KR20020033743A - 펩티드 수용체 리게이션 방법 - Google Patents

펩티드 수용체 리게이션 방법 Download PDF

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KR20020033743A
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피터 로스
리차드 와그너
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추후기재
필로스 인코포레이티드
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Abstract

본원에는 펩티드 수용체를 RNA에 리게이션하기 위한 방법과 시약은 물론 RNA-펩티드 수용체 산물이 기재되어 있다.

Description

펩티드 수용체 리게이션 방법{PEPTIDE ACCEPTOR LIGATION METHODS}
현재 RNA-단백질 융합체(RNA-protein fusion)를 제조하기 위한 여러 방법들이 존재한다. RNA-단백질 융합체는 펩티드 수용체를 RNA 분자의 3' 말단에 부착한 후, 그 RNA를 시험관내(in vitro) 또는 제자리(in situ) 해독(translation)함으로써 생성된다. 그 산물은 자신을 암호하는 RNA의 3' 말단에 부착된 펩티드이다. 이러한 RNA-단백질 융합체들의 생산은, 부분적으로 또는 전적으로 랜덤한(partially or completely random) 아미노산 서열들의 거대한 풀(pool)로부터 목적하는 특성을 갖는 단백질들을 분리해내는 것을 용이하게 해줄 뿐만 아니라, RNA 코딩 서열을 그의 상응하는 단백질 분자에 공유결합시킴으로써 단백질 서열 정보를 회수 및 증폭하는 문제를 해결해 준다.
[발명의 요약]
본 발명은 RNA 분자에 펩티드 수용체를 부착하는 방법은 물론 RNA-펩티드 수용체 산물을 특징으로 한다. 이러한 방법은, 예를 들면 부분적으로 또는 전적으로 랜덤한 아미노산 또는 핵산 서열들의 거대한 풀로부터 목적하는 특성을 갖는 단백질들 또는 핵산들을 분리해내는데 사용될 수 있는 RNA-단백질 융합체의 생산을 용이하게 한다. 이러한 본 발명의 방법은 펩티드 수용체를 핵산 분자에 부착하기 위한 다양한 전략들에 의해 수행될 수 있다. 이러한 다양한 접근법들은 펩티드를 핵산에 부착함으로써 형성되는 결합(bond)의 유형과 그러한 부착을 달성하기 위해 사용되는 시약(reagent)에 있어서 서로 상이하다.
따라서, 첫번째 측면에 있어서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, RNA 분자에 펩티드 수용체를 부착하기 위한 방법을 특징으로 한다: 헤어핀 구조를 형성하는 3' 서열을 갖는 RNA 분자를 제공하는 단계; 핵산 링커(linker) 분자에 공유결합된 펩티드 수용체를 제공하는 단계; 및 펩티드 수용체와 RNA 분자 사이의 공유결합 형성을 허용하는 조건하에서 핵산 링커 분자에 RNA 분자를 혼성화시키는 단계.
두번째 측면에 있어서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, RNA 분자에 펩티드 수용체를 부착하기 위한 방법을 특징으로 한다: 헤어핀을 형성하는 5' 서열을 갖는 링커를 보유한 펩티드 수용체를 제공하는 단계; RNA 분자에 펩티드 수용체를 혼성화시키는 단계; 및 펩티드 수용체를 RNA에 공유결합시키는 단계.
세번째 측면에 있어서, 본 발명은 다음의 단계들에 의한, RNA 분자에 펩티드 수용체를 부착하기 위한 방법을 특징으로 한다: RNA 분자, 및 링커 분자에 공유결합된 펩티드 수용체를 제공하는 단계로서, 여기서 상기 링커 분자가 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 또는 다이디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트로 시작하는 단계; 및 RNA 분자 및 펩티드 수용체를 말단 디옥시뉴클레오티드 트랜스퍼라아제(terminal deoxynucleotidyl transferase)와 접촉시켜 펩티드 수용체를 RNA 분자에 공유결합시키는 단계.
네번째 측면에 있어서, 본 발명은 RNA 분자를 펩티드 수용체에 화학적으로 리게이션함으로써 RNA 분자에 펩티드 수용체를 부착하는 방법을 특징으로 한다.
이러한 측면의 일구현예에 있어서, 펩티드 수용체는 피소랄렌 단위체(psoralen moiety)에 연결되며, 그 피소랄렌 단위체를 통해 RNA 분자에 가교결합(crosslink)된다. 피소랄렌 단위체는, 그 자신이 펩티드 수용체에 부착되어 있는 링커 분자의 5' 또는 3' 말단에 부착되거나, 또는 링커 분자의 내부 위치에 위치할 수도 있다.
이러한 기술에 따르면, 펩티드 수용체는 UV 조사(irradiation)에 의해 RNA 분자에 가교결합된다. 이러한 특정 측면의 다른 구현예에 있어서, 피소랄렌은 C6 알킬쇄를 통해 펩티드 수용체에 부착되고/되거나 RNA 분자는 그의 3' 말단에 인접한 정지 코돈(stop codon)을 보유한다. 바람직하게, 링커의 길이는 25 내지 40 뉴클레오티드이다. 또한, 펩티드 수용체를 RNA 분자에 가교결합시키기에 앞서, RNA를 광절단성 단위체(photocleavable moiety)를 추가로 포함하는 링커에 혼성화시킬 수도 있다. 혼성화된 RNA는 이어서 광절단성 단위체를 통해 고체 지지체에 고정된다. 바람직하게, 광절단성 단위체는 비오틴(biotin)이다.
본 발명의 네번째 측면의 다른 구현예에 있어서, RNA 분자는기능성화(functionalize)된 후, 펩티드 수용체와 RNA 분자 간의 화학적 결합 형성을 허용하도록 적절하게 변형된 펩티드에 부착된다. 바람직하게, RNA 분자는 IO4 -산화에 의해 기능성화된다. 펩티드 수용체는 아민류, 하이드라진류, (티오)하이드라자이드류 및 (티오)세미카르바존류로 구성된 군에서 선택되는 한 분자를 펩티드 수용체에 부착함으로써 기능성화될 수 있다.
본 발명의 네번째 측면의 또다른 구현예에 있어서, 화학적 리게이션은 외부 주형(external template)의 부재하에 수행된다. 이와 달리, 화학적 리게이션 반응을 외부 주형의 존재하에 수행하는 것도 가능하다. 이러한 두번째 방법은 RNA 분자 및 펩티드 수용체의 링커 부분을 주형을 사용하여 정렬(align)함으로써, 주형의 5' 말단은 펩티드 수용체의 링커 영역에 혼성화하고 주형의 3' 말단은 RNA 분자에 혼성화하도록 하는 단계를 포함한다. 펩티드 수용체에 공유결합되어 있는 링커 분자 자신을 RNA 분자에 혼성화시킴으로써, RNA 분자의 펩티드 수용체에의 화학적 리게이션을 외부 주형의 부재하에 수행하는 것 또한 가능하다. 이러한 혼성화는 펩티드 수용체 및 RNA 분자를 리게이션을 위해 근접시킨다. 바람직하게, 작용기(functional group)는 펩티드 수용체의 링커 부분의 5' 말단에 있거나, 또는 작용기의 한쪽 측면에는 혼성화 영역이 측접하고 있고 다른 한쪽 측면에는 펩티드 수용체가 측접하고 있다.
본 발명의 네번째 측면의 또다른 구현예에 있어서, 펩티드 수용체의 RNA 분자에의 화학적 리게이션은 RNA의 환원성 아민화(reductive amination)를 통해 RNA분자에 작용기를 부착한 후, RNA 분자와 반응할 펩티드 수용체를 변형시키는 단계를 포함한다. 이어서, 상기 두 분자들은 공유결합의 형성을 통해 연결된다. 바람직하게, RNA 분자에 부착된 작용기는 티올, 말레이미드, 또는 아민이다.
다섯번째 측면에 있어서, 본 발명은 비공유결합을 통해 RNA 분자에 펩티드 수용체를 부착하는 방법을 특징으로 한다. 일구현예에 있어서, 부착은 펩티드 핵산(PNA: peptide nucleic acid)을 펩티드 수용체에 공유결합시키고, 그 펩티드 수용체를 PNA를 통해 RNA 분자에 비공유결합시킴으로써 달성된다. 이러한 구현예에 있어서, RNA 분자는 정지 코돈을 보유할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 펩티드 수용체에 화학적으로 또는 비공유적으로 리게이션된 RNA 분자들은 물론, 이러한 RNA 분자들의 전사 및 해독(그리고, 원한다면, 역전사 및/또는 증폭)에 의해 생성된 핵산-단백질 융합체들을 특징으로 한다. 일구현예에 있어서, 펩티드 수용체는 RNA 분자의 3' 말단에 리게이션된다.
또다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 RNA-펩티드 수용체를 이용하여 목적하는 단백질 또는 핵산을 선별(selection)하는 방법을 특징으로 한다. 상기 선별 기술은 RNA-단백질 융합체 형성 및 뒤이은 목적 단백질 또는 핵산의 선별에 현존하는 분자들을 활용한다. 선별은, 예를 들어 본원에 참고자료로 포함된 Szostak et al., WO 98/31700, 및 Szostak et al., U.S.S.N. 09/247,190에 개시된 접근법들 중 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
마지막 측면에서, 본 발명은 RNA-단백질 융합체를 생산하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 링커에 혼성화된 RNA 분자를 제공하는 단계로서, 상기 링커가 광절단성 단위체, 피소랄렌 단위체, 및 펩티드 수용체를 포함하는 단계; RNA를 비고정된 RNA가 지지체로부터 충분히 제거되는 조건하에서 고체 지지체에 고정하는 단계; 펩티드 수용체를 피소랄렌 단위체를 통해 RNA에 가교결합시키는 단계로서, 가교결합이 이루어짐과 동시에 가교결합된 RNA가 고체 지지체로부터 유리되는 단계; 및 가교결합된 RNA를 해독하여 RNA-단백질 융합체를 생성하는 단계. 일구현예에서, 상기 광절단성 단위체는 비오틴이다.
본 발명의 상술한 모든 측면들에 있어서, RNA 분자는 후보 단백질 코딩 서열에 작동가능하게 연결된, 해독 개시 서열 및 정지 코돈을 포함할 수 있다. 또한, 바람직한 펩티드 수용체는 퓨로마이신(puromycin)인데, 이것은 신장중인 펩티드쇄의 C-말단에 부가되어 해독을 종결시키는 뉴클레오시드 유사체(nucleoside analog)이다. 일구현예에서, 펩티드 수용체는 링커, 예를 들면 뉴클레오티드 링커에 부착된 퓨로마이신을 포함한다. 이러한 링커는 부착을 위해 펩티드 수용체를 RNA 분자에 대해 정렬시키는 것을 용이하게 한다. 바람직한 구현예에서, 펩티드 수용체의 링커 영역은 비-뉴클레오티드 단위체, 예를 들면 PEG를 포함한다. 다른 가능한 수용체는 RNA 3' 말단의 tRNA-유사 구조(tRNA-like structure)는 물론, 퓨로마이신과 유사한 방식으로 작용하는 다른 화합물들을 포함한다. 그러한 화합물에는, 제한 없이, 아미노산 뉴클레오티드, 페닐알라닐 아데노신(A-Phe), 티로실 아데노신(A-Tyr) 및 알라닐 아데노신(A-Ala)과 같은 아데닌 또는 아데닌-유사 화합물에 연결된 아미노산 뿐만 아니라, 페닐알라닐 3' 디옥시 3' 아미노 아데노신, 알라닐 3' 디옥시 3' 아미노 아데노신 및 티로실 3' 디옥시 3' 아미노 아데노신과 같은 아마이드-유사 구조를 소유한 임의의 화합물이 포함된다; 이러한 화합물들 중 임의의 것에 있어서, 자연발생적인 L-아미노산 또는 그들의 유사체들 중 임의의 것이 이용될 수 있다. 또한, 결합된 tRNA-유사 3' 구조-퓨로마이신 콘쥬게이트(combined tRNA-like 3' structure-puromycin conjugate) 역시 본 발명에 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 디자인에서는, DNA 서열이 메시지(message)의 말단과 펩티드 수용체 사이에 포함된다. 이러한 서열은 리보좀(ribosome)이 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 말단에서 휴지(pause)하도록 하여, 펩티드 수용체(예를 들어, 퓨로마이신)가 펩티드-tRNA 결합의 가수분해 이전에 신생(nascent) 펩티드 수용체를 수용할 추가의 시간을 제공한다. 시험관내(in vitro) 해독 동안에 리보좀은 또한 화학적 리게이션 부위, 특히 피소랄렌 가교결합 부위 또는 PNA 클램프(clamp) 부위에서 휴지할 수도 있다.
본 발명의 다른 바람직한 디자인에서는, 비-뉴클레오티드 링커 단위체가 펩티드 수용체에 연결된 뉴클레오티드 링커 대신에 사용될 수 있다. 이러한 디자인은 펩티드 수용체의 RNA 분자에의 리게이션을 촉진한다. 예를 들어, 링커는 트리에틸렌 글리콜 스페이서(spacer)를 함유할 수 있다. 링커는 또한 2'-OMe-RNA 포스포르아미다이트를 함유할 수도 있다. 혼성화가 화학적 또는 효소적 리게이션에 선행되어야 하는 일부 경우에는, 리게이션 부위 옆의 링커의 충분한 부위가 핵산으로 구성되어 있어야 한다.
나아가, 본 발명의 RNA 또는 링커는 정제, 예를 들면 RNA 또는 그러한 RNA 또는 링커로부터 형성된 RNA-단백질 융합체 분자의 친화성 정제(affinitypurification)에 사용하기 위한 서열을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 상술한 모든 측면들에 있어서, 펩티드 수용체에 부착된 RNA 분자는 시험관내(in vitro) 또는 제자리(in situ) 해독되어, RNA-단백질 융합체 분자를 생산할 수 있다. RNA-단백질 융합체 분자는 이어서, Szostak et al.(09/247,190)에 기재된 바와 같이 고염(high salt) 조건에서 인큐베이션되고/되거나 저온(예를 들면, -20℃에서 밤새)에서 인큐베이션된다. 또한, RNA-단백질 융합체 분자는 표준 폴리(A) 정제 기술을 사용하여 정제될 수 있다.
본원에서 사용될 때, "단백질"이란 하나 이상의 펩티드 결합에 의해 연결된, 임의의 둘 이상의 자연발생적인(naturally occuring) 또는 변형된(modified) 아미노산들을 의미한다. "단백질" 및 "펩티드"는 호환가능하게 사용된다.
"RNA"란 둘 이상의 공유결합된, 자연발생적인 또는 변형된 리보뉴클레오티드들의 서열을 의미한다. 이러한 용어에 포함된 변형된 RNA의 일례는 포스포르티오에이트(phosphorthioate) RNA이다.
"해독 개시 서열(translation initiation sequence)"이란 기능성 리보좀 도입부(entry site)를 제공할 수 있는 임의의 서열을 의미한다. 세균 시스템에서, 이 영역은 때로 샤인-달가노(Shine-Dalgano) 서열이라 불리운다.
"개시 코돈(start codon)"이란 단백질 코딩 서열의 시작(beginning)을 신호하는 세 염기들을 의미한다. "정지 코돈(stop codon)"이란 단백질 코딩 서열의 종결을 신호하는 세 염기들을 의미한다. 일반적으로, 개시 코돈은 AUG(또는 ATG)이고, 정지 코돈은 UAA(또는 TAA), UAG(또는 TAG), 또는 UGA(또는 TGA)이다; 하지만,출발 또는 정지 코돈으로 사용가능한 임의의 다른 염기 트리플렛(triplet)으로 치환될 수도 있다.
"공유결합된(covalently bonded)"이란 공유결합을 통해 직접적으로 또는 다른 공유결합된 서열(예를 들면, 휴지부위에 해당하는 DNA)을 통해 간접적으로 함께 결합되어 있음을 의미한다.
"비공유결합된(non-covalently bonded)"이란 공유결합 이외의 다른 방법에 의해 함께 결합되어 있음을 의미한다.
"헤어핀 구조(hairpin structure)"란 단일 핵산 가닥에 의해 형성된 이중-가닥 영역을 의미한다. 바람직하게 그러한 헤어핀 구조는 길이가 적어도 8 염기쌍이고, 보다 바람직하게는 길이가 8 내지 15 염기쌍이다.
"화학적 리게이션(chemical ligation)"이란 효소를 사용하지 않고 두 분자를 결합시킴을 의미한다. 화학적 리게이션은 비공유결합은 물론 공유결합을 초래할 수 있다.
"펩티드 수용체(peptide acceptor)"란 리보좀 펩티드 트랜스퍼라아제(ribosome peptidyl transferase) 기능의 촉매활성에 의해 신장중인 단백질쇄의 C-말단에 부가될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 대체로, 그러한 분자는 (i) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드-유사 단위체, 예를 들면 아데노신 또는 아데노신 유사체(N-6 아미노 위치에서의 다이메틸화가 허용가능하다), (ii) 20 D- 또는 L-아미노산, 또는 O-메틸 티로신 또는 Ellman et al.(Meth. Enzymol. 202:301, 1991)에 의해 개시된 유사체들 중 임의의 것을 포함하는 임의의 아미노산유사체, 및 (iii) 상기 둘 사이의 결합(예를 들면, 3' 위치, 또는 덜 바람직하게는 2' 위치에서의 에스테르, 아마이드 또는 케톤 결합)을 포함한다. 바람직하게, 이러한 결합은 링이 천연 리보뉴클레오티드 형태로 주름잡히는 것(pucker)을 심각하게 방해하지 않는다. 펩티드 수용체는 친핵체(nucleophile)도 가질 수 있는데, 상기 친핵체는, 제한 없이, 아미노기, 히드록시기, 또는 설프히드릴기일 수 있다. 또한, 펩티드 수용체는 뉴클레오티드 의사체(mimetics), 아미노산 의사체, 또는 결합된(combined) 뉴클레오티드-아미노산 구조의 의사체로 구성될 수 있다.
"링커(linker)" 또는 "링커 분자(linker molecule)"란 디옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 또는 그의 유사체를 포함하는 서열을 의미한다.
"기능성화시키다(functionalize)"란 작용기(functional group) 또는 기능성 단위체(functional moiety)의 부착을 초래하는 방식으로 변형시킴을 의미한다. 예를 들어, RNA 분자를 IO4 -산화 또는 아민화를 통해 기능성화시키거나, 또는 펩티드 수용체를 아민, 하이드라진, (티오)하이드라자이드, 또는 (티오)세미카르바존 기를 부착함으로써 기능성화시킬 수 있다.
"외부 주형(external template)"이란 리게이션 반응 혼합물에 첨가되긴 하지만 리게이션 반응의 최종 산물의 일부가 아닌 핵산 서열을 의미한다.
"고염(high salt)"이란 적어도 200mM, 바람직하게는 적어도 500mM 또는 심지어 1M 농도의 1가 양이온, 및/또는 적어도 25mM, 바람직하게는 적어도 50mM, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 100mM 농도의 2가 또는 더 높은 원자가(valence)의양이온이 존재함을 의미한다.
"친화성 정제 서열(affinity purification sequence)"이란 핵산 또는 핵산-단백질 융합 분자의 정제에 이용되는 핵산 서열을 의미한다. 예를 들어, 친화성 정제 서열은, 올리고-dT 셀룰로오스 상에서의 핵산 또는 융합 분자의 정제에 사용가능한 A8-20과 같은 폴리(A) 서열일 수 있다. 친화성 정제 서열은 또한 핵산-단백질 융합 분자를 정제하는데 사용되는 폴리펩티드 서열일 수도 있다. 다른 정제 기술의 예는 Szostak et al.의 U.S.S.N. 09/247,190에 기재되어 있다.
본 발명은 많은 이점들을 제공한다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법은, 일부 양상에 있어서, 외부 주형이 RNA와 펩티드 수용체를 함께 불러모을 필요없이 펩티드 수용체와 RNA 분자의 효율적인 리게이션을 촉진한다. 본 발명은 또한 RNA-단백질 융합체의 생산과 결부된 비용을 절감시킨다.
본 발명의 다른 특징들 및 이점들이 후술하는 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 자명해질 것이다.
포괄적으로, 본 발명은 특히 펩티드 수용체(peptide acceptor)를 핵산에 연결하기 위한 리게이션(ligation) 방법에 관한 것이다.
도 1은 헤어핀 주형 상에서 T4 DNA 리가아제를 사용하여 펩티드 수용체 링커를 RNA에 리게이션하는데 수반되는 예시적인 단계들의 개략도이다. RNA 3' 서열 또는 펩티드 수용체 링커가 헤어핀 구조를 형성하도록 고안되며, 펩티드 수용체 링커는 RNA에 혼성화하여 RNA와 펩티드 수용체를 서로 인접하게 만든다.
도 2는 말단 디옥시뉴클레오티드 트랜스퍼라아제(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 사용하여 펩티드 수용체 링커를 RNA에 리게이션하는데 수반되는 예시적인 단계들의 개략도이다.
도 3A는 하이드라자이드 및 세미카르바존 형성에 의한 RNA의 3' 변형에 수반되는 예시적인 단계들의 개략도이다.
도 3B는 환원성 아민화에 의한 RNA의 3' 변형에 수반되는 예시적인 단계들의 개략도이다.
도 4A-4D는 기능성화된 퓨로마이신 링커를 기능성화된 RNA에 화학적 리게이션하기 위한 예시적인 전략을 보여주는 일련의 다이어그램이다. 한 전략은 주형-독립적(도 4A)이다. 다른 전략들은 RNA와 퓨로마이신 링커를 정렬하기 위해 외부 올리고 주형을 사용한다. 외부 올리고 주형을 사용하는 전략에서, 그 올리고 주형은 RNA 및 퓨로마이신 링커 양자에 혼성화하거나(도 4B), 또는 퓨로마이신 링커에 부착된 후 RNA에 혼성화할 수 있다(도 4D). 또한, 퓨로마이신의 5' 말단(도 4B 및 4C) 또는 내부(도 4D)에 작용기가 위치할 수 있다.
도 5는 변형된 퓨로마이신 링커에 사용하기 위한 완전히 보호된 카보하이드라자이드 포스포르아미다이트의 합성에 수반되는 예시적인 단계들의 개략도이다.
도 6은 RNA의 3' 말단에 작용기를 부착한 다음 화학적 리게이션을 행함으로써 펩티드 수용체 링커를 RNA에 리게이션하는데 수반되는 예시적인 단계들의 개략도이다. 상기 작용기는 적절히 변형된 링커 분자와 반응하여 RNA 및 퓨로마이신 링커를 티올(A), 말레이미드(B) 또는 아민기(C)를 통해 공유결합시킬 수 있다.
도 7A-7C는 광가교결합에 의해 펩티드 수용체를 RNA에 리게이션하는데 수반되는 예시적인 단계들을 보여주는 일련의 개략도이다. 이러한 일반적인 방법에 있어서, 퓨로마이신 링커에 부착된 피소랄렌 단위체는 UV 조사에 노광시 퓨로마이신 링커를 RNA에 가교결합시킨다. 피소랄렌 단위체는 퓨로마이신 링커의 5' 말단(도 7A), 내부(도 7B) 또는 3' 말단(도 7C)에 위치할 수 있다.
도 7D는 광가교결합(photo-crosslink)) 형성에 사용되는 mRNA들의 개략도이다.
도 7E는 잠재적인 피소랄렌 삽입 부위(intercalation site)를 보여주는, mRNA의 불변(constant) 3'-서열(도 7D의 mRNA의 불변 영역)과 광링커(photolinker) 사이에 형성된 이중쇄(duplex)의 개략도이다. C6 알킬쇄를 통해 링커의 5'-포스페이트에 부착된 피소랄렌의 구조 또한 도시되어 있다. 변수 x와 y는 각각 링커 내에 있는 dA-뉴클레오티드와 트리에틸렌글리콜-유닛(TEG)의 수를 의미한다. 좌측에 있는 방사선 사진은 mRNA 1과 링커 B 사이의 광가교결합 반응물의 전기영동분석을 도시한 것이다.
도 7F는 시험관내 해독과 융합체 형성을 보여주는 겔 이미지이다. mRNA 주형 2 및 주형 3으로부터의 단백질 합성이 각각 레인 1과 3에 도시되어 있다. 링커 B에 광가교결합된 mRNA 주형의 해독은 mRNA-단백질 융합체를 생성하였다(레인 2 및4). 주형 3은 링커 가교결합-부위 다음에 정지 코돈을 지니고 있다. 레인 5는 올리고-dT 셀룰로오스 상에서 정제된 후의 융합 산물을 보여준다. 정지 코돈을 지닌 mRNA 분자를 이용한 융합체 형성의 개략도가 겔 이미지 위에 도시되어 있다.
도 7G는 mRNA-단백질 융합체 분자의 수율과 링커 조성 및 염 농도의 상관관계를 보여주는 겔 이미지이다.
도 7H는 mRNA와 광절단성 비오틴-기초 혼성화 링커(biotin-based hybridized linker)의 리게이션 및 뒤이은 융합체 형성에 수반되는 단계들의 개략도이다.
도 8A는 (PNA)2-RNA 삼중쇄(triplex) 형성을 통한 퓨로마이신 링커의 RNA에의 부착을 도시한 개략도이다. 퓨로마이신 링커는, RNA에 결합하여 강력한 비공유결합에 의해 삼중 나선을 형성하는 두 개의 PNA 분자들에 부착되어 있다.
도 8B는 PNA-링커 콘쥬게이트의 합성에 수반되는 단계들의 개략도이다. 링커는 고체 지지체에 부착되며 PNA에 부착되도록 변형된다. 이어서, PNA를 목적하는 링커에 커플링시킨 후, PNA-링커 분자를 탈보호시킨 다음 고체 지지체로부터 유리시킨다.
본원에는 펩티드 수용체를 RNA 분자에 부착하는 다양한 방법들이 개시되어 있다. RNA는 정상적인 세포 합성, 재조합 기술 및 화학적 합성을 포함하는 임의의 표준 접근법에 의해 생산될 수 있고, 제한 없이 세포 RNA, mRNA 도서관(library) 및 랜덤 합성 RNA 도서관을 포함한다. 펩티드 수용체(예를 들어, 퓨로마이신)는 대체로 DNA 또는 RNA 링커에 결합된다. 그러한 펩티드 수용체 분자는 임의의 표준기술, 예를 들면 Roberts and Szostak(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297, 1997), Szostak et al.(WO 98/31700), 및 Szostak et al., U.S.S.N. 09/247,190에 개시된 기술들을 사용하여 생산될 수 있다. 이하, 본 발명의 각 방법을 수행하기 위한 기술들을 개개의 실시예들에 의해 상세히 설명한다. 이러한 실시예들은 본 발명을 설명하기 위해 제공되는 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
우선 도면을 간단히 설명한다.
실시예 1: 헤어핀 주형 상에서 T4 DNA 리가아제를 이용한 효소적 리게이션 방법
본 발명에 따른 한 특정한 접근법에서는, 예를 들면 도 1에 도시된 바와 같이 헤어핀-함유 주형을 사용하여 펩티드 수용체를 RNA 분자에 부착하는데 T4 DNA 리가아제가 사용된다. 리게이션 반응은 자가-주형(self-templating) 방식으로 수행되며, 스플린트 올리고(splint oligo)를 사용하지 않는다. RNA 3' 서열 또는 펩티드 수용체의 링커 영역의 5' 말단은 헤어핀 구조를 형성하도록 고안된다. 헤어핀 구조 내에서 펩티드 수용체의 링커 영역의 5' 말단과 RNA의 3' 말단의 밀접한 배치(close positioning)는, 예를 들면 Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989에 기술된 것과 같은 T4 DNA 리가아제를 이용한 효소적 리게이션을 촉진한다. 반응물의 비율은 약 1:1이나, 둘 중 어느 한 반응물이 약간 과량(1:1.2)으로 사용되는 것도 허용가능하다. 최적의 리게이션 조건은 반응마다 조금씩 다를 수 있으며, 당업계의 숙련가에게 공지된 기술들을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다.
실시예 2: 말단 트랜스퍼라아제를 이용한 효소적 리게이션 방법
펩티드 수용체를 RNA 분자에 부착하기 위한 다른 효소적 방법은, 예를 들면 도 2에 도시된 바와 같이, RNA의 3' 말단을 변형시킨 다음 말단 디옥시뉴클레오티드 트랜스퍼라아제를 사용하여 리게이션하는 단계를 수반한다. TdT 반응은 Sambrook, Fritsch & Maniatis(상동)에 개괄적으로 기재된 바와 같이 수행된다. 이 효소는 핵산의 3' 말단을 디옥시-(또는 다이디옥시-) 뉴클레오티드 트리포스페이트를 사용하여 신장시킨다. 이러한 (d/dd)NTP들은 목적하는 링커 구조물을 지니도록 그들의 염기 단위체 부분이 화학적으로 변형될 수 있다(예를 들면, Meyer, Methods in Molecular Biology, Agrawal, ed., vol 26, Totowa: Humana Press, 1994, pages 73-91; Kumar et al., Anal. Biochem. 169:376, 1988; Riley et al., DNA 5:333, 1986; 및 Schmitz et al., Anal. Biochem. 192:222, 1991에 기술된 바와 같이). 도 2에 도시된 바와 같이, 링커 분자는 (d/dd)NTP로 시작돼야 한다. 그러나, 링커 조성의 나머지는 다양할 수 있다. 이러한 말단 트랜스퍼라아제 리게이션 방법의 특별한 특징은 펩티드 수용체의 DNA 링커 영역이 한개의 (d/dd)NTP 유닛 정도로 짧아질 수 있다는 것이다.
실시예 3: IO 4 - 산화에 의한 RNA의 3' 말단의 기능성화 및 화학적 리게이션을 수반하는 화학적 리게이션 방법
본 발명의 방법에 따르면, 도 3에 도시된 바와 같이, RNA의 3' 말단을 IO4 -산화에 의해 기능성화한 다음 펩티드 수용체를 RNA에 화학적 리게이션함으로써 펩티드 수용체를 RNA 분자에 부착하는 것도 가능하다. IO4 -산화는 후술하는 바와 같이, 그리고 Agrawal(Methods in Molecular Biology, Agrawal, ed., vol 26, Totowa: Human Press, 1994, pp. 93-120); Proudnikov and Mirzabekov, Nucleic Acids Res., 24:4535, 1996; Gosh et al., Anal. Biochem., 178:43, 1989; Bauman et al., J. Histochem. Cytochem., 29:227, 1981; 및 Wu et al., Nucleic Acids Res., 24:3472, 1996)의 방법들에 따라 수행된다. IO4 -산화 단계는 반응에 1,2-디올을 반드시 필요로 하므로, 말단 뉴클레오티드만이 변형되고, RNA 분자의 내부 잔기들은 영향받지 않은 채로 유지된다. 결과되는 다이알데하이드는 아민류, 하이드라진류, 카보(티오)하이드라자이드류 또는 (티오)세미카르바자이드류와 같은 다양한 친핵체들과의 반응을 거쳐 쉬프 염기-유사 구조(Schiff base-like structure)를 형성할 수 있다. 이러한 반응은, 예를 들면 Agrawal(상동); Proudnikov and Mirzabekov(상동); Gosh et al.(상동); Bauman et al.(상동); 및 Wu et al.(상동)에 개시된 바와 같이 수행된다. 각각 카보(티오)하이드라자이드류 및 (티오)세미카르바자이드류와의 반응 후에 수득되는 (티오)하이드라자이드류 및 (티오)세미카르바존류가 상당히 안정하기는 하지만, 아민류 또는 하이드라진류를 함유하는 초기부가물(adduct)들은 새로 형성된 결합을 가수분해에 대해 안정하게 만들기 위해서 대체로, 도 3에 도시되고 Agrawal(상동); Proudnikov and Mirzabekov(상동); Gosh et al.(상동); Bauman et al.(상동); 및 Wu et al.(상동)에 개시된 바와 같은 환원성 아민화와 같은 후속 환원 단계를 요구한다.
상술한 커플링 반응은 도 4A-4D에 도시된 바와 같은 다수의 상이한 전략들을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 리게이션은 도 4A에 도시된 바와 같은 주형-독립적 방식으로 수행가능하다. 이 전략은 RNA 분자에의 성공적인 리게이션을 달성하기 위해서는 상당히 과량의(예를 들면, 100 내지 1000-배 과량의) 변형된 펩티드 수용체를 필요로 한다. RNA 리게이션의 효율을 증가시키기 위해, 도 4B에 도시된 바와 같이 외부 주형 올리고가 기질 정렬(substrate alignment)에 사용될 수 있다. 그러한 올리고는 서열 면에서 RNA와 펩티드 수용체 링커 서열에 상보적인데, 바람직하게 그 길이는 적어도 약 10 뉴클레오티드이다. 전형적으로, 이러한 올리고는 RNA 분자에 상보적인 적어도 약 10 뉴클레오티드와 펩티드 수용체 링커에 상보적인 약 10 뉴클레오티드를 포함할 것이다. 이와 달리, 도 4C-4D에 도시된 바와 같이, 링커와 RNA 영역의 직접적인 혼성화에 의해 반응성 부위(reactive site)들이 서로 인접하게 될 수도 있다. 여기서, 혼성화하는 서열의 범위는 최소한 10 내지 15 뉴클레오티드이다.
가교결합을 통해 펩티드 수용체를 RNA에 부착하기 위한 다양한 컨스트럭트(construct)들이 이용가능하다. 예를 들면, 한 컨스트럭트 유형의 예는 도 4A-4C에 도시된 바와 같이 5' 말단이 변형된 링커에 부착된 펩티드 수용체를 포함한다. 다른 컨스트럭트는 한쪽에는 혼성화 영역이 측접하고 있고 다른 한쪽에는 퓨로마이신-링커 영역이 측접하고 있는 내부 작용기(internal functional group)를 포함할 수 있다(도 4D).
이러한 변형된 링커의 합성은 뉴클레오티드 또는 스페이서 단위체의 본체(main body)를 조립하기 위한 상업적으로 입수가능한 포스포르아미다이트(Geln Research, Sterling, VA)를 사용한 표준 자동 DNA 합성을 수반한다. 3' 퓨로마이신은 합성을 위한 고체 지지체로서 퓨로마이신-CPG(Glen Research, Sterling, VA)를 사용함으로써 도입될 수 있다. 반응성 작용기의 부착은 아미노 말단-변형제(Glen Research, Sterling, VA) 또는 유니-링크(uni-link) 아미노 변형제(Clontech, Palo Alto, CA)를 사용하여 달성될 수 있다. 다른 작용기들은 적절한 포스포르아미다이트를 사용하여 도입될 수 있다. 카보하이드라자이드 포스포르아미다이트를 생산하기 위한 방법의 일례가 도 5A에 도시되어 있다. 카보하이드라자이드 포스포르아미다이트는 락톤을 하이드라진 및 메탄올과 혼합한 다음 상기 반응물들을 2시간 동안 환류시켜 카보하이드라자이드 단위체가 생성되도록 함으로써 생산되었다. 이러한 합성 단계의 수율은 97% 이었다. 결과되는 산물은 이어서 디메톡시트리틸기의 염 및 피리딘/톨루엔과 함께 실온에서 2.5 시간 동안 반응되어, 보호된 카보하이드라자이드 단위체를 생성하였다. 이 단계의 생산 수율은 88% 이었다. 이 산물은 테트라하이드로퓨란 및 디이소프로필아민의 존재하에 실온에서 30분 동안 포스포르아미다이트 단위체와 반응되었으며, 그 결과 완전히 보호된 카보하이드라자이드 포스포르아미다이트 반응 산물이 생성되었다(수율 72%).
나아가, IO4 -산화된 RNA에 대한 펩티드 수용체의 반응성은 다수 카피의 작용기들을 도입함으로써 더욱 향상될 수 있다.
한 가지 예시적인 리게이션 반응이 다음과 같이 수행되었다. 5' G GGA CAA UUA CUA UUU ACA AUU ACA AUG GAC UAC AAG GAC GAU GAC GAU AAG GGC GGC UGG UCC CAC CCC CAG UUC GAG AAG GCA UCC GCU(서열 1)의 서열을 갖는, 플래그 에피톱(flag epitope)을 코딩하는 전사체(transcript) 및 스트렙 태그(strep tag)로 구성된 RNA 1몰을 500mM NaOAc(pH 5.2) 20㎕ 및 5mM NaIO410㎕와 함께 혼합한 다음, 물을 사용해 최종 부피를 100㎕로 맞추었다. 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 10mM Na2SO310㎕를 첨가하고, 반응혼합물을 다시 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 1M 인산염 완충액(pH 8.0) 40㎕, 5' X CGC GGA TGC AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CC Pu(서열 2)(여기서, X는 유니-링크 아미노 변형제[Clontech]이고, Pu는 퓨로마이신-CPG[Glen Research]임)의 서열을 갖는 펩티드 수용체 링커 Uni-A1/8 1.5mole, 및 NaCNBH320㎕를 반응 혼합물에 첨가하였다. 이어서 상기 혼합물을 실온에서 18 시간 동안 인큐베이션한 후 침전시킨 다음, 6% TBE-우레아 겔 상에서 정제하고, 밤새 크러쉬-소우크(crush-soak)하여 RNA-단백질 융합체 분자를 수득하였다. 이러한 반응은 230pmole의 산물을 생성하였다.
실시예 4: RNA 분자 3' 말단에의 작용기의 부착 및 화학적 리게이션을 수반하는 화학적 리게이션 방법
펩티드 수용체는 또한, 도 6에 도시된 바와 같이, RNA 분자의 3' 말단에 작용기를 부착한 다음 화학적 리게이션을 행함으로써 RNA 분자에 부착될 수 있다. 상술한 과정들의 변형예에서, 환원성 아민화 및 관련 반응들이 RNA의 3' 말단에 작용기를 부착하는데 이용된다. 새로 도입된 이러한 작용기는 펩티드 수용체 상의 적절하게 변형된 링커와 반응하여, RNA와 펩티드 수용체 간의 공유결합 형성을 초래한다. 반응성 기들의 예에는 티올류(이황결합 형성, 또는 피리딜 다이설파이드류와 같은 친티올성(thiolphilic) 시약과의 반응의 경우; 도 6, 반응 A) 또는 말레이미드류(도 6, 반응 B)가 포함된다.
펩티드 수용체의 부착이 뒤따르는 RNA 3' 말단의 기능성화에 이용가능한 다른 반응성 기는 아민류이다. 예를 들어, N-하이드록시숙신이미드-에스테르류(NHS-esters)가, 다이숙신이미딜 글루타레이트(DSG) 또는 Cox et al.(J. Immunol. 145:1719, 1990) 및 http://www.piercenet.com/Products/linksearch.cfm(Pierce, Rockford, IL; Figure 6, Reaction C)에 개시된 바와 같은 관련 시약들과의 반응에 의해 펩티드 수용체의 5' 아미노-변형 링커 상에서 생성될 수 있다. 이러한 변형된 링커는 이어서 변형된 RNA의 아미노 작용기와 반응될 수 있다.
이러한 유형의 리게이션 반응은 상술한 바와 같이 동일한 일반적인 접근법들을 이용하여 외부 주형-독립적 또는 -의존적 방식으로 수행될 수 있다.
실시예 5: 광화학적 방법을 수반하는 화학적 리게이션 방법
펩티드 수용체는 또한 도 7A-7H에 도시된 바와 같은 광화학적 방법을 이용하여 RNA 분자에 부착될 수도 있다. 피소랄렌 기를 지닌 펩티드 수용체 링커 분자는 장파장 UV-광의 조사시 상보성 RNA 가닥들에 광가교결합이 도입되게 한다. 이러한 기술은 대체로 Pieles and Englisch(Nucleic Acids Res. 17:285, 1989); 및 Godard et al.(Nucleic Acids Res. 22:4789, 1994)에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 펩티드 수용체의 링커 영역의 5' 말단에 피소랄렌 단위체를 부착하는 일은 표준 DNA 합성기 상에서 상업적으로 입수가능한 피소랄렌 아미다이트류, 2'-OMe-RNA 포스포르아미다이트류, 피소랄렌 C6 포스포르아미다이트류, 및 트리에틸렌 글리콜(TEG) 포스포르아미다이트류(Glen Research, Sterling, VA)를 사용하여 달성가능하다.
한 가지 예시적인 접근법에서, 이러한 방법은 다음과 같이 수행되었다. 5' G GGA CAA UUA CUA UUU ACA AUU ACA AUG GAC UAC AAG GAC GAU GAC GAU AAG GGC GGC UGG UCC CAC CCC CAG UUC GAG AAG AAC GGC UAU A(서열 3)의 서열을 갖는, 플래그 에피톱(flag epitope)을 코딩하는 RNA 전사체(transcript), 스트렙 태그(strep tag) 및 광가교 타겟 부위로 구성된 RNA 1몰, 제조업자의 표준 프로토콜에 따라 합성된 5' Pso TAG CCG TTC T AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CC Pu(서열 4)(여기서, Pso는 피소랄렌 C2 아미다이트[Glen Research]이고, Pu는 퓨로마이신-CPG(Glen Research]임)의 서열로 구성된 포토링커(Photolinker) 30/10 또는 5' Pso TAG CCG TTC TTC TCG AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CC Pu(서열 5)(여기서, Pso는 피소랄렌 C2 아미다이트이고, Pu는 퓨로마이신-CPG임)의 서열로 구성된 포토링커 30/15 1.2nmol, 10×완충액(250mM Tris pH 7.0; 1M NaCl), 및 물(최종 부피를 360㎕로 맞추기 위한)을 혼합한 다음, 80℃에서 2분간 가열하였다. 이어서, 반응혼합물을 실온으로 서냉시켰다. 그런 다음, 반응 혼합물을, 마이크로센트리퓨즈 튜브(microcentrifuge tube)에 들은 시료를 침수 웰(immersion well)에 붙들어 매어 얼음물에서 냉각시키면서, 석영 침수 웰(AGE Glass, cat. no. 7854-25) 내에 파이렉스 흡광 슬리브(AGE Glass, cat. no. 7835-44)를 구비한 450W 침수 램프(medium pressure; AGE Glass, cat. no. 7825-34)를 사용하여 310nm 이상의 파장(λ)으로 0℃에서 15분간 조사하였다. 이어서, 시료를 3M NaOAc 40㎕ 및 에탄올 1000㎕를 사용하여 침전시킨 다음, 75㎕의 물에 재현탁하였다. 그 후, 시료에 2× 로딩 버퍼(Novex)를 75㎕ 첨가하고, 프리캐스트(precast) 6% TBE-우레아 겔(Novex) 상에서 정제하였다. 크러쉬 앤드 소우크(crush and soak) 방법(0.3M NaOAc, 실온에서 하룻밤)으로 산물을 회수한 다음, 에탄올 침전을 행하였다. 이러한 광가교결합 방법은 포토링커 10/30을 사용한 경우에는 272 pmole의 RNA-단백질 융합 산물을, 그리고 포토링커 15/30을 사용한 경우에는 227 pmole의 산물을 생성하였다.
이러한 광가교결합 방식의 화학적 리게이션의 경우, 다양한 반응 파라미터들이 평가되었다. 첫째, 광가교결합 형성의 염 의존성이 시험되었다. 일련의 광가교결합 시험들이 100~1000mM NaCl을 함유하는 완충액들을 사용하여 수행되었다. 다양한 반응들 간에 리게이션 효율의 차이가 관찰되지 않았다. 또한, RNA 타겟 서열의 5' GAC UAC AAG GAC GAG GCAUCC GCU CUU UCA CUAUA(서열 6)으로의 변화는 현저한 생산 수율 감소(15 내지 20% 감소)를 초래함으로써, RNA 타겟 서열이 중요함을 암시하였다. 다음으로, 반응 중에 불활성화된 피소랄렌 링커를 반복적으로 교체해줌으로써 생산 수율이 증가될 수 있는 것으로 확인되었다. 이러한 실험은 다음과 같이 수행되었다. RNA, 링커, 및 10× 완충액을 혼합한 다음, 80℃까지 2분 동안 가열하였다. 이어서, 반응혼합물을 실온으로 서냉시킨 다음, 상술한 바와 같이 광조사하였다. 그런 다음, 1nmole의 추가 링커와 1㎕의 완충액을 첨가하였다. 링커를 RNA에 어닐링(annealing)시킨 다음, 광조사하였다. 이러한 과정을 2nmole의 링커와 2㎕의 완충액을 첨가한 후 광조사함으로써 반복하였다. 이러한 과정은 적게는 20%에서 어떤 서열의 경우에는 40% 이상까지 생산 수율을 증가시켰다.
광화학적 가교결합 방법으로 생산된 리게이션 산물의 성능 또한 평가되었다. 상이한 길이(피소랄렌 더하기 타겟 혼성화 영역의 15 염기쌍 더하기 dAnCCPu[여기서, n=7, 12, 17 또는 22])의 링커들을 사용한 실험에서, 다음과 같은 사실이 관찰되었다. 긴 링커는 고염 조건(500mM KCl 더하기 50mM MgCl2) 하에서 가장 높은 RNA-단백질 융합 수율을 나타내었다. 감소된 염(250mM KCl 더하기 10mM MgCl2, 또는 250mM KCl)을 함유한 완충액 내에서는, 짧은 링커가 긴 링커보다 더 높은 수율을 나타내었으나, 전반적인 수율은 대체로 더 낮았다. 대체로, 수율은 효소적으로 리게이션된 RNA 주형을 사용하여 얻어진 수율에 필적하는 것으로 보인다.
다른 예시적인 방법에서, 다양한 mRNA 및 퓨로마이신 링커들이, 펩티드 수용체가 상기 링커의 3' 말단에 위치하도록 합성되었다. 링커들을 타겟 mRNA에 어닐링한 다음, 시험관내 해독 기술을 사용하여, mRNA-단백질 융합 분자를 형성하는데 있어서 그들의 효율에 대하여 평가하였다. 링커 길이와 조성이 융합 분자 수율에 미치는 효과 또한 결정되었다.
도 7D는 가교결합 반응에 사용된 mRNA의 디자인을 보여준다. 각 RNA 분자는, 양호한 개시 코돈 컨텍스트(Gallie et al., Nucleic Acids Res., 16:883-93, 1988; 및 Kozak, Microbiol. Rev., 47:1-45, 1983)를 갖는 담배 모자이크 바이러스 5'-UTR(TMV)의 일부, 및 해독 개시 코돈(AUG)을 함유한다. 모든 mRNA들은 또한 아미노산 서열 ASA를 코딩하는 3'-말단 10 뉴클레오티드 링커 혼성화 서열 5' GCAUCCGCUAUU을 지니며, Sinden and Hagerman(Biochemistry, 23:6299-6303, 198) 및 Gamper et al.(Photochem, Photobiol., 40:29-34, 1984)에 기술된 바와 같이, 피소랄렌 광가교결합을 위한 다이뉴클레오티드 서열 5'-UA(const.)로 끝난다. 게다가, 한 mRNA(mRNA 1)는, Strep-Tag II 서열, WSHPQFEK(Schmidt et al., J. Mol. Biol., 255:753-66, 1996)가 후행하는 플래그 에피톱, DYKDDDDK(Hopp et al., Biotechnology, 6:1205-1210, 1988)을 함유한다. 다른 mRNA 분자들(mRNAs 2, 3, 및 4)은, Bedzyk et al.(J. Biol. Chem., 265:18615-20, 1990) 및 Mallender et al.(J. Biol. Chem., 271:5338-46, 1996)에 개시된 것과 같은, 4-4-20 scFv, 항-플루오레신 단일쇄 항체 주형을 함유한다. 아울러, mRNAs 3 및 4는 잔여 비-가교결합된 주형(residual un-crosslinked template)의 해독 후에 mRNA를 리보좀으로부터 유리시키는 하류 정지 코돈을 포함한다(하기 참조). mRNA 4에는 올리고-dT를 사용한 정제를 위해 폴리 A-꼬리도 부착되었다.
이러한 연구들에 사용된 mRNA들(도 7D)은, Milligan et al.(Nucleic Acids Res., 15:8783-8798, 1987)의 방법에 따라 PCR DNA 주형의 T7 RNA 폴리메라아제 런-오프 전사(Megashortscript Transcription Kit, Ambion, TX)에 의해 제조되었다. 전사 후에, 모든 RNA들은 6% TBE-우레아 폴리아크릴아마이드 겔(Novex, CA) 상에서의 전기영동에 의해 정제되었다. 생성물 밴드를 UV-전조(shadowing)에 의해 가시화한 다음, 절단해내어 부순 후, 0.3M NaOAC 내에 담가두었다. 에탄올 침전 후에, RNA를 재현탁한 후, H2O 내에 보관하였다. 방사성표지된 RNA는 전사 완충액 내에 [α-32P]UTP(Amersham, IL)를 포함시킴으로써 동일한 과정에 따라 합성되었다.
이러한 연구에 사용된 퓨로마이신-링커들(도 7E)은 Expidite Systhesizer Model 8909(PerSeptive Biosystems, MA)를 사용하여 통상의 고체-지지체 포스포르아미다이트 화학에 따라 제조되었다. 퓨로마이신-CPG, DNA 포스포르아미다이트, 2'-OMe-RNA 포스포르아미다이트, 피소랄렌 C6 포스포르아미다이트, 및 트리에틸렌 글리콜(TEG) 포스포르아미다이트는 권장된 프로토콜(Glen Research)에 따라 사용되었다. 피소랄렌 단위체는 C6 알킬쇄를 통해 링커의 5-포스페이트에 부착되었다. 유연한(flexible) 트리에틸렌글리콜 포스페이트(TEG) 스페이서 및 다양한 길이의 폴리뉴클레오티드 서열들이 5'-dCdC-퓨로마이신을 3' 말단에 묶어두는데 사용되었다(도 7E의 표 참조). 가지(stem) 구조의 짝짓기 안정성(pairing stability)을 증가시키기 위해, 링커 혼성화 서열이 2'-OMe-RNA 포스포르아미다이트로부터 제조되었다(Inoue et al., Nucleic Acids Res., 15:6131-6148; 및 Majlessi et al.,Nucleic Acids Res., 26:2224-2229, 1998). 농축된 수산화암모늄 내에서 55℃에서 8시간 동안 탈보호시킨 후, C18 Spheri-5 컬럼(Perkin Elmer, CA) 상에서 역상 HPLC에 의해 정제하였으며, 이때 완충액 A로는 5% v/v 아세토나이트릴 내의 50mM 트리에틸암모늄 아세테이트를, 그리고 완충액 B로는 70% v/v 아세토나이트릴 내의 50mM 트리에틸암모늄 아세테이트를 사용하였고, 유속은 1.5ml/min으로 하였다. 용출은 15~60% 완충액 B의 선형 구배(linear gradient)를 이용하여 45분에 걸쳐 이루어졌다. 건조 후, 링커를 재현탁하고 H2O 내에 보관하였다.
링커(5μM)를 타겟 mRNA(2.5μM)와 함께 25mM Tris HCl 완충액, pH 7, 및 100mM NaCl 내에서 30초간 85℃로 가열한 후, 5분에 결쳐 4℃로 서냉시킴으로써 타겟 mRNA에 어닐링시켰다. 상기 반응 혼합물은 장파장(파장 λ>300nm)으로 조정된 핸드 헬드(handheld) 다파장 UV 램프 모델 UVGL-25(UVP, CA)를 사용하여 실온에서 보로실리케이트 유리 바이알(Kimble/Kontes, NJ) 내에서 15분간 조사되었다. 방사성표지된 mRNA 1과 링커 B 간의 광가교결합 반응의 생성물 혼합물을 변성 6% TBE-우레아 겔(Novex) 상에서 분리하고, 포스포이미징 시스템(phosphorimaging system, Molecular Dynamics, CA)을 사용하여 가시화하였다(도 7E). 이러한 광가교결합 생성물 혼합물은 대체로 <20% 비반응 mRNA와 >80% 광가교결합된 mRNA를 함유하고 있었으며, 별도의 정제없이 시험관내 해독 및 그에 이은 mRNA-단백질 융합체 형성에 곧바로 사용되었다. 더 긴 mRNA 기질 2, 3 및 4(>800 뉴클레오티드)의 경우에는, mRNA와 가교결합된 mRNA 간의 상대적인 크기 차이가 너무 작아서 겔 상에서 분리하는 것이 불가능하였다. 이러한 경우에는, 미정제(crude) 광가교결합 반응 혼합물을 추가의 정제없이 곧바로 융합체 형성용 용해질(lysate)에 첨가하였다.
해독 및 mRNA 융합 분자 형성은 우선 mRNA 2를 사용하여 다음과 같은 실험에 의해 시험되었다. 시험관내 해독 반응은 토끼 망상적혈구 용해질(Ambion)을 사용하여 30℃에서 30분간 수행되었다. 상기 반응액은 총 300㎕ 부피 내에 광가교결합된 mRNA(상기 참조) 100pmole, 10mM 크레아틴 포스페이트, 150mM KOAc, 0.5mM MgCl2, 메티오닌을 제외한 각 아미노산 0.1mM, 150μCi [35S]메티오닌(Amersham) 및 67% v/v 용해질을 함유하였다. mRNA-단백질 융합체 형성은 Roberts & Szostak 및 Szostak et al.(상동)의 방법에 따라, 500㎕ 부피 내에 각각 590mM와 50mM의 KCl과 MgCl2를 첨가함으로써 촉진되었다. 인큐베이션은 20℃에서 60분간 수행되었다. 융합체 형성의 염 의존성을 알아보기 위해 KCl과 MgCl2의 농도를 달리하면서도 시험해보았다.
시험관내 해독 산물은 상기 용해질을 10ml의 결합 완충액(100mM Tris HCl, pH 8.0, 10mM EDTA, 1M NaCl, 0.25% v/v Triton X-100)에 희석한 후, 그 혼합물에 올리고-dT 셀룰로오스 타입 7(Pharmacia, NJ)을 첨가함으로써 분리되었다. 시료들을 4℃에서 60분간 회전시켰다. 이어서, 고체 지지체를 5ml의 아이스-콜드(ice-cold) 결합 완충액으로 세척하고, 탈이온수 100㎕로 용출하였다. 분리된 mRNA-단백질 융합체의 양은 도입된 [35S] 메티오닌을 섬광계수(scintillation counting)함으로써 측정되었다. 상기 생성물을 MES 런닝 버퍼(Novex)를 사용하여 4~12% NuPage 겔 상에서 전기영동하여 분석하였다. 겔을 세척하여 과량의 [35S] 메티오닌을 제거한 다음 건조시키고, 포스포이미징 시스템(Molecular Dynamics) 상에서 가시화하였다.
겔 분석은 펩티드-tRNA와 유리 펩티드(도 7F, 레인 1)에 해당하는 두 개의 밴드를 나타내었다. 광가교결합된 mRNA 2를 사용하여 해독을 수행한 경우, 이동성이 더 느린 제 3의 밴드가 나타났는데, 이는 성공적인 mRNA-단백질 융합체 형성을 시사하는 것이다(도 7F, 레인 2). mRNA 3를 사용한 경우 유리 단백질과 융합체의 수율이 증가하였는데(약 20% 이상), mRNA 3는 코딩 서열에 있어서는 mRNA 2와 동일하나, 광가교결합 부위 하류에 정지 코돈을 가지고 있다(도 7F, 레인 3 및 4). 상대적인 밴드 세기는 합성된 단백질 총량의 30%가 mRNA-단백질 융합체로 전환되었음을 시사하였다(도 7F, 레인 4).
도 7E의 mRNA 4로부터 제조된 mRNA-scFv 융합 분자가, Roberts & Szostak 및 Szostak et al.(상동)의 방법에 따라, A18링커 영역을 올리고-dT 셀룰로오스에 결합시킨 다음 결합 완충액으로 세척함으로써 정제되었다(도 7E, 레인 5). 융합 산물을 광가교결합된 입력(input) mRNA의 양 대비 1.3%의 수율로 분리할 수 있었다. 광가교결합된 mRNA로부터 제조된 융합체의 물리적 특성(겔 이동성, 올리고-dT 셀룰로오스에의 결합, 친화성 시약에 대한 선택적인 펩티드 결합)은 효소적으로 리게이션된 mRNA 주형으로부터 수득된 융합 산물과 동일한 것으로 확인되었다.
융합 분자의 펩티드 영역의 조성을 확인하기 위해, 도 7E의 링커 B에 가교결합된, 플래그 및 스트렙-태그 II 에피톱을 코딩하는 mRNA 주형 1로부터 제조된 융합체를 단백질 결합에 대해 시험하였다.35S-표지된 mRNA-펩티드 융합체 용액(mRNA 1과 링커 B로부터 제조된) 10㎕를 50mM Tris HCl, pH 7.4, 1% NP 40, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM Na3VO4및 1mM NaF를 함유하는 완충액 300㎕ 내의 Anti-Flag M2 Affinity Gel(Sigma, MO) 20㎕에 첨가하였다. 두 번째 침강 실험이 동일한 융합 산물을, 100mM Tris HCl, pH 7.1, 1mM EDTA 및 0.5mg/ml 효모 tRNA를 함유하는 완충액 300㎕ 내의 StrepTactin Sepharose(Genosys, TX) 20㎕에 첨가함으로써 수행되었다. 두 침강 혼합물을 동일한 조건하에 다음과 같이 동시에 처리하였다: 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 회전시킨 다음, Ultrafree-MC 필터 유닛(0.45μm; Millipore, MA)상으로 전이시켰다. 완충액을 원심분리로 제거한 다음, 잔여물을 5×300㎕ 아이스-콜드 완충액으로 세척하였다. 상기 잔여물을 섬광계수법으로 분석하여, 융합체 결합이 Anti-Flag M2 매트릭스 및 StrepTactin 매트릭스에 대하여 각각 54%와 62%임을 확인하였다. 단백질-A 아가로오스(Sigma)를 사용한 대조 반응에서는 매트릭스에 대한 결합이 검출되지 않았다.
다양한 염 농도 조건하에서 링커의 길이 및 조성이 융합체 형성에 미치는 효과를 조사하기 위해, mRNA 3을 도 7E의 링커 A-F에 광가교결합시킨 다음, 각 주형을 융합체 형성에 대해 시험하였다(도 7G). 30℃에서 30분간 인큐베이션한 후에, 시료를 분주하고, 다양한 양의 KCl 및 MgCl2를 첨가하였다. 시료를 20℃에서 60분간 인큐베이션한 다음, 융합 산물을 겔 전기영동으로 분석하였다. 가장 높은 mRNA-단백질 융합 수율은 고염 조건하에서 긴 링커 A 및 B(각각 40 및 35 뉴클레오티드)를 사용하여 얻어졌다. 더 낮은 염 농도는 링커 A와 B를 이용한 융합체 형성에 있어 현저한 저하를 초래하였다. 한편, 더 짧은 링커 C 내지 F의 경우 융합 수율은 염 농도에 덜 의존적이었다. 또한, 융합 분자 수율은 대체로 유연성 TEG 스페이서의 수에 따라 증가하였다. 미정제 mRNA-단백질 융합 분자 용해질의 분석은 총 단백질의 최대 45%가 mRNA-단백질 융합체로 존재함을 밝혀내었다. 링커 F는 올리고-dT 정제에 필요한 올리고-dA 트랙(track)이 결여되어 있기 때문에, mRNA 4는 그의 3'-말단에, 올리고-dT 셀룰로오스 상에서의 정제를 가능케 해주는 A18스트레치(stretch)를 가지게 제조되었다.
피소랄렌을 링커의 5' 말단에 부착하는 과정을 수반하는 상기 기술의 대안에 있어서, 피소랄렌 단위체는 도 7B에 도시되고 Pieles et al.(Nucleic Acids Res. 17:8967, 1989)에 기술된 바와 같이, 또는 링커 서열 내에 분지형 포스포르아미다이트(Clontech, Palo Alto, CA)를 도입한 다음 피소랄렌 포스포르아미다이트(Glen Reseasrch, Sterling, VA)를 첨가함으로써, 펩티드 수용체의 링커 영역의 내부 위치에 도입될 수 있다. 예를 들면, 피소랄렌 단위체는 본원에 참고자료로 첨부된 U.S.S.N. 09/453,190에 개시된 바와 같이, 분지형 링커를 통해 RNA에 가교결합될 수 있다.
한 예시적인 접근법에서는, 5' cgt agg cga gaa agt gat X AAA AAA AAA AAAAAA AAA AAA AAA AAA CC Pu의 서열(여기서, Pu는 퓨로마이신-CPG[Glen Research]이고; C 및 A는 표준 3'-아미다이트[Glen Research]이며; a, t, c 및 g는 5'-포스포르아미다이트[Glen Research]이고; X는 비대칭형 분지형 아미다이트[Clontech]임)을 가진 링커를 제조업자의 표준 프로토콜에 따라 합성한 다음, 분지점 X를 선택적으로 탈보호시키고, 피소랄렌 C6 아미다이트를 커플링시켰다. 이어서, 이 링커를 상술한 광가교결합 기술을 사용하여 타겟 서열 5' GCA UCC GCU CUU UCA CUA UA을 가진 RNA에 광가교결합시켰다. 이러한 RNA-링커 컨스트럭트는 RNA-단백질 융합체 형성에 성공적으로 사용되었다.
다른 대안에서, 타겟 혼성화 영역의 3' 말단에 부착된 피소랄렌을 함유하는 링커가 제작될 수도 있다(도 7C). 이 방법에서, 피소랄렌-함유 링커의 5' 말단은 가닥 방향의 역전(reversal) 후에 3' 퓨로마이신으로 끝나는 다른 링커에 의해 연장된다. 뒤이은 RNase H를 사용한 RNA 타겟 영역의 절단은 선택적이며, 링커 컨스트럭트의 유연성을 증가시킬 것이다. 또한, 이러한 접근법은 훨씬 더 긴 RNA 분자의 내부 위치에 링커를 부착하는 것을 가능케 하며, 링커 부위 하류의 비해독(untranslated) 영역은 해독 및 RNA-단백질 융합체 형성 이전에 잘려나간다.
이 방법에 대한 한 가지 예시적인 접근법에서, 5' Pso atg cga gaa agt gat aaa aaa aaa aaa CC Pu의 서열(여기서, Pu는 퓨로마이신-CPG[Glen Research]이고; C는 표준 3'-아미다이트[Glen Research]이며; a, t, c 및 g는 5'-포스포르아미다이트[Glen Research]이고; Pso는 피소랄렌 C6 포스포르아미다이트[Glen Research]임)을 가진 링커가 제조업자의 표준 프로토콜에 따라 제작되었다. 상기 링커는 이어서 상술한 광가교결합 기술을 이용하여 타겟 서열 5' GUA UAC GCU CUU UCA CUA를 가진 RNA에 광가교결합되었다. 이러한 RNA-링커 컨스트럭트는(RNase H 처리를 미리 하거나 또는 하지 않은 후에) RNA-단백질 융합체 합성에 성공적으로 사용되었다.
RNA에 펩티드 수용체를 부착하기 위한 광가교결합 방법의 한 가지 이점은 이러한 방법이 RNA를 리게이션 이전에 화학적으로 변형하는 것을 요하지 않는다는 것이다. 이는 과정을 매우 신뢰성있고 선택적이게 만들며, 화학적 리게이션의 기질로서 미정제 T7 전사 반응으로부터 얻은 RNA를 사용하는 것을 허용한다.
실시예 6: 광절단성 비오틴-기초 RNA 정제 및 리게이션
원한다면, 친화성-기초 RNA 정제 단계가 상술한 광화학적 리게이션 과정과 결합될 수 있다(도 7H). 적절한 링커 분자가 그의 퓨로마이신 말단에서 광절단성 비오틴 단위체(예를 들면, EZ-LinkTMNHS-PC-LC-비오틴, Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 변형된다. 이어서, 타겟 RNA(예를 들면, 미정제 전사 반응액으로터 수득된)를 소정량의 링커에 혼성화시킨 다음, 결과되는 이중쇄를 스트렙트애비딘(또는 유사한) 수지와 같은 고체 지지체 상에 고정한다. 그런 다음, 과량의 RNA는 물론 전사 반응의 성분들을 세척하여 제거한다. 장파장 UV 광을 조사하면 광가교결합 형성과 생성물 유리가 동시에 일어난다. 리게이션된 RNA는 추가의 정제없이 해독 및 융합체 형성 반응에 바로 투입될 수 있다.
이러한 방법은 이전의 RNA 정제 스킴에 비해 이점을 가진다. 예를 들면, 전사 후에, RNA의 양은 단지 사용된 링커 양을 초과하게 산정되어야 한다. 상술한 과정들에 적용시, 그의 양은 자동적으로 사용된 링커 양 만큼의 양으로 감소된다. 이것은, 결과적으로, 예를 들면 A260UV 를 판독함으로써 별도로 RNA(또는 리게이션된 RNA)를 정량하는 과정 없이 다음 단계로 진행하는 것을 가능케 하며, RNA 양이 달리 조정될 필요가 없다. 따라서, 핵산-단백질 융합 분자 제조 과정이 자동화에 보다 더 적합하게 된다.
한 가지 예시적인 기술에서, 이러한 비오틴-기초 RNA 정제 및 리게이션 프로토콜은 다음과 같이 수행될 수 있다. 이러한 광절단성 비오틴-기초 RNA 정제 및 리게이션 절차에 있어서, 링커는 우선 비오틴화된다. 링커 C6-피소랄렌-2-OMe[U AGC GGA UGC]dA18TEG2dCdC-퓨로마이신을 100μM 링커 100㎕(총 10nM), DMSO 내의 1μmole EZ-LinkTMPC-LC-비오틴 50㎕, 10× PBS 20㎕, 및 물 30㎕를 혼합함으로써 비오틴화시킨다. 상기 혼합물은 실온에서 2시간 동안 인큐베이션되며, 정량적인 수율을 초래한다. 혼합물은 이어서 에탄올로 2회 침전되는데, 이때 PC-비오틴화된 링커가 >90%의 예상된 회수율로 침전되었으며, 200㎕의 물에 재현탁되었다.
다음에, RNA는 예를 들면 T7 Megashortscript Kit(Ambion)을 사용하여 전사된다. 전사는 250ul 반응 부피당 3'-말단에 GCA UCC GCU AUU UAA An의 서열을 함유하는 DNA 주형 10pmole을 사용하여 수행된다. 이러한 전사 반응은 약 2~5nmole의 미정제 RNA 산물을 생성해야만 한다. 다음 단계로 넘어가기 이전에 어떠한 정제(페놀 추출, NAP-5 컬럼, 또는 RNeasy 컬럼)도 필요치 않다.
이러한 정제 및 리게이션 기술의 다음 단계에서는, 비오틴화된 링커(50pmol/ul 비오틴화된 링커 10ul; 총 500pmol)가 PCR기(30초간 80℃로 가열한 다음, 0.3℃/sec의 속도로 4℃까지 냉각)와 5M NaCl 15ul(300ul 반응액 당 0.25M의 최종 농도로) 및 물을 사용하여 최종 반응 부피 300ul 내에서 62.5 내지 250ul의 전사 혼합물에 어닐링된다. 그후, 상기 반응 혼합물의 RNA는 반응 혼합물을 4℃에서 30분간 서서히 흔들어줌(rocking)으로써 100ul의 Neutravidin 비드(Pierce, Rockford, IL) 상에 고정된다. 이어서, 비드는 세척후 300ul의 물에 재현탁된다.
그후, 비드를 스핀 다운(spin down)한 다음, 100ul의 완충액(25mM Tris pH 7.0 및 0.25M NaCl)으로 세척한다. 이어서, 비드를 실온에서 15분간 UV 조사하여(핸드-헬드 UV 램프 UVGL-25를 사용하여; 비드가 담긴 마이크로센트리퓨지 튜브를 램프 위에 직접 올려둠), 링커를 RNA에 화학적으로 리게이션하고 리게이션된 분자를 비드로부터 광-유리(photo-release)시킨다. 리게이션된 RNA 250pmol이 광유리될 것으로 예상된다. 물 75ul를 상기 튜브에 첨가하고, 30초간 볼텍싱한 다음, 비드를 스핀 다운한다. 리게이션된 RNA/링커를 함유하는 상등액 75ul가 해독 및 핵산-단백질 융합 분자 형성에 사용된다.
핵산-단백질 융합 분자는 이전 단계로부터의 상등액 75ul를 토끼 망상적헐구 용해질 킷트(Ambion)의 완충액 성분 및 용해질 225ul와 혼합한 후 30℃에서 30분간 인큐베이션함으로써 형성된다. 그런 다음, KCl과 MgCl2를 각각 최종 농도 500mM 및50mM로 첨가하고, 실온에서 60분간 인큐베이션하여 핵산-단백질 융합 분자가 생성되도록 한다.
실시예 7: 강력한 비공유결합을 통한 펩티드 수용체의 RNA에의 부착
RNA 분자에 펩티드 수용체를 부착하기 위한 공유결합 형성에 대한 대안으로서, 강력한 복합체(complex) 형성에 의존하는 방법들 또한 가능하며 본 발명의 일부이다. 한 가지 방법은 도 8A에 도시된 바와 같이, RNA 인식 및 결합을 위한 펩티드 핵산(PNAs)의 사용을 수반한다. PNA는 비키랄성(achiral)이고 전하를 띠지 않은 N-(2-아미노에틸)글리신 단위로 구성된 DNA 의사체(mimetics)이다(Knudsen and Nielsen, Nucleic Acids Res., 24:494, 1996). PNA는 상보성 단일가닥 DNA 및 RNA에 서열 특이성 및 고친화성을 가지고 혼성화는 것으로 알려져 있다. 특히, RNA에 결합하여 클램프(clamp)를 형성할 수 있는 두 개의 PNA 분자들로 구성된 삼중나선-형성 컨스트럭트는, 그러한 컨스트럭트가 열변성 및 시험관내 해독에 사용되는 조건에 상당히 저항성을 가지기 때문에, RNA의 강력한 결합을 위한 수단을 제공할 수 있다(도 8A)(Hanvey et al., Science, 258:1481, 1992).
위이소시토신 염기(pseudoisocytosine base)의 사용은 중성 및 염기성 pH에서의 안정성을 더욱 증가시킨다(Egholm et al., Nucleic Acids Res., 23:217, 1995). 그러한 PNA-클램프는 시험관내 해독 조건하에서 mRNA와 결합된 채로 남아있고 리보좀에 의해 치환불가능한 것으로 알려져 있다(Knudsen and Nielsen, Nucleic Acids Res., 24:494, 1996). 이러한 특성은 해당 RNA-단백질 융합 컨스트럭트의 안정성을 극대화시킨다.
핵산 링커-PNA 컨스트럭트의 제조는, 도 8B에 도시되어 있고 Uhlmann et al.(Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 35:2633, 1996)에 개시된 바와 같이, 퓨로마이신-CPG로 시작하는 고체상 합성(solid phase synthesis)에 의해 달성될 수 있다. 표준 자동 합성법에 따라 목적하는 핵산 영역(또는, 그러기를 바란다면, PEG-스페이서)을 조립한 후, 적절한 시약(예를 들면, Uhlman et al.(상동)에 기재된 바와 같은)을 사용하여 PNA 부분을 부가함으로써 고체상 합성이 계속된다. 이와 달리, PNA를 별개의 단위체(PE Biosystems, Foster City, CA)로 합성한 다음, 원하는 링커 부분에 화학적으로 커플링하는 것도 가능하다.
구체적인 일례에서, 퓨로마이신-DNA 링커가 5' 말단 아미노기로 변형될 수 있는데, 상기 아미노기는 후에 화학적으로 활성화된 에스테르(예를 들어, 다이숙신이미딜 글루타레이트 또는 유사 시약과의 반응을 통해; 이러한 기술은 예를 들면 Cox et al.(J. Immunol., 145:1719, 1990) 및 http://www.piercenet.com/Products/linkersearch.cfm;Pierce, Rockford, IL에 개시되어 있음)로 전환될 수 있다. 뒤이은 PNA 단위체(비보호 아미노 말단 또는 카르복시 말단 라이신을 보유한)와의 반응은 상기 영역들을 공유결합시킨다. 이러한 과정은 최종 DNA-링커 산물을 함유하는 균질용액 내에서, 또는 보호기를 가지며 고체 수지에 부착된 채로 남아있는 DNA를 사용하여 수행될 수 있다.
실시예 8: 링커 길이 및 조성의 최적화
상술한 모든 전략의 경우, 링커 컨스트럭트를 최적화하는 것이 바람직하다. 고려해야 할 인자는 예를 들면, 주형/타겟 인식 요소(element)의 잠재적인 포함 및 부착된 작용기의 입체적 접근가능성(steric accessibility)이다. 특히 핵산 혼성화를 통한 주형 또는 타겟 인식이 수반되는 경우, 바람직하게는 타겟 서열 및 링커의 화학적 성질을 포함하는 인자들이 최적화되어야 한다. 예를 들면, RNA 혼성화 강도 및 그로부터 결과되는 리게이션 효율은 DNA 보다는 오히려 2-OMe RNA 또는 프로파인-변형된 뉴클레오염기(propyne-modified nucleobase)의 사용에 의해 증가되는 것으로 알려져 있다(예를 들면, Inoue et al., Nucleic Acids Res., 15:6131, 1987; Kibler-Herzog et al., Nucleic Acids Res., 19:2979, 1991; 및 Wagner et al., Science 260:1510, 1993에 기술된 바와 같이).
링커들은 또한 RNA-단백질 융합 반응에 있어서의 그들의 효능을 위해 최적화될 수 있다. 이는 대체로 링커 길이의 변경을 수반하지만, RNA-단백질 결합을 위한 다른 빌딩 블록(building block)의 사용 또한 수반할 수 있다. 구체적인 일례에서, 링커의 디옥시뉴클레오티드가 PEG-스페이서 또는 2-OMe-RNA 유닛(양자 모두 Glen Research, Sterling, VA로부터 구입가능함)으로 대체될 수 있다.
다른 구현예들은 청구의 범위 내에 있다.
모든 특허 및 특허출원들이 본원에 참고자료로 포함된다.

Claims (44)

  1. 다음의 단계들을 포함하는, RNA 분자에 펩티드 수용체를 부착하는 방법:
    (a) 헤어핀 구조를 형성하는 3' 서열을 갖는 RNA 분자를 제공하는 단계;
    (b) 핵산 링커 분자에 공유결합된 펩티드 수용체를 제공하는 단계; 및
    (c) 펩티드 수용체와 RNA 분자 사이의 공유결합 형성을 허용하는 조건하에서 핵산 링커 분자에 RNA 분자를 혼성화시키는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 공유결합 형성이 T4 DNA 리가아제에 의해 촉매되는 방법.
  3. 다음의 단계들을 포함하는, RNA 분자에 펩티드 수용체를 부착하는 방법:
    (a) RNA 분자를 제공하는 단계;
    (b) 핵산 링커 분자에 공유결합된 펩티드 수용체를 제공하는 단계로서, 상기 링커 분자의 5' 서열이 헤어핀 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 단계; 및
    (c) 펩티드 수용체와 RNA 분자 사이의 공유결합 형성을 허용하는 조건하에서 핵산 링커 분자에 RNA 분자를 혼성화시키는 단계.
  4. 제 3항에 있어서, 공유결합 형성이 T4 DNA 리가아제에 의해 촉매되는 방법.
  5. 다음의 단계들을 포함하는, RNA 분자에 펩티드 수용체를 부착하는 방법:
    (a) RNA 분자를 제공하는 단계;
    (b) 링커 분자에 공유결합된 펩티드 수용체를 제공하는 단계로서, 상기 링커 분자가 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 또는 다이디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트로 시작되는 것을 특징으로 하는 단계; 및
    (c) RNA 분자 및 펩티드 수용체를 말단 디옥시뉴클레오티드 트랜스퍼라아제와 접촉시켜 펩티드 수용체를 RNA 분자에 공유결합시키는 단계.
  6. 다음의 단계들을 포함하는, 펩티드 수용체를 RNA 분자에 부착하는 방법:
    (a) RNA 분자를 제공하는 단계; 및
    (b) 펩티드 수용체를 RNA 분자에 화학적으로 리게이션하는 단계.
  7. 제 6항에 있어서, 펩티드 수용체가 피소랄렌 단위체에 연결되어 있고, 화학적 리게이션 단계가 펩티드 수용체를 피소랄렌 단위체를 통해 RNA 분자에 가교결합시키는 과정을 포함하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 피소랄렌 단위체가 링커를 통해 펩티드 수용체에 부착된 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 피소랄렌 단위체가 링커의 5' 말단에 위치하는 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 피소랄렌 단위체가 링커의 3' 말단에 위치하는 방법.
  11. 제 8항에 있어서, 피소랄렌 단위체가 링커 내부에 위치하는 방법.
  12. 제 8항에 있어서, 링커가 C6 알킬쇄를 포함하는 방법.
  13. 제 8항에 있어서, RNA 분자가 그의 3' 말단에 인접한 정지 코돈을 보유하는 방법.
  14. 제 8항에 있어서, 링커의 길이가 25 내지 40 뉴클레오티드 유닛인 방법.
  15. 제 7항에 있어서, 가교결합이 UV광 조사에 의해 달성되는 방법.
  16. 제 8항에 있어서, 가교결합 이전에, RNA가 광절단성 단위체를 추가로 포함하는 링커에 혼성화되고, 혼성화된 RNA가 상기 광절단성 단위체를 통해 고체 지지체에 고정되는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 광절단성 단위체가 비오틴인 방법.
  18. 제 6항에 있어서, RNA 분자가 기능성화되고, 펩티드 수용체에 작용기가 부착된 방법.
  19. 제 18항에 있어서, RNA 분자가 IO4 -산화에 의해 기능성화되는 방법.
  20. 제 18항에 있어서, 화학적 리게이션이 외부 주형의 부재 하에 수행되는 방법.
  21. 제 18항에 있어서, 펩티드 수용체가 링커 분자에 공유결합되고, 화학적 리게이션 단계 이전에, RNA 분자와 펩티드 수용체가 RNA 분자의 3' 말단과 링커 분자의 5' 말단에 혼성화하는 외부 주형을 사용하여 정렬되는 방법.
  22. 제 18항에 있어서, 펩티드 수용체가 링커 분자에 공유결합되고, 화학적 리게이션 단계 이전에, RNA 분자와 펩티드 수용체가 링커 분자를 RNA의 3' 말단에 혼성화시킴으로써 정렬되는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 펩티드 수용체의 작용기가 링커 분자의 5' 말단에 위치하는 방법.
  24. 제 22항에 있어서, 펩티드 수용체의 작용기의 한쪽 측면에는 RNA 분자에 혼성화하는 영역이 접하고, 다른 한쪽 측면에는 펩티드 수용체가 접하는 방법.
  25. 제 18항에 있어서, 펩티드 수용체의 작용기가 아민, 하이드라진, (티오)하이드라자이드 및 (티오)세미카르바존으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  26. 제 6항에 있어서, 화학적 리게이션 단계가 다음의 과정들을 포함하는 방법:
    (a) 환원성 아민화에 의해 RNA 분자에 작용기를 부착하는 과정;
    (b) 펩티드 수용체를 RNA 분자의 작용기와 반응하도록 변형시키는 과정; 및
    (c) 공유결합 형성을 허용하는 조건하에서 펩티드 수용체를 RNA 분자와 접촉시키는 과정.
  27. 제 26항에 있어서, 작용기가 티올, 말레이미드, 또는 아민인 방법.
  28. 다음의 단계들을 포함하는, 시험관내(in vitro)에서 RNA 분자에 펩티드 수용체를 부착하는 방법.
    (a) RNA 분자를 제공하는 단계; 및
    (b) 펩티드 수용체를 RNA 분자에 비공유결합시키는 단계.
  29. 제 28항에 있어서, 펩티드 수용체가 PNA에 공유결합되어 있고, 펩티드 수용체의 RNA 분자에의 비공유결합이 PNA를 통해 일어나는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, RNA 분자가 정지 코돈을 보유하는 방법.
  31. 제 1항, 3항, 5항, 6항 또는 27항에 있어서, RNA 분자가 단백질 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 해독 개시 서열 및 정지 코돈을 포함하는 방법.
  32. 제 1항, 3항, 5항, 6항 또는 27항에 있어서, 펩티드 수용체가 퓨로마이신인 방법.
  33. 제 1항, 3항, 5항, 6항 또는 27항에 있어서, 펩티드 수용체가 비-뉴클레오티드 링커 분자에 공유결합된 방법.
  34. 제 1항, 3항, 5항 또는 8항에 있어서, 링커가 트리에틸렌 글리콜 스페이서를 포함하는 방법.
  35. 제 1항, 3항, 5항 또는 8항에 있어서, 링커가 2'-OMe-RNA 포스포르아미다이트를 포함하는 방법.
  36. 제 1항, 3항, 5항, 6항, 8항 또는 27항에 있어서, RNA 또는 링커가 친화성 정제 서열을 보유하고, 상기 방법이 RNA를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 친화성 정제 서열이 폴리(A) 서열을 포함하는 방법.
  38. 펩티드 수용체에 화학적으로 리게이션된 RNA 분자.
  39. 제 38항에 있어서, RNA가 그의 광가교결합 부위에 위치한 정지 코돈을 보유하는 방법.
  40. 펩티드 수용체에 비공유결합된 RNA 분자로서, 상기 펩티드 수용체가 링커 분자 및 PNA 분자에 부착되어 있고, 상기 비공유결합이 PNA 분자와 RNA 분자 사이에 형성된 분자.
  41. 제 38항 또는 40항에 있어서, 펩티드 수용체가 RNA 분자의 3' 말단에 리게이션된 분자.
  42. 제 38항 또는 40항에 있어서, RNA 분자가 단백질 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 해독 개시 서열 및 정지 코돈을 포함하는 분자.
  43. 제 38항 또는 40항에 있어서, 펩티드 수용체가 퓨로마이신인 분자.
  44. 다음의 단계들을 포함하는, RNA-단백질 융합체의 생산방법:
    (a) 링커에 혼성화된 RNA 분자를 제공하는 단계로서, 상기 링커가 광절단성 단위체, 피소랄렌 단위체 및 펩티드 수용체를 포함하는 단계;
    (b) 고정되지 않은 RNA가 지지체로부터 충분히 제거되는 조건하에서 RNA를 고체 지지체에 고정하는 단계;
    (c) 피소랄렌 단위체를 통해 펩티드 수용체를 RNA에 가교결합시킴으로써, 가교결합과 동시에 가교결합된 RNA가 고체 지지체로부터 유리되는 단계; 및
    (d) 단계 (c)에서 형성된 가교결합된 RNA를 해독하여 RNA-단백질 융합체를 형성하는 단계.
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