CN104892711B - 基于芯片进行规模化快速制备单根寡核苷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于芯片进行规模化快速制备单根寡核苷酸的方法，具体是基于DNA微芯片和聚丙烯酰胺凝胶分离方法，规模化快速分离制备单根寡核苷酸的方法。本发明还公开了以规模化制备单根寡核苷酸的芯片上寡核苷酸合成序列的设计方法。该方法可以在22h之内得到纳摩尔级的PAGE纯度的独立的双链寡核苷酸。该方法得到的单根寡核苷酸的花费最低可降至$0.009/碱基，并且，随着单张芯片合成量的提高，成本可以进一步降低。本发明成功制备615根不同的寡核苷酸，分为88个寡核苷酸亚库，合成寡核苷酸总长度达62,809个碱基。
Description
技术领域
本发明涉及芯片合成寡核苷酸的技术领域，特别是涉及单根寡核苷酸低成本规模化制备方法。更具体的说，本发明涉及利用聚丙烯酰胺凝胶分离方法对芯片合成所得的寡核苷酸混合物进行分离的方法。本发明还涉及针对单根寡核苷酸快速制备方面的芯片上寡核苷酸库的设计方法。
背景技术
标准的DNA化学合成是从3’端到5’端延长核苷酸链的循环过程。二十世纪八十年代，已经发展了四步法亚磷酰胺化学合成方法[1]。这个方法现在仍被大多商业化DNA合成公司所采用。该过程将酸活化的脱氧核苷亚磷酰胺(Deoxynucleoside phosphoramidite)分子耦合到一个被固定在固相上(一般是硅材质表面)的脱氧核苷酸分子上。在第一个合成循环中，核苷酸链将从第一个被固定在表面的受保护的核苷酸分子开始延伸。其中，经常采用的固定化表面主要是可控孔度玻璃(controlled pore glass，CPG)或者聚苯乙烯珠子(polystyrenebeads,PS beads)。目前，基于四步法合成方法的DNA全自动合成仪已经可以将单次合成的通量从1根提高到1,536根序列[2]。目前，商业化提供的CPG合成长寡核苷酸(<60nt)的价格可以达到$0.10-0.20/nt，较长的寡核苷酸及进一步合成的基因价格大约是$0.40-1.00/bp[3]。
传统的DNA合成方法受到通量和成本限制，合成的寡核苷酸只能充当PCR或者定点突变的引物。但随着DNA化学合成技术的发展，尤其是基于微阵列技术的并行合成寡核苷酸合成技术的发展[4][5,6]，大量寡核苷酸序列可以在几厘米见方的芯片上并行合成，通量得到提升，对应的成本也随之降低，可以直接应用到代谢工程改造、药物开发、基因组功能分析等领域。
人工合成的高保真的寡核苷酸多用来制作单链核酸探针，检测序列特异性的分子，包括DNA与蛋白质、药物或其他配体分子之间的相互作用，从而应用到核酸杂交、原位杂交荧光检测(FISH)、噬菌体展示、核磁共振NMR等技术中[7]。另外，DNA或RNA可以在细胞内结合序列互补的基因组DNA或转录的mRNA，造成基因沉默或蛋白表达水平下调，引起表型的改变。因此，寡核苷酸也可以应用到基因功能检测、基因治疗相关的药物开发等方面。比如，双链DNA寡核苷酸可以作为检测哺乳细胞对外源DNA相关应答的工具[8]，也可以用来作为敲除细胞内相关基因序列或调控序列从而研究基因功能的工具。
另外，蛋白表达相关调控因子，如启动子、核糖体结合位点等序列都是短的DNA(即寡核苷酸)序列，这种类型的寡核苷酸可以直接进行人工合成。因此，研究者们可以通过理性设计和构建寡核苷酸文库，来达到优化蛋白质表达的目的。如Schlabach,M.R.等人通过人工设计合成了一套启动子文库，分别克隆到含有GFP基因的表达载体中，控制表达蛋白产生荧光信号，经过FACS筛选得到强启动子，用来优化哺乳细胞内蛋白表达水平[9]。
寡核苷酸相关分子，包括反义RNA[10],aptamers[11]、siRNAs(small-interfering RNAs)[12]等可以选择性调控疾病相关基因的表达，具有成为治疗人类疾病的药物的潜力。在发达国家，已经有不少分子进入了临床研究[13]。而反义寡核苷酸，可以直接作为药物治疗疾病，如Isis’s Vitravene就是市场上开发的第一个治疗患视网膜炎的AIDS病人的寡核苷酸药物[14].另外，dsDNA可以克隆到转录载体中直接转录得到RNA分子，比如microRNA前体等，继而应用到各项RNA干扰相关的研究中。近些年来，双链RNA包括siRNA(small interfering RNA)和shRNA(short hairpin RNA)[15,16]的研究进入快速发展阶段。其中，shRNA可以通过化学合成单链后退火得到，也可以通过RNA聚合酶III转录寡核苷酸DNA模板得到。通常60-100bp的双链DNA寡核苷酸中含有19-29bp与目标基因同源的序列，并且该部分序列存在两份，形成回文结构，经过酶切，会形成发夹结构[17]。因此，人工合成长寡核苷酸除了可以作为长链DNA组装的起始元件，还可以用来构建RNA转录模板文库及各种短DNA文库，在很大程度上扩大了寡核苷酸应用的范围。
化学合成的寡核苷酸可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)[18]、高效液相色谱(HPLC)[19]、毛细管电泳(CE)等方法进行纯化。一般PAGE纯化是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA后，从凝胶中回收目标DNA。该方法得到的DNA纯度可以大于90％，尤其对大于50mer的寡核苷酸有效。使用HPLC的方法纯化DNA更加高效且方便，可以达到很高的纯度(>95％)和灵敏度，但是成本相比PAGE方法偏高，且更适用于小于50mer的未修饰寡核苷酸。已经商业化应用的HPLC纯化选用的有简易反相柱C18柱、反相净化滤芯(RPC)纯化柱等。其中C18柱对DNA有特异性吸附，可以被有机溶液洗脱，而不会被水洗脱，因此能有效地去除盐分，但不能有效去除比目的片段小的小片段。RPC纯化原理与反相HPLC一样，但是更加有效且经济。超高效液相色谱(UPLC)是一种比HPLC方法更快速、更高效和更高分辨率的DNA检测分离技术。已发展的纯化方法多用于纯化寡核苷酸化学合成中的N-1长度的边反应产物，目标产物是单一的一条DNA。
目前，商业化提供的CPG合成寡核苷酸(<60nt)的价格一般在$0.10-0.20/nt，更长的寡核苷酸(<200nt)价格大约会上升到到$0.40-1.00/nt[3]。众所周知，CPG合成方法可以提供大量高保真性的寡核苷酸DNA，但是存在通量低、成本高的缺点。因此，过去二十年，基于芯片的寡核苷酸合成方法得到快速发展，该方法可以提高合成通量并降低成本[3,20- 25]。有报道称420,000根寡核苷酸可以在同张芯片上合成，成本可以降到0.001-10美分/nt[3,24]。但是芯片合成方法得到的寡核苷酸是一个复杂的混合物(序列不同，长度也可能不同)[26]，单种寡核苷酸的量极低(104-106个分子)[27]。目前单根寡核苷酸的商业合成还是使用CPG合成方法，限制了寡核苷酸在代谢工程改造、药物开发、基因组功能分析等方面的应用潜力。所以，更高通量、更低成本的单根寡核苷酸合成方法应该被开发。目前还没有基于芯片大规模制备单根寡核苷酸的技术的报道。基于芯片合成的寡核苷酸混合库，分离独立寡核苷酸时，可以采用的方法是直接分离方法或者特异性引物扩增。但是具有以下难点：(1)单独寡核苷酸的绝对量极少(104-106个分子[27])，无法直接应用到下游，也无法直接进行分离(单种寡核苷酸的浓度过低，也不足以分辨)；(2)背景序列复杂[26]，因此无论是直接分离(背景序列长度不一，具有相同长度的寡核苷酸也不在少数，因此无法直接分离)，还是选择性扩增(复杂背景导致非特异性扩增)，都存在技术难度。同时，特异性扩增需要合成序列特异的引物，针对整张芯片不同寡核苷酸序列进行特异性引物合成的话，成本过高。
发明内容
基于上述问题，本发明建立了一套基于芯片合成的高通量低成本的单根寡核苷酸规模化分离制备方法。本发明以一种新的、基于微芯片的高并行DNA原位合成方法[28,29]进行寡核苷酸的大量合成。采用的4K芯片可以最高合成接近4,000根不同的寡核苷酸。在设计寡核苷酸序列时，引入通用引物将芯片合成的全部寡核苷酸分成一系列亚库，从而降低寡核苷酸混合物的复杂性；每个亚库含有5-11根长度不同的寡核苷酸，相邻长度的寡核苷酸相差至少4碱基，从而可以通过PAGE方法分辨并分离。另外，得到的寡核苷酸序列中包括目标序列及其两端的通用引物，该序列可以通过IIS型内切酶移除引物得到目标寡核苷酸；也可以作为模板，根据使用者的需求使用通用引物来自行扩增。本发明通过芯片合成了615根不同的寡核苷酸，分为88个寡核苷酸亚库，合成寡核苷酸总长度达62,809碱基，构成了包括绿色荧光蛋白、木糖异构酶、三种纤维素酶编码基因(共6,441碱基对)，以及223种线虫来源的microRNA前体模板DNA(共19,930碱基对)。通过条件优化，本发明可以在22h之内得到纳摩尔级的PAGE纯度的分离的双链寡核苷酸,花费最低可降至$0.004/碱基，并且，随着单张芯片合成量的提高，成本可以进一步降低。本发明可以提供的单根寡核苷酸从通量、成本、产量和保真度方面都可以满足科研中对大量独立寡核苷酸序列的需求，在通量和成本方面优于目前商业化提供的单根寡核苷酸(>60碱基)，极大地填补了单根寡核苷酸(>60碱基)高通量低成本合成这方面的空白。
具体地，本发明提供一种高通量合成和纯化寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：1)设计寡核苷酸序列，在寡核苷酸两端加上通用引物，以将合成的全部寡核苷酸分成若干亚库，不同亚库具有不同的通用引物，同一亚库具有相同通用引物，所述通用引物上含有IIS型内切酶的酶切位点；2)进行基于微芯片的DNA原位合成并洗脱合成产物；3)利用所述通用引物对所述合成产物进行PCR扩增；4)分离扩增产物。
在一个优选的实施方案中，所述亚库以要合成的寡核苷酸片段大小来分配。
在一个优选的实施方案中，在寡核苷酸和一侧的通用引物之间还具有接头序列。
在一个优选的实施方案中，所述接头序列在所述寡核苷酸的3’端。
在一个优选的实施方案中，所述接头序列含有IIS型内切酶的酶切位点。
在一个优选的实施方案中，每个亚库含有5-11根长度不同的寡核苷酸。
在一个优选的实施方案中，每个亚库中相邻长度的寡核苷酸相差至少4个碱基。
在一个优选的实施方案中，步骤4)中的分离使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行。
在一个优选的实施方案中，所述聚丙烯酰胺凝胶浓度为8％-10％且为非变性的。
在一个优选的实施方案中，所述方法在步骤4)后还包括用IIS型内切酶酶切和/或用相应通用引物选择性PCR扩增分离后的独立寡核苷酸的步骤。
在一个优选的实施方案中，所述IIS型内切酶是内切酶Sch I，Bbs I或Bsa I。
在一个优选的实施方案中，所述微芯片是4k芯片。
附图简述
图1单根寡核苷酸制备分离原理。芯片合成的寡核苷酸混合库中的单根寡核苷酸序列两端可以引入不同组的通用引物对，通过PCR扩增得到独立的各个寡核苷酸亚库。每个寡核苷酸亚库包含5-11根不同的寡核苷酸，这些寡核苷酸具有不同长度，相邻寡核苷酸之间的长度差别至少4碱基。
图2单根寡核苷酸设计原理。需要合成的目标寡核苷酸两端引入通用引物，该引物部分序列可以通过IIS型限制性内切酶切除，而不会破坏目标序列，也不会残留额外的碱基。有些寡核苷酸两端除了通用引物序列，另外还在DNA的3’端引入了接头序列，该接头序列同样可以通过IIS型内切酶切除。
图3寡核苷酸亚库完整性验证设计原理(基因组装)。分离寡核苷酸亚库得到的单根寡核苷酸可以通过基因序列组装来验证是否存在序列缺失或错误(非目标寡核苷酸序列)。此处，构成同一根基因片段的寡核苷酸并不属于扩增时同一组寡核苷酸亚库。基因序列通过软件DNAWorks或TmPrimer切割成为多个片段，进而切割成一组寡核苷酸。这些寡核苷酸可以通过后续的组装得到全长基因DNA。
图4PAGE分离寡核苷酸亚库。8％PAGE分离寡核苷酸亚库(A,B)。A.EGFP亚库a1的8％PAGE分离，目标条带(泳道1)如箭头所示，分别是101bp,110bp,115bp,120bp,125bp；B.CtCBH 6个亚库的分离(泳道1～6)，每个亚库分别含有9,9,8,8,8,5根不同的寡核苷酸。以上相邻大小的寡核苷酸之间的差异至少4个碱基。其中，CtCBH亚库2(泳道2)的目的条带使用箭头标注，分别是73bp,80bp,85bp,91bp,96bp,101bp,105bp,109bp,115bp。以上泳道M表示20bpDNA Ladder Marker(Takara)。
图5单根寡核苷酸组装片段DNA。A.PAGE分离CtCBH亚库3，泳道M:20bp DNA laddermarker(Takara)；泳道1:CtCBH亚库3寡核苷酸，目标条带71bp-116bp,共8条寡核苷酸序列；B.分离后再扩增的单根寡核苷酸(可组装成为TrCBH片段2)，泳道1～11:组成TrCBH片段2的11条分离后的寡核苷酸；C.Sch I对合成的寡核苷酸(构成TrCBH片段2)进行酶切，寡核苷酸在酶切前后的大小差别30个碱基的通用引物序列长度，泳道1：酶切前；泳道2：酶切后；D.酶切后的寡核苷酸组装成为TrCBH片段2，目标片段334bp，泳道1：组装使用构成该片段序列的完整的11条寡核苷酸；泳道2：组装时缺一条寡核苷酸；E.CtCBH全长基因的融合，目标片段1.6kb(泳道1)。
图6制备单寡核苷酸的完整性验证。分离制备得到的寡核苷酸用于组装基因DNA全长，并进行测序验证。目的基因分别是OXI(1.3kb),TrCBH(1.4kb),CtCBH(1.6kb)和TrEG1(1.3kb)。
图7单根寡核苷酸分离制备时间成本。第一步：芯片合成寡核苷酸(<12h)；第二步：从芯片上洗脱寡核苷酸混合物(1小时)；第三步：寡核苷酸亚库扩增(1-1.5小时)；第四步：寡核苷酸亚库内的单根寡核苷酸分离(3小时)；第五步：分离后的单根寡核苷酸进行选择性扩增(使用通用引物或者特异性引物)(1-1.5小时)；第六步：含有不同通用引物结合序列的寡核苷酸混合进行退火反应，暴露DNA链上的错误碱基，形成错配(3小时)；第七步：MICC纠错，该***全称是MutS固定化纤维素柱，基于MutS错配结合蛋白对双链上呈现的错误配对进行结合，同时与MutS融合在一起的纤维素结合结构域又与纤维素结合，在纤维柱上的MutS蛋白结合正确配对和错配的能力是不同的，时间差导致正确DNA与错误DNA分离开来(15分钟)；第八步：选择性扩增纠错后的单根寡核苷酸(1-1.5小时)；第九步：下游应用，如寡核苷酸文库构建或DNA组装。从芯片合成到得到单根寡核苷酸，共需要22h。
图8microRNA前体模板DNA序列寡核苷酸设计原理。由于芯片合成能力限制，寡核苷酸合成的最大长度是120nt。因此，大于120nt的目标片段被切割成为2～4根较短的寡核苷酸序列。构成同一根目标片段的寡核苷酸，相邻之间存在重叠区域，重叠区域的Tm统一由软件设计为70℃。
图9分离后的单根寡核苷酸。A.8％ PAGE分离线虫来源microRNA前体模板DNA亚库11，14，16，33寡核苷酸；B.分离后的寡核苷酸使用通用引物重新进行选择性扩增。以上microRNA模板DNA亚库11含有8根寡核苷酸，长度85bp-120bp；亚库14含有7根寡核苷酸，长度87bp-116bp；亚库16含有8根寡核苷酸，长度87bp-117bp；亚库33含有8根寡核苷酸，长度90bp-120bp。Lane M:20bp DNA Ladder Marker(Takara)。
图10制备分离的单根寡核苷酸(microRNA前体DNA模板)。A～R图示意从385根寡核苷酸中选择的一些单根寡核苷酸(来自线虫亚库)，经过分离制备所得产物。每个亚库所含寡核苷酸根数是7～11根，平均长度100bp。
发明详述
基因芯片技术已经在基因合成方面得到广泛应用，以芯片技术合成的寡核苷酸有通量高、成本低的优点。但是芯片得到的寡核苷酸产物复杂度高，单种的寡核苷酸含量低是制约以该方法得到的寡核苷酸直接应用到下游过程的因素。本发明基于芯片合成寡核苷酸方法，并利用聚丙烯酰胺凝胶办法建立一种高通量、低成本、高回收的单根寡核苷酸合成分离***，可直接应用下游过程。以下是本发明的具体描述。
1)寡核苷酸库的设计与合成。
目的寡核苷酸的设计涉及长度分布、引物序列及接头序列的添加。
方法：如图1所示，将全部寡核苷酸序列按照长度分成不同寡核苷酸亚库，在同一个亚库的寡核苷酸序列两端添加相同的通用引物序列，不同亚库的寡核苷酸两端具有不同的通用引物序列。分组后得到一系列由不同长度的寡核苷酸序列构成的寡核苷酸亚库，每个亚库含5～11根不同的寡核苷酸。如图2所示，当同一个亚库内的寡核苷酸序列不可避免地具有相同长度时，在目的序列的3’端添加不同长度的接头序列，使原本长度相同的寡核苷酸序列得以区分。这些额外的通用引物序列及接头序列可以通过内切酶Sch I切除。这类内切酶的识别位点与切割位点不同，使用该酶进行酶切，不会残余额外碱基，也不会切除目的序列本身的碱基，且酶切后形成平末端。
2)芯片合成寡核苷酸库。
目的寡核苷酸的合成涉及光生酸介导的微流体芯片合成***。
方法：本发明合成寡核苷酸采用的平台是基于光生酸介导的微流体芯片合成***[5]，使用的芯片是LC science 4k芯片[5]。
3)寡核苷酸亚库的扩增。
方法：根据设计，每个寡核苷酸亚库内所含的5-11根寡核苷酸可以使用同一对通用引物，通过PCR扩增得到。
4)聚丙烯凝胶酰胺方法分离寡核苷酸。
方法：每组寡核苷酸亚库内的相邻长度的寡核苷酸序列之间相差至少4～5碱基，因此，8％～10％浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用以分离同一亚库内的不同长度的寡核苷酸。分离后的含有单一寡核苷酸条带的胶被直接切割下来浸入TE缓冲液中，使DNA扩散出来。
5)选择性扩增分离后的独立寡核苷酸。
方法：以聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的单根寡核苷酸TE浸出液为模板，使用对应的通用引物选择性扩增单根寡核苷酸，而后使用与通用引物所含IIS型限制性内切酶位点对应的Sch I、Bbs I或Bsa I内切酶切除额外的通用引物序列或者接头序列，得到目的寡核苷酸序列。该步骤的选择性扩增可以多次进行，从而得到使用者所需要的DNA总量。
实施例
试剂和菌株：本发明中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上试剂。KOD plusDNA聚合酶用作寡核苷酸亚库的扩增，购自东洋纺生物公司(TOYOBO)。Pfu DNA聚合酶用于单根寡核苷酸的扩增，购自上海申能***生物公司(BBST)。核酸限制性内切酶、T4连接酶均购自Fermentas中国公司。试剂等除特别注明以外，都购自上海生工。大肠杆菌Escherichiacoli XL10-Gold作为DNA操作时使用的宿主菌。包含100μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基用于培养E.coli。引物由上海生工合成。包含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基用于培养E.coli。引物由上海生工合成。
实施例1
合成构成绿色荧光蛋白、木糖转移酶等编码基因的单根寡核苷酸
本发明合成了3张芯片，分别用来合成绿色荧光蛋白基因(EGFP,GenBank:ACX42327.1,SEQ ID NO：68)、木糖转移酶基因(来自菌株Orpinomyces sp.ukk1，OXI,GenBank序列号:ACA65427.1，SEQ ID NO：69)、三种纤维素酶基因【全称cellobiohydrolaseII，来自Trichoderma reesei菌株(缩写TrCBH,GenBank序列号:ADC83999.1，SEQ ID NO：72)；全称endoglucanase I，来自Trichoderma reesei菌株(缩写TrEG1,GenBank序列号:HM641862.1，SEQ ID NO：71),全称1,4-beta-cellobiosidase来自Chaetomiumthermophilum菌株(缩写CtCBH,GenBank序列号:CAM98448.1，SEQ ID NO：70)】，以此为例，单张芯片合成的寡核苷酸数量从30条上升到156条，合成的总长度从3,060nt上升到14,898nt，单根寡核苷酸长度范围在63～126nt，平均长度基本都在100mer左右(如表1所示)。合成得到的230根寡核苷酸(序列1～230)用于组装成不同基因的全长序列，并进行后续的蛋白质表达和功能验证，以此证明本分明得到的单根寡核苷酸的准确性和可用性。
表1芯片合成寡核苷酸的组分.
寡核苷酸的设计
绿色荧光蛋白EGFP(GenBank:ACX42327.1，SEQ ID NO：68)编码基因使用软件DNAWorks[30]进行针对大肠杆菌E.coli的密码子优化，并移除限制性内切酶位点。木糖异构酶(from Orpinomyces sp.ukk1，OXI,GenBank:ACA65427.1，SEQ ID NO：69)编码基因使用软件DNAWorks[30]进行针对***克鲁维酵母的密码子优化，并移除限制性内切酶位点。三种纤维素酶【全称cellulases including cellobiohydrolase II，来自Trichodermareesei菌株(缩写TrCBH,GenBank序列号:ADC83999.1，SEQ ID NO：72)；全称endoglucanaseI precursor from Trichoderma reesei菌株(缩写TrEG1,GenBank序列号:HM641862.1，SEQ ID NO：71),全称cellulose 1,4-beta-cellobiosidase from Chaetomiumthermophilum菌株(缩写CtCBH,GenBank序列号:CAM98448.1，SEQ ID NO：70)】编码基因使用软件DNAWorks[30]进行针对酿酒酵母的密码子优化，并移除分子克隆过程中载体中多克隆位点所常用的限制性内切酶位点，比如Hind III,Xho I等位点。然后，这些序列被TmPrime软件以Tm一致为原则进行分割，成为230根寡核苷酸序列(平均长度约100nt)。如图3所示，这些寡核苷酸可以组装成为对应的片段，10～11根寡核苷酸完全覆盖约300bp的片段的正负双链，寡核苷酸以相互交错互补配对的原则分布，相邻寡核苷酸之间只存在缺刻，而非缺口，即没有碱基的缺失。寡核苷酸重叠区域的Tm值都设定为70℃。230根寡核苷酸可分成36个亚库，每个亚库含有5～9根寡核苷酸，在每个亚库这些寡核苷酸的5’及3’端添加相同的通用引物序列(15nt)，当两条寡核苷酸长度一致时，在其中一条的寡核苷酸的3’端加入5nt,10nt,15nt,20nt长度的接头序列，从而得到一个含有不同长度寡核苷酸的亚库，每根寡核苷酸长度相差至少4nt(图1)。通用引物序列及接头序列与目的寡核苷酸序列之间存在Sch I酶切位点，便于后续额外序列的切除(图1,2)。构成同一根片段的寡核苷酸被分到不同的亚库中，分离得到单根寡核苷酸后，将属于同一片段的多个寡核苷酸聚集到一起，经过酶切移除引物及接头序列后，才可以进行后续的组装实验。本发明中的寡核苷酸长度以及所使用的通用引物如表2所示。
寡核苷酸亚库的扩增
根据寡核苷酸芯片合成目的不同，三张芯片合成的寡核苷酸亚库分别命名为1)EGFP亚库a1-a3,c1-c3,其中，a1和c1,a2和c2，a3和c3亚库的组合可以组装成为EGFP基因片段1,片段2和片段3；2)OXI亚库1～8,；3)TrCBH亚库1～8；TrEG1亚库1～7；CtCBH亚库1～7。以芯片微流技术(芯片来源：LC SCIENCES,美国休斯敦)制备得到寡核苷酸，从芯片上洗脱得到寡核苷酸(单链DNA)混合物(～20pmol)，其中每条寡核苷酸的量根据不同芯片合成寡核苷酸总量的不同而不同。以单种寡核苷酸0.013fmol为模板，使用对应的通用引物(如表2所示)，采用DNA聚合酶KOD plus(TOYOBO,Japan)进行寡核苷酸亚库的扩增。
PCR反应体系为：
PCR反应条件是：
表2寡核苷酸长度及扩增使用的通用引物序列
寡核苷酸的分离
将扩增得到的寡核苷酸亚库(5～7根不同寡核苷酸)通过8％聚丙烯酰胺凝胶【20cm(长)x0.15cm(宽)x16cm(高)】进行电泳分离。电泳条件是150V预电泳10分钟，上样品(每孔600ng，9pmol)后，冰浴条件下300V电泳3小时。电泳采用脉冲法，即30分钟停顿一次并立即重新开始。或者可以通过10％聚丙烯凝胶【8.5cm(长)x0.10cm(宽)x7.5cm(高)】进行电泳，电泳条件是100V预电泳10分钟，上样品(每孔480ng,7.2pmol)电泳100分钟。PAGE完成后，胶于EB中染色，显示每根寡核苷酸(35ng,0.5pmol)之间至少4bp的差距可以在凝胶中明显区分开(图4)。将每根寡核苷酸直接从凝胶上切割下来捣碎，浸入50μL TE缓冲液中，直接作为下一步选择性扩增的DNA模板材料。
8％聚丙烯酰胺凝胶成分(50mL):
如图4A,B所示，同一个亚库的寡核苷酸在凝胶上可以肉眼分辨到清晰的单个条带，如图5B所示，分离得到的寡核苷酸产物确实是以特异性的单根状态存在的。这说明，本发明基于PAGE分离寡核苷酸的方法是可行的。
单根寡核苷酸的选择性扩增
PAGE分离后的单根寡核苷酸从凝胶切割并捣碎，浸入到TE缓冲液中，DNA会立即扩散溶解到TE缓冲液，以此单根寡核苷酸DNA为模板，采用对应扩增组的寡核苷酸通用引物，使用Pfu DNA聚合酶进行寡核苷酸的选择性扩增。当单一寡核苷酸就是目标产物时，扩增体系是50μL。当得到的单一寡核苷酸还要进行下步组装反应时，扩增体系是20μL。
PCR反应体系为：
PCR反应条件是：
寡核苷酸亚库的完整性验证
为了验证分离得到的亚库内的寡核苷酸是否完整，以证明本方法可以大量制备寡核苷酸序列。以这些寡核苷酸作为原材料，在溶液中进行靶基因序列的组装。首先，将构成同一片段的10～11根已分离后的寡核苷酸混合在一起，进行统一的酶切和之后的拼装。酶切体系如下：
酶切反应混合物：
酶切反应于37℃进行1小时后，采用乙醇沉淀方法进行纯化，并重悬于50μL TE缓冲液中备用。
纯化后的寡核苷酸混合物直接用于片段拼装。拼装采用聚合酶循环拼装方法(PCA)。反应体系如下：
PCA反应体系为：
PCR反应条件是：
以PCA产物为模板，采用片段通用引物(含有Bbs I酶切位点)，使用Pfu DNA聚合酶扩增基因片段。反应如下：
PCR反应体系为：
PCR反应条件是：
得到的产物用3％浓度的琼脂糖电泳进行分离，并使用Axygen凝胶纯化试剂盒(Axygen生物技术公司，中国杭州)进行片段的纯化，洗脱于50ul洗脱液中备用。
以纯化后的基因片段为材料，直接进行基因全长的组装。组装方法采用融合PCR方法。采用相应基因特异性引物序列，以PrimerStar HS DNA聚合酶(Takara，大连)将多个片段一步融合成全长序列。得到的产物采用3％浓度的琼脂糖电泳进行分离，并使用Axygen凝胶纯化试剂盒(Axygen生物技术公司，中国杭州)进行片段的纯化，洗脱于50μL洗脱液中备用。具体反应如下：
PCR反应体系为：
PCR反应条件是：
如图5A-E所示，分离后的寡核苷酸亚库中对应同一根片段的序列被重新混合在一起，两端的通用引物序列通过酶切完全移除，而后组装基因片段乃至基因全长。如图5D所示，当构成一根片段DNA的寡核苷酸缺一根时，片段DNA都无法组装成功，当寡核苷酸的个数完整时，就可以得到目标大小的片段DNA。因此，可以证明我们分离得到的寡核苷酸确实是预期的序列。
分离得到的单一寡核苷酸同样经过测序验证，结果表明这种制备方法完全可以满足下游的直接应用。纯化后的DNA通过加A反应在3’末端加入碱基A。
加A反应体系为：
反应条件是：
Step 1:72 ℃ 30min。
混合液使用乙醇沉淀方法进行纯化，后使用pGEM-T Eazy Vector System I(Promega)试剂盒进行TA连接。
连接反应体系为：
反应条件是：
Step 1:16 ℃ 8hours。
连接产物通过热激法转化入E.coli XL10-Gold感受态细胞。随机挑选克隆进行Sanger测序(送至上海生工)。当PAGE检测条带非常单一时，随机挑选的10个克隆全部都含有目标序列。当PCR效果及分离效果不佳时，随机挑选的7根单寡核苷酸内有4根是目标产物。
组装得到的基因全长，包括EGFP、OXI、TrEG1、TrCBH、CtCBH基因分别进行了测序验证(图6)。
本发明制备的单根寡核苷酸的产量以及成本如表4所示，所需时间成本如图7所示。
表4单根寡核苷酸(>60nt)制备能力
以上实例说明通过本发明的方法可以快速制备高产量的单根寡核苷酸，产物具有高准确性、低成本、高保真性的特点，具有很高的应用价值。
实施例2
合成microRNA前体模板DNA的单根寡核苷酸文库
本发明合成了1张芯片，用来合成223条microRNA前体模板DNA(线虫来源,序列来自miRBase:http://www.mirbase.org/)。以此为例，单张芯片合成的寡核苷酸数量达到385条，合成的模板总长度达到达到19,930nt，单根寡核苷酸长度范围在73～120nt，平均长度基本都在103mer左右，芯片合成寡核苷酸总长度达到39,946nt(表5)。
表5芯片合成信息
试剂和菌株：本发明中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上试剂。KOD plusDNA聚合酶用作寡核苷酸亚库的扩增，购自东洋纺生物公司(TOYOBO)。Pfu DNA聚合酶用于单根寡核苷酸的扩增，购自上海申能***生物公司(BBST)。核酸限制性内切酶、T4连接酶均购自Fermentas中国公司。试剂等除特别注明，都购自上海生工。大肠杆菌Escherichiacoli XL10-Gold作为DNA操作时使用的宿主菌，大肠杆菌E.coli BL21(DE3)作为蛋白表达的宿主菌，购自Invitrogen公司。包含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基用作培养E.coli。引物由上海生工合成。
寡核苷酸的设计及合成
如表6所示，将所有的寡核苷酸(385根寡核苷酸)分为不同的亚库(共52个亚库)，每个亚库含有7～11根不同寡核苷酸(如图1,2所示)。合成的寡核苷酸亚库分别命名为microRNA前体模板DNA线虫亚库1～52。设计的关键点是：(1)引入额外的通用引物序列,将总的寡核苷酸混合库分为一系列寡核苷酸亚库(如表7所示)，降低寡核苷酸的复杂性。通用引物序列内含有IIS型限制性内切酶识别位点，该种内切酶的特点是识别位点和切割位点位于不同位置，进行酶切时，切割位点在识别位点的3’端，间隔多个碱基，如Sch I的切割位点和识别位点间隔5个碱基。这些额外添加的通用引物序列都可以通过IIS型限制性内切酶位点移除，并且不切除本身序列，也不残留额外碱基；(2)每个亚库所含的相邻寡核苷酸之间长度差别至少是4bp，便于下游的分离过程(如图1所示)；(3)同张芯片合成的寡核苷酸分到同一亚库时，不可避免会出现长度一致的情况，此时，需要在目的序列的3’端引入接头序列，使得本来长度相同的DNA显示出长度差异(如图2所示)。这些接头序列长度不一(1～36nt)。其中，大于或等于10nt的接头序列含有IIS型限制性内切酶识别位点，如Sch I、BbsI等，因此这些额外的接头序列可以通过酶切完全移除。而小于10nt的接头序列都添加在无需移除的寡核苷酸序列5’端，这些寡核苷酸序列两端本身含有构建载体时所需的酶切位点。
另外，随着同张芯片上合成寡核苷酸数量的增加，而同组亚库的寡核苷酸个数由于平均长度(～100nt)和相邻之间长度差(>4nt)的限制，很难超过15根，因此需要的通用引物量随之增加。在这里，使用的通用引物是可以使用到不同芯片合成的寡核苷酸文库中的，将一系列预先设计的通用引物库内的引物之间两两组合，可以得到大量区分寡核苷酸亚库的标签，满足大量寡核苷酸的分组。但是，需要注意的一点是，在设计通用引物库时，通用引物序列长15个碱基，其中所含5～6个碱基的IIS型限制性内切酶位点是不可变的，因此可变区只有9～10个碱基，同时该引物需要达到至少43℃的Tm值，因此可变的位置就更少了。结果导致通用引物序列之间可能会存在一定同源性，导致一部分非特异性扩增。因此，在引入通用引物到寡核苷酸序列设计的时候需要特别注意，避免不恰当的引物组合造成的PCR困扰。
构成线虫来源microRNA前体DNA模板的寡核苷酸共385根，最终可以得到223条microRNA前体的模板DNA，分别对应一条microRNA前体(SEQ ID NO：73-295)，这些序列是线虫来源microRNA前体序列，来自miRBase数据库:http://www.mirbase.org/，编号对应如下：
SEQ ID NO：73～295
因为目标长度是41bp～180bp，而芯片合成寡核苷酸的最大长度是120bp，所以，当这些目标DNA序列超过了芯片合成最大长度时，需要利用软件切割成较短的寡核苷酸；未超过芯片最大合成长度的DNA部分，可以直接应用到下游的实验过程中。另外，为了便于后续转录载体的构建，我们在目标片段两端直接引入构建载体所需的酶切位点，或者同源重组位点序列。当目标序列<78bp时，我们在目标序列两端加入酶切识别位点，并且直接在芯片上合成全长序列(<120bp)。当目标序列>78bp时，利用DNAWorks[30]和自建软件将目标序列全长两端引入酶切位点或同源同组位点后，切割成2～4段较短一些的寡核苷酸，相邻寡核苷酸之间重叠区域的Tm设定为70℃，方便后续的融合全长过程(如图8所示)。芯片合成由LCscience公司完成。
表6人工合成短DNA序列信息表
表7寡核苷酸长度及扩增使用的通用引物序列
寡核苷酸亚库的扩增
以芯片微流技术制备得到寡核苷酸，从芯片上洗脱得到寡核苷酸(ssDNA)混合物(～20pmol)，其中每条寡核苷酸的量根据不同芯片合成寡核苷酸总量的不同而不同。以单种寡核苷酸0.013fmol为模板，使用对应的通用引物(如表2所示)，采用DNA聚合酶为KODplus DNA聚合酶进行寡核苷酸亚库的扩增。
PCR反应体系为：
PCR反应条件是：
寡核苷酸的分离
将扩增得到的寡核苷酸亚库(7～11根不同寡核苷酸)通过8％聚丙烯酰胺凝胶【20cm(长)x0.15cm(宽)x 16cm(高)】进行电泳分离。电泳条件是150V预电泳10分钟，上样品(每孔600ng，9pmol)后，冰浴条件下300V电泳3小时。电泳采用脉冲法，即30分钟停顿一次并立即重新开始。每根寡核苷酸(35ng,0.5pmol)之间至少4bp的差距可以在凝胶中明显区分开(图5A)。将每根寡核苷酸直接从凝胶上切割下来浸入50μL TE缓冲液中，作为下一步选择性扩增的DNA模板材料。
8％聚丙烯酰胺凝胶成分(50mL):
单根寡核苷酸的选择性扩增
PAGE分离后的单根寡核苷酸从凝胶切割分离后浸入到TE缓冲液中，DNA会扩散溶解到TE缓冲液，以此单根寡核苷酸DNA为模板，采用对应扩增组的寡核苷酸通用引物，使用Pfu DNA聚合酶(BBST)进行寡核苷酸的选择性扩增。当单一寡核苷酸就是目标产物时，扩增体系是50μL。当得到的单一寡核苷酸还要进行下步组装反应时，扩增体系是20μL。
PCR反应体系为：
PCR反应条件是：
如图9B，10所示，采用本发明方法，可以得到明显单一的PAGE纯度的寡核苷酸，这些寡核苷酸具有不同长度，纯度已经达到PAGE级别。
寡核苷酸的功能验证
为了验证分离得到的寡核苷酸是否可用，以这些寡核苷酸作为原材料，进行统一的酶切和之后的拼装。酶切体系如下：
酶切反应混合物：
酶切反应于37℃进行1小时后，采用乙醇沉淀方法进行纯化，并重悬于50L TE缓冲液中备用。
纯化后的寡核苷酸混合物直接用于片段拼装。拼装采用聚合酶循环拼装方法(PCA)。反应体系如下：
PCA反应体系为：
PCR反应条件是：
以PCA产物为模板，使用Pfu DNA聚合酶扩增目的片段。反应如下：
PCR反应体系为：
PCR反应条件是：
得到的产物采用乙醇沉淀方法进行纯化，纯化后的DNA通过加A反应在3’末端加入碱基A。
加A反应体系为：
反应条件是：
Step 1:72 ℃ 30min。
混合液使用乙醇沉淀方法进行纯化，后使用pGEM-T Eazy Vector System I(Promega)试剂盒进行TA连接。
连接反应体系为：
反应条件是：
Step 1:16 ℃ 8hours。
连接产物通过热激法转化入E.coli XL10-Gold感受态细胞。随机挑选克隆进行Sanger测序(送至上海生工)。测序结果显示，目的片段被成功获得。
表8单根寡核苷酸(>60nt)制备能力
本发明建立的这种规模化的单一寡核苷酸分离制备方法具有以下优势：(1)整体时间成本低，如图7所示，从芯片合成到得到单一寡核苷酸的过程可以在22h内完成；(2)PAGE分离后的寡核苷酸纯度较高；(3)试剂成本低，如表8所示，当芯片合成1,879根寡核苷酸时，得到40pmol寡核苷酸产物时，单个碱基的成本可以降到$0.004,比现在商业提供的寡核苷酸(>60nt，$0.4～1.0/nt)降低了大约100倍。当芯片合成通量提高时，单个碱基的成本会进一步降低；(4)产量高，如表8所示，当芯片合成385根寡核苷酸时，最终得到的单一寡核苷酸最高量可以达到600nmol。理论上我们所使用的4K芯片最大合成规模是3,600根寡核苷酸，此时，单一寡核苷酸的最高量同样可以达到7.7nmol。分离后的单一寡核苷酸可以作为模板，通过通用引物再次扩增，根据需求得到大量的单一寡核苷酸。当然，进一步提高寡核苷酸产物产量会伴随着成本的提高，提高的部分来源于寡核苷酸扩增时使用的DNA聚合酶的成本。例如，商业化提供的直接化学合成的寡核苷酸可选择的最少的DNA量大约是1～3nmol，采用本发明方法制备3nmol寡核苷酸时成本提高达到$0.171/nt。但是，实际应用寡核苷酸时，无论是以克隆为手段，还是直接以双链DNA形式起作用，一轮分离过程得到的40pmol的寡核苷酸DNA量都已足够，因此成本可以继续缩减到$0.009/nt。另外，只要单根寡核苷酸模板存在，使用者就可以根据自己的需要自行扩增所需的DNA产物量，非常方便。
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Claims (5)
1.一种高通量合成和纯化寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：
1)设计寡核苷酸序列，在寡核苷酸两端加上通用引物，以将合成的全部寡核苷酸分成若干亚库，不同亚库具有不同的通用引物，同一亚库具有相同通用引物，所述通用引物上含有IIS型内切酶的酶切位点；
2)进行基于微芯片的DNA原位合成，并洗脱合成产物；
3)利用所述通用引物对所述合成产物进行PCR扩增；
4)分离扩增产物；
其中
每个亚库含有5-11根长度不同的寡核苷酸；并且
每个亚库中相邻长度的寡核苷酸相差至少4个碱基的长度，
所述亚库以要合成的寡核苷酸片段大小来分配，
在寡核苷酸和一侧的通用引物之间还具有接头序列，
所述接头序列含有IIS型内切酶的酶切位点。
2.根据权利要求1所述的方法，步骤4)中的分离使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行。
3.根据权利要求1所述的方法，所述方法在步骤4)后还包括用IIS型内切酶酶切和/或用相应通用引物选择性PCR扩增分离后的独立寡核苷酸的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，所述IIS型内切酶是内切酶Sch I，Bbs I或Bsa I。
5.根据权利要求1所述的方法，所述微芯片是4k芯片。
Priority Applications (1)
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Non-Patent Citations (1)
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