JP3265304B2 - 酵素に触媒される治療剤 - Google Patents

酵素に触媒される治療剤

Info

Publication number
JP3265304B2
JP3265304B2 JP2000339831A JP2000339831A JP3265304B2 JP 3265304 B2 JP3265304 B2 JP 3265304B2 JP 2000339831 A JP2000339831 A JP 2000339831A JP 2000339831 A JP2000339831 A JP 2000339831A JP 3265304 B2 JP3265304 B2 JP 3265304B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
cell
enzyme
prodrug
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP2000339831A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2001220397A (ja
Inventor
エイチ マイケル シェパード
マイケル ピー グロジアク
Original Assignee
ニューバイオティックス インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ニューバイオティックス インコーポレイテッド filed Critical ニューバイオティックス インコーポレイテッド
Publication of JP2001220397A publication Critical patent/JP2001220397A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3265304B2 publication Critical patent/JP3265304B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/555—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/555—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells
    • A61K47/556—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells enzyme catalyzed therapeutic agent [ECTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A61K47/67—Enzyme prodrug therapy, e.g. gene directed enzyme drug therapy [GDEPT] or VDEPT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/645—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6509—Six-membered rings
    • C07F9/6512—Six-membered rings having the nitrogen atoms in positions 1 and 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
【０００２】本出願は、35 U.S.C.§119 (e)のもとにそ
れぞれ1998年1月23日、1998年3月5日及び1998年11月16
日に出願された米国仮出願番号60/072,264; 60/076,95
0; 及び60/108,634に優先権を請求するものである。こ
れら文献の開示は引用として本明細書に含まれるものと
する。本発明は、薬の発見、特に異常細胞において治療
に対する抵抗性に重大な影響を持つ細胞内酵素の基質で
あって、細胞内酵素によって細胞毒素に変換されるプロ
ドラッグの設計に関する。
【０００３】
【従来の技術】本発明の開示全般を通じて、筆頭著者及
び発行年、特許番号または発表番号によって様々な文献
を引用している。個々の文献の完全な書誌的引用は、明
細書の中で、または出願の末尾で特許請求の範囲の直前
に参考文献名を掲載している。この発明が関係する工業
の状況をより十分に記述するために、これらの文献をこ
の発表資料の中に組み込んでいる。
【０００４】癌細胞は、無秩序な増殖、脱分化及び遺伝
的不安定性の特徴を持つ。遺伝的不安定性は、異常な染
色体数、染色体欠損、再配列、正常な2倍体数の損失ま
たは重複として現われる。Wilson, J.D. et al. (199
1). この遺伝的不安定性は幾つかの要因によって引き起
こされる。最も良く分かっている特性の一つは、癌抑制
遺伝子機能の消失に基づいて起こる遺伝的柔軟性の増強
である（例えば、Almasan, A. et. al. (1995)）。遺伝
的柔軟性はそれ自体癌細胞が変化する環境に適応するの
に役に立ち、かつ、より頻繁な突然変異、遺伝子増幅及
び染色体外因子の形成（Smith, K.A. et. al. (1995)
及びWilson, J.D. et. al. (1991)）を起こすことがあ
る。これらの特性は、化学療法（Almasan, A. et al.
(1995)及びWilson, J.D. et al. (1991)）に対してばか
りでなく、自然の宿主防御メカニズム、すなわち生物学
的療法（Wilson, J.D. et al. (1991)及びShepard, H.
M. et al. (1998)）に対して腫瘍が急速に抵抗性を獲得
するため、より悪性化するメカニズムを与える。
【０００５】癌は世界中で最も一般的なヒトが死に至る
病気の一つである。抗癌剤による治療は、特に外科的な
治療が可能な状態を過ぎてしまった全身的な悪性化や転
移性癌にとって、確実に重要性が増している選択肢であ
る。不幸にして、治療が可能なヒト癌のタイプはまだか
なり少ない（Haskell, C.M. eds. (1995)、 p.32）。ヒ
トの癌を治すことができる医薬品開発の進歩は遅い。本
来的な、または治療によって誘導される治療への抵抗性
ばかりでなく、遺伝学的、生物学的及び生化学的な悪性
腫瘍の不均一性が治療効果を減弱させる。さらに、多く
の抗癌剤が低い選択性しか示さないため、しばしば重篤
なまたは生命を危険にさらす毒性的な副作用を生じ、そ
のため全ての癌細胞を殺すだけの高用量を処方すること
ができない。従って、治療に抵抗性を持つ異常な悪性細
胞への選択性を改良した抗癌剤を探索することは、医薬
品開発の中心的な仕事として未だ残されている。加え
て、広範囲に及ぶ抗生物質に対する耐性が、重要なそし
て世界的な健康問題になっている (Segovia, M. (1994)
及びSnydman, D.R. et. al. (1996)）。
【０００６】（化学療法剤の種類）薬剤の主要な種類に
は、アルキル化剤、抗癌性抗生物質、植物アルカロイ
ド、代謝拮抗剤、ホルモンアゴニスト及びアンタゴニス
ト及び様々な薬剤がある。Haskell, C.M. (1995)編集並
びにDorr, R.T.及びVon Hoff, D.D. (1994)編集参照。
古典的なアルキル化剤は、ある有機化合物の水素原子を
アルキル基に置き換える高い反応性を持つ化合物であ
る。核酸、主にDNAのアルキル化が、これらほとんどの
化合物の重要な細胞毒性作用である。それらが引き起こ
す損傷は、DNAの複製及びRNAの転写を阻害する。古典的
なアルキル化剤には、メクロレタミン、クロラムブシ
ル、メルファラン、シクロフォスファミド、イフォスフ
ァミド、チオテパ及びブスルファンがある。非古典的な
アルキル化剤の多くも、メチル化またはクロロエチル化
など古典的なアルキル化剤とは異なる多様で複雑なメカ
ニズムで、DNA及びタンパク質を損傷する。非古典的な
アルキル化剤には、ダカルバジン、カルムスチン、ロム
スチン、シスプラチン、カルボプラチン及びアルトレタ
ミンがある。
【０００７】臨床上有用な多くの抗癌剤は、土壌菌類ス
トレプトマイセスの様々な株によって作られる産物であ
る。それらは、一つ以上のメカニズムによって腫瘍治療
効果を生ずる。すべての抗生物質は、通常はインターカ
レーションによりDNAと結合することができ、続いてヘ
リックスの巻き戻しをすることができる。この歪みは、
DNAがDNA合成、RNA合成、または両者の鋳型になること
を障害する。これらの薬剤は、フリーラジカルの生成及
び重要な金属イオンのキレート化によりDNAの傷害も引
き起こす。それらは、細胞***に必須の酵素であるトポ
イソメラーゼIIの阻害剤としても作用する。この種の薬
剤には、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノ
ルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ブレオマ
イシン、ダクチノマイシン、マイトマイシンC、プリカ
マイシン及びストレプトゾシンがある。
【０００８】最も有用な抗癌剤の幾つかは植物由来であ
る。この種類に属す薬剤の3つのグループに、ビンカア
ルカロイド（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、エ
ピポドフィロトキシン（エトポシド及びテニポシド）及
びパクリタキセル（タキソール）がある。ビンカアルカ
ロイドは、***細胞及び神経系に見出される微小管タン
パク質に結合する。この結合は、有糸***の紡錘糸の末
端におけるチュブリンの付加及び欠失の動力学を変え、
最終的には***を停止する結果となる。類似タンパク質
が神経組織の重要な構成要素であるため、これらの薬剤
は神経毒性を持つ。エピポドフィロトキシンはトポイソ
メラーゼIIを阻害し、細胞の機能に深刻な影響を与え
る。パクリタキセルは微小管に複雑な影響を与える。
【０００９】代謝拮抗剤は、細胞機能及び複製に必要な
正常な代謝産物のアナログである。それらは、典型的に
細胞内酵素との相互作用により働く。開発され、臨床試
験がなされてきた多くの抗代謝剤に、メトトレキサー
ト、5-フルオロウラシル（5-FU）、フロクスウリジン
（FUDR）、シタラビン、6-メルカプトプリン（6-MP）、
6-チオグアニン、デオキシコフォールマイシン、フルダ
ラビン、2-クロロデオキシアデノシン及びヒドロキシウ
レアがある。エンドクリン操作は、幾つかの腫瘍性疾患
に有効な治療法である。様々なホルモン及びホルモンア
ンタゴニストが、腫瘍学への利用を目指して開発されて
いる。利用できるホルモン剤の例に、ジエチルスチルベ
ストロール、タモキシフェン、酢酸メジェストロール、
デキサメタゾン、プレドニゾン、アミノグルテチミド、
ロイプロリド、ゴゼレリン、フルタミド及び酢酸オクト
レオチドがある。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】（最近の化学療法剤の
欠点）癌治療に化学療法剤を用いることに関して、高用
量が必要であること、正常細胞に対する毒性、すなわち
選択性の欠如、免疫抑制、二次発癌及び薬剤耐性が最近
問題になっている。現在癌の化学療法に用いられる薬剤
の大部分は、抗細胞増殖メカニズムによって作用する。
多くの正常な細胞（例えば、結腸上皮細胞、造血細胞）
は高い細胞増殖率を持つため、毒性が現われる結果とな
る。宿主への毒性のため、生存するすべての腫瘍細胞を
殺すのに必要な用量をかなり下回る用量で治療を中断せ
ざるを得ない。今日の療法に関わる別の副作用は、骨
髄、消化管粘膜、リンパ系細胞のように急速に***して
いる正常な宿主の組織における化学療法剤の毒性影響で
ある。化学療法剤は、神経毒性、***及び生殖機能の抑
制、心臓、肺、膵臓及び肝毒性、脈管の過敏反応及び皮
膚反応を含む他の不利益をも引き起こす。
【００１１】
【表１】 Smith et al. JNCl 74: 341-347 (1985)から引用
【００１２】血液毒性が、臨床に用いる多くの抗癌剤に
おいて最も危険な毒性である。血小板減少症及び出血も
起きて生命を危険にさらすが、最も一般的な毒性は好中
球減少症で、感染の高いリスクを伴う。化学療法は、多
形核白血球及び血小板の機能に定性的な欠陥も誘発す
る。これらの重篤な副作用に取り組むために、造血増殖
因子が開発された。Wilson, J.D. et al. (1991)及びDo
rr, R.T.及びVon Hoff,D.D.編集 (1994).一般に用いら
れる抗癌剤の大部分は、細胞免疫及び液性免疫の両者を
抑制することができる。感染は一般に進行癌の患者を死
に至らせるため、免疫障害はそのような死の原因となる
可能性がある。慢性的で遅延性の免疫抑制もまた癌の化
学療法によってもたらされる。主な神経毒性には、蜘網
膜炎、脊髄疾患または脳脊髄疾患、慢性脳脊髄疾患及び
傾眠症候群、急性脳脊髄疾患、末梢神経病及び急性小脳
症候群または運動失調症がある。
【００１３】一般に用いられる抗癌剤の多くには、催奇
形性ばかりでなく変異原性がある。プロカルバジン及び
アルキル化剤を含む幾つかの抗癌剤は、明らかに発がん
性がある。この発がん性は、多機能性アルキル化剤及び
エトポシドやアントラサイクリン抗生物質のようなトポ
イソメラーゼII阻害剤で治療を受けた患者に主に遅延性
急性白血病として現われる。化学療法は、遅延性の非ホ
ジキン病及び固型腫瘍にも関わる。本発明は、プロドラ
ッグが腫瘍細胞内でのみ活性化されるので、これらの作
用を最少限に抑えることができる。化学療法剤の臨床応
用は、薬剤耐性を示す悪性細胞を生ずるため、きわめて
制限される。薬剤耐性には、薬物代謝の変化、活性を持
つ化合物に対する細胞の非透過性または急速な細胞から
の***、阻害を受ける酵素の特異性の変化、標的分子の
産生増加、細胞毒性による損傷の修復能の増加、または
別の代謝経路による阻害された反応のバイパス形成な
ど、細胞が持つ幾つかのメカニズムが関与する可能性が
ある。一つの薬剤に対する耐性が、生化学的に異なる他
の薬剤に耐性を与える幾つかの例がある。癌の化学療法
に対する抵抗性の別のメカニズムは、癌抑制遺伝子、特
にp53、RB及びp16の機能の消失を通して起きる。これら
の遺伝子の機能消失は、抗癌剤が一般的に標的とする酵
素（例えば、5FU/チミジル酸シンターゼ及びメトトレキ
サート/ジヒドロ葉酸還元酵素）の発現が抑制される結
果となる（Lee, V. et al. (1997)、 Exp. Cell Res. 2
34: 270-6; Lenz, H.J. etal. (1998)、 Clinical Canc
er Res. 4: 1227-34 (1998); Fan、 J. and Bertino,
J. (1987)、 Oncogene 14: 1191-200）。ある種の遺伝
子の増幅は生物療法および化学療法耐性に関与してい
る。ジヒドロ葉酸還元酵素をコードしている遺伝子の増
幅は、メトトレキサートに対する抵抗性に関係し、チミ
ジル酸シンターゼをコードしている遺伝子の過剰発現/
増幅は、5-フルオロピリミジン治療に対する抵抗性に関
係する。Smith (1995).生物及び化学療法に対する抵抗
性に関わる幾つかの重要な酵素を表2にまとめる。
【００１４】
【表２】
【００１５】（化学療法剤の選択性を高める解決策とし
てのプロドラッグの利用）抗癌剤の選択性が低いことが
長い間認識され、選択性を改善し投与用量を高める多く
の試みがなされてきた。一つのアプローチとして、プロ
ドラッグの開発が行われてきた。プロドラッグは、毒性
学的には良性であるが、生体内で治療効果を持つ活性化
産物に変換される化合物である。ある場合には、抗
体（"ADEPT"または抗体依存酵素プロドラッグ療法（米
国特許番号4,975,278））によって標的細胞に運ばれる
非内因性酵素の作用またはジーンターゲッティング（"G
DEPT"または遺伝子依存酵素プロドラッグ療法（Melton,
R.G..及びScherwood, R.F. (1996)）によって活性化が
起こる。これらの技術には、血液を出て腫瘍に侵入する
という点で厳しい限界がある。Connors, T.A.及びKnox,
R.J. (1995).従って腫瘍に侵入して治療に抵抗性を獲
得した癌細胞の増殖を阻害する及び/または殺傷でき
る、より選択性の高い薬剤が必要とされる。本発明はこ
の必要性を満たし、関連する優位性も提供する。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明は、標的細胞を細
胞内標的酵素の選択的基質である治療剤の候補物質また
はプロドラッグと接触させることにより、潜在的な治療
剤を同定するための方法を提供する。この新しいアプロ
ーチを、酵素触媒による治療剤「ECTA」(Enzyme Catali
zed Therapeutic Agents)と名付ける。一つの実施態様
では、標的酵素は、過剰発現している内因性の細胞内酵
素で生物的及び化学的療法剤に耐性を与える酵素であ
る。別の実施態様では、癌抑制遺伝子機能の欠損（Smit
h, K.A. etal. (1995)及びLi, W. et al. (1995)）の結
果及び/または以前化学療法を受けたことが原因で（Mel
ton, R.G.及びSherwood, R.F. (1996)）癌細胞において
酵素活性が増加している。別の態様においては、標的酵
素は細胞に感染した生物の発現産物である。
【００１７】細胞をin vitro及び/またはin vivoでプロ
ドラッグの候補物質と接触させた後、薬剤が細胞***の
抑制を引き起こしたか、または細胞を死滅させたかどう
かに注目して薬剤の効力を調べる。本発明の側面の一つ
において、標的酵素によるプロドラッグからの毒性副産
物の放出によって、プロドラッグが細胞を死滅させる
か、または細胞増殖を阻害する。本発明の別の側面で
は、一つ以上の酵素がプロドラッグの活性化に用いられ
て毒性副産物を放出する。本発明の別の側面は、標的酵
素に対してここで記載される特徴を有する新しいプロド
ラッグを検定するために用いるキットを含む。このキッ
トは検定を行い結果を解析するのに必要な試薬及び説明
書を含む。
【００１８】本発明は前述した内因性の細胞内酵素のよ
うな標的酵素の選択的基質であるプロドラッグと細胞を
接触させることにより、選択的に異常細胞を死滅させる
方法及び分子の例も提供する。基質は細胞内の標的酵素
によって細胞毒素に特異的に変換される。本発明の別の
側面は、初期反応産物が、続けてアシラーゼ、ホスファ
ターゼまたは他のハウスキーピング酵素（Voet, et al.
(1995)）のような普通の細胞内酵素または通常の細胞
成分（例えば水）によって十分に活性化されてプロドラ
ッグから毒性副産物を放出することである。さらに本発
明によって、標的酵素の選択的基質であり、増殖亢進細
胞において酵素によって選択的に細胞毒素に変換される
プロドラッグを患者に投与し、異常な増殖亢進細胞を特
徴とする患者の病変を治療する方法が提供される。本発
明のプロドラッグは、単独で、または他の化学療法剤ま
たは放射線のような別の抗癌療法と組み合わせて用いて
もよい。
【００１９】本発明の別の側面として、標的酵素の選択
的基質であり、増殖亢進細胞において酵素によって選択
的に細胞毒素に変換されるプロドラッグを患者に投与
し、異常な増殖亢進細胞を特徴とする患者の病変を治療
する際に用いる医薬品の調製がある。
【００２０】本発明の別の側面は、内因性の細胞内酵素
を過剰に発現している細胞を分離し、この細胞を本発明
の少なくとも一つのプロドラッグと接触させることによ
り、一つ以上の本発明のプロドラッグの内どれが細胞の
増殖を阻害または死滅させるかを明らかにし、患者に対
する最適な治療法を明らかにする方法である。
【００２１】
【発明の実施の形態】本発明は、癌細胞の生物及び化学
療法に対する抵抗性に密接に関係している主要なゲノム
及び表現型の変化を利用することによって成し遂げられ
る。本発明は、癌治療（腫瘍壊死因子（TNF）のような
生物療法または化学療法）に曝露されたことにより選択
を受けた細胞を生体内においてその増殖を選択的に阻害
及びまたは殺傷する方法を提供する（表２参照）。結果
として、突然変異または遺伝子増幅によって活性化され
たある酵素が、初期またはその後の薬物療法に抵抗性を
示す。内因性細胞内酵素のより強力な阻害剤を作ること
を目指してきた先行技術と違い、本発明は、正常な細胞
及び組織に比較して治療に抵抗性を持つ病変細胞が示す
より高い酵素活性を利用するもので、酵素の阻害に頼る
ものではない。本発明のプロドラッグで治療効果がある
腫瘍細胞は、標的酵素の活性が増強している特徴を持つ
ため、標的酵素を過剰に発現していない正常細胞に比べ
プロドラッグを毒性物質に変換するはるかに高い能力が
ある。「標的酵素」という用語は、ここでは上に述べた
特徴を一つ以上持つ酵素を定義する。
【００２２】本発明を実施するには、別に示さない限
り、当業者の能力の範囲内にある分子生物学、微生物
学、細胞生物学及び組み換えDNAの従来の技術を用い
る。Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLON
ING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989); CURR
ENT PROTOCOLS IN MOKECULAR BIOLOGY (Academic Pres
s, Inc.): PCR2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPher
son, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995) and AN
IMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987))参
照。明細書及び特許請求の範囲で用いられる単数形"
a"、"an"及び"the"は、文脈上あきらかでない限り、複
数の参照を含む。例えば、"a cell"は、それらの混合物
を含めて多数の細胞を意味する。「有効量」とは、有益
なまたは望む結果をもたらすのに十分な量のことであ
る。有効量は、一回以上の投与、塗布または服用で投薬
することができる。ここで「宿主細胞」、「標的細胞」
及び「増殖亢進細胞」という用語は、細胞内酵素の遺伝
学的突然変異による活性化または細胞内酵素の過剰発現
を特徴とする細胞を広く意味する。幾つかの態様をあげ
ると、酵素の過剰発現は、薬剤耐性または異常な表現型
に関係する遺伝的不安定性に機能する腫瘍抑制遺伝子産
物の欠損に関連性を持つ。薬剤耐性には、薬物代謝の変
化、活性を持つ化合物に対する細胞の非透過性または急
速な細胞からの***、阻害を受ける酵素の特異性の変
化、標的分子の産生増加、細胞毒性による損傷の修復能
の増加、または別の代謝経路による阻害された反応のバ
イパス形成など、細胞が持つ幾つものメカニズムが関与
する。活性化または過剰発現され、薬剤耐性に関係する
酵素には、これらに限定されるわけではないが、チミジ
ル酸シンターゼ（TS）（Lonn, U. et al.(1996); Kobay
ashi, H. et al. (1995); Jackmen, A.L. et al. (199
5)）、ジヒドロ葉酸還元酵素（Banerjee, D. et al. (1
996)）、チロシンキナーゼ（TNA-α, Hudziak, R.M. et
al. (1998)）及び多剤耐性（Stuhlinger, M. et al.
(1994); Akdas, A. et al. (1996);及びTannock, I.F.
(1996)）； 及びATP依存多剤耐性関連タンパク質及び結
腸癌及び前立腺癌を含むある種の癌ではトポイソメラー
ゼI（Husain et al. (1994)）がある。また、ある薬剤
に対する抵抗性は、他の生化学的に異なる薬剤に対する
抵抗性を与えることがある。本出願では特に癌に焦点を
当てているが、同様な方法は抵抗性が増したために阻害
剤が効力を失ったヒト及び動物の病原菌によってコード
されている酵素にも適用できる。
【００２３】ある遺伝子の増幅は、化学療法に対する抵
抗性に関与している。チミジル酸シンターゼをコードし
ている遺伝子の増幅が、5-フルオロピリミジンによる癌
の治療に抵抗性を示し、一方、ジヒドロ葉酸還元酵素
（DHFR）の増幅は、メトトレキサートに対する抵抗性に
関係している。薬剤耐性に関係する遺伝子の増幅は、Ka
shini-Sabetら（1988）の米国特許番号5,085,983に記載
されているような改良ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、
またはここに記載される方法によって検出及びモニター
することができる。獲得された薬剤耐性は、両者とも遺
伝子増幅と関係している染色体の均一染色領域及びダブ
ルマイニュート染色体のような細胞遺伝学的異常の検出
によってモニターされる。別の検定方法として、直接的
または間接的酵素活性測定法（例えば、Carreras & San
ti (1995)）が含まれ、そのどちらも遺伝子増幅と関連
しており； 他の方法論（例えば、ポリメラーゼチェイ
ン反応、 Houze, T.A. et al. (1997)）、または免疫組
織化学（Johnson, P.G. et al. (1997)）がある。ま
た、標的細胞は、例えばTS（Li, W. et al. (1995)）ま
たはDHFR（Bertino,et al. (1996)及びLi, W. et al.
(1995)）の発現を増強することが知られているレチノブ
ラストーマ（RB）またはp53の欠損または不活化など癌
抑制遺伝子機能の不活化の特徴を持つ。
【００２４】本発明のプロドラッグは、癌抑制遺伝子の
機能的な損失、化学療法によるin vivoの選択、または
両方が原因となって病気に関わる酵素が化学療法に対す
る耐性に結びついている病気を治療または改善するため
に有用である。これは例えば、TS酵素のように正常細胞
に比べて異常細胞で過剰発現、過剰蓄積または賦活化さ
れる例を含む。幾つかのヒトの癌で偶然亢進しているこ
とが明らかになったグルタチオン-S-トランスフェラー
ゼは例外である。Morgan, A.S. et al. (1998).本発明
のプロドラッグは、本発明の標的酵素が正常細胞に比べ
異常細胞において一般に過剰に発現しているか、過度に
蓄積しているか、または賦活化していることに基づいて
識別が可能である。本発明を他の方法と区別するもっと
も重要な原理は： (1) 本発明は、チミジル酸シンターゼのような酵素基質
の合成について記述する。過剰に発現した酵素は、異常
細胞で選択的に毒性物質を生成する。先行の方法は阻害
剤に頼ってきた。阻害剤は酵素発現の増加をもたらし、
その結果、治療に耐性を示す（例えば、Lonn, U. et a
l. (1996)参照）。 (2) 本アプローチは、例えばグルタチオン-S-トランス
フェラーゼのような他の「基質−プロドラッグ」とも区
別される（Morgan, A.S. et al. (1998)参照）。GSTフ
ァミリーの酵素は、細胞に対する毒性的傷害に反応して
発現レベルが増加する。GSTファミリーの酵素は、基質
特異性が重複しているため、癌細胞で発現が亢進してい
る一種類の酵素とのみ反応する基質を設計することが困
難である（Morgan, A.S. et al. (1998)）。本発明の酵
素はそれぞれ（例えば、チミジル酸シンターゼ、ジヒド
ロ葉酸還元酵素及びチミジンキナーゼ）、その構造及び
基質特異性が固有であるため、固有の基質を容易に設計
できる。本出願の明細書にチミジル酸シンターゼの基質
に関する幾つかの例を提供する。 (3) 標的酵素（例えばチミジル酸シンターゼ）をコード
する遺伝子に突然変異が生じ阻害剤に抵抗性を示す（Ba
rbour, K.W. et al. (1992)及びDicken, A.P.et al. (1
993)）場合があるが、非阻害剤である基質プロドラッグ
とはまだ反応することができる。 (4) この方法のさらに優位な点は、癌抑制遺伝子機能の
消失が悪性化の進展に必須であることである。大部分の
癌細胞は、p53、RBまたはp16癌抑制遺伝子機能の一つを
失っている。そのような欠損は、化学療法を受けていた
かどうかとは無関係に、抵抗性酵素（例えば、チミジル
酸シンターゼ）の発現が亢進する結果となる。ここで記
述するプロドラッグは、以前化学療法を受けた病気ばか
りでなく、悪性化の初期の治療にも有用である。GSTの
ような酵素の基質は、わずかな治療インデックスの可能
性を与えるに十分な過剰発現を達成するためにさえ、癌
細胞がそれ以前に化学療法を受けていることを必要とす
る。
【００２５】（薬剤検定試験）本発明は、増殖亢進性ま
たは腫瘍性の病気、例えば癌などに治療効果を持つ薬剤
を確認する方法を提供する。またこの方法は、細胞の増
殖、または癌細胞のような増殖亢進細胞の細胞周期を阻
害する薬剤も同定できる。他の細胞として、患者の体内
で不適切に増殖する結果、病気を引き起こすバクテリ
ア、酵母及び寄生細胞が含まれる。対照細胞に比べて、
細胞増殖、複製または細胞周期の回転が減少すると、そ
の薬剤は潜在的な治療薬であると考えられる。もっとも
望ましいのは、細胞が薬剤によって死滅することであ
る。細胞は原核生物（大腸菌のようなバクテリア）また
は真核生物のいずれでもよい。細胞は、マウス細胞、ラ
ット細胞、ヒト細胞、菌類（例えば酵母）または病気を
起こす寄生虫（例えばニューモシスチスまたはリーシュ
マニア）など、ほ乳類または非ほ乳類のいずれでもよ
い。
【００２６】本明細書において、「増殖亢進細胞」と
は、脱分化、不死化、腫瘍性、悪性化、転移性、形質転
換している細胞を含むことを意図している。そのような
細胞には、肉腫細胞、白血病細胞、癌細胞または腺癌細
胞があるが、それらに限定されるわけではない。より具
体的には、乳癌細胞、肝細胞癌細胞、検出可能な癌細
胞、膵臓癌細胞、食道癌細胞、膀胱癌、卵巣癌細胞、皮
膚癌細胞、肝癌細胞または胃癌細胞がある。別の実施態
様においては、標的細胞は、従来の抗生物質に抵抗性の
感染性病原体に感染した細胞を妨げるまたは殺すために
用いる薬剤または化合物に耐性を示し得る。感染性病原
体には、バクテリア、酵母及びトリパノソームのような
寄生虫がある。
【００２７】本発明の主題である標的酵素の具体的な例
を表２（上記）または表３（下記）に記載する。化学療
法に対する抵抗性に関与し、癌療法に耐性の特徴を持つ
細胞内で賦活化、過剰発現または過剰蓄積しており、病
気に関係しているこれらの酵素には、チロシンキナーゼ
・スーパーファミリー群またはATP依存性MDR関連タンパ
ク質CAD、チミジル酸シンターゼ、ジヒドロ葉酸還元酵
素及びリボヌクレオチド還元酵素があるが、これらに限
定されるわけではない。感染性疾患において本方法の標
的となる酵素を表３に示す。
【００２８】
【表３】
【００２９】本発明の方法により同定される潜在的治療
薬は、酵素の基質であり、細胞内で細胞内毒性物質に変
換されるプロドラッグである。ここで、「プロドラッ
グ」とは、その薬剤の代謝物に比べて標的または増殖亢
進細胞に対する細胞毒性が弱い薬学的に活性な因子また
は物質の前駆体または誘導体で、より高い活性を持つ構
造に酵素的に賦活化または変換され得るものである（Co
nnors, T.A. (1986)及びConnors, T.A. (1996)）。薬剤
の毒性は、治療濃度の細胞毒素を異常細胞内で生産する
のに十分な量の変換酵素を産生している細胞に向けられ
ている。
【００３０】本発明は、少なくとも幾つかの要求される
特性を有する化合物の初期同定を可能にする迅速で簡単
なスクリーニング試験を提供する。本発明の目的のため
に、実施態様の一つの一般的スキームを図３に示す。こ
の図は、試験準備の方法及びその過程で必要な材料を記
す。図３に示すように、試験には二つのタイプの細胞が
必要で、第一の細胞は標的酵素が発現していないか、ま
たは低いレベルでしか発現していない対照細胞である。
第二のタイプの細胞は、細胞内で標的酵素が検出可能な
レベル、例えば高レベルで発現している試験細胞であ
る。例えば、標的酵素TSを内因的に発現していない原核
細胞である大腸菌が最適な宿主細胞または標的細胞であ
る。細胞には、対照対応細胞（標的酵素を欠いてい
る）、または別の実施態様では標的酵素または酵素群
（標的酵素の適切な酵素種を含む）を異なって発現する
よう遺伝的に改良された対応細胞があり得る。一種類以
上の酵素を各々別個の宿主細胞に導入することができ、
その結果、標的酵素に対する候補薬の効果を、別の酵素
または別の種に由来する同一の酵素に対する効果と同時
に比較できる。
【００３１】別の実施態様では、例えば強力なプロドラ
ッグであることが知られている以下に示すような有効量
の化合物に細胞を暴露するために、第三の細胞が対照と
して用いられる。この態様は特にチミジル酸シンターゼ
によって賦活化される新薬のスクリーニングに有用であ
る。別の実施態様では、ras遺伝子で形質転換されたNIH
3T3細胞（ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, V
A 20110-2209, U.S.A.）のような形質転換細胞株が操作
され、標的酵素をコードしているクローン化cDNAからそ
の酵素を可変的かつ増加した量で発現する。トランスフ
ェクションは、この技術でよく知られており、Chen, L.
et al. (1996), Hudziak, R.M. et al. (1988)またはC
arter. P. etal. (1992)に記載され、以下の実験の項に
もある方法を用いて、一過性または恒久性のいずれかと
する。cDNAの挿入に適切なベクターは、商業的にはStra
tagene, La Jolla, CAや他の会社から入手できる。それ
ぞれのトランスフェクトした細胞株における酵素発現レ
ベルを、免疫検出用の酵素に対するモノクローナルまた
はポリクローナル抗体を用いて、細胞溶解物のイムノブ
ロット及び酵素検定方法によりモニターすることができ
る。Chen、 L. et al. (1996)参照。細胞に導入する発
現カセットのコピー数または利用するプロモーターを変
えることによって発現量を制御することができる。発現
酵素の量を検出するには、Carreras, C.W.及びSanti,
D.V. (1995)の総説または以下の実験の項に示す方法に
従って酵素検定を行うこともできる。チミジル酸シンタ
ーゼを高レベルに発現させるために、癌細胞株（例え
ば、Copur et al. (1995)によって記載されるような結
腸癌細胞）を選択することができる。
【００３２】上述したように、要求する遺伝的欠損を持
つ細胞をCold Spring Harbor, Agricultural Research
Service Culture CollectionまたはAmerican Type Cult
ureCollection から入手することができる。Miller (19
92),Sugarman et al. (1985)及びSpector et al. (199
8)に記載されているような標準的な方法で、標的酵素を
コードしている遺伝子を細胞に導入することによっても
適切な細胞株を用意できる。図３に示すスクリーニング
法は抗生物質の発見にも広く適用できることは当業者に
は当然である。例えば、酵母由来のチミジル酸シンター
ゼを、図４に示す大腸菌由来の酵素に置き換えることが
できる。これにより酵母の病原体を標的とする特定の抗
菌類抗生物質の発見が可能となる。さらに、他の酵素も
この方法にかけることができる。例えば、Pneumocystis
carniiのような感染性生物のジヒドロ葉酸還元酵素活
性を特に標的とするプロドラッグを選別することができ
る。図３に示すスクリーニング試験を用いることによっ
て、これらの薬剤は酵素の特異性に関して選択され、本
来の宿主の酵素を活性化しないことを示すことができ
る。正常なヒトの酵素のみが存在する場合は毒性がない
ことを示すために、対照細胞は該当する正常なヒトの酵
素を持つ。例えば図４に示すように、外来遺伝子、例え
ばTSをコードするヒトの遺伝子を、ヒトTSを発現するよ
うに宿主細胞に導入できる。この遺伝学的に作出された
細胞は試験細胞として図３に示されている。対照細胞は
標的酵素を発現しない。幾つかの実施態様においては、
培地に標的酵素のタンパク産物を補う必要があるかもし
れない。
【００３３】別の実施態様では、野生型宿主細胞は注目
している酵素を一つ以上欠いているかまたは発現しな
い。図４に示すように、宿主細胞は内因的にチミジンキ
ナーゼ（TK-）またはチミジル酸シンターゼ（TS-）を産
生しない。これらの酵素のヒトの対応酵素をコードして
いる遺伝子を宿主細胞に導入して望みの発現レベルを得
る。本明細書に記載する方法、例えば免疫的検出のため
に予め酵素に対して生じさせたモノクローナルまたはポ
リクローナル抗体を使って細胞溶解液のイムノブロット
及び酵素検定方法によって、トランスフェクト細胞株そ
れぞれにおける酵素の発現レベルをモニターすることが
できる。Chen, L. et al. (1996)参照。Carreras, C.W.
及びSanti, D.V. (1995)の総説に従い、例えばトリチウ
ム標識基質のような検出標識基質を用いる酵素検定方法
を行うこともできる。考えられる「二酵素システム」の
優位性は、癌細胞で過剰発現している二つの酵素による
活性化を必要とすることで、正常細胞に対する安全性を
高めることであろう。
【００３４】試験細胞を小さなマルチウエル・プレート
で増殖させ、試験するプロドラッグの生物学的活性の検
出に用いる。本発明の目的には、有用な候補薬は試験細
胞の増殖を抑制するかまたは死滅させるが、対照細胞に
有害性を示さないものである。プロドラッグ候補物質は
細胞を培養する培地に直接添加するか、またはあらかじ
め細胞表面のレセプターと特異的なリガンドと結合させ
た後、培地に添加することができる。細胞特異的輸送の
ための結合方法は、この技術分野ではよく知られてい
る。米国特許番号5,459,127及び5,264,618並びに公開特
許明細WO 91/17424（1991年11月14日発行）参照。プロ
ドラッグ候補物質の脱離基は、検出可能に、例えばトリ
チウムで標識することができる。次に標的細胞または培
地を検定して、プロドラッグ候補物質から放出された標
識の量を知る。あるいは、Lasic, D.D. (1996)に記載の
方法でプロドラッグをリポソームに包むか、またはLewi
s, J.G.. et al. (1996)に記載のサイトフェクチンと結
合させることにより、細胞内への取り込みを増強させる
ことができる。別の実施態様では、注目している酵素、
すなわち標的酵素を過剰に発現している培養ヒト癌細胞
を上記の方法で確認する。薬剤が細胞内に取り込まれや
すい条件下で、細胞を治療薬剤と接触させる。次に細胞
増殖阻害または殺細胞作用を調べる。
【００３５】常に明示することはしないが、それぞれの
実施態様は、例えば以下に示す強力なプロドラッグであ
ることが分かっている化合物の有効量が与えられたこと
によって対照として働く別個の標的細胞を提供すること
で、さらに変更できることを理解しておくべきである。
【００３６】生物学的に活性な化合物を同定するハイス
ルプットスクリーニング法の概要を図３、４及び５に示
す。試験の基礎は大腸菌及び同様な単細胞生物の遺伝子
操作および増殖が簡単であることにある。Miller (199
2)及びSpector et al. (1998)参照。設計されたプロド
ラッグの標的酵素に該当する内因性の酵素活性を取り除
くことが重要なステップである。これは、Miller (199
2)、Sambrook et al. (1989)及びSpector et al. (199
8)が示すいずれの方法によっても行うことができる。こ
れらの方法には、化学的及び生物学的（例えばウイルス
またはトランスポゾンの挿入）突然変異の誘発とそれに
続く適切な選択が含まれる。TS陰性（TS-）細胞が、チ
ミジル酸シンターゼによって賦活化されると細胞毒性物
質になるプロドラッグを同定する陰性対照となる。他の
細胞、例えばバクテリア、酵母またはその他の選択可能
な単細胞生物を使って同様なアプローチができる。この
試験では対照及び組換え体の両方の細胞で試験化合物に
対する感受性を比較する。当業者には容易に理解される
ように、酵素の種の相違を区別するプロドラッグもこの
方法から導くことができる。例えば、ヒト及び酵母の酵
素を発現しているという点以外は同一の細胞を用いて、
酵母の酵素を発現している細胞のみを選択的に死滅させ
る抗生物質のプロドラッグを検出することができる。こ
のようにして、新規かつ特異的な抗生物質を発見するこ
とができる。
【００３７】細胞株の例にras遺伝子で形質転換されたN
IH3T3細胞（ATCCから入手）で、クローニングされたcDN
Aからヒトチミジル酸シンターゼ（Hu TS）を高発現する
よう操作されてた細胞がある。トランスフェクションは
一過性または恒久的に行なわれる（Chen, L. et al. (1
996), Hudziak, R.M. et al. (1988)及びCarter, P. et
al. (1992)参照）。NIH-000 （ras遺伝子で形質転換し
た親細胞株）、NIH-001（Hu TSの低発現株）、NIH-002
（Hu TSの中間発現株）、NIH-003（Hu TSの高発現
株）。免疫検出用のHu TSに対する抗体を使って細胞溶
解液のイムノブロット及び酵素検定方法により、それぞ
れの細胞におけるTSの発現レベルをモニターする（Che
n, L. et al. (1996)参照）。酵素検定方法はCarreras
及びSanti (1995)の総説に従って行う。
【００３８】ヒト結腸及び乳癌細胞株をHu TS酵素発現
についてスクリーニングした。低、中間及び高レベルの
Hu TSを発現している細胞株を、NIH3T3細胞株について
上述したように、候補薬に暴露する。増殖抑制及び細胞
毒性を上記の方法でモニターする。表１に掲載する各酵
素について同様な試験を行うことができる。
【００３９】癌細胞におけるTSの過剰発現を利用するプ
ロドラッグの別の実施態様に、デオキシウリジン・ホス
ホルアミデート、または治療用放射性核種を結合した他
の修正（ここに引用する）がある。治療用放射性核種に
はレニウム188がある。この同位元素は基本的にはCalla
han, et al. (1989)に従って合成することができる。ま
たは、商業的にも、例えばMallicrodt Medical BV（オ
ランダ）から入手することができる。治療用放射性核種
を標準的な方法（例えばLin, W-Y. et al. (1997)）に
よりデオキシウリジンまたはデオキシウリジン5'-ホス
ホルアミデートまたは他の誘導体と結合させることがで
きる。放射性核種を含むデオキシウリジン・ホスホルア
ミデートは、チミジル酸シンターゼを過剰に発現してい
る癌細胞のDNAに優先的に取り込まれ、高濃縮のベータ
及びガンマ線を放出して癌細胞を死滅させる。他の放射
性核種にはレニウム-186その他が含まれる（Troutner,
D.A. (1987)）。
【００４０】（In vivo投与）In vitro試験の結果は、i
n vivoでの効力を決定するために、ヒトの腫瘍を持つ
か、または抗生物質に耐性の微生物を感染させた動物モ
デルで確認する。本発明の別の特徴は、細胞増殖が亢進
している特徴をもつ患者の病気を治療する方法で、ここ
で定義したように、細胞内酵素によって増殖亢進細胞内
で毒性物質に変換されるプロドラッグの治療量を患者に
投与することを含む方法である。好ましい態様では、化
合物は以下の「プロドラッグ」の項で定義される化合物
の中から選択する。マウス、ラットまたはヒトの患者の
ような患者にプロドラッグを投与する時は、薬剤を製薬
的に許容できる担体に添加して全身的または局所的に投
与することができる。治療が有効であると考えられる患
者を判断するために、患者から腫瘍の標本を摘出し、細
胞における指標酵素の発現レベルを調べる。投与される
毒性量のプロドラッグが望ましくない副作用を示さない
程度に正常細胞よりも発現レベルが高い場合は、腫瘍ま
たは細胞が治療に適している判断され、したがってその
患者は本発明の治療に適合している。例えば、標的酵素
が正常細胞よりも少なくとも２倍そして好ましくは約３
倍高く発現していれば、その患者は本発明の治療法に適
した患者である。治療に有効な量は経験的に決めること
ができ、治療対象になる病気、患者の状態及び変換され
るプロドラッグの毒性または細胞内毒性物質に応じて変
えられる。
【００４１】動物に投与する場合、本方法はプロドラッ
グの効力をさらに確かめるために有用である。動物モデ
ルの例として、約105から約109個の増殖が亢進してい
る、ここで規定するような癌細胞または標的細胞をヌー
ドマウス（雌性Balb/c NCR nu/nu, Simonsen, Gilroy,
CA）の各群に皮下接種する。腫瘍が確立したならば、プ
ロドラッグを例えば腫瘍の周囲に皮下注射によって投与
する。腫瘍のサイズを１週間に２回カリパスで測定し、
腫瘍の退縮を決定する。他の動物モデルを適用してもよ
い。Lovejoy et al. (1997)及びClarke, R. (1996)。In
vivoにおける投与は、１回の投与でも治療期間中連続
してまたは間欠的に投与しても効果を示し得る。最も有
効な投与手段及び投与量を決める方法は、当業者によく
知られており、治療に使う組成、治療の目的、治療する
標的細胞及び治療を受ける患者に応じて変えられるであ
ろう。医者によって選択される投与量及びパターンに応
じて、単回または複数回投与してもよい。適切な投与量
の算出及び投与方法を以下に示す。
【００４２】本発明の薬剤及び組成物は製剤分野で使わ
れ、製剤の活性成分のように従来の手法に従って投与さ
れることによりヒト及び他の動物の治療に使われる。本
医薬組成物は、経口、経鼻、非経口的に、または吸入の
経路で投与され、錠剤、ドロップ、顆粒、カプセル、丸
薬、アンプル、座薬またはエアロゾールの形態をとって
いてよい。活性成分の水系または非水系希釈液における
懸濁液、溶解液及びエマルジョン、シロップ、顆粒また
は粉末の形態をとることもある。本発明の化合物に加
え、本医薬組成物は他の薬理作用を持つ化合物または本
発明の複数の化合物を含む。特に、ここで活性成分と呼
ぶ本発明の式の化合物は、経口、直腸、鼻、局所（経
皮、エアロゾル、口内及び舌下）、膣、非経口（皮下、
筋注、静脈内及び皮内投与を含む）及び肺を含む適切な
あらゆる経路で治療のために投与される。患者の状態及
び年齢並びに治療を行う病気に応じて好ましい投与経路
が変動することは理解されるであろう。
【００４３】一般的に上述した各化合物の適切な用量
は、約１から約100 mg/kg体重/日の範囲で、好ましくは
約１から約50 mg/kg体重/日の範囲で、さらに最も好ま
しくは約１から約25 mg/kg体重/日の範囲である。他に
指示しない限り、本発明の式の親化合物として活性成分
の全重量を計算し、塩およびエステルについては重量は
それに伴って増加する。必要な用量は、好ましくは一日
の中で適切な間隔で２、３、４、５、６またはそれ以上
の回数で投与される分割用量として表される。これらの
分割投与は、例えば単位用量あたり約１から約100 mg、
好ましくは約１から約25 mg、そして最も好ましくは約5
から約25 mgの活性成分を含む単位用量で投与する。本
発明の化合物及び組成物の適切な用量は、病気の種類、
重篤度及びステージに依存することがあり、患者によっ
て変えられることが理解されるであろう。
【００４４】至適用量は、一般に本発明による治療での
有害な副作用に対する治療効果のバランスで決定される
であろう。理想的には、プロドラッグは病変部で活性化
合物濃度が最大に達するよう投与されるべきである。こ
のことは、例えばプロドラッグを、場合によっては生理
食塩水中のものとして、静脈内投与したり、活性成分を
含有する錠剤、カプセルまたはシロップを経口投与する
ことによって達成される。連続注入によってプロドラッ
グの望ましい血中濃度を維持し、病変組織内に活性成分
の治療量を供給してもよい。個々の治療剤が単独で使わ
れる場合に必要とされる量に比べ、各々の成分である抗
ウイルス剤の総量をより低い量でしか必要としない治療
の組合わせを提供し、それによって有害効果を減少させ
る有効な組み合わせが検討される。
【００４５】プロドラッグ成分を単独で投与することも
可能であるが、一つ以上の製薬的に許容できる担体、お
よび、場合によっては他の治療剤とともに、上に定義し
た少なくとも一つの活性成分を含む製剤として提供する
ことが好ましい。各担体は製剤中の他の成分と共存可能
という意味で「許容できる」ものでなければならず、患
者に有害なものであってはならない。調剤は、経口、直
腸、鼻、局所（経皮、エアロゾル、口内及び舌下）、
膣、非経口（皮下、筋注、静脈内及び皮内投与を含む）
及び肺投与に適したものを含む。調剤は、簡便に単位用
量で表され、製薬技術分野でよく知られた方法によって
調製される。そのような方法には、一つ以上の副次的な
成分を構成する担体と活性成分を会合させるステップが
ある。一般的に製剤は活性成分を液体担体または固体担
体または両方と均一にそして密接に会合させ、必要なら
ば、産物を成形することにより調製される。経口投与に
適した本発明の調剤は、各々があらかじめ決められた量
の活性成分を含有するカプセル、または錠剤のような個
々の単位として、粉末または顆粒として、水性または非
水性の溶液または縣濁液として、またはオイル/水また
は水/オイルの液体エマルジョンとして表されることが
ある。活性成分は、丸薬、舐剤または泥膏剤として表さ
れる場合もある。
【００４６】錠剤は、任意に一つ以上の副次的な成分を
加え、圧搾または鋳型によって作られてよい。圧搾錠剤
は、粉末または顆粒のような流動性を持たない形態中の
活性成分を、場合により、バインダー（例えば、ポピド
ン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロー
ス）、滑剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングルコ
ール酸ナトリウム塩、架橋ポビドン、架橋塩化カルボキ
シメチルセルロース）、表面活性剤または分散剤と混合
し、適切な機械で圧搾することにより作られることがあ
る。鋳型錠剤は、粉末の化合物と不活性な液体希釈剤の
混合物を適切な機械で型に入れて作られることがある。
錠剤は任意にコートされるか、または刻み目を入れられ
てもよく、望ましい放出特性を与えるため、例えば種々
の割合のヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて
活性成分が徐々にまたは制御されて放出されるように調
剤が施されてもよい。錠剤は、場合により胃よりも腸で
放出されるように腸溶剤が任意に施されてもよい。
【００４７】口中で局所的な使用に適した調剤は、風味
がある基剤、通常は蔗糖及びアカシアまたはトラガカン
ト、に活性成分を含む舐剤；ゼラチン及びグリセリンま
たは蔗糖及びアカシアのような不活性な基剤に活性成分
を含んだトローチ；及び適切な液体担体に活性成分を含
んだうがい薬がある。
【００４８】本発明の局所的投与製剤の組成は、軟膏、
クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、泥膏、ゲ
ル、スプレー、エアロゾルまたはオイルとして処方され
る。また、活性成分と任意に一つ以上の賦形剤または希
釈剤を混ぜた包帯または絆創膏のような膏薬または手当
用品がある。
【００４９】眼または口及び皮膚などの外部組織の病気
に関しては、活性成分を例えば約0.075%から約20%w/w、
好ましくは約0.2%から約25%w/w、そして最も好ましくは
約0.5%から約10%w/wの活性成分を含有する局所的軟膏ま
たはクリームとして適用される。軟膏で処方される時
は、プロドラッグはパラフィンまたは水と混和できる軟
膏基剤のいずれかが使われる。所望であれば、クリーム
基剤の水相は、例えば、少なくとも約30%w/wの多価アル
コール、すなわちプロピレングリコール、ブタン-1、3-
ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロール
及びポリエチレングリコール並びにそれらの混合液のよ
うな二つ以上のヒドロキシ基を持つアルコールを含んで
よい。局所製剤は、プロドラッグの成分が皮膚または他
の適用部位における吸収または通過を増強させる化合物
を含むことが望ましい。そのような皮膚通過増強剤の例
にジメチルスルホキシド及び関連する類似物がある。
【００５０】本発明のエマルジョンのオイル相は、既知
の成分から既知の様式で構成されてよい。このオイル相
は乳化剤（エマルゲンとして知られる）のみを含んでい
てもよいが、少なくとも一つの乳化剤と油脂またはオイ
ル、もしくは油脂とオイルの両者との混合物を含むこと
が望ましい。親水性の乳化剤が安定化剤として働く油脂
親和性の乳化剤と一緒に含まれることが好ましい。オイ
ルと油脂の両者を含むことも好ましい。安定化剤含有ま
たは非含有乳化剤はいわゆる乳化ワックスを作り、ワッ
クスはオイル及び/または油脂とともにクリーム製剤の
オイル分散層を形成するいわゆる乳化軟膏基剤を作る。
本発明の製剤に適したエマルゲンまたはエマルジョンに
は、Tween 60、Span 80、セトステアリルアルコール、
ミリスチルアルコール、グリセリルモノステアレート及
びラウリル硫酸塩がある。調剤に適したオイルまたは油
脂の選択は、医薬品のエマルジョン製剤に使われる大部
分のオイルに対して活性化合物の溶解性が大変低いた
め、所望の化粧品の性質を達成するための基礎となって
いる。そのため、クリームはチューブまたは他の容器か
らもれない程度の適切な粘度を有する非グリース系、非
染色性で洗浄可能な物であることが好ましい。ジ−イソ
アジペート、イソセチルステアレート、ココナツ脂肪酸
のプロピレングリコールジエステル、イソプロピルミリ
ステート、デシルオレート、イソプロピルパルミテー
ト、ブチルステアレート、2-エチルヘキシルパルミテー
トのような、直鎖または分枝鎖の一または二塩基アルキ
ルエステル、またはクロダモールCAPとして知られる分
枝鎖エステルのブレンドが用いられることがあるが、最
後の三つが好ましいエステルである。これらは必要な性
質に基づき、単独または組み合わせて使用してよい。あ
るいは、白色軟パラフィン及び/または液体パラフィ
ン、または他の鉱物オイルのような高い融点を持つ脂質
を使用することもできる。
【００５１】眼への局所的投与に適した調剤は、活性成
分を適切な担体、特にプロドラッグ成分に対する水系溶
媒に溶解または縣濁させた点眼液を含む。プロドラッグ
成分は約0.5%から約20%、約0.5%から約10%で存在するこ
とが好ましく、約1.5%(w/w)で存在することが特に好ま
しい。直腸に投与する場合の調剤は、例えばココアバタ
ーまたはサリチル酸塩から成る適切な基剤で作られる座
薬として提供されることがある。膣内投与に適した調剤
は、プロドラッグの活性成分に加えて関連工業分野で適
当であることが知られているような担体を含む座薬、タ
ンポン、クリーム、ゲル、パスタ、フォームまたはスプ
レー製剤として提供されることがある。鼻腔内投与に適
した調剤は、担体は固体であり、嗅ぐことで投与される
例えば約20から500ミクロンの範囲にある粒子径を持つ
粗粉末を含み、鼻に近づけた粉末容器から鼻腔を通って
急速に吸入される。例えば鼻用スプレー、鼻用ドロッ
プ、またはネブライザーによるエアロゾル投与のよう
に、液体を担体とする投与に適切な調剤は、プロドラッ
グ成分の水性溶液または油性溶液を含有する。
【００５２】非経口的投与に適した調剤は、抗酸化剤、
緩衝液、制菌剤及び製剤を患者の血液と等張に保つ溶質
を含んでいてもよい水性及び非水性の等張滅菌注射溶
液、分散剤及び濃縮剤を含んでいてもよい水性及び非水
性の滅菌懸濁液、及び化合物が血液成分または一つ以上
の器官を標的とするように設計されたリポソームまたは
他の微粒子系がある。これらの調剤は、例えばアンプル
及びバイアルのような単位用量または多用量がシールさ
れた容器で提供されることがあり、使用直前に滅菌され
た液体担体、例えば注射用蒸留水を添加するだけでよい
凍結乾燥条件で保存されることがある。即時注射溶液及
び懸濁液は、滅菌された前述の粉末、顆粒及び錠剤から
調製されてよい。
【００５３】好ましい単位用量の処方は、上述のように
プロドラッグ成分の一日用量または単位、一日亜用量、
またはそれらの適切な分画を含むものである。特に上述
した成分に加えて、本発明の調剤は、問題としている剤
形タイプについてこの技術分野で伝統的に使われる他の
薬剤を含むことがあるのは当然であり、例えば経口投与
に適した薬剤は、甘味剤、シックナー及び芳香剤などの
薬剤を含有する場合がある。本発明の式のプロドラッグ
及び組成は、例えばこの技術分野における伝統的な方法
によって調製される獣医薬としても使われてよい。本発
明のプロドラッグを賦活化するために有用な細胞及び標
的酵素について、以下に簡単にまとめる。
【００５４】（チロシンキナーゼ）チロシンキナーゼ・
スーパーファミリーは、EGFリセプター（EGFR）、マク
ロファージコロニー刺激因子（CSF-1）リセプター（v−
fms）及びインシュリンリセプターから成り、rosオンコ
ジーン産物と30%から40%の相同性を持つ。より詳細に
は、このスーパーファミリーは、v-src、c-src、EGFR、
HER2、CSF-1リセプター、c-fms、v-ros、インシュリン
リセプター及びc-mosを含む。Burck, K.B. et al., eds
(1988)の図8.5参照。チロシンキナーゼ・スーパーファ
ミリーのタイプ１リセプターの過剰発現が、多くの癌で
報告されている（Eccles, S.A. et al. (1994-95)）。
チロシンキナーゼの過剰発現は、α−癌生物療法剤TNF-
α（Hudziak, R.M. et al. (1988)及びHudziak, R.M. e
t al. (1990)）及び化学療法剤（Stuhlinger et al. (1
994)）への暴露に関連して起こる。ラウス家鶏肉腫の形
質転換遺伝子、v-src、は、タンパク質のチロシン残基
をリン酸化する酵素をコードしている。c-srcプロトオ
ンコジーンが20番染色体上で発見された。神経皮膚炎に
起源を持つ腫瘍に由来する組織及び細胞株は、高度に特
異的なキナーゼ活性を伴う高レベルのc-srcを発現して
いる。
【００５５】癌細胞はc-erbB-2/neu (HER2)を過剰に発
現していることが幾つかの研究グループから報告されて
いる。Briston（1993）は、ヒトの腫瘍ではerbBプロト
オンコジーンが増幅しており、多くの場合過剰に発現し
ていることを指摘している。c-erbB-2/neuオンコジーン
の増幅がヒトの乳癌（Slamon, et al. (1987), van de
Vijver et al. (1987), Pupa et al. (1993)及びAnders
en et al. (1995)）及び膀胱癌（Sauter et al. (199
3)）で報告され、いずれの場合にも過剰発現を伴う増幅
であった。c-erbB-2/neu過剰発現は卵巣癌組織サンプル
（Salmon, et al.(1989), Meden et al. (1994)及びFel
ip et al. (1995)）及び末梢神経系由来の腫瘍（Sukuma
r及びBarbacid (1990)）においても報告された。医薬品
のスクリーニング試験を行うため、癌細胞株のオンコジ
ーンの発現が調べられ、またチロシンキナーゼを様々な
レベルで発現するよう操作される。選択された細胞株を
培養し、候補薬が様々な濃度で添加される。Hudziak,
R.M. et al. (1988)及びHudziak, R.M. et al. (1990)
に従い、細胞毒性及び細胞増殖阻害について細胞を試験
する。
【００５６】（ジヒドロ葉酸還元酵素）メトトレキサー
トは、細胞内における葉酸代謝に必須の酵素であるジヒ
ドロ葉酸還元酵素の強力な阻害剤である。ジヒドロ葉酸
還元酵素は、チミジル酸合成反応産物であるジヒドロ葉
酸からテトラヒドロ葉酸を再生産する機能を持つ（Voe
t, et al. Eds. (1995), p.-813）。細胞のメトトレキ
サート耐性の重要なメカニズムは、DHFR遺伝子の増幅に
よるDHFR活性の増加であることが確立されている。術後
に補助的化学療法（シクロフォスファミド、メトトレキ
サート、5-フルオロウラシル[CMF]）を受けていた肺癌
患者にDHFR遺伝子の増幅が起きていたことが、Banerje
e, D. et al. (1995), Schimke, R.T. et al. (1988),
Lonn, U. et al. (1996)によって報告されている。レチ
ノブラストーマ（Rb）の欠損も、遺伝子増幅を伴わずに
DHFR mRNAの発現が増加する結果、MTX耐性の増強に繋が
ることがある。Li, W.W. et al. (1995).変異したp53を
持つ細胞株は、遺伝子増幅が進行することが知られてお
り、化学療法により耐性細胞が選択される。Banerjee,
D. et al. (1995)、 Yin, Y. et al. (1992)及びLiving
ston, L.R. et al. (1992). Schimke, R.T. et al. (19
88)が、本発明の検定の目的で、幾つかのマウス、ハム
スター及びヒト細胞株を記載している。また、DHFR遺伝
子の増幅を調べて本明細書に記載の治療剤を同定する方
法に有用な細胞を明らかにするためにLonn, U. et al.
(1996)のPCR法が使われる。ヒトジヒドロ葉酸還元酵素
をコードするcDNAのヌクレオチド配列がMasters, J.A.
及びAttardi, G. (1983)によって提供され、本明細書に
述べるようにして、その酵素を様々なレベルで発現する
ように細胞を操作することができる。Dicken, A.P. et
al. (1993)が、化学療法によって選択された変異DHFR遺
伝子について述べている。DHFRの精製及び酵素機能に関
する試験が、Nakano, T. et al. (1994)によって示され
ている。また、DHFRをコードするcDNAがNIH3T3細胞にト
ランスフェクトされる。候補薬を様々な濃度で添加し、
殺細胞及び増殖阻害作用が調べられる。例えば、ジヒド
ロ葉酸のN5またはC6位のいずれかにアルキル化基を結合
させることによって、ジヒドロ葉酸還元酵素活性に依存
する代謝拮抗剤を合成することができる。DHFRによるN5
-C6結合の還元により、アルキル化剤が遊離する結果と
なる。アルキル化基に加えて、DHFRによる遊離が毒性物
質または代謝拮抗物を生産する結果になるどんな部分(m
oiety)も、すべて本発明の実行に有用である。これらの
化合物は、ホスファターゼまたホスホルアミデートによ
ってさらに修飾される。
【００５７】（多剤耐性癌）多剤耐性（MDR）とは、癌
細胞が抗癌剤の細胞毒性作用を回避するために用いる様
々な戦略に関する包括的な用語である。MDRは、化学療
法に用いられる薬剤に対してばかりでなく、明らかな構
造的相同性や共通の標的を持たない薬剤に対しても広い
スペクトルに渡って、癌細胞の感受性を減弱させる特徴
を示す。この多様な抵抗性が、癌の有効な治療にとって
重大な障害の一つとなっている。MDRは、細胞質膜また
は細胞質内、細胞または核における構造的または機能的
変化によってもたらされるかもしれない。MDRの分子メ
カニズムは、解毒及びDNA修復経路の修飾、薬物封鎖の
細胞部位の変化、薬物−標的親和性の減少、特異的な薬
物阻害剤の細胞内における合成、タンパク質に対する変
化した、又は不適切なターゲッティング及び薬物排除ま
たは排出の促進という観点から議論されている。MDRに
関係しているメカニズムの一つは、薬剤で選択された細
胞株におけるATP依存性多剤耐性タンパク質（MRP）とし
て知られる遺伝子の増幅及び過剰発現の結果起こる。MD
Rメカニズムに関する総説はGottesman, M.M. et al. (1
995)及びNoder, et al. (1996)参照。MDR細胞株を樹立
するために、Gottesman, M.M. et al. (1995)並びにSim
opn,S.M.及Schindler, M. (1994)に従い、一段階または
多段階のいずれかの薬剤選択を行う。様々なほ乳類から
のMDRをコードするDNA配列の分離は、Gros, P. et al.
(1986)、 Gudkov, A.V. et al. (1987)及びRoninson,
I.B. et al. (1984)に記載されており、Gottesman, M.
M. et al. (1995)に総説が記載されている。上述したよ
うに、この酵素が様々なレベルで発現するように細胞を
操作することができる。MDRを標的とするプロドラッグ
は、この輸送体のATPase活性に基づいている。
【００５８】（リボヌクレオチド還元酵素）リボヌクレ
オチド還元酵素は、リボヌクレオシド二リン酸を対応す
るデオキシリボヌクレオシド二リン酸に還元する。この
酵素は二つのα-サブユニット及び二つのβ-サブユニッ
トから成る四量体である。ヒドロキシウレアは、β2-基
質複合体のチロシン・フリーラジカル（Tyr-122）と相
互作用してこの反応を特異的に阻害する。Voet et al.
(1995).この反応を標的とする目標は、強力な細胞毒性
を示すフリーラジカル産物であるO2 -を蓄積させること
である。
【００５９】（他の疾患への技術の応用）この出願の主
題は癌であるが、この技術は他の疾患、特に抗生物質耐
性の細菌感染にも広く適用できることを認識しておく必
要がある。β-ラクタム系抗生物質は、β-ラクタマーゼ
の過剰発現の結果としての細菌の抵抗性に遭遇する。Ha
milton-Miller, J.M.T.及びSmith, J.T. eds. (1979)
p. 443. カナマイシンのようなアミノグリコシド系抗生
物質による治療に続いて、アミノグリコシドホスホトラ
ンスフェラーゼ・タイプIIIのような他の酵素が誘導さ
れて選択される。McKay, G.A. et al. (1994). この応
用のために、酵素活性は阻害しないが、その代わり感染
生物に対する細胞内毒性物質を産生するために酵素の高
い活性を利用する既知の基質から誘導されたプロドラッ
グが調製される。
【００６０】（チミジル酸シンターゼ）チミジル酸シン
ターゼの過剰発現は、結腸癌、乳癌、胃癌、頭部及び頚
部の癌、肝癌及び膵臓癌と関連している。これらの疾患
は、最近では代謝拮抗剤（ウラシルベース、葉酸ベー
ス、キナゾリンベース（表１参照））で治療される。こ
れらのそれぞれのケースで、腫瘍サプレッサーの欠損及
び/または5-フルオロウラシル療法がTS活性の増強を導
くか、またはこの酵素の薬剤耐性型を選択する結果、薬
物耐性の病気の再発をもたらす可能性がある。Lonn, U.
et al. (1996)が、以前術後に補助的化学療法（シクロ
ホスファミド、メトトレキサート、5-フルオロウラシル
[CMF]）を受けていた乳癌患者でTS遺伝子の増幅が起き
ていたことを報告した。このTS遺伝子の発現増強は、癌
抑制遺伝子機能の欠如に起因するTS遺伝子の基礎的な増
加に付加されたものである。TS遺伝子によって正常に行
われる主要な反応は、デオキウリジン一リン酸（dUMP）
及びN(5),N(10)-メチレン-テトラヒドロ葉酸（THF）か
らデオキシチミジン一リン酸（dTMP）及びジヒドロ葉酸
（DHF）を合成することである。ひとつの実施態様にお
いては、ウラシルまたはTHFの誘導体がTS遺伝子を発現
している細胞に与えられる。本発明のために、「ウラシ
ル」（塩基のみ）及び「ウリジン」（塩基及び糖）は互
いに互換的に使用され、同等に用いられる。TS遺伝子の
発現亢進によって影響を受ける多くの癌のタイプを表４
（以下）にまとめた。
【００６１】
【表４】 平均の倍数 >2.5
【００６２】誘導体または「プロドラッグ」は、酵素に
よって強力な細胞毒性代謝物に変換される。正常細胞で
発現している低レベルのTSでは、変換された毒性物質は
毒性を示す量に達しない。疾患組織で発現している高レ
ベルのTSは、毒性物質をより多く産生して細胞増殖の阻
害及び/または細胞死を引き起こす。例えば、現行の療
法では、5-フルオロデオキシウリジレートをTS活性を阻
害するために使用する。基質と反応する間に、フッ素原
子が不可逆的にTS酵素と結合して酵素活性を阻害する。
一実施態様において、提案された新しい治療法はTSが反
応を完結することを許すが、DNAに組み込まれると毒性
影響を起こす修飾産物を産生させるものである。酵素産
物は、他の重要な細胞機能（例えば、タンパク合成やエ
ネルギー代謝）も阻害することがある。プロドラッグの
変換は、細胞に毒性があるCN-のような代謝産物も放出
し得る。ウラシル/dUTP及びN(5)(10)-THFの誘導体を合
成することができ、すべてTSによって代謝的変換を受け
た後、毒性物質を生じる可能性がある。
【００６３】１次配列からTSは最も高度に保存されてい
る酵素の一つであることが分かった。Perry, K. et al.
(1990).原核生物の幾つかの種、ラクトバチラス カセ
イ（Hardy, L.W. et al. (1987); Finer-Moore, J. et
al. (1993)）及びエシェリヒア コリ（Perry, K. et a
l. (1990)）、真核生物ロイシュマニア マジャー (Knig
hton, E.R. et al. (1994))及びT4ファージ（Finer-Moo
re, J.S. et al. (1994)）から得られたTSの結晶構造が
決定された結果、３次構造も大変よく保存されているこ
とが示された。三次元構造が決定された生物種のTS配列
の比較整列(alignment)がSchiffer, C.A. et al. (199
5)に示されている。これらのアミノ酸配列から、当業者
によく知られている方法を用いてDNA配列を推定する、
または分離することができる。Sambrook, et al. (198
9). または、異なる生物に由来する約29のTS配列がクロ
ーニングされ、Carreras, C.W.及びSanti, D.V. (1995)
に記載されているように、DNAデータベースに登録され
た。ヒトのチミジル酸合成酵素遺伝子の配列、そのクロ
ーニング、発現及び精製が、Takeishi, K. et al.(198
5)、 Davisson, V.J. et al. (1989)及びDavisson, V.
J. et al. (1994)によって提供される。TSタンパクをコ
ードし、必要な制御配列を持つ遺伝子が、当業者によく
知られる方法で構築される。TSをコードしている遺伝子
は電気窄孔法、トランスフォーメーションまたはトラン
スフェクションの方法で標的細胞に導入される。また
は、当業者によく知られている方法で、例えばCarrera
s, C.W.及びSanti, D.V. (1995)、 Miller (1992)及びS
pector et al. (1998)に記載されているように、適切な
発現ベクターに遺伝子を組み込む。発現ベクターは細胞
にTS遺伝子を組み込む。次に、TSタンパクが発現して生
産されやすい条件下で細胞を増殖させる。
【００６４】TSの選択的基質である潜在的治療薬を同定
するために、ヒトの胃癌細胞株、MKN-74 、MKN-45、 MK
N-28及びKATO-IIIを用いることができる。MKN-74及びMK
N-45は、それぞれよく分化した腺癌及び未分化の腺癌か
ら樹立される。これらの細胞株及び培養条件は、Osaki,
M. et al. (1997)及びその中の引用文献に記載されて
いる。または、Copur, S. et al. (1995)に記されてい
るような、5-FUで選択されチミジル酸合成酵素を過剰発
現している癌細胞株が使われる場合もある。当業者によ
く知られている酵素的生化学法でTSの定量が行われる。
ヒトの癌組織標本からのTSタンパク及びTS遺伝子の発現
レベルを定量するためには、Johnston, P.G. et al. (1
991)及びHorikoshi, T. et al. (1992)によって報告さ
れているような方法が感度がよい。また、Lonn, U. et
al. (1996)のPCR法が、TS遺伝子の増幅を調べ、本明細
書に記載する治療剤を同定する方法に有用な細胞を確認
するために用いられる。
【００６５】当業者には明らかなことであるが、薬剤で
処理しない対照となる細胞培養系及び別途以下に例示す
る化合物のような参考薬剤で処理する細胞培養系も試験
する。リード(lead)化合物は、正常細胞に比較して2倍
または好ましくは３倍以上の活性で選択的に標的細胞を
死滅させる化合物の一つである。本発明は、本明細書に
記載する方法で同定された薬剤も提供する。別の特徴と
して、本発明は上記の試験を最初に行うことにより、増
殖亢進細胞の増殖を阻害する方法を提供する。この試験
によって同定されたプロドラッグは、細胞と接触させら
れ、上述した内在する細胞内酵素によって細胞内で毒性
代謝物に変換される。バクテリア、酵母及び他の種類の
細胞増殖及び細胞毒性は、Miller et al. (1992), Suga
rman et al. (1985)及びSpector et al. (1998)に記載
されているように、モニターすることができる。
【００６６】（TSプロドラッグ）好ましい実施態様にお
いて、本発明は、TSによって賦活化される二つのクラス
の化合物を含み、それぞれ5-置換デオキシウリジン一リ
ン酸誘導体または保護5-置換ウラシルまたはデオキシウ
リジン一リン酸である。保護5-置換デオキシウリジン一
リン酸誘導体は、リン酸部分が適切な化学的保護基でブ
ロックされたものである。5-置換デオキシウリジン一リ
ン酸誘導体の保護は、溶解性を改善し、細胞内への通過
を促進し、血液−脳関門の通過を促進し、リン酸基が失
われる結果にならないよう細胞内または細胞外ホスファ
ターゼの作用を妨げる。別の態様においては、5-置換ウ
ラシルまたはウリジン誘導体は、ヌクレオシドキナーゼ
活性を持つ細胞に与えられ、そこで5-置換ウラシル/ウ
リジン誘導体は5-置換ウリジン一リン酸誘導体に変換さ
れる。ウリジン誘導体は修飾されることもあり、溶解
性、細胞通過及び/または血液−脳関門通過能が増加す
る。
【００６７】チミジル酸シンターゼは5-置換ウリジン一
リン酸誘導体に作用して、ピリミジン環の5-位に結合し
た置換基（脱離基）を放出する。放出された置換基はそ
のままの形で、または別の細胞内成分と反応後のいずれ
かにおいて、毒性物質または細胞増殖阻害剤として作用
するすことができる。
【００６８】（クラスI化合物の一般的合成）クラスI化
合物のL型及びD型異性体は、
【化２】 の構造を持つ。前記式で、R1（5-位の位置）は、チミジ
ル酸合成酵素によるピリミジン環から引き抜かれ得る大
きさ及び親電子性を持つ化学的要素である脱離基である
かまたはそれを有し、チミジル酸合成酵素によりピリミ
ジン環から放出されると、細胞増殖を阻害するか、また
は細胞を死滅させる。
【００６９】前記式で、Qは糖基、チオ糖基、炭素環状
基及びそれらの誘導体から成る群の中から選択される化
学的要素を含むホスフェートまたはホスホルアミデート
誘導体である。糖基の例には、オキセタン（４員環
糖）、フラノース（５員環糖）及びピラノース（６員環
糖）から誘導される単環糖のグループがあるが、これら
に限定されるわけではない。フラノースの例には、トレ
オ−フラノシル（４炭糖トレオースから）、エリトロ−
フラノシル（４炭糖エリトロースから）、リボ−フラノ
シル（５炭糖リボースから）、アラ−フラノシル（しば
しばアラビノ−フラノシルと称される。５炭糖アラビノ
ースから）、キシロ−フラノシル（５炭糖キシロースか
ら）及びリキソ−フラノシル（５炭糖リキソースから）
がある。糖誘導体の例には、「デオキシ」、「ケト」及
び「デヒドロ」誘導体およびその置換誘導体がある。チ
オ糖の例には、上記糖の環状酸素が硫黄原子で置き換え
られた硫黄アナログがある。炭素環状基の例には、C4炭
素環状基、C5炭素環状基及びC6炭素環状グループがあ
り、それらはさらに-OH基のような一つ以上の置換基を
持つ場合がある。
【００７０】一実施態様においては、Qは、式
【化３】 （式中、R7はホスホリルまたはホスホルアミデート及び
それらの誘導体からなる群から選択され、R2及びR3は、
同一であるかまたは異なり、独立に-Hまたは-OHであ
る）のβ-D-リボフラノシル基である。
【００７１】ある実施態様では、R1はアルケニル基、す
なわち(-CH=CH)n-R4、式中、nは0から10までの整数で、
R4はI-またはBr-のようなハロゲン、CN-または水銀であ
る；式中R2はHでR3が-OHである；式中R2は-OHでR3は H
である；式中R2及びR3は Hである；または式中R2及びR3
は -OHである。
【００７２】別の態様では、R1はアルケニル基、すなわ
ち、 (-CH=CH)n-R4、式中、nは0から10までの整数で、R
4がH、ハロゲン、アルキル、アルケン、アルキン、ヒド
ロキシ、-O-アルキル、-O-アリール、O-ヘテロアリー
ル、-S-アルキル、-S-アリール、シアニド、シアネート
及びチオシアネートハロビニル基、ハロ水銀基、-S-ヘ
テロアリール、-NH2、-NH-アルキル、-N(アルキル)2、-
NHCHO、-NHOH、-NHO-アルキル、NH2CONHO-及びNHNH2か
らなる群の中から選択される基であるか、またはそれを
含む。これらの態様における、他の特徴は、R2及びR3が
Hであるもの；R2がOHでR3がHであるもの；R2がHでR3がO
Hであるもの；またはR2及びR3がOHであるものを含む。
【００７３】好ましいR1位置の置換基は図８に示すよう
なアリリックな交換ができるものである。
【００７４】さらに別の態様では、治療薬の候補物質は
式：
【化４】 の化合物である。式中、nは0から10の整数を示し、Aは
ホスホルアミド誘導体か、または式：
【化５】 の化合物で、QはH、上記で定義した置換されていない
か、または置換されている糖、及び上記で定義した置換
されていないか、または置換されている環状炭素基であ
る。
【００７５】さらに別の実施態様では、上記の化合物が
構造：
【化６】 （式中、R7はH、ホスホリル、ホスホルアミデート及び
それらの誘導体から成る群の中から選択され、R2及びR3
は同一かまたは異なり、独立に-Hまたは-OHである）を
持つQによって修飾される。一つの実施態様において
は、R7はHではない。これらの実施態様において、R
1は、構造(-CH=CH)n-R4をとることもでき、式中、nは0
から10の整数を示し、R4はH、ハロゲン、アルキル、ア
ルケン、アルキン、ヒドロキシ、-O-アルキル、-O-アリ
ール、O-ヘテロアリール、-S-アルキル、-S-アリール、
-S-ヘテロアリール、−NH2、-NH-アルキル、-N(アルキ
ル)2、-NHCHO、シアニド、シアネート及びチオシアネー
トハロビニル基、ハロ水銀化合物、-NHOH、-NHO-アルキ
ル、NHNH2及びNH2CONHO-からなる群の中から選択され
る。
【００７６】さらに別の側面において、治療薬の候補物
質は式：
【化７】 の化合物で、式中Rは2'-デオキシ-5-ウリジルで、mは0
または1、nは0から10の整数を示す。
【００７７】適切な場合には、化合物は、例えばD-また
はL-体を含む、鏡像体、ジアステレオマーまたは立体異
性体のいずれであってもよく、または、例えば、α-ま
たはβ-アノマー体を含むいずれの立体化学構造であっ
てもよい。
【００７８】当業者にはよく知られている方法によっ
て、上記の5位を置換したピリミジンヌクレオシド及び5
位を置換したピリミジンヌクレオシド一リン酸の合成を
行うことができる。例えば、5-クロロマーキュリー-2'-
デオキシウリジンを、Li2PdCl4存在下でハロアルキル化
合物であるハロアセテートまたはハロアルケンで処理す
ると、有機パラジウム中間物を経て、それぞれ5-アルキ
ル、5-アセチルまたは5-アルケン誘導体となる。Watay
a, et al. (1979)及びBergstrom, et al. (1981). ピリ
ミジンヌクレオシド及びヌクレオチドのC5の修飾例に、
保護していないヌクレオチドを酢酸水銀で処理した後、
Li2PdCl4存在下スチレンまたは環を置換したスチレンを
付加して生成するC5-trans-スチリル誘導体がある。Big
ge et al. (1980). ピリミジンデオキシリボヌクレオシ
ド三リン酸は、酢酸緩衝液中で酢酸水銀と50℃、3時間
反応させてピリミジン環の5位を水銀で誘導体化する。D
ale、 et al. (1973). そのような処理は、一リン酸の
修飾にも有効であると考えられる；あるいは、例えばア
ルカリホスファターゼで制御しつつ処理した後に一リン
酸を精製することにより、修飾された三リン酸を酵素的
に修飾一リン酸に変換することができる。水銀に類似し
た分子特性を有するが、薬理学的に好ましい特性を有す
る他の有機部分または無機部分で置きかえることができ
る。置換されたピリミジンを合成する一般的な方法に
は、例えば、米国特許番号4,247,544; 4,267,171及び4,
948,882及びBergstrom et al. (1981)がある。上記の方
法は、リボースまたは2'-デオキシリボース以外の、例
えば2'-3'-デオキシリボース、アラビノース、フラノー
ス、リクソース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース
及びピラノースなどの糖を持つ5-位が置換されたピリミ
ジンヌクレオシド及びヌクレオチド誘導体の合成にも適
用できる。5-位置換基の例に、E-5-(2-ブロモビニル)-
2'-デオキシウリジレートのようなハロビニル基があ
る。この化合物は、以下の実験の項に書かれているよう
に合成される。
【００７９】あるいは、5-ブロモデオキシウリジン、5-
ヨードデオキシウリジン及びそれらの一リン酸誘導体
は、Glen Research, Sterling, VA (USA), Sigma-Aldri
ch Corporation, St. Louis, MO (USA), Moravek Bioch
emicals, Inc., Brea, CA (USA), ICN, Costa Mesa, CA
(USA)及びNew Englan Nuclear, Boston, MA (USA)から
商業的に入手できる。商業的に入手できる5-ブロモデオ
キシウリジン及び5-ヨードデオキシウリジンは、化学的
またはGlen Research, Sterling, VA (USA)及びICN, Co
sta Mesa, CA (USA)から提供される試薬にキナーゼ酵素
を作用させて酵素的に一リン酸に変換することができ
る。これらのハロゲン誘導体を他の置換基と組み合わ
せ、より強力な新規の代謝拮抗剤を造ることができる。
【００８０】（クラスII化合物の一般的な合成）別の態
様において、チミジル酸シンターゼを過剰に発現してい
る細胞と接触されるプロドラッグは、式：
【化８】 の化合物のLまたはD異性体である。
【００８１】前記式においてR1は式：
【化９】 で表される部分である。式中、R2は二価の電子伝達部分
であるか、またはそれを含有する。一実施態様として、
R2はピリミジン環から電子を奪って脱離基R1に伝達する
モノまたはポリ不飽和電子伝達体であるか、またはそれ
を含有する。ひとつの態様において、R2は不飽和ヒドロ
カルビル基；一つ以上の不飽和ヒドロカルビル基を含む
芳香族ヒドロカルビル基；及び一つ以上の不飽和ヒドロ
カルビル基を含むヘテロ芳香族基から成る群より選択さ
れる。
【００８２】一実施態様として、R2は、
【化１０】 から成る群の中から選択される構造を持つ不飽和ヒドロ
カルビル基である。
【００８３】一実施態様として、R2及びR3は一緒になっ
て、
【化１１】 から成る群の中から選択される構造をとる。
【００８４】一実施態様として、R2は
【化１２】 から成る群の中から選択される構造を持つ芳香族ヒドロ
カルビル基である。
【００８５】一実施態様として、R2は
【化１３】 から成る群の中から選択される構造を有するヘテロ芳香
族基であり、式中、Jは-O-、-S-、または-Se-のような
ヘテロ原子またはNH-または-NRALKのようなヘテロ原子
基で、式中、RALKは1から10の炭素原子を持つ直鎖また
は分枝鎖アルキル基または3から10の炭素原子を持つシ
クロアルキル基である。
【００８６】前記式で、R3は二価のスぺーサー部分で、
スぺーサー単位とも呼ばれる。一実施態様として、R
3は、
【化１４】 から成る群の中から選択される構造を有する二価のスぺ
ーサー部分で、式中、R5は、同一または異なり、独立
に、炭素原子を1から10個有する直鎖また分枝アルキル
基、または炭素原子を3から10個有するシクロアルキル
基である。
【００８７】一実施態様として、R3は
【化１５】 から成る群の中から選択される構造を有する二価のスぺ
ーサー部分である。前記式において、nは0から10の整数
で、mは0または1の整数である。一実施態様では、nが0
から10の整数で、mが1をとる。一実施態様では、nが0
で、mが0をとる。一実施態様では、R7が-Hであれば、n
は0ではない。一実施態様では、R7が-Hであれば、mは0
ではない。一実施態様において、R7が-Hである場合は、
nは０でなく、mは0でない。一実施態様では、R7が-Hで
あれば、R4はハロゲン（例えば、-F、 -Cl、 -Br、 -
I）ではない。一実施態様では、R7が-H、mが0、nが0で
あれば、R4はハロゲン（例えば、-F, -Cl, -Br, -I）で
はない。
【００８８】前記式において、R4はトキソホア部分であ
る。ここで、トキソホアという用語は、チミジル酸シン
ターゼによってピリミジン環から引き抜かれる得る大き
さと電荷を持つ化学的部分である脱離基またはそれを含
有する部分であって、チミジル酸シンターゼによってピ
リミジンから放出されると、細胞増殖を阻害するかまた
は死滅させる能力を有する部分を意味する。
【００８９】一実施態様として、トキソホアは、細胞で
過剰に発現されている細胞内酵素によって賦活化または
放出される脱離基であるか、またはそれを含有する。一
実施態様として、R4は、
【化１６】 から成る群の中から選択される構造を有する基である
か、またはそれを含有し、式中、Xは-Cl、 -Br、 -Iま
たは他の強力な遊離基（-CN、 -OCN及び-SCNを含むが、
これらに限定はされない）で、Yは同一かまたは異な
り、独立に-Hまたは-Fであり、Zは同一かまたは異な
り、独立に-O-または-S-である。
【００９０】一実施態様として、R4は、
【化１７】 から成る群の中から選択される構造を有する基である
か、またはそれを含有する。
【００９１】一実施態様として、R4は、
【化１８】 から成る群の中から選択される構造を有する基である
か、またはそれを含有する。
【００９２】一実施態様として、R4は構造：
【化１９】 を有する基であるか、またはそれを含有する。
【００９３】一実施態様として、R4は、構造：
【化２０】 を有する基であるか、または基を含有する。
【００９４】一実施態様として、R4は、
【化２１】 から成る群の中から選択される構造を有する基である
か、またはそれを含有する。
【００９５】一実施態様として、R4は、構造：
【化２２】 を有する基であるか、またはそれを含有する。
【００９６】一実施態様として、R4は、構造：
【化２３】 を有する基であるかまたは基を含有する。
【００９７】一実施態様として、R4は、構造：
【化２４】 を有する基であるかまたは基を含有する。
【００９８】一実施態様として、R4は、-Br、 -I、 -O-
アルキル、 -O-アリール、 O-ヘテロアリール、 -S-ア
ルキル、 -S-アリール、 -S-ヘテロアリール、 -CN、 -
OCN、 -SCN、 -NH2、 -NH-アルキル、 -N(アルキル)2、
-NHCHO、 -NHOH、 -NHO-アルキル、 NH2CONHO-、 NHNH
2、 -N3及び
【化２５】 のようなシスプラチン誘導体から成る群から選択される
化学的要素であるか、またはそれを含有する。
【００９９】前記式において、QはプロドラッグとTSま
たはTKのような酵素との機能的結合を助ける糖部分また
はそれに類似する部分であるか、それを含む。一実施態
様として、Qは、
【化２６】 から成る群から選択され、式中、R6は同一かまたは異な
り、独立に-H、 -OH、 -OC(=O)CH3、 または他の保護さ
れたヒドロキシル基（ベンゾイル、-COC6H5及びトルオ
イル、-COC6H4CH3を含むが、これらに限定されない）
で、R7は水素、リン酸基、ホスホルアミデート基、また
は他のリンを含有する基である。
【０１００】一実施態様として、Qは
【化２７】 である。
【０１０１】一実施態様として、Qは
【化２８】 である。
【０１０２】一実施態様では、R7は水素である。一実施
態様においては、R7は水素ではない。一実施態様とし
て、R7はリン酸基またはホスホルアミデート基である。
一実施態様として、R7はホスホルアミデート基である。
【０１０３】一実施態様として、R7は、例えば20種類の
天然アミノ酸を含むアミノ酸から誘導されるホスホルア
ミデート基である。一実施態様として、R7は、アラニン
から誘導されるホスホルアミデート基である。一実施態
様として、R7は構造：
【化２９】 を有する基であるか、またはそれを含有する。前記の基
及び作製方法はMcGuigan et al. (1993)及びMcGuigan e
t al. (1996)に記載されている。
【０１０４】一実施態様として、R7はトリプトファンか
ら誘導されるホスホルアミデート基である。一実施態様
として、R7は構造：
【化３０】 を有する基であるか、またはそれを含有する。前記の基
及び作製方法はAbaraham et al. (1996)に記載されてい
る。
【０１０５】一実施態様として、R7はリン酸基である。
一実施態様として、R7は、
【化３１】 から成る群の中から選択される構造を有する基である
か、またはそれを含有する。
【０１０６】前記二つの基の内、一番目の基及びその作
製方法は、Freed et al. (1989)、Sastry et al. (199
2)、 Farquhar et al. (1994)及びFarquhar et al. (19
95)に記載されている。前記二つの基の内、二番目の基
及びその作製方法は、Valette et al. (1996)及びBenza
ria et al. (1996)に記載されている。
【０１０７】一実施態様として、R7は
【化３２】 （Rは芳香族置換基である）から成る群の中から選択さ
れる構造を有する基であるか、またはそれを含有する。
【０１０８】前記二つの基の内、一番目の基及びその作
製方法は、Meier et al. (1997), Meier et al. (199
7), Meier et al. (1997)に記載されている。前記二つ
の基の内、二番目の基及びその作製方法は、Hostetler
et al. (1997)に記載されており、Hostetler et al.の
国際特許出願番号WO 96/40088 (1996)に記載されてい
る。
【０１０９】一実施態様として、R7はQ内で環状基を形
成する。そのような実施態様の一つ、及び作製方法を以
下に示す。（式中、DMTrは4、4'-ジメトキシトリチル
を、Bocはt-ブチルオキシカルボニルを、DCCは1、3-ジ
シクロヘキシルカルボジイミドを、そして4-DMAPは4-ジ
メチルアミノピリジンを示す。）
【化３３】
【０１１０】一実施態様として、化合物はD体、L体、α
-アノメリック体、β-アノメリック体を含む鏡像異性
体、 ジアステレオメリック体、または立体異性体であ
ってよい。
【０１１１】一実施態様として、化合物は、例えば塩、
エーテルまたはエステルとして、塩の形態、保護体また
はプロドラッグ体、またはそれらの組み合わせの形態を
とることがある。
【０１１２】一実施態様として、プロドラッグは式：
【化３４】 の化合物である。
【０１１３】一実施態様として、プロドラッグは式：
【化３５】 の化合物である。
【０１１４】一実施態様として、プロドラッグは式：
【化３６】 の化合物である。
【０１１５】一実施態様として、プロドラッグは式：
【化３７】 の化合物である。
【０１１６】一実施態様として、プロドラッグは式：
【化３８】 の化合物である。
【０１１７】別の実施態様として、前記構造は以下に述
べる方法でさらに修飾を受け、ホスホジアジリジン基の
かわりにチオホスホジアジリジンを有する。
【０１１８】（クラスII化合物の一般的な合成戦略）ウ
ラシルの5位の構造は、それらが脱離基（トキソホア）
を複素環に結合するため結合鎖と呼ばれる。ヒトTSのCy
s-195と反応して複素環が活性化すると、負の電荷がウ
ラシルの6位から結合鎖に移る。このメカニズムは、Bar
r et al. (1983)により(E)-5-(ブロモビニル)-2'-デオ
キシウリジン（BVDU）の5'-一リン酸化体、Wataya et a
l. (1979), Santi (1980)及びBergstrom et al. (1984)
により(E)-5-(3,3,3-トリフルオロ-1-プロペニル)-2'-
デオキシウリジン（TFPe-dUrd）のリン酸化体について
述べられている。
【０１１９】TS-Cys-スルフヒドリル攻撃によって供給
される、毒素を不安定化する負電荷を伝達し易いよう
に、毒素とdNMPの間のスぺーサー鎖は飽和されてはなら
ない。この目的のために利用できる多くの不飽和炭素化
合物官能基の中で、ビニル基、アリル及びプロパルギル
単位が、単純で小さくしかも容易に合成できる。ビニル
及びアリル単位は、二つの非相互転換幾何異性体のどち
らも作ることができるという優位性を持つ。したがっ
て、これらはTS活性部位によるプロドラッグ調節のプロ
ーブとして使われる。他方、プロパルギル単位は、円柱
状に対称的であるという優位性を持つため、ビニル及び
アリル分子の場合と異なり、TSが触媒する結合鎖からの
毒素の放出は、dUMPにおけるウラシル環に対する配向に
影響されない。
【０１２０】この発明のヌクレオチドを基礎としたプロ
ドラッグの設計に、二つの異なるアプローチがとられて
きた。一つはBVDU一リン酸構造に基づいており、遊離基
/毒素をdUMPのC5に位置する（ポリ）ビニル置換基の末
端に直接結合する特徴を持つ。これがビニル結合鎖アプ
ローチである。これらの化合物は、「クラスI」化合物
として一部定義されている。もう一つ別のアプローチ
は、TFPe-dUMP構造に基づいており、第一の方法に類似
しているが、遊離基/毒素と不飽和単位を分けるメチレ
ン単位を有し、従って、アリルまたはプロパギル単位を
有する。これらは、以下に「クラスII」として記載され
ている。これがアリル結合鎖アプローチである。
【０１２１】それぞれの5'-ホスホルアミデート版の構
造を以下に示す：
【化３９】
【０１２２】アリル結合鎖アプローチのプロパギル版の
活性化メカニズムには、5-エチニル-2'-デオキシウリジ
ン5'-一リン酸（EdUMP）及び5-(3-ヒドロキシ-1-プロピ
ニル)-2'-デオキシウリジン5'-一リン酸（HOPdUMP）の
両者ともTSと相互作用するという先例がある（Barr et
al. 1981、 Barr及びRobins 1983）。EdUMPは強力なTS
阻害剤（Ki=0.1 μM）で、活性部位においておそらくア
レンを基礎とする分子種を形成する。HOPdUMP（Ki=3.0
μM）は異常な阻害キネティクスを示し、これは活性部
位においてクムレンを基礎とする分子種を形成するため
であるかもしれない。
【０１２３】ビニル及びアリル結合アプローチの両メカ
ニズムに共通する中間体の構造に類似した5-アルキリデ
ン化-5、6-ジヒドロウラシルが最近合成された（Anglad
a etal. 1996）。これらは高度に求電子性であることが
示された。それらがエタノールと容易に反応して5-(エ
トキシメチル)ウラシルを生成することは、図８に示す
メカニズムにおいて触媒作用を十分に持つTSを再生する
水付加の先例である。さらにごく最近になって、長い間
見出されなかったTSによって作られるC5メチレン中間体
の存在が、捕獲研究によって証明された（Barret et a
l. (1998)）。
【０１２４】C5プロパギル及びアリルアルコールを持つ
2'-デオキシウリジンの合成は簡単である。これら及び
これらの密接な誘導体の多くは文献に報告されており、
それらの幾つかはTSと関連して研究されている。例え
ば、5-(3-メトキシ-1-プロピニル)-dUMP及び5-(3-ヒド
ロキシ-1-プロピニル)-dUMPを含む5-アルキニル-dUMP類
はTS阻害剤として調べられており（Barr et al. (198
1)）、これらの幾つかはTS欠損癌細胞のDNAに組み込ま
れることが証明された（Balzarini et al. (1985)）。
【０１２５】5-水銀-ウリジン（Ruth et al. (1978)）
及び5-ヨードウリジン（Robins et al. (1981)）はどち
らも、パラジウム触媒の存在下で容易にアルケン及びア
ルキンと縮合し、C5結合鎖を有するウリジンを生じる。
後者の経路がより多く用いられる（Robins et al. (198
2)、 Asakura及びRobins (1988)及び(1990)）。保護さ
れた5-ヨード-2'-デオキシウリジンとt-ブチルジメチル
シリル・プロパギルエーテル（Graham et al. (1998) D
e Clercq et al. (1983)、メチルプロパギルエーテル
（Tolstikov et al. (1997)）及びプロパギルアルコー
ル自身（Chaudhuriet al. (1995)、 Goodwin et al. (1
993)）の縮合による高い収率が実現されている。後者の
反応によって導入される3-ヒドロキシ-1-プロピニル置
換基も、それ自体はBVDU合成に用いられるのと同じヘッ
ク反応から生じるが、メタクリレート基のDIBAL-H還元
（Cho et al. (1994)）によって接近させることができ
る。これらの触媒反応は極めて用途が広いため、長くて
精巧な機能を持つプロパギルを基礎とする結合鎖を5-ヨ
ード-2'-デオキシウリジンと縮合するために用いること
ができる（Livak et al. (1992), Hobbs (1989)）。(Z)
-アリルを基礎とする結合鎖は、Undiar触媒(RobinsとBa
rr(1983))上でプロパギル前駆体の部分的水素添加によ
り生じるが、(E)-アリルを基礎とする結合鎖は、(E)-ト
リブチルスタンニル化エチレンのヘック共役反応による
調製が最もよい（Crisp (1989)）。
【０１２６】文献の方法に忠実に従って、t-ブチルジメ
チルシリルプロパギルエーテルを有する3'、5'-ジ-O-保
護-2'-デオキシウリジン（Graham et al. (1998)、 De
Clercq et al. (1983)）を調製し、対応する(Z)-アリル
エーテル（Robins及びBarr (1983)）に変換されたその
一部を還元する。TBAFが介在するTBDMS基の除去は、そ
の場で機能を発揮する酸素陰イオンを発生するため、こ
れらのTBDMS保護プロパギル-及び(Z)-アリル-結合鎖を
有するヌクレオシドは、トキソホアを持つ標的の便利な
前駆体として役に立つ。(E)-アリルアルコールを持つヌ
クレオシドを調製するためには、文献にある(E)-トリブ
チルスタンニル化エチレンのヘック共役反応（Crisp (1
989)）により、既知のO-テトラヒドロピラニルエーテル
誘導体を調製する。
【化４０】
【０１２７】文献の２段階プロトコール（Phelps et a
l. (1980), Hsiao及びBardos (1981)）を用いて、プロ
パギル並びに(E)及び(Z)アリルアルコールを対応するビ
ス-アジリジニルホスホルアミデートまたはチオホスホ
ルアミデートに変換し、5'-一リン酸ヌクレオチドバー
ジョンのTSプロセシングにより細胞静止薬TEPAまたはチ
オTEPAそれぞれの活性代謝産物が放出される（Dirven e
t al. (1995)）。
【化４１】
【０１２８】プロパギルまたはアリルアルコールから誘
導されるエステルの潜在的な加水分解的不安定性を避け
るために、3-ニトロプロピオン酸のようなトキソホアの
カルボン酸の部分を、α、α-ジフルオロエーテルのよ
うに、アルコールに結合させて「マスク」する。これを
行うために、正常なエステルをラベッソン試薬（Cava及
びLevinson (1985)）で処理することによりプロパギル
またはアリルチオエステル結合鎖が最初に調製され、次
にテトラブチルアンモニウムジハイドローゲントリフル
オライドを用いる確立した方法（Kuroboshi及びHiyama
(1991)及び(1994)）でチオエステルをα、α-ジフルオ
ロエーテルに変換する。α、α-ジフルオロエーテルに
基づく結合鎖は、通常どおり、保護された5-ヨード-2'-
デオキシウリジンと縮合させる。α、α-ジフルオロエ
ーテルのように、マスクされたトキソホアはTSがそれを
隠れた反応性アシルフルオライドとして放出するまでは
安定である。続いて起こる迅速な加水分解はカルボン酸
を基礎とするトキソホアをその場で生じるさせる。
【化４２】
【０１２９】CSプロパギル並びに(E)及び(Z)アリルアル
コールを持つ2'-デオキシウリジンのp-ニトロフェニル
エーテル誘導体は、in vitro TS酵素検定方法のよい試
薬である。なぜならば、p-ニトロフェノール放出の分光
測光法的、動力学的測定な放出速度を測定することによ
って、結合鎖の末端から容易に脱離基が放出されるよう
な様式でTSに結合する、結合鎖のついたdUMP骨格を同定
できるからである。必要なp-ニトロフェニルエーテルは
塩基触媒による4-フルオロニトロベンゼンとの縮合によ
ってアルコールから直接、または適切なp-ニトロフェニ
ルプロパギルまたはアリルエーテルのヘック共役反応に
よる新規合成のいずれかから得られる。TS検定方法に必
要な5'-一リン酸は、十分に確立された部位特異的な5'-
一リン酸化プロトコール（Imai et al. (1969)）に従
い、酵素的または化学的にヌクレオシドから生成する。
【化４３】
【０１３０】多くの5位置換2'-デオキシウリジンはヒト
TKの基質ではないが、興味深いことに、5-(4-ヒドロキ
シ-1-ブチニル)-2'-デオキシウリジンは例外であること
が発見された（Bar et al. (1981)）。従って、トキソ
ホアを持つヌクレオシドの幾つかも都合のよいTK基質活
性を有すると期待され、従って、癌細胞の増殖を抑制す
る活性について調べられるであろう。なお、5'-ホスホ
ルアミデートは、この新しく開発された部位特異的手法
により簡単に調製できるため、前プロドラッグが作られ
試験もなされている。
【０１３１】（組み合わせ合成）リード化合物を作る迅
速な方法は、組み合わせの化学方法論を用いることであ
る。チミジル酸シンターゼの作用メカニズムはよく知ら
れているので、次の事項：プロドラッグの細胞内移行、
チミジンキナーゼによるプロドラッグのリン酸化及びチ
ミジル酸シンターゼによるプロドラッグ（ウリジン誘導
体）から活性薬剤への変換が予想される。細胞内への移
行に関して、リン酸化ヌクレオチドの修飾が行われる
（例えば、米国特許番号5,233,031及び5,627,165）。さ
らに、大部分の腫瘍細胞においては癌抑制遺伝子が欠損
している結果、チミジンキナーゼが過剰発現しているた
め、腫瘍細胞において優先的なプロドラッグのリン酸化
が促進される（Hengstschlager et al. (1996)）。同様
に、癌抑制遺伝子の欠損（Li, W.et al. (1995)）及び
化学療法（Peters, G.J. et al. (1995)）に伴いチミジ
ル酸シンターゼが過剰発現しているため、腫瘍細胞にお
いてリン酸化プロドラッグ及びホスホルアミデート誘導
体の優先的活性化が起こる。ウリジン環の5-位（そこか
ら細胞毒素が生じる）、またはペントースの5'-位（チ
ミジル酸シンターゼへの結合を促進する）を標的とする
組み合わせの化学が、ペントースの5'-位でリン酸化を
受ける基の最適化、および、ウリジン環からの脱離基
（細胞毒素）の構造の最適化により、リード化合物の発
見を急速に早めることになる。図３、４、及び５に示す
スクリーニングのために、単一部位（図４）または同時
に分子の二つの部位（図５）を狙った化学によって試験
化学物質が作られる。図３に示すスクリーニングととも
に、チミジル酸シンターゼを標的とするプロドラッグを
発見するための強力な試験系が開発された。ここで使用
する組み合わせ化学による方法は、Lam, K.S. (1997)の
方法に類似している。一つの実施態様では、毒性を有す
る脱離基を供給するプロドラッグは図６に示したもので
ある。図６に示すウリジン基質は、ホスホルアミダーゼ
（全ての細胞に存在する）及び腫瘍細胞において活性が
亢進しているチミジル酸シンターゼ（TS）を利用する。
当業者には当然だが、この合理的なドラッグデザイン
は、ここで定義する他のプロドラッグの合成に広く適用
できる。
【０１３２】図３に示すスクリーニングは抗生物質の発
見に広く適用できることは当業者には当然のことであ
る。例えば、酵母からのチミジル酸シンターゼは、図４
において大腸菌のそれと置き換ることができる。これに
より、酵母を標的とする特殊な抗菌類抗生物質の発見が
可能になる。さらに、この方法は他の酵素にも応用でき
る。例えば、ニューモシスチス カルニ(Pneumocystis c
arnii)のような感染性生物のジヒドロ葉酸還元酵素を特
異的に標的とするプロドラッグを選択できる。これらの
物質は標的酵素の特異性で選択され、図３に示すスクリ
ーニング試験で用いる自然の宿主が持つ酵素は活性化し
ないことを示すことができる。正常なヒトの酵素だけが
存在する場合には毒性がないこと示すために、対照細胞
は正常なヒトの該当酵素を持っているであろう。
【０１３３】本発明やここで述べた薬剤または物質は、
様々な化学的修飾の方法により、例えば細胞膜または血
液−脳関門を通過し易くすることができる。それらには
リン酸部分に膜通過性を改善する様々な官能基を結合す
る方法が含まれる。そのような官能基には、米国特許番
号5,233,031及び5,627,165; Fries, K.M., et al. (199
5)及びMcGuigan, C., et al. (1984)に記載されている
ものがあるが、これらに限定はされない。ジデオキシウ
リジン（ddU）のある種のホスホルアミデート誘導体がH
IVに活性を示し、幸運にもチミジンキナーゼをバイパス
する。McGuigan, C., et al. (1984). そのような化学
的修飾は置換されたピリミジン一リン酸誘導体を細胞内
及び細胞外ホスファターゼから保護するためにも役立ち
得る。水銀またはハロゲン誘導体が効果的かもしれない
が、アルキル化剤または代謝拮抗剤を放出する修飾の方
が好ましいと考えられる。図６に好ましい実施態様を示
す。
【０１３４】（クラスI及びII化合物の誘導体）ここに
示した前記化合物の塩、エステル及びエーテルも、この
発明の範囲内にある。本発明のプロドラッグの塩は、無
機または有機の酸及び塩基から誘導されるであろう。酸
の例には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、
フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、
サリチル酸、琥珀酸、トルエン-p-スルフォン酸、酒石
酸、酢酸、クエン酸、メタンスルフォン酸、エタンスル
フォン酸、蟻酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン-2-
スルフォン酸及びベンゼンスルフォン酸がある。シュウ
酸などのような他の酸は、それ自体では製薬に許容され
ないが、本発明の化合物を得る中間体として役に立つ塩
及び製薬的に許容される酸付加塩の調製に用いることが
できる。塩基の例には、アルカリ金属（例えばナトリウ
ム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えばマグネシウ
ム）水酸化物、アンモニア及び式NW4 +（式中、WはC1-4
アルキルを示す）の化合物がある。
【０１３５】塩の例には、酢酸塩、アジピン酸塩、アル
ギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンス
ルフォン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸
塩、樟脳硫酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグ
ルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルフォン酸塩、
フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、
ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭
化水素酸塩、ヨウ素酸塩、2-ヒドロキシエタン硫酸塩、
乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタ
レンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、蓚酸塩、パルミチン
酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸
塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、琥珀
酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩及びウン
デカン酸塩がある。他の塩の例に、Na+、 NH4+及びNW4 +
（WはC1-4アルキル基）のような適切な陽イオンと結合
する本発明の化合物の陰イオンを含む塩がある。治療へ
の利用には、本発明の化合物の塩が製薬的に許容し得る
であろう。しかし、製薬的に許容できない酸及び塩基の
塩であっても、例えば製薬的に許容できる化合物を調製
または精製して利用の仕方を見出せる可能性がある。
【０１３６】この発明の方法により同定されるプロドラ
ッグまたは化合物のエステルには、2'-、 3'-及び/また
は5'-ヒドロキシ基をエステル化して得られるカルボン
酸エステル（すなわち-O-C(=O)R）があり、Rは(1)直鎖
または分枝鎖アルキル基（例えばn-プロピル基、t-ブチ
ル基、またはn-ブチル基）、アルコキシアルキル基（例
えばメトキシメチル基）、アラルキル基（例えばベンジ
ル基）、アリールオキシアルキル基（例えばフェノキシ
メチル基）、アリール基（例えばハロゲン基、C1-4アル
キル基、またはC1-4アルコキシ基またはアミノ基などに
よって置換されていてもよいフェニル基）；(2)アルキ
ルスルフォニル基（例えばメタンスルフォニル基）また
はアラルキルスルフォニル基のようなスルホン酸エステ
ル；(3)アミノ酸エステル（例えばL-バリルまたはL-イ
ソロイシン）；(4)ホスホネートエステル及び(5)一、
二、三リン酸エステルの中から選択される。リン酸エス
テルは、C1-20アルコールまたはそれらの反応性誘導
体、または2、3-ジ-(C6-24)アシルグリセロールなどに
よってさらにエステル化される。そのようなエステルで
は、特定しない限り、アルキル部分はすべて、1から18
の炭素原子、特に1から6の炭素原子、より具体的には1
から4の炭素原子を有するのが好ましい。そのようなエ
ステルのシクロアルキル部分はすべて3から6の炭素原子
を有するのが好ましい。そのようなエステルのアリール
部分はすべてフェニル基を含むのが好ましい。本発明の
リキソフラノシルプロドラッグ誘導体には、例えば2'-O
-アセチル-リキソ-フラノシル；3'- O -アセチル-リキ
ソ-フラノシル；5'- O -アセチル-リキソ-フラノシル；
2'、3'-ジ-O -アセチル-リキソ-フラノシル及び2'、
3'、5'-トリ-O -アセチル-リキソ-フラノシルなどの化
学的に保護されたヒドロキシル基（例えばO-アセチル
基）を有する誘導体が含まれる。
【０１３７】本発明のエーテル化合物には、メチル、エ
チル、プロピル、ブチル、イソブチル及びイソブチルエ
ーテルがある。更なる実施態様においては、基質がピリ
ミジンまたは葉酸と化学的関連性を持たないことがあ
り、むしろ合理的なドラッグデザインにおける既知のパ
ラメーターに基づいて基質が合成される場合もある。Du
nn, W.J. et al. (1996).反応生成物がdUMPのブロモビ
ニル誘導体であるプロドラッグの化学的検定法は以下の
実施例またはBarr, J. et al. (1983)に示されている。
【０１３８】（診断への適用）本発明の別の態様とし
て、標的細胞を本発明のプロドラッグと接触させること
を含む、治療薬をスクリーニングする方法がある。その
実施態様において、プロドラッグはチミジン酸合成酵素
の細胞内レベルを検出するという診断目的の、以下に示
すクラスIIの部類に属す化合物で、R4は、
【化４４】 であり、標的細胞はこの化合物を細胞内に好んで取り込
む。
【０１３９】
【実施例】以下の実施例は、標的酵素TSを特に取上げて
いる。以下の方法は、ここで定義する標的酵素に対する
他のプロドラッグを発見するために変更することができ
るし、あるいはTSおよび別の細胞内酵素に対する他のプ
ロドラッグを発見する対照として用いることができるこ
とは当業者には明らかである。
【０１４０】（プロドラッグの合成）5-フルオロ-2'-デ
オキシウリジン（5-FUdR）のホスホルアミデート誘導
体、(E)-5-(2-ブロモビニル)-2'-デオキシウリジン（BV
DU）及びBVDUのホスホルアミデート誘導体を合成した。
BVDUは文献の方法（Dyer, et al. (1991)）に従って2'-
デオキシウリジンから調製した。標準的な方法に従っ
て、最初にO5'位をジメトキシトリチル（DMTr）基で保
護し、次にO3'位を第３ブチルジメチルシリル（TBDMS）
基で保護した後、5'-O- DMTrを酸で処理して除いた（以
下参照）。
【化４５】
【０１４１】得られた3'-O- TBDMS保護ヌクレオシドを
フェニルL-メトキシアラニニルホスホロクロリデート
（PMPC）（McGuigan, et al. (1992)）と反応させて3'-
O-TBDMS保護BVDU-PAを得た。しかし、予期しえなかった
が、ホスホルアミデートの官能性はシリカゲル上のテト
ラブチルアンモニウムフルオリド（TBAF）による極めて
穏やかな脱シリル反応に不安定であることが、1H核磁気
共鳴（NMR）分光測定によって明らかになった。穏やか
な塩基条件に感受性を持つというこの観察により、アラ
ビノヌクレオシドを除いて（McGuigan, et al. (199
8)）、なぜ今日までに報告されているすべてのヌクレオ
シド5'-ホスホルアミデート誘導体が3'-ヒドロキシ基の
官能性を欠いているか（McGuigan, et al. (1996); McG
uigan, et al. (1993); McGuigan, et al. (1994), Bal
zarini, et al. (1997), Balzarini,et al. (1996)）、
に一つの説明が可能である。この問題を解決するため
に、新しい合成方法が開発された。
【０１４２】(E)-5-(ブロモビニル)-2'-デオキシ-5'-ウ
リジルフェニルL-アラニニルホスホルアミデート（BVDU
-PA）を合成するために、アルゴン存在下で無水DMF2 mL
に溶解したBVDU（420 mg, 1.26 mmol）溶液をイミダゾ
ール（103 mg, 1.51 mmol）で処理し、次にフェニルL-
メトキシアラニニルホスホロクロリデート（350 mg, 1.
26 mmol）（McGuigan, et al. (1992)）を滴下して処理
した。この反応混合液をアルゴン存在下で23℃、24時間
攪拌した。ジクロロメタン中の10%メタノールを溶離液
として用いたシリカゲル上の薄層クロマトグラフィーに
よれば、BVDU（Rf0.53）からBVDU-PA（Rf 0.70）が生成
したが、わずか（ca.15%）であったため、イミダゾール
（52 mg, 0.75 mmol）及びPMPC試薬（175 mg, 0.63 mmo
l）を追加して添加し、この反応液をアルゴン存在下で2
3℃、12時間攪拌した。薄層クロマトグラフィーによれ
ば、反応の進行が幾らか増加（ca.30% 完結）してい
た。この溶液を回転エバポレーターで0.75 mLに濃縮
し、次に等量のジクロロメタンで希釈して4mmの乾燥シ
リカゲル・クロマトトロンのプレートに直接充填した。
250 mLのジクロロメタンを用いて円形クロマトグラフィ
ー(radial chromatography)によって残存するDMFを溶出
した後、10%メタノール含有ジクロロメタンで反応産物
及び出発物質を溶出し、144 mg（20%）のBVDU-PA及び29
4 mgの未反応BVDUを得た。未回収の出発物質からBVDU-P
Aの生成率は67%であった。反応生成物の1H NMRスペクト
ルでイミダゾール（δ7.65及び7.01）またはDMF（δ7.9
5, 2.89及び2.73）の存在が明らかになった場合は、放
射状クロマトグラフィーによる精製を追加した。このよ
うにして、薄層クロマトグラフィー及び1H NMRにより少
なくとも98%の純度のBVDU-PAがオイルまたは泡状粉末と
して得られた。1H NMR ((CD3)2SO) δ11.4 (bs、 D2O交
換, 1,3'OH), 8.28 (t, 1, H6), 7.35 (m, 2, Ph), 7.3
1 (d, 1, ビニル1H), 7.20 (m、 3、 Ph), 6.89 (d, 1,
ビニル2H), 6.19 (プソイド-t, 1, H1'), 6.08 (t, D2
O交換, アラニニル NH), 5.45 (bs, D2O交換, 1,3'OH),
4.32 (m, 1, H4'), 4.22 (m, 2, 5'CH2), 3.97 (m, 1,
H3'), 3.86 (t,1, アラニニルCH), 3.58 (s, 3, CO2M
e), 2.15 (m, 2, 2'CH2), 1.23 (t, 3, アラニニルC
H3). Jvinyl CH-vinylCH=13.5, JH1 ' -H2 '〜６．８、 J
H3 ' -H4 '〜０、 alaCH-Ala-NH3ＮＨ〜６ Ｈｚ。 1H/1H
COSY 2D NMR分光学によってスペクトルの帰属が確認さ
れた。
【０１４３】同様にして、薄層クロマトグラフィー及び
1H NMRによれば、少なくとも98%の純度の5-フルオロ-2'
-デオキシ-5'-ウリジルフェニルL-アラニニルホスホル
アミデート（5FUdR-PA）が得られた。1H NMR ((CD3)2S
O)δ11.9 (bs, D2O交換, N3H), 7.88 (t, 1, H6), 7.36
(m, 2, Ph), 7.19 (m, 3, Ph), 6.15 (プソイド-t, 1,
H1'), 6.07 (t, D2O交換, 1, アラニニル NH), 5.42
(bs, D2O交換, 1,3'OH),4.21 (m, 3, H4'及び5'CH2),
3.98 (m, 1, H3'), 3.84 (t, 1, アラニニルCH),3.58
(s, 3, CO2Me), 2.08 (m, 2, 2'CH2), 1.22 (t, 3, ア
ラニニルCH3). JH6 -5F=7.1、 JH1 ' -H2 '〜５．２、 JH3 '
-H4 '〜０、 Jalaninyl CHalaninylNH〜６ Ｈｚ。 1H/1
H COSY 2D NMR分光学がによってスペクトルの帰属が確
認された。低−解像能マススペクトル(DC-NH3), m/z 50
5 (MNH4+), 488 (MH+).
【０１４４】保護されてない2'-デオキシリボヌクレオ
シドとPMPCとの直接的な縮合反応は非常に速やかに進
み、望みのホスホルアミデートが得られると考えられ、
塩基ではなくHClのスカベンジャー存在下で反応を行っ
た場合には、5'-O-位置選択的に望みのホスホルアミデ
ートが得られると考えられた。無水DMF溶液中でイミダ
ゾール存在下でBVDU及び5FUdRの両者をMcGuigan試薬と
縮合させ、それぞれBVDU-PA及び5FUdR-PAが得られた
（以下参照）。反応条件は最適化されていないし、反応
は最後まで進行しないが、いずれの場合にも薄層クロマ
トグラフィーにより容易に分離する生成混合物は、大部
分が望みの産物及び出発物質だけから成る。合成の概略
を以下にまとめる。
【化４６】
【０１４５】（(E)-5-(ブロモビニル)-2'-デオキシ-5'-
ウリジルフェニルL-アラニニルホスホルアミデート (BV
DU-PA)）TLCモニタリング（溶離液として10%メタノール
含有ジクロロメタン）により、BVDU (Rf 0.53)からBVDU
-PA (Rf 0.70)の生成が明らかになった。このようにし
て、薄層クロマトグラフィー及び1H NMRによれば、少な
くとも98%の純度のBVDU-PAが得られた。1H NMR ((CD3)2
SO). 1H/1H COSY 2D NMRスペクトルによってスペクトル
の帰属が確認された。NH3、m/z 593/591 (M・NH4+)、57
6/574 (M・H+)を用いて化学的イオン化（DCI）による低
−解像能マススペクトル。
【０１４６】（5-フルオロ-2'-デオキシ-5'-ウリジルフ
ェニルL-アラニニルホスホルアミデート（5FUdR-PA））
同様にして、薄層クロマトグラフィー及び1H NMRによ
り、少なくとも98%の純度の5FUdR-PAが得られた。1H NM
R ((CD3)2SO). 1H/1H COSY 2D NMRスペクトルが指示ス
ペクトルを確認した。低−解像能マススペクトル(DCI-N
H3)、m/z 505 (M・NH4+)、488 (M・H+)。
【０１４７】そこで、本発明の態様は、フラノシルヌク
レオシドの2'-デオキシ、3'-ヒドロキシ、5'-ホスホル
アミデートを調製する方法に適しており、その方法はHC
lスカベンジャー存在下において保護されていない2'-デ
オキシ、3'-ヒドロキシ、5'-ヒドロキシフラノシルヌク
レオシドとホスホクロリデートの反応を含む。一つの実
施態様において、ホスホクロリデートは、アラニンのよ
うなアミノ酸に由来するリン置換基から成る。一つの実
施態様では、ホスホクロリデートはフェニルL-メトキシ
アラニンホスホクロリデートを含む。さらなる実施態様
として、本発明は、式：
【化４７】 の化合物を作る方法に適しており、式中、「塩基」は核
酸塩基（例えばウラシル、チミン、シトシン、アデニン
またはグアニン、好ましくはウラシル、またはそれらの
誘導体）を指し；この方法はHClの存在下で式：
【化４８】 の化合物と、式：
【化４９】 の化合物との反応のステップを含む。
【０１４８】一実施態様においては、フラノシルヌクレ
オシドはウリジンヌクレオシドである。別の態様におい
ては、フラノシルヌクレオシドはウリジンリボフラノシ
ルヌクレオシドである。別の例として、フラノシルヌク
レオシドはウリジンβ-D-リボフラノシルヌクレオシド
である。そこで、一実施態様として、本発明は式：
【化５０】 の化合物を作る方法に適しており、式中R1は置換基（例
えば前記のR1について記載した基を含む）で；この方法
はHClの存在下で式：
【化５１】 の化合物と、式：
【化５２】 の化合物との反応のステップから成る。
【０１４９】一実施態様において、この反応は塩基の非
存在下で行なわれるが、イミダゾールのようなHClスカ
ベンジャーの存在下で行われる。別の実施態様として、
この反応は非水系媒質中で起こる。別の実施態様とし
て、この反応は無水ジメチルホルムアミド（DMF）を含
む非水系の媒質中で起こる。
【０１５０】（化学的及び細胞を基礎にする検定方法） H630R10 (Copur, et al. (1995))及び正常な結腸上皮細
胞であるCCD18co（ATCC）の二つの細胞株がこれらの検
定方法に用いられた。10 μMの5-FU耐性のH630P(Copur,
et al. (1995))の細胞株を選択してH630R10が得られ
た。これらの細胞株は、TS酵素の発現レベルが亢進して
いる特徴を持つ。試験物質に対する感受性をH630R10と
比較するために、正常な結腸上皮細胞であるCCD18co（A
TCC）が用いられた。Pegram et al. (1997)に従って作
られたp185-HER2またはネオマイシンマーカーだけを発
現している細胞株は、ウエスタンブロット解析によりH6
30R及びH630R10がCCD18coに比べて10倍増加したチミジ
ル酸シンターゼを発現していることを示している。試験
物質の細胞増殖阻害能はクリスタルバイオレット法（Su
garman et al. (1985)及びAntelman et al. (1995)）に
よって決定した。
【０１５１】化合物はジメチルスルホキシドに1 M濃度
に溶解させた。それらは、必要があれば、細胞培養液DM
EMでさらに希釈し、続けて96ウエルのマイクロタイター
プレートの第1のウエルに添加した。各濃度は標的細胞
株ごとに3連で試験した。1 μMから3000 μMの濃度を試
験した。細胞を化合物共在下で72時間培養した後、プレ
ートを洗浄し、細胞をメタノール固定してSugarman et
al. (1985) 及びAntelman et al. (1995)に従いクリス
タルバイオレットで染色した。
【０１５２】（細胞株におけるTSレベルのウエスタンブ
ロット解析） ウエスタンブロットの実験は、ヒト正常結腸上皮細胞CC
D18co（ATCC, Manassas, VA）、結腸腺癌細胞株H630R10
(エール大学S. Copur博士から供与)及びHER2トランス
フェクト肺癌細胞株（Pegram et al. (1997)）で実施し
た。RIPA緩衝液（50 Mmトリス塩酸、pH 7.5、150 mM塩
化ナトリウム、0.5% Triton-X、0.1% SDS及び0.5%デオ
キシコール酸、ナトリウム塩及びプロテアーゼ阻害剤）
で細胞を溶解した。BCA-200タンパク質検定方法キット
（Piece, Rockford, IL）を用いてタンパク質濃度を決
定した。各細胞株から10 μgのタンパク質を12% SDS-PA
GEで分離した。分離したタンパク質をPVDF膜（Amersha
m, England）に転写した後、ヒトチミジル酸シンターゼ
モノクローナル一次抗体及び抗チューブリンモノクロー
ナル抗体（NeoMarkers, Fremont, CA）でイムノブロッ
トを行った。羊抗マウスIgを結合したセイヨウワサビペ
ルオキシダーゼを二次抗体（Amersham）として用いた。
ECLプラスキット（Amersham）を用いて免疫活性を検出
した。イメージ解析（Molecular Dynamics Stoem）によ
り、チューブリンのバンドを基準にチミジル酸シンター
ゼに対応するバンドを定量した。
【０１５３】（細胞株におけるTS mRNAのRT-PCR解析）
異なる細胞株におけるヒトチミジル酸シンターゼ転写物
の発現レベルをRT-PCRを用いて定量化した。ヒトチミジ
ル酸シンターゼ及びβ-アクチンを増幅するためのオリ
ゴヌクレオチドプライマーを次のように設計した：チミ
ジル酸シンターゼのセンスプライマー5'-GGGCAGATCCAAC
ACATCC-3'（チミジル酸シンターゼcDNA配列の208番目か
ら226番目までの塩基に対応、Genbank Accession No. X
02308）、アンチセンスプライマー5'-GGTCAACTCCCTGTCC
TGAA-3'（564番目から583番目までの塩基に対応）、β-
アクチンのセンスプライマー5'-GCCAACACAGTGCTGTCTG-
3'（β-アクチン遺伝子配列の2643番目から2661番目ま
での塩基に対応、Genbank Accession No. M10277）及び
アンチセンスプライマー5'-CTCCTGCTTGCTGATCCAC-3'（2
937番目から2955番目までの塩基に対応）。Rneasyミニ
キット（Qiage, Valencia, CA）を用いてCCD18co及びH6
30R10細胞から総RNAを抽出した。DNA混入の可能性をモ
ニターするために、β-アクチン増幅用プライマーは、
エクソン4/イントロン5/エクソン5が連結するように設
計した。ゲノムDNAの鋳型はβ-アクチン断片の313bpに
なり、cDNAの鋳型は210bpの産物を生ずる。
【０１５４】SuperScript前増幅システム（Gibco/BRL,
Gaithersburg, MD）を用いて逆転写反応を行った。製造
メーカーのプロトコールに従って、3 μgの総RNAを20
μlの緩衝液に添加して逆転写反応を行った。PCR反応
は、逆転写反応から得た3 μlのcDNA混合液、3 mMのMgC
l2、50 mMのKCl、20 mMのトリス塩酸、 pH 8.4、0.2 mM
の各dNTP、0.4 μMのチミジル酸シンターゼのセンス及
びアンチセンスプライマー、及び3ユニットのTag DNAポ
リメラーゼ（Promega, Madison, WI）を含む48μlの容
量で実施した。反応混合液を94℃で3分間インキュベー
トした後、94℃で1分間のインキュベーションを10サイ
クル行い、58℃で1分間のインキュベーション次に72℃
で1分間のインキュベーションを行った。10サイクルの
後、ヒトβ-アクチンプライマーを最終濃度が0.2 μMに
なるように2 μl添加して最終反応量を50 μlにした。
合計28サイクルまでPCR反応を続けた後、72℃で7分間の
インキュベーションを行った。5 μlのPCR産物を2%アガ
ロースゲル電気泳動にかけた後、SYBR Gold核酸ゲル染
色（Molecular Probes, Eugene, OR）で染色した。Mole
cular Dynamics Stomを用いて、β-アクチンのバンドを
基準にしてチミジル酸シンターゼに対応するDNAバンド
を定量した。
【０１５５】（ノーザンブロット解析）ノーザンブロッ
トはInvitrogen（Carlsbad, CA）から入手してクローン
化されたTS cDNAプローブとハイブリダイズした。ハイ
ブリダイゼーションのシグナルは、ハウスキーピング転
写物であるリボソーマルタンパク質S9に対して正規化し
た。正規化されたシグナルが正常組織のコントロールに
対して少なくとも2倍増加している場合には、腫瘍細胞
がTS mRNAを過剰に発現していると考えられた。
【０１５６】（ヒトチミジル酸シンターゼのクローニン
グ、発現及び精製）pGCHTS中の修飾されたヒトTS cDNA
を用いてヒトチミジル酸シンターゼ（TS）の大腸菌プラ
スミド発現ベクターを構築した。Dan Santi博士から供
与されたこのクローンはヒトTSの完全なオープンリーデ
ィングフレームを持つ。
【０１５７】大腸菌で発現させるために、この完全なヒ
トTS ORFをT7プロモーター発現ベクターpET28a（Novage
n Inc.）にサブクローニングした。得られたプラスミド
ベクターは、6個のヒスチジン配列の後にトロンビン切
断部位を持つ組み換え融合タンパク質としてヒトTSの合
成をコードしている。この融合タンパク質は、ヒトTSの
アミノ末端に合計20個の余分なアミノ酸を付加してい
る。組み換えタンパク質を生産するために、ラクトース
オペレーターの制御下に染色体に挿入されたT7ポリメラ
ーゼ遺伝子を持つ大腸菌BL21 (DE3)株にヒトTS発現ベク
ターを導入した。
【０１５８】金属キレートアフィニティーレジン（Nova
gen Inc.）を用いて、ヒトTS-ポリ-ヒスチジン融合タン
パク質を精製した。タンパク質を精製した後、10% SDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。Pierce BCA
タンパク質検定方法を用いてタンパク質濃度を決定し
た。500 mlの大腸菌倍溶液から約10 mgのヒト融合タン
パク質を回収した。銀染色して視覚化したところ、ヒト
TSに対応するバンドのみが現われた。ヒトTSバンドの同
定は、抗TSモノクローナル抗体TS106（NeoMarkers）を
用いるウエスタンブロットを実施して確認した。
【０１５９】（チミジル酸シンターゼ酵素活性検定方
法） Wahba及びFriedkin (1961)従い、分光光学的方法を用い
てTS活性を測定した。この検定方法では、dUTPがdTTPに
変換される際に、補酵素5、10-メチレンテトラヒドロフ
ォレートがジヒドロフォレートに酸化されるときに起き
る340 nmにおける吸光度の増加を測定してTS活性をモニ
ターする。この方法で調製される酵素は0.5 0.65単位/
mgタンパク質の特異的活性を持つ。１ユニットは、1分
間あたり1μmoleのdTNPを生産する単位として定義す
る。この値はPedersen-Lane et al.(1997)の報告とほぼ
同じである。
【０１６０】（実験結果）これらの結果は、チミジル酸
シンターゼを腫瘍細胞における細胞毒素生成体として利
用する可能性を確立した。この検定方法では、CCD18co
細胞（正常結腸上皮細胞）及びチミジル酸シンターゼを
数倍発現しているH630P（Copur et al. (1995)）の派生
株であるH630R 10を用いた。それぞれの細胞におけるTS
タンパク質レベルをウエスタンブロットで解析し、ヒト
チューブリンとの比較でサンプル間を正規化した（表
5）。H630R 10（13x）及びCCD18co（1x）の順番であっ
た。RT-PCRで決定した細胞株間のmRNAレベルの比較も行
った。表5参照。ウエスタンブロット解析と同様、β-ア
クチンRT-PCRを標準とした時、H630R 10（24x）及びCCD
18co（1x）の順番であった。
【表５】
【０１６１】（HER2プロトオンコジーンの発現は腫瘍細
胞におけるTSレベルを増加させる。）イムノブロッティ
ング技術を用いて、ネオマイシン及びHER2/neuトランス
フェクトヒト肺癌細胞におけるTS発現レベルを調べた。
結果（図７参照）は、ヒトHER2/neu cDNAのトランスフ
ェクション及び過剰発現に続きTS発現の増加が証明し
た。HER2/neuをトランスフェクトしたヒト卵巣癌細胞に
おいて同様な結果が得られた。これらの細胞タイプの中
でMCF7/HER2及びMCF7/neo細胞株はTSの誘発が最も強力
（約20倍）であるため、これらの細胞株が本発明の検定
方法の標的細胞である。フルオロピリミジン5-FUdRは5-
FUと同様なメカニズムで細胞増殖を阻害する。これは、
TS酵素活性を阻害するだけでなく、核酸に組み込まれる
結果起こる細胞毒性作用を含む（Goodman及びGilman (1
996)）したがって、TSを高発現している細胞は低い発現
量に細胞よりもより耐性（より高いIC50）を示すと考え
られる。表6（1行目）はこのことがまさに得られた結果
そのものであることを証明した。さらに初期の研究から
考えられたことであるが、BVDUはこの検定方法でほとん
ど活性を持たなかった（表6；2列目）。これはおそらく
チミジル酸シンターゼとの結合に必要なヒトチミジンキ
ナーゼによるBVDUの一リン酸化が行われないためである
と考えられる（Balzarini et al/ (1987)、 Balzarini
et al/ (1993), Carreras及びSanti (1995)）。BVDUに
対する二つの細胞株の感受性に有意な差はない。リボー
ス部分の5'-水酸基のホスホルアミデート化によりBVDU
の活性化が起こる。BVDA-PA（表６、第３行）は、高発
現H630R10細胞株でCCD18co細胞株の10倍高い活性を示
す。
【表６】 1標準誤差20%以下
【０１６２】次に、これら二つの細胞株の5-FUdR及びBV
DUのホスホルアミデート誘導体（BVDU-PA）に対する感
受性を比較した。5-FUdRは5-FUと同じメカニズムで細胞
増殖を阻害するので、CCD18coの方がより高いレベルの
チミジル酸シンターゼを発現している理由から、H630R1
0よりもより強い感受性を示す（より低いIC50を示す）
と考えられる。表7に示すデータは、このことがまさに
前述のクリスタルバイオレット法で得られた結果そのも
のであることを証明した。この結果はまた最近の癌化学
療法における重要な問題の一つ、例えばそれらがしばし
ば癌細胞よりも正常細胞により強い毒性を示すこと、も
示す。表７のデータは、正常な結腸上皮細胞（CCD18co;
IC-50=9.5μM）がH630-R10結腸腫瘍細胞（IC-50=169.
8）よりも5-FUdRに対して約18倍感受性であることを示
す。しかし、プロドラッグ基質であるBVDU-PAは、この
関係を逆転させる。BVDU-PAは、TSによって細胞毒性物
質に変換されるが、TS高発現H630-R10株（IC50=216.7）
で正常な結腸細胞株（IC50=2810.2）におけるよりも約1
3倍強力な活性を示す。 1. 数回の検定方法での代表的なデータ 2. 検定方法は各濃度ごとに3ウエルで実施した。標準誤
差は20%未満である。
【０１６３】アラマーブルー検定方法（ACCUMED Int.,
West Lake, OHより商業的に入手可能）を用いてこの結
果を確認した。以下の表8のデータは、5-FUでさえ正常
細胞及び癌細胞に毒性を示す非選択的な性質を持つこと
を示す。 X=0.57 μM X=4.10 μM
【０１６４】この発明の追加試験では、N5N10-メチレン
テトラヒドロ葉酸塩の存在下及び非存在下でのヒトチミ
ジル酸シンターゼ及び薬剤の候補物質を含む反応混合液
中で薬剤の候補物質をスクリーニングすることが必要で
ある。プロドラッグの候補物質の脱離基（例えばピリミ
ジン5-位）を、この技術分野でよく知られている方法
で、例えばトリチウムを用いて標識する。対照の基質は
同一の反応条件下で同様に標識した（例えば5-3H）dUMP
である。Carreras, C.W.及びSanti, D.V. (1995)並びに
それらに引用されている文献と同様にして検定方法を実
施する。ヒトチミジル酸シンターゼは発現したヒトチミ
ジル酸シンターゼを持つ大腸菌から精製することができ
る。Davisson, V.J. et al. (1989)及びDavisson, V.J.
et al. (1994)参照。この方法は多数の候補物質をスク
リーニングできる検定方法である。
【０１６５】（TSプロドラッグ代謝の細胞内プロドラッ
グの決定）提案されている活性化及び作用メカニズムを
立証し、治療候補物質を同定するために、TSプロドラッ
グ代謝の細胞内産物を決定することは重要である。アリ
ールホスホジエステルアミデートの細胞内代謝の受け入
れ可能な考えは、カルボン酸への酵素的変換及びリン酸
モノエステルアミデートの5'-一リン酸ヌクレオシドへ
の分子内再配列（Valette et al. (1996)）を含むもの
である。しかし、このメカニズムではホスホルアミデー
トを基礎とするプロヌクレオシドすべての細胞内プロセ
シングを説明できない。例えば、アリールホスホモノエ
ステルアミデートのプロセシングに関しては異なるメカ
ニズムが提案されており、その１つはホスホルアミデー
ト水解酵素によるホスホルアミデートの一リン酸分子種
への単純な直接変換を含むものである（McIntee et al.
(1997)及びFries et al. (1995)）。ヌクレオシド一リ
ン酸をアンマスクするメカニズムにかかわらず、この検
定方法は細胞内一リン酸の細胞毒性物質への細胞内TS変
換生成物を検出するであろう。
【０１６６】プロドラッグ化合物のTSによる反応産物を
図8に示す。この仕事を成し遂げるために、細胞を高TS
発現細胞株の増殖を50%阻害する量（事前に実施した72
時間培養の試験で算出）のプロドラッグ化合物とインキ
ュベートする。低及び高TS発現細胞（例えばCCD18co 対
H630R10）を用いる。McIntee et al. (1997)の方法にし
たがって経時的変化を調べる。細胞を-20℃で60%メタノ
ールにより融解させ、遠心により粒子状の残査を取り除
く。上清を乾燥させ、-20℃で保存する。最初にRP-HPLC
で次にLC-MSで上清の一部を評価し、ホスホルアミデー
トの一リン酸への細胞内変換及びチミジル酸シンターゼ
による一リン酸の確実なトランスフォーメーションも証
明する。
【０１６７】（精製チミジル酸シンターゼを用いる基質
活性の記載）TS酵素調製物の長期にわたる活性を保証
し、適切な活性についてスクリーニングされた化合物が
in vitroの反応条件下でTS酵素を不活化するかを決定す
るために、この検定方法は将来のTS酵素調製物の比活性
を決定する。プロドラッグ化合物が精製された組換え体
TS酵素と一緒にインキュベートされると、どのような反
応産物が生成するかを決定するために、TS活性試験の場
合と同様の反応条件を適用して、in vitroで反応産物を
生成させる。次に、これらの反応産物をGCマススペクト
ルで解析して、形成された実際の分子を同定する。
【０１６８】（In vivo有効試験） １． 細胞株及び細胞培養 MCF7/NEO及びMCF7/HER-2形質転換乳癌細胞株はDennis S
almon博士（UCLA）から供与された。他のHER-2/neu形質
転換細胞株と同様MCF7/HER-2形質転換ヒト乳癌細胞株は
TS発現の増加が明らかにされている（Pegram et al. (1
997)）。したがって、CCD18co及びHR630R10に加えてこ
れらの細胞株はプロドラッグに対する異なる応答を調べ
るのに適している。上記のin vitro実験と同一の方法
で、5-FUdR及びBVDU-PAに対するMCF7/NEO及びMCF7/HER-
2の特徴的な反応を最初に確認する。Bertino博士から供
与されたHT1080腫瘍細胞（Banerjee et al. (1998)）に
ついても同様に特徴を調べる。
【０１６９】２．プロドラッグ化合物の異種移植モデル
試験 MCF7/HER-2乳癌細胞は無胸腺マウスにおいて効率に異種
移植片を形成し、それらの増殖特性は徹底的に調べられ
ている（Pegram et al. (1997)）。この異種移植片モデ
ルの増殖特性はきわめて均一であるため、異なる薬剤を
組み合わせた治療の後、これらの腫瘍増殖曲線の軌跡を
予測するコンピューターモデルがUCLA大学医学部生物数
理学講座のAngela Lopez 博士及びElliot Landau博士に
よって開発されている。このモデルの均一性及び再現性
から、新しい実験的治療の前臨床試験において大変有用
になってきた。例えば、このモデルは最近米国の食品医
薬品局が転移性乳癌の治療に承認した医薬品ヘルセプチ
ンの予備的in vivo解析の基礎となった（Pegram et al.
(1998)）。結腸癌細胞株（HT1080/NEO及びHT1080/E2F
1.1）は催腫瘍性であることが証明された（Banerjee et
al. (1998)）。
【０１７０】ras形質転換NIH 3T3細胞株を免疫欠損マウ
スの皮下に異種移植する。最初の治療は直接的な腫瘍内
への注入であろう。予測される結果は、ヒトTSまたは標
的酵素の増加した発現レベルが薬剤候補物質による抗腫
瘍活性を増加させることである。ヒトTSまたは標的酵素
の発現レベルが増加しているヒトの腫瘍で同様な研究が
実施され、薬剤に対する応答効率は、ヒトTSまたは標的
酵素の発現レベルに相関することが証明された。場合に
より、薬剤の候補物質の効力、毒性及び薬物生物学に関
係する事柄を扱うため、薬剤を動物に静脈内投与する以
外は上記と同じ実験が行われなければならない。さら
に、上記「プロドラッグ」の項で確認した薬剤の有効量
を対照動物に投与する。
【０１７１】特に、in vivoの研究は二つの異なる異種
移植モデルにより行うことができる（表９参照）。
【０１７２】明らかにTSを発現している細胞（表９に示
す）を、Pegram et al. (1997)に従い、4週齢から6週齢
（20-25g）のCD-1 (nu/nu)無胸腺マウス（Charles Rive
r Laboratories、 Wilmington, MA）の横腹に5 x 106/
部位で皮内注射する。各処理群（媒体対照溶液またはプ
ロドラッグ化合物）ごとに8匹のマウス（4マウス/ケー
ジ）を使った。各実験に必要な動物の匹数を減らし、群
間での応答の違いを検出する統計解析力を改良するため
に、マウスあたり二つの部位に異種移植片を確立させ
た。群の平均の解析に加えて個々のマウスについて異種
移植片のたどる軌跡を算出できるように、マウスは耳に
標識を付けた。MCF-7乳癌細胞の異種移植片モデルで用
いたマウスはすべて雌で、細胞移植前に、腫瘍生成を促
進するため17B-エストラジオール（Innovative Researc
h of America, Toledo, OH）を生分解性の担体（1.7 mg
エストラジオール/ペレット）中で皮下投与する。腫瘍
の体積を（幅2x長さ）/2で計算し、一重盲検法により連
続ミクロメーター測定により週2回測定する。出発時の
腫瘍の体積の平均が各群で同じになるように動物を各処
理群に分ける。処理群間で出発時の腫瘍の体積が均一で
あることを保証するために、統計処理（ANOVA）を実施
する。プロドラッグまたは等量の媒体対照溶液を第一群
に単一腹腔内注射する。初期実験において第一群で効力
が認められる場合、単回腹腔内投与実験のIC10に相当す
るプロドラッグを総投与量として、毎日の皮内投与スケ
ジュールを5日間行なう追加実験を実施する。
【０１７３】これらの効力実験では、各群で異種移植量
の平均が50 mm3に到達したときにプロドラッグの投与を
開始する。対照動物に比較したプロドラッグ投与動物の
腫瘍の体積の平均を記述的統計を用いてプロットする。
統計処理（ANOVA）を行って、処理群間における異種移
植片の体積の差を比較する。異種移植片体積データセッ
トにおける変動が示された場合には、これを安定化させ
るため、ANOVA計算にlog変換を施す。異種移植データの
分布に基づいて、必要ならばノンパラメトリックな統計
処理を行うことができる。TS高発現の異種移植と低TS発
現のそれとの間における効率の差を、プロドラッグ処理
群/対照群の腫瘍比率（T/C 比率）を用いて前記統計法
で比較する（Pegram et al. (1997)）。この方法論は、
TS高発現の異種移植と低TS発現のそれとの間における本
来の増殖率の差に適用できる。In vivo実験はHarris, M
P et al. (1996)及びAntelman, D. et al. (1995)に記
載されているように実施することもできる。
【０１７４】３．最大耐量（MTD）を決定するための腫
瘍非担体無胸腺マウスを用いる用量設定試験 1群6匹のCD-1 nu/nu無胸腺マウス（Charles River Labo
ratories）（雄3匹、雌3匹）に単一用量のプロドラッグ
を腹腔内注射する。プロドラッグの分布量がマウスの総
体水分（TBW）区画（gで表した体重ｘ０．６、TBWマウス）
に限定されと仮定して、経験的にin vitro実験のIC50に
相当する血中濃度に達するプロドラッグの量によって決
まる最初の用量で投与を開始する。この濃度で毒性が観
察されない場合は、6匹のマウスの群において半対数間
隔で用量を上げる。経験的な用量レベルで毒性が観察さ
れる場合は、毒性用量の10%から開始する用量増加実験
を同じ要領で繰り返す。マウスの運動性、身繕い、摂餌
及び摂水能を毎日観察する。体重を毎週測定する。MTD
は、観察期間中に体重が10%以上減少する用量、またはL
D10の90%の用量として定義されるであろう。ある特定の
用量で致死性がみられた場合は、実験を繰り返す（この
レベルでは毒性が観察されないと仮定する）。観察期間
は約60日である。特定の用量レベルで毒性がみられない
場合は、3週間間隔で用量増加実験を行う。
【０１７５】特定の実施態様を参照して本発明を詳細に
記述してきたが、その精神及び範囲から離れずに様々な
変化及び修正を行うことが可能であることは当業者にと
って明白である。 参考文献 Abrahamet al. (1996) J. Med. Chem., Vol. 39, pp. 4
569-4575 Agarwala, S.S. et al. (1988) J.M. Hematol. Oncol.
Clin. North Am. 12(4):823-833 Akdas, A.et al. (1996) Eur. Urol. 29(4):483-486 Almasan, A.et al. (1995) Cancer Metastases Rev. 1
4:59-73 Andersen,et al. (1995) Acta Oncol. 34(4):499-504 Anglada, J.M. (1996) J. Heterocycl. Chem. 33:1259-
1270 Antelman, D.et al. (1995) Oncogene 10:697 Asakura, J. et al. (1988) Tetrahedron Lett. 29:285
5-2858 Asakura, J. et al. (1990) J. Org. Chem. 55:4928-49
33 Balzarini, J.et al. (1987) Molecular Pharm. 32:410
-16 Balzarini, J. et al. (1985) Methods Find. Exp. Cli
n. Pharmacol. 7:19-28 Balzarini, J. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:633
2-6337 Balzarini, J. et al. (1996) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 225:363-369 Balzarini, J. et al. (1997) FEBS Lett. 410:324-328 Banerjee, D. et al. (1998) Cancer Res. 58:4292-429
6 Banerjee, D.et al. (1995) Acta Biochem. Pol. 42
(4):457-464 Barbour, K.W.et al. (1992) Mol. Pharmacol. 42:242-
8 Barr, P.J.et al. (1983) J. Biol. Chem. 258(22):136
27-13631 Barr, P.J. et al. (1983) Biochemistry 22:1696-1703 Barr, P.J. (1981) J. Med. Chem. 24:1385-1388 Barr, P.J. (1983) J. Biol. Chem. 258:3627-3631 Barrett, J.E. (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:449-450 Bergstrom, D.E. et al. (1984) J. Med. Chem. 27:279
-284 Benzariaet al. (1996) J. Med. Chem., Vol. 39, p. 4
958 Bergstrom,et al. (1981) J. Org. Chem. 46:1432-1441 Bertino, J.R.et al. (1996) Stem Cells 14:5-9 Bigge, et al (1980) J. Amer. Chem. Soc. 102:2033-2
038 Bohman, C. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:8036-8
043 Brison (1993) Biochem. Biophys. Acta 1155(1):25-41 Budavari, eds., Merck Index (12th Ed., 1996) Burck, K.B.et al. eds. "Oncogenes: An Introduction
to the Concept of Cancer Genes" (Springer-Verlag,
New York 1988) Callahan, A.P.,et al. (1989) Commun Nucl Med 20: 3
-6 Canute, G.W. et al. (1996) Neurosurgery 39:976-983 Carreras, C.W. et al. (1995) Annu. Rev. Biochem 6
4:721-762 Carter, P.et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:4285-4289 Cava, M.P. et al. (1985) Tetrahedron 41:5061-5087 Chadhuri, N.C. et al. (1995) J. Am. Chem. Soc. 11
7:10434-10442 Chakravarty P.K. et al. (1983) J. Med. Chem. 16
(5):638-644 Chen, C.H. et al. (1998) J. Biomed. Sci. 5(4):231-
252 Chen, L.et al. (1996) Cancer Research 56:1331-1340 Cho, Y.M. et al. (1994) Tetrahedron Lett. 25:1149-
1152 Christopherson, K.S. et al. (1992) Proc. Natl. Aca
d. Sci. (USA) 89:6314-6318 Chu, E. et al. (1996a) Cancer Treat. Res. 87:175-1
95 Chu, E. et al. (1996b) Adv. Enzyme Regul. 36:143-1
63 Clarke, R. (1996) Brest Cancer Res. Treat. 39:1-6 Clark, J.W. (1997) Semin. Oncol. 24 (Suppl.):518-5
19 Connors, T.A. (1986) Xenobiotica 16(10/11):975-988 Connors, T.A. (1996) Ann. Oncol. 7:445 Connors, T.A. and Knox, R.J. (1995) Stem Cells 13:
501-511 Copur, S.et al. (1995) Biochem. Pharm. 49(10):1419
-26 Crisp, G.T. (1989) Synth.Commun. 19:2117-2123 Dale,et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:2
238-2242 Davisson, V.J.et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:914
5-48 Davisson, V.J.et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:307
40 DeClercq, E. et al. (1983) J. Med. Chem. 26:661-66
6 Dicken, A.P.et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 90:11797-801 Dirven, H.A. et al. (1995) Cancer Res. 55:1701-170
6 Dorr, R.T. and Von Hoff, D.D., eds. "Cancer Chemot
herapy Handbook" 2nd ed. (Appleton and Lange 199
4), pp. 768-773, 1020 Dunn, W.J.et al. (1996) J. Med. Chem. 39:4825 Dyer, R.L. et al. (1991) "Nucleic Acids Chemistry:
Improved and New Synthetic Procedures, Methods,
and Techniques." Townsend, L.B. & Tipson, R.S., ed
s. (Wiley-Interscience, New York, NY) Vol. 4:79-83 Eccles, S.A.et al. (1994-95) Invasion Metast. 14(1
-6):337-348 El-Deiry, W.S. (1997) Current Opinion in Oncology
9:79-87 Fan and Bertino, J.R. (1997) Oncogene 14(10):1191-
1200 Farquharet al. (1994) J. Med. Chem. 37:3902-3909 Farquharet al. (1994) J. Med. Chem. 38:488-495 Felip,et al. (1995) Cancer 75(8):2147-2152 Findlay, M.P. et al. (1997) Br. J. Cancer 75:903-9
09 Finer-Moore, J. S.et al. (1994) Biochemistry 33:15
459-15468 Finer-Moore, J.et al. (1993) J. Mol. Bio. 232:1101
-116 Freedet al. (1989) Biochem. Pharmacol. 38:3193-319
8 Fries, K.M.,et al. (1995) J.Med.Chem 38:2672-80 Garrett, C.et al. (1979) Biochem 18:2798-2804 Goodwin, J.T. et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34:5
549-5552 Gottesmanm, M.M.et al. (1995) Annu. Rev. Genet. 2
9:607-649 Graham, D. et al. (1998) J. Chem. Soc. Perkin Tran
s. 1:1131-1138 Gros, P.et al. (1986a) Cell 47:371-80 Gros, P.et al. (1986b) Nature 323:728-731 Gros, P.et al. (1986c) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83:337-41 Gudkov, A.V.et al. (1987) Somat. Cell Mol. Genet.
13:609-19 Hamilton-Miller, J.M.T. and Smith, J.T., eds. B-La
ctamases (Academic Press, 1979) Hardy, L.W.et al. (1987) Science 235:448-455 Harris, M.P.et al. (1996) Cancer Gene Therapy 3:12
1 Hashimoto, Y.et al. (1987) Anal. Biochem. 167:340-
346 Hashimoto, Y. et al. (1988) Cancer Biochem. Biophy
s. 10:1-10 Haskell, C.M. ed. Cancer Treatment 4th Ed., J. Dys
on, Ed., (Philadelphia: W.B. Saunders Co. 1995) Hengstschlager, M.et al. (1996) Oncogene 12:1635-4
3 Hermann, J.G. (1995) Cancer Res. 55(20):4525-4530 Hobbs, F.W. Jr. (1989) J. Org. Chem. 54:3420-3422 Horikoshi, T.et al. (1992) Cancer Res. 52:108-116 Hostetleret al. (1997) Biochem. Pharmacol. 53:1815 Houze, T.A. (1997) Tumour Biol. 18:53-68 Hsiao, L.Y. et al. (1981) J. Med. Chem. 24:887-889 Hudziak, R.M.et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.U
SA 85:5102-5106 Hudziak, R.M.et al. (1990) Cell Growth & Different
iation 1:129-134 Husain, I. et al. (1994) Cancer Res. 54:539-546 Hussain, S. P. et al. (1998) Cancer Res. 58(18):40
23-4027 Imai, K. et al. (1969) J. Org. Chem. 24:1547-1550 Jackman, A.L.(1995) Anti-Cancer Drug Design 10:573
-589 Jackman, A.L. et al. (1995) Ann. Oncol. 6(9):871-8
81 Johnson, P.G.et al. (1997) J. Clin. Oncol. 15:1923
-1931 Johnston, P.G. (1991) Cancer Res. 51:6668-6676 Johnston, P.G. (1994) J. Clin. Oncol. 12:2640-2647 Johnston, P.G. (1995) Cancer Res. 55:1407-1412 Kamb, A. (1998) Curr. Top Microbiol. Immunl. 227:1
39-148 Kashani-Sabet,et al. (1988) Cancer Res 48:5775-577
8 Knighton, E.R.et al. (1994) Nature Struct. Biol.
1:186-194 Kobayashi, H.et al. (1995) Japanese J. Cancer Res.
86:1014-1018 Komaki, K. (1995) Breast Cancer Res. and Treat. 3
5:157-162 Kornmann, M. (1997) Cancer Letters 118:29-35 Kuroboshi, M. et al. (1991) SYNLETT. 909-910 Kuroboshi, M. et al. (1994) SYNLETT. 251-252 Lasic, D.D. (1996) Nature 380:561-2 Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Research 12:145-6
7 Lasic, D.D. (1996) Nature 380:561-562 Lee, Y. (1997) Exp. Cell Res. 234:270-276 Leichman, C.G. (1997) J. Clin. Oncol. 15:3223-3229 Lenz, H.J. (1995) PCR Methods Appl. 4:305-308 Lewis, J.G. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3
176-3181 Li, W.W.et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
2:10436-10440 Lin W-Y.,et al. (1997) Eur J. Nucl. Med 24: 590-59
5 Livak, K. J. et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:4
831-4837 Livingstone, L.R.et al. (1992) Cell 70:923-936 Lonn, U.et al. (1996) Cancer 77(1):107-112 Lovejoy,et al. (1997) J. Pathol. 181:130-5 Maelandsmo, G. M. (1996) Br. J. Cancer 73:909-916 Masters, J.N. and Attardi, G. (1983) Gene 21:59-63 McGuigan, C. (1992) Antiviral Res. 17:311-321 McGuigan, C. (1998) Antiviral Chem. Chemother. 9:1
87-197 McGuigan, C. (1993) J. Med. Chem. 36:1048-1052 McGuigan, C. (1996) J. Med. Chem. 39:1748-1753 McGuigan, C.et al. (1994) FEBS Let 351:11-14 McIntee, E.J. (1997) J.Med Chem. 40:3323-3331 McKay, G.A.et al. (1994) Biochem 33:6936-6944 Meden, et al. (1994) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1
20(6):378-81 Meieret al. (1997) Bioorg. Med. Chem. Lett. 7:1577 Meieret al. (1997) Bioorg. Med. Chem. Lett. 7:99 Meieret al., (1997) International Antiviral News.
5:183 Melton, R.G. and Sherwood, R.E. (1996) J. Natl. Ca
ncer Inst. 88:153-65 Miller, J.H. "A short course in bacterial genetic
s: A laboratory manualand handbook for E. coli an
d related bacteria" (Cold Spring Harbor Press 199
2) Mitchell, M.S. (1996) J. Investig. Dermatol. Symp.
Proc. 1(2):215-218 Montfort, W.R. et al. (1997) Pharmacol. Ther. 76(1
-3):29-43 Morgan, A.S.et al. (1998) Cancer Res. 58:2568-2575 Murakami et al. (1998) Mutat. Res. 400(1-2):421-43
7 Nakano, T.et al. (1994) Biochemistry 33:9945-52 Noder,et al. (1996) Pathol. Res. Pract. 192:768-80 Osaki, M.et al. (1997) Apoptosis 2:221-226 Parr, A. (1998) Biochem. Pharmacol. 56:231-235 Pederson-Lane, J. (1997) Protein Expression and Pu
rification 10:256-262 Pegram, M.D. (1998) J. Clin. Oncol. 16(8):2659-267
1 Pegram, M.D. et al. (1997) Oncogene 15:537-547 Perry, K.et al. (1990) Proteins 8:315-333 Pestalozzi, B.C. (1997) J. Clin. Oncol. 15:1923-19
31 Peters, G.J.et al. (1995) Eur. J. Cancer 31A:1299-
1305 Phelps, M.E. et al. (1980) J. Med. Chem. 23:1229-1
232 Pupa,et al. (1993) Oncogene 8(11):2917-23 Rigg, A. et al. (1997) Mol. Med. Today 3:359-366 Roberts, D. (1966) Biochem. 5:3546-3548 Robins, M.J. et al. (1983) J. Org. Chem. 48:1854-1
862 Robins, M.J. et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:42
1-424 Robins, M.J. et al. (1982) Can. J. Chem. 60:554-55
7 Roninson, I.B.et al. (1984) Nature 309:626-28 Rustum, Y.M. (1997) J. Clin. Oncol. 15(1):389-400 Ruth, J.L. et al. (1978) J. Org. Chem. 43:2870-287
6 Sambrook,et al., eds. "Molecular Biology: A Labora
tory Manual" (2nd ed.)(Cold Spring Harbor Press 19
89) Santi, D.V. (1980) J. Med. Chem. 23:103-111 Sastryet al., (1992) Mol. Pharmacol 41:441-445 Sauter,et al. (1993) Cancer Res. 53(10 Suppl.):219
9-203 Schaechter, M.et al., eds. "Mechanisms of Microbia
l Disease" (2nd ed.) (Williams and Wilkins 1993) Schiffer, C.A.et al. (1995) Biochemistry 34:16279-
16287 Schimke, R.T.et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:5989
-5992 Segovia, M. (1994) Ann. Tropical Med. Paras. 88
(2):123-130 Shepard, H.M.et al. (1988) J. Clin. Immunol. 8:353
-395 Simon, S.M. and Schindler, M. (1994) Proc. Natl. A
cad. Sci.USA 91(9):3497-3504 Slamon, D.J.et al. (1987) Science 235:177-182 Slamon, D.J.et al. (1989) Science 244:707-712 Smith, K.A.et al. (1995) Philos Tran Royal Soc 34
7:49-56 Snydman, D.R.et al. (1996) Clinical Infectious Dis
eases 23(Suppl. 1):554-65 Spector, D.L.et al. (1998) "Cells, A Laboratory Ma
nual" Vols I to III, (Cold Spring Harbor Press) Stuhlinger, M.et al. (1994) J. Steroid Biochem. Mo
lec. Biol. 49(1):39-42 Sugarman, B.J.et al. (1985) Science 230:943-945 Sukumar and Barbacid (1990) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87(2):718-722 Takeishi, K.et al. (1985) Nucl. Acid Res. 13:2035-
2043 Takemura, Y. et al. (1997) Anticancer Drugs 8(1):3
-16 Tannock, I.F. (1996) J. Clin. Oncol. 14(12):3156-3
174 Tolstikov, V.V. et al. (1997) Nucleosides Nucleoti
des 16:215-225 Troutner, D.A. (1987) Nuc.l Med. Bio.l 14: 171-176 Valetteet al. (1996) J. Med. Chem 39:1981 Van Den Berg, C.L. (1994) Anti-Cancer Drugs 5:573-
578 van de Vijver,et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7(5):
2019-23 Vlaykova, T. (1997) Oncology 54:146-152 Voet,et al. eds. Biochemistry 2nd Ed. (John Wiley
& Sons, Inc. 1995) Volm, M. et al. (1996) Critical Rev. in Oncogenesi
s 7:227-244 Volm, M and Mattern, J. (1992) Anticancer Res. 12
(6B):2293-6 Wahba, A.J. et al. (1961) J. Biol. Chem. 236(3):C1
1 Wall, M.E. (1998) Med. Res. Rev. 18:229-314 Wataya, Y. (1979) J. Med. Chem. 22:339-340 Wettergren, Y.et al. (1994) Mol. Genet. 20:267-85 Wilson, J.D.,et al. (eds.) "Harrison's Principles
of Internal Medicine"(12th ed) (McGraw-Hill, Inc.
1991) 2208, esp. 21-76 Yamachika, T. (1998) Cancer 82:70-77 Yeh, K.H. et al. (1998) Chemotherapy Cancer 82(9):
1626-1631 Yin, Yet al. (1992) Cell 70:937-948 Yin, Y.et al. (1994) Cancer Res. 54:3686-91 特許文献 U.S. Patent No. 4,247,544, Bergstrom, D.E.et al. "
C-5 Substituted UracilNucleosides", issued January
27, 1981 U.S. Patent No. 4,267,171, Bergstrom, D.E.et al. "
C-5 Substituted Cytosine Nucleosides" issued May 1
2, 1981 U.S. Patent No. 4,948,882, Ruth, J.L. "Single-Stra
nded Labelled Oligonucleotides, Reactive Monomers
and Methods of Synthesis" issued August 14,1990 U.S. Patent No. 4,975,278, Senter, P.D.et al. "Ant
i-body-Enzyme Conjugates in Combination with Prodr
ugs for the Delivery of Cytotoxic Agents toTumor C
ells" issued December 4, 1990 U.S. Patent No. 5,085,983, Scanlon, K.J. "Detectio
n of human tumor progression and drug resistance"
issued February 4, 1992 U.S. Patent No. 5,233,031, Borch, R.F.et al. "Phos
phoramidate Analogs of2'-Deoxyuridine" issued Augu
st 3, 1993 U.S. Patent No. 5,264,618, Felgner, P.L.et al. "Ca
tionic Lipids for Intracellular Delivery of Biolog
ically Active Molecules" issued November 23,1993 U.S. Patent No. 5,459,127, Felgner, P.L.et al. "Ca
tionic Lipids for Intracellular Delivery of Biolog
ically Active Molecules" issued October 17,1995 U.S. Patent No. 5,627,165, Glazier, A. "Phosphorou
s Prodrugs and Therapeutic Delivery Systems Using
Same" issued May 6, 1997 PCT Application WO 91/17474, published November 4,
1991 Hostetleret al., Patent Application No. WO 96/4008
8 (1996)
【０１７６】
【発明の効果】本発明により、腫瘍に侵入して治療に抵
抗性を獲得した癌細胞の増殖を阻害する及び/または殺
傷できる、より選択性の高い薬剤、およびそのような薬
剤を含む医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞が抗癌剤療法に抵抗性を獲得していく様式
及び結果を示している。
【図２】本発明のプロドラッグの活性化経路を模式的に
示している。
【図３】薬剤耐性に重要な細胞内酵素によって活性化さ
れるプロドラッグのハイスループットスクリーニングを
模式的に示している。
【図４】標的細胞としてTS陰性の大腸菌を用いてリード
ヒトチミジル酸シンターゼ （TS）プロドラッグを発見
する方法を模式的に示している。
【図５】二つの標的酵素に対するプロドラッグの活性を
同時に最適化するためにこのスクリーニング試験法をど
のように用いるかの実施例を示している。
【図６】チミジル酸シンターゼ（TS）が活性化するプロ
ドラッグの多分割された基質の一つの実施態様を示して
いる。Box 1はマスクされたか、または欠如したリン酸
基R7を表す。マスクされる場合、それはホスホルアミデ
ートまたは類似の誘導体で、細胞通過性が促進するもの
であって、細胞内でTSと結合できる一リン酸に変換され
るものである。Fries,K.M. et al. (1995)参照。存在し
ない場合、R7は水素原子となり、プロドラッグは細胞内
チミジンキナーゼ（TK）の基質となってin vivoで必要
な一リン酸を生成する。Box 2は2'-デオキシリボフラノ
ース基、または他の類似の糖、チオ糖、炭素環状基また
は非環状基で、プロドラッグがTSと、R7が水素原子の場
合はTKと、機能的に結合できるように、一リン酸をピリ
ミジン環に結合させる。この基はBox 1のR7基と結合す
るために酸素原子を利用する必要がない。従って、糖リ
ン酸塩のフォスフォネートアナログを利用できる。Box
3は結合基で、nは0から10の整数を示し、TSによってプ
ロドラッグが作用を受けると、ピリミジン環から電子を
奪って脱離基R4に移動させる作用を果たすモノまたはポ
リの不飽和電子伝達体である。結合基は非環式ビニル、
エチニル、イミン、またはアゾ単位または環状不飽和、
アロマティック、またはヘテロアロマティック単位のよ
うな0から10の不飽和部分を含み、それらの連結が必要
な電子伝達導管を供給する限りそれらを随意に混合し調
和させることができる。Box 4はスペース単位Xを表し、
mは0ないし1の整数で、結合基を脱離基R4に繋ぐ。Box 3
でnが0であれば、Box 4 でmは1である。好ましい形
は、Xがメチレン（CH2）単位で、置換基を持つか持たな
いかのいずれかである。さらに、Xは酸素、硫黄、窒
素、または少なくとも二つの共有結合を形成できれば他
の原子でもよい。Xがない場合（Box 4でmが0）、プロド
ラッグがTSの作用を受ける間に起きる脱離基R4の放出
は、ピリミジンヌクレオチドに基づくアルキル化因子を
残すことになる。Xが存在する場合（Box 4でmが1）、プ
ロドラッグがTSの作用を受ける早い時期に脱離基R4の放
出が起こる。Box 5はTSのプロドラッグへの作用によっ
て放出される脱離基R4を表す。それは、それ自体が毒性
の代謝拮抗物質か、アルキル化剤か、またはin vivoで
速やかに毒性代謝拮抗物質またはアルキル化剤を作る因
子である。例えば、脱離基R4はTSによる作用を受けて、
抗癌剤テパまたはチオテパの活性代謝産物、ホスホルア
ミドマスタード、N-アセチルスフィンゴシン（C2セラミ
ド、腫瘍抑制脂質）またはヒドロキシウレア（リボヌク
レオチド還元酵素阻害剤）として離れる。脱離基R1も
α,α-ジハロゲン化エーテルであってよく、その場合は
TSによって放出されたα,α-ジハロゲン化アルコールの
加水分解が進むとカルボン酸基を生じる。そこで、脱離
基R4はすべて酸化的リン酸化反応の強力な阻害剤である
フルオロアセテート、フルオロシトレート、マロン酸、
メチルマロン酸、または3-ニトロプロピオン酸の前駆体
として離れる。
【図７】ネオマイシン耐性をコードしているプラスミド
で形質転換したHER-2プロトオンコジーンを持つかまた
は持たない細胞株のTSウエスタンブロットを示してい
る。レーン(1) MCF7/HER2; (2) MCF7/neo; (3) MDA-MB-
435/HER2; (4) MDA-NM-435/neo; (5) BT-20/HER2; (6)
BT-20/neo。
【図８】プロドラッグ化合物と酵素チミジル酸シンター
ゼの反応生成物を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 早期審査対象出願 (72)発明者 グロジアク マイケル ピー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94303−3047 パロ アルト プリムロ ーズ ウェイ 153 (56)参考文献 特表 平６−511003（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07H 19/06 - 19/10 A61K 31/7072 ＣＡＯＬＤ（ＳＴＮ) ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の式を有する化合物。 【化１】
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の化合物を含む医薬組成
    物。
  3. 【請求項３】 異常細胞がチミジル酸シンターゼを過剰
    発現している場合に、前記異常細胞を請求項１の化合物
    の効果的量と接触させることにより、前記異常細胞の増
    殖をin vitroで阻害する方法。
  4. 【請求項４】 異常細胞が、大腸癌細胞、乳癌細胞、胃
    癌細胞、頭頚部癌細胞、肝臓癌細胞および膵臓癌細胞か
    らなる群より選ばれる、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 異常細胞が、大腸癌細胞である、請求項
    ４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載の化合物を含む、チミジ
    ル酸シンターゼを過剰発現している異常細胞によって特
    徴づけられる病気の治療用医薬組成物。
JP2000339831A 1998-01-23 2000-11-08 酵素に触媒される治療剤 Expired - Lifetime JP3265304B2 (ja)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7226498P 1998-01-23 1998-01-23
US60/072,264 1998-01-23
US7695098P 1998-03-05 1998-03-05
US60/076,950 1998-03-05
US10863498P 1998-11-16 1998-11-16
US60/108,634 1998-11-16

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000528661A Division JP2002500880A (ja) 1998-01-23 1999-01-22 酵素に触媒される治療剤

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2001220397A JP2001220397A (ja) 2001-08-14
JP3265304B2 true JP3265304B2 (ja) 2002-03-11

Family

ID=27372051

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000528661A Pending JP2002500880A (ja) 1998-01-23 1999-01-22 酵素に触媒される治療剤
JP2000339831A Expired - Lifetime JP3265304B2 (ja) 1998-01-23 2000-11-08 酵素に触媒される治療剤

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000528661A Pending JP2002500880A (ja) 1998-01-23 1999-01-22 酵素に触媒される治療剤

Country Status (16)

Country Link
US (3) US6245750B1 (ja)
EP (2) EP1167972B1 (ja)
JP (2) JP2002500880A (ja)
CN (1) CN1192102C (ja)
AT (1) ATE212661T1 (ja)
AU (1) AU753155B2 (ja)
BR (1) BR9907736A (ja)
CA (1) CA2317505C (ja)
DE (1) DE69900841T2 (ja)
DK (1) DK1045897T3 (ja)
ES (1) ES2172303T3 (ja)
HK (2) HK1039520A1 (ja)
IL (1) IL137164A0 (ja)
PT (1) PT1045897E (ja)
TW (1) TWI244924B (ja)
WO (1) WO1999037753A1 (ja)

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE222765T1 (de) 1995-02-01 2002-09-15 Resprotect Gmbh Verwendung von 5' substituierten nukleosiden zur hemmung von resistenzbildung bei der zytostatikabehandlung
ATE413881T1 (de) * 1997-08-08 2008-11-15 Celmed Oncology Usa Inc Verfahren und zubereitungen um resistenz gegen biologische oder chemische therapien zu überwinden
US6703374B1 (en) 1997-10-30 2004-03-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleosides for imaging and treatment applications
US7462605B2 (en) 1998-01-23 2008-12-09 Celmed Oncology (Usa), Inc. Phosphoramidate compounds and methods of use
AU753155B2 (en) * 1998-01-23 2002-10-10 Kiadis Pharma Intellectual Property B.V. Enzyme catalyzed therapeutic agents
CA2379834A1 (en) * 1999-07-22 2001-02-01 Newbiotics, Inc. Enzyme catalyzed anti-infective therapeutic agents
US6683061B1 (en) * 1999-07-22 2004-01-27 Newbiotics, Inc. Enzyme catalyzed therapeutic activation
BR0012677A (pt) * 1999-07-22 2003-07-01 Newbiotics Inc Ativação terapêutica catalisada por enzima
KR20020059341A (ko) * 1999-07-22 2002-07-12 뉴바이오틱스 인코퍼레이티드 치료법-내성 종양의 치료 방법
US6673564B2 (en) * 1999-10-18 2004-01-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for using 22045, a human cyclic nucleotide phosphodiesterase
WO2001045690A2 (en) * 1999-12-23 2001-06-28 Newbiotics, Inc. Use of bvdu for inhibiting the growth of hyperproliferative cells
US20030212037A1 (en) * 2000-12-21 2003-11-13 Christopher Boyer Use of bvdu for inhibiting the growth of hyperproliferative cells
AU2001277093A1 (en) * 2000-07-20 2002-02-05 Newbiotics, Inc. Methods for identifying therapeutic targets
US20030130179A1 (en) * 2000-07-20 2003-07-10 Shepard H. Michael Methods for identifying therapeutic targets for treating infectious disease
PL213214B1 (pl) 2000-07-21 2013-01-31 Gilead Sciences Diastereoizomerycznie wzbogacone proleki fosfonianowych analogów nukleotydowych oraz kompozycje zawierajace takie zwiazki
CA2441350A1 (en) * 2001-01-19 2002-07-25 Newbiotics, Inc. Methods to treat autoimmune and inflammatory conditions
DE10108851A1 (de) * 2001-02-23 2002-09-12 Resprotect Gmbh Verwendung von 5'-substituierten Nukleosiden und/oder deren Prodrugs zur resistenzfreien Therapie von Infektionskrankheiten
BR0210149A (pt) * 2001-05-09 2004-06-29 Newbiotics Inc Pródrogas ativadas por deformilase de peptìdeo
US20030212147A1 (en) * 2001-07-12 2003-11-13 Chung Sum Man Stephen Enzyme activated chemotherapy of liver cancer
EP1417967A4 (en) * 2001-08-14 2007-03-28 Toyama Chemical Co Ltd NEW VIRUS PROTECTION INHIBITION, VIRCIDIDIC PROCEDURE AND NEW PYRADIN NUCLEOTIDE / PYRADIN NUCLEOSIDE ANALOGON
HUP0500054A2 (hu) * 2001-11-23 2005-04-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Tumorjelző enzimek azonosítására szolgáló eljárás
US20030152747A1 (en) * 2002-01-11 2003-08-14 The Garland Company, Inc., An Ohio Corporation Roofing materials
MXPA04010230A (es) * 2002-04-18 2005-06-08 Celmed Oncology Usa Inc Profarmacos de peptido deformilasa activada.
US7001922B2 (en) 2002-11-14 2006-02-21 Celmed Oncology (Usa), Inc. Peptide deformylase activated prodrugs
EP1599484A2 (en) * 2003-02-21 2005-11-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for the preparation of hexacyclic camptothecin derivatives
WO2004111192A2 (en) * 2003-05-29 2004-12-23 The Scripps Research Institute Targeted delivery to legumain-expressing cells
GB0317009D0 (en) 2003-07-21 2003-08-27 Univ Cardiff Chemical compounds
CA2538252C (en) * 2003-09-18 2014-02-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-thionucleosides and oligomeric compounds
GB0401088D0 (en) * 2004-01-19 2004-02-18 Univ Cardiff Phosphoramidate derivatives
MXPA06011679A (es) * 2004-04-09 2007-01-23 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Novedosos profarmacos solubles en agua.
US7309589B2 (en) 2004-08-20 2007-12-18 Vironix Llc Sensitive detection of bacteria by improved nested polymerase chain reaction targeting the 16S ribosomal RNA gene and identification of bacterial species by amplicon sequencing
GB0505781D0 (en) * 2005-03-21 2005-04-27 Univ Cardiff Chemical compounds
US20070010477A1 (en) * 2005-04-07 2007-01-11 Dolnick Bruce J Acyl homoserine lactones for inhibition of cell growth
WO2006121820A1 (en) * 2005-05-05 2006-11-16 Valeant Research & Development Phosphoramidate prodrugs for treatment of viral infection
TW200744603A (en) * 2005-08-22 2007-12-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Novel anticancer concomitant drug
BRPI0617730A2 (pt) * 2005-10-19 2011-08-02 Chugai Pharmaceutical Co Ltd agente para prevenir ou tratar cáncer do páncreas, cáncer de ovário ou cáncer hepático contendo nova pró-fármaco hidrossolúvel
WO2007064759A2 (en) * 2005-11-29 2007-06-07 The Scripps Research Institute Inhibiting tumour cell invasion, metastasis and angiogenesis through targetting legumain
DE102006037786A1 (de) * 2006-08-11 2008-03-20 Resprotect Gmbh Nukleoside, diese enthaltendes Arzneimittel und deren Verwendung
US7964580B2 (en) 2007-03-30 2011-06-21 Pharmasset, Inc. Nucleoside phosphoramidate prodrugs
US8173621B2 (en) 2008-06-11 2012-05-08 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside cyclicphosphates
CL2009002206A1 (es) * 2008-12-23 2011-08-26 Gilead Pharmasset Llc Compuestos derivados de pirrolo -(2-3-d]-pirimidin-7(6h)-tetrahidrofuran-2-il fosfonamidato, composicion farmaceutica; y su uso en el tratamiento de enfermedades virales.
US8618076B2 (en) 2009-05-20 2013-12-31 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside phosphoramidates
TWI598358B (zh) * 2009-05-20 2017-09-11 基利法瑪席特有限責任公司 核苷磷醯胺
WO2011005525A2 (en) * 2009-06-22 2011-01-13 Health Research Inc. Prodrug anti-cancer therapy
PE20130151A1 (es) 2010-03-31 2013-02-21 Gilead Pharmasset Llc Sintesis estereoselectiva de activos que contienen fosforo
US8563530B2 (en) 2010-03-31 2013-10-22 Gilead Pharmassel LLC Purine nucleoside phosphoramidate
KR102077871B1 (ko) 2010-11-16 2020-02-14 유니버시티 오브 써던 캘리포니아 체세포 줄기 세포의 비대칭 분열을 향상시키기 위한 ｃｂｐ/카테닌 길항제
TW201242974A (en) 2010-11-30 2012-11-01 Gilead Pharmasset Llc Compounds
KR101969333B1 (ko) * 2011-02-18 2019-04-16 더 유에이비 리서치 파운데이션 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 또는 뉴클레오시드 하이드롤라아제 프로드러그의 증강된 치료적 용도
RS62721B1 (sr) 2011-03-01 2022-01-31 NuCana plc Farmaceutska formulacija koja sadrži fosforamidatni derivat 5-fluoro-2’-deoksiuridina za upotrebu u lečenju kancera
MD4589C1 (ro) 2011-09-16 2019-03-31 Gilead Pharmasset Llc Compoziţie farmaceutică cu conţinut de sofosbuvir şi utilizarea acesteia în tratamentul hepatitei virale C
US8889159B2 (en) 2011-11-29 2014-11-18 Gilead Pharmasset Llc Compositions and methods for treating hepatitis C virus
EP3150616B1 (en) 2012-11-16 2017-05-10 University College Cardiff Consultants Limited Mixture of rp/sp gemcitabine-[phenyl-(benzyloxy-l-alaninyl)]-phosphate
EA029081B9 (ru) 2013-01-31 2018-09-28 Джилид Фармассет Ллс Комбинированный состав двух противовирусных соединений
RU2015148006A (ru) 2013-04-12 2017-05-18 Ачиллион Фармасютикалз, Инк. Дейтерированные нуклеозидные пролекарства, применимые для лечения hcv
CA2921160C (en) 2013-08-27 2021-04-13 Gilead Pharmasset Llc Combination formulation of two antiviral compounds
US9828409B2 (en) * 2014-03-19 2017-11-28 Minghong Zhong Bridged-cyclo-ProTides as prodrugs of therapeutic nucleosides and nucleotides
TWI765176B (zh) 2014-06-25 2022-05-21 英商努卡那公眾有限公司 磷酸酯衍生物之調配物
TWI758728B (zh) 2014-06-25 2022-03-21 英商努卡那公眾有限公司 前藥
EP3204004A4 (en) 2014-10-08 2018-05-30 Epigenetics Pharma LLC Vitamin e-nucleoside prodrugs
GB201709471D0 (en) 2017-06-14 2017-07-26 Nucana Biomed Ltd Diastereoselective synthesis of hosphate derivatives
CN109207551B (zh) * 2017-07-07 2023-05-26 上海睿智化学研究有限公司 一种筛选叶酸代谢相关药物的方法
KR102545956B1 (ko) * 2022-10-19 2023-06-22 주식회사 카이팜 브리부딘을 유효성분으로 포함하는 오스카 유도 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Family Cites Families (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB982776A (en) * 1962-01-24 1965-02-10 Wellcome Found 2-deoxyuridines and their use in pharmaceutical compositions having anti-immune activity
JPS5017989B1 (ja) * 1970-12-24 1975-06-25
US4247544A (en) 1979-07-02 1981-01-27 The Regents Of The University Of California C-5 Substituted uracil nucleosides
US4267171A (en) 1979-07-02 1981-05-12 The Regents Of The University Of California C-5 Substituted cytosine nucleosides
US4668777A (en) 1981-03-27 1987-05-26 University Patents, Inc. Phosphoramidite nucleoside compounds
JPS5843993A (ja) 1981-09-09 1983-03-14 Yamasa Shoyu Co Ltd １−β−Ｄ−アラビノフラノシル−（Ｅ）−５−（２−ハロゲノビニル）ウラシル−５′−りん酸およびその製造法
EP0095294A1 (en) 1982-05-22 1983-11-30 Beecham Group Plc Deoxyuridine compounds, methods for preparing them and their use in medicine
DE3229169A1 (de) 1982-08-05 1984-02-09 Robugen GmbH Pharmazeutische Fabrik, 7300 Esslingen Verwendung von 5-alkylpyrimidinnukleosiden und deren derivate als zytostatika
US4816570A (en) 1982-11-30 1989-03-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Biologically reversible phosphate and phosphonate protective groups
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
RO88451A2 (ro) 1984-06-05 1986-01-30 Intreprinderea De Antibiotice,Ro Derivati ai acidului 7-aminocefalosporanic si procedeu de preparare aacestora
US5116827A (en) 1986-10-23 1992-05-26 American Cyanamid Company Quinolinecarboxylic acid derivatives as solubilized pro-drugs
US5212291A (en) * 1986-10-23 1993-05-18 American Cyanamid Company Anthracycline derivatives as solubilized pro-drugs
US5077283A (en) * 1986-10-23 1991-12-31 American Cyanamid Company Solubilized imidazole pro-drugs
US5070082A (en) * 1986-10-23 1991-12-03 American Cyanamid Company Solubilized pro-drugs
US5077282A (en) 1986-10-23 1991-12-31 American Cyanamid Company Solubilized pro-drugs
US4963533A (en) 1986-10-24 1990-10-16 Stichting Rega Vzw (Rega) Therapeutic application of dideoxycytidinene
US5116822A (en) 1986-10-24 1992-05-26 Stichting Rega Vzw Therapeutic application of dideoxycytidinene
NL8700366A (nl) 1987-02-13 1988-09-01 Stichting Rega V Z W Combinatie van fu met bvdu als middel tegen adenocarcinoom.
US5085983A (en) 1988-08-19 1992-02-04 City Of Hope Detection of human tumor progression and drug resistance
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
JPH01265099A (ja) 1987-10-08 1989-10-23 Stichting Rega Vzw 抗ｈｉｖ活性をもつ３’，−フルオロプリン−２’，３’−ジデオキシリボシド類
EP0311108A3 (en) 1987-10-08 1990-04-04 Stichting REGA V.Z.W. Anti-hiv active 3'-azido-2,6-diaminopurine-2',3'-dideoxyriboside
US5133866A (en) 1988-03-24 1992-07-28 Terrapin Technologies, Inc. Method to identify analyte-bending ligands
US5300425A (en) 1987-10-13 1994-04-05 Terrapin Technologies, Inc. Method to produce immunodiagnostic reagents
US4963263A (en) 1988-03-24 1990-10-16 Terrapin Technologies, Inc. Method of identity analyte-binding peptides
US5338659A (en) 1991-04-02 1994-08-16 Terrapin Technologies, Inc. Method for determining analyte concentration by cross-reactivity profiling
US5217869A (en) 1987-10-13 1993-06-08 Terrapin Technologies, Inc. Method to produce immunodiagnostic reagents
EP0316592A3 (en) 1987-11-13 1990-09-19 Stichting REGA V.Z.W. 3'-fluoro-2',3'-dideoxyuridine, and its therapeutic application
CA1317291C (en) 1987-12-14 1993-05-04 Naeem Botros Hanna Antitumor 6-sulfenamide, 6-sulfinamide and 6-sulfonamide purines, purine nucleosides, purine nucleotides and related compounds
AU631119B2 (en) * 1988-02-24 1992-11-19 Institut De Recherches Chimiques Et Biologiques Appliquees (I.R.C.E.B.A.) New derivatives of deoxy-2'-uridine substituted in the 5,3' or 5' position by acylated alpha-amino groups, process for obtaining them and drugs containing them
WO1990003978A1 (en) 1988-10-03 1990-04-19 Stichting Rega Vzw 5-halogeno-3'-fluoro-2',3'-dideoxyuridine compounds and their therapeutic application
US5596018A (en) 1988-12-28 1997-01-21 Toray Industries, Inc. Antiviral agents against aids-causing virus
US5433955A (en) 1989-01-23 1995-07-18 Akzo N.V. Site specific in vivo activation of therapeutic drugs
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
CZ285420B6 (cs) 1990-04-24 1999-08-11 Ústav Organické Chemie A Biochemie Avčr N-(3-Fluor-2-fosfonylmethoxypropyl)deriváty purinových a pyrimidinových heterocyklických bazí, způsoby jejich přípravy a použití
AU7979491A (en) 1990-05-03 1991-11-27 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
GB9010242D0 (en) 1990-05-08 1990-06-27 British Telecomm Optical signal regenerator and optical communications system incorporating same
US5137724A (en) 1990-05-23 1992-08-11 Stichting Rega Vzw Combinations of TS-inhibitors and viral TK-inhibitors in antiherpetic medicines
US5627165A (en) 1990-06-13 1997-05-06 Drug Innovation & Design, Inc. Phosphorous prodrugs and therapeutic delivery systems using same
US5608046A (en) * 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
DE69227594D1 (de) 1991-04-29 1998-12-17 Terrapin Tech Inc Verfahren zur erkennung und behandlung anomaler zellen
US5556942A (en) 1991-04-29 1996-09-17 Terrapin Technologies, Inc. Glutathione S-transferase-activated compounds
US5645988A (en) 1991-05-08 1997-07-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods of identifying drugs with selective effects against cancer cells
DK0513917T4 (da) 1991-05-16 2001-06-25 Glaxo Group Ltd Antivirale kombinationer indeholdende nukleosidanaloger
DE69120069T2 (de) 1991-09-04 1996-10-02 Stichting Rega V Z W Substituierte Nukleosidderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen
US5233031A (en) 1991-09-23 1993-08-03 University Of Rochester Phosphoramidate analogs of 2'-deoxyuridine
US5879700A (en) 1991-10-15 1999-03-09 Hostetler; Karl Y. Nucleoside analogue phosphates for topical use
US5274162A (en) * 1991-12-13 1993-12-28 Arnold Glazier Antineoplastic drugs with bipolar toxification/detoxification functionalities
WO1993013740A2 (en) * 1991-12-31 1993-07-22 Worcester Foundation For Experimental Biology Antiparasitic oligonucleotides active against drug resistant malaria
US5430148A (en) 1992-03-31 1995-07-04 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Antiproliferative quinazolines
US5668828A (en) * 1992-05-08 1997-09-16 Sanconix, Inc. Enhanced frequency agile radio
US6057305A (en) 1992-08-05 2000-05-02 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Of The Academy Of Sciences Of The Czech Republic Antiretroviral enantiomeric nucleotide analogs
US5516631A (en) 1992-10-13 1996-05-14 La Jolla Cancer Research Foundation Method of inhibiting replication of hyperproliferative cells
IL105244A (en) * 1993-03-31 2003-07-31 Dpharm Ltd Prodrugs with enhanced penetration into cells
US5502037A (en) 1993-07-09 1996-03-26 Neuromed Technologies, Inc. Pro-cytotoxic drug conjugates for anticancer therapy
US5798340A (en) 1993-09-17 1998-08-25 Gilead Sciences, Inc. Nucleotide analogs
US20020068275A1 (en) 1993-09-21 2002-06-06 Michael A. Reeve Methods of using a chimeric nucleic acid/nucleic acid analogue molecule
US5908919A (en) 1993-10-01 1999-06-01 Terrapin Technologies Urethane mediated, GST specific molecular release systems
GB9323008D0 (en) 1993-11-05 1994-01-05 Connors Thomas Improvements relating to cancer therapy
US5457187A (en) * 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5521161A (en) 1993-12-20 1996-05-28 Compagnie De Developpment Aguettant S.A. Method of treating HIV in humans by administration of ddI and hydroxycarbamide
GB9415167D0 (en) * 1994-07-27 1994-09-14 Springer Caroline J Improvements relating to cancer therapy
US5556992A (en) * 1994-09-02 1996-09-17 Universite De Montreal Novel rhodamine derivatives for photodynamic therapy of cancer and in vitro purging of the leukemias
IL115156A (en) 1994-09-06 2000-07-16 Univ Georgia Pharmaceutical compositions for the treatment of cancer comprising 1-(2-hydroxymethyl-1,3-dioxolan-4-yl) cytosines
US5968910A (en) 1994-11-30 1999-10-19 Jan M. R. Balzarini Compositions containing two or three inhibitors of different HIV reverse transcriptases
ATE222765T1 (de) 1995-02-01 2002-09-15 Resprotect Gmbh Verwendung von 5' substituierten nukleosiden zur hemmung von resistenzbildung bei der zytostatikabehandlung
US5705336A (en) * 1995-03-07 1998-01-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Assay for sensitivity of tumors to DNA-platinating chemotherapy
GB9505025D0 (en) 1995-03-13 1995-05-03 Medical Res Council Chemical compounds
IN186549B (ja) 1995-04-19 2001-09-29 Kumiai Chemical Co Ltd
US5856464A (en) 1995-06-07 1999-01-05 Lajolla Pharmaceutical Company Selective capping solution phase oligonucleotide synthesis
US5998151A (en) * 1995-12-01 1999-12-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods for predicting the efficacy of a chemotherapeutic regimen for gastrointestinal cancers using antibodies specific for thymidylate synthase
US5981507A (en) 1995-12-14 1999-11-09 Advanced Magnetics, Inc. Polymeric carriers linked to nucleotide analogues via a phosphoramide bond
US5880097A (en) 1996-01-04 1999-03-09 Terrapin Techologies, Inc. Tethered prodrugs
EP0888376A4 (en) * 1996-01-31 2001-12-19 Univ California PROCESS FOR INHIBITING TUMOR CELL GROWTH
RU2111970C1 (ru) 1996-06-25 1998-05-27 Иван Игоревич Федоров 3'-оксимино-2',3'-дидезоксинуклеозиды
GB9708611D0 (en) 1997-04-28 1997-06-18 Univ Cardiff Chemical compounds
WO1999006072A1 (en) 1997-07-30 1999-02-11 Boehringer Mannheim Corporation Cyclized prodrugs
ATE413881T1 (de) * 1997-08-08 2008-11-15 Celmed Oncology Usa Inc Verfahren und zubereitungen um resistenz gegen biologische oder chemische therapien zu überwinden
AU729377B2 (en) * 1997-10-23 2001-02-01 Asterias Biotherapeutics, Inc. Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture
CA2307002C (en) 1997-10-30 2008-07-29 Raymond W. Klecker Antitumour uridine analogues
US6703374B1 (en) 1997-10-30 2004-03-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleosides for imaging and treatment applications
AU753155B2 (en) * 1998-01-23 2002-10-10 Kiadis Pharma Intellectual Property B.V. Enzyme catalyzed therapeutic agents
GB9821121D0 (en) 1998-09-29 1998-11-25 James Robinson Ltd Grey colouring photochromic fused pyrans
PT1144011E (pt) 1998-12-11 2010-06-16 Coulter Pharm Inc Compostos pró-fármacos e processo para a sua preparação
BR0012677A (pt) * 1999-07-22 2003-07-01 Newbiotics Inc Ativação terapêutica catalisada por enzima
US6683061B1 (en) * 1999-07-22 2004-01-27 Newbiotics, Inc. Enzyme catalyzed therapeutic activation
WO2001007888A2 (en) 1999-07-23 2001-02-01 Westinghouse Electric Company Llc Pulsed gamma neutron activation analysis (pgnaa) method and apparatus for nondestructive assay of containerized contaminants
US6294546B1 (en) * 1999-08-30 2001-09-25 The Broad Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Uses of diterpenoid triepoxides as an anti-proliferative agent
GB0009486D0 (en) 2000-04-17 2000-06-07 Univ Cardiff Chemical compounds
GB0011203D0 (en) 2000-05-09 2000-06-28 Univ Cardiff Chemical compounds
AU2002236455A1 (en) * 2000-11-16 2002-05-27 Newbiotics, Inc. Synergistic ecta compositions
CA2441350A1 (en) * 2001-01-19 2002-07-25 Newbiotics, Inc. Methods to treat autoimmune and inflammatory conditions

Also Published As

Publication number Publication date
PT1045897E (pt) 2002-07-31
IL137164A0 (en) 2001-07-24
AU2464699A (en) 1999-08-09
HK1030624A1 (en) 2001-05-11
US7601703B2 (en) 2009-10-13
DE69900841D1 (de) 2002-03-14
AU753155B2 (en) 2002-10-10
EP1045897B1 (en) 2002-01-30
DE69900841T2 (de) 2002-10-02
WO1999037753A1 (en) 1999-07-29
CN1291228A (zh) 2001-04-11
TWI244924B (en) 2005-12-11
JP2002500880A (ja) 2002-01-15
ATE212661T1 (de) 2002-02-15
US20010034440A1 (en) 2001-10-25
EP1045897A4 (en) 2000-10-25
JP2001220397A (ja) 2001-08-14
CN1192102C (zh) 2005-03-09
EP1045897A1 (en) 2000-10-25
CA2317505C (en) 2011-01-04
CA2317505A1 (en) 1999-07-29
ES2172303T3 (es) 2002-09-16
EP1167972B1 (en) 2017-03-08
US6245750B1 (en) 2001-06-12
EP1167972A3 (en) 2006-05-24
US6339151B1 (en) 2002-01-15
HK1039520A1 (zh) 2002-04-26
DK1045897T3 (da) 2002-05-13
BR9907736A (pt) 2000-10-17
EP1167972A2 (en) 2002-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3265304B2 (ja) 酵素に触媒される治療剤
EP1200455B1 (en) Enzyme catalyzed therapeutic activation
CA2298681C (en) Methods and compositions for overcoming resistance to biologic and chemotherapy
JP2003505466A5 (ja)
CA2378187C (en) Methods for treating therapy-resistant tumors
US6683061B1 (en) Enzyme catalyzed therapeutic activation
KR20020059340A (ko) 효소 촉매 항-감염 치료제
MXPA00006993A (es) Agentes terapeuticos catalizados por enzimas
EP1240922B1 (en) Methods and compositions for overcoming resistance to biologic and chemotherapy

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081228

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081228

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091228

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101228

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101228

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111228

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121228

Year of fee payment: 11

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131228

Year of fee payment: 12

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term