였다.
혈장으로부터의 모계 DNA 와 주형 DNA 는 동일한 샘플에서 기원하였다. 비침습적인 절차를 통해서 얻은 샘플은 모계 및 태아 모두에 대한 유전적 핑거프린트를 제공하였다.
모계 주형 DNA 가 동형접합성인 29 SNP 중에서, 태아 주형 DNA 는 29 SNPs 중 2개에서 동형접합성이였다. 태아 DNA 는 남아있는 27SNPs 에서의 모계 주형 DNA 와 동일한 대립유전자에 대하여 동형접합성이였다(데이터는 제시되지 않음). 허용된 SNP 에서의 모계 주형 DNA 와 혈장 주형 DNA 의 동형접합성 대립유전자의 비교는 향상된 수준의 품질 컨트롤을 제공한다. 모계 주형 DNA 와 혈장 주형 DNA 가 동일한 SNP 에서 상이한 대립유전자에 대하여 동형접합성이라는 것은 가능하지 않다. 이렇게 나타났다면, 과정에서 에러가 발생하였다는 것을 나타내는 것이다.
본원에 기재된 방법은 모계 혈장 샘플에서 모계 유전자 신호가 태아 유전자 신호로부터 분리되고 구별될 수 있다는 것을 증명한다. 상기 실시예에서 분석된 SNPs 는 염색체 13에 위치하였다. 그러나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X 와 Y 및, 태아 염색체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X 와 Y 를 포함하는 어떤 염색체도 분석될 수 있다.
추가적으로, 본원에 기재된 방법은 세포, 조직, 혈, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 눈물, 질 분비액, 제대혈, 융모막 융모, 양수, 배아 조직, 림프액, 뇌척수액, 점막 분비액, 복막액, 복수액, 대변, 또는 체삼출물을 제한없이 포함하는 어떤 생물학적 샘플에서 태아 DNA 를 검출하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 방법은 모계 샘플중의 태아 DNA 의 비율은, 모계 DNA 가 동형접합성이고, 임신한 여성의 혈장에서 분리된 DNA 가 이형접합성인 SNPs 를 분석함으로써 결정될 수 있다는 것을 증명한다. 태아 DNA 의 비율은 태아 유전자형이 어떤 염색체 장애를 가지는 지를 결정하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 혈액 중에 존재하는 태아 DNA 의 비율이 염색체 1의 분석에 의해서 30%로 계산된다면(염색체 1이 관련된 염색체 이상은 임신 초기에 종결된다), 그때, 30% 태아 DNA 로부터의 어떤 편차는 염색체 이상의 징후이다. 예를 들어, 염색체 18 중의 SNP 또는 다중 SNPs 를 분석하는 경우라면, 태아 DNA 의 비율은 30% 이상이고 따라서, 염색체 18의 추가적인 복제물이 존재한다. 어떤 염색체로부터의 태아 DNA 의 계산된 비율이 어떤 다른 염색체와 비교될 수 있다. 특히, 염색체 13에서의 태아 DNA 의 비율은 염색체 18 및 21상의 태아 DNA 의 비율과 비교될 수 있다.
이러한 분석은 각 SNP 에서 어떤 대립유전자 대 다른 대립유전자의 기대되는 비율을 아는 것에 의해서 도움을 받을 수 있다. 실시예 9에 논의된 대로, 모든 이형접합성 SNPs 가 50:50 의 비율을 나타내는 것은 아니다. 어떤 대립유전자 대 다른 대립유전자의 기대되는 비율의 정보는 분석하여야만 하는 가변부의 전체적인 숫자를 감소시켜준다. 그러나, 가변성 SNPs 에 대한 기대되는 비율의 정보가 없는 경우조차도, 많은 SNPs 를 분석함으로써 태아 DNA 의 비율이 계산될 수 있다. SNPs 의 표본추출의 크기가 충분히 큰 경우에, 기대되는 비율의 수치로부터의 통계학적 편차가 감소될 것이다.
추가적으로, 이형접합성 모계 SNPs 는 또한 중요한 정보를 제공한다. 분석은동형접합성 모계 SNP 에 제한되는 것이 아니다. 예를 들어, 모계 DNA 상의 이형접합성 SNP 에서라면, 대립유전자 1 대 대랩 유전자 2의 비율은 1:1 이고, 이 경우, 태아 DNA 가 염색체 이상을 가지지 않는 한, 혈장 주형 DNA 에서의 비율은 1:1 이여야만 한다.
점 돌연변이, 전이, 염기전환, 전위, 삽입, 결실, 및 복제를 제한없이 포함하는 상기 방법은 또한 태아 DNA 중의 돌연변이를 검출하는데 사용될 수 있다. 도 20 에 나타난 대로, 태아 DNA 는 모계 DNA 로부터 용이하게 구별될 수 있다. 상기 방법은 어떤 유전자에 대한 관심있는 어떤 유전자좌의 서열을 결정하는데 사용될 수 있다.
상기에서 본원발명을 충분히 기재하였지만, 당업자라면 본원발명 또는 그것의 어떤 구체예의 정신 또는 범위에 영향을 미치지 아니하고 다양하고 동등한 정도의 조건, 변수 등에 의해 본원발명이 수행될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에 언급된 예를 들어, 과학 문헌, 특허 및 특허 공보와 같은 모든 문헌은 각각의 문헌이 참고문헌으로서 수록된 것과 마찬가지로 전체로서 본원에 참고문헌으로 수록된다. 인용된 문헌이 단지 문헌의 첫페이지만을 제공하는 경우에도 나머지 페이지를 포함하는 전 문헌으로 의도된다.

Claims (66)

  1. (a) 주형 DNA 로부터 관심있는 유전자좌의 대립유전자 서열을 결정하는 단계;
    (b) (a) 의 관심있는 유전자자로부터 동정된 관심있는 이형접합성 유전자좌에서의 대립유전자의 상대적인 양을 정량화하는 단계를 포함하며, 상기 상대적인 양은 비율로서 표현되고, 상기 비율은 염색체 이상의 존재 또는 부재를 나타내는 것을 특징으로 하는 염색체 이상을 검출하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 주형 DNA 는 사람, 비사람, 포유류, 파충류, 소, 고양이, 개, 염소, 돼지, 피그, 원숭이, 유인원, 고릴라, 황소, 젖소, 곰, 말, 양, 가금, 마우스, 래트, 어류, 돌고래, 고래, 및 상어로 구성된 군으로부터 선택된 공급원으로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 주형 DNA 는 사람 공급원으로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 주형 DNA 는 세포, 태아 세포, 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 눈물, 질 분비액, 재대혈, 융모막 융모, 양수, 배아 조직, 배아, 2-세포기 배아, 4-세포기 배아, 8-세포기 배아, 16-세포기 배아, 32-세포기 배아, 64-세포기 배아, 128-세포기 배아, 256-세포기 배아, 512-세포기 배아, 1024-세포기 배아, 림프액, 뇌척수액, 점막 분비액, 복막액, 복수, 대변 물질, 또는 체삼출물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 관심있는 다수의 유전자좌의 대립유전자가 서열결정되고, 그것의 상대적인 양이 정량화되고 비율로서 표현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 관심있는 다수의 유전자좌는 다수의 염색체상에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 3 항에 있어서, 상기 사람은 임신한 여성인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 임신한 여성으로부터 주형 DNA 는 세포, 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 눈물, 질 분비액, 림프액, 뇌척수액, 점막 분비액, 복막액, 복수, 대변 물질, 제대혈, 융모막 융모, 양수 및 체삼출물로 구성된 군으로부터 선택된 샘플로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 4 항에 있어서, 상기 샘플은 세포 용해 저해제와 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 세포 용해 저해제는 글루타알데히드, 글루타알데히드의 유도체, 포름알데히드, 포르말린, 및 포름알데히드의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 샘플은 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 샘플은 임신한 여성의 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 혈액은 태아가 0-4, 4-8, 8-12, 12-16, 20-24, 24-28, 28-32, 32-36, 36-40, 40-44, 44-48, 48-52, 및 52 주 이상으로 구성된 군으로부터 선택된 태아기일 때 임신한 여성으로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 주형 DNA 는 상기 혈액의 혈장으로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 12 항에 있어서, 상기 주형 DNA 는 상기 혈액의 혈청으로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 상기 주형 DNA 는 모계 DNA 및 태아 DNA의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, (a) 단계 전에, 관심있는 동형접합성 유전자좌를 동정하기 위해서 모계 DNA 가 서열결정되고, 더욱이 상기 관심있는 동형접합성 유전자좌는 (a) 의 주형 DNA 에서 분석된 관심있는 유전자좌에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, (a) 단계 전에, 관심있는 이형접합성 유전자좌를 동정하기 위해서 모계 DNA 가 서열결정되고, 더욱이 상기 관심있는 이형접합성 유전자좌는 (a) 의 주형 DNA 에서 분석된 관심있는 유전자좌에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항에 있어서,
    (a) 제 1 프라이머 및 제 2 프라이머를 사용하여 주형 DNA 상의 관심있는 유전자좌의 대립유전자를 증폭시키는 단계에서, 제 2 프라이머는 제한효소로의 절단으로 관심있는 유전자좌를 함유하는 5' 돌출부가 생성되도록 제한효소에 대한 인식부위를 함유하는 관심있는 유전자좌를 증폭시키는 단계;
    (b) 증폭된 DNA를 제 2 프라이머상의 인식 부위를 인식하는 제한효소로 절단하는 단계;
    (c) 뉴클레오티드를 주형으로서 관심있는 유전자좌를 함유하는 5' 돌출부를사용함으로써 (b) 의 절단된 DNA 로 통합시키는 단계; 및
    (d) (c) 의 DNA 서열을 결정함으로써 관심있는 유전자좌의 대립유전자의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 대립유전자의 서열결정 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 제 1 프라이머 및 제 2 프라이머는 가변성 뉴클레오티드를 함유하는 제한효소 인식 부위의 부분을 포함하고, 전 제한효소 인식부위는 증폭후에 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 제한 효소 인식 부위는 BsaJ I, Bssk I, Dde I, EcoN I, Fun4H I, Hinf I, 및 ScrF I 로 구성된 군으로부터 선택된 제한효소에 대한 것임을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 19 항에 있어서, 제한 효소는 인식 부위에서 떨어져 있는 DNA 를 절단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 인식 부위는 IIS 형 제한 효소에 대한 것임을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, IIS 형 제한 효소는 Alw I, Alw 26 I, Bbs I, Bbv I, BceA I, Bmr I, Bsa I, Bst71 I, BsmA I, BsmB I, BspM I, Ear I, Fau I, Fok I,Hga I, Ple I, Sap I, SSfaN I, 및 Sthi32 I 로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 19 항에 있어서, 상기 증폭 방법은 중합효소 연쇄반응, 자기보존 서열 반응, 리가제 연쇄반응, cDNA 말단의 고속 증폭, 중합효소 연쇄반응 및 리가제 연쇄반응, Q-베타 파아지 증폭, 가닥 전이 증폭, 및 스플라이스 오버랩 연장 중합효소 연쇄반응으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 증폭 방법은 PCR 인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, PCR 의 사이클 1에 대한 어닐링 온도는 대략 주형 DNA 에 어닐링하는 제 2 프라이머의 3' 영역 부분의 용융 온도인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, PCR 의 사이클 2에 대한 어닐링 온도는 대략 주형 DNA 에 어닐링하는 제 1 프라이머의 3'영역의 부분의 용융 온도인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, PCR 의 나머지 사이클에 대한 어닐링 온도는 대략 전 제 2 프라이머의 용융 온도인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1 항에 있어서, 서열을 결정하는 단계는 대립유전자 특이적 PCR, 질량 분광, 혼성화, 프라이머 연장, 형광 공명 에너지 전달(FRET), 서열결정, 생거 디데옥시 서열결정, DNA 마이크로어레이, 서던 블롯, 슬롯 블롯, 도트 블롯, 및 MALDI-TOF 질량 분광으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 1 항에 있어서, 염색체상의 관심있는 이종접합성 유전자좌에서 대립유전자에 대한 상기 비율은 합계되어 상이한 염색체상의 관심있는 이종접합 유전자좌의 대립유전자에 대한 비율과 비교되며, 비율상의 차이가 염색체 이상의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 비교되는 염색체들은 염색체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X 및 Y 로 구성된 군으로부터 선택된 사람 염색체인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 31 항에 있어서, 염색체 13, 18, 및 21 의 관심있는 이형접합성 유전자좌의 대립유전자에 대한 비율이 비교되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 1 항에 있어서, 상기 관심있는 유전자좌는 단일 뉴클레오티드 다형성인것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 1 항에 있어서, 상기 관심있는 유전자좌는 돌연변이인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. (a) 임신한 여성의 샘플로부터 주형 DNA 를 얻는 단계;
    (b) (a) 의 상기 샘플에 세포 용해 저해제를 첨가하는 단계; 및
    (c) (b) 의 상기 샘플로부터의 주형 DNA 상의 관심있는 유전자좌의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 태아 DNA 에서 관심있는 유전자좌의 서열을 결정하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 임신한 여성으로부터의 상기 샘플은 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 및 질 분비액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 샘플은 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 36 항에 있어서, 상기 세포 용해 저해제는 글루타알데히드, 글루타알데히드 유도체, 포름알데히드, 포름알데히드 유도체, 및 포르말린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 36 항에 있어서, 단계 (c) 전에, 주형 DNA 가 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 38 항에 있어서, 상기 주형 DNA 는 상기 혈액의 혈장으로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 38 항에 있어서, 상기 주형 DNA 는 상기 혈액의 혈청으로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 36 항에 있어서, 단계 (c) 전에, 모계 주형 DNA 상의 관심있는 유전자좌의 서열이 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 36 항에 있어서, 단계 (c) 전에, 부계 주형 DNA 상의 관심있는 유전자좌의 서열이 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 36 항에 있어서, 상기 관심있는 유전자좌는 단일 뉴클레오티드 다형성인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 36 항에 있어서, 상기 관심있는 유전자좌는 돌연변이인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 36 항에 있어서, 관심있는 다수의 유전자좌의 서열이 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 47 항에 있어서, 관심있는 다수의 유전자좌는 다수의 염색체상에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 36 항에 있어서,
    (a) 제 1 프라이머와 제 2 프라이머를 사용하여 주형 DNA 상의 관심있는 유전자좌를 증폭시키는 단계에서, 제 2 프라이머는 제한효소로의 절단으로 관심있는 유전자좌를 함유하는 5' 돌출부가 생성되도록 제한효소에 대한 인식부위를 함유하는 관심있는 유전자좌를 증폭시키는 단계;
    (b) 증폭된 DNA 를 제 2 프라이머상의 인식부위를 인식하는 제한효소로 절단하는 단계;
    (c) 뉴클레오티드를 주형으로서 관심있는 유전자좌를 함유하는 5' 돌출부를 사용함으로써 (b) 의 절단된 DNA 에 통합시키는 단계; 및
    (d) (c) 의 DNA 서열을 결정함으로써 관심있는 유전자좌의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 서열 결정방법.
  50. 제 49 항에 있어서, 상기 제 1 프라이머 및 제 2 프라이머는 가변성 뉴클레오티드를 함유하는 제한효소 인식부위의 부분을 포함하고, 전 제한효소 인식부위는 증폭후에 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 50 항에 있어서, 제한효소는 BsaJ, Bssk I, Dde I, EcoN I, Fun4H I, Hinf I 및 ScrF I 로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 49 항에 있어서, 제한효소는 인식 부위에서 떨어져 있는 DNA 를 절단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 52 항에 있어서, 인식부위는 IIS 형 제한효소에 대한 것임을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 53 항에 있어서, IIS 형 제한 효소는 Alw I, Alw26 I, Bbs I, Bbv I, BceA I, Bmr I, Bsa I, Bst71 I, BsmA I, BsmB I, BsmF I, BspM I, Ear I, Fau I, Fok I, Hga I, Ple I, Sap I, SSfaN I, 및 Sthi32 I 로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 49 항에 있어서, 상기 증폭 방법은 중합효소 연쇄반응, 자기-유지 서열반응, 리가제 연쇄반응, cDNA 말단의 고속 증폭, 중합효소 연쇄반응 및 리가제 연쇄반응, Q-베타 파아지 증폭, 가닥 전이 증폭, 및 스플라이스 오버랩 연장 중합효소 사슬 반응으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 55 항에 있어서, 상기 증폭 방법은 PCR 에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 56 항에 있어서, PCR 의 사이클 1에 대한 어닐링 온도는 대략 주형 DNA 에 어닐링하는 제 2 프라이머의 3' 영역의 부분의 용융 온도인 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 57 항에 있어서, PCR 의 사이클 2에 대한 어닐링 온도는 대략 주형 DNA 에 어닐링하는 제 1 프라이머의 3'영역의 부분의 용융 온도인 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 58 항에 있어서, PCR 의 나머지 사이클에 대한 어닐링 온도는 대략 전 제 2 프라이머의 융용온도인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 36 항에 있어서, 관심있는 유전자좌의 서열은 대립유전자 특이적 PCR, 질량 분광, 혼성화, 프라이머 연장, 형광 분극, 형광 공명 에너지 전달(FRET), 형광 검출, 서열결정, 생거 디데옥시 서열결정, DNA 마이크로어레이, 서던 블릇, 도트블롯, 및 MALDI-TOF 질량 분광으로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 태아 DNA 상의 관심있는 유전자좌의 서열을 결정하는 방법으로서,
    (a) 제 1 프라이머 및 제 2 프라이머를 사용하여 주형 DNA 상의 관심있는 유전자좌를 증폭시키는 단계로서, 제2의프라이머가 제한효소에 대한 인식부위를 포함하여 제한효소로의 절단이 관심있는 유전자좌를 포함하는 5' 돌출부를 생성하는 단계;
    (b) 제 2 프라이머상의 인식부위를 인식하는 제한효소로 증폭된 DNA 를 절단하는 단계;
    (c) 주형으로서 관심있는 유전자좌를 포함하는 5' 돌출부를 사용함으로써 (b) 의 절단된 DNA 내로 뉴클레오티드를 통합시키는 단계; 및
    (d) (c) 의 DNA 의 서열을 결정함으로써 관심있는 유전자좌의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  62. 제 61 항에 있어서, 임신한 여성의 샘플로부터 주형 DNA 를 얻는 단계와 임신한 여성의 샘플에 세포 용해 저해제를 첨가하는 단계를 더 포함하며, 상기 주형 DNA 는 태아 DNA 와 모계 DNA 를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 62 항에 있어서, 상기 임신한 여성의 샘플은 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 및 질 분비액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 63 항에 있어서, 상기 샘플은 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 62 항에 있어서, 상기 세포 용해 저해제는 글루타알데히드, 글루타알데히드의 유도체, 포름알데히드, 포름알데히드의 유도체, 및 포르말린으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 1 항 내지 제 65 항 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위한 키트로서, 방법에 사용된 프라이머의 세트와 설명서 세트를 포함하며, 제 2 프라이머는 제한효소로의 절단으로 관심있는 유전자좌를 함유하는 5' 돌출부가 생성되도록 제한효소에 대한 인식부위를 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
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