ITTO20070307A1 - Metodo e dispositivo per la diagnosi prenatale non-invasiva - Google Patents

Description

DE SCR IZ ION E

Campo della tecnica

La presente invenzione riguarda dei metodi per la diagnosi prenatale non-invasiva, in particolare per l'individuazione di anomalie genetiche e cromosomiche nel feto.

Stato dell'arte

La diagnosi prenatale per anomalie cromosomiche è stata introdotta con lo scopo di evidenziare anomalie dei cromosomi già nel feto.

Ad oggi, la certezza diagnostica che un feto sia affetto da un'anomalia cromosomica è ottenibile soltanto mediante test diagnostici invasivi, esaminando le cellule embrionali al fine di determinarne il cariotipo, mediante un'amniocentesi, un prelievo dei villi coriali o una cordonocentesi. L'amniocentesi è una manovra invasiva che deve essere eseguita da medici esperti dopo la 15<a>settimana di gestazione e comporta un aumentato rischio di interruzione spontanea di gravidanza (stimato intorno allo 0,5-1%); la villocentesi consiste nell'aspirazione di tessuto transplacentare tra la 10<a>e la 13<a>settimana e comporta anch'essa un aumentato rischio di aborto, inoltre i due abbozzi fetali e placentari potrebbero avere uno sviluppo diverso a causa di modificazioni cromosomiche spontanee, e in questo modo non sempre il risultato dell'esame cromosomico sui villi coriali corrisponde a quello del feto; la cordonocentesi , o funicolocentesi, consiste in un prelievo dal cordone ombelicale effettuato solo da reparti ospedalieri altamente specializzati dopo la 19<a>settimana, che, per la sua maggiore invasività e per l'aumentato rischio d'aborto (5%), è solitamente impiegato per verificare risultati dubbi di villocentesi e amniocentesi o per diagnosticare malattie ereditarie. La determinazione del cariotipo fetale mediante villocentesi presenta un rischio di falsi positivi del 1-2% mentre con 1'amniocentesi tale rischio è dello 0,25-0,5%; non sono invece riportati falsi negativi nel caso della cordonocentesi. Tali esami diagnostici danno informazioni solo ed esclusivamente sull'assetto cromosomico e quindi sulle patologie legate ad alterazioni del numero e della struttura dei cromosomi stessi. L'esito si ottiene dopo dieci giorni dal prelievo per la villocentesi e venti giorni per 1'amniocentesi. Nel 3% dei casi la coltura delle cellule embrionali prelevate fallisce, essendo quindi impossibile dare un esito risulta necessario ripetere l'esame.

Effettuare sempre la diagnosi prenatale consentirebbe di individuare prima della nascita tutti i bambini affetti da anomalie cromosomiche, in particolar modo affetti da Sindrome Down (SD), ma l'elevata percentuale di perdite fetali indotte dalla manovra invasiva viene considerata inaccettabile. Utilizzando il criterio dell'età materna per individuare donne a rischio si ritiene sensato eseguire i test diagnostici invasivi nelle donne di almeno 35 anni, in cui il rapporto rischio/beneficio risulta vantaggioso.

Recentemente si sono diffusi su larga scala test diagnostici prenatali non invasivi, detti "di screening", da applicare a tutte le donne gravide per individuare quelle a rischio aumentato per SD rispetto al rischio medio delle donne della stessa età e alle quali proporre l'analisi prenatale.

Nel primo trimestre di gravidanza possono essere svolti il Duo-Test, che ricerca nel sangue materno la subunìtà beta dell'hCG e la Pregnancy Associated Plasma Protein-A (PAPP-A); la misurazione della translucenza nucale, effettuata mediante esame ecografico, che ha una sensibilità del 74% contro un 4,4% di falsi positivi; e il Test combinato (translucenza nucale e Duo-Test) che raggiunge l'86% di predittività.

Un ulteriore esame è il Tri-Test, che viene effettuato tra la 15<a>e la 17<a>settimana, e che prevede l'elaborazione statistica dei livelli ematici di tre ormoni presenti nel sangue materno (alfafetoproteina, beta-gonadotropina corionica, estriolo non coniugato) e ha una sensibilità del 68% e un rischio di falsi positivi del 5%. Il Quadruplo-Test prevede l'aggiunta di un altro marker, l'inhibin A, che aumenta al 79% la sensibilità del test. Con il test integrato (Tri-Test e translucenza nucale) si arriva a stimare il 95% dei casi con un 5% di falsi positivi. Tutte queste metodiche hanno il vantaggio di non essere invasive, ma lo svantaggio di non essere sempre ben riproducibili e di poter determinare dei falsi positivi e falsi negativi.

L'approccio tradizionale nella diagnosi prenatale di anomalìe cromosomiche comporta la coltura delle cellule fetali prelevate e la determinazione del cariotipo tramite l'analisi dei cromosomi in metafase. Benché sia un'analisi molto accurata, le colture cellulari richiedono lunghi tempi di attesa. Negli anni '90 è stata introdotta la metodica della FISH prenatale (Fluorescent In Situ Hybridization) applicata direttamente su cellule fetali non coltivate, che permette un rapido screening delle più comuni anomalie numeriche quali la triploidia, le trisomie 21, 18, 13 e le aneuploidie dei cromosomi sessuali, patologie che comprendono circa 1'80-95% delle possibili anomalie cromosomiche rilevabili tramite determinazione del cariotipo. Recentemente è stata introdotta la tecnica Quantitative Fluorescent-Polymerase Chain Reaction (QF-PCR), una metodica molecolare in grado di identificare e quantificare simultaneamente sequenze di DNA cromosomo-specifiche. La QF-PCR viene applicata principalmente su prelievi di liquido amniotico e si affianca all'analisi citogenetica quale ausilio diagnostico rapido e accurato che permette di evidenziare, nell'arco di 24-48 ore, le più comuni anomalie cromosomiche del feto. Rispetto alla FISH prenatale, la QF-PCR presenta costi inferiori, è meno laboriosa, più rapida, facilmente automatìzzabile, è meno suscettibile a contaminazioni da cellule materne e consente l'identificazione di mosaicismi .

In letteratura sono presenti numerose pubblicazioni, delle quali anche alcune [1-6, vedere Bibliografia a fine descrizione] a carattere di review, il cui contenuto viene qui incorporato per le parti necessarie per semplice riferimento, riguardanti l'utilizzo della QF-PCR nelle analisi prenatali.

D. W. Bianchi e collaboratori hanno sviluppato [17-30] un sistema di isolamento delle cellule fetali (NRBCs) da sangue materno basato su scoring multiparametrico; i parametri includono due caratteristiche morfologiche (rotondità e morfologia del nucleo) e due proprietà della marcatura dell'emoglobina fetale (intensità di fluorescenza e luminosità periferica del citoplasma) e la loro combinazione permette di distinguere le NRBCs di origine fetale da quelle materne. Il protocollo prevede la separazione delle cellule mononucleate su gradiente di densità e l'arricchimento mediante deplezione di leucociti (MACS con anticorpi per CD15 e CD45) e isolamento su citofluorimetro con metodica FACS usando un anticorpo anti-emoglobina gamma. Le cellule identificate attraverso lo scoring multiparametrico vengono recuperate utilizzando un micromanipolatore sotto osservazione al microscopio.

Il sistema di scoring risulta molto laborioso, in quanto ogni cellula deve essere valutata separatamente per quattro diversi parametri, e l'utilizzo del micromanipolatore causa la perdita di una parte delle cellule, così come accade negli stadi successivi del protocollo, che prevede l'analisi genetica mediante FISH e QF-PCR. Inoltre, l'utilizzo del FACS è anch'esso molto costoso e comporta un'attenta pulizia delle apparecchiature tra una analisi e la successiva. In generale questo metodo ha mostrato una sensibilità nel recupero di cellule fetali del 74% associato ad una frequenza di falsi positivi del 5%.

L'azienda statunitense Ravgen ha sviluppato e brevettato (si vedano, per esempio, le domande di brevetto statunitensi US2005260656 e US2006160105) test di analisi prenatale non invasivi che sfruttano il potenziale degli SNPs per lo studio di alterazioni cromosomiche . I concetti su cui si basa l'efficacia di questi test sono: 1) l'utilizzo della formaldeide per identificare il DNA fetale presente nel sangue materno, 2) l'utilizzo di SNPs per distinguere il DNA materno dal DNA fetale, 3) il calcolo del rapporto degli SNPs in eterozigosi per determinare il numero delle copie dei cromosomi. Tutte queste analisi vengono effettuate sul plasma ottenuto da un prelievo di sangue periferico. Tuttavia nello studio clinico condotto su 60 pazienti, che prevedeva l'utilizzo di questa metodica per l'analisi della trisomìa del cromosoma 21, è stata evidenziata la presenza di un falso negativo e di un falso positivo. Probabilmente questo errore è dovuto sia alla bassa percentuale di DNA fetale analizzato rispetto a quello materno che al basso numero di SNPs analizzati sul cromosoma 21.

La Sequenom è un'azienda che ha sviluppato (si veda per esempio la domanda di brevetto internazionale WO9820166) un sistema (MassARRAY) ad alta performance di analisi degli acidi nucleici che misura efficientemente la quantità di materiale genetico e le variazioni di questo anche in poche cellule. Tale sistema può, in combinazione con la specificità della spettroscopia di massa, essere usato per identificare e quantificare variazioni genetiche. Viene creata una mappa dell'intero genoma basata sull'analisi degli SNPs testata su acidi nucleici fetali derivati dal plasma o dal siero materno. Tale metodica ha tuttavia gli stessi limiti del test brevettato dalla Ravgen in quanto basato su una stima probabilistica.

La Living Microsystems ha sviluppato (si veda per esempio la domanda di brevetto internazionale W02006/108101) un sistema in grado di separare i diversi componenti del sangue, ed in particolare anche le cellule nucleate fetali dal sangue materno. Lo strumento utilizza una processazione microfluidica che permette di separare le diverse popolazioni cellulari in base alle differenti forme idrodinamiche. Lo strumento presenta inoltre un ulteriore componente che consente di U sare le cellule di interesse, utilizzando diversi buffer di lisi specifici in grado di lisare specifiche popolazioni cellulari per poter così effettuare analisi genetiche sugli acidi nucleici di queste. Tuttavia, tale sistema realizza un arricchimento che non è del tutto sufficiente per poter realizzare un'analisi genetica affidabile senza falsi positivi.

AVIVA-Bìosciences Corporation (vedasi ad esempio EP-A-1439897} ha sviluppato un sistema basato su biochip per isolare cellule fetali da sangue materno. Questa metodica utilizza un reagente che permette di rimuovere la maggior parte degli eritrociti, un sorting mediante biglie magnetiche altamente specifiche e un cocktail di anticorpi specifici per antìgeni fetali. Il sistema si basa su camere di filtrazione ad alta risoluzione con pori dal diametro di dimensioni variabili in base al tipo di cellule da isolare. Forze dielettroforetiche sono generate da elettrodi posti sul chip e possono essere utilizzate per muovere le cellule attraverso il filtro. Il sistema può comunque essere supportato da selezione mediante biglie magnetiche specifiche. Tale metodica comunque si limita alla selezione di cellule fetali mediante arricchimento del campione, che non limita la possibilità di avere cellule materne contaminanti ed il conseguente rischio di realizzare quindi un'analisi genetica inaffidabile.

L'azienda Gribbles-Molecular Science ha sviluppato (si veda per esempio la domanda di brevetto internazionale W02005047532) una metodica di diagnosi prenatale basata sull'isolamento di cellule fetali da campioni di brush vaginali e endocervicali (Pap smear) ottenuti tra la 5a e la 31a settimana di gestazione. L'isolamento di cellule fetali è fatto tramite laser microdissezione e/o FACS e lo screening viene effettuato mediante DNA fingerprinting. In campioni così ottenuti sarebbero presenti 1/300 cellule fetali, ma, seppur non invasivo, il prelievo, oltre ad essere spiacevole per la donna, comporta un rischio di aborto spontaneo pari all’1% ed è inoltre piuttosto laborioso.

Nessuno dei suddetti metodi non-invasivi ha ad oggi dimostrato di poter essere usato come pratica di routine per la diagnosi di aneuploidie del feto e/o altri difetti cromosomici.

Obiettivo della presente invenzione è pertanto quello di realizzare un metodo per la diagnosi prenatale non-invasivo, basato sul prelievo di sangue materno e sull'isolamento di cellule fetali circolanti. Un ulteriore obiettivo della presente invenzione è quello di realizzare un metodo per la diagnosi prenatale automatizzatile, senza falsi negativi, e con un basso numero di falsi positivi e risposte non-informative (no-call).

Sommario dell'Invenzione

La presente invenzione riguarda metodi e dispositivi per la diagnosi prenatale non-invasiva, in particolare per l'individuazione di anomalie genetiche nel feto. Secondo la presente invenzione la diagnosi viene effettuata partendo da sangue materno, in particolare sangue periferico, individuando ed analizzando le cellule fetali circolanti, operando secondo il metodo della rivendicazione 1.

Secondo la presente invenzione il sangue materno viene in prima istanza processato effettuando uno o più passaggi di arricchimento delle cellule fetali nucleate. Il metodo si caratterizza poi per l'utilizzo di un sistema microfluidico in grado di selezionare singolarmente singole cellule dal campione arricchito. Tramite un sistema microfluidico di isolamento di singole cellule è possibile ottenere un'insieme di cellule fetali di purezza sufficiente ad effettuare una diagnosi genetica.

Per dispositivo microfluidico si intende, in questa sede, un dispositivo atto a gestire dei volumi di liquido in regime di flusso laminare.

Per dispositivo in grado di selezionare singolarmente singole cellule si intende, in questa sede, un dispositivo in grado di consentire la selezione di una o più singole cellule, una alla volta o simultaneamente, sulla base di parametri valutati individualmente su ciascuna cellula.

L'analisi genetica può poi essere effettuata tramite tecniche quali la Quantitative Fluorescent PCR (QF-PCR) , eventualmente utilizzando per il confronto l'analisi delle cellule della madre, la FISH, il cariotipo, la Comparative Genomic Hybridization (CGH).

L'utilizzo di un sistema microfluidico porta con sé diversi vantaggi, tra i quali la possibilità di avere sistemi usa e getta, senza rischi di contaminazione tra le diverse analisi, né necessità di lavaggi accurati dell'attrezzatura. Inoltre l'utilizzo di un sistema microfluidico comporta la possibilità di avere sistemi automatici o semiautomatici, caratterizzati da una grande affidabilità .

Ulteriori caratteristiche e vantaggi dell'invenzione appariranno chiari dalla descrizione che segue di alcuni suoi esempi di attuazione non limitativi, effettuata con riferimento alle figure dei disegni annessi.

Breve descrizione delle figure

Fig. 1 mostra un diagramma riassuntivo del metodo di diagnosi prenatale non-invasiva secondo la presente invenzione.

Fig. 2 mostra un'immagine del chip ad ingrandimento 10X con filtro per la fluorescenza del DAPI . Si notano tre nuclei, corrispondenti a tre cellule singole.

Fig. 3: mostra un'immagine del chip ad ingrandimento 10X con filtro per la fluorescenza del FITC. L'area fotografata è la medesima della fig. 2 e si notano due cellule Hb-ε positive e una cellula Hbε negativa.

Fig. 4 mostra un elettroferograirana relativo all'analisi del marcatore cromosomico AMXY. Il plot superiore si riferisce all'analisi effettuata su cellule fetali recuperate da sangue materno, il plot inferiore si riferisce all'analisi effettuata su cellule materne. Dal grafico si evidenzia la presenza dei cromosomi sessuali X e Y nel feto.

Fig. 5 mostra un elettroferogramma relativo all'analisi del marcatore (o microsatellìte} D21S11. Il plot superiore si riferisce all'analisi effettuata su cellule fetali recuperate da sangue materno, il plot inferiore si riferisce all'analisi effettuata su cellule materne. Dal grafico si evidenzia la presenza di due alleli (eterozigote normale) e si può escludere contaminazione da parte di cellule materne.

Fig. 6 mostra un elettroferogramma relativo all'analisi del marcatore D21S11. Il plot superiore si riferisce all'analisi effettuata su cellule fetali recuperate da sangue materno, il plot inferiore si riferisce all'analisi effettuata su cellule materne. Dal grafico si evidenzia la presenza di un allele in omozigosi nelle cellule fetali.

Fig. 7 mostra un elettroferogramma relativo all'analisi del marcatore D21S11. Il plot superiore si riferisce all'analisi effettuata su cellule fetali recuperate da sangue materno, il plot inferiore si riferisce all'analisi effettuata su cellule materne. Dal grafico si evidenzia la presenza di tre alleli (trisomico triallelico).

Fig. 8 mostra un elettroferogramma relativo all'analisi del marcatore D21S11. Il plot superiore si riferisce all'analisi effettuata su cellule fetali recuperate da sangue materno, il plot inferiore si riferisce all'analisi effettuata su cellule materne.

Fig. 9 mostra un elettroferogramma relativo all'analisi del marcatore D13S628. Il plot superiore si riferisce all'analisi effettuata su cellule fetali recuperate da sangue materno, il plot inferiore si riferisce all'analisi effettuata su cellule materne. Dal grafico si evidenzia la presenza di due alleli {eterozigote normale) e si può escludere contaminazione da parte di cellule materne.

Fig. 10 mostra un diagramma di flusso di una forma di realizzazione preferita del metodo secondo la presente invenzione.

Fig. 11 mostra l'andamento del numero di cellule fetali in singola gabbia (NCISCC) in funzione della densità media di cellule per gabbia (ACPC).

Fig. 12 mostra schematicamente un esempio di dispositivo per l'attuazione del metodo (o della parte sostanziale e caratterizzante di esso) secondo 1'invenzione.

Descrizione dettagliata

Oggetto della presente invenzione è un metodo per eseguire la diagnosi prenatale non invasiva.

Arricchimento

Circa 1 su 10<3>-10<7>delle cellule nucleate presenti nella circolazione materna è di origine fetale. La proporzione di cellule fetali può essere arricchita utilizzando diverse metodiche, quali l'arricchimento meccanico, l'arricchimento mediante separazione per dielettroforesi, la lisi selettiva, la separazione immunomagnetica, il FACS. La maggior parte di queste metodiche sono anche automatizzate e tutte le metodiche di separazione possono essere precedute da separazione di cellule mononucleate totali tramite centrifugazione su gradiente di densità o in alternativa possono essere applicate su sangue in toto.

In genere si parte da una diluizione, ma non è strettamente necessario per tutte le tecniche.

Centri fugazione

Le cellule mononucleate totali sono recuperate dal sangue materno mediante centrifugazione su gradiente di densità, costituito da soluzioni quali Ficoll o Percoli, seguendo le procedure standard di conoscenza ad operatori del settore con ordinarie capacità.

Sistemi meccanici

Sono basati su filtri che selezionano nRBC e svuotano il campione di RBC, come filtri microfabbricati (del tipo descritto in EP-A-1439897 -AVIVA) o in tessuto, ad esempio disponibili presso Living Microsystems.

Lisi selettiva

Mediante lisi selettiva, tipicamente degli eritrociti, possono essere eliminate delie popolazioni cellulari non di interesse. Possono essere usati tamponi di lisaggìo composti da soluzioni di saccarosio che facilitano la rottura della membrana eritrocitaria o si può effettuare una incubazione con acqua distillata che permette la rottura delle membrane per lisi osmotica.

Arricchimento tramite biglie immuno-magnetiche L'utilizzo di biglie immunomagnetiche permette dì arricchire il campione mediante selezione positiva (utilizzando biglie legate ad antìcorpi specifici per la popolazione fetale da recuperare) o negative (deplezione di popolazioni cellulari non di interesse). I due tipi di separazione possono essere accoppiati per aumentare la specificità della metodica come ad esempio insegnato in US2006/0051775 (Bianchi).

Una ulteriore tecnica ben nota agli esperti del ramo è quella denominate MACS della Miltenyi Biotech, oppure Easy-sep, della Stem-cell technologies.

È poi possibile eseguire un arricchimento dielettroforetico tramite apposito dispositivo Dielectrophoretic activated celi sorter (DACS); questo tipo di tecnologia include DACS "label-free", in flusso, per la deplezione di globuli rossi dalle cellule mononucleate, oppure per l'isolamento positivo di cellule con determinate caratteristiche; oppure DACS utilizzando biglie funzionalizzate con anticorpi per antigeni di superficie.

Arricchimento tramite FACS

Le cellule possono essere marcate con anticorpo fluorescente specifico per antigeni fetali e il campione può quindi essere arricchito tramite Fluorescent Activation Celi Sorting (FACS), che permette di fare analisi multiparametrica su singole cellule, basata su caratteristiche morfologiche e di fluorescenza.

Altre tecniche di arricchimento

Ulteriori sistemi descritti in letteratura sono basati sullo sfruttamento delle caratteristiche magnetiche intrinseche delle cellule.

Isolamento di singole cellule fetali

Marcatura delle cellule fetali

Cellule già marcate

Le cellule fetali possono essere già marcate se nell'arricchimento si è utilizzato un anticorpo che sia specifico per le cellule fetali (in grado di discriminarle da quelle materne) e sia fluorescente o coniugato ad una biglia fluorescente o coniugato ad un anticorpo secondario o terziario fluorescente. In questo caso sì può iniettare nel dispositivo microfluidico in grado di selezionare singole cellule, direttamente il campione arricchito, in quanto è già possibile identificare le cellule fetali .

Cellule da marcare

Preferibilmente, secondo un aspetto del trovato, si utilizza per l'identificazione delle cellule fetali una marcatura con un secondo anticorpo specifico per le cellule fetali (in grado di discriminarle da quelle da materne) , differente dall'anticorpo utilizzato per l'arricchimento che, come sopra descritto, non è necessariamente specifico per le cellule fetali.

In questo caso si possono utilizzare:

• anticorpi che riconoscono antigeni di superficie (come i-antigen);

• antigeni intra-cellulari (come ad esempio, le catene globiniche γ o ε. In questi casi si procede preferibilmente, come da arte nota, al fissaggio e permeabilizzazione delle cellule per permettere una buona marcatura.

Successivamente, il campione contenente le cellule viene inserito in un dispositivo microfluidico in grado di selezionare singolarmente singole cellule, di qualsiasi tipo noto. A tale scopo si può utilizzare un isolamento dielettroforetico (DEPArray, chip attivo e passivo, usando ad esempio le tecniche descritte in PCT/IB2007/000963 o in PCT/IB2007/000751, o ancora in [34) e [35]), oppure trappole opto-elettroniche o 1'isolamento optoforetico o, ancora, Laser tweezers [31-33]. Il contenuto di tali documenti [31-33] e [34-35] è qui incorporato per le parti necessarie per semplice riferimento.

L'individuazione delle cellule di interesse può essere effettuata per esempio tramite sensori:

esterni

- Ottici quali un microscopio a fluorescenza, o anche

interni

- Ottici, come insegnato nel brevetto PCT/IB2006/000636, che descrive un metodo integrato di individuazione delle cellule fluorescenti

- impedenziometrici

Analisi genetica

Sulle cellule fetali recuperate possono essere effettuati vari tipi di analisi che ne permettono la caratterizzazione genetica o cromosomica a diversi livelli di risoluzione e di sensibilità e a seconda dello scopo diagnostico dello studio.

In caso di analisi per aberrazioni cromosomiche possono essere applicate l'analisi del cariotipo con metodica classica o molecolare (FISH) o lo studio di marker cromosomici mediante QF-PCR. L'acquisizione o perdita di materiale genetico può essere anche indagata mediante Comparative Genomic Hybridization.

In caso di necessità di valutazione di particolari alterazioni a livello genico responsabili per esempio di malattie ereditarie vi è la possibilità di effettuare un'analisi genetica molecolare mirata attraverso una metodica molecolare tra cui sequenziamento, PCR-allele specifica (ARMS), Reai Time PCR con sonde TaqMan allele specifiche, tecniche per analisi di eteroduplex (DHPLC Denaturing High Performance Liquid Chromatography-, DGGE -Denaturing Gradient Gel Electrophoresis-, TGGE -Temperature Gradient Gel Electrophoresis-, TGCE -Temperature Gradient Capillary Electrophoresis-) , Single-Strand Conformation Poiimorphism (SSCP), analisi del polimorfismo dei frammenti di restrizione (RFLP), PCR per la valutazione dell'amplificazione di un particolare frammento presente in caso di traslocazioni e per la valutazione della lunghezza del frammento amplificato in caso di inserzioni o delezioni.

QF-PCR

La QF-PCR è una tecnica di biologia molecolare applicata con successo alla diagnosi prenatale. Rispetto alle metodiche classiche di citogenetica ha il vantaggio di essere precisa, affidabile e rapida.

La QF-PCR è basata sull'amplificazione fluorescente di sequenze di DNA ripetute altamente polimorfiche (Short Tandem Repeat - STR) localizzate sui cromosomi oggetto di studio e successiva elettroforesi capillare con l'impiego di un sequenziatore automatico e permette di definire l'esatto assetto numerico dei cromosomi presi in considerazione. L'elettroforesi capillare viene eseguita mediante sequenziatore automatico a tecnologia fluorescente, a seguito della quale per ciascun prodotto di PCR vengono calcolate le dimensioni, l'altezza e l'area di ciascun picco fluorescente.

La verifica in termini qualitativi e quantitativi della segregazione degli alleli parentali permette di poter evidenziare nel feto la presenta di eventuali trisomie. I tracciati che si ottengono, per ogni STR, in caso di un assetto cromosomico normale, sono 2 picchi di uguale area ed altezza. In caso di trisomia si possono verificare 2 differenti situazioni: presenza di 3 picchi per la trisomia triallelica o 2 picchi con rapporto aree 1:2 per la trisomia diallelica.

L'impiego di più marcatori con un alto indice di eterozigosità per ciascun cromosoma porta ad una frequenza molto bassa del pattern allelico non informativo (unico picco) per tutti i loci investigati. Inoltre, nella QF-PCR la presenza di contaminazione materna è facilmente riconoscibile in quanto nel tracciato elettroforetico si nota, per ciascun STR, l'amplificazione dell'allele materno che non è stato ereditato dal feto e in parallelo può essere condotta l'analisi di un'aliquota del prelievo di sangue della madre.

Cariotipo

La citogenetica classica permette di identificare riarrangiamenti cromosomici coinvolgenti non meno di 5Mb.

L'analisi del cariotipo per piccolo numero di cellule secondo la presente invenzione prevede diverse fasi prima e dopo l'isolamento delle cellule fetali: coltura cellulare prima della selezione e colorazione, acquisizione dell'immagine, conta dei cromosomi e ricostruzione del cariotipo con valutazione finale sulle cellule fetali recuperate.

Le colture vengono allestite con supplemento di fitoemoagglutinina che stimola la proliferazione cellulare con lo scopo di ottenere il maggior numero possibile di cellule in metafase. Le colture dopo qualche giorno di incubazione vengono bloccate con colchicina e il campione viene quindi marcato con un anticorpo specifico per antigene fetale. Viene quindi sottoposto a selezione e le cellule fetali recuperate vengono trattate con soluzioni fissanti e soluzioni ipotoniche per allestire il preparato cromosomico. La sospensione cellulare viene quindi strisciata su vetrino e i cromosomi sono identificati a seconda della lunghezza e in base alla caratteristiche morfologiche, visibile con diversi tipi di colorazione differenziale.

Come da arte nota si possono utilizzare diversi tipi di bandeggi, quali il bandeggio G, il bandeggio QFQ (Q-Fluorescence Quinacrine) analogo al bandeggio G, il bandeggio R, il bandeggio T, il bandeggio CBG (C-Barium Giemsa).

FISH

La citogenetica molecolare abbina la possibilità dell'<’>analisi molecolare del DNA con l'analisi della struttura cromosomica. La tecnica FISH (Fluorescent In Situ Hybridization, ibridazione in situ non radioattiva) consente un'analisi mirata di una regione cromosomica su preparati di cromosomi metafasici e nuclei interfasici.

A differenza della citogenetica classica dopo l'allestimento dei vetrini non viene effettuato il bandeggio ma si utilizzano delle sonde fluorescenti locus-specifiche (per evidenziare aberrazioni che coinvolgono un gene o una parte di esso), sonde chromosome painting (riconoscono sequenze specifiche per ogni singolo cromosoma localizzate lungo tutto il suo asse ed il cromosoma appare interamente colorato), sonde centromeriche (riconoscono brevi sequenze alfoidi altamente ripetitive specifiche per ciascun cromosoma) e sonde telomeriche. Nei cariotipi complessi è utile adoperare 24 sonde painting in fluorescenza per tutti i cromosomi (Spectral Karyotype SKY, multicolor FISH), che, marcando ogni cromosoma con una combinazione unica di massimo quattro dei cinque fluorocromi utilizzati ed ottenendo uno specifico spettro per ciascun cromosoma, permettono l'analisi simultanea di tutto il corredo cromosomico con un approccio rapido

Comparative Genomi c Hybridization (CGH)

La Comparative Genomic Hybridization è un metodo di citogenetica molecolare per l'identificazione di modificazioni geniche, classificate come guadagno (gain) o perdita (loss) di DNA e permette l'analisi dell'intero genoma con un solo esperimento, mostrando un'elevata sensibilità per l'analisi delle amplificazioni geniche. A tale metodologia è affiancata la CGH-array, che ha un potere di risoluzione maggiore rispetto alla CGH classica (3Mb per la CGH e 1Mb per l'array-CGH).

Il metodo si basa su un'ibridazione in situ modificata, che sfrutta la competizione tra due campioni di DNA genomico (test e controllo) marcati con due differenti molecole fluorescenti e ibridati contemporaneamente in quantità equimolari su un vetrino su cui sono fissati cromosomi normali in metafase (CGH) o sull'array su cui si trovano immobilizzate le sequenze omologhe di DNA (CGH-array). Preventivamente all'analisi su array-CGH è prevista l'amplificazione del genoma delle cellule fetali recuperate. Tale amplificazione può essere ottenuta attraverso varie metodiche: DOP-PCR (degenerate-nucleotide primed), linker-adaptor PCR o tecnologie basate sull'utilizzo di librerie genomiche (GenomePlex Single Celi Whole Genome Amplification Kit, Sigma-Aldrich) che prevede la frammentazione random del DNA fetale e conseguente conversione in prodotti amplificabili in PCR.

Sequenzi amento

Il processo di sequenziamento si compone di diverse fasi: reazione di sequenza e marcatura dell'amplificato (prodotto di PCR ottenuto mediante un'amplificazione specifica della regione di interesse) , in cui si utilizzano ddNTPs terminatori di catena marcati con fluorescenza, separazione dei frammenti marcati in elettroforesi capillare ad alta risoluzione in condizioni denaturanti su sequenziatori automatici, rilevamento dei frammenti dì DNA e lettura delle sequenze attraverso un elettroferogramma . Tale metodica permette l'identificazione di mutazioni puntiformi, brevi inserzioni e delezioni sia note che nuove.

Single-Strand Conformation Polimorphism (SSCP) I/SSCP si basa sul fatto che la mobilità di una singola elica di DNA varia anche in base alla conformazione assunta in conseguenza alla sua sequenza nucleotidica: il cambio di una singola base produce un pattern di migrazione specifico. Le alterazioni di mobilità elettroforetica vengono visualizzate marcando il frammento di DNA con marcante radioattivo e impressionando con il gel di corsa una lastra autoradiografica.

Reai -Time PCR

E' una reazione di PCR quantitativa basata sull'emissione di fluorescenza direttamente correlata alla quantità di DNA amplificato. Permette di evidenziare e quantificare sia la presenza di traslocazioni (utilizzando primer specifici ai lati del punto di rottura cromosomico) sia la presenza di mutazioni puntiformi, brevi inserzioni o delezioni (utilizzando un primer specifico per la mutazione o una sonda complementare alla regione da analizzare).

Tecniche di analisi degli eteroduplex

I frammenti di interesse vengono amplificati mediante PCR. Il prodotto di PCR del campione viene mescolato con il prodotto di PCR del controllo (campione wild type), si riscaldano per denaturarli e si raffreddano lentamente per formare degli eteroduplex rinaturando in modo random gli ampliconi.

II DHPLC è una tecnica che permette di individuare gli eteroduplex di DNA e di effettuare uno screening delle mutazioni note o nuove: i due filamenti di DNA a doppia elica che differiscono per una mutazione vengono scaldati e rinaturati a formare omoduplex (entrambi i filamenti rinaturati sono wild type o entrambi mutati) e eteroduplex (sono rinaturati un filamento wild type ed uno mutato). I differenti prodotti della rìnaturazione vengono identificati mediante analisi al DHPLC in quanto gli eteroduplex presenteranno una velocità di migrazione differente rispetto agli omoduplex; i campioni mutati presenteranno quindi un profilo di picchi specifico, corrispondenti alla velocità di migrazione del duplex attraverso la colonna cromatografica, a determinate temperature. Nell'analisi al DHPLC la temperatura rimane costante durante la separazione degli eteroduplici .

La DGGE è una tecnica che consente di individuare mutazioni di una singola base. Separa frammenti di DNA sulla base della loro mobilità, sotto condizioni crescenti di denaturazione (usando formammide/urea) . I frammenti wild type e mutanti migrano quindi a differente velocità su un gel a gradiente denaturante.

Nella TGCE i campioni sono separati mediante gradiente di temperatura e per elettroforesi capillare. I campioni etero e omoduplex si risolvono intorno alla temperatura di melting della reazione di PCR, e la temperatura ottimale per risolvere omoduplex ed eteroduplex dipende dalle caratteristiche del frammento. La rilevazione utilizza la fluorescenza indotta dal laser e un marcatore intercalante. Per la separazione degli eteroduplici si utilizza un gradiente di temperatura.

Esempi di realizzazioni preferenziali dell'invenzione A titolo di esempio non limitativo dello scopo dell'invenzione, si riporta una realizzazione preferenziale del metodo secondo la presente invenzione, seguendo il diagramma di flusso indicato in Fig. 10.

Prelievo

Si ottengono, tramite prelievo, 10-20 mi di sangue periferico da una donna gravida.

Arricchimento

La realizzazione preferenziale dell'invenzione prevede un processo a fasi successive presentante una prima fase in cui si effettua la separazione di cellule mononucleate totali dal sangue materno, preventivamente diluito con PBS/EDTA, mediante centrifugazione su gradiente di densità Ficoll.

Ovviamente, si potrebbe in alternativa, utilizzare uno qualsiasi degli altri metodi riassunti in figura 1, ad esempio arricchire il campione di sangue mediante una selezione di cellule effettuata sulla base di almeno un parametro scelto nel gruppo consistente in:

a. densità;

b. morfologia;

c. proprietà elettriche;

d. proprietà chimiche;

e. proprietà meccaniche;

f. espressione di antigeni di superficie; g. espressione di antigeni intracitopiasmatici

h. proprietà dielettriche

i. proprietà magnetiche

o combinazioni delle medesime.

In ogni caso, secondo una caratteristica non secondaria della presente invenzione, una parte del sangue o delle cellule mononucleate non viene processata ulteriormente e viene utilizzata per l'analisi del DNA materno.

L'arricchimento delle cellule nucleate fetali è poi ulteriormente ottenuto mediante una seconda fase, in cui si effettua la selezione positiva di cellule esprimenti il CD71 (cellule in attiva proliferazione) dalle cellule mononucleate recuperate nel primo step. La selezione positiva viene effettuata attraverso separazione immunomagnetica (MACS - Miltenyi Biotec) con l'utilizzo di anticorpi anti-CD71 coniugati a biglie magnetiche.

Ovviamente, il secondo passo di arricchimento può comprendere una selezione effettuata sulla base di almeno una delle seguenti caratteristiche della popolazione di cellule comprendente almeno un tipo di cellule fetali nucleate:

a. Esprimere 1'antigene di superficie CD71 (come già descritto e che rappresenta la forma preferita dell'invenzione);

b. Esprimere 1'antigene di superficie CD34; c. Esprimere 1'antigene di superficie GPA; d. Non esprimere 1'antigene di superficie CD14;

e. Non esprimere 1'antigene di superficie CD15;

f. Non esprimere 1'antigene di superficie CD45.

Inoltre, il passo di arricchire il campione di sangue nella popolazione di cellule comprendente almeno un tipo di cellule fetali può avvenire mediante almeno una delle seguenti tecniche:

a. MACS;

b. DACS;

c. FACS.

Isolamento

Le cellule CD71+ (positive per CD71) così ottenute vengono fissate e permeabilizzate con metodiche standard adattate allo scopo, e quindi marcate con anticorpo anti-catena globinica fetale (epsilon o gamma in base alla settimana di gestazione del prelievo) coniugato a fluorocromo con emissione nello spettro del verde (es. FITC o Alexa 488); secondo un aspetto importate del trovato, il campione viene inoltre, in combinazione, contromarcato con DAPI (o altro adatto marcatore) per visualizzare i nuclei di tutte le cellule.

Prima di essere inserito nel chip per la manipolazione dielettroforetica e l'isolamento delle cellule fetali, il campione viene sottoposto ad un controllo di qualità per verificare l'intensità di fluorescenza della marcatura e la concentrazione cellulare totale. Un'aliquota del campione marcato è risospeso in minimo volume di Buffer specifico utile per la manipolazione dielettroforetica ed è caricato su un dispositivo per il controllo di qualità del campione e controllato al microscopio a fluorescenza: si osserva l'intensità di fluorescenza delle cellule nei diversi canali e si effettua una conta delle cellule marcate in DAPI (cellule nucleate totali). Se la concentrazione cellulare è superiore a quella ottimale per il corretto funzionamento del dispositivo di isolamento delle singole cellule si procede con la diluizione del campione per ottenere la concentrazione desiderata; nel caso in cui il numero totale di cellule sia troppo basso per consentire il recupero di un numero minimo di cellule fetali non si procede con il recupero delle cellule fetali (risultato no cali).

Per il calcolo della concentrazione ottimale di cellule facciamo riferimento ad un dispositivo commerciale specifico (DEPArray™, Silicon Biosystems SpA), ben noto in letteratura [33-34], basato su gabbie mobili di dielettroforesi. In particolare il modello CONV600k comprendente 100,000 gabbie.

Una politica preferenziale di utilizzo di tale dispositivo prevede di :

1. selezionare le gabbie contenenti una cellula fetale (positiva alla marcatura)

2. se ia cellula fa parte di un cluster, cioè condivide la gabbia con altre cellule non fetali, dividere le cellule del cluster in gabbie separate fino ad isolare la cellula fetale in una gabbia non condivisa con altre cellule non-fetali. Se la cellula fetale non si separa dalle altre non-fetali, scartarla .

3. Recuperare tutte le cellule fetali in singola gabbia.

Una ulteriore politica alternativa preferenziale di utilizzo di tale dispositivo prevede di:

1. selezionare le gabbie contenenti una cellula fetale (positiva alla marcatura)

2. se la cellula fa parte di un cluster, scartare tale cellula dalla lista di cellule da recuperare .

3. Recuperare tutte le cellule fetali in singola gabbia.

In questo secondo caso, la scelta della densitàmedia di cellule per gabbia (ACPC) da iniettare nel chip viene effettuata, tenendo conto del numero di cellule totali presenti nel campione (NCELLSTOT), e della percentuale attesa di cellule fetali (PCI).

Infatti, aumentando ACPC, il numero di cellule fetali presenti nella camera di manipolazione del chip aumenta. Tuttavia la probabilità di ogni cellula di appartenere ad una gabbia con singola cellula decresce, e il numero di cellule fetali in singolagabbia (NCISCC) raggiunge dunque un massimo per ACPC~=1,6. Tale valore è indipendente da PCI, e si può definire un valore normalizzato di NCISCC rispetto al massimo teorico per ACPC=1,6 il cui andamento è riportato nel grafico di Fig. 11. Tale concentrazione massimizza il numero di cellule recuperabili ad ogni flussata di campione nella microcamera di manipolazione. Questa scelta rappresenta una buona scelta qualora il numero totale di cellule fetali recuperabili sia sufficiente per l'analisi genetica a valle.

All'aumentare di ACPC, aumenta tuttavia in modo monotono crescente la percentuale di cellule da scartare per via del fatto che condividono la gabbia con altre cellule non fetali, come illustrato in Fig. 11 in riferimento al valore normalizzato rispetto al numero di cellule fetali presenti nella microcamera di manipolazione (Normalized Cell-Waste).

Se il numero di cellule recuperabili è inferiore al minimo richiesto per l'analisi a valle, si può allora diluire il campione ed effettuare un maggior numero di flussate per recuperare un numero maggiore di cellule fetali.

Il valore di ACPC ottimale per recuperare un numero sufficiente di cellule fetali con il minor numero di flussate può essere calcolato in base all'analisi statistica sopra determinata, per esempio con calcoli basati sul numero atteso di cellule fetali e il numero minimo di cellule per l'analisi genetica, individuando dunque una efficienza minima di recupero (rapporto tra cellule in singola gabbia/cellule in gabbia con altre cellule) delle cellule fetali presenti nel campione. Da tale efficienza sì può desumere un valore massimo di ACPC, cui consegue un numero minimo di flussate per processare l'intero campione con detta efficienza di recupero.

Il campione è quindi inserito (loading) in un chip per l'isolamento di cellule mediante gabbie mobili dì dielettroforesi (DEPArray™, Silicon Biosystems SpA, ad esempio inserito in un "package" o dispositivo complessivo come quello schematicamente illustrato in figura 12} e sottoposto ad esame (scanning), identificazione e selezione (selection), movimentazione (sorting) e recupero (recovery) delle cellule fetali. Le cellule ingabbiate sono osservate (scanning) in modo automatico o manuale al microscopio a tre diversi canali di fluorescenza (ovvero in tre diverse lunghezze d'onda): nella fattispecie non limitativa qui descritta il canale del blu permette di verificare la presenza del nucleo ed eventualmente la sua morfologia (per es. marcatura con DAPI); il canale del verde evidenzia le cellule che sono state marcate con 1'anticorpo specifico fetale che è coniugato ad un fluoroforo che emette nello spettro del verde (es. FITC o Alexa 488); secondo un aspetto del trovato, viene poi utilizzato anche un terzo canale, differente dai primi due (es. il canale di emissione nel rosso, come per il filtro utilizzato per rilevare la fluorescenza del TRITO), e per il quale non è stato utilizzato alcun marcatore fluorescente, il che consente di identificare le cellule autofluorescenti, per le quali l'eventuale segnale rilevato nei canali del DAPI e del verde non sarebbero specifici.

La selezione (selection) di cellule avviene quindi selezionando le gabbie che contengono una sola cellula nucleata (positive al DAPI, Fig. 2), che hanno un segnale forte dell'anticorpo specifico fetale (positive al FITC/Alexa, Fig. 3), e che abbiano bassa o nulla autofluorescenza, rilevata su altri canali (es. canale del rosso).

Per migliorare ulteriormente la selettività del metodo, i marcatori fluorescenti, in particolare quello di fetalità, possono essere costituiti, anziché da semplici molecole fluorescenti, da biglie fluorescenti coniugate con anticorpo in grado di riconoscere le cellule di interesse, nella fattispecie le cellule fetali.

Le cellule vengono recuperate in pochi microlitri (< 40 microlitri) in un tubo da PCR da 0,2 millilitri.

Analisi Genetica

Da tali cellule cosi ottenute viene estratto il DNA che è amplificato ed analizzato per la presenza di aneuploidie cromosomiche, preferibilmente operando nel medesimo dispositivo microfluidico utilizzato per la selezione e, eventualmente, già utilizzato in precedenza per almeno parte del processo di arricchimento (ad esempio in caso di uso di tecnologia DACS); in tal caso il dispositivo può assumere l'aspetto di quello illustrato in figura 12.

L'apparato contiene una schiera di elettrodi come nell'arte nota, ma è caratterizzato da una microcamera principale (CHM) e da una molteplicità di microcamere secondarie (CHJ), tutte delimitate su almeno una faccia da un unico chip o da una pluralità di chip separati, recanti una schiera di elettrodi attivabili. La microcamera principale può essere riempita con un campione comprendente almeno una cellula attraverso gli ingressi (IMI) ed uscite (0M1) relativi. Ciascuna microcamera secondaria (CHJ) è di dimensioni preferibilmente sostanzialmente superiori, ma paragonabili, a quelle di una cellula. Preferibilmente ciascuna microcamera secondaria è connessa alla microcamera principale attraverso un canale di configurazione (lunghezza e/o forma) sufficiente a prevenire (impedire o almeno limitare) la dispersione del campione per diffusione e la contaminazione verso altre microcamere, nel tempo necessario per l'analisi. Secondo l'esempio illustrato, vi è una molteplicità di microcamere secondarie per la lisi connesse ad un canale per l'elettroforesi capillare su chip, per esempio con giunzione a croce. In alternativa si può realizzare una serie di canali per l'elettroforesi capillare con giunzione a doppia T, secondo l'arte nota.

Opzionalmente, alla fine del canale per l'elettroforesi capillare è presente un sensore integrato, di tipo impedenziometrico e/o ottico, in grado di produrre un elettroferogramma basato sul tempo di migrazione dei composti analizzati dall'incrocio (a croce o doppia T) al sensore stesso. Secondo quanto illustrato in figura 12, in particolare, ciascuna microcamera della molteplicità di microcamere è connessa ad un capillare per l'elettroforesi (CAPJ) attraverso un uscita fluidica (OJ) di ciascuna microcamera secondaria.

L'estrazione è fatta, secondo un ulteriore aspetto del trovato, immergendo le cellule per pochi secondi in azoto liquido e scaldandole a 60°C per dieci minuti, infine si recupera il DNA utilizzando il kit con resina ChelexlOO.

La determinazione di alterazioni cromosomiche è fatta tramite analisi degli STR che viene eseguita mediante QF-PCR per analisi dei frammenti. La tecnologia dell'elettroforesi capillare a fluorescenza permette l'analisi simultanea di più STR mediante la scelta appropriata di frammenti di DNA marcati con differenti molecole fluorescenti.

Sono amplificati in multiplex-PCR almeno tre STR diversi, con elevata frequenza di eterozigosità nella popolazione, di ognuno dei cromosomi 13, 18, e 21 e dei cromosomi del sesso. In caso di risultato non informativo, per esempio per la presenza di STR in omozigosi, si amplifica un ulteriore STR dello stesso cromosoma. Gli STR analizzati sono, per esempio: D21S11, D21S1410, D21S1411, D21S1412, D21S1435 e D21S1446 per l'analisi del cromosoma 21; D13S631, D13S634, D13S258, D13S305 e D13S742 per il cromosoma 13; D18S535, D18S386, D18S391, D18S858 e D18S51 per il cromosoma 18; per l'analisi dei cromosomi del sesso sono analizzati i marker AMXY e SRY, e gli STR X22, DXYS218, DXS6803, DXS6809, DXS8377, HPRT e SBMA.

Parallelamente all'amplificazione del DNA delle cellule fetali, viene analizzato il DNA materno per riconoscere, secondo un aspetto del trovato, la presenza di un'eventuale contaminazione materna delle cellule fetali o una possibile contaminazione esterna della QF-PCR (Figg. 4-9).

Negli elettroferogrammi, ottenuti dall'elettrofo-resi capillare degli ampliconi al sequenziatore automatico (per esempio con ABI prism 310), si analizzano le aree e le dimensioni dei picchi corrispondenti ai diversi alleli dei microsatelliti amplificati. L'analisi contemporanea del DNA materno può aiutare come controllo ad interpretare il risultato dell'analisi genetica aiutando ad individuare eventuali casi di contaminazioni di laboratorio, contaminazione delle cellule fetali recuperate con cellule materne, eccetera.

La fase di analisi genetica può anche essere eseguita, secondo una possibile variante del trovato, mediante cariotipo, nel qual caso la fase di arricchimento di almeno una popolazione di cellule comprendente almeno un tipo di cellule fetali nucleate comprende inoltre le fasi di:

. bloccare in metafase le cellule.

Dopo avere fermato in metafase le cellule, si effettuano il fissaggio e la permeabilizzazione per l'identificazione delle cellule fetali tramite un anticorpo intra-citoplasmatico.

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Claims (29)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la diagnosi prenatale non-invasiva comprendente i passi di: a. ottenere un campione di sangue da una donna gravida; b. arricchire detto campione di sangue in almeno una popolazione di cellule comprendente almeno un tipo di cellule fetali nucleate; c. isolare almeno una cellula tra dette almeno un tipo di cellule fetali nucleate; d. eseguire una analisi genetica su detta almeno una cellula isolata tra dette almeno un tipo di cellule fetali nucleate in modo tale da evidenziare almeno una caratteristica genetica di detta almeno una cellula fetale nucleata adatta a permettere detta diagnosi; caratterizzato dal fatto che detto passo di isolare almeno una cellula tra dette almeno un tipo di cellule fetali nucleate viene effettuato selezionando singolarmente singole cellule in un dispositivo microfluidico a tale scopo disegnato.
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto passo di isolare almeno una cellula tra dette almeno un tipo di cellule fetali nucleate viene effettuato catturando singole cellule/preferibilmente ciascuna in corrispondenza di uno specifico sito di una pluralità di siti di detto dispositivo microfluidico disposti nel dispositivo microfluidico secondo una schiera, e successivamente selezionando singole cellule tra le cellule catturate, sulla base di almeno un parametro rilevabile mediante un sensore interno o esterno al dispositivo microfluidico
3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che detto passo di arricchire detto campione di sangue comprende una selezione di cellule effettuata sulla base di almeno un parametro scelto nel gruppo consistente in: a. densità; b. morfologia; c. proprietà elettriche; d. proprietà chimiche; e. proprietà meccaniche; f. espressione di antigeni di superficie; g. espressione di antigeni intracitopiasmatici h. proprietà dielettriche i. proprietà magnetiche o combinazioni delle medesime.
4. 4. Metodo secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detto passo di arricchire detto campione di sangue in almeno una popolazione di cellule comprendente almeno un tipo di cellule fetali nucleate comprende il passo di trattare detto campione di sangue in modo da separare le cellule nucleate e arricchirlo conseguentemente in cellule nucleate.
5. 5. Metodo secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che detto passo di trattare il campione di sangue in modo da separare le cellule nucleate e arricchirlo conseguentemente in cellule nucleate comprende il passo di centrifugare detto campione di sangue in gradiente di densità.
6. 6. Metodo secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detto passo di arricchimento comprende una selezione effettuata sulla base della morfologia delle cellule, mediante filtri meccanici.
7. 7. Metodo secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detto passo di arricchimento comprende una selezione effettuata sulla base delle proprietà elettriche mediante dielettroforesi .
8. 8. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che detto passo di arricchimento comprende una selezione effettuata sulla base di almeno una delle seguenti caratteristiche di detta popolazione di cellule comprendente almeno un tipo di cellule fetali nucleate: a. Esprimere 1'antigene di superficie CD71; b. Esprìmere 1'antigene di superficie CD34; c. Esprimere 1'antigene di superficie GPA; d. Non esprimere 1'antigene di superfìcie CD14; e. Non esprimere l'antigene di superficie CD15; f. Non esprimere 1'antigene di superficie CD45;
9. 9. Metodo secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che detto passo di arricchire detto campione di sangue in detta popolazione di cellule comprendente almeno un tipo di cellule fetali avviene mediante almeno una delle seguenti tecniche: a. MACS; b . DACS; c . FACS.
10. 10. Metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto passo di arricchire detto campione di sangue in detta popolazione di cellule comprendente almeno un tipo di cellule fetali comprende una pluralità di fasi successive, in particolare una prima fase di selezione per centrifugazione, in base alla densità delle cellule, ed una seconda fase dì selezione per instaurazione di un legame antigene-anticorpo.
11. 11. Metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che comprende il passo di diluire detto campione di sangue dopo detto passo di arricchimento e prima di detto passo di isolamento di almeno una cellula tra le dette almeno un tipo di cellule fetali nucleate.
12. 12. Metodo secondo la rivendicazione 11, caratterizzato dal fatto che detto campione viene portato ad una diluizione scelta in un intervallo stabilito sulla base di un conteggio del numero di cellule nucleate presenti in una aliquota di volume prefissato del detto campione, che viene separata dal campione di sangue subito dopo il detto passo di arricchimento .
13. 13. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che almeno uno o entrambi i detti passi di arricchimento e di esecuzione di una analisi genetica vengono eseguiti in combinazione con detto passo di isolamento all'interno del medesimo detto dispositivo microfluidico utilizzato per eseguire il passo di isolamento .
14. 14. Metodo secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che viene utilizzato un dispositivo microfluidico munito di una pluralità di camere diverse, tra loro separate e collegate idraulicamente, delimitate su almeno una faccia da un unico chip o da una pluralità di chip separati.
15. 15. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti caratterizzato dal fatto che detto passo di isolare almeno una cellula fetale viene effettuato selezionando singolarmente singole cellule presenti in detto dispositivo microfluidico, le quali sono state precedentemente marcate con almeno un marcatore.
16. 16. Metodo secondo la rivendicazione 15, caratterizzato dal fatto che detto almeno un marcatore è coniugato ad un anticorpo.
17. 17. Metodo secondo una delle rivendicazioni 15 o 16, caratterizzato dal fatto che detto almeno un marcatore è un marcatore fluorescente.
18. 18. Metodo secondo una delle rivendicazioni 15 o 16, caratterizzato dal fatto che detto almeno un marcatore è una biglia fluorescente coniugata con almeno un anticorpo specifico per cellule fetali.
19. 19. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 15 a 18, caratterizzato dal fatto di comprendere la fase di marcare con un primo marcatore specifico per il nucleo cellulare cellule nucleate di detto campione di sangue, e di marcare con un secondo marcatore, distinguibile dal primo, almeno detta popolazione di cellule comprendente almeno un tipo di cellule fetali nucleate, in modo da selezionare in detto passo di isolare almeno una cellula fetale solo singole cellule che evidenziano la presenza di entrambi detti primo e secondo marcatore.
20. 20. Metodo secondo la rivendicazione 19, caratterizzato dal fatto che entrambi detti primo e secondo marcatore sono marcatori fluorescenti aventi emissione in, rispettivamente, una prima ed in una seconda lunghezze d'onda, tra loro differenti, preferibilmente nel blu e nel verde, rispettivamente.
21. 21. Metodo secondo la rivendicazione 20, caratterizzato dal fatto che detta fase di selezionare singolarmente sìngole cellule in detto passo di isolare almeno una cellula fetale viene eseguita rilevando anche l'emissione di una terza lunghezza d'onda, preferibilmente nel rosso, generabile per autofluorescenza da parte di dette cellule in detto campione di sangue, in modo da selezionare solo cellule che emettono sia nella prima che nella seconda detta lunghezza d'onda ma che, al contempo, non emettono nella detta terza lunghezza d'onda.
22. 22. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detta fase di analisi genetica è eseguita mediante QF-PCR.
23. 23. Metodo secondo la rivendicazione 22, caratterizzato dal fatto che detta fase di analisi genetica comprende una fase di estrazione del DNA eseguita mediante immersione delle cellule singolarmente selezionate per pochi secondi in azoto liquido e scaldandole a 60°C per dieci minuti.
24. 24. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 20, caratterizzato dal fatto che detta fase di analisi genetica è eseguita mediante cariotipo; e dal fatto che, in combinazione, detta fase di arricchimento di almeno una popolazione di cellule comprendente almeno un tipo di cellule fetali nucleate comprende inoltre le fasi di: I) bloccare in metafase le cellule
25. 25. Metodo secondo la rivendicazione 24 caratterizzato dal fatto di comprendere, dopo avere fermato in metafase le cellule, una fase di fissaggio e di permeabilizzazione per l'identificazione delle cellule fetali tramite un anticorpo intracitoplasmatico .
26. 26. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 22 a 25, caratterizzato dal fatto che detta fase di analisi genetica comprende una fase di comparazione tra informazioni genetiche portate da detta almeno una cellula fetale nucleata e da almeno una cellula materna nucleata recuperata dopo la detta fase di selezione in detto passo di isolare almeno una cellula tra dette almeno un tipo di cellule fetali nucleate .
27. 27. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che il detto passo di arricchire detto campione di sangue in almeno una popolazione dì cellule comprendente almeno un tipo di cellule fetali nucleate comprende le fasi di mettere in coltura detto campione di sangue arricchito in detta almeno una popolazione di cellule comprendente almeno un tipo di cellule fetali nucleate e di ripetere successivamente su detto campione una fase di arricchimento.
28. 28. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto campione di sangue è un campione di sangue periferico.
29. 29. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto dispositivo microfluidico per la selezione di singole cellule è un dispositivo usa e getta.