WO2014134790A1 - 神经纤维瘤病pcr诊断试剂盒 - Google Patents

神经纤维瘤病pcr诊断试剂盒 Download PDF

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WO2014134790A1
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贺雄雷
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广州百赫医疗信息科技有限公司
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • Neurofibromatosis is a benign peripheral neuropathy [Raphael Rubin, David S. Strayer (2008 Baltimore). Rubin's Pathology: Clinicopathologic Foundation of Medicine (5 ed.). Wolters Kluwer Health: Lippincot Williams & Wilkins. pp. 201-3. ISBN 978-0-7817-9516-6]. Its histologically originated from the connective tissue of the periendron of the peripheral nerve sheath, causing damage to the nervous system and other tissues through growth and compression, often involving organs originating from the ectoderm, such as the nervous system, eyes and skin, etc.
  • NF is an autosomal dominant genetic disease, that is, as long as one copy of the genetic gene is defective, it is enough to cause the disease. It also shows that if one of the parents has the disease, the incidence of the child is 50%. About 50% of the cases in clinical cases are caused by new mutations in the individual's own genes. 50% is family inheritance.
  • NF2 neurofibromatosis type 1
  • NF2 neurofibromatosis type 2
  • Neurofibromatosis type 2 NF2
  • the NF1 pathogenic gene is called the neurofibromatosis protein 1 gene (Neurofibromin 1, NF1 gene) located on the autosome 17qll.2.
  • the gene encodes a neurofibromin protein that negatively regulates the RAS signaling pathway by interacting with the GTPase [John Barone (2008). USMLE Step 1 Lecture Notes: Pathology. KAPLAN Inc. pp. 57.].
  • NF2 neurofibromin 2
  • gene also known as Mer/[gene] located on autosome 22ql2.
  • the gene is also a tumor suppressor gene, but its specific mechanism of action is still unclear.
  • This gene mutation causes NF2 type [Rouleau GA, Merel P, Lutchman M, Sanson M, Zucman J, Marineau C, Hoang-Xuan K, Demczuk S, Desmaze C, Plougastel B (1993). "Alteration in a new gene encoding a putative membrane-organizing protein causes neuro-fibromatosis type 2". Nature 363 (6429): 515-21.
  • the clinical diagnostic criteria for NF1 and NF2 are as follows:
  • Obvious skeletal lesions such as sphenoid dysplasia, long tubular cortical bone, accompanied by pseudoarticular formation;
  • NF2 nerve growth factor 2
  • NF2 nerve growth factor 3
  • the patient has 2 of the following lesions: neurofibromatosis, meningioma, glioma, Schwann cell tumor, adolescent lens posterior capsule opacity.
  • a neurofibroma diagnostic kit comprising at least one of the following primers:
  • PCR primer pair for NF1 gene point mutation/small fragment insertion deletion detection is selected from primer pair 1 ⁇ 58;
  • the PCR primer pair for the NF1 gene LOH detection is selected from the primer pair 75 ⁇ 100; the PCR primer pair for the NF2 gene LOH detection is selected from the primer pair 101 ⁇ 113;
  • the primer pairs 1 to 113 are as follows:
  • the kit contains at least 75 to 113 pairs of primer pairs.
  • the kit contains primer pairs 1 to 113.
  • a method for diagnosing a neurofibromatosis includes the following steps: 1) extracting the whole genome of the test subject and performing PCR amplification using any of the above primer pairs 1 to 113;
  • ENST00000338641 Perform an alignment or compare the results of sequencing with their parental samples to determine whether the subject has a genetic mutation that causes neurofibromatosis.
  • the kit of the invention has the following advantages in detecting NF: 1) short time-consuming, only about 5 days in total time consumption; 2) complete coverage, including major possible defect forms of NF1 and type 2 pathogenic genes; 3) diagnosis Flexible and accurate, it can comprehensively detect two different defects of genes, can also detect NF1 or NF2 genes or even some gene regions, and can also detect different types of gene defects; 4) Low cost, compared with existing NF production The cost of pre-screening is reduced by approximately 90%.
  • the longest transcript ENST00000338641 is selected as the target region, and the transcript has a total of 16 exons encoding 595 amino acids.
  • the present invention takes a total of 74 exons of two genes, and designs PCR amplification primers in the range of 200 bp upstream to 200 bp downstream of each exon.
  • the primers are required to be between 18-25 bp in length; the amplified product completely covers each exon, and at least 20 bp sequence is left upstream and downstream of the exon to ensure the accuracy of the Sanger sequencing read sequence; the primer Tm value is 55-61.
  • the target fragment was PCR amplified by central template method, using 20 ⁇ l system as standard system: 2 ⁇ 1 DNA template, 12.5 pmol primer, 0.1 mM dNTP, lO PCR buffer, 1.5 ⁇ M MgCl 2 , l.OuTaq enzyme.
  • the recovered fragments were sent to Huada Gene Company for sequencing by the Sanger method.
  • the present invention uses the data of 1000 Genome to select 32 and 19 single-nucleotide polymorphism SNPs in the Asian population on the NF1 gene and the NF2 gene, respectively, at the target SNP site.
  • PCR primers were designed from 300 bp upstream to 300 bp downstream. The primers are required to be between 18-25 bp in length; the ends of the amplified product are at least 20 bp from the target SNP site to ensure accurate Sanger sequencing reads; primers have Tm values between 55 and 61; all primer sequences are associated with human whole genome. The sequences were aligned to ensure primer specificity and avoid false amplification; a total of 39 pairs of primers were designed (NF1: 26 pairs, NF2: 13 pairs). Primer synthesis is carried out using conventional synthetic methods. Primer sequences and target SNP site information are shown in Tables 3 and 4.
  • the genomic template DNA preparation method employs a conventional human genomic DNA template preparation method.
  • LOH test a total of 3 genomic DNA samples of the test subject, the tester's father, and the test subject's mother are prepared.
  • the target fragment was PCR amplified by central template method, and the standard system was 20 ⁇ l: 2 ⁇ 1 (50 ⁇ ) DNA template, 12.5pmol primer, 0.1mMdNTP, lOxPCR buffer, 1.5uMMgC12, l.OuTaq enzyme.
  • FIG. 2 is an electropherogram showing the PCR amplification products of SNP rs2952999 and rs2953000.
  • the first, second, and third lanes are mother, father, and testee (son).
  • Figure 3 is a fragmentation peak of the PCR product. As shown in the figure: The tested father and mother are healthy individuals.

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Abstract

公开了一种神经纤维瘤诊断试剂盒。试剂盒含有以下引物中的至少一对：用于NF1基因点突变/小片段***缺失检测的PCR引物对；用于NF2基因点突变/小片段***缺失检测的PCR引物对；用于NF1基因LOH检测的PCR引物对；用于NF2基因LOH检测的PCR引物对。

Description

神经纤维瘤病 PCR诊断试剂盒 技术领域 本发明涉及一种诊断试剂盒，特别涉及一种用于神经纤维瘤病临床诊断及 产前筛查用的 PCR诊断试剂盒。
背景技术 神经纤维瘤病 (Neurofibromatosis, NF)是一种良性的周围神经疾病 [Raphael Rubin, David S. Strayer (2008 Baltimore). Rubin's Pathology: Clinicopathologic Foundation of Medicine (5 ed.). Wolters Kluwer Health: Lippincot Williams & Wilkins. pp. 201-3. ISBN 978-0-7817-9516-6]。 其组织学上起源于周围神经鞘神 经内膜的***， 通过生长压迫对神经***及其他组织造成伤害， 常累及起 源于外胚层的器官， 如神经***、 眼和皮肤等， 是常见的神经皮肤综合征之一 [Conrad Fischer, Farshad Bagheri, Rajpal Manchandani, Richard Pinsker, Sudheer Chauhan, Parenkumar Patel, Mohammad Maruf, Dhaval Satani, Kaushik Doshi, Ayaz Alwani, Naveen Pathak, Craigh Thurm, Mohammad Babury, Mahendra C. Patel, Arthur Shalanov, Samir Sarkar, Sabiha Raouf, Jebun Nahar, Prakashkumar Patel (2010). Master the Board USMLE Step 2 CK. KAPLAN Medical, p. 287. ISBN 978-1-60714-653-7]。
NF是一种常染色体显性遗传病， 即只要一个拷贝的遗传基因出现缺陷就 足以导致该疾病的发生。 同时表明， 如父母其中一方患有该疾病， 则子女的发 病率为 50%。 在临床病例中约有 50%病例为个体本身基因新发突变造成， 约 50%为家族遗传。
根据其临床表现和致病基因不同， 1988年美国国立卫生研究院 （National Institute of Health ,ΝΙΗ) 将 NF分为神经纤维瘤病 1型 （ Neurofibromatosis type 1， NF1 ) 和神经纤维瘤病 2型 （Neurofibromatosis type 2， NF2)。
NF1型是最常见的一型约占总 NF病例的 90%， 发病率约为 2500-3000分 之 1。 NF1致病基因名为神经纤维瘤蛋白 1基因 （Neurofibromin 1， NF1基因） 位于常染色体 17qll.2。 基因编码神经纤维瘤蛋白， 通过与 GTP酶相互作 用，负调节 RAS信号转导通路 [John Barone (2008). USMLE Step 1 Lecture Notes: Pathology. KAPLAN Inc. pp. 57.]。 当 NF1 基因发生突变 （缺失、 错义突变 ( mis sense mutation)、 无义突变 （nonsense mutation )、 杂合性缺失等) 京尤会造 成神经***周围细胞增殖不受控制， 进一歩引发肿瘤 [Raphael Rubin, David S. Strayer (2008 Baltimore). Rubin's Pathology: Clinicopathologic Foundation of Medicine (5 ed.). Wolters Kluwer Health: Lippincot Williams & WiMns. pp. 201-3. ISBN 978-0-7817-9516-6]。
NF2型发病率约为 45000分之 1， 占 NF总发病数的约十分之一。 其致病 基因名为神经纤维瘤蛋白 2基因 （Neurofibromin 2， 基因） （又名 Mer/ « 基因） 位于常染色体 22ql2。 基因同样为抑癌基因， 但其具体作用机制目 前仍不清楚，该基因突变引起 NF2型 [Rouleau GA, Merel P, Lutchman M, Sanson M, Zucman J, Marineau C, Hoang-Xuan K, Demczuk S, Desmaze C, Plougastel B (1993). "Alteration in a new gene encoding a putative membrane-organizing protein causes neuro-fibromatosis type 2". Nature 363 (6429): 515-21. Golovnina K, Blinov A, Akhmametyeva EM, Omelyanchuk LV, Chang LS (2005). "Evolution and origin of merlin, the product of the Neurofibromatosis type 2 (NF2) tumor-suppressor gene". BMC Evol. Biol. 5: 69.]。
根据 1987年美国 NIH制定的诊断标准， NF1和 NF2型的临床诊断标准如 下：
NF1 :
1 ) 6个或以上的牛奶咖啡斑， ***前最大直径 5mm以上， ***后 15mm以上；
2) 2个或以上任意类型神经纤维瘤或 1个丛状神经纤维瘤；
3 ) 腋窝或腹股沟褐色雀斑；
4) 视神经胶质瘤；
5 ) 2个或以上 Lisch结节， 即虹膜错构瘤；
6) 明显的骨骼病变： 如蝶骨发育不良， 长管状骨皮质菲薄， 伴有假关节 形成；
7) 一级亲属中有确诊 NF1的患者。
上述标准符合 2条或以上者可诊断 NF1。
NF2
1 ) 双侧听神经瘤；
2) 有 NF2家族史 （一级亲属中有 NF2患者）， 患单侧听神经瘤；
3 ) 有 NF2家族史（一级亲属中有 NF2患者），患者有以下病变中的 2中： 神经纤维瘤、 脑膜瘤、 胶质瘤、 雪旺氏细胞瘤、 青少年晶状体后囊浑浊斑。
上述标准符合 1项即可诊断 NF2。
针对 NF的治疗， 目前除了外科手术外没有比较有效的手段。 有不到 10% 的 NF病人会发生癌变， 这部分病人病情可以通过化疗得到有效的控制。 由于 NF 为常染色体显性遗传疾病， 目前也可以通过产前筛查 （Preimplantation Genetic Diagnosis, PGD) 的方式来对胚胎进行筛查， 但现行 PGD筛查耗时较 长， 约需 1年时间 [NF2 Planned Parenthood: Current prenatal testing options]。 为了降低患者的风险， 有必要开发出一种用于神经纤维瘤的诊断试剂盒。 发明内容 本发明的目的在于提供一种神经纤维瘤诊断试剂盒及检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种神经纤维瘤诊断试剂盒， 含有以下引物中的至少一对：
用于 NF1基因点突变 /小片段***缺失检测的 PCR引物对；
用于 NF2基因点突变 /小片段***缺失检测的 PCR引物对；
用于 NF1基因 LOH检测的 PCR引物对；
用于 NF2基因 LOH检测的 PCR引物对；
其中： 用于 NF1基因点突变 /小片段***缺失检测的 PCR引物对选自引物 对 1〜58；
用于 NF2基因点突变 /小片段***缺失检测的 PCR弓 1物对选自弓 1物对 59〜
74；
用于 NF1基因 LOH检测的 PCR引物对选自引物对 75〜 100; 用于 NF2基因 LOH检测的 PCR引物对选自引物对 101〜113；
所述的引物对 1〜113如下：
序号 上游引物序列 下游引物序列
1 CCTCTTCCCTCACCTCAGC TCCCCTCACCTACTCTGTCC
2 ACGTCATGATTTTCAATGGCAAG TCCCCAAAACACAGTAACCCA 上游引物序列 下游引物序列
GATGTGTGTTGATTGGTAGCAGA GACTGTCCTCTTGGTCCACAT
TCTATTTTAGCAACCAAAGGACACA CCCATGTGGATTTACACACTAACC
GGTTTTTACTTTTTAGGTTACAGGA TGGTGTTCTAGTTCAGCACAAT
TGGAAAGTTATTTTGCTCTGAGTT TGATTCAGGATGCTAACAACAGC
TCACTGTAAAGACATGTGGTTCT AGGTTTTTATGTCACAAGTAGGCA
TGTTGCCCTTGGGTTTTTACAT GCCTAAAGTAATACACACCTTGAG
AACCACAAATATAAATTATGCATTC GTCCATTTAGGCTGATGAACA
TGCCATTTGTGTGGGTAATGT GTTTATAAAGGATAACAGCATCAGT
ATTGATGTTCGTTTCAAGACCT ACCATGGAGAAATTTTCCTATTTCA
AACAGAGCATACAACTCACGTAAT ACCAAAGCAGCAGGAATAGGAT
AACGATTTTCATTGTTTTGTTAAGC GAGACGTCTTAGTTTTCAGGT
ACTTGGTACCCTTTAGCAGTCA ACTCACAGAAACCACACACCA
TCTGTCTGTATTATTCCCTAGAGGT TGCTGTGATACTTTTCTTACAGT
ACCTGTAGACTTATTTCCTTTGAT TTTGCCAGTCATTGTCCTCTG
AAAGAATTAAGTAAACCTTGTTTGT ACAAACAGAGCACATAAAATGA
ATGTCTTCCACCCTTGACTCT ATGTGCTTTGAGGCAGACTGA
ACTCCTTTTGGGTGGAGCTT CTGGGAGGGGTGTTTCTGTT
TGAAACTTGGCTGTAGCTGA ACTTTACTGAGCGACTCTTGAA
CATGGAAGAAATGTTGGATAAAGCA ACTTTACCTGTCCTTGGGAGTC
TAGGGGGTCTGTCTTCTGGG ACCAGTATCAGTGTGTAAGAGGT
TGCCTTCTCTTTTGTCTATATCTGA TCCTCCTTTCTACCAATAACCGC
AGGTGTGTGTGTGGCTTCAA AACTCTCACAGTAAAACCCACT
TCTGGGATCTGCATATTAACTCA TCCTAGTCCTGTCATGGGTAT
CATGTCCAACATAGCACACTTCA CTTGTCTGGAGATCCTTGTGGT
TGCCAACGTAGACAGTGGTC CAGGTCTAGTGGTGCCAACC
GGGATTGTTTGCACTAACCTGA ATCAGCCCTGCACATTCTGT
TGTGCAGGGCTGATTGTCTT GAAGGTGCCTTGCTTCATGC
TAGGTTAGAACCATCAGAGAGCC ATCTCTAACTGTAAGCATACCTGG
AGTCGGTGCTGTGACTTGTT AGGTCAAATAGGCTGAAGTGAAGA
TCAACTCCTTGTTTTTAGGTGGT GCTGAAAATTTAGTTGGAAGGGGAA
ACCCTGTTTTATTGTGTAGATACTT TGGCAAGAAAATTACCTGCGT
AATTCAAACATAAGTCTGGGTGT TGCAAAGTAAAAAGCACTATTCAT
GGGAGTTTAAATGACAGGGC TGGTGGCAAACTCTCCTTCT
GTGCATGTTGCCAAATTACCCT AGCAGCTACTAGATACCGACCA
TTTTCCTTAGGTTCAAAACTGGTCA AGGGGTAGGACACCTAGGGA
CCACCACTTTCCAGGTTGGT AGCAACAAACCCCAAATCAAAC
CATTTGTGTTTTCTCCTAGGTCAGC TGGAAAATTCTGAAATGAAAGGGTT
ATTTTCATTGACCATCACATGCT CCCTAGTGTCTAGCGCAGTG
TTTTCATATTGATTAGGCTGTTCCA AGTACAGAAGGCAAAAGAAAAGTGA
TGTGCTAAAACTTTGAGTCCCAT TGGAGAAAGGAACTGGTAAACACA 上游引物序列 下游引物序列
CTCTTACAGAAGAGACCAAGCAAG CATTTTGGCTTCTATACCTCCATGA
CTTGCATGGACTGTGTTATTGGT TCTTGGTTGCAGGGATGGAT
TTCTGTGGATCTTTTAATTGCAGA TATTTGGGAGAAGTGAGGGCG
TGTTCCTGAATTCATTCCGAGATTC AGTAACATTCAACACTGATACCCA
TGCTTTATTTTTAACTGCAGTGTGT AGCAACAAGAAAAGATGGAAGAGT
TTGACTGTCTTGCACCAGTT TCACTTATTCAAATTACTTCTGGTT
ACCTCAGCAGATGCTTGTTCA CCACGCAACCGCCAAAAA
AGGTACTATGCTCTTTAGGAGACTG CTGCTGCTTGCCTCCATTAG
CACTTGGAAGGAGCAAACGA GATAAACTAACCAAGCAACTTCTTA
AGCTTAAACACTTTATGTCCAAACA TGACTTTCATGTACTCTCCCACC
TGCTGCAGAAACTCAGAGGAT AGGGCCTCCTAAAAGTAGACTG
AGTCTTCTACTTCTCACCCAAACA AGACAGGCACGAAGGTGAAT
TGGCACATTATTCTGGGGAATGTAT AGCGCGCATGTTAGCAAGTT
AGGTTTTAGTTGCTTTGACACTC CAACACCATGCTGCCTCCT
TGGCTTCAGATGGGGATTTACT GGGAATTCCTAATGTTGGTGTCT
TCCCCGTTGTTAAGCGACAC AAGCAAGCAAGCTTCACACG
CTGAGGCCTGTGCAGCAA AACCTCTCGAGCTTCCACCT
CCCCACGTTTTGGAACCTGA TCAGCCCCACCAGTTTCATC
AGGCTTCTTTGAGGGTAGCAC CTCTGAGGCCAACTCTGCAA
CCCTCATTAGAACGCCGTGA CTCTCTGAAGTACAGAAAACCCA
AGGGAATGAGATTGGTCCAGC TTCCAATATTCCTTCAAGTCCTTTG
TGATGCATAATTATAAAAGTGGCAA AAGCATGTCCTAGTTTTGCAGT
TGGCAGGGTCAGAATGCTTG ATCGCCTTGGAATGAAGAAGT
TGTGACAGTGTGTGCCAGATT GATCTGCTGGACCCATCTGC
TGGTTGCGCATTTGTGGAAT ACTTCACAAGATGTCACTCTGA
GGCCAGTAGGCAGTGAAGTA GGACTGACCACACAGTGACA
TCTCGAGCCCTGTGATTCAA CCAAGTAGCCTCCTGGAACC
GCACATGATCCCACTTCAGC TGTAGAGCTCAGCCTCAGGG
GTGGGGTGGTGTCTTTTCCT GCACCGCCAGATGAACTGAA
TGCTGGAGGATCGGTTGTCA GCACAGGGGGCTACATACTT
TGCATGATACCCTCTTGCCG AGGAAACCAGATGCCAACCG
GCCACCTTTGAGGTGAGTCC TGATATCTGGTCCATCCCGC
AGCCCTTCCGCTTGGAAATG ACGACGTTGTAGGGCATCAC
TGTTAGGATATTTTGCAATGGTGTG CCAGAGACTAGTCACGCTCTC
TCTTGTTTGTTTTTATTTAGGCCA TGTATAAAGGCTGAGTGGTCA
AGGCCAGGATAGCTTTGTAGC CAAGAGAATGGAGCACACTCA
TCAGATGTGTGTTGATTGGTAGC CTCATGAAAAATTGTCTGTCACC
CCCATGCATCTCTTACTCTGCT TGTAGAAAGGCAAATAACGCAGT
TGCTGAAAGCACCAAACGTA AAGTGATGAACTCAAGTAGGGCA
ACATTAATTTTCCAAATGAGAGCAC AGCAGTATGGGAAACTGTTACAT 序号 上游引物序列 下游引物序列
83 TGTGGCTAGTTACTTTAATTGTGAA TTAGCCTCAAACCAAGGGGG
84 TGGTGCAAAAACGATTTTCATTGT GCAAGAGCTTTGGATCTGCAT
85 GAAAACAGGGGCCCGAAACC ACAAAGCAAGTAAACCCCTTCTTT
86 GACTGTTTGTTGCAGAGACCATT GCATGACAAAAACACCATGGAGGA
87 AGTTGATACGGCCTTCACTA TAGGGAGTTCTCCTTGATCACC
88 AAACATACTTAACCTTGTCTCTCTT TAGGCCAACCAAGAAGCTGA
89 ACCAGGGAGTGAAGACAACATT ATCACAGACACGAAGGAGCA
90 CAGGCCAATCGGTGATAGCTT TGTCCCAAATTGCCTCTCAGTC
91 AGGGAAGGGTTGGTACACAGT ATTGGCACAATTCTTTGGGAAAGC
92 AAGTCTCTTTATGCCTTGTTACT GGTCGGTAAATTGACCCTCAG
93 ATGCAGGAGATGTACAGAGAAGTT ACAGGTAGTTAGATGGGAGAAGT
94 TGTGCCATATGGAAAGATAAAGGAT TTCCCTATGTAGCAACAGTGGTT
95 ACTGTCACAGCCCGACTCTA CCCCACAACTTGATGAGGTC
96 TAGGATGGTCTGACCTTATCCCA ATGGTAATCTCTTGCTGCTCTGA
97 TCTTGTTTTCTTCAACAAACTCACT CCATTTGGGAAGGTAAAACATGC
98 CAGCATTTTAAAAGCACTGATTAAC CATTCCCCAGAATAATGTGCCA
99 TGGCTGTCTATTCAATCACCTG GGTGAATAAAAGAAAAGGCATCT
100 CTCAACACCTGTTCATGACTGAG TCATTATGCCTGGGAGTCGG
101 TCGCAGCATCTATGCGTCAG GCTCATGCGGGAAGCGAT
102 GCACTACTTGCTGCATTGCT ATGCTGGAATGATCTGCAATGTT
103 AGTCAGGGGTTGTGTTTCGT GTCTATGAGCTTGACATGACTTTGT
104 CCTGTGATTGGACTGTCTGGT CAGGTTCCAAAACGTGGGGA
105 TCCCTTAGAGCAGCACGTTG GGAAGTGAGGTGTGTAGGCT
106 TTCCCCTTAAGGTAGGTGCC TCTTATGGGTTTGAAATGTTGCCT
107 AGGTATGTGTACTGCCTGTCA GCAAAAGCAATGGGATAGCCA
108 TGTGTACTGCAGATGGGTCC TCTGCCACATGTATCAAGCAC
109 TGCCTACCTGGTGGGATGTC TGCTGATAGATGCTCCTGGC
110 TGGATAACAGGCAACAGGGC GACTTCCAACTGCATGGCAC
111 GTTGGACACTTTGTGGGTGG TAGGGGGCTCTACAAATACCAG
112 ACCTTCCCTTGCTTTAGGAACA AAAGAACCTGGTACCCAGCC
113 GAATACTGAGGTGCCTCCCC CCAGGCCCTAAAATGTTCGC
优选的， 试剂盒中至少含有引物对 1〜74对。
优选的， 试剂盒中至少含有引物对 75〜113对。
优选的， 试剂盒中含有引物对 1〜113。
一种神经纤维瘤诊断方法， 包括如下歩骤： 1)提取待检者的全基因组并使用上述引物对 1〜113中的任一对进行 PCR 扩增；
2)回收纯化 PCR扩增产物并测序；
3)将将测序所得结果与 Ensembl e70 标准数据 （ ENST00000358273，
ENST00000338641 ) 进行比对或与其父母亲样本测序结果进行比对， 确定待检者是否存在引发神经纤维瘤的基因突变。
本发明试剂盒检测 NF具有以下优点： 1 ) 耗时短， 总耗时仅需要约 5天 时间； 2) 覆盖面完整， 包含了 NF1型和 2型致病基因的主要可能缺陷形式； 3 ) 诊断灵活准确， 既可对两个基因不同缺陷型进行全面检测， 也可针对 NF1 或 NF2基因甚至部分基因区域进行检测， 也可针对不同基因缺陷类型进行检 测； 4) 成本低， 比现有 NF产前筛查花费降低约 90%。
附图说明 图 1， NF1基因点突变检测 PCR扩增产物测序峰图
图 2， NF1基因 LOH检测 PCR扩增产物电泳图
图 3， 基因 LOH检测 PCR扩增产物测序峰图。
具体实施方式
(一）点突变 /小片段***缺失检测
1 ) 点突变 /小片段***缺失检测 PCR引物设计合成
人 基因 （Eensembl ENSG00000196712， NCBI Gene ID :4763 )位于人 染色体 17qll.2 (29,421,945-29,709,134) 全长 287kb。 本发明选取最长的转录 本 ENST00000358273为目标区域，该转录本共计 58个外显子，编码蛋白 2839 个氨基酸。 基因 （Eensembl ENSGOOOOO 186575， NCBI Gene ID :4771 ) 位 于人染色体 22ql2.2 ( 29,999,545-30,094,587 )全长 95kb。 本发明选取最长的转 录本 ENST00000338641为目标区域， 该转录本共计 16个外显子， 编码 595个 氨基酸。 本发明全取两个基因共 74个外显子， 在每个外显子上游 200bp至下 游 200bp范围内设计 PCR扩增引物。引物要求长度在 18-25bp之间；扩增产物 完整覆盖每个外显子， 且在外显子上下游留有至少 20bp序列以保证 Sanger测 序读取序列的准确； 引物 Tm值在 55~61之间； 所有引物序列均与人全基因组 序列进行比对， 保证引物特异性， 避免错误扩增； 共设计引物 74对 （NF1 : 58对， NF2: 16对）。 引物合成采用常规合成方法。 引物序列及目标扩增区域 信息见表 1、 2。
2) 基因组模板 DNA制备
基因组模板 DNA制备方法采用常规人基因组 DNA模板制备方法
3 ) PCR扩增
采用中心模板法 PCR扩增目的片段， 以 20μ1体系为标准体系： 2μ1 DNA 模板、 12.5 pmol引物、 0.1 mM dNTP、 lO PCR缓冲液 、 1.5 μ M MgCl2、 l.OuTaq 酶。
循环条件是： 94 °C 3分钟； 循环 94°C 30秒、 60°C 30秒、 72°C 30秒、 循环 35次， 最后 72V 10分钟。
Figure imgf000010_0001
表 1 NFl基因外显子 PCR扩增引物
序
基因组位置 上游引物序列 下游引物序列 号
6 29508440-29508507 TGGAAAGTTATTTTGCTCTGAGTT TGATTCAGGATGCTAACAACAGC
7 29508728-29508803 TCACTGTAAAGACATGTGGTTCT AGGTTTTTATGTCACAAGTAGGCA
8 29509526-29509683 TGTTGCCCTTGGGTTTTTACAT GCCTAAAGTAATACACACCTTGAG
9 29527440-29527613 AACCACAAATATAAATTATGCATTC GTCCATTTAGGCTGATGAACA
10 29528055-29528177 TGCCATTTGTGTGGGTAATGT GTTTATAAAGGATAACAGCATCAGT
11 29528429-29528503 ATTGATGTTCGTTTCAAGACCT ACCATGGAGAAATTTTCCTATTTCA
12 29533258-29533389 AACAGAGCATACAACTCACGTAAT ACCAAAGCAGCAGGAATAGGAT
13 29541469-29541603 AACGATTTTCATTGTTTTGTTAAGC GAGACGTCTTAGTTTTCAGGT
14 29546023-29546136 ACTTGGTACCCTTTAGCAGTCA ACTCACAGAAACCACACACCA
15 29548868-29548947 TCTGTCTGTATTATTCCCTAGAGGT TGCTGTGATACTTTTCTTACAGT
16 29550462-29550585 ACCTGTAGACTTATTTCCTTTGAT TTTGCCAGTCATTGTCCTCTG
17 29552113-29552268 AAAGAATTAAGTAAACCTTGTTTGT ACAAACAGAGCACATAAAATGA
18 29553453-29553702 ATGTCTTCCACCCTTGACTCT ATGTGCTTTGAGGCAGACTGA
19 29554236-29554309 ACTCCTTTTGGGTGGAGCTT CTGGGAGGGGTGTTTCTGTT
20 29554541-29554624 TGAAACTTGGCTGTAGCTGA ACTTTACTGAGCGACTCTTGAA
21 29556043-29556483 CATGGAAGAAATGTTGGATAAAGCA ACTTTACCTGTCCTTGGGAGTC
22 29556853-29556992 TAGGGGGTCTGTCTTCTGGG ACCAGTATCAGTGTGTAAGAGGT
23 29557278-29557400 TGCCTTCTCTTTTGTCTATATCTGA TCCTCCTTTCTACCAATAACCGC
24 29557860-29557943 AGGTGTGTGTGTGGCTTCAA AACTCTCACAGTAAAACCCACT
25 29559091-29559207 TCTGGGATCTGCATATTAACTCA TCCTAGTCCTGTCATGGGTAT
26 29559718-29559899 CATGTCCAACATAGCACACTTCA CTTGTCTGGAGATCCTTGTGGT
27 29560020-29560231 TGCCAACGTAGACAGTGGTC CAGGTCTAGTGGTGCCAACC
28 29562629-29562790 GGGATTGTTTGCACTAACCTGA ATCAGCCCTGCACATTCTGT
29 29562936-29563039 TGTGCAGGGCTGATTGTCTT GAAGGTGCCTTGCTTCATGC
30 29576002-29576137 TAGGTTAGAACCATCAGAGAGCC ATCTCTAACTGTAAGCATACCTGG
31 29579956-29580018 AGTCGGTGCTGTGACTTGTT AGGTCAAATAGGCTGAAGTGAAGA
32 29585362-29585520 TCAACTCCTTGTTTTTAGGTGGT GCTGAAAATTTAGTTGGAAGGGGAA
33 29586050-29586147 ACCCTGTTTTATTGTGTAGATACTT TGGCAAGAAAATTACCTGCGT
34 29587387-29587533 AATTCAAACATAAGTCTGGGTGT TGCAAAGTAAAAAGCACTATTCAT
35 29588729-29588875 GGGAGTTTAAATGACAGGGC TGGTGGCAAACTCTCCTTCT
36 29592247-29592357 GTGCATGTTGCCAAATTACCCT AGCAGCTACTAGATACCGACCA
37 29652838-29653270 TTTTCCTTAGGTTCAAAACTGGTCA AGGGGTAGGACACCTAGGGA
38 29654517-29654857 CCACCACTTTCCAGGTTGGT AGCAACAAACCCCAAATCAAAC
39 29657314-29657516 CATTTGTGTTTTCTCCTAGGTCAGC TGGAAAATTCTGAAATGAAAGGGTT
40 29661856-29662049 ATTTTCATTGACCATCACATGCT CCCTAGTGTCTAGCGCAGTG
41 29663351-29663491 TTTTCATATTGATTAGGCTGTTCCA AGTACAGAAGGCAAAAGAAAAGTGA
42 29663653-29663932 TGTGCTAAAACTTTGAGTCCCAT TGGAGAAAGGAACTGGTAAACACA
43 29664386-29664600 CTCTTACAGAAGAGACCAAGCAAG CATTTTGGCTTCTATACCTCCATGA
45 29664837-29664898 CTTGCATGGACTGTGTTATTGGT TCTTGGTTGCAGGGATGGAT
45 29665043-29665157 TTCTGTGGATCTTTTAATTGCAGA TATTTGGGAGAAGTGAGGGCG 表 1 NF1基因外显子 PCR扩增引物
序
基因组位置 上游引物序列 下游引物序列 号
46 29665722-29665823 TGTTCCTGAATTCATTCCGAGATTC AGTAACATTCAACACTGATACCCA
47 29667523-29667663 TGCTTTATTTTTAACTGCAGTGTGT AGCAACAAGAAAAGATGGAAGAGT
48 29670027-29670153 TTGACTGTCTTGCACCAGTT TCACTTATTCAAATTACTTCTGGTT
49 29676138-29676269 ACCTCAGCAGATGCTTGTTCA CCACGCAACCGCCAAAAA
50 29677201-29677336 AGGTACTATGCTCTTTAGGAGACTG CTGCTGCTTGCCTCCATTAG
51 29679275-29679332 CACTTGGAAGGAGCAAACGA GATAAACTAACCAAGCAACTTCTTA
52 29683478-29683600 AGCTTAAACACTTTATGTCCAAACA TGACTTTCATGTACTCTCCCACC
53 29683878-29684108 TGCTGCAGAAACTCAGAGGAT AGGGCCTCCTAAAAGTAGACTG
54 29684287-29684387 AGTCTTCTACTTCTCACCCAAACA AGACAGGCACGAAGGTGAAT
55 29685498-29685640 TGGCACATTATTCTGGGGAATGTAT AGCGCGCATGTTAGCAAGTT
56 29685887-29686133 AGGTTTTAGTTGCTTTGACACTC CAACACCATGCTGCCTCCT
57 29687505-29687721 TGGCTTCAGATGGGGATTTACT GGGAATTCCTAATGTTGGTGTCT
58 29701031-29701173 TCCCCGTTGTTAAGCGACAC AAGCAAGCAAGCTTCACACG 表 1中， 基因组的位置均在 chrl7上。
Figure imgf000012_0001
表 2中， 基因组的位置均在 chr22上。 4) PCR产物电泳检测与回收纯化
扩增完成后对扩增产物进行 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测， 并将目的片段用 "Takara胶回收试剂盒"参照说明书进行回收纯化。
5 ) 目的片段 Sanger测序
将回收片段送华大基因公司进行 Sanger法测序。
6) 序列比对与结果分析
将测序所得结果与 Ensembl e70 标准数据 （ ENST00000358273， ENST00000338641 )进行比对， 检测是否发生点突变， 并判断突变类型为： 同 义突变、 错义突变还是无义突变， 图 1为检测 NF!基因点突变测序峰图， 箭 头所指位置一个拷贝的 NF1基因发生一个 A-T点突变。
(二） LOH (杂合性缺失）检测
1 ) LOH检测 PCR引物设计合成
本发明利用 lOOOGenome的数据分别在 NF1基因和 NF2基因上选取亚洲 人群高频 （>0.1 )单核苷酸多态性（Single-nucleotide polymorphism SNP)位点 32个和 19个， 在目标 SNP位点上游 300bp至下游 300bp范围内设计 PCR引 物。 引物要求长度在 18-25bp之间； 扩增产物两端距目标 SNP位点至少 20bp 以保证 Sanger测序读取序列的准确； 引物 Tm值在 55~61之间；所有引物序列 均与人全基因组序列进行比对， 保证引物特异性， 避免错误扩增； 共设计引物 39对 （NF1 : 26对， NF2: 13对）。 引物合成采用常规合成方法。 引物序列及 目标 SNP位点信息见表 3、 4。
2) 基因组模板 DNA制备
基因组模板 DNA制备方法采用常规人基因组 DNA模板制备方法。 LOH 检测需准备被检测人、本检测人父方、被检测人母方共 3份基因组 DNA样本。
3 ) PCR扩增 采用中心模板法 PCR扩增目的片段， 以 20μ1体系为标准体系： 2μ1 ( 50η) DNA模板、 12.5pmol引物、 0.1mMdNTP、 lOxPCR缓冲液 、 1.5uMMgC12、 l.OuTaq酶。
循环条件是： 94 °C 3分钟； 循环 94°C 30秒、 60°C 30秒、 72°C 30秒、 循环 35次， 最后 72V 10分钟。
4) PCR产物电泳检测与回收纯化
扩增完成后对扩增产物进行 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测， 并将目的片段用 "Takara胶回收试剂盒"参照说明书进行回收纯化。
5 ) 目的基因 Sanger测序
将回收片段送华大基因公司进行 Sanger法测序。
6) 序列比对与结果分析
LOH检测需同时检测被检测人、被检测人父方、被检测人母方 DNA样本， 以确定被检测人致病基因是否发生。 图 2为检测 SNP rs2952999和 rs2953000 位点 PCR扩增产物电泳图， 第 1、 2、 3泳道分别为母亲、 父亲和被检测者（儿 子）。 图 3为 PCR产物测序峰图。 如图所示： 该被检测者父亲、 母亲均为健康 个体，图中测序结果显示 rs2953000位点母亲为 T纯和子，父亲为 C/T杂合子， 而测序峰图显示儿子仅有 C; rs2952999位点母亲为 T纯和子， 父亲为 G/T杂 合子， 而儿子仅有 G， 此两个位点均支持被检测者 基因在此处发生 LOH。
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001

Claims

权 利 要 求 书 一种神经纤维瘤诊断试剂盒， 含有以下引物中的至少一对：
用于 基因点突变 /小片段***缺失检测的 PCR引物对；
用于 NF2基因点突变 /小片段***缺失检测的 PCR引物对；
用于 NF1基因 LOH检测的 PCR引物对；
用于 NF2基因 LOH检测的 PCR引物对；
其中： 用于 基因点突变 /小片段***缺失检测的 PCR引物对选自引物对 1〜58；
用于 NF2基因点突变 /小片段***缺失检测的 PCR引物对选自引物对 59〜 74；
用于 基因 LOH检测的 PCR引物对选自引物对 75〜100；
用于 基因 LOH检测的 PCR引物对选自引物对 101〜113；
所述的引物对 1〜113如下：
序号 上游引物序列 下游引物序列
CCTCTTCCCTCACCTCAGC TCCCCTCACCTACTCTGTCC
ACGTCATGATTTTCAATGGCAAG TCCCCAAAACACAGTAACCCA
GATGTGTGTTGATTGGTAGCAGA GACTGTCCTCTTGGTCCACAT
TCTATTTTAGCAACCAAAGGACACA CCCATGTGGATTTACACACTAACC
GGTTTTTACTTTTTAGGTTACAGGA TGGTGTTCTAGTTCAGCACAAT
TGGAAAGTTATTTTGCTCTGAGTT TGATTCAGGATGCTAACAACAGC
TCACTGTAAAGACATGTGGTTCT AGGTTTTTATGTCACAAGTAGGCA
TGTTGCCCTTGGGTTTTTACAT GCCTAAAGTAATACACACCTTGAG
AACCACAAATATAAATTATGCATTC GTCCATTTAGGCTGATGAACA
TGCCATTTGTGTGGGTAATGT GTTTATAAAGGATAACAGCATCAGT
ATTGATGTTCGTTTCAAGACCT ACCATGGAGAAATTTTCCTATTTCA
AACAGAGCATACAACTCACGTAAT ACCAAAGCAGCAGGAATAGGAT
AACGATTTTCATTGTTTTGTTAAGC GAGACGTCTTAGTTTTCAGGT
ACTTGGTACCCTTTAGCAGTCA ACTCACAGAAACCACACACCA
TCTGTCTGTATTATTCCCTAGAGGT TGCTGTGATACTTTTCTTACAGT
ACCTGTAGACTTATTTCCTTTGAT TTTGCCAGTCATTGTCCTCTG
AAAGAATTAAGTAAACCTTGTTTGT ACAAACAGAGCACATAAAATGA
ATGTCTTCCACCCTTGACTCT ATGTGCTTTGAGGCAGACTGA 上游引物序列 下游引物序列
ACTCCTTTTGGGTGGAGCTT CTGGGAGGGGTGTTTCTGTT
TGAAACTTGGCTGTAGCTGA ACTTTACTGAGCGACTCTTGAA
CATGGAAGAAATGTTGGATAAAGCA ACTTTACCTGTCCTTGGGAGTC
TAGGGGGTCTGTCTTCTGGG ACCAGTATCAGTGTGTAAGAGGT
TGCCTTCTCTTTTGTCTATATCTGA TCCTCCTTTCTACCAATAACCGC
AGGTGTGTGTGTGGCTTCAA AACTCTCACAGTAAAACCCACT
TCTGGGATCTGCATATTAACTCA TCCTAGTCCTGTCATGGGTAT
CATGTCCAACATAGCACACTTCA CTTGTCTGGAGATCCTTGTGGT
TGCCAACGTAGACAGTGGTC CAGGTCTAGTGGTGCCAACC
GGGATTGTTTGCACTAACCTGA ATCAGCCCTGCACATTCTGT
TGTGCAGGGCTGATTGTCTT GAAGGTGCCTTGCTTCATGC
TAGGTTAGAACCATCAGAGAGCC ATCTCTAACTGTAAGCATACCTGG
AGTCGGTGCTGTGACTTGTT AGGTCAAATAGGCTGAAGTGAAGA
TCAACTCCTTGTTTTTAGGTGGT GCTGAAAATTTAGTTGGAAGGGGAA
ACCCTGTTTTATTGTGTAGATACTT TGGCAAGAAAATTACCTGCGT
AATTCAAACATAAGTCTGGGTGT TGCAAAGTAAAAAGCACTATTCAT
GGGAGTTTAAATGACAGGGC TGGTGGCAAACTCTCCTTCT
GTGCATGTTGCCAAATTACCCT AGCAGCTACTAGATACCGACCA
TTTTCCTTAGGTTCAAAACTGGTCA AGGGGTAGGACACCTAGGGA
CCACCACTTTCCAGGTTGGT AGCAACAAACCCCAAATCAAAC
CATTTGTGTTTTCTCCTAGGTCAGC TGGAAAATTCTGAAATGAAAGGGTT
ATTTTCATTGACCATCACATGCT CCCTAGTGTCTAGCGCAGTG
TTTTCATATTGATTAGGCTGTTCCA AGTACAGAAGGCAAAAGAAAAGTGA
TGTGCTAAAACTTTGAGTCCCAT TGGAGAAAGGAACTGGTAAACACA
CTCTTACAGAAGAGACCAAGCAAG CATTTTGGCTTCTATACCTCCATGA
CTTGCATGGACTGTGTTATTGGT TCTTGGTTGCAGGGATGGAT
TTCTGTGGATCTTTTAATTGCAGA TATTTGGGAGAAGTGAGGGCG
TGTTCCTGAATTCATTCCGAGATTC AGTAACATTCAACACTGATACCCA
TGCTTTATTTTTAACTGCAGTGTGT AGCAACAAGAAAAGATGGAAGAGT
TTGACTGTCTTGCACCAGTT TCACTTATTCAAATTACTTCTGGTT
ACCTCAGCAGATGCTTGTTCA CCACGCAACCGCCAAAAA
AGGTACTATGCTCTTTAGGAGACTG CTGCTGCTTGCCTCCATTAG
CACTTGGAAGGAGCAAACGA GATAAACTAACCAAGCAACTTCTTA
AGCTTAAACACTTTATGTCCAAACA TGACTTTCATGTACTCTCCCACC
TGCTGCAGAAACTCAGAGGAT AGGGCCTCCTAAAAGTAGACTG
AGTCTTCTACTTCTCACCCAAACA AGACAGGCACGAAGGTGAAT
TGGCACATTATTCTGGGGAATGTAT AGCGCGCATGTTAGCAAGTT
AGGTTTTAGTTGCTTTGACACTC CAACACCATGCTGCCTCCT
TGGCTTCAGATGGGGATTTACT GGGAATTCCTAATGTTGGTGTCT
TCCCCGTTGTTAAGCGACAC AAGCAAGCAAGCTTCACACG 上游引物序列 下游引物序列
CTGAGGCCTGTGCAGCAA AACCTCTCGAGCTTCCACCT
CCCCACGTTTTGGAACCTGA TCAGCCCCACCAGTTTCATC
AGGCTTCTTTGAGGGTAGCAC CTCTGAGGCCAACTCTGCAA
CCCTCATTAGAACGCCGTGA CTCTCTGAAGTACAGAAAACCCA
AGGGAATGAGATTGGTCCAGC TTCCAATATTCCTTCAAGTCCTTTG
TGATGCATAATTATAAAAGTGGCAA AAGCATGTCCTAGTTTTGCAGT
TGGCAGGGTCAGAATGCTTG ATCGCCTTGGAATGAAGAAGT
TGTGACAGTGTGTGCCAGATT GATCTGCTGGACCCATCTGC
TGGTTGCGCATTTGTGGAAT ACTTCACAAGATGTCACTCTGA
GGCCAGTAGGCAGTGAAGTA GGACTGACCACACAGTGACA
TCTCGAGCCCTGTGATTCAA CCAAGTAGCCTCCTGGAACC
GCACATGATCCCACTTCAGC TGTAGAGCTCAGCCTCAGGG
GTGGGGTGGTGTCTTTTCCT GCACCGCCAGATGAACTGAA
TGCTGGAGGATCGGTTGTCA GCACAGGGGGCTACATACTT
TGCATGATACCCTCTTGCCG AGGAAACCAGATGCCAACCG
GCCACCTTTGAGGTGAGTCC TGATATCTGGTCCATCCCGC
AGCCCTTCCGCTTGGAAATG ACGACGTTGTAGGGCATCAC
TGTTAGGATATTTTGCAATGGTGTG CCAGAGACTAGTCACGCTCTC
TCTTGTTTGTTTTTATTTAGGCCA TGTATAAAGGCTGAGTGGTCA
AGGCCAGGATAGCTTTGTAGC CAAGAGAATGGAGCACACTCA
TCAGATGTGTGTTGATTGGTAGC CTCATGAAAAATTGTCTGTCACC
CCCATGCATCTCTTACTCTGCT TGTAGAAAGGCAAATAACGCAGT
TGCTGAAAGCACCAAACGTA AAGTGATGAACTCAAGTAGGGCA
ACATTAATTTTCCAAATGAGAGCAC AGCAGTATGGGAAACTGTTACAT
TGTGGCTAGTTACTTTAATTGTGAA TTAGCCTCAAACCAAGGGGG
TGGTGCAAAAACGATTTTCATTGT GCAAGAGCTTTGGATCTGCAT
GAAAACAGGGGCCCGAAACC ACAAAGCAAGTAAACCCCTTCTTT
GACTGTTTGTTGCAGAGACCATT GCATGACAAAAACACCATGGAGGA
AGTTGATACGGCCTTCACTA TAGGGAGTTCTCCTTGATCACC
AAACATACTTAACCTTGTCTCTCTT TAGGCCAACCAAGAAGCTGA
ACCAGGGAGTGAAGACAACATT ATCACAGACACGAAGGAGCA
CAGGCCAATCGGTGATAGCTT TGTCCCAAATTGCCTCTCAGTC
AGGGAAGGGTTGGTACACAGT ATTGGCACAATTCTTTGGGAAAGC
AAGTCTCTTTATGCCTTGTTACT GGTCGGTAAATTGACCCTCAG
ATGCAGGAGATGTACAGAGAAGTT ACAGGTAGTTAGATGGGAGAAGT
TGTGCCATATGGAAAGATAAAGGAT TTCCCTATGTAGCAACAGTGGTT
ACTGTCACAGCCCGACTCTA CCCCACAACTTGATGAGGTC
TAGGATGGTCTGACCTTATCCCA ATGGTAATCTCTTGCTGCTCTGA
TCTTGTTTTCTTCAACAAACTCACT CCATTTGGGAAGGTAAAACATGC
CAGCATTTTAAAAGCACTGATTAAC CATTCCCCAGAATAATGTGCCA 序号 上游引物序列 下游引物序列
99 TGGCTGTCTATTCAATCACCTG GGTGAATAAAAGAAAAGGCATCT
100 CTCAACACCTGTTCATGACTGAG TCATTATGCCTGGGAGTCGG
101 TCGCAGCATCTATGCGTCAG GCTCATGCGGGAAGCGAT
102 GCACTACTTGCTGCATTGCT ATGCTGGAATGATCTGCAATGTT
103 AGTCAGGGGTTGTGTTTCGT GTCTATGAGCTTGACATGACTTTGT
104 CCTGTGATTGGACTGTCTGGT CAGGTTCCAAAACGTGGGGA
105 TCCCTTAGAGCAGCACGTTG GGAAGTGAGGTGTGTAGGCT
106 TTCCCCTTAAGGTAGGTGCC TCTTATGGGTTTGAAATGTTGCCT
107 AGGTATGTGTACTGCCTGTCA GCAAAAGCAATGGGATAGCCA
108 TGTGTACTGCAGATGGGTCC TCTGCCACATGTATCAAGCAC
109 TGCCTACCTGGTGGGATGTC TGCTGATAGATGCTCCTGGC
110 TGGATAACAGGCAACAGGGC GACTTCCAACTGCATGGCAC
111 GTTGGACACTTTGTGGGTGG TAGGGGGCTCTACAAATACCAG
112 ACCTTCCCTTGCTTTAGGAACA AAAGAACCTGGTACCCAGCC
113 GAATACTGAGGTGCCTCCCC CCAGGCCCTAAAATGTTCGC
2. 根据权利要求 1所述的诊断试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒中至少含有引 物对 1〜74对。
3. 根据权利要求 1所述的诊断试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒中至少含有引 物对 75〜： 113对。
4. 根据权利要求 1所述的诊断试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒中含有引物对
1〜113。
5. 一种神经纤维瘤诊断方法， 包括如下歩骤：
1) 提取待检者的全基因组并使用上述引物对 1〜113中的任一对进行 PCR扩 增；
2) 回收纯化 PCR扩增产物并测序；
3) 将将测序所得结果与 Ensembl e70 标准数据 （ ENST00000358273， ENST00000338641 ) 进行比对或与其父母亲样本测序结果进行比对， 确 定待检者是否存在引发神经纤维瘤的基因突变。
PCT/CN2013/072211 2013-03-06 2013-03-06 神经纤维瘤病pcr诊断试剂盒 WO2014134790A1 (zh)

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