CN112301119A - 猫类多重遗传病筛查的方法、引物和试剂盒 - Google Patents
猫类多重遗传病筛查的方法、引物和试剂盒 Download PDFInfo
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-
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Abstract
本发明公开了一种猫类多重遗传病筛查的方法，所述方法包括步骤：1)获取来自猫的含有DNA的样品；2)从所述含有DNA的样品中提取DNA；3)构建二代测序文库，得到含有需要检测的20个DNA靶点的DNA片段，使用的引物如下：SEQ ID NO.1‑40，其中所述引物每两个依次组成正向引物和反向引物；4)对文库进行测序；5)分析测序数据，得到40个疾病位点的DNA突变情况；6)根据突变情况预测或者诊断疾病。本发明还公开了用于猫类多重遗传病筛查的引物和试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，特别涉及一种猫类多重遗传病筛查的方法和试剂盒。
背景技术
猫类遗传病筛查的方法目前主要分为两大类，第一类：通过临床表征结合生化实
验方法对猫类遗传病进行诊断；第二类：通过PCR和Sanger测序对引起遗传病的突变位点定性鉴定。
上述两类产品的技术缺点如下：第一类：1)只有疾病发作时才能检测出来，往往丧失了预防，延缓以及治疗的黄金时间；2)很多遗传疾病在发病期症状很相似，甚至在做完很多种临床表征检查或者生化检测后都很难确诊出具体病症；3)猫类不像人类可以用语言描述其真实感受，给疾病确诊带来了更大的挑战。第二类：1)PCR和Sanger测序的成本很高，如果猫类需要全面筛查几十甚至上百种遗传病，往往成本太大而难以实现2)全面筛查多种疾病的时候需要大量的猫类唾液或者血液样本，给采样带来很多麻烦。
因此，本领域中需要一种猫类多重遗传病筛查的方法和试剂盒。
发明内容
本发明通过唾液DNA提取，加上靶向高通量测序试剂盒，来达到对20个疾病位点的检测。 因此，在第一方面，本发明提供了一种猫类多重遗传病筛查的方法，所述方法包括步骤：
1)获取来自猫的含有DNA的样品；
2)从所述含有DNA的样品中提取DNA；
3)构建二代测序文库，得到含有需要检测的20个DNA靶点的DNA片段，使用的引物 如下：
4)对文库进行测序；
5)分析测序数据，得到20个疾病位点的DNA突变情况；
6)根据突变情况预测或者诊断疾病。
在一个实施方案中，所述含有DNA的样品为来自猫的唾液。
在一个实施方案中，在步骤4)中使用Illumina二代测序仪进行测序。
在第二方面，本发明提供了一种猫类多重遗传病筛查的试剂盒，所述试剂盒包括
如下引物：SEQ ID NO .1-40，其中所述引物每两个依次组成正向引物和反向引物。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包括获取来自猫的含有DNA的样品的试剂，所述样品优选为唾液。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包括从样品中提取DNA的试剂。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包括对文库进行测序的试剂。
在第三方面中，本发明还提供了一种猫类多重遗传病筛查的引物组，所述引物组
包括如下引物：SEQ ID NO .1-40，其中所述引物每两个依次组成正向引物和反向引物。
本发明的优点在于：与现有方案一相比，用DNA信息进行疾病诊断，所以准确并且有预见性，可以在疾病发病前检测出来患病风险。与现有方案二相比，因为可以通过二代测序平台同时检测多个位点，从而极大的降低了成本，提高了检测速度，并减少了对初始DNA样本量的要求。
应当理解，前述大体的描述和后续详尽的描述均为示例性说明和解释，并不应当
用作对本发明所要求保护内容的限制。
具体实施方式
在本发明中，本发明人发现猫类基因组上20个位点与疾病相关，为了检测这20个位点，发明人首先获得了20个DNA序列，通过这些序列可以唯一定位相应位点，这20个DNA序列和相应突变位点。
在本发明中，对于每个位点的而言，使用引物设计均能设计数十种引物进行相应
位点的检测，本发明为了将这20组引物在一个试剂盒中进行检测，经过了繁琐的实验验证，发现长度为18-25的引物彼此干扰最小，因此每个位点的引物中选择这个长度范围的引物 进行进一步测定，对于没有这个范围引物的位点，选择最接近这个范围的3对引物进行测定。同时，发明人考虑了不同位点的引物之间的序列相似性，将每个序列与其他选中序列的平均相似性定在20％，并且与任一其他选中序列的相似性不大于40％，以下并且越小越优选。选中了如下序列：
在本发明中，对于SEQ ID NO .X而言，X为奇数为正向引物，X为偶数则为反向引物。
本发明的方法与现有方案一相比，用唾液或者血液中的DNA信息进行疾病诊断。与现有方案二相比，设计出可以在同一反应进行扩增的PCR引物，通过二代测序平台同时检测多个位点。
通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方
法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。
实施例
本实施例中，实验步骤如下：
1 .取得4只猫的唾液样品(编号猫1-4)。
提取唾液样品的步骤如下
1)使用一次性采样棉签。将棉签头***猫嘴唇和上牙龈之间，按住上嘴唇，轻轻转动棉签头10次。
2)取出棉签 ,不要让棉签头接触任何污染源。
3)晾干棉签15分钟。
2 .提取从所述唾液样品分别提取DNA。
使用赛默飞(Thermo Fisher)的 gDNA Buccal Cell Kit试剂盒
从棉签中提取猫基因组DNA(步骤参照产品说明书)。
3 .用本发明的引物，构建二代测序文库，得到含有需要检测的20个DNA靶点的DNA片段(多重PCR+二代测序减少了实验成本，提高了实验速度)。 本发明的引物通过生工合成，构建文库使用Illumina TrueSeq library prep kit进行建库。
4 .用Illumina二代测序仪对文库进行测序。
测序在IMH-bio进行，使用的是Illumina Hiseq 2000测序仪。
5 .分析测序数据，得到20个疾病位点的DNA突变情况。
其中，猫2在“多囊肾”位点处携带致病基因；猫4在“维生素D佝偻症”位点处携带致病基因。猫2和猫4的其他19个位点正常；猫1和猫3在全部20个位点正常。
6 .验证
选取20个位点数据的样品通过PCR和Sanger测序进行验证。
结果这20个位点的测序结果与用步骤5中的结果完全一致。
结合这里披露的本发明的说明和实践，本发明的其他实施例对于本领域技术人员
都是易于想到和理解的。说明和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真正范围和主旨均 由权利要求所限定。
序列表
<110> 北京宠耀基因科技服务有限公司
<120> 猫类多重遗传病筛查的方法、引物和试剂盒
<130> 2019.7.17
<141> 2019-07-19
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 1
ggctgctagg ccatacttgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
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cctccattgg cccatctcag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 3
tagactcgca tctcatacac 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
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ccttcatcag gctacatcc 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
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tcactggagg acacataatg 20
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<400> 6
ctcagacggt caggaact 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
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<212> DNA
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gagaagaatg tatgtgcgag agt 23
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
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<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
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<213> 人工序列(未知)
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 21
ggtgttgttg acctggaa 18
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
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<211> 19
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<213> 人工序列(未知)
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<213> 人工序列(未知)
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gacaaggtcc ctcagagaat ccc 23
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<400> 40
ttctcctggt caacgactg 19
Claims (8)
1.一种猫类多重遗传病筛查的方法，所述方法包括步骤：
1)获取来自猫的含有DNA的样品；
2)从所述含有DNA的样品中提取DNA；
3)构建二代测序文库，得到含有需要检测的20个DNA靶点的DNA片段，使用的引物如下：
SEQ ID NO .1-40，其中所述引物每两个依次组成正向引物和反向引物；
4)对文库进行测序；
5)分析测序数据，得到20个疾病位点的DNA突变情况；
6)根据突变情况预测或者诊断疾病。
2.根据权利要求1所述的方法，所述含有DNA的样品为来自猫的唾液。
3.根据权利要求1所述的方法，在步骤4)中使用Illumina二代测序仪进行测序。
4.一种猫类多重遗传病筛查的试剂盒，所述试剂盒包括如下引物：SEQ ID NO .1-40，其中所述引物每两个依次组成正向引物和反向引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，所述试剂盒还包括获取来自猫的含有DNA的样品的试剂，所述样品优选为唾液。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，所述试剂盒还包括从样品中提取DNA的试剂。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，所述试剂盒还包括对文库进行测序的试剂。
8.一种猫类多重遗传病筛查的引物组，所述引物组包括如下引物：SEQ ID NO .1-40，其中所述引物每两个依次组成正向引物和反向引物。
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Publications (1)
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| CN201910688040.2A Pending CN112301119A (zh) | 2019-07-29 | 2019-07-29 | 猫类多重遗传病筛查的方法、引物和试剂盒 |
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- 2019-07-29 CN CN201910688040.2A patent/CN112301119A/zh active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20210202 |